PL184947B1

PL184947B1 - Heksapeptyd somatostatyny i środek farmaceutyczny wykazujący powinowactwo wiązania do przynajmniej jednego podtypu receptora somatostatyny

Info

Publication number: PL184947B1
Application number: PL96323943A
Authority: PL
Inventors: Albert┴Rainer; Bauer┴Wilfried; Bruns┴Christian; Chandramouli┴Nagarajan; Lewis┴Ian; Weckbecker┴Gisbert
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1995-06-29
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 2003-01-31
Also published as: WO1997001579A3; ES2169251T3; KR100454664B1; NZ313147A; ATE210152T1; TR199701718T1; DE69617687T2; US6225284B1; BR9609335B8; CN1156492C; PL323943A1; NO976064D0; NO976064L; CA2222524C; SK177097A3; SK284087B6; JP3445796B2; JPH11506108A; EP0835263B1; EP0835263A2

Abstract

1 . Heksapeptyd somatostatyny o wzorze (II) (II) w którym X1 jest reszta o wzorze (a) lub (b) (a) lub (b) w których R1 oznacza fenyl, korzystnie podstawiony przez halogen, metyl, etyl, grupe metoksy lub etoksy, R2 oznacza-Z1 -CH2 -R1 , -CH2 -CO-O-CH2 -R1 , grupe o wzorze 1 lub grupe o wzorze 2, przy czym 3. Heksapeptyd somatostatyny o wzorze cyklo[4-(NH2 -C2 H4-NH-CO-O-)Pro-Y-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe], w którym Y oznacza naturalny lub nienaturalny a-aminokwas. 4. Heksapeptyd somatostatyny, którym jest cyklo[{4-(NH2 -C2H4-NH-CO-O-)Pro}-Phe-DTrp-Lys-Tyr(O-ben- zylo)-Phe], cyklo[{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-Tyr-DTrp-Lys-Tyr(O-benzylo)-Phe] albo cyklo[{4-(NH2 -C2 H4-NH-CO- -O-)Pro}-Phe-DTrp-Lys-Ser(O-benzylo)-Phe]. 5. Srodek farmaceutyczny wykazujacy powinowactwo wiazania do przynajmniej jednego podtypu receptora somato- statyny, znamienny tym, ze zawiera heksapeptyd somatostatyny zdefiniowany w zastrz. 1 albo jego farmaceutycznie akceptowalna sól, albo jego kompleks z wykrywalnym pierwiastkiem w polaczeniu z jednym lub wiecej farmaceutycznie akceptowalnym nosnikiem lub rozcienczalnikiem. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest heksapeptyd somatostatyny i środek farmaceutyczny wykazujący powinowactwo wiązania do przynajmniej jednego podtypu receptora somatostatyny.

Somatostatyna jest znanym tetradekapeptydem o budowie:

I I

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Po raz pierwszy naturalną somatostatynę wyekstrahowano z podwzgórza ale następnie stwierdzono, że występuje ona również w komórkach wysepek trzustki.

Od czasu wyizolowania i scharakteryzowania naturalnej somatostatyny, wykazującej aktywność hamującą uwalnianie hormonu wzrostu, kontynuowane są poszukiwania silniejszych i stabilniejszychjej analogów. W wyniku tych poszukiwań otrzymano, między innymi, cykliczne peptydy somatostatynowe, ujawnione w opisach patentowych WO-A-9500553, WO-A-9400489 oraz EP-A-0 029 310.

Zgodnie z wynalazkiem, wprowadzono do cząsteczki somatostatyny charakterystyczne rodniki o wzorach (a) lub (b) i stwierdzono, że wprowadzenie ich nadaje tej grupie związków niezwykle korzystne właściwości.

Zgodnie z wynalazkiem heksapeptyd somatostatyny określony jest wzorem (II) cyklo[A-ZZ_a-(D/L)Trp-Lys-Xi-X₂] (II)

2 3 4 5 6

184 947 w którym Xj_jest resztą o wzorze (a) lub (b)

-NH-CH-COI

CH-O-CH₂-Ri (_a)

I ch₃ lub

-NH-CH-COI

CH₂ (b)

I r₂

We wzorach (a) i (b)

Rj oznacza fenyl, który jest korzystnie podstawiony przez halogen, metyl, etyl, grupę metoksy lub etoksy, a

R₂ oznacza Z₁-CH₂-R₁, -CH₂-CO-O-CH₂-Rj, grupę o wzorze 1 lub grupę o wzorze 2, przy czym

Zj jest O lub S.

We wzorze II

Χ2 oznacza α-aminokwas mający aromatyczną resztę na bocznym łańcuchu C_a lub jednostkę aminokwasową wybraną spośród Dab, Dpr, Dpm, His, (Bzl)HyPro, tienylo-Ala, cykloheksylo-Ala i t.-butylo-Ala,

A oznacza dwuwartościową resztę wybraną z Pro, (R₃-NH-CO-O)Pro-,

R₅-N-R₇-Pro, HO-R₇-Pro,

Ró grupę o wzorze 3, R_3aR_3bN-(CH₂)₁.₆-CO-NH-Pro-,

R_3aR_3bN-(CH₂) 1.6-S-Pro, R₃-NH-CO-O-R_bCH(NR₄)-CO-,

I I

R„-CH(NR₄)-CO- oraz -NR_4a-CH₂-CO-, gdzie R₃, oznacza NR₈R_g-C₂.-alkilen, ggianidyno-C₂.₆alkiien 1 ub C₂_₆alkiien-COOH, R_3a oznacza H, Cj- alkil lub ma niezależniejedno ze znaczeń podanych dla R₃, R_3b oznacza H lub C_Malkil, Ra oznacza OH lub NR5R6, Rb oznacza -(CH2)i.₃ - lub CH(CH,)-, R₄ oznacza H lub CH,, R₄a oznacza benzyl z dowolnie podstawionym pierścieniem, każdy z R5I R₆ oznacza niezależnie H, Cj- alkil, ω-amino- Cj- alkilen, ω-hydroksy- Cj- alkilen lub acyl, R₇ jest bezpośrednim wiązaniem lub Cj- alkilenem, każdy z R₈ i R9 oznacza niezależnie H, Cj_4 alkil, ω-hydroksy-C2-4alkilen, acyl lub CH2OH-(CHOH)_c-CH2- gdzie c oznacza 0 j 2,3 lub 4, lub R₈ i R9 tworzą razem z atomem azotu, do którego są przyłączone grupą heterocykliczną, która może zawierać kolejny heteroatom, a Rj j oznacza benzyl z dowolnie podstawionym pierścieniem, grupy -(C^j^-OH, CH3-CH(OH)- lub -(CH2)j-5-NR5R6 i

ZZa jest naturalnym lub nienaturalnym α-aminokwasem, przy czym związki o wzorze II występują w postaci wolnej albo w postaci soli, albo w postaci kompleksu.

Korzystnymi związkami o wzorze II są cykliczne heksapeptydy somatostatyny o wzorze: cyklo^-CN^^Hzt-NH-CO-O-^ro-Y-DTrp-Lys-TyrBzlj-Phe],

184 947 w którym Y oznacza naturalny lub nienaturalny α-aminokwas, cyklo[{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-Phe-DTrp-Lys-Tyr(O-benzylo)-Phe], cyklo[{4-(NH2-C2H₄-NH-CO-O-)Pro}-Tyr-DTrp-Lys-Tyr(O-benzylo)-Phe] albo, cyklo[{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro} -Phe-DTrp-Lys-Ser(O-benzylo)-Phe].

Heksapeptydy somatostatyny według wynalazku, występując w postaci wolnej, w postaci soli albo w postaci kompleksu z wykrywalnym pierwiastkiem, korzystnie zawierają boczną grupę aminową w pozycji 1, niosącą grupę chelatującą.

Środek farmaceutyczny wykazujący powinowactwo wiązania do przynajmniej jednego podtypu receptora somatostatyny, charakteryzuje się tym, że zawiera analogi somatostatyny określone wzorem (II), o znaczeniach podstawników określonych wyżej albo w postaci wolnej, albo w postaci soli, albo w postaci kompleksu z wykrywalnym pierwiastkiem i poza wymienionymi wyżej związkami o wzorze II zawieraj eden lub więcej farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub rozcieńczalnik.

Stosowane określenie „analog somatostatyny” odnosi się do peptydu liniowego lub cyklicznego pochodzącego od naturalnie występującej somatostatyny-14, zawierającej sekwencję podaną we wzorze I (D/L)Trp-Lys-Xi-X2 (I), o znaczeniach podstawników Xi i Χ2 podanych wyżej, w której dodatkowo pominięto jedną lub więcej jednostek aminokwasowych i/lub zastąpiono przez jedną lub więcej reszt aminokwasowych, i/lub w której jedną lub więcej grup funkcyjnych zastąpiono przez jedną lub więcej grup izosterycznych. Ogólnie pojęcie to obejmuje wszystkie zmodyfikowane pochodne natywnej somatostatyny-14 zawierające powyższą sekwencję o wzorze I, które mająpowinowactwo wiązania w zakresie nM do przynajmniej jednego podtypu receptora somatostatyny.

