PL185710B1 - Sposób wywoływania cytoplazmatycznej niepłodnościmęskiej u roślin i zastosowanie w wytwarzaniu nasion hybrydowych - Google Patents
Sposób wywoływania cytoplazmatycznej niepłodnościmęskiej u roślin i zastosowanie w wytwarzaniu nasion hybrydowychInfo
- Publication number
- PL185710B1 PL185710B1 PL95316435A PL31643595A PL185710B1 PL 185710 B1 PL185710 B1 PL 185710B1 PL 95316435 A PL95316435 A PL 95316435A PL 31643595 A PL31643595 A PL 31643595A PL 185710 B1 PL185710 B1 PL 185710B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gene
- plastid
- male
- nuclear
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 title claims abstract description 105
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 152
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 373
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 claims abstract description 307
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 143
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 126
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 123
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 121
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 95
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims abstract description 53
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 35
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims abstract description 24
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 63
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 60
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 60
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 claims description 51
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 47
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 47
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 38
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 38
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 30
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 29
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 27
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 26
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 claims description 21
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 19
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 claims description 16
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 claims description 16
- 101000708283 Oryza sativa subsp. indica Protein Rf1, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 15
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 15
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 claims description 14
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 5
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 5
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 5
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 claims description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims 4
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 claims 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims 1
- 108700043532 RpoB Proteins 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 101150002954 rmf gene Proteins 0.000 abstract description 53
- 101150085756 NMS gene Proteins 0.000 abstract description 44
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 14
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000034994 death Effects 0.000 abstract description 7
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 117
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 42
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 27
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 26
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 23
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 20
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 19
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 17
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 16
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 14
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 10
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 10
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 9
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 9
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 8
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 8
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 8
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 6
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 6
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 6
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 6
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 6
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 6
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 101150074945 rbcL gene Proteins 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 101100301006 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) cbbL2 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 4
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 4
- 101150067314 aadA gene Proteins 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 101150004101 cbbL gene Proteins 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 3
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 3
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 102200111112 rs397514590 Human genes 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010049994 Chloroplast Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 101150103998 MATALPHA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150054907 Mrps12 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 101100199945 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) rps1201 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 101150015537 rps12 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 2
- 102220092319 rs876657875 Human genes 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000228438 Bipolaris maydis Species 0.000 description 1
- 101100377748 Campylobacter jejuni aadK gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 241001071944 Cyta Species 0.000 description 1
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 1
- 101000777488 Heteractis magnifica DELTA-stichotoxin-Hmg2b Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 101000708522 Marchantia polymorpha Uncharacterized mitochondrial protein ymf1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000272041 Naja Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 108700005079 Recessive Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000052708 Recessive Genes Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 101150102982 RpS10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100191561 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150059441 Srm gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000583281 Sugiura Species 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 101150057833 THEG gene Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007152 anther development Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000022602 disease susceptibility Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000005242 forging Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150101900 uidA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S47/00—Plant husbandry
- Y10S47/01—Methods of plant-breeding and including chromosome multiplication
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania cytoplazmatycznie mesko nieplodnych roslin, znamienny tym, ze obejmuje: a) dostarczenie odpowiedniej rodzicielskiej linii roslinnej; b) wytwarzanie rosliny rodzicielskiej transgenicznej plastydowo z wymienionej linii roslinnej przez trwale transformowanie plastydu w komórkach rodzicielskiej linii roslinnej plastydowym genem nieplodnosci meskiej i regeneracje z nich rosliny o transgenicznym plastydzie, przy czym plastydowy gen nieplodnosci meskiej moze byc regulowany przez kodowany jadrowo, ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy, a regulacja w tkance pylników powoduje przerwanie tworzenia zywotnego pylku; c) wytwarzanie transgenicznych jadrowo roslin rodzicielskich z rodzicielskiej linii roslinnej przez trwale transformowanie jader komórkowych rodzicielskiej linii roslinnej jadrowym genem nieplodnosci meskiej i regeneracje z nich transgenicznych jadrowo ro- slin, przy czym jadrowy gen nieplodnosci meskiej obejmuje swoiste dla pylników nukle- otydowe sekwencje regulatorowe 5' polaczone operacyjnie z sekwencja nukleotydowa kodujaca ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy zdolny do wnikania do pla- stydu i regulowania plastydowego genu nieplodnosci meskiej; i d) przenoszenie pylku pomiedzy roslina transgeniczna plastydowo a roslina transge- niczna jadrowo w celu wytworzenia rosliny, w której ukierunkowany na plastyd regulator polipeptydowy jest wytwarzany w sposób swoisty dla pylników, wnika do transformowa- nych plastydów komórek pylnika i reguluje plastydowy gen nieplodnosci meskiej, przy czym regulacja powoduje przerwanie tworzenia zywotnego pylku, co prowadzi do uzy- skania cytoplazmatycznie mesko nieplodnych roslin. PL PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Wynalazek dotyczy ulepszenia roślin istotnych z punktu widzenia rolniczego i gospodarczego, a zwłaszcza nowego układu transgenicznego opartego na plastydzie, do wytwarzania roślin cytoplazmatycznie męsko niepłodnych oraz zastosowania tych roślin w wytwarzaniu nasion hybrydowych.
Odkrycie, że skrzyżowanie dwóch wsobnych linii roślin powoduje powstanie hybryd o zwiększonej produktywności wywołało wśród hodowców roślin wielkie zainteresowanie opracowaniem ekonomicznych sposobów wytwarzania nasion hybrydowych. Hybrydy ogólnie są bardziej produktywne i wydajniejsze pod względem utylizacji substancji odżywczych takich jak nawozy czy woda. Hybrydy FI wykazują również wyższą odporność na stres otoczenia w porównaniu ze wsobnymi liniami rodzicielskimi, oraz mogą przejawiać pożądane cechy oporności na choroby. Przy wytwarzaniu hybryd dwóch linii wsobnych możliwe jest
185 710 również skojarzenie charakterystyk w sposób trudny albo niemożliwy do skojarzenia innymi sposobami.
Wigor mieszańców (hybryd) jest znanym zjawiskiem u roślin i zwierząt i od wielu lat jest wykorzystywany komercyjnie w hodowli roślin. Obecnie dostępne są w handlu hybrydy wielu ważnych gospodarczo gatunków uprawnych i czynione są wysiłki wobec roślin, których hybrydy mogą być wytwarzane ekonomicznie i niezawodnie.
W celu wytwarzania potomstwa hybrydowego dwóch linii wsobnych musi zajść zapylenie krzyżowe. Stanowi to przeszkodę w wytwarzaniu hybryd wielu gatunków roślin uprawnych, które są z natury samopylne, wytwarzających pyłek i jaja, często w tym samym kwiatostanie. W celu zapobieżenia samozapyleniu narząd wytwarzający pyłek musi być usunięty lub zniszczony u jednego z rodziców. Może to być wykonane przez ręczną emaskulację, tzn. usunięcie całych kwiatostanów męskich albo usunięcie pylników z kwiatostanów posiadających zarówno męskie jak i żeńskie organy w tym samym kwiatostanie. Ręczna emaskulacja jest pracochłonnym i w konsekwencji drogim procesem.
Męsko-niepłodne linie rodzicielskie do wytwarzania nasion hybrydowych mogą być również wytworzone przez zastosowanie chemikaliów („gametocydów”) zapobiegających tworzeniu żywego pyłku. Chemikalia te są również drogie i nie w pełni niezawodne z powodu ograniczeń wynikających ze sposobu ich podawania roślinom.
Jednorodne zapylenie krzyżowe może być również uzyskane przez zastosowanie roślin genetycznie męsko niepłodnych jako rodziców żeńskich posadzonych w pobliżu wytwarzających pyłek rodziców męskich. Przy zastosowaniu tego sposobu wszystkie nasiona zebrane z rzędu rodziców żeńskich powstały w wyniku zapylenia krzyżowego.
Brak wytwarzania pyłku (tzn. niepłodność męska) może być spowodowana mutacjami jądrowymi albo czynnikami dziedziczonymi cytoplazmatycznie. Cytoplazmatyczna niepłodność męska (CMS) jest korzystniejsza w stosunku do genetycznej niepłodności męskiej w wytwarzaniu nasion hybrydowych, ponieważ nie podlega segregacji mendlowskiej (Hanson i Conde, Intl. Rev. Cytol., 94:213-267 (1985)). W celu zobrazowania, genetyczna jądrowa niepłodność męska jest zwykle kodowana przez pojedynczy gen recesywny, stąd wymaga homozygotyczności aby został wyrażony fenotyp męsko niepłodny. W celu rozmnożenia genetycznie jądrowo męsko niepłodnych roślin homozygotycznie recesywny, niepłodny osobnik męski musi być skrzyżowany z linią izogenicznie męsko płodną która jest heterozygotyczna pod względem genu niepłodności męskiej. Takie krzyżowanie powoduje powstanie pewnego odsetka roślin męsko płodnych (50% w przypadku układu jednogenowego), które muszą być usunięte z pola jak najszybciej po wykryciu ich płodności w celu zachowania efektywności pożądanej populacji męsko niepłodnej. Podobnie do ręcznej emaskulacji, usuwanie roślin męsko płodnych z pola jest pracochłonne i drogie. Stąd segregacja genów jądrowych znacznie ogranicza zastosowanie genetycznej jądrowej męskiej niepłodności do wytwarzania nasion hybrydowych.
Jądrowa genetyczna niepłodność męska posiada wadę segregacji mendlowskiej. W przeciwieństwie, cytoplazmatyczna niepłodność męska wyrażana jest u wszystkich potomków krzyżówki hybrydowej pomiędzy wsobnym CMS i męsko płodnym rodzicem. Stąd charakterystyka CMS jest pożądanym sposobem wytwarzania nasion hybrydowych.
Występująca naturalnie cytoplazmatyczna niepłodność męska jest spowodowana mutacjami w genomie mitochondrialnym. Zależność pomiędzy tymi mutacjami mitochondrialnymi i cytoplazmatyczną niepłodnością męską jest zmienna w zależności od gatunku i nie jest dobrze poznana. U kukurydzy, jeden z lepiej poznanych mitochondrialnych układów CMS, cytoplazmatyczna niepłodność męska w cytoplazmie Texas (CMS-T) wydaje się być związana z ekspresją polipeptydu 13 kDa (Hansen, Ann. Rev. Genet., 25:461-486 (1991); Levings i Siedow, Plant Molec. Biol., 19:135-147 (1992)). Wykazano, że ten polipeptyd jest białkiem śródbłonowym zwiększającym przepuszczalność błony komórkowej. Polipeptyd nie wywiera szkodliwego skutku w normalnie dzielących się komórkach wegetatywnych, ale w nieznanym mechanizmie powoduje nadmierną przepuszczalność błon komórek tapetum i przerwanie tworzenia pyłku. Wytwarzanie polipeptydu 13 kDa koreluje z podatnością kukurydzy CMS-T na patogeny roślin jak Bipolaris maydis i Phyllostricta maydis.
185 710
W programach hodowli roślin, gdzie dostępna jest naturalnie występująca cytoplazma CMS, produkcja nasion wymaga trzech linii wsobnych: (1) linii cytoplazmatycznie męsko niepłodnej posiadającej cytoplazmę CMS; (2) płodnej wsobnej z normalną cytoplazmą, będącej izogeniczną w stosunku do linii CMS, pod względem genów jądrowych („linia utrzymująca”); oraz (3) płodnej wsobnej o normalnej cytoplazmie, niosącej gen przywracający (linia „przywracająca”, która nie musi być izogeniczną z linią CMS). Linia CMS jest namnażana przez zapylenie linią utrzymującą. Wszystkie rośliny z tej krzyżówki są męsko niepłodne ponieważ cytoplazma CMS jest dostarczana przez żeńskiego rodzica. Nasiona hybrydowe produkowane są przez zapylenie drugą linią wsobną niosącą gen przywracający płodność (Rf). Jeżeli nie jest dostępny gen przywracający, niepłodne hybrydy mogą być uzyskane przez zapylenie inną wsobną linią która nie niesie genu przywracającego płodność. Hybrydy takie są użyteczne u roślin uprawnych, w których zużytkowana jest tkanka wegetatywna (np. liście tytoniu albo kwiaty petunii). Jednakże, w większości upraw nasiona stanowią wartościową część uprawy, tak więc płodność hybryd w tych uprawach musi zostać przywrócona.
Jakkolwiek cytoplazmatyczna niepłodność męska jest użyteczna dla produkcji nasion, jej użyteczność jest często ograniczona licznymi problemami praktycznymi towarzyszącymi naturalnie występującej cytoplazmatycznej niepłodności męskiej. Obejmują one niemożność identyfikacji cytoplazm CMS czy alleli jądrowych genów przywracających, jak również segregację niepożądanych cech, jak wrażliwość na choroby (jak to opisano wyżej), zmniejszoną płodność itp. Każda z tych trudności powstaje z braku zrozumienia mechanizmów mitochondrialnych cytoplazmatycznej niepłodności męskiej i przywracania płodności. Pokrótce, wartość cytoplazmatycznej niepłodności męskiej znacznie by wzrosła gdyby opracowano układ CMS, którego składniki były w pełni zrozumiałe i scharakteryzowane, oraz mogły być w wiarygodny sposób manipulowane bez ryzyka niekorzystnych skutków ubocznych.
Niniejszy wynalazek dostarcza nowego układu CMS opartego na modyfikacji genomu plastydu zamiast genomu mitochondrialnego i wykorzystującego trzy transgeny: gen plastydowej niepłodności męskiej oraz dwa geny jądrowe regulujące ekspresję genu piasty do wej niepłodności męskiej.
W nawiązaniu do jednego z aspektów niniejszego wynalazku, dostarczono sposobu wytwarzania roślin cytoplazmatycznie męsko niepłodnych. Po pierwsze, wybierana jest rodzicielska linia roślinna. Wytwarzana jest linia rodzicielska o transgenicznym plastydzie przez stabilne transformowanie plastydów w komórkach linii rodzicielskiej genem plastydowej niepłodności męskiej pms, i regenerację rośliny. Gen pms jest regulowany kodowanym jądrowo, ukierunkowanym na plastyd polipeptydem regulatorowym. Gdy regulacja zachodzi w innej tkance, przerywane jest tworzenie żywotnego pyłku. W jednym z wykonań, określanym tu jako metoda „niszczenia pyłku”, gen pms jest genem nieaktywnym, zawierającym region kodujący substancję zdolną do uszkadzania lub niszczenia plastydów, przerywającą w ten sposób tworzenie żywotnego pyłku, połączony operacyjnie z docelową sekwencją nukleotydową służącą aktywacji ekspresji genów. W innym wykonaniu, określanym tu jako metoda „głodzenia pyłku” gen pms obejmuje niezbędny gen genomu plastydu, połączony operacyjnie z docelową sekwencją nukleotydową służącą zapobieganiu ekspresji genu. Gen ten zastępuje natywny gen plastydu i zapobiega ekspresji genu powodując uszkodzenie albo śmierć plastydów, przerywając w ten sposób tworzenie żywotnego pyłku. Rośliny o transgenicznym plastydzie zawierającym gen pms są płodne. Następnie, różne komórki rodzicielskiej linii roślinnej poddawane są stabilnej transformacji jądrowej genem jądrowej niepłodności męskiej, nms, zawierającym swoistą dla pylników regulatorową sekwencję nukleotydową 5', połączoną operacyjnie z sekwencją kodującą wspomniany wcześniej ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy zdolny do wchodzenia do plastydów i regulujący gen pms, przez oddziaływanie z nukleotydową sekwencją docelową aktywując ekspresję (metoda „niszczenia pyłku”) albo zapobiegając ekspresji (metoda „głodzenia pyłku”). Roślina jest regenerowana z komórek rośliny rodzicielskiej transformowanych jądrowo. Rośliny takie są również płodne. Cytoplazmatycznie męsko niepłodne rośliny wytwarzane są przez skrzyżowanie rośliny rodzicielskiej o transgenicznym plastydzie z rośliną rodzicielską transgeniczną jądrowo, dostarczając
185 710 kompletnego układu dla rozprzężenia albo śmierci plastydu swoistego dla pylników, które powoduje przerwanie tworzenia żywotnego pyłku.
Nawiązując do innego aspektu wynalazku, dostarczono sposobu wytwarzania męsko płodnych nasion hybrydowych z dwóch linii roślin rodzicielskich, z których jedna stanowi cytoplazmatycznie męsko niepłodną linię roślinną opisaną wyżej. W nawiązaniu do tego sposobu, rośliny rodzicielskie cytoplazmatycznie męsko niepłodne wytwarzane są w wyżej opisany sposób. Następnie wybierana jest druga roślinna linia rodzicielska. W oparciu o tę linię tworzona jest rodzicielska linia męska o przywróconej płodności, przez poddanie komórek drugiej linii rodzicielskiej stabilnej transformacji jądrowej genem „przywracającym płodność męską” (rmf) . Gen rmf obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą produkt genu „przywracającego”, zdolny do zakłócania genu nms, przez blokowanie ekspresji genu nms albo przez blokowanie ekspresji możliwego do aktywacji toksycznego genu pms. Roślina jest regenerowana z komórek stabilnie transformowanych jądrowo. Linia cytoplazmatycznie męsko niepłodna jest następnie krzyżowana z linią o przywróconej płodności, w której ekspresja genu rmf zapobiega regulowaniu genu pms przez peptyd regulatorowy, przywracając w ten sposób płodność męską roślin hybrydowych.
