PL185182B1 - Sposób identyfikacji genów o miejscowo-swoistej albo miejscowo-wybiórczej ekspresji w swoistych nowotworowych komórkach docelowych oraz zastosowanie sposobu identyfikacji genów - Google Patents
Sposób identyfikacji genów o miejscowo-swoistej albo miejscowo-wybiórczej ekspresji w swoistych nowotworowych komórkach docelowych oraz zastosowanie sposobu identyfikacji genówInfo
- Publication number
- PL185182B1 PL185182B1 PL97329038A PL32903897A PL185182B1 PL 185182 B1 PL185182 B1 PL 185182B1 PL 97329038 A PL97329038 A PL 97329038A PL 32903897 A PL32903897 A PL 32903897A PL 185182 B1 PL185182 B1 PL 185182B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- isolated
- target cells
- genes
- specific
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 title claims description 25
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 72
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 42
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 32
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 claims abstract description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 90
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 6
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 3
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 206010026673 Malignant Pleural Effusion Diseases 0.000 claims 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 13
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 12
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 11
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 5
- 210000002418 meninge Anatomy 0.000 description 4
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 2
- 206010027459 Metastases to lymph nodes Diseases 0.000 description 2
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010027452 Metastases to bone Diseases 0.000 description 1
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 1
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 206010006007 bone sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- 230000017239 negative regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000019532 positive regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
1. Sposób identyfikacji genów o miejscowo-swoistej albo miejscowo-wybiórczej eks- presji w swoistych nowotworowych komórkach docelowych obecnych w srodowisku ko- mórkowym innym niz ich miejsce pochodzenia albo nie bedacym ich miejscem pochodzenia, znamienny tym, ze komórki docelowe poczatkowo wykrywa sie i izoluje przez kolejne procedury immunomagnetyczne w celu otrzymania nawet 100% swoistych komórek docelo- wych przed poddaniem tych komórek znanym sposobom klonowania genów, w których porównuje sie nieznane geny rózniace sie poziomem ekspresji mRNA w komórkach doce- lowych izolowanych z róznych tkanek. PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji genów o miejscowo-swoistej albo miejscowo-wybiórczej ekspresji w swoistych nowotworowych komórkach docelowych oraz zastosowanie sposobu identyfikacji genów różnorodnie wyrażanych w nowotworowych komórkach docelowych wyizolowanych z różnych tkanek.
Wiadomo, że wiele rodzajów nowotworów wykazuje typowy wzorzec rozsiewu, taki, że przerzuty pojawiają się w wybiórczo w pewnych tkankach i narządach, często w sposób uporządkowany. Tak więc, przerzuty raka sutka zwykle rozwijają się najpierw w węzłach chłonnych pachowych, podczas gdy przerzuty do szpiku i kości stanowią pierwsze i główne miejsce przerzutów odległych (50%). Wśród innych tkanek, wątroba, płuca i ośrodkowy układ nerwowy (ponad 20%) stają się miejscem przerzutów raka sutka. Podobnie, rak stercza daje przerzuty do kości; czerniak do węzłów chłonnych, wątroby, płuc i mózgu. Bardzo mało wiadomo o czynnikach, które determinują taki tkankowo-wybiórczy rozsiew nowotworu, ale z pewnością związane są z tym konkretne charakterystyczne cechy komórek nowotworowych np. umożliwiające komórkom nowotworowym zasiedlenie w narządach docelowych, wniknięcie do nich i naciekanie tkanki, reakcja na miejscowe czynniki wzrostu, indukcja naczyniotworzenia albo reakcja w niezbadany jeszcze sposób. Charakterystyka ta musi być związana z ekspresją swoistych białek wyrażanych przez znane albo nieznane geny. Stąd, zidentyfikowanie takich genów może mieć wielkie znaczenie dla zrozumienia mechanizmów tworzenia przerzutów i zapewnić nowe wytyczne albo podstawy diagnostyki i terapii.
Stosuje się kilka sposobów w poszukiwaniu genów, które ulegają silnemu wyrażeniu w pewnych populacjach komórek nie zaś winnych, w tym procedur takich jak klonowanie przez hybrydyzację subtrakcyjną i zastosowanie podejścia różnicowej ekspozycji. Większość takich projektów klonowania obejmuje zastosowanie linii komórkowych in vitro albo klonów jako materiału wyjściowego. Jednakże wiadomo, że linie komórkowe mogą się znacznie różnić od komórek nowotworowych, z których powstały oraz, że warunki hodowli in vitro mogą powodować dodatniąalbo ujemną regulację ekspresji genów związanych z decydowaniem o zdolności komórek do naciekania macierzy zewnątrzkomórkowej i tkanki zrębu jak również ich całkowitej zdolności przerzutowej.