Lys, Xii Χ2 w sekwencji wzoru I mają konfigurację L, Trp może mieć konfigurację D- lub L,-, przy czym korzystna jest konfiguracja D-.

We wzorze II podstawnik - ZZ_a- może mieć konformację D lub L i może odpowiednio być np. Thr, Ser, Ala, Val, Ile, Leu, Nle, His, Arg, Lys, Nal, Pal, Tyr, Trp, dowolnie podstawioną w pierścieniu Phe lub N^ć-benzylo-Gli. Gdy ZZ_a oznacza Phe jej pierścień benzenowy może być podstawiony np. NH2, NO2, CH2, OCH₃ lub halogenem, korzystnie w pozycji para.

Gdy A obejmuje resztę aminokwasową proliny każdy podstawnik obecny na pierścieniu prolinowym np. R3-NH-CO-O- itp. jest korzystnie w pozycji 4. Taka podstawiona reszta proliny może występować w położeniu cis, np. grupie o wzorze 4, jak i w położeniu trans.

Wynalazek obejmuje każdy poszczególny izomer geometryczny związku o wzorze II i mieszaniny tych izomerów.

Gdy A jest (NR3R9- C2_₆alkileno-NH-CO-O)Pro-, gdzie NR₈R9 tworzy grupę heterocykliczną, może to być grupa aromatyczna lub nasycona zawierająca jeden atom azotu lub jeden atom azotu oraz drugi heteroatom wybrany spośród azotu i tlenu. Korzystnie heterocykliczna grupa jest np. grupą pirydylową lub morfolinową. C2_₆alkilenem w tej reszcie jest korzystnie -CH2-CH2-.

Każdy acyl jak R5, R$, R₈ i R9 w A może być np. R_nCO- gdzie R12 to H, C_Malkil, C2-4ailkenyl, C3.₆cykloalkil lub benzyl, korzystnie metyl lub etyl. Gdy R4a lub Ri jest benzylem o podstawionym pierścieniu, pierścień benzenowy może być podstawionyjak podano powyżej dla ZZa.

Preferowane grupy związków według wynalazku to związki o wzorze II, w którym A nie zawiera bocznej reszty -NH-CO-O-, a także związki o wzorze II, w którym A zawiera zasadową boczną resztę np.:

R5-N-R7- lub Ra-NH-CO-OR5-N-R7- lub R3-NH-CO-Ooraz związki, w któ wi podstawioną prolinę, zwłaszcza podstawioną w pozycji 4, np. grupa o wzorze 2, gdzie a jest proliną podstawioną w pozycji 4.

Szczególnie korzystne są związki, w których A oznacza 4-(R3-CO-O)Pro.

184 947

Dalsze reprezentatywne związki według wynalazku są to związki, w których występuje grupa aminowa niosąca grupę chelatującą szczególnie związki o wzorze II, w którym A grupa aminowa łańcucha bocznego niesie grupę chelatującą. Te związki, występujące w postaci wolnej, w postaci soli lub skompleksowane z wykrywalnym pierwiastkiem, są dalej nazywane chelatowymi związkami według wynalazku.

Odpowiednie grupy chelatujące są to grupy chelatujące fizjologicznie akceptowalne i zdolne do skompleksowania wykrywalnego pierwiastka. Korzystnie grupa chelatującąma charakter hydrofilowy. Przykłady grup chelatujących obejmują m.in.: grupy pochodzące od kwasów lub bezwodników aminopolikarboksylowych, np. pochodzące od niecyklicznych ligandów takich jak: kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA), kwas etylenoglikolo-0,0'-bis(2-aminoetylo)-N,N,N,,N'-tetraoctowy (EGTA), kwas N,N'-bis(hydroksybenzylo)etylenoamino-N,N'-dioctowy (HBED) i kwas trietylenotetraaminoheksaoctowy (TTHA), grupy pochodzące od podstawionego EDTA lub DPTA, np. p-izotiocyjano-benzylo-EDTA lub -DPTA, pochodzące od makrocyklicznych ligandów takich jak: kwas 1,4,7,10-tetraazocyklododekano-N-N-N^-N tetraoctowy (DOTA), kwas 1,-4,8,11 -tetnaazoyklododekano-N-N-NibT-tetraoctowy (TETA) lub kwas 1,4,7,10-tetracyklotridekano-N-N'-N-N-tetraoctowy(TITRA).

Grupa chelatująca może być przyłączona bezpośrednio albo przez przerywnik do grupy aminowej związku według wynalazku. Odpowiednie przerywniki znane w dziedzinie, są to przerywniki ujawnione w GB-A-2 225 579, na przykład dwuwartościową reszta kwasu aminokarboksylowego, korzystnie reszty β-ala lub reszta dwuwartościową, pochodzące z kwasu 6-aminokapronowego.

Preferowane grupy chelatujące pochodzą z DTPA, DOTA, TETA lub podstawionej EDTA lub DTPA, przy czym szczególnie preferowane są grupy chelatujące pochodzące od DTPA lub DOTA.

Przez wykrywalny pierwiastek rozumie się każdy pierwiastek, który wykazuje może być wykrywalny w terapeutycznych technikach diagnostycznych in vitro, np. jon metalu, który emituje wykrywalne promieniowanie lub jon metalu, który wpływa na właściwości relaksacyjne NMR.

Odpowiednie wykrywalne jony metali obejmują np. pierwiastki ciężkie lub jony ziem rzadkich np. stosowane przy CAT (computer axial scannig - tomografia komputerowa), jony paramagnetyczne np. Gd³⁺, Fe³⁺, Mn²⁺ i Cr², fluoryzujące jony metali np. Eu³⁺ i radionuklidy, np. radiolantanid, szczególnie radionuklidy emitujące promieniowanie γ, radionuklidy emitujące promieniowanie β, radionuklidy emitujące promieniowanie α, radionuklidy emitujące elektrony Auger, radionuklidy emitujące pozytrony, np. ^ć8Ga. Odpowiednie radionuklidy emitujące promieniowanie γ obejmują te, które są pożyteczne w technikach diagnostycznych. Radionuklidy emitujące promieniowanie γ korzystnie mają okres półtrwania odjednej godziny do 40 dni, korzystnie od 5 godzin do 4 dni, bardziej korzystnie od 12 godzin do 3 dni. Przykładem sąradionuklidy pochodzące od galu, indu, technetu, iterbu, renu, terbu, talu i samaru, np. 6^?Ga, ^1HIn, ^99mTc,¹⁶¹Tb,¹⁶⁹Yb i ^Re.

Odpowiednie radionuklidy emitujące promieniowanie β obejmują te, które są pożyteczne w technikach terapeutycznych na przykład 9°Y, 6?Cu, ^m’Re, ’88Re, i69Er, i²¹Sn, i²⁷Te, i43Pr, 198Au, i09Pd, ^Dy, 3²P, i⁴²Pr i i^%Sm.

Odpowiednie radionuklidy emitujące promieniowanie α obejmują te, które są pożyteczne w technikach terapeutycznych, np. 2ⁿAt, 2ⁿBi, lub 2°1Tl.

Związki według wynalazku mogą istnieć w postaci wolnej lub w postaci soli. Pojęcie „postać soli” obejmuje sole addycyjne z kwasami, zwłaszcza z kwasami organicznymi, polikwasami lub kwasami nieorganicznymi, przykładowo chlorowodorki i octany oraz podstawione lub nie-podstawione postacie soli, np. soli metali alkalicznych, takich jak sole sodowe, potasowe lub amonowe otrzymywalne w przypadku występowania grup karboksylowych kwasu, jeśli są one obecne w cząsteczce, np. w grupie chelatującej.

184 947

Związki według wynalazku wytwarza się znanymi sposobami, przy czym można stosować następujące warianty postępowania:

a) jeżeli peptyd somatostatyny zawiera reszty występujące we wzorze I w postaci zablokowanej, przez usuwanie przynajmniej jednej, obecnej w peptydzie grupy blokującej lub,

b) przez połączenie za pomocą wiązania amidowego, dla uzyskania pożądanej sekwencji aminokwasów, dwóch jednostek peptydowych, z których każda zawiera przynajmniej jeden aminokwas w postaci zablokowanej lub niezablokowanej i jeżeli jest to potrzebne przez przeprowadzenie czynności określonej w a) lub

c) przez usunięcie grupy funkcjonalnej zablokowanego albo niezablokowanego peptydu somatostatynowego lub przekształcenie go w ten sposób, że otrzymuje się inny zabloko wany lub niezablokowany peptyd; i przez przeprowadzenie, w drugim przypadku, czynności określonej w a) lub

d) przez wytworzenie chelatowego związku według wynalazku, stanowiącego połączenie chelatowego i niechelatowego związku według wynalazku, w postaci zablokowanej lub niezablokowanej, obejmującego wolną grupę aminową związaną z grupą chelatującą i przez przeprowadzenie czynności określonej w a) i następnie przez odzyskanie tak otrzymanych związków w postaci wolnej, w postaci soli lub dowolnie skompleksowanych z wykrywalnym pierwiastkiem.