Nawiązując do innych aspektów niniejszego wynalazku, dostarczone są konstrukty DNA i rośliny transgeniczne do wykonania niniejszego wynalazku. Dostarczona jest roślina transgeniczna jądrowo zawierająca gen pms i roślina transgeniczna plastydowo z tej samej linii rodzicielskiej, zawierająca gen nms. Dostarczona jest również roślina cytoplazmatycznie męsko niepłodna, powstała przez skrzyżowanie rośliny transgenicznej jądrowo z rośliną transgeniczną plastydowo. Dostarczona jest również roślina transgeniczna jądrowo drugiej roślinnej linii rodzicielskiej, która zawiera gen rmf. Dostarczone są również męsko płodne rośliny hybrydowe, wytworzone przez skrzyżowanie rodzicielskiej rośliny cytoplazmatycznie męsko niepłodnej z drugą rodzicielską linią roślinną zawierającą gen rmf.
Figura 1. Schemat korzystnego sposobu wywoływania plastydowej niepłodności męskiej (PMS) metodą „niszczenia pyłku”, wykorzystującego układ polimerazy RNA T7/represora lac. (fig. IA): Ekspresja genów niepłodności męskiej w komórkach tapetum albo mikrosporach roślin niepłodnych. Jądrowy gen nms („Knms”) ulega transkrypcji, kodowany polipeptyd (polimeraza RNS T7) ulega translacji na rybosomach cytoplazmatycznych i jest importowany do plastydów. Następująca potem transkrypcja genu niszczącego plastyd („Kpms”) z promotora Ulać powoduje śmierć komórkową („+” oznacza regulator pozytywny, polimerazę RNA T7, która jest swoista dla promotora T7). (fig. IB): Ekspresja genów niepłodności męskiej w komórkach tapetum albo mikrosporach płodnych roślin hybrydowych. Represor lac, produkt jądrowego genu przywracającego płodność (Krmj) wiąże się z promotorem Kpms ΎΊ/lac w plastydach zapobiegając transkrypcji genu toksycznego przez produkt genu Yaims. (Biały symbol „X” w czarnym kółku oznacza swoiste wiązanie represora lac z operatorem lac na sekwencji regulatorowej ΎΊ/lac).
Figura 2. Schemat korzystnego sposobu wywoływania plastydowej niepłodności męskiej metodą „głodzenia pyłku”, wykorzystującego ukierunkowany na plastyd represor lac i ukierunkowany na jądro represor tet. (fig. 2A): Ekspresja genów niepłodności męskiej w komórkach tapetum albo mikrosporach roślin niepłodnych. Gen jądrowy nms („Snms”) ulega transkrypcji zaś kodowany represor lac jest importowany do plastydów, gdzie blokuje ekspresję niezbędnego genu (Spms), którego promotor zawiera miejsce wiążące represor lac. Brak ekspresji niezbędnego genu Spms powoduje śmierć komórkową (biały symbol „X” w czarnym kółku oznacza swoiste wiązanie represora lac z sekwencją operatora lac genu Spms). (Fig. 2B): Ekspresja genów niepłodności męskiej w komórkach tapetum albo mikrosporach roślin płodnych. Gen przywracający płodność (Srmf) koduje ukierunkowany na jądro represor, zapobiegający transkrypcji jądrowego genu Snms, w sposób wykorzystujący wprowadzenie miejsca wiązącego represor do genu Snms, umożliwiając w ten sposób ekspresję genów Spms (biały symbol w czarnym kółku oznacza swoiste wiązanie ukierunkowanego na jądro represora z jego miejscem wiążącym na genie Snms).
Figura 3. Kasety do ekspresji Kpms w plastydach, do metody „niszczenia pyłku”. Sekwencje DNA pokazano dla promotorów Pt/acl (Identyfikator Sekw. Nr 1) i PT7/<zc2 (Identy
185 710 fikator Sekw. Nr 2) oraz terminatorów transkrypcji TT7 (Identyfikator Sekw. Nr 3) i Trpsl6T7 (Identyfikator Sekw. Nr 4). Zaznaczono przez RBS miejsca wiążące rybosom oraz podkreślono promotor genu 10 faga T7 (0 10), operator lac i istotne miejsca restrykcyjne. Kodon rozpoczynający translację, włączony w sekwencję rozpoznawaną przez Ncol zaznaczono wytłuszczoną czcionką.
Figura 4. Integracja genu Kpms w niemym transkrypcyjnie regionie genomu plastydu przez połączenie z genem oporności na spektynomycynę (aadA.). Pokazano region ukierunkowujący na plastyd plazmidu pC8, spokrewnionym z regionem w genomie plastydu typu dzikiego (Nt-ptDNA) oraz region zawierający zintegrowany gen niszczący. Integracja aadE i genu pasażerskiego zachodzi w dwóch zjawiskach rekombinacji homologicznej pomiędzy liniami przerywanymi. Skróty: lóSrDNA = gen 16S rRNA; V = gen trnN·, B = otwarta ramka odczytu ORF70B; PT7 = promotor PT7/izcl; TT7 = terminator TT7. Miejsca restrykcyjne: E, EcoRI; B, BawHI; Bg, BgM; H, Hindill; RV, EcoRN.
Figura 5. Geny Knms jądrowej niepłodności męskiej (pZS233: sekwencja nukłeotydowa stanowi Identyfikator Sekw. Nr 5, sekwencja białkowa stanowi Identyfikator Sekw. Nr 6; pZS243: sekwencja nukleotydowa stanowi Identyfikator Sekw. Nr 7, sekwencja białkowa stanowi Identyfikator Sekw. Nr 8). Pokazane geny Knms ulegają ekspresji jako geny konstytutywne, z promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiorów (P35S; Timmermans i in., J. Biotechnol., 14:333-344, 1990), małą podjednostką peptydu tranzytowego RuBisCo (TP-SSU; Kanevski iMaliga, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91:1969-1973, 1994), polimerazą RNA T7 (T7-RNAP; Studier i in., Meth. Enz., 185:60-89, 1990) i terminatorem transkrypcji wirusa mozaiki kalafiorów (T35S; Timmermans iin., 1990, wyżej). Pokazana jest również sekwencja białkowa peptydu tranzytowego (linie przerywane) oraz N-końcowa fuzja z polimerazą RNA T7. Miejsce obróbki zaznaczono wypełnionym trójkątem. Obróbka preT7RNAP powoduje powstanie T7RNAP bez dodatkowych aminokwasów, jeżeli przebiega ekspresja genu pZS233 pokazanego wyżej, albo pozostawia 5 aminokwasów dojrzałej SSU fuzowanych na końcu N, gdy przebiega ekspresja genu pZS243 pokazanego wyżej.
Figura 6. Jądrowy gen przywracający płodność męską Srmf (pZS253: sekwencja nukleotydowa stanowi Identyfikator Sekw. Nr 9, sekwencja białkowa stanowi Identyfikator Sekw. Nr 10; pZS263: sekwencja nukleotydowa stanowi Identyfikator Sekw. Nr 11, sekwencja białkowa stanowi Identyfikator Sekw. Nr 12). Pokazano konstytutywny gen kontrolny, z promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiorów (P35S; Timmermans iin., J. Biotechnol., 14:333-344, 1990). TP-SSU, mała podjednostką peptydu tranzytowego RuBisCo (Kanevski iMaliga, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91:1969-1973, 1994), lad, region kodujący represor lac (Farabaugh, Naturę, 274:765-769, 1978) i T35S, terminator transkrypcji wirusa mozaiki kalafiorów (Timmermans i in., 1990, wyżej). Pokazana jest również sekwencja białkowa peptydu tranzytowego (linie przerywane) oraz N-końcowa fuzja z polimerazą RNA T7. Miejsce obróbki zaznaczono wypełnionym trójkątem. Obróbka preT7RNAP powoduje powstanie T7RNAP bez dodatkowych aminokwasów, jeżeli przebiega ekspresja genu pZS253 pokazanego wyżej, albo pozostawia 5 aminokwasów dojrzałej SSU fuzowanych na końcu N, gdy przebiega ekspresja genu pZS263 pokazanego poniżej.
Figura 7. Zmodyfikowane sekwencje promotora zastosowane do transkrypcji genów Spms w metodzie „głodzenia pyłku”. Promotory Prmfocl (Identyfikator Sekw. Nr 13) i Prm/ac2 (Identyfikator Sekw. Nr 14) uzyskano z promotora operonu rRNA, promotor BtrnN-lac2 (Identyfikator Sekw. Nr 15) uzyskano z genu trnN. Należy zauważyć podkreślone elementy promotora -10 i -35 oraz sekwencję operatora lac (czcionka wytłuszczona). Liczby oznaczają pozycję nukleotydu w genomie plastydu tytoniu (Shinozaki i in., EMBO J., 5:20432049, 1986).
Figura 8. Zmodyfikowane sekwencje promotora zastosowane do ekspresji genów Spms kodujących białka w metodzie „głodzenia pyłku”. Pokazane promotory są pochodnymi promotora operonu rRNA i posiadają sekwencję liderową lidera genu 10 faga T7 (PrrnladA; Identyfikator Sekw. Nr 16) albo lidera genu plastydowego rbcL (PrrnlacL2, Identyfikator Sekw. Nr 17). Należy zauważyć podkreślone elementy promotora -10 i -35 oraz sekwencję
185 710 operatora lac (czcionka wytłuszczona). Liczby oznaczają pozycję nukleotydu w genomie plastydu tytoniu (Shinozaki i in., wyżej).
Transgeniczny układ CMS według wynalazku oparty jest na doktrynie głoszącej, że dla tworzenia żywotnego pyłku niezbędne są żywotne, funkcjonujące chloroplasty w rozwijającej się tkance pylnika (zwłaszcza tapetum lub mikrosporach). Układ trzech transgenów obejmuje plastydowy gen męskiej niepłodności (pms), regulowany przez dwa geny jądrowe. Jednym z dwóch jądrowych genów regulatorowych jest jądrowy gen męskiej niepłodności (nms) zaprojektowany tak, że ulega ekspresji wyłącznie w tkance pylników. Gen nms koduje ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulujący gen pms przez jego aktywację lub inaktywację, który powoduje, że transformowane piastydy wybranej tkanki pylników są uszkadzane lub zabijane, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się żywotnego pyłku. Drugi gen jądrowy, gen przywracający męską płodność (rmf), koduje produkt genowy zapobiegający regulacji genu pms przez gen nms.
Szczegółowy opis umieszczony w rozdziałach I-III, poniżej, opisuje szczegółowo korzystne sposoby wytwarzania i zastosowania konstruktów DNA i roślin transgenicznych według wynalazku, oraz praktyczne sposoby wykonania wynalazku. Rozdział I przedstawia ogólne sposoby konstruowania układów CMS opartych na plastydzie według wynalazku (określanych czasem jako układy „plastydowej niepłodności męskiej” albo „pms”). Rozdziały II i III przedstawiają dwa korzystne wykonania układu CMS opartego na plastydzie transgenicznym, sposób „niszczenia pyłku” i sposób „głodzenia pyłku”, oraz opisują konstrukty DNA i inne składniki użyteczne w praktycznym wykonaniu obu korzystnych rozwiązań. Wszystkie nie opisane szczegółowo techniki klonowania molekularnego albo rekombinacji DNA, wykonywane są standardowymi sposobami, jak to przedstawiono, przykładowo, w Sambrook i in., „DNA Cloning, A Laboratory Manuał”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
I. Ogólne metody konstruowania układów CMS opartych na plastydzie transgenicznym oraz produkcji nasion hybrydowych.
Transgeniczne układy CMS według wynalazku są wytwarzane i stosowane zgodnie z ogólnymi sposobami, podanymi poniżej, transformacji jądrowej i plastydowej roślin wyższych, utrzymywania rodzicielskich linii roślinnych oraz produkcji nasion hybrydowych.
A. Konstrukty DNA i sposoby stabilnej transformacji plastydów genem pms oraz regeneracji roślin o transgenicznym plastydzie.
Sposoby i konstrukty DNA do stabilnej, wysoko wydajnej transformacji plastydów i ekspresji białek rekombinowanych w plastydach są znane specjalistom. Sposoby i konstrukty opisane w poniższych odnośnikach są korzystne w praktycznym wykonaniu niniejszego wynalazku: Svab i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8526-30 (1990); Svab i Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:913-17 (1993); Carrer i in.. Mol. Gen. Genet., 241:49-56 (1993); Staub i Maliga, EMBO J., 12:601-06 (1993) i patent USA Nr 08/111,398 oraz 08/189,256; wszystkie wymienione tu odnośniki opisują obecny stan w odniesieniu do stabilnej, wysoko wydajnej transformacji plastydu i ekspresji genów rekombinowanych w plastydach.
Poniższe definicje pomagają w zrozumieniu sposobów transformacji plastydu zastosowanych w niniejszym wynalazku:
Heteroplazmatyczny: dotyczy obecności mieszanej populacji różnych genomów plastydowych w pojedynczym plastydzie albo w populacji plastydów zawartych w komórkach lub tkankach roślinnych.
Homopłazmatyczny: dotyczy czystej populacji genomów plastydowych, w plastydzie albo w komórkach i tkankach.
Transformacja plastydów: trwała integracja transformowanego DNA w genomie plastydowym, w taki sposób, że jest on przekazywany potomstwu (nasionom) roślin zawierających transformowany plastyd.
Wcześniej wspomniane korzystne sposoby i konstrukty do transformacji plastydu opierają się na zastosowaniu innych niz letalne sposobów selekcji, co nadaje komórkom zawierającym transformowany plastyd fenotyp możliwy do rozpoznania. Określenia „marker selekcyjny” albo „marker umożliwiający selekcję” dotyczy fenotypu identyfikującego z powodzeniem transformowane organelle, komórkę albo tkankę, gdy gen albo allel kodujący marker
185 710 selekcyjny włączony jest do obcego DNA użytego do transformacji. Powszechnie stosowane markery selekcyjne obejmują geny oporności na antybiotyki, herbicydy albo inne związki, które byłyby śmiercionośne dla komórek, organelli albo tkanek nie ekspresjonujących genu lub allelu oporności. Wybór transformantów dokonywany jest przez hodowanie komórek bądź tkanek pod presją selektywną, tzn. w pożywce zawierającej antybiotyk, herbicyd albo inny związek. Jeżeli marker selekcyjny jest markerem „śmiercionośnym” komórki, które ekspresjonują marker przeżyją, podczas gdy komórki pozbawione markera selekcyjnego zginą. Jeżeli marker selekcyjny „nie jest śmiercionośny”, transformanty (tzn. komórki ekspresjonujące marker) będą odróżniane od nietransformantów innymi sposobami, ale zarówno transformanty jak i nietransformanty przeżyją w obecności presji selektywnej.
Marker selekcyjny może nie być śmiercionośny na poziomie komórkowym, ale może być wybiórczy na poziomie organelli; ma to miejsce w przypadku markerów selekcyjnych korzystnych w transformacji piastydu. Przykładowo, antybiotyk spektynomycyna hamuje translację wplastydach, ale nie w cytoplazmie. Plastydy wrażliwe na spektynomycynę są niezdolne do wytwarzania białek wchodzących w skład mechanizmu fotosyntezy. W obecności spektynomycyny, komórki zawierające taki plastyd utrzymywane są przy życiu przez hodowanie ich w warunkach fotoheterotrofowych (tzn. dostarczających im egzogennego źródła węgla), ale plastydy takie rosną wolniej, zaś komórki czy tkanki stają się białe zamiast zielone. W przeciwieństwie, plastydy ekspresjonujące wybiórczy fenotyp oporności na spektynomycynę dzielą się w szybszym tempie, zaś komórki, w których się znajdują są zielone. W mieszanych populacjach komórek zawierających plastydy transformowane i nietransformowane, wrażliwe nietransformanty będą znacznie mniej liczne i zostaną „rozcieńczone” podczas podziału plastydu/komórki pod presją selektywną, tak że populację plastydów tworzyć będą zasadniczo wyłącznie plastydy transformowane (komórki i tkanki homoplazmatyczne, jak to zdefiniowano wyżej). Tak więc, termin „selekcyjny marker, nieśmiercionośny”, oznacza, że nie jest on śmiercionośny na poziomie komórkowym, zatem wrażliwe komórki czy tkanki mogąbyć hodowane w pożywce selekcyjnej, ale tkanki oporne są łatwe do odróżnienia od nich.
Transformacja plastydu wymaga: (1) sposobu dostarczania DNA przez podwójną błonę plastydu; (2) integracji heterologicznego DNA bez zakłócania normalnych funkcji genomu plastydowego (osiąganej przez zastąpienie istniejącego genu albo przez wprowadzenie dodatkowych genów w odpowiednie położenie w genomie plastydu); oraz (3) efektywnej selekcji transformowanego genomu plastydowego, korzystnie przez zastosowanie nieśmiercionośnego, dominującego markera selekcyjnego, jak to opisali Svab i Maliga, 1993, wyżej opisując gen aadA jako marker selekcyjny do wysoko wydajnej transformacji chloroplastów tytoniu.
