PL183432B1 - Ksylanaza, wydzielona i oczyszczona sekwencja nukleotydowa DNA, wektor, drobnoustrojowa komórka gospodarz, sposób wytwarzania ksylanazy, sposób degradacji ksylanu i sposób delignifikacji - Google Patents

Ksylanaza, wydzielona i oczyszczona sekwencja nukleotydowa DNA, wektor, drobnoustrojowa komórka gospodarz, sposób wytwarzania ksylanazy, sposób degradacji ksylanu i sposób delignifikacji

Info

Publication number
PL183432B1
PL183432B1 PL95312962A PL31296295A PL183432B1 PL 183432 B1 PL183432 B1 PL 183432B1 PL 95312962 A PL95312962 A PL 95312962A PL 31296295 A PL31296295 A PL 31296295A PL 183432 B1 PL183432 B1 PL 183432B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
xylanase
leu
asn
asp
thr
Prior art date
Application number
PL95312962A
Other languages
English (en)
Other versions
PL312962A1 (en
Inventor
Vidar Grönberg
Simon Forster
Dean Moody
Diane P. Williams
Sara Iverson
Roberta L. Farrell
Peter L. Bergquist
Roy M. Daniel
Hugh W. Morgan
Wilhelmus J. Quax
Margareta A. Herweijer
Brian E. Jones
Original Assignee
Bergquist Peter Leonard
Daniel Roy Mciver
Farrel Roberta Lee
Simon Forster
Gistbrocades Bv
Groenberg Vidar
Herweijer Margareta Adriana
Sara Iverson
Jones Brian Edward
Dean Moody
Morgan Hugh William
Quax Wilhelmus Johannes
Williams Diane P
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bergquist Peter Leonard, Daniel Roy Mciver, Farrel Roberta Lee, Simon Forster, Gistbrocades Bv, Groenberg Vidar, Herweijer Margareta Adriana, Sara Iverson, Jones Brian Edward, Dean Moody, Morgan Hugh William, Quax Wilhelmus Johannes, Williams Diane P filed Critical Bergquist Peter Leonard
Publication of PL312962A1 publication Critical patent/PL312962A1/xx
Publication of PL183432B1 publication Critical patent/PL183432B1/pl

Links

Classifications

    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C9/00—After-treatment of cellulose pulp, e.g. of wood pulp, or cotton linters ; Treatment of dilute or dewatered pulp or process improvement taking place after obtaining the raw cellulosic material and not provided for elsewhere
    • D21C9/10—Bleaching ; Apparatus therefor
    • D21C9/1026—Other features in bleaching processes
    • D21C9/1036—Use of compounds accelerating or improving the efficiency of the processes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Braking Arrangements (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

1. Ksylanaza posiadajaca w temperaturze co najmniej 80°C i przy pH 9 znaczaca akty- wnosc delignifikacyjna charakteryzujaca sie tym, ze posiada sekwencje aminokwasowa wy- kazujaca co najmniej 70% identycznosc i pelna sekwencje aminokwasowa SEQ ID nr 13. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest ksylanazą wydzielona i oczyszczona sekwencja nukleotydowa DNA, wektor, drobnoustrojowa komórka gospodarz, sposób wytwarzania ksylanazy, sposób degradacji ksylanu i sposób delignifikacji. Przedmiotem wynalazku są zwłaszcza enzymy stanowiące termostabilne ksylanazy. Ksylanazy takie wytwarzane są przez anaerobowe
183 432 bakterie termofilowe. Ksylanazy znajdują zastosowanie w warunkach wykorzystywanych w przemyśle papierniczym, to znaczy przy pH powyżej 9 i w temperaturze ponad 70°C,; w szczególności enzymy wykazują aktywność w 80°C.
Ksylan jest składnikiem hemicelulozy roślinnej. Ksylan zawiera szkielet 1,4-gIikozydowo połączonej β-D-ksylozy. Zazwyczaj ksylany zawierają boczne łańcuchy lub grupy zawierające ksylozę i inne pentozy, heksozy, kwasy uronowe i grupy acetylowe.
W procesie produkcji papieru istotny etap stanowi bielenie masy celulozowej. Schematycznie proces wykorzystywany do obróbki masy celulozowej w przemyśle papierniczym przeprowadzany jest w następujący sposób:
Masę celulozową poddaje się obróbce przy pH 10-12 w 80°C w celu usunięcia większości ligniny w tak zwanym etapie delignifikacji tlenowej. Uzyskana masa celulozowa zawiera 2-5% ligniny. Lignina ta nadaje masie celulozowej brunatne zabarwienie. W związku z tym przeprowadza się wielostopniowe bielenie masy celulozowej. W takim procesie bielenia stosuje się chemikalia takie jak chlor, ditlenek chloru, nadtlenek wodoru i/lub ozon, aby uzyskać jasną masę celulozową do produkcji papieru o wysokiej jakości.
W procesie bielenia często stosuje się chlor i chemikalia zawierające chlor. Jednak w związku z tym, że zastosowanie takich chemikaliów prowadzi do powstawania dioksyny i innych chlorowanych związków organicznych, stwarzają one zagrożenie dla środowiska. Z tego względu istnieje rosnąca tendencja pomijania zastosowania chemikaliów powodujących powstawanie tego typu produktów odpadowych.
Rozwija się tendencja opracowywania procesów bezchlorowych, całkowicie bezchlorowego (TCF) i zasadniczo bezchlorowego (ECF). W procesach tych do bielenia stosuje się nadtlenek wodoru lub ozon. Jednakże zastosowanie takich utleniających chemikaliów może wywrzeć niekorzystny wpływ na jakość papieru, zwłaszcza na jego wytrzymałość.
Stwierdzono, że pewne enzymy powodują iż masa celulozowa staje się bardziej podatna na środki bielące, dzięki czemu zmniejsza się ilość środka bielącego. W szczególności stwierdzono, że ksylanazy są bardzo przydatne w produkcji papieru. Doniesiono, że ksylanazy zwiększają usuwanie ligniny z masy celulozowej. W aktualnych procesach ksylanazy najczęściej stosuje się po etapie delignifikacji tlenowej, gdyż nie są one aktywne i nie mogą przetrwać w warunkach występujących podczas delignifikacji tlenowej.
Ksylanazy rozszczepiają łańcuchy hemicelulozy odpowiedzialne za ścisłe przyleganie ligniny do sieci celulozy. Po obróbce ksylanazą ligninę łatwiej usuwa się w następnych etapach.
Z tego względu zastosowanie ksylanaz powoduje zmniejszenie zużycia aktywnego chloru we wstępnym bieleniu o 25-30%. Takie zmniejszenie ilości chloru nie wpływa na parametry jakościowe wytwarzanego papieru (Viikari i inni 1986, Proc, of the third Int. Conf. Biotechnology in Pulp and Paper Ind., Stockholm, 67-69, oraz Bajpai i Bajpai, 1992, Process Biochemistry 27: 319-325).
Obróbka ksylanazą zmniejsza również zużycie innych chemikaliów w procesie bielenia, np. nadtlenku wodoru.
Znane jest zastosowanie ksylanaz pochodzenia grzybowego w bieleniu masy celulozowej siarczanowej. Są to ksylanazy kwasowe, a optymalne pH i temperatury działania tych enzymów sa następujące: pH = 3-5, T = 30-50°C. Nie są to wielkości idealne z punktu widzenia procesu bielenia, który w przeważającej części prowadzi się przy pH > 9 i w temperaturze >70°C.
Doniesiono również o zastosowaniu pochodzenia bakteryjnego, o wyższych wielkościach optymalnych pH i/lub temperatury w procesie bielenia. Pewne z tych ksylanaz pochodzą z następujących gatunków (w nawiasach podano wielkości pH i temperatury odpowiadające optymalnej aktywności ksylanazy):
Bacillus pumilis (pH = 7-9, T = 40°C, Nissen i inni, Progress in Biotechnology 7: 325-337), Bacillus stearothermophilus (pH = 7, T = 65°C, międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 91/10724), Dictyoglymus termophilus (PH = 6-8, T = 70°C, zgłoszenie patentowe
183 432 europejskie 0 511 933), Rhodothermus (pH = 5,5-6,5, T = 80-100°C, pH = 5-6, T = 90°C, głoszenie patentowe europejskie EP 0 538 177), Thermotoga (pH = 5-6, T = 90°C, międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 93/19171) i Thermoanaerobacter ethanolicus (T = 68°C, Deblois i Wiegel), 1992, Progress in Biotechnology 7: 487-490).
Jakkolwiek zastrzeżono zastosowanie pewnych spośród tych ksylanaz, jak dotychczas brak jest danych o jakichkolwiek ksylanazach wykazujących pożądaną cechę, znaczącą aktywność delignifikacyjną w temperaturze > 80°C.
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem wynalazku są ksylanazy uzyskiwane z anaerobowych termofilowych drobnoustrojów, wydzielonych w postaci czystej hodowli z gorących źródeł w Nowej Zelandii. Drobnoustroje zostały zdeponowane w Central Bureau voor Schmmelcultures (CBS), Baar, Holandia, 14 kwietnia 1994 roku.
Przedmiotem wynalazku są również enzymy o znaczącej aktywności ksylanazowej w temperaturze co najmniej 80°C. Ponadto w opisie wynalazku ujawniono, że ksylanazy takie wykazują znacząca aktywność delignifikacyjną w temperaturze co najmniej 80°C. Enzymy takie uzyskuje się ze zdeponowanych szczepów.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania ksylanaz aktywnych w temperaturze 80°C. Sposób obejmuje hodowlę zdeponowanych drobnoustrojów według wynalazku w odpowiednim ośrodku, a następnie wydzielanie enzymów o podanej aktywności.
Przedmiotem wynalazku jest także klonowanie genów kodujących ksylanazy według wynalazku. Ujawniono również ekspresję genów w komórce gospodarza. Enzymy uzyskiwane w taki sposób są wyjątkowo czyste. W związku z tym, przedmiotem wynalazku jest również inny sposób wytwarzania ksylanaz, na drodze ekspresji zrekombinowanego DNA.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie ksylanaz w warunkach równoważnych warunkom procesów przemysłowych, w wysokiej temperaturze i przy wysokim pH.
Figura 1: Analiza filogenetyczna wewnętrznej sekwencji największej zgodności sześciu szczepów ekstremofilowych. Sekwencje określono w sposób następujący: organizm/sterter początku/numer rekombinantu. Podane liczby rozgałęzień stanowią wielkości uzyskane z analizy sekwencji metodą „sznurowadła (Boot-strap).
Figura 2: Ułożenie sekwencji w rodzinie G wewnętrznej sekwencji największej zgodności.
Figura 3: Domena ksylanazy w xynD z TG456 wstawionego jako fragment Sphl-BamHIwpJLA602.
Figura 4: Właściwości papieru wytworzonego z masy celulozowej drzew liściastych bielonej metodą TCF w sposób opisany w przykładzie 15. Ref = bez enzymu; 715 = TG456 xynD, 716 = TG53 xynD. Podano wskaźnik wytrzymałości na rozciąganie (A), porowatość (B), rozdzieranie (C) i przepuklenie (D) w zależności od wielkości Schoppena-Rieglera.
Figura 5: Właściwości papieru wytworzonego z masy celulozowej drzew liściastych bielonej metodą ECF w sposób opisany w przykładzie 15. Ref = bez enzymu; 715 - TG456 xynD, 716 = TG53 xynD. Podano wskaźnik wytrzymałości na rozciąganie (A), porowatość (B), rozdzieranie (C) i przepuklenie (D) w zależności od wielkości Schoppena-Rieglera.
Figura 6: Właściwości papieru wytworzonego z masy celulozowej drzew iglastych bielonej metoda TCF w sposób opisany w przykładzie 15. Ref = bez enzymu; 715 = TG456 xynD, 716 = TG53 xynD. Podano wskaźnik wytrzymałości na rozciąganie (A), porowatość (B), rozdzieranie (C) i przepuklenie (D) w zależności od wielkości Schoppena-Rieglera.
Figura 7: Właściwości papieru wytworzonego z masy celulozowej drzew iglastych bielonej metodą ECF w sposób opisany w przykładzie 15. Ref = bez enzymu; 715 = TG456 xynD, 716 = TG53 xynD. Podano wskaźnik wytrzymałości na rozciąganie (A), porowatość (B), rozdzieranie (C) i przepuklenie (D) w zależności od wielkości Schoppena-Rieglera.
Figura 8: Krzywe rafinacji ustalone w przykładzie 15 dla bielenia masy celulozowej z drzew iglastych metodą TCF (A) i ECF (B) oraz dla bielenia masy celulozowej z drzew liściastych metodąTCF © i ECF (D). Ref = bez enzymu; 715 = TG456 xynD, 716 = TG53 xynD.
183 432
Figura 9: Porównanie optymalnych wielkości pH (A) i temperatury (B) dla ksylanazy TG456 xynD i enzymu Pulpenzyme HB (Novo Nordisk).
Figura 10. Porównanie termostabilności ksylanazy TG456 xynD i enzymu Pulpenzyme HB (Novo Nordisk) w 80°C przy pH 7,0 (A) i w 65°przy pH 9,0 (B).
Wynalazek ujawnia drobnoustroje wydzielone z gorących źródeł w Nowej Zelandii. Drobnoustroje scharakteryzowano jako anaerobowe termofilowe bakterie i sklasyfikowane według Raine/a (1992, praca doktorska, University of Waikato, Hamilton, Nowa Zelandia).
Następnie przeprowadzono przeszukiwanie z wykorzystaniem testu dyfuzji ksylanu w agarze. Szczepy wykazujące w teście strefę wyklarowania wybrano jako szczepy potencjalnie zdolne do wytwarzania ksylanazy. Szczepy hodowano w warunkach anaerobowych przy pH 7,0 w T = 75 lub 80°C, w zależności od organizmu. Po zatężeniu na drodze ultrafiltracji bulion hodowli zanalizowano przeprowadzając test na aktywność ksylanazową przy pH 6,5 i 9 w T = 90°C (przykład 1).
Stwierdzono, że 6 różnych szczepów wykazuje aktywność ksylanazową w podanych warunkach. Drobnoustroje te zdeponowano w CBS 14 kwietnia 1994 pod numerami CBS 211.94, CBS 212.94, CBS 213.94, CBS 214.94, CBS 215.94 i CBS 216.94.
Przedmiotem wynalazku są enzymy o aktywności ksylanazy, w szczególności wykazujące co najmniej znaczną aktywność ksylanazową w temperaturze co najmniej 80°C przy pH 6 lub powyżej. Enzymy takie uzyskuje się ze zdeponowanych szczepów. Enzymy takie można także uzyskać z mutantów lub wariantów zdeponowanych szczepów.
Określenie „znacząca aktywność” oznacza, że enzymy według wynalazku wykazują w co najmniej 80°C co najmniej 40% aktywności wykazywanej w 70°C, korzystnie co najmniej 60%, jeszcze korzystniej co najmniej 80%, a szczególnie korzystnie około 200%.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania ksylanazy aktywnej w temperaturze około 80°C lub wykazującej znaczną aktywność w tych warunkach. Sposób obejmuje hodowlę zdeponowanych drobnoustrojów według wynalazku w odpowiednim ośrodku, a następnie wydzielanie enzymów wykazujących podaną aktywność. Wydzielanie i oczyszczanie ksylanazy przeprowadzić można znanymi sposobami.
Częściowe oczyszczanie enzymów przykładowo opisano w przykładzie 2. W przykładzie tym komórki najpierw usuwa się na drodze filtracji przez puste włókna. Następnie białko dalej oczyszcza się poprzez dodanie siarczanu amonowego do uzyskania jego stężenia IM. Roztwór wprowadza się do kolumny z fenylosefarozą i białko eluuje się IM NaCl. Na koniec białko zatęża się metodą ultrafiltracji usuwając sól na drodze diafiltracji.
W celu ustalenia zdolności ksylanaz do degradacji ksylanu przy alkalicznym pH dokonano porównania aktywności ksylanaz wydzielonych z podanych szczepów przy pH 7 i 9 stosując różne substraty w temperaturze 70°C (przykład 3). Stwierdzono, że ksylanazy wykazują znaczną aktywność przy alkalicznym pH. W zależności od substratu i testu przy pH 9 ksylanazy wykazują około 20 lub więcej procent aktywności wykazywanej przy pH 7. Jednak z ksylanaz zachowała przy pH 9 80% aktywności przy pH 7.
Termostabilność ksylanaz wydzielonych z wymienionych szczepów waha się znacznie. Pewne ksylanazy są bardzo stabilne termicznie; wykazują one okres półtrwania ponad 2 godziny przy pH 9 w 80°C (patrz przykład 4). Okres półtrwania przy pH 9 w 80°C ksylanaz według wynalazku wynosi co najmniej 10 minut, korzystnie ponad 20 minut, jeszcze korzystniej ponad 30 minut, szczególnie korzystnie ponad 60 minut, a najkorzystniej ponad 120 minut.
Wynalazek dotyczy ponadto klonowania i ekspresji sekwencji DNA charakteryzującego się tym, że koduje ksylanazę uzyskiwaną z anaerobowego termofilowego szczepu. Wynalazek ujawnia wektory obejmujące wektory ekspresji charakteryzujące się tym, że zawierają sekwencję DNA kodującą ksylanazy według wynalazku. Ujawniono również drobnoustrojowego gospodarza transformowanego takimi wektorami.
Analiza sekwencji DNA kodujących ksylanazy według wynalazku potwierdziła, że uzyskane sekwencje należą do dwóch grup rodzin enzymów, to znaczy do ksylanaz typu F i typu G, zgodnie z nomoklaturą wprowadzoną przez Gilkesa i innych (1991, Microbiol, Rev. 55:
183 432
303-315). Sekwencje xynA, xynB i xynC uzyskane z drobnoustrojów według wynalazku należą do ksylanaz typu F; sekwencje xydD uzyskane z tych drobnoustrojów należą do ksylanaz typu G (patrz przykłady 6, 7, 8 i 9). Według posiadanych informacji nie opisano dotychczas ksylanaz typu G pochodzących z tennofilowych drobnoustrojów. Termofilowe drobnoustroje będące źródłem ksylanaz według wynalazku określa się jako drobnoustroje o optymalnej temperaturze rozwoju powyżej 65°C. Korzystnie optymalna temperatura rozwoju wynosi ponad 68°C, jeszcze korzystniej ponad 70°C, a najkorzystniej ponad 75°C.
