PL184188B1

PL184188B1 - Sposób stymulacji produkcji niefibroblastowych komórek nabłonkowych

Info

Publication number: PL184188B1
Application number: PL95347592A
Authority: PL
Inventors: Charles F. Morris; William C. Kenney; Bao-Lu Chen; Eric W. Hsu
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 2002-09-30

Abstract

1. Sposób stymulacji produkcji niefibroblastowych komórek nablonkowych znamienny tym, ze niefibroblastowe komórki nablonkowe kontaktuje sie ze skuteczna iloscia analoga rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, zdefiniowanego przez sekwencje aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2 z sekwencja sygnalna lub bez tej sekwencji, o sekwencji aminokwasów wlasciwej KGF lecz obejmujacej modyfikacje jednego lub wiecej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym kazda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys1 oraz Cys1 5 ), jest albo usunieta albo podstawiona innym aminokwasem. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób stymulacji produkcji niefibroblastowych komórek nabłonkowych.

Obecny wynalazek jest związany z technologiami opartymi na rekombinantowym DNA oraz inżynierii białkowej wykorzystywanymi w związku z keratynocytowym czynnikiem wzrostu - KGF, będącym silnym mitogenem w niefibroblastowym wzroście komórek nabłonkowych.

18-4 188

W skomplikowanym procesie generowania i regenerowania tkanek pośredniczy szereg czynników proteinowych, czasem nazywanych czynnikami wzrostu tkanki miękkiej. Cząsteczki tego rodzaju są zwykle wytwarzane przez jeden rodzaj komórek i wpływają na rozmnażanie się komórek innych rodzajów. (Rubin i współpracownicy (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:802-806). Niektóre czynniki wzrostu tkanek miękkich są wydzielane przez poszczególne rodzaje komórek i wpływają na rozmnażanie, różnicowanie się i/lub dojrzewanie odnośnych komórek podczas rozwoju organizmów międzykomórkowych (Finch i współpracownicy (1989), Science 245:752-755). Poza roląjaką pełnią w rozwoju organizmów, niektóre z nich mająjstotne znaczenie w ciągłym zdrowiu i utrzymywaniu bardziej dojrzałych systemów. Na przykład, w przypadku ssaków, istnieje wiele systemów, w których występuje szybki przerób komórkowy. Do takich systemów należy skóra oraz układ gastryczno-wchłanialny, oba obejmujące komórki nabłonkowe. Do omawianej grupy czynników, wzrostu tkanek miękkich należy rodzina protein znanych jako czynniki wzrostu fibroblastów (FGF).

Obecnie znanych jest osiem protein należących do rodziny FGF, posiadających wspólną strukturę w swej zasadniczej budowie: podstawowy fibroblastowy czynnik wzrostu - bFGF (Abraham i współpracownicy (1986), EMBOJ, 5:2523-2528); kwasowy fibroblastowy czynnik wzrostu - aFGF (Jaye i współpracownicy (1986), Scicncc, 233:541-545); int-2 produkt genowy, int-2 (Dickson & Peters (1987), Naturc, 326;833); hst/kFGF (Dell-Bovi i współpracownicy (1987), Ccli, 50:729-737 oraz Yoshida i współpracownicy (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7305-7309); FGF-5 (Zhan i współpracownicy (1988), Mol. Celi. Biol., 8:3487-3495); FGF-6 (Maries i współpracownicy (1989), Oncogene, 4:335-340); keratynocytowy czynnik wzrostu KGF (Finch i współpracownicy (1989), Science, 24:752-755); oraz hisaktofilina (hisactophilin) (Habazzettl i współpracownicy, (1992), Nature 359:855-858).

W rodzinie protein FGF, keratynocytowy czynnik wzrostu („KGF”) jest wyjątkowym efektorem dla niefibroblastowego (szczególnie keratynocytowego) rozmnażania komórek nabłonkowych, pochodzących z tkanek krążkowych. Termin „rodzimy KGF” odnosi się do naturalnego ludzkiego (hKGF) lub rekombinacyjnego (rKGF) polipeptydu (z sekwencją sygnałową lub bez takiej sekwencji), określonego przez sekwencję aminokwasów SEQ IDNO:2 lub jego wariantu alleilowego. [Jeżeli nie jest to w jakiś inny sposób określone, numeracja aminokwasów w cząsteczkach opisywanych w niniejszym tekście powinna odpowiadać numeracji aminokwasów w dojrzałej formie cząsteczki rodzimej (to znaczy z pominięciem sekwencji sygnałowej), określonej jako aminokwasy 32 do 194 w sekwencji SEQ ID NO:2.]

Rodzimy KGF może być wyodrębniony z naturalnych ludzkich źródeł (hKGF) lub być wytworzony przez rekombinacyjne techniki DNA (rKGF) (Finch i współpracownicy (1989) jak wyżej; Rubini współpracownicy (1989),jak wyżej. Roni współpracownicy (1993), The Journal ofBiological Chemistry, 268(4):2984-2988; oraz Yan i współpracownicy (1991), In Vitro Celi. Dcv. Biol., 27A:437-438).

Ogólnie wiadomo, iż rodzimy KGF jest stosunkowo niestabilny w stanie uwodnionym oraz że podczas przetwarzania i przechowywania podlega on chemicznej i fizycznej degradacji prowadzącej do utraty aktywności biologicznej (Chen i współpracownicy (1994), Pharmaceutical Research, 11:1582-1589). Rodzimy KGF jest podatny także na agregację w podwyższonej temperaturze i ulega dezaktywacji w środowisku kwaśnym (Rubin i współpracownicy (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:802-806). Agregacja rodzimego KGF w roztworach wodnych również prowadzi do dezaktywacji proteiny. Jest to niekorzystne, ponieważ taka strata aktywności powoduje, że niepraktyczne staje się przechowywanie wodnych roztworów rodzimych protein KGF przez dłuższy okres czasu bądź podawanie tej proteiny przez wydłużone okresy. Co więcej, jest to szczególnie kłopotliwe przy przygotowywaniu kompozycji farmaceutycznych, ponieważ znany jest fakt, iż zagregowane proteiny stają się immunogenne (Cleland i współpracownicy (1993), Crit Rcv. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10:307-377; Robbins i współpracownicy (^TJDiabetes, 36:838-845; oraz Pinckard i współpracownicy (1967), Clin. Exp. Immunol, 2:331-340).

Rodzimy KGF zawiera pięć reszt cysteinowych, a mianowicie aminokwasy w pozycjach 1,15, 40, 102 oraz 106 (Finch i współpracownicy (1989), Scicncc, 24:752-755). Chociaż

184 188 opublikowano już informacje o zawartości cysteiny w rodzimym KGF, nie wyjaśniono jednak dotychczas roli, jaką reszty cysteinowe odgrywają z punktu widzenia aktywności (przykładowo ich doniosłości dla aktywności biologicznej) oraz trzeciorzędowej struktury (przykładowo ich tendencji do tworzenia niekorzystnych wewnątrzcząsteczkowych lub międzycząsteczkowych wiązań dwusulfidowych). A zatem, dotychczasowy stan techniki nie zawiera informacji, które reszty cysteinowe - jeśli jakiekolwiek - są istotne dla lub zaangażowane w tworzenie niekorzystnych wiązań dwusulfidowych, powodujących, że proteina staje się podatna na agregację i/lub niestabilna.

W celu polepszenia lub w inny sposób zmienieniajednej lub większej ilości charakterystyk rodzimego KGF, wykorzystać można inżynierię proteinową. Technologia rekombinacyjna DNA była wykorzystywana do zmodyfikowania sekwencji w rodzimym KGF.

Ron i współpracownicy (1993), J. Biol. Chem., 268(4):2984ł-2988D>onieśli o zmodyfikowanych polipeptydach KGF mających na N-końcu usunięte aminokwasy w pozycjach 3, 8, 27, 38 lub 49. Jedynie polipeptydy z brakującymi resztami w pozycjach 3, 8 lub 27 na N-końcu zachowały zdolność do wiązania heparyny; pozostałe zaś tej zdolności nie zachowały. Jednocześnie doniesiono, że polipeptydy niezawierające reszt 3 i 8 były całkowicie aktywne, podczas gdy postać niezawierająca reszty 27 była 10 do 20 razy mniej mitogenna, a z kolei formy niezawierające aminokwasów 38 lub 49 nie wykazywały aktywności mitogennej. Stabilność tak zmodyfikowanych polipeptydów KGF nie była dyskutowana, ani w inny sposób omówiona.

Publikacja nr 90/08771 zgłoszenia PCT, supra, również ujawnia wytwarzanie chimerycznej proteiny, w której pierwsze około 40 N-końcowych aminokwasów z dojrzałej formy rodzimego KGF połączono z C-końcową częścią (około 140 aminokwasów) aFGF. Stwierdzono, że tak otrzymany związek chimeryczny rozpoznaje keratynocyty podobnie do KGF, ale brakuje mu podatności na oddziaływanie z heparyną, co jest charakterystyczne dla aFGF, ale nie dla KGF. Nie dyskutowano, ani nie podawano żadnej informacji na temat stabilności tego chimerycznego związku.

A zatem, w literaturze nie opublikowano informacji o zmodyfikowanej cząsteczce KGF, która charakteryzowałaby się podwyższoną stabilnością w porównaniu z rodzimym KGF. Co więcej, dane zawarte w literaturze nie dostarczają dostatecznego wyjaśnienia lub wskazań, uzasadniających przewidywania jak skutecznie wytworzyć cząsteczki KGF, o takich pożądanych właściwościach.

Ogólnie rzecz biorąc, wpływ jaki zmiana aminokwasu wywiera na aktywność biologiczną proteinyjest zmienny i zależy od szeregu czynników, w tym od trójwymiarowej struktury proteiny oraz od tego czy modyfikacje dotyczą czy też nie dotyczą obszaru wiążącego receptor w pierwszorzędowej sekwencji proteiny. Ponieważ nie opublikowano dotychczas ani trójwymiarowej struktury proteiny ani obszaru wiążącego receptor pierwotnej struktury rodzimego KGF, wiedza zawarta w stanie techniki nie pozwala na ogólne stwierdzenia odnośnie wpływu, jaki wywrą modyfikacje aminokwasów w rodzimym KGF, w oparciu o efekty wywoływane przez modyfikację aminokwasu w ogólnie znanych proteinach.

Jest zatem celem niniejszego wynalazku dostarczenie sposobu stymulacji produkcji niefibroblastowych komórek nabłonkowych, opartego na wykorzystniu analogów KGF o podwyższonej stabilności, przykładowo przy poddaniu typowym warunkom pH, temperatury i/lub innych parametrów podczas przechowywania - w porównaniu z rodzimym KGF.

Sposób stymulacji produkcji niefibroblastowych komórek nabłonkowych według wynalazku polega na tym, że niefibroblastowe komórki nabłonkowe kontaktuje się ze skuteczną ilością analoga rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, zdefiniowanego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2 z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, o sekwencji aminokwasów właściwej KGF lecz obejmującej modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji sEq ID NO:2, w którym każda z reszt cysteinowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ED NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem.

18·4 188

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są usunięte.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym aminokwasy 32-55 w SEQ ID NO:2 są odcięte.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SeQ ID NO:2 jest usunięta, a reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym pierwsze - do czternastu, N-końcowe aminokwasy są odcięte, a reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są podstawione innym aminokwasem.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym za resztę cysteinową jest podstawiona reszta aminokwasowa wybrana z grupy obejmującej reszty alaniny, leucyny i seryny.

Szczególnie korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym reszta serynowa jest podstawiona za resztę cysteinową.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym występuje dodatkowo podstawienie zmieniające ładunek w pozycji aminokwasu wybranego spośród: reszty argininowej wpozycji aminokwasu 72 w SEQ IDNO:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasu 74 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 86 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 126 w sEq ID nO:2, reszty asparginowej w pozycji aminokwasu 168 w sEq ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego wpozycji aminokwasu 169 wSEQ IDNO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 170 wSEQ ID NO:2, reszty argininowej wpozycji aminokwasu 175 w sEq ID NO:2, reszty lizynowej wpozycji aminokwasu 178wSEQ ID NO:2,reszty glutaminowej wpozycji aminokwasu 183 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 184 w SeQ ID NO:2 lub reszty treoninowej w pozycji aminokwasu 185 w SEQ ID NO:2.

, Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym dodatkowo występuje modyfikacja polegająca na tym, że co najmniej jeden aminokwas w pętlotwórczej sekwencji reszt aminokwasowych w pozycjach Asn¹⁴⁶ - Thr¹⁵⁰w SEQ ID NO:2 - zastąpiony jest resztą innego aminokwasu posiad^ącą wyższy potencjał tworzenia pętli.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym reszty aminokwasowe w pozycjach 32-54 w SEQ ID NO:2 są usunięte, a jednocześnie występują oba wyżej wskazane typy dodatkowych modyfikacji.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF wybrany z grupy analogów obejmującej C(1,15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:32, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuj e ewentualnie), C(1,15,40) S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 78, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15,102)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:80, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C( 1, 15,102,106)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:82, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ADN15 (SEQ ID NO:42, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie)DN16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN17 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:46, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ANI 8 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:48, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN 19 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:50, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje

184 188 ewentualnie), AN20 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:52, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje owentuαlnie), AN21 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:54, w której początkowa metioninajeęt uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN22 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:56, w której początkowa metioninajoit uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie, ADN23 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:58, w której początkowa motioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ24 (odpowiadający sekwencji SEQ ID N0:60, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN1^/^(15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:34, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), A^<3/^(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:36, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN8/C(15)S (odpowiadający sekwencji SEQIDNO:38, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN8/C(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID N0:40, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:62, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ IDNO:64, w której początkowa motioninajost uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/H( 116)G (odpowiadający sekwencji aminokwasów 54-194 w SEQ ID NO:2), z resztą histydynową w pozycji aminokwasu 147 podstawioną glicyną, AN23/N(137)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:84, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K( 139)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:86, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K( 139)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 88, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)A (odpowiadający sekwencji SEQ ID N0:90, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)E odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:92, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje owontual.nio), AN23/R(144)L (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:94, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(147)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:96, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(147)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:98, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/N(153)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 100, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/NK(.153)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 102, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/Q(152)E/K(153)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID N0:104, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie) i AN121^_i/R(144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID N0:66, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się analog DN16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje siępolipeptydowy analog KGF mający sekwencj ę sygnalną lub amino-końco wą resztę motioninową_> a zwłaszcza polipeptydowy analog KGF, w którym sekwencję sygnalną stanowią aminokwasy 1-31 w SEQ ID NO:2.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF połączony kowalencyjnie z ugrupowaniem chemicznym, a zwłaszcza polipeptydowy analog KGF, w którym ugrupowaniem chemicznym jest glikol polietylenowy.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje iiępolipoptydowy analog KGF, którym jest AN23 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:58, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), połączony kowalencyjnie z ugrupowaniem

18-4 188 chemicznym, a zwłaszcza polipeptydowy analog KGF, w którym ugrupowaniem chemicznym jest glikol polietylenowy.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF w postaci liofilizowanej.

Szczególnie korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptydowy analog KGF wytworzony sposobem obejmującym prowadzenie namnażania w odpowiednich warunkach odżywczych prokariotycznej lub eukariotycznej komórki-gospodarza trwale transformowanej cząsteczką rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys1 oraz Cys¹5), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem, albo biologicznie funkcjonalnym wektorem zawierającym cząsteczkę takiego rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w sEq ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys1 oraz Cys¹5), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem i prowadzi się hodowlę w sposób pozwalający na ekspresję kodowanego analoga KGF, po czym wyodrębnia się tak wytworzony analog KGF.

Obecny wynalazek zapewnia nowy sposób stymulacji produkcji niefibroblastowych komórek nabłonkowych przy użyciu biologicznie aktywnych polipeptydowych analogów KGF, przeznaczony do stosowania w celach niemedycznych.

Dla potrzeb niniejszego wynalazku termin „KGF” obejmuje rodzimy KGF oraz proteiny charakteryzujące się sekwencją peptydową zasadniczo taką samą jak sekwencja peptydowa rodzimego KGF, która zachowuje reszty cysteinowe odpowiadające Cys1 oraz Cys¹5 rodzimego KGF (Cys32 oraz Cys⁴⁶ w SEQ ID NO:2) oraz która zachowuje niektóre lub wszystkie z biologicznych aktywności rodzimego KGF, w szczególności zdolność niefibroblastowej proliferacji komórek nabłonkowych. [Przy odnoszeniu się do rysunków fig. 4, 7-24 oraz 37-50 oraz przy wskazywaniu pozycj i poszczególnych aminokwasów, początkowa reszta metioninowa powinna być uważana za grupę o numerze „0”]. Termin „charakteryzujące się sekwencją peptydową zasadniczo taką samą jak sekwencja peptydową rodzimego KGF” oznacza sekwencję peptydową kodowaną przez sekwencję DNA zdolną do hybrydyzacji do nukleotydów 201 do 684 w sekwencji SEQ ID NO:1, korzystnie w ścisłych warunkach hybrydyzacji.

Określenie odpowiadi^^cych sobie pozycji aminokwasów pomiędzy dwoma sekwencjami aminokwasów można zrealizować przez ułożenie obu sekwencji obok siebie i zmaksymalizowanie dopasowania do siebie reszt, włącznie z przesuwaniem aminowych i/lub karboksylowych końców, wprowadzaniem przerwy gdy jest to konieczne i/lub usuwaniem reszt obecnych jako inserty w cząsteczce-kandydacie. Można przeprowadzić poszukiwania w bazach danych, analizę sekwencyjną oraz manipulacje, z wykorzystaniem dobrze znanych i rutynowo stosowanych programów algorytmowych do skanowania homologii/identyczności porównywanych sekwencji (na przykład, Pearson i Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:2444-2448; Altschul i współpracownicy (1990;, J. Mol. Biol., 215:403-410; Lipan i Pearson (1985), Scicncc, 222:1435 lub Devereux i współpracownicy (1984), Nuc. AcidsRcs. 12:387-395.

Termin „ściśle określone warunki”, w kontekście hybrydyzacjj Dotyczy określonej kombinacji warunków soli, temperatury, rozpuszczalników organicznych oraz innych parametrów typowo kontrolowanych w reakcjach hybrydyzacji. Przykładowymi ściśle określonymi warunkami hybrydyzacji są warunki hybrydyzacji w 4 X SSC w temperaturze 62-67°C, a następnie przemywanie w 0.1 X SSC w temperaturze 62-67°C przez około godzinę.

184 188

Alternatywnie, przykładowe określone warunki hybrydyzacji dotyczą hybrydyzacji w 45-55% formamidzie, 4 X SSC w temperaturze 40-45°C. [Patrz T. Maniatis i współpracownicy, Molecular Cłoning (Podręcznik Laboratoryjny - A Laboratory Manuał); wydany przez Cold Spring Harbor Laboratory (1982), strona 387 do 389].

Zatem, proteiny stosowane w sposobie według wynalazku obejmują alleliowe wariacje, lub usunięcie (usunięcia), podstawienie (podstawienia) lub wstawienie (wstawienia) aminokwasów, w tym fragmenty, chimeryczne lub hybrydowe cząsteczki rodzimego KGF. Jeden przykład KGF obejmuje polipeptydy ze zmienionym ładunkiem, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych 41-154 rodzimego KGF (korzystnie reszty Arg⁴1 Gln⁴³, Lys55, Lys⁹5, Lys¹²⁸, Asn^⁷, Glnⁿ⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gln^², Lys^3 lub Thr¹*) zostały usunięte lub podstawione przez obojętną resztę lub przez resztę naładowaną ładunkiem ujemnym, wybraną w celu uzyskania proteiny o zmniejszonym ładunku dodatnim (jak podano w zgłoszeniu nr U. S.

S.N. 08/323, 337, złożonym 13 października 1994 dokonanym także na rzecz obecnego uprawnionego), zwłaszcza R(144)Q, czyli KGF mającego podstawienie glutaminy za argininę w pozycji 144 rodzimego KGF. Inny przykład KGF obejmuje proteiny wytworzone przez zastąpienie co najmniej jednym aminokwasem mającym wyższy potencjał do tworzenia pętli co najmniej jednego aminokwasu wewnątrz obszaru tworzącego pętle: Asnⁿ5 -His¹’⁶ -Tyr^-Asn¹^ -Thr¹¹⁹ rodzimego KGF (jak podano w zgłoszeniu nr U. S. S.N. 08/323,473, złożonym 13 października 1994 dokonanym także na rzecz obecnego uprawnionego), zwłaszcza H(116)G, czyli KGF mający podstawienie glicyny za histydynę w pozycji 116 rodzimego KGF. Wciąż dalszy przykład obejmuje proteiny mające jeden lub więcej aminokwasowych podstawień, usunięć lub wstawień w zakresie 123-133 (aminokwasy 15-4-164 w SEQ ID NO:2) rodzimego KGF; te proteiny mogą wykazywać aktywność agonistyczną lub antagonistyczną.

