PL185748B1

PL185748B1 - Zasadniczo czysty DNA, wektor, komórka, rośliny transgeniczne, komórki z roślin transgenicznych, sposób wykrywania genu oporności, sposób izolowania,sposób zapewniania roślinie oporności, sposób wytwarzania polipeptydu, zasadniczo czysty polipeptyd

Info

Publication number: PL185748B1
Application number: PL95316875A
Authority: PL
Inventors: Frederick M. Ausubel; Brian J. Staskawicz; Andrew F. Bent; Douglas Dahlbeck; Fumiaki Katagiri; Barbara N. Kunkel; Michael N. Mindrinos; Guo-Liang Yu
Original assignee: Gen Hospital Corp; The General Hospital Corp; The Regents Of The University Of California; Univ California
Priority date: 1994-04-13
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2003-07-31
Also published as: US7179601B2; US5981730A; JP2002502225A; CZ295796A3; US20020147324A1; AU2356595A; AU2289595A; WO1995028423A1; US20040088756A1; CA2187771A1; EP0759068A1; EP0763058A4; AU708081B2; JP2006055169A; US20080085835A1; AU693891B2; US6127607A; US6262248B1; EP0759068A4; EP0763058A1

Abstract

1. Zasadniczo czysty DNA kodujacy polipetyd obejmujacy petle-P i domena LRR, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roslinom z ekspresja tego poliptydu odpornosci na patogen roslinny. 9. Zasadniczo czysty DNA posiadajacy sekwencje o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujacy sekwencje aminokwasowa otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na fig. 2. 18. Wektor zawierajacy DNA kodujacy polipeptyd obejmujacy petle-P i domene LRR o zdolnosci do nadawania ro- slinom z ekspresja tego peptydu opornosci na patogen roslinny i kierowania ekspresja peptydu kodowanego przez DNA w komórkach zawierajacych ten wektor. 23. Komórka zawierajaca DNA kodujacy polipetyd obejmujacy petle-P i domene LRR, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roslinom z ekspresja tego polipeptydu odpornosci na patogen roslinny. 37. Rosliny trangeniczne, zawierajace zasadniczo czysty DNA kodujacy polipetyd obejmujacy petle-P i domene LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roslinom z ekspresja tego peptydu odpornosci na patogen roslinny, polaczone w sposób umozliwiajacy dzialanie z sekwencjami regulatorowymi ekspresji polipeptydu obejmujacymi pro- motor zintegrowany z genomem roslin, przy czym DNA ulega ekspresji w tych roslinach transgenicznych. 50. Sposób wykrywania genu odpornosci w komórce roslinnej, znamienny tym, ze kontaktuje sie zasadniczo czysty DNA posiadajacy sekwencje o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujacy se- kwencje aminokwasowa otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na figurze 2 lub jego czesc wieksza niz dlugosc 18 nukleotydów z preparatem genomowego DNA z komórki roslinnej w warunkach hybrydyzacji zapewniajacych wykry- wanie sekwencji DNA wykazujacych identycznosc sekwencji okolo 50% lub wieksza z sekwencja o numerze identyfika- cyjnym SEQ ID nr 1. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zasadniczo czysty DNA, wektor, komórka, rośliny transgeniczne, komórki z roślin transgenicznych, sposób wykrywania genu oporności, sposób izolowania, sposób zapewniania roślinie oporności, sposób wytwarzania polipeptydu, zasadniczo czysty polipeptyd.

185 748

Rośliny wykorzystują różne strategie obronne do zwalczania patogenów. Jedna ze strategii obronnych, tak zwana odpowiedź nadwrażliwa (HR) obejmuje szybką lokalną nekrozę zainfekowanej tkanki. W kilku oddziaływaniach gospodarz-patogen analiza genetyczna ujawniła oddziaływania międzygenowe pomiędzy określonym genem braku zjadliwości (avr) w niezjadliwym patogenie, która wywołuje HR u gospodarza posiadającego określony gen odporności.

Przedmiotem wynalazku jest zasadniczo czysty DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego poliptydu odporności na patogen roślinny. Korzystnie, kodowany polipeptyd wywołuje superwrażliwą odpowiedź.

Również korzystnie kodowany polipeptyd stanowi polipeptyd Rps.

W następnym korzystnym rozwiązaniu DNA zawiera gen Rps2 o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.

W następnym korzystnym rozwiązaniu jest DNA genomowym lub także korzystnie DNA jest cDNA.

W innym korzystnym rozwiązaniu DNA pochodzi z rośliny rodzaju Arabidiopsis. Zasadniczo czysty DNA według wynalazku nadaje roślinom odporność, korzystnie na bakterie i grzyby.

Przedmiotem wynalazku jest także zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na fig. 2.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zasadniczo czysty DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ED nr l, przy czym kodowany przez ten DNA polipeptyd zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny. Korzystnie, kodowany polipeptyd wywołuje superwrażliwą odpowiedź.

W korzystnym wykonaniu DNA jest połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi ekspresji wspomnianego polipeptydu, przy czym sekwencje regulatorowe obejmują promotor. Jeszcze bardziej korzystnie promotor ten jest promotorem konstytutywnym. Również korzystnie, promotor jest indukowany przez jeden lub więcej czynników zewnętrznych. W następnym korzystnym rozwiązaniu DNA według wynalazku, promotor jest specyficzny wobec typu komórki.

Następnym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR o zdolności do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny i kierowania ekspresją peptydu kodowanego przez DNA w komórkach zawierających ten wektor.

Następnym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający DNA zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na fig. 2.

Następnym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający zasadniczo czysty DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR o zdolności do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu odporności na patogen roślinny, przy czy każda pętla-P i domena

185 748

LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 i zdolny do kierowania ekspresją polipeptydu kodowanego przez DNA w komórkach zawierających ten wektor.

Następnym przedmiotem wynalazku jest komórka zawierająca DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu odporności na patogen roślinny.

Następnym przedmiotem wynalazku jest komórka zawierająca DNA o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na fig. 2.

Następnym przedmiotem wynalazku jest komórka zawierająca zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka zawierająca zasadniczo czysty DNA kodujące polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR o zdolności do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka zawierająca zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym kodowany przez ten DNA polipeptyd zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny. Korzystnie według wynalazku komórka jest komórką roślinną. Bardziej korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że komórka ta jest odporna na choroby spowodowane patogenem roślinnym niosącym gen braku zjadliwości wywołujący sygnał rozpoznawany przez polipeptyd Rps.

Jeszcze bardziej korzystnie komórka ta jest odporna na choroby spowodowane patogenem roślinnym niosącym gen avrRpt2.

Także korzystnym rozwiązaniem jest komórka roślinna pochodząca z grupy roślin obejmującej Arabidopsis, pomidora, soję, fasole, kukurydzę, pszenicę i ryż.

Korzystnie komórką według wynalazku jest komórka roślinna odporna na patogen roślinny, którym jest Pseudomonas syringae.

Bardziej korzystnie komórka roślinna może zawierać ponadto gen avrRpt2 połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi, przy cżym wspomniane sekwencje regulatorowe obejmują promotor.

Jeszcze bardziej korzystnie, komórka roślinna według wynalazku obejmuje promotor, który jest promotorem konstytutywnym.

Również korzystnie promotor ten może być indukowalny przez jeden lub więcej czynników zewnętrznych, a także w innym korzystnym rozwiązaniu promotor ten jest specyficzny wobec typu komórki.

Następnym przedmiotem wynalazku są rośliny transgeniczne, zawierające zasadniczo czysty DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu odporności na patogen roślinny, połączone w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi ekspresji polipeptydu obejmującymi promotor zintegrowany z genomem roślin, przy czym DNA ulega ekspresji w tych roślinach transgenicznych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku są także rośliny transgeniczne zawierające zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na fig. 2, przy czym DNA ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku są także rośliny transgeniczne zawierające zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją

185 748

DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym DNA ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.

Przedmiotem wynalazku są także rośliny transgeniczne zawierające zasadniczo czysty DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, a każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 i przy czym DNA ulega ekspresji we wspomnianej roślinie transgenicznej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku są także rośliny transgeniczne zawierające zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny i przy czym DNA ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.

Następnym przedmiotem wynalazku są także rośliny transgeniczne utworzone z komórki roślinnej zawierającej DNA posiadające około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu odporności na patogen roślinny i zawierające ponadto gen avrRpt2 połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi i charakteryzujący się tym, że sekwencje regulatorowe zawierają promotor, przy czym DNA i gen avrRpt2 ulegają ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.

Przedmiotem wynalazku są komórki z roślin transgenicznych zawierające zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na figurze 2, kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny.

Przedmiotem wynalazku są komórki z roślin transgenicznych zawierające zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na figurze 2 przy czym, DNA to ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.

Następnym przedmiotem wynalazku są komórki z roślin transgenicznych zawierające zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym DNA to ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.

Przedmiotem wynalazku są także komórki z roślin transgenicznych zawierające zasadniczo czysty DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, a każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 i przy czym DNA to ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku są komórki z roślin transgenicznych zawierające zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny i przy czym DNA to ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.

Następnym przedmiotem wynalazku są komórki z roślin transgenicznych utworzone z komórek roślinnych zawierających DNA posiadające około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym kodowany przez to DNA polipeptyd zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny i zawierające ponadto gen avrRpt2 połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi, charakteryzujący się tym, że te sekwencje reguła

185 748 cyjne zawierają promotor, przy czym DNA i gen avrRpt2 ulegają ekspresji we wspomnianej roślinie transgenicznej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania genu odporności w komórce roślinnej, polegający na tym, że kontaktuje się zasadniczo czysty DNA kodujący polipetyd, zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, obejmujący pętlę-P i domenę LRR lub jego część większą niż długość 18 nukleotydów z preparatem genomowego DNA z komórki roślinnej w warunkach hybrydyzacji zapewniających wykrywanie sekwencji DNA wykazujących identyczność sekwencji około 50% lub większą z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania genu odporności w komórce roślinnej, polegający na tym, że kontaktuje się zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na figurze 2 lub jego część większą niż długość 18 nukleotydów z preparatem genomowego DNA z komórki roślinnej w warunkach hybrydyzacji zapewniających wykrywanie sekwencji DNA wykazujących identyczność sekwencji około 50% lub większą z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania genu odporności w komórce roślinnej, polegający na tym, że kontaktuje się zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jego część większą niż długość 18 nukleotydów z preparatem genomowego DNA z komórki roślinnej w warunkach hybrydyzacji zapewniających wykrywanie sekwencji DNA wykazujących identyczność sekwencji około 50% lub większą z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania genu odporności w komórce roślinnej, polegający na tym, że kontaktuje się zasadniczo czysty DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, lub jego część większą niż długość 18 nukleotydów z preparatem genomowego DNA z komórki roślinnej w warunkach hybrydyzacji zapewniających wykrywanie sekwencji DNA wykazujących identyczność sekwencji około 50% lub większą z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQIDnr 1.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania genu odporności w komórce roślinnej, polegający na tym, że kontaktuje się zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny lub jego część większą niż długość 18 nukleotydów z preparatem genomowego DNA z komórki roślinnej w warunkach hybrydyzacji zapewniających wykrywanie sekwencji DNA wykazujących identyczność sekwencji około 50% lub większą z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób izolowania z roślin genu odporności na chorobę lub jego część wykazującą identyczność sekwencji z genem kodującym polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, polegający na tym, że przeprowadza się amplifikację genu odporności na chorobę lub jego części metodą PCR z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych które to startery oligonukleotydowe są

a) wszystkie są większe pod względem długości niż 13 nukleotydów;

b) wszystkie posiadają regiony komplementarne do przeciwległych nici DNA w regionie sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1; i

c) ewentualnie zawierają sekwencje zdolne do wytwarzania miejsca cięcia przez enzymy restrykcyjne w zamplifikowanym produkcie; i izoluje się gen odporności na chorobę lub jego część.

