PL182890B1

PL182890B1 - Sposób wytwarzania środka farmaceutycznego na bazie ekstraktu z rośliny Nigella sativa

Info

Publication number: PL182890B1
Application number: PL94313223A
Authority: PL
Inventors: Rajko D. Medenica
Original assignee: H E Sheikh Ghassan I Shaker
Priority date: 1993-08-25
Filing date: 1994-08-25
Publication date: 2002-03-29
Also published as: EP0804212B1; US5482711A; BR9407362A; PL313223A1; DE69435091D1; SI9420054A; HU9600442D0; WO1995005839A1; SI9420054B; AU7868794A; HUT74226A; OA10572A; US5653981A; EP0804212A2; CA2169956A1; HU226319B1; ATE392902T1

Abstract

1. Sposób wytwarzania srodka farmaceutycznego na bazie ekstraktu z rosliny Nigella sativa polegajacy na ekstrakcji nasion tej rosliny, wyodrebnianiu substancji czynnej z uzyska- nego ekstraktu i formulowaniu substancji czynnej ewentualnie w polaczeniu z zaróbka lub substancjami pomocniczymi, znamienny tym, ze nasiona ekstrahuje sie C1C4 -alkoholem i formuluje sie dawki jednostkowe zawierajace substancje czynna w ilosci 20 - 40 g. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania środka farmaceutycznego na bazie ekstraktu z rośliny Nigella sativa Linn (N. sativa), użytecznego w leczeniu raka, leczeniu chorób wirusowych, w ochronie przed efektami ubocznymi chemioterapii i jako czynnik wzrostowy dla szpiku kostnego w hemopoezie.

Obecnie dostępnych jest szereg ziołowych i roślinnych ekstraktów lub preparatów przeznaczonych do leczenia różnorodnych chorób dotykających organizm człowieka. Niektóre preparaty sąznane dosłownie od tysięcy lat, a działanie lecznicze innych odkryto dopiero niedawno. Skuteczne ekstrakty roślinne sąbardzo pożądane w „naturalnej” drodze leczenia chorób. Uważa się, że preparaty naturalne nie będąmieć tak wielu efektów ubocznych w organizmiejak preparaty syntetyczne.

Jednym z głównych celów leczenia jest zwalczanie raka. Obecnie dostępne są leki przeciwrakowe skuteczne w zabijaniu komórekrakowych. Jednakże wiele z tych leków uszkadza lub zabija także normalne komórki lub wykazuje inne poważne efekty uboczne. Dlatego też bardzo ważne jest opracowanie programu przeciwrakowego, który byłby specyficzny wobec wzrostu tikowego w organizmie, a nietoksyczny wobec reszty organizmu. idealnie byłoby, gdyby program ten obejmował leczenie wykorzystujące naturalne ekstrakty roślinne. W znaczeniu stosowanym w tym ujawnieniu określenia „organizm” lub „pacjent” mogą obejmować każdego stałocieplnego ssaka, ale szczególnie mają dotyczyć organizmu człowieka.

Znane są lecznicze właściwości różnorodnych korzeni i ziół (Srivastava, 1989). U S 4986895 (Grossmana i in.) dotyczy wykorzystania rozpuszczalnych w wodzie ekstraktów roślinnych w leczeniu wirusowych infekcji skóry. US 5178865 (Ho i in.) dotyczy wykorzystania in vitro ekstraktów ziół chińskich w leczeniu choroby związanej z HIV. Ogółem, wykorzystując techniki in vitro, przebadano 56 ekstraktów ziołowych pod kątem aktywności przeciw HlV.

Także Aruna (1990) opisuje zastosowanie korzeni, warzyw liściastych i przypraw mających różne właściwości lecznicze. Wykorzystując indukcję S-transferazy glutationowej przebadano 20 produktów z korzeni lub warzyw liściastych pod kątem aktywności przeciwrakowej. Jedną z wykorzystanych roślin była Cuminum cyminum Linn (C. cyminum), znana także jako kminek. Wszystkie te korzenie i warzywa liściaste były dobrze tolerowane i nie stwierdzono żadnych działań toksycznych.

Bitterman i in. (1991) ujawniają badania przeprowadzone na populacji 964 dorosłych pacjentów, z których 28% cierpiało z powodu złośliwych chorób układu moczowego, a 72% z powodu szerokiego spektrum dziewięciu chorób układu nerwowego. Wyniki pozwalająwyciągnąć wniosek, że stosowanie w diecie C. cyminum może mieć udział w zapobieganiu chorobom zależnym od peroksydacji lipidów.

im90

Aruna i Sivaramakrishnan (1992) opisali przeciwrakotwórcze właściwości pewnych korzeni. Badano nasiona kminku (C.cyminum Linn). nasiona kminku znacząco hamująpowstawanie pewnych raków.

Inny ekstrakt roślinny, z rośliny N. sativa, wykazywał szeroki zakres zastosowań leczniczych. N. sativa jest rocznym ziołem należącym do rodziny Ranunculaceae. Inne gatunki Nigella obejmują Nigella arvensis i Nigella damascena. Indukcja hodowli kalusa wskazuje na znaczną różnorodność chromosomalną tkanek kalusa pochodzących z różnych gatunków Nigella (Datta i in, 1983).

N. saliva charakteryzuje się wzniesioną, rozgałęzionąłodygąi przeciwległymi, drobno podzielonymi, pierzastymi liśćmi o barwie szarawo-zielonej. Kwiaty pojedyncze, w kształcie gwiazdy, o barwie niebieskawo-białej są umieszczone terminalnie. Płatki są nieobecne. Owoc jest kulistą torebką z małymi, czarnymi, szorstkimi nasionami. Roślinę hoduje się w Indiach, Bangladeszu, Turcji, na Środkowym Wschodzie i w basenie Śródziemnomorskim, głównie ze względu na jej nasiona, czyli „czarny kminek”, które prawie wyłącznie wykorzystuje się do celów spożywczych lub medycznych, jako przyprawę i do leczenia różnych chorób.

Wiadomo, że dojrzałe nasiona N. sativa, znane takżejako Kalajira lub Kalaonji, mająszeroki zakres zastosowań leczniczych (Kirtikar i in., 1982 i Chopra i in., 1982). Składniki nasion obejmują saponinę, olejek eteryczny, związek o gorzkim smaku (nigellon) i garbniki. Substancje te wykazują właściwości moczopędne (Nadkarni, 1976), żółciopędne i przeciwspazmatyczne (Tennekooniin., 1991), wiatropędne (Shayeb i Mabrouk, 1984), mlekopędne (Vihan 1987),przeciwbakteryjne (Hassan i in, 1989), przeciwgrzybicze (Agarwal i in., 1979), przeciw robakom pasożytniczym (Akhlar 1991) i wywołujące miesiączkę (Siddiqui i in., 1988). al-Awadi i in. (1985) wykazali przeciwcukrzycowy wpływ ekstraktu roślinnego N.sativa.

Opisywano zastosowanie N.sativa w egipskiej medycynie ludowej jako środka moczopędnego i wiatropędnego (Sayed 1980). Olejek stosuje się w leczeniu astmy, chorób układu oddechowego i kaszlu. Z lotnej frakcji olejku wyizolowano składnik aktywny, nigellon, który jest użyteczny w leczeniu astmy oskrzelowej.

Testując otrzymany eterem naftowym ekstrakt z nasion w stężeniu 1000-62,5 części na milion (ppm) wobec Dysdercus simięlis w piątym stadium larwalnym stwierdzono, że wykazuje on takie same aktywności, jak regulujący wzrost hormon juwenilny (Kumar i in., 1987).

Badania al-Awadi i in. (1981) dotyczyły wpływu ekstraktu z mieszanki roślinnej zawierającej N. sativa na glukoneogenezę w wątrobie. Badacze opisują, że w Kuwejcie cukrzycę insulinoniezależnąleczy się ekstraktem z mieszanki roślin zawierającej N. saliva. W badaniach tych sproszkowaną mieszaninę, zawierającą w równych proporcjach N. saiiva, Linn, Commiphora myrrh, Eng, Ferula Asafoetida, Linn, Aloe vera, Linn i kadzidło arabskie, gotowano w wodzie destylowanej w ciągu 10 minut. Zwierzęta chore na cukrzycę otrzymywały dzienne dawki przez intubację dożołądkową. Wyniki wskazują, że przeciwcukrzycowe działanie ekstraktu roślinnego jest przynajmniej częściowo wynikiem zmniejszenia glukoneogenezy w wątrobie.

Elkadi i Kandil (1987) zajmowali się N. sativa i jej wpływem na ludzkie komórki T. N. saliva testowano na ochotnikach mających niski stosunek komórek T pomocniczych do komórek T supresorowych. Wyniki wskazywały na wzrost populacji komórek T pomocniczych w grupie eksperymentalnej. Ponadto wzrósł stosunek komórek T pomocniczych do komórek T supresorowych, podczas gdy w grupie kontrolnej pozostał on nie zmieniony.

Nair i in. (1991) badali wpływ N. sativa jako potencjalnego czynnika ochronnego wobec toksyczności indukowanej cisplatyną u myszy. Pewne wpływy ochronne stwierdzono stosując ekstrakty N. saliva.

Salomi, N. J. i in. (1992) badali nasiona N. sativa zawierające pewne kwasy tłuszczowe pod względem ich aktywności przeciwnowotworowych przeciw komórkom raka wysiękowego Ehrlicha (EAC), komórkom wysięku chłoniaka Daltona (DLA) i mięsaka -180 (S-180). Publikacja przedstawia wyniki doświadczeń przeciwnowotworowych in vilro i in vivo. Wyizolowano składnik aktywny przeciwnowotworowo. Stwierdzono, że składnik aktywny był cytotoksyczny wobec komórek EAC, komórek KB i limfocytów.

182 890

Salomi i in. (1991) opisali wpływ składnika aktywnego wyizolowanego z N. sativa na hamowanie chemicznie indukowanej karcynogenezy skóry. Stwierdzono, że śródotrzewnowe podawanie ekstraktu N. sativa zapobiega przypadkom mięsaków tkanek miękkich i zmniejsza średnice nowotworu w traktowanych grupach.

Metcalf (1984,1985) opisywał hamujący wpływ N. sativa na chemiczną karcynogenezę u myszy. Jednakże nie było w tych publikacjach dowodów na niszczenie ludzkich komórek nowotworowych.

Niniejszy wynalazek dostarcza przeciwrOkowego środka farmaceutycznego zawierającego jako substancję czynną ekstrakt z rośliny N. sativa. Środek ten, gdy stosuje się go właściwie, jest użyteczny w leczeniu raka i efektów ubocznych terapii przeciwrakowej, zapobieganiu toksyczności leków przeciwrakowych w organizmie człowieka i podwyższaniu odporności.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że środek farmaceutyczny o tak cennych właściwościach leczniczych można wytworzyć dzięki użyciu odpowiedniego środka ekstrahującego, umożliwiającego uzyskanie innej substancji czynnej niż w znanych ekstraktach.

Tak więc zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania środka farmaceutycznego na bazie ekstraktu z rośliny Nigella sativa polega na ekstrakcji nasion tej rośliny, wyodrębnianiu substancji czynnej z uzyskanego ekstraktu i formułowaniu substancji czynnej ewentualnie w połączeniu z zaróbką i/lub substancjami pomocniczymi, a cechą tego sposobu jest to, że nasiona ekstrahuje się CpC^-alkoholem i formułuje się dawkijednostkowe zawierające substancję czynnąw ilości 20 - 40 g

Korzystnie jako Cj-C^alkohol stosuje się etanol.

Korzystnie formułuje się dawkijednostkowe zawierające substancję czynnąw ilości 30g.

Środek farmaceutyczny wytwarzany sposobem według wynalazku stosuje się w sposobie zwiększania odporności ludzi, polegającym na podawaniu ludziom skutecznych dawek ekstraktu z Nigella sativa, w stężeniu ekstraktu skutecznie zwiększającym odporność.

Środek farmaceutyczny wytwarzany sposobem według wynalazku stosuje się również w sposobie ochrony normalnych komórek przed cytopatycznymi oddziaływaniami wirusa, polegaj ącym na podawaniu ludziom skutecznych dawek ekstraktu z Nigella sativa, w stężeniu ekstraktu skutecznie chroniącym przed cytopatycznymi wpływami wirusa.

Środek farmaceutyczny wytwarzany sposobem według wynalazku stosuje się ponadto w sposobie zwiększania ilości wytwarzających przeciwciała komórek B, polegającym na podawaniu ludziom ekstraktu z Nigella sativa, w stężeniu skutecznie zwiększającym ilość wytwarzających przeciwciała komórek B.

Środek farmaceutyczny wytwarzany sposobem według wynalazku stosuje się też w sposobie hamowania komórek nowotworowych w organizmie pacjenta bez wpływania na komórki normalne i nienowotworowe, polegającym na podawaniu pacjentowi ekstraktu z Nigella sativa w stężeniu skutecznie hamującym komórki nowotworowe i nie wpływającym na komórki nienowotworowe.

Środek farmaceutyczny wytwarzany sposobem według wynalazku stosuje się także w sposobie stymulacji tworzenia się szpiku kostnego w ludzi, polegającym na podawaniu ludziom skutecznych dawek ekstraktu z Nigella sativa w stężeniu ekstraktu skutecznie stymulującym tworzenie się szpiku kostnego.

Ogólnie ekstrakt z N. sativa pomaga stymulować komórki szpiku kostnego, chrom normalne komórki przed cytopatycznymi oddziaływaniami wirusa, niszczy komórki nowotworowe i zwiększa liczbę wytwarzających przeciwciała komórek B. Chroni on szpik kostny przed działaniem chemioterapii i jednocześnie może działa jako czynnik przeciwrakowy. Dzięki temu środek farmaceutyczny wytwarzany sposobem według wynalazku, zawierający ekstrakt z nasion N sativa, jest idealnym preparatem do stosowania w charakterze szczepionek zapobiegających rakowi i leczących raka.

Środek farmaceutyczny wytwarzany sposobem według wynalazku, zawierający ekstrakt z rośliny N sativa, jest skuteczniejszy niż standardowe leki przeciwrakowe stosowane w chemioterapii

182 890

Ekstrakt N. sativa stymuluje komórki szpiku kostnego, chroni normalne komórki przed cytopatycznym działaniem wirusa, niszczy komórki nowotworowe i zwiększa liczbę wytwarzających przeciwciała komórek B. Ponadto chroni on szpik kostny przed działaniem chemioterapii i może działać jako czynnik przeciwrakowy.

Stwierdzono również, że ekstrakt rośliny W. sativa pomaga odnowić komórki immunologiczne kompetentne u pacjentów chorych na raka z wywolanąimmunosupresjąi w znacznym stopniu stymuluje tworzenie szpiku kostnego u osobników normalnych.

Ekstrakt z N. sativa pomaga uwalniać miejsca wiązania antygenu nowotworowego na komórkach B. Stwierdzono, że raczej podawanie ekstraktu V. sativa, niż zwiększenie liczby komórek immunologicznie kompetentnych, pomaga uwalniać miejsca wiązania antygenu nowotworowego na komórkach B, tym samym zwiększając populację CD 191 związanych komórek. Jeśli w wyniku działania N. sativa miejsce wiązania na cząsteczce immunoglobuliny znajdującej się na powierzchni komórek B jest wolne, to wiąże ono antygen związany z nowotworem i w ten sposób wywołuje odpowiedź immunologiczną wobec antygenu.

Po podaniu ekstraktu rośliny /V. sativa zaobserwowano również ochronę ludzkich komórek owodnionych „WISH” przed cytopatycznymi oddziaływaniami wirusa pryszczycy (VSV). Dodatkowo stwierdzono wzrost poziomu interferonu w surowicy, a zatem ekstrakt roślinny N. sativa wykazuje podobną do interferonu aktywność przeciwwirusową. Jest to przykład zwiększania poziomu interferonu krążącego, zapobiegania chorobom wirusowym, a w dodatku możliwości leczenia chorób wirusowych.

N. sativa pobudza aktywność przeciwnowotworową. Dane pochodzące z badań farmakowrażliwości wskazują na przeciwnowotworową aktywność ekstraktu roślinnego N. sativa, głównie wobec czerniaka i raka okrężnicy.

Ekstrakt roślinny N. sativa niszczy komórki nowotworowe i pozostawia normalne komórki nienaruszone, prawdopodobnie ze względu na swoją zdolność do wiązania z asialofetuiną(lektyna) na powierzchni komórek chorych, co powoduje agregację i zlepianie się komórek nowotworowych Blokuje on także enzymy i niewłaściwe produkty genów zaangażowanych w syntezę i metabolizm kwasów nukleinowych.

Inne cele, cechy i zalety wynalazku staną się jasne na podstawie poniższego szczegółowego opisu w powiązaniu z załączonymi rysunkami.

Figura 1 jest graficznym przedstawieniem wzrostu populacji komórek CD 19, HLADR , VK CD3-/CD56+ i CD38 krwi obwodowej populacji pacjentów chorych na raka po 18-godzinnej inkubacji w obecności ekstraktu N. sativa w temperaturze 37°C w inkubatorze o atmosferze 5% CO2, jak to przedstawiono w Doświadczeniu 2.

Figura 2 jest graficznym przedstawieniem procentowej ochrony komórek WISH występujących w ilości 3,5 x 10⁴ przed oddziaływaniami cytopatycznymi (CPE) wirusa pryszczycy (VSV) przez kolejne rozcieńczenia ekstraktu N. sativa, jak to opisano w Doświadczeniu 3.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU Definicje:

Następujące definicje będą wykorzystywane w niniejszym zgłoszeniu:

komórki B: komórki B lub limfocyty B wydzielająbiałka/przeciwciała, które chronią organizm człowieka przed infekcjami.

CD3: Cluster Differentiation 3. Są to przeciwciała, które wskazują zaktywowane limfocyty T wykorzystywane przez organizm do ochrony przed obcymi szkodliwymi drobnoustroj ami

CD19: Cluster Differentiation 19. Sąto przeciwciała, które pomagają wykrywać limfocyty

B. Zwiększenie ilości CD19 wskazuje na zwiększenie ilości limfocytów B i odwrotnie.

CD56: Cluster Differentiation 56, są przeciwciałami, które hamują w pewnych układach oddziaływania komórek Natural Killer z komórkami docelowymi.

G-CSF: czynnik stymulujący kolonizację granulocytów.

GM-CSF: czynnik stymulujący kolonizację granulocytów i makrofagów.

182 890

HLADR: antygen DR ludzkich leukocytów. DR oznacza locus genetyczny lub odpowiadający locus antygenu głównego kompleksu zgodności tkankowej. Wzrost ilości HLADR wskazuje na podwyższenie parametrów immunologicznych przy zwalczaniu choroby.

NK: komórki Natural Killer. NKjest wskaźnikiem do wykrywania komórek Natural Killer.