Wykazano, że w wyniku ekspresji sekwencji DNA ksylanazy typu F i typu G w E.coli uzyskuje się aktywne białka (przykłady 10 i 11). Białka takie wykazują aktywność w temperaturze 80°C.
Klonowanie i ekspresja przedstawione w przykładach opisu umożliwiają ekspresje genów w homologicznych organizmach. Ekspresję można również przeprowadzić w innym drobnoustroju z wykorzystaniem odpowiednich sekwencji regulujących ekspresję i wydzielanie. Wybrać można drożdże, grzyby i bakterie. Do konkretnych drobnoustrojów należą szczepy Aspergillus niger, Kluyveromyces lactis i Bacillus licheniformis.
Stwierdzono, że enzymy według wynalazku wykazują znaczną aktywność w stosunku do ksylanu orkiszowego i ksylanu brzozowego.
Zbadano również enzymy według wynalazku pod względem skuteczności bielenia. Skuteczność bielenia określa się jako aktywność delignifikacyjną enzymów według wynalazku. Wynalazek ujawnia enzymy o znacznej aktywności delignifikacyjnej w odniesieniu do różnych mas celulozowych. Preparaty enzymatyczne, ksylanazy, są zdolne do delignifikacji masy celulozowej w temperaturze co najmniej 80°C. Wyrażenie „masa celulozowa” należy interpretować w szerokim zakresie, tak że obejmuje ono wszystkie rodzaje materiałów lignocelulozowych.
Enzymy zbadano pod względem skuteczności bielenia w odniesieniu do mas celulozowych zarówno z drzew liściastych jak i iglastych. Usuwanie ligniny oznaczano dwoma różnymi sposobami (przykład 5). Ligninę w ośrodku oznaczano za pomocą testu A300. W teście tym wszystkie preparaty wykazały znaczną aktywność delignifikacyjną w 80°C w przypadku drewna zarówno liściastego jak i iglastego. Przy pH 8 w 80°C. aktywność w stosunku do drewna iglastego wynosiła co najmniej 43% aktywności przy pH 6; w stosunku do drewna liściastego 3 szczepy wykazały przy pH aktywność ponad 50% w odniesieniu do aktywności przy pH 6, a 3 inne aktywność 18-30%. Bielenie masy celulozowej z drewna iglastego mierzono również oznaczając spadek zawartości ligniny w masie celulozowej z wykorzystaniem testu k. Po inkubacji masy celulozowej przy pH w 80°C z preparatami ksylanazowymi liczba κ zmniejszyła się o 0,5-1,4 jednostki.
Skuteczność bielenia wykazywaną przez enzymy według wynalazku można również mierzyć np. określając wzrost białości według ISO papieru wytworzonego z masy celulozowej poddanej zwykłej obróbce, dodatkowo inkubowanej z enzymami, w porównaniu z inkubowaniem bez enzymów. Taka zwykła obróbka obejmuje poddawanie masy celulozowej działaniu znanych środków wybielających jak H2O2, ozon, Cl2 lub C1O2.
Klonowane ksylanazy typu F i typu G według wynalazku, powstałe w wyniku ekspresji w E.coli również zbadano w celu określenia ich skuteczności w procesach bielenia ECF masy celulozowej z drewna zarówno iglastego jak i liściastego (przykład 12). Nieoczekiwanie stwierdzono, że ksylanazy typu G (kodowane genami xynD) wykazują o wiele wyższą skuteczność w procesach bielenia w przypadku masy celulozowej zarówno z drewna iglastego jak i liściastego, w porównaniu z ksylanazami typu F, zapewniając wzrost o 6,8% białości Δ według ISO w porównaniu z nieenzymatyczną próbą kontrolną, podczas gdy w przypadku najlepszej ksylanazy typu F wzrost białości według ISO wynosi co najwyżej 1,2%. Ponadto badania termostabilności ksylanaz typu G wykazały, że zapewniają one uzyskiwanie doskonałych wyników w doświadczeniach bielenia typu TCF w odniesieniu do masy celulozowej z drewna zarówno iglastego jak i liściastego (patrz przykłady 14 i 15).
183 432
Badania potwierdzające właściwości papieru wytworzonego z masy celulozowej bielonej w taki sposób nie wykazały znaczących różnic w stosunku do enzymu.
Klonowane ksylanazy typu G wykazują wysoką tennostabilność, nawet przy wysokim pH. Zmierzony okres półtrwania w 80°C przy pH 7,0 wynosi ponad 30 minut. W 65°C przy pH 9,0 okres półtrwania enzymu nie zmniejsza się znacząco nawet po inkubowaniu przez 120 minut (patrz przykład 16). Okres półtrwania przy pH 9,0 w 65°C ksylanaz typu G według wynalazku wynosi co najmniej 10 minut, korzystnie ponad 30 minut, jeszcze korzystniej ponad 60 minut, a najkorzystniej ponad 120 minut.
Wynalazek ujawnia sekwencje DNA kodujące termostabilne ksylanazy typu G, których wewnętrzna sekwencja największej zgodności (ICF) wykazuje ponad 80% identyczności z ICF Seq. ID nr 12. ICF typu G określa się jako fragment leżący między sekwencjami odpowiadającymi Seq ID nr 4 i Seq ID nr 5 w Seq ID nr 12 (pozycje nukleotydów od 295 do 623). Korzystnie identyczność z ICF typu G wynosi ponad 87%, jeszcze korzystniej ponad 95%, a najkorzystniej ponad 99%.
W kolejnym wykonaniu przedmiotem wynalazku są sekwencje ksylanazy typu G, wykazujące w co najmniej 70% identyczność z sekwencją aminokwasów Seq ID nr 13. Identyczność aminokwasów wynosi korzystnie ponad 80%, jeszcze korzystniej ponad 90%, szczególnie korzystnie ponad 95%, a najkorzystniej ponad 99%.
Enzymy według wynalazku stosować można natychmiast po etapie delignifikacji tlenowej w opisanym powyżej procesie wytwarzania masy celulozowej. Dzięki charakterystyce enzymu pod względem temperatury i pH uniknąć można konieczności nadmiernego chłodzenia i korygowania pH. W innym wykonaniu według wynalazku enzymy stosuje się przed lub w czasie etapu delignifikacji tlenowej. Przed tym etapem stężenie ligniny jest znacznie wyższe i w związku z tym efekt zastosowania ksylanazy jest większy.
Ujawniono ponadto zastosowanie enzymów według wynalazku, w szczególności sposób obróbki masy celulozowej preparatami enzymatycznymi według wynalazku.
Preparatami enzymatycznymi według wynalazku można także poddawać obróbce masę celulozową spulchnioną.
Wynalazek dotyczy ponadto papieru, tektury lub masy celulozowej spulchnionej wytworzonej z masy celulozowej poddanej obróbce preparatami enzymatycznymi według wynalazku.
Przykład 1. Wydzielanie szczepów produkujących aktywną termostabilną ksylanazę
Drobnoustroje produkujące ksylanazę otrzymano z gorących źródeł w różnych obszarach termalnych Nowej Zelandii. Szczepy wydzielono przez wzbogacenie in situ z zastosowaniem ksylanu orkiszowego jako substratu z gorących źródeł o temperaturze ponad 70°C i pH w zakresie 6,0-8,5. Hodowle szczepów uzyskano w wyniku dalszej hodowli anaerobowej w laboratorium na pożywce 2/1 z dodatkiem ksylanu w temperaturze (70, 75 lub 85°) odpowiadających temperaturze miejsca, z którego pobrano próbkę.
Skład pożywki 2/1 z ksylanem był następujący:
Anaerobowy ośrodek 2/1
Resazuryna (0,1%) 1,0 ml/litr
śladowe pierwiastki SL10 1,0 ml/litr
Roztwór FeCl3 (0,28 mg/ml) 1,0 ml/litr
Witaminy Wolina 0,1 ml/litr
NaCl 0,9 g/litr
MgCl2-6H2O 0,2 g/litr
K2HPO4 1,5 g/litr
kh2po4 0,75 g/litr
nh4ci 0,9 g/litr
Cysteina 0,75 g/litr
Ekstrakt drożdżowy 0,5 g/litr
Trypton Batco 0,5 g/litr
183 432
Ksylan orkiszowy 2g/litr
pH 7,0
Dozować w atmosferze azotu
Mieszanka witamin Wolina mg/100 ml
Biotyna 2,0
Kwas foliowy 10,0
Chlorowodorek pirydoksyny 5,0
Ryboflawina 5,0
Tiamina 5,0
Kwas nikotynowy 5,0
Kwas pantotenowy 5,0
Witamina B12 0,1
Kwas p-aminobenzoesowy 5,0
Kwas tioktynowy 5,0
Zmodyfikowane pierwiastki śladowe SL10
5M kwas solny 15 ml
mg/litr
ZnCl2 70
MnCl44H2O 100
H3BO3 6
CoC126H2O 130
CuC12-2H2O 2
NiCl2-2H2O 24
NaMoO4-2H2O 36
Czyste hodowle szczepów otrzymano z pojedynczych kolonii w probówkach z
wałkiem agarowym. Koncentraty hodowli uzyskane na drodze ultrafiltracji zbadano pod względem aktywności ksylanazowej w 70 i 80°Ć przy pH 6,5 i 9,0 wykorzystując do tego metodę barwionego ksylanu (patrz poniżej) i metodę PAHBAH (patrz przykład 3).
szczepów zdeponowanych w CBS (Centraal Bureau voor Schmmelcultures) wymieniono w tabeli 1.
Tabela 1
Numery zdeponowanych szczepów wykorzystanych w zgłoszeniu patentowym
Szczep Przypisany numer CBS
TG 53 CBS 211.94
TG 453 CBS 212.94
TG 456 CBS 213.94
TG 457 CBS 214.94
TG 479 CBS 215.94
TG 631 CBS 216.94
Zabarwiony ksylan złożony z ksylanu z drewna modrzewiowego sprzężonego z błękitem brylantowym Ramazol Brilliant Blue R (Sigma) otrzymano w sposób opisany przez Biely 'ego i innych (1985), Anal. Biochem. 144, 142-146. Ksylan z drewna modrzewiowego (6,7 g) dodano do 250 ml wody i mieszano przez kilka godzin w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia. Do mieszaniny dodano barwnik Ramazol Brilliant Blue R (10,0 g). Po rozpuszczeniu wkroplono 20 ml roztworu octanu sodu (2,7 g) w 20 ml wody destylowanej. Następnie dodano roztwór 6 g NaOH w 70 ml wody i mieszanie kontynuowano przez 18 godzin. Powstały zabarwiony ksylan wytrącono dodając 700 ml 96% etanolu. Po odstawieniu na 6 godzin osad
183 432 odsączono (Whatman GF/A). Placek filtracyjny przemyto 3 litrami mieszaniny 2:1 96% etanolu/0,05M octanu sodowego, a następnie 1 litrem 96% etanolu i 3 litrami acetonu aż do uzyskania bezbarwnego przesączu. Uzyskano 10,5 g zabarwionego ksylanu.
Do testów enzymatycznych 5,1 g zabarwionego ksylanu rozpuszczono w 150 ml 0,lM buforu MOPS o pH 6,8. Mieszaninę tą mieszano do rozpuszczenia w 70°C przez 4 godzin. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej nierozpuszczalny materiał odwirowano przy 10 000 x g. Do testów aktywności roztwór podstawowy zawierający 3,34% wagowo/objętościowych zabarwionego ksylanu rozcieńczono 0,lM buforem MOPS o pH 6,8, tak aby uzyskać roztwór roboczy zawierający 0,5% zabarwionego ksylanu.
Test enzymatyczny z zastosowaniem zabarwionego ksylanu przeprowadzono dodając 0,9 ml 0,5% roztworu zabarwionego ksylanu do 0,6 ml mieszanego preparatu enzymatycznego w odpowiednim buforze. Część (0,4 ml) tej mieszaniny przeniesiono do 0,8 ml 96% etanolu jako próbkę kontrolną (ślepą). Resztę roztworu inkubowano w 70°C przez 90 minut. Reakcję kończono przenosząc 0,4 ml mieszanki testowej do 0,8 ml 96% etanolu. Roztwór pozostawiono na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wytrącenie się nierozszczepionego ksylanu. Próbki odwirowywano przez 5 minut przy pełnej szybkości w mikrowirówce Beckman Microfuge E, po czym oznaczano absorbancję supematantu przy 595 nm w spektrofotometrze.
Przykład 2. Wydzielanie preparatów enzymatycznych
Anaerobowe fermentacje przeprowadzono w 2-litrowych kolbach Schotta zawierających 1800 ml pożywki 2/1 ksylanem, w warunkach inkubacji stacjonarnej w temperaturze 75 lub 80°C (w zależności od hodowanego organizmu) przez 24 godziny. Z 10 litrów dobrze wyrośniętej hodowli komórki usunięto na drodze filtracji przez puste włókna w obecności 0,01% tritonu XI00 (filtr Amicon DC 10 LA i Amicon 0,1 pm H5MP01-43). Do ośrodka hodowli wolnego od komórek dodano siarczan amonowy do uzyskania ostatecznego stężenia IM. Uzyskany roztwór przetłoczono do kolumny 9x15 cm, zawierającej 1 litr fenylosefarozy (Pharmacia-Fast Flow-low substitution, szybki przepływ-niskie podstawienia) doprowadzonej do równowagi z IM siarczanem amonu. Szybkość przepływu wynosiła 150-200 ml/minutę. Kolumnę przemyto 5 litrami IM siarczanu amonowego. Ksylanazę wyeluowano 5 litrami IM NaCl. Zbierano frakcje o objętości 500-1000 ml. We frakcjach oznaczano aktywność ksylanazową metodą PAHBAH (w sposób opisany w przykładzie 3), po czym aktywne frakcje połączono, poddano ultrafiltracji do małej objętości i diafiltracji w celu zmniejszenia stężenia soli, stosując cele Amicon Stirred Celi (Model 2000A lub 8400) z membraną YM2.
Przykład 3. Ocena aktywności ksylanazowej częściowo oczyszczonych preparatów enzymatycznych
Metody analityczne
Aktywność ksylanazową oznaczano przeprowadzając zmodyfikowany test Sumnera (Sumner i inni, 1921, J. Biol. Chem. 47: 5-9). Alternatywnie aktywność ksylanazową oznaczano przeprowadzając zmodyfikowany test PAHBAH oparty na metodzie Levera (1973, Biol. Med. 1:274-281).
Metoda 1: Test Sumnera aktywności ksylanazy w stosunku do ksylanu orkiszowego
Roztwór ksylanu orkiszowego jako substratu przygotowano w sposób następujący: 4 g ksylanu orkiszowego zawieszono w 100 ml wody demineralizowanej. Zawiesinę poddano obróbce ultradźwiękami ( w aparacie Sonics & Materials, typ Vibracell VC 250 B), inkubowano w 100°C przez 10 minut i odwirowano przez 10 minut z szybkością 10 000 obrotów/minutę w wirówce Sorvall RC-5B. Supematant zawierający 2% ksylanu orkiszowego zastosowano jako roztwór substratu.
Test przeprowadzono w sposób następujący: Probówkę napełniano 200 μΐ roztworu ksylanu orkiszowego i 600 μΐ preparatu enzymatycznego (z przykładu 2) rozcieńczonego odpowiednim buforem. Probówkę inkubowano w kontrolowanych warunkach w łaźni wodnej przez 15 minut. Po inkubowaniu dodawano 7,2 ml odczynnika DNS (kwasu dinitrosalicylowego). Mieszaninę ogrzewano w łaźni wodnej w 100°C przez 10 minut, po czym probówkę
183 432 schładzano w lodzie. Mierzono absorbancję przy 575 nm. W celu wyeliminowania absorbancji tła próbek enzymu przeprowadzano doświadczenie kontrolne w następujący sposób: probówkę zawierającą substrat bez preparatu enzymatycznego inkubowano w identycznych warunkach jak probówkę z badaną próbką. Po inkubowaniu przez 15 minut dodawano 7,2 ml DNS i próbkę enzymu (w podanej kolejności).
Jedną jednostkę aktywności ksylanazowej (xU) określa się jako ilość enzymu wytwarzającego 1 pml równoważnika ksylozy oznaczanej jako cukier redukujący.
Pomiary wykonywano przy pH 7,0 i 9,0 w 70°C. Przy pH 7 stosowano 50 mM bufor fosforanowy, a przy pH 9,0 50 mN bufor boran/KOH.
Tabela 2
Względne aktywności ksylanazy względem ksylanu orkiszowego znaczone w 70°C
Szczep Aktywność (%)
pH7,0 pH 9,0
TG 453 100 57
TG 456 100 39
TG 457 100 31
TG 479 100 19
TG 631 100 31
Metoda 2: Test Sumnera aktywności ksylanazy w stosunku do ksylanu z drewna brzozowego
Zastosowano zasadniczo taki sam sposób jak w metodzie 1. Zamiast roztworu ksylanu orkiszowego zastosowano zawiesinę ksylanu z drewna brzozowego. Roztwór substratu, ksylanu z drewna brzozowego, otrzymano w sposób następujący: 4 g ksylanu z drewna brzozowego zawieszono w 50 ml 0,2 N NaOH i mieszano aż do widocznego rozpuszczenia. pH roztworu doprowadzono do 7,0 lodowatym kwasem octowym, dodano wodę do 100 ml i roztwór odwirowano z szybkością 10000 obrotów/minutę w wirówce Sorvall RC-5B. Supematant zastosowano jako roztwór substratu zawierający około 3% ksylanu z drewna brzozowego. Test przeprowadzono przy pH 7 i 9 w 70°C. Wyniki podano w tabeli 3.
