PL184108B1 - Konstrukcja genetyczna, rośliny o właściwościach opóźnionego starzenia się, sposób wprowadzania do roślin właściwości opóźnionego starzenia się, sposób wytwarzania roślin, rośliny zawierające sekwencję związanego ze starzeniem się promotora oraz sekwencja związanego ze starzeniem się promotora - Google Patents
Konstrukcja genetyczna, rośliny o właściwościach opóźnionego starzenia się, sposób wprowadzania do roślin właściwości opóźnionego starzenia się, sposób wytwarzania roślin, rośliny zawierające sekwencję związanego ze starzeniem się promotora oraz sekwencja związanego ze starzeniem się promotoraInfo
- Publication number
- PL184108B1 PL184108B1 PL96327438A PL32743896A PL184108B1 PL 184108 B1 PL184108 B1 PL 184108B1 PL 96327438 A PL96327438 A PL 96327438A PL 32743896 A PL32743896 A PL 32743896A PL 184108 B1 PL184108 B1 PL 184108B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- aging
- promoter
- plant
- plants
- sequence
- Prior art date
Links
- 230000032683 aging Effects 0.000 title claims description 120
- 108010050516 adenylate isopentenyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 101100148680 Arabidopsis thaliana SAG12 gene Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 121
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 34
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 claims description 32
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 28
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 16
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 16
- 230000009758 senescence Effects 0.000 claims description 16
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 claims description 14
- 101100148681 Arabidopsis thaliana SAG13 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 claims description 13
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 claims description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 9
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 7
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 230000008124 floral development Effects 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 4
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 claims description 4
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 claims description 4
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 claims description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 4
- 230000008117 seed development Effects 0.000 claims description 4
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003679 aging effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000008121 plant development Effects 0.000 claims description 3
- 230000002786 root growth Effects 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims 5
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims 5
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims 2
- 206010061291 Mineral deficiency Diseases 0.000 claims 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 claims 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 claims 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims 1
- 230000009661 flower growth Effects 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000012538 light obscuration Methods 0.000 claims 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 claims 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 claims 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 claims 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 claims 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 claims 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 claims 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 46
- 102100031262 Deleted in malignant brain tumors 1 protein Human genes 0.000 description 42
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 7
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 4
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 4
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 101150012864 ipt gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000014634 leaf senescence Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002431 foraging effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-triaminopyrimidine Chemical compound NC1=CC(N)=NC(N)=N1 JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000893303 Homo sapiens Glycine amidinotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000724418 Homo sapiens Neutral amino acid transporter B(0) Proteins 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 102100028267 Neutral amino acid transporter B(0) Human genes 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150016396 SAG12 gene Proteins 0.000 description 1
- 108050007496 Shikimate kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 1
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 description 1
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 230000009547 development abnormality Effects 0.000 description 1
- 235000019262 disodium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002526 disodium citrate Substances 0.000 description 1
- CEYULKASIQJZGP-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(carboxymethyl)-2-hydroxybutanedioate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(C(=O)O)CC([O-])=O CEYULKASIQJZGP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000011890 leaf development Effects 0.000 description 1
- 239000010807 litter Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 244000045561 useful plants Species 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
- C12N15/8225—Leaf-specific, e.g. including petioles, stomata
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8249—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving ethylene biosynthesis, senescence or fruit development, e.g. modified tomato ripening, cut flower shelf-life
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8291—Hormone-influenced development
- C12N15/8295—Cytokinins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1 . Konstrukcja genetyczna zawierajaca sekwencje promotora SAG 12 albo SAG13 operacyjnie zw iazana z sekw encja DNA kodujaca bialko me zwiazana w stanie naturalnym z ta sekwencja promotora 8 Konstrukcja genetyczna zawierajaca promotor SAG 12 operacyjnie zwiazany z sekw encja DNA kodujaca enzym katalizujacy synteze cytokinmy 11 Komórka zawierajaca konstrukcje genetyczna posiadajaca promotor SAG 12 operacyjnie zwiazany z sekw encjaD N A kodujacaen- zym katalizujacy synteze cytokininy 15 Rosliny o wlasciwosciach opóznionego starzenia sie, zawierajace w swym genomie w kierunku 5' do 3' konstrukcje genetyczna obej- mujaca promotor zwiazany ze starzeniem 1 region kodujacy dlaenzymu katalizujacego synteze cytokinmy, przy czym promotor jest wybrany z gru- py obejmujacej promotor SAG 12 albo promotor homologiczny z ta sekwencja SAG12 w stopniu wystarczajacym do preferencyjnej ekspresji tego enzymu w starzejacej sie tkance na poziomie podobnym do tego, jaki daje promotor SAG12 inicjujac ekspresje genu GUS w Arabidopsis 18 Sposób wprowadzania do roslin wlasciwosci opóznionego starzenia sie poprzez wbudowywania do ich genom u odpowiedniej kon- strukcji genetycznej, znam ienny tym , ze w prowadza sie do genomu rosliny w kierunku 5’ do 3' konstrukcje genetyczna obejm ujaca prom o tor zwiazany ze starzeniem 1 region kodujacy dla enzymu katalizujacego synteze cytokininy, przy czym prom otor jest wybrany z grupy obejmujacej promotor SAG 12 albo promotor homologiczny z ta sekwencja SAG 12 w stopniu wystarczajacym do preferencyjnej ekspresji tego enzymu w starzejacej sie tkance na poziomie podobnym do tego ja k i daje promotor SAG 12 inicjujac ekspresje genu GUS w Arabidopsis 21 Rosliny o wlasciwosciach opóznionego starzenia sie, zawierajace w swym genomie obca konstrukcje genetyczna, która obejmuje w kierunku 5' do 3', - promotor specyficzny dla starzenia, - region kodujacy bialko enzym u, ekspresja którego to regionu katalizuje w ytw a- rzanie cytokininy w komórkach tych roslin 1 - sekwencje konca transkrypcji, w których to roslinach ekspresja obcej konstrukcji genetycznej przebiega w tkankach wchodzacych w okres starzenia, opózniajac starzenie sie tych tkanek roslinnych 25 Sposób wytwarzania roslin o wlasciwosciach opóznionego starzenia, poprzez wprowadzanie do tych roslin obcej konstrukcji gene- tycznej, w których ekspresja obcej konstrukcji genetycznej przebiega w tkankach wchodzacych w okres starzenia, opózniajac starzenie tych tkanek roslinnych, znam ienny tym , ze w prow adza sie do genomu roslin obca konstrukcje genetyczna, która zaw iera w kierunku 5' do 3', - promotor specyficzny dla starzenia, - region kodujacy bialko dla enzymu, ekspresja którego to regionu katalizuje wytwarzanie cytokininy w komórkach tych roslin 1, - sekwencje konca transkrypcji 30 Rosliny zawierajace sekwencje zwiazanego z starzeniem sie promotora operacyjnie zw iazana z sekw encja DNA kodujaca bialko, wstanie naturalnym n ie zw iazana z ta sekw encja promotora, znam ienne tym, ze prom otor ten jest obecny w roslinach N icitianatabacum 1 ta kodujaca bialko sekwencja DNA koduje enzym katalizujacy synteze cytokininy, przy czym rosliny Nicotiana tabacum pozostaja niezmie- nione w jednym lub wiekszej ilosci odgalezien, rozwoju kwiatu lub wzroscie korzenia w porównaniu z roslinami N icotiana tabacum bez pro- motora operacyjnie zwiazanego z sekw encja DNA kodujaca enzym katalizujacy synteze transferazy izopentylowej PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest konstrukcja genetyczna zawierająca sekwencję promotora SAGI 2 operacyjnie związanąz sekwencjąkodującąbiałko nie związanąw stanie naturalnym z tą sekwencją promotora. Korzystnie, tą sekwencją promotora SAG12 jest sekwencja SAG12-1. Najkorzystniej, promotorem SAG12 sąpierwsze 602 pary zasad sekwencji SEQ ID Nr. 2 a sekwencją DNA kodującą białko jest sekwencja kodująca transferazę izopentenylową.
Przedmiotem wynalazku jest również komórka bądź roślina zawierająca powyższą konstrukcję genetyczną.
Celem wynalazku było otrzymanie konstrukcji genetycznej z sekwencją promotora umożliwiającą ekspresję genu swoistego dla starzenia, która to sekwencja jest związana operacyjnie sekwencją kodującą białko.
Następnym celem wynalazku było otrzymanie promotora swoistego dla starzenia, związanego operacyjnie z sekwencją kodującą enzym, który katalizuje syntezę hormonu roślinnego, korzystnie cytokininy.
Następnym celem wynalazku było otrzymanie promotora swoistego dla starzenia, związanego z sekwencją kodującą transferazę izopentenylową.
Innym celem wynalazku było otrzymanie transgenicznej rośliny zawierającej trans-gen, którego ekspresja zachodzi tylko w starzejącej się tkance.
Istota wynalazku polega na tym, że ekspresję genu możne kierować specyficznie do starzejącej się tkanki, unikając ekspresji konstytutywnej, która mogłaby być niszcząca.
Inne cele, korzyści i cechy wynalazku okażąsię oczywiste po zapoznaniu się z niniejszym opisem, rysunkami i zastrzeżeniami.
Opis rysunków
Figura lprzedstawia mapę schematyczną konstrukcji: promotor SAG12-l/GUS/MAS-ter w wektorze binarnym.
Figura 2 przedstawia mapę schematyczną konstrukcji: promotor SAG12-l/IPT/NOS-ter w wektorze binarnym.
Figura 3 przedstawia sekwencję nukleotydowąkonstrukcji: promotor SAG 12-1/IPT/NOS-ter. Oznaczenia „a” i „b” odpowiadają oznaczeniom „a” i „b” na fig. 1 i fig. 2.
Szczegółowy opis wynalazku
W jednym z aspektów, przedmiotem wynalazku jest konstrukcja genetyczna zawierająca promotor specyficzny dla starzenia związany operacyjnie z sekwencją obcego genu, która to sekwencja w stanie naturalnym nie jest związana z tym promotorem. Scharakteryzowano użyteczny promotor specyficzny dla starzenia, zidentyfikowany w niniejszym opisie jako promotor SAG12. Dostępność promotora specyficznego dla starzenia umożliwiła wytworzenie roślin transgenicznych o zmienionej morfologii starzenia, np. o opóźnionym starzeniu. To odkrycie otwiera drogę do zwiększania w czasie wzrostu użytecznych roślin.
Izolacja konkretnego promotora SAG 12 z Arabidopsis thaliana, SAG 12-1, jest opisana szczegółowo poniżej. W zasadzie opiera się ona na tym, że specyficzny dla starzenia cDNA, w opisie oznaczony symbolem „SAG 12”, izoluje się razem z klonem genomowym odpowiadającym temu sDNA SAG12. Z tego materiału genomowego izoluje się promotor SAG2-1. Termin „SAG” oznacza gen związany ze starzeniem.
184 108
Sekwencja SEQ ID Nr. 1 i fig. 3 przedstawiają sekwencję nukleotydową dlajednej z postaci promotora SAG12-1. Sekwencja SEQ ID Nr. 2 przedstawia skróconą wersję tego promotora. Obie wersje tego promotora SAG12-1 są wystarczające do pobudzenia ekspresji genu w sposób specyficzny dla starzenia.
Poniżej opisany jest również drugi promotor specyficzny dla starzenia, wyizolowany z Arabidopsis w podobny sposób. Ten drugi promotor jest oznaczony symbolem „SAGI 3”. Promotor SAG13 również wyizolowano z genomu Arabidopsis. Sekwencja SEQ ID Nr. 3 zawiera sekwencję nukleotydową dla promotora SAG13, w tym 1782 pary zasad w górę od miejsca początku transkrypcji.
Określenie „promotor specyficzny dla starzenia” wskazuje, że promotory SAG 12 i SAG 13 mają zdolność preferencyjnego pobudzania ekspresji genu w tkance roślinnej w sposób regulowany etapami rozwoju, tak, że ekspresja regionu 3' kodującego białko pojawia się zasadniczo tylko wówczas, gdy dana tkanka roślinna ulega starzeniu.
Korzystnie, promotor SAG12 zawiera nukleotydy wystarczająco homologiczne z pierwszymi 602 parami zasad sekwencji SEQ ID Nr. 2, dzięki czemu promotor ten ma zdolność ekspresji genów preferencyjnie w starzejącej się tkance. Również promotor specyficzny dla starzenia może zawierać sekwencję nukleotydową SEQ ID Nr. 2.
Korzystnie, promotor SAGI 3 zawiera część, sekwencji przedstawionej poniżej na sekwencji SEQ ID Nr. 3. Jakkolwiek taka całkowita sekwencja jest wystarczająca do wykazywania aktywności promotora specyficznego dla starzenia, jest prawdopodobne, że mniejsza sekwencja będzie również wystarczająca. Wiązania takiej mniejszej sekwencji można łatwo oznaczyć przez skracanie poniższej sekwencji SEQ ID Nr. 3 i przez następne doświadczalne oznaczanie w tych skróconych sekwencjach aktywności promotora specyficznego dla starzenia.
W ponizszych przykładach jest opisane wytwarzanie z Arabidopsis klonów cDNA specyficznych dla starzenia, charakteryzacja tych klonów i użycie tych klonów cDNA do wytworzenia specyficznego dla starzenia promotora SAG12-1 i drugiego promotora, SAG13. Przyjmuje się, że istnieją inne promotory specyficzne dla starzenia o homologii z SAG 12-1 bądź SAG 13 wystarczającej aby nadawały się do celów według wynalazku. Do wytworzenia takich homologicznych promotorów można z łatwością użyć techniki opisane poniżej.