Nieoczekiwanie okazało się, że korzystnie stosuje się cząsteczkę KGF (to znaczy macierzystą cząsteczkę) mającąreszty cysteinowe odpowiadające (jak zostało to określone za pomocą technik opisanych wyżej) Cys1 oraz Cys^ rodzimego KGF (reszty cysteinowe 32 oraz 46 w SEQ ID NO:2) zmodyfikowane przez zastąpienie ich innymi resztami, gdyż tak otrzymany analog KGF wykazuje polepszoną stabilność w porównaniu z wyjściową cząsteczką macierzystą. Dodatkowo poza wykorzystaniem związków o podwyższonej stabilności, zgodnie z wynalazkiem stosuje się korzystnie te analogi KGF, które wykazują równocześnie pełną aktyw ność biologiczną (to znaczy co najmniej zasadniczo podobną zdolność wiązania receptora lub zasadniczo podobne powinowactwa do receptora) w porównaniu z rodzimym KGF.

Analogi KGF korzystnie stosowane w sposobie według wynalazku mogą być wytworzone metodami biotechnologicznymi. Obecnie opisane zostały, oczyszczone i wyizolowane cząsteczki kwasów nukleinowych kodujących różne biologicznie aktywne polipeptydowe analogi KGF. Konstrukty takich kwasów nukleinowych mogą być wykorzystane do trwałego transformowania prokariotycznej lub eukariotycznej komórki-gospodarza, a w wyniku hodowania wskazanej komórki-gospodarza w odpowiednich warunkach żywienia, w sposób pozwalający na ekspresję analogu KGF - można po ekspresji wyizolować i oczyścić wytworzony rekombinacyjny polipeptyd. Wytworzony analog KGF jest przystosowany do stymulowania niefibroblastowych komórek nabłonkowych.

Obecny wynalazek opiera się na stosowaniu nowych związków i w tym zakresie wynalazek obecny zilustrują załączone rysunki, na których:

Figury 1A i1B przedstawiają nukleotydową (SEQ ED NO : 1) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:2) sekwencję rodzimego KGF (nukleotyd kodujący dojrzałą formę rodzimego KGF jest przedstawiony przez zasady 201 do 684 w SEQ ID NO: 1, a dojrzała forma KGF jest określona przez reszty aminokwasowe 32 do 194 w SEQ ED NO:2).

Figury 2A, 2B oraz 2C przedstawiają odpowiednio mapy plazmidowe pCFM1156, pCFM1656 oraz pCFM3102.

Figura 3 przedstawia sekwencje:,nukleotydową(SEQ IDNO:3) i aminokwasową (SEQ ID NO:4) dla konstruktu RSH-KGF.

184 188

Figura 4 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:5) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:6) dla konstruktu zawartego w plazmidzie KGF.

Figura 5 przedstawia chemicznie zsyntetyzowane związki typu OLIGO (OLIGO#6 do OLIGO#11; odpowiednio SEQ ID NO: 1(2-17) stosowane do zastąpienia sekwencji DNA pomiędzy miejscem KpnI a miejscem EcoRI (od pozycji aminokwasów 46 do 85 w SEQ ID NO:6), w konstrukcie zawartym w plazmidzie KGF do wytworzenia konstruktu w plazmidzie KGF (dsd).

Figura 6 przedstawia chemicznie zsyntetyzowane związki typu OLIGO (OLIGO# 12 do OLIGO#24, odpowiednio SEQ ID NO: 18-30) stosowane do skonstruowania KGF (zoptymalizowany kodon).

Figura 7 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:31) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:32) dla związku C(1,15)S - analoga kGf mającego podstawienie seryny za cysteinę w pozycjach aminokwasów 1 oraz 15 rodzimego KGF.

Figura 8 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:33) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:34) dla związku AN3/C(15)S - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze trzy aminokwasy z N-końca oraz podstawiono serynę za cysteinę w pozycji aminokwasu 15 rodzimego KGF.

Figura 9 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:35) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:36) dla związku AN3/C(15)- - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze trzy aminokwasy z N-końca oraz usunięto cysteinę w pozycji aminokwasu 15 rodzimego KGF.

Figura 10 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:37) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:38) dla związku AN8/C(15)S - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze osiem aminokwasów z N-końca oraz podstawiono serynę za cysteinę w pozycji aminokwasu 15 rodzimego KGF.

Figura 11 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:39) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:40) dla związku AN8/C( 15)- - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze osiem aminokwasów z N-końca oraz usunięto cysteinę w pozycji aminokwasu 15 rodzimego KGF.

Figura 12 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:41) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:42) dla związku AN15 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 15 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 13 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:43) oraz aminokwasową (5EQ ID NO:44) dla związku ΔΝ16 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 16 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 14 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:45) oraz aminokwasowa (SEQ ID NO:46) dla związku ΔΜ7 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 17 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 15 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:47) oraz aminokwasowa (SEQ ID NO:48) dla związku ΔΧ18 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 18 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 16 przedstawia sekwencje: nukleotydową, (SEQ ID NO:49) oraz aminokwasowa (SEQ ID NO:50) dla związku ΔΜ9 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 19 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 17 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:51) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:52) dla związku ^\N20 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 20 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 18 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:53) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:54) dla związku ΔΚ21 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 21 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 19 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:55) oraz aminokwasowa (SEQ ID NO:56) dla związku ΔΗ22 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 22 aminokwasy z N-końca rodzimego KGF.

184 188

Figura 20 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:57) oraz aminokwasowa (SEQ ID NO:58) dla związkuAN23 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca rodzimego kGf.

Figura 21 przedstawia sekwencje: (SEQ ID NO:59) oraz aminokwasowa (SEQ ID NO:60) dla związku AN24 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 24 aminokwasy z N-końca rodzimego KGF.

Figura 22 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:61) oraz aminokwasowa (SEQ ID NO:62) dla związku C(1,15)S/R(144)E - analoga KGF mającego podstawienia seryny za cysteinę w pozycjach aminokwasu 1i 15 oraz podstawienie kwasu glutamowego za argininę w pozycji aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 23 przedstawia sekwencje: nukleotydową. (SEQ ID NO:63) oraz aminokwasowa (SEQ ID NO:64) dla związku C(1,15)S/R(144)Q - analoga KGF mającego podstawienia seryny za cysteinę w pozycjach aminokwasu 1i 15 oraz podstawienie glutaminy za argininę w pozycji aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 24 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:65) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:66) dla związku AN23/R(144)Q - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono glutaminę za argininę w pozycji aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 25 przedstawia ilość pozostałej rozpuszczalnej proteiny, gdy rodzimy KGF oraz C( 1,15)S przetrzymywano w roztworze 20 mM fosforanu sodu, 0,15 M NaCl, pH=7,0 w temperaturze 37°C przez 27 godzin.

Figura 26 NaCl przedstawia ilość pozostałej rozpuszczalnej proteiny, gdy rodzimy KGF i C(1,15)S przetrzymywano w PBS i w roztworze 50 mM NaPO4, 0,15 MNaCl,pH-7,0 w temperaturze 37°C przez 27 godzin.

Figura 27 przedstawia ilość rozpuszczalnej proteiny rodzimego KGF, C(1,15)S, C( 1,15)S/R( 1-44) i C( 1,15)S/R( 144)Q - oznaczoną metodą HPLC z wykluczaniem ze względu na wielkość cząstek, jako funkcję czasu inkubacji w temperaturze 37°C.

Figura 28 przedstawia szacunkową temperaturę topnienia (T_m)jako funkcję pH dla rodzimego KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)Q i C(1,15)S/R(144)E.

Figura 29 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności C(1,15)S oznaczonej przez pomiar przyłączania [³H]-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standardową krzywą rodzimego KGF.

Figura 30 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności AN15 oznaczonej przez pomiar przyłączania pHj-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standardową krzywą rodzimego KGF.

Figura 31 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności AN23 oznaczonej przez pomiar przyłączania [3H]-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standardową krzywą rodzimego KGF.

Figura 32 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności AN23/R(144)Q oznaczonej przez pomiar przyłączania [3H]-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standardową krzywą rodzimego KGF.

Figura 33 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności C(1,15)S/R(144)Q oznaczonej przez pomiar przyłączania [3H]-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standardową krzywą rodzimego KGF.

Figura 34 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności C(1,15)S/R(144)E oznaczonej przez pomiar przyłączania [3H]-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standardową krzywą rodzimego KGF.

Figura 3 5 przedstawia wpływ rodzimego KGF, KGF-a AN15 ,C(1,15)Si AN23 na chemię surowicy.

Figura 36 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:77) oraz aminokwasową. (SEQ ID NO:78) dla związku C(1,15,40)S - analoga KGF, w którym podstawiono serynę za cysteinę w pozycjach aminokwasów 1, 15 i 40 rodzimego KGF.

184 188

Figura 37 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:79) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:80) dla związku C(1,15,102)S - analoga KGF w którym podstawiono serynę za cysteinę w pozycjach aminokwasów 1, 15 i 102 rodzimego KGF.

Figura 38 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:81) oraz aminokwasową (SEQ ID NO: 82) dla związku C( 1,15,102,106)S - analoga KGF, w którym podstawiono serynę za cysteinę w pozycjach aminokwasów 1, 15, 102 i 106 rodzimego KGF.

Figura 39 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:83) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:84) dla związku DN23/N(137)E - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutaminowy za asparaginę w pozycji aminokwasu 137 rodzimego KGF.

Figura 40 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:85) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:86) dla związku AN23/K(139)E - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutaminowy za lizynę w pożyci i aminokwasu 139 rodzimego KGF.

Figura 41 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:87) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:88) dla związku AN23/K(139)Q - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono glutaminę za lizynę w pozycji aminokwasu 139 rodzimego KGF.

Figura 42 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:89) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:90) dla związku AN23/R(144)A - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono alaninę za argininę w pozycji aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 43 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:91) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:92) dla związku AN23/R(144)E - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutaminowy za argininę w pozycji aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 44 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID N0:93) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:94) dla związku AN23/R(144)E - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono leucynę za argininę w pozycji aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 45 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:95) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:96) dla związku AN23/K(147)E - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutaminowy za lizynę w pozycji aminokwasu 147 rodzimego KGF.

Figura 46 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:97) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:98) dla związku AN23/K(147)Q - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono glutaminę za lizynę w pozycji aminokwasu 147 rodzimego KGF.

Figura 47 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:99) oraz aminokwasową (SEQ ID NO: 100) dla związku AN23/K(153)E - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutaminowy za lizynę w pozycji aminokwasu 153 rodzimego KGF.

Figura 48 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO: 101) oraz aminokwasową (SEQ ID NO: 102) dla związku AN23/K(153)Q - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono glutaminę za lizynę w pozycji aminokwasu 153 rodzimego KGF.

Figura 49 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO: 103) oraz aminokwasową (SEQ ID NO: 104) dla związku AN23/Q(152)E/K(153)E -analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutaminowy za glutaminę w pozycji aminokwasu 152 i kwas glutaminowy za lizynę w pozycji 153 rodzimego KGF.

184 188

Figura 50. przedstawia wpływ AN23 na cukrzycę wywołaną streptozotocyną u szczurów Sprague-Dawley.

Zgodnie wynalazkiem opracowano sposób stymulacji produkcji niefbroblastowych komórek nabłonkowych, w którym stosuje się nowe analogi KGf. Dokonano ustalenia, że cztery reszty cysternowe znajdujące się w rodzimym KGF (Cys1 i Cys^, i Cys”⁵² i Cys’°6) mająudział w tworzeniu dwóch mostków dwusulfidowych. Cys⁴0 nie bierze udziału w tworzeniu wewnątrzcząsteczkowego wiązania dwusulfidowego. A zatem, KGF zawiera dwie małe pętle dwusulfidowe rozdzielone przez prawie 90 aminokwasów. W oparciu o pierwsze ustalenia określono, które reszty cysteinowe są zaangażowane w tworzenie mostków dwusulfidowych wskazuje, które cysteiny mogą swobodnie tworzyć niekorzystne międzycząsteczkowe wiązania sieciujące lub wiązania wewnątrzcząsteczkowe, które mogą spowodować, że proteina przyjmie niekorzystną strukturę trzeciorzędową (przykładowo konformację, która zmniejsza aktywność proteiny).

Niespodziewanie okazało się, że modyfikacja KGF przez usunięcie lub podstawienie reszt aminokwasowych za reszty cysteinowe znajdujące się w pozycjach 1i 15 KGF (pozycje 32 i 46 w SEQ ID NO:2) prowadzi do otrzymania analoga KGF mającego w istotny sposób polepszoną stabilność (przykładowo zmniejszone problemy wywołane przez nieodpowiednie sfałdowanie, tworzenie międzycząsteczkowego wiązania dwusulfidowego i/lub agregację protein). Przykładowo, analogi KGF mogą w zasadzie być oczyszczane z większą wydajnością rozpuszczalnych, w odpowiedni sposób sfałdowanych protein. Co więcej, materiał, który raz był oczyszczony, będzie bardziej odporny wobec pH, temperatury i tak dalej w porównaniu do stabilności wyjściowej molekuły, a więc korzystniejszy do stosowania w sposobie według wynalazku. Uważa się, że Cys” i Cys” w KGF - poza tworzeniem międzycząsteczkowego mostku dwusulfidowego oraz N-końcowej pętli dwusulfidowej - w pewnych warunkach występują również jako wolne cysteiny, które są zdolne do tworzenia międzycząsteczkowych mostków dwusulfidowych, prowadzących do niestabilności i agregacji protein. Co więcej, zostało odkryte, że usunięcie N-końcowej pętli dwusulfidowej nie jest ważne do wiązania receptora lub aktywności mitogennej i przydatności w sposobie według wynalazku.

Jak przyjęto w niniejszym wynalazku, „analog KGF” lub „polipeptydowy analog KGF” będzie oznaczać każdy z opisanych naturalnych lub nie występujących w stanie naturalnym polipeptydów różniących się w strukturze od KGF przez posiadanie modyfikacji w sekwencji peptydowej odpowiadającej 24 aminokwasowemu N-końcowi KGF (aminokwasy 32 do 55 w SEQ ID NO:2), podczas gdy Cys” oraz Cys”5 z KGF (aminokwasy 32 do 46 w SeQ ID NO:2) zostały zastąpione lub usunięte. Sposób, za pomocą którego cysteiny zostały zastąpione lub usunięte nie posiada zasadniczego znaczenia i w sposobie według wynalazku stosuje się, przykładowo, analogi polipeptydowe zawierające jedno lub więcej usunięć aminokwasów i/lub podstawień. Zatem, zgodnie z wynalazkiem stosuje się rodzinę nowych protein keratynocytowego czynnika wzrostu, w której wyróżnić można kilka grup protein.

Jedna z grup analogów KGF obejmuje cząsteczki, w których cysteiny w pozycji 1i 15 KGF są zastąpione przez aminokwasy, włącznie z tymi, które nie występują w sposób naturalny w proteinach. Strategie wytwarzania takich analogów podstawieniowych obejmują ukierunkowaną-na-miejsce mutagenezę (Ho i współpracownicy (1989), Gene, 77:51-59; Innis i współpracownicy „PRC Protocols”, Academic Press, Inc. San Diego, CA). [Analogi KGF zawierające podstawienie aminokwasu są określane przez wskazanie reszty znajdującej się w pozycji podstawienia w dojrzałej cząsteczce proteiny (odejmując sekwencję sygnałową) opisanej sekw^irncj^ą SEQ ID NO:2, następnie w nawiasie podana jest ta właśnie pozycja aminokwasu, a po nawiasie nowy aminokwas. Przykładowo, analog zawierający cysteinę podstawionąprzez serynę w pozycj i 15 w KGF (pozycja 46 w SEQ ID NO :2) opisywanyjestj ako „C(15)S”]. Korzystne jest przekształcenie cysteiny w obojętny aminokwas taki jak glicyna, walina, alanina, leucyna, izoleucyna, tyrozyna, fenyloalanina, histydyna, tryptofan, seryna, treonina i metionina, z których najkorzystniejszymi aminokwasami - ze względu na ich największe podobieństwo do cysteiny, są seryna, treonina oraz alanina. Przykład I szczegółowo

18-4 188 omawia wytwarzanie C(1,15)S z wykorzystaniem częściowej syntezy genowej (w sprzężeniu z innymi technikami rekombinacyjnymi). po którym następuje rekombinacyjna ekspresja w stabilnie transformowanym gospodarzu bakteryjnym.

Inna grupa analogów KGF obejmuje cząsteczki, w których nastąpiło usunięcie cysteiny w pozycjach 1i 15 KGF. Różne strategie mogą być wykorzystane dla uzyskania takich analogów KGF, jak N-końcowe odcięcia lub specyficzne miejscowo usunięcia lub połączenie obu tych metod.

Termin „N-końcowe odcięcie” odnosi się do modyfikacj i KGF, gdzie 1 do 24 N-końcowych reszt aminokwasowych KGF (aminokwasy 32 do 55 w SEQ ID NO:2), w tym z Cys¹ i Cys^]5 zostało usuniętych. [Analogi KGF zawierające odcięcie aminokwasów będą określane przez wskazanie reszty usuniętej w danej pozycji dojrzałej proteiny (bez sekwencji sygnalnej) przedstawionej w SEQ ID NO:2, rozpoczynając się od miejsca usunięcia i przez wskazanie liczby usuniętych reszt. Przykładowo, analog KGF posiadający N-końcowe odcięcie 24 reszt z KGF (reszty 1-55 w SEQ NO:2) będzie określany jako analog „AN24”]. W szczególności w tej grupie znajdą się analogi AN23 rodzimego KGF, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych 41-154 (aminokwasy 72-185 w SEQ ID NO:2), w tym zwłaszcza reszty aminokwasowe ^^3-133 (aminokwasy 15-4-164 w SEQ NO:2), są usunięte lub podstawione przez reszty obojętne lub reszty obdarzone ładunkiem ujemnym, wybrane tak, aby w rezultacie otrzymać proteinę ze zmniejszonym ładunkiem dodatnim. Resztami korzystnymi do modyfikacji są reszty Arg4’, Gb^, Lys⁵5, Lys⁹⁵, Asn’/⁷, Gln¹³⁸, Lys^⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gln¹^, Lys^!53 lub Thr’⁵⁴, a zwłaszcza Gln’^, Lys’39, Arg¹⁴⁴, Lys^, Gln^ lub Lys’^, wśród których Arg144 jest najkorzystniejsza. Również w tej grupie znajdują się analogi AN32 rodzimego KGF mające modyfikacje tworzące pętle w obszarze pętlotwórczym: Asn^His’¹⁶ -Tyr^Asn¹’ -Thr¹’ (aminokwasy 146-150 w SEQ ID NO:2), korzystnie obejmujące modyfikację zmieniającą ładunek reszty aminokwasowej 116, a zwłaszcza podstawienie Gly w pozycji 116. Ponadto, objęte tą grupą są analogi AN23 rodzimego KGF mające jedno lub więcej podstawień aminokwasów, usunięć lub dodań w zakresie regionu (aminokwasy o kolejności 154-164 SEQ

ID NO:2) rodzimego KGF.

Przykład I podaje szczegóły systematycznego generowania N-końcowych obcięć wykonanych za pomocą częściowej syntezy genowej, w połączeniu z innymi technikami rekombinacyjnymf po której następuje rekombinacyjna ekspresja w trwale transformowanym bakteryjnym gospodarzu. Takimi przykładowymi N-końcowymi obcięciami będą AN15 do AN24. Co więcej, przykład III szczegółowo objaśnia ekspresję - w kulturze komórek ssakówDNAkodującego rodzimy KGF i heterogeniczne N-końcowe glikozylowane izoformy, oczyszczanie korzystnie glikozylowanej izoformy mającej N-końcowe obcięcie aminokwasów 1-23 dojrzałej formy rodzimego KGF.

Dla kontrastu, usunięcie specyficzne dla miejsca odnosi się do modyfikacji KGF, w której jednią lub więcej reszt aminokwasowych (przykładowo Cys’ lub Cys¹⁵) usunięto. Gdy Cys’ lub Cys’5 KGF są specyficznie usunięte, to powstały analog jest o jeden aminokwas krótszy niż KGF. [Analogi KGF zawierające usunięcie aminokwasu są określane przez wskazanie reszty znajdującej się w określonej pozycji w dojrzałej proteinie (bez sekwencji sygnalnej) przedsta- wionej w SEQ ID NO:2, po której w nawiasie podana jest pozycja aminokwasu, a po nawiasie występuje znak minus. Przykładowo, analog z tej grupy obejmujący usunięcie cysteiny w pozycji 15 KGF (pozycja 36 w SEQ IDNO:2) określany jest jako „C(15)-”]. Usunięcia specyficzne co do miejsca mogą być otrzymywane za pomocą ukierunkowanej na miejsce mutagenezy, co opisano powyżej.

Grupą tą objęte sąrównież analogi, w których przez wycięcie i usunięcie pozbyto się Cys’ i Cys’5 z KGF. Na przykład, reprezentatywni przedstawiciele takich analogów KGF zawierają obcięcie pierwszych trzech reszt aminokwasowych (Cys-Asn-Asp) KGF lub obcięcie pierwszych ośmiu aminokwasów (Cys-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-GIn) KGF sprzężone z usunięciem cysteiny w pozycji 15 KGF (te analogi są oznaczone odpowiedniojako „AN^C^)-” i ,,DN8/C(15)-”). Jako, że reszta metioninowa w naturalny sposób występuje jako czwarty

184 188 i dziewiąty aminokwas w rodzimym KGF, nie jest potrzebny dodatkowy kodon Met, aby umożliwić prawidłowe rozpoczęcie translacji.