Logiczną alternatywą dla linii komórkowych, do porównywania ekspresji interesujących transkryptów genów albo białek może być zastosowanie próbek tkanki nowotworowej z guzów pierwotnych albo przerzutów od pacjentów. Podejście takie, jednakże, obejmuje kilka możliwości popełnienia błędu jak również przedstawia trudności techniczne. Przy stosowaniu komórek nowotworowych od różnych pacjentów charakterystyka ekspresji genów każdego osobnika musi zostać odjęta przed porównaniem wzorców ekspresji genu będącego przedmiotem badania. Komplikuje to klonowanie genów. Stąd, byłaby korzystna możliwość porównania wzorców ekspresji w komórkach nowotworowych uzyskanych z miejsc nowotworowych położonych w różnych miejscach u tego samego osobnika. Możliwe jest to przez pobranie tkanki nowotworowej z nowotworu pierwotnego i widocznych przerzutów stwierdzonych i usuniętych podczas zabiegu chirurgicznego i/lub podczas zabiegu albo biopsji choroby nawrotowej, albo z wtórnych guzów u pacjentów z postępującąchorobąotrzymali albo nie otrzymali zmienione leczenie po pierwotnym zabiegu.
W każdym projekcie dotyczącym klonowania genu istotna jest praca na możliwie oczyszczonej populacji komórek docelowych, w celu uniknięcia nieistotnych sygnałów z komórek innych niż docelowe, zamazujących porównywany wzorzec ekspresji. W próbkach z guzów litych
185 182 jest to trudne do osiągnięcia, ponieważ w próbkach z zabiegów chirurgicznych i biopsji komórki nowotworowe zmieszane sąznormalnątkankąwłóknistą, w tym z komórkami zrębu i komórkami śródbłonka, których konwencjonalne sposoby preparatyki tkanek nie są w stanie usunąć w satysfakcjonujący sposób. W nowotworach pochodzenia krwiotwórczego komórki nowotworowe posiadaj ą wspólne determinanty z odpowiednimi populacj ami komórek normalnych, co uniemożliwia rozdzielenie tych dwóch rodzajów komórek.
Podczas prób identyfikacji genów związanych ze wczesnymi stadiami rozsiewu nowotworowego może być istotne uzyskanie komórek nowotworowych z odpowiednich miejsc, gdy guzy wtórne są małe, albo o ile to możliwe nawet z ognisk albo komórek subklinicznych. Przykładem powinny być komórki nowotworowe obecne we krwi albo w szpiku, zanim konwencjonalne metody diagnostyczne potrafią wykazać obecność przerzutu. Inny przykład to komórki nowotworowe obecne w płynie mózgowo-rdzeniowym, moczu albo w wysięku w jamie opłucnej albo otrzewnej zanim konwencjonalne procedury morfologiczne będą w stanie wykryć takie komórki. Ponadto, podczas zabiegu chirurgicznego albo gdy podejrzewa się rozsiew nowotworowy, usuwa się często węzły chłonne z powodu ich powiększenia. Jednakże, badanie morfologiczne wciąż może być negatywne w przypadkach, gdy występuje ograniczona liczba komórek nowotworowych. We wszystkich tych przypadkach wynalazek opisuje sposoby wykrywania i selekcjonowania docelowych komórek nowotworowych w celu klonowania genów.
Oprócz zastosowania komórek nowotworowych z różnych tkanek albo narządów pacjentów, wynalazek opisuje również inny sposób pozyskania komórek przerzutujących do zastosowania w poszukiwaniu genów o miejscowo-swoistej ekspresji. Komórki z kilku nowotworów ludzkich hoduje się in vitro albo na zwierzętach niezdolnych do reakcji odpornościowej invivo i komórki takie stosuje się do wytworzenia doświadczalnych modeli przerzutów albo modeli, w których komórki można hodować ortotopowo, tj. w klinicznie istotnych tkankach pochodzenia; czerniaka w skórze, mięsaka kostnego w kości, raka okrężnicy i odbytnicy w ścianie jelita grubego; raka sutka w poduszeczce tłuszczowej sutka itd. W modelach przerzutów doświadczalnych, obserwować można różne wzorce rozsiewu nowotworu, zależnie od linii komórkowej, drogi wstrzyknięcia i rodzaju zastosowanego gospodarza. Powszechnie, wzorzec przerzutowy symuluje taki wzorzec odpowiedniego rodzaju nowotworu klinicznego Przez zastosowanie takich modeli możliwe jest uzyskanie komórek nowotworowych z miejsc przerzucania nie dostępnych zwykle u pacjentów takich jak rdzeń kręgowy i tkanki mózgu. Ponownie, w celu klonowania genów może być istotne selekcjonowanie ludzkich komórek nowotworowych z komórek zwierzęcych w celu uniknięcia problemów z genami wyrażanymi przez normalne komórki gospodarza.