Tabela 3
Względne aktywności ksylanazy względem ksylanu z drewna brzozowego oznaczone w 70°C
Szczep Aktywność (%)
pH7,0 pH 9,0
TG 453 100 40
TG 456 100 20
TG 457 100 21
TG 479 100 12
TG 631 100 21
Metoda 3: Test PAHBAH aktywności ksylanazy w stosunku do ksylanu orkiszowego
Modyfikacja metody PAHBAH (Lever, 1973) polegała na zastosowaniu odczynnika PAHBAH o następującym składzie: 0,05 M cytrynian trisodowy, 0,1 M Na2SO4, 0,02 M CaCl2, 0,5 M NaOH i 0,1 M hydrazyd kwasu p-hydroksybenzoesowego (PAHBAH).
183 432
W celu wykonania testu 0,05 ml lub 0,1 ml preparatu enzymatycznego wymieszano z 0,3 ml buforowanego substratu (50 mM Bis-Tris-Propan, pH niezależnie od potrzeb + 0,2% ksylanu orkiszowego w zawiesinie). Dodano odpowiednią ilość wody do uzyskania objętości 0,5 ml. Zazwyczaj inkubowanie prowadzono w 70°C przez 30 minut. W celu przerwania reakcji po inkubowaniu dodawano 1,0 ml odczynnika PAHBAH i próbki ogrzewano w 100°C przez 6 minut. Ślepa próbka zawierała buforowany substrat inkubowany tak samo jak próbka, do którego dodano enzym po wprowadzeniu odczynnika PAHBAH. Przed oznaczeniem absorpcji przy 420 nm wszystkie próbki wirowano przez 1 minutę z pełną szybkością w mikro wirówce Beckman Microfuge E w celu usunięcia zawieszonego ksylanu z supematantu. Wyniki przedstawiono w tabeli 4. Z wyników w tabeli można wywnioskować, że przy pH 9,0 w 80°C wszystkie szczepy w dalszym ciągu wykazują znaczącą aktywność w porównaniu z testem przy pH w 70°C.
Tabela 4
Względne aktywności ksylanazy względem ksylanu orkiszowego oznaczone w teście PAHBAH
Szczep Aktywność (%)
pH 6,0 70°C pH 9,0 80°C
TG 53 100 57
TG 453 100 20
TG 456 100 65
TG 457 100 82
TG 479 100 30
TG 631 100 65
Przykład 4. Termostabilność aktywności ksylanazowej.
Okresy półtrwania aktywności ksylanazowej w preparatach enzymatycznych oznaczano w sposób następujący. Preparat enzymatyczny rozcieńczano w stosunku 1/10 100 mM buforem TAPS (pH 9,0, 80°C) i inkubowano w 80°C. Próbki pobierano po 0, 10, 20, 40, 60 i 120 minutach dodając je do 100 mM buforu MOPS (pH 6,0, w 70°C) w lodzie, do ostatecznego rozcieńczenia od 1/20 do 1/100, zależnie od wymagań testu. Próbki trzymano w lodzie aż do wykonania testu w 70°C przy pH 6,0 metodą PAHBAH, jak to opisano w przykładzie 3, sposób 3. Wyniki podano w tabeli 5.
Tabela 5
Termostabilność aktywności ksylanazy przy pH 9,0 w 80°C , oznaczana metodą PAHBAH w stosunku do ksylanu orkiszowego
Szczep Okres półtrwania; pH 9,0, 80°C
TG 53 30 minut
TG 453 60 minut
TG 456 >120 minut
TG 457 > 120 minut
TG 479 < 10 minut
TG 631 < 20 minut
183 432
Przykład 5. Aktywność delignifikacyjna
Zdolność ksylanaz do delignifikacji oznaczano dwoma różnymi metodami. Metodą A300 oznacza się ilość ligniny uwolnionej z masy celulozowej po obróbce enzymem. W teście κ mierzy się zawartość ligniny pozostającej w masie celulozowej po obróbce.
Metoda 1: Test A300
Aby zbadać delignifikację z wykorzystaniem testu A300 preparaty enzymatyczne inkubowano z masą celulozową z drewna iglastego lub liściastego w stężeniu 2 jednostki PAHBAH/g wilgotnej masy celulozowej (około 6 jednostek PAHBAH/g suchej masy celulozowej). Inkubację prowadzono przez 2 godziny w 80°C przy pH 6,0 w buforze MOPS oraz przy pH 9,0 w buforze TAPS. Stężenie masy celulozowej przy inkubowaniu wynosiło 0,1 g wilgotnej masy celulozowej/ml. Zastosowano dwa różne rodzaje masy celulozowej: masę celulozową siarczanową z drewna iglastego po delignifikacji tlenowej i masę celulozową siarczanową z drewna liściastego po delignifikacji tlenowej. Właściwości mas celulozowych podano w tabeli 6.
Tabela 6
Właściwości mas celulozowych stosowanych w doświadczeniach delignifikacji
Liściaste Iglaste
brzoza 80% świerku + 20% sosny
Białość, % ISO 50,8 35,8
Liczba κ 11,0 16,7
Lepkość, dm3/kg 979 1003
Wapń, ppm 1900 2600
Miedź, ppm 0,3 0,6
Żelazo, ppm 5,1 11
Magnez, ppm 210 270
Mangan, ppm 25 70
Ilość ligniny usuniętej z masy celulozowej oznaczano mierząc absorbancję supematantu przy 300 nm po oddzieleniu supematantu od masy celulozowej na drodze filtracji podciśnieniowej przez filtr Whatman GF/C nałożony na filtr ze spiekanego szkła. Wyniki testu A300 podano w tabeli 7. W teście tym wielkości Δ A300 > 0,2 są znacząco wyższe od poziomu tła. W związku z tym z przykładów wynika, że enzymy wykazują znaczącą aktywność delignifikacyjną w 80°C.
Tabela 7
Delignifikacja oznaczana metodą A300 w 80°C, pH 6,0 i 9,0, w odniesieniu do drewna iglastego i liściastego
Szczep ΔΑ300
Liściaste Iglaste
pH6,0 pH9,0 %’ pH 6,0 pH 9,0 %*
TG 53 0,7 0,5 71 0,6 0,35 58
TG 453 1,0 0,3 30 0,7 0,3 42
TG 456 1,0 0,3 30 0,6 0,6 100
TG 457 1,0 0,7 70 1,0 0,5 50
TG 479 0,9 0,16 18 0,8 0,6 75
TG 631 U 0,7 58 0,8 0,7 88
% aktywności przy pH 9 w porównaniu z aktywnością przy pH 6.
183 432
Metoda 2: Test κ
Testy κ przeprowadzano zgodnie z procedurą TAPPI T236 (dostępnej z TAPPI, Technology Park, Atlanta, USA), z pewnymi modyfikacjami. Preparat enzymatyczny dodawano w dawce 10 x U/g suchej masy celulozowej i prowadzono inkubację przez 2 godziny w 80°C przy pH 9. Masę celulozową kontrolną inkubowano przez taki sam okres w tych samych warunkach, ale bez enzymu. Zastosowano masę celulozową z drewna iglastego po delignifikacji tlenowej, której właściwości podano w tabeli 6.
Różnica między liczbą κ z dodatkiem enzymu i liczbą κ bez enzymu określana jako spadek κ jest miarą delignifikacji. Spadki κ podano w tabeli 8, przy czym wielkości > 0,5 są znacząco wyższe od poziomu tła. W związku z tym, podobnie jak w poprzednim przykładzie, z przykładów -wynika, że enzymy wykazują znaczącą aktywność delignifikacyjną w 80°C.
Tabela 8
Spadek κ jako miara delignifikacji w odniesieniu do drewna iglastego i liściastego
Szczep Spadek κ
TG 453 1,0
TG 456 1,3
TG 457 1,4
TG 479 1,0
TG 631 0,5
Przykład 6. Klonowanie i oznaczanie wewnętrznych sekwencji fragmentów o największej zgodności genów kodujących termostabilne ksylanazy typu F
6.1. Amplifikacja PCR wewnętrznych fragmentów genów ksylanazy startery PCR zastosowano do amplifikacji fragmentów największej zgodności genów ksylanazy: dwa różne startery postępu (xynFA, {5' CAC ACK CTK GTK TGG CA 3', Seq ID nr 1} i xynFB {5' CAT ACK TTK GTT TGG CA 3', Seq ID nr 2} oraz jeden starter odwrotny (xynR {TMG TTK ACM ACR TCC CA, Seq ID nr 3}). Startery xynFA i xynFB wiążą się w tym samym miejscu, ale różnią się nieznacznie sekwencją z uwagi na nieznaczne różnice w sekwencji genów ksylanazy w poprzednim obszarze największej zgodności. Warunki PCR były następujące (94°C 1 minuta, 50°C 1 minuta, 72°C 1 minuta) x 30. Wszystkie wewnętrzne fragmenty największej zgodności rodziny F zawierały około 350 bp.
6.2. Oznaczenie sekwencji produktów PCR
Wszystkie produkty PCR wewnętrznej ksylanazy (około 350 bp) naprawiono na końcach (dopełniono) w sposób opisany poniżej, przed klonowaniem w miejscu Smali (fosfatazo wanym) wektora sekwencjonującego M13mpl0.
Etap 1 - Wytrącanie octanem amonu:
(a) uzupełnić 50 μΐ mieszaniny PCR do 100 μΐ buforem TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0); (b) dodać 100 μΐ 4 M CH3COO-NH4 + i 240 μΐ 100% CH3CH2OH; (c) inkubować w lodzie przez 15 minut (lub przez noc w -20°C); (d) odwirować z szybkością 16000 obrotów/minutę przez 15 minut i odrzucić supematant; (e) przemyć pastylką 500 μΐ zimnego 70% CH3CH2OH. Ponownie odwirować (16000 obrotów/minutę, 5 minut) i odrzucić supematant; (f) wysuszyć pastylkę pod zmniejszonym ciśnieniem przez 5 minut i ponownie zawiesić w 20 μΐ buforu TE.
Etap 2 - Naprawa końców fragmentów PCR:
(a) do 20 μΐ wytrąconego DNA dodać 3 μΐ buforu 10 x Ligase (Boehringer Mannheim), 1 μ1 12,5 mM dNTP (mieszanka polimeryzująca DNA, Pharmacia), 0,5 pl (5U) dużego fragmentu (Klenowa) polimerazy DNA z E. coli (BRL Technologies Ltd.), 0,25 μΐ (2,5U) polimerazy T4 DNA (Boehringer Mannheim), 0,25 μΐ (2,5U) kinazy polinukleotydowej T4
183 432 (Boehringer Mannheim) i H20 do 30 pl; (b) inkubować w 37°C przez 30 minut i zabić enzymy na ciepło przez inkubację w 70°C przez 10 minut.
Etap 3 - Oczyszczanie na żelu fragmentu ksylanazy z naprawionymi końcami:
(a) przepuścić DNA przez 2% agarozę LMP w buforze 1 x Tris-octan (pH 7,8); (b) wyciąć pasmo ksylanazy o 350 bp z agarozy; (c) oczyścić DNA z plasterka agarozy stosując procedurę GeneClean® (Bio 101 Inc.).
Etap 4 - Ligowanie z M13mpl0 (fosfatazowana Smal):
(a) zmieszać 1 pl DNA wektora M13mpl0 (odpowiednio rozcieńczonego do około 10 ng/pl), 20-50 nm DNA insertu (fragmentu największej zgodności startera ksylanazy), 1 pl buforu 10 x ligazy (Boehringer Mannheim), 1 pl ligazy DNA T4 (Boehringer Mannheim) i H2O do 10 pl; (b) inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
Etap 5 - Transformacja mieszaniny ligacyjnej w szczepie E. coli JM101:
(a) transformować JM101 całymi 10 pl mieszaniny ligacyjnej stosując technikę transformacji Chunga i innych z udziałem DMSO (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 2172-2175); (b) posiać M13/JM101 i wydzielić zrekombinowane plazmidy Ml3 standardowymi technikami (Sambrook i inni, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press).
Zrekombinowany fag Ml3 zawierający wewnętrzne fragmenty największej zgodności ksylanazy sekwencjonowano z ssDNA (Sambrook i inni, 1989) w zautomatyzowanym aparacie do sekwencjonowania DNA Applied Biosystems 373A, z wykorzystaniem chemizmu barwnika-startera (jako starter sekwencjonowania zastosowano uniwersalny starter postępu M13 {znaczony barwnikiem}, ABI Ltd.). Wszystkie dane dotyczące sekwencjonowania analizowano i obrabiano z wykorzystaniem oprogramowania G C G do analizy sekwencji (zainstalowanego na Irix'ie) w Silicon Graphics Personal Iris Workstation.
Wyniki sekwencj onowania wewnętrznego fragmentu ksylanazy z rodziny F
W oparciu o fragmenty PCR amplifikowane z 6 szczepów wymienionych w tabeli 1 z wykorzystaniem starterów największej zgodności ksylanazy założono, że każdy organizm zawiera 1 -3 geny ksylanazy z rodziny F. Wyniki zanalizowano z wykorzystaniem znanej analizy “sznurowadła do butów” (Wisconsin Molecular Biology Package, Devereux, 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-394). Na fig. 1 pokazano dendogram różnych ksylanaz i szczepów. Z sekwencji nukleotydów fragmentów rodziny F o największej zgodności wynika, że każdy organizm zawiera 3 różne geny z rodziny F. Każdy z genów ksylanazy z rodziny F w każdym organizmie należy do odrębnego skupienia ksylanaz (na podstawie homologii sekwencji nukleotydów i podstawowych aminokwasów), które oznaczono jako skupienie A, skupienie B i skupienie C. Ksylanaza o pełnej długości amplifikowana z TG 456 należy do skupienia A i w związku z tym została nazwana jako TG 456 xynA. Ponadto zidentyfikowano wewnętrzne fragmenty największej zgodności ksylanazy skupienia B z TG 456 (TG 456 xynB) oraz z ksylanazy skupienia C z TG 456 (TG 456 xynC).
Przykład 7. Klonowanie i oznaczanie sekwencji wewnętrznych fragmentów największej zgodności genów kodujących termostabilne ksylanazy typu G
7.1. Amplifikacja PCR wewnętrznych fragmentów genów ksylanazy typu G
Wewnętrzne fragmenty największej zgodności (ICF) rodziny G wydzielono z wykorzystaniem polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) stosując postęp i odwrotne startery największej zgodności rodziny G (GF i GR). Profil PCR był następujący:
uwagi: °C oznacza stopnie Celsjusza, x oznacza liczbę cykli (np. xl oznacza 1 cykl) (94°C, 4 minuty) xl (94°C, 1 minuta; 45°C, 1 minuta; 72°C, 1 minuta) x35 (94°C, 1 minuta; 45°C, 1 minuta; 72°C, 6 minut) xl
PCR przeprowadzano stosując mieszaniny reakcyjne o objętości 50 pl, zawierające następujące składniki: 100 ng startera GF, 100 ng startera GR, 0,25 mM dNTPs, 1 jednostka polimerazy Taq, 0,25 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl o pH 8,8; 50 mM KC1, 0,001% żelatyny, 1-10 ng matrycowego DNA.
183 432
Dwa startery PCR zastosowano do amplifikacji fragmentów genów ksylanazy o największej zgodności:
GF: TATNTGRSTNTMTATGGWTGG (starter postępu wewnętrznego fragmentu o największej zgodności), Seq ID nr 4.
GR: CCGCTNTTTTGGTANCCTTC (starter odwrotny wewnętrznego fragmentu o największej zgodności), Seq ID nr 5.
W przypadku wszystkich 6 szczepów stwierdzono obecność fragmentu PCR po amplifikacji ze starterami o największej zgodności.
Przeprowadzono amplifikację 2 rodzajów produktów PCR (fragmentów DNA): fragmentu o 300 kb o oczekiwanej wielkości oraz nieoczekiwanego produktu PCR o 600 kb ten fragment o 600 bp stanowił dimer typu głowa-do-ogona produktu PCR o 300 bp; prawdopodobnie takie fragmenty o 600 bp powstały w wyniku samostartu w czasie reakcji PCR, wynikającego z homologii między starterami GF i GR.
7.2. Oznaczanie sekwencji produktów PCR
Fragmenty o 300 bp uzyskane w wyniku amplifikacji z każdego z organizmów naprawiono na końcach (patrz przykład 6).
Fragmenty z naprawionymi końcami oczyszczono z wykorzystaniem 1% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia (stosując bufor Tris-octan), z wykorzystaniem procedury (Geneclean Bio 101, La Jolla, Calif).
Około 10 ng 300 ICF z naprawionymi końcami, oczyszczonych na żelu, zligowano w miejscu Smali w M13mpl0, stosując ligazę DNA BM T4, stosując mieszaniny reakcyjne o objętości 10 μΐ.
7.3. Oznaczanie sekwencji produktów PCR
Przeprowadzono sekwencjonowanie 6 niezależnych fagów pochodzących ze szczepów TG457 i TG53. Z ułożenia sekwencji (fig. 2) wynika, że w każdym z tych szczepów obecny jest tylko jeden gen ksylanazy typu G. Dodatkowo przeprowadzono sekwencjonowanie rekombinantów M13mpl0 zawierających ICF z grupy G, z TG453, TG456, TG479 i TG631. Organizmy te zawierały cały gen ksylanazy z rodziny G, kodujący zasadniczo identyczną ksylanazę, choć zmiany w sekwencji DNA dochodziły do 13%.
Przykład 8. Sekwencja ksylanazy typu F o pełnej długości
Na podstawie wewnętrznych fragmentów PCR zidentyfikowano 3 różne typy genów ksylanazy F: xynA, xynB i xynC. Wykorzystując technikę Genome Walking PCR (GWPRCR) z większości szczepów wydzielono geny ksylanazy o pełnej długości.
Ustalono sekwencję o pełnej długości genu xynA z TG464. Pełną sekwencję genu xynA stanowi Seq ID nr 6. Kodowaną sekwencję aminokwasów ksylanazy A z TG456 stanowi Seq ID nr 7.
W przypadku xynB i xynC ustalono, że geny te kodują wielodomenowe enzymy z jedną domeną ksylanazy. Takie domeny ksylanazy subklonowano z wykorzystaniem starterów PCR na sekwencjach na granicy domeny ksylanazy.