Przygotowanie promotora SAG 12
W poniższych przykładach jest opisane izolowanie promotora SAGI 2 z użyciem klonu cDNA SAG 12. Ten klon cDNA otrzymano z cząsteczki RNA, która, jak się okazało, podlega ekspresji tylko w okresie starzenia.
Ten cDNA SAG 12 użyto do skriningu biblioteki Arabidopsis w celu otrzymania genu SAG12. Gen ten początkowo oznaczono symbolem SAG12-1, przyjmując, że w Arabidopsis istniejądwa geny SAG12. Obecnie uznano, że jest tylko jeden. Promotor SAG12-1 otrzymano z klonu genomowego SAG2-1. SEQ ID Nr. 1i fig. 3 ujawniają sekwencję 2073 par zasad promotora SAG 12-1. Dalsze badania, również opisane poniżej, wykazały, że promotor SAG 12-1 może być skrócony do 602 par zasad bez utraty jego funkcji. Sekwencja SEQ ID Nr. 2 przedstawia sekwencję 602 par zasad przyłączoną do niepodlegającego translacji regionu 5' genu SAG 12-1.
Otrzymywanie promotora SAG12 jest postępowaniem wieloetapowym. Drogą najprostszą jest przygotowanie sondy oligonukleotydowej z sekwencji ujawnionych w SEQ ID Nr. 1 i SEQ ID Nr. 2 albo na fig. 3 i sondowanie biblioteki genomowej Arabidopsis w celu wyodrębnienia kopii promotora SAGI2 . Zakład się , że pommejsze addycje, deeecje lub mutacje nukleotydowe nie wpłyną na funkcję promotora SAG 12-1. Ponadto, jest możliwe jeśli nie prawdopodobne, że istnieją różnice w sekwencji genu SAG12 (albo SAGI3) i promotora w poszczególnych populacjach zbiorów Arabidopsis z powodu normalnych zmian allelicznych. Jest również prawdopodobne i tak się przyjmuje, że homologiczne sekwencje można uzyskać z innych roślin. Tak więc, sekwencja odpowiedniego promotora SAG nie musi być identyczna z sekwencją ujawnioną na sekwencjach SEQ ID Nr. 1 bądź SEQ ID Nr. 2. Poniżej jest szczegółowo opisana próba, dzięki której można sprawdzić, czy proponowana sekwencja genomowa
184 108 jest wystarczająco homologiczna z sekwencją promotora SAG12-1 specyficznego dla starzenia, aby nadawała się do celów niniejszego wynalazku.
Dodatkowo, bierze się pod uwagę, że wspomniane 602 pary zasad sekwencji SEQ-ID Nr. 1 można dalej skracać, ciągle zachowując funkcję promotora SAG12. Specjaliści łatwo spostrzegą, że w tej sekwencji 602 par zasad można dokonać cięć 5' albo 3' albo delecji wewnętrznych i otrzymane skrócone produkty można badać na aktywność specyficzną dla starzenia znajdując pomniejszone, skrócone wersje promotora SAG12-1.
Korzystnie, niepodlegającątranslacji część 5'regionu z genu SAG 12-1 można dodać do sekwencji promotora. Sekwencja tajest ujawniona na SEQ ID Nr. 1 i Nr. 2. Na fig. 3 niepodlegający translacji region 5'jest regionem pomiędzy symbolem +1 a symbolem „Nco I”.
Przygotowanie promotora SAG 13
Podobny sposób zastosowano do wyizolowania i identyfikacji promotora SAGI3 opisanego w poniższych przykładach. Tu również spodziewane są różnice w sekwencji SAGI 3 wynikające różnic allelicznych i podobnych. Sekwencje SAG12 i SAG13 nie sąznacząco homologiczne.
Oznaczanie kandydata na promotora
Po wyizolowaniu proponowanej sekwencji genomowej można oznaczyć, czy ta sekwencja DNA jest promotorem SAG 12 bądź SAGI 3. Można sekwencjonować tę sekwencję DNA technikami znanymi specjalistom z zakresu biologii molekularnej roślin oznaczać czy sekwencja tajest identyczna z jedną z sekwencji SEQ ID Nr. 1, Nr. 2 albo Ni-. 3. Jeśli proponowana sekwencja jest identyczna bądź homologiczna z porcją pierwszych 2073 par zasad sekwencji SEQ ID Nr. 1, z pierwszymi 602 parami zasad sekwencji SEQ ID Nr. 2 albo z pierwszymi 1782 parami zasad sekwencji SEQ ID Nr. 3, wówczas sekwencja tajest odpowiednim promotorem SAG12 albo SAG13.
Jeśli jednak sekwencja nie jest identyczna i jest ściśle homologiczna, to znaczy, homologiczna w 95%, można wyizolować kopię allelicznego promotora SAG12 albo SAG13. Następnie można przeprowadzić próbę funkcyjną w celu stwierdzenia, czy sekwencja tajest wystarczająco homologiczna z pierwszymi 602 parami zasad sekwencji SEQ ID Nr. 2, z pierwszymi 2073 parami zasad sekwencji SEQ ID Nr. 1 albo z pierwszymi 1782 parami zasad sekwencji SEQ ID Nr. 3 aby nadawała się do celów niniejszego wynalazku.
Określenie „wystarczająco homologiczna” oznacza, że kandydat na promotora jest w co najmniej 95% homologiczny w sekwencji nukleotydowej i jest zasadniczo równoważny z sekwencją promotora SAG 12-1 pod względem zdolności preferencyjnego pobudzania ekspresji genu w starzejącej się tkance roślinnej. Próba na oznaczanie, czy sekwencja będąca kandydatem na promotora jest odpowiednia, jest opisana poniżej.
W celu wykonania tego oznaczenia, postępuje się według podanych poniżej przykładów. Przyłącza się kandydata na promotora do sekwencji kodującej białko reporterowe, takiej jak sekwencja GUS kodująca enzym β-glukuronidazę. Sekwencja genu GUS jest podana w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr. 5.268.463. Transformacja rośliny kasetą ekspresyjną zawierającą sekwencję GUS pozwala na oznaczenie, czy sekwencja reporterowa GUS podlega ekspresji tylko w tkankach starzejących się, czy podlega ekspresji konstytutywnej lub czy podlega ekspresji wogóle. Jedynie wynik wykazujący, że sekwencja reporterowa podlega ekspresji tylko w tkankach starzejących się a nie w innych tkankach wskazuje, że badany promotor jest odpowiedni.
Alternatywnie, sekwencję kandydata można przyłączyć do sekwencji dla transferazy izopentenylowej (IPT) i transformować do roślin tytoniu, co jest opisane poniżej. W tabeli 2 zamieszczonej w przykładach ujawnione są specyficzne różnice pomiędzy roślinami transformowanymi promotorem SAG 12 przyłączonym do genu IPT i transgenicznymi roślinami kontrolnym zawierającymi konstrukcję z promotorem SAG 12 przyłączonym do genu reporterowego GUS. Kandydat na promotora, jeśli ma się nadawać do celów niniejszego wynalazku, powinien zachowywać się równoważnie.
184 108
Tak więc, kandydat na promotora musi spełniać trzy kryteria. Po pierwsze, musi się dawać izolować lub hydrolizować sondą oligonukleotydową przygotowaną z pierwszych 2073 par zasad sekwencji SEQ ID Nr. 1, z pierwszych 602 par zasad sekwencji SEQ ID Nr. 2 albo z odpowiedniej porcji sekwencji SEQ ID Nr. 3. Po drugie, musi być wystarczająco homologiczny z pierwszymi 2073 parami zasad sekwencji SEQ ID Nr. 1, z pierwszymi 602 parami zasad sekwencji SEQ ID Nr. 2 albo z odpowiedniąporcjąsekwencji SEQ ID Nr. 3, tak, aby mógł inicjować ekspresję genu reporterowego, takiego jak GUS w sposób specyficzny dla starzenia. Po trzecie, musi dawać ekspresję specyficzną dla starzenia równoważną z promotorem SAG12albo SAG 1 3 opisanymi w tabeli 2 w przykładach.
Przygotowanie konstrukcji genetycznej
Po otrzymaniu promotora SAGl2 albo SAG 13 przygotowuje się konstrukcję genetyczną zawierającą zarówno ten promotor jak i sekwencję kodującą białko. Określenie „konstrukcja genetyczna” oznacza połączone operacyjnie; promotor i sekwencję genu. Na ogół, sekwencja promotora znajduje się w kierunku 5' albo „w górę” od sekwencji genu. Promotor ma zdolność inicjowania aktywności transkrypcyjnej z użyciem sekwencji tego genu jako matrycy.
Odpowiednia sekwencja obcego genu jest zdolna do ekspresji cząsteczki RNA. Ta cząsteczka RNA może ale nie musi podlegać translacji do dojrzałego białka. „Sekwencja obcego genu” może alternatywnie występować w orientacji antysensownej w tym celu, aby przebiegała ekspresja antysensownego mRNA. Korzystnie, sekwencja obcego genu koduje białko.
W jednym z rozwiązań wynalazku, sekwencja obcego genu koduje enzym katalizujący biosyntezę hormonu roślinnego, korzystnie cytokininy. Najkorzystniej, enzymem tym jest IPT (transferaza izopentenylowa).
Do połączenia sklonowanego promotora z sekwencją kodującą białko, takąjak sekwencja IPT, można zastosować standardowe procedury biologii molekularnej. Wyizolowano, zsekwencjonowano i opublikowano szereg genów kodujących IPT. Szczepy bakteryjne zawierające te geny zostały zdeponowane w ATCC i są tam dostępne. Mając opublikowaną informację o sekwencji można do wyizolowania genów IPT zastosować reakcję enzymatycznej amplifikacji PCR bądź inną technikę amplifikacji i odzysku genów. Przykłady sekwencji dla IPT (oznaczonych również symbolami tmr albo tzs) sąpodane w następujących publikacjach: Crespi i wsp., EMBO J. 11, 795-804, 1992; Goldberg i wsp., Nucleic Acids Res. 12, 4665-4677, 1984; Heide Kamp i wsp., Nucleic Acids Res., 11,6211 -6223,1983; Strabala i wsp., Mol. Gen. Genet. 216,388-394, 1989).
Konstrukcję genetyczną można przygotowywać stosując wektory plazmidowe albo wirusowe bądź inne metody znane w biologii molekularnej do wytwarzania konstrukcji dających się transformować do komórki roślinnej. Opisano przygotowanie konstrukcji genetycznej odpowiedniej do transformowania z użyciem układu Agrobacterium. Istniejąjednak inne sposoby transformowania roślin i wytwarzania roślin transgenicznych, takie jak bombardowanie cząstkami i elektroporacja, w których to sposobach stosuje się wiele różnych układów wektorowych. Umiejętność konstruowania i dostosowywania takich wektorów do układu transformacyjnego, który ma być użyty posiadają specjaliści z tej dziedziny.
Modyfikacja procesu starzenia w roślinie
Dostępność efektywnych promotorów roślinnych specyficznych dla starzenia daje możliwość wytwarzania transgenicznych roślin o zmienionych właściwościach starzenia. Do roślin można wbudowywać konstrukcje genetyczne, które stają się aktywne tylko wówczas, gdy komórki rośliny wkraczają w okres starzenia się. Taka ekspresj a specyficzna dla starzenia pozwala na ekspresję w roślinach takich genów, które mogą mieć niszczące działanie dla morfologii rośliny lub jej produktywności jeśli ich ekspresja zachodzi w innym etapie rozwoju rośliny. Dla przykładu, obecnie stała się możliwa insercj a genu koduj ącego enzym biosyntezy cytokininy pod kontrolą promotora specyficznego dla starzenia bez eksponowania tkanek roślinnych na nadmiar cytokininy podczas fazy wzrostu przed starzeniem. Następnie, na początku starzenia, promotor specyficzny dla starzenia aktywuje produkcję cytokininy, zmieniając przebieg procesu starzenia w tej roślinie. Okazało się zwłaszcza, ze połączenie promotora specyficznego dla sta184 108 rżenia i sekwencji genu dla wytwarzania cytokininy prowadzi do wytworzenia rośliny transgenicznej w której starzenie jest opóźnione. Taka roślina będzie w fazie wegetatywnej rosła dłużej, będzie dawała więcej kwiatów, nasion lub owoców niż odpowiednia roślina nietransgeniczna. Bierze się również pod uwagę, że za promotorem specyficznym dla starzenia można umieścić inne regiony kodujące, wpływające na dojrzewanie i starzenie się roślin i dokonać transformacji do roślin, uzyskując użyteczne rośliny transgeniczne o zmienionych cechach starzenia.
Przykłady
Materiały i metody
Materiały roślinne
Nasiona Arabidopsis thaliana, ekotyp Landsberg erecta, sterylizowano w 2,5% roztworze podchlorynu sodu przez 5 minut i przemyto, pięciokrotnie zmieniając sterylną wodę. Sterylne nasiona moczono w temperaturze 4°C w 1 mM kwasie A3 gibberelinowym przez 5 godzin i następnie wysiano do mieszaniny ściółki torfowej, wermikulitu i perlitu (1:1:1) nasyconej roztworem pożywki dla Arabidopsis opisanej przez Somerville'a i wsp. (Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier Biomedical Press, Nowy Jork, N.Y., str. 129-137,1982). Wzrost roślin prowadzono w temperaturze 23 °C przy wilgotności względnej 60%, w 120 pmolach x m'2 x sek'1 ciągłego światła pochodzącego z mieszaniny zimnych białych lamp fluorescencyjnych (80%) i żarówek (20%) i nawadniano podglebie wodą w miarę potrzeb. W tych warunkach rośliny wzrastały wegetatywnie przez około 3 tygodnie tworząc 6-7 rozetkowych liści i następnie wypuszczając łodygę. Rozetkowe liście 5 i 6 zebrano w różnych czasach po ich pełnym rozwinięciu się. W szy stki tkanki zamrożono w ciekłym azocie natychmiast po zebraniu i przechowywano w temperaturze -80°C.