185 748

Przedmiotem wynalazku jest także sposób zapewniania roślinie odporności na patogen roślinny, polegający na tym, że

a) wytwarza się transgeniczną komórkę roślinną zdolną do ekspresji zasadniczo czystego DNA kodującego polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny; i hoduje się roślinę transgeniczną z komórki roślinnej, przy czym DNA ulega ekspresji w tej wspomnianej roślinie transgenicznej.

a) wytwarza się transgeniczną komórkę roślinną zdolną do ekspresji zasadniczo czystego DNA posiadającego sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na figurze 2; i hoduje się roślinę transgeniczną z komórki roślinnej, przy czym DNA ulega ekspresji w tej wspomnianej roślinie transgenicznej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób zapewniania roślinie odporności na patogen roślinny, znamienny tym, że

a) wytwarza się transgeniczną komórkę roślinną zdolną do ekspresji zasadniczo czystego DNA kodującego polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1; i hoduje się roślinę transgeniczną z komórki roślinnej, przy czym DNA ulega ekspresji w tej wspomnianej roślinie transgenicznej.

a) wytwarza się transgeniczną komórkę roślinną zdolną do ekspresji zasadniczo czystego DNA posiadającego około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny i hoduje się roślinę transgeniczną z komórki roślinnej, przy czym DNA ulega ekspresji w tej wspomnianej roślinie transgenicznej.

Korzystnie roślina trangeniczna jest odporna na patogen bakteryjny lub grzybowy.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób zapewniania roślinie odporności na patogen roślinny, polegający na tym, że hoduje się roślinę transgeniczną z komórki roślinnej odpornej na choroby spowodowane patogenem roślinnym niosącym gen braku zjadliwości wywołujący sygnał rozpoznawany przez polipeptyd Rps zawierająca zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 i charakteryzującej się tym, że patogen roślinny niesie gen avrRpt2, przy czym wspomniany DNA i wspomniany gen avrRpt2 ulegają ekspresji w roślinie transgenicznej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego pętlę-P i domenę LRR i który jest zdolny do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny pochodzenia bakteryjnego i grzybowego, polegający na tym, że

a) dostarcza się komórkę transformowaną zasadniczo czystym DNA kodującym polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR umiejscowiony w tej komórce dla wywołania ekspresji;

b) hoduje się stransformowaną komórkę w warunkach odpowiednich dla ekspresji tego DNA; i

c) izoluje się wspomniany polipeptyd.

185 748

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego pętlę-P i domenę LRR i który jest zdolny do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, polegający na tym, że

a) dostarcza się komórkę transformowaną zasadniczo czystym DNA posiadającym sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na figurze 2.;

c) izoluje się wspomniany polipeptyd.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego pętlę-P i domenę LRR i który jest zdolny do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, polegający na tym, że

a) dostarcza się komórkę transformowaną zasadniczo czystym DNA wykazującym około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1;

c) izoluje się wspomniany polipeptyd.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego pętlę-P i domenę LRR i który jest zdolny do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen pochodzenia bakteryjnego i grzyby roślinny, polegający na tym, że

a) dostarcza się komórkę transformowaną zasadniczo czystym DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencjąpętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1;

c) izoluje się wspomniany polipeptyd.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego pętlę-P i domenę LRR i który jest zdolny do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, polegający na tym, że

a) dostarcza się komórkę transformowaną zasadniczo czystym DNA posiadającym około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1;

c) izoluje się wspomniany polipeptyd.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zasadniczo czysty polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny. Korzystnie polipeptyd według wynalazku zdolny jest do wywołania superwrażliwej odpowiedzi. W innym korzystnym rozwiązaniu polipeptyd ten stanowi polipeptyd Rps. Także korzystnie polipeptyd pochodzi z rośliny rodzaju Arabidiopsis.

Również korzystnie polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z sekwencją aminokwasową rozpoczynającą się od Metę w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 2.

Przedmiotem wynalazku jest także zasadniczo czysty polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny pochodzenia bakteryjnego lub grzybowego, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na fig. 2.

Przez „gen odporności na chorobę” rozumie się gen kodujący polipeptyd zdolny do wyzwalania odpowiedzi obronnej rośliny w komórce roślinnej lub tkance roślinnej. Gen Rps jest genem odporności na chorobę posiadającym około 50% lub większą identyczność sekwencji

185 748 z sekwencją Rps2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) przedstawioną na fig. 1 lub jej częścią. Gen Rps2 jest genem odporności na chorobę kodującym polipeptyd odporności na chorobę Rps2 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 2-5) z Arabidopsis thaliana.

Przez „polipeptyd” rozumie się jakikolwiek łańcuch aminokwasów, bez względu na długość lub modyfikację potranslacyjną(np. glikozylację lub fosforylację).

Przez „zasadniczo identyczny’’ rozumie się polipeptyd lub kwas nukleinowy wykazujący co najmniej 50%, korzystnie 85%, korzystniej 90%, a najkorzystniej 95% homologii do sekwencji aminokwasowej lub kwasu nukleinowego odniesienia. Dla polipeptydów długość porównywanych sekwencji będzie na ogół wynosić co najmniej 25 aminokwasów, a najkorzystniej 35 aminokwasów. Dla kwasów nukleinowych długość porównywanych sekwencji będzie na ogół wynosić co najmniej 50 nukleotydów, korzystnie co najmniej 60 nukleotydów, korzystniej co najmniej 75 nukleotydów, a najkorzystniej 110 nukleotydów.

Identyczność sekwencji zazwyczaj ocenia się z wykorzystaniem oprogramowania do analizy sekwencji (np. Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Takie oprogramowanie przyporządkowuje podobne sekwencje przez ustalenie stopnia homologii dla różnych podstawień, delecji, podstawień i innych modyfikacji. Podstawienia konserwatywne zazwyczaj obejmują podstawienia w obrębie następujących grup: glicyna alanina; walina, izoleucyna, leucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina; i fenyloalanina, tyrozyna.

Przez „zasadniczo czysty polipeptyd” rozumie się polipeptyd Rps2, który oddzielono od składników, które towarzyszą mu w stanie naturalnym. Zazwyczaj uważa się, że polipeptyd jest zasadniczo czysty, gdy jest w co najmniej 60%, wagowo, wolny od białek i naturalnie występujących cząsteczek organicznych, które w stanie naturalnym z nim współwystępują. Korzystnie, preparat jest w co najmniej 75%, korzystniej w co najmniej 75%, najkorzystniej w co najmniej 99%, wagowo, polipeptydem Rps. Zasadniczo czysty polipeptyd Rps2 można otrzymać, na przykład, przez ekstrakcję ze źródła naturalnego (np. komórki roślinnej), przez ekspresję zrekombinowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd Rps2, lub przez chemiczne zsyntetyzowanie białka. Czystość można mierzyć jakąkolwiek odpowiednią metodą np. metodami opisanymi dla chromatografii kolumnowej, elektroforezy w żelu poliakryloamidowym lub przez analizę HPLC.

- Białko jest zasadniczo wolne od współwystępujących z nim naturalnie składników, jeśli oddzielono je od tych zanieczyszczeń, które towarzyszą mu w jego stanie naturalnym. A zatem, białko, które zsyntetyzowano chemicznie lub wytworzono w układzie komórkowym różnym od komórki, z której ono naturalnie pochodzi, będzie zasadniczo wolne od współwystępujących z nim naturalnie składników. A zatem, zasadniczo czyste polipeptydy obejmuje te pochodzące z organizmów eukariotycznych, ale zsyntetyzowane w E. coli lub innych organizmach prokariotycznych.

Przez „zasadniczo czysty DNA” rozumie się DNA, który jest wolny od genów, które flankują gen w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego DNA według wynalazku pochodzi. Termin obejmuje dlatego, na przykład, zrekombinowany DNA, który wprowadzono do wektorą do plazmidu ulegającego autonomicznej replikacji łub wirusą bądź do DNA genowego organizmu prokariotycznego lub eukariotycznego, lub który występuje jako oddzielna cząsteczka (np. cDNA lub genomowy lub fragment cDNA wytworzony przez PCR bądź trawienie endonukleazą restrykcyjną) niezależna od innych sekwencji. Obejmuje on także zrekombinowany DNA, który jest częścią hybrydowego genu kodującego dodatkową sekwencję polipeptydu.

Przez „stransformowaną komórkę” rozumie się komórkę, do której (lub do której przodka) wprowadzono technikami rekombinacji DNA cząsteczkę DNA kodującą (w znaczeniu tu stosowanym) polipeptyd Rps2.

Przez „umiejscowiony w sposób umożliwiający ekspresję” rozumie się, że cząsteczka DNA jest umiejscowiona w bezpośrednim sąsiedztwie sekwencji DNA, która kieruje transkrypcją i translacją sekwencji (tj. umożliwia wytwarzanie np. polipeptydu Rps2, zrekombinowanego białka lub cząsteczki RNA).

185 748

Przez „gen reporterowy” rozumie się gen, którego ekspresja można oznaczać; takie geny obejmują, ale nie ograniczają się do, genów β-glukuronidazy (GUS), lucyferazy, transacetylazy chloramfenikolowej (CAT) i β-galaktozydazy.

Przez „promotor” rozumie się minimalną sekwencję wystarczającą do kierowania transkrypcją. Wynalazek obejmuje również elementy promotorowe, które są wystarczające do zajścia zależnej od promotora ekspresji podlegającej kontroli pod względem specyficzności wobec typu komórki, specyficzności tkankowej lub indukowalnej przez zewnętrzne sygnały lub czynniki; elementy takie mogą być zlokalizowane w regionach 5'-końcowym lub 3 końcowym natywnego genu.

Przez „połączone w sposób umożliwiający działanie” rozumie się, że gen i sekwencja(e) regulująca(e) połączone są w taki sposób, aby umożliwiać ekspresję genu, gdy odpowiednie cząsteczki (np. białka aktywatorów transkrypcji) związane są z sekwencją(ami) regulującą (ymi).

Przez „komórkę roślinną” rozumie się jakąkolwiek samonamnażającą się komórkę otoczoną przez błonę póiprzepuszczalną i zawierającą plastyd. Jeśli pożądane jest dalsze namnażanie, komórka taka wymaga również ściany komórkowej. W znaczeniu tu stosowanym, komórka roślinna obejmuje, ale nie ogranicza się do glonów, sinic, nasiona, hodowle zawiesinowe, zarodki, regiony merystematyczne, tkankę kalusa, liście, korzenie, pędy, gametofity, sporofity, pyłek i mikrospory.

Przez „transgen” rozumie się jakikolwiek fragment DNA, który sztucznie wstawiono do komórki i, który stał się częścią organizmu rozwiniętego z komórki. Taki transgen może obejmować gen, który jest częściowo lub w pełni heterologiczny (t j. obcy) dla organizmu transgenicznego, lub może być genem homologicznym do endogennego genu organizmu.

Przez „transgeniczna” rozumie się jakkolwiek komórkę, która zawiera sekwencję DNA, którą sztucznie wstawiono do komórki i, która stała się częścią genomu organizmu rozwiniętego z komórki. W znaczeniu tu stosowanym, organizmami transgenicznymi są generalnie rośliny transgeniczne, a DNA (transgen) wstawia się sztucznie do ich genomu jądrowego lub plastydowego.

Przez „patogen” rozumie się organizm, którego infekcja komórek żywej tkanki roślinnej wywołuje odpowiedź chorobową w tkance roślinnej.

Inne cechy i zalety wynalazku staną się oczywiste na podstawie poniższego opisu jego korzystnych rozwiązań oraz zastrzeżeń.

Szczegółowy opis

Rysunki

Figury 1A - 1F są schematycznym podsumowaniem analizy fizycznej iRFLP, które wskazują sposób sklonowania locus Rps2.

Figura 1A jest diagramem przedstawiającym przyporządkowanie map genetycznych i RFLP istotnych dla zagadnienia części chromosomu IV Arabidopsis thaliana, na podstawie mapy opublikowanej przez Listera i Deana (1993) Plant J. 4: 745-750. Marker RFLP L11F11 odpowiada lewemu ramieniu klonu YAC YUP11F11.

Figura IB jest diagramem przedstawiającym przyporządkowanie istotnych dla zagadnienia YAC wokół locus Rps2. Konstrukcje YAC oznaczone YUP16G5, YUP18G9 iYUPUFll dostarczył J. Ecker, University of Pennsilvania. Konstrukcje YAC oznaczone EW3H7, EW11D4, EW11E4 i EW9C3 dostarczył E. Warda, Ciba-Geigy, Inc.