NKCD3-/CD56+: Natural Killer Cluster Differentiation 3/Cluster Differentiation 56+. Przygotowywanie ekstraktu N. sativa:

Sposób przygotowywania ekstraktu N. sativa obejmuje mielenie nasion i wydzielanie ekstraktu N. sativa odpowiednimi rozpuszczalnikami, takimi jak alkohol lub woda, usuwanie lipidów przez ekstrakcję eterem lub eterem naftowym, krystalizację lub frakcjonowanie chromatograficzne, a następnie mieszanie jego składników we właściwych proporcjach. Ekstrakt N. sativa można następnie przygotować w 3 postaciach - oleju, płynu i kryształów - z użyciem znanych w nauce sposobów. Korzystny sposób przygotowywania ekstraktu N. sativa opisano w Doświadczeniu 1.

Podawanie:

Ekstrakt N. sativa można podawać sam lub w mieszaninie z odpowiednią zaróbką lub odpowiednim nośnikiem. Preparat można podawać pacjentowi dojelitowo, czyli doustnie lub doodbytniczo, albo pozajelitowo, czyli dootrzewnowo, domięśniowo, dożylnie lub podskórnie. Preparat można również podawać w połączeniu z dodatkami, takimij ak czynniki przeciwwirusowe, czynniki immunomodulujące, przeciwciała lub inne czynniki chemioterapeutyczne, bądź ich połączenia. Preparat można ponadto podawać w postaciach dawkowanych, takich jak kapsułki, tabletki, czopki ltp.

Dawkowanie:

Stwierdzono, że N. sativa jest najskuteczniejszy, gdy podaje się go w dawce 30 g na dzień, przy skutecznym zakresie 20 - 40 g na dzień.

Wiadomo również, że ekstrakt N. sativa zapewnia ludzkim komórkom owodniowym ochronę przed cytopatycznym działaniem wirusa pryszczycy (VSV). Maksymalną ochronę daje ekstrakt roślinny w rozcieńczeniu 1:1000, inkubowany w ciągu 24 godzin w temperaturze 37°C z obecnymi w ilości 3,5 x 104 komórkami WISH.

Teoretycznie pacjent ważący 70 kg ma w swoim organizmie 7 x 10¹³ komórek, toteż N. sativa będzie użyteczny w dawce od około 20 do 40 g na dzień, a korzystnie około 30 g na dzień do ochrony przed atakiem wirusa w rejonach jego endemicznego występowania.

Wynalazek ilustrują bliżej poniższe, nie stanowiące ograniczenia doświadczenia i testy.

DOŚWIADCZENIA

W celu oszacowania użyteczności N. sativa w leczeniu raka mierzono aktywność ekstraktu N. sativa wobec szpiku kostnego i krwinek białych krwi obwodowej. Mierzono również in vitro aktywność przeciwwirusową, przeciwnowotworowąi podobnądo aktywności czynnika wzrostu.

W celu określenia wzrostu komórek ekstrakt N. sativa inkubowano z komórkami szpiku kostnego. Wyniki porównano z tymi otrzymanymi dla czynników wzrostowych szpiku kostnego i czynników modyfikujących odpowiedź biologiczną (GM-CSF, G-CSF, erytropoetyna, interferon, IL-2 i STS). Oznaczeń dokonywano również na komórkach mysiej tkanki łącznej i ludzkich komórkach owodniowych „WISH”.

W przykładach stosowano następujące obliczenia:

Obliczanie procentu zwiększenia wzrostu:

Wzór: % podwyższenia = 1 ^Rę Rę ^RMAX^-Rc x 100 w którym Rt jest średnim zliczeniem komórek w studzience doświadczalnej z ekstraktem/czynnikami wzrostowymi, Rc jest średnim zliczeniem komórek tła z prób kontrolnych, Rfmax jest średnim maksymalnym zwiększeniem wzrostu bez ekstrakWczynnika wzrostowego.

182 890

Obliczanie procentu hamowania:

Wzór: % hamowania

R _T ^_ Rc = 1--¹——— x 100 ^RMAX ~ ^Rc w którym Rt jest średnim zliczeniem komórek w studzience doświadczalnej z ekstraktem/kontroląz Abrin, Rcjest średnim zliczeniem komórek tła z prób kontrolnych, RmAxjest średnim maksymalnym hamowaniem bez ekstraktu/kontroli z Abrin.

Poniżej zamieszczono opisy niektórych procedur stosowanych w doświadczeniach. Przy posługiwaniu się wszystkimi materiałami biologicznymi muszą być przestrzegane znane uniwersalne zasady bezpieczeństwa.

Procedura 1

Bezpośrednie wybarwianie immunofluoroscencyjne w cytometrii przepływowej

Automatyczna cytometria przepływowa (FC) stanowi skuteczną, czułąi ilościową metodę analizy populacji komórek, ich subpopulacji i składników w zawiesinie. W komórkach, przez całe ich życie, zachodzi ekspresja i ekspozycja anttyy^^n<^'w powierzchniowych wskazujących na klasyfikację komórek, etap dojrzewania, stan aktywacji lub stadium choroby. Opracowano przeciwciała monoklonalne (mAB), które specyficznie wiążąte antygeny powierzchniowe. Opracowano zastosowania kliniczne w diagnozie białaczki i chłoniaka, analizie subpopulacji komórek T, monitorowaniu odrzucania przeszczepów, monitorowaniu wpływów czynników chemioterapeutycznych na różne typy komórek i mierzeniu aktywacji komórkowej.

Pełną krew, szpik kostny lub zawiesinę komórkową najpierw traktuje się roztworem lizującym krwinki czerwone, przemywa, a następnie miesza ze znakowanym mAB skierowanym przeciw specyficznemu antygenowi błonowemu. Następnie, po procedurze bezpośredniego wybarwiania, prowadzi się analizę z wykorzystaniem cytometru przepływowego Immunocutometry Systems FACSCAN (FACSCAN Users Guide, Becton Dickinson).

Wszystkie próbki na ogół oznakowuje się następującymi informacjami: 1) nazwiskiem pacjenta; 2) datą pobrania; 3) czasem pobrania; 4) inicjałami osoby pobierającej próbki i 5) numerem zestawu. Pielęgniarka lub osoba pobierająca próbkę na ogół identyfikują próbki pacjenta przez sprawdzenie nazwiska pacjenta na etykiecie z oznakowaniem próbki. Dla zagwarantowania właściwego śledzenia losów próbki, każdej pojedynczej próbce nadaje się odrębny numer.

Krew obwodową pobiera się aseptycznie do takiego pojemnikajak probówka Vacutainer z nakrywką o barwie lawendowej (z EDTA jako środkiem przeciwkrzepliwym) i transportuje w temperaturze pokojowej w ciągu 48 godzin. Minimalna wymagana ilość wynosi około 2 ml pełnej krwi na zamówiony zestaw badań. Dość optymalna wynosi około 3 ml pełnej krwi na zamówiony zestaw badań.

Próbki szpiku kostnego (BM) pobiera się aseptycznie do takiego pojemnikajak probówka Vacutainer z nakrywką o barwie lawendowej (EDTA) i transportuje w temperaturze pokojowej w ciągu 48 godzin. Minimalna wymagana ilość wynosi około 2 ml próbki BM na zamówiony zestaw badań. Ilość optymalna wynosi około 3 ml próbki BM na zamówiony zestaw badań.

Nowotwory lite obejmująnowotwory piersi, węzłów chłonnych, okrężnicy, jajnika, płuc i skóry. Opis procedur znajduje się w części „Procedura oznaczania farm^kowrażliwości HTCA” (Procedura 5, poniżej). Nowotwór powinien zostać dostarczony w temperaturze pokojowej w ciągu 48 godzin od pobrania. Minimalna wymagana ilość wynosi około 2 ml komórek o stężeniu 1x10⁶/ml na zamówiony zestaw badań. Ilość optymalna wynosi około 3 ml komórek o stężeniu 1 x 10⁶/ml na zamówiony zestaw badań.

Materiały:

Wymagane materiały są następujące:

Probówki do pobierania krwi Vacutainer z EDTA Plastykowe probówki 12 x 75 mm

Wirówka serologiczna

Cytometr przepływowy FASCAN

182 890

Mikropipety (20 pl i 100 pl)

Końcówki do mikropipet

Pipeta Repeater

Małe zlewki

Przeciwciała monoklonalne

Roztwór lizujący

PBS

0,5% p-formaldehyd

Podłoża transportowe ml probówki stożkowe

Końcówki do pipety Repeater

Ekran ochronny

Wirówka Sorvall TR6000

Komórki kontrolne Coulter Cytotrol

Odczynniki:

Odczynniki przygotowuje się w następujący sposób:

A. Przeciwciała monoklonalne - w celu właściwego przygotowania i przechowywania różnych mAB patrz instrukcje dołączone do opakowań. W przypadku mAB z Coulter, przygotowywać według instrukcji dołączonych do opakowań, a następnie wykonać rozcieńczenie 1:2 jałową wodą i umieścić w odpowiednim pojemniku.

B. Roztwór lizujący - (Becton-Dickinson, nr kat. 92-0002). W celu przygotowania IX roztworu roboczego, dodać 10 ml 10X podstawowego roztworu lizującego do 90 ml wody destylowanej. Dobrze wymieszać. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Wyrzucić po tygodniu.

C. Sól fizjologiczna zbuforowana fosforanami (PBS) bez Ca++ i Mg++ (Gibco, nr kat. 310-4190AJ).

D. 0,5% paraformaldehyd. Rozpuścić 2,5 gparaformaldehydu (Baker, S-898-7) w 500 ml 1 x PBS bez Ca++ i Mg++.

E. Komórki kontrolne Coulter Cytotrol. Przygotować komórki kontrolne Cytotrol według instrukcji producenta dołączonej do opakowania. Codziennie trzeba przygotowywać świeże komórki.

Kontrola jakości.

W przypadku każdego pacjenta należy stosować bramkę z leukocytami i z kontrolą ujemną. Dla każdego mAB stosowanego danego dnia należy włączyć probówkę dla komórek kontrolnych Cytotrol.

Procedura:

Oznakować probówkę nazwiskiem pacjenta i odpowiednim mAB. Z użyciem mikropipety do każdej probówki dodać 100 pl pełnej krwi pacjenta. Mieszać każdą probówkę na wstrząsarce wirowej. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej w ciągu 15 minut. Stosując pipetę Repeater (nastawionąna 4) dodać do każdej probówki 2 ml roztworu lizującego IX. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut. Wirować probówki w wirówce serologicznej nastawionej na wysokie obroty w ciągu 3 minut, lub w wirówce Sorvall TR6000 w ciągu 5 minut przy 3000 obrotów na minutę. Zlać supematant do zlewki na odpady uważając, aby nie rozlać. Osuszyć gazikiem górną część probówki. Mieszać każdą probówkę na wstrząsarce wirowej w celu rozbicia osadu (stosować ekran ochronny). Stosując pipetę Repeater (nastwionąna 4), do każdej probówki dodać 1 ml 1X PBS, a następnie mieszać na wstrząsarce wirowej (stosować ekran ochronny). Wirować probówki w wirówce serologicznej nastawionej na wysokie obroty w ciągu 3 minut lub w wirówce Sorvall TR6000 w ciągu 5 minut przy 3000 obrotów na minutę Zlać supematant do zlewki na odpady uważając, aby nie rozlać. Osuszyć gazikiem górną cześć probówki. Mieszać probówki na wstrząsarce wirowej w celu rozbicia osadu (stosować ekran ochronny). Stosując pipetę Repeater (nastawioną na 2) dodać 0,5 ml 0,5% paraformaldehydu Mieszać na wstrząsarce wirowej. Przechowywać probówki zakryte parafoliąw lodówce do momentu analizy przez cytometrię przepływową.

182 890

Analiza próbek.

Analizować każdąprobówkę na cytometrze przejpywowym FACSCAN stosując oprogramowanie Simulset do oceny markerów powierzchniowych (patrz FACSCAN Userś Guide i Simulset Software Manual). Przy wprowadzaniu całkowitej liczby krwinek białych i procentu limfocytów wykorzystać informacje z pełnego badania liczby komórek krwi (CBC) (upewnić się, czy próbkę CBC pobrano w tym samym dniu i czasie, co próbkę FC).

Procedura 2

Komórki tworzące kolonie

Aby móc obliczyć siłę szpiku kostnego prowadzi się oznaczenie komórek macierzystych. Otrzymuje się informacje na temat stanujednostek tworzących kolonie (CFU) przed przeprowadzeniem terapii. Umożliwia to dokładne określenie ewentualnych oddziaływań toksycznych leku. Umożliwia to również przewidywanie toksyczności leku. Charakter CFU przy traktowaniu komórek macierzystych rióżnymi lekami pomoże okr^^Hć dominacje rozwojowe linii komórkowych. Wykazano, że interferon przedłuża różnicowanie komórek szpiku, dlatego też liczba CFU będzie wzrastać. Wykaże to skuteczność interferonu w odnawianiu szpiku kostnego i potwierdzi jego ochronną aktywność wobec szpiku.

Różne hemopoetyczne czynniki wzrostu mogą kierować rozwojem CFU różnych linii komórkowych.

Wymagania, pobieranie i postępowanie z próbkami:

Wymagania dotyczące próbki: Szpik kostny w ilości wystarczającej do otrzymania minimalnie 4,0 ml, a optymalnie 5,0 ml komórek monojądrzastych o stężeniu 1,0 x 10⁶ komórek/ml.

Procedura pobierania szpiku kostnego: przygotować 4-6 50 ml probówek Falcon zawierających 20 ml podłoża transportowego dla tkanek. Transportować podłoża w pojemniku chłodzącym z zamrożonymi płatkami lodu do miejsca przeprowadzenia procedury. Podczas procedury należy założyć maskę, rękawiczki i fartuch. Stosując technikę pracy jałowej wstrzyknąć do probówek z podłożem 2500jednostek heparyny wolnej od środków konserwujących. Należy to wykonać nie wcześniej niż na 15 minut przed otrzymaniem próbki szpiku kostnego. Dobrze zamieszać. Po dostarczeniu laborantowi szpiku kostnego w strzykawce, ostrożnie wstrzykiwać do probówek z podłożem, dwukrotnie przemywając podłożami. Wyrzucić strzykawkę do pojemnika na ostre przedmioty. Zamknąć probówkę i dobrze zamieszać. Oznakować próbkę w następujący sposób: 1) imię i nazwisko pacjenta; 2) data otrzymania próbki; 3) czas otrzymania próbki i 4) inicjały laboranta, który otrzymał próbkę. Do transportu umieścić w pojemniku chłodzącym z płatkami lodu.

Materiały:

Konieczne są następujące materiały:

Ficoll-Hypaąue

Zamykane 15 ml probówki (jałowe)

Probówki Falcon - 50 ml

Szafa laminarna ze światłem UV

Wirówka

Jałowe pipety jednorazowe 1,0 ml 5,0 ml

10,0 ml 25,0 ml

RPM1 1640 [1X]

Podłoże Dulbecco zmodyfikowane przez Iscove'a [1X]

Płodowa surowica bydlęca

Penicylina/streptomycyna

L-glutamina [100X]

Mikroelementy [100X]

2-Merkaptoetanol

182 890

Uzupełnienie msulina-tr;uisfeiyna-selenin sodowy (ITS) do podłoży

Szklane probówki 12x75 ml

Barwnik błękit trypanowy (0,4%)

Hemocytometr ze szkiełkami nakrywkowymi

Mikroskopy (świetlne, odwrócone)

Kolby do hodowli tkankowych - o powierzchni dna 25 cm2

Somatostatyna - 50 pg/ml (Sandoz - Sandostatin)

Interferon - 3 x 10⁶ U/ml (Roferon A - Hoffman LaRoche)

Interleukina-2 (Boehringer Mannheim GMBH, numer kat. 799068)

GM-CSF (Amgen, numer kat. 13050)

G-CSF (Amgen, numer kat. 10050)

Epogen (Amgen, numer kat. 06050)

PIXY 321 (Immunex)

Inkubator CO2

Licznik ręczny

Płatki lodu

Przygotowywanie podłoży i odczynników:

Po przygotowaniu każdego podłoża produkt końcowy oznakowuje się następująco: 1) nazwa produktu; 2) data przygotowania; 3) termin ważności; 4) zalecenia dotyczące przechowywania i 5) inicjały laboranta.

10% RPMI 1640 (1X) wzmocnione G. G:

Ilość 500,0 ml 50,0 ml

5,0 ml 1,5 ml 2,0 ml 0,5 ml 5,0 ml

Składnik

RPMI 1640 (IX) z L-glutamin

Płodowa surowica bydlęca (kontrolowana jakościowo, inaktywowana termicznie)

L-glutamina (100X), 200 mM penicylina/streptomycyna mieszanina mikroelementów (100X), liofilizowana

2-merkaptoetanol uzupełnienie ITS do podłoży, liofilizowane, napromieniowane promienowaniem gamma

Wszystkie składniki łączy się w szafie laminarnej i wyjaławia przez sączenie stosując sączek błonowy o średnicy porów 0,22 mikrometra z przesączkiem o średnicy porów 60 mikrometrów. Przygotowane podłoża oznacza się i przechowuje w temperaturze 2-10° C.

IMDM/RMPI1640 [1X] (Transportowe podłoże dla tkanek):

Ilość

500,0 ml

500,0 ml 100,0 ml

5,0 ml

10,0 ml

5,0 ml

0,5 ml

5,0 ml

Składnik

RPMI 1640 [1X]

IMDM [1X]

FBS (płodowa surowica bydlęca) penicylina/streptomycyna L-glutamina (100X) mieszanina mikroelementów (100X) aminokwasy egzogenne (100X) witaminy MEM 2-merkaptoetanol ITS

182 890

Interferon:

Użyć 1 fiolki Roferon A Interferon dostępnego w Hoffmann-LaRoche Inc. (3000000 U). Aby otrzymać stężenie 75000 U/ml pobrać 1 ml interferonu i dodać 39 ml podłoża RPMI(1X). Przygotować 40 próbek tego rozcieńczenia o objętości 1 ml i zamrozić. Do oznaczenia tworzenia kolonii stosować 1 ml interferonu o stężeniu 75000 U/ml na każdąkolbę do hodowli tkankowych o powierzchni dna 25 cm² zawierającą 4,0 ml podłoża i 0,5 ml komórek.