Informację o częściowej sekwencji genów xynB i xynC pochodzących z TG456 przedstawiają odpowiednio Seq ID nr 8 i Seq ID nr 10. Kodowane sekwencje aminokwasów ksylanaz B i C z TG456 przedstawiają odpowiednio Seq ID nr 9 i Seq ID nr 11.
Przykład 9. Pełna sekwencja genów ksylanazy typu G
Wykorzystując technikę Genome Walking PCR (GWPRCR) z większości szczepów wydzielono geny xynD ksylanazy o pełnej długości.
Pełną sekwencję genu xynD z TG456 stanowi Seq ID nr 12, a kodowaną sekwencję aminokwasów ksylanazy D z TG456 stanowi Seq ID nr 13.
Przykład 10. Konstrukcja wektorów ekspresji i gospodarzy do wytwarzania ksylanazy z klonowanych genów
W starterach PCR największej zgodności zaprojektowano miejsca restrykcyjne, co umożliwiło subklonowanie genów ksylanazy w odpowiednich wektorach ekspresji.
183 432
Geny xynA i xynC wstawiono w miejsce Ncoll-BamHI w wektorze ekspresji pJLA602 [B. Schauder, H. Blucker, R. Frank i J.E.G. McCarthy (1987). Inducible Expression Vectors Incorporating the Escherichia coli aptE Transcriptional Initiation Region. Gene 52: 279-283] w celu wykonania fuzji w ramce odczytu z promotorami lambda L i R [M.G. Gibbs, D.J. Saul, E. Luthi i P.L. Bergquist (1992). The beta-mannanase from “Caldocellum Saccharolyticum” is Part of a Multidomain Enzyme. Appl. Environ. Microbiol. 58 (12): 3864-3867].
Geny xynB i xynD wstawiono w unikatowe miejsca SphI-BamHI w pJLA602.
Konstrukty przeniesiono do gospodarzy, E. coli JM101 i E. coli DH5a wykorzystując standardowe techniki transformacji.
Na figurze 5 pokazano sekwencję domeny ksylanazy xynD z TG456 wstawionej w pJLA602 jako fragment SphI-BamHI.
Przykład 11. Wytwarzanie i odzysk klonowanych ksylanaz
W celu uzyskania próbek białka z klonowanych ksylanaz typu F przeprowadzono fermentację E. coli w 10-litrowych fermentatorach HL (seria 210). Hodowlę utrzymywano w 30°C do zaindukowania (42°C) z ciągłym napowietrzaniem (4,8 litra/minutę), mieszaniem (500 obrotów/minutę) i regulacjąpH (pH 7,1). Stosowane ośrodki i inne dodatki podano poniżej.
Ośrodek Luria Broth (do hodowli inokulum).
Trypton 10g
Ekstrakt drożdżowy 5g
NaCl 10g
Woda do 1000ml
Ośrodek wzrostu BGM2 do stosowania w fermentatorach (ilości dotyczą ostatecznego ośrodka, 2 szarż po 8,5 litra).
NH4C1 3,22 g
kh2po4 1,05 g
MgSO4 7 H2O 0,135 g
K2SO4 0,043 g
FeSO4 7 H2O 0,003 g
Pierwiastki śladowe SL-10 1 ml
Trypton 10g
Ekstrakt drożdżowy 4,7 g
Gliceryna 34 ml
Woda do 1000 ml
Zbiornik fermentatora z około 6 litrami wody wysterylizowano przez autoklawowanie w 121°C przez 30 minut, a następnie schłodzono do 30°C. Koncentrat pożywki (8,5 porcji koncentratu) przetłoczono przez sterylny 0,2 pm wkład filtracyjny (Sartorius). Przed zaszczepieniem dodano następujące składniki:
Środek przeciwpieniący (Bevaloid 5901) 10 m (autoklawowano)
CaCh (17 mg/ml roztworu podstawowego) 1 ml (autoklawowano)
Ampicylina 850 ml (sterylizowano przez sączenie)
Tiamina (tylko w hodowli JM101) 850 ml (sterylizowano przez sączenie)
Objętość cieczy doprowadzono do 8,5 litra. pH pożywki nastawiono na 7,1. Wysterylizowane przez filtrację powietrze przedmuchiwano przez fermentator z szybkością 4,8 litra/minutę. Utrzymywano temperaturę fermentatora 30°C przepuszczając zimną i ciepłą wodę przez sondę palcową. pH regulowano dodając autoklawowany NaOH (5M) lub H2SO4(2 M). Zawartość fermentatora mieszano z szybkością 500 obrotów/minutę.
183 432
Hodowlę zainicjowano przez zaszczepienie porcją (około 10,0 ml) świeżej hodowli klonu E. coli prowadzonej w ośrodku Luria Broth ze 100 pg/ml ampicyliny, o gęstości optycznej OD650 0,2-0,4. Hodowlę komórek prowadzono do osiągnięcia OD650 11-13 w 30°C, po czym uzupełniono ją koncentratem pożywki, pozostawiono do dojścia do równowagi i prowadzono hodowlę do OD650 14-16. Następnie przeprowadzono indukowanie podwyższając temperaturę do 42°C.
Komórki zebrano w 4 godziny po osiągnięciu maksymalnej OD650. Komórki oddzielono na drodze filtracji przez puste włókna (0,1 pm, Amicon) i ponownie zawieszono w roztworze 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7,5 mM EDTA, 7,5 mM β-merkaptoetanol, 0,02% PMSF, 1,0 μΜ pepstatyna A, 0,02% Dnaza i 0,02% lizomasa, prowadząc następnie inkubację w 4°C przez 1 godzinę (całkowita objętość około 1 litr). Komórki poddano w lodzie obróbce ultradźwiękami w porcjach po 160 ml przez 4-6 minut, stosując 1-minutowe szoki, aż do zajścia lizy (z monitorowaniem mikroskopowym). Po każdych 2 minutach obróbki ultradźwiękowej dodawano porcję 56 mM PMSF (w izopropanolu) (każda porcja odpowiadała 160 μΜ), ale tak, aby ostateczne stężenie nie przekraczało 1 mM PMSF. Po zajściu pełnej lizy szczątki komórek odwirowano. Supematant poddano obróbce cieplnej w 70°C do wystąpienia wytrącania się białka (zwykle przez około 20-30 minut) i zdenaturowane białko odwirowano. Przed chromatografią na fenylosefarozie do supematantu po obróbce cieplnej dodano siarczan amonowy do uzyskania stężenia 1,0 M uzyskując ekstrakt określany jako ekstrakt po obróbce cieplnej pierwszego stopnia. Pastylkę komórek po obróbce ultradźwiękowej wyekstrahowano 1 litrem zawiesiny zawierającej 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA, 7 mM β-merkaptoetanol, po czym przeprowadzono drugą obróbkę cieplną w 70°C przez 15 minut, po której wytrącone białko odwirowano. Stwierdzono, że w ten sposób można wyekstrahować 20-40% ksylanazy, a uzyskany ekstrakt oznaczono jako ekstrakt po obróbce cieplnej drugiego stopnia. Do ekstraktu po obróbce cieplnej drugiego stopnia dodano siarczan amonowy do uzyskania stężenia 1,0 M i ekstrakty po obróbce cieplnej pierwszego i drugiego stopnia połączono przed rozdzielaniem na fenylosefarozie. Aktywną ksylanazę eluowano etapowo z kolumny zawierającej 1100 ml złoża z fenylosefarozy (po wyczerpującym przemywaniu 1,0 M siarczanem amonowym i powrocie do linii podstawowej) za pomocą 1,0 M NaCl. Eluowane białko zatężono i odsolono na drodze ultrafiltracji przez membranę YM3 (Amicon). Ostateczne stężenia w preparatach były następujące: 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA, 7 mM β-merkaptoetanol, około 250 nM NaCl, 20% gliceryny, 0,05% azydku sodowego.
Sposób produkcji ksylanaz typu G jest prawie identyczny z opisanym powyżej, z tym, że zamiast buforu Tris-HCl stosuje się bufor HEPES zarówno w etapie ekstrakcji (pH 8,0), jak odsalania (pH 7,3). Ostateczne stężenia w preparatach były następujące: 50 mM HEPES (pH 7,3), 1 mM EDTA, 7 mM β-merkaptoetanol, 0,05% azydku sodowego, 20% gliceryny i ± około 250 mMNaCl.
Dla 6 preparatów typu F (5 xynA i 1 xynB) oraz 2 preparatów typu G uzyskano wystarczający poziom czystości. Stężenie białka w preparatach typu F i G oznaczono standardową metodą BCA (Pierce, Rockford, Illinois, USA). Czystość próbek zgrubnie oceniano wykonując próbę na żelu SDS-PAGE (Pastsystem, Pharmacia, 20% żelu) i porównując grubość pasma przy około 40 KDa w przypadku typu F oraz przy około 25 kDa w przypadku typu G z grubością pasm zanieczyszczeń. Czystość próbek wahała się od 20 do 70% (patrz tabela 9).
183 432
Tabela 9
Enzym Czystość (%)
30
TG53xynD (typ G) 20
TG456xynA 70
TG456xynD (typ G) 30
TG457xynA 70
TG479xynA 70
TG631xynA 70
TG631xynB 20
Przykład 12. Wyniki bielenia ECF z wykorzystaniem klonowanych ksylanaz typu F i G
Bielenie ECF przeprowadzono stosując delignifikowaną tlenowo masę celulozową siarczanową ze szwedzkiej papierni. Liczba κ masy celulozowej z drewna iglastego (SW) wynosiła 16,0 a liczba κ masy celulozowej z drewna liściastego (HW) wynosiła 10,6. Zastosowano sekwencję XDED w warunkach podanych w tabeli 10.
Tabela 10
Warunki bielenia
Etap X Do E D,
Stężenie 10% 10% 10% 10%
Czas 120 minut 60 minut 60 minut 120 minut
Temperatura 65°C 60°C 60°C 70°C
pH 9 »2,5 »10 »3,5
Dawka chemikaliów 15 pg białka ksylanazowego/g masy chlor, krotność 0,15 NaOH: 7,2 kg/t (SW); 5,9 kg/t (HW) aC12: 10 kg/t (SW/HW)
X = enzym; Do, Di = ditlenek chloru; E = ługowanie NaOH
Wyniki tych doświadczeń przedstawiono w tabeli 11. Można stwierdzić, że ksylanazy typu G wykazują nieznacznie lepszą skuteczność niż ksylanazy typu F, jeśli będzie się porównywać białka enzymów.
Tabela 11
Bielenie ECF z wykorzystaniem klonowanych ksylanaz typu F i G
Enzym Δ białości (% ISO)
SW HW
1 2 3
TG53xynA 1,02) 1,2 5)
TG53xynD (typ G) 5,9 ” / 6,84) 3,06)
TG456xynA 1,2 υ/0,72) 1,0 5)
TG456xynD (typ G) 4,3 3) /5,94) 4,0 5>/ 2,1 6)
183 432
ciąg dalszy tabeli 11
1 2 3
TG457xynA 0 υ 0-6)
TG479xynA 0,3 2) 0,3 5)
TG631xynA 0 ” 0-6)
TG631xynB 02) -
''6) dotyczy 6 odrębnych doświadczeń.
Stopnie białości według ISO w ślepych próbach w tych doświadczeniach wynosiły odpowiednio: doświadczenie 1: 73,5; doświadczenie 2: 78,3; doświadczenie 3: 52,0; doświadczenie 4: 52,3; doświadczenie 5: 79,0; doświadczenie 6: 80,5.
Przykład 13. Krzywe zależności dawka/reakcja w ECF z zastosowaniem klonowanych ksylanaz typu G
Wykorzystując tą samą sekwencję bielenia XDED, którą opisano w przykładzie 12, zmieniano dawkę dwóch ksylanaz typu G. Wyniki przedstawiono w tabeli 12. Dawki 1-3 pg/g masy celulozowej powodują wzrost białości ISO o co najmniej 2 punkty.
Tabela 12
Krzywe zależności dawka/reakcja dla dwóch ksylanaz typu G
Enzym Dawka (gg ksyl./g masy) Białość HW (XDED) Białość SW (XDED)
% ISO Δ % ISO % ISO Δ % ISO % ISO Δ % ISO
TG456 0 78,5 - 55,85 - 62,92 -
xynD 1 80,73 2,33 56,80 0,95 67,72 2,81
3 81,03 2,53 58,06 2,21 68,12 5,20
6 80,99 2,49 59,20 3,25 68,32 5,40
15 70,45 7,53
TG53 0 78,5 - 55,85 - 62,92 -
xynD 1 79,13 1,23 57,28 1,43 69,04 2,29
3 80,13 1,63 57,87 2,02 69,35 2,60
6 81,32 2,82 58,23 2,38 69,92 3,17
15 72,39 5,64
Przykład 14. Wyniki bielenia TCF z zastosowaniem klonowanych ksylanaz typu G
Dwie ksylanazy typu G zbadano w sekwencji bielenia TCF, z wykorzystaniem sekwencji XQPP opisanej poniżej w przykładzie 15. Zastosowano odligninowaną tlenowo masę celulozową siarczanową z drewna liściastego (30 g suchej masy w próbce). Dawkę ksylanaz typu G zmieniano, jak to podano w tabeli 13. Stopnie białości według ISO uzyskane dla każdej próbki po etapach X, PI i P2 podano w tabeli 13. Są to wielkości średnie z dwóch próbek.
183 432
Tabela 13
Bielenie TCF - reakcja na dawkę przy zastosowaniu ksylanaz typu G
Próbka Dawka (pg białka/g masy) Białość X Białość Pl Białość P2
Kontrolna 0 50,3 79,5 81,0
TG456 xynD 15 53,8 81,8 84,3
6 52,9 81,0 83,8
TG53 xynD 15 55,2 82,2 85,1
6 53,6 82,7 85,1
Doświadczenie powtórzono stosując 3 i 6 pg białka/g masy celulozowej. Oznaczano tylko stopień białości po etapie P2. Wyniki przedstawiono w tabeli 14.
Tabela 14
Bielenie TCF - reakcja na dawkę przy zastosowaniu ksylanaz typu G
Próbka Dawka (pg białka/g masy) Białość P2
Kontrolna 0 84,5
TG456 xynD 6 85,4
3 86,5
TG53 xynD 6 86,1
3 86,8
Przykład 15. Wyniki bielenia ECF i TCF, włącznie z właściwościami papieru
Zbadano wpływ próbek ksylanazy na bielenie ECF i TCF mas celulozowych siarczanowych z drewna liściastego (H/W) i iglastego (S/W), dostarczonych ze szwedzkiej papierni. Klonowane enzymy TG456 xynD i TG53 xynD (w przykładzie tym oznaczone odpowiednio jako 715 i 716) porównano z próbkami kontrolnymi “bez enzymu”. Testy rozdrabniania w młynie kulowym Lampen wykazały, że 715 wykazuje ogólnie lepsze właściwości użytkowe, zapewniając znaczną poprawę wskaźnika rozdzierania bez znaczącego spadku wskaźników wytrzymałości na rozciąganie i przepuklenia.
Schemat selekcjonowania
L.p. Drewno liściaste Drewno iglaste
1. TCF kontr. QPP TCF kontr. QPP
2. Enzym 715 XQPP Enzym 715 XQPP
3. Enzym 716 XQPP Enzym 716 XQPP
4. ECF kontr. bez X DEDED ECF kontr. bez X DEDED
5. Enzym 715 XDEDED Enzym 715 XDEDED
6. Enzym 716 XDEDED Enzym 716 XDEDED
7. Chem. kontr. DEDED Chem. kontr. DEDED
183 432
Właściwości niebielonej masy celulozowej
Masa Liczba κ % białości ISO Lepkość dm3/kg
Siarczanowa H/W 10,8 53 1104
Siarczanowa S/W 16,1 36,4 1003
Oznaczane parametry bielenia - TCF
% białości ISO Zużycie chemikaliów Liczba κ Lepkość Wytrzymałość papieru
Po X XQP XQPP XQPP XQPP
XQP XQPP
XQPP
Oznaczane parametry bielenia - ECF
% białości ISO Zużycie chemikaliów Liczba κ Lepkość Wytrzymałość papieru
PoX XDE XDE XDEDED XDEDED
XDE XDED
XDED XDEDED
XDEDED
Warunki bielenia
A) TCF H/W i S/W (te same warunki bielenia dla obydwu mas celulozowych
Etap X Q P P
Stężenie (%) 10 9 10 10
Czas (minuty) 120 5 * 4 s w mieszarce 180 180
Temperatura (°C) 65 65 85 85
pH 9 4-5 10,5-11 10,5-11
Wsad enzymu 3 . - - -
Wsad EDTA (kg/t) - 3 - -
Wsad NaOH (kg/t) - - 20 10
Wsad H2O2 (kg/t) - - 20 10
B) ECF dla H/W
Etap X D E D E D
Stężenie (%) 10 10 10 10 10 10
Czas (minuty) 120 60 60 120 60 180
Temperatura (°C) 65 60 60 70 60 70
pH 9 2-3 -11,5 2,5-3 -11,5 4-5
Wsad enzymu 3 - - - - -
Wsad aCl (kg/t) - 0,18 * κ = 19,4 dla X kontr, i wszystkich X 21,6 dla Chem. kontr. - 18 - 8
Wsad NaOH (kg/t) - - 11,6 dla X kontr. i wszystkich X 13 dla Chem. kontr. - 10 -
183 432
C) ECF dla S/W
Etap X D E D E D
Stężenie (%) 10 10 10 10 10 10
Czas (minuty) 120 60 60 120 60 180
Temperatura (°C) 65 60 60 70 60 70
pH 9 2-3 -11,5 2,5-3 - 11,5 4-5
Wsad enzymu (pg/g) 3 - - - - -
Wsad aCl (kg/t) - 0,18 * κ = 28,8 dla X kontr, i wszystkich X 32 dla Chem. kontr. - 18 - 8
Wsad NaOH (kg/t) - - 17,36 dla X kontr. i wszystkich X 19,2 dla Chem. kontr. - 10 -
Wyniki uzyskane w powyższych doświadczeniach zestawiono w tabelach 15 (drewno liściaste) i 16 (drewno iglaste).