Figura 1C jest diagramem przedstawiającym przyporządkowanie klonów kosmidowych wokół locus Rps2. Klony kosmidowe z oznaczeniem H są pochodnymi klonu YAC EW3H7, podczas gdy te z oznaczeniem E są pochodnymi klonu YAC EW11E4. Pionowe strzałki wskazują względne pozycje markerów RFLP pomiędzy ekotypami roślinnymi La-er i rpslOlN. Markery RFLP zidentyfikowano przez przeszukanie biotu Southema zawierającego więcej niż 50 mieszanin produktów trawienia różnymi enzymami restrykcyjnymi z zastosowaniem albo całości lub fragmentów odpowiadających klonów kosmidowych jako sond. Klony kosmidowe opisane na fig. 1C dostarczył J. Giraudat, C.N.R.S., Gif-sur-Yvette, Francja.

185 748

Figury ID i 1E są mapami miejsc restrykcyjnych EcoRI wkosmidach odpowiednio E4-4 i E4-6. Punkty przerw rekombinacyjnych otaczające locus Rps2 zlokalizowane są we fragmentach restrykcyjnych EcoRI o długości 4,5 i 7,5 kb.

Figura 1F jest diagramem przedstawiającym przybliżone położenie genów, które kodują transkrypty RNA zidentyfikowane przez analizę biotów poliA ⁺RNA. Wielkość każdego transkryptu podano w tysiącach par zasad, poniżej każdego transkryptu.

Figura 2 jest pełną sekwencją cDNA-4 zawierającego locus genu Rps2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1]. Poniżej sekwencji nukleotydowej przedstawiono trzy ramki odczytu. Podano przewidywaną sekwencję aminokwasową [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 2-5] ramki odczytu „a” i zawiera ona 909 aminokwasów. W otwartej ramce odczytu „a” na fig. 2 metioninę kodowaną przez kodon start ATG otoczono kółeczkiem. A kodon start ATG jest nukleotydem 31 na fig. 2.

Figura 3 jest sekwencją nukleotydową genu avrRpt2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 106.]. Potencjalne miejsce wiązania rybosomu podkreślono. Odwrócone powtórzenie wskazano poziomymi strzałkami w końcu 3' otwartej ramki odczytu. Pod sekwencją nukleotydową otwartej ramki odczytu podano przewidywaną sekwencję aminokwasowa.

Figura 4 jest schematycznym podsumowaniem analizy komplementacyjnej, która umożliwia funkcjonalne potwierdzenie, że DNA zawarty wp4104 ip4115 (kodujących cDNA-4) nadaje aktywność zależnej od Rps2 odporności na chorobę roślinom Arabidopsis thaliana uprzednio pozbawionym takiej aktywności. Małe pionowe kreski wzdłuż linii „genomu” odpowiadają miejscom rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny EcoRI, a liczby nad tą linią odpowiadają wielkości, w tysiącach par zasad (kb), powstających w wyniku trawienia fragmentów DNA (patrz także fig. 1E). Przeciwległe „cDNA” są przybliżonymi położeniami sekwencji kodujących transkrypty RNA (patrz także fig. 1F); groty strzałek wskazują kierunek transkrypcji cDNA 4, 5 i 6. W doświadczeniach komplementacji funkcjonalnej, rośliny rps2-201C/rps2-201C stransformowano genetycznie wskazanymi sekwencjami genomowego DNA Arabidopsis thaliana', sekwencje te zawarte są w wymienionych plazmidach (pochodnych binarnego wektora kosmodowego pSLJ4541) i wprowadzone do rośliny metodą transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium. Fenotyp odporności na chorobę transformantów otrzymanych po inokulacji P syringae, u którego zachodzi ekspresja avrRpt2 podano jako „Pod.” (podatny, brak odpowiedzi odpornościowej) lub „Odp.” (odporny na chorobę).

Genetyczne podłoże odporności na patogeny

Przedstawia się przegląd oddziaływań pomiędzy gospodarzem roślinnym a patogenem będącym mikroorganizmem. Inwazja rośliny przez potencjalny patogen może mieć szereg następujących wyników: albo patogen z powodzeniem namnaźa się w gospodarzu, powodując towarzyszące objawy chorobowe, albo jego wzrost zahamowany przez mechanizmy obronne gospodarza. W niektórych oddziaływaniach roślina-patogen widoczną oznaką aktywnej odpowiedzi obronnej jest tak zwana odpowiedź nadwrażliwa lub „HR”. HR obejmuje szybką nekrozę komórek w pobliżu miejsca infekcji i może obejmować tworzenie widocznych suchych, brązowych lezji. Patogeny, które wywołują HR u danego gospodarza określa się jako niezjadliwe dla tego gospodarza, gospodarza określa się jako odpornego, a oddziaływanie roślina patogen określa się jako niekompatybilne. Szczepy, które namnaźają się i powodują chorobę konkretnego gospodarza określa się jako zjadliwe, w tym przypadku gospodarza określa się jako podatnego, a oddziaływanie roślina-patogen określa się jako kompatybilne.

Dla ułatwienia wyjaśnienia genetycznego podłoża rozpoznawania roślina-patogen w tych przypadkach, w których szeregi szczepów (rasy) określonego patogenu grzybowego lub bakteryjnego są albo zjadliwe, albo niezjadliwe wobec szeregów kultywarów (lub różnych dzikich przedstawicieli) określonych gatunków gospodarza, z powodzeniem zastosowano „klasyczną” analizę genetyczną. W wielu takich przypadkach analiza genetyczna zarówno gospodarza, jak i patogenu ujawniła, że wiele niezjadliwych szczepów grzybowych i bakteryjnych różni się od szczepów zjadliwych posiadaniem jednego lub więcej genów braku zjadliwości (avr), które posiadają odpowiadające geny „odporności” u gospodarza. Odziaływania gen braku zjadliwości-gen odporności nazwano modelem oddziaływań międzygenowych (Crute i in., (1985) str. 197-309, w: Mechanisms of Resistance to Plant Disease,

185 748

R.S.S. Fraser, red.; Ellingboe, (1981) Annu. Rev. Phytopatol. 19: 125-143; Flor, (1971) Annu. Rev. Phytopatol. 9: 275-296; Keen i Staskawicz, (1988), powyżej oraz Keen i in., w: Application of Biotechnology to Plant Pathogen Control, I. Chet, red., John Wiley & Sons, 1993, str. 65-88). Według prostego sformułowania tego modelu, geny oporności roślin kodują specyficzne receptory sygnałów molekularnych generowanych przez geny avr. Szlak(i) przekazywania sygnałów przenoszą następnie sygnał do zespołu genów docelowych, które inicjują HR i inne mechanizmy obronne gospodarza (Gabriel i Rolfe, (1990) Annu. Rev. Phytopathol. 28: 365-391). Pomimo tego prostego, pozwalającego na przewidywania modelu, molekularne podłoże oddziaływania pomiędzy genami avr, a genami odporności, jest nadal nieznane.

Jedno podstawowe przewidywanie hipotezy oddziaływań między genowych zostało przekonywująco potwierdzone na poziomie molekularnym przez sklonowanie różnych bakteryjnych genów avr (Innes i in., (1993) J. Bacteriol. 175: 4859-4869; Dong i in., (1991) Plant Celi 3: 61-72; Whelan i in., (1991) Plant Celi 3: 49-59; Staskawicz i in., (1987) J. Bacteriol. 169: 5789-5794; Gabriel i in., (1986) P.N.A.S., USA: 6415-6419; Keen i Staskiewicz, (1988) Annu. Rev. Microbiol. 42: 421-440; Kobayashi iin., (1990) Mol. Plant-Microbe Interact. 3: 94-102 oraz (1990) Mol. Plant-Microbe Interact. 3: 103-111). Wykazano, że wiele z tych sklonowanych genów braku zjadliwości odpowiadało na pojedyncze geny odporności w pokrewnych gospodarzach roślinnych oraz że nadają fenotyp braku zjadliwości po przeniesieniu do szczepu inaczej zjadliwego. Locus avrRpt2 wyizolowali z Pseudomonas syringae pv. tomato i zsekwencjonowali Innes i in. (Innes, R. i in. (1993) J. Bacteriol. 175: 4859-4869). Fig. 3 jest sekwencją nukleotydową [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 105] i przewidywaną sekwencją aminokwasową [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6] genu avrRpt2.

Przykłady znanych sygnałów, na które rośliny odpowiadają po zainfekowaniu patogenami obejmują struktury „szpilki do włosów” z Erwinia (Wei i in. (1992) Science 257: 85-88) i Pseudomonas (He i in. (1993) Celi 73: 1255-1266); peptydy avr4 (Joosten i in. (1994) Naturę 367: 384-386) i avr9 (van den Ackerveken iin. (1992) Plant J. 2: 359-366) zCladosporium, PopAl zPseudomonas (Arlat iin. (1994) EMBO J. 13: 543-553); lipopolisacharyd wytwarzany przez avrD (Midland iin. (1993) J. Org. Chem. 58: 2940-2945) iNIPl z Rhynchosporium (Hahn i in. (1993) Mol. Plant-Microbe Interact. 6: 745-754).

W porównaniu z genami avr, znacznie mniej wiadomo o roślinnych genach odporności, które odpowiadają na specyficzne sygnały generowane przez avr. Roślinny gen odporności, Rps2 (rps od ang. resistance to Pseudomonas syringae, odporność na Pseudomonas syringae), pierwszy gen nowej, uprzednio niezidentyfikowanej klasy genów odporności na choroby roślin, odpowiada na specyficzny gen avr (avrRpt2). Część prac prowadzących do sklonowania Rps2 opisano wYu, iin. (1993), Molecular Plant-Microbe Interactions 6: 434-443 oraz w Kunkel, i in. (1993) Plant Celi 5: 856-875.

W rzeczywistości nie spokrewniony gen braku zjadliwości, który specyficznie odpowiada na roślinny gen odporności na chorobę Pto, wyizolowano z pomidorów (Lycopersicon esculentum) (Martin iin., (1993) Science 262: 1432-1436). Rośliny pomidorów, u których zachodzi ekspresja genu Pto, są odporne na infekcje szczepami Pseudomonas syringae pv. tomato, u których zachodzi ekspresja genu braku zjadliwości avrPto. Sekwencja aminokwasowa przewidziana na podstawie sekwencji DNA genu Pto wykazuje silne podobieństwo do kinaz serynowo-tyrozynowych, co wskazuje na udział Pto w przekazywaniu sygnałów. Dla Rps2 nie zaobserwowano żadnego podobieństwa do locus Pto pomidora ani jakiejkolwiek innej kinazy białkowej, co sugeruje, że Rps2 jest przedstawicielem nowej klasy roślinnych genów odporności na choroby.

Doniesiono o wyizolowaniu specyficznego wobec rasy genu odporności z Zea mays (kukurydzy), znanego jako Hml (Johal iBriggs (1992) Science 258: 985-987). Hml nadaje odporność na specyficzne rasy patogenu grzybowego Cochliobolus carbonum przez kontrolowanie degradacji toksyny grzybowej, co jest strategią różną pod względem mechanizmu od odporności specyficznej wobec genu braku zjadliwości mechanizmu odporności Rps2avrRpt2.

185 748

Sklonowany gen Rps2 według wynalazku można stosować do ułatwiania konstruowania roślin, które są odporne na specyficzne patogeny i do przezwyciężenia niemożliwości przenoszenia genów odporności na choroby pomiędzy gatunkami przy zastosowaniu klasycznych technik hodowli (Keen iin., (1993), powyżej). Poniżej nastąpi opis klonowania i charakteryzacji locus genetycznego Rps2 Arabidopsis thaliana, DNA genomowego Rps2 i cDNA Rps2. Gen avrRpt2 i gen Rps2, jak również mutanty rps2-101C, rps2-102C i rps2201C (oznaczony również rps2-201) opisano w Dong, iin., (1991) Plant Celi 3: 61-72; Yu i in., (1993) powyżej; Kunkel i in., (1993) powyżej; Whalen i in., (1991) powyżej oraz Innes i in., (1993) powyżej). Wyizolowano również mutanta oznaczonego rps2-101N. Identyfikację i klonowanie genu Rps2 opisano poniżej.