Dostępnych jest kilka sposobów wprowadzania DNA do plastydów roślin kwitnących, obejmujących, choć nie ograniczonych do wektorów Agrobacterium, traktowania plastydów glikolem polietylenowym (PEG), bombardowania komórek lub tkanek mikropociskami pokrytymi DNA transformującym plastyd (określane czasem jako „balistyczne wprowadzanie DNA”) oraz wycinania „chwilowych” otworków mikro wiązką lasera UV. Inne sposoby obejmują zastosowanie wektorów geminiwirusowych, traktowanie protoplastów fosforanem wapnia, elektroporację wyizolowanych protoplastów i wytrząsanie zawiesin komórkowych z mikroperełkami pokrytymi transformującym DNA. Sposób balistyczny opisany przez Svab i Maliga, 1993, wyżej, jest korzystny do transformacji plastydu, ponieważ może być zastosowany do licznych roślin i ich tkanek, obejmujących rodzaje niemożliwe do hodowli komórkowej lub protoplastowej albo do regeneracji. W innym wykonaniu, użytecznym w przypadku roślin, których protoplasty mogą być uzyskane i zregenerowane w całe rośliny, transformacje plastydu można uzyskać przez traktowanie protoplastów glikolem polietylenowym w obecności transformującego DNA. Sposoby trwałej transformacji plastydowej w traktowanych PEG protoplastach opisano na przykładzie tytoniu w Golds i in., Bio/Technology, 11:95-97 (1993).
Konstrukty DNA przydatne do trwałej transformacji plastydowej genem pms (określane czasem jako „DNA transformujący” albo „wektory insercyjne”) obejmują następujące elementy: (1) sekwencje DNA homologiczne z regionem genomu plastydu, który ma być transformowany (określane tu czasem jako „segment ukierunkowujący” albo „fragment ukierun14
185 710 kowujący”) o długości odpowiedniej do zapewnienia zjawiska rekombinacji homologicznej koniecznej do wprowadzenia transformującego DNA do genomu plastydowego, (2) gen nieśmiercionośnego markera selekcyjnego, jak gen aadA, oraz (3) gen pms, przy czym oba geny połączone są operacyjnie z odpowiednimi regionami regulatorowymi 5' i 3', służącymi ekspresji w piastydzie. Wektory takie są dogodnie zestawione jako geny chimeryczne, w których regiony kodujące (tzn. region kodujący gen markera selekcyjnego i region kodujący genpms) flankowane są na końcach 5' i 3' odpowiednimi sekwencjami regulatorowymi. Segmenty regulatorowe 5' i 3' segmentu kodującego marker selekcyjny są tak dobrane, aby gen markera selekcyjnego ulegał wydajnej ekspresji, nadając w ten nieśmiercionośny fenotyp selekcyjny. Segmenty regulatorowe 5' i 3' genu pms dobrane są jak to opisano wyżej, tak, aby gen był możliwy do aktywacji i inaktywacji pod kontrolą jądrowych genów nms irmf Takie geny chimeryczne flankowane są z obu stron przez części segmentu ukierunkowującego.
Segment ukierunkowujący wektora insercyjnego powinien być wystarczająco duży, aby zapewnić rekombinację homologiczną pomiędzy transformującym DNA i genomem plastydowym. W tym celu, segment ukierunkowujący powinien mieć długość przynajmniej 50 par zasad, zaś najkorzystniej od 500 do 1500 par zasad, z każdej strony DNA, który ma być wprowadzony do genomu plastydowego.
Segment ukierunkowujący jest tak dobrany, że DNA transformujący nie zaburza ekspresji sąsiadujących genów plastydu. Przydatne segmenty ukierunkowujące mogąbyć zidentyfikowane przez specjalistów, dzięki dostępności informacji dotyczącej mapowania genomów oraz informacji o sekwencjach niektórych genomów plastydowych, w połączeniu z możnością zastosowania tych informacji do innych genomów plastydowych na skutek wysokiego stopnia konserwacji genomów plastydowych (Palmer, Trends in Genetics, 6:115-120, 1990; Sugiura, Plant Mol. Biol., 19:149-168, 1992).
Dla sposobu „głodzenia pyłku” według wynalazku, segment ukierunkowujący obejmuje gen, który ma być zastąpiony, i całkowicie usuwa ten gen bez zaburzania sąsiadujących genów genomu plastydowego. Zastąpienie jest osiągane przez połączenie genu markera selekcyjnego poniżej genu, który ma zastąpić gen plastydowy, i selekcję transformantów wykazujących fenotyp selekcyjny (patrz Maliga i in., Phil. Trans. R. Soc. Lond., B, 342:203-208 (1993)).
Dla sposobu „niszczenia pyłku”, segment ukierunkowujący jest dobrany tak, ze transformujący DNA jest wprowadzany do genomu plastydowego w położeniu niemym transkrypcyjnie, bez zakłócania genów plastydowych. Zakładając, że regiony 3' genów plastydowych kończą transkrypcję nieefektywnie (Gruissem i Tonkyn, Critical Review in Plant Sciences, 12:19-55, 1993), można oczekiwać pewnego stopnia transkrypcji „z rozpędu”, przy wprowadzeniu transformującego DNA w niemal każdym położeniu genomu plastydowego. W świetle tych faktów, szczególnie korzystne jest miejsce wprowadzenia w regionie odwróconego powtórzenia, pomiędzy genem trnV i operonem rps!2/7, ponieważ transformujący DNA ulega transkrypcji bez istotnej transkrypcji „z rozpędu”, ponieważ jest zorientowany w kierunku operonu rpsl2/7. Brak transkrypcji „z rozpędu” w położeniu trnN-rps!2/7 spowodowany jest, prawdopodobnie, tym, że flankujące geny plastydowe czy operony ulegają przeciwstawnej transkrypcji (tzn. transkrypcji z przeciwległych nici, w przeciwnym kierunku). Tak więc, segmenty ukierunkowujące skierowane w miejsca pomiędzy geny ulegające przeciwstawnej transkrypcji mogąbyć również korzystne w wykonywaniu niniejszego wynalazku. Obejmują one, choć nie są ograniczone, miejsca pomiędzy trnL i ORF2280 w regionie odwróconego powtórzenia, oraz pomiędzy trnS i ORF168 i trnW ipetG w dużym regionie pojedynczej kopii. Alternatywnie, mogą być także użyteczne miejsca wprowadzenia pomiędzy dowolnymi dwoma genami tRNA, ponieważ geny tRNA są stosunkowo skutecznymi terminatorami transkrypcji (Stern i Gruissem, Celi, 51:1145-57, 1987). Takie same wyniki można uzyskać przez flankowanie miejsc insercji terminatorami transkrypcji, które mogą być syntetyzowane albo wycięte z genów źródłowych i klonowane.
Gen markera selekcyjnego i gen pms mogą być dostarczone do wprowadzania do segmentów ukierunkowujących w kasetach ekspresji. Kaseta ekspresji, w znaczeniu tu użytym, zawiera segmenty regulatorowe 5' i 3', korzystnie zaadaptowane do wygodnego mieszania
185 710 i dobierania standardowymi technikami rekombinacji DNA. Kasety ekspresji stosowane są do wytworzenia chimerycznych genów pms i genów markera selekcyjnego, służących do konstruowania wektorów insercyjnych. Wektory insercyjne do transformowania plastydów genem pms zawierają więc przynajmniej jeden inny gen, zapewniający nieśmiercionośny fenotyp selekcyjny.
Kasety ekspresji zawierają segmenty regulatorowe 5' i 3', służące do kontrolowania różnych segmentów kodujących. Segment regulatorowy 5' kontroluje ilość i swoistość ekspresji w plastydach. Segment regulatorowy 3' zapewnia stabilność mRNA. Segmenty regulatorowe 5' i 3' są korzystnie otrzymywane z regionów regulatorowych 5' i 3' endogennych genów plastydowych, które mogą być dalej modyfikowane. Można również stosować inne regiony regulatorowe 5' i 3', w szczególności regiony pobrane z E. coli, cyjanobakterii, bakterii fotosyntetyzujących, bakteriofagów i wirusów roślin.
W celu uzyskania wysokich poziomów ekspresji białka genu markera selekcyjnego i genu pms w plastydach pylników, w segmencie regulatorowym 5’ mogą być zastosowane zmodyfikowane promotory inne niż fotosyntetyczne. Silnym promotorem tego rodzaju jest promotor operonu rybosomalnego RNA 16S, Prrn, opisany przez Svab i Maliga, 1993, wyżej.
Oprócz elementów promotora służących sterowaniu transkrypcją, segmenty regulatorowe 5' mogą zawierać dodatkowe elementy wspomagające ekspresję służące regulacji translacji, takie jak miejsca wiążące rybosom zawarte w nieulegających translacji regionach 5' (UTR) genów plastydowych, jak również sekwencje kodujące kilka N-końcowych aminokwasów genu plastydowego.
Przykład promotora operonu rrn, który został zaprojektowany do ekspresji genu oporności na spektynomycynę, aadA, przedstawiony został przez Svab'a i Maliga, 1993, wyżej. Ten segment regulatorowy 5' zawiera segment regionu 5' operonu rrn, zawierający elementy promotora -10 i -35, poddane fuzji z 18 nukleotydami regionu nie ulegającego translacji silnie ekspresjonowanego rbcL, zawierającego miejsce wiążące rybosom GGGUGGG. Ten segment regulatorowy 5' był zdolny do kierowania ekspresją konstytutywną genu uidA w transformowanych plastydach. Jako inny przykład, ten sam promotor opisany przez Carrer i in., 1993, wyżej, był zdolny do kierowania ekspresją genu kan.
Stwierdzono również, ze ekspresja może być poprawiona przez włączenie do segmentu regulatorowego 5' całej sekwencji wiodącej rbcL, od -16 do +18, w odniesieniu do miejsca rozpoczęcia translacji. Wziąwszy pod uwagę ważność sekwencji wiodących mRNA (tzn. 5'UTR i regionów kodujących koniec N) dla wysokiego poziomu ekspresji białka, inne użyteczne sekwencje wiodące mogą być uzyskane z innych genów ulegających silnej ekspresji, szczególnie genów wirusowych (np. sekwencja omega białka otoczki wirusa mozaiki tytoniowej (TMV), nie ulegające translacji sekwencje wiodące RNA4 wirusa mozaiki lucerny (AMV) albo RNA3 wirusa mozaiki stokłosy (BMV) oraz sekwencja wiodąca faga T7 (patrz fig. 8 i przykład 4).
Przykład segmentów regulatorowych 3' odpowiednich do wykonywania wynalazku opisano w Staub i Maliga, 1993, wyżej, oraz w przykładzie 1 (fig. 3). Segmenty te uzyskano z nie ulegających translacji regionów 3' różnych genów plastydowych oraz genu 10 faga T7.
Stosując opisane powyżej konstrukty, można uzyskać wielokomórkowe rośliny o trwale transformowanym plastydzie, zawierające genpms, w następujący sposób:
(1) należy wprowadzić gen pms do wektora insercyjnego zawierającego gen nieśmiercionośnego markera selekcyjnego oraz odpowiedni segment ukierunkowujący;
(2) wprowadzić transformujący DNA do plastydu (najkorzystniej sposobem balistycznym) umożliwiając w ten sposób integrację transformującego DNA bez zakłócania normalnych funkcji genomu plastydowego;
(3) utrzymywać traktowane komórki albo tkanki w odpowiedniej pożywce selekcyjnej oraz powtarzać klonowanie do uzyskania komórek lub tkanek homoplazmatycznych;
(4) zidentyfikować komórki lub tkanki homoplazmatyczne dzięki ekspresji w nich fenotypu selekcyjnego; i (5) hodować zidentyfikowane transformanty w dojrzałe rośliny i badać ich potomstwo w kierunku utrzymywania fenotypu selekcyjnego i obecności genu pms
185 710
B. Sposoby uzyskiwania roślin transgenicznych jądrowo, zawierających gen nms albo gen rmf.
Transformacja jąder roślin może być osiągnięta tymi samymi sposobami jak opisane dla transformacji plastydu. Obejmują one, choć nie są do nich ograniczone, stosowanie wektorów Agrobacterium, traktowanie protoplastów PEG, balistyczne wprowadzanie DNA, stosowanie mikrowiązek lasera UV, wektorów geminiwirusowych, traktowanie protoplastów fosforanem wapnia, elektroporację izolowanych protoplastów, wytrząsanie zawiesiny komórkowej z mikroperełkami pokrytymi transformującym DNA, bezpośredni wychwyt DNA, wychwyt DNA zależny od liposomów itp. Sposoby te opisane są w publikacjach, patrz, np. Methods for Plant Molecular Biology, wyd. Weissbach i Weissbach, Academic Press, Inc. (1988); Methods for Plant Molecular Biology, wyd. Schuler i Zieliński, Academic Press, Inc., (1989); Plant Molecular Biology Manuał, Gelvin Schilperoort, wyd. Verma, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1993); i Methods in Plant Molecular Biology - A Laboratory Manuał, wyd. Maliga, Klessig, Cahmore, Gruissem i Vamer, Cold Spring Harbor Press (1994, w druku).
Sposób transformowania zależy od rośliny, która ma być transformowana. Sposób balistycznego wprowadzania DNA opisano już dla transformacji plastydów i można go zastosować do transformacji jądrowej. W innym wykonaniu wynalazku, korzystnie zostały zastosowane do transformacji jąder roślin wektory Agrobacterium.
W korzystnym wykonaniu, gen nms (jak również gen rmf opisany poniżej) wprowadzono do jąder roślin w binarnych wektorach Agrobacterium. Wektory te obejmują, choć nie są ograniczone do BIN19 (Bevan, Nuci. Acids Res., 12:8711-8721, 1984) ijego pochodnych, serii wektorów pBI (Jefferson i in., EMBO J., 6:3901-07, 1987) oraz wektorów binarnych pGA482 ipGA492 (An, Plant Physiol., 81:86-91, 1986). Korzystna według wynalazku jest nowa seria wektorów binarnych Agrobacterium, z rodziny pPZP. Zastosowanie tej rodziny wektorów do transformacji roślin jest opisane przez Svab'a i in., Methods in Plant Molecular Biology - A Laboratory Manuał, wyd. Maliga, Klessig, Cahmore, Gruissem i Vamer, Cold Spring Harbor Press (1994, w druku).
Przy zastosowaniu układu wektorów binarnych Agrobacterium do transformacji, geny nms i rmf połączone są z jądrowym markerem oporności na leki, takie jak kanamycyna czy gentamycyna. Gen nms oraz gen rmf są korzystnie połączone z dwoma różnymi markerami oporności, tak ze oba geny mogą być selekcjonowane niezależnie od siebie. Transformacja jąder roślin zależna od Agrobacterium może być osiągnięta w następujący sposób:
(1) gen nms albo gen rmf wprowadzany jest do wybranego wektora binarnego Agrobacterium;
(2) transformacja jest uzyskiwana przez współhodowlę tkanki roślinnej (np. krążków liści) z zawiesiną rekombinowanych Agrobacterium, a następnie inkubację (np. przez dwa dni) w pożywce hodowlanej pod nieobecność leku, stosowanego jako pożywka selekcyjna (patrz, np. Horschi in., Science 227:1229-1231, 1985);
(3) tkanka roślinna jest następnie przenoszona do pożywki selekcyjnej w celu identyfikacji tkanki transformowanej; i (4) zidentyfikowane transformanty są regenerowane do całych roślin.
Należy rozumieć, że wielkość ekspresji jak również swoistość tkankowa ekspresji genów nms i rmf w roślinach transformowanych będzie zalezeć od ich położenia w genomie jądrowym. Taki wpływ położenia jest dobrze znany, patrz, Weising i in., Ann. Rev. Genet., 22:421-477 (1988). Z tego powodu, należy zregenerować kilka transformantów jądrowych i badać w krzyżówkach z transformowaną plastydowo linią Ap (albo linią „testową” Ap, w której gen pms jest genem reporterowym, takim jak np. uid\, kodującym β-glukuronidazę (GUS) aby odpowiednio odróżnić transformanty, w których zachodzi eksprecja transgenu jądrowego.
C. Przygotowanie i utrzymywanie linii rodzicielskich oraz wytwarzanie nasion hybrydowych.
Zgodnie ze sposobami opisanymi wyżej, do wybranych linii roślinnych wprowadzono trzy transgeny, jak następuje. Wybrano linię rodzicielską rodzica A. Plastydy rośliny rodzicielskiej A stransformowano trwale genem pms i zregenerowano plastydowo-transgeniczną
185 710 roślinę A (Ap). Jądra innej rodzicielskiej rośliny A stransformowano trwale genem nms i zregenerowano roślinę transgeniczną jądrowe (AN). Wybrano drugą linię rodzicielską rodzica B. Jądra rodzicielskiej rośliny B stransformowano trwale genem rmf i zregenerowano roślinę transgenicznąjądrowo (BR).