Wciąż dalsza grupa obejmuje cząsteczki, w których cysteiny w pozycji 1 i 15 KGF są zastąpione przez obcięcie i podstawienie. Przykładowo, przedstawicielem takich analogów KGF są AN3/C(15)S oraz AN8/C(15)S. Te analogi zawierają obcięcie pierwszych trzech amino-końcowych reszt aminokwasowych w KGF lub usunięcie pierwszych ośmiu amino-końcowych reszt aminokwasowych, sprzężone z podstawieniem cysteiny w pozycji 15 przez inny aminokwas, przykładowo serynę.

Gdy analogi KGF są wytwarzane w sposób biologiczny, na przykład są produktem ekspresji komórkowej w przeciwieństwie do syntezy w stanie stałymDo proteolitycznej lub enzymatycznej derywatyzacji naturalnie występujących produktów itp., kwasy nukleinowe kodujące takie polipeptydy będą różnić się w jednym lub większą ilością nukleotydów w porównaniu z sekwencją nukleotydową rodzimego KGF. Takie nukleotydy mogą być poddawane ekspresji, a otrzymane polipeptydy - oczyszczane jedną z wielu, znanych biegłym w sztuce, technologicznych metod rekombinacyjnych.

Sekwencje DNA kodujące wszystkie lub część analogów KGF mogą zawierać między innymi inkorporowane kodony „preferowane” ze względu na ekspresję w wybranych komórkach gospodarza (przykładowo kodony ekspresji w E. coli). Dostarczać miejsca do rozerwania przez enzymy restrykcyjne; oraz dostarczać dodatkowe początkowe, końcowe lub pośrednie sekwencje nukleotydowe (przykładowo początkową metioninową resztę aminokwasową do ekspresji w komórkach E. coli). Dla ułatwienia konstrukcji wektorów łatwo ulegających ekspresji.

W sposobie według obecnego wynalazku wykorzystuje się analogi KGF uzyskiwane dzięki wykorzystaniu odpowiednich rekombinacyjnych cząsteczek lub wektorów do stosowania w metodzie ekspresji tych polipeptydów. Wektory tego rodzaju mogą zawierać DNA lub RNA i mogą być kołowe, liniowe, lub mieć budowęjednoniciową lub dwuniciową i mogą występować w naturze lub stanowić zestaw wielu składników, zarówno występujących naturalnie, jak i syntetycznych. Znanych jest wiele przykładów takich wektorów ekspresji. Składniki tych wektorów, przykładowo replikony, geny selekcyjne, wzmacniacze, promotory oraz tym podobne, mogą być otrzymane ze źródeł naturalnych lub syntetyzowane znanymi metodami. W każdym przypadku, wektory ekspresji mające zastosowanie do wytwarzania polipeptydów stosowanych w sposobie według wynalazku będą zawierały co najmniej jeden element kontroli ekspresji funkcjonalnie związany z wstawioną cząsteczką kwasu nukleinowego kodującego peptydowy analog KGF. Ten element kontrolny jest odpowiedzialny za regulowanie ekspresji polipeptydu z odpowiedniej cząsteczki kwasu nukleinowego. Przydatne elementy kontrolne obejmują, przykładowo, lac system, trp system, operatory i promotory z fagu X, glikolityczny promotor drożdżowy, promotor z drożdżowego genu kwasowej fosfatazy, drożdżowy czynnik alfa-kojarzący oraz promotory wyprowadzone z adenowirusa, wirusa E-pstem-Barna, poliomy, małpiego wirusa, jak również rożne inne pochodzące z retrowirusów. Jednakże, w stanie techniki znane są liczne inne wektory oraz elementy kontrolne odpowiednie do prokariotycznej lub eukariotycznej ekspresji i mogą zostać zastosowane w praktycznym wytwarzaniu polipeptydów stosowanych w sposobie według obecnego wynalazku.

Przykłady odpowiednich prokariotycznych wektorów do klonowania mogą obejmować plazmidy z E. coli (przykładowo pBR322, col El, pUC oraz czynnik F), przy czym korzystnymi plazmidami sąpCFM1156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC 69576) oraz pCFM3102 (opisany poniżej w części dotyczącej przykładów). Inne odpowiednie wektory ekspresji, z których liczne typy są znane w stanie techniki jako przydatne do ekspresji w komórkach ssaków, owadów, drożdży, grzybów i bakterii, mogą również być obecnie zastosowane w tym celu. Transfekcja tych wektorów do odpowiednich komórek gospodarzy może prowadzić do ekspresji polipeptydowych analogów KGF stosowanych w sposobie według wynalazku.

Mikroorganizmy-gospodarze przydatne przy wytwarzaniu analogów KGF stosowanych w sposobie według wynalazku mogą być zarówno prokariotycznymi jak i eukariotyczne.

18-4 188

Odpowiednimi gospodarzami prokariotyczni są różne szczepy E. coli (przykładowo FM5, HB101DH5alfaDR 1 0 oraz MC 1061), Pseudomonas, Bacillus oraz Streptomyces, przy czym korzystnym gospodarzem prokariotocenom jest E. coli. Odpowiednie eukariotyczne komórki gospodarza obojmująkomórki drożdży i innych grzybów, komórki owadów, komórki roślinne i zwierzęce, takie jak COS (przykładowo COS-1 oraz COS-7) oraz małpie linie komórkowe CV-1, linie komórkowe 3T3 pochodzące od myszy Swiss, Balb-c oraz NIH, mysie komórki HeLa i L-929 oraz komórki chomika: CHO, BHK lub HaK. W zależności od wybranego gospodarza, rekombinacyjne polipeptydy stosowane zgodnie z obecnym wynalazkiem będą glikozylowane przez pochodzące od ssaków lub inne eukariotyczne węglowodany lub też mogą być nie-glikozolowano.

Korzystny sposób wytwarzania pożądanych analogów KGF będzie zmieniał się i zależał od wielu czynników i uwarunkowań; optymalna procedura produkcyjna w danej sytuacji będzie jasno zrozumiała dla biegłych w sztuce, po niewielkiej dozie doświadczeń. Otrzymany produkt ekspresji może być następnie oczyszczony do stanu prawie homogenicznego znanymi sposobami. Typowa metoda oczyszczania w produkcji przy użyciu komórek prokariotycenoch polega na rozerwaniu ścian komórkowych za pomocą wysokiego ciśnienia lub innych środków, odwirowaniu lub filtracji, w celu usunięcia pozostałości komórkowych i następnie chromatografii jonowymiennej ptynu znad osadu lub filtratu, a w końcu - hydrofobowej chromatografii interakcyjnej. Jeżeli analog powstaje w formie nierozpuszczalnej, inna metoda oczyszczania polega najpierw na rozpuszczeniu ciał inkluzyjnych zawierających wytworzone analogi, a następnie chromatografii jonowymiennej oraz ponownym zfałdowaniu proteiny, a w końcu - interakcyjnej chromatografii hydrofobowej. Przykładowe metody oczyszczania są przedstawione w zgłoszeniu nr U.S. S.N. 08/323,339 złożonym 13 października 1994, dokonanym na rzecz tego samego uprawnionego. Generalnie zgłoszenie nr U.S. S.N. 08/323,339 ujawnia sposób oczyszczania koratynocotowogo czynnika wzrostu obejmujący: a) otrzymanie roztworu zawierającego pożądany KGF; b) związanie KGF z roztworu z etapu a) z żywicą jonowymienną; c) wypłukanie KGF w roztworze eluenta z żywicy jonowymiennej; d) albo przepuszczenie roztworu eluatu z etapu c) przez odpowiednią molekularną matrycę rozdzielającą pod względem wagi, albo poddanie eluatu z etapu c) hydrofobowej interakcyjnej chromatografii; oraz e) wyodrębnienie pożądanego KGF z matrycy rozdzielającej według masy lub z hydrofobowej chromatografii interakcyjnej.

Oczywiście, stosowane w sposobie według obecnego wynalazku analogi KGF mogą być poddane szybkiemu skriningowi, aby określić ich własności fizyczne. Poniższa część opisu obejmująca przykłady zawiera omówienie różnych dobrze znanych prób do badania stabilności, chociaż wybór określonej próby do badania określonego analoga nie ma decydującego znaczenia. Co więcej, poziom biologicznej aktywności (przykładowo zdolność do wiązania receptora i/lub powinowactwo do receptora, mitogeneza, proliferacja komórek i/lub aktywność in vivo) mogą być również testowane za pomocą przeróżnych prób, a niektóre z nich są przedstawione w poniższej części doświadczalnej. Liczne próby są dobrze znane i mogą zostać zastosowane do szybkiego zbadania obecnych analogów KGF w celu określenia, czy posiadają one akceptowalny poziom aktywności biologicznej, czy też go nie posiadają. Jedna z takich prób specjalnie sprawdza analogi KGF na ich zdolność wiązania się z receptorem KGF (KGFR) przez konkurencję wiązania ^I25I-KGF (Bottaro i współpracownicy, (1990,), J Biol. Chem. 2665, 12767-12770; Ron i współpracownicy (1993), J. Biol. Chem. 268, 2984-2988). Alternatywny sposób sprawdzenia interakcji KGFR i analoga KGF opartyjest na wykorzystaniu takich technik jak analiza oddziaływań biospecyficznych (BIA) w czasie rzeczywistym (Felder i współpracownicy (1993), Molecular & Cellular Biology, 13:1449-1455). Dodatkowo próba mitogonicena może być wykorzystana do sprawdzenia zdolności analogów KGF do stymulacji syntezy DNA (Rubin i współpracownicy (1989), cytowana powyżej). Ostatecznie, próby na proliferację komórek mogą być zastosowane do oceny zdolności analogów KGF do stymulowania proliferacji komórek (Falco i współpracownicy, Oncogene 2;573-578). Stosując

184 188 jakąkolwiek omówioną powyżej próbę, analogi KGF mogą być błyskawicznie sprawdzone pod kątem ich aktywności biologicznej.

W korzystnym przykładzie realizacji, w obecnym wynalazku wykorzystuje się analogi KGF, które zachowują całkowitą (to znaczy co najmniej istotnie podobną) aktywność biologiczną (BIA) w porównaniu z rodzimym KGF. Przykładami analogów KGF o takich własnościach, zbadanych za pomocą jednej lub większej ilości powyższych prób, są:

C(1,15)SAN3/C(15)SAN3/C(15)-AN8/C(15)SAN8/C(15)-AN15AN16AN17AN18ńN19 AN20AN21AN22AN23AN24 lub AN23/R(144)Q.

Analogi KGF mogą być dalej modyfikowane tak, aby zawierały dodatkowe ugrupowania chemiczne, które normalnie nie są częścią peptydu. Takie zderywatyzowane cząsteczki mogą polepszyć rozpuszczalność, absorpcję, biologiczny czas pół-życia oraz inne własności obecnego analoga KGF. Takie reszty mogą również alternatywnie eliminować albo osłabiać dowolne niepożądane efekty uboczne proteiny i jej podobnych. Ugrupowania zdolne do pośredniczenia w osiągnięciu takich efektów są opisane, przykładowo w REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, wydanie 18, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Kowalencyjne modyfikacje można wprowadzić do cząsteczki w wyniku reakcji wybranej reszty aminokwasowej w cząsteczce peptydu z organicznym związkiem derywatyzującym, który jest zdolny do reakcji z wybranymi łańcuchami bocznymi lub resztami końcowymi (T.E. Creighton (1983), PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULE PROPERTIES, W.H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79-86). Glikol polietylenowy („PEG”) jest jednym z takich chemicznych ugrupowań, które jest szeroko stosowane do przygotowania terapeutycznych produktów proteinowych. Dla niektórych protein wykazano, że przyłączenie glikolu polietylenowego zabezpiecza przed proteolizą, Sada i współpracownicy, (1991), J. Fermentation Bioengineering, 71:137-139. Jednocześnie, dostępne są sposoby przyłączenia pewnych reszt glikoli polietylenowych. Patrz patent USA nr 4 179 337 Davis i współpracownicy, „Nowe Immunologiczne Polipeptydy” wydany 18 grudnia 1979 oraz patent USA nr 4 002 531, Royer „Modyfikacja enzymów przez glikole polietylenowe i otrzymane tak produkty” wydany 11 stycznia 1977. Przegląd można znaleźć w: Abuchowski i współpracownicy, w Enzymy jako środki lecznicze (Enzymes as Drugs). (Holcerberg i Roberts (redaktorzy), str. 367-383 (1981). Dla glikolu polietylenowego liczne środki były wykorzystywane do przyłączenia cząsteczki glikolu polietylenowego do proteiny. Ogólnie rzecz biorąc, cząsteczki glikolu polietylenowego są przyczepione do proteiny poprzez reaktywną grupę znajduj jącą się w proteinie. Grupy aminowe, takie jak w grupa aminowa reszcie lizynowej lub na N-końcu, są wygodne do takiego przyłączenia. Na przykład Royer (patent USA nr 4 002 531, opisany powyżej) podaje, że redukcyjne alkilowanie było zastosowane do połączenia cząsteczki glikolu polietylenowego do enzymu. Patent europejski nr EP 0 539 167 opublikowany 28 kwietnia 1993, Wright „Imidany PEG i ich pochodne proteinowe” („Peg Imidates and Protein Derivates Thereof’) podaj e, że peptydy i organiczne związki z wolną (wolnymi) grupą (grupami) aminową (aminowymi) są modyfikowane przez pochodne imidowe PEG lub pokrewnych polimerów rozpuszczalnych w wodzie. Patent USA nr 4 904 584, Shaw, wydany 27 lutego 1990, odnosi się do modyfikacji licznych reszt lizynowych w proteinach w celu dołączenia cząsteczek glikolu polietylenowego poprzez reaktywne grupy aminowe.

Analogi KGF stosowane w sposobie według wynalazku mają również zastosowanie farmaceutyczne, a kompozycje farmaceutyczne zawierające te analogi w dawkach jednostkowych mogą być wykorzystane do podawania pozajelitowego lub doustnie podczas leczenia zwierząt ciepłokrwistych (takich jak ludzie). Środki farmaceutyczne tego rodzaju mogą być w formie liofilizowanej lub w innej formie odwodnionej środka terapeutycznego lub diagnostycznego, którą można zrekonstruować przez dodanie fizjologicznie akceptowalnego rozpuszczalnika. Rozpuszczalnikiem takim może być dowolne medium takie, jak sterylna woda, roztwór fizjologiczny solanki, roztwór glukozy lub inny wodny roztwór węglowodanu (przykładowo poliolu takiego, jakmannitol, ksylitol lub gliceryna), zdolny do rozpuszczenia suchej kompozycji, kompatybilny z wybraną drogą podawania i który nie oddziaływuje

184 188 w sposób negatywny z substancją aktywną oraz z zastosowanymi stabilizatorami rekonstrukcyjnymi.

Analogi KGF stosowane w sposobie według obecnego wynalazku mogą być przydatne jako środki terapeutyczne i diagnostyczne oraz jako środki badawcze. A zatem analogi KGF mogą być stosowane w próbach in vitro i/lub in vivo do ilościowego określania KGF w tkance lub w próbce organu lub do określenia i/lub wyizolowania komórek, które ekspresjonują KGFR (Bottaro i współpracownicy, (1990), J. Biol. Chem., 265:12767-2770; Ron i współpracownicy (1993), J. Biol. Chem., 268:2984-2988). W próbach dotyczących tkanek lub organów będzie mniej radioaktywności od analogu ¹²⁵I-KGF wiążącego kGfR, w porównaniu do standaryzowanej (wzorcowej) krzywej wiązania analogu ¹²⁵I-KGF, na skutek wiązania nie- oznakowanego rodzimego KGF do KGFR. Podobnie, analog ¹²⁵I-KGF można wykorzystać do wykrywania obecności KGFR w komórkach różnego rodzaju.

Możliwe jest również zastosowanie omawianego analoga KGF do generowania przeciwciał wytwarzanych przeciwko peptydowi, które to przeciwciała łączą się również z rodzimym KGF. Przeciwciała takie są przeciwciałami monoklonami lub poliklonami z pochodzenia i są wytwarzane przy użyciu analoga KGF. Otrzymane przeciwciała wiążą się przede wszystkim do rodzimego KgF, zwłaszcza gdy proteina ta znajduje się w swojej naturalnej (biologicznie aktywnej) konformacji. Takie przeciwciała mogą być zastosowane do detekcji lub oczyszczania rodzimego KGF.

Co więcej, analogi KGF mogą być wykorzystywane do odkrywania wysoce pokrewnych lub małopokrewnych cząsteczek wiążących KGF, mających zastosowanie terapeutyczne, przykładowo, jako środek do skutecznego dostarczania KGf lub jako inhibitor aktywności KGF. Termiczna stabilność analogów KGF jest ważna do zidentyfikowania takich molekuł wiążących w warunkach fizjologicznych (przykładowo w temperaturze 37°C) skoro ich zdolność do wiązania się z KGF może być silnie zależna od temperatury i może być nieprzewidywalnie odmienna od zdolności do wiązania się przejawianej w temperaturze 4°C.

Dla zastosowań in vivo, analogi KGF mogą być formułowane w kompozycje z różnymi dodatkami. Dodatki tego rodzaju obejmują bufory, nośniki, stabilizatory, obojętne środki dodatkowe (wypełniacze farmaceutyczne), środki konserwujące, środki regulujące toniczność, antyutleniacze i tym podobne (przykładowo związki regulujące lepkość lub rozcieńczalniki). Wybór tych specyficznych dodatków zależeć będzie od formy przechowywania (to znaczy postać ciekła lub liofilizowana) oraz od dróg podawania analogów KGF. Odpowiednie kompozycje, znane w stanie techniki, można znaleźć w REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES (ostatnie wydanie), Mack Publishing Company, Easton, PA.

Analogi KGF mogą być stosowane w celach terapeutycznych, w skutecznych ilościach do tkanek specyficznie cechujących się uszkodzeniem lub - klinicznie niewystarczającą ilością nie-fibroblastowych komórek nabłonkowych. Obszary, w których analogi KGF mogą być z powodzeniem podawane obejmują, lecz nie wyłącznie: stymulację, proliferację i różnicowanie struktur przydatkowych takich, jak torebki włosowe, gruczoły potowe, oraz gruczoły łojowe u pacjentów z poparzeniami oraz innymi częściowymi lub na całej grubości uszkodzeniami; przyspieszone odtwarzanie nabłonka podczas obrażeń spowodowanych przez epidermę naskórka bullosa, co jest defektem w przyleganiu naskórka do leżącej poniżej skóry, prowadzące do często otwartych, bolesnych pęcherzy, które mogą spowodować znaczną chorobliwość; zapobieganie wywołanemu przez chemoterapię łysieniu oraz leczenie typowej dla mężczyzn łysiny lub postępującej utraty włosów u mężczyzn i u kobiet, leczenie wrzodów żołądka oraz dwunastnicy; leczenie zapalnych chorób jelit takich jak choroba Crohna (wpływająca zasadniczo na jelito cienkie) oraz wrzodowy nieżyt kiszek (wpływający zasadniczo na jelito grube); zapobieganie lub zmniejszanie zatruć loszek podczas reżimu kuracji radiacyjnej lub chemoterapii do kuracji (przykładowo wstępna kuracja i/lub kuracja końcowa) w celu wywołania efektu chroniącego komórki (cytoochrona) lub ich regenerację lub oba efekty naraz; wywoływanie produkcji śluzu przez cały przewód gastryczno-wchłanialny; wywoływanie proliferacji oraz różnicowania rodzaju II komórek płucnych (pneumocyty), co może okazać się być pomocne w leczeniu lub zapobieganiu chorobom takim jak choroba membran ciała

184 188 szklistego (przykładowo syndrom niemowlęcej choroby oddechowej oraz oskrzelowo-płucna duszność (dysplazja) występująca u wcześniaków; przyspieszenie proliferacji i różnicowania nabłonka oskrzelowego i/lub pęcherzyków płucnych w ostrym lub chronicznym uszkodzeniu płuc lub jego niedoborem wywołanym przez uszkodzenia podczas inhalacji (włącznie ze zbyt wysokim stężeniem tlenu), rozedma płuc, stosowanie środków leczniczych chemicznych uszkadzaaiących płuca, uszkodzenia układu oddechowego lub inne uwarunkowania uszkadzające płuca; podwyższenie funkcja wątroby w celu leczenia lub zapobieganiu marskości żółtaczkowej, wybuchowego uszkodzenia wątroby, uszkodzenia wywołanego przez ostrą, wirusową żółtaczkę i/lub toksyczne obrażenia wątroby; wywołanie regeneracji komórek rogówki, przykładowo podczas leczenia uszkodzeń rogówki; wywołanie regeneracji komórek nabłonkowych w celu leczenia postępującej choroby dziąseł; wywołanie regeneracji bębenkowych komórek nabłonkowych podczas leczenia uszkodzenia bębenka usznego oraz leczenie lub zapobieganie rozpoczęciu cukrzycy lub jako środka pomocniczego przy przeprowadzaniu przeszczepu komórek wyspowatych (islet).