Rps2 znosi wrażliwość na patogeny zawierające gen avrRpt2

W celu wykazania genetycznej zależności pomiędzy genem braku zjadliwości u patogenu i genem odporności u gospodarza, konieczne było najpierw wyizolowanie genu braku zjadliwości. Przez przeszukiwanie szczepów Pseudomonas, o których wiadomo, że są patogenami roślin uprawnych spokrewnionych z Arabidopsis, zidentyfikowano szczepy o wysokiej zjadliwości, P. syringae pv. maculicola (Psm) ES4326, P. syringae pv. tomato (Pst) DC3000 oraz szczep niezjadliwy, Pst MM1065 i zanalizowano je pod katem ich indywidualnych zdolności do wzrostu w roślinach Arabidopsis thaliana typu dzikiego (Dong iin., (1991) Plant Celi, 3: 61-72; Whalen i in., (1991) Plant Celi 3: 49-59; w Whalen i in. MM1065 oznaczono jako JL1065). Psm ES4326 lub Pst DC3000 mogąnamnaźać się lO^crotnie w liściach Arabidopsis thaliana i powodować przesiąknięte woda lezje, które pojawiają się w ciągu dwóch dni. Pst MMI065 namnaża się maksymalnie 10-krotnie w liściach Arabidopsis thaliana i powoduje pojawianie się po 48 godzinach umiarkowanie chlorotycznych, suchych lezji. A zatem, odporności na chorobę towarzyszy silne zahamowanie wzrostu patogenu.

Gen braku zjadliwości (avr) szczepu Pst MMI065 sklonowano stosując standardowe techniki, jak opisano w Dong i in., (1991), Plant Celi 3: 61-72; Whalen i in., (1991), powyżej, oraz Innes i in., (1993), powyżej. Wyizolowany gen braku zjadliwości tego szczepu oznaczono avrRpt2. Normalnie, zjadliwy szczep Psm ES4326 lub Pst DC3000 powoduje pojawianie się objawów choroby po 48 godzinach, jak opisano powyżej. W przeciwieństwie, Psm ES4326/avrRpt2 lub Pst DC3000/avrRpt2 wywołuje pojawianie się widocznej nekrotycznej odpowiedzi nadwrażliwej (HR) w ciągu 16 godzin i namnaża się 50-krotnie gorzej niż Psm ES4326 lub Pst DC3000 w liściach Arabidopsis thaliana typu dzikiego (Dong i in., (1991), powyżej, oraz Whalen i in., (1991), powyżej). A zatem, odporność na chorobę rośliny Arabidopsis typu dzikiego wymaga w części genu braku zjadliwości u patogenu lub sygnału generowanego przez gen braku zjadliwości.

Opisano wyizolowanie czterech mutantów odpornych na chorobę z zastosowaniem sklonowanego genu avrRpt2 do poszukiwania genu gospodarza wymaganego do odporności na chorobę wywoływana przez patogeny zawierające gen avrRpt2 (Yu i in., (1993), powyżej; Kunkel i in., (1993), powyżej). Cztery mutanty Arabidopsis thaliana nie rozwijały HR po infiltracji Psm ES4326/avrRpt2 lub Pst DC3OOO/avrRpt2, jak oczekiwano dla roślin, które utraciły swoją zdolność do odporności na chorobę. W przypadku jednego z tych mutantów, około 3000 pięcio- do sześciotygodniowych roślin M2ekotyp Columbia (rośliny Col-0) utworzonych przez mutagenezę kwasem etylo-metanosulfenowym (EMS) inokulowano ręcznie Psm ES4326/avrRpt2 i zidentyfikowano pojedynczego mutanta, rps2-101C (od ang. resistance to Pseudomonas syringae, odporność na Pseudomonas syringae) (Yu i in., (1993), powyżej).

Drugiego mutanta wyizolowano stosując procedurę, która specyficznie wzbogaca w mutanty niezdolne do rozwijania HR (Yu iin., (1993), powyżej. Gdy 10-dniowe siewki Arabidopsis thaliana rosnące na szalkach Petrigo poddawano infiltracji Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Psp) NPS3121 w porównaniu zPsp NPS3121/avrRpt2, około 90% roślin infiltrowanych Psp NPS3121 przeżyło, podczas gdy około 90%-95% roślin infiltrowanych Psp NPS3121/avr.Rpt2 zginęło. W rzeczywistości, próżniowa infiltracja całej małej siewki Arabidopsis thaliana Psp NPS3121/avrRpt2 wywołuje systemową HR, która zazwyczaj zabija siewkę. W przeciwieństwie, siewki infiltrowane Psp NPS3121 przeżywają, ponieważ Psp NPS3121 jest słabym patogenem dla Arabidopsis thaliana. Drugiego mutanta odpor

185 748 nego na chorobę wyizolowano przez infiltrację Psp NPS3121/avrRpt 24000 mutagenizowanych EMS siewek Columbia M₂. Uzyskano dwieście roślin, które przeżyły. Przesadzono je do gleby i ponownie poddano badaniom przesiewowym przez ręczne inokulację po osiągnięciu przez rośliny dojrzałości. Spośród tych 200 roślin, które przeżyły, u jednej nie rozwinęła się HR po ręcznej infiltracji Psm ES4326/avrRpt2. Mutanta tego oznaczono rps2-102C (Yu i in., (1993), powyżej).

Trzeciego mutanta, rps-201C, wyizolowano w badaniach przesiewowych około 7500 roślin M₂ pochodzących z nasion ekotypu Col-0 Arabidopsis thaliana, które mutagenizowano diepoksybutanem (Kunkel i in., (1993), powyżej). Rośliny inokulowano przez zanurzenie całych rozetek liściowych w roztworze zawierającycm bakterie Pst DC3000/avrRpt2 i środek powierzchniowo czynny Silwet L-77 (Whalen i in., (1991), powyżej), inkubowanie roślin w komorze wzrostowej o kontrolowanym środowisku wciągu trzech do czterech dni, a następnie wzrokową obserwację rozwoju objawów choroby. Te badania przesiewowe ten ujawnił cztery zmutowane linie (zawierające allele rps2-201C, rps2-202C, rps2-203C i rps2204C) i rośliny homozygotyczne pod względem rps2-201C były głównym obiektem dalszych badań (Kunkel i in., (1993), powyżej i niniejsze zgłoszenie).

Wyizolowanie czwartego mutanta, rpslOlN, nie zostało dotąd opublikowane. Ten czwarty izolat jest mutantem, albo podatnym ekotypem Arabidopsis. Nasiona ekotypu Nossen Arabidopsis naproomieniowano promieniami gamma, a następnie gęsto wysiano w płaskich pojemnikach i umożliwiono kiełkowanie i wzrost przez siatkę nylonową. Gdy rośliny osiągnęły pięć do sześciu tygodni, pojemniki odwrócono, rośliny częściowo zanurzono w tacy zawierającej hodowlę Psm ES4326/avr.Rpt2 i rośliny poddawano infiltracji próżniowej w desykatorze próżniowym. U roślin inokulowanych w ten sposób HR rozwijała się w ciągu 24 godzin. Stosując tę procedurę przeszukano około 40 000 roślin i zidentyfikowano jedną podatną roślinę. Późniejsza analiza RFLP tej rośliny sugerowała, że może ona nie być mutantem Nossen, a raczej odrębnym ekotypem Arabidopsis, który jest podatny na Psm ES4326/avr.Rpt2. Roślinę tę oznaczono rps-ΙΟΙΝ. Wyizolowane mutanty rps2-101C, rps2102C, rps2-201C i rps2-101N określa się łącznie jako,,mutanty rps2ⁿ.

Mutanty rps2 wykazują brak specyficznej odpowiedzi na sklonowany gen braku zjadliwości, avrRpt2.

Produkt genu Rps2 jest specyficznie wymagany do odporności na patogeny zawierające gen braku zjadliwości, avrRpt2. Mutacja w polipeptydzie Rps2, która eliminuje lub zmniejsza jego działanie powinna być możliwa do zaobserwowania jako nieobecność odpowiedzi nadwrażliwej po infiltracji patogenem. Mutanty rps2 wykazywały objawy choroby lub brak odpowiedzi po infiltracji Psm ES4326/avrRpt2, Pst DC3000 avrRpt2 lub Psp NPS3121/avrRpt2. Szczegółowo, nie wywoływana była odpowiedź HR, wskazując, że rośliny były podatne i utraciły odporność na patogen pomimo obecności genu avrRpt2 u patogenu.

Wzrost patogenu w liściach zmutowanych roślin rps2 był podobny w obecności i nieobecności genu avrRpt2. Porównano wzrost Psm ES4326 i Psm ES4326/avr.Rpt2 w mutantach rps2 i stwierdzono, źe namnażają się one równie dobrze w mutantach rps2, z tą samą szybkością jak Psm Es4326 namnażał się w liściach Arabidopsis typu dzikiego. Podobne wynik zaobserwowano dla wzrostu Pst DC3000 i Pst DC 3000/avrRpt 2 w mutantach rps2.

Mutanty rps2 wykazywały HR po infiltracji patogenami Pseudomonas zawierającymi inne geny avr, Psm ES4326/avrB, Pst DC3000/avrB, Psm ES4326/avrRpml, Pst DC3000/avrRpml. Zdolność do rozwijania HR na gen avr inny niż avrRpt2 wskazuje, że mutanty rps2 wyizolowane przez selekcję z avrRpt2 są specyficzne wobec avrRpt2.

Mapowanie i klonowanie genu Rps2

Analiza genetyczna mutantów rps2 rps2-101C, rps2-102C, rps-201C i rps-ΙΟΙΝ wykazała, że wszystkie one odpowiadały genom, które ulegały segregacji w sposób oczekiwany dla pojedynczego locus mendlowskiego i że wszystkie cztery były najprawdopodobniej allelami. Cztery mutanty rps zmapowano w dolnej części chromosomu IV z zastosowaniem standardowych procedur mapowania RFLP obejmujących markery oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) (Yu i in., (1993), powyżej; Kunkel i in., (1993), powyżej, oraz Mindrinos, M., nieopublikowane). Analiza segregacji wykazała, że rps2-101C irps2-102C są ściśle

185 748 związane z markerem PCR, PG11, podczas gdy do określenia chromosomalnego położenia mutacji rps2-201C wykorzystano marker RFLP M600 (fig. 1A) (Yu iin., (1993), powyżej; Kunkel iin., (1993), powyżej). W dalszej kolejności Rps2 zmapowano po centromerowej stronie PG11.

Heterozygotyczne rośliny Rps2/rps2 wykazują odpowiedź obronną, która jest pośrednia pomiędzy tymi wykazywanymi przez rośliny typu dzikiego i zmutowane rośliny homozygotyczne rps2/rps2 (Yu, in., (1993), powyżej, oraz Kunkel i in., (1993), powyżej). Rośliny heterozygotyczne rozwijały odpowiedź HR na infiltrację Psm ES4326/avrRpt2 lub Pst DC3000/avr.Rpt2; jednakże, HR pojawiała się później niż u roślin typu dzikiego i wymagała wyższego minimalnego inokulum (Yu, i in., (1993), powyżej oraz Kunkel i in., (1993), powyżej).

Mapowanie z wysoką rozdzielczością genu Rps2 i izolowanie cDNA Rps2.

W celu przeprowadzenia klonowania na podstawie mapy genu Rps2, skrzyżowano rps2101N/rps2-101N zLandsberg erecta Rps2/Rps2. Roślinom pokolenia F] umożliwiono samozapylenie i 165 roślin pokolenia F2; poddano samozapyleniu dla utworzenia rodzin F₃. Standardowe procedury mapowania RFLP wykazały, że rps2-101N mapuje się w pobliżu i po stronie centromeowej markera RFLP, PG11. Dla otrzymania bardziej szczegółowej pozycji na mapie skrzyżowano rps2-101N/rps2-101N ze szczepem Landsberg erecta o dwóch markerach, zawierającym mutacje recesywne cer2 i ap2. Odległość genetyczna między cer2 i ap2 wynosi w przybliżeniu 15 cM, a locus rps2 umiejscowiony jest wewnątrz tego rejonu. Rośliny F2, które wykazywały genotyp CER2 ap2 lub cer2 AP2 zebrano, poddano samozapyleniu i oceniano pod katem .RP52 przez inokulację co najmniej 20 roślin F₃ dla każdego F2 Psm ES4326/avrRpt2. Dla każdej linii F2 przygotowano także DNA z grupy około 20 roślin F₃. Rekombinanty CER2 ap2 i cer2 AP2 użyto do przeprowadzenia „kroczącej” analizy chromosomu, co zilustrowano na figurze 1.