Tabela 15
Zestawienie wyników bielenia drewna liściastego
Liściaste
P2 % ISO P2 κ P2 lepkość P łącznie
TCF kontr. 78,4 6,7 866 25,2
TCF 715 81 6,2 850 26,1 ++ - -
TCF 716 81,7 6,2 740 27,7 ++ —
D2 % ISO XDE κ D2 lepkość aCl łącznie
ECF kontr. 88,6 4,6 1050 46,1
ECF 715 89,1 4,5 1035 44,8 ++ -+
ECF 716 88,6 4,6 1040 45 00-+
Chem. kontr. 88,6 4,9 1020 47
Tabela 16
Zestawienie wyników bielenia drewna iglastego
Iglaste
P2 % ISO P2 κ P2 lepkość Płącznie
TCF kontr. 69,1 7,3 814 18,5
TCF 715 72,1 6,7 805 16 ++ -+
TCF 716 71 6,7 833 16,7 +-H-
D2 % ISO XDEk D2 lepkość aCl łącznie
ECF kontr. 85,5 4,6 941 54,5
ECF 715 86,5 4,4 935 54,5 ++ -0
ECF 716 86,7 4,3 935 54,5 ++ -0
Chem. kontr. 87,5 3,7 962 57,3
183 432
Sprawdzenie właściwości papieru
Po wykonaniu całej sekwencji pełnego bielenia pobrano próbki 30 g i rozdrobniono w młynie kulowym Lampen (10, 20 i 30 tysięcy obrotów). Oznaczono parametr Schoppera-Rieglersa, po czym wykonano około 2-gramowe arkusze do oznaczenia wskaźnika odporności na rozciąganie, wskaźnika porowatości, wskaźnika wytrzymałości na rozdzieranie i wskaźnika przepuklenia. Arkusze sezonowano przez 24 godziny w 23 °C przy wilgotności względnej 50%. Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 4-8.
Przykład 16. Optimum pH, optimum temperaturowe i termostabilność TG456 xynD
Aktywności oznaczono w sposób podany w przykładzie 2, metoda 1, stosując ksylan orkiszowy jako substrat. Wszystkie testy przeprowadzano w 50 mM buforze fosforanowym, przy podanych pH i temperaturach. Wyniki przedstawiono na fig. 9 i 10.
Ksylanaza D z TG456 jest o wiele bardziej termostabilna niż enzym wzorcowy, Pulpenzyme HB (Novo Nordisk) oraz wykazuje nieco wyższe optimum pH.
Zestawienie sekwencji (1) Informacja ogólna (i) Zgłaszający (A) Nazwa: Gist-brocades B.V (B) Ulica: Wateringseweg 1 (C) Miasto: Delft (E) Państwo: Holandia (F) Kod pocztowy (ZIP): 2611 XI (ii) Tytuł wynalazku: Termostabilne ksylanazy (iii) Liczba sekwencji: 13
183 432 (iv) Postać odczytywana komputerowo:
(A): Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1,0, wersja #1.25 (EPO (2) Informacja dotycząca Seq. nr 1 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 17 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:
(C) Konkretny izolat: xynFA (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 1
CACACKCTKG TKTGGCA (2) Informacja dotycząca Seq. nr 2 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 17 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie
183 432 (vi) Źródło pochodzenia:
(C) Konkretny izolat: xynFB (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 2 CATACKTTKG TTTGGCA (2) Informacja dotycząca Seq. nr 3 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 17 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) : Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: tak (vi) Źródło pochodzenia:
(C) Konkretny izolat: xynr (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 3 TMGTTKACMA CRTCCCA (2) Informacja dotycząca Seq. nr 4 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 21 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:
(C) Konkretny izolat: GF
183 432 (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 4 TATNTGRSTN TMTATGGWTG G (2) Informacja dotycząca Seq. nr 5 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 20 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: tak (vi) Źródło pochodzenia:
(C) Konkretny izolat: GR (xi) Opis sekwencji: Seg. ID nr 5 CCGCTNCTTT GGTANCCTTC (2) Informacja dotycząca Seg. nr 6 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 1065 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:
(A) Organizm: Extremophile (C) Konkretny izolat: TG456
183 432 (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 3..1058 (D)Inna informacja: / produkt = ksylanaza A /gen = xynA (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 6
CC ATG GAC CTT TAT TCA ATC TCA GAT GAA AAT TGG GGG CAG CCT GTG 47 Met Asp Leu Tyr Ser Ile Ser Asp Glu Asn Trp Gly Gln Pro Val 15 1015
CCT GAT TAT AAA CTG CCA TCA CTT TGT GAA AAG TAC AAA AAC TAT TTC95
Pro Asp Tyr Lys Leu Pro Ser Leu Cys Glu Lys Tyr Lys Asn TyrPhe
2530
AAG ATT GGA GTT GCT GTG CCC TAC AGG GCT CTG ACA AAT CCA GTT GAT143
Lys Ile Gly Val Ala Val Pro Tyr Arg Ala Leu Thr Asn Pro ValAsp
4045
GTG GAG ATG ATA AAA AGG CAT TTC AAC AGC ATA ACA CCG CGA AAC GAG191
Val Glu Met Ile Lys Arg His Phe Asn Ser Ile Thr Pro Glu AsnGlu
5560
ATG AAA CCA GAG AGC CTT CAG CCT TAT GAA CGT GGT TTT AGC TTT AGC239
Met Lys Pro Glu Ser Leu Gln Pro Tyr Glu Gly Gly Phe Ser PheSer
7075
ATT GCA GAT GAG TAT ATA GAT TTT TGC AAA AAG AAC AAT ATC TCA CTG287
Ile Ala Asp Glu Tyr Ile Asp Phe Cys Lys Lys Asn Asn Ile SerLeu
85 9095
CGA GGG CAC ACK CTT GTT TGG CAT CAG CAA ACC CCG AGC TGG TTC TTT335
Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Gln Gln Thr Pro Ser Trp PhePhe
100 105110
ACA AAT CCT GAG ACG GGC GAA AAA CTT ACT AAC AGT GAG AAG GAC AAG383
Thr Asn Pro Glu Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asn Ser Glu Lys AspLys
115 120125
RAA ATA CTA TTG GAT AGG CTA AAG AAG CAC ATC CAG ACA GTT GTT GGC431
Xaa Ile Leu Leu Asp Arg Leu Lys Lys His Ile Gln Thr Val ValGly
130 135140
AGG TAT AAG GGG AAA GTA TAT GCA TGG GAC GTT GTG AAT GAG GCG AAT479
Arg Tyr Lys Gly Lys Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu AlaIle
145 150155
GAT GAG AAT CAG CCG GAT GGG TAT AGA AGA AGT GAC TGG TAC AAT ATC527
Asp Glu Asn Gln Pro Asp Gly Tyr Arg Arg Ser Asp Trp Tyr AsnIle
160 165170
183 432
TTR GGA CCG GAG TAC Tyr 180 ATT Ile GAA Glu AAG GCA Lys Ala TTT Phe 185 ATC Ile TGG GCG Trp Ala CAT His GAA Glu 190 GCA Ala 575
Xaa Gly Pro Glu
GAC CCG AAA GCA AAG CTT TTC TAC AAT GAC TAC AGT ACA GAA GAM CCA 623
Asp Pro Lys Ala 195 Lys Leu Phe Tyr Asn 200 Asp Tyr Ser Thr Glu 205 Xaa Pro
TAT AAA AGA GGG AAT TTA TAT ACA CTA ATT AAA AAY TTA AAA GCM AAA 671
Tyr Lys Arg 210 Gly Asn Leu Tyr Thr 215 Leu Ile Lys Asn Leu 220 Lys Ala Lys
GGT GTG CCA GTT CAT GGT GTT GGG CTT CAG TGT CAT ATT TCA CTT GAC 719
Gly Val 225 Pro Val His Gly Val 230 Gly Leu Gln Cys His 235 Ile Ser Leu Asp
TGG CCG GAT GTG AGT GAA ATC GAG GAG ACT GTC AAA TTA TTT AGC AGG 767
Trp 240 Pro Asp Val Ser Glu 245 Ile Glu Glu Thr Val 250 Lys Leu Phe Ser Arg 255
ATT CCA GGA CTT GAA ATA CAC TTC ACA GAA ATT GAT ATA AGT ATT GCT 815
Ile Pro Gly Leu Glu 260 Ile His Phe Thr Glu 265 Ile Asp Ile Ser Ile 270 Ada
AAA AAC ATG ACC GAT GAT GAT GCA TAT AAC CGC TAT CTT TTG ATT CAG 863
Lys Asn Met Thr 275 Asp Asp Asp Ala Tyr 280 Asn Arg Tyr Leu 285 Leu Ile Gln
CAG GCA CAA AAA TTA AAA GCA ATT TTT GAT GTT TTG AAA AAG TAC AGA 911
Gln Ala Gln 290 Lys Leu Lys ALa Ile 295 Phe Asp Val Leu Lys 300 Lys Tyr Arg
AAT GTA GTT ACA AGT GTT ACA TTC TTG GGA CTG AAG GAT GAT TAC TCA 959
Asn Val 305 Val Thr Ser Val Thr 310 Phe Trp Gly Leu Lys 315 Asp Asp Tyr Ser
TGG CTA CGG GGA GAT ATG CCA CTT TTA TTC GAT AAA GAC TAC CAG CCA 1007
Trp 320 Leu Arg Gly Asp Met 325 Pro Leu Leu Phe Asp 330 Lys Asp Tyr Gln Pro 335
AAG TTT GCG TTC TGG AGC TTA ATT GAC CCA TCA GTT GTC CCA AAA GAG 1055
Lys Phe Ala Phe Trp 340 Ser Leu Ile Asp Pro 345 Ser Val Val Pro Lys 350 Glu
(2) Informacja dotycząca Seq. nr 7 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 351 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji:
Seq. ID nr 7
183 432
Met Asp Leu Tyr Ser Ile Ser Asp Glu 5
Asp Tyr Lys Leu Pro Ser Leu Cys Glu 2025
Ile Gly Val Ala Val Pro Tyr Arg Ala 3540
Glu Met Ile Lys Arg His Phe Asn Ser 5055
Lys Pro Glu Ser Leu Gin Pro Tyr Glu 6570
Ala Asp Glu Tyr Ile Asp Phe Cys Lys 85
Gly His Thr Leu Val Trp His Gin Gin 100105
Asn Pro Glu Thr Gly Glu Lys Leu Thr 115120
Ile Leu Leu Asp Arg Leu Lys Lys His 130135
Tyr Lys Gly Lys Val Tyr Ala Trp Asp 145150
Glu Asn Gin Pro Asp Gly Tyr Arg Arg 165
Gly Pro Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Phe 180185
Pro Lys Ala Lys Leu Phe Tyr Asn Asp 195200
Lys Arg Gly Asn Leu Tyr Thr Leu Ile 210215
Val Pro Val His Gly Val Gly Leu Gin 225230
Pro Asp Val Ser Glu Ile Glu Glu Thr 245
Pro Gly Leu Glu Ile His Phe Thr Glu 260265
Asn Met Thr Asp Asp Asp Ala Tyr Asn 275280
Ala Gin Lys Leu Lys Ala Ile Phe Asp 290295
Asn Trp Gly Gin Pro Val Pro 10 15
Lys Tyr Lys Asn Tyr Phe Lys 30
Leu Thr Asn Pro Val Asp Val 45
Ile Thr Pro Glu Asn Glu Met 60
Gly Gly Phe Ser Phe Ser Ile 75 80
Lys Asn Asn Ile Ser Leu Arg 90 95
Thr Pro Ser Trp Phe Phe Thr 110
Asn Ser Glu Lys Asp Lys Xaa 125
Ile Gin Thr Val Val Gly Arg 140
Val Val Asn Glu Ala Ile Asp 155 160
Ser Asp Trp Tyr Asn Ile Xaa 170 175
Ile Trp Ala His Glu Ala Asp 190
Tyr Ser Thr Glu Xaa Pro Tyr 205
Lys Asn Leu Lys Ala Lys Gly 220
Cys His Ile Ser Leu Asp Trp 235 240
Val Lys Leu Phe Ser Arg Ile 250 255
Ile Asp Ile Ser Ile Ala Lys 175
Arg Tyr Leu Leu Ile Gin Gin 285
Val Leu Lys Lys Tyr Arg Asn 300
183 432
Val Val Thr Ser Val Thr Phe Trp Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Trp
305 310 315320
Leu Arg Gly Asp Met Pro Leu Leu Phe Asp Lys Asp Tyr Gin ProLys
325 330335
Phe Ala Phe Trp Ser Leu Ile Asp Pro Ser Val Val Pro Lys Glu 340 345350 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 8 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 1633 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) : Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:
(A) Organizm: Extremophile (C) Konkretny izolat: TG456 (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1..1632 (D)Inna informacja: /częściowy/produkt = ksylanaza B /gen = xynB (xi) Opis sekwencji: Seg. ID nr 8
TGT Cys 1 ACC ATA AAA TGG CAG Gin CAA ACA GTT CCA TCT GGG GTT TGG ACA GAA 48
Thr Ile Lys Trp 5 Gin Thr Val Pro 10 Ser Gly Val Trp Thr 15 Glu
GTT TCT GGT TCA TAT ACA GTA CCA CAG ACA GCA ACC CAG CTC ATA TTC 96
Val Ser Gly Ser 20 Tyr Thr Val Pro Gin 25 Thr Ala Thr Gin Leu Ile 30 Phe
TAT GTG GAA TCG CCA AAT GCA ACA CTT GAC TTT TAC CTT GAC GAC TTT 144
Tyr Val Glu 35 Ser Pro Asn Ala Thr 40 Leu Asp Phe Tyr Leu 45 Asp Asp Phe
183 432
ACT GTA ΑΤΑ GAC AAA AAC CCG GTT ACA ATA CCT GCT GCG GCA AAA GAG 192 Thr Val Ile Asp Lys Asn Pro Val Thr Ile Pro Ala Ala Ala Lys Glu
5560
CCA GAG TTG GAG ATT CCA TCA CTT TGC CAG CAA TAC AGC CAG TAC TTT240
Pro Glu Leu Glu Ile Pro Ser Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Gin TyrPhe
70 7580
TCA ATT GGT GTT GCA ATA CCA TAT AGA GTG CTC CAA AAC CCG GTA GAA288
Ser Ile Gly Val Ala Ile Pro Tyr Arg Val Leu Gin Asn Pro ValGlu
9095
AGA GCA ATG GTT TTA AAG CAT TTC AAC AGT ATT ACT GCT GAA AAT GAG336
Arg Ala Met Val Leu Lys His Phe Asn Ser Ile Thr Ala Glu AsnGlu
100 105110
ATG AAG CCC GAT GCT ATA CAA AGA ACA GAA GGG CAG TTC AAT TTC GAT384
Met Lys Pro Asp Ala Ile Gin Arg Thr Glu Gly Gin Phe Asn PheAsp
115 120125
GTT GCA GAC CAG TAT GTT GAC TTT GCA CAG AGC AAT AAT ATT GGA ATA432
Val Ala Asp Gin Tyr Val Asp Phe Ala Gin Ser Asn Asn Ile GlyIle
130 135140
AGA GGT CAT ACA CTG GTT TGG CAT CAA CAA ACT CCA GAT TGG TTT TTC480
Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Gin Gin Thr Pro Asp Trp PhePhe
145 150 155160
CAG CAT TCT GAC GGT TCG CCA CTT GAT CCA AAC AAT TCT GAA GAC AAG528
Gin His Ser Asp Gly Ser Pro Leu Asp Pro Asn Asn Ser Glu AspLys
165 170175
CAG CTT TTG AGA AAT AGG TTA AAA ACA CAC ATT CAG ACA CTT GTT GGA576
Gin Leu Leu Arg Asn Arg Leu Lys Thr His Ile Gin Thr Leu ValGly
180 185190
AGA TAT GCA GAG AAA GTT TAT GCA TGG GAT GTT GTA AAT GAA GCA ATT634
Arg Tyr Ala Glu Lys Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu AlaIle