Pacjent, któremu potrzebna jest terapia powodująca proliferację niefibroblastowych komórek nabłonkowych będzie otrzymywać dawki skutecznych ilości analogu KGF. Jako „skuteczna ilość” należy rozumieć taką ilość analogu KGF jaka jest wymagana do uzyskania pożądanej odpowiedzi leczonego pacjenta i będzie zatem generalnie określona przez lekarza prowadzącego. Czynniki wpływające na ilość podawanego analoga KGF będą uwzględniały wiek i ogólny stan pacj enta, rodzaj leczonej choroby i tak dalej. Typowe dawki będą zawierać się w zakresie od 0.001 mg na kg masy ciała do 500 mg/kg masy ciała.

Analog KGF może być w bezpieczny sposób dozowany parenteralnie (przykładowo dożylnie - IV, dotkankowo - IT, domięśniowo - IM, podskórnie -SC lub dootrzewnowo - IP), doustnie lub zewnętrznie miejscowo ciepłokrwistym zwierzątom (takim jak ludzie). Analog KGF może być stosowany jednokrotnie lub może być podawanych w dawce wielokrotnej, zależnie od choroby i stanu pacjenta. W niektórych przypadkach analog KGF może być dawkowany jako środek pomocniczy przy innych terapiach oraz także wraz z innymi kompozycjami farmaceutycznymi.

Poniższe przykłady zamieszczono w celu pełniejszego zilustrowania analogów KGF stosowanych w sposobie według obecnego wynalazku. Zrozumiałejest, że mogąbyć poczynione modyfikacje w przedstawionych procedurach.

Standardowe metody występujące w wielu opisanych procedurach w poniższych przykładach, lub odpowiednie alternatywne procedury, są dostępne w szeroko znanych podręcznikach biologii molekularnej takich jak, przykładowo, Molecular Cloning (Klonowanie Molekularne), Second Edition, Sambrook i współpracownicy, Cold Spring Harbor Labboratory Press (1987) oraz Current Protocols in Molecular Biology (Obecne Metody w Molekularnej Biologii), Ausabel i współpracownicy, Green Publishing Associates/Wiley Interscience, New York (1990).

Przykład I. Przygotowanie DNA kodującego KGF oraz analogi KGF

Klonowanie genu ludzkiego KGF o pełnej długości (kodowanie polipeptydu o sekwencji z rodzimego KGF) przeprowadzono zarówno na drodze łańcuchowej reakcji polimeryzacji (PCR) RNA z komórek zwierzęcych, jak i na drodze PCR chemicznie zsyntetyzowanych (kodon zoptymalizowany dlajE coli) oligonukleotydów (związków „OLIGO”). Obie procedury zostały opisane poniżej:

Metodą PCR przeprowadzono powielanie (amplifikacja PCR) RNA wyizolowanego z komórek znanych z wytwarzania polipeptydu KGF. Na początku, komórki z ludzkiej linii komórek fibroblastowych AG1523A (otrzymanych z Human Genetic Mutant Celi Culture Repository Institute For Medical Research, Camden, New Jersey - Instytutu Badań Medycznych w Składnicy Ludzkich Genetycznie Zmienionych Mutantów Kultur Komórkowych) zostały rozerwane za pomocą tiocyjanianu guanidyny, a następnie poddano je ekstrakcji (zgodnie z metodą Chomyzinskiego i współpracowników (1987), Anal. Biochem. 172:156). Stosując standardowy protokół odwróconej transkryptazy dla całego RNA, wytworzono cDNA czynnika KGF. Amplifikację PCR (PCR#1) genu KGF przeprowadzono stosując cDNA czynnika KGF jako matrycę oraz primery OLIGO71 i OLIGO#2, kodujące sekwencje DNA w bezpośrednim sąsiedztwie końców 5' oraz 3' genu KGF [Model 9600 termocyklera (Perkin-Elmer Cetus,

184 188

Norwalk, CT); 28 cykli; każdy cykl składał się z jednej minuty w 94°C w celu denaturacji (rozdzielenia nici)Dwie minuty w 60°C dla splatania (annealingu) i następnie 3 minuty w 72°C dla syntezy (wydłużania - elongacji)]. Niewielkie próbki produktu z reakcji PCR#1 stosowano nαstąpnij jako matrycę do drugiej amplifikacji PCR (PCR#2) KGF, identycznej pod względem warunków poszczególnych cykli, z opisaną powyżej, z tym jedynie wyjątkiem, że temperatura splatania wynosiła 50°C. Dla ekspresyjnego klonowania genu KGF, zastosowano zagnieżdżone primery PCR do wytworzenia dogodnych miejsc restrykcyjnych na obu końcach genu KGF. Zastosowano związki OLIGO13 oraz OLIGO14 do zmodyfikowania produktu KGF DNA z reakcji PCR12 tak, aby obejmował miejsca restrykcyjne MluI oraz BamHI odpowiednio na końcach 5' oraz 3' genu [PCR#3; 30 cykli; każdy cykl składający się z jednej minuty w 94°C w celu denaturacjiDwie minuty w 60°C dla splatania oraz trzy minuty w 72°C dla elongacji]. To DNA było następnie rozcięte za pomocą MluI oraz BamHI, ekstrahowane fenolem i wytrącone etanolem. Następnie ponownie przeprowadzono je w zawiesinę oraz ligowano (stosując T4 ligazę) do plazmidu pCFM1156 (fig. 2A), który zawierał sekwencję sygnalną „RSH” aby wytworzyć konstrukt RSH-KGF (fig. 3).

Produkty ligacji transformowano (metodą Hanahan'a (1983), J. Mol. Biol., 166:557) do E. coli - szczepu FM5 (ATCC: 53911) oraz naniesiono na płytki LB+kanamycyna w temperaturze 28°C. Wybrano kilka transformantów i hodowano je w małych ciekłych kulturach zawierających 20 ftg/ml kanamycyny. Wyizolowano plazmid RSH-KGF z komórek każdej z hodowli i przeprowadzono sekwencjowanie DNA. Z powodu wewnętrznego miejsca Ndcl w genie KGF, nie było możliwe bezpośrednie klonowanie naturalnej sekwencji genu do pożądanego wektora ekspresji ze skrajnymi miejscami restrykcyjnymi Ndcl oraz BamHI. Osiągnięto to w trzystopniowej ligacj i. Plazmid RSH-KGF został rozcięty w swych unikalnych miejscach restrykcyjnych BsmI oraz Sstl i po zastosowaniu elektroforezy na 1% żelu agarozowym wyizolowano fragment DNA (obejmujący koniec 3' genu KGF) o ok. 3 kilopar zasad (kbp). Amplifikację PCR (PCR#4) przeprowadzono tak, jak to opisano dla PCR13 z tą jedynie różnicą, że podstawiono OLIGO#5 zamiast OLIGO#3. Otrzymany w wyniku PCR produkt DNA został następnie rozcięty za pomocą NdeI oraz BsmI i fragment DNA o 311 parach zasad (bp) został wyizolowany w wyniku elektroforezy na 4% żelu agarozowym. Trzecim elementem ligacji jest fragment DNA o 1.8 kbp, z plazmidu pCFM1156 rozciętego za pomocą NdeI oraz Sstl i wyizo- lowany w wyniku elektroforezy na 1%o żelu agarozowym. Po ligacji (T4 ligaza), tranformacji, selekcji przy użyciu kanamycyny i sekwencjonowaniu DNA, jak to zostało opisane powyżej, otrzymano klon zawierający konstrukt przedstawiony na rysunku fig. 4 oraz plazmid oznaczony KGF. Z powodu wewnętrznego iybozomowego miejsca wiążącego, które wytwarza obcięte produkty, sekwencja DNA czynnika KGF pomiędzy unikalnymi miejscami KpnI oraz EcoRI została zastąpiona przez chemicznie syntetyzowane związki OLIGO (OLIGO#6 do OLIGO# 11) w celu zminimalizowania wykorzystania tego wewnętrznego miejsca startowego fig. 5)

OLIGO# 1 (SEQ ID NO:7):

5'-C.AATGACCT.AGGAGTAACAATC'AAC-3'

OLIGO#2 (SEQ ID NO:8):

5'-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3'

OLIGO#3 (SEQ ID NO:9):

5'-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3'

OLIGO#4 (SEQ ID NO: 10):

5'-ACAGGATCCTATTAA

GTTATTGCCATAGGAA-3'

OLIGO#5 (SEQ ID NO: 11):

5'-ACACATATGTGCAATG

ACATGACTCCA-3'

OLIGO#6 (SEQ ID NO: 12):

5'-CTGCGTATCGACAAACGC

GGCAAAGTCAAGGGCACCC-3'

184 188

OLIGO#7 (SEQ ID NO: 13):

5'AAGAGATGyAAAAACAACTAC

AATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3'

OLIGO#8 (SEQ ID NO: 14):

5' -GCTGTTGGTATCG

TTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3'

OLIGO#9(SEQIDNO: 15):

5'-TCTTGG<GT(^(^(^(CTTG.ACTTTGCCGCGTTTGTCG

ATACGCAGGTAC3'

OLIGO#10 (SEQ ID NO:16):

5'-ACAGCAACAGTACGGAT

TTCCATAATATTG

TAGTTGnTTTCATC-3'OLIGO# 11 (SEQ ID NO: 17):

5' -AATTCAGAT

TCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3'. Związki OLIGO były fosforylowane za pomocą polinukleotydowej kinazy T4 i następnie denaturowane przez ogrzewanie. Jednoniciowe (ss) związki OLIGO były następnie pozostawione do utworzenia dwuniciowego (ds) fragmentu DNA przez pozwolenie temperaturze na powolne opadanie do temperatury pokojowej. Następnie zastosowano ligazę T4 do kowalentnego związania obu wewnętrznych lepkich końców związków OLIGO oraz całego dwuniciowego (ds) fragmentu OLIGO do plazmidu KGF rozciętego za pomocą KpnI oraz EcoRI. Nowy plazmid oznaczono jako KGF (dsd).

Kompletny gen KGF z kodonem zoptymalizowanym dla E. coli został skonstruowany za pomocą amplifikacji PCR chemicznie zsyntetyzowanych związków OLIGO od #12 do #24.

OLIGO# 12 (SEQ ID NO: 18):

5'AGTTTTGAT(CT^<^.AAG<^.AGG-3'

OLIGO# 13 (SEQ ID NO: 19):

5'-TCAAAACTGGATCCTATTj^.A-3'

OLIGO# 14(SEQ ID N0:20): 5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGA

ATAACATAAGTGCAACGACATG-ACTCCGGAACAGATGGCTACCA

ACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGTOLIGO# 15 (SEQ ID NO:21):

5'-CACACCCGTAGCT

ACGACTACATGGAA<TTTGGTGACATCCGT-GTTCGTCGTCTGTTCTTCCGTACCC

AGTGTTACCTGCTTATCGACAAA-3'

OLIGO# 16 (SEQ ID NO:22):

5'CGTGGTAAAGTT^AAGGTACCC

AGGAAATt^yAAAAACAACTACAACATC-ATGGAAATCCGTACTGrTGCTG

TTGGT,A^<^(^^r^^r^(^<^,AA^(^CAAA-3'

OLIGO# 17 (SEQ ID NO:23): 5'-GGTGTTGAATCTGAAT

TTCTACCTGGC

AATGAACAAAGAAGGTAAACT-GTACGCAAAAAAAGA

AT<^<^.^^<^^jA^<^2^<CT<^<^.^<CTTC.AAAGAA-3'

OLIGO# 18 (SEQ ID NO:24):

5'-CTGAT<^CT»^(^jAAA^(CC.ACTACAACACC

TACTCATCTGCTAAΛΪGGAC-CCACAACTGTTTTTAAATGTTC

TTTGCTCTGAACCAGAAATTT-3'

OLIGO# 19 (SEQ ID NO:25):

5'-ATCCCTTTTCTTT

TτTAAΛΛAAACCAAAAA.ATAACAGAAAACCTCTC-ACTTCCTGCCTATGTCA

ATCACTTAATATT

184 188

ATCCAGTTTTGA-3'

OLIGO#20 (SEQ ID NO:26): 5'-TA

CGGGTGTGACGTTCCGGG-3'

OLIGO#21 (SEQ ID NO:27):

5'-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3'

OLIGO#22 (SEQ ID NO:28):

5'-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3'

OLIGO#23 (SEQ ID NO:29):

5'-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-/'

OLIGO#24 (SEQ ID NO:30):

5'-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3'

Związki OLIGO #12 do 24 zostały zaprojektowane w taki sposób, że całkowita sekwencja DNA kodującego rodzimy KGF została przedstawiona przez związki OLIGO albo z nici „Watson” albo z nici „Craig”, a po amplifikacji PCR były zdolne do wytworzenia pożądanej dwuniciowej sekwencji DNA (fig. 6) [PCR#5, Model 9600 termocykler, Perkin-Elmer Cetus]; 21 cykli, każdy cykl składający się z 3’ sekund w 94°C do denaturacji, 31 sekund w 50°C do splatania oraz 31 sekund w 73°C do wydłużania; po 21 cyklach łańcuchową reakcję polimeryzacji zakończono prowadząc ostatni etap wydłużania przez 7 minut]. Po amplifikacji PCR, wytworzony fragment DNA został rozcięty za pomocą Xbal oraz BamHI i fragment o 521 bp ligowano do ekspresyjnego plazmidu pCFM’156 rozciętego za pomocą tych samych enzymów. W PCR#5 wykorzystano zewnętrzne primery (100 pinoH/OG pl rxn) OLIGO# ’2 oraz OLIGO# 13 oraz 1 pl/100 rxn matrycy KGF uzyskanej przez ligację (za pomocą, ligazy T4) związków OLIGO# 14 do OLIGO# ’9 (OLIGO# 15 do OLIGO# 18 były fosforylowane za pomocą kinazy polinekleotydowej T4) stosując związki OLIGO#20 do OLIGO4234 jako pasmo-wspomagające związki oligo (Jayaraman i współpracownicy (1992), Biotechniąues, 12:392) do ligacji. Ostateczny konstrukt oznaczono jako KGF (kodon zoptymalizowany).

Wszystkie analogi KGF opisane tutaj składają się częściowo z sekwencji DNA znalezionych w KGF (dsd) lub w KGF (kodon zoptymalizowany), lub z ich kombinacji. Sekwencje te są dalej modyfikowane poprzez wstawienie do odpowiednich miejsc restrykcyjnych sekwencji DNA kodujących aminokwasy szczególnego analoga KGF, zrealizowane przy wykorzystaniu jednej lub kilku wyżej opisanych technik syntezy fragmentów DNA. Dowolny z tych analogów może być w całości wytworzony wyżej wymienionymi technikami. Jednakże, zastosowano kodony zoptymalizowane dla £. coli, gdzie było to właściwe -jako część ogólnego projektu OLIGO, chociaż obecność kodonów zoptymalizowanych dla E. coli w części lub we wszystkich genach, gdzie było to badane nie spowodowała istotnego wzrostu wydajności protein, które mogły być otrzymane z wyhodowanych komórek bakterii. Na rysunkach fig. 7 do 24 oraz fig. 37 do 50 przedstawiono dogodne przykłady konstrkcji sekwencji nukleotydów i sekwencji aminokwasów poszczególnych analogów KGF:

CO^jS (fig. 7); AN3/C(15)S (fig. 8); AN3/C(15) - (fig. 9); AN8/C(15)S (fig. 10); AN8/C(15)-(fig. 11); ANI 5 (fig. 12); AN16(fig. 13); AN17(fig. 14); AN18ffig. 15); ADN19(fig. 16); AN20 (fig. 17); AN21 (fig. 18); AN22 (fig. 19); AN23 (fig. 20); AN24 (fig. 21); 0X15^(144^ (fig. 22); CG^S/R^^ (fig. 23); AN23/R(144)Q (fig. 24); C( 1,15,40)S (fig. 36); C(1,15,102^ (fig. 37); C(I,15,1G2,406)S (fig. 38); ΔN23/N(4/7)E (fig. 39); AN23/KG39)E (fig. 40); ΔN23/K(4/9)Q (fig. 41); AN23/R( 144)A (fig. 42); AN23/R(144)E (fig. 43); AN23/R(144)L (fig. 44); AN23'K(’47)E (fig. 45); AN23/'K(447)Q (fig. 46); AN23/K(153)E (fig. 47);AN23/K(153)Q (fig. 48);

oraz AN23/Q(152)EAK(153)E (fig. 49). Wszystkie opisane tu konstrukcje analogów KGF miały potwierdzoną sekwencję DNA.

Przykład II. Wytwarzanie w E. coli A.

Ekspresja analogów KGF

Trzy różne plazmidy ekspresji wykorzystano do klonowaniu genów analogów KGF. Były to: pCFM’156 (ATCC# 69702), pCFM’656 (ATCC# 69576) i pCFM3102 (odpowiednio

184 188 rysunki: fig. 2A, 2B i 2C). Plazmid p3102 można uzyskać z plazmidu pCFM1656 przez wykonanie serii zmian zasad w określonych miejscach metodą mutagenetycznej amplifikacji PRC zachodzących na siebie związków oligo. Wychodząc z miejsca .£Z1-II(odpowiodnio pCFM1656 - bp # 180) bezpośrednio 5' względem promotora replikacji plazmidu, PcopB, i postępując w kierunku genów replikacji plazmidu zmiany par zasad są następujące:

# paro zasad	para zasad	zmieniona para zasad
wpCFM1656	w DCFM1656	w pCFM3102
#204	T/A	C/G
#4128	A/T	G/C
#509	G/C	A/T
#617	- -	insert dwóch G/C bp
#^77	G/C	T/A
#^78	T/A	C/G
#992	G/C	A/T
# 1002	A/T	C/G
# 1005	C/G	T/A
# 1026	A/T	T/A
# 1045	C/G	T/A
# 1176	G/C	T/A
# 1464	G/C	T/A
#2026	G/C	usunięcie pary zasad
#2186	C/G	T/A
#24179	A/T	T/A
#2498-2501	AGTG	GTCA
	TCAC	CAGT
#2641-2647	TCCGAGC AGGCTCG	usunięcie pary zasad
#3441	G/C	A/T
#3452	G/C	A/T
#3649	A/T	T/A
#41556		insert par zasad

(SEQ ID NO:67) 5'- GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3' (SEQ ID NO:68) 3'- CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-5'

Jak widać z powyższego, pCFM1 156, pCFM1656 oraz pCFM3102 są do siebie bardzo podobne i zαwierαjąwiolo takich samych miejsc restrykcyjnych. Plazmidy te zostały wybrane dla wygody, a składniki wektora DNA można łatwo wymienić dla celów nowych konstruktów. Gospodarzem stosowanym do wszystkich klonowań był szczep E. coli FM5 (ATCC: 53911) i transformacje prowadzono metodą Hanahan’a (1983), (supra), bądź też metodą elektrowomywania z wykorzystaniem urządzenia do transfekcji Gene Pulser™ (BioRad Laboratories, Inc., Herc^es, CA), zgodnie z fabryczną instrukcją obsługi.

Na wstępie zapoczątkowano niewielką świeżą hodowlę materiału inokulacyjnego pożądanego klonu rekombinantu E. coli przechowuj ącego pożądany konstrukt na j ednym z trzech wektorów pCFM, poprzez przoniesienio 0,1 ml zamrożonej gliceryny z wyjściowym odpowiednim szczepem bakteryjnym do naczynia o pojemności 2 1, zawierającego 500 ml brzeczki Luria. Hodowlę wytrząsano przez 16 godzin w temperaturze 30°C, po czym hodowlę przonieiinno do naczynia fermentacyjnego o pojemności 15 1 zawierającego 8 1 wyjałowionej pożywki (Tsai, et al. (1987), J. IndustrialMicrobiol,\: 181-187).

Fermentację szarżową wsadu rozpoczęto wprowadzając pożywką Feed #1 (Tsai, et al. (1987), supra). Kiedy wskaźnik OD6OO osiągnął 35, indukowano ekspresję pożądanego analogu

184 188

KGF poprzez szybkie podniesienie temperatury hodowli do 37°C na dwie godziny, a następnie do temperatury 42°C powodując denaturację represora CI. Zaprzestano dodawania Feed 1 i rozpoczęto dodawanie pożywki Feed 2, z początkową szybkością dodawania 300 ml/godzinę. Pożywka Feed 2 składała się ze 175 g/l peptonu tryptykazy, 87,5 g/l ekstraktu drożdży oraz 260 g/l glukozy. Po upływie jednej godziny w temperaturze 42°C, temperaturę hodowli obniżono do 36°C i tę temperaturę utrzymywano przez następne 6 godzin.

Następnie fermentację zatrzymano i komórk i zebrano przez odwirowanie do plastikowych toreb umieszczonych w 1-litrowych butelkach wirówkowych.

Komórki pastylkowano przez odwirowanie z szybkością 400 obrotów na minutę w ciągu 60 minut, po czym ciecz znad osadu usuwano, a pastę komórkową oziębiono do temperatury -90° C.