Sposób określony jako b) prowadzi nie tylko do otrzymania liniowego peptydu, ale może też obejmować cyklizację przez wiązanie amidowe liniowego peptydu, prowadząc do wytworzenia cyklicznego peptydu, mającego pożądaną sekwencję aminokwasów. Jeśli jest to wskazane, łańcuch boczny obecny w A może być wprowadzony do aminokwasu przed sprzęganiem z peptydem, zgodnie ze sposobem określonym w b), lub może być wprowadzony do cząsteczki peptydu liniowego lub cyklicznego według sposobu określonego w c), np. związek o wzorze II gdzie A jest hydroksy-Pro może być przekształcony w związek o wzorze II, gdzie A jest R3-NH-CO-O-Pro.

Cyklizacja może być korzystnie przeprowadzona poprzez hydrazyd. Gdy peptyd liniowy jest przygotowywany na żywicy, na ogół nie ma zasadniczego znaczenia, który aminokwas znajdzie się w pozycji C-końcowej, pod warunkiem, że sekwencja aminokwasów w liniowym peptydzie odpowiada sekwencji w pożądanym analogu somatostatyny. Po cyklizacji liniowego peptydu nie można już określić, który aminokwas był na C-końcu liniowego peptydu. Ponieważ liniowy peptyd będzie cyklizowany, na ogół wybór pierwszego aminokwasu, który rozpoczyna łańcuch nie ma zasadniczego znaczenia, ale mogą występować różne inne czynniki, które będą preferować dany aminokwas. Korzystnie liniowy peptyd jest cyklizowany w taki sposób by wytwarzać wiązanie od Trp w pozycji 3 do ZZ_a w pozycji 2 lub z X₂ w pozycji 6 do X jw pozycji 5.

Skompleksowanie związku według wynalazku obejmującego grupę aminową podstawioną grupą chelatującą może być przeprowadzone przez reakcję chelatowego związku z odpowiednim związkiem dającym wykrywalny pierwiastek, np. solą metalu, korzystnie solą rozpuszczalną w wodzie. Reakcja może być przeprowadzona przez analogię ze znanymi metodami, np. ujawnionymi w Perrin, Organic Ligand, Chemical Data Series 22, NY Pergamon Press (1982), w Krejcarit i Tucker, Biophys. Biochem. Res. Com. 77:581 (1977) i Wagner i Welch, J. Nucl. Med 20:428 (1979).

Związki wyjściowe dla związków według wynalazku i sposoby ich wytwarzania sąznane.

W poniżej przedstawionych przykładach ilustruj ących wynalazek temperatury zostały podane w °C i zastosowano następujące skróty:

Bzl = benzyl = CH₂-fenyl przyłączony do tlenu lub siarki zgodnie z (a) lub (b)

DMF == dimetylofomaamid

BOC = trzecioreędowyy butylokorbonyl

Fmoc == 9-fluorenyiomefoksykorbonyl

TFA = kwas tnfluiofoctowy

DIPCI = diizopropyiocarbotliimld

DCCI = dicykioheksyiokarbodiimid

184 947

HOBt = hydroksybenzotriazol

Dab = kwas 2,4-diaminomasłowy

Dpr = kwas 2,3-diaminopropanowy

Dde = 4,4-dimetylo-2,6-dipksocykloheks-1-ylidenoetyl

RT = temperatura pokojowa

HyPro = 4-hydroksy-Pro (trans o ile nie podano inaczej)

Tic = kwas tetrahydroizochinolino karboksylowy,

Przykład 1. cyklo [HyPro-Phe-DTrp-.Lys-Tys(Bzl)-Phe]

Żywica Fmoc-Phe-SASRJN® (1,00 g, 0,65 mmola) jest przeprowadzana przez procedury syntezy Fmoc na fazie stałej aż powstanie pożądana żywica peptydowa SASRIN® Fmoc-(D)Trp-Lys(Boc)-Tys(Bzl)-Phe-Pro(y-t-OH)-Phe. Grupa Fmoc jest odblokowywana za pomocą piperydyny. Rozszczepienie żywicy peptydowej przeprowadza się za pomocą hydrazyny. Do 1,00 g żywicy peptydowej dodaje się 8,3 ml DMF i 1,24 ml wodzianu hydrazyny (około 15% wodzian hydrazyny w DMF). Następnie miesza się przez 15 godzin w RT. Po reakcji żywicę sączy się i dokładnie płucze DMF. Zbiera się przesącz i odparowuje w wysokiej próżni by powstał oleisty osad hydrazyny. Osad rozpuszcza się w wodzie i liofilizuje, aby uzyskać 480 mg liniowego produktu hydrazynowego H-(D)Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-HyPiO-Phe-NH-NH₂. Ten hydrazyd rozpuszcza się w 16 ml DNF, schładza do -20°C i poddaje działaniu 4N HCI w eterze (2,4 ml, 11,6 mmola) a następnie trzeciorzędowego azotanu butylu (41,3 pl, 0,348 mmola) i miesza przez 20 minut. Dodaje się diizopropyloetyloaminę (11,6 mmola, 2 ml) i miesza przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji usuwa się DMF pod wysoką próżnią. Do oleistej pozostałości dodaje się wody, co powoduje wytrącanie. Przeprowadza się ekstrakcję między octanem etylu i wodą. Fazy organiczne suszy się nad siarczanem sodu i wyodrębnia się produkt. Odblokowywanie przeprowadza się stosując TFA/woda 95 : 5 i izoluje się produkt stosując HPLC w odwróconej fazie. Przeprowadza się wymianę jonową frakcji zawierających produkt a po liofilizacji uzyskuje produkt tytułowy jako biały proszek, MH+ (FAB) 975, F = 1,24 [a ]^D22 = -39,0° (95% AcOH; c =0,1).

Przykład 2. cyklo[4- {NH2-C2H₄-NH-CO-O)Pro}-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe]

Fmoc-HyPro-OMe wkrapla się do roztworu trifosfogenu (0,6 równoważników) w THF. Po 1 godzinie dodaje się dimetyloaminopirydynę (1,0 równ.) i N-BOC diaminoetan (6,0 równ.) i reakcję miesza się w RT. Po analizie za pomocą TLC (chromatografii cienkowarstwowej) usuwa się rozpuszczalnik przez odparowanie w próżni i Fmoc-4-(N-BOC-aminoetyloaminokarbonyloksy)Pro-OMe ekstrahuje się z systemu dwufazowego octan etylu/0,1 M HCl aby uzyskać surowy produkt (MH+ = 554). Surowy ester metylowy wyizolowany powyżej następnie rozszczepia się do wolnego kwasu przez działanie 1 N NaOH w dioksanie/wodzie i produkt Fmoc-4-(aminoetyloaminokarbonyloksy)-Pro-OH oczyszcza się na żelu krzemionkowym, (MNa)+ = 562).

Żywica Fmoc-Phe-SASRIN® (1,0 g, 0,65 mmola) jest przeprowadzana przez procedurę syntezy Fmoc na fazie stałej do uzyskania pożądanej żywicy peptydowej Fmoc-(D)Trp(BOC)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Pro(y-t-N-BOC-diamino-etanokarbamoilo)-Phe-SASRIN. Fmoc odblokowuje się za pomocą piperydyny. Przecięcie żywicy peptydowej przeprowadza się przez działanie na nią w kolumnie szklanej 2% TFA w CH^Cf. Zobojętnia się za pomocą 1M roztworu NaHCO₃. Rozpuszczalnik odparowuje się w próżni i zablokowany liniowy peptyd poddaje się liofilizacji (MH+ = 1379,8). Zablokowany liniowy peptyd cyklizuje się przez działanie DCCl (6,0 równ.) i HOBt (6,0 równ.) przez okres 5 dni.

Następnie uzyskuje się odblokowanie za pomocą95 : 5 TFA: H2O i cykliczny peptyd oczyszcza się za pomocąpreparatywnego HPLC i wymianyjonowej do formy soli octanowej stosując żywicę jonowymienną AG4-X4 aby dać związek z tytułu (FAB-MH+ = 1061,7).

Przykład 3. cyklo[{4(morfolino-etylo-aminokarbonyloksy)-Pro}-Phe-DTrp-.Lys-Tyr(Bzl)-Phe]

Synteza przedłużenia hydroksyprolinowego przeprowadzana jest w następujący sposób: Fmoc-HyPro-OMe wkrapla się do roztworu trifosfogenu (0,6 równ.) w THF. Po 1 godzinie doda184 947 je się dimetyloaminopirydynę (1,0 równ.) i N-BOC diaminoetan (6,0 równ.) i reakcję miesza się w temperaturze pokojowej. Po analizie za pomocą TLC usuwa się rozpuszczalnik przez odparowanie w próżni i Fmoc-4-(morfolinoetyloaminokarbonyloksy)Pro-OMe oczyszcza się na żelu krzemionkowym, (MH+ = 52). Ester metylowy następnie rozszczepia się przez działanie 1N NaOH w dioksanie/wodzie i produkt Fmoc-4-(morfolinoetylaminokarbonyloksy)-Pro-OH oczyszcza się na żelu krzemionkowym, (MH+ 510).