Posiadając linie rodzicielskie Ap, AN i BR, można łatwo przeprowadzić rozmnażanie oraz produkcję nasion hybrydowych. Wszystkie rodzicielskie linie transformowane jądrowe były wsobne do homozygotyczności. Linia transformowana piasty do wo Ap jest homoplazmatyczna. Wszystkie linie rodzicielskie są męsko płodne i mogą być utrzymywane w nieskończoność. W celu uzyskania cytoplazmatycznie męsko niepłodnego potomstwa, A1 (rodzic pyłkowy) jest krzyżowany z Ap (rodzic żeński), z zastosowaniem różnych technik (jak usuwanie części męskich Ap i stosowanie AN jako rodzica męskiego) w celu zapewnienia uzyskania nasion skrzyżowanych, a nie powstałych z samozapylenia. Potomstwo to jest męsko niepłodne, ponieważ posiada zarówno gen pms jak i gen regulatorowy nms, co prowadzi do uszkodzenia albo śmierci plastydów lub komórek w wybranej tkance pylników i w następstwie braku produkcji żywotnego pyłku. Przez powtarzane krzyżówki wsteczne z AN, uzyskuje się trwałą linię As, posiadającą homozygotyczność pod względem AN w cytoplazmie Ap.
Nasiona męsko niepłodnych roślin As mogą być namnażane przez krzyżówkę wsteczną z transformowanym jądrowo rodzicem AN. Do namnażania nasion As, rośliny As mogą być sadzone w pobliżu roślin AN, w naprzemiennych rzędach, zaś nasiona zbierane osobno z każdego rzędu. Rośliny rosnące z nasion rzędów As będą męsko niepłodne. Ponieważ niepłodność męska jest generowana na poziomie plastydu przez plastydy transgeniczne, cecha niepłodności męskiej jest jednorodnie dziedziczona cytoplazmatycznie bez wytwarzania niepożądanych osobników męsko płodnych, na skutek segregacji genów jądrowych.
Druga linia rodzicielska, rodzic B, stosowana jest do wytwarzania nasion hybrydowych. Gdy męsko płodna roślina hybrydowa nie jest konieczna, dokonywana jest zwykła krzyżówka AsxB, zaś potomstwo ASB będzie dziedziczyć cechę CMS, tworząc rośliny, które są męsko niepłodne, ponieważ potomstwo będzie posiadało przynajmniej jedną kopię genu nms, ale nie rmf Z drugiej strony, jeżeli pożądane jest aby z nasion hybrydowych wyrosły rośliny męsko płodne, korzysta się z transgenicznego jądrowo rodzica, B^. Do wytwarzania męsko płodnych nasion hybrydowych, rośliny As mogą być sadzone w pobliżu wytwarzających pyłek roślin BR. Ponieważ rośliny As nie wytwarzają płodnego pyłku, wszystkie wytwarzane przez rośliny As nasiona są wynikiem zapłodnienia pyłkiem BR. Krzyżówki As z BR powodują powstanie nasion hybrydowych ASBR, które wyrosną w postaci roślin męsko płodnych, dzięki ekspresji genu rmf, blokującego aktywność regulacyjną produktu genu nms na gen pms.
II. Metoda „niszczenia pyłku”.
W jednym z wykonań wynalazku, określanym tu jako metoda „niszczenia pyłku” gen pms jest genem nieaktywnym, tak zmodyfikowanym, że może ulec aktywacji i ewentualnie inaktywacji. Aktywowany genpms ulega ekspresji do produktu genowego, toksycznego albo śmiercionośnego dla plastydów. Gen nms jest jądrowym genem swoistym dla pylników, kodującym ukierunkowany na plastyd aktywator polipeptydowy, zdolny do wnikania do plastydu i aktywacji toksycznego genu pms i uszkadzania albo niszczenia plastydów wybranej tkanki pylników. Gen rmf rodzica B koduje produkt genu „przywracającego”, zdolnego do zaburzania czynności aktywatora polipeptydowego, zapobiegając w ten sposób tworzeniu śmiercionośnego produktu genu pms. W korzystnym wykonaniu, gen rmf koduje ukierunkowany na plastyd polipeptyd, zdolny do wnikania do plastydu i zakłócania tam czynności aktywatora polipeptydowego (np. przez oddziaływanie z miejscem inaktywacji genu pms, blokując w ten sposób wpływ aktywatora polipeptydowego). W innym wykonaniu, gen rmf koduje cytoplazmatyczny produkt genowy, oddziaływujący z prekursorem aktywatora polipeptydowego zanim ten wniknie do plastydu (np. jest ukierunkowany na jądro i hamuje ekspresję genu nms).
Metodę „niszczenia pyłku” przedstawiono na przykładzie układu wykorzystującego polimerazę RNA T7 jako polipeptyd aktywujący, represor lac jako polipeptyd przywracający oraz toksyczny dla plastydu gen „niszczący” („killer”) połączony operacyjnie z promotorem TlHac. W tym wykonaniu, produkt genowy nms obejmuje wysoce swoistą polimerazę RNA
185 710 bakteriofaga T7, poddaną fuzji z plastydowym peptydem tranzytowym (np. małąpodjednostką RuBisCo) aby ukierunkować polimerazę na przedział zrębowy plastydu. Polimeraza RN A T7 jest stosunkowo prostą polimerazą, stanowiącą mouomeryczny enzym wielkości —100 kDa. Polimeraza wiąże się swoiście z krótką (23 bp) sekwencją promotorową, ze swoistością uniemożliwiającą zakłócanie ekspresji genów gospodarza. Region kodujący ukierunkowanej na plastyd polimerazy RNA T7 jest połączony operacyjnie z promotorem swoistym dla tapetum, w taki sposób, że gen ten będzie ulegał transkrypcji wyłącznie w komórkach tapetum, wywołując śmierć komórkową. Układ polimeraza T7-promotor T7//ac jest szczególnie korzystny do zastosowania w niniejszym wynalazku, ponieważ nawet silna ekspresja polimerazy nie jest w stanie spowodować żadnych niepożądanych efektów w komórkach roślinnych (ekspresja polimerazy T7 na poziomie równym 1 % całkowitego białka komórkowego nie wpływa niekorzystnie, jak stwierdzono, na wzrost drożdży (Chen in., Celi, 50:1047-1055, 1987)).
Tak więc, w tym wykonaniu, w linii rodzicielskiej AN następuje ekspresja polimerazy RNA T7, linia rodzicielska Ap zawiera w plastydach nieaktywny gen pms, zaś potomstwo AnxAp jest cytoplazmatycznie męsko niepłodne z powodu oddziaływania polimerazy T7 z promotorem THlac, aktywującego gen pms. To męsko niepłodne potomstwo, linia As, stosowane jest do wytwarzania nasion hybrydowych, jak to opisano wyżej. Do wytwarzania męsko płodnych hybryd, rodzic As krzyżowany jest z rodzicem BR, w którym w wyniku ekspresji powstaje produkt genowy rmf, ukierunkowany na plastyd represor lac. Represor lac wchodzi do przedziału plastydowego i wiąże się z sekwencją operatora lac, zawartą w promotorze THlac, zapobiegając w ten sposób transkrypcji genu pms przez polimerazę RNA T7 (patrz, Dubendorff i Studier, J. Mol. Biol., 219:45-49, 1991). Tak więc, hybrydowe potomstwo ASBP będzie męsko płodne, ponieważ jego płodność zostanie przywrócona przez ekspresję genu rmf.
Opisany powyżej układ T7/lac przedstawiono bardziej szczegółowo w przykładach 1 -3 i schematycznie na fig. 1. W świetle powyższego opisu układu THlac, będzie zrozumiałe, że aby uzyskać ten sam efekt mogą być zastosowane inne układy aktywatorów i represorów. Przykładowo, alternatywą dla układu polimeraza RNA T7/represor lac jest układ polimeraza T3/represor lac, opisany przez Deuschle i in.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5400-5404,1989.
Innym układem przydatnym do wykonania wynalazku jest układ represora i operatora tetracyklinowego, opisany poniżej, zaadaptowany do układów ssaczych jak i roślinnych (patrz, Gossen i in., Trends in Biotechnology, 12:58-62, 1994).
A. Geny plastydowej niepłodności męskiej do zastosowania w metodzie „niszczenia pyłku”.
Zgodnie ze sposobem „niszczenia pyłku” według wynalazku, gen pms wprowadza się do plastydu jako gen nieaktywny, pod kontrolą sekwencji docelowej, która umożliwia ekspresję genu wyłącznie w obecności aktywatora polipeptydowego kodowanego przez gen nms innego składnika rodzicielskiej linii CMS. W tym wykonaniu, region kodujący genu pms koduje produkt genowy (RNA albo białko), który jest toksyczny dla plastydów, w których jest wytwarzany. Ponieważ plastydy są miejscami niezwykle ważnych procesów metabolicznych i biochemicznych roślin, włączywszy fotosyntezę (w chloroplastach), syntezę i akumulację skrobi (w chloroplastach i amyloplastach) oraz syntezę aminokwasów i lipidów (ogólnie, w plastydach), istnieje w plastydach wiele celów do działania plastydotoksycznych produktów genowych. Przykłady możliwych układów toksycznych dla plastydów obejmują, choć nie są do nich ograniczone, nadekspresję swoistych produktów genów plastydu, ekspresję RNA antysensownego albo rybozymów skierowanych przeciwko mRNA kodującym niezbędne produkty genów plastydu, modyfikację potranskrypcyjną życiowo ważnych białek, np. rybozylację ADP (Ueda i Hayaishi, Ann. Rev. Biochem., 54:73-100, 1985) heterologicznych DNAz, RNAz, proteaz i białek tworzących pory, czyniących błony plastydu przepuszczalnymi albo w inny sposób niszczących układ błon plastydu. Należy zaznaczyć, że toksyczne produkty genowe mogą również wydostawać się (albo ulegać translokacji) do cytoplazmy, gdzie mogą wywierać efekty toksyczne. Konkretne przykłady użytecznych śmiercionośnych polipeptydów obejmują, choć nie są do nich ograniczone:
T-ur/13 z genomu mitochondrialnego kukurydzy CMS-T.
185 710
Jak to omówiono w rozdziale „Podstawy wynalazku”, polipeptyd 13 kDa kodowany przez gen urfl3 zwiększa przepuszczalność błon biologicznych, co prowadzi do powstania fenotypu CMS w występujących naturalnie układach, patrz, Hanson, Ann. Rev. Genet, 25:461-86 (1991). Inne użyteczne białka niszczące błony obejmują liczne błonowe białka transportujące drożdży, bakterii i ssaków (patrz, np. Ortiz i in., EMBO J„ 11:3491-3499, 1992; Guranka i in., FASEB J„ 3:2583-2592, 1989);
gen toksyny CytA z Bacillus thuringensis Israeliensis, który koduje białko hemolityczne zabijające komary. Ekspresja genu w komórkach roślinnych powoduje śmierć komórki z powodu niszczenia błon komórkowych (McLean i in., J. Bacteriol., 169:1017-1023, 1987; Ellar i in., patent USA Nr 4,918,006, 1990), aktywność biologiczna możliwa również do zastosowania w błonach organelli, jak plastydy;
rekombinazę Cre z bakteriofagów PI i układ Cre-Ιοχ, do wywoływania miejscowo swoistej rekombinacji i rearanżacji, które prowadzą do utraty żywotności komórki (van Haaren i Ow, Plant Mol. Biol., 23:525-533,1993).
W tym wykonaniu wynalazku, region kodujący genu pms może również kodować RNA zdolne do hamowania kluczowych funkcji plastydu, powodując w ten sposób uszkodzenie plastydu albo śmierć. Mogą one obejmować cząsteczki antysensowne albo rybozymy, których konstrukcja i zastosowanie są znane. Cząsteczki antysensowne są ogólnie zaprojektowane tak, by wiązały się z kluczowymi regionami genu albo mRNA, zapobiegając w ten sposób transkrypcji albo translacji, albo wyzwalając degradację docelowego RNA. Rybozymy obejmują region hybrydyzujący, komplementarny w swej sekwencji nukleotydowej do części docelowego RNA oraz region katalityczny, który tnie docelowy RNA w określonym położeniu.
W metodzie „niszczenia pyłku”, możliwe do regulowania sekwencje docelowe genu pms obejmują nieplasty do wy promotor, który jest swoiście aktywowany przez ukierunkowany na plastyd produkt genowy genu nms. W korzystnym wykonaniu, możliwa do regulowania sekwencja docelowa genu pms zawiera również miejsce wiążące represor, położone względem promotora tak, że związanie swoistego represora z miejscem wiążącym represor zapobiega transkrypcji genu, nawet w obecności polipeptydu aktywującego (określana tu jako „pozycja kontrolująca” względem promotora i regionu kodującego pms}. Korzystny jest konstrukt promotora ΊΊ/lac, opisany przez Dubendorff i Studier, J. Mol. Biol., 219:45-49 (1991) i przedstawiony powyżej. Zastosowanie tej sekwencji promotora/represora umożliwia aktywację genu pms przez ukierunkowaną na plastyd polimerazę RNA T7 i inaktywację genu przez ukierunkowany na plastyd represor lac do przywrócenia płodności męskiej.
Inną możliwą do regulacji sekwencją docelową użyteczną do tego wykonania, jest miejsce wiążące represor tet (operator tet), również omówiony powyżej i poniżej w odniesieniu do sposobu „głodzenia pyłku”. Operator lac albo inne miejsca wiążące represor są podobnie przydatne w układach wykorzystujących chimeryczne polipeptydy aktywujące wytworzone z domeny wiążącej represor i domeny aktywatora heterologicznego.
B. Jądrowe geny niepłodności męskiej do metody „niszczenia pyłku”.
Jądrowe geny niepłodności męskiej według wynalazku obejmują trzy elementy: (1) region kodujący polipeptyd regulatorowy, poddany fuzji translacyjnej z (2) plastydowym peptydem tranzytowym umożliwiającym przeniesienie polipeptydu regulatorowego do plastydu, zaś transkrypcja genu chimerycznego znajduje się pod kontrolą (3) promotora swoistego dla pylników.
Swoistość dla pylników zapewniana jest układowi CMS według wynalazku, przez umieszczenie regionu kodującego genu nms pod kontrolą promotora swoistego dla pylników. Promotorem swoistym dla pylników jest taki promotor, który kieruje transkrypcją związanej z nim sekwencji kodującej w taki sposób, że odpowiedni posłańcowy RNA jest obecny w tkance pylników w stężeniu przynajmniej 100-krotnie wyższym niż obserwowane w innych tkankach.
Metabolicznie czynna warstwa tapetum pylników odgrywa rolę odżywczą dla mikrosporów, będących prekursorami pyłku. Ablacja komórek tapetum powoduje, jak wykazano, jądrową niepłodność męską (Mariani i in.. Naturę, 347:737-741 (1990); Mariani i in., Naturę, 357:384-387 (1992)). Stąd, w korzystnym wykonaniu wynalazku, wykorzystywane są pro
185 710 motory swoiste dla tapetum. Promotory swoiste dla tapetum są znane, jak np. opisane przez Mariani i in., 1990, 1992, wyżej. W innym wykonaniu wykorzystane są promotory swoiste dla mikrosporów. Promotory takie są również znane (np. T52 i T59, opisane przez Twell i in., Genes & Devel„ 5:496-507, 1991).
Geny nms mogą również obejmować inne sygnały regulatorowe. Przykładowo, do konstruktu mogą być włączone roślinne jądrowe translacyjne sekwencje zgodności, jak również odpowiednie sygnały zakończenia transkrypcji i translacji roślinnych genów jądrowych.
Większość białek plastydowych jest kodowana w jądrze, ulega translacji w cytoplazmie i jest transportowana potranslacyjnie do plastydu. Takie kodowane jądrowo białka są syntetyzowane jako prekursory o wyższym ciężarze cząsteczkowym i zawierają odcinaną N-końcową sekwencję, określaną jako peptyd tranzytowy. Peptyd tranzytowy jest niezbędny i wystarczający do transportu polipeptydu prekursorowego przez błonę otaczającą plastyd (i, zależnie od położenia końcowego polipeptydu, do różnych przedziałów plastydu). Peptydy tranzytowe są zdolne do wychwytu i wewnętrznego umiejscowienia heterologicznych białek pasażerskich („passenger protein”), z którymi są poddane fuzji translacyjnej (patrz, ogólnie, Theg i Scott, Trends in Celi Biology, 3:186-190 (1993); patrz również Schnell i Blobel, J. Celi Biol., 120:103-115 (1993); Kanefsky i in.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1969-1973 (1994)).
Do wykonywania niniejszego wynalazku, wykorzystywany jest peptyd tranzytowy kierujący przeniesieniem kodowanego jądrowo polipeptydu regulatorowego do zrębu plastydu, ponieważ genomy plastydowe zawierające gen pms są zlokalizowane w zrębie. W korzystnym wykonaniu, do genu nms włączona jest sekwencja DNA kodująca peptyd tranzytowy prekursora podjednostki mniejszej (pre-SS) karboksylazy rybulozo-l,5-bifosforanowej/oksygenazy (RuBisCo), w celu spowodowania ekspresji polipeptydu prekursorowego obejmującego polipeptyd regulatorowy poddany fuzji translacyjnej z peptydem tranzytowym pre-SS. Jakkolwiek jako przykładu użyto tu peptydu tranzytowego pre-SS, powinno być zrozumiałe dla specjalistów, że każdy peptyd tranzytowy kierujący białko kodowane w jądrze i ukierunkowane na zrąb, będzie użyteczny w niniejszym wynalazku.