Po ekspresji różnych analogów KGF w E. coli, rodzimy KGF i proteiny C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q AN15AN23 oraz AN23/R(144)Q oczyszczano stosując następującą procedurę. Pastę komórkową z fermentacji, o wysokiej gęstości komórkowej, rozpraszano w temperaturze 4 °C w 10-20% roztworze (masa na objętość) zawierającym 0,2 M NaCl i 20 mM NaPO4, o pH=7,5, stosując odpowiedni wysokotnący mikser. Następnie, komórki w stanie zawiesiny poddawano lizie przepuszczając roztwór trzykrotnie przez homogenizator (APV Gaulin, Inc., Everett, MA). Wypływający homogenat schładzano do temperatury 4-8°C stosując odpowiedni wymiennik ciepła. Odpady płuczkowe (Debris) usuwano przez odwirowanie lizatu w wirówce typu J-6B™ (Beckman Instruments, Inc., Brea, CA) wyposażonej w wirnik JS 4.2, stosując prędkość 4200 obrotów na minutę przez 30-60 minut, w temperaturze 4°C. Następnie roztwór znad osadu ostrożnie dekantowano i wprowadzano na uprzednio przygotowaną kolumnę o objętości 450 ml (5 cmx 23 cm), wypełnioną żywicą S-Sepharose Fast Flow™ (Pharmacia, Piscataway, NJ) doprowadzoną do stanu równowagi przy użyciu roztworu 0,2 M NaCl, 20 mM NPO4, o pH=7,5 w temperaturze 4°C. Następnie kolumnę przemywano roztworem 0,4 M NaCl, 20 mM NaPO4 o p.H=7,5 w temperaturze 4°C, o objętości równej pięciu objętościom kolumny (2250 ml). Pożądaną proteinę wymywano przemywając kolumnę 5 litrami roztworu zawierającego 0,5 M NaCl, i 20 ml NaPO4 o pH=7,5. Zbierano frakcje po 50 ml i kontrolowano w sposób ciągły wartość A280 w eluacie. Frakcje, zidentyfikowane dzięki A280 Jako zawierające wymywaną substancję były następnie analizowane metodą SPD-PAGE na 14% żelu w celu potwierdzenia obecności pożądanego polipeptydu.

Następnie frakcje zawierające oczekiwane proteiny połączono, a następnie dodano taką samą objętość wody destylowanej. Rozcieńczoną próbkę umieszczono następnie na uprzednio przygotowanej kolumnie S-Sepharose Fast Flow o objętości 450 ml (5 cm x 23 cm) zrównoważonej roztworem 0,4 M NaCl i 20 mM NPO4, o pH=6,8 w temperaturze 4°C. Kolumnę przemywano 2250 ml roztworu zawierającego 0,4 M NaCl, 20 mM NaPO4 o pH=6,8 i żądaną proteinę wymywano z kolumny przemywając ją używając objętości roztworu równej 20 objętościom kolumny o liniowym gradiencie stężenia od 0,4 M NaCl i 20 mM NaPO4 i pH=6,8 do 0,6 mM NaCl i 20 mM NaPO4 i pH=6,8. Ponownie zbierano frakcje po 50 ml monitorując w sposób ciągły wielkość A280 w płynie wypływającym z kolumny. Frakcje zawierające proteinę (oznaczoną metodą 14% SPD-PAGE) połączono, a następnie zatężono przepuszczając przez membranę YM-10 (odcinającą cząsteczki o ciężarze cząsteczkowym 10.000) w naczyniach do odwirowania o objętości 350 cm3 (Amicon, Inc. Mayberry, MA) do objętości 30-40 ml.

Koncentrat następnie wprowadzono na uprzednio przygotowaną kolumnę o objętości 1300 ml (4,4 cm x 85 cm) wypełnioną żywicą Superdex-75™ (Pharmacia) i zrównoważoną buforem kolumnowym zawierającym CIX PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, „D-PBS”, wolny od wapnia i magnezu) lub roztworem 0,15 M NaCl, 20 mM NPO4 o pH=7,0. Po umożliwieniu próbce wniknięcia do kolumny, proteinę wymywano z matrycy żelu filtracyjnego stosując bufor kolumnowy. Następnie odzyskiwano frakcje po 10 ml i frakcje zawierające pożądany analog

184 188 (oznaczony metodą 14% SPD-PAGE) połączono. Typowo, stężenie proteiny wynosiło około 5-10 mg/ml w połączonych frakcjach. Wszystkie powyższe operacje prowadzano w temperaturze 4-8 °C, o ile nie zostało to inaczej zaznaczone.

Alternatywny sposób oczyszczania zastosowano do oczyszczania rodzimego KGF, C(1,15)S oraz AN23. Procedura ta obejmuje następujące etapy i - o ile nie zostało to inaczej zaznaczone, wszystkie procedury, roztwory i substancje były realizowane w temperaturze 23±5°C.

Po zakończeniu etapu wytwarzania w procesie fermentacji bakteryjnej, hodowlę komórkową ochłodzono do temperatury 4-8°C i komórki zebrano przez odwirowanie lub inną, podobną, metodą. Na podstawie spodziewanej wydajności proteiny w przeliczeniu na jednostkę masy pasty komórkowej oraz potrzebnej ilości oczyszczonej proteiny, odpowiednią ilość pasty komórkowej, określoną wagowo, przeprowadzono w stan zawiesiny w roztworze buforowym zawierającym 20 mM NaPO4,0,2 M NaCl o pH=7,5, w ilości wagowo około pięciokrotnie większej niż masa pasty komórkowej przewidzianej do przeprowadzenia w stan zwiesiny. Komórki zdyspergowano do uzyskania homogennego roztworu, przy użyciu wysokotnącego miksera. Podczas homogenizacji temperaturę pasty komórkowej utrzymywano w przedziale 4-8°C.

Następnie komórki poddano lizie przez działanie ciśnienia, przykładowo przez dwukrotne przepuszczenie pasty komórkowej przez naczynie homogenizujące o odpowiednich wymiarach. Homogenat przechowywano w postaci schłodzonej do temperatury 5±3°C. W celu sklarowania lizatu komórkowego zastosowano uprzednio przygotowaną obudowę filtru głębokościowego (depth filter housing - Cuno, Inc., Meriden, CT) wyposażoną w filtr posiadający odpowiednią wielkość powierzchni filtrującejDoprowadzony do stanu równowagi przy zastosowaniu odpowiedniej objętości roztworu 0,2 M NaCl 20 mM NaPO4, o pH=7,5. Tak równoważenie, jak i klarowanie prowadzono w temperaturze 5±3°C. Przed procesem klarowania stosowano odpowiednią ilość pomocniczego materiału filtrującego do wstępnego pokrycia filtru i dokładnego wymieszania z lizatem komórkowym, po czym lizat klarowano przez przepuszczenie roztworu przez urządzenie filtrujące. Filtr przemywano roztworem 0,2 M NaCl i 20 mM NaPO4 o pH=7,5. Przesącz oraz późniejszy roztwór pochodzący z przemycia zebrano w chłodzonym zbiorniku o odpowiedniej objętości i wszystkie operacje przeprowadzono w temperaturze poniżej 10°C.

Po sklarowaniu lizat przepuszczono przez uprzednio przygotowaną kolumnę S-Sepharose Fast Flow zawierającą przynajmniej 1 ml żywicy na 2 g pasty komórkowej. Kolumnę S-Sepharose Fast Flow zrównoważono zimnym (5±3°C) roztworem 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO4 o pH=7,5. Kolumnę utrzymywano w temperaturze poniżej 10°C. Sklarowany li:zat (5±3°C) wprowadzono następnie na kolumnę jonowymienną, i w sposób ciągły monitorowano absorbancję eluatu przy 280 nm (A2₈q). Po załadowaniu próbki kolumnę przemywano zimnym roztworem 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO4 o pH=7,5, a następnie przemywano roztworem 0,3 M NaCl, 20 mM NaPO4 o pH=7,5 w temperaturze 23±5 °C.

W celu wymywania pożądanej proteiny stosowano roztwory o liniowym gradiencie stężeń w granicach od 0,2 do 1 M NaCl, 20 mM NaPO4 o pH=7,5. Produkt zbierano w kilku frakcjach na podstawie wielkości A2₈₍₎ eluatu. Frakcje te po zebraniu połączono i zanotowano objętość.

W celu utlenienia wolnych grup sulfhydrylowych przeprowadzono operację utleniania. W przypadku protein ze zmienionym układem reszt cysternowych - w porównaniu z rodzimym KGF, środek utleniający (przykładowo dwuchlorowodorek cystaminy lub inny odpowiedni środek utleniający, przykładowo cystynę, utleniony glutation lub dwuwartościowąmiedź) dodawano w takiej ilości, aby końcowe stężenie wynosiło 1 -20 mM, a pH doprowadzono do wartości 7-9,5, przy czym w przypadku zastosowania dwuchlorowodorku cystaminy korzystna wartość pH wynosiła 9,0±0,3. Utlenianie prowadzono w temperaturze 10-30°C przez odpowiedni okres czasu. W przypadku rodzimej proteiny KGF utlenianie realizowano przez dodanie odpowiedniej ilości

184 188 (NH4)2SO4, przykładowo 1-2 M (NH4)-SO4Doprowjdzając pH roztworu do wartości 7,5±0,5 i utrzymując temperaturę w przedziale 23±5 °C przez odpowiedni okres czasu.

Po utlenieniu pH roztworu doprowadzono do wartości 6,5-9,5. Jeśli to było konieczne dodawano do roztworu stały (NH4)2SO4, aż do osiągnięcia końcowego stężenia równego 2 M. W celu usunięcia nierozpuszczalnych części stałych roztwór przepuszczono przez odpowiednie filtry klarujące.

Następnie przesączony, utleniony produkt poddawano chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC). Matrycą HIC była żywica o nazwie Butyl-650M Toyopearl™ (Tosohaas, Inc., Montgomeryville, PA). Zawierający proteinę roztwór wprowadzono na kolumnę chromatograficzną, którą uprzednio zrównoważono przy użyciu roztworu 2 M (NH4)2SO4,0,15 M NaCl, 20 mM NaPO4, o pH=7,0. Po umieszczeniu próbki kolumnę przemywano roztworem 2 M (NfRRSCty, 0,15 NaCl i 20 mM NaPO4 o pH==7,0. Następnie pożądaną proteinę eluowano przy użyciu roztworu o zmniejszającym się liniowo gradiencie stężenia (NH4)2SO4 w przedziale od 2 do 0 M, rozwiniętym w roztworze 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO4, o pH=7,0. Kiedy rozpoczęło się wymywanie pożądanej proteiny, na co wskazywał wzrost A^ eluatu, frakcje zbierano. Próbkę każdej frakcji poddano następnie analizie metodą SDS-PAGE. Frakcje zawierające pożądaną proteinę połączonoDokładnie wymieszano i oznaczono objętości połączonych frakcji oraz stężenie proteiny.

Następnie połączony, zawierający proteinę, eluat z chromatografii HIC zatężono i wymieniono bufor wymywający. Typowo, proteiny zależano do stężenia 5,0-10,0 mg/ml. Ultrafiltrację przeprowadzano przy użyciu urządzenia do ultrafiltracji wyposażonego w system kaset PTGC Pellicon™ (Millipore, Inc., Bedford, MA), z odpowiednio dobraną membraną odcinającą.

Po zatężeniu próbkę poddawano diafiltracji względem odpowiedniego buforu. Zatężony roztwór z etapu zatężania poddawano diafiltracji względem roztworu 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO4, o pH--'7,0 do momentu, gdy przewodnictwo diafiltrowanego roztworu mieściło się w zakresie do 5% od wartości przewodnictwa roztworu 0,15 M NaCl, 20 mM NPO4, o pH=7,0.

Dodatkowo, w celu usunięcia osadów oraz endotoksyn pochodzenia bakteryjnego, które mogą być obecne, zatężoną i diafiltrowaną próbkę zawierającą pożądaną proteinę przepuszczono przez filtr 0,1 pm Posidyne™ (Pali, Inc., Cortland, NY). Po określeniu stężenia proteiny w roztworze i na podstawie pożądanego stężenia końcowego produktu, oczyszczony jak wyżej roztwór rozcieńczono roztworem zawierającym 0,15 M NaCl, 20 mM fosforanu sodu, o pH=7,0 do pożądanego stężenia końcowego. Następnie przeprowadzono końcowe, aseptyczne sączenie przez filtr 0,22 pm, przy przenoszeniu produktu końcowego do pojemników wolnych od pyrogenów w celu przechowywania (w temperaturze około 5°C) do późniejszego wykorzystania przy wytwarzaniu różnych form galenicznych.

B. Analiza

Analizie poddano rodzimy KGF; C(1,15)S; C(1,15)S/R(144)Q; AN15;

AN23 oraz AN23/R( 144)Q, wytworzone w komórkach E. coli.

Stabilność konformacyjna

Polipeptydy były porównywane pod względem ich trwałości w czasie przechowywania, temperatury przejścia do formy rozdzielonej (rozplecionej) (Tm) oraz trwałości w szerokim zakresie pH.

Trwałość w czasie przechowywania

Na rysunku fig. 25 przedstawiono porównanie rodzimego KGF i C(1,15)S po przechowywaniu w roztworze 20 mM NPO4, 0,15 M NaCl o pH=7,0, w temperaturze 37°C przez 27 godzin. C(1,15)S wykazuje znacząco większą ilość rozpuszczalnej proteiny w porównaniu z rodzimym KGF.

184 188

Na rysunku fig. 26 przedstawiono porównanie trwałości rodzimego KGFAN15 (dane nieuwidocznione) i C( 1,15)S w PB S oraz w roztworze 50 mM NaPO₄,0,15 M NaCl o pH=7,0 po przechowywaniu w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Odzyskiwanie rozpuszczonej proteiny jest znacząco większe w stężonym roztworze fosforanu aniżeli w PBS. AN 15, jak również C( 1,15)S wykazują znaczący wzrost trwałości w porównaniu z rodzimym KGF. AN15 oraz C(1, 15)S również wykazują około stuprocentowe odzyskania w stężonym roztworze zawierającym fosforany, tak jak tego oczekiwano na podstawie wyników dla rodzimego KGF.

Jednakże, pojedyncze wstępne badanie porównawcze trwałości przy przechowywaniu pomiędzy C( 1,15,40)S i C(40)S (który jest kodowany zasadami od 201 do 684 w SEQ ID NO:1, z tym jedynie wyjątkiem, że Ser⁴⁰ jest kodowana przez AGA), oraz pomiędzy C(1,15,102) i C(102)S (który jest kodowany zasadami od 201 do 684 w SEQ ID NO:1, z tym jedynie wyjątkiem, że Ser™² jest kodowana przez AGG). Rezultaty (nie pokazane) wskazująna obniżoną trwałość (to znaczy: mniej rozpuszczalnej proteiny po przechowywaniu w temperaturze 37°C). Jednakże, ilość rozpuszczalnej, prawidłowo sfałdowanej proteiny C(1,15,40)S, która została oczyszczona z pożywki hodowlanej była większa niż ilość proteiny C(40)S, co sugeruje, że analog C(1,15,40)S może być w rzeczywistości bardziej trwałe, z także wyniki powyższego badania porównawczego nie są rozstrzygające. Niniejszy wynalazek korzystnie obejmuje analog KGF zawierający inne podstawnienia niż przy Cys40, Cys¹02, Cys™⁶ i bardziej korzystnie nie obejmuje C(1,15,40)S, C(1,15,102)S oraz C(1,15,40,102,106)S.

Przebadano również zdolność rodzimego KGF, C(1,15)SAN23, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q i AN23/R(144)Q do zapobiegania agregacji w podwyższonych temperaturach. Przygotowano próbki zawierające 0,5 mg/ml proteiny w D-PBS. Po 0,5 ml z każdej próbki pobrano do szklanych fiołek o objętości 3 cm typu 1. Fiolki zamknięto gumowymi korkami i dodatkowo nałożono 13 mm zaciski aluminiowe. Następnie fiolki te umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37°C. W uprzednio ustalonych odstępach czasu fiolki otwierano i analizowano pod kątem ubytku rozpuszczalnej proteiny. Zauważalne osady usuwano przez odwirowanie 250 pl każdej próbki w jednostce filtrującej 0,22 pm Spin-X™ (Costar, Cambridge, MA). Rozpuszalną proteinę zawartą w przesączu poddano następnie analizie metodą wykluczającej pod względem wymiarów wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Ilość rozpuszczalnej proteiny określano przez całkowanie powierzchni pod pikiem chromatograficznym (HPLC), a wyniki dla KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E i C(1,15)S/R(144)Q przedstawiano jako wykres w funkcji czasu inkubacji w temperaturze 37 °C (danych AN23 i AN23/R(144)Q nijuwidoczniono),. Wyniki przedstawiono na rysunku fig. 27.

Następnie wyznaczono półokres zaniku rozpuszczalnej monomerycznej proteiny z tych krzywych kinetycznych. W tabeli 1 przedstawiono czas połowicznego zaniku pozostałego w roztworze rozpuszczalnego KGF podczas przechowywania powyższych w temperaturze 37°C.

Tabela 1

Czas połowicznego zaniku rozpuszczalnej monomerycznej proteiny

Proteina	11/2 (dni)
rodzimy KGF	0,6
AN23	1,1
C (1,15)S	1,2
C(1,15)S/R(144)Q	13,3
AN23./R(144)Q	22,3
C(1,15)S/R(144)E	38,0

184 188

Jak widać z powyższej tabeli 1 oraz z rysunku fig. 27 najszybciej ulega agregacji rodzimy KGF, z okresem półtrwania rozpuszczalnej formy równym 0,6 doby. C(1,15)S/R(144)Q AN23/R(144)Q oraz C(1,15)S/R(144)Q wykazują znaczący wzrost okresu półtrwania rozpuszczalnych monomerów odpowiednio do 13,3, 22,3 oraz 38 dni.

Rozdzielanie (rozplatanie) termiczne

Rozdzielanie (rozplatanie) termiczne monitorowano metodą dichroizmu kołowego (CD) przy 230 nm stosując spektropolarymetr J-720™ (Jasco, Inc., Easton, MD), wyposażony w system kontroli temperatury typu PTC-343 Peltier. Dla potrzeb analizy CD przygotowano odrębne próbki zawierające 0,1 mg/ml polipeptydu przeznaczonego do analizy w D-PBS (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). Około 2,5 ml każdej próbki umieszczano w prosto- kątnym, wykonanym z kwarcu Supraśli™ (Heraeus OaTzschmelze, Gmbh, Hanau, Germany), naczynku fluorescencyjnym (Heima Cells, lnc., Jamaica, NY), o długości drogi optycznej równej 10 mm. Naczynko umieszczano następnie w układzie kontroli temperatury typu Peltier, w spektropolary metrze. Rozdzielanie (rozplatanie) termiczne prowadzono przy szybkości zmian temperatury 50°C /godzinę. Zmiany w eliptyczności monitorowano przy 230 nm w celu wykrycia rozdzielania (rozplatania). Temperaturę Tm dla każdej próbki wyznaczano na podstawie określenia temperatury, przy której 50% cząsteczek proteiny zawartej w roztworze było w postaci rozdzielonej (rozplecionej) (Biophysical Chemistry, Cantor and Schimmel (eds), W.H. Freeman and Co. San Francisco (1980). W tabeli 2 zestawiono szacunkowe temperatury T_m dla każdej z trzech protein.

Tabela 2

Szacunkowe temperatury „topnienia”

Proteina	Tm(°C)
rodzimy KGF	54,0
ADN15	55,0
C(1,15)S	55,0
AN23	56,0
C(1,15)S/R(144)Q	62,5
AN23/^/R(144)Q	63,0
C(1,15)S/R(144)E	63,5

Jak wynika z powyższych rezultatów C(1,15)S i DN15 wykazują wzrost temperatury T_m, o 1°C w porównaniu z naturalnym KGF. Dla DN23 temperatura Tm wzrasta o dodatkowyjeden stopień. Jednakże podstawienie R144Q do C(1,15)S/R(144)Q lub DN23 zwiększa o więcej niż 6°C temperaturę Tm i więcej niż o 7°C w porównaniu z rodzimym KGF. Ponadto, C(1,15)S/R( 144)E jest o więcej niż 9 °C bardziej trwały w porównaniu z rodzimym KGF.

Kwasowość, pH

Porównywano także stabilność kwasową C(1,15)S/R(144)Q oraz C(1,15)S/R(144)E w porównaniu z rodzimym KGFDoprowadzając D-PBS do różnych wartości pH przez dodawanie stężonego HCl lub NaOH. W kwarcowym naczynku mieszano około 2,35 ml D-PBS o różnych wartościach pH ze 100 μΐ rozwtoru proteiny KGF o stężeniu 2,45 mg/ml. Próbki te termicznie rozfałdowywano z szybkością 50°C/godzinę i monitorowano techniką dichroizmu kołowego (CD) przy 230 nm. Na rysunku fig. 28 przedstawiono zależność temperatury Tm, od pH dla rodzimego KGF, C(1,15)S/R(144)Q oraz C(1,15)S/R(144)E. W badanym obszarze pH C(1,15)S/R(144)Q oraz C(1,15)S/R(144)E zawsze wykazywały wyższą temperaturę Tm niż KGF.