Żywica Fmoc-Phe-SASRIN jest przeprowadzana przez procedurę syntezy Fmoc na fazie stałej w sposób analogiczny do podanego w poprzednim przykładzie aż do uzyskania pożądanej żywicy Fmoe-(D)Trp(Boe)-Lys(Boe)-Tyr(Bzl)-Phe-(morfolinoetylammokarbamino)-HyPro-Phe-SASRIN. Fmoc odblokowuje się za pomocąpiperydyny. Przecięcie żywicy peptydowej przeprowadza się przez działanie na nią 2% TFA w CItyCty w kolumnie szklanej. Przeprowadza się zobojętnienie za pomocą 1M roztworu NaHCO₃. Rozpuszczalnik odparowuje się w próżni i ochraniany liniowy peptyd cyklizuje się przez działanie DCCl (6,0 równ.) i HOBt (6,0 równ.) przez okres 5 dni. Następnie uzyskuje się odblokowanie za pomocą95 : 5 TFA: II₂O i cykliczny peptyd oczyszcza się za pomocą preparatywnego HPLC i wymianyjonowej do formy soli octanowej stosując żywicę jonowymienną AG4-X4 aby uzyskać związek tytułowy.

MH⁺(FAB): 1131, [a]^D22= -55,0° (95% AcOH; c = 0,1).

Przez powtórzenie procedury jak ujawniono poniżej, ale stosując odpowiednie materiały wyjściowe można uzyskać związki o wzorze:

cyk.lo[X- Y-DTrp-Lys-Z-Phe] w którym X, Y i Z są zdefiniowane w tabeli I.

Tabela I

Przykład	X	Y	Z	Dane fizyko-chemiczne MH+
1	2	3	4	5	6
4	4-HyPro	N-Bzl-Gly	Tyr(Bzl)	E.S.	975,7
5	Pro	Phe	Tyr(Bzl)	FAB	959
6	4-(NH₂-C2H4-NH-CO-O-)Pro	His	Tyr(Bzl)	E.S.	1051,5
7	id.	Ty	Tyr(Bzl)	FAB	1077
8	id.	Arg	Tyr(Bzl)	E.S.	1070,4
9	4-(NH2C₃H6-NH-CO-O-)Pro	His	Tyr(Bzl)	E.S.	1065,4
10	id.	Phe	Tyr(Bzl)	FAB	1075
11	id.	Tyr	Tyr(Bzl)	E.S.	^^91,7
12	4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro	Phe	Ser(pClBzl)	E.S.	1019,6
13	id.	Ala	Thr(Bzl)	E.S.	924,2
14	id.	Phe	Tyr(Bzl)	FAB	1047
15	id.	Trp	Tyr(Bzl)	FAB	1100
16	id.	Phe	Thr(Bzl)	E.S.	999,6
17	id.	Phe	Glu(Bzl)	E.S.	1027,7
18	4-(N[CH₃]2-C2H^^^H-CO-O-)Pro	Phe	Tyr(Bzl)	FAB	1089
19	4-(NH-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro 1 cooh₃	Phe	Tyr(Bzl)	E.S.	1103,6
20	NH2-C2H4-CO-O-NCH₃Ser	Tyr	Tyr(Bzl)	E.S.	1065,6

184 947

Tabela I - ciąg dalszy

1	2	3	4	5	6
21	MeSer	Phe	Tyr(Bzl)	FAB	963 1)
22	4-(pirydylo-C2H4-NM-CO-O)Pro	Phe	Tyr(Bzl)	FAB	1123 2)
23	4-(NH2-C5H₁₍)-NH-GO-O-)Pro	Phe	Tyr(Bzl)	FAB	1118 3)
24	4-HyPro	His	Tyr(Bzl)	E.S.	965,7
25	id.	Tyr	Glu(Bzl)	FAB	941
26	id.	Phe	Thr(Bzl)	FAB	913
27	4-NH2-Pro	Phe	Tyr(Bzl)	FAB	974 4)
28	N^aMe-Lys	Phe	Tyr(Bzl)	FAB	967
29	4-(NH2-C-NH-C₂H₄-NH-CO-O)Pro 1 NH	Tyr	Tyr(Bzl)	E.S.	1118,7
30	4-(NH2-G2H4-NH-CO-O-)Pro	Tyr	Thr(Bzl)	E.S.	1015,5
31	4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro	Phe	Ser(Bzl)	E.S.	985,1
32	4-(NI J2-C₂H4-NH-CO-O)Pro (cis)	Phe	Ser(Bzl)	E.S.	985,1
33	4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro	Ser	Thr(Bzl)	E.S.	939,0
34	4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro	Thr	Thr(Bzl)	E.S.	953,1
35	4-NH2-Pro-	Phe	Ser(Bzl)	E.S.	898,0
36	Ż^NCCiPk^FT-NH-CO-OUro	Phe	Ser(Bzl)	E.S.	1013,2
37	4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro	Tyr	Ser(Bzl)
38	4-NH2-Pro (cis)	Phe	Ser(Bzl)	E.S.	898
39	4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro	Ile	Thr(Bzl)
40	4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro	Phe	Cys(Bzl)

1) [α]°22 = -47,0° 955% AcOH; c = OJ)

2) [α]^d22 = -54,0° (95% AcOH; c = 0,1)

3) [α]°22 = -54,0° 955% AcOH; c = 0,1)

4) [α]^D22 = -99° 995% AcOH; c = 0,1) id. = idem *Peptyd z przykładu 29 można przygotować w sposób następujący:

Zablokowany peptyd cyklo[NH2-C(N=NH)-N-C2H4-NH-CO-O-)]-Pro-Tyr-JDrp>-Lys(Ddle)-Tyr(Bzl)-Phe montuje się na żywicy stosując procedurę syntezy opisaną w przykładzie 2. Zamiast N^c-Bos-Lys stosuje się N^cDde-Lys by preferencyjnie wprowadzić guanidyl w zasadowym łańcuchu bocznym reszty HyPro. Po zmontowaniu peptydu końcową grupę Fmoc usuwa się i peptyd cyklizuje i w końcu odblokowuje jak w przykładzie 2. Peptyd ten jest rozpuszczany w DMF i dodaje się diizopropyloetyloaminę (3 równ.) i HOBt (4 równ.) a następnie azotan 3,5-dimetylo-pyrazoiloformamidyny (4 równ.) i roztwór miesza się przez 72 godz. w RT. Mieszaninę reakcyjną odparowuje się w próżni i poddaje działaniu bezwodnej hydrazyny (2% w DMF) przez 30 minut by usunąć grupę Dde z Lys. Surowy peptyd z tytułu (przykład 29) oczyszcza się na HPLC w układzie acetonitrylu i wodnego fosforanu trietylamonu.

P r z y k ła d 41. cyklo[4-(NH2C2H4-NH-CO-O)Pro}-Ala-DTrp-Lys-Tyr(3-Bzl)-Phe] MH⁺(E.S.): 984,5

Przykład 42. cyklo[4-(NH₂C2H4-NH-CO-O)Pro)-p-NH2)-Phe-DTip-Lys-Tyr(3-BzJ)-Phe]

184 947

MH⁺(E.S.): 1076,6

Przykład 43. cyklo[4-HyPro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-b'Nal]

MH⁺(E.S.): 1025,5

Przykład 44. cyklo[4-HIyPro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Tyr]

MH⁺(E.S.): 991,6

Przykład 45. cyklo[MePhe-IHis-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Dab]

MH⁺(FAB): 1005

Przykład 46. Wzór5

a) cyklo[4-(NH2C₂H4-NH-CO-O)Pro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(e-Boc)-Tyr(Bzl)-Phe] mg cyklo[4-(NH2C2H4-NH-CO-O)Pro-Phe-DTrp-Lys-Tyire-Boc)-TyrQBzl)-Phe], 12 mg NaHCO₃ i 12 mg (BOC)₂O rozpuszcza się w 10 ml DMF/woda 7/3 i miesza w temperaturze pokojowej przez noc. Po odparowaniu rozpuszczalnika produkt tytułowy izoluje się za pomocą chromatografii cienkowarstowej stosując chlorek metylenu/metanol/kwas octowy^ 8/2/0,25 jako fazę ruchomą.

b) cyklo[4-(DPTA-NH₂CH4-NH-CO-O)Pro-Phe-DTrpLys-(e-Boc)-TyT(Bzl)-Phe].

Rozpuszcza się 120 mg hydrazydu-DPTA w 5 ml DMF i doprowadza się do pH 3 kropelkami eteru dwuetylowego/3N HCl. Po schłodzeniu do -15°C dodaje się 4 pl trzeciorzędowego nitrobutylu i roztwór 15 mg związku otrzymanego w (a) powyżej w 3 ml DMF zawierających 15 pl zasady Huniga. Po 4 godzinach usuwa się rozpuszczalnik przez odparowanie i pozostały osad odblokowuje się bez dalszego oczyszczania.

c) cyklo[4-(DPTA-NH-C2H4-NH-CO-O)Pro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe]

Na surowy produkt etapu (b) działa się 5 ml TFA/woda 95/5 w 0°C przez 10 minut. Po rozcieńczeniu 50 ml wody roztwór bezpośrednio przenosi się na kolumnę RP 18-HPLC i eluuje gradientem woda/acetonitryl/TFA0_)I%. Czyste frakcje łączy się i liofilizuje. FAB-MS: 1346,6.