Ilościowe oznaczenie chlorofilu i białka
Ilość 45 cm2 świeżych liści moczono w temperaturze 65°C przez 2 godziny w etanolu i ilość chlorofilu oznaczono spektrofotometrycznie (Wintermans i wsp., Biochem. Biophys. Acta, 109,448-453,1965). Po inkubacji z etanolem te same liście użyto do ekstrakcji całkowitego białka i następnie krótko je suszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość liści z 45 cm2 materiału liści zmielono w ciekłym azocie, zawieszono w 9 ml roztworu o składzie: 10 mM cytrynian dwusodowy, 1 mM EDTA, 1 % SDS (pH = 8) i inkubowano w temperaturze 70°C, mieszając, w czasie 30 minut. Składniki rozpuszczalne i nierozpuszczalne oddzielono przez wirowanie. Frakcję w peletce rozpuszczano w 10 ml 1 N roztworu NaOH przez dobę w temperaturze 30°C. Następnie oznaczono ilościowo poziomy białka we frakcjach rozpuszczalnej i speletkowanej metodąLowr/ego i wsp. (J. Biol. Chem. 193,265-275,1951) z modyfikacjami Petersona (Anal. Biochem., 83,346-356,1977) i Larsona i wsp. (Anal. Biochem., 155,243-248, 1986). Analizowano trzy próbki - repliki z trzech niezależnych partii Arabidopsis.
Analiza RNA
Całkowity RNA ekstrahowano w sposób opisany przez Puissanta i wsp. (BioTechniąues 8, 148-149, 1990) i oznaczano ilościowo spektrofotometrycznie (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: a Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Press, NY, 1989). Do analiz RNA metodą blottingu w żelu, próbki RNA frakcjonowano elektroforetycznie w żelach formaldehydoagarozowych, przenoszono na filtry polisulfonowe (Gelman, Ann Arbor, MI) i hybrydyzowano ze znakowanymi 32P sondami wytworzonymi metodą znaczenia losowego (John i wsp., J. Bacteriol 170,790-795,1988). RNA nanoszono na żele w przeliczeniu na masę (5 pg RNA na pasmo) i w przeliczeniu na powierzchnię (ilość RNA równoważna połowie liścia na pasmo). Ilość sondy hybrydyzującej z tym RNA oznaczano ilościowo za pomocą skanera Betagen z cząstkami beta (IntelliGenetics, Inc., Mountain View, CA). Dla każdego klonu cDNA analizowano plamy RNA w żelu przygotowane z trzech niezależnych partii tkanki.
Konstruowanie i skrining bibliotek cDNA
Poli (A) + RNA użyty do konstruowania bibliotek cDNA wyizolowano w sposób opisany przez Crowelfa i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8815-8819, 1990). RNA wyizolowany z liści S2 i połączonych partii liści S3 i S4 użyto do konstruowania dwu bibliotek cDNA. Pierwszą nić cDNA syntetyzowano przy użyciu jako primera oligo (dT)17-Xba I i odwrotnej
184 108 transkryptazy, SuperScript™ RNA-zy H' a drugą nić cDNA syntetyzowano stosując polimerazę DNA i z E. coli, ligazę DNA z E. coli i RNA-zę H, jak zalecał producent (BRL, Gaithersberg, MD). Dwuniciowy cDNA frakcjonowano pod względem wielkości na kolumnie BioGel a 0,5 m (BioRad, Richmond, CA) w celu usunięcia cDNA krótszego od 200 par zasad. Do tego cDNA przyłączano przez ligację linkery-adaptory EcoRI (Promega, Madison, WI), następnie końce 5' tego cDNA fosforylowano kinaząpolinukleotydową. Ten cDNA frakcjonowano pod względem wielkości metodą elektroforezy w żelu agarozowym i cząsteczki cDNA> 500 par zasad elektroeluowano i poddawano ligacji z plazmidem Bluescript SKII(+) (Stratagene, La Jolla, CA) uprzednio ciętym enzymem EcoRI i defosforylowanym. Produkty ligacji wprowadzano do E. coli, szczep IDH5a, metodąelektroporacji. Biblioteki S2 cDNA i S3/4 cDNA zawierały po 1 x 105 klonów rekombinantowych. W celu skriningu tych bibliotek przygotowano filtry-repliki tych bibliotek w sposób opisany przez Sambrook'a i wsp. (Sambrook i wsp., 1989, jak wyżej) i hybrydyzowano je z sondami cDNA wytworzonymi przez odwrotnątranskrypcję poli (A) + RNA z użyciem dezoksyadenozyno-5-[a-32P]-trójfosforanu. Do analizy metodą hybrydyzacji krzyżowej przygotowano sondy odpowiadające insertom cDNA metodą znakowania losowego i hybrydyzowano je z plamami „dot biot” kandydujących plazmidów (Sambrook i wsp., 1989, jak wyżej).
Starzenie się liści w Arabidopsis thaliana przebiega poprzez określone zmiany fenotypowe i biochemiczne
Podzielono proces starzenia rozetkowych liści Arabidopsis thaliana na 5 stadiów oznaczonych symbolami od S1 do S5 w oparciu o wygląd fenotypowy i oznaczoną ilość RNA, białka i chlorofilu obecnego w każdym stadium. Liście w stadium starzenia S1 wykazują pierwszą widzialną oznakę starzenia - utratę chlorofilu na czubku liścia. W miarę, jak liść przechodzi przez starzenie, występuje następna utrata chlorofilu. W stadiach S2, S3, S4 i S5 odpowiednio około 25%, 25-50%, 50-75% i ponad 75% powierzchni liścia przybiera barwę żółtą. Ocena wizualna tych stadiów była zgodna z odpowiednimi poziomami utraty chlorofilu. W zastosowanych warunkach wzrostu, liście osiągają stadium S1, S2, S3, S4 i S5 odpowiednio dniach 3,5,7,9 i 10 po pełnym rozwinięciu się liścia.
Podczas starzenia, ilość RNA, białka i chlorofilu obecnego w liściu spada. Spadek ilości RNA i białka rozpoczyna się w czasie, gdy po raz pierwszy jest zauważalna strata chlorofilu (stadium S1). Ciągnie się on w czasie, gdy liść przechodzi przez program starzenia. Istnieje wysoce powtarzalna korelacja między ilościową utratą chlorofilu a spadkiem poziomów białka i RNA.
Izolowanie genów związanych ze starzeniem
W celu identyfikacji tych mRNA, których występowanie wzrasta w liściach Arabidopsis podczas starzenia, dokonano różnicującego skriningu biblioteki cDNA skonstruowanej z mRNA pochodzącego ze starzejących się liści. Konkretnie, dwie biblioteki cDNA były skonstruowane z matrycowego RNA wyizolowanego z liści w stadium S2 i mieszanki liści ze stadium S3 i stadium S4. Skrining bibliotek cDNA S2 i S3/4 prowadzono różnicująco z sondami cDNA wytworzonymi przez odwrotną transkrypcję odpowiednio poli (A) + RNA wyizolowanego z liści niestarzejących się (NS) i poli (A) + RNA wyizolowanego z liści w stadium S2 albo S3/4.
Przez różnicujący skrining biblioteki cDNA S3/4 zidentyfikowano mRNA, których występowanie wzrasta podczas starzenia. Z tej biblioteki wyselekcjonowano 23 klony cDNA, które hybrydyzowały silniej z sondą cDNA S3/4 niż z sondą cDNA NS do dalszej charakteryzacji. Tę klasę nazwaliśmy „genami związanymi ze starzeniem” (SAG). Analiza metodą hybrydyzacji krzyzowej wykazała, że ta kolekcja zawiera sześć gatunków cDNA. Najdłuższe cDNA z każdej rodziny użyto do dalszych analiz. Wielkości mRNA, które odpowiadaj ącDNA SAG są przedstawione poniżej, w tabeli 1.
184 108
Tabela 1
Przybliżone wielkości mRNA w nukleotydach SAG
| SAG | Wielkość | SAG | Wielkość |
| 12 | 1360 | 15 | 4560 |
| 13 | 1340 | 16 | 1150 |
| 14 | 1140 | 17 | 800 |
Różnicujący skrining biblioteki cDNA S2 wobec sond cDNA NS i S2 ujawnił, że ogromna większość klonów poddanych ekspresji w sposób różnicujący hybrydyzowała silniej z sondą cDNA NS niż z sondą cDNA S2. Te klony cDNA odpowiadajątym mRNA, których występowanie spada podczas starzenia. Podczas starzenia, wydajność fotosyntezy w liściu i poziomy transkryptów kodujących białka potrzebne do fotosyntezy spadają(Hensel i wsp., 1993, jak wyżej). Tak więc, cDNA odpowiadające transkryptom kodującym białka związane z fotosyntezą występują prawdopodobnie w tej grupie klonów, których ilość spada podczas starzenia. Sześć cDNA, które hybrydyzowały silniej z sondą cDNA NS niż z S2 dowolnie wybrano do dalszych badań w celu określenia różnic z cDNA SAG. Nazwaliśmy te klony genami starzenia regulowanymi w dół (SDG) od 1 do 6. Pragniemy podkreślić, że SDG 1 do 6 odpowiadająjedynie małej frakcji cDNA w tej bibliotece, wykazując ostry spadek ilościowy podczas starzenia.
Ekspresja genów podczas naturalnego starzenia się liścia
Poziomy w stanie ustalonym mRNA odpowiadającego wyizolowanym klonom cDNA badano okresowo w ciągu starzenia się liści. Tę kolekcję cDNA wyizolowano na podstawie różnicującej ekspresji w oparciu o masę. Konkretnie, filtry - repliki tych bibliotek poddano skriningowi z równą masą (mierzonąjako dpm) cDNA znakowanego 32P, otrzymanego przez odwrotnątranskrypcję poli (A) + RNA wyizolowanego z liści NS albo z liści starzejących się. Ponieważ ilość całkowitego RNA obecnego w liściu spada podczas starzenia, możliwe jest, że odpowiednio spadająpoziomy poli (A) + mRNA. Jeśli poziomy poli (A) + mRNA spadająpodczas starzenia, to różnicujący skrining cDNA może ujawnić klony SAG odpowiadające sygnałom, które pozostają stałe podczas starzeniajeśli ekspresję bada się w przeliczeniu na komórkę ale zwiększają się ilościowo jeśli ekspresję bada się jako funkcję masy RNA. Dla przykładu, może się okazać, że sygnał SAG, który pozostaje na stałym poziomie przy oznaczaniu w przeliczeniu na komórkę, wzrasta ilościowo w przeliczeniu na masę jeśli poziomy większości mRNA spadają. Dla stwierdzenia, czy poziomy mRNA SAG zwiększaaąsię podczas starzenia, zbadano ekspresję tych sygnałów, zarówno w funkcji masy jak i powierzchni liścia, w każdym stadium starzenia. Poziomy w stanie ustalonym RNA odpowiadających genom SAG, wzrastająpodczas starzenia przy badaniu zarówno w przeliczeniu na masę jak i w przeliczeniu na powierzchnię. Wzrost oznaczony w oparciu o powierzchnię liścia wykazuje, że poziomy mRNA SAG w przeliczeniu na komórkę wzrastają podczas starzenia. Przy oznaczaniu w oparciu o masę, poziomy wszystkich mRNA SAG były maksymalne w ostatnich stadiach starzenia się (S3-S5). Jeśli jednak wykonano pomiar w oparciu o powierzchnię liścia, niektóre mRNA SAG (np. 13 i 15) powtarzalnie wykazująmaksymalne poziomy we wcześniejszych stadiach starzenia się. SAG12 wykazuje jeden z najwyższych poziomów wzbudzenia i w ramach czułości metod detekcji można uznać, że podlega ekspresji jedynie podczas starzenia. Nie pojawia się wykrywalny sygnał SAG12 w pasmach RNA pochodzących z niestarzejących się liści nawet przy długich czasach ekspozycji autoradiografu ani przy pomiarze w kolektorze cząstek beta. Poziomy mRNA SAG12 zwiększają się w przebiegu procesu starzenia i osiągają poziomy maksymalne w ostatnim badanym stadium starzenia.
Poziomy RNA w stanie ustalonym odpowiadające sześciu genom regulowanym w dół spadająpodczas starzenia przy badaniu zarówno w funkcj i masy RNA jak i w ftinkcj i powierzchni liścia. Jak oczekiwano, spadek ten jest znacznie większy jeśli ekspresję bada się w funkcji powierzchni niż w funkcji masy. Jak opisano powyżej, większość mRNA występujących w liściu wydaje się podlegać tej prawidłowości, włączając w to mRNA odpowiadające genom kodowa12
184 108 nym w jądrach, zaangażowanych w fotosyntezę, takichjak gen dla białka wiążącego chlorofil a/b (CAB) i dla małej podjednostki karboksylazy/oksygenazy bifosforanu rybulozy (Rubisco) (Hensel i wsp., 1993,. jak wyżej). Oznaczono również poziomy CAB mRNA podczas zdefiniowanych stadiów starzenia. Okazało się, że poziomy CAB mRNA spadają podczas starzenia się liścia w przybliżeniu w tym samym stopniu co sDg. Jednakże analizy hybrydyzacji krzyżowej wykazały, że żaden z 6 klonów SDG nie należy do rodziny genów CaB ani Rubisco.