184 188

Aktywność biologiczna in vitro

Aktywność mitogeniczną in vitro protein C(1,15)SAN 15AN23/R( 144)Q, C( 1,15) S/R( 144)Q oraz C(1,15)S/R(144)S oznaczono także w funkcji stężenia proteiny oraz stężeń półmaksymalnych przez pomiar wychwytu [³HJ-tymidyny przez komórki Balb/MK (według metod Rubiny al. (1989), supra). Zasadniczo stężenia każdego z analogów KGF w porównaniu ze znanym standardowym rodzimym KGF oznaczano stosując próbę biologiczną in vitro. Następnie, każdy analog KGF rozcieńczano i badano na aktywność biologiczną stosując próbę mitogenicznąBalb/MK. Próbki na wstępie rozcieńczono w pożywce do bioprób składającej się z 50% Eagle's MEM (przyrządzonej przez użytkownika), 50% F12 (przyrządzonej przez użytkownika), 5 pg/ml transferryny, 5 pg/ml seleninu sodu, 0,0005% HSAi 0,005% Tween 20. Następnie, próbki KGF naniesiono na płytki Falcon Primeria o 96 zagłębieniach, na których zaszczepiono komórki Balb/MK. Mierzono przyłączanie [3HJ-tymidyny podczas syntezy DNA i przeliczono na wejściowe stężenie rodzimego KGF przez porównanie z krzywą standardową rodzimego KGF. Wyniki zaprezentowano na rysunkach fig. 29-34. Jak widać z tych rysunków badane analogi KGF opisane na rysunkach fig. 28-33 mają aktywność porównywalną z rodzimym KGF.

Przykład III. Wytwarzanie w hodowli komórkowej przy użyciu komórek z organizmu ssaka

Przykład niniejszy opisuje ekspresję, wyodrębnienie i charakteryzowanie dwóch aktywnych biologicznie form rekombinacyjnych KGF (rKGF) wytworzonych w układzie ekspresji pochodzącym z organizmu ssaków.

Gen ludzkiego KGF wyodrębniono przez amplifikację PCR cDNA otrzymanego z normalnych komórek fibroblastowych pochodzących z ludzkiej skóry (Clonetec, Inc., San Diego, CA). Po otrzymaniu cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy zastosowano metodę PCR do amplifikacji genu KGF. Związków OLIGO#25 i OLIGO#26 użyto do amplifikacji genu z cDNA, a OLIGO#27 oraz OLIGO#28 użyto do umieszczenia miej sc restrykcyjnych Hind1 III i Bg1 II na końcach tego fragmentu przez drugą amplifikację PCR, jak podano na rysunku fig.1A i 1B.

OLIGO#25 (SEQ ID NO:69): 5'-CAATCTACAATTCACAGA-3'

OLIGO #26 (SEQ ID N0:70): 5'-TTAAGTTATTGCCATAGG-3'

OLIGO #27 (SEQ ID NO:71):

5'-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3'

OLIGO #28 (SEQ ID NO:72):

5'-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3'

Po klonowaniu i potwierdzeniu sekwencji DNA, użyto następnie DNA genu KGF. Amplifikację zrealizowano stosując związki OLIGO#29 oraz

OLIGO#30.

OLIGO #29 (SEQ ID NO:73):

5'-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG-3'

OLIGO #30 (SEQ ID NO:74) 5^,-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3'

Primer sensowny, OLIGO#29, obejmował miejsce Xbal i konsensusową sekwencję translacji Kozaka (5'-CCACC-3/) w górę względem kodonu startowego - ATG. Primer antysensowny - OLIGO#30, obejmował miejsce klonowania Sali i dodatkowy stop-kodon. Po 18 cyklach amplifikacji PCR (denaturacja przez 30 sekund w temperaturze 94°C, splatanie annealing, przez 40 sekund w temperaturze 55°C oraz wydłużanie przez 40 sekund w temperaturze 72°C) produkt wytrawiono Xbal oraz Sali i poddano ligacji z podobnie wytra- wionym DNA z pDSRa2 (zgodnie z metodą: Bourdrel i wsp. al. (1993), Protein Exp. & Purif., 4:130-140 orazLui wsp. (1992), Arch. Biochem. Biophys, 298:150-158). Otrzymano plazmid KGjF/pDSR(c2, w którym ten ludzki gen KGF znajdował się między sekwencjami wczesnego promotora SV40 i poliadenylacji α-FSH. Wybrano dwa klony i analiza sekwencyjna DNA potwierdziła skonstruowanie pożądanego wektora.

18*4188

Następnie dwa mikrogramy DNA KGF/pDSRa2 poddano linearyzacji przy użyciu Pvul Komórki jajnikowe chomika chińskiego (CHO) zaszczepione dzień wcześniej w ilości 0,8 x K)6 komórek/60 mm płaskie naczynie do hodowli, transfekowano poddanym takiej obróbce DNA stosując standardowy sposób wytrącania osadu fosforanu wapnia (Bourdrel et al., supra). Dwa tygodnie później wybrano pojedyncze kolonie i przeniesionoje na płytki z 24 zagłębieniami. Kondycjonowane pożywki uznano za pozbawione surowicy, kiedy komórki uzyskały płynność i pobrane z nich próbki analizowano metodą „Western blotting” stosując poliklonalną surowicę odpornościową z królika reaktywną względem ludzkiego KGF uzyskanego metodą ekspresji w E. coli.

Próby typu Western blotting wykonano przez przepuszczenie próbek przez 12,5% (wagowo/objętościowe) żele poliakrylamidowe SDS, a następnie elektroblotting w ciągu 1 godziny pirzy 400 mA na membranach niirocelulozowyc ci pirzy użyć i u przyrządu do pcó-suchego przenoszenia (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Roztwór 20 mM Tris, 150 mM glicyny oraz 20% metanolu służył jako bufor przenoszenia. Arkusze nitrocelulozy zablokowano przez inkubację przy użyciu 10% normalnej surowicy kozy w PBS. Króliczą surowicę odpornościową reaktywną wobec KGF uzyskanego metodą ekspresji w E. coli użyto jako pierwotne przeciwciało. W celu zastosowania rozcieńczono ją stosunku 1/10.000 w 1% normalnej surowicy koziej w PBS i inkubowano z zablokowanymi akruszami nitrocelulozowymi przez 12 godzin w temperaturze pokoj owej, po czym nadmiar przeciwciała usunięto w wyniku trzykrotnego, po 30 minut, przemywania w PBS. Nitrocelulozowe membrany następnie inkubowano w 100 ml roztworu 1% normalnej surowicy koziej w PBS z dodatkiem Veltastin™- biotynylowaną kozią IgG przeciwkróliczą (przeciwciało wtórne, Vector Labs, Burlingame, CA) w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym, 10-minutowym przemywaniu w PBS przeprowadzono 30 minutową inki^u^aicję w temperaturze pokojowej w 100 ml roztworu 1% normalnej surowicy koziej zawierającym streptawidynę i biotynylowaną peroksydazę, przygotowaną zgodnie z zaleceniami producenta (Vector Labs). Następnie przemyto trzykrotnie w PBS i materiał krzyżowo-reaktywnego KGF wizualizowano przez inkubowanie w mieszaninie 60 pi 30% (wagowo/objętościowych) H2O2 w 100 ml PBS i 50 mg

4-chloronaftolu w 20 ml metanolu. Reakcję przerwano po upływie 10 minut przez płukanie w wodzie.

Analiza biotów ujawniła, KGF-specyficzne przeciwciało uległo zasocjowaniu z trzema oddzielnymi pasmami protein - z których dwa były ściśle pokrewne, o ciężarach cząsteczkowych około 25-29 kDa, a jedno miało szacunkowy ciężar cząsteczkowy około 17 kDa - w porównaniu ze spodziewanym ciężarem cząsteczkowym około 18,8 dla dojrzałej proteiny o 163 aminokwasach. Dodatkowo wybrano kilka wysoko-ekspresyjnych klonów wydzielających więcej niż 2,0 mg rKGF na litr, jak to oceniono na podstawie analizy Western, wybrano i namnożono do butelek w kształcie walca (zgodnie z metodą podaną przez Lu i wsp.,supra), by wytworzyć duże objętości wolnej od surowicy kondycjonowanej pożywki do oczyszczania KGF metodą chromatografii kationowymiennej i przez filtrację żelową, jak podano niżej.

KGF z 3 litrów wolnego od surowicy kondycjonowanego medium oczyszczono wprowadzając pożywkę bezpośrednio na kolumnę kationowymienną (5 x 24 cm) wypełnioną 450 ml sulfoetylu kolumnę S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) uprzednio kondycjonowaną roztworem 20 mM fosforanu sodu, o pH=7,5. Po przemyciu pięcioma objętościami kolumny rroztworu 20 mM fosforanu sodu, 0,2 M NaCl o pH=7,5, rKGF eluowano stosując 20-krotną objętość kolumny roztworu o zmieniającym się liniowo gradiencie stężenia NaCl od 0,2 do 1,0 M w 20 mM fosforanu sodu, o pH =7,5. Zbierano 50 ml frakcje przy ciągłym monitorowaniu A280. Obecność proteiny KGF stwierdzono poddając próbkę z każdej frakcji analizie metodą SDS-PAGE. Analizę SDS-PAGE prowadzono metodą elektroforezy (Novex, San Diego, CA) przy użyciu wstępnie przygotowanego żelu 14% trójghcyny (zgodnie z metodą Laemmli (1970) Nature, 227:680-685). Próbki mieszano z nie-redukującym buforem SDS bez ogrzewania przed załadowaniem. Obecność protein stwierdzono przez barwienie błękitem Coomassie lub srebrem.

184 188

Obserwowano dwa późno wymywane piki zawierające pasma proteinowe odpowiadające pasmom 25-29 kDs i 17 kDa wykrytym w próbach Western błot. Frakcje zawierające każdy z tych pików oddzielnie zatężono do objętości mniejszej niż 1,0 ml i poddano filtracji żelowej.

Przy filtracji żelowej wykorzystywano kolumny wypełnione żywicą (HR

10/30, Pharmacia) wstępnie równoważone za pomocą PBS o pH=7,2 i kalibrowane następującymi znanymi standardami ciężaru cząsteczkowego (BioRad, San Francisco, CA): tyroglobulina (670 kDa), g-globulina (158 kDa), owalbumina (44 kDa), mioglobina (17 kDa) oraz witamina B-12 (1,4 kDa). Powyższe etapy oczyszczania dały w efekcie około 2000-krotne oczyszczenie rKGF, zawieraj ący w szczególności materiał o 17 kDa oraz 30 kDa, jak to oceniono przez barwienie srebrem.

W przypadku materiału o wyższym ciężarze cząsteczkowym, rKGF eluowano jako główny symetryczny pik (wykrywany przez A^), który nazwano KGF-a. Na podstawie analizy SDS-PAGE mniejszej ilości tego materiału - 3 pg/pasek wobec 6 pg/ pasek, rozdzielono dwa pasma o różnicy ciężaru cząsteczkowego mniejszej niż 1-2 kDa. W przypadku substancji o niższym ciężarze cząsteczkowym, zwanej KGF-b, filtracja żelowa dała preaparat proteinowy o spodziewanej ruchliwości. Dla obu materiałów (KGF-a i KGF-b) całkowita wydajność po oczyszczaniu wyniosła około 30-40%.

Analizowano również sekwencje aminokwasów KGF-a i KGF-b. Analizy te przeprowadzano na przyrządzie do automatycznego sekwencj onowania (Model 477A lub 470A, Applied Biosystem, Inc., Foster City, CA) wyposażonym w analizator aminokwasów PTH Model 120A do analizy on-line oraz układ zbierania danych Model 900A (zgodnie ze sposobem podanym przez Lu i wsp. (1991), J. Biol. Chem., 266:8102-81071 Analiza sekwencji KGF-a metodą Edmana ujawniła główną sekwencję N-końnowąX₁-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-X--X3-S[SEQ ID NO:75]. Mniejsza sekwencja rozpoczynająca się od trzeciego N-końcowego aminokwasu, kwasu asparaginowego, była również obecna w 1,6% całości proteiny poddanej sekwencjonowaniu. X_b X2 oraz Χ3 nie zostały zidentyfikowane wskutek braku sygnałów aminokwasu fenylotiohydantoinylu (PHT) podczas analizy sekwencyjnej. N-końcowa sekwencja aminokwasowa KGF przewidziana na podstawie sekwencji cDNA wskazuje, że Xj oraz Χ3 są resztami Cys a X2 jest asparaginą. Nieobecność Χ1 oraz Χ3 wskazuje, że te dwie cysteiny mogą tworzyć mostki dwusiarczkowe. Na podstawie N-przy łączonej konsensusowej sekwencji glikolizowania Asn-X-Ser nieobecność przewidzianej reszty Asn odpowiadającej X2 wskazuje, że jest to potencjalne miejsce N-glikozylowania.

Ciekawe, że analiza sekwencyjna N-końca KGF-b ujawniła N-końcową sekwencję aminokwasów S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-Y- (SEQ ID NO:76) co wskazuje, że jest to N-końcowo obcięta forma KGF proteolitycznie odcięta przy wiązaniu peptydowym Arg^Ser*¹.

W celu dalszego charakteryzowania oczyszczonego KGF-a oraz KGF-b proteinę poddano działaniu glikozydaz (neuramidazy, O-glikanaza, i/lub N-glikanaza) stosując znane techniki (Sasaki i wsp. (1987), J. Biol. Chem., 262:12059-12076); Takeuchi i wsp. (1988), J. Biol. Chem., 263:3657-3663:

Zsebo i wsp. (1990), Celi, 62j.l95-201). Tak uzyskane dane wskazują, że KGF-a zawiera węglowodany związane przez azot N- lub tlen O-, chociaż forma KGF-a o niższej masie cząsteczkowej prawdopodobnie zawiera tylko N-połączony cukier. Poddanie działaniu glikozydaz nie spowodowało zmniejszenia ciężaru cząsteczkowego KGF-b wskazując, że jego cząsteczka nie jest glikozylowana.

Schemat glikozylowania KGF-a badano dalej metodą spektroskopii masowej peptydów wytworzonych przez endoproteinazę Glu-C, jak to opisano powyżej. Wyjaśnienie struktury węglowodanowej glikopeptydów metodą stopniowego ujścia masowej analizy spektrometry cznej okazało się skuteczne w stosunku do innych protein (Huddleston i wsp. (1993), Anal Chem, 65:877-884; Carr i wsp. (1993), Prot.Sci., 2:183-196). Jak to potwierdzono przez wyodrębnienie nieglikozylowanego peptydu, reszta Thr— zdaje się być częściowo glikozylowana. Podobna analiza metodą spektrometrii masowej Asn¹4 zasugerowała

184 188 mikroheterogeniczność w glikozylowaniu strukturami dwu-, trzy- i cztero- „czułkowymi” o zmiennych stopniach sialilowania.

W tabeli 3A przedstawiono stężenia KGF do stymulowania włączenia [³H]-tymidyny przez keratynocyty w półmaksymalnym stopniu (zgodnie z metodą podaną przez Rubin i wsp. (1989), Supra). Oddziaływanie z receptorem KGF badano stosując preparaty błony receptora KGF przygotowane z naskórkowych keratynocytów myszy Balb/MK (zgodnie z procedurą opisaną przez Massague (1983), J. Biol. Chem., 258.13614-13620). Bardziej szczegółowo, różne postaci KGF rozcieńczono buforem 50 mM Tris-HCl, pH=7,5, zawierającym 0,2% albuminy z surowicy bydlęcej, uzyskując stężenia w zakresie od 0,8 ng do 100 ng w 50 pl. Były one osobno inkubowane z preparatem błonowym (75 ng/ml) i KGF znaczonym ” 25 j otrzymanym w drodze ekspresji w E. coli (1,5 ng). Doświadczenia w zakresie wiązania receptora i badania konkurencji prowadzano w temperaturze 4°C przez 16 godzin, po czym próbki odwirowano i przemyto dwukrotnie powyższym buforem użytym do rozcieńczeń, by usunąć niezwiazany i niespecyficznie związany znakowany KGF. Zliczono resztkową radioaktywność próbek. Krzywe konkurencj i wiązania receptora między próbkami KGF i znaczonym KGF skonstruowano przez wykreślenie procentu niekonkurencji względem stężeń każdej próbki KGF. W tabeli 3B podano stężenia KGF potrzebne do osiągnięcia 60% niekonkurencji względem znaczonego KGF pochodzącego z E. coli, wyrażone w ng/ml.

Tabela 3A

Stężenie KGF użytego do stymulowania włączania [³H]-tymidyny do keranocytów w półmaksymalnym stopniu

Formy	ng/ml
KGF z E coli	10
KGF-a	30
KGF-b	30

Tabel a 3B

Stężenie KGF użytego do konkurencyjnego wiązania receptora przy KGF znaczonym jodem ¹²⁵J przy 60% stopniu niekonkurencji

Formy	ng/ml
KGF z E. coli	65,8
KGF-a	93,5
KGF-b	89,1

Jak podano w tabeli 3A, KGF-a i KGF-b stymulująporównywalne włączanie [3H]-tymidyny, przy czym półmaksymalny stopień włączenia jest stymulowany przez około 30 ng/mL każdego z analogów. Zatem, obcięcie nie zmniejsza biologicznej aktywności cząsteczki. Jednak te dwa analogi mają około trzykrotnie niższą aktywność niż KGF o pełnej długości, uzyskany przy E. coli. Jak podano w tabeli 3B, badania niekonkurencji za pomocą próby radioreceptorowej wskazały, że KGF uzyskany przy użyciu E. coli, KGF-a i KGF-b maj ą podobną aktywność wiązania receptora.

Przykład IV. Próba biologiczna in vivo zastosowana do polipeptydów KGF wytworzonych w E. coli i hodowli komórkowej komórek z organizmu ssaka

Stwierdzono, że pojedyncza podskórna dawka KGF powodowała u myszy zależny od dawki wzrost poziomu cholesterolu w surowicy w ciągu 24 godzin. Oceniono zdolność rodzimego KGF,

184 188

KGF-a, C(1,15)S ANI 5 i AN23 do podwyższania poziomu cholesterolu w surowicy w sposób zależny od dawki.

Każda badana grupa obejmowała pięć samic myszy Balb/c (18-20 gramów) otrzymanych z CRL. Proteinę rozcieńczono 0,9% roztworem soli uzyskując końcową objętość iniekcji 100 pg/mysz. Każdej myszy wykonano pojedynczą podskórną iniekcję w następujących dawkach:

Grupa	Podawany składnik	Dawka (mg/kg)
1	rodzimy KGF	0Ί
	rodzimy KGF	0,25
	rodzimy KGF	0,5
	rodzimy KGF	1
	rodzimy KGF	5
2	CG^S	0Ί
	CG,’5)S	0,25
	C(1,15)S	0,5
	C(1,15)S	1
	C(1,15)S	5
3	ΔΝ15	0,25
	AN15	0,5
	AN15	1
	AN15	5
4	ΔΝ23	0’
	AN23	0,5
	AN23	1
	AN23	5
5	KGF-a	0,01
	KGF-a	0,05
	KGF-a	0’
	KGF-a	0,5
6	roztwór soli (kontrola)	-

Po upływie 24 godzin po iniekcji myszy uśmiercono i wykrwawiono przez przebicie serca. Próbki krwi poddano obróbce w celu oznaczenia cholesterolu w surowicy.

Jak podano na rysunku fig. 35 okazało się, że każdy badany analog KGF podwyższa poziom cholesterolu w surowicy w sposób zależny od dawki.

Nie było również widocznej różnicy bioaktywności między badanymi analogami KGF.

Model cukrzycy in vivo

Modele chemicznie wywołanej cukrzycy u różnych gatunków zwierząt użyto klasycznie do badania choroby i jej leczenia. Streptozotocyna wywołuje cukrzycę u myszy, szczura, chomika, psa i małpy chociaż badania na szczurach i myszach są stosowane najczęściej. Junod i wsp., Proc. Soc. Exp. Pio. Mcd. 126:210-205 (1967); Rerup, Pharm. Rcv. 22:485-518 (1970); Rossini i wsp., P.N.A.S. 74:2485-2489 (1977); i ArRajab andAhrcn, Pancreas 8:50-57 (1993). U szczurów dawki streptozotocyny od 45 do 70 mg/kg, podane dożylnie w pojedynczej dawce, wywołują trwałą chorobę. Dawki poniżej 45 mg/kg in(^tdku'^pr:zejś^iowy stan chorobowy, który jest odwracalny. W ciągu jednego dnia po iniekcji streptozotocyny, wywoływany jest stan hiperglikemii. Poziomy insuliny we krwi pozostają zasadniczo niezmienione w porównaniu z normalnymi szczurami; jednakże, całkowita zawartość insuliny i C-peptydu w trzustce jest silnie obniżona. Szczury objawiają klasyczne oznaki i symptomy cukrzycy u ludzi: zwiększone poziomy glukozy we krwi (hiperglikemia), glukoza w moczu (cukromocz), wzmożone pragnienie (polidipsja), zwiększone wydalanie moczu (poliuria), wzmożony apetyt (hiperfagia).