Uprzednio było niemożliwe przeprowadzenie pełnych doświadczeń klonowania genów na próbkach guzów litych i przerzutów oraz komórek przerzutów we krwi i szpiku w celu identyfikacji genów o miejscowo-swoistej ekspresji. Spowodowane to było tym, że znaczna frakcja nowotworów litych i przerzutów nie jest komórkami nowotworowymi ale tkanką łącznąpodpierającąi wrastającąpomiędzy komórki nowotworowe, która również zawiera naczynia krwionośne zapewniające niezbędne dostarczanie czynników odżywczych i tlenu do guza. Nie uważano za możliwe odpowiednie oddzielenie komórek nowotworowych od komórek normalnych bez włączania pośredniego etapu hodowania komórek in vitro, obejmującego manipulowanie w celu usunięcia komórek normalnych. Jednakże, taka hodowla in vitro powinna spowodować wyselekcjonowanie populacji komórek nowotworowych w środowisku nieco różnym od sytuacji in vivo, powodując w ten sposób istotne zmiany we wzorcu ekspresji genu. Stąd, w celu identyfikacji genów związanych z procesem tworzenia przerzutów, nie można zastosować hodowli komórek nowotworowych z przerzutów. Ponadto, nie uważano za interesujące porównanie wzorca ekspresji genów w komórkach nowotworowych guza pierwotnego i guzów przerzutowych. Ponadto, w próbkach krwi i szpiku komórki nowotworowe stanowiąbardzo małą frakcję całkowitej liczby komórek jądrzastych, zaś komórki nowotworowe we krwi i szpiku nie były uważane za interesujące w próbach klonowania genów. Spowodowane to było tym, że nie można odpowiednio oddzielić komórek nowotworowych od normalnych, a ponadto, spe185 182 cjaliści zajmujący się klonowaniem genów nie oczekiwali, że komórki nowotworowe są wystarczająco różne pod względem wzorca ekspresji genów od nowotworów pierwotnych.
Komórek nowotworowych wyizolowanych z ludzkich guzów przerzutowych w różnych i klinicznie ważnych tkankach i narządach i zwierząt niezdolnych do wytworzenia reakcji odpornościowej nie stosowano w próbach identyfikacji genów związanych z nowotworem o ekspresji miejscowo-swoistej, z tego powodu, że takie modele nowotworów ludzkich sąbardzo rzadkie, ale również dlatego, że brak jest metod otrzymywania czystych populacji komórek nowotworowych.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji genów o miejscowo-swoistej albo miejscowo-wybiórczej ekspresji w swoistych nowotworowych komórkach docelowych obecnych w środowisku komórkowym innym niż ich miejsce pochodzenia albo nie będącym ich miejscem pochodzenia, w którym komórki docelowe początkowo wykrywa się i izoluje przez kolejne procedury immunomagnetyczne w celu otrzymania nawet 100% swoistych komórek docelowych przed poddaniem tych komórek znanym sposobom klonowania genów, w których porównuje się nieznane geny różniące się poziomem ekspresji mRNA w komórkach docelowych izolowanych z różnych tkanek.
Ponieważ przedmiotem wynalazku jest identyfikacja genów wyrażanych swoiście podczas wczesnych etapów rozsiewu nowotworowego, guzy pierwotne i przerzuty powinny mieć małe wymiary, zaś komórki nowotworowe we krwi i szpiku powinny stanowić tzw. chorobę mikroprzerzutową, tj. powinna występować ograniczona liczba komórek nowotworowych. Jeżeli to możliwe, takie komórki nowotworowe powinny zostać zebrane nawet w przypadkach gdzie nie można wykryć komórek konwencjonalnym badaniem morfologicznym albo procedurami diagnostycznymi, takimi jak obrazowanie radiologiczne albo rezonansem magnetycznym. Oczywistym jest, że ponieważ komórki te były niewykrywalne, nie były interesujące z punktu widzenia klonowania genów. Zastosowanie technik immunomagnetycznych umożliwia izolację tych komórek nowotworowych nawet wtedy, gdy występująw małej liczbie. Różne metody amplifikacji sekwencji DNA i RNA umożliwiają klonowanie genu na takiej małej liczbie komórek nowotworowych, zakładając, że populacja taka jest odpowiednio czysta.