Izolowanie promotora specyficznego dla starzenia
Przeprowadziliśmy skrining biblioteki genomowej Arabidopsis z cDNA SAG 12 na obecność klonów zawierających region promotora SAG12 z SAG12. Bibilioteka ta pochodziła od Davida Marksa z Uniwersytetu w Minnesota.
Okazało się, że w genomie Arabidopsis znajduje się jedna kopia SAGI 2. Fig. 1 przedstawia diagram konstrukcji zawierającej 2073 pary zasad promotora SAG12-1 i niepodlegający translacji region 5', przyłączony do genu reporterowego GUS. Fig. 2 przedstawia diagram sekwencji nukleotydowej promotora SAG 12-1 przyłączonej do niepodlegającej translacji sekwencji 5' SAG12-1, genu transferazy izopentenylowej i sekwencji zakańczania NOS.
Fragment promotora SAG12-1 (od miejsca dla EcoRV przy pozycji -2073 poprzez miejsce dla Ncol sztucznie utworzone w miejscu kodonu startu SAG12-1 przez oligomutagenezę) klonowano do miejsc EcoRV-NcoI w pGEM5Zf (+) (Promega, Madison, WI). Tę konstrukcję oznaczono symbolem pSG499. Fragment Sall-Sall o długości 2,6 kilozasad, zawierający 1,87 kilo zasady GUS i 0,8 kilozasady terminatora MAS klonowano do miejsca Sali plazmidzie pUC18. Terminator MAS jest opisany w czasopiśmie Plant Mol. Biol. 15,373-381 (1990). Tę konstrukcję oznaczono symbolem pSG468-2. Długość 2,2 kilozasad promotora SAG12-1 od miejsca Ncol do miejsca Pstl w pSG499 klonowano do pSG468-2 miejscach Ncol-Pstl. Tę konstrukcję oznaczono symbolem pSG506. Fragment Pstl-Xbal zawierający promotor SAG12-1: GUS: MAS-ter klonowano następnie do wektora binarnego w miejscach Pstl-Xbal, uzyskując konstrukcję przedstawioną na fig. 1.
FragmentNcoI-XbaI o wielkości 1 kilozasady, zawierający 0,7 kilozasady IPT i 0,3 kilozasady sekwencji terminatora NOS (Yi Li i wsp., Dev. Biol. 153,386-395,1992) klonowano do plazmidu pSG506 w miejscachNcol-Xbal, zastępując fragment GUS:MAS-ter. Tę nowąkonstrukcję oznaczono symbolem pSG516. Następnie sklonowano fragment Spel-Spel zawierający konstrukcję: promotor SAG12-1 : IPT : NOS-ter w pSG516 do wektora binarnego w miejscu Xbal (zarówno miejsce Spel jak i Xbal mają kompatybilne lepkie końce restrykcyjne), uzyskując konstrukcję przedstawioną na fig. 2.
Zmapowano miejsce początku transkrypcji SAG12-1 (wskazane jako +1 na fig. 3) i dokonano fuzji fragmentu o długości 2180 par zasad, zawierającego 2073 pary zasad w górę od tego miejsca startu i 107 par zasad niepodlegającego translacji regionu 5' z SAG12-1 (UTR) do dwu genów: genu reporterowego beta-glukuronidazy (GUS) i genu transferazy izopentenylowej (IPT), enzymu katalizującego etap ograniczenia szybkości biosyntezy cytokininy. Ten fragment promotora zaczyna się w punkcie „a”nafig. 1, na fig. 2 i na fig. 3. Sekwencja SEQ ID Nr. 1jest sekwencją promotora SAG12-1, genu IPT i sekwencji NOS-ter.
Te geny wprowadzono do genomów Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) i Nicotiana tabacum (tytoń) metodą transformacji za pośrednictwem Agrobacterium (Horsch i wsp., Science 227,1229-1231,1985; Valvekensi wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,5536-5540,1988). Wytworzone rośliny utrwalano i analizowano na ekspresję genu GUS metodą kolorymetryczną. Analiza ekspresj i transgenu wykazała, że sekwencj a geneomowa SAG 12-1 złączona przez fuzję z genem reporterowym zawiera promotor, specyficzny dla starzenia. Zarówno w Arabidopsis jak i w tytoniu, ekspresja genu GUS przebiegała w starzejących się liściach natomiast była niewykrywalna w liściach przed starzeniem.
Przeprowadzono bardziej wyczerpującą analizę transgenicznych roślin tytoniu. Stwierdzono, że promotor SAG 12-1 jest również aktywny w częściach kwiatowych podczas starzenia. Ten fakt nie jest zaskoczeniem, gdyż narządy kwiatowe sąrozwojowo i ewolucyjnie spokrewnione z liśćmi (uważa się, że narządy kwiatowe są to zmodyfikowane liście).
184 108
Okazało się, że fragment o wielkości 709 par zasad (602 pary zasad w górę od początku transkrypcji; punkt „b” na fig. 1) połączony przez fuzję z genem GUS daje prawidłowości ekspresji genu GUS w roślinach trrnsgjnicznych identyczne z tymi, jakie obserwuje się dla fragmentu o wielkości 2180 par zasad. Tak więc, ten mniejszy region zawiera wszystkie sygnały regulacyjne potrzebne do regulacji specyficznej dla starzenia. Sekwencja SEQ ID Nr. 2 składa się z 602 par zasad w górę od początku transkrypcji w genie SAG 12-1 i ze 107 par zasad niepodlegającego transkrypcj i regionu 5'.
Użycie promotora specyficznego dla starzenia do opóźniania starzenia.
Wiadomo, że cytokininy wykazują właściwości blokowania starzenia się liścia zarówno w liściach zerwanych jak i w liściach podlegających naturalnemu starzeniu na roślinie w wielu gatunkach obejmujących rośliny Cednoliścijnnj i dwuliścienne. Przeglądu dokonał Nooden (Senescence and Aging i Plants, str. 391-439,1988) i Van Staden i wsp. (Senescence and Aging in Plants, str. 281-328, 1988). Ponadto, zapobieganie starzeniu przez cytokininy wiąże się z podtrzymywaniem aktywności fotosyntezy w liściu. W szeregu badań wykazano, że traktowanie cytokininami stymuluje fotosyntezę i chloroplasty oraz syntezę cytoplazmatycznego białka, zapobiegając rozpadowi chloroplastów (Van Staden i wsp., jak wyżej).
Jakkolwiek w większości badań na temat wpływu cytokinin na starzenie stosowano cytokininy egzogenne, istnieje dowód na to, że cytokininy wytwarzane endogennie są naturalnymi regulatorami starzenia się liści. Ostatnio Nooden wraz ze współpracownikami (Plant Physiol., 93,33-39, 1990) badał pr^<^^ł;^’wy w ilściach soi podlegających naturalnemu starzeniu na nienaruszonej roślinie. Podczas późniejszych stadiów rozwoju nasion, które wyzwalają proces starzenia w soi, drastycznie obniża się przepływ cytokinin z korzeni do liści. Ponadto, usunięcie kolb nasiennych odwraca proces starzenia i przywraca przepływ cytokinin do liści. Dalsze potwiedzenie tego zjawiska stanowią badania nad roślinami transgenicznymi. Gen transferazy izopentenylowej (IPT) z T-DNA z plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens katalizuje etap ograniczenia szybkości biosyntezy cytokinin. Trrnsgenicznj rośliny, w których zachodzi nadekspresja genu IPT często wyka^j^pewne opóźnienie w starzeniu się liści (Li i wsp. Dev. Biol., 153, 386-395,1992; Ooms i wsp., Plant Mol. Biol., 17,727-743,1991; Smart i wsp., The Plant Cell, 3,647-656,1991). Jednakże ekspresja IPT w tych transgenicznych roślinach nie jest specyficzna dla liści i w związku z tym w takich transgjnicznych roślinach występują nieprawidłowości rozwojowe typowe dla ogólnej nadprodukcji cytokinin, takie jak zahamowanie wzrostu korzeni i brak górowania wierzchołka.
Celem badań było skierowanie produkcji cytokinin do starzejących się liści na poziomie, który będzie blokował starzenie ale nie będzie przeszkadzał w innych procesach zachodzących podczas rozwoju rośliny.
Wytworzono osiem transgenicznych linii tytoniu stosując konstrukcję genetyczną przedstawioną na fig. 2. Wszystkie osiem transgenicznych linii tytoniu, w których zachodziła ekspresja fuzji SAG 12-1/IPT były całkowicie normalne fenotypowo (to znaczy nie było zmian w rozgałęzieniu, w rozwoju kwiatów we wzroście korzeni itp.) za wyjątkiem tego, że wszystkie liście tych transgenicznych roślin zachowywały wysokie poziomy chlorofilu przez cały okres rozwoju kwiatów i nasion. Nietransformowane rośliny kontrolne i rośliny transformowane konstrukcją podobną do fuzji SAG 12-1 /IPT, w której to konstrukcji sekwencje IPT zastąpiono genem GUS, wykazywały rozległe starzenie niższych liści podczas rozwoju kwiatów i nasion. Tak więc, osiągnięto cel zmiany starzenia bez zaburzania innych procesów rozwoj owych rośliny.
Transgeniczne rośliny odznaczały się znacznie zwiększoną produkcją biomasy, kwiatów i nasion. Jak to jest zilustrowane w tabeli 2, w roślinach trrnsgjnicznych IPT znacznie wzrastała całkowita biomasa i ilość kwiatów w porównaniu do roślin transgenicznych, w których zachodzi ekspresja genu GUS, jakkolwiek ilość liści i czas kwitnienia były takie same. Wydajność nasion w przeliczeniu najeden kwiat była taka sama w roślinach kontrolnych i w roślinach IPT, j ednak wydajność nasion była prawie dwukrotnie większa w transgenicznych roślinach IPT. Rośliny transgeniczne IPT ciągle rosły (rośliny kontrolne przestały rosnąć) w czasie kończenia doświadczenia w wyniku zakażenia owadami i rzeczywisty wzrost wydajności byłby prawdopodobnie większy jeśli doświadczenie byłoby kontynuowane. Tak więc, ten układ ma potencjalne zastosowanie do zwiększania wydajności biomasy i nasion i do zwiększania produkcji kwiatów w roślinach ozdobnych.
184 108
Konstrukcję SAG12-IPT przedstawioną na fig. 2 wprowadzono również do Arabidopsis. Wykazano, że blokuje ona starzenie się liści również w tym gatunku.
Wytworzono konstrukcję SAGI 2-1 /IPT z użyciem konstrukcji IPT dostarczonej prze Yi Li (Li i wsp. Dev. Biol., 153,386-395,1992). Użyteczną cechą tego genu jest to, że wprowadza się miejsce Ncol na początku translacji. Gen IPT był łatwo dostępny z naszych poprzednich prac (patrz np. Akiyoshi wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,5994-5998),jednak wybrano konstrukcję Li w celu zabezpieczenia etapu klonowania. W tej konstrukcji jest użyty terminator (sekwencja dająca prawidłowy koniec 3' w mRNA) z genu syntazy nopalinowej (NOS) (Bevan i wsp., Nucleic Acids Research 11, 369-385, 1983).
Izolowanie promotora SAG 13
W bibliotece mRNA opisanej powyżej zidentyfikowano 23 klony cDNA związane ze starzeniem się liści. Identyfikacja jednego z nich, SAG12,jest opisana powyżej, podobne sposoby użyto do identyfikacji SAG 13 i związanego z nim promotora.
Klon SAGI 3 zawierał insert o wielkości 1,24 kilozasady. Insert ten użyto do przygotowania sondy do skriningu opisanej powyżej biblioteki genomowej Arabidopsis. Wykryto dwa unikalne klony genomowe (to znaczy, że istniejądwie kopie SAG13 wgenomie Arabidopsis). Te dwa klony zawierały fragment EcoRI-Sall o wielkości 3,53 kb, zawierający region w górę od_ miejsca początku transkrypcji. Te fragmenty DNA podklonowano do wektora pBluescript IIS-K w miejscach EcoRI i Sali i następnie przeprowadzono ich sekwencjonowanie. Fragment ten zawierał sekwencję cDNA SAGI 3 i nad nią sekwencję promotora. Sekwencja SAGI 3, w górę od sekwencji promotora, jest przedstawiona na SEQ ID Nr. 3, poniżej. Miejsce początku transkrypcji znajduje się przy nukleotydzie 1782 a miejsce początku translacji znajduje się przy nukleotydzie 1957. Te dwie sekwencje były identyczne za wyjątkiem pozycji 1009, w której jedna kopia tego genu zawiera resztę G a druga kopia zawiera resztę A.
