PL184903B1 - Sposób wytwarzania standaryzowanego odczynnika zawierającego immunoglobuliny ludzkie klasy G o swoistości anty-D - Google Patents

Abstract

1· Sposób wytwarzania standaryzowanego odczynnika zawierającego immunoglobuliny ludzkie klasy G o swoistości anty-D, zwłaszcza do badań serologicznych grup krwi człowieka, znamienny tym, że uzyskuje się roztwór o zawartości przeciwciał anty-D klasy IgG od 0,05-0,06 pg/ml przez rozcieńczenie substancji wyjściowej zawierającej immunoglobuliny, dogodnie za pomocą zbuforowanej soli fizjologicznej o odczynie pH 6,9-7,2, korzystnie 7, który bezpośrednio po tym stabilizuje się ludzką surowicą grupy krwi AB bądź albuminą: ludzką, bydlęcą w ilości 1% objętościowego, konserwuje, dogodnie azydkiem sodu w ilości 0,1% wagowego, po czym chłodzi w temperaturze od + 2 do + 8°C przez około 24 godziny

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania standaryzowanego odczynnika, zawierającego immunoglobuliny ludzkie klasy G o swoistości anty-D przeznaczonego do kontroli testów diagnostycznych, zwłaszcza do badań grup krwi człowieka.

Znane są różne sposoby otrzymywania preparatów na bazie surowicy. Z polskiego opisu patentowego nr 114 529 znany jest sposób wytwarzania liofilizowanego preparatu surowicy antyglobulinowej zwierzęcej. Polega on na tym, że natywną surowicę antyglobulinową bezpośrednio przed liofilizacją rozcieńcza się roztworem buforu fosforanowego o pH 4-8, korzystnie 6,5 zawierającym w 1000³ cm wody destylowanej 13-15 g NajHPO4 · 12H₂O najkorzystniej 14,32 g, 7-10 g KH₂PO4 najkorzystniej 8,16 g.

Z kolei sposób wytwarzania surowic wzorcowych układu ABO - według polskiego opisu patentowego nr 134 342 charakteryzuje się tym, że osocze krwi o mianie niższym od 1 : 32, po odwłóknieniu poddaje się parokrotnie, naprzemiennie zamrożeniu w temperaturze poniżej 5°C i powolnemu rozmrażaniu w temperaturze powyżej + 4°C aż do uzyskania wyraźnego rozdziału surowicy na dwie frakcje. Następnie rozwarstwioną surowicę rozdziela się, frakcję dolną surowicy wzbogaconą w przeciwciała o mianie co najmniej 1 : 32 sączy się przez filtr bakteriologiczny i dodaje środek konserwujący.

W dotychczasowej praktyce używano surowicy ludzkiej zawierającej przeciwciała anty-D klasy IgG - którą uzyskuje się dzięki immunizacji ochotników spośród dawców krwi - do wykonywania badań kontrolnych jedynie niektórych testów serologicznych. Natomiast do przeprowadzania testu enzymatycznego zwanego LEN i pośredniego testu antyglobulinowego zwanego PTA używano surowicy o wysokim mianie i krwinek wzorcowych. Polegało to na skontaktowaniu badanej surowicy z krwinkami wzorcowymi według określonej procedury, końcowym odwirowaniu próbek w ściśle określonych warunkach, a następnie na odczycie wyniku w kierunku obecności reakcji aglutynacji.

Stosowanie surowicy od dawców immunizowanych, zwykle o wysokim mianie to znaczy 1 : 32 do wykonywania kontroli testów LEN i PTA dawało błędne wyniki z uwagi na zbyt wysoki poziom przeciwciał anty-D w surowicy kontrolnej, co dawało pozytywne wyniki, nawet

184 903 w przypadku nieprawidłowej techniki wykonywania badań; różną zawartość przeciwciał anty-D w surowicy kontrolnej, która w praktyce była różna w różnych jej seriach.

Jak z powyższego wynika, wykorzystanie wymienionej surowicy nie pozwalało na standaryzację badań w zakresie testów enzymatycznych i pośrednich testów antyglobulinowych.

Celem wynalazku jest wyeliminowanie wymienionych niedogodności, a zadaniem technicznym opracowanie sposobu wytwarzania wzorcowego odczynnika zawierającego immunoglobuliny ludzkie klasy G o swoistości anty-D gwarantującego prawidłowość wyników badań łatwość ich prowadzenia i standaryzację testów.

Przy uwzględnieniu faktu, że surowica ludzka od dawców immunizowanych, o niskim poziomie przeciwciał anty-D klasy IgG wynoszącym około 0,05 pg/ml będzie odpowiednia dla wykonywania testów enzymatycznych i pośredniego testu antyglobulinowego stwierdzono, że otrzymany z niej w określonych warunkach i środowisku odczynnik charakteryzuje się nieoczekiwanie dużą stabilnością - ustalony poziom przeciwciał utrzymuje się w ciągu 12 miesięcy.