Jak przedstawiono na figurze 1, Rps2 zmapowano w regionie o długości 28-35 kb, ograniczonym przez kosmidowe klony E4-4 i E4-6. Region ten zawiera co najmniej sześć genów, które wytwarzają wykrywalne transkrypty. Nie występowały żadne znaczące różnice w wielkościach transkryptów ani poziomach ich ekspresji u mutantów rps2, jak wykazano przez analizę poprzez bloting RNA. Wyizolowano klony cDNA każdego z tych transkryptów i pięć z nich zsekwencjonowano. Jak opisano poniżej, wykazano, że jeden z tych transkryptów, cDNA-4, odpowiada locus Rps2. W badaniach tych otrzymano trzy niezależne klony cDNA (cDNA-4-4, cDNA-4-5 i cDNA-4-11) odpowiadające Rps2 roślin typu dzikiego ekotypu Columbia. Przybliżone wielkości transkryptów Rps2 wynosiły 3,8 i 3,1 kb, jak wyznaczono przez analizę poprzez bloting RNA.

W oddzielnych badaniach otrzymano czwarty niezależny klon cDNA-4 (cDNA-4-2453) przy zastosowaniu izolacji Rps2 w oparciu o mapę. Wykazano, że klony sztucznego chromosomu drożdży (YAC) zawierajai sąsiadujące, zachodzące na siebie wstawki genomowego DNA Arabidopsis thaliana ekotypu Col-O, z regionu M600 obejmującego około 900 kb w regionie Rps2. Biblioteki YAC Arabidopsis otrzymano od J. Eckera i E. Warda, powyżej i od E. Grilla (Grill i Somerville (1991) Mol. Gen. Genet. 226: 484-490). Ze wstawek YAC otrzymano kosmidy oznaczone „H” i ”E” i użyto ich w izolacji Rps2 (figura 1).

Genetyczne i fizyczne położenie Rps2 wyznaczono dokładniej przy użyciu fizycznie zmapowanych markerów RFLP, RAPD (losowo zamplifikowany polimorficzny DNA) i CAPS (rozszczepiona amplifikowana sekwencja polimorficzna). Do mapowania genetycznego użyto segregujących populacji krzyżówek pomiędzy roślinami o genotypie Rps2/Rps2 (typ dziki No-O) i rps2-201/rps2-201 (tło Col-O). Locus Rps2 zmapowano przy użyciu markerów 17B7LE, PG11, M600 oraz innych markerów. Do mapowania genetycznego z wysokę rozdzielczością utworzono serię ściśle związanych markerów RFLP przy użyciu końcowych fragmentów końcowych wstawki z YAC i klonów kosmidowych (figura 1) (Kunkel iin. (1993), powyżej; Konieczny i Ausubel (1993) Plant J. 4: 403-410; oraz Chang iin. (1988) PNAS USA 85: 6856-6860). Klony kosmidowe E4-4 i E4-6 zastosowano następnie do zidentyfikowania ulegających ekspresji transkryptów (oznaczonych jako cDNA-4, -5, -6, -7 , -8 na fig. 1F) 2 tego regionu, łącznie z klonem cDNA-4-2453.

185 748

Analiza Sekwencji DNA Rps2

Analiza sekwencji cDNA-4 z roślin typu dzikiego Col-0 i mutantów rps2-101C, rps2102C, rps2-201C irps2-101N wykazała, że cDNA-4 odpowiada Rps2. Analiza sekwencji DNArps2-101C, rps2-102C i rps2-201C ujawniła zmiany w stosunku do sekwencji typu dzikiego, jak przedstawiono w tabeli 1. Układ numerowania w tabeli 1 rozpoczyna się przy kodonie start ATG, kodującym pierwszą metioninę, gdzie A jest nukleotydem 1. Analiza sekwencji cDNA-4 odpowiadającego mutantowi rps2-102C wykazała, że różni się ona od sekwencji typu dzikiego resztą aminokwasową w pozycji 476. Ponadto, analiza sekwencji cDNA odpowiadającego cDNA-4 rps2-101N wykazała, że zawiera ona wstawkę o długości 10 bp w pozycji 581 reszty aminokwasowej, w miejscu wewnątrz powtarzalnego regionu bogatego wleucynę, która powoduje przesunięcie ramki odczytu Rps2. Mutant rps2-101C zawiera mutację, która prowadzi do tworzenia kodonu terminacji łańcucha. Sekwencja DNA allelu mutanta rps2-201C ujawniła mutację zmieniające pojedynczy aminokwas wewnątrz odcinka leżącego w regionie LRR, który wykazuje również podobieństwo do motywu helisapętla-helisa, dalej potwierdzając oznaczenie tego locus jako genu Rps2. Sekwencje DNA i aminokwasową przedstawiono na figurze 2 [odpowiednio sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1 i sekwencje o numerach identyfikacyjnych 2-5].

Tabela 1

Mutant	Typ dziki	Pozycja	Zmiana na skutek mutacji
rps2-101C	703 TGA 705	704	Kodon stop TA
rps2-101N	1741 GTG 1743	1741	Wstawka GTGGAGTTGTATG
ips2-102C 476	1426 AGA 1428 arg	1427	AAA, aminokwas lys
rps2-201C	2002 ACC 2004 thr	2002	CCC, aminokwas pro

Analiza sekwencji cDNA-4 odpowiadającego Rps2 roślin typu dzikiego Col-O ujawniła otwartą ramkę odczytu (pomiędzy dwoma kodonami stop) obejmująca 2 751 bp. Pomiędzy kodonem pierwszej metioniny tej ramki odczytu a 3^l-końcowym kodonem stop znajduje się 2 727 bp, co odpowiada przewidywanemu polipeptydowi o długości 909 aminokwasów (patrz otwarta ramka odczytu „a” na fig. 2). Sekwencja aminokwasowa posiada względna masę cząsteczkową 104 460 i pi 6,51.

Rps2 należy do nowej klasy genów oporności na choroby; struktura polipeptydu Rps2 nie przypomina struktury białkowej produktu niedawno sklonowanego i opublikowanego roślinnego geu odporności na choroby specyficznego wobec genu braku zjadliwości, Pto, który posiada przypuszczalną domenę kinazy białkowej. Powyższa analiza przewidywanej sekwencji aminokwasowej wykazała, że RPS2 zawiera szereg odrębnych domen białkowych zachowanych winnych białkach, zarówno organizmów eukariotycznych, jak i prokariotycznych. Domeny te obejmują ale nie ograniczają się do powtórzeń bogatych wleucynę (LRR) (Kobe i Deisenhofer, (1994) Naturę 366: 751-756); pętli P (Saraste i in. (1990) Trends in Biological Sciences TIBS 15: 430-434; helisy-pętli-helisy (Murre iin. (1989) Celi 56: 777-783; i suwaka leucynowegp (Rodrigues i Park (1993) Mol. Celi Biol. 13: 6711-6722). Sekwencja aroinokwasowa Rps2 zawiera motyw LRR od reszty aminokwasowej w pozycji 505 do reszty aminokwasowej w pozycji 867), który obecny jest w wielu znanych białkach i uważa się, że uczestniczy w oddziaływaniach białko-białko, mógłby zatem umożliwiać oddziaływania z innymi białkami, które uczestniczą w oporności roślin na choroby. Nkońcowa część LRR polipeptydu Rps2 jest na przykład zbliżona do LRR cyklazy adenylowej CYR1 drożdży (Saccharomyces cerevlsiae). Region przewidywany jako domena transbłonowa (Klein i in. (1985) Biochim. Biophys. Acta 815: 468-476) położony jest pomiędzy resztami aminokwasowymi w pozycjach od 350 do 365, w kierunku końca N od LRR. Przewiduje

185 748 się, że motyw miejsca więżącego ATP/GTP (pętla P) znajduje się między resztami aminokwasowymi w pozycjach od 177 do 194 włącznie.

Na podstawie powyższej analizy przewidywanej sekwencji aminokwasowej, polipeptyd Rps2 mógłby posiadać strukturę receptora błonowego, który składa się z pozakomórkowego regionu N-końcowego i cytoplazmatycznego regionu C-końcowego. Alternatywnie, topologia Rps2 mogłaby być odwrotna: N-koricowy region cytoplazmatyczny i C-koricowy region pozakomórkowy. Motywy LRR sę w wielu przypadkach pozakomórkowe, a LRR Rps2 zawiera pięć potencjalnych miejsc N-glikozylacji.

Identyfikacja Rps2 przez komplementację funkcjonalną

Komplementacja homozygot rps2-201 genomowym DNA odpowiadającym Arabidopsis thaliana potwierdziła funkcjonalnie, że region genomowy kodujący cDNA-4 zawiera aktywność Rps2. Skonstruowano kosmidy, które zawierały zachodzące na siebie, sąsiadujące sekwencje DNA Arabidopsis thaliana typu dzikiego z regionu Rps2, zawartego wYAC EW11D4, EW9C3 i YUP11F1 na fig. 1 i fig. 4 zpSU4541 (otrzymanego od J. Jonesa, Sainsbury Institute, Norwich, Anglia) skonstruowano wektory kosmidowe zawierającego sekwencje umożliwiające integrację sekwencji wstawionej z genomem rośliny poprzez transformację zależną od Agrobacterium (oznaczony jako „kosmid bifunkcjonalny”). Kosmidy „H” i ”E” (fig. 1) zastosowano do identyfikacji klonów zawierających DNA zgenomowego regionu Rps2 Arabidopsis thaliana.

Do stransformowania mutantów homozygotycznych rps2-201 przy zastosowaniu transformacji zależnej od Agrobacterium, użyto ponad czterdziestu kosmidów bifunkcjonalnych zawierających wstawiony DNA regionu Rps2 (Chang i wsp. (1990) str. 28, Abstracts of the Fourth International Conference on Arabidopsis Research, Wiedeń, Austria). Transformanty, które pozostały podatne (wyznaczone metodami obejmującymi obserwowany brak silnej super wrażliwej odpowiedzi HR po infekcji szczepem 3121 P. syringae pv. phaseolicola, zawierającym avrRpt2 i Psp 3121 bez avrRpt2) wskazywały, że wstawiony DNA nie zawierał funkcjonalnego Rps2. Kosmidy te nadawały fenotyp „Pod.” czyli podatny wskazany na fig 4. Transformanty, które posiadały nabytą oporność na chorobę specyficzną wobec avrRpt2 (wyznaczone metodami obejmującymi wykazywanie silnej odpowiedzi nadwrażliwej (HR) po inokulacji Psp 3121 z vrRpt2, lecz nie po inokulacji Psp 3121 bez avrRpt2) sugerowały, że wstawiony DNA zawierał funkcjonalny gen Rps2 zdolny do nadawania fenotypu „Odp.”, czyli opornego, wskazanego na fig. 4. Transformanty otrzymane przy użyciu kosmidu bifunkcjonalnego pD4 wykazywały fenotyp silnej odporności, jak opisano powyżej. Obecność wstawionego DNA u transformantów potwierdzono przez klasyczną analizę genetyczną (ścisły związek genetyczny fenotypu odporności na chorobę i fenotypu oporności na kanamycynę, nadawanego przez ulegający kotrans formacji marker selekcyjny) i analizę Southema. Wyniki te wskazywały, że Rps2 kodowany jest przez odcinek regionu genomowego Arabidopsis thaliana o długości 18 kb, zawarty w kosmidzie pD4 (fig. 4).