Tabela 2
Porównanie niektórych cech charakterystycznych transgenicznych rośli SAG12-itp i roślin pokrewnych
| Wisconsin 38 (typ dziki) | Rośliny SAG12-gus | Rośliny SAG 12gus/SAG12-ipt | Rośliny SAG12-ipt | |
| Zawartość; chlorofilu (Hg x cm , liść nr. 7) . roślina 39-dniowaf. roślina 68-dniowa | 19,911 ±0,642 | 21,627 ± 1,893 | 22,117 ± 1,944 | 25,638 ± 1,877 |
| 1,239 ±0,719 | 1,797 ± 1,575 | 16,905 ± 1,551 | 18,527 ±2,855 | |
| Zawartość białka (|tgxcm , liść nr. 7). roślina 39-dniowa. roślina 68-dniowa | 52,47 ± 1,75 | 52,27 ± 1,01 | 71,33 ± 7,04 | 71.60 ±3,86 |
| 16,00 ±5,29 | 19,60 ± 10,65 | 54,40 ± 3,49 | 49.60 ± 5,88 | |
| Całkowita ilość kwiatów (liczba) | 178,3 ±28,1 | 176,2 ±51,1 | 318,6 ±44,2 | 327,5 ± 46,3 |
| Wydajność nasion (g/roślinę) | 20,436 ±41,182 | 21,142 ±3,683 | 30,240 ±4,037 | 31,154 ± 4,100 |
| Biomasa (g/roślinę) | 107,51 ± 14,41 | 101,64 ± 10,97 | 151,80 ±20,40 | 150,79 ±20,15 |
| Wysokość roślin | 176,25 ± 14,27 | 172,54 ±6,70 | 178,38 ± 10,54 | 180,15 ±7,91 |
| Ilość liści na głównej łodydze | 33,3 ± 0,5 | 33,0 ±0,9 | 33,1 ± 1,0 | 33,5 ± 1,4 |
a) - We wszystkich genotypach roślin liście nr 7 były w pełni rozwinięte ale me starzały się po 39 dniach od ich pojawienia się
b) - Zarówno w roślinach typu dzikiego jak i w roślinach SAG-12-gus obserwowano całkowite zestarzenie liści po 68 dniach od ich wzejścia
c) - Sucha masa rośliny powyżej gleby za wyjątkiem nasion
d) - Od powierzchni gleby do najwyższej łodygi kwiatowej
Wielkości próbek Wiscomsm38 - 8 roślin
SAG12-gus - 13 roHm
SAG12-gus/SAG12-ipt - 8 ro^lιn
SAG12-ipt - 13 rośhn.
184 108
WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA (i) ZGŁASZAJĄCY: Amasino, Richard M
Gan, Sushang (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Rośliny transgeniczne o zmienionej charakterystyce starzenia.
(iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 3 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
| (A) | ADRESAT: | Quaries & Brady |
| (B) | ULICA: | 1 South Pinckney Sreeet |
| (C) | MIASTO: | Madison |
| (D) | STAN: | WU |
| (E) | KRAJ: | Sttn^y Zjednoczony Z^n^.re^lii |
| (F) | ZIP: | 53703 |
(v) FORMA DO ODCZYTU KOMPUTEROWEGO:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, wersja #1.30 (vi) DANE O NINIEJSZYM ZGŁOSZENIU:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(viii) INFORMACJA O RZECZNIKU/AGENCIE:
(A) NAZWISKO: Seay Nicholas J.
(B) NUMER REJESTRACYJNY: 27,386 (C) NUMER REFERENCYJNY/NUMER SPRAWY: 960296.92808 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
(A) TELEFON: 608-251-5000 (B) TELEFAX: 608-251-9166 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr: 1:
(i) CHTARATTłRYSTTYKA SEK^WNCJ:
(A) DŁUGOŚĆ: 3183 pary zasad (B) TYP: was nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa
184 108 (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 1:
| GATATCTCTT | TTTATATTCA | AACTACTTCC | TGAGACTTGG | TTKGCAACACG | GACATCCTCT | 60 |
| CTCGTGGAGC | ACCGAGTCTG | TTGTATAGAA | taaatcccat | TGGTATTTTT | AGATATAGAG | 120 |
| ACTACAGTAA | AATCGTTGAT | TGTTTTGAGG | TGATTTGTAGG | GTCATCCCCGG | TTGAATTTTT | 180 |
| AAATGATTAG | TTATCTTCGC | TATTATTGTA | TCGTTTATAA | GTAGGGTTTT | GACACCCCTT | 240 |
| TTTTCTCTCT | TTGGTGTTTT | CTTAACATTA | CGATATTCCCA. | TATCATTCGCA | CCTTCATCCTr | 300 |
| AATTAAAAAC | aatatttcca | AGGTTTATAT | AlCGAGTTGCTTG | ΤΓΓΤΤΤΤΜΤΤ | GATTCATCTT | 360 |
| GAATAGTTGA | TTATGCATTT | GAT AGAT CAT | TACTOATAT | ATGGTTATTTG | ATGTATATAT | 420 |
| ATGAACTCAG | TTGTTATACA | AGACCTCGACC | ATGCTATGTA | ATTACCCATTC | ATGACTGTGAT | 480 |
| AAAAAGTGTC | AGAATATGAC | ATTGCCAAA | TTGACCAACC | GAAATTTCCATG | TTATAtAGTT | 540 |
| ggatctctca | AGAATATTTT | ggacccataga | ACTTATATTT | CAACCCTCCTGC | gttagottc | 600 |
| GAGACGAGGA | AGACAGATTG | GCTOATTATA | ATCATTACTAC | GACATCTCGTA | TTAGTTACTA | 660 |
| CTTTGGTAGC | AAGTCGATTT | ATTTGAACTT | TfCCCUCATTA | TACACATCAG | A<ATTAC<ATA | 720 |
| TCGTTATTAG | TTTGTACTTG | GTACCAAGG | TTGTTAATTA | (ATTACTATAG | TTTGCCTCCCAC | 780 |
| TGTGTTCATG | AGGTGATTGT | GAGCTTTCGGA | CTGTGACTCA | (ACAAACCAA | OCATTATACT | 840 |
| TAACTAAGTT | TTATAGATTT | TTTTTTATAA | CATTGTTGCC | ACCGATCGTA | ACGATCTG^T^CT | 900 |
| TTTACACCGC | ATTTTTCCCT | GTACCCCGiGTT | TCATATACTA | ΓΓΓΑΤΤΤΑΤΑ | TAGTCCCCGGT | 960 |
| GAAAATTATA | AGTTTATAAC | GTTTTTACAC | TTAGTTCATTT | ACCCCTATATT | CGTTCCCCTATT | 1020 |
| TATGTCTTAC | TTCTTCTTTG | TGTAAGAJGTT | CTTAGATTTT | CATAATCCTTA | JCCTTCCTTCCT | 1084) |
| AATCATTATA | TTTGTCAATT | TGOATTCATT | TTATAATTTT | CAATTTACTA | GTTTAACCCAC | 1000 |
| TTATCACTTC | AGCCATTTAT | GATTTTAACT | TTTTTGCCACCT | ATTACCCTTC | GTACGTATCCC | 1002 |
| CTCTTGTCGT | CTTATGATTA | tttgattatt | TCATATACTA | TCCCTCCAAA | (AGACAAJGAC | 1000 |
| TTTATATTGT | ATTCTAATGA | CACCGAACTA | TTCATACATGA | GTOAGCTCTAC | TTGCCTTTACT | 1320 |
| GAACTTATTC | ATTGAACAGG | AACCCTTTAT | CAAATCATTC | CGACTTATCT | ACCTTTTGJATC | 1384) |
| ACTTAGAGTA | ATACAGTTCT | CAGTATGTGA | ATGGGAGTTA. | TTTCAACCCTAT | GTAGTTGTTTC | 1000 |
| TTGTCAATTC | ATTTTTCTTT | TTGATTTTGAT | TTATTCCTGTA | AGTCGAACGA | ATTAAAGACA | 1008) |
| TATGATTATA | ACATATATGT | gjgggtcaatt | TATTTCAGTA | CTCACTTTATC | JCCTTACTACT | 1060 |
| TCCTTGTTTT | TATGTGATTA | GATACTrrGA | TG5CA.CCACCTG | CGCACCTACGT | ACTACACACT | 1000 |
184 108
| AAATAAACAT | GTACGTAACT | ACGTATCAGC | ATCGCAAAAGT | attttttccc | AAATAATTCA | 1680 |
| TACTCATGAT | AGATTTTTTT | TTTTTGAAAT | CTCAATTAAA | TAMTGCTTTCT | TAAATATTAA | 1740 |
| TTTTAATTAA | TTAAATAAGG | a^atatattt | ATGCAJMAMCM | TCCCTCcMCCCCC | ATATCGMCCT | 1800 |
| TCGAAAATCT | CTATAGTACA | CCGTAGAGA | cmamcjamattc | TACTA<GCTAC | WACCTTCCTA | 1860 |
| ATCATCAATT | ATAAATGTTT | ACJCMAMACTM | TTAAACCCAC | CCMCCCAAAIT’ | jacctcaaamct | 1920 |
| CCGAGCAAAG | TGAGTGAACA | AGAcrraArr | tca<gcttcct | CTCMCGCCTCMC | jmctcggctacg | 1980 |
| TATCAAACAT | CAACGATCAT | TTAGTTATGT | ATGiMMTGGACT | CTCACCCCMCTA | CTTCEAMMIC | 2040 |
| AAAAATGCTT | TGATTTGGAT | OCATOCACC | ATGTGGmCCCCT | tacacamttcc | atoaccccta | 2100 |
| TTTTCACTAT | AAAACCCCAT | CTCACTACCC | CrrCTGAAtGCA | ATGAAMCrCAM | (GMGCAMMACC | 2160 |
| CATTTAACTT | TCCTAAAACC | ATCTGCCCCTG | ccctcccmattc | tccaatcccmcc | ttgococcagc | 2220 |
| AAGACGACGA | CCGCGATAGC | TCTTCCCCCG | oaccomcggc | TTCCOCGTCCT | ttcgcttgat | 2280 |
| CGGGTCCAAT | CGTGTCCTCA | ACTATCTCMCC | CGGMCGCCCGCC | CGMCOAMCAAC | (GGAAGMACKG | 2340 |
| AAAGGAACGA | CGCGTCTCTA | c<ccTT^!KT^:r | ccctcctcctg; | TCGAMAGGAT | octcgcccgcc | 2400 |
| AAGCAAGCTC | ATCATAGCCT | GATCCCCAAGG | (ACCGTCTCMCTC | AAKAAGACCAM | CCAGCGGCTT | 2460 |
| ATTCTTGACA | GAGGATCCAC | CTCGCTGCTC | CMMCTCCMKG5 | CGCCAMACCCG | CTATTCGACCCC | 2520 |
| GCAAATTTTC | GTTGGCATAT | TATTCGCGCC | CAACT^^^I^CCS | acccaacmacc | cttoctcgmmc | 2580 |
| GCGGCCAAGG | CCAGAGTTAA | GOCACTGCCCG | <C^C^^C^C^C^<CrC3 | CCMACCAMTC | TATTATTOMC | 2640 |
| GAGTTGCTTT | ATCTTTCGAA | TG^GACCrCCCS | CTCAGGCCOC | TrerOAACGA | CGCTCCACTCGAC | 2700 |
| TATCGATATG | CCATGTTGTT | TGCTAGCCAG | (MCCCCMACTCCC | (CCACMA.TAT | caccattgocg | 2760 |
| CTTGACGCAA | ATATGGAAGG | TAAGAKTCMr | CAMCCGACTCG | CTCCMGGMCCA | TrracTcacT | 2820 |
| GCGCGCCAAC | AGGAACAGAA | attccccgca | gttcamcgocg | ccgcctctccac | CCGGCITCCGMC | 2880 |
| GGTCATCCGT | TCGAAATGTA | TTAGGGTACG | CCCCGCCCTGA | gctcgatccac | tccmaccccttt | 2940 |
| GGCAATAAAG | TTTCTTAAGA | TTGGTCCCC | TCGCCCGACCCC | TCGCGATCMCC | atoctatcmct | 3000 |
| TTCTGTTGAA | TTACGTTAAG | catgtgtctctc | TTCACOCTGTA | atgccacaccg | TnATTCATGC | 3C = 0 |
| gatccgtttt | TATGATTAGA | gtcccgcccct | TATACCMTTCA | ataogcacta | CAAMMCOMMMC | 3120 |
| TATGGCGCGC | AAACTGGGAT | AjAAATATCGC | GCGCCGGCGTC | ATCTATGTTA | ctcmgctccgac | 3180 |
TTC
3183
184 108 (2) INFOORMAJA O SEKKWNCJI ID nr: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 709 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: == (^lk-t^c^oi^^)” (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 2
| AAGCTTTTAA | CTTGCACGAA | TGGTTCTCTT | GTGAATAAAC | AGAATCTTTG | AATTCAAACT | 60 |
| ATTTGATTAG | TGAAAAGACA | AAAGAAGATT | CCTTGTTTTT | ATGTGATTAG | TGATTTTGAT | 120 |