W metodzie „niszczenia pyłku”, gen nms koduje ukierunkowany na plastyd polipeptyd aktywujący zdolny do aktywacji toksycznego genupms, przez docelową sekwencję nukleotydową operacyjnie związaną z genem. Polipeptydy aktywujące, według wynalazku, obejmują, ale nie są do nich ograniczone, polimerazy, białka wiążące DNA, występujące naturalnie albo syntetyczne aktywatory transkrypcyjne, aktywatory translacyjne, inne aktywatory potranskrypcyjne itp. Zastosowanie polipeptydu aktywującego do kierowania ekspresji innych sekwencji nukleotydowych przedstawiono powyżej na przykładzie polimerazy RNA T7 (patrz, patent USA Nr 5,122,457, Reim i in., patent USA Nr 4,952,496, Studier i in., jak również praca przeglądowa Studier i in., Meth. Enzymol., 185:60-89 (1990)).
Polipeptyd aktywujący według wynalazku może również obejmować inne białka wiązące DNA, niezbędne do aktywacji transkrypcji swoistych promotorów (np. polimerazę RNA faga T3). Dodatkowo, domena wiążąca jednego białka może być poddana fuzji z domeną aktywującą transkrypcję innego białka. Przykładem takiego białka chimerycznego jest aktywator transkrypcyjny te/ńWPló, opisany przez Gossen i in., Trends in Biotech., 12:58-62 (1994). Inne przykłady chimerycznych aktywatorów transkrypcji obejmują aktywator transkrypcyjny Lex A (domena wiąząca)/Ga!4, opisany przez Brent i Ptashne, Celi, 43;729-736 (1985) oraz Gal4/VP16 (Carey i in., J. Mol. Biol., 209:423-432, 1989; Cress i in., Science, 251:87-90, 1991; Sadowski i in., Naturę, 335:563-564, 1988).
W niniejszym wynalazku mogą być również wykorzystane aktywatory translacyjne. Szczególnie użyteczne są sekwencje liderowe i ich swoiste aktywatory translacyjne, kierujące silną ekspresją genów wirusowych. Jednym z przykładów jest aktywator transłacyjny wirusa mozaiki kalafiora (TAV), jak opisany przez Futterer i Hohn, EMBO J., 10:3887-3896 (1991). W tym układzie, gen pms może być skonstruowany tak, by kodował informację dicistronową w której np. pierwszy cistron może być genem markera selekcyjnego, zaś drugi cistron może być śmiercionośnym genem plastydowym, przy czym oba ulegają transkrypcji jako jeden mRNA spod tego samego promotora. Translacja mRNA markera selekcyjnego zachodzi bez
185 710 dodatku innych składników; jednakże, śmiercionośny dla piastydu mRNA nie będzie ulegał translacji o ile nie będzie obecny TAV.
C. Geny przywracające płodność męską do metody „niszczenia pyłku”.
Produkt genu rmf może zapobiegać działaniu genu nms w każdym z kilku punktów, obejmujących, ale nie wyłącznie: (1) wplastydach na gen pms np. przez zakłócanie transkrypcji albo translacji toksycznego dla plastydu genupms albo przez derepresję niezbędnego genu pms, który został inaktywowany przez represor kodowany przez nms', (2) w plastydach ale nie koniecznie na gen pms, przez zakłócanie albo niszczenie dojrzałego polipeptydu regulatorowego; (3) w cytoplazmie przez zakłócanie albo niszczenie prekursora polipeptydu regulatorowego zanim ulegnie translokacji do chloroplastów; i (4) w cytoplazmie albo jądrze przez zakłócanie ekspresji genu nms (np. jako represor transkrypcyjny albo translacyjny).
Geny rmf według wynalazku, obejmują przynajmniej region kodujący produkt genu przywracającego, połączony operacyjnie z odpowiednimi sekwencjami regulatorowymi 5' i 3' w celu ekspresji z genomu jądrowego. Sekwencje regulatorowe, niezbędne do włączenia do genu rmf zależą od punktu działania polipeptydu regulatorowego, w którym produkt genowy rmf ma działać, jak to opisano wyżej.
Swoistość dla pylników produktu genowego rmf nie jest absolutnie konieczna do wykonywania niniejszego wynalazku; gen rmf mógłby ulegać ekspresji winnych tkankach, o ile ulega również ekspresji w tkankach pylników, w których również ulega ekspresji gen nms. Jednakże, swoistość dla pylników jest korzystna w wykonywaniu niniejszego wynalazku, o ile uogólniona ekspresja genu rmf może wywołać efekt toksyczny, który jest często obserwowany w odniesieniu do ekspresji obcych genów w komórkach gospodarza. Ponadto, włączenie silnego promotora swoistego dla pylników do genu rmf korzystnie tego samego albo podobnego do zastosowanego w genie nms, zapewni silną ekspresję genu rmf i wytwarzanie produktu genowego rmf w tym samym położeniu, w którym ulega ekspresji gen nms. Nawiązując, gen rmf według wynalazku, obejmuje region kodujący polipeptyd przywracający, połączony operacyjnie z promotorem swoistym dla pylników, jak opisane wyżej dla genu nms.
Gen rmf może również obejmować inne sygnały regulatorowe. Przykładowo, do konstruktu mogą być włączone roślinne jądrowe translacyjne sekwencje zgodności, jak również odpowiednie sygnały zakończenia transkrypcji i translacji roślinnych genów jądrowych.
Jeżeli produkt genu rm/jest polipeptydem przywracającym przeznaczonym dla plastydowego przedziału zrębowego, region kodujący genu rmf musi być połączony z sekwencją DNA kodującą plastydowy peptyd tranzytowy, jak peptyd tranzytowy pre-SS opisany w odniesieniu do genu nms. Sekwencje DNA kodujące inne peptydy tranzytowe do translokacji białek do zrębu plastydu są również znane i mogąbyć wykorzystane w wykonywaniu tego aspektu wynalazku.
W korzystnym wykonaniu metody „niszczenia pyłku”, gen rmf koduje ukierunkowany na plastyd polipeptyd, który wnika do plastydu i zakłóca czynność polipeptydu regulatorowego, kodowanego przez nms, przez wywieranie przeciwstawnego działania hamującego gen pms. Sposób ten jest przedstawiony na przykładzie genu rmf który koduje ukierunkowany na plastyd polipeptyd represorowy lac. Gen pms obejmuje miejsce wiążące represora lac tak położone w stosunku do możliwej do aktywacji docelowej sekwencji nukleotydowej i regionu kodującego pms, że związanie represora lac hamuje transkrypcję genu pms, mimo obecności kodowanego przez nms polipeptydu aktywującego (np. polimerazy RNA T7).
Jak opisano powyżej, znane są liczne układy represorów transkrypcyjnych i translacyjnych. Te inne białka represorowe mogąbyć również wykorzystane jako kodowany przez rmf polipeptyd przywracający. Dodatkowo, mogąbyć również wykorzystane białka chimeryczne, obejmujące domeny wiązące DNA z jednego polipeptydu z domenami represorowymi z innego polipeptydu, jak to opisano dla polipeptydów aktywujących.
W innych wykonaniach wykorzystujących ukierunkowany na plastyd polipeptyd przywracający, polipeptyd przywracający może być białkiem zdolnym do swoistego wiązania z polipeptydem regulatorowym, zapobiegającym w ten sposób jego działaniu na gen pms, jak np. ukierunkowane na plastyd immunoglobuliny albo ich fragmenty, albo inne swoiste ligan
185 710 dy związane ze znanymi układami represorów aktywatorów (np. enzym powodujący powstanie małej cząsteczki induktora, który wiąże się z represorem i czyni go nieaktywnym).
W alternatywnym wykonaniu, możliwym do zastosowania zarówno w metodzie „niszczenia pyłku” jak i „głodzenia pyłku”, gen rmf koduje polipeptyd cytoplazmatyczny zapobiegający wnikaniu do plastydu prekursora kodowanego przez nms regulatora polipeptydowego. Białka, które można zastosować w tym wykonaniu obejmują, choć nie są ograniczone do immunoglobulin i ich fragmentów, swoistych dla prekursora polipeptydu regulatorowego oraz proteaz albo innych enzymów modyfikujących białka zdolnych do swoistego działania na prekursor polipeptydu regulatorowego i czyniących go niezdolnym do przejścia przez błonę plastydu, albo terminatorów translacji, zapobiegających translacji mRNA kodowanego przez nms.
W innym wykonaniu, gen rmf koduje polipeptyd ukierunkowany na jądro, taki jak represor transkrypcyjny albo translacyjny, zdolny do wejścia do jądra i zapobieżenia ekspresji genu nms. Do tego wykonania wynalazku gen nms powinien zawierać miejsce wiążące represor dla represora kodowanego przez rmf. W odniesieniu do tego wykonania, należy zaznaczyć, że jądra eukariotyczne, włączywszy jądra roślin, zawierają zestaw białek, które są syntetyzowane wcytoplazmie i ulegają translokacji do jądra dzięki działaniu aminokwasowych sekwencji sygnałowych zawartych w tych białkach. Takie sygnały położenia do ukierunkowywania białek do jądra są dobrze znane (patrz, np. Hall i in.. Celi, 36:1057-1065 (1984), opisujące kierowanie bakteryjnej β-galaktozydazy do jądra drożdży dzięki sekwencji ukierunkowującej z genu drożdży MAT alfa 2).
H. Metoda „głodzenia pyłku”.
W innym wykonaniu, określanym jako metoda „głodzenia pyłku”, gen pms jest homologiem natywnego genu plastydowego, niezbędnego do życia plastydu, który jest aktywny, ale został zmodyfikowany w sposób umożliwiający jego inaktywację (tzn. możliwy do represji). Natywny gen piasty do wy jest zastępowany zmodyfikowanym genem pms drogą rekombinacji homologicznej, w taki sposób, że rośliny o trwale stransformowanym piastydzie zawierają wyłącznie zmodyfikowaną postać genu. Gen nms w tym wykonaniu jest genem swoistym dla pylników, kodującym ukierunkowany na plastyd inaktywator polipeptydowy, zdolny do wniknięcia do plastydu i zablokowania ekspresji niezbędnego genu pms, uszkadzając albo niszcząc plastyd wybranej tkanki pylnika. Gen rw/rodzica B koduje „przywracający” produkt genowy, zdolny do zakłócania działania inaktywatora polipeptydowego, umożliwiając w ten sposób niezbędnemu genowi pms pozostanie aktywnym. W korzystnym wykonaniu, gen rmf koduje skierowany jądrowo polipeptyd, zdolny do wnikania do jądra i zakłócania ekspresji genu nms. W innym wykonaniu, gen rmf koduje cytoplazmatyczny produkt genowy zakłócający translację mRNA kodującego inaktywator polipeptydowy albo translokację prekursora do plastydów.
Sposób „głodzenia pyłku” przedstawiono na przykładzie układu wykorzystującego ukierunkowany na plastyd represor lac, jako polipeptyd inaktywujący, ukierunkowany na jądro represor tet, jako produkt genowy rmf oraz niezbędny gen plastydowy połączony operacyjnie z sekwencjami regulatorowymi 5' i 3', niezbędnymi do jego ekspresji wplastydach, pod kontrolą przynajmniej jednego miejsca wiążącego represor lac.
W tym wykonaniu, w rodzicielskiej linii A74 ekspresji ulega ukierunkowany na plastyd polipeptyd represora lac, linia rodzicielska Ap zawiera aktywny, modyfikowany gen pms w plastydach zaś potomstwo ANxAp jest cytoplazmatycznie męsko niepłodne z powodu wiązania represora lac z miejscem wiązącym represor lac, co zapobiega ekspresji niezbędnego genu pms. Do wytwarzania męsko płodnych hybryd, rodzic Abjest krzyżowany zB, w którym ulega ekspresji produkt genowy rmf, ukierunkowany na jądro represor tet.
Układ represora tet powinien być szczególnie użyteczny u roślin, jak to juz wykazano na transgenicznym tytoniu, ze represor tetracyklinowy może powodować represję transkrypcji z promotora wirusa mozaiki kalafiora, zawierającego trzy miejsca wiążące represor tet w pobliżu promotora TATA-box. Represja była gwałtownie odwracana przez tetracyklinę dając czynnik regulacji rzędu kilkuset (Gatz i in.. Plant J., 2:397-404, 1992; Gatz i Quail, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:1394-1397, 1988).
185 710
Represor tetracyklinowy opisany powyżej może być również zastosowany jako produkt genowy nms w metodzie „głodzenia pyłku” według wynalazku. W tym wykonaniu polipeptyd inaktywujący zawiera ukierunkowany na plastyd represor tet. Gen pms zawiera przynajmniej jedno miejsce wiążące represor tet, tak położone względem wewnątrzpochodnych plastydowych regionów regulatorowych 5' i 3', że związanie represora tet powoduje zablokowanie ekspresji genu pms. Jak to opisano wyżej, płodność męska jest przywracana u hybryd przez transformowanie linii rodzicielskiej B genem rmf, kodującym inny ukierunkowany na jądro represor, taki jak represor lac albo inny represor tet. Należy zaznaczyć, że represor ukierunkowany na plastyd oraz represor ukierunkowany na jądro, może być wybrany z dwóch różnych rodzin represorów, jak to opisano wyżej (represor lac ukierunkowany na plastyd i represor tet ukierunkowany na jądra, albo odwrotnie). Sposób ten może być również przeprowadzony z zastosowaniem tego samego represora, poddanego fuzji translacyjnej z sekwencją kierującą do plastydu albo sekwencją kierującą do jądra. Jednakże, zastosowanie dwóch różnych represorów jest korzystne.
A. Plastydowe geny niepłodności męskiej do metody „głodzenia pyłku”.
W metodzie „głodzenia pyłku” według wynalazku, niezbędny gen plastydowy zastępowany jest genem homologicznym, który został zmodyfikowany w sposób umożliwiający jego inaktywację. Zmodyfikowany gen jest trwale integrowany do genomu plastydowego przez rekombinację homologiczną jak to opisano wyżej. Użyteczne niezbędne geny plastydowe obejmują: operon rybosomalnego RNA, gen rybosomalnego białka rps\6, gen trn\l i gen rpoB. Ponieważ w tym przypadku gen pms wprowadzany jest do plastydu w swej aktywnej postaci, gen pms musi zawierać również naturalne promotory plastydowe i inne sekwencje regulatorowe niezbędne do ekspresji genupms w plastydach.
W korzystnym wykonaniu, gen pms obejmuje miejsce wiążące represor lac, jak to opisano wyżej. Miejsce wiążące represor położone jest w taki sposób w stosunku do naturalnych plastydowych sekwencji promotora kontrolujących transkrypcję genu pms, ze związanie represora lac hamuje transkrypcję niezbędnego genu, powodując w ten sposób uszkodzenie plastydu albo śmierć. Płodność może być przywrócona dzięki mechanizmowi zakłócającemu syntezę ukierunkowanego na plastyd dezaktywatora polipeptydowego w jądrze albo cytoplazmie. Inne miejsca wiążące represor użyteczne w tym wykonaniu obejmują ale nie wyłącznie, miejsce wiążące represor tet, miejsce wiążące LexA (Brent i Ptashne, Celi, 43729-736, 1985) i miejsce wiążące Gal4.
B. Jądrowe geny niepłodności męskiej do metody „głodzenia pyłku”.
W metodzie „głodzenia pyłku” gen nms koduje ukierunkowany na plastyd „inaktywator” polipeptydowy, który zapobiega ekspresji niezbędnego genu pms wplastydzie. Inaktywator polipeptydowy może zawierać represor transkrypcyjny albo translacyjny, których liczne przykłady są znane. W korzystnym wykonanią białko represora lac kodowane jest przez gen nms. Białko wchodzi do chloroplastów i wiąże się z miejscem wiążącym represor lac, połączonym z genempms w taki sposób, że wiązanie białka represora z miejscem wiążącym hamuje transkrypcję genu pms, powodując śmierć plastydu.
Inne białka represorów transkrypcyjnych użyteczne w wykonywaniu niniejszego wynalazku obejmują choć nie są ograniczone do represora tet opisanego powyżej. Mogą być również wykorzystane białka chimeryczne, obejmujące domeny wiążące DNA z jednego polipeptydu z domenami represorowymi z innego polipeptydu, jak to opisano dla polipeptydów aktywujących.
C. Geny przywracające płodność męską do metody „głodzenia pyłku”.
Jak to opisano wyżej, produkt genowy rmf może zapobiec działaniu genu nms w każdym z kilku punktów pomiędzy ekspresją genu nms a działaniem polipeptydu kodowanego przez nms na gen pms. Geny przywracające płodność męską według niniejszego wynalazku obejmują przynajmniej jeden region kodujący produkt genu przywracającego, połączony operacyjnie z sekwencjami regulatorowymi 5' i 3' dla ekspresji z genomu jądrowego. Sekwencje regulatorowe niezbędne do włączenia do genu rmf zależą od punktu działania polipeptydu regulatorowego, w którym produkt genowy rmf ma zakłócać, jak to opisano wyżej.
185 710
Jak wspomniano wcześniej, swoistość dla pylników produktu genowego rmf nie jest absolutnie konieczna, ale jest korzystna w wykonaniu wynalazku. Gen rmf zawiera region kodujący polipeptyd przywracający, połączony operacyjnie z promotorem swoistym dla pylników, tak jak w opisanym powyżej genie nms.