Przykład 47. Związek z przykładu 46c znakowany ⁱⁿIn mg związku z przykładu 46c) rozpuszcza się w 5 ml 0,01 M kwasu octowego. Otrzymany roztwór przepuszcza się przez filtr Millex®-GV (Nazwa Rejestrowana) 0,22 pl, rozporcjowuje i przechowuje w -20°C. 1ⁿInCl₃ (Amersham, 1 mCi/100 ml) rozcieńcza się równą objętością 0,5 M octanu sodu i znakowanie przeprowadza się przez zmieszanie ligandu z roztworem InCl₃i łagodne mieszanie w temperaturze pokojowej. Następnie dodaje się bufor HEPES, pH 7,4 aby otrzymać roztwór W^M.

Przykład 48.cyklo[4-(DOTA-NH-C2H4-NH-CO-O)Pro-Phe-DTrp-Lys-Ser(Bzl)-Phe]

M.S.: 1371,57

Związek ten znakuje się za pomoco⁹⁰Y w następujący sposób: 20 pl ⁹⁰Y (1,2 mCi, 0,04 M HCl) dodaje się do 20 pl powyższego 50 pM związku (0,15 M N^Ac, 0,3% BSA, pH 4,5). Roztwór inkubuje się w 100° przez 15 minut. Pobiera się próbkę i rozcieńcza 4 mM DTPA (pH 4,5) przed analizą w C18 HPLC w fazie odwróconej aby ustalić ilość wolnego niezwiązanego ⁹⁰Y w mieszaninie reakcyjnej (co jest wskazane przez ilość [⁹⁰YDTPA]2’).

Przykład 49. Wzór 6

116 mg związku z przykładu 46a), 12 mg NaCNBH₃ i 2 równoważniki odpowiedniego aldehydu rozpuszcza się w 25 ml DMF/HOAc^, i trzyma w 60°C aż nie daje się wykryć wyjściowego materiału za pomocą TLC. Po usunięciu rozpuszczalnika pozostały osad oczyszcza się za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowymi (chlorek metylenu/metanol/HOAc_50O/o9/1/0,125 -> 8/2/0,25) aby oddzielić mono i dialkilowany produkt końcowy'.

i) Aldehyd: (D)-glukoza

Χ1 = HOCH2-(CHOH)4-CH2-X2 = H ES.-MH+ = 1225,4 ii) Aldehyd: (D)-glukoza

X1 = Χ2 = HOCH2-(CHOH)4-CH₂ES.-MH+= 1389,6 iii) Aldehyd: 2,3-O-izopropylideno-(D)-gliceraldehyd Χ1 = HOCH2-(CHOH)-CH₂- X₂ = H

184 947 iv) Aldehyd: 2,3-O-izopropylideno-(D)-gliceraldehyd X1 = Χ2 = HOCH2-(CHOH)-CH2- Χ2 = H ES.-MH+ = 1209,4

v) Aldehyd: hydroksyacetaldehyd X1 = Χ2 = HOCH2-CH2ES.-MH+ 1149,4

Związki według wynalazku w postaci wolnej lub w postaci farmaceutycznie akceptowalnych soli i kompleksów mają cenne właściwości farmakologiczne, co wykazały badania in vitro i in vivo i dlatego stosowanie ich jest wskazane w terapii.

W szczególności związki według wynalazku wiążą się przynajmniej z jednym podtypem receptora somatostatyny. Sklonowano i scharakteryzowano 5 podtypów receptorów somatostatyny SST-1, SST-2, SST-3, SST-4 i SST-5.

hSST-1, hSST-2, hSST-3 i ich sekwencje ujawnili Y. Yamadai wsp. w Proc. Nat. Acad. Sci, 89,251-255 (1992). hSST-4 i jego sekwencję ujawnili L. Rohrer i wsp. w Proc. Nat. Acad. Sci. 90,4196-4200 (1993). hSST-5 i jego sekwencję opisali R. Panetta i wsp. w Mol. Pharmacol. 45, 417-427, 1993.

Badanie wiązania może być przeprowadzone stosując membrany przygotowywane z selektywnych linii komórkowych hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 lub hSST-5, np. komórek CHO stabilnie eksprymujących hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 lub hSST-5.

Stosuje się tkankę mózgu lub przysadki, w których prowadzi się wizualizację hSST, np. za pomocą hybrydyzacji in situ i/lub autoradiografii receptorów. Membrany przygotowuje się korzystając ze znanych metod, np. metody ujawnionej przez J.C. Reubi i wsp. w J. Clin. Endocrinol. Metab 1987,65,1127-1137. Membrany produkowane z selektywnych pod względem hSST linii komórkowych, np. komórek CHO stabilnie eksprymujących hSST-1 lub hSST-2 lub hSST-3 lub hSST-4 lub hSST-5 inkubuje się w trzech powtórzeniach w całkowitej objętości 300 pl w 22°C przez 30 minut ze wzrastającymi stężeniami [R-Tyb-oktreotydu w buforze Hepes (pH 7,6) 10 mmol/l zawierającym 0,5% BSA. Inkubację kończy się przez szybkie przesączenie przez filtry szklane Whatman GF/B, które następnie płucze się cztery razy każdy 5 ml 10 mrmol/l Tris 150 mmol/litr NaCl w temperaturze lodu. Filtry liczy się w liczniku LKB przy wydajności liczenia 78%. Specyficzne wiązanie to całkowite wiązanie, od którego odejmuje się niespecyficzne wiązanie w obecności 1 pmol/l somatostatyny-14. Doświadczenia przeprowadza się w trzech powtórzeniach. Stała powinowactwa (K_D) i liczba miejsc wiązania wyliczane są na podstawie wykresów Scatcharda na podstawie danych.

Jak zostało podane dalej, związki według wynalazku wykazują np. w powyższych badaniach wiązania w stosunku do hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 i/lub hSST-5, wartości IC50 w zakresie nmolarnym, korzystnie IC50 od 0,1 do 10 nM (IC₅0 = stężenia dla połowy maksymalnej inhibicji w teście współzawodnictwa w wiązaniu stosując [1²⁵l-Tyr3]oktreoid, ten sam radioligand, który wskazano powyżej).

IC50 nM
Związek	hSSTR-1	hSSTR-2	hSSTR-3	hSSTR-4	hSSTR-5
Przykład 1	63,00	0,94	1,90	320,00	0,35
Przykład 2	4,60	2,30	0,93	490,00	0,46
Przykład 14	7,40	1,20	0,86	> 100	0,13
Przykład 31	0,50	0,80	3,90	3,60-	2,90
Przykład 32	3,80	0,13	57,00	7,90	2,00
Przykład 36	0,60	1,30	2,40	2,20	4,50

184 947

Co więcej, związki według wynalazku wykazują aktywność hamującą uwalnianie GH, na co wskazuje hamowanie uwalniania GH in vitro z hodowanych komórek przysadki. Przednie gruczoły przysadki z dorosłych szczurów płci męskiej kroi się w małe kawałki i rozprasza w 20 mM buforze HEPES z użyciem 1% trypsyny. Rozproszone komórki hoduje się cztery dni w MEM (Gibco) uzupełnionym 5% płodową surowicą cielęcą, 5% surowicą końską, 1 mM NaHCO₃, 2,5 nM deksametazonem, 2,5 mg/ml insuliny i 20 jedn./ml Pen/Strep. W dniu doświadczenia przyczepione komórki płucze się dwa razy pfżywkąKoebsa-Ringeta zbuforo waną20 mM HEPES i uzupełnionąó mM gluk<^^^i 0,2% BSA. Następnie komórki inkubuje się dwie do czterech godzin z badanym związkiem w obecności 3 x 10⁴⁹ M czynnika uwalniającego hormon. Ilość hormonu wzrostowego uwalnianego do pożywki mierzy się za pomocą testu radioimmunologicznego. Związki według wynalazku hamująuwalnianie GH w sposób zależny od stężenia od 10'^H do 1 θ'⁴ M. Związek z przykładu 2 ma IC₅₀ przy 0,4 nM.

Związki według wynalazku hamują także uwalnianie insuliny i/lub glukagonu, jak wykazano w standardowych testach z zastosowaniem szczurów płci męskiej. Substancje testowane podaje się w różnych, logarytmicznie różniących się dawkach używając przynajmniej 5 szczurów na dawkę. W jedną godzinę po podaniu substancji testowanej s.c. (podskórnie) pobiera się krew. Ocenę poziomów insuliny i glukagonu w surowicy krwi przeprowadza się za pomocą testu oadioimmluloiogicznegf. Związki według wynalazku sączynne w tym teście kiedy podane sąw dawce w zakresie od 0,02 do 1000, np. do 10 pg /kg s.c. Związek z przykładu 9 w dawce 1,8 pg/kgs.c, ma EC50 odnośnie wydzielania insuliny.