Selekcję pozytywną docelowych komórek nowotworowych można osiągnąć przez zastosowanie znanych technik, jak opisano w zgłoszeniu patentowym PCT/N093/00136 (WO 94/07139) oraz w PCT/N095/00052. Ponieważ w obecnym wynalazku istotna jest czystość docelowej populacji komórek, proces selekcji immunomagnetycznej można przeprowadzić więcej niż jeden raz albo można go przeprowadzić jako kombinację selekcji pozytywnej (z przeciwciałami monoklonalnymi rozpoznającymi komórki docelowe) i negatywnej (z przeciwciałami, które wiążą komórki niepożądane). Techniki te z powodzeniem zastosowano do izolowania komórek docelowych. Korzystnie w sposobie według wynalazku komórki docelowe izoluje się z litych guzów pierwotnych albo nawrotowych i/albo z przerzutów tych guzów do węzłów chłonnych i/albo krwi i/albo szpiku i/albo tkanki kostnej i/albo wątroby i/albo płuc i/albo ośrodkowego układu nerwowego i/albo nowotworowego wysięku opłucnowego i otrzewnowego, moczu i/albo płynu mózgowo-rdzeniowego i/albo innych narządów-·. Podobnie przedstawiono również oddzielenie ludzkich komórek nowotworowych od normalnych komórek zrębu albo krwiotwórczych u gospodarzy zwierzęcych, nawet w przypadkach, gdy komórki nowotworowe znajdowały się w kości, szpiku, rdzeniu kręgowym albo tkance mózgu. Korzystnie komórki nowotworowe izoluje się z jednokomórkowej zawiesiny wytworzonej z guzów litych i/albo frakcji komórek jednojądrzastych otrzymanej z próbek szpiku albo krwi i/albo z komórek występujących w innych płynach komórkowych. Ponieważ przedmiotem wynalazku jest identyfikacja genów, których produkty związane sąz wczesnymi etapami tworzenia przerzutu możliwe jest, że uzyska się tylko bardzo małą liczbę komórek nowotworowych, zaś jej czystość będzie miała szczególne znaczenie. Przy użyciu tego podejścia, możliwe jest otrzymanie lepiej oczyszczonej populacji komórek docelowych od pacjentów i gospodarzy zwierzęcych, niż przy zastosowaniu innych znanych technik, dostarczając unikalnej możliwości klonowania genów o ekspresji miejscowo-swoistej
185 182
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się komórki nowotworów ludzkich hodowane in vitro i/albo komórki nowotworów ludzkich hodowane w swoistych tkankach zwierząt niezdolnych do reakcji odpornościowej i/albo doświadczalnych przerzutów ludzkich nowotworów u takich zwierząt.
Korzystnie w sposobie według wynalazku z izolowanych komórek izoluje się RNA i/albo DNA, a następnie ekstrahowany kwas nukleinowy stosuje się do klonowania genów.
Następny etap wynalazku obejmuje zastosowanie znanych procedur klonowania genu. Korzystnie w sposobie według wynalazku klonowanie przeprowadza się metodą różnicowej ekspozycji. Ten sposób klonowania po raz pierwszy został opisany przez Liang A. i Pardee A. B. (Science, tom 257, 967-971, 1992). W metodzie tej przeprowadza się reakcje łańcuchowe polimerazy z enzymami i starterami, które powodują odwrotną transkrypcję i losową amplifikację transkryptów genowych obecnych w komórkach docelowych. Korzystnie w sposobie według wynalazku klonowanie można również przeprowadzić przez hybrydyzację subtrakcyjną albo przy wykorzystaniu innych procedur stosowanych do identyfikacji genów o różnicowej ekspresji.
Korzystnie w sposobie według wynalazku amplifikowany cDNA uzyskany z komórek nowotworowych bada się na żelusekwencjonującym, a miejscowo-swoiste są ekstrahowane i sekwencjonowane. Fragmenty interesującego genu można dalej badać, w tym również ich wzorzec ekspresji w materiale podobnym do zastosowanego do klonowania. Ponownie, bardzo istotny jest dostęp do oczyszczonych populacji komórek nowotworowych bez nieistotnych komórek innych niż docelowe, zakłócających wynik. Możliwość zastosowania ludzkich komórek nowotworowych wyizolowanych z modelu przerzutów na zwierzętach niezdolnych do reakcji odpornościowej jest korzystna również z tego powodu, że model zapewnia wiarygodne i ciągle źródło docelowych komórek nowotworowych do dalszych badań. Istotne jest również, że komórki docelowe od pacjentów albo z modelu zwierzęcego są izolowane i traktowane w badaniach DNA i RNA bezpośrednio i bardzo szybko w celu uniknięcia niepożądanych zmian w ekspresji genów nie związanych z celem identyfikacji genów o ekspresji miejscowo-swoistej.
Różne metody zastosowane do klonowania mają swoje ograniczenia. Metody różnicowej ekspozycji oparte na technice reakcji łańcuchowej polimerazy obarczone są problemem reprezentatywności i powtarzalności. Stosując niniejsze podejście, włączono etapy minimalizujące te problemy. Uzyskano to głównie przez zastosowanie techniki selekcji perełkami pokrytymi przeciwciałem, co umożliwiło badanie swoistych biologicznie reprezentatywnych komórek, nie tylko w pierwszym etapie różnicowej ekspozycji, ale również w etapach w których potencjalne geny bada się na poziom ekspresji w odpowiednich komórkach i tkankach.
Korzystnie w sposobie według wynalazku geny zidentyfikowane w poprzedzających etapach stosuje się w terapii genowej i/albo jako cel procedur ukierunkowanych na zmianę albo inaktywację genów albo ich produktów.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie sposobu identyfikacji genów według wynalazku do uzyskiwania sekwencji swoistych genów i produktów ich ekspresji w nowotworowych komórkach docelowych obecnych w środowiskach komórkowych innych niż ich miejsce pochodzenia albo nie będących ich miejscem pochodzenia.