18*4 188

Badania opisane w tym opisie przeprowαaennn stosując model cukrzycy indukowanej Streptozotoconą u szczurów Sprague-Dawloo. Użyto szczury (samce) ważące 200-260 gramów w mmomencie rozpoczęcia badania. Cukrzycę wywołano przez pojedynczą dożylną, iniekcję streptozotocyny w dawce 50 mg streptozotocono w buforze cytrynianu sodu na 1 kilogram masy ciała. Niodiabotycene szczury kontrolne otrzymały pojedynczą iniekcję dożylną buforu cytrynianu sodu dla celów kontrolnych. KGF podawano codziennie metodą iniekcji podskórnej. Dawka KGF wynosiła 3 lub 5 mg/kz/aeień, w zależności od eksperymentu. W pierwszym eksperymencie terapię KGF zapoczątkowano dwa dni przed wywołaniem cukrzycy i kontynuowano jąpo wywołaniu cukrzycy aż do ogółem ośmiu iniekcji. W eksperymencie drugim i trzecim terapię KGF podawanego podskórnie zapoczątkowano jeden dzień po wywołaniu cukrzycy Streptozotocyną. W czwartym eksperymencie, 7-aniową terapię KGF zapoczątkowano 7 dni po działaniu Streptozotocyną i zwierzęta były kontrolowane przez dalsze 12 tygodni. We wszystkich eksperymentach, oprócz eksperymentu czwartego, poziomy glukozy' we krwi, poziomy glukozy w moczu i objętość moczu użyto jako punkty końcowe analizy. Dodatkowo, w niektórych eksperymentach mierzono spożycie wody, poziomy C-peptydu w moczu lub całkowitą zawartość w trzustce insuliny i C-peptydu. W czwartym eksperymencie jedynym ocenionym punktem końcowym był poziom glukozy we krwi.

Ponieważ duża część insulinyj est usuwana z obiegu przez wątrobę, pomiar stężeń insuliny obwodowej jest odbiciem raczej zjawisk metabolizmu post-hepatycznogo niż wydzielania insuliny przez trzustkę. Dlatego pomiary C-peptydu są często wykonywane i stosowane jako obwodowy marker wydzielania insuliny. C-peptyd jest wytwarzany w wyniku przetwarzania pro-insuliny w insulinę. Insulina i C-peptyd są wydzielane z komórek beta w ilościach równomolowych i jedynie mała ilość C-peptydu jest ekstrahowana przez wątrobę.

Poniższe badanie dotyczyło wpływu rKGF na cukrzycę ί^υΚο wanąprzez streptosotocynę u szczurów Sprazuo-Dawley. Dnia „zerowego” grupy szczurów poddano działaniu 45 lub 50 mg/kg itreptozotocyny (STZ). Następnie, poziomy nie „na czczo” glukozy we krwi monitorowano codziennie, by ocenić nasilenie uszkodzenia komórek wyspowych. W piątym dniu zwierzęta, na które oddziaływano STZ podzielono na dwie grupy po 20 osobników w grupie, zależnie od stopnia hiperglikemii. Punktem granicznym był poziom glukozy we krwi równy 300 mg/dl. Grupa zwierząt, na które nie działano STZ służyła jako grupa kontrolna. Od siódmego dnia dziesięciu zwierzętom z każdej grupy hiperzlikomίcznęj podawano ΔΝ23 (3 mg/kg/dzień) lub PBS przez iniekcję podskórną przez 7 dni. Następnie poziom glukozy we krwi monitorowano codziennie, co drugi dzień lub co tydzień, jak pokazano na rysunku fig. 50. Należy zauważyć, że zwierzęta poddane działaniu STZ z dwóch grup otrzymujących ΔΝ23 wykazywały znaczące spadki poziomu glukozy we krwi podczas okresu podawania ΔΝ23. Istotne jest, że średni spadek poziomu glukozy we krwi w przypadku zwierząt poddanych działaniu STZ w grupie o początkowym poziomie glukozy we krwi> 300 mg/dl - stabiiizował się przy około 150 mg/dl, zaś w przypadku grupy o początkowym poziomie glukozy we krwi > 300 mg/dl spadek ten był jedynie przejściowy. Należy pamiętać, że skala dni na rysunku jest nieliniowa.

O ile nimejszy ejynamon apżkano ęawyżet worówno ogńinin jak i w katagoriaeZ korzystnych wykonań, należy rozumieć, że w świetle powyższego opisu specjalista z tej dziedziny techniki dostrzeże inne odmiany i modyfikacje.

184 188

F!G. 1A ludzki KGF (+ sekwencja sygnałowa) |— OLIGO#25-----1 |-------OLIGO#1---------1 ' -CAATCTACAATTCACAGA-3' 5' -CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3'

5' -CAATCTACAATTCACAGATAGGAAGAGGTCAATGACCTAGGAGTAACAATCAACTCAAGA--------v-+---------+---------+---------+---------+---------_{+ 6θ}

-TTCATTTTCATTATGTTATTCATGAACACCCGGAGCACTACACTATAATGCACAAATGGA---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ ₁₂q

Μ Η K W I

-TACTGACATGGATCCTGCCAACTTTGCTCTACAGATCATGCTTTCACATTATCTGTCTAG---------₊---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ ]_QQ

LTWILPTLLYRSCFHIICLV

-TGGGTACTATATCTTTAGCTTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGA---------₊---------₊---------₊---------₊---------+---------+ 240

GTISLACNDMTPEQMATNVN

-ACTGTTCCAGCCCTGAGCGACACACAAGAAGTTATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAA---------₊---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ 3QQ

CSSPERHTRSYDYMEGGDIR

-GAGTGAGAAGACTCTTCTGTCGAACACAGTGGTACCTGAGGATCGATAAAAGAGGCAAAG---------+---------+---------+---------₊---------₊---------₊ 36q

VRRLFCRTQWYLRIDKRGKV

-TAAAAGGGACCCAAGAGATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGACAGTGGCAG---------₊---------₊---------₊---------+---------+---------₊ 420

KGTQEMKNNYNIMEIRTVAV

-TTGGAATTGTGGCAATCAAAGGGGTGGAAAGTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAG---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ 480

GIVAIKGVESEFYLAMNKEG

-GAAAACTCTATGCAAAGAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGG---------+---------+---------₊---------+---------₊---------₊ 540

KLYAKKECNEDCNFKELILE

- AAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAAIGTTTG ---------₊---------+---------₊---------₊---------+---------₊ 600

NHYNTYASAKWTHNGGEMFV

-TTGCCTTAAATCAAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAAAA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 660

ALNQKGIPVRGKKTKKEQKT

184 188

(ciąg dalszy)

CAGCCCACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATTGCATATGGTATATAAAGAACCCAGTT ---------+---------₊---------₊---------₊---------+---------+ 720

AHFLPMAIT*

3’-GGATACCGTTATTGAATT-5'

I----OLIGO#26----j

CCAGCAGGGAGAITrCTTTAAGTGGACTGTTTTCTTTCTTCTCAAAATTTTCTTTCCTTT ---------+---------+---------₊---------₊---------₊---------+ 780

TATTTTTTAGTAATCAAGAAAGGCTGGAAAAACTACTGAAAAACTGATCAAGCTGGACTT ---------₊----------------₊---------₊---------+---------+ 840

3'-ACCTGAAGTGCATTTATGTTTGTTTTAAG-3'

---------+---------+__ 862

CACGTAAATACAAACAAAA- 5' —OLIGO#2--------1

184 188

184 188 (ciąg dalszy)

Nde Xbol Clol 4500

FIG.2B

4000

3500 » APHII(Kon)»

<rep Al« <<repA4 «

2500

184 188

BamHI

3500

2000

2500Ί

BstElI

184 188

F1G.3A

RSH-KGF sekwencja plazmidu DNA

Ciał Xbal Ndel

-ATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGAAAAAG- 4 O

Μ K K sekwencja sygnałowa rsh Mlul

-CGCGCACGTGCTATCGCCATTGCTGTGGCTCTGGCAGGTTTCGCAACTAGTGCACA-3 '

RARAIAIAVALAGFATSAHA-96

Mlul

5' -CGCGTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGAACTGTTCCAGCCCTGA---------₊---------+---------₊---------₊---------₊---------₊ 156

-CNDMTPEQMATNVNCSSPE

-GCGACACACAAGAAGTTATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTT----------i-----------1----------₃----------4-----------|-----------1- 216

RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

KpnI Ciał

-CTGTCGAACACAGTGGTACCTGAGGATCGATAAAAGAGGCAAAGTAAAAGGGACCCAAGA---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ 276

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-GATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGACAGTGGCAGTTGGAATTGTGGCAAT---------₊---------₊---------₊---------₊---------+---------+ 336

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

EcoRI

-CAAAGGGGTGGAAAGTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAA---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ 396

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

Bsmł

-GAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACAC---------₊---------₊---------₊---------₊---------+---------+ 456

KECNEDCNFKELILENHYNT

Ndel

-ATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTTTGTTGCCTTAAATCAAAA---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ 516

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAAAACAGCCCACTTTCTTCC---------₊---------₊---------₊---------₊---------+---------+ 576

Gl PVRGKKTKKEQKTAHFLP

184 188

FIG.3B

BamHI

TATGGCAATAACTTAATAG-3'

---------+---------+— 595

Μ A I T * ⁴ sekwencja plazmidu DNA

184 188

FIG.4

KGF

Ndel

5' -TATGTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGAACTGTTCCAGCCCTGA---------₊---------+---------₊---------*---------₊---------₊ go

MCNDMTPEQMATNVNCSSPE

-GCGACACACAAGAAGTTATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTT---------4---------4.---------+---------4.---------4.---------4 120

RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

KpnI Ciał

-CTGTCGAACACAGTGGTACCTGAGGATCGATAAAAGAGGCAAAGTAAAAGGGACCCAAGA---------₊---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. Igo

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-GATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGACAGTGGCAGTTGGAATTGTGGCAAT---------₊---------4.---------4.---------4---------+---------4. 240

MKNNYNIMEIR TVAVGIVAI

EcoRI

-CAAAGGGGTGGAAAGTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------+ 300

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

BsmI

-GAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACAC---------₊---------4---------4---------4---------4---------4 360

KECNEDCNFKELILENHYNT

Ndel

-ATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTTTGTTGCCTTAAATCAAAA---------4---------4---------4---------4---------4---------+ 420

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAAAACAGCCCACTTTCTTCC---------4---------4---------4---------4---------+---------+ 480

GIPVRGKKTKKEQKTAHFLP

BamHI

-TATGGCAATAACTTAATAG-3 *

---------4---------4

Μ A I T *

503

184 188

FIG5

KpnI |-----------0LIG0#6-----------------J |------OLIGO#7--------5' -CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAAT3 ' -CATGGACGCATAGCTGTTTGCGCCGTTTCAGTTCCCGTGGGTTCTCTACTTTTTGTTGATGTTA|---------------0LIG0#9---------------------11 —OLIGOłlO--------LRIDKRGKVKGTOEMKNNYNEcoRI

--------------------J |---------OŁIGO#8-------------------1

5' -ATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3'

3' -TAATACCTTTAGGCATGACAACGACAACCATAGCAACGTTAGTTTCCACAACTTAGACTTAA-5

-------------------------1|----OLIGO#11----------------------1

IMEIRTVAVGIVAIKGVESE184 188

KGF (kodon zoptymalizowany)

Xbal |-----0LIG0U2-----1

5' -AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3 ' |---------------------------OLIGO#14------------------------5' -AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGACTCCGGAACAGATGGCT

----------------------------- |--------------OLIGO#15--------ACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGTCACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTG

3'-GGGCCTTGCAGTGTGGGCAT-5’ |-----OLIGO#20--------------------------OLIGO#15----------------------------| |-GTGACATCCGTGTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACG 3'-ATAGCTGTTTGC |-OLIGO#21 —

----------------------OLIGO#16-------------------------------TGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACT

-ACCATTTC-5'

--------------------------| |-------------OLIGO#17------------GTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACA3'-ACGTTAGTTTCCACAACTTA-5' (-----OLIGO#22-----1

------------------OLIGO#17-----------------------------| 1----AAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGAT 3’-GAAGTTTCTTGACTA —OLIGO#23—

----------------------OLIGO#18-------------------------------CCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATG

-GGACC-5'

-----------------------1|-------------------OLIGO#19---------TTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGA

3'-GGTCTTTCCATAGGGCCAAG-5'

-----OLIGO#24-----1

-------OLIGO#19-----------------------------------1

- AAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3'

3'-AATTATCCTAGGTCAAAACT-5' |----OLIGO#13------|

BamHI

184 188

FUG.7

KGF C(1,X5)S

5' -ATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCCTCCTCCCCGGAA---------4---------4----------4----------[-----------f.---------4. gO

MSNDMTPEQMATNVNSSSPE

-CGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCIGTTC---------4---------4---------4----------(.---.-------(.---------4 120

RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

-TGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAG---------₊---------4---------4---------4---------4---------4 jgo

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------4---------4---------4---------4---------4---------4 240

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAA---------4---------4---------4---------4---------₊---------4 300

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

-AAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACC---------4-----------------------------4----------4---------4 360

KECNEDCNFKELILENHYNT

-TACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAA---------4---------4---------4---------4---------4---------4 420

YASAKWTHNGGEMFV ALNQK

-GGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------4---------4---------4---------4---------4---------4 480

GIPVRGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3'

---------4-----495

Μ A I T *

184 188

FIG.8

KGF ńN3/C{15)S ’ -ATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCCTCCTCCCCGGAACGTCACACGCGT---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------_{+ 60}

MTPEQMATNVNSSSPERHTR

-TCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 120

SYDYMEGGDIRVRRLFCRTQ

-TGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAAC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ Igo

WYLRIDKRGKVKGTQEMKNN

-TACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAA---------₊---------4----------+---------+---------₊---------₊ 240

YNIMEIRTVAVGIVAIKGVE

-TCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAAC---------₊---------₊---------₊---------+---------+---------₊ 300

SEFYLAMNKEGKLYAKKECN

-GAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCT---------₊---------+---------+---------+---------₊---------+ 300

EDCNFKELILENHYNTYASA

-AAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTT---------₊---------₊---------+---------+---------+---------+ 420

KWTHNGGEMFVALNQKGI P V

-CGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACT---------4.----------μ---------4----------4----------4----------4- 480

RGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

-TAA-3¹ — 483 *

184 188

FIG. 9

KGF ńN3/C(15)~ * -ATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCTTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCC----------1----------j----------4---------+---------j----------+ gQ

MTPEQMATWVNSSPERHTRS

-TACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGG---------₊---------+---------₊---------₊---------₊---------4 120

YDYMEGGDIRVRRLFCRTQW

-TACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTAC---------4-----------1----------4----------1-----------1----------4. 130

YLRIDKRGKVKGTQEMKNNY

-AATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCT---------4---------4.---------4---------4---------4----------₊ 240

NIMEIRTVAVGIVAIKGVES

-GAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4---------4 3oo

EFYLAMNKEGKLYAKKECNE

-GACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAA---------4.---------4.---------4---------4---------4---------4 360

DCNFKELILENHYNTYASAK

-TGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGT---------4---------4---------4---------4---------4---------4 420

WTHNGGEMFVALNQKGIPVR

-GGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA- 3 '

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 480

GKKTKKEQKTAHFLPMAIT*

184 188

KGF AN8/C(15)S

5' -ATGGCTACTAATGTTAACTCCTCTTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATG---------+---------+---------+---------+---------4----------₊ go

MATNVNSSSPERHTRSYDYM

-GAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATC---------₊---------₊---------+---------+---------₊---------₊ 420

EGGDIRVRRLFCRTQWYLRI

-GACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAA----------1-----------|-----------|-----------1.---------4.---------4. 130

DKRGKVKGTQEMKNNYNIME

-ATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTG---------4.---------₊---------4.---------4.---------4.---------4. 240

IRTVAVGIVAIKGVESEFYL

-GCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4----------4. 300

AMNKEGKLYAKKECNEDCNF

-AAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAAC---------4.---------4.---------₊---------4.---------4.---------4. 360

KELILENHYNTYASAKWTHN

-GGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACC---------4-----------1-----------j.---------4.---------4-----------1- 420

GGEMFVALNQKGIPVRGKKT

-AAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3 *

---------4.---------4.---------+---------+--------468

KKEQKTAHFLPMAIT*

184 188

KGF AN8/C155 * -ATGGCTACTAATGTTAACTCTTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAA----------+---------+---------+----------I----------4----------4- 0Q

MATNVNSSPERHTRSYDYME

-GGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGAC----------μ---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 120

GGDIRVRRLFCRTQWYLRID

-AAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------+ Igo

KRGKVKGTQEMKNNYNIMEI

-CGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCA---------4.---------4.---------4.---------4----------4.---------4. 240

RTVAVGIVAIKGVESEFYLA

-ATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAA---------4.---------4.---------₊---------4---------4---------4 300

MNKEGKLYAKKECNEDCNFK

-GAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGT---------4---------4---------4---------4---------4---------4 300

ELILENHYNTYASAKWTHNG

-GGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAA---------4---------4---------4---------4---------4---------4 420

GEMFVALNQKGIPVRGKKTK

-AAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------4---------4---------4---------4-----405

KEQKTAHFLPMAIT *

184 188

KGF ΔΝ15

5-ATGTCTTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGC---------₊---------4---------+---------4---------4---------_{+ 60}

MSSPERHTRSYDYMEGGDIR

-GTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTC---------j----------4---------4---------4----------4---------4 120

VRRLFCRTQWYLRIDKRGKV

-AAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTT---------4---------4---------4---------4---------4---------4 180

KGTQEMKNNYNIMEIRTVAV

-GGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGT---------4----------(.---------4---------4---------4---------4 240

GIVAIKGVESEFYLAMNKEG

-AAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAA---------4---------4---------4---------4---------4---------4 300

KLYAKKECNEDCNFKELILE

-AACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTT---------4---------4---------4---------4---------4---------4 360

NHYNTYASAKWTHNGGEMFV

-GCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACC---------4---------4---------₊---------4---------4---------4 420

ALNQKGIPVRGKKTKKEQKT

-GCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------4---------4---------4 450

AHFLPMAIT*

184 188

FIG. 13

KGF ΔΝ16 ’ -ATGTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTA---------₊---------₊---------+---------+---------+---------+ ₆₀

MSPERHTRSYDYMEGGDI RV

-CGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAG---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ ₁₂0

RRLFCRTQWYLRIDKRGKVK

-GGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGT---------+---------+---------+---------+---------₊---------+ ]_gQ

GTQEMKNNYNIMEIRTVAVG

-ATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAA---------₊---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ 240

IVAIKGVESEFYLAMWKEGK

-CTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAAC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------+ 30θ

LYAKKECNEDCNFKELILEN

-CACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCT---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ 36Q

HYNTYASAKWTHNGGEMFVA

-CTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCT---------₊---------₊---------+---------+---------₊---------₊ 420

LNQKGIPVRGKKTKKEQKTA

-CACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------+---------+-------447

HFLPMAIT*

184 188

FIG„ I 4

KGF ΔΝΧ7

5' -ATGCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGT---------4----------4----------j.---------4---------4----------4 gQ

MPERHTRSYDYMEGGDIRVR

-CGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGC---------4---------4---------4---------4---------4----------4 120

RLFCRTQWYLRIDKRGKVKG

-ACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATC----------p---------4---------4----------1----------4-----------H 180

TQEMKNNYNIMEIRTVAVGI

-GTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTG---------4---------₊---------4---------4---------4---------4 240

VAIKGVESEFYLAMNKEGKL

-TACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCAC---------₊---------₊---------₊---------4---------4---------4 300

YAKKECNEDCNFKELILENH

-TACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTG---------4---------4---------4---------4---------4---------4 360

YNTYASAKWTHNGGEMFVAL

-AACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCAC---------4---------4---------4---------4---------4---------4 420

NQKGIPVRGKKTKKEQKTAH

-TTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------+---------+---- 444

FLPMAIT*

184 188

KGF ΔΝΧ3 ’ -ATGGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ gQ

MERHTRSYDYMEGGDIRVRR

-CTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 220

LFCRTQWYLRIDKRGKVKGT

-CAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTT---------+---------+---------+---------₊---------₊---------₊ 280

QEMKNNYNIMEIRTVAVGIV

-GCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTAC---------₊---------₊---------₊---------+---------₊---------₊ 240

AIKGVESEFYLAMNKEGKLiY

-GCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTAC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

AKKECNEDCNFKELILENHY

-AACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAAC---------₊---------+---------+---------₊---------+---------+ 300

NTYASAKWTHNGGEMFVALN

-CAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTC---------+---------+---------₊---------+---------+---------+ 420

QKGIPVRGKKTKKEQKTAHF

-CTGCCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------₊---------+- 442

L P Μ A I T *

184 188

F5 G» 115

KGF ΔΝ19 ’ -ATGCGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTG---------4---------+---------+---------4---------4---------4 0Q

MRHTRSYDYMEGGDIRVRRL

-TTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAA----------1----------4---------4---------4---------4----------μ 120

FCRTQWYLRIDKRGKVKGTQ

-GAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCA----------,-----------1-----------|----------4-----------1-----------μ 130

EMKNNYNIMEIRTVAVGIVA

-ATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCA---------4---------4---------4---------4---------+---------4 240

IKGVESEFYLAMNKEGKLYA

-AAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAAC---------4---------4---------4---------₊---------4---------₊ 300

KKECNEDCNFKELILENHYN

-ACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAG---------₊---------4---------4---------4---------4---------₊ 300

TYASAKWTHNGGEMFVALNQ

-AAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTG---------4---------4---------4---------4---------4---------4 420

KGIPVRGKKTKKEQKTAHFL

-CCGATGGCAATCACTTAA-3 ’

---------+--------438

P Μ A I T *

184 188

FIG.I7

KGF ΔΝ20

5' -ATGCATACTCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTC---- -----4.---------4.---------4.---------4.-----.—.--4.---------4. gQ

MHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

-TGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAG---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 220

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACIOTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------4-----------j.---------4.----------,----------4.----------j. I80

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 240

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

-AAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 300

KECNEDCNFKELILENHYNT

-TACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 3go

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 420

GIPVRGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3'

---------4.-----435

Μ A I T *

184 188

KGF ΔΝ21

5' -ATGACTCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGC---------4---------4---------4---------4---------4---------4 gO

MTRSYDYMEGGDIRVRRLFC

-CGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATG---------4---------4----------j.----------1----------4---------4 120

RTQWYLRIDKRGKVKGTQEM

-AAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA---------4---------4---------4---------4---------4---------4 130

KNNYNIMEIRTVAVGIVAIK

-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAA---------4---------4---------₊---------4---------4---------4 240

GVESEFYLAMNKEGKLYAKK

-GAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTAC---------4---------₊---------4---------₊---------₊---------4 300

ECNEDCŃFKELILENHYNTY

-GCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT----------I----------4----------1-----------j-----------1----------4 360

ASAKWTHNGGEMFVALNQKG

-ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATG---------4---------4---------4---------4----------μ---------4 420

IPVRGKKTKKEQKTAHFLPM

-GCAATCACTTAA-3'

---------+__ 432

A I T *

184 188

KGF ΔΝ22

5' -ATGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ go

MRSYDYMEGGDIRVRRLFCR

-ACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAA---------4---------4---------4---------4---------4---------4 ]_20

TQWYLRIDKRGKVKGTQEMK

-AACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGT---------4---------4---------4---------4----------4----------4 180

NNYNIMEIRTVAVGIVAIKG

-GTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAA---------4---------4---------4---------4---------4---------4 240

VESEFYLAMNKEGKLYAKKE

-TGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCA---------₊---------4---------₊---------4---------₊---------4 300

CNEDCNFKELILENHYNTYA

-TCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATC---------4---------4---------₊---------4---------₊---------4 360

SAKWTHNGGEMFVALNQKGI

-CCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCA---------4---------4---------4---------4---------4---------4 420

PVRGKKTKKEQKTAHFLPMA

-ATCACTTAA-3'

---------429

I T

184 188

FSG.20

KGF ΔΝ23 ’ -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ οθ

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT

-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC---------₊---------₊---------+---------+---------₊---------₊ 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN

-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT---------₊---------₊---------4---------4---------4---------4 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV

-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC----------1-----------1-----------1----------4----------μ----------μ 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC

-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT---------₊---------4---------4---------4---------4---------₊ 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS

-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCG ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 300

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP

-GTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC---------4-------------------4---------4---------j----------4 420

VRGKKTKKEQKTAHFLPMAI

-ACTTAA-3'

------ 420

184 188

KGF ΔΝ24 ’ -ATGTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAG---------+---------+---------+---------₊---------4---------4 ₆Q

MYDYMEGGDIRVRRLFCRTQ

-TGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAAC---------4---------+---------+---------+---------4---------+ 120

WYLRIDKRGKVKGTQEMKNN

-TACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAA---------4---------4---------+---------+---------+---------4 180

YNIMEIRTVAVGIVAIKGVE

-TCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAAC---------4---------4---------4---------4---------4---------4 240

SEFYLAMNKEGKLYAKKECN

-GAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCT---------4---------4---------4---------4---------4---------4 300

EDCNFKELILENHYNTYASA

-AAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTT---------4---------4---------4---------4---------4---------4 350

KWTHNGGEMFVALNQKG I P V

-CGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACT---------4---------4---------4---------4---------4---------4 420

RGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

-TAA-3'

---423

184 188

KGF C(1,15)S/R(144)E ’ -ATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCCTCCTCCCCGGAA---------₊---------+---------+---------+---------+---------_{+ 60}

MSNDMTPEQMATNVNSSSPE

-CGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTC---------+---------+---------₊---------₊---------+---------+ ₁₂₀

RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

-TGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAG---------₊---------+---------₊---------₊--------—₊---------+ igQ

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 240

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAG---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------+ 300

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

-AAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 360

KECNEDCNFKELILENHYNT

-TATGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAA---------4----------f----------1----------+----------1----------4. 420

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGTATCCCTGTTGAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------₊---------+---------₊---------₊---------+---------+ 4go

GIPVEGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3'

---------+-----495

Μ A I T *

184 188

KGF C(X,15)S/R<144)Q ’ -ATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCCTCCTCCCCGGAA---------+------------------+---------4----------4.---------4. gQ

MSNDMTPEQMATNVNSSSPE

-CGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTC---------4----------4----------4----------4----------4.---------4. 120

RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

-TGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAG---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. igo

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 240

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAG---------4.---------4----------4----------4.---------4.---------4. 300

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

-AAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACA---------4.---------₊---------4.---------+---------4.---------4. 3gQ

KECNEDCNFKELILENHYNT

-TATGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 420

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGTATCCCTGTTCAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------4.---------4----------4----------+---------4.---------4. 480

Gl PVQGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3'

---------+-----495

Μ A I T *

184 188

FIG.24

KGF AN23/R(144)Q

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC---------4---------4---------4---------4----------4---------4 6Q

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT

-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC---------+---------+---------4---------4---------4---------+ 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN

-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT---------j----------4----------1-----------1-----------1-----------1- 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV

-GAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAGAAAGAATGC---------4---------4---------4---------4---------4---------4 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACATATGCATCT---------4---------₊---------4---------4---------4---------4 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS

-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT---------4---------4---------4---------4---------4---------4 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP

-GTTCAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC---------4---------4---------4---------4---------4---------4 420

VQGKKTKKEQKTAHFLPMAI

-ACTTAA-3'

------426

184 188

LL

Ο χ:

ω

ί)

Ο

LL

Ο

184 188

to η

(κ ίΖ:

β •Η

Ν

Ό •ri

C

Μ <U ca ο

Ή οι

0)

0« ω

ίη >» β

•Η

Ν τι φ

•Η

C

Λ

Μ

Ο

Μ

W

Ο

Ή i

CO ***» m

184 188

pozostałego rozpuszczalnego KGF

Czas inkubacji w 37*C (dni)

184 188

pozorne(°C)

ss KGF C(1,15)S/R(144)E *KGF C(1,15)S/R(144)Q O KGF C(1,15)S ArhKGF

184 188

CPM

I-1

-3.00

®— rhKGF c— KGFC(1,15)S

184 188

log ng/zagłębienia fi— rhKGF o— KGFAN15

184 188

FIG. 31

log ng/zagłębienie «— rhKGF o— KGF ΔΝ23

184 188

log ng/zagłębienie «— rhKGF o— KGF C(1,15)S/R(144)Q

184 188

0- rhKGF o— KGF C(1,15)S/R(144)E

184 188

KGFC(1,15)S A KGFAN15 γ KGF ΔΝ23

CHO

184 188

FIG.36

KGF cfL,X5,40)s

5' -CTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGT

---------₊---------4---------₊---------4---------₊---------_{+ 6θ}

MSNDMTPEQMATNV

TAACTCCTCCTCCCCGGAACGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACAT

---------4---------4---------4---------4---------₊---------₊ 120

NSSSPERHTRSYDYMEGGDI

CCGCGTACGCCGTTTGTTCTCTCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAA

---------4---------4---------+---------4---------4---------4 180

RVRRLFSRTQWYLRIDKRGK

AGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGC

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 240

VKGTQEMKNNYNIMEIRTVA

TGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGA

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 300

VGIVAIKGVESEFYLAMNKE

AGGAAAACTCTATGCAAAGAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCT

---------+---------4---------4---------4---------4---------+ 300

GKLYAKKECNEDCNFKELIL

GGAAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTT ---------4---------4---------4---------4---------4---------₊ 420

ENHYNTYASAKWTHNGGEMF

TGTTGCCTTAAATCAAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAA ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 480

VALNQKGIPVRGKKTKKEQK

AACAGCCCACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATAG-3 ’

---4-----+---------4---------4---------4- 521

TAHFLPMAIT * *

184 188

KGF C|,15,102^

5' -CTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGT

---------4---------4---------+---------4---------4---------4 gQ

MSNDMTPEQMATNV

TAACTCCTCCTCCCCGGAACGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACAT

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 120

NSSSPERHTRSYDYMEGGDI

CCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAA

---------4---------4---------4---------4---------4----------l· Igo

RVRRLFCRTQWYLRIDKRGK

AGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGC

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 240

VKGTQEMKNNYNIMEIRTVA

TGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCTATGAACAAAGA

---------+---------+---------4---------4---------4---------4 300

VGIVAIKGVESEFYLAMNKE

AGGTAAACTGTACGCTAAAAAAGAATCCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCT ---------4---------₊---------4---------₊---------4---------4 360

GKLYAKKESNEDCNFKELIL

GGAAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTT

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 420

EN-HYNTYASAKWTHNGGEMF

TGTTGCCTTAAATCAAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAA

---------4---------4---------4---------4---------4---------4 480

VALNQKGIPVRGKKTKKEQK

AACAGCCCACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATAG-3*

---------4-----------1-----------(-----------521

TAHFLPMAIT* *

184 188

KGF C&,15,X02,10$S ’ -CTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGT ---------₊---------₊---------+---------+---------+---------_{+ 6θ}

MSNDMTPEQMATNV

TAACTCCTCCTCCCCGGAACGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACAT

---------₊---------₊---------₊---------+---------+---------+ ₁₂q

NSSSPERHTRSYDYMEGGDI

CCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAA

---------₊---------₊---------+---------₊---------+---------₊ 280

RVRRLFCRTQWYLRIDKRGK

AGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGC

---------+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 240

VKGTQEMKNNYNIMEIRTVA

TGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCTATGAACAAAGA

---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------+ 3QQ

VGIVAIKGVESEFYLAMNKE

AGGTAAACTGTACGCTAAAAAAGAATCCAATGAAGATTCTAACTTCAAAGAACTAATTCT ---------₊---------+---------+---------+---------+---------₊ 360

GKLYAKKESNEDSNFKELIL

GGAAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTT ---------₊---------+---------₊---------₊---------₊---------₊ 420

ENHYNTYASAKWTHNGGEMF

TGTTGCCTTAAATCAAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAA ----------1-----------)-----------1-----------1-----------1-----------f- 480

VALNQKGIPVRGKKTKKEQK

AACAGCCCACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATAG-3 ’

---------₊---------+---------+---------₊_ 522

TAHFLPMAIT * *

184 188

FIG.39

ΔΝ23/Ν(137)Ε

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC4---------+---------+---------+---------₊---------4--------- g₀

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC4---------4---------4---------+---------4---------4--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT4---------4---------4---------4---------+---------4--------- 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC4----------4----------4-----------μ----------1-----------1---------- 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGGAACAGAAAGGTATCCCT+---------4---------4---------4---------4---------4--------- 360

AKWTHNGGEMFVALEQKGIP-GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------4---------4---------4---------+--------- 420

VRGKKTKKEQKTAHFLPMAI -ACTTAA-3' +----- 426 rp *

184 188

ΔΝ23/Κ(139)Ε

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------ί----------+---------+---------+---------+--------- 60

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC +---------+---------+---------+---------4---------+--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT4---------4---------4---------4---------₊---------₊--------- 13Q

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC -AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT

4---------₊---------₊---------4---------₊---------4--------- 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS -GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGGAAGGTATCCCT4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQEGIP -GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC₊---------₊---------4---------4---------4---------4--------- 420

VRGKKTKKEQKTAHFLPMAI -ACTTAA-3' +----- 426

T *

184 188

FI (5. 48 ńN23/K(139)Q

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC₊---------+---------+---------₊---------+---------₊--------- ₆₀

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC₊---------+---------₊---------₊---------₊---------₊--------- i20

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊--------- Igo

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊--------- 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT+---------+---------₊---------₊---------₊---------₊------,— 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGCAAGGTATCCCT+---------₊---------+---------₊---------₊---------4---------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQQGI P -GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4----------4----------4----------4.---------4----------4---------- 420

VRGKKTKKEQKTAHFLPMAI -ACTTAA-3'

4------ 426

T *

184 188

AN23/R(144)A ’ -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------+---------4---------4---------4---------4--------- 60

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------+---------4---------4---------4---------4--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------+---------+---------4---------+---------4--------- 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT4---------+---------₊---------4---------4---------4--------- 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS -GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT4---------₊---------4---------4---------₊---------4--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQKG I P -GTTGCTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 420

VAGKKTKKEQKTAHFLPMAI-ACTTAA-3'

4----- 426 rp »

184 188 ńN23/R(144)E

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------4---------+----------μ---------4---------4--------- 00

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 180

NYN IMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAGAAAGAATGC ₊---------4---------4---------4---------4---------4--------- 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC -AATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACATATGCATCT₊---------4---------4---------4---------₊---------4--------- 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS -GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 300

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP -GTTGAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC₊---------₊---------4---------₊---------4---------4--------- 420

VEGKKTKKEQKTAHFLPMAI -ACTTAA-3’ +----- 420 ip *

184 188

FS G. 44

AN23/R(144)L ’ -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------+---------₊---------₊---------₊---------₊--------- go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------+---------₊---------₊---------+---------₊--------- 220

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATAITATCGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 280

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC+---------₊---------+---------+---------+---------₊--------- 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT+---------+---------₊---------₊---------+---------+--------- 3oo

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCTGGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC+---------₊---------+---------+---------+---------+--------- 420

VLGKKTKKEQKTAHFLPMAI-ACTTAA-3' +----- 426 ip *

184 188

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------₊---------4---------+---------+---------+--------- 60

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC4---------4---------4---------4---------4---------.)---------- 120

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC -AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT4---------4-----,---4---------4---------4---------4--------- 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATTCCT4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCGTGGTAAGGAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------₊---------4---------4---------₊---------4--------- 420

VRGKETKKEQKTAHFLPMAI -ACTTAA-3’ +----- 426

T *

184 188

FIG. 46

AN23/K(147)Q

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------₊---------+---------4---------4---------4--------- ₆Q

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------+---------+---------+---------+---------4--------- Χ20

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------4---------+---------+---------4---------4--------- 130

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGCTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC₊---------4---------4---------4---------4---------4--------- 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT4---------₊---------₊---------₊---------4---------4--------- 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCGTGGTAAGCAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------₊---------₊---------4---------4--------- 420

VRGKQTKKEQKTAHFLPMAI -ACTTAA-3'

4----- 426

T *

184 188

FlG.47

ΔΝ23/Κ(153)Ε

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC₊---------+---------+---------₊---------₊---------₊--------- ₆₀

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC4---------+---------+---------+---------4---------4--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACIGTTGCTGTTGGTATCGITGCAATCAAAGGTGTT+---------4---------4---------4---------4---------4--------- 130

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC -AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT4---------₊---------4---------4---------₊---------4--------- 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS -GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT+---------4---------₊---------4---------4---------4--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGI P -GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGGAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------4----------(.---------4---------4--------- 420

VRGKKTKKEQETAHFLPMAI -ACTTAA-3’ +----- 426

T *

18*4 188

FI G.48

ΔΝ23/Κ(153)Ο

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------+---------+---------+---------4---------4--------- gO

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT- CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC +---------+---------+---------+---------+---------₊--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------+---------4---------4---------4---------4--------- Igo

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC4--------------------1----------4---------4---------.)---------- 240

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGCAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------4---------4---------4---------4--------- 420

VRGKKTKKEQQTAHFLPMAI -ACTTAA-3' +----- 426

T * 184 188

F! G .49

AN23/Q(152)E/K(153) E * -ATOTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 60

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------+---------+---------+---------₊---------+--------- i20

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------+---------+---------4---------+---------₊--------- Igo

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC +---------+---------+---------+---------+---------+--------- 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-aacgaagactgcaacttcaaagaactgatcctggaaaaccactacaacacctacgcatct+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------+--------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAAGAGGAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC+---------₊---------₊---------₊---------4---------4--------- 420

VRGKKTKKEEETAHFLPMAI-ACTTAA-3’ +----- 426

T *

184 188

O cd ΓΟ			cd CD ro
Λ			V
CD CO Ll_	>. c	o o ΓΟ	CD CO U-	o o ro Λ
CD	r4 (tf	V cs>	CD	CD
+	g	CQ	+	CO
	r-u	r-j	l*M
1—	0	1—	ł—	ł—
CO	z	co	co	CO

ł

I-Γ o o cd cd co uo

(ąp/fim) τωχ θμ Αζο^ριχβ morzom

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób stymulacji produkcji niefibroblastowych komórek nabłonkowych znamienny tym, że niefibroblastowe komórki nabłonkowe kontaktuje się ze skuteczną ilością analoga rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, zdefiniowanego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2 z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, o sekwencji aminokwasów właściwej KGF lecz obejmującej modyfikacjęjednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są usunięte.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym aminokwasy 32-55 w SEQ ID NO:2 są odcięte.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SEq ID NO:2 jest usunięta, a reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2jest podstawiona innym aminokwasem.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym pierwsze - do czternastu; N-końcowe aminokwasy są odcięte, a reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w sEq ID NO:2 oraz reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są podstawione innym aminokwasem.
7. Sposób według zastrz. 4 albo 5, albo 6, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym za resztę cysteinowąjest podstawiona reszta aminokwasowa wybrana z grupy obejmującej reszty alaniny, leucyny i seryny.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym reszta serynowa jest podstawiona za resztę cysternową.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym występuje dodatkowo podstawienie zmieniające ładunek w pozycji aminokwasu wybranego spośród: reszty argininowej wpozycj i aminokwasu 72 w SEQ ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasu 74 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 86 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 126 w SEQ ID NO:2, reszty asparginowej w pozycji aminokwasu 168 w SEQ ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasu 169 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 170 w SEQ ID nO:2, reszty argininowej w pozycji aminokwasu 175 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 178 w SEQ ID NO:2, reszty glutaminowej w pozycji aminokwasu 183 w SeQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 184 w SEQ ID NO:2 lub reszty treoninowej w pozycji aminokwasu 185 w SEQ ID NO:2.
10. SposóS wedhig zastrz . 1, znamiennytym, że sto suj e siępo lipeptypowy analo g KGF, w którym dodatkowo występuje modyfikacja polegająca na tym, że co najmniej jeden aminokwas w pętlotwórczej sekwencji reszt aminokwasowych w pozycjach Asn¹⁴⁶ -Thr¹⁵⁰ w SEQ ID NO:2 -zastąpiony jest resztą innego aminokwasu posiadającą wyższy potencjał tworzenia pętli.

184 188
11. Sposób według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że stosuje siępolipeptydowy analog KGF, w którym reszty aminokwasowe w pozycjach 32-54 w SEQ ID NO:2 są usunięte.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF wybrany z grupy analogów obejmującej C(1,15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:32, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie). C(1,15,40)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:78, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C( 1,15,102)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:80, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C( 1, 15,102,106)8 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 82, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ADN15 (SEQ ID NO:42, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN 17 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:46, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN 18 (odpowiad:^j^cy sekwencji SEQ ID NO:48, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ANI 9 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:50, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN20 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:52, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN21 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:54, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN22 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:56, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:58, w której początkowa metionmajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN24 (odpowiadający sekwencji SEQ ID N0:60, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN3/C( 15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:34, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN3/C(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NQ:36, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN8/C(15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:38, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0’’ i występuje ewentualnie), AN8/C(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:40, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:62, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:64, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentuajnie)DN23/H(116)G (odpowiadający sekwencji aminokwasów 54-194 w SEQ ID NO:2), z resztą histydynową w pozycji aminokwasu 147 podstawioną glicyną, AN23/N(137)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:84, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(139)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:86, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AID^Ć^i^/^(139)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:88, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)A (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:90, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)E odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:92, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0”i występuje ewentualnie), AN23/R(144)L (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:94, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), A^Ć^(^/^('U47)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:96, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(147)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:98, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/N(153)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 100, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/NK(153)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 102, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje

184 188 ewentualnie), AN23/Q(152)E/K(153)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 104, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie) i AN23//R(144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:66, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stosuje się analog AN'16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF mający sekwencję, sygnalną lub amino-końcową resztę metioninową.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym sekwencję sygnalną stanowią aminokwasy 1-31 w SEQ ID NO:2.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF połączony kowalencyjnie z ugrupowaniem chemicznym.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym ugrupowaniem chemicznym jest glikol polietylenowy.
18. Sposób ąwedług zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, którym jest AN23 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:58, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), połączony kowalencyjnie z ugrupowaniem chemicznym.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF, w którym ugrupowaniem chemicznym jest glikol polietylenowy.
20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF w postaci liofilizowanej.
21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptydowy analog KGF wytworzony sposobem obejmującym prowadzenie namnażania w odpowiednich warunkach odżywczych prokariotycznej lub eukariotycznej komórki-gospodarza trwale transformowanej cząsteczką rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję, aminokwasów 32-194 w SEQ IDNO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującąmodyfikacjęjednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycj i aminokwasu 3 2 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem, albo biologicznie funkcjonalnym wektorem zawierającym cząsteczkę takiego rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ED NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obej^iu^^^modyfikacjęjednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys1 oraz Cys^),jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem i prowadzi się hodowlę w sposób pozwalający na ekspresję kodowanego analoga KGF, po czym wyodrębnia się tak wytworzony analog KGF.