| GCATGAAAGG | TACCTACGTA | CTACAAGAAA | AATAAACATG | TACGTAACTA | CGTATCAGCA | 180 |
| TGTAAAAGTA | TTTTTTTCCA | aataatttat | ACTCATGATA | GATTTTTTTT | TTTTGAAATG | 240 |
| TCAATTAAAA | ATGCTTTCTT | AAATATTAAT | TTTAATTAAT | TAAATAAGGA | AATATATTTA | 300 |
| TGCAAAACAT | CATCAACACA | TATCCAACTT | CGAAAATCTC | TATAGTACAC | AAGTAGAGAA | 360 |
| AATAAATTTT | ACTAGATACA | aacttcctaa | TCATCAATTA | TAAATGTTTA | CAAAACTAAT | 420 |
| TAAACCCACC | ACTAAAATTA | ACTAAAAATC | CGAGCAAAGT | GAGTGAACAA | GACTTGATTT | 480 |
| CAGGTTGATG | TAGGACTAAA | ATGGCTACGT | ATCAAACATC | AACGATCATT | TAGTTATGTA | 540 |
| TGAATGAATG | TAGTCATTAC | TTGTAAAACA | AAAATGCTTT | GATTTGGATC | AATCACTTCA | 600 |
| TGTGAACATT | AGCAATTACA | TCAACCTTAT | TTTCACTATA | AAACCCCATC | TCAGTACCCT | 660 |
TCTGAAGTAA TCAAATTAAG AGCAAAAGTC ATTTAACTTT CCTAAAACC
709
184 108 (2) INFORRMAJA O SSKKWNCC ID nr: 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1974pa3pzaszd (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: pdesc = „promotorGNASAG13” (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 3:
| GAATTCTCAG | TGTTCTCTTA | AATCAAATCT | CTCACACTAT | GAGTATATGA | ACAAAATCAT | 60 |
| ATACATATCA | CAATTCCATT | ATGGATATCT | CCCAATCTAT | CTCTCATACA | TGAAAATGTT | 120 |
| CTATTTCGAT | CTTGTATTTA | ATAATGTTAA | TACTCTGTTT | TAATTTGTGT | ATCCTGATTT | 180 |
| ttttttcttt | TTGAAGTTCA | ACAAATATAT | CAAAATAACT | CAGAACCATT | actatttttt | 24 0 |
| CTTAGTTCAT | caattcttta | CTACACATAG | AAACGTATTT | atcttgtttg | ATCTACTTTG | 300 |
| ACTCTATATA | TGTCATGTGG | GATCTCTGGT | <CATTG<CTA<GT | CACAGGTAAA | AGTAAJAAATT | 360 |
| GATCAAAGAT | AAAGAGTCTT | TCATGGTAAA | aattctcttg | TAACTGGTGG | AGATAGTAGA | 420 |
| TGTCAATTCG | TTTGCAATAA | CTTACATTTG | CAATAACATG | TCAGCCATAT | TTATTTAAAT | 480 |
| TTCCATGCAT | TTGATATTAT | TTTCTCTCTA | ATACATATAT | GATGTGTTAC | ggtcattcta | 540 |
| AAAATCCAGT | TGACAGCATA | ATGAAGCTGG | TACACCATAC | ATGCACTTGA | TTATATATGG | 600 |
| ATGTTACTGC | CATGATTGAT | GTTTTGATGG | AATTAGTGTT | AAAGGATGGA | CCCTCACTAA | 660 |
| CGCGGTTGGA | AATTATGATC | aaactcttca | ATGTCACTTA | TCAAGAGAGC | TAATGACTAG | 720 |
| cacgtttagt | TGTTCTGTTG | TTTCTTATGG | CTGCTTAATG | TCTCCATCAA | atatttagac | 780 |
| attgtggcta | GTAAAATGCC | ATCTACCTTA | ATCCTATATA | TAAGTATAAC | TAGATAATAA | 840 |
| TCCATATTTT | TGCTGGGTTT | AGTAGCTGAT | ACGACGTTTA | TGGTTGTTAT | TGAGTTTGAA | 900 |
| TACAAAATAT | AGAGTATTGT | TGGAGTTATA | TTGATTTTTG | TTCATATTAG | TTAACAAATA | 960 |
| ATAAAAAAAT | TAAGAAAGGT | TTTTGAAAAT | GCATCTTCTA | GAATATATRT | ATATTCGAAA | 1020 |
| AAGTCACATC | TTTAATTGAC | atatgttttg | TTTGTTTGTT | TTTTTTTACT | GGCCACACAA | 1080 |
| ATTGACAACA | ATGGTCATGC | ATGAAATGAA | atgtttgttg | TCAATTTTTT | TTACTAACTT | 1140 |
| GTAATATCAT | TATGAAATGA | AATAGAAGGT | ATATATTACA | AAATATTACC | TAAAAGTAGA | 1200 |
| GCAATCTTAG | AAAAAAAAAA | AAAAAAAAAA | AAAAAAGAAA | AAGAAAAAGA | AACAAGATTA | 1260 |
| CAATGCATTT | AAAAAGAGAT | GGAAAGAATC | CGAGCTATCG | AATCCAAAGA | AGCATCTACT | 1320 |
184 108
| TCCTCCATCT | GTTCTTGTAT | CGTCTACCAG | AGATGGTGTT | CCGGATCTCT | CGATCAATAT | 1380 |
| TCTTAAAGAT | GGTTGTTGGA | GGGATCCTTT | GGCTATTATG | GAGAACATTA | TTCGTTTATC | 1440 |
| TCCAGATGTG | ATAGACAAAG | GGCTGTGTGG | CCTGTGAGAC | CGATGGCCAC | TTAATTATTG | 1500 |
| GTTTTTTGTC | AATGGTTGTG | TATGCATAGA | AATTCCCACA | ACCGTTTGTG | GCTTAACACA | 1560 |
| ATTTACCAGG | GGTTTAAGTG | GTTAAATTGA | TACATGTAGA | TCTAAAGTTT | TATGCTAATA | 1620 |
| TAAATTAGTT | TTAATTATAT | AAATTTTAAC | TACGCTCATG | ACACGTAAAT | GGTAGACCAA | 1680 |
| TATGTGGTGC | TCTATTAACT | AAGGGGTGCT | TCATTATTAA | TTCATAAAGA | TTTCTTTACT | 1740 |
| ATACAAGACT | TGTCAAAAGG | AAAAGTAGTA | TTTTCGTACT | ACGTCTACCC | CTCTCACGGA | 1800 |
| TATGTGTGGT | CGAGCAGTCA | TTATCATAAT | GTGGAATTTT | GAATTGAGCG | AGGTTTCAAA | 1860 |
| GTTCAAAACT | ATCACAACTA | GTCTTGATCA | ATTCTATATA | AGATCTGTGA | TCTTGGTTGA | 1920 |
| AGAAAAGAAT | CGTCGTAGGT | TGATATTTAA | CAAGGAATGG | CAAAGGAAGG | GGGC | 1974 |
184 108
184 108
▼ a -2073 bp EcoR V
GATATCTCTT TTTATATTCA AACAATAAGT CTCGTGGAGC ACCGAG7CTG TTTTATATTA .AAAAAAGTAA AATCGTTGAT TGTTAAAATT aaatgattag TTATCATAGC TAATATAGCA TTTTCTCTCT TTGGTGTTTT CTTAACATTA AATTAAAAAC AATATTTCCA AGTTTTATAT GATAGTTGA TTATGAATTA GTTAGATCAA ATGAACTCAG TTGTTATACA AGAAATGAAA AAAAAGTGTC AGAATATGAC ATGAGCGTT GGATCTCTCA AGATATTTT GGGCCATATT GAGACGAGGA AGAAAGATTG GGTCAGTTA CTTTGGTAGC AAGTCGATTr ATTTGCCAGT TCGTTATTAG TTTGTACTTG GTACCTTTGG TGTGTTCATG AGGTGATTGT GATTTAATTT TACAAAGTT TTATAGATTT TTTTTTATAA TTTACACCGC ATTTTTCCCT GTACAAGAAT GACAATTATA AGTTTATAAC GTTTTTACAA TATGTCTTAC TTCTTCTTTG TGTAAGAAAA AATCATTATA TTTGTAAATA TGCAGTTATT TTATCACTTC AGCCAAATAT GATTTGGATT CTCTTGTCGT CTAATGATTA TTTCATATT TTTATATTGT ATTCTAATGA CAGGGAAACT GGGAAACATC ATTGAACAGG AACTTTTAG ACTTAGCGTA ATGAAGTTCA CTTGTTGTGA
TTGTCGAATC ATTTTTCTTT TTGATTTGAT TGTGAATAAA CAGATCTTT GAATTCAAAC TCCTTGTTTT TATGTGATTA GTGATTTTGA AATAACAT GTACGTAACT ACGTATCAGC TACTCATGAT AGATTTTTTT TTTTTGAAAT TTTTAATTAA TTAAATAAGG AAATATATTT TCGAAAATCT CTATAGTACA CAAGTAGAGA ATCATCAATT ATAAATGTTT ACAAACTAA CCGAGCAAAG TGAGTGAACA AGACTTGATT TATCAAACAT CAACGATCAT TTAGTTATGT
AAAAATGCTT tgatttggat caatcacttc TTTTCACTAT AAACCCCAT CTCAGTACCC ¥ Aco I —>EPT
CATTTACTT TCCTAAAACC ATGGACCCTG AGACGACGA CCGCGATAGC TCTTGCCCAG CGGGTCCAAT GCTGTCCTCA ACTATCAACC AAGGAACGA CGCGTCTCTA CCTTGATGAT AGCAGCTC ATCATAGGCT GATCGAGGAG ATTCTTGAGG GAGGATCCAC CTCGTTGCTC GCAATTTTC GTTGGCATAT TATTCGCCAC GCGGCCAAGG CCAGAGTTAA GCAGATGTTG GAGTTGGTTT ATCTTTGGAA TGAACCTCGG TATCGATATG CCATGTTGTT TGCTAGCCAG CTTGACGCAA ATATGGAAGG TAGTTGATT GCGCGCCAAC AGGAACAGAA ATTCCCCCAA
GGTCATCCGT TCGGAATGTA TTAGGTTACG GGCAATAAAG TTTCTTAGA TTGAATCCTG TTCTGTTGAA ttacgttaag catgtaataa GATGGGTTTT TATGATTAGA GTCCCGCAAT TATGGCGCGC AAACTGGGAT AAATTATCGC TTC
TGAGATATGT TTGAGAAGAG GACACTATT GAAACCCGAT TGTTATTATT AGACTGAGAC TAAAATTAGT TTCATCACGT TTCGATAAAA TGATTCTAAA TTTGTTTTTT GACACCCTTT GAAGAACCCA TAACAATGTA CGTTCAAATT ACGAAACTTG TTTTTTTAAT GAAACAGTT TACTCAATAT ATGATCAATG ATGTATATAT atgctattta AATACCGATC ATGAGTGTT TTGTCCTACC GGGTATCGAG TTATAGGTTT AGTTATATTT GGGCTTAGC GTTTTGCAAA ACAAAACAGA GACACTCGTA TTAGTTGGTA AAAACTTGG TACACAACTG ACAACTCGTA TTAAGAAAAA GTTGATATAG TTAAATCAGT GTTGACTAGG GCGATTCCTT CACATCACAA CATTTTTGCC ACGCTTCGTA AGTTTGGTA TCATATATTA TTTATTTATA TACTCCAGTT TTATTTAAAT ACCATGTGAA GATCCAAGAA CTAACTATAT CACTATAATA AAATATCT TGTCAATTTT GATTTAGTA TTTTAGACGG TAAGTCCAAA ATGCAATTTC GTACGTATCC TCTTATATTA TCCCTAACTA CAGAGCTACA TTCATAGAGA TTCAGATAGA TGAAATTGGT CAAATCATAT CGATTATCT ACAAAAGAAT ATGACTATGA TTTGATCAAA TTAGTTAATT fb -602 bp Hind HI tAagctttta ACTTGCACGA ATGGTTCTCTTATTTGATTA GTGAAAAGAC AAAAGAAGAT TGCATGAAAG GTACCTACGT ACTACAAGAA ATGTAAAGT ATTTTTTTCC AAATAATTTA GTCAATTAAA ATGGTTTCT TAAATATTAA ATGCAAAACA TCATCAACAC ATATCCAACT AAATAAATTT TACTAGATAC AAACTTCCTA TTAAACCCAC CACTAAAATT AACTAAAAAT TCAGGTTGAT GTAGGACTA AATGGCTACG ATGAATGAAT GTAGTCATTA CTTGTAAAAC 'lI+1 atgTgaacat tagcattac atcaacctta TTCTGAAGTA ATCAATTA GAGCAAAAGT
CATCTATTT TCGGTCCAAC TTGCACAGGA CAGACAGGGC TTCCAGTCCT TTCGCTTGAT GGAAGCGGAC GACCAACAGT GGAAGAACTG CGGCCTCTGG TGGAGGGTAT CATCGCAGCC GTGTATAATC ATGAGGCCAA CGGCGGGCTT AACTGCATGG CGCGAAACAG CTATTGGAGT AAGTTACCCG ACCAAGAGAC CTTCATGAAA CACCCCGCTG CAGGCCATTC TATTATTCAA CTGAGGCCCA TTCTGAAAGA GATCGATGGA AACCAGATCA CGGCAGATAT GCTATTGCAG AATGGGATCG CTCAGGAGTA TTTCATCCAT GTTAACGCAG CCGCTTTCGA CGGATTCGAA
Sst 1 —>NOS-ter ccagccctgA gctcgatcgt tcaacattt TTGCCGGTCT TGCGATGATT ATCATATAAT TTAACATGTA ATGCATGACG TTATTTATGA TATACATTTA ATACGCGATA GAAAACAAAA GCGCGGTGTC ATCTATGTTA CTAGATCGAA i.3
Departamene Wydawnintw UP RP.NNdad 70eg z. Cena 4,00 zł.
Claims (33)
- Zastrzeżenia patentowe1. Konstrukcja genetyczna zawierająca sekwencję promotora SAG 12 albo SAG13 operacyjnie związaną z sekwencją DNA kodującą białko nie związaną w stanie naturalnym z tą sekwencją promotora.
- 2. Konstrukcja według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja promotora zawiera pierwsze 602 pary zasad z sekwencji SEQ ID Nr. 2.