Interleukina-2:

Rozmrozić interleukinę-2 i pobrać 5 ml zawierających 200jedńostek na ml. Niezwłocznie zamrozić pozostałąinterleukinę-2 w 5 ml porcjach. Do 5 ml interleukiny-2 zawierającej 200jednostek na ml dodać 5 ml podłoża RPMI( 1X) aby uzyskać stężenie 100 jednostek/ml. Do 10 probówek zawierających 9 ml podłoża dodawać 1 ml interleukiny-2 o stężeniu 100 jednostek/ml aby uzyskać stężenie 10jednostek/ml. Próbki te są stabilne w ciągu 30 dni w temperaturze 4-8°C. Do oznaczenia tworzenia kolonii stosować 0,5 ml (lub 5 j ednostek) na każdą kolbę do hodowli tkankowych o powierzchni dna 25 cm2 zawierającą 4,5 ml podłoża i 0,5 ml komórek. Somatostatyna:

Somatostatyna dostępna jest w Sandoz Ltd. w pojedynczych fiolkach zawierających 50 pg/ml i 100 pg/ml. Przechowywać w temperaturze 4-8°C. Do oznaczenia tworzenia kolonii stosować 1,0 ml somatostatyny (STS) o stężeniu 50 pg/ml na każdą kolbę do hodowli tkankowych o powierzchni dna 25 cm2 zawierającej 4 ml podłoża i 0,5 ml komórek. Procedurę tę opisano dla fiolek zawierających 50 pg/ml. Gdy stosuje się fiolki zawierające 100 pg/ml, używać 0,5 ml somatostatyny i 4,5 ml podłoża na kolbę do hodowli tkankowych o powierzchni dna 25 cm2. GM-(CSF:

Rozcieńczyć 250 pl GM-CSF zawierających 50000 jednostek w 50 ml podłoża, aby uzyskać stężenie 1000jednostek/ml. W jałowych zamykanych probówkach przygotować próbki po 5 ml, z których każda zawiera 5000jednostek. Oznakować każdąpróbkę: GM-CSF - 5000jednostek (1000 jednostek/ml). Zamknąć dziewięć z tych próbekjałową folią przylegającą i przechowywać w temperaturze 4°C. Próbkę numer 10, zawierającą 1000jednostek/ml (w całości 5000j ednostek) zastosować w następujący sposób: odpipetować jeden ml do każdej z 5 jałowych probówek. Dodać 19 ml podłoża, aby otrzymać 50 jednostek/ml. (Każda probówka będzie zawierać całkowitą ilość 1000 jednostek). Oznakować każdą z tych próbek: GM-CSF - 50 jednostek/ml (całość 1000jednostek). Zamknąć 4 z tych próbekjałową foliąprzylegająaąi przechowywać w temperaturze 4°C. Próbkę numer 5 oznakować „W UŻYCIU” i przechowywać w temperaturze 4°C. Do oznaczenia tworzenia kolonii stosować 50 pl (lub 2,5 jednostek) na kolbę do hodowli tkankowych o powierzchni dna 25 cm2 zawierającą 5,0 ml podłoża i 0,5 ml komórek.

G-CSF:

Rozcieńczyć 125 pl G-CSF, zawierających 60000 jednostek w 50 ml podłoża, aby otrzymać 1200jednostek/ml. Wjałowych zamykanych probówkach przygotować próbki po 5 ml każda zawierające 6000 jednostek Oznakować każdąpróbkę: G-CSF - 6000 jednostek (1200 jednostek/ml). Wpisać datę. Zamknąć 9 z tych próbek jałową folią przylegającą i przechowywać w temperaturze 4°C. Próbkę numer 10, zawierającą5 ml o stężeniu 1200jednostek/ml (w całości 6000jednostek) zastosować w następujący sposób: odpipetować jeden ml do każdej z 5 jałowych probówek. Dodać 19 ml podłoża, aby otrzymać stężenie 60 jednostek/ml (każda probówka zawierać będzie całkowita ilość 1200jednostek). Oznakować każdąz tych próbek: G-CSF - 60 jednostek/ml (całość 1200 jednostek). Wpisać datę. Zamknąć 4 z tych próbek jałową folią przylegającą i przechowywać w temperaturze 4°C. Próbkę numer 5 oznakować „W UŻYCIU” i przechowywać w temperaturze 4°C. Do oznaczenia tworzenia kolonii stosować 50 pl (lub 3 jednostki) na każdą kolbę do hodowli tkankowych o powierzchni dna 25 cm2 zawierającą 5,0 ml podłoża i 0,5 ml komórek.

182 890

Epogen:

Do jednego ml epogenu, zawierającego 2000 jednostek, dodać 19 ml podłoża, aby otrzymać 20 ml zawierających 2000jednostek czyli 100jednostek/ml. Do każdej z 10 fiolek do zamrażania dodać próbki o objętości 2 ml. Oznakować w następujący sposób: Epogen -100jednostek/ml i data. Przechowywać w temperaturze 4-8°C. Do oznaczenia tworzenia kolonii stosować 50 pl (lub 5 jednostek) na każdą kolbę do hodowli tkankowych o powierzchni dna 25 cm² zawierającą 5,0 ml podłoża i 0,5 ml komórek.

PIXY 321 - GM-CSF/IL-3:

W 15 mljałowych zamykanych probówkach rozcieńczyć 1 ml Pixy 321 (aby zapewnić ilościowe pobranie przenieść przez przemycie fiolek) 9 ml 10% BSA i dobrze zamieszać. Uzyska się w ten sposób wpływ neutralizuj ący 1,0 x 10⁶jednostek/ml. Do każdej z 9 fiolek do zamrażania dodać po 1,0 ml tego roztworu o stężeniu 1 x 10⁶jednostek/ml. Oznakować każdąz fiolek do zamrażania nazwą, stężeniem i terminem ważności. Przechowywać w temperaturze -70°C. Do pozostałego 1 ml roztworu 1,0 x 106jednostek/ml dodać 9 ml 10% BSA i dobrze zamieszać. Uzyska się w ten sposób wpływ neutralizujący 1,0 x 10⁵jednostek/ml. Do każdej z 9 fiolek do zamrażania dodać po 1,0 ml tego roztworu 1 x 10⁵jednostek/ml. Oznakować każdąfiolkę: nazwą, stężeniem i terminem ważności. Przechowywać w temperaturze -70°C. Do pozostałego 1 ml roztworu l,0x 10⁵ jednostek/ml dodać 9 ml 10% BSA i dobrze zamieszać. Uzyska się w ten sposób wpływ neutralizujący 1,0 x 10⁴jednostek/ml. Do każdej z 9 fiolek do zamrażania dodać po 1,0 ml tego roztworu o stężeniu 1 x 104 jednostek/ml. Oznakować każdą fiolkę: nazwą, stężeniem i terminem ważności. Przechowywać w temperaturze -70°C. Do pozostałego 1 ml roztworu 1,0 x 104 jednostek/ml dodać 9 ml 10%BSA i dobrze zamieszać. Uzyska się w ten sposób wpływ neutralizujący l,0x l0 jednostek/ml. Do każdej z 10 fiolek do zamrażania dodać po 1,0 ml tego roztworu. Oznakować każdą: nazwą „Roztwór roboczy pixy”, stężeniem i terminem ważności. Przechowywać w temperaturze -70°C. Jedna fiolka może być rozmrożona i przechowywana w 4°C do stosowania w oznaczeniu. Z zamrażarki o temperaturze -70°C pobrać i rozmrozić próbkę o objętości 1 ml i stężeniu 1,0 x ^jednostek/ml. Oznakować „W UŻYCIU” i przechowywać w temperaturze 4°C. Do oznaczenia tworzenia kolonii stosować 50 pl (lub 2,5 jednostek) na kolbę do hodowli tkankowych o powierzchni dna 25 cm2.

PROCEDURA Obróbka próbek:

Stosując jałowąpipetę dodać po 20-25 ml histopaque do odpowiedniej liczbyjałowych zamykanych probówek stożkowych o objętości 50 ml. Używając innej jałowej pipety ostrożnie nawarstwić szpik kostny pod kątem 45°C na histopaque, stosując histopaque i próbkę w stosunku 1:1. Odwirować przy 1600 obrotach na minutę w ciągu 20 minut w chłodzonej wirówce w temperaturze 4°C (hamulec w pozycji 2). Pobrać i odrzucić supernatant. Pobrać zawierającąkomórki interfazę i umieścić w RPMI (1X) w uprzednio oznakowanej probówce. Komórki dwukrotnie przemyć podłożem RPMI (1X) i odwirować przy 1600 obrotach na minutę w ciągu 5 minut, przy hamulcu w pozycji 2. Pobrać i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml podłoża RPMI (1X).

Przeprowadzanie zliczania komórek:

W szklanej probówce 12x75 ml połączyć:

0,1 ml dobrze wymieszanej zawiesiny komórek

0,2 ml 0,4% barwnika błękitu trypanowego

0,7 ml podłoża

Jest to rozcieńczenie 1:10.

Dobrze wymieszać i zawiesinąkomórek wypełnić jedną komorę hemocytometru. Policzyć żywe komórki (te, które nie zaabsorbowały błękitu trypanowego) pod mikroskopem świetlnym w czterech narożnych kwadratach o powierzchni 1 mm2.

Policzyć całkowitą liczbę komórek (wybarwionych i nie wybarwionych) w czterech narożnych kwadratach o powierzchni 1 mm2.

182 890

Obliczanie stężenia komórek:

1. Przeprowadzić obliczenie żywych komórek stosując następujące równanie:

średnia liczba żywych komórek na kwadrat x współczynnik rozcieńczenia x współczynnik hemocytometru = komórki/ml

Przykład obliczenia: 20 komórek (średnia liczba żywych komórek na kwadrat) x10⁴x 10 (współczynnik rozcieńczenia) = 2 x 10⁶ komórek/ml.

2. Określić % żywotności stosując następujący wzór:

liczba żywych komórek —— -— ;—— x 100= % żywotności liczba wszystkich komorek

3. Stosując następujący wzór doprowadzić objętość do potrzebnej dla odpowiedniego stężenia komórek do oznaczenia (oznaczenie to wymaga stężenia 1 x 10⁶ komórek/ml):

(V,C, = V₂C₂)

Na przykład:

V, = 10 ml V₂ = ?

Cj = 2 x 10⁶ komórek/ml C₂ = 1 χ 10⁶ komórek/ml ml X 2 X 10⁶ komórek / ml 1 χ 10⁶ komórek/ml ml = V₂ ml - 10 ml = 10 ml

Należy dodać dziesięć ml podłoża, aby uzyskać stężenie 1x 106 komórek/ml.

4. Przygotować kolby: oznakować osiem kolb do płynnych hodowli tkankowych o powierzchni dna 25 cm² następującymi informacjami: 1) nazwiskiem pacjenta; 2) numerem; 3) datą; 4) czynnikiem wzrostowym lub BRM.

5. Do każdej z kolb o powierzchni dna 25 cm2 dodać komórki szpiku kostnego (BMC), czynnik wzrostowy lub czynnik modyfikujący odpowiedź biologiczną (BRM) i podłoże, zgodnie z tabelą 1:

Tabela 1

	BMC	BRM	Podłoże
BMC + M (kontrola)	0,5 ml	-	5,0 ml
BMC + IFN + M	0,5 ml	1,0 ml	4,0 ml
BMC + IL2 + M	0,5 ml	0,5 ml	4,5 ml
BMC + STS + M	0,5 ml	1,0 ml	4,0 ml
BMC + GM-CSF + M	0,5 ml	50 pl	5,0 ml
BMC + G-CSF + M	0,5 ml	50 μ	5,0 ml
BMC + EPO + M	0,5 ml	50 pl	5,0 ml
BMC + PIXY + M	0,5 ml	50 pl	5,0 ml

Uwaga Objętość końcowa we wszystkich kolbach będzie wynosić 5,5 ml.

6. Inkubowau kolbć w tempetetorze 37°C, w uCubatome aapzwniającnm atenos atrę 5% CO₂Kolby sprawdza się i uzupełnia pożywką w miarę potrzeby, zwracając uwagę, aby z każdą kolbą w oznaczaniu postępować jednakowo.

182 890

Odczytywanie i przedstawianie wyników:

W dniach 7,14 i 21 każdą z kolb do oznaczania tworzenia kolonii oglądać pod mikroskopem odwróconym. Kolonię definiuje się jako 40 lub więcej komórek przylegających do dna kolby. Vie liczyć kolonii pływających. Obejrzeć całą kolbę i podać całkowitą liczbę kolonu zliczonych dla każdej kolby w formularzu wynikowym oznaczenia tworzenia kolonii.

Jeśli pod koniec 21 dni nie jest widoczny wzrost, wpisać „brak wzrostu” i trzymać kolby przez dodatkowe 7 dni. Kolby można wyrzucić, jeśli raport końcowy został zatwierdzony przez kierownika d/s medycznych.

Procedura 3

Testowanie czynników immunomodulacyjnych

Celem wielu badaczy było przewidywanie odpowiedzi klinicznej lub in vitro na leczenie raka i właściwe określanie optymalnego leczenia pacjenta poprzez stosowanie oznaczeń in vitro Oznaczenie immunomodulacyjnejest procedurąmającąna celu określenie,jakpacjent będzie reagował na pewne czynniki modyfikujące odpowiedź biologiczną in vitro. Jest to konieczne uzupełnienie form testów, ponieważ można w ten sposób określić, czy surowica pacjenta naturalnie zawiera czynniki, które sązdolne do supresji lub aktywacji wzrostu komórek nowotworowych.

W procedurze tej surowicy i/lub krwinki białe pacjenta łączy się z różnymi czynnikami modyfikującymi odpowiedź biologiczną (BRM) i hoduje razem z linią komórek nowotworowych. Określa się procent stymulacji lub procent hamowania wzrostu komórek nowotworowych. Informacja ta umożliwia onkologowi określenie odpowiedniego i zindywidualizowanego leczenia każdego pacjenta.

WYMAGANIA I POBIERANIE PRÓBEK

Oznakować wszystkie próbki nazwiskiem pacjenta, datą pobrania, czasem pobrania i inicjałami osoby pobierającej. Dla zagwarantowania właściwego śledzenia losów próbki, każdej pojedynczej próbce nadaje się odrębny numer.

Wymagania:

1. Pełna krew (WB) - 10 ml

2. Surowica - 3 ml

3. Szpik kostny (BM) - BM zjednej biopsji aspiracyjnej w 25 ml podłoża transportowego Optymalna ilość wynosi 3 ml o stężeniu 1 x 10⁶ komórek na ml.

4. Próbka plazmaferetyczna - 3 ml

Dla pełnej oceny immunomodulacyjnej wymagane są zarówno próbki pełnej krwi, jak i próbki surowicy. Jednakże w przypadku gdy dostępnajest tylko jedna z dwóch próbek (WB lub surowica), można przeprowadzić częściowe oznaczenie immunomodulacyjne.

Wymagania, pobieranie i postępowanie z próbkami:

Pacjent będzie we właściwy sposób identyfikowany przez pielęgniarkę lub osobę pobierającą próbkę (tj. sprawdzenie etykiety z oznakowaniem próbki, zweryfikowanie nazwiska pacjenta).

Próbki będzie pobierać aseptycznie pielęgniarka lub osoba wyznaczona do pobierania próbek. Podczas pobierania próbki i manipulowania nią należy założyć rękawiczki i fartuch laboratoryjny oraz przestrzegać „uniwersalnych środków ostrożności”.

1. Pełna krew

a. Pobieranie - dodać 2500jednostek heparyny wolnej od środków konserwujących (kalcyparyna) do 10 ml probówki Vacutainer z nakrywką o barwie czerwonej. Przeprowadzić nakłucie żyły i pobrać krew pacjenta do probówki. Oznakować wszystkie probówki nazwiskiem pacjenta, datą i czasem pobrania. W celu wymieszania środka przeciwkrzepliwego odwrócić kilka razy probówkę. Chłodzić probówki do momentu przeprowadzenia rozdziału warstwy monojądrzastej przez procedurę wirowania w gradiencie gęstości (odwołać się do procedury 4, poniżej, cześć B-2)

Minimalna ilość pełnej krwi = 7 ml

Optymalna ilość pełnej krwi = 10 ml

b. Próbki nieakceptowalne - nieakceptowalne sąpróbki skrzepłe, w znacznym stopniu zhemolizowane lub zamrożone.

182 890

2. Surowica

a. Pobieranie - do przeprowadzenia nakłucia żyły stosować probówki Vacutainer z nakrywką o barwie czerwonej i pobrać 10 ml krwi pacjenta do probówki. Wirować próbkę krwi przy 2000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut w temperaturze 25°C. Chłodzić probówkę do momentu przeprowadzania testu. Aseptycznie odciągnąć surowicę i umieścić w oddzielnej probówce.

Minimalna ilość surowicy = 3 ml

Optymalna ilość surowicy = 5 ml

b. Próbki nieakceptowalne - nieakceptowalne sąpróbki z nadmiernym skrzepem fibryny.

c. Odrzucanie próbek - gdy którekolwiek kryterium pozostaje niespełnione, w razie konieczności można testować próbki nieakceptowalne.

3. Plazmaferaza

a. Pobieranie - dodać 2500jednostek heparyny wolnej od środków konserwujących (kalcyparyna) do 10 ml probówki Vacutainer z nakrywką o barwie czerwonej. Z pojemnika zbieraj jącego osocze pobrać na początku procedury plaźmaferaźy. Oznakować probówkę numerem 1. Chłodzić do momentu przeprowadzania testu.

Minimalna ilość osocza = 3 ml

Optymalna ilość osocza = 5 ml

3. Szpik kostny

a. Pobieranie - Nie więcej niż 15 minut przed procedurąz BM dodać aseptycznie 2500jednostek kalcyparyny na 25 ml podłoża transportowego dla tkanek. Stosując techniki pracy jałowej szybko dodać próbkę BM do probówki transportowej i dobrze zamieszać. Chłodzić probówkę do momentu przeprowadzenia rozdziału warstwy monojądrzastej przez procedurę wirowania w gradiencie gęstości (patrz część IV, cześć B-2).

MATERIAŁY:

Do tej procedury wymagane są następujące materiały:

Szafa laminarna

Bacto-Agar

Waga

Papierki wagowe

Naczynka wagowe

Zamykane butelki (jałowe) (-250 ml, -500 ml)

Woda destylowana (jałowa)

Kuchenka mikrofalowa

Autoklaw

Podłoże RPMI 1640

Gentamycyna

Pipety jednorazowe (jałowe) (-1 ml, -2 ml, -5 ml, -10 ml, 25 ml)

Glutamina

Mikroelementy

2-Merkaptoetanol z PBS Dulbecco

Roztwór ITS

Płodowa surowica bydlęca

Probówki (zamykane) (-5 ml, -10 ml)

Szalki Petrfego (jałowe) (zwykłe 100 x 15 mm, kratkowane 35 mm)

Probówki Falcon

182 890

Probówka stożkowa (jałowa-plastykowa)

Barwnik błękit trypanowy (0,4~)

Hemocytometr ze szkiełkami nakrywkowymi

Mikroskopy (odwrócony mikroskop do hodowli tkankowych, mikroskop świetlny)

Paski do badania pH (wąski zakres)

Cylindry miarowe (50 ml, 100 ml)

Histopaąue - 1077

Łaźnia wodna

Pipeta zasysająca

Wirówka z chłodzeniem

Inkubator CO2

Czynniki modyfikujące odpowiedź biologiczną(zrekombinowany interferon alfa 2a, zrekombinowana interleukina-2, przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw interferonowi alfa) Wstrząsarka wirowa

Lodówka (2-8 C)

Licznik ręczny

Pojemnik na ostre przedmioty

Pipety pasteurowskie

Wkraplacze

Zamrażarka na -70°C

Skuteczne środki do dezynfekcji powierzchni

Środek dezynfekcyjny/czyszczący do drobnego szkła laboratoryjnego

Zlewka (250 ml)

Roztwór dezynfekcyjny Betadine

Strzykawki (1 cm³) (jałowe)

Igły (różnej grubości)

Probówki Vacutainer (z nakrywkami czerwonymi i „tygrysimi”)

PRZYGOTOWYWANIE PODŁOŻY I ODCZYNNIKÓW Przygotować agar:

Dolna warstwa (2,5% roztwór roboczy): odważyć 2,50 g Bacto-Agaru i umieścić w 100 ml zamykanej butelce. Dodać 100 ml wody destylowanej. Ostrożnie zamieszać.