Związki według wynalazku są odpowiednio stosowane do leczenia zaburzeń o etiologii obejmującej lub związanej z nadmiernym wydzielaniem GH np. w leczeniu akromegalii jak i w leczeniu cukrzycy, szczególnie jej komplikacji, np.: angiopatii, retynopatii proliferacyjnej, objawów porannych, nefropatii i innych zaburzeń metabolicznych związanych z uwalnianiem insuliny lub glukagonu.

Związki według wynalazku hamują wydzielanie kwasu żołądkowego, zewnątrzwydzielnicze i wewnątrzwydzielnicze funkcje trzustki i sekrecję różnych peptydów przewodu pokarmowego, jak wskazano w standardowych testach stosując np. szczury z jelitowymi lub trzustkowymi przetokami, gdzie związki są aktywne w dawce od 0,01 do 10 mg/kg.

Związki według wynalazku są stosowane do leczenia zaburzeń żołądkowo-jelitowych, na przykład w leczeniu wrzodów trawiennych, przetok nabłonka jelitowego i trzustkowosk^ć^rnych, choroby i zespołu nadwrażliwościjelita grubego, zespołu poposiłkowego, zespołu wodnistych stolców, biegunki związanej z AIDS, biegunki wywołanej przez chemioterapię, ostrego lub przewlekłego zapalenia trzustki i nowotworów wydzielających hormony żoładkowo-jelitowe (np. guz wysepek powodujący biegunki, guzy wydzielające glukagon, gruczolaki wysepkowatokomórkowe, rakowiaki itp.) jak i krwawienie wewnątrzjelitowe.

Związki według wynalazku są także skuteczne w leczeniu guzów, które mają receptory na somatostatynę, w szczególności guzów niosących receptory hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 i/lub hSST-5 co wykazano w testach proliferacji z różnymi liniami komórkowymi niosącymi takie receptory somatostatynowe.

Linia komórek guza trzustki szczura AR42J pochodzi od zewnątrzwydzielniczego guza trzustki wywołanego azaserynąJessop i Hay, 1980). Regularnie sprawdza się obecność mykoplazm stosując barwienie bisbenzimidem i test hybrydyzacji GenProbe (San Diego, CA). Hodowle hoduje się na DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) w 5% CO₂. Komórki hoduje się bez antybiotyków i związków przeciwgrzybowych. Subkonfluentne komórki AR42J poddaje się trypsynizacji, rozcieńcza w DMEM + 2,5% FCS i zaszczepia na niepowlekanych płytkach z 96 studzienkami. Po inkubacji 48 godzinnej (dzień 0) liczba komórek w oddzielnej płytce kontrolnej jest ustalana zarówno przez liczenie komórek w liczniku Coultera jak i w kolorymetrycznym pomiarze SRB. Komórki następnie eksponuje się na związek, który ma być badany przez 2 do 5 dni w różnych stężeniach a następnie liczy się je. W tych warunkach związki według wynalazku hamują proliferację komórek guza w stężeniu od 10^² do 10'⁶ M. Związek z przykładu 2 ma IC50 przy 0,7 ± 0,3 (SE) nM.

j4 j84 947

Badanie wzrostu guzów in vivo

Samice myszy typu nude (nu/nu Balbc-A od IFFA Credo, Lyon, Francja) ważące j9-22 g trzymane są w grupach 5 zwierząt w klatkach z makrolonu (typ III, ł6 x 22 xU cm). Siatki umieszcza się w przewietrzanych szafach (Iffa Credo) utrzymywanych w 24 ± UC. Zwierzęta mają wolny dostęp do wody pitnej i dietę dla gryzoni wolną od patogenów (Dieta A, Kliba, Bazylea, Szwajcaria). Aby zainicjować nowotwory z hodowanych komórek, komórki AR42J poddaje się trypsynizacji i 5-10x10-4 komórek nowotworowych (w 0,2 ml) wstrzykuje się podskórnie (s.c) w oba boki myszy nude. 2-4 dni po zaszczepieniu rozpoczyna się leczenie, podając związek, który ma być testowany korzystnie w formie ciągłego wlewu np. w tempie K) do 50 pg/kg/godz. Wielkość guza oznacza się stosując cyrkiel kalibrowy. Aby obliczyć objętość guza stosuje się równanie objętość (elipsoidy) = długość x głębokość x wysokość x 0,52. Do obliczeń statystycznych stosowany jest test t Studenta. W tym oznaczeniu związek z przykładu 2 hamuje wzrost guza w dniu U o 5j% w porównaniu z kontrolą z soli fizjologicznej.

Związki według wynalazku są więc pożyteczne w leczeniu złośliwych chorób proliferacji komórek np. guzów nowotworowych, szczególnie guzów niosących receptory somatostatyny typów, na które działają związki np. jak ujawniono poniżej dla związków chelatowych.

Związki według wynalazku majątakże hamujący efekt na angiogenezę, jak wykazano w testach standardowych, np. na nagich myszach jak ujawniono poniżej.

Myszy znieczula się podając 400 mg/kg wodzianu chloralu (Sigma) i.p. Komórki guza (0J do D x W6 w 0J ml) (komórki SiHa i komórki MDA-MB-23 j przygotowane jak ujawniono w Angiogenesis, Red. E. Steiner, RB. Weisz i R. Langer, j992, Szwajcaria) są wszczepiane podskórnie. Na ogół zaszczepia się dwa miejsca w śródbrzuszu myszy które są umieszczone daleko od głównych brzusznych naczyń skórnych, tak że liczba naczyń w tle jest niska. Grupy kontrolne otrzymują0, j ml 0,02 % błękitu trypanu w PBS. D dni po wstrzyknięciu znieczulone myszy zabija się podając im do wdychania CO₂. Skórę nakłada się na plastikowy pierścień (40 mm średnicy) dla oceny za pomocą mikroskopu odwróconego (Zeiss IM) przy powiększeniu j2,5 i 25. Jako miarę angiogenezy fotografuje się naczynia i liczy się te, które sąbezpośrednio połączone z guzem. U zwierząt kontrolnych liczy się naczynia, które są związane z konkretnym obszarem wokół miejsca wstrzyknięcia. Obszar ten odpowiada średniej powierzchni guzów skórnych, którą ustala się za pomocą cyrkla kalibracyjnego według równania 3,ł4 x r². Związki badane podaje się s.c. albo w dniu wstrzyknięcia guza albo 3 dni później. Zwierzętom kontrolnym podaje się nośnik. W tym oznaczeniu związki według wynalazku hamują wytworzenie naczyń krwionośnych gdy są podane w dawce np. 0,0ł do W00 pg/kg s.c.

Związki według wynalazku są więc dodatkowo pożyteczne do zapobiegania lub leczenia angiogenezy, chorób zapalnych i retynopatii.

Związki według wynalazku mają też efekt hamujący na proliferację i migrację komórek mięśni gładkich, co wykazują następujące testy.

Przewlekłe odrzucanie alloprzeszczepów

Związki według wynalazku hamują przewlekłe odrzucanie alloprzeszczepów nerki szczura. Nerkę samca szczura DA (RT!) transplantuje się ortotropowo do odbiorcy samca Lewis (RT¹). W sumie transplantacje przeprowadza się u 24 zwierząt. Wszystkim zwierzętom podaje się cyklosporynę w stężeniu 7,5 mg/kg/dzień doustnie przez M dni poczynając od dnia przeszczepu, aby zapobiec ostremu odrzucaniu komórkowemu. Nie przeprowadza się kontralateralnej nefrotomii. Każda grupa doświadczalna traktowana odrębną dawką związku według wynalazku lub placebo składa się z sześciu zwierząt.

Poczynając od 53-64 dni po przeszczepie, biorcom podaje się przez 69-72 dni związki według wynalazku lub placebo za pomocą wlewu. W ł4 dni po transplantacji mierzy się perfuzję narządu stosując MRI. Pomiar powtarza się 53-64 dni po transplantacji i pod koniec doświadczenia. Następnie u zwierząt przeprowadza się autopsję. Podanie związku według wynalazku np. związku z przykładu 31 w dawce od j do D pg/kg/h w tym modelu alloprzeszczepu nerki daje lepszą perfuzję narządu. Stwierdzono także ostry spadek poziomów IGF.

184 947

Plastyka naczyń

Badania plastyki naczyń przeprowadza się na modelu uszkodzeń przez cewnik balonowy, cewnikowanie balonowe przeprowadza się w dniu 0, zasadniczo zgodnie z opisem Powell i wsp. (1989). Pod znieczuleniem izofluranowym wprowadza się cewnik Fogarty 2F do lewej wspólnej tętnicy szyjnej i napompowuje się go (rozciągnięcie -10 pi H₂O). Napompowany balonik usuwa się wzdłuż długości wspólnej tętnicy szyjnej trzy razy, przy dwóch ostatnich razach kręcąc delikatnie by uzyskać równomierne usunięcie nabłonka. Następnie usuwa się cewnik, umieszcza podwiązkę wokół zewnętrznej tętnicy szyjnej aby zapobiec krwawieniu i pozwala się zwierzętom powrócić do zdrowia.