Dla dalszego zlokalizowania locus Rps2 i potwierdzenia jego zdolności do nadawania fenotypu odporności u mutantów homozygotycznych rps2-201, badano zestaw sześciu kosmidów bifunkcjonalnych zawierających częściowo zachodzące na siebie wstawki genomowego DNA. Zachodzące na siebie wstawki pD2, pD4, pD14, pD15, pD27 i pD47 wybrano na podstawie miejsca transkrypcji odpowiadającego pięciu klonom cDNA w regionie Rps2 (fig. 4). W tych doświadczeniach transformacji zastosowano procedurę infiltracji próżniowej (Bechtold i in. (1993) C.R. Acad. Sci. Paris 316: 1194-1199) do transformacji zależnej od Agrobacterium. Zależne od Agrobacterium transformacje kosmidami pD2, pD14, pD15, pD39 i pD46 przeprowadzono przy użyciu protokołu transformacji/regeneracji korzeni (Valveekens i in. (1988), PNAS 85: 5536-5540). Wyniki doświadczeń inokulacji patogenem z oznaczaniem aktywności Rps2 u tych transformantów przedstawiono na fig. 4.

W dodatkowych doświadczeniach transformacji zastosowano kosmidy bifunkcjonalne zawierajęce cały region kodujący oraz odcinek o długości ponad 1 kb leżący przed regionem kodującym sekwencji genomowej tylko dla cDNA-4 lub cDNA-6. Stosując metodę transformacji przez infiltrację próżniową otrzymano trzy niezależne transformanty, które zawierały region genomowy cDNA-6 typu dzikiego w tle homozygoty rps2-201c (pAD431 na fig. 4).

185 748

Żadna z tych roślin nie wykazywała zależnej od avrRpt2 odporności na chorobę. Homozygotyczne mutanty rps2-201c stransformowano genomowym cDNA-4 typu dzikiego (p4104 i p4115, każdy zawierający sekwencje genomowe Col-0 odpowiadające całej otwartej ramce odczytu cDNA-4 plus około 1,7 kb sekwencji 5'-końcowej sekwencji leżącej wcześniej i około 0,3 kb sekwencji 3'-końcowej leżącej za kodonem stop). Te transformanty p4104 i p4115 wykazywały fenotyp odporności na chorobę podobny do homozygot Rps2 typu dzikiego, z których otrzymano rps2. Dodatkowe mutanty (homozygoty rps2-101N i rps2-101C) także wykazywały odporność zależna od avrRpt2 po stransfonnowaniu regionu genomowego cDNA-4.

Sekwencje Rps2 umożliwiają wykrywanie innych genów odporności.

Analiza przez bloting genomowego DNA Arabidopsis thaliana przy użyciu cDNA Rps2 jako sondy wykazała, że Arabidopsis zawiera szereg sekwencji DNA, które hybrydyzują z Rps2 lub z jego częścią, sugerując że w genomie Arabidopsis istnieje szereg zbliżonych genów.

Na podstawie powyższego opisu i sekwencji kwasu nukleinowego [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1] przedstawionej na fig. 2, możliwe jest wyizolowanie innych genów odporności na choroby roślin, posiadających około 50% lub wyższą identyczność sekwencji z genem Rps2. Wykrywanie i izolację można przeprowadzić za pomocą sondy oligonukleotydowej zawierającej gen Rps2 lub jego część, o długości większej niż około 18 nukleotydów. Korzystne są sondy wobec sekwencji kodujących swoiste cechy strukturalne polipeptydu Rps2 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 2-5], ponieważ zapewniają one sposób izolacji genów odporności na choroby posiadających podobne domeny strukturalne. Hybrydyzacji można dokonywać przy użyciu standardowych technik, takich jak opisane przez Ausubela i in., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1989).

Na przykład, wysoce surowe warunki wykrywania genu Rps2 obejmują hybrydyzację w temperaturze około 42°C i w około 50% formamidzie; pierwsze płukanie w temperaturze około 65°C, wokoło 2X SSC i 1% SDS; następnie drugie płukanie w temperaturze około 65°C i w około 0,1% SSC. Łagodniejsze warunki wykrywania genów Rps posiadających sekwencje o około 50% identyczności z genem Rps2 wykrywań się przez, na przykład, hybrydyzację w temperaturze około 42°C w nieobecności formamidu; pierwsze płukanie w temperaturze około 42°C, wokoło 6X SSC i około 1% SDS; i drugie płukanie w temperaturze około 50°C, wokoło 6X SSC i około 1% SDS. Jako sondy w powyższym przykładzie użyto sondy DNA o długości około 350 nukleotydów, kodującej środkową część regionu LRR Rps2. W łagodniejszych warunkach wykryto co najmniej 5 prążków DNA w genomowym DNA Arabidopsis thaliana strawionym BarnHI, jako sekwencje posiadające wystarczającą identyczność do hybrydyzowania z DNA kodującym środkową część motywu LRR Rps2. Podobne wyniki uzyskano przy użyciu sondy zawierającej część genu Rps2 o długości 300 nukleotydów, kodującej skrajny koniec N Rps2 za motywem LRR.

Izolację innych genów odporności na choroby przeprowadza się za pomocą technik amplifikacji PCR, dobrze znanych specjalistom w dziedzinie biologii molekularnej, przy użyciu starterów oligonukleotydowych zaprojektowanych do amplifikowania tylko sekwencji flankowanych oligonukleotydami w genach wykazujących identyczność sekwencji z Rps2. Ewentualnie startery projektuje się dla umożliwienia sklonowania zamplifikowanego produktu w odpowiednim wektorze.

Ekspresja Rps2 w transaenicznych komórkach roślinnych i roślinach.

Ekspresję genu Rps2 w roślinach podatnych na patogeny zawierające avrRpt2 uzyskuje się przez wprowadzenie do rośliny sekwencji DNA zawierającej gen Rps2 dla ekspresji polipeptydu Rps2. Powszechnie dostępnych jest wiele wektorów odpowiednich do stabilnej transfekcji komórek roślinnych lub do ustalenia roślin transgenicznych; wektory takie opisano na przykład w Pouwels i in., Cloning Vectors: A Laboratory Manuał, 1985, Supp. 1987); Weissbach i Weissbach, Methods for Plant Molecular- Biology, Academic Press, 1989; oraz Gelvin iin.. Plant Molecular Biology Manuał, Kluwer Academic Publishers, 1990. Zazwyczaj roślinne wektory ekspresyjne zawierają (1) jeden lub więcej sklonowanych genów roślinnych pod kontrolą transkrypcyjną 5'- i 3 -końcowych sekwencji regulujących i (2) dominujący

185 748 marker selekcyjny. Jeśli jest to pożądane, takie roślinne wektory ekspresyjne mogą także zawierać promotorowy region regulujący (na przykład region regulujący kontrolujący ekspresję indukowaną lub konstytutywną regulowaną czynnikami środowiskowymi lub etapem rozwoju, bądź specyficzną komórkowe lub tkankowo), miejsce inicjacji początku transkrypcji, miejsce wiązania rybosomów, sygnał modyfikacji RNA, miejsce terminacji transkrypcji i/lub sygnał poliadenylacji.

Przykładem użytecznego promotora roślinnego, który można stosować do ekspresji roślinnego genu odporności według wynalazku jest promotor wirusa kalafiora, na przykład promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV). Promotory te zapewniają wysoki poziom ekspresji w większości tkanek roślinnych, a ich aktywność nie jest zależna od białek kodowanych przez wirusa. CaMV jest źródłem promotorów 35S i 19S. W większości tkanek roślin transgenicznych promotor 35S CaMV jest silnym promotorem (patrz na przykład Odel i in., Naturę 313: 810, (1985)). Promotor CaMV wykazuje także wysoką aktywność w roślinach jednoliściennych (patrz na przykład Dekeyser iin.. Plant Celi 2: 591, (1990); Terada i Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220: 389, (1990)).

Inne użyteczne promotory roślinne obejmują lecz nie ograniczają się, do promotora syntazy nopalinowej (An i in., Plant Physiol. 88: 547, (1988)) i promotora syntazy oktopinowej (Fromm i in.. Plant Celi 1: 977, (1989)).

Do pewnych zastosowań mogłoby być pożądane wytworzenie produktu genu Rps2 lub produktu genu avrRpt2 w odpowiedniej tkance, na odpowiednim poziomie lub w odpowiednim okresie rozwojowym. A zatem, istnieją różne promotory genów, każdy o swoich własnych, odrębnych własnościach określanych przez jego sekwencje regulujące, dla których wykazano, że podlegają w odpowiedzi na czynniki środowiskowe, hormonalne i/lub rozwojowe. Obejmują one promotory genów, które są odpowiedzialne za (1) ekspresję genów regulowaną przez temperaturę (patrz na przykład Callis i in.. Plant Physiol. 88: 965, (1988)), (2) ekspresję genów regulowaną przez światło (na przykład rbcS-3A grochu opisany przez Kuhlemeiera i in., Plant Celi 1: 471, (1989); promotor rbcS kukurydzy opisany przez Schaffhera i Sheeną Plant Celi 3: 997, (1991); lub występujący u grochu promotor genu białka wiążącego chlorfil a/b, opisany przez Simpsona i in., EMBO J. 4: 2723, (1985)), (3) ekspresję genów regulowaną przez hormony (na przykład sekwencje odpowiadające na kwas abscysynowy z genu Em pszenicy opisane przez Marcotte i in., Plant Celi 1; 969, (1989)), (4) ekspresję genów indukowane przez zranienie (na przykład genu wunl, opisany przez Siebertza i in.. Plant Celi 1: 961, (1989)), lub (5) ekspresję genów specyficzną dla organu (na przykład genu białka zapasowego swoistego dla bulw, opisany przez Roshala i in., EMBO J. 6: 1155, (1987); genu zeiny 23-kDa kukurydzy, opisany przez Schemthanera i in., EMBO J. 7: 1249, (1988); lub genu β-fazeoliny fasoli odmiany French opisany przez Bustosa i in.. Plant Celi 1: 839,(1989)).

Wektory ekspresyjne roślin mogą także ewentualnie zawierać sygnały modyfikacji RNA, na przykład introny, dla których stwierdzono, że są istotne dla sprawnej syntezy i gromadzenia RNA (Callis i in., Genes and Dev. 1: 1183, (1987)). Położenie sekwencji rozszczepiania RNA może wpływać na poziom ekspresji transgenu w roślinach. W świetle tego faktu, intron może być umiejscowiony przed lub za sekwencją kodującą polipeptyd Rps2 w transgenie dla modulowania poziomu ekspresji genu.

Poza wymienionymi powyżej 5'-końcowych kontrolnych sekwencji regulujących, wektory ekspresyjne mogą także zawierać kontrolne regiony regulujące, które sę zwykle obecne w regionach 3-końcowych genów roślinnych (Thomburg i in., Proc. Natl Acad. Sci. USA 84: 744, (1987); An i in.. Plant Celi 1: 115, (1989)). Na przykład region 3'-końcowy region terminacji może być włączony do wektora ekspresyjnego dla zwiększenia stabilności mRNA. Jeden taki region terminacji można otrzymać z regionu terminacji ΡΙ-Π ziemniaka. Ponadto inne używane powszechnie sygnały terminacji pochodzą z sygnałów syntazy oktopinowej lub nopalinowej.

Roślinny wektor ekspresyjny zawiera zwykle także gen dominującego markera selekcyjnego używanego do identyfikacji komórek, które zostały stransfonnowane. Użyteczne geny markerów selekcyjnych dla układów roślinnych obejmują geny kodujące geny oporności

185 748 na antybiotyki, na przykład te kodujące oporność na higromycynę, kanamycynę, bleomycynę, G418, streptomycynę lub spektynomycynę. U szczepów pozbawionych zdolności do fotosyntezy jako markery selekcyjne można także stosować geny wymagane do fotosyntezy. Ostatecznie, jako markery selekcyjne można stosować geny kodujące oporność na herbicydy; użyteczne geny oporności na herbicydy obejmują gen bar kodujący enzym acetylotransferazę fosfinotrycynową, który nadaje oporność herbicyd o szerokim spektrum działania Basta® (Hoechst AG, Frankfurt, Niemcy).

Efektywne użycie markerów selekcyjnych ułatwia określenie podastności komórki roślinnej na określony czynnik selekcyjny i oznaczenie stężenia tego czynnika, które skutecznie zabija większość, jeśli nie wszystkie stransformowane komórki. Pewne użyteczne stężenia antybiotyków do transformacji tytoniu wynoszą na przykład 75-100 pgml (kanamycyna), 2050 pg/ml (higromycyna) lub 5-10 pg/ml (bleomycyna). Użyteczną strategię selekcji transformantów pod kątem oporności na herbicydy opisano na przykład w Vasil I.K., Celi Culture and Somatic Celi Genetics ot Plants, tom I, II, III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, Nowy Jork, 1984.