Górna warstwa (1,5% roztwór roboczy): odważyć 1,5 g Bacto-Agar i umieścić w 100 ml zamykanej butelce. Dodać 100 ml wody destylowanej. Ostrożnie zamieszać. Umieścić obie butelki z poluzowanymi zamknięciami w kuchence mikrofalowej. Ogrzewać w kuchence mikrofalowej w ciągu 60 sekund na pełnej mocy, mieszając co 20 sekund. Unikać wrzenia. Gdy agar będzie gotowy, będzie przejrzysty. Jeśli roztwór zawrze, nie stosować go. Ponownie przyrządzić roztwór agaru. Luźno przykryć taśmą wskaźnikową do autoklawowania i autoklawować oba roztwory w ciągu 20 minut przy 22 psi i w temperaturze 250-270°F. Umieścić obie butelki w łaźni wodnej pod przykryciem. Łaźnia ta cały czas musi utrzymywać temperaturę 45-50°C. Agar powinien przed użyciem ulec schłodzeniu do temperatury 50°C. Przed użyciem dobrze zamieszać agar. Przygolować podłoża:

Po przygotowaniu każdego podłoża, produkt końcowy oznakować następującymi informacjami: 1) nazwą produktu; 2) datą przygotowania; 3) terminem ważności; 4) zaleceniami dotyczącymi przechowywania i 5) inicjałami laboranta.

10% RPMI 1640 (1X1 wzmocnione G. G:

Ilość Składnik

500,0 ml RPMI 1640 (1χ) z L-glutaminą

50,0 ml Płodowa surowica bydlęca, kontrolowana jakościowo, inaktywowana termicznie

5,0 ml L-glutamma (100X)200 mM

2,5 nd penicyiina/sfreptomycyna

2,0 ml mieszirnina mikroelementów (100X), liofiiizowmia

182 890

0,5 ml 2-merkaptoetanol

5,0 ml msułTu-bf fenyna-eelemn sodowy, uzupehnenie do podłoży, liofilizowane, napromieniowane promieniowaniem gamma

Połączyć wszystkie składniki w szafie laminarnej. Wyjałowić przez sączenie stosując błonowy sączek z octanu celulozy o średnicy porów 0,22 mikrometra z przesączkiem o średnicy porów 60 mikrometrów. Przygotowane podłoża przechowywać w temperaturze 2-10°C.

10%RPMI 1640 (2X) wzmocnione G. G:

Ilość Składnik

500,0 ml	RPMI 1640 (2X) sproszkowane podłoże do hodowli komórkowych z L-glutaminą (Rozpuścić jedno opakowanie proszku w ogółem 500 ml jałowej wody destylowanej)
50,0 ml	Płodowa surowica bydlęca, kontt^i^dowana jakościo wo, inaktywowana termicznie
5,0 ml	L-glutamina (100X) 200 mM
2,5 ml	penicylina/streptomycyna
2,0 ml	mieszanina mikroelementów (100X), liofilizowana
0,5 ml	2nmerkaptoetanol
5,0 ml	lnsullna-transfeΓyel·-seleniu sodowy, uzupełnienie do podłoży, liofilizowane, napromieniowane promieniowaniem gamma

W szafie laminarnej odmierzyć 450 mljałowej wody destylowanej i umieścić w 500 ml butelce na odczynniki. Dodać do wody sproszkowane podłoże, ostrożnie mieszając. Wymyć wnętrze opakowania w celu usunięcia wszystkich śladów proszku. Dodać 1,0 g NaHCo₃ na 500 ml podłoża. Rozcieńczyć jałową wodą destylowaną do objętości 500 ml. Wartość pH preparatu doprowadzić do o 0,2-0,3 niższej od pożądanej końcowej roboczej wartości pH (pH zazwyczaj wrasta po sączeniu o 0,1-0,3 jednostki); zalecane jest stosowanie 1N NaOH lub 1N HC1. Po doprowadzeniu pH pojemnik trzymać zamknięty do momentu sączenia podłoża. Wyjaławiać natychmiast przez sączenie stosując sączek błonowy z octanu celulozy o średnicy porów 0,22 mikrometra z przesączkiem o średnicy porów 60 mikrometrów. Przygotowane podłoża przechowywać w temperaturze 2-10°C.

Przygotować podłoże podstawowe dolnej warstwy:

125 ml Płodowa surowica byż<Słl^<3ίł

125 ml Roztwór 2 X wzmocnóony G , G

250 ml RozWór 1 X wzmocniony G, G

Zamieszać, oznakować i przechowywać w temperaturze 2-10°C.

Przygotować podłoże podstawowe górnej warstwy:

150 ml PPodowa surowica bAy(^lς^t^£ł

150 ml Roztwór 2 X wzmocmony G , G

150 ml Rozw/ór 1 X wzmocnóony G , G

Zamieszać, oznakować i przechowywać w temperaturze 2-10°C.

Przygotowywanie leków:

Przygotować robocze stężenia leków przeznaczonych do testowania. Wszystkich rozcieńczeń leków dokonuje się RPMI 1640 1X wzmocnionym G, G.

W celu przygotowania IFN alfa-2a w 10 ml zamykanej probówce, zamieszać 0,1 ml Roferon (3000000 jednostek/ml) z 9,9 ml podłoża 1X G, G. Oznakować probówkę nazwą leku, datą przygotowania, terminem ważności (1 tydzień od dnia przygotowania), stężeniem (30000 u/ml) i inicjałami laboranta.

W celu przygotowania IL-2 w 10 ml zamykanej probówce, pobrać z lodówki próbkę roboczego roztworu podstawowego IL-2 (10 jednostek/ml). Jeśli próbki nie ma w lodówce, zastosować procedurę przygotowywania próbek IL-2, którą można znaleźć w książce procedur przygotowywania próbek. Probówki z roztworem podstawowym przechowuje się w zamrażarce w -48°C

182 890

Dawka do testowania wyniesie 0,1 ml, co odpowiada 1 jednostce interleukiny-2. Dlatego też w procedurze immunomoduiacyjnzj będzie się testować 1 jednostkę intzele7klny-2. Interleukinę^ można w tym podłożu utrzymywać w ciągu 30 dni w temperaturze 2-8°C.

W celu przygotowania LI-8-ABIFN (mAB skierowane przeciw IFN alfa 2A) w 10 ml zamykanej probówce, pobrać próbkę roboczą (wpływ neutralizujący 1000 jednostek/ml z zamrażarki). Dawka w oznaczeniu wyniesie 0,1 ml, co da stężenie 100 jednostek neutralizujących ABIFN.

PROCEDURA:

Warstwa dolna (2,5%o agar):

Stosować podłoże podstawowe dolnej warstwy i dodać po 8 ml podłoża podstawowego do odpowiedniej liczeyjałownch 15 ml zamykanych probówek (zjednej probówki można wykonać około 8 płytek). Trzymać zamknięte w temperaturze pokojowej do momentu aż będą potrzebne do przygotowania płytek z dolną warstwą lub przechowywać zamknięte przez noc w temperaturze 2-8°Cdo stosowania następnego dnia. Przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej. Gdy wszystko jest gotowe do przygotowywania płytek z dolną warstwą, pracować szybko aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu agaru. Używając jałowej 10 ml pipety pobrać 2,0 ml mieszaniny 2,5% agaru. Dodać 2,0 ml do jednej z 15 ml plastykowych probówek zawierających 8 ml podłoża dolnej warstwy i dwukrotnie zamieszać przez pobieranie i dodawanie do probówki. Pobrać 9,0 ml mieszaniny i dodać po 1,0 ml na każdąkratkowanąpłytkę o średnicy 35 mm. Zamieszać aby pokryć dno płytki. Uważać, aby nie powstały bąble. Jednocześnie przygotowywać tylko 8 płytek, tak aby agar nie zestalił się przed wylaniem. Pozostawić płytki nieruchomo na płaskiej powierzchni do zestalenia się agaru. Odrzucić każdąp-łytkę z nierówno rozmieszczonym agarem. Płytki przechowywać w temperaturze pokojowej do użycia tego samego dnia lub przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze zapewniającym atmosferę CO2, do stosowania dnia następnego. Przygotowywanie linii komórkowych:

Na ogół w oznaczeniu stosuje się komórki L929, ale można również użyć komórek okrężnicy, prostaty, piersi lub jajnika.

W celu przygotowania komórek L929, sprawdzić mikroskopowo butelki do hodowli płynnych pożadanej linii komórkowej i określić na podstawie spójności warstwy komórek, której kolby użyć. Usunąć pipetą supernata^ i odrzucić. Dodać 5 ml ttypsyny. Warstwę komórkową wystawić najej działania i usunąć 2 ml. Inkubować kolby z trypsynąw ciągu minuty. Uderzyć kolbę dłoniąaby strącić komórki. Dla zatrzymania reakcji dodać 7 ml podłoża dla komórek L929. Przenieść komórki do jałowej 50 ml probówki stożkowej, dodać więcej podłoża (do uzyskania 20 ml). Wirować probówkę przy 1600 obrotów na minutę w ciągu 5 minut, z hamulcem w pozycji 2. Usunąć supematant i ponownie zawiesić osad w podłożu dlakomórek L929. Odwirować komórki przy 1600 obrotów na minutę w ciągu 5 minut, z hamulcem w pozycji 2. Usunąć supernata^, osad ponownie zawiesić w odpowiednim podłożu.

Przygotowywanie komórek pacjenta (z pełnej krwi z kalcyparyną lub próbki szpiku kostnego z kalcyparyną).

Do zamykanych probówek plastykowych o odpowiedniej wielkości (zależnej od objętości próbki), oznakowanych nazwiskiem pacjenta, dodać odpowiednią objętość histopaąue (stosować równe ilości histopaąuz i pełnej krwi, tj. jeśli otrzymano probówkę pełnej krwi zawierającą 8 ml krwi, dodać 4 ml histopαąuz i 4 ml pełnej krwi do każdej z dwóch 15 ml zamykanych probówek). Jeśli otrzymano 75 ml bM, dodać około 18,75 ml histopaąue i 18,75 ml BM do czterech 50 ml probówek stożkowych. Nawarstwić pełną krew bardzo wolno pod kątem 45° na hlstoaaauz Odwirować przy 1600 obrotach na minutę w ciągu 20 minut w wirówce o temperaturze 4°C, z hamulcem w pozycji 2. Usunąć i odrzucić supematant Pobrać zabizrαjącą komórki interfazę i umieścić w oddzielnej probówce zαbizrajączj 10 podłoża RPM11X G, G. Szybko rozcieńczyć komórki podłożem, ponieważ hlstoaaą7e jest bardzo toksyczny wobec komórek gdy są wystawione na jego działanie przez dłuższy okres czasu. Przemyć komórki dwukrotnie 10 ml podłoża RPM11X G, G Odwirować przy 1600 obrotach na minutę w ciągu 5 minut, z hamulcem w pozycji 2. Usunąć i odrzucić suazmαtαnt. Ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml podłoża RPMI1X G, G.

182 890

PRZEPROWADZIĆ ZLICZANIE KOMÓREK

W 11x75 ml szklanej probówce połączyć 0,7 podłoża, 0,2 błękitu trypanowego i 0,1 zawiesiny komórek. Jest to rozcieńczenie 1:10. Dobrze wymieszać. Napełnićjednąkomorę hemocytometru. Policzyć żywe komórki (te, które nie zaabsorbowały błękitu trypanowego) pod mikroskopem świetlnym w czterech narożnych kwadratach o powierzchni 1 mm2. Stężenia linii komórkowych i komórek pacjentów w oznaczeniu IM będą następujące: (komórki na ml):

Komórki L 5 x 10⁵

Komórki okrężnicy 1 x 10⁵

Komórki prostaty 5 x 104

Komórki piersi 5 x 104

Komórki jajnika 2 x 104

Komórki pacjenta 1 x 106

Policzyć całkowitą liczbę komórek (wybarwionych i niewybarwionych) w czterech narożnych kwadratach o powierzchni 1 mm².

OBLICZANIE LICZBY KOMÓREK:

Do obliczania liczby komórek stosować następujący wzór:

Komórki na ml = średnia liczba żywych komórek x współczynnik rozcieńczenia x współczynnik hemocytometru

PRZYKŁADOWE OBLICZENIE: Komórki pacjenta znajdują się w 10 ml podłoża. 0,1 ml komórek dodano do 0,2 ml błękitu b-ypanowego i 0,7 ml podłoża. Zliczono 4 kwadraty o powierzchni 1 mm2 i liczba komórek = 80 komórek.

komórek (80 komórek w 4 kwadratach o powierzchni 1 mm2 = średnia liczba komórek) x 10 (współczynnik rozcieńczenia) x 104 _ 2 x 1θ6 komórek/ml.

Obliczyć % żywotności stosując następujący wzór:

% żywych komórek całkowita liczba komórek

0%=% óywotoości

Doprowadzić objętość do potrzebnej dla odpowiedniego stężenia komórek do oznaczenia:

(V,C,=V₂C₂)

Yj-lOml V₂ = ?

Cj = 2 X 10⁶ komórek/ml C₂ = 1 χ 10⁶ komórek/ml

V,C, = v, ml x 2 χ 10⁶ komórek / ml 1 χ 10⁶ komórek/ml ml = V₂ ml - 10 ml = 10 ml

Należy dodać dziesięć ml podłoża aby uzyskać stężenie 1x 106 komórek/ml.

Oznakować odpowiednią liczbę płytek następującymi informacjami: 1) numerem próbki, 2) nazwiskiem pacjenta, 3) nazwą BRM, 4) datą rozpoczęcia oznaczenia.

Przygotowywanie górnej warstwy

Oznakować i ustawić w statywie do probówek, zgodnie z tabelą2 (poniżej), potrzebne 15 ml jałowe zamykane probówki dla każdej kontroli, surowicy pacjenta, próbki pełnej krwi pacjenta. Upewnić się, że włączono kontrolę dla komórek i kontrolę dla każdego testowanego BMR. Kontrola komórkowa powinna zawierać wszystko to, co zawierają inne próby, poza BMR. Dla każdej

182 890 oznaczanej linii komórek (komórki okrężnicy, komórki L, komórki prostaty) musi być ustawiony oddzielny zestaw probówek kontrolnych. Do każdej probówki dodać podłoże podstawowe górnej warstwy, następnie dodać odpowiednie ilości BMR, ABIFN, linii komórek i surowicy lub pełnej krwi pacjenta. Patrz tabela 2 poniżej:

Tabela 2

Przy przygotowywaniu roztworów górnej warstwy postępować według tej tabeli (Wszystkie wartości w ml):

	Górna warstwa	BRM	ABFIN	WBC lub surowica pacjenta	Komórki L	Agar 1,5%	Objętość całkowita
Kontrola komórkowa	2,1	-	-	-	0,3	0,6	3,0 ml
Kontrola IFN	2,0	0,1	-	-	0,3	0,6	3,0 ml
Kontrola IL2	2,0	0,1	-	-	0,3	0,6	3,0 ml
Kontrola ABIFN	2,0	-	0,1	-	0,3	0,6	3,0 ml
Surowica pacjenta	1,9	-	-	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
Surowica pacjenta/ ABIFN	1,8	-	0,1	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
Surowica pacjenta/ IFN	1,8	0,1	-	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
Surowica pacjenta/ IL2	1,8	0,1	-	02	0,3	0,6	3,0 ml
WBC pacjenta	1,9	-	-	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
WBC pacjenta/ surowica	1,7	-	-	02 0,2	0,3	0,6	3,0 ml
WBC pacjenta/ surowica/ABIF	1,6	-	0,1	02 0,2	0,3	0,6	3,0 ml
WBC pacjenta/IFN	1,8	0,1	-	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
WBC pacjenta/ IFN/ surowica	1,6	0,1	-	02 02	0,3	0,6	3,0 ml
WBC pacjenta/ IL-2	1,8	0,1	-	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
WBC pacjenta/ IL-2/ surowica	1,6	0,1	-	02 0,2	0,3	0,6	3,0 ml

Dodać wszystkie, poza agarem, składniki do odpowiedniej probówki. Przed przejściem do następnej probówki należy skończyć dodawanie do poprzedniej. Z użyciem 2,0 ml pipety pobrać 0,6 ml 1,5% agaru. Dodać pojedynczo agar do próbówek, zaczynając od probówki numer 1. Zamieszać przez dwukrotne wciągnięcie i wydmuchanie. Pobrać 2,2 ml roztworu i dodać 1,0 ml na każdą z kratkowanych szalek Petri'ego (na wierzch drugiej warstwy), uważając aby nie powstały bąble w agarze. Płytką ostrożnie zakręcić, aby umożliwić równomierne rozmieszczenie agaru.

Umożliwić zestalenie agaru, a następnie dodać wody destylowanej (około 0,5 ml) dla nawilżenia płytki i umieścić w dużej oznakowanej szalce Petri’ego. Powtórzyć etapy 5-7 dla każdej przygotowanej płytki. Inkubować hodowle w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze wzbogaconej w 5% CO2.

PRZEDSTAWIANIE WYNIKÓW:

Odczytywanie płytek z półpłynnymi hodowlami:

Odczytywać płytki po 7 dniach w następujący sposób: oglądać płytkę pod kątem w obecności kolonii i agregatów. Jeśli są one obecne, zliczyć wszystkie kwadraty dla otrzymania liczby agregatów 1 kolonii na płytce (agregaty = 4-20 komórek na grupę) (kolonię tworzy> 20 komórek na grupę). Jeśli brak jest kolonii lub agregatów, zliczyć wszystkie pojedyncze komórki (linia komórkowa 1WBC pacjentów) w 4 kwadratach i obliczyć średnią Pomnożyć średnią przez 15 x 13,36

182 890 (15 = liczba kwadratów w środkowym rzędzie (13,36=pole płytki). Płytki można odczytywać 5, 6 lub 8 dnia. Rejestrować wszystkie dane w formularzu wynikowym w notacji naukowej. Procedura 4

Oznaczenie ludzkiego interferonu

Interferony są cytokinami, które mają zdolność hamowania wzrostu wirusów i ochrony zainfekowanych komórek przed wirusowymi wpływami cytopatycznymi. Immunoregulacyjne funkcje interferonów, takie jak zwiększanie aktywności limfocytów natural killer (NK), wzrost ilości antygenów zgodności tkankowej i aktywacja działania monocytów/makrofagów i komórek B, mająrównież uwodnione znaczenie kliniczne. Pierwszy naturalny interferon został odkryty przez Isaaca i Lindermana w 1975 r., a zrekombinowany interferon alfa 2 został zarejestrowany przez FDA w 1986 r., dając początek nowej fazie bioterapii. Celem tego oznaczenia jest określenie poziomu interferonu w surowicy pacjenta w jednostkach międzynarodowych/ml. Siła działania interferonu ludzkiego w próbkach surowicy i kontrolach będzie określana przy użyciu WISH zainfekowanych wirusem pryszczycy przez pomiar wpływu cytopatycznego.