Przykład 1
Komórki nowotworowe z guza pierwotnego i węzłów chłonnych pachowych od pacjenta z rakiem sutka preparowano metodami fizycznymi i enzymatycznymi w celu otrzymania zawiesiny jednokomórkowej. Pobrano próbkę szpiku (50 ml) i krwi obwodowej z żyły, po czym w obu przypadkach wyizolowano komórki jednojądrzaste na preparacie Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Norwegia) Zawiesiny komórek inkubowano niezależnie z przeciwciałami monoklonalnymi MOC-31 i BM7, rozpoznającymi, odpowiednio, antygen pan-epitelialny (powszechny antygen nabłonkowy) oraz produkt genu MUC-1. Po płukaniu i inkubacji dodano Dynabeads M-450 SAM SD (Dynal, Oslo, Norwegia), które wiążąsię z regionem Fc przeciwciał pierwotnych. Komórki nowotworowe ze związanymi kompleksami przeciwciało-Dynabeads M-450 SAM SD
185 182 można izolować od normalnych komórek jednojądrzastych przez zastosowanie silnego magnesu. Naturę wyselekcjonowanych komórek potwierdzono badaniem mikroskopowym. Z różnych populacji komórkowych izolowano RNA i poddawano materiał procedurze klonowania różnicowej ekspozycji (Liang i Pardee, 1992), w której częściowe sekwencje cDNA z populacji mRNA otrzymano przez odwrotną transkrypcję w reakcji łańcuchowej polimerazy. Porównanie fragmentów cDNA z różnych populacji komórek nowotworowych przeprowadzono na żelu sekwencjonującym, zaś fragmenty swoiście wyrażane w komórkach uzyskanych z tych miejsc ekstrahowano i sekwencjonowano. Wśród licznych interesujących sekwencji genowych o ekspresji miejscowej w wyizolowanych komórkach nowotworowych techniką magnetycznych perełek pokrytych przeciwciałem ze szpiku albo z przerzutów do węzłów chłonnych, stwierdzono jeden czynnik transkrypcyjny związany z cyklem komórkowym, jeden produkt onkogenu oraz niezidentyfikowane jeszcze geny. Analizuje się obecnie ekspresję dwóch zidentyfikowanych sekwencji genowych w odpowiednich układach biologicznych i materiale klinicznym.
Przykład 2
W tym przykładzie zastosowano komórki z modelu doświadczalnych przerzutów ludzkiego raka sutka. U bezgrasiczych, nagich szczurów wstrzyknięcie ludzkich komórek raka sutka MA-11 do zbiornika wielkiego (CM) powoduje rozsiew oponowy i wzrost komórek nowotworowych. Ponadto, komórki MA-11 wstrzyknięte do lewej komory serca (LV) tworzą przerzuty w rdzeniu kręgowym, co powoduje rozwój porażenia tylnych łap u zwierząt po około 35 dniach. Komórki nowotworowe z obu miejsc otrzymano przez pocięcie tkanki i wytworzenie zawiesiny jednokomórkowej, zaś technikę perełek pokrytych przeciwciałem opisaną w przykładzie 1, zastosowano w celu selekcji pozytywnej komórek nowotworowych. Następnie, przeprowadzono ekstrakcję RNA z komórek z dwóch miejsc oraz z komórek MA-11 hodowanych in vitro i poddano materiał procedurze klonowania przez różnicową ekspozycję jak to opisano. Oprócz tego, mRNA ekstrahowany z odpowiednich normalnych tkanek szczura zastosowano jako kontrolę. Należy zaznaczyć, że linię komórkową MA-11 ustalono z mikroprzerzutów komórek nowotworowych wyizolowanych metodą immunomagnetyczną ze szpiku pacjenta z II stopniem raka sutka. Wykryto kilka potencjalnych fragmentów swoistych dla komórek rosnących w oponach albo jako przerzuty do rdzenia kręgowego. Analiza sekwencji wykazała, że fragmenty te stanowią geny zarówno nowe jak i znane. Wśród tych fragmentów, które ulegały różnicowej ekspresji w komórkach MA-11 wyselekcjonowanych z komórek przerzutowych szczegółowo badano cztery potencjalne geny. Dwa z nich, oznaczone LVI i LV12 są szczególnie interesujące. LVI wykazuje silną ekspresję w komórkach nowotworowych z przerzutów do rdzenia kręgowego, podczas gdy LV12 ulega ujemnej regulacji w komórkach rosnących w oponach. Stwierdzono, że LVI ulega dodatniej regulacji w wielu liniach komórkowych znanych w właściwości tworzenia doświadczalnych przerzutów u zwierząt niezdolnych do reakcji odpornościowej. W panelu guzów pierwotnych od pacjentów z rakiem sutka, niska ekspresja LV12 związana była z krótkim przeżyciem odpowiednich pacjentów Podsumowując, wyniki pokazują, że mRNA LV12 korelował odwrotnie z progresją i przerzutami komórek raka sutka. Oba geny są nowe. Oprócz tego trzeci obiecujący gen CM13, jest również nowym genem dodatnio regulowanym w komórkach nowotworowych rosnących w oponach mózgu. Kilka innych potencjalnych genów bada się obecnie. Dla cDNA LVI i LV12 zapoczątkowano pełne klonowanie.