195 200205
GAT GAA AAT CAA CCG GAT GGA TAT AGA AGA AGT GAA TGG TAC AGA ATT672
Asp Glu Asn Gin Pro Asp Gly Tyr Arg Arg Ser Glu Trp Tyr ArgIle
210 215220
TTA GGA CCA ACT CCA GAA ACA GGC GGA ATA CCA GAG TAT ATA ATC CTT720
Leu Gly Pro Thr Pro Glu Thr Gly Gly Ile Pro Glu Tyr Ile IleLeu
225 230 235240
GAC TTC CAG TAT GCA CGG GAA GCT GAC CCG AAC GCA AAA CTT TTC TAC768
Ala Phe Gin Tyr Ala Arg Glu Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu PheTyr
245 250255
AAC GAT TAC AGC ACT GAA AAT CCA AAG AAG AGA CAG TTT ATT TAC AAC816
Asn Asp Tyr Ser Thr Glu Asn Pro Lys Lys Arg Gin Phe Ile TyrAsn
260 265270
183 432
ATG GTC AAA GCT Ala TTG CAT GAT AGA GGT Gly CTC ATT GAT Asp GGT Gly 285 GTT Val GGT Gly CTG Leu 864
Met Val Lys 275 Leu His Asp Arg 280 Leu Ile
CAG GGA CAT ATT AAT GTG GAT TCG CCT GCA GTC AAA GAA ATA GAA GAT 912
Gin. Gly 290 His Ile Asn. Val Asp 295 Ser Pro Ala Val Lys 300 Glu Ile Glu Asp
ACA ATC AAT TTA TTC AGC ACA ATA CCG GGT CTT CAA ATT CAA ATA ACA 960
Thr 305 Ile Asn Leu Phe Ser 310 Thr Ile Pro Gly Leu 315 Gin Ile Gin. Ile Thr 320
GAG CTT GAT ATC AGC GTA TAT ACA AGC AGC ACT CAG CAA TAT GAC ACA 1008
Glu Leu Asp Ile Ser 325 Val Tyr Thr Ser 330 Ser Thr Gin Gin Tyr Asp 335 Thr
TTA CCA CAG GAT ATT ATG ATT AAA CAG GCT TTA AAA TTC AAA GAG CTG 1056
Leu Pro Gin Asp 340 Ile Met Ile Lys Gin 345 Ala Leu Lys Phe Lys 350 Glu Leu
TTT GAA ATG TTA AAG CGC CAC AGC GAC AGA ATC ACA AAT GTT ACA CTT 1104
Phe Glu Met 355 Leu Lys Arg His Ser 360 Asp Arg Ile Thr Asn 365 Val Thr Leu
TGG GGT CTC AAA GAT GAT TAT CCA TGG CTG TCA AAA GAT AGA AGT AAC 1152
Trp Gly 370 Leu Lys Asp Asp Tyr 375 Pro Trp Leu Ser Lys 380 Asp Arg Ser Asn
TGG CCA CTG CTA TTT GAT AGT AAC TAC CAG GCA AAA TAC AAT TAC TGG 1200
Trp 385 Pro Leu Leu Phe Asp 390 Ser Asn Tyr Gin Ala 395 Lys Tyr Asn Tyr Trp 400
GCT ATT GTA GAA CCT TCG GTG TTG CCT GTT GCT ATA AAT AAG GGA TAT 1248
Ala Ile Val Glu Pro 405 Ser Val Leu Pro Val 410 Ala Ile Asn. Lys Gly 415 Tyr
GCG AAC AAT GCA CAG CCA AGA ATT GAT GGG ATT ATG GAT AAA GAA TAC 1296
Ala Asn Asn Ala 420 Gin Pro Arg Ile Asp 425 Gly Ile Met Asp Lys 430 Glu Tyr
AAA GGA ACC ATT CCA CTT TCG GTT TTG AAT GAT GCA GGG CAG GAT ATT 1344
Lys Gly Thr 435 Ile Pro Leu Ser Val 440 Leu Asn Asp Ala Gly 445 Gin Asp Ile
GCT CAG GTA AGG GCA CTG TGG AGT GGC AAT GAG CTT TGT CTT TAT GTC 1392
Ala Gin 450 Val Arg Ala Leu Trp 455 Ser Gly Asn Glu Leu 460 Cys Leu Tyr Val
ACT GTA AAT GAT TCA AGT GTG GAT GCT AAC AAT GAT AGG GTT GTA ATT 1440
Thr 465 Val Asn Asp Ser Ser 470 Val Asp Ala Asn Asn 475 Asp Arg Val Val Ile 480
TTC ATT GAT CAG GAC AAT GGA AAG TTG CCA GAG TTA AAA GAT GAT GAC 1488
Phe Ile Asp Gin Asp 485 Asn Gly Lys Leu Pro 490 Glu Leu Lys Asp Asp 495 Asp
TTC TGG GTT TCA ATT TCG AGA AAT GGC ACA AAG AAT CAA TCC AAA ACT 1536
Phe Trp Val Ser 500 Ile Ser Arg Asn Gly 505 Thr Lys Asn. Gin Ser 510 Lys Thr
183 432
GGC TAT GTA AAA GAT TAT GTA GTG TTA CAG CAA TTA AAT GGA TAT ACA
Gly Tyr Val Lys Asp Tyr Val Val Leu Gln Gln Leu Asn Gly Tyr Thr
515 520 525
ATG GAG GTT AAG CTG CTT TTA AAC AAC AGT TTA GCA ATT AAC ACA AAT
Met Glu Val Lys Leu Leu Leu Asn Asn Ser Leu Ala Ile Asn Thr Asn
530 535 540 (2) Informacja dotyczącą Seq. nr 9 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 544 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 9
1584
1632
Cys Thr Ile Lys Trp Gln Gln Thr 15
Val Ser Gly Ser Tyr Thr Val Pro 20
Tyr Val Glu Ser Pro Asn Ala Thr 3540
Thr Val Ile Asp Lys Asn Pro Val 5055
Pro Glu Leu Glu Ile Pro Ser Leu 6570
Ser Ile Gly Val Ala Ile Pro Tyr 85
Arg Ala Met Val Leu Lys His Phe 100
Met Lys Pro Asp Ala Ile Gln Arg 115120
Val Ala Asp Gln Tyr Val Asp Phe 130135
Arg Gly His Thr Leu Val Trp His 145150
Val Pro Ser Gly Val Trp Thr Glu 1015
Gln Thr Ala Thr Gln Leu Ile Phe 2530
Leu Asp Phe Tyr Leu Asp Asp Phe 45
Thr Ile Pro Ala Ala Ala Lys Glu 60
Cys Gln Gln Tyr Ser Gln Tyr Phe 7580
Arg Val Leu Gln Asn Pro Val Glu 9095
Asn Ser Ile Thr Ala Glu Asn Glu 105110
Thr Glu Gly Gln Phe Asn Phe Asp 125
Ala Gln Ser Asn Asn Ile Gly Ile 140
Gln Gln Thr Pro Asp Trp Phe Phe
155 160
Gln His Ser Asp Gly Ser Pro Leu Asp Pro Asn Asn Ser Glu Asp Lys
165 170 175
183 432
Gin Leu Leu Arg Asn Arg Leu Lys Thr His Ile Gin Thr Leu Val Gly 180 185190
Arg Tyr Ala Glu Lys Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Ile 195 200205
Asp Glu Asn Gin Pro Asp Gly Tyr Arg Arg Ser Glu Trp Tyr Arg Ile 210 215220
Leu Gly Pro Thr Pro Glu Thr Gly Gly Ile Pro Glu Tyr Ile IleLeu
225 230 235240
Ala Phe Gin Tyr Ala Arg Glu Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu PheTyr
245 250255
Asn Asp Tyr Ser Thr Glu Asn Pro Lys Lys Arg Gin Phe Ile Tyr Asn 260 265270
Met Val Lys Ala Leu His Asp Arg Gly Leu Ile Asp Gly Val Gly Leu 275 280285
Gin Gly His Ile Asn Val Asp Ser Pro Ala Val Lys Glu Ile Glu Asp 290 295300
Thr Ile Asn Leu Phe Ser Thr Ile Pro Gly Leu Gin Ile Gin IleThr
305 310 315320
Glu Leu Asp Ile Ser Val Tyr Thr Ser Ser Thr Gin Gin Tyr AspThr
325 330335
Leu Pro Gin Asp Ile Met Ile Lys Gin Ala Leu Lys Phe Lys Glu Leu 340 345350
Phe Glu Met Leu Lys Arg His Ser Asp Arg Ile Thr Asn Val Thr Leu 355 360365
Trp Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Pro Trp Leu Ser Lys Asp Arg Ser Asn 370 375380
Trp Pro Leu Leu Phe Asp Ser Asn Tyr Gin Ala Lys Tyr Asn TyrTrp
385 390 395400
Ala Ile Val Glu Pro Ser Val Leu Pro Val Ala Ile Asn Lys GlyTyr
405 410415
Ala Asn Asn Ala Gin Pro Arg Ile Asp Gly Ile Met Asp Lys Glu Tyr ’ 420 425430
Lys Gly Thr Ile Pro; Leu Ser Val Leu Asn Asp Ala Gly Gin Asp Ile 435 440445
Ala Gin Val Arg Ala Leu Trp Ser Gly Asn Glu Leu Cys Leu Tyr Val 450 455460
Thr Val Asn Asp Ser Ser Val Asp Ala Asn Asn Asp Arg Val Val Ile 465 470 475480
Phe Ile Asp Gin Asp Asn Gly Lys Leu Pro Glu Leu Lys Asp Asp Asp
485 490495
183 432
Phe Trp Val Ser Ile Ser Arg Asn Gly Thr Lys Asn Gin. Ser Lys Thr 500 505510
Gly Tyr Val Lys Asp Tyr Val Val Leu Gin Gin Leu Asn Gly Tyr Thr 515 520525
Met Glu Val Lys Leu Leu Leu Asn Asn Ser Leu Ala Ile Asn Thr Asn 530 535540 (2) Informacja dotycząca Seg. nr 10 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 1125 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) : Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:
(A) Organizm: Extremophile (C) Konkretny izolat: TG456 (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1..1125 (D)Inna informacja: /częściowy/produkt = ksylanaza C /gen = ”xynC’' (xi) Opis, sekwencji: Seg. ID nr 10
CGC GAG TTA TTA CTT TAT GTT
Arg Glu Leu Leu Leu Tyr Val 1 5
TGG GTT GAT GAT TTA AAG ATT Trp Val Asp Asp Leu Lys Ile 20
GAG GCG CAA ΑΆΤ GCA AAT TTG GCT TTC Glu Ala Gin Asn Ala Asn Leu Ala Phe 10 15
TAT GAT TTA TCC AAG CTG GCT GAA CCT Tyr Asp Leu Ser Lys Leu Ala Glu Pro 25 30
183 432
GAA TGG GAG ATA CCA TCT TTG ΆΤΑ GAA AAG TAT AAA GAT TAT TTC AAA144
Glu Trp Glu Ile Pro Ser Leu Ile Glu Lys Tyr Lys Asp Tyr PheLys
4045
GTA GGG GTA GCT TTG TCT TAC AAA AGT ATT GCT YCT GAT ACA GAG AAG192
Val Gly Val Ala Leu Ser Tyr Lys Ser Ile Ala Xaa Asp Thr GluLys
5560
AAG ATG GTT TTG AAG CAT TTC AAT AGT ATT ACT GCA GGG AAT GAA ATG2 40
Lys Met Val Leu Lys His Phe Asn Ser Ile Thr Ala Gly Asn GluMet
7075
AAA CCA TCA GAG TTA CTT ATC AGT GAA AAT AAT TAT AAC TTT ACT AAA288
Lys Pro Ser Glu Leu Leu Ile Ser Glu Asn Asn Tyr Asn Phe SerLys
9095 gCA GAT GAA TTT GTA AAT TTT GCA ACA AGT AAC AAC ATT GCC ATC AGA336
Ala Asp Glu Phe Val Asn Phe Ala Thr Ser Asn Asn Ile Ala IleArg
100 105110
GGT CAT ACA CTG GTT TGG CAT GAG CAA ACA CCC GAC TGG TTT TTC AAG384
Gly His Thr Leu Val Trp His Glu Gin Thr Pro Asp Trp Phe PheLys
115 120125
GAT GCA AAT GGA AAT ACC TTG AGC AAG GAT GCA TTG CTA AGC AGA TTA432
Asp Ala Asn Gly Asn Thr Leu Ser Lys Asp Ala Leu Leu Ser ArgLeu
130 135140
AAG CAG TAT ATT TAT ACG GTA GTG GGA AGA TAT AAA GGG AAG GTT TAT480
Lys Gin Tyr Ile Tyr Thr Val Val Gly Arg Tyr Lys Gly Lys ValTyr
145 150 155160
GCA TGG GAT GTG GTA AAT RAA GCA ATA GAT GAA AGT CAA GGT AAT GGA528
Ala Trp Asp Val Val Asn Xaa Ala Ile Asp Glu Ser- Gin Gly AsnGly
165 170175
TTC AGG AGA TCT AAC TGG TAC AAC ATT TGT GGT CCC GAA TAT ATT GAA576
Phe Arg Arg Ser Asn Trp Tyr Asn Ile Cys Gly Pro Glu Tyr IleGlu
180 185190
AAG GCT TTT ATA TGG GCA CAT GAR GCC GAT CCA GAC GCA AAA TTG TTT624
Lys Ala Phe Ile Trp Ala His Glu Ala Asp Pro Asp Ala Lys LeuPhe
195 200205
TAC AAC GAT TAC AAC ACA GAA AAC AGT CAG AAG AGA CAG TTT ATT TMC672
Tyr Asn Asp Tyr Asn Thr Glu Asn Ser Gin Lys Arg Gin Phe IleXaa
210 215220
AAC ATG ATT AAG AGT CTC AAG GAA AAA GGT GTT CCA ATT CAT GGA ATA720
Asn Met Ile Lys Ser Leu Lys Glu Lys Gly Val Pro Ile His GlyIle
225 230 235240
GAA TTG CGG TGT CAT ATA AAT CTT GAT TGG CCC TCG ATT AGC GAG ATA768
Gly Leu Arg Cys His Ile Asn Leu Asp Trp Pro Ser Ile Ser GluIle
245 250255
GAG AAC ACC ATA AAA TTG TTC AGC TCT ATA CCT GGA TTG GAG ATA CAC816
Glu Asn Thr Ile Lys Leu Phe Ser Ser Ile Pro Gly Leu Glu IleHis
260 265270
183 432
ATT ACG GAG Glu 275 CTT Leu GAT ATG AGT Ser TTT Phe 280 TAT Tyr CAG Gin TGG GGT Trp Gly TCG AGT ACC AGT 864
Ile Thr Asp Met Ser 285 Ser Thr Ser
TAT TCA ACG CCA CCM AGA GAT CTC CTG ATA AAA CAG GCA ATG AGA TAT 912
Tyr Ser Thr Pro Pro Arg Asp Leu Leu Ile Lys Gin Ala Met Arg Tyr
290 295 300
AAG GAG TTA TTC GAT TTA TTT ΆΆΆ AAG TAC AAT GTA ATA ACT AAT GTA 960
Lys Glu Leu Phe Asp Leu Phe Lys Lys Tyr Asn Val Ile Thr Asn Val
305 310 315 320
ACA TTC TGG GGA CTA AAG GAT GAT TAC TCA TGG CTG AGT CAA AAC TTT 1008
Thr Phe Trp Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Trp Leu Ser Gin Asn Phe
325 330 335
GGA AAA AGT GAT TAC CCG TTG TTA TTT GAT GGA AAC TAT AAG TCA AAA 1056
Gly Lys Ser Asp Tyr Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn Tyr Lys Ser Lys
340 345 350
TAT GCC TTT TGG AGC CTG ATT GAG CCA ACT GTG GTG CCG GTT ACC GGT 1104
Tyr Ala Phe Trp Ser Leu Ile Glu Pro Thr Val Val Pro Val Thr Gly
355 360 365
CAT AGC TGT TTT TGC GCC ATG 1125
His Ser Cys Phe Cys Ala Met
370 375
(2) Informacja dotycząca Seq. nr 11 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 375 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Seg. ID nr 11
Arg Glu Leu Leu Leu 1 5
Trp Val Asp Asp Leu 20
Glu Trp Glu Ile Pro 35
Val Gly Val Ala Leu 50
Lys Met Val Leu Lys 65
Tyr Val Glu Ala Gin 10
Lys Ile Tyr Asp Leu 25
Ser Leu Ile Glu Lys 40
Ser Tyr Lys Ser Ile 55
His Phe Asn Ser Ile 70
Asn Ala Asn Leu Ala Phe 15
Ser Lys Leu Ala Glu Pro 30
Tyr Lys Asp Tyr Phe Lys 45
Ala Xaa Asp Thr Glu Lys 60
Thr Ala Gly Asn Glu Met 75 80
183 432
Lys Pro Ser Glu Leu Leu Ile Ser 85
Ala Asp Glu Phe Val Asn Phe Ala 100
Gly His Thr Leu Val Trp His Glu 115120
Asp Ala Asn Gly Asn Thr Leu Ser 130135
Lys Gln Tyr Ile Tyr Thr Val Val 145150
Ala Trp Asp Val Val Asn Xaa Ala 165
Phe Arg Arg Ser Asn Trp Tyr Asn 180
Lys Ala Phe Ile Trp Ala His Glu 195200
Tyr Asn Asp Tyr Asn Thr Glu Asn 210215
Asn Met Ile Lys Ser Leu Lys Glu 225230
Gly Leu Arg Cys His Ile Asn Leu 245
Glu Asn Thr Ile Lys Leu Phe Ser 260
Ile Thr Glu Leu Asp Met Ser Phe 275280
Tyr Ser Thr Pro Pro Arg Asp Leu 290295
Lys Glu Leu Phe Asp Leu Phe Lys 305310
Thr Phe Trp Gly Leu Lys Asp Asp 325
Gly Lys Ser Asp Tyr Pro Leu Leu 340
Tyr Ala Phe Trp Ser Leu Ile Glu
355 360
Asn Asn Tyr Asn Phe Ser Lys 90 95
Ser Asn Asn Ile Ala Ile Arg 110
Thr Pro Asp Trp Phe Phe Lys 125
Asp Ala Leu Leu Ser Arg Leu 140
Arg Tyr Lys Gly Lys Val Tyr 155 160
Asp Glu Ser Gln Gly Asn Gly 170 175
Cys Gly Pro Glu Tyr Ile Glu 190
Asp Pro Asp Ala Lys Leu Phe 205
Gln Lys Arg Gln Phe Ile Xaa 220
Gly Val Pro Ile His Gly Ile 235 240