WYMAGANIA, POBIERANIE I POSTĘPOWANIE Z PRÓBKAMI

Próbki oznakowuje się następującymi informacjami: 1) nazwiskiem pacjenta, 2) datą pobrania, 3) czasem pobrania, 4) inicjałami osoby pobierającej 5) nazwą testu.

Surowica - wymagana ilość:

Optimum =3,0 ml

Minimum = 1,0 ml

Próbka musi być pobrana aseptycznie do probówki Vacutainer z nakrywką „tygrysią” pozostawiona do skrzepnięcia, a następnie wirowana w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut przy 2000 obrotów na minutę. Następnie surowicę należy przelać do jałowej plastykowej probówki, zamknąć, odpowiednio oznakować i przechowywać zamrożoną do przeprowadzenia oznaczenia.

Plazmafereza - wymagana ilość

Optimum = 3,0 ml

Minimum = 1,0 ml

Próbka musi zostać pobrana aseptycznie do 10 ml probówki Vacutainer z nakrywką o barwie czerwonej z woreczka z osoczem otrzymanego podczas procedury plazmaferezy. Do 10 ml probówki Vacutainer z nakrywką, o barwie czerwonej zawierającej próbkę plazmaferetyczną dodać 2500 jednostek kalcyparyny. Poza wymaganiami podanymi powyżej, próbka powinna być oznakowana numerem woreczka, z którego jąotrzymano, np. #1, #2 itp. Próbka musi być przelana do jałowej plastykowej probówki, zamknięta, odpowiednio oznakowana i przechowywana zamrożona do przeprowadzenia oznaczenia.

WYPOSAŻENIE:

Do tej procedury wymagane jest następujące wyposażenie:

Szafa laminama z ultrafioletem Lodówka 2-8 C

Autoklaw

Waga analityczna

Wirówka z chłodzeniem

Inkubator CO2

Spektrofotometr (czytnik 96-studzienkowych płytek Bio-Rad z filtrem 540 nm)

96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania - jałowe, płaskie dno, z przykrywkami, Falcon 3872

Pipeta pomocnicza

Mikropipety

Octapettes firmy Costar - 50 pl, 100 pl i 200 pl wielokanałowa pipeta Wheaton - zakres 20 - 200pl MLA - 40 pl

182 890

Jałowe jednorazowe:

Pipety (1 ml, 5 ml, 10 ml i 25 ml)

Końcówki do pipet Wheaton 851247

Plastykowe rynienki

Gaza

Fiolki do zamrażania

Zamykane probówki stożkowe o objętości 50 ml

Probówki

Kolby do hodowli (75 cm i 150 cm)

Wycieraczka Kimtex

Puszka i worki na niebezpieczne odpady biologiczne

Miska ze stali nierdzewnej z pokrywą

MATERIAŁY:

Do tej procedury wymagane są następujące materiały:

Podłoże podstawowe Eagle'a 1X (BME), 500 ml, Gibco, nr kat. 320-1010AJ Płodowa surowica bydlęca, 100 ml, Hyclone, nr kat. A-111-D L-Glutamina, nr kat. 320-5030AG

Roztwór buforu Heps (1M) 100 ml, Gibco, nr kat. 380-5630AG

Penicylina/streptomycyna

Komórki WIsH (ludzkiej owodni) ATCC 25-CCL

Wirus pryszczycy ATCC

Ludzki intrferon (alfa), Reference NIAID, nr kat. Ga23-902-530

Kontrolny interferon gamma

Barwnik czerwień obojętna Sigma, nr N-2880

Sól fizjologiczna zbuforowana fosforanami (PBS)

PBS bez Ca++1 Mg++, pH 7,4, Gibco, nr kat. 310-4190AJ

PBS z Ca++ i Mg++, pH 6,8, Gibco, nr kat. 310-4040AJ

Lodowaty kwas octowy, Sigma, nr kat. A-6283

Woda destylowana

Alkohol etylowy, Aldrich, nr kat. 18, 738-0

Surowice pacjentów

One-Stroke Environ, Calgon Vestal, nr 539708

Trypsyna-EDTA 1X, 100 ml, Gibco, nr kat. 610-5200AG błękit trypanowy, Gibco, 6305250AG

PRZYGOTOWYWANIE ODCZYNNIKÓW

Wszystkie podłoża muszą być przesączone w celu wysterylizowania, oznakowane nazwą, datą przygotowania, terminem ważności, informacjami dotyczącymi przechowywania i inicjałami laboranta. Przygotowane podłoża sąstabilne przez trzy miesiące w temperaturze 2-8°C. BME z 15% FBS

Dodać 75 m1 FBS, 5,0 ml penicyliny/streptomycyny, 10 ml glutaminy i 5 ml Hepes do 500 ml butelki BME (do odżywiania komórek WISH).

BME z 10% FBS

Dodać 50 m1 FBS, 2,5 ml penicylmy/streptomycyny, 10 ml glutaminy i 5 ml Hepes do 500 ml butelki BME.

BME z 2% FBS

Dodać 10m1FBS,2,5 ml penicyliny/streptomycyny, 10 ml glutaminy i 5 ml Hepes do 500 ml butelki BME.

Wirus pryszczycy (VSV);

Prygotować dwie kolby, o powierzchni dna 150 cm2, hodowli komórek WISH. Gdy komórki utworzą spójną warstwę, usunąć podłoże. Przemyć raz świeżym BME z 2% FBS. Preparat podstawowy V SV rozcieńczyć 1000 razy BME z 2% FBS. Każdąkolbę komórek WISH zaszczepić 8-10 ml roztworu VSV o rozcieńczeniu 1: 1000, tak aby pokrywał całą warstwę komórkową

182 890

Inkubować kolby w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C w inkubatorze zapewniającym atmosferę 5% CO₂. Do każdej kolby dodać 15 ml BME z 2% FBS i inkubować w temperaturze 37°C w inkubatorze zapewniającym atmosferę 5% CO₂ w ciągu 1-3 dni, lub dopóki warstwa komórek nie wykaże prawie całkowicie cytopatycznego wpływu wirusa (CPE). Zebrać płyn hodowlany i sklarować przez odwirowanie przy 3000 obrotów na minutę w ciągu 20 minut w temperaturze 4°C. Zawierający wirusa supematant dodać do 10 ml probówek i przechowywać w temperaturze -70°C. Ten roztwór podstawowy wirusa zazwyczaj zawiera 1 x 10⁹ jednostek łysinko-twórczych/ml, gdyjego infekcyjnośćjest oceniana na komórkach WISH. Rozcieńczyć BME z 2% FBS jedną 10 ml probówkę roztworu podstawowego VSV 1:10 aby otrzymać roztwór roboczy V SV o stężeniu 1x10⁸ jednostek łysinkotwórczych/ml. W fiolkach do zamrażania przygotować próbki roztworu roboczego VSV o objętości 1 ml i przechowywać w temperaturze -70°C. Należy wykonać rozcieńczenia roztworu roboczego VSV 1:100,1:200 i 1:3θ0 i zaszczepić nimi spójną warstwę komórek WISH w 96-studźienkowej płytce w celu określenia rozcieńczenia, które daje prawie 100% CPE w ciągu 24-48 godzin.

Ludzki interferon alfa (National Institute of Health: nr kat. Ga23-902-530):

Rozpuścić w 1,0 ml jałowej wody destylowanej uważając, aby uniknąć jakiejkolwiek straty materiału w szyjce ampułki. Rozcieńczyć do stężenia 105 IU interferonu/ml BME z 2% FBS (bez pemcylmy/streptomycyny i bez Hepes). W fiolkach do zamrażania przygotować próbki o objętości 200 pi i przechoyywać w zamrażarce o temperaturze -70°C. W temperańzrze tej próbki są stabilne przez dwa lata.

Barwnik czerwień obojętna:

Przygotować 0,1% roztwór podstawowy barwnika czerwieni obojętnej przez dodanie 500 mg sproszkowanego barwnika do 500 ml wody destylowanej. Mieszać na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny. Autoklawować w ciągu 10 minut przy 15 psi. Schłodzić. Oznakować i przechowywać barwnik czerwień obojętną w brązowej butelce w lodówce. Roztwór barwiący - przygotować 15% roztwór barwiący przez dodanie 85 ml PBS z Ca++ o Mg++ (pH 6,85) do 15 ml roztworu podstawowego barwnika czerwieni obojętnej. Roztwór eluujący.

Do 1 ml lodowatego kwasu octowego dodać 49 ml wody destylowanej i 50 ml 100% etanolu. Oznakować i przechowywać w szklanej zamykanej butelce w temperaturze pokojowej. Kontrolny interferon gamma:

Nabyć Actimmune (3,0 x 10⁶ jednostek/ml). Dla otrzymania stężenia 300 jednostek/ml rozcieńczyć 0,05 ml (501) Actimmune 49,95 ml BME z 2% FBS i dobrze wymieszać. Dodać po 10 ml do każdej z 5 jałowych zamykanych probówek i oznakować „roztwór podstawowy IFN gamma”, 3000jednostek/ml, data przygotowania i terminem ważności. (Stabilny w ciągu 2 lat w temperaturze -70°C). Rozcieńczyć 1 ml roztworu podstawowego IFN gamma 9,0 ml BME z 2% BME, aby uzyskać stężenie robocze 300jednestek/ml. W fiolkach do zamrażania umieścić próbki o objętości 200 pl, oznakować i przechowywać w temperaturze - 40°C (stabilne w ciągu 2 lat). Przed skierowaniem do użycia zastosować równolegle z kontrolą bieżącą, aby określić zakres.

PROCEDURA:

Dzień pierwszy:

Utworzyć arkusz roboczy na podstawie bazy danych interferonu dla 24 próbek. Nadać numery w arkuszu roboczym: 1 jako próba odniesienia, próbki od pacjentów 2-25, kontrola interferonu gamma 26 i kontrola interferonu alfa 27. Pobrać próbki od pacjentów, prób odniesienia interferonu i kontrole z zamrażarki. Zweryfikować próbki z arkuszem roboczym. Oznakować dziewięć jałowych 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania numerami próbek (oznaczonych w dwóch powtórzeniach), numerem płytki i datą. Laborant obsługujący płynnąCodowlę zbiera i przemywa dwie kolby o powierzchni dna 150 cm² zawierające spójną warstwę komórek WISH. Próbkę z komórkami oznakowuje się nazwą komórek, numerem pasażu, datąi inicjałami laboranta. Uwaga: numer pasażu komórek WISH powinien być niższy niz P250 Przed osiągnięciem tego pasażu powinno się pobrać z ciekłego azotu komórki pasażu wcześniejszego i rozpocząć płynną hodowlę.

182 890

Przeprowadzić zliczanie komórek w następujący sposób: w 12 x 75 ml probówce połączyć 0,5 ml komórek WISH i 0,5 ml 0,4% błękitem tryptanu (rozcieńczenie 1:2). Dobrze zamieszać i napełnić komorę hemocytometru. Policzyć żywe komórki WISH pod mikroskopem świetlnym w czterech narożnych kwadratach o powierzchni 1 mm² i podzielić przez 4 dla otrzymania średniej na jeden kwadrat. Określić % żywotności przez podzielenie liczby żywych komórek przez liczbę wszystkich komórek i pomnożenie przez sto. Zapisać % w żywotności w arkuszu roboczym zliczania komórek.

Określić liczbę komórek/ml stosując następujące równanie:

średnia liczba żywych komórek/kwadrat X współczynnik rozcieńczenia X współczynnik hemocytometru = komórki/ml

Rozcieńczyć komórki WISH do otrzymania stężenia 3,5x10⁵komórek/ml zgodnie z następującym wzorem:

ViC, = V₂C₂

Na przykład:

Objętość, = 10 ml Stężenie, = 2,0 x 10⁶

ObjętośĆ2 = ? Stężenie2 = 3,5 x 105

ml x 2,0 x 10⁶ komórek / ml _

3,5 x 10⁵ komórek/ml ²

V2 = 229 ml

W celu otrzymania stężenia 3,5 x 105 komórek/ml, do początkowej objętości 40 ml dodać 189 ml BME z 10% FBS. Odstawić na bok rozcieńczone komórki WISH do momentu dodawania do płytek do mikromiareczkowania. Stosując techniki pracyjałowej dodać do każdej studzienki (włącznie ze studzienkami dla prób odczynnikowych) 96 studzienkowych płytek do miareczkowania 100 pl 10% BME. Do studzienek w rzędzie pionowym numer 1, B-G, dodać dodatkowe 60 pl 10% BME. Do studzienek o pozycjach B1i C1 płytki numer 1 (każda próbka będzie wykonana w dwóch powtórzeniach) dodać 40 pl próby odniesienia. Do studzienek o pozycjach D11 E1dodać 40 pl surowicy pacjenta. Do każdej kolejnej pary studzienek dodać 40 pl surowicy odpowiedniego pacjenta. Poza próbkami od pacjentów, na ostatniej płytce oznaczenia przeprowadzić kontrolę interferonu gamma i kontrolę interferonu alfa (próba odniesienia). Wykonać kolejne rozcieńczenia stosując 100 pl pipetę Octapet od rzędu pionowego numer 1 do rzędu pionowego nr 10 i rzędów poziomych B-G przez kilkakrotne mieszanie na dół i do góry , a następnie przeniesienie 100 pl do następnego rzędu pionowego aż do rzędu pionowego numer 10. Z rzędu pionowego numer 10 odrzucić pozostające 100 pl. Do wszystkich studzienek, poza studzienkami prób odczynnikowych, w rzędach poziomych A i H dodać 100 ul komórek WIS H o stężeni u 3,5 x 10⁵ komórek/ml. Na każdej płytce rząd pionowy numer 11 oznaczyć jako kontrolę komórkową, a rząd pionowy numer 12 jako kontrolę wirusową. Inkubować płytki w ciągu 18-24 godzin w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Pozostawić miskę ze stali nierdzewnej zawierającą O-nóStrokó Environ, wycieraczki i gaziki w szafie laminamej ze światłem białym przez noc.

Dzień drugi:

Sprawdzić płytki pod mikroskopem odwróconym pod względem spójności warstwy komórek. Sprawdzić toksyczność surowic pacjentów (czarne krawędzie). Stosując techniki pracy jałowej, zlać podłoża z płytek do miski ze stali nierdzewnej zawierającej OneStroke Environ, osuszyć gazą. Przemyć komórki przez dodanie do wszystkich studzienek, z wyjątkiem studzienek z próbami odczynnikowymi, 100 pl BME z 2% FB S, zlać i osuszyć. D o izęup piooowegn nu182 890 mer 11 dodać 50 pl 2% BME. Do wszystkich studzienek (włącznie ze studzienkami z próbami odczynnikowymi) dodać 100 p2 2% BME. Dw wyzystkics ud^c^^nkk p ρη^Αοη! w rzędacp oknowych numer 1-10 i 12 dodać 50 pl VSV (o stężeniu, które spowoduje 90% CPE w kontroli wirusowej w ciągu 24-48 godzin). Inkubować 24-48 godzin w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Dzień trzeci'.

Sprawdzić płytki pod mikroskopem pod kątem 90-100% CPE w kontroli wirusowej. Poszukać 50% CPE w próbie odniesienia i próbach. Dla próby odniesienia 50% CPE powinien wypaść pomiędzy rzędami pionowymi numer 4 i 6. Inkubować płytki do osiągnięcia tego rezultatu. Umieścić miskę ze stali nierdzewnej kαwizrającąOnz-Steoke Environ razem z wycieraczkami Kimtzx w ilości wystarczającej do osuszania płytek pod przykryciem. Zlać płytki i osuszyć. Do wszystkich studzienek z próbkami dodać 100 pl 15% barwnika czerwieni obojętnej. Inkubować w ciągu 45 minut w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Zlać płytki i osuszyć. Przemyć 200 pl PBS o pH 6,85. Zlać i osuszyć. Płytki przed elucjiąmożna pozostawić na kilka dni do wysuszenia odwrócone na bycierakkkach Kimtex na tacy. Ehiować aekzk dodanie do każdej studzienki z próbką 100 pl roztworu eluującego.

Odczytywać na czytnikach mtkeop^yek z filtrem 540 ran. Z menu wybrać Microman, aby uzyskać dostęp do programu Microalatz Menager. W opcji Analysis wybrać Multiple Readings.

Wybrać:

Single Wavelength

540 nm

Mixing duration - 5 sekund

Reading per plate - 1

Number ofplates -9

Filename - data (tj. 0722)

Usunąć przykrywkę z płytki do mikromiαeecz.kobania numer 1 i płytkę umieścić w czytniku. Wybrać Start. Po odczytaniu wszystkich płytek, wydrukować nie opracowane dane następująco: W opcji File wybrać Open i Lotus Results. Przejść kursorem do filename lub wpisać wfile nazwę i numer płytki. Wybrać Open. Jeśli pojawi się komunikat „Save current results odpowiedzieć NO. Gdy na monitorze pokaże się Raw Data Report, w oakji File wybrać Print. Wybrać Raw Data Report i OK. W opcji File wybrać Close. Powtórzyć dla każdej płytki do wydrukowania.

WYNIKI:

A. Uśrednić wartości gęstości optycznej (O.D.) dla kontroli wirusowej (rząd pionowy numer 11) i kontroli komórkowej (rząd pionowy numer 12).

B. Uśrednić wartości O.D. dla dwukrotnych powtórzeń próbek od pacjentów i próbek odniesienia tj. uśrednić B i C dla każdego z rzędów pionowych numer 1-10, uśrednić D i E dla każdego z rzędów pionowych numer 1-10 itp.