Gen rmf może również obejmować inne sygnały regulatorowe. Przykładowo, do konstruktu mogą być włączone roślinne jądrowe translacyjne sekwencje zgodności, jak również odpowiednie sygnały zakończenia transkrypcji i translacji roślinnych genów jądrowych.
W szczególnie korzystnym wykonaniu metody „głodzenia pyłku”, gen rm/koduje polipeptyd ukierunkowany na jądro, taki jak np. represor transkrypcyjny, zdolny do wniknięcia do jądra i zapobieżenia ekspresji genu nms. Do tego wykonania wynalazku, gen nms powinien zawierać miejsce wiążące represor dla represora kodowanego przez rmf. W odniesieniu do tego wykonania, należy zaznaczyć, że jądra eukariotyczne, włączywszy jądra roślin, zawierają zestaw białek, które są syntetyzowane w cytoplazmie i ulegają translokacji do jądra dzięki działaniu aminokwasowych sekwencji sygnałowych zawartych w tych białkach. Takie sygnały położenia do ukierunkowywania białek do jądra są dobrze znane (patrz, np. Hall i in.. Celi, 36:1057-1065 (1984), opisujące kierowanie bakteryjnej β-galaktozydazy do jądra drożdży dzięki sekwencji ukierunkowującej z genu drożdży MAT alfa 2).
W alternatywnym wykonaniu, gen rmf koduje polipeptyd cytoplazmatyczny zapobiegający przed wnikaniem do plastydu prekursora kodowanego przez nms regulatora polipeptydowego. Białka, które można zastosować w tym wykonaniu obejmują choć nie są do nich ograniczone, immunoglobuliny i ich fragmenty, swoiste dla prekursora polipeptydu regulatorowego oraz proteazy albo inne enzymy modyfikujące białka, zdolne do swoistego działania na prekursor polipeptydu regulatorowego i czyniące go niezdolnym do przejścia przez błonę plastydu, albo terminatory translacji, zapobiegające translacji mRNA kodowanego przez nms.
W wykonaniu polegającym na zakłócaniu ekspresji genu nms, powinno być zrozumiale dla specjalistów w tej dziedzinie wiedzy, ze geny rmf mogą kodować cząsteczkę RNA zdolną do zapobiegania transkrypcji albo translacji genu albo mRNA nms. Takie cząsteczki mRNA mogą być oligonukleotydami antysensownymi wiązącymi się swoiście z kluczowymi regionami genu lub mRNA nms. Alternatywnie, cząsteczka mRNA może być rybozymem zdolnym do wiązania z wybranym miejscem na mRNA kodowanym przez nms, tnącym cząsteczkę mRNA i zapobiegającym jej translacji.
Układ wytwarzania transgenicznych nasion CMS według wynalazku jest podobny w budowie do występujących naturalnie i standardowych schematów opartych na CMS. Jednakże, układy według wynalazku stanowią znaczne ulepszenie w stosunku do tamtych układów, ponieważ są zbudowane z elementów w pełni określonych na poziomie sekwencji DNA i zamiast mitochondriów wykorzystują plastydy jako podstawę cytoplazmatycznej niepłodności męskiej. W przeciwieństwie do mitochondriów i genomu mitochondrialnego, genom plastydowy jest dobrze scharakteryzowany, zaś metody manipulacji genetycznych na plastydach są lepiej rozwinięte niż odnoszące się do mitochondriów. W wyniku tego, układ CMS oparty na plastydzie jest zasadniczo wolny od nieprzewidywalnych niekorzystnych efektów związanych z układami CMS opartymi na mitochondriach i jest możliwy do wdrożenia w każdej uprawie podatnej na technologię transformacji jądrowej i plastydowej. Ponieważ technologia ta rozwija się obejmując nowe gatunki uprawne, nowe sposoby CMS według wynalazku mogą być zastosowane do tych upraw. Tak więc, układy według wynalazku czynią produkcję nasion hybrydowych bardziej opłacalną i umożliwiają opracowanie hybryd upraw, dla których obecnie nie jest dostępna produkcja nasion hybrydowych. Uprawy takie obejmują główne gospodarcze uprawy Stanów Zjednoczonych, włączywszy jęczmień i bawełnę.
Poniższe przykłady przedstawiono w celu bardziej szczegółowego opisu wynalazku. Przykłady te mają na celu zilustrowanie a nie ograniczenie zakresu wynalazku.
PRZYKŁAD 1
Uzyskiwanie plastydowej niepłodności męskiej metoda niszczenia pyłku:
Plastydowe geny niepłodności męskiej Kprns
Metodę „niszczenia pyłku” według wynalazku pokazano schematycznie na fig. 1. W korzystnym wykonaniu metody „niszczenia pyłku”, plastydowy gen „niszczący” (Kpms) ulega
185 710 ekspresji spod regulowanego promotora TIHac zawierającego promotor genu 10 faga T7 oraz operator lac\, tak, że transkrypcja może być zablokowana przez represor lac (Studier i in., 1990, wyżej; Dubendorf i Studier, 1991, wyżej). Sekwencje promotora pokazane na fig. 3, są zmodyfikowane z plazmidu ekspresyjnego pET21d (Novagen). W odniesieniu do fig. 3, Ptlacl posiada nie ulegającą translacji sekwencję wiodącą genu 10, włączywszy miejsce wiązania rybosomu (RBS). PTlac2 posiada sekwencję wiodącą oraz RBS plastydowego genu rbcL. Dwa promotory ulegają transkrypcji z porównywalną efektywnością. Jednakże, mRNA z sekwencją wiodącą genu 10 ulegają translacji -2000 razy wydajniej niz zawierające lider rbcL. Względnie niski poziom translacji jest korzystny w sposobie „niszczenia pyłku”, ponieważ zapobiega śmiercionośnej akumulacji toksycznego produktu genowego, z transkrypcji pochodzącej z promotorów zewnętrznych. Takie rzadkie transkrypty, jeżeli ulegają wydajnej translacji, mogłyby wywierać efekty niepożądane w tkankach innych niż docelowe.
W celu stabilizacji mRNA, region kodujący genu Kpms ligowano ze zmodyfikowanym terminatorem genu 10 T7 (TT7) albo terminatorem Trpsl6T7, zawierającym sekwencję „trailer” 3' genu plastydowego białka rybosomalnego rpsló i terminator genu 10 T7 w ustawieniu tandemowym (fig. 3).
Toksyczne geny odpowiednie do niszczenia funkcji plastydu wymieniono w „Szczegółowym opisie wynalazku” powyżej. W celu dogodnej ekspresji w kasetach, geny Ypms powinny zawierać: (i) miejsce restrykcyjne Ncol, obejmujące kodon inicjujący translację (ATG) oraz (ii) miejsce Xbal bezpośrednio poniżej regionu kodującego. Jednakże mogąbyć również zastosowane inne znane strategie klonowania.
W celu zminimalizowania możliwości generowania transkryptów spod promotorów zewnętrznych, integracja genów Yfims powinna odbyć się w regionie niemym transkrypcyjnie genomu plastydowego. Najodpowiedniejsze miejsce znajduje się pomiędzy genami trnN i ORF70B, kierującym transkrypcję genu niszczącego w kierunku operonu rpsl2/7, jak to pokazano schematycznie na fig. 4, dla wektora insercyjnego oznaczonego „pC8”. Transformacja i selekcja transformantów plastydowych przeprowadzana jest według protokołów standardowych (Svab i Maliga, 1993, wyżej).
PRZYKŁAD 2
Wywoływanie plastydowej niepłodności męskiej metoda niszczenia pyłku:
Jądrowe geny niepłodności męskiej Ycnms
Uzyskiwanie plastydowej niepłodności męskiej metodą „niszczenia pyłku” opiera się na transkrypcji plastydowego genu Ypms w komórkach tapetum. Powodzenie strategii zależy od: (i) czasowej zależności rozwojowej i swoistości tkankowej ekspresji genu Ymms kodującego polimerazę RNA T7 oraz (ii) ukierunkowania kodowanego polipeptydu na plastydy.
Czasowa zależność rozwojowa genu Yarns osiągana jest przez wykorzystanie promotorów swoistych dla tapetum i mikrospor. Odpowiedni dla tego celu jest promotor TA29, ulegający czasowej transkrypcji podczas wczesnego rozwoju pylnika. Promotor TA29 wykorzystano do uzyskania swoistej dla tapetum ekspresji genu i następnie niepłodności męskiej przez ekspresję chimerycznej rybonukleazy (Marini i in., 1990, wyżej). Dodatkowe scharakteryzowane promotory swoiste dla pylników odpowiednie do ekspresji jądrowego genu nms są dostępne z kilku źródeł (patrz, prasa przeglądowa: Goldberg i in.. Plant Celi, 5:1217-1229,1993).
W odniesieniu do fig. 5, region kodujący polimerazę RNA T7 w genie Yatms poddany jest fuzji translacyjnej z peptydem tranzytowym kodowanego jądrowo białka chloroplastu, podjednostki mniejszej RuBisCo (SSU). Gdy gen Ynms ulega ekspresji w jądrze, peptyd tranzytowy kieruje białko do plastydu. Po importowaniu do plastydu, peptyd tranzytowy jest odcinany od pre-białka T7 (preT7RNAP) dając polimerazę RNA T7 (T7RNAP) bez dodatkowych aminokwasów. Sekwencja DNA kodująca peptyd tranzytowy SSU oraz połączenie białka fuzyjnego T7 pokazano na fig. 5 (u góry). preT7aRNAP w drugim genie (fig. 5 sekwencja na dole) ulega obróbce do T7aRNAP w plastydach. T7aRNAP zawiera pięć aminokwasów dojrzałej SSU. Białka kodowane przez oba geny mogą różnić się w odniesieniu do efektywności ich importowania, i mogą być zastosowane do uzyskania roślin transgenicznych akumulujących polimerazę RNA T7 na różnych poziomach.
185 710
Rośliny, w których ulega ekspresji polimeraza RNA T7, nie posiadają szczególnego fenotypu. W celu ułatwienia odróżniania roślin niosących Knms, gen połączono z selekcyjnym genem oporności na kanamycynę, w binarnym wektorze Agrobacterium (przykładowo, wektor plazmidowy pBI121; Clonetech). Alternatywnie, plazmidy niosące geny Knms mieszane są z plazmidami niosącymi selekcyjny gen oporności na kanamycynę: przykładowo, plazmidem pLGVneo!103 (Czemylowski i in., DNA, 5:101-103, 1986) albo plazmidem pFF19K (Timmermans i in., 1990), wyżej). Aby uzyskać równoczesną integrację obu genów w tym samym locus stosowana jest transformacja balistyczna mieszanym DNA, a następnie selekcja pod kątem oporności na kanamycynę. Współsegregacja genów oporności na kanamycynę i polimerazy T7 potwierdza, że oba geny zostały integrowane w tym samym locus.
PRZYKŁAD 3
Uzyskiwanie plastydowej niepłodności męskiej metodą niszczenia pyłku:
Jądrowe geny przywracające płodność męską Krmf
Plastydowa niepłodność męska jest fenotypem roślin niosących zarówno gen plastydowy Kpms jak i jądrowy Knms. Przywrócenie płodności męskiej zależy od obecności drugiego genu jądrowego, Krmf genu przywracającego płodność korzystnie zastosowanego w plastydowej niepłodności męskiej typu „niszczenia pyłku”. Krmf wywiera swój wpływ przez blokowanie ekspresji plastydowego genu Kpms (fig. 1). Regulacja ta zachodzi przez region promotorowy genu Kpms.
Promotory PT71acl i pT71ac2, pokazane na fig. 3, mogą ulegać regulacji: (i) pozytywnej, przez polimerazę RNA T7 ukierunkowaną na plastyd (powyżej) i (ii) negatywnej, przez represor lac. Przywrócenie płodności męskiej zależy od obecności represora lac w plastydach, w odpowiednim stężeniu, blokującym aktywność produktu genowego Knms.
Ekspresja genu Krmf przed i podczas ekspresji jądrowego genu niepłodności męskiej, Knw?5, jest istotna dla pełnego przywrócenia płodności męskiej. Najprostszą i najefektywniejszą drogą do uzyskania tego jest wywołanie ekspresji kodowanego przez lac białka represora spod promotora konstytutywnego, jak np. promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora zawierającego kasetę swoistą dla pylników w konstrukcie pTS24 (van der Meer i in., Plant Celi, 4:253262, 1992). Alternatywnie, transkrypcja może być kierowana przez promotor genu swoistego dla pylników, aktywowanego przed ekspresją genu Knms. Scharakteryzowane, swoiste dla pylników promotory, odpowiednie do napędzania ekspresji jądrowego genu przywracającego dostępne są z kilku źródeł jak to opisano wGoldberg i in., 1993, wyżej. Dodatkowo, przywrócenie płodności męskiej było również możliwe przy zastosowaniu tych samych (TA29) promotorów do ekspresji transgenu wywołującego niepłodność jak itransgenu przywracającego płodność (Mariani i in., 1992).
W celu ukierunkowania represora lac na plastydy, poddaje się go fuzji z peptydem tranzytowym podjednostki mniejszej RuBisCo. Konstrukcja genu oraz sekwencja DNA i białka kluczowego peptydu tranzytowego oraz regionu kodującego lacl, pokazane są na fig. 6, oraz omówione dla genu Knms powyżej. Należy zaznaczyć, że schemat na fig. 6 pokazuje ekspresję spod konstytutywnego promotora nie swoistego tkankowo, P35S (Timmerman i in., 1990, wyżej). Jednakże, do ekspresji swoistej dla pylników powinna być zastosowana pochodna zawierająca kasetę swoistą dla pylników (np. PTS24, van den Meer i in., 1992, wyżej).
Wprowadzony do genomu jądrowego, gen Knms jest połączony z selekcyjnym markerem oporności na gentamycynę, kodowanym przez chimeryczny gen aacCl (Carrer iin.. Plant. Mol. BioL, 17:301-303,' 1991). Sposoby transformowania są identyczne z opisanymi dla genu Knms. Gen oporności na gentamycynę połączony z genem Krmf jest łatwy do odróżnienia od genu oporności na kanamycynę, połączonego z Knms i z genem oporności na spektynomycynę połączonym z plastydowym genem Kpms.
PRZYKŁAD 4
Uzyskiwanie plastydowej niepłodności męskiej metodą głodzenia pyłku:
Plastydowe geny niepłodności męskiej Spms
Z powodu wymogu całości organelli do utrzymania biosyntezy aminokwasów i lipidów, wyeliminowanie syntezy białek w plastydach prowadzi do śmierci komórkowej. Stąd, żabio
185 710 kowanie ekspresji genów niezbędnych do utrzymania plastydu może być również zastosowane do ablacji komórek tapetum i mikrospor.
Plastydowe geny niepłodności męskiej w metodzie „głodzenia pyłku” (Spms) są endogennymi genami piasty do wymi ulegającymi ekspresji spod chimerycznych promotorów piasty dowych z wbudowanym miejscem wiążącym represor lac. Promotory te w komórkach somatycznych ulegają transkrypcji pod wpływem plastydowej polimerazy RNA. Jednakże, ekspresja genów piasty do wych w komórkach tapetum zatrzymywana jest przez represor lac, który zaprojektowano tak, by ulegał ekspresji wyłącznie w tapetum, mikrosporach i innych komórkach pylnika. W sposobie „głodzenia pyłku” najkorzystniejszym celem do represji jest operon rRNA. Zmodyfikowane promotory operonu rRNA i promotor genu trnN z sekwencją operatora lac pokazane są na fig. 7. Promotory te są zastosowane w celu zastąpienia naturalnych endogennych promotorów genów drogą rekombinacji heterologicznej. Pochodne promotora operonu rRNA, zmodyfikowane do ekspresji białek, pokazano na fig. 8. Dwa promotory różnią się w odniesieniu do ich sekwencji liderowych (miejsc wiążących rybosom). Spośród tych dwóch, mRNA z sekwencją liderową genu 10 prawdopodobnie ulegają wydajniejszej translacji.
Endogenne promotory genu zastąpiono promotorami Spms przez połączenie z selekcyjnym genem oporności na spektynomycynę (naJA) (Maliga i in., 1993). Geny Spms ulegają transkrypcji dzięki plastydowej polimerazie RNA we wszystkich tkankach z wyjątkiem komórek tapetum, w których ukierunkowany na plastyd represor lac wytwarzany jest z genu Spms. Ukierunkowany na plastyd represor lac blokuje transkrypcję spod promotorów Spms, powodując w ten sposób śmierć komórki.
PRZYKŁAD 5
Uzyskiwanie plastydowej niepłodności męskiej metodą głodzenia pyłku:
Jądrowe geny niepłodności męskiej Snms
Jak opisano w przykładzie 4, pyłkowa niepłodność męska w sposobie „głodzenia pyłku” osiągana jest przez zablokowanie transkrypcji endogennych genów plastydowych. Brak transkrypcji jest spowodowany akumulacją represora lac wplastydach i jego wiązaniem się z sekwencjami operatora lac w promotorze chimerycznym genu Spms. Tkankowo swoista ekspresja represora lac uzyskiwana jest dzięki promotorom swoistym dla pylnika, jak to opisano dla genu ¥jvns (przykład 2). Jednakże, promotor Snms jest wrażliwy na represor tetracyklinowy (tet) tak, że ekspresja genu Snms może być uniemożliwiona przez gen Srm/kodujący ukierunkowany na jądro represor tet (patrz, przykład 6). Geny Snms są połączone genetycznie z markerami oporności na kanamycynę, jak to opisano dla genu Knms (przykład 2).