Dla specjalisty w dziedzinie biologii molekularnej roślin powinno być łatwo zrozumiałe, że poziom ekspresji genu zależny nie tylko od kombinacji promotorów, sygnałów modyfikacji RNA i elementów terminacji, lecz także od tego, jak elementów tych użyto do zwiększenia poziomu ekspresji genu.

Transformacja roślin

Znanych jest szereg standardowych metod wprowadzania zrekombinowanego materiału genetycznego do gospodarzy roślinnych po skonstruowaniu roślinnego wektora ekspresyjnego dla utworzenia rośliny transgenicznej. Metody te obejmują (1) transformację zależne od Agrobacterium (A. tumefaciens lub A. rhizogenes) (patrz np. Lichtenstein i Fuller, w: Genetic Engineering, tom 6, PWJ Rigby, red., Londyn, Academic Press, 1987 oraz Lichtenstein, C. P. i Draper, J., w: DNA Cloning, tom II, D.M. Glover, red, Oxford, IRI Press, 1985), (2) układ wprowadzania cząstek (patrz np. Gordon-Kamm i in., Plant Celi 2: 603, (1990); lub BioRad Technical Bulletin 1987, powyżej), (3) protokoły mikroiniekcji (patrz np. Green iin., Plant Tlssue and Celi Culture, Academic Press, Nowy Jork, 1987), (4) procedury z zastosowaniem glikolu polietylenowego (PEG) (patrz np. Draper i in.. Plant Celi Physiol.23: 451, (1982) np. Zhang i Wu, Theor. Appl. Genet. 76: 835, (1988)), (5) wprowadzanie DNA za pośrednictwem liposomów (patrz np. Freeman i in., Plant Celi Physiol. 25: 1353, (1984)), (6) protokoły elektroporacji (patrz np. Gelvin i in., powyżej; Dekeyser i in., powyżej lub Fromm i in., Naturę 319: 791, (1986)) i (7) metodę wytrząsania (patrz np. Kindle, K., Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:1228,(1990)). ’

Poniżej przedstawiono przykład transformacji roślin zależnej od Agrobacterium. Generalny proces manipulowania genami mającemu ulec przeniesieniu do genomu komórek roślinnych przeprowadza się w dwóch fazach. Po pierwsze, wszystkie etapy klonowania i modyfikacji DNA przeprowadza się w E. coli, a plazmid zawierający konstrukcję genu będącego przedmiotem zainteresowania przenosi się przez konjugację do Agrobacterium. Po drugie, otrzymany szczep Agrobacterium stosuje się do transformowania komórek roślinnych. A zatem, w przypadku ogólnego roślinnego wektora ekspresyjnego plazmid zawiera miejsce początku replikacji, co umożliwia mu replikację w Agrobacterium, i wysoką liczbę kopii miejsca początku replikacji działającego w E. coli. Umożliwia to łatwe wytwarzanie i badanie transgenów w E. coli przed przeniesieniem do Agrobacterium dla dalszego wprowadzenia do roślin. Geny oporności mogą znajdować się w wektorze, jeden do selekcji w bakteriach, na przykład na streptomycynę, i inne, które będą ulegały ekspresji u roślin, na przykład gen kodujący oporność na kanamycynę lub gen oporności na herbicydy. Obecne są także miejsca endonukleazy restrykcyjnej dla dodania jednego lub więcej transgenów poleczonych w sposób umożliwiający działanie z odpowiednimi sekwencjami regulującymi i graniczne sekwencje kierunkowego T-DNA które, kiedy są rozpoznane przez funkcje transferowe Agrobacterium, wytyczają region, który będzie przeniesiony do rośliny.

W innym przykładzie komórki roślinne można transformowane przez wstrzelenie do komórki mikropocisków wolframowych, na których osadzono sklonowany DNA. W Biolistic

185 748

Apparatus (BioRad, Hercules, CA) użytym do strzelania, ładunek prochu strzelniczego (Power Piston Tool Charge kaliber 22) lub strumień powietrza prowadzi plastikowy makropocisk poprzez lufę. Porcję zawiesiny cząstek wolframu, na których wytrącono DNA, umieszcza się z przodu plastikowego makropocisku. Ten ostatni strzela w akrylową płytkę zatrzymującą, która posiada otwór za mały do przejścia makropocisku. W wyniku tego, plastikowy makropocisk rozpada się przy zderzeniu z płytkę zatrzymującą, a mikropociski wolframowe podążają dalej do celu poprzez otwór w płytce. Dla niniejszego wynalazku celem może być jakakolwiek komórka roślinna, tkanka, nasiono lub zarodek. DNA wprowadzony do komórki na mikropociskach zostaje zintegrowany w jądrze lub w chloroplaście.

Transfer i ekspresja transgenów w komórkach roślinnych jest obecnie praktyką rutynową dla specjalistów w tej dziedzinie. Stała się ona głównym narzędziem do przeprowadzania badań nad ekspresją genów i w próbach otrzymania ulepszonych odmian roślin, korzystnych dla rolnictwa i handlu.

Regeneracja roślin transgenicznych

Komórki roślinne stransformowane roślinnym wektorem ekspresyjnym można regenerować, na przykład z pojedynczych komórek, tkanki kalusa lub krążków liści, zgodnie ze standardowymi technikami hodowli tkanki roślinnej. Wiadomo dobrze w nauce, że różne komórki, tkanki i narządy niemal wszystkich roślin można z powodzeniem hodować w celu regeneracji całej rośliny; takie techniki opisali na przykład Vasil, powyżej; Green i in., powyżej; Weissbach i Weissbach, powyżej; i Gelvin i in., powyżej.

W jednym z możliwych przykładów, wektor niosący gen markera selekcyjnego (na przykład oporności na kanamycynę), sklonowany gen Rps2 pod kontrola swego własnego promotora i sekwencji terminacji, lub jeśli to pożądane, pod kontrolę egzogennych sekwencji regulujących, takich jak promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora i sekwencja terminacji syntazy nopaliny, transformuje się do Agrobacterium. Transformację tkanki liściowej za pomocą Agrobacterium zawierających wektor przeprowadza się jak opisali Horsch i in. (Science 227: 1229, (1985)). Przypuszczalne transfonnanty selekcjonuje się po kilku tygodniach (na przykład 3 do 5 tygodni) na podłożach do hodowli tkanek roślinnych zawierających kanamycynę (na przykład 100 pg/ml). Pędy oporne na kanamycynę umieszcza się następnie na podłożach do hodowli tkanek roślinnych bez hormonów, aby wypuściły korzenie. Rośliny oporne na kanamycynę selekcjonuje się następnie do wzrostu w szklarni. Jeśli to pożądane, nasiona od samozapylających się roślin transgenicznych mogę być potem wysiewane na podłoża bezglebowe i hodowane w szklarni. Potomstwo oporne na kanamycynę selekcjonuje się przez wysiewanie powierzchniowo wyjałowionych nasion na wolne od hormonów podłoża zawierające kanamycynę. Analizy integracji transgenu dokonuje się za pomoce standardowych technik (zobacz na przykład Ausubel i in., powyżej; Gelvin i in., powyżej).

Rośliny transgeniczne, w których zachodzi ekspresja markera selekcyjnego przeszukuje się następnie pod kątem przenoszenia DNA transgenu za pomocą standardowych technik immunoblotingu i wykrywania DNA i RN A. Każda dodatnia roślina transgeniczna i jej transgeniczne potomstwo są unikalne w porównaniu z innymi roślinami transgenicznymi otrzymanymi przez przeniesienie tego samego transgenu. Integracja DNA transgenu do genomowego DNA rośliny jest w większości przypadków losowa, a miejsce integracji może znacznie wpływać na poziomy oraz wzory ekspresji tkankowej i rozwojowej transgenu.

Linie transgeniczne ocenia się pod względem poziomu ekspresji transgenu. Na początku wyznacza się ekspresję na poziomie RNA dla zidentyfikowania i policzenia roślin, w których zachodzi ekspresja. Stosuje się standardowe techniki analizy RNA obejmujące oznaczenia przez amplifikację techniką PCR przy użyciu starterów oligonukleotydowych zaprojektowanych do amplifikowania tylko matryc transgenowego RNA i oznaczenia przez hybrydyzację w roztworze przy użyciu sond specyficznych dla transgenu (zobacz na przykład Ausubel i in., powyżej). Rośliny RNA-dodatnie analizuje się następnie pod względem ekspresji białek za pomocą immmunoblotingu Western przy użyciu przeciwciał specyficznych dla polipeptydu Rps2 (zobacz na przykład Ausubel i in., powyżej). Ponadto, można przeprowadzić hybrydyzację in situ i oznaczenia immunocytochemiczne zgodnie ze standardowymi protokołami przy

185 748 użyciu, odpowiednio, sond nukleotydowych i przeciwciał specyficznych dla transgenu, dla zlokalizowania miejsc ekspresji w tkance transgenicznej.

Jeśli polipeptyd Rps2 ulega ekspresji w jakiejkolwiek komórce lub roślinie transgenicznej (na przykład jak opisano powyżej), można go wyizolować przy użyciu standardowych technik, na przykład chromatografii powinowactwa. W jednym przykładzie, przeciwciało skierowane przeciw Rps2 (na przykład utworzone jak opisano w Ausubel i in., powyżej lub jakąkolwiek techniką standardową) można związać z kolumną i użyć do izolacji połipeptydu. Przed chromatografię powinowactwa można przeprowadzić lizę i frakcjonowanie komórek wytwarzających Rps2 z zastosowaniem standardowych metod (zobacz na przykład Ausubel i in., powyżej). Po wyizolowaniu polipeptyd rekombinacyjny można, jeśli to pożądane, dalej oczyszczany, na przykład za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (zobacz na przykład Fisher, Laboratory Techniąues In Biochemistry And. Molecular Biology, red. Work i Burdon, Elsevier, 1980).

Te ogólne techniki ekspresji i oczyszczania połipeptydu można także stosować do wytwarzania i izolacji użytecznych fragmentów lub analogów Rps2.

Zastosowanie

Wprowadzenie Rps2 do stransformowanej komórki roślinnej zapewnia oporność na patogeny bakteryjne posiadające gen braku zjadliwości avrRpt2. Na przykład rośliny transgeniczne według tego wynalazku, w których zachodzi ekspresja RPS2 mogłyby być użyte aby zmienić, prosto i niedrogo, odporność na choroby roślin normalnie podatnych na patogeny roślinne posiadające gen braku zjadliwości avrRpt2.

Wynalazek zapewnia także odporność na szerokie spektrum patogenów poprzez naśladowanie naturalnego mechanizmu odporności gospodarza. Po pierwsze, transgen Rps2, ulega ekspresji w komórkach roślinnych na odpowiednio wysokim poziomie do zapoczątkowania konstytutywnej odpowiedzi obronnej rośliny przy nieobecności sygnałów od patogenu. Poziom ekspresji związanej z zapoczątkowaniem odpowiedzi obronnej rośliny wyznacza się przez mierzenie poziomu ekspresji genu odpowiedzi obronnej jak opisali Dong i in., powyżej. Po drugie, ekspresja transgenu Rps2 jest kierowana przez podlegający kontroli promotor, taki jak promotor specyficzny wobec tkanki, promotor specyficzny wobec typu komórki lub przez promotor, który jest indukowany przez zewnętrzny sygnał lub czynnik, ograniczając przez to chwilową i tkankową ekspresję odpowiedzi obronnej. Wreszcie, produkt genu Rps2, ulega koekspresji z produktem genu avrRpt2. Ekspresja genu Rps2 jest kierowana przez jego naturalny promotor, przez promotor, którego ekspresja jest konstytutywna, taki jak promotor S35 wirusa mozaiki kalafiora, przez promotor specyficzny wobec tkanki łub typu komórki albo przez promotor, który jest aktywowany przez zewnętrzny sygnał lub czynnik. Koekspresja Rps2 i avrRpt2 będzie naśladować wytwarzanie produktów genów związanych z zapoczątkowaniem odpowiedzi obronnej rośliny i zapewni odporność na patogeny przy nieobecności swoistych, odpowiadających sobie par gen odpomości-gen braku zjadliwości w gospodarzu roślinnym i patogenie.