C. Dla określenia O.D. przy 50%»:

X kontroli wirusowych+ X kontroli wirusowych

D. Dla wprowadzenia wartości O.D. i odpowiadających im rokcieńkzeń IFN:

1. Wprowadzić pierwszą średnią O.D., nacisnąć X - Y.

2. Wprowadzić odpowiadające pierwsze rozcieńczenie IFN, nacisnąć LOG, następnie Σ +

3. Wprowadzić drugą średnią O.D., nacisnąć X - Y

4. Wprowadzić drugie odpowiadające rozcieńczenie IFN, nacisnąć LOG, następnie Σ Σ

5. Wprowadzić trzecią średnią O.D., nacisnąć X - Y

6. Wprowadzić odpowiadające trzecie rozcieńczenie IFN, nacisnąć LOG, następnie Σ +

E. Dla określenia współczynnika korelacji (r):

1. Nacisnąć 2nd, następnie CORR (-)

2. Współczynnik korelacji (r) powinien wynieść - 1,0 ± 0,1.

3. Wprowadzić O.D 50%, nacisnąć 2nd, następnie y (X)

182 890

F. Dla przekszatłcenia miana (log 10) w jednostki/ml, nacisnąć IVV, następnie LOG

G. Dla usunięcia danych nacisnąć 2nd, następnie STO, następnie CE/C

H. Dla przekształcenia jednostek IFV/ml w międzynarodowe jednostki odniesiema/ml:

1. jednostki IFN/ml próby odniesienia = współczynnk międzynarodowych jednostek odniesienia/ml próby odniesienia

2. jednostki IFN próbki/ml = współczynnik miana próbki (IRU/ml)

Procedura 5

Chemiowrażliwość komórek ludzkich nowotworowych tworzących kolonie (farmakowrażliwość)

The Human Tumor Colony Assay (HTCA: próba z klonogennymi lub nowotworowymi komórkami macierzystymi) to system hodowli in vitro wykorzystujący półpłynne podłoże nośnikowe, opisany po raz pierwszy przez Salmona, Hamburgera i in. Stosując HtcA można badać wzrost i wrażliwość na chemioterapeutyki klonogennych nowotworowych obecnych w świeżych próbkach z biopsji nowotworów ludzkich. Odkąd tę technikę opisano po raz pierwszy, nastąpił znaczny wzrost bezpośrednich badań nowotworowych ludzkich in vitro. Uzyskano doskonałe dowody, które pozwoliły ustalić, że kolonie rosnące w HTCA składają się z komórek nowotworowych, i że komórki klonogenne w koloniach nowotworowych mają właściwość samoodnawiania się (charakterystyczna właściwość nowotworowych komórek macierzystych). Testowanie wrażliwości na chemioterapeutyki ze specyficznymi antygenami w HTCA udokumentowało uderzający stopień heterogenności pod względem wrażliwości na leki pomiędzy pacjentami, nawet dla nowotworów o tej samej histopatologii. Dokonano klinicznych korelacji pomiędzy wrażliwością na chemioterapeutyki in vitro, a odpowiedzią na chemioterapię pacjentów z przerzutowym rakiem. W serii prób HTCA wykazało 71% wyników rzeczywiście dodatnich i 91 ~ wyników rzeczywiście dodatnich przy przewidywaniu odpowiednio wrażliwości i oporności pacjentów na konkretne czynniki chemioterapeutyczne Oznaczenie wydaje się być zatem czynnikiem prognostycznym, który identyfikuje wrażliwość pacjentów na chemioterapeutyki i który może umożliwić pewną indywidualizację chemioterapii.

Próbki nowotworów, pochodzące albo z masy nowotworów litych albo złośliwego płynu wysiękowego, albo szpiku kostnego homogenizuje się mechanicznie do otrzymania zawiesiny, która jest możliwie najbardziej zbliżona do „zawiesiny pojedynczych komórek” Komórki te, wraz z czynnikami chemioterapeutycznymi, czynnikami modyfikującymi odpowiedź biologiczną i hormonami, zawiesza się w zawierającym agar podłożu hodowlanym, a następnie wylewa lub „wysiewa” na półstałąwarstwę dolną. Dolna warstwa zapobiega przyleganiu normalnych ludzkich fibroblastów, głównego składnika zrębu nowotworowego, do dna szalki hodowlanej, i tworzeniu kolonii, które mogłyby być mylone z koloniami pochodzącymi od komórek nowotworowych. Po 7 dniach, 14 dniach i 21 dniach inkubacji w wilgotnej, wzbogaconej w CO2 atmosferze, w temperaturze 37°C, liczy się kolonie (większe niż 20 komórek) i agregaty (4-20 komórek). Dla każdego nowotworu przeprowadza się kontrolę ujemną i kontrolę dodatnią. Na podstawie tych danych można określić wpływ każdego konkretnego leku na nowotwór.

WYMAGANIA, POBIERANIE I POSTĘPOWANIE Z PRÓBKAMI'

Oznaczenie to można Przeprowadzić wobec następujących typów próbek:

Nowotworów litych otrzymanych podczas operacji chirurgicznych lub biopsji

Biopsji aspiraeyjnych i biopsji szpiku kostnego

Płynów wysiękowych

Płynów opłucnowych

Pfynów z nakłucia klatki piersiowej

Próbka powinna być wystarczająca do otrzymania optymalnego 20 ml żywych komórek o stężeniu 1,0 x 106 komórek/ml. Dopuszczalne jest minimalnie 12 ml żywych komórek o stężeniu 1,0 x ΙΟ*⁵ komórek/ml. Wszystkie próbld powiimy być oznakowane nazwiskiem pacjenta, daaą pobrania, typem nowotworu i inicjałami laboranta.

182 890

MATERIAŁY:

Do tej procedury wymagane są następujące materiały:

Szafa laminarna Bacto-Agar Waga analityczna Papierki do ważenia Naczynka wagowe

Jałowe zamykane butelki (100 ml, 200 ml, 500 ml, i 1000 ml)

Woda destylowana

Kuchenka mikrofalowa

Autoklaw

Podłoża RPMI 1640 (1X i 2X)

HC1 (1N)

Diwęglan sodowy

Penicylina/ streptomycyna

Pipety jednorazowe (jałowe) (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)

Pipeta Select-A-Pette (1 ml)

Końcówki Select-A-Pette (jałowe)

Pipety Eppendor

Końcówki Combitip Eppendorf (jałowe) (2,5 ml, 5,0 ml, 12,5 ml)

Glutamina

Pierwiastki śladowe

2-Merkaptoetanol z PBS Dulbecco

Roztwór ITS

Płodowa surowica bydlęca

Probówki (12 x 75) szklane, jednorazowe; 15 ml zamykane jałowe i jednorazowe Szalki Petri'ego (jałowe) (zwykłe - 100 x 15 mm, kratkowane 35 mm x 10 mm) Jałowe zamykane probówki stożkowe o objętości 50 ml (Falcon)

Homogenizator

Barwnik błękit tryptanu (0,4~)

Hemocytometr ze szkiełkami nakrywkowymi

Mikroskopy (odwrócony, świetlny)

Licznik ręczny

Paski do badania pH (wąski zakres)

Cylindry miarowe (50 ml i 100 ml)

Histopaque -1077

Łaźnia wodna

Pipeta zasysająca Aide

Wirówka z chłodzeniem

Kolby do hodowli płynnych (25 cm2)

Inkubator CO2

Leki chemioterapeutyczne

Czynniki modyfikujące odpowiedź biologiczną

Hormony

Wstrząsarka wirowa

Lodówka (2-10°C)

Skalpel (jednorazowy i jałowy)

Pojemnik na ostre przedmioty

Pipety pasteurowskie 5 3/4' (jednorazowe)

Wkraplacze

Zamrażarka -70°C

Dokładny powierzchniowy środek dezynfekcyjny

182 890

70% alkohol w tryskawce

Środek dezynfekcyjny/czyszczący do szkła Contrad

Termometr (-20°C - 120°C)

Zlewka (500 ml)

Roztwór dezynfekcyjny Betadine

Strzykawki (jednorazowe i jałowe) (1 cm! 10 cm!

Igły (różnej grubości)

PRZYGOTOWYWANIE PODŁOŻY I ODCZYNNIKÓW 4gar

Dolna warstwa=2,5% roztwór roboczy: odmierzyć 2,50 g Bacto-Agaru i umieścić w 100 ml zamykanej butelce. Dodać 100 ml wody destylowanej. Ostrożnie zamieszać.

Górna warstwa =1,5% roztwór roboczy: odmierzyć 1,5 g Bacto-Agaru i umieścić w 100 ml zamykanej butelce. Dodać 100 ml wody destylowanej. Otrożnie zamieszać.

Umieścić obie butelki z poluzowanymi zamknięciami w kuchence mikrofalowej. Ogrzewać w kuchence mikrofalowej w ciągu 60 sekund na pełnej mocy, mieszając co 20 sekund. Unikać wrzenia. Gdy agar będzie gotowy, będzie przejrzysty. Jeśli roztwór zawrze, nie stosować go, ponownie przyrządzić roztwór agaru. Umieścić kawałek taśmy wskaźnikowej do autoklawowania na każdej z luźno zamkniętych butelek i autoklawować roztwory w ciągu 20 minut przy 22 psi. Umieścić obie butelki w łaźni wodnej pod przykryciem. ŁAŹNIA TA CAŁY CZAS MUSI UTRZYMYWAĆ TEMPERATURĘ 45-50°C. Agar powinien przed użyciem ulec schłodzeniu do temperatury 50°C. Przed użyciem dobrze zamieszać agar. Po przygotowaniu każdego podłoża, produkt końcowy oznakować zgodnie z procedurami opisanymi uprzednio.

PODŁOŻA

10% RPMI 1640 (1X)

Ilość Składnik

500,0 ml RPMI 1640 (1X) z L-glutamin

50,0 ml Płodowa surowica bydlęca, kontrolowana jakościowo, maktywowana termicznie 5,0 ml L-glutamina (100X) 200 mM

1.5 ml penicylina/ streptomycyna

2,0 ml mieszanina mikroelementów (100X), liofilizowana 0,5 ml 2nmerkaptoetanol

5,0 ml msulma-traniferyna-selenm sodowy, uzupełnienie do podłoży, liofilizowane, napromieniowane promieniowaniem gamma

Połączyć wszystkie składniki w szafie laminarnej. Wyjałowić przez sączenie stosując sączek błonowy o średnicy porów 0,22 mikrometra z przesączkiem o średnicy porów 60 mikrometrów. Przygotowane podłoże oznakować i przechowywać w temperaturze 2-10°C.

10% RPMI 1640 (2X) wzmocnione G. G:

Ilość Składnik

500,0 ml RPMI 1640 (2X) sproszkowane podłoże do hodowli komórkowych z L-glutaminą (Rozpuścić jedno opakowanie proszku w ogółem 500 ml jałowej WODY DESTYLOWANEJ)

50,0 ml Płodowa surowica bydlęca, kontrolowana jakościowo, inaktywowana termicznie 5,0 ml L-glutamina (100X) 200 mM

2.5 ml penicylina/streptomycyna

2,0 ml mieszanina mikroelementów (100X), liofilizowana 0,5 ml 2-merkaptoetanol

5,0 ml insuliua-tπmsfeΓyia-selenln sodowy, uzupełnienie do podłoży, liofilizowane, napromieniowane promieniowaniem gamma

W szafie laminarnej odmierzyć 450 ml jałowej wody destylowanej i umieścić w jałowej

500 ml butelce na odczynniki. Ostrożnie mieszając, dodać do wody sproszkowane podłoże. Wymyć wnętrze opakowania w celu usunięcia wszystkich śladów proszku. Dodać 1,0 g NaHCO3 na 500 ml podłoża. Rozcieńczyć jałową H₂O destylowanądo objętości 500 ml. pH preparatu dopro182 890 wadzić do 0,2-0,3 poniżej pożądanego końcowego pH roboczego 7,2 (pH zazwyczaj wzrasta o 0,1-0,3 jednostki po sączeniu); zalecane jest stosowanie 1N NaOH lub 1N HC1. Po doprowadzeniu pH trzymać pojemnik zamknięty do momentu przeprowadzania sączenia. Wyjaławiać natychmiast przez sączenie stosując sączek błonowy o średnicy porów 0,22 mtkeomzteów z przesączkiem o średnicy porów 60 mikrometrów (zalecane jest nadciśnienie). Przygotowane podłoże oznakować i przechowywać w temperaturze 2-10°C.

Podłoże podstawowe dolnej warstwy:

125 ml płodowej surowicy bydlęcej

125 ml roztwór 2 X wzmocniony G,G

250 ml roztwór 1X wzmocniony G,G

Zamieszać, oznakować i przechowywać w temperaturze 2-10°C.

Podłoże podstawowe górnej warstwy:

150 ml płodowej surowicy bydlęcej

150 ml roztwór 2 X wzmocniony G,G

150 ml roztwór 1 X wzmocniony G,G

Zamieszać, oznakować i przechowywać w temperaturze 2-10°C.

Przygotowanie leków:

Robocze próbki każdego leku, hormonu i czynnika modyfikującego odpowiedź biologiczną przygotowuje się co dwa tygodnie zgodnie z procedurą. Robocze próbki przechowuje się w temperaturze 4°C i są one gotowe do użycia.

PROCEDURA:

Przygotowanie probówek z podłożem podstawowym dolnej warstwy :

Odaiaetować po 8 ml podłoża podstawowego dolnej warstwy do 15 ml jałowych zamykanych probówek. (UWAGA: określić liczbę potrzebnych płytek mnożąc liczbę testowanego zestawu x 2. Z jednej probówki z podłożem dolnej warstwy można wykonać około 8 płytek) Trzymać zamknięte w temperaturze pokojowej do momentu aż będą potrzebne do przygotowania płytek z dolna warstwą lub przechowywać zamknięte przez noc w temperaturze 28°C do stosowania następnego dnia. Przed użyciem upewnić się czy sąogrzane do temperatury pokoj owej.

Wylać płytki z dolną warstwą w następuj ący sposób (PRACOWAĆ SZYBKO ABY ZAPOBIEC PRZEDWCZESNEJ ZESTALENIU AGARU): Używając jałowej 10 ml pipety pobrać 2,0 ml mieszaniny 2,5 agaru. Dodać 2,0 ml dojednej z 15 ml plastykowych probówek zawierających 8 ml podłoża dolnej warstwy i dwukrotnie zamieszać przez pobieranie i dodawanie do probówki. Pobrać 9,0 ml mieszaniny i dodać po 1,0 ml na każdąz ośmiujałowych kratkowanych płytek o średnicy 35 mm. Zamieszać, aby pokryć dno płytki. Uważać by nie powstały bąble. Pozostawić płytki nieruchomo na płaskiej powierzchni do zestalenia się agaru. Odrzucić każdą płytkę z nierówno rozmieszczonym agarem. Płytki przechowywać w temperaturze pokojowej do użycia tego samego dnia, lub anek noc w temperaturze 37°C w inkubatoekz zapewniającym atmosfer (^2, do stosowania dnia następnego.

Przygotować zawiesinę komórek:

Nowotwór lity: najałowej szalce Petriego, używając jałowego skalpela i pensety, pociąć próbkę nowotworu na kawałki wielkości ziarna grochu. Zachować oryginalne podłoże transportowe do wirowania. Umieścić próbkę w szklanej probówce stożkowej posiadającej luźno dopasowany homogenizator. Dodać 5 ml podłoża transportowego. Delikatnie homogenizować kawałki nowotworu małymi porcjami i przenieść zawiesinę komórek dojałowej 50 ml probówki stożkowej. Kiedy cały nowotwór będzie zhomogenikDwany, dobrze wymieszać, a następnie pozostawić zawiesinę komórek nieruchomo na jedną minutę do osadzenia (umożliwi do osadzenie się bryłek tkanki). Odpipztować supematant do jałowej probówki, rozcieńczyć RPMI 1 X 10% FBS i wirować przy 1600 obrotów na minutę w ciągu 5 minut. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w RPMI 1X z 10% FBS i przeprowadzić zliczanie komórek 1 określanie żywotności.

Nowotwór płynny (płyn wysiękowy, szpik kostny ^.): Stosując jałobąatpztę, odaiaetobαy po 20-25 ml histopaąue do odpowiedniej liczby zamykanych jałowych 50 ml probówek

182 890 stożkowych. Stosując inną jałową pipetę, ostrożnie nawarstwić płyn wysiękowy, szpik kostny lub zawiesinę komórek pod kątem 45° na histopaąue, stosując histopaąue i próbkę w stosunku 1:1. Odwirować przy 1600 obrotach na minutę w ciągu 20 minut w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4°C (hamulec w pozycji 2). Usunąć i odrzucić supematant. Pobrać zawierającą komórki interfazę i umieścić w oznakowanej wcześniej probówce zawierającej RPMI (1X) wzmocnionego G,G. SZYBKO ROZCIEŃCZYĆ KOMÓRKI PODŁOŻEM, PONIEWAŻ HISTOPAQUE JEST BARDZO TOKSYCZNY WOBEC KOMÓREK, JEŚLI SĄ WYSTAWIONE NA JEGO DZIAŁANIE PRZEZ DŁUŻSZY OKRES CZASU. Przemyć komórki dwukrotnie podłożem RPMI 1640 (1X) i wirować przy 1600 obrotach na minutę w ciągu 5 minut, z hamulcem w pozycji 2. Usunąć i odrzucić supematant. Ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml podłoża RPMI 1X.

PRZEPROWADZIĆ ZLICZANIE KOMÓREK:

W 12 x 75 ml szklanej probówce połączyć:

0,1 ml dobrze wymieszanej zawiesiny komórek 0,2 ml 0,4% barwnika błękitu trypanowego 0,7 ml podłoża.

Jest to rozcieńczenie 1:10.

Dobrze wymieszać i napełnić jedną komorę hemocytometru zawiesiną komórek. Pod mikroskopem świetlnym policzyć żywe komórki nowotworowe (te, które nie zaabsorbowały błękitu trypanowego) w czterech narożnych kwadratach o powierzchni 1 mm2. Policzyć całkowitą liczbę komórek nowotworowych (wybarwionych i niewybarwionych) w czterech narożnych kwadratach o powierzchni 1 mm2.

Obliczanie stężenia komórek

Przeprowadzić zliczanie żywych komórek wykorzystując następnie równanie: średnia liczba żywych komórek na kwadrat X współczynnik rozcieńczania X współczynnik hemocytometru. Przykładowe obliczanie: 20 komórek (średnia liczba żywych komórek na kwadrat) X 104 X 10 (współczynnik rozcieńczema) = 2 x 106 komórek/ml.

Obliczyć % żywotności stosując następujący wzór:

%żywych komórek _{<ΛΛ Λ}. , .

-F-²-x 100= % żywotności całkowita liczba komórek

Doprowadzić objętość do potrzebnej dla odpowiedniego stężenia komórek do oznaczenia (to oznaczenie wymaga 1 χ 10⁶ komórek/ml) stosując następujący wzór:

(ViC, = V₂C₂)

Na przykład:

V! = 10 ml V₂ = ?

C, - 2 X 10⁶ komórek/ml C₂ = 1 x 10⁶ komórek/ml

V, C, = v, ml x 2 χ 10⁶ komórek / ml 1 χ 10⁶ komórek/ml ml = V₂ ml -lOml = 10 ml

Należy dodać dziesięć ml podłoża aby uzyskać stężenie 1 χ 10⁶ komórek/ml.