- 3. Konstrukcja według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja promotora zawiera pierwsze 1782 pary zasad z sekwencji SEQ ID Nr. 3.
- 4. Konstrukcja według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja kodująca białko koduje enzym syntetyzujący hormon roślinny.
- 5. Konstrukcja według zastrz. 4, znamienna tym, że sekwencja kodująca białko koduje enzym katalizujący syntezę hormonu roślinnego, cytokininy.
- 6. Konstrukcja według zastrz. 5, znamienna tym, że sekwencja kodująca białko koduje transferazę izopentenylową.
- 7. Konstrukcja według zastrz. 1 dodatkowo zawierająca nie podlegający translacji region 5 z SAG12-1.
- 8. Konstrukcja genetyczna zawierająca promotor SAG 12 operacyjnie związany z sekwencją DNA kodującą enzym katalizujący syntezę cytokininy.
- 9. Konstrukcja według zastrz. 8, znamienna tym, że zawarta w niej sekwencja DNA koduje transferazę izopentenylową.
- 10. Komórka zawierająca konstrukcję genetyczną, posiadającą sekwencję promotora zawierającą pierwsze 602 pary zasad z sekwencji SEQ 1D Nr. 2.
- 11. Komórka zawierająca konstrukcję genetycznąposiadającąpromotor SAG12 operacyjnie związany z sekwencją DNA kodującą enzym katalizujący syntezę cytokininy.
- 12. Roślina zawierającakonstrukcjęgenetycznąposiadającąsekwencję promotora SAG12 albo SAG13 operacyjnie związaną z sekwencją DNA kodującą białko nie związaną w stanie naturalnym z tą sekwencją promotora.
- 13. Roślina zawierająca konstrukcję genetyczną zawierającą promotor SAG12 operacyjnie związany z sekwencją DNA kodującą enzym katalizujący syntezę cytokininy.
- 14. Konstrukcja genetyczna zawierająca promotor SAG13 operacyjnie związany z sekwencją DNA kodującą enzym katalizujący syntezę cytokininy.
- 15. Rośliny o właściwościach opóźnionego starzenia się, zawierające w swym genomie w kierunku 5' do 3' konstrukcję genetycznąobejmującąpromotor związany ze starzeniem i region kodujący dla enzymu katalizującego syntezę cytokininy, przy czym promotorjest wybrany z grupy obejmującej promotor SAG 12 albo promotor homologiczny z tą sekwencją SAG 12 w stopniu wystarczającym do preferencyjnej ekspresji tego enzymu w starzejącej się tkance na poziomie podobnym do tego, jaki daje promotor SAG12 inicjując ekspresję genu GUS w Arabidopsis.
- 16. Rośliny według zastrz. 15, znamienne tym, że zawierają promotor SAG13.
- 17. Rośliny według zastrz. 15, znamienne tym, że katalizowany jest w nich enzym transferaza izopentenylową.184 108
- 18. Sposób wprowadzania do roślin właściwości opóźnionego starzenia się poprzez wbudowywania do ich genomu odpowiedniej konstrukcji genetycznej, znamienny tym, że wprowadza się do genomu rośliny w kierunku 5' do 3' konstrukcję genetyczną obejmującą promotor związany ze starzeniem i region kodujący dla enzymu katalizującego syntezę cytokininy, przy czym promotor jest wybrany z grupy obejmującej promotor SAG12 albo promotor homologiczny z tą sekwencją SAG12 w stopniu wystarczającym do preferencyjnej ekspresji tego enzymu w starzejącej się tkance na poziomie podobnym do tego, jaki daje promotor SAG12 inicjując ekspresję genu GUS w Arabidopsis.
- 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że jako promotor stosuje się promotor SAGI 3.
- 20. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że enzymem katalizującym syntezę cytokininy jest transferaza izopentylowa.
- 21. Rośliny o właściwościach opóźnionego starzenia się, zawierające w swym genomie obcą konstrukcję genetyczną, która obejmuje w kierunku 5' do 3',- promotor specyficzny dla starzenia,- region kodujący białko enzymu, ekspresja którego to regionu katalizuje wytwarzanie cytokininy w komórkach tych roślin i- sekwencję końca transkrypcji, w których to roślinach ekspresja obcej konstrukcji genetycznej przebiega w tkankach wchodzących w okres starzenia, opóźniając starzenie się tych tkanek roślinnych.
- 22. Rośliny według zastrz. 21, znamienne tym, że jako cytokinina występuje w nich transferaza izopentenylowa.
- 23. Rośliny według zastrz. 21, znamienne tym, że jako promotor zawierają SAG 12-1.
- 24. Rośliny według zastrz. 21, znamienne tym, że jako promotor zawierają SAGI 3.
- 25. Sposób wytwarzania roślin o właściwościach opóźnionego starzenia, poprzez wprowadzanie do tych roślin obcej konstrukcji genetycznej, w których ekspresja obcej konstrukcji genetycznej przebiega w tkankach wchodzących w okres starzenia, opóźniając starzenie tych tkanek roślinnych, znamienny tym, że wprowadza się do genomu roślin obcą konstrukcję genetyczną, która zawiera w kierunku 5' do 3',- promotor specyficzny dla starzenia,- region kodujący białko dla enzymu, ekspresja którego to regionu katalizuje wytwarzanie cytokininy w komórkach tych roślin i;- sekwencję końca transkrypcji.
- 26. Sposób według zastrz 25, znamienny tym, żejako cytokinina występuje w niej transferaza izopentenylowa.
- 27. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że jako promotor stosuje się SAGI 24.
- 28. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że jako promotor stosuje się SAG13.
- 30. Rośliny zawierające sekwencję związanego z starzeniem się promotora operacyjnie związaną z sekwencją DNA kodującą białko, w stanie naturalnym nie związaną z tą sekwencją promotora, znamienne tym, że promotor ten jest obecny w roślinach Nicitiana tabacum i ta kodująca białko sekwencja DNA koduje enzym katalizujący syntezę cytokininy, przy czym rośliny Nicotiana tabacum pozostają niezmienione w jednym lub większej ilości odgałęzień, rozwoju kwiatu lub wzroście korzenia w porównaniu z roślinami Nicotiana tabacum bez promotora operacyjnie związanego z sekwencjąDNA koduj ącąenzym katalizujący syntezę transferazy izopentylowej.
- 31. Rośliny według zastrz. 30, znamienne tym, że enzymemjest transferaza izopentylowa.
- 32. Sekwencja związanego ze starzeniem się promotora operacyjnie związana z sekwencją DNA kodującąbiałko w stanie naturalnym nie związaną z tą sekwencją promotora, znamienna tym, ze promotor ten jest obecny w roślinie Nicitiana tabacum i tym, że ta kodująca białko sekwencja dNa koduje enzym katalizujący syntezę cytokininy, przy czym roślina Nicotiana tabacum pozostaje niezmieniona w jednym lub większej ilości odgałęzień, rozwoju kwiatu lub wzroście184 108 korzenia w porównaniu z roślinąNicotiana tabacum bez promotora operacyjnie związanego z sekwencją DNA kodującą enzym katalizujący syntezę transferazy izopentylowej.
- 33. Sekwencja związanego ze starzeniem się promotora, według zastrz. 32, znamienna tym, że enzymem jest transferaza izopentylowa.
- 34. Sekwencja związanego ze starzeniem się promotora, według zastrz. 32, znamienna tym, że tworzy część konstrukcji genetycznej.Niniejszy wynalazek dotyczy roślin o właściwościach opóźnionego starzenia się; przedmiotem wynalazku jest także sposób wprowadzania do roślin właściwości opóźnionego starzenia się, sposób wytwarzania roślin, rośliny zawierające sekwencję związanego ze starzeniem się promotora oraz sekwencja związanego ze starzeniem się promotora.Starzenie się liścia jest fazą rozwoju, podczas której komórki zanim obumrąpodlegająwyraźnym zmianom metabolicznym i strukturalnym (Nooden, Senescence and Aging in Plants; pod red. L.D. Nooden'a i A.C. Leopold'a, str. 391-439, Academic Press, San Diego, CA, 1988). Jest to ważna faza w cyklu życiowym rośliny. Sądzi się, że przyczynia się ona do przystosowania się rośliny poprzez zawracanie do obiegu substancji odżywczych do regionów aktywnie rosnących. Rozpoczęcie procesu starzenia się liścia można zainicjować za pomocąwielu czynników zewnętrznych, takich jak zasłanianie światła, niedobór składników mineralnych, susza i infekcja patogenem (Thomas i wsp., Ann. Rev. Plant Physiol., 31, 83-111, 1980) a także za pośrednictwem procesów rozwojowych takich jak rozwój nasion (Noodćn, 1988, jak wyżej). Przy braku takich czynników starzenie się liścia w wielu gatunkach przebiega w sposób zależny od wieku (Batt i wsp., J. Exp. Bot., 26, 569-579,1975; Hensel i wsp., Plant Celi, 5, 553-564,1993; Jiang i wsp., Plant Physiol., 101, 105-112, 1993).Badania fizjologiczne i genetyczne wskazują że starzenie się jest procesem o wysokim stopniu regulacji (Nooden 1988, jak wyżej; Thomas, 1980, jak wyżej). Przechodzenie liścia przez program starzenia się jest widoczny gołym okiem i przejawia się utratą chlorofilu z następnym żólknieniem, będącym wynikiem rozkładu chloroplastów (Thomson i wsp., Plant Senescence: Its Biochemistry and Physiology, str. 20-30,1987; Woolhouse, Can. J. Bot. 62,2934-2942, 1984). w starzeniu się liści następuje degradacja białek, kwasów nukleinowych i błon i następnie przebiega transport składników odżywczych wytworzonych podczas tej degradacj i do innych regionów rośliny, takichjak rozwijające się nasiona, liście i organ zapasowe (Nooden, 1988jak wyżej; Woolhouse, 1984, jak wyżej).Badania molekularne wykazują, że zmiany w ekspresji genu są związane z programem starzenia się. Poziomy mRNA kodujących białka zaangażowane w fotosyntezie spadają podczas starzenia (Bate i wsp., J. Exp. Bot., 42, 801-811, 1991; Hensel i wsp., Plant Celi, 5, 553-564, 1993; Jiang i wsp., Plant Physiol., 101,105-112,1993) podczas gdy poziomy mRNA genów kodujących białka, o których sądzi się, że są zaangażowane w program starzenia, wzrastają (Graham i wsp., Plant Celi, 4, 349-357,1992; Hensel i wsp., Plant Celi, 5, 553-564,1993; Kamachi i wsp., Plant Physiol. 93, 1323-1329, 1992; Taylor i wsp., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5118-5122,1993). Wykazano ponadto, że podczas starzenia wzrastają również aktywności kilku enzymów, które prawdopodobnie odgrywają rolę i procesie rozpadu i mobilizacji substancji odżywczych (Blank i wsp., Plant Physiol, 97,1409-1413,1991; Debellis i wsp., Plant Cell Physiol. 32, 1227-1235, 1991; Friedrich i wsp., Plant Physiol.,65,1103-1107,1980; Pistelli i wsp., J. Plant Physiol., 19, 723-729, 1992).Jakkolwiek ogólne zmiany pojawiające się podczas starzenia są znane, pozostało jeszcze do zbadania wiele szczegółów biochemicznych na temat tego, j ak przebiega remobilizacja składników odżywczych. Poza tym, niewiele wiadomo o tym, w jaki sposób są regulowane zmiany w ekspresji genów towarzyszące starzeniu.W badaniach z zakresu biologii molekularnej roślin potrzebne sąpromotory zdolne do inicjowania ekspresji gen podczas etapu rozwoju rośliny jakim jest starzenie.184 108W pierwszym etapie prac zdążających do tego celu badano zmiany makromolekularne, które występują podczas starzenia się liści w Arabidopsis thaliana. Początek starzenia się liścia w Arabidopsis jest zdeterminowany wiekiem liścia (Hensel i wsp., jak wyżej). Ta przewidywalność programu starzenia Arabidopsis ułatwiła zintegrowane badanie zmian w RNA, chlorofilu, białku i w ekspresji genu związanego z naturalnym starzeniem się liścia w roślinie niemodyfikowanej. Użyto również ten system cytowany w opisie do wyizolowania i scharakteryzowania czasowych prawideł ekspresji mRNA, których ilość zwiększa się i zmniejsza podczas starzenia się liścia. Te mRNA specyficzne dla starzenia pozwoliły nam na wyizolowanie i scharakteryzowanie nowych promotorów specyficznych dla starzenia, co jest opisane poniżej.Streszczenie wynalazku
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/413,135 US5689042A (en) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | Transgenic plants with altered senescence characteristics |
| PCT/US1996/002313 WO1996029858A1 (en) | 1995-03-29 | 1996-02-20 | Transgenic plants with altered senescence characteristics |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL327438A1 PL327438A1 (en) | 1998-12-07 |
| PL184108B1 true PL184108B1 (pl) | 2002-08-30 |
Family
ID=23635988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96327438A PL184108B1 (pl) | 1995-03-29 | 1996-02-20 | Konstrukcja genetyczna, rośliny o właściwościach opóźnionego starzenia się, sposób wprowadzania do roślin właściwości opóźnionego starzenia się, sposób wytwarzania roślin, rośliny zawierające sekwencję związanego ze starzeniem się promotora oraz sekwencja związanego ze starzeniem się promotora |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5689042A (pl) |