PRZYKŁAD 6
Uzyskiwanie plastydowej niepłodności męskiej metodą głodzenia pyłku:
Jądrowe geny niepłodności męskiej Srmf
Przywrócenie płodności męskiej wymaga przywrócenia normalnej czynności genu Spms w plastydach komórek tapetum. Może to być osiągnięte najlepiej przez zablokowanie ekspresji jądrowego genu Snms. Gen Snms ulega ekspresji spod promotora swoistego dla pylnika, który zawiera również kopie palindromicznego operatora tet wielkości 19 bp. Gen przywracający płodność w tym układzie, Srmf, koduje represor tet, który jest ukierunkowany na jądro i 500-krotnie hamuje ekspresję genu Snms. Układ taki opisano w Gatz i in.. Plant J., 2:397-404 (1992). Gen Srmf połączony jest z genem oporności na gentamycynę tak, że jest łatwy do odróżnienia od roślin niosących gen Spms (połączony z opornością na spektynomycynę) i gen Snms (połączony z opornością na kanamycynę).
Claims (49)
1. Sposób wytwarzania cytoplazmatycznie męsko niepłodnych roślin, znamienny tym, że obejmuje:
a) dostarczenie odpowiedniej rodzicielskiej linii roślinnej;
b) wytwarzanie rośliny rodzicielskiej transgenicznej plastydowo z wymienionej linii roślinnej przez trwałe transformowanie plastydu w komórkach rodzicielskiej linii roślinnej plastydówym genem niepłodności męskiej i regenerację z nich rośliny o transgenicznym plastydzie, przy czym plastydowy gen niepłodności męskiej może być regulowany przez kodowany jądrowo, ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy, a regulacja w tkance pylników powoduje przerwanie tworzenia żywotnego pyłku;
c) wytwarzanie transgenicznych jądrowo roślin rodzicielskich z rodzicielskiej linii roślinnej przez trwałe transformowanie jąder komórkowych rodzicielskiej linii roślinnej jądrowym genem niepłodności męskiej i regenerację z nich transgenicznych jądrowo roślin, przy czym jądrowy gen niepłodności męskiej obejmuje swoiste dla pylników nukleotydowe sekwencje regulatorowe 5' połączone operacyjnie z sekwencją nukleotydową kodującą ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy zdolny do wnikania do plastydu i regulowania piasty do wego genu niepłodności męskiej; i
d) przenoszenie pyłku pomiędzy rośliną transgeniczną plastydowo a rośliną transgeniczną jądrowo w celu wytworzenia rośliny, w której ukierunkowany na plastyd regulator polipeptydowy jest wytwarzany w sposób swoisty dla pylników, wnika do transformowanych plastydów komórek pylnika i reguluje plastydowy gen niepłodności męskiej, przy czym regulacja powoduje przerwanie tworzenia żywotnego pyłku, co prowadzi do uzyskania cytoplazmatycznie męsko niepłodnych roślin.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że swoista dla pylników regulatorowa sekwencja nukleotydowa 5' jest wybrana z grupy składającej się z promotorów swoistych dla tapetum i promotorów swoistych dla mikrosporów.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że:
a) plastydowy gen niepłodności męskiej zawiera docelową sekwencję nukleotydową do aktywacji ekspresji genu, połączoną operacyjnie z nukleotydową sekwencją kodującą produkt genowy zdolny do przerwania tworzenia żywotnego pyłku, gdy ulega ekspresji w piasty dach komórek pylnika; i
b) jądrowy gen niepłodności męskiej koduje ukierunkowany na plastyd aktywator polipeptydowy wnikający do plastydów i oddziaływujący swoiście z docelową sekwencją nukleotydową, zaś oddziaływanie powoduje ekspresję piasty do wego genu niepłodności męskiej.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, ze plastydowy gen niepłodności męskiej koduje RNA.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że RNA jest wybrane spośród grupy składającej się z RNA antysensownego i rybozymu.
6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że plastydowy gen niepłodności męskiej koduje polipeptyd.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że polipeptyd wybrany jest spośród grupy składającej się z DNAz, RNAz, proteaz, rekombinaz i polipeptydów tworzących pory w błonie.
8. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że ukierunkowany na plastyd aktywator polipeptydowy obejmuje aktywator transkrypcyjny zaś docelowa sekwencja nukleotydowa obejmuje region regulatorowy, z którym wiąże się aktywator transkrypcyjny.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, ze aktywator transkrypcyjny jest polimerazą.
185 710
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, ze polimeraza jest polimerazą RNA T7 zaś docelowa sekwencja nukleotydowa zawiera promotor T7.
11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że aktywator transkrypcyjny jest białkiem chimerycznym obejmującym domenę wiążącąDNA i domenę aktywatora.
12. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że ukierunkowany na plastyd aktywator polipeptydowy obejmuje aktywator translacyjny zaś docelowa sekwencja nukleotydowa obejmuje region regulatorowy, z którym wiąże się aktywator translacyjny.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że:
a) plastydowy gen niepłodności męskiej obejmuje docelową sekwencję nukleotydową do zapobiegania ekspresji genu, połączoną operacyjnie z niezbędnym genem plastydowym, przy czym plastydowy gen niepłodności męskiej jest genem ukierunkowanym na genom plastydowy, tak, że natywne formy niezbędnego genu plastydowego w plastydach transformowanych są zastąpione plastydowym genem niepłodności męskiej, zaś zapobieżenie ekspresji plastydowego genu niepłodności męskiej w plastydach pylnika jest zdolne do przerwania tworzenia żywotnego pyłku; i
b) jądrowy gen niepłodności męskiej koduje ukierunkowany na plastyd inaktywator polipeptydowy wnikający do plastydu i swoiście oddziaływujący z docelową sekwencją nukleotydową do zapobiegania ekspresji genu, zaś oddziaływanie zapobiega ekspresji plastydowego genu niepłodności męskiej.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że niezbędny gen plastydowy wybrany jest z grupy składającej się z operonu rybosomalnego RNA, genu białka rybosomalnego 16S, genu trnV i genu rpob.
15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że ukierunkowany na plastyd inaktywator polipeptydowy obejmuje represor transkrypcyjny, zaś docelowa sekwencja nukleotydowa obejmuje region regulatorowy, z którym wiąze się represor transkrypcyjny.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że represor transkrypcyjny jest represorem lac zaś docelowa sekwencja nukleotydowa obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiążące represor lac.
17. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że inaktywator polipeptydowy jest białkiem chimerycznym obejmującym domenę wiążącąDNA i domenę represorową.
18. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że ukierunkowany na plastyd inaktywator polipeptydowy obejmuje represor translacyjny, zaś docelowa sekwencja nukleotydowa obejmuje region regulatorowy, z którym wiąże się represor translacyjny.
19. Sposób wytwarzania męsko niepłodnych nasion hybrydowych z dwóch rodzicielskich linii roślinnych, z których jedna obejmuje rośliny cytoplazmatycznie męsko niepłodne, znamienny tym, że obejmuje:
a) wytwarzanie cytoplazmatycznie męsko niepłodnych roślin z pierwszej rodzicielskiej linii roślinnej przez:
i) wytwarzanie rośliny rodzicielskiej transgenicznej plastydowo z wymienionej rodzicielskiej linii roślinnej przez trwałą transformację plastydu w komórkach rodzicielskiej linii roślinnej plastydowym genem niepłodności męskiej i regenerację z nich rośliny o transgenicznym plastydzie, przy czym plastydowy gen niepłodności męskiej może być regulowany przez kodowany jądrowo, ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy, zaś regulacja w tkance pylników powoduje przerwanie tworzenia żywotnego pyłku;
ii) wytwarzanie transgenicznych jądrowo roślin rodzicielskich z rodzicielskiej linii roślinnej przez trwałe transformowanie jąder komórkowych rodzicielskiej linii roślinnej jądrowym genem niepłodności męskiej i regenerację z nich transgenicznych jądrowo roślin, przy czym jądrowy gen niepłodności męskiej obejmuje swoiste dla pylników sekwencje regulatorowe 5' połączone operacyjnie z sekwencją nukleotydową kodującą ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy zdolny do wnikania do plastydu i regulowania plastydowego genu niepłodności męskiej; i iii) przenoszenie pyłku pomiędzy rośliną transgeniczną plastydowo a rośliną transgeniczną jądrowo w celu wytworzenia rośliny, w której ukierunkowany na plastyd regulator polipeptydowy jest wytwarzany w sposób swoisty dla pylników, wnika do transformowanych
185 710 piasty dów komórek pylnika i reguluje piasty do wy gen niepłodności męskiej, zaś regulacja powoduje przerwanie tworzenia żywotnego pyłku, co prowadzi do uzyskania cytoplazmatycznie męsko niepłodnych roślin;
b) wytwarzanie roślin przywracających płodność drugiej rodzicielskiej linii roślinnej przez trwałe transformowanie jąder komórek drugiej rodzicielskiej linii roślinnej genem przywracającym płodność męską i regenerację z nich rośliny, przy czym gen przywracający płodność męską koduje produkt genu przywracającego zdolny do zapobiegania regulacji plastydowego genu niepłodności męskiej przez ukierunkowany na plastyd regulator polipeptydowy, umożliwiając tworzenie żywotnego pyłku; i
c) przenoszenie pyłku pomiędzy rośliną cytoplazmatycznie męsko niepłodną a roślinami przywracającymi płodność męską w celu wytwarzania męsko płodnych nasion hybrydowych z dwóch rodzicielskich linii roślinnych.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że:
a) plastydowy gen niepłodności męskiej obejmuje docelową sekwencję nukleotydową posiadającą miejsce do aktywacji ekspresji genu i miejsce do zapobiegania ekspresji genu, przy czym miejsce do zapobiegania ekspresji genu znajduje się w położeniu kontrolującym względem miejsca aktywującego ekspresję genu, zaś docelowa sekwencja nukleotydową jest połączona operacyjnie z sekwencją nukleotydową kodującą produkt genowy zdolny do przerywania tworzenia żywotnego pyłku, gdy ulega ekspresji w plastydach komórek pylnika;
b) jądrowy gen niepłodności męskiej koduje ukierunkowany na plastyd aktywator polipeptydowy, wnikający do plastydów i swoiście oddziaływujący z miejscem aktywującym ekspresję genu, które to oddziaływanie powoduje ekspresję plastydowego genu niepłodności męskiej; i
c) gen przywracający płodność męską koduje ukierunkowany na plastyd polipeptyd przywracający, wnikający do plastydów i swoiście oddziaływujący z miejscem do zapobiegania ekspresji genu, które to oddziaływanie zapobiega ekspresji plastydowego genu niepłodności męskiej.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że ukierunkowany na plastyd aktywator polipeptydowy obejmuje aktywator transkrypcyjny, zaś miejsce do aktywacji ekspresji genu obejmuje region regulatorowy, z którym wiąże się aktywator transkrypcyjny.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, ze aktywator transkrypcyjny jest polimeraząRNA T7, zaś miejsce do aktywacji ekspresji genu obejmuje promotor T7.
23. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że ukierunkowany na plastyd polipeptyd przywracający obejmuje represor transkrypcyjny, zaś miejsce zapobiegające ekspresji genu obejmuje region regulacyjny, z którym wiąze się represor transkrypcyjny.
24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że represor transkrypcyjny jest represorem lac, zaś miejsce do zapobiegania ekspresji genu obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiążące represor lac.
25. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, ze:
a) plastydowy gen niepłodności męskiej obejmuje pierwszą docelową sekwencję nukleotydową do zapobiegania ekspresji genu, połączoną operacyjnie z niezbędnym genem plastydowym, przy czym plastydowy gen niepłodności męskiej jest genem ukierunkowanym na genom plastydowy, tak, że natywne formy niezbędnego genu plastydowego w plastydach transformowanych są zastąpione piasty do wym genem niepłodności męskiej, zaś zapobieżenie ekspresji plastydowego genu niepłodności męskiej w plastydach pylnika jest zdolne do przerwania tworzenia żywotnego pyłku;
b) jądrowy gen niepłodności męskiej obejmuje drugą docelową sekwencję nukleotydową do zapobiegania ekspresji genu, połączoną operacyjnie z sekwencją nukleotydową kodującą ukierunkowany na plastyd inaktywator polipeptydowy wnikający do plastydu i swoiście oddziaływujący z pierwszą docelową sekwencją nukleotydową do zapobieżenia ekspresji genu, zaś oddziaływanie zapobiega ekspresji plastydowego genu niepłodności męskiej; i
c) gen przywracający płodność męską koduje ukierunkowany na jądro polipeptyd przywracający, wnikający do jądra i swoiście oddziaływujący z drugą docelową sekwencją
185 710 nukleotydową do zapobiegania ekspresji genu, które to oddziaływanie zapobiega ekspresji jądrowego genu niepłodności męskiej.
26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że ukierunkowany na plastyd inaktywator polipeptydowy obejmuje represor transkrypcyjny, zaś pierwsza docelowa sekwencja nukleotydową obejmuje region regulatorowy, z którym wiąże się represor transkrypcyjny.
27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że represor transkrypcyjny ukierunkowany na plastyd jest represorem lac, zaś pierwsza docelowa sekwencja nukleotydową obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiążące represor lac.
28. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że represor transkrypcyjny ukierunkowany na plastyd jest represorem tet, zaś pierwsza docelowa sekwencja nukleotydową obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiążące represor tet.
29. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, ze ukierunkowany na jądro polipeptyd przywracający obejmuje represor transkrypcyjny, zaś druga docelowa sekwencja nukleotydowa obejmuje region regulatorowy, z którym wiąże się represor transkrypcyjny.
30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że represor transkrypcyjny jest represorem tet, zaś pierwsza docelowa sekwencja nukleotydową obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiążące represor tet.
31. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, ze represor transkrypcyjny jest represorem lac, zaś pierwsza docelowa sekwencja nukleotydową obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiążące represor lac.
32. Roślina posiadająca genom plastydowy, który zawiera trwale integrowany plastydowy gen niepłodności męskiej, który może być regulowany przez kodowany jądrowo, ukierunkowany na plastyd regulator polipeptydowy, zaś regulacja w tkance pylników powoduje przerwanie tworzenia żywotnego pyłku.
33. Roślina według zastrz. 32, znamienna tym, że plastydowy gen niepłodności męskiej obejmuje docelową sekwencję nukleotydową posiadającą miejsce do aktywacji ekspresji genu oraz miejsce do zapobiegania ekspresji genu znajdujące się w położeniu kontrolującym miejsce aktywacji ekspresji genu, zaś docelowa sekwencja nukleotydową jest połączona operacyjnie z nukleotydową sekwencją kodującą produkt genowy zdolny do przerwania tworzenia żywotnego pyłku, gdy ulega ekspresji w plastydach komórek pylnika.
34. Roślina według zastrz. 32, znamienna tym, że docelowa sekwencja nukleotydową obejmuje promotor T7 do aktywacji ekspresji genu i przynajmniej jeden represor lac do zapobiegania ekspresji genu.
35. Roślina według zastrz. 32, znamienna tym, że plastydowy gen niepłodności męskiej obejmuje docelową sekwencję nukleotydową do zapobiegania ekspresji genu, połączoną operacyjnie z niezbędnym genem plastydowym, przy czym plastydowy gen niepłodności męskiej jest genem ukierunkowanym na genom plastydowy, tak, że natywne formy niezbędnego genu piasty do wego w plastydach transformowanych są zastąpione plastydowym genem niepłodności męskiej, zaś zapobieżenie ekspresji plastydowego genu niepłodności męskiej w plastydach pylnika jest zdolne do przerwania tworzenia żywotnego pyłku.
36. Roślina według zastrz. 32, znamienna tym, że docelowa sekwencja nukleotydową obejmuje przynajmniej jedno miejsce wiążące represor lac
37. Roślina posiadająca genomy jądrowe, które zawierają trwale zintegrowany jądrowy gen niepłodności męskiej, który obejmuje swoiste dla pylników sekwencje regulatorowe 5' połączone operacyjnie z sekwencją nukleotydową kodującą ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy zdolny do wnikania do plastydu i regulowania plastydowego genu niepłodności męskiej, a regulacja ta przerywa tworzenie żywotnego pyłku.
38. Roślina według zastrz. 37, znamienna tym, że jądrowy gen niepłodności męskiej koduje ukierunkowany na plastyd inaktywator polipeptydowy wnikający do plastydu i swoiście oddziaływujący z plastydowym genem niepłodności męskiej obejmującym docelową sekwencjąnukleotydową do aktywacji ekspresji genu, zaś oddziaływanie powoduje ekspresję plastydowego genu niepłodności męskiej, w wyniku której przerwane jest tworzenie żywotnego pyłku.
185 710
39. Roślina według zastrz. 38, znamienna tym, że aktywator polipeptydowy jest polimerazą RN A T7.
40. Roślina według zastrz. 37, znamienna tym, że jądrowy gen niepłodności męskiej obejmuje jeszcze docelową sekwencję nukleotydową do zapobiegania ekspresji genu, połączoną operacyjnie z sekwencją nukleotydową kodującą ukierunkowany na plastyd inaktywator polipeptydowy wnikający do plastydu i swoiście oddziaływujący z plastydowym genem niepłodności męskiej obejmującym inną docelową sekwencję nukleotydową do zapobiegania ekspresji genu, zaś oddziaływanie zapobiega ekspresji plastydowego genu niepłodności męskiej, powodując przerwanie tworzenia żywotnego pyłku.