182 890

Przygotować probówki z podłożem górnej warstwy:

Wyjąć i ustawić przygotowane leki przeznaczone do testowania wobec komórek nowotworowych. Oznakować odpowiednią liczbę 15 ml zamykanych probówek nazwami leków. Ustawić probówki w statywie. Wykorzystać poniższą tabelę 3 podczas przygotowywania górnych warstw (wszystki objętości w ml):

Tabela 3

	Podłoże górnej warstwy	Komórki	Leki	1,5% agar
Kontrola	2,1	0,3	—	0,6
Abnn	1,8	0,3	0,3	0,6
Lek 1	1,8	0,3	0,3	0,6
Lek 2	1,8	0,3	0,3	0,6
Lek 3	1,8	0,3	0,3	0,6

Dodać wszystkie, poza agarem, składniki do odpowiednich probówek. Przed przejściem do następnej probówki należy skończyć dodawanie do poprzedniej. Z użyciem 2,0 ml pipety pobrać 0,6 ml 1,5% agaru. Dodać pojedynczo agar do probówek, zaczynając od probówki numer 1. Zamieszać przez dwukrotne wciągnięcie i wydmuchanie. Pobrać 2,2 ml roztworu i dodać 1,0 ml na każdą z kratkowanych szalek (na wierzch drugiej warstwy), uważając by nie powstały bąble w agarze. Płytkę ostrożnie zamieszać, aby umożliwić równomierne rozmieszczenie agaru. Pozostawić nieruchomo dla umożliwienia zestalenia agaru, a następnie dodać około 0,5 ml wody destylowanej do trzeciej „półpłytki” w dużej szalce Petrfego oznakowanej odpowiadającym lekiem. Powtórzyć etapy 5-7 dla każdego testowanego leku. Inkubować hodowle w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze wzbogaconej w 5%o Co2.

Hodowla płynna:

Z pozostałej zawiesiny komórek założyć hodowle płynne w następujący sposób: oznakować dwie kolby do hodowli płynnej o powierzchni dna 25 cm2. Do kolb dodać RPMI 1640 1x, wzmocnione, z FBS oraz zawiesinę komórek w następujący sposób:

Podłoże Komórki cm2 4,0 ml 0,5-1,0 ml

Inkubować hodowle w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze wzbogaconej w 5°% CO2. Zamknięcie pozostawić poluzowane dla wymiany C(O.

Analiza DNA:

Jeśli wymaga tego lekarz, zachować co najmniej 1 ml do analizy DNA (UWAGA: do testowania DNA komórki nie muszą pozostać żywe). Oznakować probówkę nazwiskiem pacjenta, datą rodzajem próbki i numerem i umieścić w zlewce z DNA w lodówce.

Ciekły azot:

Przygotować co najmniej 2 fiolki do zamrażania do długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie, zgodnie z protokołem zamrażania.

Immunomodulacja:

Jeśli wymaga tego lekarz, zachować co najmniej 2,0 ml do oznaczenia i przechowywać w lodówce do czasu przeprowadzenia oznaczenia IM.

Przedstawianie wyników:

W ciągu 24 godzin po nastawieniu oznaczenia farmako wraallwości, odczytywać płytki z kontrolą komórkową i Abrin pod odwróconym mikroskopem. Przejrzeć płytki w całości. Policzyć wszystkie zgrupowania komórek i zapisać w arkuszu roboczym jako zliczenie tła. Zawsze

182 890 przeglądać całąpłytkę pod kątem kolonii i agregatów stosując ręczny licznik do rejestracji liczby obu z nich.

Jeśli nie ma żadnych kolonii lub agregatów, zliczyć liczbę komórek w czterech kwadratach. Podzielić przez 4 dla otrzymania średniej liczby komórek w jednym kwadracie, pomnożyć przez 15, a następnie przez 13,3 6 dla otrzymania liczby komórek na całej płytce o średnicy 35 mm Dla każdej liczby większej od trzycyfrowej, stosować notację naukową przy podawaniu liczby kolonii, agregatów i/lub komórek. Należy wykonać mikrofotografie reprezentowanych kolonii, agregatów i/lub komórek i wpisać je do książki raportowej przed wyrzuceniem płytek. Sprawdzić czy kontrole wypadająw oczekiwanym zakresie. Jeśli nie, udokumentować w części uwagi i bezzwłocznie powiadomić przełożonego. Nie wyrzucać oznaczenia; może to zaakceptować według uznania kierownik d^zs medycznych.

Doświadczenie 1

Aktywność N. sativa wobec komórek szpiku kostnego

Przygotowanie N. sativa

1. Wysuszone nasiona mieli się drobno i 5 gramów (5 g) proszku ekstrahuje się 3 razy 95% etanolem, metodą ekstrakcji Soxhleta. Aparat do ekstrakcji Soxhleta (Wheaton) składa się z 3 części: dolną część stanowi kolba, w której ogrzewany jest 95% etanol; środkową część stanowi ekstraktor; górną część stanowi kondensator Allihna, w którym znajdująsię wpływ i wypływ dla krążącej przez kondensator zimnej wody. Proszek z wysuszonych nasion N. sativa palcuje się w bibułę filtracyjną i umieszcza w ekstraktorze.

2. Zebrane ekstrakty odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem do żądanej objętości 10 ml, nakłada na kolumnę z żelem krzemionkowym (Kiesegel 60; Fluka) i eluuje mieszaniną 95% metanol/woda (9:1). W kolumnie żel krzemionkowy zawieszony w mieszaninie metanol/woda nawarstwia się na piasek. Na górną powierzchnię żelu daje się ekstrakt N. sativa, a następnie rozpuszczalnik eluujący.

3. Aktywne frakcje (wskazane przez brązowy kolor) zbiera się i rozdziela drogąpreparatywnej chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Na dostępne w handlu płytki chromatograficzne nakrapla się pasmo związku aktywnego N. satiwa, a następnie rozwija się je w komorze TLC stosując chloroform jako układ rozpuszczalników.

4. Plamę odpowiadającązwiązkowi aktywnemu, znajdującąsię na froncie rozpuszczalnika usuwa się, eluuje metanolem (w ciągu nocy) i odparowuje pod zmniejszonym ciśnieniem aby uwolnić produkt od alkoholu.

5. Ekstrakt otrzymuje sięjako rozpuszczalny roztwór i przechowuje się go w temperaturze 2°C.

Przybliżona zawartość związku aktywnego w nasionach wynosi 2,2% (wag./wag.).

Obliczenia ilości związku aktywnego w ekstrakcie N. sativa przeprowadzono w następujący sposób: ekstrakt z nasion zawiera 2,2% (wag./wag.) związku aktywnego. Jeden gram nasion dodano do 10 ml podłoża do oznaczeń. Dodano zatem 22 mg związku aktywnego na ml podłoża. Ostatecznie do oznaczenia pobrano z tego roztworu 40 μΐ. akk więc ilość dodanego związku aktywnego wynosiła 88 pg. Następnie wykonano rozcieńczenia 1:10, 1:100 i 1:1000 aby uzyskać stężenie robocze, odpowiednio 8,8 pg, 880 ng, 88 ng.

Oznaczenie jednostek tworzących kolonię

Próbka: Pobrano szpik kostny w ilości wystarczającej do otrzymania optymalnej ilości 5,0 ml komórek jednojądrzastych o stężeniu 1,0 x 106 komórek/ml.

Oznaczenie: Oznaczenie przeprowadzono zgodnie ze zmodyfikowanym sposobem Metcalfa(\ 98^, 1985), włączonym do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Sposób opisano szczegółowo powyżej w Procedurze 2. Do każdej kolby o powierzchni dna 25 cm2 dodano 1x 106 komórek szpiku kostnego, 100 pl ekstraktu roślinnego N sativa i inkubowano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.

Immunofluorescencyjne barwienie komórek: Aseptycznie pobrano komórki krwi obwodowej Do każdego zestawu analiz potrzebne było 3,0 ml pełnej krwi. Oznaczenie przeprowadzono zgodnie ze sposobami ujawnionymi i częściowo zmodyfikowanymi przez Karena (1989) 1 Mer182 890 kela i in. (1987), które włączono do ninieJozógo opisu poprzez odnośniki literaturowe. Sposób ten opisano szczegółowo powyżej w Procedurze 1.

Ekstrakt roślinny N.saliva inkubowano z komórkami krwi obwodowej pacjentów chorych na raka w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C, w inkubatorze zapewniającym atmosferę 5% Co2. Ustawiono bramki markerów powierzchniowych przeciwciał CD3, CD 19, HLADR, LAK CD3+/CD56+, NK CD3-/cD56+, CD38, CD37 i CD33 w Becton Dickinson FacScan numer kolejny 81326. Przeciwciała te są przeznaczone do pomocy przy charakteryzowaniu typów komórek. Termin grupa oznaczenia (CD) stosuje się do grupy dwóch lub więcej przeciwciał monoklonalnych, które wykazują statystycznie podobną ekspresję na komórkach normalnych, nowotworowych i linii komórkowych, jak również charakteryzują się podobnym rozpoznawaniem tego samego antygenu lub miejsca wiążącego (epitopu). Podczas gdy przeciwciała monoklonalne należące dojednej grupy CD zazwyczaj określająróżne epitopy na tym samym antygenie, pewne grupy CD, głównie grupy nielimfoidalne, zawierają przeciwciała monoklonzlme, które nie wiążą się z tym samym antygenem.

Wyniki otrzymane w doświadczeniu 1 porównywano z wynikami otrzymanymi dla czynnków wzrostowych szpiku kostnego i czynników modyfikujących odpowiedź biologiczną, mianowicie GM-CSF, G-CSF, eryt^opoetyny, interferonu, IL-2 i STS.

7,14 i 21 dnia każdą kolbę oglądano pod mikroskopem odwróconym Reichart Jung Biostar. Kolonię definiuje się jako 40 lub więcej komórek przylegających do dna kolby.

Oznaczenia komóokowychjódnootók tworzących kolonię (CFU) przeprowadzone na 1x 106 komórek szpiku kostnego pobranych od 2 pacjentów chorych na raka wykonano z inkubacją i bez inkubacji ze 100 pl ekstraktu roślinnego N. saliva.

Wyniki: Oznaczenie komórkowych jednostek tworzących kolonie, wykonane na 1 x 106 komórek szpiku kostnego po 15 dniach inkubacji ze 100 pl ekstraktu roślinnego, wykazało 600% wzrost. Wzrost ten wynosił 125% po 21 dniach inkubacji. Spośród różnych czynników wzrostowych/czynników modyfikujących odpowiedź biologi«^:^^i^, maksymalny wzrost - 120 i 115%, uzyskano po 15 dniowej inkubacji komórek szpiku kostnego z IL-2 i GM-CSF Nie wystąpiła duża detekcja wzrostu CFU po 21 dniowej inkubacji z czynnikiem wzrostowym/czynnikami modyfikującymi odpowiedź biologiczną. Interferon wykazał niewielki wzrost po 15 dniowej inkubacji, ale po 21 dniach nie stwierdzono znacząco wykrywalnej odpowiedzi.

Ekstrakt N. saliva pomaga odtworzyć komórki immunologicznie kompetentne u pacjentów chorych na raka z wywołaną immunosupresją. Oznaczenie komórkowych jednostek tworzących kolonie wykazało zwiększenie ilości CFU, zarówno gdy komórki szpiku kostnego pochodzące od pacjentów chorych na raka imkubowzno z ekstraktem roślinnym N. saliva, jak i innymi czynnikami wzrostowymi; wskazuje to na fakt, iż ekstrakty roślinne N. sativa naśladują działanie tych kilku czynników wzrostowych. Nawet jeśli ekstrakt roślinny stosowano bez rozcieńczania, nie wykazywał on żadnych toksycznych wpływów wobec ludzkich komórek szpiku kostnego. A zatem, ekstrakt roślinny N. sativa pomaga odtworzyć komórki immunologicznie kompetentne u pacjentów chorych na raka z wywołaną immunosupresję i w znacznym stopniu stymuluje szpik kostny u normalnych osobników.

Doświadczenie 2

Zależność pomiędzy zwiększeniem ilości komórek immunologicznie kompeleninych/wzrosiem hemopoezy a ekstraktem N. saliva.

Testowanie czynników immunomodulacyjnych

Testowanie czynników immnnDmodulzcyjnych określa aktywność surowicy i krwinek białych pacjenta w odniesieniu do interferonu, interleukiny i limfokirny, wykazując obecność w procedurze doświadczalnej czynnika hamującego interferon i czynnika hamuj ącego limfokinę. Szczegółowy opis testowania czynników immunomodulacyjnych znajduje się powyżej w procedurze 3.

W celu zbadania ewentualnej zależności pomiędzy zwiększeniem ilości komórek immunologicznie kompetentnych/wzrostem hemopoezy a ekstraktem N. saiiva, analizowano metodą

182 890 automatycznej cytometrii przepływowej, jak opisano powyżej w procedurze 3, różne markery powierzchniowe komórek immunologicznie kompetentnych.

Wyniki wskazuj^na zwiększenie się populacji CD19, HLADR, NK CD3-/CD56+ i CD38. Nie stwierdzono zmian wskaźnika markerów powierzchniowych CD3, CD37 i CD33. Po inkubacji w ciągu 7 dni, w temperaturze 37°C, w inkubatorze zapewniającym atmosferę 5% CO2, z surowicąpacjentów chorych na raca i ekstraktem Nsativa, obserwowano proliferację komórek tkanki łącznej U.

Linia komórkowa: Mysie komórki tkanki łącznej L929 otrzymano z ATCC i hodowano w podłożu MEM (GIBCO) z 20% końskąsurowicąpłodową(BioWhtttaker), jak opisano powyżej.

Oznaczenie: Oznaczenie przeprowadzono zgodnie ze sposobem Medenica i in. (1990), włączonym do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy. Proliferację komórek L o stężeniu 5 x 10⁵/ml sprawdzano stosując procedurę wykorzystującą dwuwarstwowe podłoże agarowe. Dolna warstwa 1,5% podłoża agarowego zawiera 125 ml FBS, 125 ml roztworu 2X, wzmocnionego G.G. i 250 ml roztworu IX, wzmocnionego G.G. Górna warstwa podłoża zawiera 150 ml FBS, 150 ml roztworu 2X, wzmocnionego G.G i 150 ml roztworu IX, wzmocnionego G.G. Do 2,0 ml podłoża górnej warstwy dodano 0,1 mł ekstraktu N. sativa, 0,3 ml komórek L' 1 0,6 ml 1,5% egeru, uzyskując łącznie objętość 3,0 ml. Wzrost komórek V analizowano po 7 dniach inkubacji w temperaturze w temperaturze 37°C, w atmosferze CO2, wykorzystując mikroskop odwrócony typu Reichert Jung biostar.

Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 4.

Tabela 4

Inkubowana mieszanina	Liczba komórek	% wzrostu
komórki 'L' + podłoża	2,0 x 10⁴	0
komórki 'L' + IFN + podłoża	2,7 x 10⁴	35
komórki 'L' + IL-2 + podłoża	2,3 x 10⁴	15
komórki 'L' + surowica + ekstrakt roślinny	4,7 x 104	135
komórki 'L' + białe krwinki + ekstrakt roślinny	7,4 x 104	270

Komórki tkanki łącznej 'L' w stężeniu 5 x 105 inkubowano z IFN, IL-2 lub ekstraktem roślinnym w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w inkubatorze w ciągu 7 dni.

Odchylenie standardowe wyników było < 10%.

Wyniki: Jak przedstawiono na figurze 1, komórki krwi obwodowej pacjentów chorych na raka po inkubacji z ekstraktem N. sativa w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C, w inkubatorze zapewniającym atmosferę 5% CO2 wykazywały przyrost populacji CD 19, HLADR, NKCD3-/CD56+ i CD38. Wskaźnik markera powierzchniowego cD 19 wykazywał 90% przyrost w porównaniu z kontrolą, a populacją HLADR, NKCD3-/CD56+ i CD38 wykazywały, odpowiednio, przyrost 44, 38 i 5%. Nie stwierdzono zmian w populacji CD3.

Raczej podawanie ekstraktu N. sativa, niż zwiększenie ilości komórek immunologicznie kompetentnych, pomagało uwalniać miejsca wiązania antygenu nowotworowego na komórkach B, tym samym zwiększając populacje CD19 i związanych komórek. Dane otrzymane z analizy metodącytometrii przepływowej wskazuj ąna przyrost populacji CD19, HLADR, NKCD3-/CD56+ i CD38. Nie stwiendono zmian pod względem wslkaźmka maakeerw powleikźhcieooyh CD3, CD3 7 i CD3 3. Dane te wskaźująwyraźnie na proliferację komórek immunologicznie kompetentnych, głównie odpowiedzialnych za odpowiedź humor aanąwobec antygenów nowotworowych. Dlatego też, raczej podawanie ekstraktu N. sativa, niż zwiększenie ilości komórek immunologicznie kompetentnych, pomaga uwalniać miejsca wiązania antygenu nowotworowego na komórkach B, tym samym awleSZsoaJ ks popupop u CD 19 i Dwiązmych nomóeea. Wikzania antyganu nowono!182 890 rowego na komórkach B pomaga raczej, poprzez zwiększanie ilości CD 19 i populacji związanych komórek, ekstrakt N sativa niż wzrost liczby komórek immunologicznie kompetentnych.

Komórki tkanki łącznej TL' w stężeniu 5 x 10⁵po inkubacji z ekstraktem roślinnym N. sativa i surowic /krwinkami białymi pacjenta wykazywały przyrost ilości. Ilość komórek TL' po inkubacji z samym podłożem wynosiła 2,0 x 104, i wzrosła do 4,7 x 104 i 7,4 _χ 104 po inkubacji z, odpowiednio, surowicąpacjenta chorego na raka i ekstraktem roślinnym oraz krwinkami białymi i ekstraktem roślinnym. Jak przedstawiono w tabeli 4 (supra), wskazuje to na przyrost, odpowiednio, 135 i 270%. Z drugiej strony interferon i interleukina-2 spowodowały niewielkie przyrosty, tylko 35 i 15%, po inkubacji z komórkami U w stężeniu 5 x 105w takich samych w-runkachjak w przypadku ekstraktu roślinnego N. sativa.

Badanie działania immunomodulacyjnego wykazało zwiększoną proliferację komórek tkanki łącznej TL' w obecności ekstraktu N. sativa, w porównaniu zjego brakiem, co wskazuje na pozytywny wpływ immunomodulacyjny ekstraktu. Podobne wyniki otrzymano również dla krwinek białych pacjenta.

Dane wskazują na obecność czynnika hamującego interferon (HF) w surowicy pacjenta chorego na raka i dlatego nie stwierdzono proliferacji komórek L' po inkubacji z samą surowicą pacjenta. Inkubacja z ekstraktem roślinnymN. sativa zahamowała IIF i czynnik hamujący limfokiny (LIF) w surowicy pacjenta i dlatego proliferacja komórek TL' uległa wzmocnieniu. IIF nie można wykryć przeciwciałami skierowanymi przeciw inteferonowi.