| EP (1) | EP0804066A4 (pl) |
| JP (1) | JPH11501819A (pl) |
| KR (1) | KR100359598B1 (pl) |
| CN (2) | CN1154737C (pl) |
| CA (1) | CA2191482C (pl) |
| MX (1) | MX9605889A (pl) |
| NZ (1) | NZ303829A (pl) |
| PL (1) | PL184108B1 (pl) |
| WO (1) | WO1996029858A1 (pl) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5689042A (en) | 1995-03-29 | 1997-11-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Transgenic plants with altered senescence characteristics |
| US5965543A (en) * | 1996-04-18 | 1999-10-12 | Geron Corporation | Senescence responsive transcriptional element |
| AU8651298A (en) * | 1997-07-30 | 1999-02-22 | Instituut Voor Agrobiologisch En Bodemvruchtbaarheidsonderzoek (Ab-Dlo) | Inhibition of unwanted hormone action in plants |
| GB9817909D0 (en) * | 1998-08-17 | 1998-10-14 | Zeneca Ltd | DNA constructs |
| WO2000025575A1 (en) * | 1998-10-30 | 2000-05-11 | Ball Horticultural Company | MUTANT APICAL DOMINANCE GENE IN $i(EUSTOMA) |
| AU778437B2 (en) | 1999-02-16 | 2004-12-02 | Senesco, Inc. | DNA encoding a plant lipase, transgenic plants and a method for controlling senescence in plants |
| US6693228B1 (en) * | 1999-02-25 | 2004-02-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Alteration of flowering time in plants |
| US6992237B1 (en) | 1999-04-16 | 2006-01-31 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Regulated expression of genes in plant seeds |
| NZ514955A (en) * | 1999-04-16 | 2004-01-30 | Pioneer Hi Bred Int | Regulated expression of cytokinin modulating genes in plant seeds |
| US7531723B2 (en) * | 1999-04-16 | 2009-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Modulation of cytokinin activity in plants |
| GB9911247D0 (en) * | 1999-05-15 | 1999-07-14 | Inst Of Grassland & Environmen | Senescence promoters |
| US6538182B1 (en) * | 1999-07-06 | 2003-03-25 | Senesco, Inc. | DNA encoding a plant deoxyhypusine synthase, a plant eukaryotic initiation factor 5A, transgenic plants and a method for controlling senescence programmed and cell death in plants |
| MXPA02003254A (es) * | 1999-09-27 | 2002-09-30 | Pioneer Hi Bred Int | Tolerancia mejorada al estres en maiz via manipulacion de los genes reguladores del ciclo de la celula. |
| US6709863B2 (en) * | 1999-12-08 | 2004-03-23 | Iowa State University Research Foundation | Nucleic acid molecules encoding multiple start codons and histidine tags |
| US6388067B1 (en) | 2000-01-10 | 2002-05-14 | Academia Sinica | Rice cysteine proteinase gene promoter |
| EP1130104A1 (en) * | 2000-02-16 | 2001-09-05 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Reduction of in planta degradation of recombinant plant products |
| EP1263977A2 (en) | 2000-02-28 | 2002-12-11 | Yale University | Methods and compositions to reduce or eliminate transmission of a transgene |
| NZ523280A (en) * | 2000-06-19 | 2005-02-25 | Senesco Technologies Inc | DNA encoding a plant lipase, transgenic plants and a method for controlling senescence in plants |
| US8399739B2 (en) | 2000-09-06 | 2013-03-19 | Agriculture Victoria Services Pty | Manipulation of plant senescence using modified promoters |
| US20080014633A1 (en) * | 2000-09-06 | 2008-01-17 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd. | Manipulation of plant senescence using modified promoters |
| AUPQ994600A0 (en) * | 2000-09-06 | 2000-09-28 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Manipulation of plant senescene |
| US20040117871A1 (en) * | 2000-11-25 | 2004-06-17 | Peter Meyer | Plant growth regulation |
| WO2002072818A1 (en) * | 2001-03-12 | 2002-09-19 | Suntory Limited | Genes encoding proteins participating in cytokinin synthesis |
| US20030150009A1 (en) * | 2002-02-07 | 2003-08-07 | The University Of California | Generation of multiple embryo maize |
| US7335812B2 (en) | 2002-05-15 | 2008-02-26 | Monsanto Technology Llc | Method of increasing plant organ and seed size in a plant |
| US20040016016A1 (en) * | 2002-06-19 | 2004-01-22 | Mankin S. Luke | Compositions and methods for improving plant performance |
| US7138566B2 (en) * | 2002-06-21 | 2006-11-21 | Regents Of The University Of California | Methods of modulating cytokinin related processes in a plant using B3 domain proteins |
| US20050044596A1 (en) * | 2003-03-19 | 2005-02-24 | Smith Alan G. | Methods to confer enhanced floral properties to plants |
| BRPI0409178A (pt) * | 2003-04-04 | 2006-05-02 | Pioneer Hi Bred Int | método para produzir plantas transgênicas e para modular a atividade de citocina em plantas, plantas transgênicas, dna recombinate, promotor e cassete de expressão |
| BRPI0411874A (pt) | 2003-06-23 | 2006-08-08 | Pionner Hi Bred International | potencial de staygreen controlado em plantas por gene simples obtido por engenharia genética |
| US7253340B2 (en) * | 2004-02-02 | 2007-08-07 | University Of Florida Research Foundation | Floral organ tissue-specific expression of isopentenyl transferase |
| KR100604195B1 (ko) * | 2004-09-02 | 2006-07-25 | 고려대학교 산학협력단 | 식물 노화에 특이적으로 발현되는 유전자 및 그 유전자의프로모터 |
| BRPI0516039A (pt) * | 2004-09-24 | 2008-08-19 | Monsanto Technology Llc | moléculas promotoras para o uso em plantas |
| PL1863334T3 (pl) * | 2005-03-21 | 2012-04-30 | Univ California | Sposoby uzyskiwania roślin odpornych na suszę |
| CN100427602C (zh) * | 2005-08-22 | 2008-10-22 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 一种植物二价抗逆基因双元表达载体 |
| WO2008095066A2 (en) * | 2007-01-31 | 2008-08-07 | The Curators Of The University Of Missouri | Auto-regulated expression of bacterial isopentenyltransferase gene promotes t-dna transformaton in soybean |
| CN101932712B (zh) | 2007-11-20 | 2014-05-14 | 先锋国际良种公司 | 用于改善植物应激耐性的玉米乙烯信号转导基因及其调节 |
| TWI347168B (en) * | 2008-03-24 | 2011-08-21 | Univ Nat Taiwan | Plant senescence-inducible promoter |
| GB2462645A (en) * | 2008-08-15 | 2010-02-17 | Advanced Technologies | Modification of plant threonine production by aspartate kinase |
| GB0903346D0 (en) | 2009-02-27 | 2009-04-08 | Cambridge Advanced Tech | Transgenic Plants |
| MX336182B (es) | 2009-06-08 | 2016-01-11 | Nunhems Bv | Plantas tolerantes a la sequia. |
| CN102031271A (zh) * | 2010-07-17 | 2011-04-27 | 怀化学院 | 一种简单高效的青蒿遗传转化体系 |
| JP6215196B2 (ja) | 2011-05-31 | 2017-10-18 | キージーン・エン・フェー | 有害生物耐性植物 |
| US20150059018A1 (en) | 2011-10-19 | 2015-02-26 | Keygene N.V. | Methods and compositions for producing drimenol |
| WO2013095125A1 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-27 | Keygene N.V. | Method for producing a plant having enhanced disease resistance to nematodes |
| WO2014142647A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Wageningen Universiteit | Fungals strains with improved citric acid and itaconic acid production |
| CN103911369B (zh) * | 2014-04-04 | 2017-01-11 | 中国农业科学院烟草研究所 | 一种高效提取烟草成熟叶片总rna的方法 |
| CN104212824B (zh) * | 2014-07-24 | 2017-04-12 | 中国热带农业科学院橡胶研究所 | 一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因HbSAG12H1及其应用 |
| WO2018102131A1 (en) * | 2016-11-29 | 2018-06-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Transcriptional terminators for gene expression in plants |
| KR20230023402A (ko) | 2021-08-10 | 2023-02-17 | 주식회사 팜앤셀 | 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 메디카고 트런카툴라 AT-hook 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5268463A (en) | 1986-11-11 | 1993-12-07 | Jefferson Richard A | Plant promoter α-glucuronidase gene construct |
| US5177307A (en) * | 1987-05-26 | 1993-01-05 | Calgene, Inc. | Compositions and methods for modulation of endogenous cytokinin levels |
| ES2185614T3 (es) * | 1989-07-19 | 2003-05-01 | Calgene Llc | Factores transcripcionales de tejidos de ovarios. |
| WO1993007272A1 (en) * | 1991-10-03 | 1993-04-15 | Calgene Pacific Pty. Ltd. | Transgenic plants |
| GB9318927D0 (en) * | 1993-09-13 | 1993-10-27 | Zeneca Ltd | Regulation of senescence |
| GB9505608D0 (en) * | 1995-03-17 | 1995-05-03 | Zeneca Ltd | DNA constructs and plants incorporating them |
| US5689042A (en) | 1995-03-29 | 1997-11-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Transgenic plants with altered senescence characteristics |
-
1995
- 1995-03-29 US US08/413,135 patent/US5689042A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-02-20 MX MX9605889A patent/MX9605889A/es not_active Application Discontinuation
- 1996-02-20 WO PCT/US1996/002313 patent/WO1996029858A1/en not_active Ceased
- 1996-02-20 KR KR1019960706757A patent/KR100359598B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-20 CN CNB961937033A patent/CN1154737C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 NZ NZ303829A patent/NZ303829A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 EP EP96907079A patent/EP0804066A4/en not_active Withdrawn
- 1996-02-20 CA CA002191482A patent/CA2191482C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 CN CN200410043468.5A patent/CN1616664A/zh active Pending
- 1996-02-20 PL PL96327438A patent/PL184108B1/pl unknown
- 1996-02-20 JP JP8529371A patent/JPH11501819A/ja not_active Abandoned
-
1997
- 1997-11-17 US US08/971,395 patent/US6359197B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6359197B1 (en) | 2002-03-19 |
| NZ303829A (en) | 1998-05-27 |
| CN1616664A (zh) | 2005-05-18 |
| KR100359598B1 (ko) | 2004-12-31 |
| EP0804066A1 (en) | 1997-11-05 |
| WO1996029858A1 (en) | 1996-10-03 |
| JPH11501819A (ja) | 1999-02-16 |
| CA2191482A1 (en) | 1996-10-03 |
| AU707577B2 (en) | 1999-07-15 |
| CN1154737C (zh) | 2004-06-23 |
| CA2191482C (en) | 2008-01-22 |
| US5689042A (en) | 1997-11-18 |
| AU5020996A (en) | 1996-10-16 |
| EP0804066A4 (en) | 1999-01-27 |
| CN1192120A (zh) | 1998-09-02 |
| PL327438A1 (en) | 1998-12-07 |
| MX9605889A (es) | 1997-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL184108B1 (pl) | Konstrukcja genetyczna, rośliny o właściwościach opóźnionego starzenia się, sposób wprowadzania do roślin właściwości opóźnionego starzenia się, sposób wytwarzania roślin, rośliny zawierające sekwencję związanego ze starzeniem się promotora oraz sekwencja związanego ze starzeniem się promotora | |
| EP2383345B1 (en) | Polynucleotides and polypeptides involved in plant fiber development and methods of using same | |
| CA2213991C (en) | Cold-inducible promoter sequence | |
| JP2000505290A (ja) | シロイヌナズナｇａｉ遺伝子をコードする核酸 | |
| EP3246337B1 (en) | Transgenic plant having the property of an enhanced seed yield and increased growth | |
| US8420890B2 (en) | Use of NAP gene to manipulate leaf senescence in plants | |
| PL202462B1 (pl) | Wyizolowany kwas nukleinowy do modyfikacji cech roślin przy użyciu genu wernalizacji VRN2, para starterów, sposób wytwarzania kwasu nukleinowego, sposób identyfikowania, klonowania lub określania obecności w genetycznie zmienionej roślinie kwasu nukleinowego, sposób selekcjonowania rośliny posiadającej żądany allel genu VRN2, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, sposób transformowania komórki gospodarza, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, roślina transgeniczna, część lub rozmnóżka rośliny, wyizolowany polipeptyd, sposób wytwarzania polipe | |
| US5686649A (en) | Suppression of plant gene expression using processing-defective RNA constructs | |
| EP3017049B1 (en) | Methods and means for modulating flowering time in monocot plants | |
| US7790957B2 (en) | Genes that confer regeneration ability to plants, and uses thereof | |
| CN120989150A (zh) | 水稻sd10基因在调控产量和抗倒伏中的应用 | |
| JP3051874B2 (ja) | 植物を矮性化させる方法 | |
| AU2006314535A1 (en) | EMP4 gene | |
| JPWO2008120410A1 (ja) | エンドリデュプリケーション促進活性を有する遺伝子 | |
| AU4826397A (en) | Agl15 sequences in transgenic plants | |
| US20020133850A1 (en) | Melon promoters for expression of transgenes in plants | |
| AU707577C (en) | Transgenic plants with altered senescence characteristics | |
| AU5496199A (en) | Transgenic plants with altered senescence characteristics | |
| HK1015628A (en) | Transgenic plants with altered senescence characteristics | |
| SLLLYGGGGGG | 20 sustains the embryo during its development and its germination. | |
| JP2001037484A (ja) | メロンエチレン受容体遺伝子のプロモーター |