41. Roślina według zastrz. 40, znamienna tym, że inaktywator polipeptydowy jest represorem lac.
42. Roślina posiadająca genom jądrowy, który zawiera trwale zintegrowany jądrowy gen przywracający płodność męską kodujący produkt genu przywracającego, zdolny do zapobiegania regulacji plastydowego genu niepłodności męskiej przez kodowany jądrowo, ukierunkowany na plastyd regulator polipeptydowy.
43. Roślina według zastrz. 42, znamienna tym, że gen przywracający płodność męską koduje ukierunkowany na plastyd polipeptyd przywracający, wnikający do plastydu i swoiście oddziaływujący z miejscem do zapobiegania ekspresji genu, połączonym operacyjnie z plastydowym genem niepłodności męskiej, zaś oddziaływanie zapobiega ekspresji plastydowego genu niepłodności męskiej.
44. Roślina według zastrz. 43, znamienna tym, że polipeptyd przywracający jest wybrany spośród grupy składającej się z represora lac i represora tet.
45. Roślina według zastrz. 42, znamienna tym, że gen przywracający płodność męską koduje ukierunkowany na jądro polipeptyd przywracający, wnikający do jądra i swoiście oddziaływujący z docelową sekwencją nukleotydową do zapobiegania ekspresji genu, operacyjnie położony w jądrowym genie niepłodności męskiej, przy czym oddziaływanie to zapobiega ekspresji jądrowego genu niepłodności męskiej.
46. Roślina według zastrz. 45, znamienna tym, że polipeptyd przywracający jest wybrany spośród grupy składającej się z represora lac i represora tet.
47. Cytoplazmatycznie męsko niepłodna roślina posiadająca genomy plastydowe, które zawierają trwale zintegrowany piasty do wy gen niepłodności męskiej, który może być regulowany przez kodowany jądrowo, ukierunkowany na plastyd regulator polipeptydowy, oraz genomy jądrowe, które zawierają trwale zintegrowany jądrowy gen niepłodności męskiej, który obejmuje swoiste dla pylników sekwencje regulatorowe 5' połączone operacyjnie z sekwencją nukleotydową kodującą ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy zdolny do wnikania do plastydu i regulowania plastydowego genu niepłodności męskiej, co powoduje przerwanie tworzenia żywotnego pyłku.
48. Cytoplazmatycznie męsko niepłodna roślina wytworzona sposobem, który obejmuje:
a) dostarczenie rodzicielskiej linii roślinnej;
b) wytwarzenie rośliny rodzicielskiej transgenicznej plastydowo z wymienionej linii roślinnej przez trwałą transformację plastydu w komórkach rodzicielskiej linii roślinnej plastydowym genem niepłodności męskiej i regenerację z nich rośliny o transgenicznym plastydzie, przy czym plastydowy gen niepłodności męskiej może być regulowany przez kodowany jądrowo, ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy, zaś regulacja w tkance pylników powoduje przerwanie tworzenia żywotnego pyłku;
c) wytwarzanie transgenicznych jądrowo roślin rodzicielskich z rodzicielskiej linii roślinnej przez trwałe transformowanie jąder komórkowych rodzicielskiej linii roślinnej jądrowym genem niepłodności męskiej i regenerację z nich transgenicznych jądrowo roślin, przy czym jądrowy gen niepłodności męskiej obejmuje swoiste dla pylników sekwencje regulatorowe 5' połączone operacyjnie z sekwencją nukleotydową kodującą ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy zdolny do wnikania do plastydu i regulowania plastydowego genu niepłodności męskiej; i
185 710
d) przenoszenie pyłku pomiędzy rośliną transgeniczną plastydowo a rośliną transgeniczną jądrowo w celu wytworzenia rośliny, w której ukierunkowany na plastyd regulator polipeptydowy jest wytwarzany w sposób swoisty dla pylników, wnika do transformowanych plastydów komórek pylnika i reguluje plastydowy gen niepłodności męskiej, a regulacja powoduje przerwanie tworzenia żywotnego pyłku.
49. Męsko płodne nasiona hybrydowe wytworzone z dwóch rodzicielskich linii roślinnych, z których jedna obejmuje rośliny cytoplazmatycznie męsko niepłodne, sposobem, który obejmuje:
a) wytwarzanie cytoplazmatycznie męsko niepłodnych roślin z pierwszej rodzicielskiej linii roślinnej przez:
i) wytwarzanie rośliny rodzicielskiej transgenicznej plastydowo z wymienionej linii roślinnej przez trwałą transformację plastydu w komórkach rodzicielskiej linii roślinnej plastydowym genem niepłodności męskiej i regenerację z nich rośliny o transgenicznym plastydzie, przy czym plastydowy gen niepłodności męskiej może być regulowany przez kodowany jądrowo, ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy, a regulacja w tkance pylników powoduje przerwanie tworzenia żywotnego pyłku;
ii) wytwarzanie transgenicznych jądrowo roślin rodzicielskich z rodzicielskiej linii roślinnej przez trwałe transformowanie jąder komórkowych rodzicielskiej linii roślinnej jądrowym genem niepłodności męskiej i regenerację z nich transgenicznych jądrowo roślin, przy czym jądrowy gen niepłodności męskiej obejmuje swoiste dla pylników sekwencje regulatorowe 5' połączone operacyjnie z sekwencją nukleotydową kodującą ukierunkowany na plastyd polipeptyd regulatorowy zdolny do wnikania do plastydu i regulowania plastydowego genu niepłodności męskiej; i iii) przenoszenie pyłku pomiędzy rośliną transgeniczną plastydowo a rośliną transgeniczną jądrowo w celu wytworzenia rośliny, w której ukierunkowany na plastyd regulator polipeptydowy jest wytwarzany w sposób swoisty dla pylników, wnika do transformowanych plastydów komórek pylnika i reguluje plastydowy gen niepłodności męskiej, a regulacja powoduje przerwanie tworzenia żywotnego pyłku, dając cytoplazmatycznie męsko niepłodne rośliny;
b) wytwarzanie roślin przywracających płodność drugiej rodzicielskiej linii roślinnej przez trwałe transformowanie jąder komórek drugiej rodzicielskiej linii roślinnej genem przywracającym płodność męską i regenerację z nich rośliny, przy czym gen przywracający płodność męską koduje produkt genu przywracającego zdolny do zapobiegania regulacji plastydowego genu niepłodności męskiej przez ukierunkowany na plastyd regulator polipeptydowy, umożliwiając tworzenie żywotnego pyłku; i
c) przenoszenie pyłku pomiędzy roślinami cytoplazmatycznie męsko niepłodnymi a roślinami przywracającymi płodność męską w celu wytwarzania męsko płodnych nasion hybrydowych z dwóch rodzicielskich linii roślinnych.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/217,360 US5530191A (en) | 1994-03-24 | 1994-03-24 | Method for producing cytoplasmic male sterility in plants and use thereof in production of hybrid seed |
| PCT/US1995/003822 WO1995025787A1 (en) | 1994-03-24 | 1995-03-23 | Methods for producing cytoplasmic male sterility in plants and use thereof in production of hybrid seed |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL316435A1 PL316435A1 (en) | 1997-01-06 |
| PL185710B1 true PL185710B1 (pl) | 2003-07-31 |
Family
ID=22810751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL95316435A PL185710B1 (pl) | 1994-03-24 | 1995-03-23 | Sposób wywoływania cytoplazmatycznej niepłodnościmęskiej u roślin i zastosowanie w wytwarzaniu nasion hybrydowych |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5530191A (pl) |
| EP (1) | EP0805852B1 (pl) |
| JP (1) | JPH09510615A (pl) |
| CN (1) | CN1148869A (pl) |
| AT (1) | ATE230028T1 (pl) |
| AU (1) | AU687544B2 (pl) |
| BR (1) | BR9507180A (pl) |
| CA (1) | CA2186164C (pl) |
| DE (1) | DE69529233T2 (pl) |
| DK (1) | DK0805852T3 (pl) |
| ES (1) | ES2191049T3 (pl) |
| NZ (1) | NZ283622A (pl) |
| PL (1) | PL185710B1 (pl) |
| RU (1) | RU2139347C1 (pl) |
| WO (1) | WO1995025787A1 (pl) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6808904B2 (en) * | 1994-06-16 | 2004-10-26 | Syngenta Participations Ag | Herbicide-tolerant protox genes produced by DNA shuffling |
| US5767373A (en) | 1994-06-16 | 1998-06-16 | Novartis Finance Corporation | Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms |
| US6084155A (en) * | 1995-06-06 | 2000-07-04 | Novartis Ag | Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes |
| AUPN816196A0 (en) * | 1996-02-19 | 1996-03-14 | Forbio Research Pty Ltd | Regulation of eukaryotic gene expression |
| CN1552849B (zh) | 1996-09-12 | 2013-08-14 | 辛根塔参与股份公司 | 表达纤维素分解酶的转基因植物 |
| GB9619633D0 (en) * | 1996-09-20 | 1996-11-06 | Univ Leeds | Recombinant plant cells |
| GB9706381D0 (en) * | 1997-03-27 | 1997-05-14 | Cambridge Advanced Tech | Improvements relating to the specificity of gene expression |
| US6362398B1 (en) | 1998-03-11 | 2002-03-26 | Syngenta Participations Ag | ClpP plastid promoter sequence |
| CA2339641C (en) * | 1998-08-03 | 2010-11-02 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Translation control elements for high-level protein expression in the plastids of higher plants and methods of use thereof |
| IL125632A0 (en) * | 1998-08-03 | 1999-04-11 | Israel State | Degeneration and restoration of plant tissue |
| US6890726B1 (en) | 1999-04-06 | 2005-05-10 | Oklahoma Medical Research Foundation | Method for selecting recombinase variants with altered specificity |
| AU4231600A (en) * | 1999-04-12 | 2000-11-14 | Monsanto Technology Llc | Transgenic plants containing altered levels of sterol compounds and tocopherols |
| WO2000068392A1 (en) * | 1999-05-11 | 2000-11-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Plant-derived antigens against respiratory syncytial virus |
| WO2001000819A1 (en) * | 1999-06-25 | 2001-01-04 | Chauhan, Sarita | Targeted gene replacements in enteric bacteria using linear dna |
| DE60040125D1 (de) * | 1999-08-09 | 2008-10-16 | Riken Wako | Verfahren zur Transformierung von Pflanzen, transformierte Pflanzen und Verfahren zur Herstellung von Polyestern |
| US6852911B1 (en) * | 1999-08-31 | 2005-02-08 | Fertiseed Ltd. | Method of producing a male sterile plant by exogenic allelism |
| CA2391156A1 (en) * | 1999-11-19 | 2001-05-31 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Method for reducing pollen fertility using tapetum-specific zinc finger transcription factor gene |
| CN1461187A (zh) * | 1999-11-19 | 2003-12-10 | 独立行政法人农业生物资源研究所 | 使用花粉特异性的锌指转录因子基因降低花粉受育性的方法 |
| JP4727113B2 (ja) | 2000-03-22 | 2011-07-20 | アイコン・ジェネティクス，インコーポレイテッド | 植物プラスチドを形質転換する方法およびプラスチド転換植物を製造する方法 |
| ATE497538T1 (de) * | 2002-02-26 | 2011-02-15 | Syngenta Ltd | Verfahren zur selektiven herstellung männlich- oder weiblich-steriler pflanzen |
| WO2005054478A1 (en) * | 2003-12-03 | 2005-06-16 | Muehlbauer Stefan | Controlling gene expression in plastids |
| WO2007134122A2 (en) | 2006-05-09 | 2007-11-22 | The Curators Of The University Of Missouri | Plant artificial chromosome platforms via telomere truncation |
| AU2009239333A1 (en) * | 2008-04-21 | 2009-10-29 | Danziger Innovations Ltd. | Plant viral expression vectors and use of same for generating genotypic variations in plant genomes |
| US8304616B2 (en) * | 2009-04-07 | 2012-11-06 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Soybean variety G00-3209 |
| US8362332B2 (en) * | 2009-04-15 | 2013-01-29 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV165560 |
| US8071865B2 (en) * | 2009-04-15 | 2011-12-06 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV589782 |
| US8071864B2 (en) * | 2009-04-15 | 2011-12-06 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV897903 |
| US20100299773A1 (en) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for selecting an improved plant |
| WO2011048600A1 (en) | 2009-10-21 | 2011-04-28 | Danziger Innovations Ltd. | Generating genotypic variations in plant genomes by gamete infection |
| US10117411B2 (en) * | 2010-10-06 | 2018-11-06 | Dow Agrosciences Llc | Maize cytoplasmic male sterility (CMS) C-type restorer RF4 gene, molecular markers and their use |
| US9504215B2 (en) * | 2012-09-27 | 2016-11-29 | Sakata Seed Corporation | Cytoplasmic male sterile eustoma and a method for developing thereof |
| KR20170081268A (ko) | 2014-11-27 | 2017-07-11 | 단지거 이노베이션즈 엘티디. | 게놈 편집용 핵산 구조체 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4952496A (en) * | 1984-03-30 | 1990-08-28 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
| US4918006A (en) * | 1985-07-01 | 1990-04-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Gene coding for insecticidal crystal protein |
| US5122457A (en) * | 1989-10-19 | 1992-06-16 | Schering Corporation | Expression systems utilizing bacteriophage t7 promoters, gene sequences, and t7 rna polymerase |
| US5576198A (en) * | 1993-12-14 | 1996-11-19 | Calgene, Inc. | Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids |
-
1994
- 1994-03-24 US US08/217,360 patent/US5530191A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-23 CA CA002186164A patent/CA2186164C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-23 NZ NZ283622A patent/NZ283622A/en unknown
- 1995-03-23 CN CN95193218.7A patent/CN1148869A/zh active Pending
- 1995-03-23 RU RU96121242A patent/RU2139347C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-03-23 AU AU21981/95A patent/AU687544B2/en not_active Ceased
- 1995-03-23 WO PCT/US1995/003822 patent/WO1995025787A1/en not_active Ceased
- 1995-03-23 AT AT95914915T patent/ATE230028T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-03-23 EP EP95914915A patent/EP0805852B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-23 DE DE69529233T patent/DE69529233T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-23 PL PL95316435A patent/PL185710B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-03-23 JP JP7524843A patent/JPH09510615A/ja not_active Ceased
- 1995-03-23 ES ES95914915T patent/ES2191049T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-23 DK DK95914915T patent/DK0805852T3/da active
- 1995-03-23 BR BR9507180A patent/BR9507180A/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2186164A1 (en) | 1995-09-28 |
| JPH09510615A (ja) | 1997-10-28 |
| AU687544B2 (en) | 1998-02-26 |
| AU2198195A (en) | 1995-10-09 |
| RU2139347C1 (ru) | 1999-10-10 |
| DK0805852T3 (da) | 2003-04-14 |
| US5530191A (en) | 1996-06-25 |
| ATE230028T1 (de) | 2003-01-15 |
| EP0805852B1 (en) | 2002-12-18 |
| EP0805852A4 (pl) | 1997-12-17 |
| CA2186164C (en) | 2005-09-13 |
| PL316435A1 (en) | 1997-01-06 |
| WO1995025787A1 (en) | 1995-09-28 |
| CN1148869A (zh) | 1997-04-30 |
| ES2191049T3 (es) | 2003-09-01 |
| NZ283622A (en) | 1997-12-19 |
| EP0805852A1 (en) | 1997-11-12 |
| BR9507180A (pt) | 1997-10-14 |
| DE69529233D1 (de) | 2003-01-30 |
| DE69529233T2 (de) | 2003-09-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL185710B1 (pl) | Sposób wywoływania cytoplazmatycznej niepłodnościmęskiej u roślin i zastosowanie w wytwarzaniu nasion hybrydowych | |
| US5409823A (en) | Methods for the production of hybrid seed | |
| US5356799A (en) | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production | |
| EP0329308B1 (en) | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production | |
| HU226920B1 (en) | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants | |
| JP4642239B2 (ja) | 作物植物での異系交雑および望ましくない遺伝子拡散を制限するための方法および遺伝子組成物 | |
| JPH03503004A (ja) | 変更された花を有する植物 | |
| AU2010343047B2 (en) | Male and female sterility lines used to make hybrids in genetically modified plants | |
| KR20030031467A (ko) | 트랜스진의 유전을 감소 또는 제거하는 방법 및 조성물 | |
| WO1999046396A2 (en) | Glyphosate as a gametocide | |
| US5728926A (en) | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production | |
| US6603064B1 (en) | Nuclear male sterile plants, method of producing same and methods to restore fertility | |
| CA2416063C (en) | Molecular control of transgene segregation and its escape by a recoverable block of function (rbf) system | |
| AU2001282177A1 (en) | Molecular control of transgene segregation and its escape by a recoverable blockof function (RBF) system | |
| Heberle-Bors et al. | In vitro pollen cultures: progress and perspectives | |
| Vinod | Cytoplasmic genetic male sterility in plants. A molecular perspective | |
| MXPA00008850A (en) | Glyphosate as a gametocide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20050323 |