Do badań stosuje się 2 grupy 12 szczurów RoRo (400 g, około 24 tygodnie), grupę kontrolną! grupę otrzymującą związek według wynalazku. Szczury sąw pełni randomizowane podczas wszystkich kontaktów, procedur eksperymentalnych i analizy.

Związek, który ma być badany podawany jest przez ciągły wlew stosując minipompy w tempie 10-50 pg/kg/h rozpoczynając 3 dni przed uszkodzeniami spowodowanymi balonem (dzień -3) do końca badań, 14 dni po uszkodzeniu balonowym (dzień +14). Szczury trzyma się w indywidualnych klatkach i podaje się im karmę i wodę ad libitum.

Szczury znieczula się następnie za pomocąlzofluranu, cewnik perfuzyjny wsadzony przez lewą komorę i zabezpieczony w łuku aorty i kaniula aspiracyjna wsadzona do prawej komory. Zwierzęta perfunduje się pod ciśnieniem perfuzyjnym 150 mmHg, najpierw przez 1 min z 0,1 M solą buforowaną fosforanem (PBS, pH 7,4) i następnie przez 5 min z 2,5% glutaraldehydem w buforze fosforanowym (pH 7,4). Następnie wycina się tętnice szyjne, oddziela od otaczającej tkanki i zanurza w 0,1 M buforze kakodylanowym (pH 7,4) zawierającym 7% sacharozę i inkubuje przez noc w 4°C. Następnego dnia tętnice szyjne zanurza się i wytrząsa przez 1 godz w temp, pokojowej w 0,05% KMnO₄ w 0,1 M kakodylanie. Tkanki następnie odwadnia się w serii stężeń etanolu:: 2 x 10 min w 75%, 2x10 min w 85%, 3x10 min w 95% i 3 x 10 min w 100% etanolu. Odwodnione tętnice szyjne następnie zatapia się w Technovit 7100 według zaleceń producenta. Związek zatapiający pozostawia się przez noc do polimeryzacji w eksykatorze pod argonem.

Tnie się skrawki o grubości 4 pm ze środkowego przekroju każdej tętnicy szyjnej twardym metalowym nożem z kręcącym się mikrotomem i barwi przez 2 minuty barwnikiem Giemzy. Z każdej tętnicy szyjnej przygotowuje się około pięć skrawków i przekrojów mięśniówki, błony wewnętrznej naczyń i światła i ocenia morfometrycznie za pomocą systemu analizy obrazu (MCI D Toronto, Kanada).

W tym pomiarze związki według wynalazku hamują proliferację błony wewnętrznej naczyń gdy podawane sąw formie ciągłego wlewu w dziennych dawkach od 0,2 do 10 mg/kg, korzystnie 0,05 do 5 mg/kg.

Związki według wynalazku są więc także pożyteczne w zapobieganiu lub zwalczaniu chorób związanych z przeszczepem naczyń, np. miażdżycy przeszczepionych naczyń, np. przy przeszczepie narządu np. serca, płuc, łącznie serca i płuc, wątroby, nerek lub trzustki, lub dla zapobiegania lub leczenia nawrotu zwężenia i/lub zamknięcia naczynia po uszkodzeniu naczyń np. plastyce naczyń.

Dla wszystkich wyżej wymienionych wskazań wymagana dawka będzie oczywiście różna w zależności od, na przykład, związku według wynalazku, którego użyto, gospodarza, drogi podawania i ostrości leczonego stanu. Jednak na ogół zadawalające wyniki uzyskuje się po podaniu około od 1 pg do 0,5 mg/kg/dzień związku. Wskazana dzienna dawka, dla pacjentów jest w zakresie od około 2 pg do około 20 mg, korzystnie około 0,01 do około 20 mg, np. około 10 do około 5 000 pg s.c. związku odpowiednio podanego w dawkach podzielonych około 3 razy dziennie w postaci jednostkowych dawek zawierających na przykład od około 0,5 pg do około 10 mg, korzystnie od około 2 pg do około 10 mg związku lub w postaci podawania o przedłużonym uwalnianiu.

Związki według wynalazku mogąbyć podawane w postaci wolnego związku lub w postaci farmaceutycznie akceptowalnej soli lub farmaceutycznie akceptowalnych kompleksów. Takie sole i kompleksy oraz środek farmaceutyczny według wynalazku są przygotowywane w sposób konwencjonalny. Sole i kompleksy mogą wykazywać ten sam rząd aktywności jak wolne związki.

184 947

Związki według wynalazku lub farmaceutycznie akceptowalna sól lub jej kompleks mogą być podawane dowolną konwencjonalną drogą, przykładowo: dojelitowo, w postaci roztworów lub zawiesin nadających się do wstrzyknięć lub w postaci odpowiedniej do podawania do nosa lub w postaci czopków.

Związki według wynalazku stosowane sąjako leki, przy zapobieganiu lub leczeniu zaburzeń opisanych powyżej, u pacjentów potrzebujących takiego leczenia. Leczenie polega na podaniu pacjentowi skutecznej ilości związku według wynalazku np. związku o wzorze Ii lub farmaceutycznie akceptowalnej soli lub kompleksu, lub też środka farmaceutycznego według wynalazku.

Chelatowe związki według wynalazku lub ich farmaceutycznie akceptowalne sole są stosowane jako środek kontrastujący, np. do wizualizacji guzów i przerzutów mających receptory dla somatostatyny, chorób zapalnych lub autoagresyjnych wykazujących receptory somatostatyny, gruźlicy lub odrzutów narządów po przeszczepach, zwłaszcza gdy są skompleksowane z radionuklidem emitującym promieniowanie y lub pozytrony, np. ^H1In, ⁿ⁴1Tb lub 86γ lub jako radiofarmaceutyk do leczenia in vivo guzów i przeszczepów somatostatyno-dodatnich, gośćca przewlekłego postępującego i ostrych stanów zapalnych gdy jest skompleksowany z radionuklidem emitującym promieniowanie α lub β lub nuklid z kaskadami Augera-e' np. 9°Y, 61Tb, 211 At, 213Bi, 201Tl jak wykazano za pomocą standardowych testów⁷.

W szczególności obserwuje się, że związki chelatowe, np. schelatowane z ^HIIn, 88γ, 90γ, 1⁵³Sm, *86Re lub 161Tb wiążą się z dobrym powinowactwem do receptorów somatostatyny z wartościami pKi od około 8 do 10. Związek z przykładu 47 ma wartość Ic^j 1,2 nM w stosunku do hSST-2, 0,65 nM w stosunku do hSST-3 i 0,30 nM w stosunku do hSST-5.

Powinowactwo związków chelatowych i ich kompleksów do receptorów somatostatyny może być także wykazane za pomocąbadań in vivo, stosując standardowe testy np. ujawnione w GB-A-2,225,579. Naprzykład związek z przykładu 47 daje znaczącą akumulację w guzie 4 godziny po wstrzyknięciu do myszy lub szczurów niosących zewnątrzwydzielniczy guz trzustkowy niosący receptory SST-2.

Po podaniu chelatowego związku w postaci kompleksu, np. związku schelatowanego¹11ln, 86γ lub ^]61Tb w dawce od 1 do 5 mg/kg wyznakowane 0,1 do 5 mCi radionuklidu, korzystnie z 0,1 do 2 mCi, miejsce staje się widoczne wraz z narządami, w których zasadniczo zachodzi wydzielanie.

Chelatowe związki, gdy są wyznakowane za pomocą radionuklidu emitującego promieniowanie α lub β lub nuklidu z kaskadami Auger-e- mają działanie antyproliferacyjne i/lub cytotoksyczne na komórki nowotworowe niosące receptory somatostatyny, m.in. wykazano to w testach na myszach „nude”.

Nagie myszy zaszczepia się komórkami guza trzustki szczura AR42J lub ludzkiego drobnokomórkowego raka płucajak ujawniono powyżej. Gdy guzy osiągająobjętość 1 do2cm³zwierzęta dzieli się losowo do grup testowych i kontrolnych. Zwierzęta kontrolne otrzymująnieznakowany związek lub chelatowy związek w formie skompleksowanej poprzez wstrzyknięcie

i.p. lub i.v. w dawkach odpowiadających naj wyższej dawce grup traktowanych. Podaje się dawki do 40 mCi/mysz. Wielkość guzów mierzy się za pomocą cyrkla kalibracyjnego jak przedyskutowano powyżej. Do obliczeń statystycznych stosuje się test t Studenta. W tym teście obserwuje się przejściowe zmniejszenie się guzów do 50% początkowej wielkości i wzrost guzów jest opóźniany przez dwa tygodnie po pojedynczym podaniu związku z przykładu 48. W przeciwieństwie, grupy kontrolne wykazująciągły wzrost guzów z czasem podwojenia objętości około siedmiu dni.