Sposób według wynalazku polega na tym, że uzyskuje się roztwór o zawartości przeciwciał anty-D klasy IgG od 0,05-0,06 pg/ml przez rozcieńczenie substancji wyjściowej zawierającej immunoglobuliny dogodnie za pomocą zbuforowanej soli fizjologicznej o odczynie pH 6,9-7,2, korzystnie 7. Bezpośrednio po tym roztwór stabilizuje się ludzką surowicą o grupie krwi AB bądź albuminą: ludzką, bydlęcą w ilości 1% objętościowego, konserwuje dogodnie azydkiem sodu w ilości 0,1°% wagowego, po czym chłodzi w temperaturze od + 2 do + 8°C przez około 24 godziny. Jako substancję wyjściową stosuje się osocze, surowicę ludzką od dawców immunizowanych, monoklonalne przeciwciała anty-D klasy IgG lub inną oczyszczoną immunoglobulinę tej klasy i swoistości. Proces prowadzi się w temperaturze najwyżej 35°C, a dogodnie w temperaturze pokojowej 18-23°C. Po procesie chłodzenia bada się aktywność serologiczną odczynnika, a następnie oznacza zawartość przeciwciał anty-D klasy IgG, które staiowiąjego ściśle określoną wielkość.

Sposób według wynalazku odznacza się prostotą, łatwością wykonania. Umożliwia standaryzację metody badań do kontroli testów diagnostycznych takich jak: testy enzymatyczne, pośredni test antyglobulinowy oraz powtarzalność wyników. Otrzymany odczynnik jest stabilny i zachowuje ważność w okresie 12 miesięcy.

Przykład I.

W osoczu uzyskanym od immunizowanego dawcy oznaczono w autoanalizatorze, zawartość ilościową immunoglobulin klasy G anty-D, która wyniosła 40 pg/ml. Pobrano 10 ml tego osocza i dodano do niego 7920 ml roztworu soli fizjologicznej zwanej PBS o odczynie pH 6,9. W trakcie mieszania dodano do niego 80 ml surowicy ludzkiej o grupie krwi AB oraz 8 g azydku sodu. Otrzymano 800 ml odczynnika, który chłodzono przez okres 24 godzin w temperaturze 5°C, po czym zbadano, że odczynnik jest aktywny serologicznie. Po 3 dniach skontrolowano odczynnik pod względem zawartości przeciwciał anty-D klasy IgG na autoanalizatorze, który wykazał, że zawartość immunoglobulin klasy G anty-D nie zmieniła się i wyniosła 0,05 pg/ml.

Przykład II.

W osoczu jak w przykładzie I zbadano zawartość ilościową immunoglobulin klasy G antyD, która wyniosła 20 pg/ml. Do 25 ml tego osocza dodano 9900 ml roztworu soli fizjologicznej zwanej PBS o odczynie pH 7,1. W trakcie mieszania dodano do niego 100 ml surowicy ludzkiej o grupie krwi AB oraz 10 g azydku sodu. Otrzymano 10000 ml odczynnika, który chłodzono przez okres 24 godziny w temperaturze 4°C. Po przebadaniu stwierdzono, że odczynnik jest aktywny serologicznie. Dalsze czynności wykonano jak w przykładzie I.

Wykonanie oznaczenia za pomocą standaryzowanego odczynnika pokazano na przykładzie testu enzymatycznego zwanego LEN. Do probówki wlano 2 krople 3% zawiesiny krwinek wzorcowych w soli o niskiej sile jonowej zwanej LISS o grupie „0 Rh +” i fenotypie Cc DEe oraz 1 kroplę odczynnika LEN. Otrzymaną, mieszaninę poddano inkubacji w temperaturze + 37°C przez 10 minut. Następnie dodano 2 krople standaryzowanego odczynnika otrzymanego sposobem według wynalazku i ponownie poddano inkubacji w temperaturze 37°C przez 3 minuty. Z kolei odwirowywano przez 60 sekund przy 150 g. Na końcu odczytano wynik badania delikatnie wstrząsając probówką i obserwując jej zawartość w kierunku obecności aglutynacji.

Standaryzowany odczynnik - według wynalazku - reaguje z krwinkami Rh + dając aglutynację o nasileniu na ++ i nie reaguje z krwinkami Rh

184 903

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania standaryzowanego odczynnika zawierającego immunoglobuliny ludzkie klasy G o swoistości anty-D, zwłaszcza do badań serologicznych grup krwi człowieka, znamienny tym, że uzyskuje się roztwór o zawartości przeciwciał anty-D klasy IgG od 0,05-0,06 pg/ml przez rozcieńczenie substancji wyjściowej zawierającej immunoglobuliny, dogodnie za pomocą zbuforowanej soli fizjologicznej o odczynie pH 6,9-7,2, korzystnie 7, który bezpośrednio po tym stabilizuje się ludzką surowicą grupy krwi AB bądź albuminą: ludzką, bydlęcą w ilości 1% objętościowego, konserwuje, dogodnie azydkiem sodu w ilości 0,1% wagowego, po czym chłodzi w temperaturze od + 2 do + 8°C przez około 24 godziny.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancję wyjściową stosuje się osocze, surowicę ludzką od dawców immunizowanych, monoklonalne przeciwciała anty-D klasy IgS lub inną oczyszczoną immunoglobulinę tej klasy i swoistości.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się go w temperaturze najwyżej 35°C, a dogodnie w temperaturze pokojowej 18-23°C.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po procesie chłodzenia bada się aktywność serologiczną odczynnika, a następnie oznacza zawartość przeciwciał anty-D klasy IgG, które stanowią jego ściśle określoną wielkość.