Przykład 3
W podobnym modelu jak opisany w przykładzie 2, komórki ludzkiego raka sutka MT1 rosły w oponach mózgu po wstrzyknięciu do CM, podczas gdy komórki wstrzyknięte do LV dawały przerzuty do szpiku i kości kręgów oraz kości długich. Wyizolowano komórki z tych dwóch miejsc, jak również komórki hodowane in vitro i ekstrahowano RNA z różnych populacji komórkowych. W stosunku do tego materiału można zastosować podobne procedury jak opisane w przykładzie 2.
185 182
Przykład 4
Komórki nowotworowe izolowane techniką opisaną w przykładzie 1 wyizolowano od innych pacjentów z rakiem sutka, od pacjentów z rakiem okrężnicy i odbytnicy, gdzie komórki izolowano z guzów pierwotnych i nawrotowych, z przerzutów do węzłów chłonnych i wątroby oraz z próbek krwi i szpiku, oraz od pacjentów z rakiem stercza z próbek guza pierwotnego i nawrotowego, z węzłów chłonnych jak również próbek krwi i szpiku. Izolowane komórki można zastosować w celu klonowania genów.
Oprócz zastosowań materiału opisanego w przykładach 1-4 do klonowania genów, można go zastosować do badania wzorców ekspresji wszystkich sekwencji obiecujących genów.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł
Claims (11)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób identyfikacji genów o miejscowo-swoistej albo miejscowo-wybiórczej ekspresji w swoistych nowotworowych komórkach docelowych obecnych w środowisku komórkowym innym niż ich miejsce pochodzenia albo nie będącym ich miejscem pochodzenia, znamienny tym, że komórki docelowe początkowo wykrywa się i izoluje przez kolejne procedury immunomagnetyczne w celu otrzymania nawet 100% swoistych komórek docelowych przed poddaniem tych komórek znanym sposobom klonowania genów, w których porównuje się nieznane geny różniące się poziomem ekspresji mRNA w komórkach docelowych izolowanych z różnych tkanek.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zastosowane komórki docelowe są komórkami nowotworowymi otrzymanymi z litych guzów pierwotnych albo nawrotowych i/albo z przerzutów tych guzów do węzłów chłonnych i/albo krwi i/albo szpiku i/albo tkanki kostnej i/albo wątroby i/albo płuc i/albo ośrodkowego układu nerwowego i/albo nowotworowego wysięku opłucnowego i otrzewnowego, moczu i/albo płynu mózgowo-rdzeniowego i/albo innych narządów.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że komórki nowotworowe izoluje się z jednokomórkowej zawiesiny wytworzonej z guzów litych i/albo frakcji komórek jednojądrzastych otrzymanej z próbek szpiku albo krwi i/albo z komórek występujących w innych płynach ustrojowych.
- 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że zastosowanymi komórkami nowotworowymi są komórki nowotworów ludzkich hodowane in vitro i/albo komórki nowotworów ludzkich hodowane w swoistych tkankach zwierząt niezdolnych do reakcji odpornościowej i/albo doświadczalnych przerzutów ludzkich nowotworów u takich zwierząt.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że z izolowanych komórek izoluje się RNA i/albo DNA.
- 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że ekstrahowany kwas nukleinowy stosuje się do klonowania genów.
- 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że metodą klonowania genów jest metoda różnicowej ekspozycji albo hybrydyzacji subtrakcyjne albo inne procedury, które można zastosować do identyfikacji genów o różnicowej ekspresji.
- 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że amplifikowany cDNA uzyskany z komórek nowotworowych wybranych z różnych miejsc badany jest i porównywany na żelu sekwencjonującym, a miejscowo-swoiste albo miejscowo-wybiórcze interesujące wzorce sekwencjonuje się i identyfikuje.
- 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że wzorce ekspresji identyfikowanych sekwencji genów bada się na materiale uzyskanym ze wszystkich odpowiednich miejsc występowania komórek nowotworowych opisanych w zastrz. 1-4.
- 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że uprzednio nieznane geny zidentyfikowane w poprzedzających zastrzeżeniach stosuje się w terapii genowej i/albo jako cel procedur ukierunkowanych na zmianę albo inaktywację genów albo ich produktów.