Trp Pro Ser Ile Ser Glu Ile 250 255
Ile Pro Gly Leu Glu Ile His 270
Gln Trp Gly Ser Ser Thr Ser 285
Ile Lys Gln Ala Met Arg Tyr 300
Tyr Asn Val Ile Thr Asn Val 315 320
Ser Trp Leu Ser Gln Asn Phe 330 335
Asp Gly Asn Tyr Lys Ser Lys 350
Thr Val Val Pro Val Thr Gly 365
His Ser Cys Phe Cys Ala Met
370 375
183 432 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 12 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 1244 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:
(A) Organizm: Extremophile (C) Konkretny izolat: TG456 (ix) C-echy:
(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1..1107 (D)Inna informacja: /częściowy/produkt = ksylanaza D /gen = xynD (xi) Opis sekwencji: Seg. ID nr 12
AAA GTC TTG
Lys Val Leu 1
TAT GCA CAG
Tyr Ala Gin
GAT GGT TAC Asp Gly Tyr 35
ACA GTT GAC Thr Val Asp 50
AAT GCA GTG Asn Ala Leu 65
CTG GCT GCT CTG ATG TGT GTT Leu Ala Ala Leu Met Cys Val 5 10
GCA GCC ATG ACA TTT ACC TCT
Ala Ala Met Thr Phe Thr Ser 20 25
TAC TAC GAG TTG TGG AAG GAC
Tyr Tyr Glu Leu Trp Lys Asp 40
ACA GGA GGA AGA TTT AGC TGT Thr Gly Gly Arg Phe Ser Cys 55
TTG AGA ACA GGT AAA AAG TTT Phe Arg Thr Gly Lys Lys Phe 70
GTG TTG
Val Leu
AAT GCA
Asn Ala
ACA GGG
Thr Gly
CAG TGG Gin Trp 60
AGC ACT Ser Thr 75
GCT AAT CCT TTT Ala Asn Pro Phe 15
ACT GGG ACA TAC Thr Gly Thr Tyr 30
AAT ACT ACC ATG
Asn Thr Thr Met 45
AGT AAC ATT AAC Ser Asn Ile Asn
GCA TGG AAT CAG Ala Trp Asn Gin 80
144
192
240
183 432
CTT Leu GGG ACT GTA Val AAG Lys 85 ATT Ile ACC Thr TAC TCT GCT AGG TAC Tyr AAT Asn CCA Pro AAT Asn 95 GGC Gly 288
Gly Thr Tyr Ser Ala 90 Thr
AAT TCC TAT CTC TGC ATT TAT GGA TGG TCA AGA AAT CCA CTT GTT GAA 336
Asn Ser Tyr Leu 100 Cys Ile Tyr Gly Trp 105 Ser Arg Asn Pro Leu 110 Val Glu
TTT TAT ATC GTT GAA AGC TGG GGC TGA TGG CGT CCG CCC GGG GCA ACG 384
Phe Tyr Ile 115 Val Glu Ser Trp Gly 120 Ser Trp Arg Pro Pro 125 Gly Ala Thr
TCA CTT GGC ACT GTA ACA ATT GAT GGA GCA ACA TAT GAT ATT TAT AAG 432
Ser Leu 130 Gly Thr Val Thr Ile 135 Asp Gly Ala Thr Tyr 140 Asp Ile Tyr Lys
ACA ACT CGT GTT AAT CAG CCA TCT ATC GAA GGA ACA AGA ACA TTT GAT 480
Thr 145 Thr Arg Val Asn Gln 150 Pro Ser Ile Glu Gly 155 Thr Arg Thr Phe Asp 160
CAG TAC TGG AGT GTT AGG ACA TCA AAG AGA ACA AGT GGT ACT GTT ACT 528
Gln Tyr Trp Ser Val 165 Arg Thr Ser Lys Arg 170 Thr Ser Gly Thr Val 175 Thr
GTA ACT GAT CAT TTC AAA GCA TGG GCT GCA AAA GGT TTG AAC CTG GGT 576
Val Thr Asp His 180 Phe Lys Ala Trp Ala 185 Ala Lys Gly Leu Asn 190 Leu Gly
ACA ATT GAC CAG ATT ACA CTC TGT GTG GAA GGY TAC CAR AGC AGC GGC 624
Thr Ile Asp 195 Gln Ile Thr Leu Cys 200 Val Glu Gly Tyr Gln 205 Ser Ser Gly
TCA GCA AAT ATA ACA CAG AAT ACA TTT ACT ATT GGT GGT TCG AGT AGT 672
Ser Ala 210 Asn Ile Thr Gln Asn 215 Thr Phe Thr Ile Gly 220 Gly Ser Ser Ser
GGC TCA AGT AAT GGT TCA AAT AAC GGT TCA AAT GAT GGT TCC AAT GGA 720
Gly 225 Ser Ser Asn Gly Ser 230 Asn Asn Gly Ser Asn 235 Asp Gly Ser Asn Gly 240
GGA ACA AAT GCA GGA ATT TCA ACY GCA AGC AGG ATA GAA TGT GAA AGT 768
Gly Thr Asn Ala Gly 245 Ile Ser Thr Ala Ser 250 Arg Ile Glu Cys Glu 255 Ser
ATG TCG CTC AGC GGY CCT TAT GTT TCA AGA ATT ACT TAT CCA TTT AAT 816
Met Ser Leu Ser 260 Gly Pro Tyr Val Ser 265 Arg Ile Thr Tyr Pro 270 Phe Asn
GGT ATA GCA CTT TAT GCG AAC GGA GAT AGA GCA ACG GCA ATT GTA AAC 864
Gly Ile Ala 275 Leu Tyr Ala Asn Gly 280 Asp Arg Ά1 Thr Ala 285 Asn Val Asn
TTT TCA GCA AGC CGT AAC TAT ACT TTT AAA TTA CGT GGA TGT GGA AAT 912
Phe Ser 290 Ala Ser Arg Asn Tyr 295 Thr Phe Lys Leu Arg 300 Gly Cys Gly Asn
183 432
AAC AAT AAT TTG GCA TCA GTT GAT TTA Asn Asn Asn Leu Ala Ser Val Asp Leu 305310
GGT TCG TTC TAT TAT AAG GGA ACATAT
Gly Ser Phe Tyr Tyr Lys Gly ThrTyr
325
AAT GTG TAT GTA AGT GCA GGT ACCCAC
Asn Val Tyr Val Ser Ala Gly ThrHis
340345
GCT GAT AAT GGT ACA TGG GAT GTCTAT
Ala Asp Asn Gly Thr Trp Asp ValTyr
355360
CTG ATA GAT GGA AAG AAA GTA 960
Leu Ile Asp Gly Lys Lys Val 315320
CCT TGG GAA GCY TCT ATA AAT 1008
Pro Trp Glu Ala Ser Ile Asn 330335
AGA GWG GAG CTT GTA CTT TCT 1056
Arg Xaa Glu Leu Val Leu Ser 350
GCG GAT TAT TTG TTA ATA CAA 1104
Ala Asp Tyr Leu Leu Ile Gin 365
TGAAATTCGG AAATGTTTTT AAAAATACTG
ACTATTATAA AGCGATTGAA GTCAGTCTTA
TAGCTGTTTC CKGCGCCATG
CTTCGRAGAA GCAGGTATTT TTTTATGTTC 1164
GTTCATCCTA GTTGTTCTTC ARACCGRTCA 1224
1244 (2) Informacja dotyczącą Seq. nr 13 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) długość: 368 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 13
Lys Val Leu Leu Ala Ala Leu Met 15
Tyr Ala Gin Ala Ala Met Thr Phe 20
Asp Gly Tyr Tyr Tyr Glu Leu Trp 3540
Thr Val Asp Thr Gly Gly Arg Phe 5055
Asn Ala Leu Phe Arg Thr Gly Lys 6570
Leu Gly Thr Val Lys Ile Thr Tyr 85
Asn Ser Tyr Leu Cys Ile Tyr Gly 100
Cys Val Val Leu Ala Asn Pro Phe 10 15
Thr Ser Asn Ala Thr Gly Thr Tyr 25 30
Lys Asp Thr Gly Asn Thr Thr Met 45
Ser Cys Gin Trp Ser Asn Ile Asn 60
Lys Phe Ser Thr Ala Trp Asn Gin 7580
Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Asn Gly 9095
Trp Ser Arg Asn Pro Leu Val Glu 105110
183 432
Phe Tyr Ile Val 115 Glu Ser Trp Gly 120 Ser Trp Arg Pro Pro 125 Gly Ala Thr
Ser Leu 130 Gly Thr Val Thr Ile Asp 135 Gly Ala Thr Tyr 140 Asp Ile Tyr Lys
Thr 145 Thr Arg Val Asn Gin 150 Pro Ser Ile Glu Gly 155 Thr Arg Thr Phe Asp 160
Gin Tyr Trp Ser Val 165 Arg Thr Ser Lys Arg Thr 170 Ser Gly Thr Val 175 Thr
Val Thr Asp His 180 Phe Lys Ala Trp Ala Ala Lys 185 Gly Leu Asn 190 Leu Gly
Thr Ile Asp Gin 195 Ile Thr Leu Cys 200 Val Glu Gly Tyr Gin 205 Ser Ser Gly
Ser Ala 210 Asn Ile Thr Gin Asn Thr 215 Phe Thr Ile Gly 220 Gly Ser Ser Ser
Gly 225 Ser Ser Asn Gly Ser 230 Asn Asn Gly Ser Asn 235 Asp Gly Ser Asn Gly 240
Gly Thr Asn Ala Gly 245 Ile Ser Thr Ala Ser Arg 250 Ile Glu Cys Glu 255 Ser
Met Ser Leu Ser 260 Gly Pro Tyr Val Ser Arg Ile 265 Thr Tyr Pro 270 Phe Asn
Gly Ile Ala Leu 275 Tyr Ala Asn Gly 280 Asp Arg Ala Thr Ala 285 Asn Val Asn
Phe Ser 290 Ala Ser Arg Asn Tyr Thr 295 Phe Lys Leu Arg 300 Gly Cys Gly Asn
Asn 305 Asn Asn Leu Ala Ser 310 Val Asp Leu Leu Ile 315 Asp Gly Lys Lys Val 320
Gly Ser Phe Tyr Tyr 325 Lys Gly Thr Tyr Pro Trp 330 Glu Ala Ser Ile 335 Asn
Asn Val Tyr Val 340 Ser Ala Gly Thr His Arg Xaa 345 Glu Leu Val 350 Leu Ser
Ala Asp Asn Gly 355 Thr Trp Asp Val 360 Tyr Ala Asp Tyr Leu 365 Leu Ile Gin
183 432
Fig. 1
i—TG4S' TG4531 —65-- TG4S7: TG4S7Ż TG4S71 TG4S61 TG4561 TG4S61 TG456I TG4571 TG4S31 TG4531 TG4561 TG4561 —TG45€ 7fa4 rb2 TG479fbl TG479fb3 TG479fa3 TG479fal TG479fb2 TG479fa2 źb2 Żb3 ib5 żal Żb4 żbS żb6 żbl żal żbl żbl 252 fb3 XynC
TG457fb4 —TG456fa3 TG457fa7 TG457fa2
--100--- -|TG457fa3 |TG4S7fa6
W J TG53fal TG53fa4 TGS3fa6 TG53fa2 TGS3faS TGS3fb6
a zf TG631fb4 TG631fb5 TG631fal TG631fa3 TG631fa5 TG531fa2 TG631fbl TG631fb2 TG631fa6 TG631fb3
---100
TGS3fbl
TGS3fb3
TG53fa3
TG53fb2
TG53fb4
TG53fb5
TG4S6fa2
93-- TG457fa8
TG4S7fal
TG453fa2
XynA
XynB •93
TG4 57 TG457 TG4 57 TG53 TG53 TGS3 . CGCTGCTTTGGTATCCTTCCACACAGAGTGTAATCTGGTCAATTGTACC CCGCTGCTTTGGTATCCTTCCACACAGAGTGTAATCTGGTCAATTGTACC CCGCTGCTTTGGTAGCCTTCCACACAGAGTGTAATCTGGTCAATTGTACC CCGCTACTTTGGTAACCT.TCAACGCAAAGAGTAATCTGATCGATTGTACC . CGCTGCTTTGGTATCCTTCAACGCAAAGAGTAATCTGATCGATTGTACC ................CTTCAACGCAAAGAGTAATCTGATCGATTGTACC 51 100
TG4 57 TG457 TG4 57 TG53 TG53 TG53 CAGGTtCAAACCTTTTGCAGCCCATGCTTTGAAATGATCAGTTACAGTAA CAGGTtCAAACCTTTTGCAGCCCATGCTTTGAAATGATCAGTTACAGTAA CAGGTTCAAACCTTTTGCAGCCCATGCTTTGAAATGATCAGTTACAGTAA AAGATTCAAACCTTTTGCAGCCCATGCCTTGAAATGATCTGTAACTGTTA AAGATTCAAACCTTTTGCAGCCCATGCCTTGAAATGATCTGTAACTGTTA AAGATTCAAACCTTTTGCAGCCCATGCCTTGAAATGATCTGTAACTGTTA 101 150
TG457 TG457 TG457 TG53 TGS3 TG53 CAGTACCACtTGTTCTCTTTGATGTCCTAACACTCCAGTACTGATCAAAT CAGTACCACtTGTTCTCTTTGATGTCCTAACACTCCAGTACTGATCAAAT CAGTACCACTTGTTCTCTTTGATGTCCTAACACTCCAGTACTGATCAAAT CTGTACCGCTGGTTCTCTTCGAGGTTCTAACGCTCCAGTATTGATCAAAT CTGTACCGCTGGTTCTCTTCGAGGTTCTAACGCTCCAGTATTGATCAAAT CTGTACCGCTGGTTCCCTTCGAGGTTCTAACGCTCCAGTATTGATCAAAT 151 200
TG4 57 TG457 TG457 TGS3 TG53 TG53 GTTCTTGTTCCTTCGATAGATGGCTGATTAACACGAGTTGTCTTATAAAT GTTCTTGTTCCTTCGATAGATGGCTGATTAACACGAGTTGTCTTATAAAT GTTCTTGTTCCTTCGATAGATGGCTGATTAACACGAGTTGTCTTATAAAT GTTGTTGTCCCTTCAATAGATGGTTGATTTACACGAGTTGTCTTGTAAAT GTTGTTGTCCCTTCAATAGATGGTTGATTTACACGAGTTGTCTTGTAAAT GTTGTTGTCCCTTCAATAGATGGTTGATTTACACGAGTTGTCTTGTAAAT 201 250
TG457 TG4 57 TG4 57 TG53 TG53 TG53 ATCATATGTTCCTCCATCAATTGTTACAGTGCCAAGTGACGTTGCCCCGG ATCATATGTTCCTCCATCAATTGTTACAGTGCCAAGTGACGTTGCCCCGG ATCATATGTTGCTCCATCAATTGTTACAGTGCCAAGTGACGTTGCCCCGG ATCATATGTTCCTCCATCGATTGTTACAGTACCAAGTGATGTTGCTCC. G ATCATATGTTCCTCCATCGATTGTTACAGTACCAAGTGATGTTGCTCCGG ATCATATGTTCCTCCATCGATTGTTACAGTACCAAGTGATGTTGCTCCGG 251 300
TG4 57 TG45 7 TG4 57 TG53 TG53 TG53 GCGGACGCCATGAGCCCCAGĆTTTCAACGATATaAAATTCAACAAGTGGA GCGGACGCCATGAGCCCCAGCTTTCAACGATATaAAATTCAACAAGTGGA GCGGACGCCATGAGCCCCAGCTTTCAACGATATAAAaTTCAACAAGTGGA GCGGACGCCATGAACCCCAGCTTTCAACAATATAGAATTCAACAAGTGGA GCGGACGCCATGAACCCCAGCTTTCAACAATATAGAATTCAACAAGTGGA gCGGACGCCATGAACCCCAGCTTTCAACAATATAGAATTCAACAAGTGGA 301 329
TG4 57 TG457 TG457 TG 5 3 TG53 TG 5 3 T............................ TTTCTTGACCaTC................ TTTCTTGACCATCCATATACAcCCAA. . . TTTCTTGACCATCCATAGAArCCCATATA TTTCTTGACCATCCAT............. TTTCTTGACCATCCATATACAGCCACATA Fig · 2
183 432
Fig. 3
20 30 40 5060
ACGAAACGAAGCATTGGCGCCTCGAGTAATTTACCAACACTACTACGTTTTAACTGAAAC
80 90SpHT 100 110120
AAAakAACTGGAGACTGCCATGGCATATGGCATGCCATTTACCTCTAATGCAg.CTGGGAC + PFTSNATGT
130 140 150 160 170180
ATACGATGGTTACTACTACGAGTTGTGGAAGGACACAGGGAATACTACCATGACAGTTGA YDGYYYELWKDTGNTT-rTVD
190 200 210 220 230240
CACAGGAGGAAGATTTAGCTGTCAGTGGAGTAACATTAACAATGCACTCTTCAGAACAGG TGGRFSCQWSNINNALFRTG
250 260 270 280 290300
TAAAAAGTTTAGCACTGCATGGAATCAGCTTGGGACTGTAAAGATTACCTACTCTGCTAC KKFSTAWNQLGTVKITYSAT
310 320 330 340 350360
CTACAATCCAA^TGGCAATTCCTATCTCTGCATTTATGGATGGTCAAGAAATCCACTTGT
YNPNGNSYLCIYGWSRNPLV
370 380 390 400 410420
TGAATTTTATATCGTTGAAAGCTGGGGCTCATGGCGTCCGCCCGGGGCAACGTCACTTGG
EFYIVESWGSWRPPGATSLG
430 440 450 460 47048Ó·
CACTGTAACAATTGATGGAGCAACATATGATATTTATAAGACAACTCGTGTTAATCAGCC
TVTIDGATYDIYKTTRVNQP
490 500 510 520 530540
ATCTATCGAAGGAACAAGAACATTTGATCAGTACTGGAGTGTTAGGACATCAAAGAGAAC
S IEGTRTFDQYWSVRTSKRT
550 560 570 580 590600
AAGTGGTACTGTTACTGTAACTGATCATTTCAAAGCATGGGCTGCAAAAGGTTTGAACCT
SGTVTVTDHFKAWAAKGLNL
610 620 630 640 650660
GGGTACAATTGACCAGATTACACTCTGTGTGGAAGGYTACCARAGCAGCGGCTCAGCAAA GTIDQITLCVEGYQSSGSAN
670 680 690 700BamHI 710720
TATAACACAGAATACATTTACTATTGGTGGTTCGAGTAGTGGATCCTAAGTAAGTAGAZkT
1TQNTFTIGGSSSGSX
730 TCTGAGTAGGTAA
183 432
•SR 'SR
ω LL. ω
Λί
C π3 ω 2
•SR
Wskaźnik wytrzymałości na rozciąga- ECF S/W ECF n;*-e (Nm/g) A Porowatość (ml/min)
183 432
Optima pH różnych enzymów temperatura^ 60°C
---TG456xynD Pulpz HB optima temperatury różnych enzymów pH = 7 (TG)/6 (Pulp HB)
---TG456xynO —*— Pulpz HS
Fig. 9
183 432
TermostabilnośćTG456xynD j
Pulpzyme HB w 80“C (pH 7).
Aktywność
Pulpzyme HB TG456xynD
TermostabilnośćTG4-56XynD i
Pulpzyme HB w 65 °C (pH 9).
---Pulpzyme HB ~TG456xynD
Fig. 10
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (29)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Ksylanaza posiadająca w temperaturze co najmniej 80°C i przy pH 9 znaczącą aktywność delignifikacyjną charakteryzującą się tym, że posiada sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 70% identyczność i pełną sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 13.
  2. 2. Ksylanaza według zastrz. 1, znamienna tym, że jej okres półtrwania w 80°C przy pH 9,0 wynosi ponad 10 minut.