Związki według wynalazku są stosowane jako związki chelatowe do wykrywania in vivo komórek i tkanek somatostatyno-dodatnich u pacjenta i zapisywania lokalizacji receptorów tego chelatu oraz jako związki radioaktywnie znakowane jako czynnik uwidaczniający, który może być podawany dootrzewnowo, np. w postaci wstrzykiwanych roztworów lub zawiesin, korzystnie jako pojedynczy zastrzyk. Korzystne jest przeprowadzanie znakowania krótko przed podaniem pacjentowi.

184 947

Związek chelatowy jest podawany, korzystnie, w dawce obejmującej 0,2 do 20 mCi stabilnie skompleksowanego radionuklidu, szczególnie korzystnie 1 do 10 mCi.

U zwierząt wskazany zakres dawki związku chelatowego skompleksowanego z 0,02 do 0,5 mCi radionuklidu emitującego promieniowanie y wynosi od 0,1 do 1 pg/kg. U większych ssaków, na przykład, u ludzi, wskazany zakres dawki chelatowego związku skompleksowanego np. z 1 do 10 mCi ^1HIn lub ⁸⁶Y może wynosić 1 do 20 pg.

Związki chelatowe według wynalazku, np. związek chelatowy o wzorze II w formie skompleksowanej są stosowane ponadto do leczenia in vivo nowotworów i przerzutów somatostatyno- dodatnich.

Dawki stosowane w praktycznych radioterapeutycznych zastosowaniach niniejszego wynalazku będąoczywiście różnić się w zależności od stanu, który ma być leczony, na przykład znanej radiotoksyczności w stosunku do normalnych narządów wyrażających receptory SST-2, objętości guza i pożądanej terapii. Ogólnie, dawkajest liczona na podstawie farmakokinetyki i rozmieszczenia radioaktywności do zdrowych narządów i obserwowanego pobierania w miejscu docelowym. Kompleks chelatowego związku emitującego promieniowanie β może być podawany wielokrotnie np. przez okres od 1 do 3 miesięcy.

Dla zwierząt wskazany zakres dawki chelatowego związku skompleksowanego z 15 do 70 mCi ⁹0γ lub ^Tb wynosi 20 do 100 pg/kg.

Chelatowe związki według wynalazku w postaci kompleksu mogąbyć podawane dowolną konwencjonalną drogą w szczególności dootrzewnowe lub dożylnie, np. w postaci wstrzykiwanych roztworów lub zawiesin. Mogą też korzystnie być podawane w postaci wlewów, np. wlewu trwającego 30 do 60 minut. W zależności od miejsca występowania guza, mogą być podawane tak blisko jak to jest możliwe do miejsca guza np. za pomocą cewnika.

Chelatowe związki według wynalazku w formie kompleksu mogą być odpowiednie do wizualizacji lub terapii guzów takich jak przysadkowe, żołądkowo-jelitowo-trzustkowe, rakowiaki, nowotwory ośrodkowego układu nerwowego, sutka, stercza, jajnika i jelita grubego, drobnokomórkowy rak płuca, przyzwojaki, raknerki, rak skóry, nerwiaki niedojrzałe, guzy chromochłonne, rak rdzeniasty tarczycy, szpiczaki, chłoniaki, chłoniaki Hodgkina i nie-Hodgkina, nowotwory kości i ich przerzuty i gościec przewlekły postępujący.

Środek farmaceutyczny zawierający chelatowy związek według wynalazku w postaci wolnej lub skompleksowanej wraz z jednym lub większą ilością farmaceutycznie akceptowalnych nośników lub ich składników jest wytwarzany w sposób konwencjonalny i jest stosowany do obrazowania, np.: w formie zestawu obejmującego dwie oddzielne dawki, jednąz nich jest radionuklid a drugą nieskompleksowany chelat. Zestaw zawiera instrukcję jak obydwa składniki mieszać. W radioterapii, chelatowe związki według wynalazku w postaci wolnej lub kompleksu są być korzystnie stosowane jako radioaktywny preparat płynny.

j84 947 ~\θ)— OCHj-(oV-OH

Cą-R,

Wzór j ^Ra’(^CHs)_M-N-N

I

O-coWzór 2

γ°.

S ęi^Phe-DTrp

O

Phe-Tyr(Bzl)-Lys

Wzór 6

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Heksapeptyd somatostatyny o wzorze (II) cyklo[A-ZZ_a-(D/L)Trp-Lys-Xi-X₂] (II)

1 2 3 4 5 6 w którym Xj jest resztą o wzorze (a) lub (b)

-NH-CH-COI

CH-O-CHj-Rj (a)

I ch₃ lub

-NH-CH-COI r₂ w których

Rj oznacza fenyl, korzystnie podstawiony przez halogen, metyl, etyl, grupę metoksy lub etoksy,

R₂ oznacza -ZpCH^R,, -CH₂-CO-O-CH₂-R_b grupę o wzorze 1 lub grupę o wzorze 2, przy czym

Zj oznacza O lub S oraz

X₂ oznacza α-aminokwas mający aromatyczną resztę na bocznym łańcuchu C_a lub jednostkę aminokwasową wybraną spośród Dab, Dpr, Dpm, His, (Bzl)IIyPro, tienylo-Ala, cykloheksylo-Ala i t.-buty ło-Ala,

A oznacza dwuwartościową resztę wybraną z Pro, (R₃-NH-CO-O)Pro-,

R₅-N-R₇-Pro, HO-R₇-Pro,

I I I

R6 grupę o wzorze 3, R_3aR_3bN-(CH₂)i^-CO-NH-Pro-,

R₃a^R3bN-(CH₂), ₆-S-Pro, R₃-NH-CO-O-R_bCH(NR₄)-CO-,

I I

R_n-CH(NR₄)-CO- oraz -NR_4a-CH₂-CO-, gdzie R₃ oznacza NRgRę-C^alkilen, guanidyno-C₂.₆alkilen lub C₂.₆alkilen-COOH, R_3a oznacza H, C,_₄ alkil lub ma niezależnie jedno ze znaczeń podanych dla R₃ R_3b oznacza H lub C_Malkil, Ra oznacza OH lub NRjR^, Rt, oznacza -(CH^- lub -CH-(CH₃)-, R₄ oznacza H lub CH₃, R_4a oznacza benzyl z dowolnie podstawionym pierścieniem, każdy z R_s i R₆ oznacza niezależnie H, Cj^alkil, Ci>ammo-C_Malkilen, o>hydroksy-C_Malkilen lub acyl, R₇ jest bezpośrednim

184 947 wiązaniem lub C^alkilenem, każdy z R₈ i R9 oznacza niezależnie H, C,- alkil, ω-hydroksy-C₂-₄alkilen, acyl lub CH₂OH-(CHOH)_c-CH₂- gdzie c oznacza 0,12,3 lub 4, lub R₈ i R tworzą razem z atomem azotu, do którego są przyłączone grupę heterocykliczną, która może zawierać kolejny heteroatom, a R_n oznacza benzyl z dowolnie podstawionym pierścieniem, grupy -(CH2), 3-OH, CH₃-CH(OH)- lub -(CH2)j-5-NR₅R6 i

ZZ_a jest naturalnym lub nienaturalnym α-aminokwasem, przy czym związek o wzorze II występuje w postaci wolnej albo w postaci soli, albo w postaci kompleksu.
2. Heksapeptyd somatostatyny według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera bocznągrupę aminowąw pozycji 1, z przyłączoną grupą chelatującą i występuje jako wolny związek, w postaci soli albo w postaci kompleksu z wykrywalnym pierwiastkiem.
3. Heksapeptyd somatostatyny o wzorze cyklo[4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro-Y-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe], w którym Y oznacza naturalny lub nienaturalny α-aminokwas.
4. Heksapeptyd somatostatyny, którymjest cyklo[{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-Phe-DTip-Lys-Tyr(O-be^lo)--^l^e],eyklo[{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-TyT-DTrp-Lys-Tyr(O-benzylo)-Phe] albo cyklo[{4-(NH₂-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-Phe-DTrp-Lys-Ser(O-benzylo)-Phe].
5. Środek farmaceutyczny wykazujący powinowactwo wiązania do przynajmniej jednego podtypu receptora somatostatyny, znamienny tym, że zawiera heksapeptyd somatostatyny zdefiniowany w zastrz. 1 albo jego farmaceutycznie akceptowalną sól, albo jego kompleks z wykrywalnym pierwiastkiem w połączeniu z jednym lub więcej farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.
6. Środek farmaceutyczny według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera heksapeptyd somatostatyny, zdefiniowany w zastrz. 2 albo jego farmaceutycznie akceptowalną sól, albo jego kompleks z wykrywalnym pierwiastkiem.
7. Środek farmaceutyczny według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera heksapeptyd somatostatyny, zdefiniowany w zastrz. 3 albo jego farmaceutycznie akceptowalną sól, albo jego kompleks z wykrywalnym pierwiastkiem.
8. Środek farmaceutyczny według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera heksapeptyd somatostatyny zdefiniowany w zastrz. 4 albo jego farmaceutycznie akceptowalną sól, albo jego kompleks z wykrywalnym pierwiastkiem.

* * *