- 11. Zastosowanie sposobu identyfikacji genów różnicowo wyrażanych w nowotworowych komórkach docelowych wyizolowanych z różnych tkanek, przy czym komórki docelowe początkowo wykrywa się i izoluje przez kolejne procedury immunomagnetyczne w celu otrzymania nawet 100% swoistych komórek docelowych przed poddaniem tych komórek znanym sposo185 182 bom klonowania genów, w których porównuje się nieznane geny o różnicach w poziomie ekspresji mRNA w komórkach docelowych izolowanych z różnych tkanek, do uzyskiwania sekwencji swoistych genów i produktów ich ekspresji w nowotworowych komórkach docelowych obecnych w środowiskach komórkowych innych niż ich miejsce pochodzenia albo nie będących ich miejscem pochodzenia.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO961221A NO961221D0 (no) | 1996-03-26 | 1996-03-26 | Fremgangsmåte til å identifisere nye gener assosiert med setepreferert cancer mestastasedannelse |
| PCT/NO1997/000083 WO1997036004A1 (en) | 1996-03-26 | 1997-03-25 | Immuno-magnetic cell separation used in identification of genes associated with site-preferenced cancer methastasis formation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL329038A1 PL329038A1 (en) | 1999-03-01 |
| PL185182B1 true PL185182B1 (pl) | 2003-03-31 |
Family
ID=19899192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97329038A PL185182B1 (pl) | 1996-03-26 | 1997-03-25 | Sposób identyfikacji genów o miejscowo-swoistej albo miejscowo-wybiórczej ekspresji w swoistych nowotworowych komórkach docelowych oraz zastosowanie sposobu identyfikacji genów |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0894146B1 (pl) |
| JP (1) | JP2000509250A (pl) |
| KR (1) | KR19990087833A (pl) |
| CN (1) | CN1214738A (pl) |
| AT (1) | ATE251223T1 (pl) |
| AU (1) | AU703262B2 (pl) |
| BR (1) | BR9708256A (pl) |
| CA (1) | CA2250202A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ286598A3 (pl) |
| DE (1) | DE69725297T2 (pl) |
| HU (1) | HUP9901786A3 (pl) |
| IL (1) | IL126257A (pl) |
| NO (1) | NO961221D0 (pl) |
| NZ (1) | NZ331920A (pl) |
| PL (1) | PL185182B1 (pl) |
| RU (1) | RU2180963C2 (pl) |
| SK (1) | SK282091B6 (pl) |
| TR (1) | TR199801916T2 (pl) |
| WO (1) | WO1997036004A1 (pl) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9425138D0 (en) | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
| US6828157B1 (en) | 1999-05-04 | 2004-12-07 | Dan A. Pankowsky | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells |
| US6682940B2 (en) | 1999-05-04 | 2004-01-27 | Dan A. Pankowsky | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells |
| FR2804126B1 (fr) * | 2000-01-21 | 2005-09-30 | Patrick Rambaud | Procede et systeme de gestion de lots de cellules immuno-competentes prelevees sur des sujets humains ou animaux en vue d'utilisations differees |
| WO2002036833A1 (en) * | 2000-11-06 | 2002-05-10 | Bio-Tech Imaging, Inc. | Method and kits for detecting hepatitis infected cells |
| FR2816322A1 (fr) * | 2000-11-06 | 2002-05-10 | Epigene | Methode de separation d'acide nucleique differemment exprime entre une cellule cible et une cellule de reference |
| CN115064209B (zh) * | 2022-08-17 | 2022-11-01 | 普瑞基准科技（北京）有限公司 | 一种恶性细胞鉴定方法及系统 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2045966C1 (ru) * | 1991-05-22 | 1995-10-20 | Воронин Александр Юрьевич | Способ противолучевой защиты организма животного |
| WO1994007138A1 (en) * | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Fodstad Oystein | Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations |
| NO180658C (no) * | 1994-03-10 | 1997-05-21 | Oeystein Fodstad | Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner |
| RU2089242C1 (ru) * | 1994-09-16 | 1997-09-10 | Долорес Лазаревна Федорова | Способ воздействия на микрообъект магнитным полем |
-
1996
- 1996-03-26 NO NO961221A patent/NO961221D0/no unknown
-
1997
- 1997-03-25 CA CA002250202A patent/CA2250202A1/en not_active Abandoned
- 1997-03-25 KR KR1019980707486A patent/KR19990087833A/ko not_active Ceased
- 1997-03-25 WO PCT/NO1997/000083 patent/WO1997036004A1/en not_active Ceased
- 1997-03-25 IL IL12625797A patent/IL126257A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-03-25 HU HU9901786A patent/HUP9901786A3/hu unknown
- 1997-03-25 TR TR1998/01916T patent/TR199801916T2/xx unknown
- 1997-03-25 AU AU23116/97A patent/AU703262B2/en not_active Ceased
- 1997-03-25 AT AT97915776T patent/ATE251223T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-03-25 NZ NZ331920A patent/NZ331920A/xx unknown