  3. 3. Ksylanaza według zastrz. 1, znamienna tym, że
    a) stanowi ksylanazę typu G oraz
    b) pochodzi z termofilowego organizmu o optymalnej temperaturze rozwoju ponad 65°C.
  4. 4. Ksylanaza według zastrz. 3, znamienna tym, że organizm termofilowy jest anaerobowy.
  5. 5. Ksylanaza według zastrz. 3, znamienna tym, że jej okres półtrwania w 80°C przy pH 7,0 wynosi ponad 10 minut.
  6. 6. Ksylanaza według zastrz. 3, znamienna tym, że jej okres półtrwania w 65°C przy pH 9,0 wynosi ponad 10 minut.
  7. 7. Ksylanaza według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienna tym, że pochodzi ze szczepu wybranego z grupy obejmującej szczepy zdeponowane pod następującymi numerami depozytowymi: CBS 211.94,212.94,213.94, 214.94, 215.94 i 216.94.
  8. 8. Wydzielona i oczyszczona sekwencja nukleotydowa DNA obejmująca sekwencję nukleotydową w co najmniej 80% identyczną z sekwencją nukleotydową SEQ ID nr 12, kodująca co najmniej część ksylanazy wykazującej znaczącą akty wność delignifikacyjną w temperaturze co najmniej 80°C i przy pH 9 oraz posiadającej sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 70% identyczność z pełną sekwencją aminokwasów SEQ ID nr 13.
  9. 9. Wektor, znamienny tym, że zawiera sekwencję DNA obejmującą sekwencję nukleotydową w co najmniej 80% identyczną z sekwencją SEQ ID nr 12.
  10. 10. Drobnoustrojowa komórka gospodarza transformowana wektorem zawierającym sekwencję DNA obejmującą sekwencję nukleotydową w co najmniej 80% identyczną z sekwencj ąSEQ ID nr 12.
  11. 11. Sposób wytwarzania ksylanazy, znamienny tym, że hoduje się dowolny zdeponowany drobnoustrój wybrany z grupy drobnoustrojów zdeponowanych pod numerem CBS 211.94, 212.94, 213.94, 214.94, 251.94 lub 216.94 lub otrzymany przez hodowlę komórki gospodarza transformowanego wektorem zawierającym sekwencję DNA obejmującą sekwencję nukleotydową w co najmniej 80% identyczną z sekwencją nukleotydową SEQ ID nr 12, na odpowiedniej pożywce, a następnie wydziela się enzymy wykazujące podaną aktywność.
  12. 12. Sposób degradacji ksylanu, znamienny tym, że kontaktuje się ksylanazę wykazującą znaczącą aktywność delignifikacyjną w temperaturze co najmniej 80° i przy pH 9, posiadającą sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 70% identyczność z pełną sekwencją aminokwasową SEQ ID nr 13 z kompozycją zawierającą ksylan.
  13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że ksylanazę stosuje się w temperaturze co najmniej 80°C.
    183 432
  14. 14. Sposób delignifikacji masy celulozowej z drewna, znamienny tym, że kontaktuje się masę celulozową z ksylanazą wykazującą znaczącą aktywność delignifikacyjną w temperaturze co najmniej 80°C i przy pH 9 oraz posiadającą sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 70% identyczność z pełną sekwencją aminokwasową SEQ ID nr 13, w temperaturze co najmniej 80°C i w warunkach pozwalających na aktywność ksylanazy.
  15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że ksylanazę stosuje się przed etapem delignifikacji tlenowej w czasie tego etapu lub po tym etapie.
  16. 16. Środek odpowiedni do rozkładania ksylanu lub traktowania ścieru drzewnego, znamienny tym, że zawiera ksylanazę posiadającą w temperaturze co najmniej 80°C i przy pH 9 znaczącą aktywność delignifikacyjną, charakteryzującą się tym, że ma sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 70% identyczność z pełna sekwencją aminokwasową SEQ ID nr 13.
  17. 17. Środek według zastrz. 16, znamienny tym, że jej okres półtrwania w 80°C przy pH 9,0 wynosi ponad 10 minut.
  18. 18. Środek według zastrz. 16, znamienny tym, że zawiera ksylanazę która stanowi ksylanazę typu G oraz, która pochodzi z termofilowego organizmu o optymalnej temperaturze rozwoju ponad 65°C.
  19. 19. Środek według zastrz. 16, znamienny tym, że zawiera ksylanazę pochodzącą z organizmu termofilowego będącego organizmem anaerobowym.
  20. 20. Środek według zastrz. 16, znamienny tym, że zawiera ksylanazę której okres półtrwania w 80°C przy pH 7,0 wynosi ponad 10 minut.
  21. 21. Środek według zastrz. 16, znamienny tym, że zawiera ksylanazę której okres półtrwania w 65°C przy pH 9,0 wynosi ponad 10 minut.
  22. 22. Środek według zastrz. 16, znamienny tym, że zawiera ksylanazę pochodzącą ze szczepu wybranego z grupy obejmującej szczepy zdeponowane pod następującymi numerami depozytowymi: CBS 211.94, 212.94, 213.94, 214.94, 215.94 i 216.94.
  23. 23. Zastosowanie ksylanazy do rozkładania ksylanu lub traktowania ścieru drzewnego, znamienny tym, że stosuje się ksylanazę posiadającą w temperaturze co najmniej 80°C i przy pH 9 znaczącą aktywność delignifikacyjną charakteryzującą się tym, że ma sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 70% identyczności z pełną sekwencją aminokwasową SEQnr 13.
  24. 24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że okres półtrwania ksylanazy w 80°C przy pH 9,0 wynosi ponad 10 minut.
  25. 25. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że stosuje się ksylanazę którą stanowi ksylanazę typu G oraz, która pochodzi z termofilowego organizmu o optymalnej temperaturze rozwoju ponad 65°C.
  26. 26. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że stosuje się ksylanazę pochodzącą z organizmu termofilowego będącego organizmem anaerobowym.
  27. 27. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że stosuje się ksylanazę której okres półtrwania w 80°C przy pH 7,0 wynosi ponad 10 minut.
  28. 28. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że stosuje się ksylanazę której okres półtrwania w 65°C przy pH 9,0 wynosi ponad 15 minut.
  29. 29. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, ze stosuje się ksylanazę pochodzącą ze szczepu wybranego z grupy obejmującej szczepy zdeponowane pod następującymi numerami depozytowymi: CBS 211.94,212.94, 213.94, 214.94, 215.94 i 216.94. * * *
PL95312962A 1994-06-14 1995-06-14 Ksylanaza, wydzielona i oczyszczona sekwencja nukleotydowa DNA, wektor, drobnoustrojowa komórka gospodarz, sposób wytwarzania ksylanazy, sposób degradacji ksylanu i sposób delignifikacji PL183432B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP94201699 1994-06-14
PCT/EP1995/002299 WO1995034662A1 (en) 1994-06-14 1995-06-14 Thermostable xylanases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL312962A1 PL312962A1 (en) 1996-05-27
PL183432B1 true PL183432B1 (pl) 2002-06-28

Family

ID=8216949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95312962A PL183432B1 (pl) 1994-06-14 1995-06-14 Ksylanaza, wydzielona i oczyszczona sekwencja nukleotydowa DNA, wektor, drobnoustrojowa komórka gospodarz, sposób wytwarzania ksylanazy, sposób degradacji ksylanu i sposób delignifikacji

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6083733A (pl)
EP (2) EP1340814A1 (pl)
JP (1) JP4285767B2 (pl)
CN (1) CN1143387A (pl)
AT (1) ATE222956T1 (pl)
AU (1) AU693909B2 (pl)
BR (1) BR9506262A (pl)
CA (1) CA2168344C (pl)
DE (1) DE69527924T2 (pl)
FI (1) FI119436B (pl)
MX (1) MX9600450A (pl)
NO (1) NO323549B1 (pl)
NZ (1) NZ289089A (pl)
PL (1) PL183432B1 (pl)
WO (1) WO1995034662A1 (pl)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7816129B2 (en) 1994-07-29 2010-10-19 Ab Enzymes Gmbh Production and secretion of proteins of bacterial origin in filamentous fungi
WO1997012991A1 (en) * 1995-09-22 1997-04-10 Terragen Diversity Inc. Method for isolating xylanase gene sequences from soil dna, compositions useful in such method and compositions obtained thereby
US7220542B2 (en) 2000-07-17 2007-05-22 Van Den Brink Johannes Maarten Expression cloning in filamentous fungi
FI108728B (fi) 1999-10-12 2002-03-15 Carbozyme Oy Menetelmä perheen G/11 ksylanaasien stabiilisuuden parantamiseksi ja optimaalisen pH-alueen muuttamiseksi
US7718411B1 (en) 2004-08-05 2010-05-18 Danisco Us Inc. Trichoderma reesei G/11 xylanases with improved stability
US6833259B2 (en) * 2001-03-19 2004-12-21 Council Of Scientific And Industrial Research ‘Pseudomonas stutzeri’ strain and process for preparation of xylanase
KR20080045764A (ko) 2002-06-14 2008-05-23 신젠타 파티서페이션즈 아게 자일라나제, 이를 암호화하는 핵산, 및 이의 제조 및 사용방법
US7807174B2 (en) * 2002-11-22 2010-10-05 Nexbio, Inc. Class of therapeutic protein based molecules
US20050000666A1 (en) * 2003-05-06 2005-01-06 Novozymes A/S Use of hemicellulase composition in mechanical pulp production
US7960148B2 (en) 2003-07-02 2011-06-14 Verenium Corporation Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2535526C (en) 2003-08-11 2015-09-29 Diversa Corporation Laccases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7727755B2 (en) * 2005-11-02 2010-06-01 Battelle Energy Alliance, Llc Enzyme and methodology for the treatment of a biomass
US8969033B2 (en) * 2005-11-02 2015-03-03 Battelle Energy Alliance, Llc Alteration and modulation of protein activity by varying post-translational modification
TR201809912T4 (tr) 2006-02-14 2018-07-23 Bp Corp North America Inc Ksilanazlar, bunları kodlayan nükleik asitler ve bunları yapmak ve kullanmak için yöntemler.
WO2007115391A1 (en) 2006-04-12 2007-10-18 National Research Council Of Cananda Modification of xylanases to increase thermophilicity, thermostability and alkalophilicity
DK2069389T3 (en) 2006-08-04 2015-01-12 Bp Corp North America Inc Glucanases, nucleic acids encoding them, and processes for their preparation and use
US8492114B2 (en) 2008-01-25 2013-07-23 Battelle Energy Alliance, Llc Methods of combined bioprocessing and related microorganisms, thermophilic and/or acidophilic enzymes, and nucleic acids encoding said enzymes
US9732330B2 (en) 2008-01-25 2017-08-15 Battelle Energy Alliance, Llc Methods of combined bioprocessing and related microorganisms, thermophilic and/or acidophilic enzymes, and nucleic acids encoding said enzymes
US7923234B2 (en) * 2008-01-25 2011-04-12 Battelle Energy Alliance, Llc Thermal and acid tolerant beta-xylosidases, genes encoding, related organisms, and methods
US8426185B2 (en) 2008-01-31 2013-04-23 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from Alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
NZ585950A (en) * 2008-01-31 2012-06-29 Battelle Energy Alliance Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer- degrading genes and enzymes from alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
US8557557B2 (en) * 2008-01-31 2013-10-15 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from Alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
US8497110B2 (en) * 2008-01-31 2013-07-30 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
MX2010008575A (es) * 2008-02-22 2010-12-07 Battelle Energy Alliance Llc Control transcripcional en alicyclobacillus acidocaldarius y genes, proteinas y metodos asociados.
BRPI0907629A2 (pt) 2008-02-26 2019-01-15 Battelle Energy Alliance Llc enzimas e genes transportadores de açúcar termoacidofílico e termofílico de alicyclobacillus acidocaldarius e organismos relacionados e métodos
JP2011517931A (ja) 2008-02-27 2011-06-23 バテル エナジー アライアンス，エルエルシー アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスおよび関連生物体からの好熱性および好熱好酸性グリコシル化遺伝子および酵素、方法
EP2245143A4 (en) * 2008-02-28 2013-07-31 Battelle Energy Alliance Llc THERMOPHILIC AND THERMOACIDOPHILIC ACID CHALK AND ENZYMES FROM ALICYCLOBACILLUS ACIDOCALDARIUS AND CORRESPONDING ORGANISMS AND METHODS
AU2009330641A1 (en) 2008-12-22 2011-06-30 The Regents Of The University Of California Acidothermus celluloyticus xylanase
WO2010129287A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Hemicellulose-degrading enzymes
CN101724613B (zh) * 2009-12-15 2012-07-04 中国农业科学院饲料研究所 一种耐碱中温木聚糖酶xynam6及其基因和应用
US20110275135A1 (en) 2010-05-05 2011-11-10 Battelle Energy Alliance, Llc Genetic elements, proteins, and associated methods including application of additional genetic information to gram (+) thermoacidophiles
CN101892208B (zh) * 2010-05-28 2011-11-09 温州海螺挑战生物工程有限公司 一种高温酸性木聚糖酶xyn10j88及其基因和应用
CN102392007B (zh) * 2011-12-05 2013-06-26 武汉新华扬生物股份有限公司 一种高温碱性木聚糖酶xyn10a及其基因和应用
CN103232985B (zh) * 2013-04-27 2015-05-20 武汉新华扬生物股份有限公司 一种高催化效率木聚糖酶xyn10b及其基因和应用
GB201401648D0 (en) * 2014-01-31 2014-03-19 Dupont Nutrition Biosci Aps Protein
JP2016029908A (ja) 2014-07-28 2016-03-07 本田技研工業株式会社 Ｇｈファミリー１０に属する耐熱性キシラナーゼ
JP6354462B2 (ja) 2014-08-29 2018-07-11 本田技研工業株式会社 Ｇｈファミリー１０に属する耐熱性キシラナーゼ
WO2016073610A1 (en) * 2014-11-07 2016-05-12 Novozymes A/S Xylanase based bleach boosting
CN105671019B (zh) * 2014-12-04 2019-02-26 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种耐热木聚糖酶及其应用
CN112512480B (zh) * 2018-05-21 2024-10-01 中外制药株式会社 被封入玻璃容器的冷冻干燥制剂
EP3974526A1 (en) 2020-09-25 2022-03-30 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Xylanase enzyme with extreme thermostability and alkaline stability
EP4525615A2 (en) 2022-05-14 2025-03-26 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK69591D0 (da) * 1991-04-18 1991-04-18 Novo Nordisk As Nye mikroorganismer
DK175391D0 (da) * 1991-10-18 1991-10-18 Novo Nordisk As Nye enzymer
DK34892D0 (da) * 1992-03-16 1992-03-16 Novo Nordisk As Nyt enzym
EP0728197A1 (en) * 1993-11-05 1996-08-28 Cornell Research Foundation, Inc. THERMOSTABLE XYLANASE FROM A $i(THERMOMONOSPORA FUSCA) GENE

Also Published As

Publication number Publication date
FI960631A0 (fi) 1996-02-12
PL312962A1 (en) 1996-05-27
CA2168344A1 (en) 1995-12-21
NO960567D0 (no) 1996-02-13
NO960567L (no) 1996-02-14
US6083733A (en) 2000-07-04
CA2168344C (en) 2009-11-24
FI119436B (fi) 2008-11-14
BR9506262A (pt) 1997-08-12
WO1995034662A1 (en) 1995-12-21
ATE222956T1 (de) 2002-09-15
NZ289089A (en) 1998-05-27
DE69527924T2 (de) 2003-01-09
EP0716702B1 (en) 2002-08-28
AU2882495A (en) 1996-01-05
AU693909B2 (en) 1998-07-09
EP0716702A1 (en) 1996-06-19
DE69527924D1 (de) 2002-10-02
NO323549B1 (no) 2007-06-11
FI960631L (fi) 1996-04-12
EP1340814A1 (en) 2003-09-03
MX9600450A (es) 1997-06-28
CN1143387A (zh) 1997-02-19
JP4285767B2 (ja) 2009-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL183432B1 (pl) Ksylanaza, wydzielona i oczyszczona sekwencja nukleotydowa DNA, wektor, drobnoustrojowa komórka gospodarz, sposób wytwarzania ksylanazy, sposób degradacji ksylanu i sposób delignifikacji
US5661021A (en) Mannanase enzymes, genes coding for them and a method for isolating the genes, as well as a process for bleaching of lignocellulosic pulp
JP3435946B2 (ja) 耐熱性キシラナーゼ
AU690955B2 (en) Alkali-tolerant xylanases
JP4385766B2 (ja) セルロース分解酵素遺伝子及び該遺伝子の利用
Bezalel et al. Characterization and delignification activity of a thermostable α-L-arabinofuranosidase from Bacillus stearothermophilus
EP1005536B1 (en) Microbial xyloglucan endotransglycosylase (xet)
Saul et al. Sequence and expression of a xylanase gene from the hyperthermophile Thermotoga sp. strain FjSS3-B. 1 and characterization of the recombinant enzyme and its activity on kraft pulp
FI118010B (fi) Actinomaduran ksylanaasisekvenssit ja käyttömenetelmät
US6506593B2 (en) Production and secretion of proteins of bacterial origin in filamentous fungi
CA2063352C (en) Cloning and expression of acetyl xylan esterases from fungal origin
WO1991018976A1 (en) HEMICELLULASES PRODUCED BY $i(BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS)
Chhabra et al. β-Mannanases from Thermotoga species
JPH09506003A (ja) 熱安定性キシラナーゼ
JP2004121257A (ja) 耐熱性キシラナーゼ
JP3475930B2 (ja) 耐熱性キシラナーゼを有効成分として含む漂白剤
JP3880318B2 (ja) 耐熱性キシラナーゼ
CA2240390C (en) Novel xylanases, genes encoding them, and uses thereof
FI118264B (fi) Mannanaasientsyymit, niitä koodavat geenit ja menetelmä näiden eristämiseksi sekä menetelmä lignoselluloosapitoisen massan valkaisemiseksi
JP2002095470A (ja) 耐熱性キシラナーゼ