HF jest czynnikiem, który uniemożliwia wytwarzania autologicznego (własnego) interferonu przez organizm ludzki. Kiedy czynnik indukujący inicjuje wytwarzanie interferonu, organizm ludzki wytwarza inne białko, uniemożliwiające wytwarzanie interferonu. LIF obejmuje wszystkie czynniki hamujące aktywność cytokin, włącznie z interferonem.

Podwyższona stymulacja komórek tkanki łącznej, przez zmniejszenie ilości HF i LIF, umożliwia organizmowi ludzkiemu wytwarzanie własnego interferonu, który następnie zakłóca kontrolowanie wytwarzania komórek tkanki łącznej. Dlatego też N. sativa może znaleźć potencj alne zastosowanie w leczeniu chorób tkanki łącznej, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń i choroby autoimmunologiczne.

Doświadczenie 3

Cytopatyczne wpływy wirusa pryszczycy

Linia komórkowa: Ludzkie komórki owodniowe „WISH” otrzymano z kolekcji American Type Celi Culture (ATCC) i hodowano w podstawowym podłożu Eagle'a (BEM) (GIBCO) z 15% płodową surowicą bydlęcą.

Wirus: Wirus pryszczycy (VSV) otrzymano z ATCC. Roztwór podstawowy VSV rozcieńczono 1000 X podłożem BEM zawierającym 2% płodową surowicę bydlęcą (FBS).

Oznaczenie: Oznaczenie wykonano jak opisano powyżej w procedurze 4. W celu określenia stopnia ochrony komórek „WISH” przez ekstrakt roślinny N. sativa, pełny wpływ cytopatyczny wirusa (CPE) obliczono przez zaszczepienie każdej kolby z komórkami WISH (zawierającej

3,5 x 105 komórek/ml) 8-10 iml roztworu VSV o rozcieńczeniu 1: 1000 tak, że całkowicie pokrywał on warstwę komórek. Kolby inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C w inkubatorze zapewniającym atmosferę 5% Co₂. Do każdej kolby dodano 15 ml BMEM z 2% płodową surowicą bydlęcą i inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze zapewniającym atmosferę 5% Co2 w ciągu 1-3 dni lub do momentu, gdy warstwa komórek zaczęła wykazywać pełny cytopatyczny wpływ wirusa (CPE). Wykonano kolejne rozcieńczenia ekstraktu roślinnego N. sativa w 96-studzienkowej płytce z polistyrenu. Do 40 pl ekstraktu roślinnego N. sativa dodano 100 pl zawiesiny komórek WISH o stężeniu 3,5 x 105 komórek/ml i płytki inkubowano w ciągu około 18-24 godzin w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Do kontrolnych studzienek ekstraktu me dodano. Następnego dnia (po 18-24 godzinach) płytki oglądano pod mikroskopem Nikon TMS pod kątem spójności warstwy komórek. Dodano 50 pl VSV (w stężeniu dającym 100% CPE) i inkubowano w ciągu 24-48 godzin w temperaturze 37°C w atmosferze 5% Co₂.

Następnego dnia płytki oglądano pod mikroskopem Nikon TMS pod kątem 100% CPE w studzienkach kontrolnych z wirusem. Jeśli uzyskano zadowalający wynik, płytki zlano i osu36

182 890 szono bibułą. Do wszystkich studzienek dodano po 100pl 15% barwnika czerwieni obojętnej. Studzienki inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze zapewniającym atmosferę 5% CO₂w ciągu 45 minut. Płytki zlano, osuszono bibułą i przemyto 200 μ PBS o pH 6,85. Płytki znów zlano i osuszono bibułą. Komórki eluowano przez dodanie do każdej studzienki 100 μΐ utworom eluującego. Płytki odczytywano stosując czytnik do mikropłytek BioRad model 3550.

Najpierw określono stężenie wirusa pryszczycy (VSV), które powodowało 100% wpływ cytopatyczny (CPE) na ludzkie komórki owodniowe „WISH”; wynosiło ono 1 x 10⁵ jednostek łysinkotwórczych. Następnie określono optymalną ochronę komórek WISH zapewnianą przez ekstrakt N. saiiva przez wykonanie kolejnych rozcieńczeń ekstraktu N. sativa i dodanie ich pomiędzy komórki WISH i VSV.

Wyniki: Wyniki przedstawione na figurze 2 wska^ji^na ochronę komórek „WISH” rzędu 25 i 65% po inkubacji z ekstraktem roślinnym N. sativa o rozcieńczeniu 1:10 i 1:100. Nie stwierdzono zauważalnego wpływu cytopatycznego jeśli N. sativa dodano w rozcieńczeniu 1:1000. Przybliżone stężenia związku aktywnego obliczano zgodnie z materiałami i metodami. Poziomy interferonu w surowicy mierzono po dodaniu ekstraktu roślinnego zgodnie ze zmodyfikowaną procedurą Fintera (1969).

Ochronę ludzkich komórek owodniowych „WISH” przed cytopatycznymi wpływami wirusa pryszczycy (VSV) obserwowano po podaniu ekstraktu roślinnego N. sativa rozcieńczonego 1:1000. Odpowiadało to ilości związku aktywnego równej 88 ng. Teoretycznie, pacjent ważący 70 kg posiada około 7 x 10ⁿ komórek w swoim organizmie i N. sativa będzie użyteczna do ochrony przed atakiem wirusa w rejonach jego endemicznego występowania w dawce 20-40 g. Po podaniu ekstraktu stwierdzono wzrost poziomu lnterferono w surowicy i dlatego N. sativa wykazuje podobną do interferonu aktywność przeciwwirusową. Ekstrakt prawdopodobnie blokuje wszystkie miejsca receptorowe na komórkach „WISH”, które mają zasadnicze znaczenie dla łączenia się wirusa z błona komórkową.

Doświadczenie 4 Oznaczenie farmakowrażliwości

Próbki nowotworów mogą być dwóch rodzajów: nowotwór lity i nowotwór płynny.

Nowotwór lity: Pobrano próbkę nowotworu ważącą2 gramy, pocięto na porcje wielkości ziarna grochu i ostrożnie zhomogenizowano w homogenizatorze Pottera-Elvehjama z 10% FBS, odwirowano przy 1600 obrotach na minutę w ciągu 20 minut w wirówce z chłodzeniem do temperatury 4°C Mistral 30001. Komórki ostatecznie zawieszano w podłożu RPMI 1640 z 10% FBS do uzyskania dobrze rozdrobnionej zawiesiny.

Nowotwór płynny: Próbkę pobrano z płynu wysiękowego pacjenta chorego na raka. Płyn wysiękowy ostrożnie nawarstwiano na histopaque, stosując hlstopaąue i próbkę w stosunku 1:1. Następnie odwirowano przy 1600 obrotach na minutę w ciągu 20 minut w wirówce z chłodzeniem do temperatury 4°C Mistral 30001. Komórki ostatecznie zawieszono w podłożu RPMI 1640 z 10% FBS.

Oznaczenie: Oznaczenie przeprowadzono zgodnie ze zmodyfikowanymi sposobami Von Hoffa i in. (1981) i Salomona i in. (1978), włączonymi do niniejszego opisu j ako odnośniki literaturowe, jak opisano powyżej w procedurze 5.

Przeciwnowotworową aktywność N. sativa sprawdzano na dwuwarstwowym podłożu agarowym. Dolnąwarstwę roztworu roboczego ciepłego 2,5% Bacto-agaru nalano do kratkowanych płytek Petrfego o śr^dnis^^y 35 mm. Płytki pozostawiono następnie nieruchomo na płaskiej powierzchni do zastygnięcia agaru. Do 2,1 ml podłoża górnej warstwy zawierającego 150 ml FBS, 150 ml roztworu 2X, wzmocnionego G.G. i 150 ml roztworu 1X, wzmocnionego G.G., dodano 0,3 ml komórek nowotworowych i 0,6 ml 1,5% agaru.

Górną warstwą ostrożnie nawarstwiano na górnej powierzchni dolnej warstwy w kratkowanej płytce Petrfego o średnicy 35 mm. Jako kontrole stosowano próbki rosnące bez ekstraktu i z 'Abnn'. Wzrost komórek nowotworowych w obecności ekstraktu roślinnego monitorowano po 7, 14 i 21 dniach inkubacji w temperaturze 37°C i atmosferze 5% CO2; w tych dniach komórki liczono pod odwróconym mikroskopem ReichertτJoug biostar. Komórki z próbek no182 890 bOtwDrów [8,2 x 10⁴] hodowano z podłożem/Abrm/zkstraktzm roślinnym na dwuwarstwowym podłożu agarowym i inkubowano w inkubatorze w ciągu 7,14 i 21 dni w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2.

Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 5.

Tabela 5

Inkubowana mieszanina	Czas inkubacji
	7 dni	% hamowania	14 dni	% hamowania	21 dni	% hamowania
komórki nowotworowe + podłoże	8,2 x 10⁴	0	10,0 x10⁴	0	10,5 x 104	0
komórki nowotworowe + Abrin	8,1 x 10⁴	1,2	9,8 x 104	2,0	10,3 x 104	1,9
komórki nowotworowe + ekstrakt	5,3 x 10⁴	35,0	5,4 x 104	46,0	5,5 x 10⁴	48,0

Odchylenie standardowe wyników wynosiło < 10%. Procent hamowania obliczono jak opisano w Materiałach i Metodach.

Wyniki analizowano w oparciu o oznaczenie farmakoMażlwości, monitorując wzrost komórek nowotworowych. Aktywność pikeciwnowDtworowąstwierdzDno po 7,14 i 21 dniach inkubacji z ekstraktem roślinnym. Tak więc N. sativa ma wizlosteDnnz, wolne od wpływów toksycznych działanie lecznicze wobec raka.

Wyniki: Próbki nowotworów (2 gramy) pochodzące zarówno z masy nowotworu litego, jak i złośliwego płynu wysiękowego homogenizowanego mechanicznie do otrzymania zawiesiny zawierającej 8,2 x 10⁴ komórek. Inkubacja komórek nowotworowych z ekstraktem roślinnym N. sativa w 3 7°C w inkubatorze w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w ciągu 7,14 i 21 dni wykazała procent hamowania, odpowiednio 35,46 i 48. Inkubacja z Abrin w idealnie podobnych warunkach nie wykazała żadnego zauważalnego hamowania.

N. sativa pobudza aktywność aezeciwnowDtwΌrową. Dane z testowania fa^akowraihwości wskazują na arzecibnowDtworową aktywność ekstraktu roślinnego N. sativa, ponieważ wzrost komórek w hodowli był hamowany w zakresie pomiędzy 25-90%. Podobne wyniki uzyskano w badaniach nowotworów in vitro z zastosowaniem testu szybkiego wykrywania farmakowrażliwości, w którym komórki inkubowano z ekstraktem roślinnym N. sativa dały podobne wyniki. Tak więc ekstrakt ma działanie przeciwnowotworowe głównie wobec typów czerniaka i raka okrężnicy. Ekstrakt roślinny N. sativa niszczy komórki nowotworowe i pozostawia normalne komórki niznaruszonz, prawdopodobnie ze względu na swoją zdolność do wiązania z asialofetuiną (lektyna) na powierzchni komórek chorych, co powoduje agregację i zlepianie się komórek nowotworowych. Blokuje on także enzymy i niewłaściwe produkty genów zaangażowanych w syntezę i metabolizm kwasów nukleinowych.

Zrozumiałe jest, że wynalazek nie jest ograniczony do konkretnego ujęcia i układu tu opisanego, ale obejmuje takie jego zmodyfikowane postacie, które obejmują zastrzeżenia patentowe.

182 890

BIBLIOGRAFIA

Agarwal, R, Kharya, M.D., i Shrivastava, R, 1979, „Anti-microbial anthelmintic activities of the essential oil of Nigella sativa Linn 'Indian J. Exp. Biol. 17, 1264.

Akhtar, M.S., Riffat, S., 1991, „Field Trial of Saussurea Lappa Roots Against Nematodes and Nigella Sativa Seeds Against Cestodes in Children”, JPMAJPakMed Assoc 41 (8) 185-7 al-Awadi, F.M., Khattar, M.A. i Gumaa, K.A., 1985, „On the Mechanism ofthe Hypoglycemic Effect of a Plant Extract”, Diabetologia 28,432-434.

al-Awadi, F.; Fatania, H., Shamte, U., 1991, „The Effect of a Plants Mixture Extrakt on Liver Gluconeogenesis in Streptozotocin Induced Diabetic Rats”, Diabetes Res (Scotland) 18 (4): 163-8.

Aruna, K., Sivaramakrishnan, V.M., 1990, „Plant Products as Protective Agents Against Cancer”, Indian J Exp Biol 28 (11):1008-11.

Aruna, K., Sivaramakrishnan, VM., 1992, „Anticarcinogenic Effects ofSome Indian Plant Products”, Food Chem Toxicol (England) 30 (11) 953-6.

Bitterman, W.A.; Farhadian, H., Abu Samra, C., Lemer, D., Amoun, H., Krapf, D,. Makov, U.E., 1991, „Environmental and Nutntional Factors Significantly Associated with Cancer ofthe Urinary Tract among Different Ethnic Groups”, Urol Clin North Am 18 (3)501-8.

Chopra, RN. Chopra, I.C., Handa, K.L., i Kapur, L.D., 1982, Indiaenous Drags of India,Academic Publishers; Kalkuta, Indie.

Datta, A.K., Biswas, A.K. and Ghosh, PD., 1983, „Chromosomal vanations in callus tissues of two species of Nigella sativa, L. ”, The nucleus 26 (3) 173-177.

Elkadi, A.; Kandil, O., 1987, „The Black Seed Nigella sativa and Immunity Its Effects on Human Cell Subsets, „Fed Proc 45 (4) 1222.

Finter, N.B., 1969, „Dye Uptake Methods for Assessing Viral Cytopathogenicity and Their Application to Interferon Assays”, J. Gen Virol. 5,419-427.

Karen, D.F., 1989, „Flow Cytometry in Clinical Diagnosis”, American Society of Clinical Pathology . Kirtikar, K.R. i Basu, B.D., 1982, Indian Medicinal Plants Vol. I, Bishen Singh i Mahendra Pal Singh, wyd. Dehra Dun, Indie.

Kumar, B.H. i Thakur, S.S., 1989, Effect of Certain Nonedible Seed Oils on Growth Regulation in Disdercus Similis (F)”, J. Anim. Mornhol. PhysioL 36 (2) 209-218.

Medenica, R, Alonso, K., Huschart, T. i Tyler, K., 1990, „Tumor Tissue Culture for Determining Efficient Drug for Intra-Artenal, Intra-Hepatic Chemotherapy and Interferon of Colon Carcmoma Liver Metastasis”, skrót z konferencji pt. Combining BRM with Cytotoxic in the Treatment of Cancer.

Merkel, D.E., Dressier, L.G. i McGuire, W. L., 1987, „Flow Cytometry Cellular DNA Contents and Prognosis in Human Malignancy”, J. of Clinical Oncoloqy, 5, 1690-1703.

Metcalf, D., 1984, Clonal Culture ofHematopoietic Cells, Elsevier/North American Biomedical Press.

Metcalf, D., 1985, „The Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factors,” Science 229, 16-22.

Nadkami, K.M., 1976, „Crocus sativus, Nigella sativa, Indian Materia Medica, K.M Nadkami (ed) Bombay, India; Popular Prakashan, Vol 1, 386-411.

Nair, S.C.; Salomi, M.J.; Pantkkar, B.; Pannikar, K.R., 1991, „Modulatory Effects of Crocus sativus and Nigella sativa Extracts on Cisplatin-Induced Toxicity in Mice”, J Ethnopharmocol 31 (1):75-83.

182 890

Salmon, S.E.,Hamburger, A.W., Soehnlein, B., 1978, „Quan-titation ofDifferential Sensitivity of Human Tumor Stem Cells to Anticancer Drugs”, N. Eng. J. Med. 298,1321-1327.

Salomi, N.J., Nair, S.C., Jayawardhanan, K.K.,Varghese, C.D., Panikkar, K.R., 1992, „Anititumour Principles from Nigella sativa Seeds”, Cancer Lett 63 (1): 41-6.

Salomi, M.J., Nair, S.C., Panikkar, K.R., 1991, „Inhibitory Effects of Nigella sativa and Saffon (Crocus Sativus) on Chemical Carcmogenesis in Mice”, Nutr Cancer 16(1): 67-72.

Sayed, M.D., „Traditional Medicine in Health Care”, 1980, J Ethnopharmocol 2 (1): 19-22.

Shayeb, N.A. i Mabrouk, S.S., 1984, „Utilization of Some Edible and Medicinal Plants to Inhibit Aflatoxin Formation”, Nutrition Reports International 29 (2).

Siddiqui, M.B., Alam, M.M., Husain, W. i Sharma, G.K., 1988, „Ethno-medical Study of Plants used for Terminating Pregnancy”, Fitoterapia V. LIX, no. 3,250.

Salmon. S.E., Hamburger, A.W., Soehnlein, B., i inni, 1978, „Quantitation of differential sensitivity of human tumor stem cells to anticancer drugs”, N Eng! J Med 298:1321-1327.

Snvastava, K.C., 1989, „Extracts from Two Frequently Consumed Spices—Cumin (Cuminum cyminum) and Turmeric (Curcuma Longa)—Inhibit Platelet Aggregation and Alter Eicosanoid Biosynthesis in Human Blood Platelets”, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 37 (1) 57-64.

Tennekoon, K.H., Jeevathayaparan, S., Kumkuliosooriya, A.P., Karunayake, E.H:, 1991, Possible Hepatotoxicity of Nigella sativa Seeds and Dregea Volubilis Leaves”,, J Ethnopharmocol 31 (3):283-9.

Vihan, V.S. i Panwar, H.S., 1987, „Galactopoietic Effect of Nigella sativa (H-Kalonji) in Clincial Cases of Agalactia in Goats”, Indian Vet J.64, 347-349.

Von Hoff, D.D., Cowan, J., Harris, J. i Reisdof, G., 1981, „Human Tumor Cloning: Feasibility and Clinical Correlattons”, Cancer Chemother Pharmacol. 6, 265-271.

182 890

FIG. 2

182 890 ω w

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania środka farmaceutycznego na bazie ekstraktu z rośliny Nigella sativa polegający na ekstrakcji nasion tej rośliny, wyodrębnianiu substancji czynnej z uzyskanego ekstraktu i formułowaniu substancji czynnej ewentualnie w połączeniu z zaróbką i/lub substancjami pomocniczymi, znamienny tym, że nasiona ekstrahuje się C_t-C₄-alkoholem i formułuje się dawki jednostkowe zawierające substancję czynną w ilości 20 - 40 g.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako C_rC₄-alkohol stosuje się etanol.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że formułuje się dawki jednostkowe zawierające substancję czynną w ilości 30 g.