- 1997-03-25 DE DE69725297T patent/DE69725297T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-25 SK SK1416-98A patent/SK282091B6/sk unknown
- 1997-03-25 BR BR9708256A patent/BR9708256A/pt unknown
- 1997-03-25 CN CN97193361A patent/CN1214738A/zh active Pending
- 1997-03-25 PL PL97329038A patent/PL185182B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-03-25 CZ CZ982865A patent/CZ286598A3/cs unknown
- 1997-03-25 JP JP9534283A patent/JP2000509250A/ja active Pending
- 1997-03-25 EP EP97915776A patent/EP0894146B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-25 RU RU98119525/14A patent/RU2180963C2/ru not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1214738A (zh) | 1999-04-21 |
| CZ286598A3 (cs) | 1999-02-17 |
| JP2000509250A (ja) | 2000-07-25 |
| WO1997036004A1 (en) | 1997-10-02 |
| NO961221D0 (no) | 1996-03-26 |
| RU2180963C2 (ru) | 2002-03-27 |
| IL126257A0 (en) | 1999-05-09 |
| ATE251223T1 (de) | 2003-10-15 |
| HUP9901786A2 (hu) | 1999-09-28 |
| TR199801916T2 (xx) | 1998-12-21 |
| HUP9901786A3 (en) | 2000-10-30 |
| SK282091B6 (sk) | 2001-10-08 |
| AU703262B2 (en) | 1999-03-25 |
| PL329038A1 (en) | 1999-03-01 |
| CA2250202A1 (en) | 1997-10-02 |
| DE69725297T2 (de) | 2004-08-05 |
| AU2311697A (en) | 1997-10-17 |
| IL126257A (en) | 2003-09-17 |
| EP0894146A1 (en) | 1999-02-03 |
| SK141698A3 (en) | 2000-01-18 |
| KR19990087833A (ko) | 1999-12-27 |
| BR9708256A (pt) | 1999-08-03 |
| NZ331920A (en) | 2000-01-28 |
| DE69725297D1 (de) | 2003-11-06 |
| EP0894146B1 (en) | 2003-10-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| McKiernan et al. | Expression of the tumor-associated gene MN: a potential biomarker for human renal cell carcinoma | |
| Cutz et al. | Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression–related changes | |
| Wang et al. | Undifferentiated small round cell sarcomas with rare EWS gene fusions: identification of a novel EWS-SP3 fusion and of additional cases with the EWS-ETV1 and EWS-FEV fusions | |
| Pantel et al. | Occult micrometastasis: enrichment, identification and characterization of single disseminated tumour cells | |
| JP2002536635A (ja) | 体液から腫瘍細胞を濃縮するか又は除去する方法及びかかる目的に適したキット | |
| CN107828779B (zh) | 前列腺癌特异性外泌体、lncRNA及其制备方法和应用 | |
| EP3447140A2 (en) | Receptor gene for peptide cancer antigen-specific t cell | |
| Zhou et al. | Marker expression in circulating cancer cells of pancreatic cancer patients | |
| CN104651509A (zh) | 骨肉瘤的药物新靶标 | |
| WO2009037385A1 (en) | Diagnostics of b-cell lymphoma | |
| JP4392163B2 (ja) | 肺癌用遺伝子マーカー | |
| Bridge et al. | Cytogenetic and molecular genetic techniques as adjunctive approaches in the diagnosis of bone and soft tissue tumors | |
| AU703262B2 (en) | Immuno-magnetic cell separation used in identification of genes associated with site-preferenced cancer methastasis formation | |
| Simpson et al. | Genetic heterogeneity of primary and metastatic breast carcinoma defined by fluorescence in situ hybridization | |
| Alcaraz et al. | High‐grade prostate intraepithelial neoplasia shares cytogenetic alterations with invasive prostate cancer | |
| CN104611449A (zh) | Wwp1基因在制备骨肉瘤诊断产品和治疗药物中的应用 | |
| Shimazui et al. | Detection of cadherin-6 mRNA by nested RT-PCR as a potential marker for circulating cancer cells in renal cell carcinoma | |
| AU2003260389B2 (en) | Method for the immunocytological or molecular detection of disseminated tumor cells in a body fluid and kit that is suitable therefor | |
| JP2800850B2 (ja) | 新生物形成の検出方法 | |
| Woelfel et al. | Molecular cytogenetic characterization of epithelioid hemangioendothelioma | |
| Miyake et al. | Highly specific and sensitive detection of malignancy in urine samples from patients with urothelial cancer by CD44v8–10/CD44v10 competitive RT‐PCR | |
| US20060154309A1 (en) | Method of examining cancer cells and reagent therefor | |
| Tveito et al. | Specific isolation of disseminated cancer cells: a new method permitting sensitive detection of target molecules of diagnostic and therapeutic value | |
| Hara et al. | Expression of CD44 adhesion molecules in nonpapillary renal cell carcinoma and normal kidneys | |
| MXPA98007590A (en) | Immunomagnetic separation of cells, used in the identification of genes associated with formation of cancer metastases with preference for a yes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20050325 |