Wynalazek zapewnia także ekspresję w komórkach roślinnych kwasu nukleinowego posiadającego sekwencję [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1] przedstawiona na fig. 2 lub ekspresję jego zdegenerowanego wariantu kodującego sekwencję aminokwasową [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 2-5] otwartej ramki odczytu „a” przedstawioną na fig. 2.

Wynalazek zapewnia ponadto izolację sekwencji kwasu nukleinowego posiadających około 50% lub większa identyczność sekwencji z Rps2 poprzez użycie sekwencji Rps2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1] przedstawionej na fig. 2 lub jego części o długości większej niż około 18 nukleotydów jako sondy. W celu izolacji sekwencji DNA posiadających około 50% lub większą identyczność sekwencji z sekwencją Rps2 [sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1] przedstawioną na figurze 2, stosuje się odpowiednie łagodniejsze warunki hybrydyzacji.

Wynalazek zapewnia roślinom odporność na choroby, szczególnie roślinom uprawnym, a zwłaszcza istotnym roślinom uprawnym takim jak ziemniak, pieprz, kukurydza, pszenica, ryż i roślinom strączkowym, takim jak soja i fasolą albo jakiejkolwiek roślinie, która jest podatna

185 748 na patogeny zawierające gen braku zjadliwości, na przykład gen braku zjadliwości avrRpt2. Patogeny takie obejmują lecz nie są ograniczone do szczepów Pseudomonas syringae.

Wynalazek obejmuje również każdy aktywny biologicznie fragment lub analog polipeptydu Rps2. Przez „aktywny biologicznie” rozumie się posiadanie jakiejkolwiek aktywności in vivo, która jest charakterystyczna dla polipeptydu Rps2 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 2-5] przedstawione na fig. 2. Użytecznym fragmentem Rps2 lub analogiem Rps2 jest taki, który wykazuje aktywność biologiczną w jakimkolwiek teście biologicznym na aktywność produktu genu odporności na choroby, na przykład testach opisanych przez Dong i in. (1991), powyżej; Yu i in. (1993), powyżej; Kunkel i in. (1993), powyżej; i Whalen i in. (1991). W szczególności, aktywny biologicznie fragment lub analog polipeptydu Rps2 zdolny jest do zapewnienia istotnej odporności na patogeny roślinne posiadające gen braku zjadliwości avrRpt2. Przez „istotną odporność” rozumie się przynajmniej częściową redukcję podatności na patogeny roślinne mające gen avrRpt2.

Preferowane analogi obejmują polipeptydy Rps2 (lub ich fragmenty aktywne biologicznie), których sekwencje różnią się od sekwencji typu dzikiego tylko konserwatywnymi podstawieniami aminokwasów, na przykład, podstawieniem jednego aminokwasu na inny o podobnych własnościach (na przykład walina na glicynę, arginina na lizynę itd.) albo jednym lub więcej niekonserwatywnymi podstawieniami, delecjami lub insercjami aminokwasów, które nie znoszą aktywności biologicznej polipeptydu.

Analogi mogą się różnić od występującego w naturze polipeptydu Rps2 pod względem sekwencji aminokwasowej lub mogą być zmodyfikowane w sposób nie dotyczący sekwencji, albo pod oboma względami. Analogi według wynalazku będą generalnie wykazywać co najmniej 70%, korzystnie 80%, korzystniej 90%, a najkorzystniej 95% lub nawet 99% homologii z segmentem o długości 20 reszt aminokwasowych, korzystnie 40 reszt aminokwasowych lub korzystniej z całą sekwencją występującego naturalnie polipeptydu Rps2 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 2-5].

Zmiany w sekwencji pierwszorzędowej obejmuję warianty genetyczne, zarówno naturalne jak i indukowane. Włącza się także analogi, które zawierają reszty inne niż występujące naturalnie L-aminokwasy, na przykład D-aminokwasy albo aminokwasy nie występujące w przyrodzie lub syntetyczne, na przykład aminokwasy β lub Y. Wynalazek obejmuje także polipeptydy Rps2 zmodyfikowane przez chemiczną otrzymywanie pochodnych polipeptydów in vivo, włącznie z acetylacją, metylacją, fosforylacją, karboksylacjąlub glikozylacją.

Poza polipeptydami o zasadniczo pełnej długości, wynalazek obejmuje również biologicznie fragmenty polipeptydów. W znaczeniu tu stosowanym, termin „fragment”, gdy dotyczy polipeptydu, będzie zwykle miał długość co najmniej 20 reszt aminokwasowych, częściej co najmniej 40 reszt, a korzystnie co najmniej 60 reszt. Fragmenty polipeptydu Rps2 można tworzyć metodami znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Zdolność kandydującego fragmentu do wykazywania aktywności biologicznej Rps2 można oznaczać opisanymi tu metodami. Wynalazek obejmuje także polipeptydy Rps2 zawierające reszty, które nie są wymagane dla aktywności biologicznej peptydu, na przykład te dodane przez alternatywne wycinanie/składanie roRNA lub alternatywne zjawiska modyfikacji białka.

Inne rozwiązania objęte są poniższymi zastrzeżeniami.

185 748

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Ausubel, Frederick M. Staskawicz, Brian J. Brent, Andrew F. Dahlbeck, Douglas Katagiri, Fumiaki Kunkel, Barbara N. Mindrinos, Michael N. Yu, Guo-Liang (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: GEN RPS2 I JEGO ZASTOSOWANIA (iii) LICZBĄ SEKWENCJI: 106 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Fish & Richardson (B) ULICA: 225 Franklin Street Suitę 3100 (C) MIASTO: Boston (D) STAN: MA (E) KRAJ: STANY ZJEDNOCZONE AMERYKI (F) KOD POCZTOWY: 02110-2904 (v) ZAPIS KOMPUTEROWY:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: PC kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, werja #1.30B (vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA: (A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/227,360 (B) DATA ZŁOŻENIA: 13 kwietnial994 (C) KLASYFIKACJA:

(viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:

(A) NAZWISKO: Clark, Paul T.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 30 162 (C) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁYWAĆ/NUMER W REJESTRZE: 00786/230001 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: (617) 542-5070 (B) TELEFAX: (617) 542-8906 (C) TELEX: 100254

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2903 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1: AAGTAAAAGA AAGAGCGAGA AATCATCGAA ATGGATTTCA TCTCATCTCT TATCGTTGGC60

TGTGCTCAGG TGTTGTGTGA ATCTATGAAT ATGGCGGAGA GAAGAGGACA TAAGACTGAT120

CTTAGACAAG CCATCACTGA TCTTGAAACA GCCATCGGTG ACTTGAAGGC CATACGTGAT180

GACCTGACTT TACGGATCCA ACAAGACGGT CTAGAGGGAC GAAGCTGCTC AAATCGTGCC240

AGAGAGTGGC TTAGTGCGGT GCAAGTAACG GAGACTAAAA CAGCCCTACT TTTAGTGAGG300

TTTAGGCGTC GGGAACAGAG GACGCGAATG AGGAGGAGAT ACCTCAGTTG TTTCGGTTGT360

GCCGACTACA AACTGTGCAA GAAGGTTTCT GCCATATTGA AGAGCATTGG TGAGCTGAGA420

GAACGCTCTG AAGCTATCAA AACAGATGGC GGGTCAATTC AAGTAACTTG TAGAGAGATA480

CCCATCAAGT CCGTTGTCGG AAATACCACG ATGATGGAAC AGGTTTTGGA ATTTCTCAGT540

GAAGAAGAAG AAAGAGGAAT CATTGGTGTT TATGGACCTG GTGGGGTTGG GAAGACAACG600

TTAATGCAGA GCATTAACAA CGAGCTGATC ACAAAAGGAC ATCAGTATGA TGTACTGATT660

TGGGTTCAAA TGTCCAGAGA ATTCGGCGAG TGTACAATTC AGCAAGCCGT TGGAGCACGG720

TTGGGTTTAT CTTGGGACGA GAAGGAGACC GGCGAAAACA GAGCTTTGAA GATATACAGA780

GCTTTGAGAC AGAAACGTTT CTTGTTGTTG CTAGATGATG TCTGGGAAGA GATAGACTTG840

GAGAAAACTG GAGTTCCTCG ACCTGACAGG GAAAACAAAT GCAAGGTGAT GTTCACGACA900

CGGTCTATAG CATTATGCAA CAATATGGGT GCGGAATACA AGTTGAGAGT GGAGTTTCTG960

GAGAAGAAAC ACGCGTGGGA GCTGTTCTGT AGTAAGGTAT GGAGAAAAGA TCTTTTAGAG1020

TCATCATCAA TTCGCCGGCT CGCGGAGATT ATAGTGAGTA AATGTGGAGG ATTGCCACTA1080

GCGTTGATCA CTTTAGGAGG AGCCATGGCT CATAGAGAGA CAGAAGAAGA GTGGATCCAT1140

GCTAGTGAAG TTCTGACTAG ATTTCCAGCA GAGATGAAGG GTATGAACTA TGTATTTGCC1200

185 748

CTTTTGAAAT	TCAGCTACGA	CAACCTCGAG	AGTGATCTGC	TTCGGTCTTG	TTTCTTGTAC	1260
TGCGCTTTAT	TCCCAGAAGA	ACATTCTATA	GAGATCGAGC	AGCTTGTTGA	GTACTGGGTC	1320
GGCGAAGGGT	TTCTCACCAG	CTCCCATGGC	GTTAACACCA	TTTACAAGGG	ATATTTTCTC	1380
ATTGGGGATC	TGAAAGCGGC	ATGTTTGTTG	GAAACCGGAG	ATGAGAAAAC	ACAGGTGAAG	1440
ATGCATAATG	TGGTCAGAAG	CTTTGCATTG	TGGATGGCAT	CTGAACAGGG	GACTTATAAG	1500
GAGCTGATCC	TAGTTGAGCC	TAGCATGGGA	CATACTGAAG	CTCCTAAAGC	AGAAAACTGG	1560
CGACAAGCGT	TGGTGATCTC	ATTGTTAGAT	AACAGAATCC	AGACCTTGCC	TGAAAAACTC	1620
ATATGCCCGA	AACTGACAAC	ACTGATGCTC	CAACAGAACA	GCTCTTTGAA	GAAGATTCCA	1680
ACAGGGTTTT	TCATGCATAT	GCCTGTTCTC	AGAGTCTTGG	ACTTGTCGTT	CACAAGTATC	1740
ACTGAGATTC	CGTTGTCTAT	CAAGTATTTG	GTGGAGTTGT	ATCATCTGTC	TATGTCAGGA	1800
ACAAAGATAA	GTGTATTGCC	ACAGGAGCTT	GGGAATCTTA	GAAAACTGAA	GCATCTGGAC	1860
CTACAAAGAA	CTCAGTTTCT	TCAGACGATC	CCACGAGATG	CCATATGTTG	GCTGAGCAAG	1920
CTCGAGGTTC	TGAACTTGTA	CTACAGTTAC	GCCGGTTGGG	AACTGCAGAG	CTTTGGAGAA	1980
GATGAAGCAG	AAGAACTCGG	ATTCGCTGAC	TTGGAATACT	TGGAAAACCT	AACCACACTC	2040
GGTATCACTG	TTCTCTCATT	GGAGACCCTA	AAAACTCTCT	TCGAGTTCGG	TGCTTTGCAT	2100
AAACATATAC	AGCATCTCCA	CGTTGAAGAG	TGCAATGAAC	TCCTCTACTT	CAATCTCCCA	2160
TCACTCACTA	ACCATGGCAG	GAACCTGAGA	AGACTTAGCA	TTAAAAGTTG	CCATGACTTG	2220
GAGTACCTGG	TCACACCCGC	AGATTTTGAA	AATGATTGGC	TTCCGAGTCT	AGAGGTTCTG	2280
ACGTTACACA	GCCTTCACAA	CTTAACCAGA	GTGTGGGGAA	ATTCTGTAAG	CCAAGATTGT	2340
CTGCGGAATA	TCCGTTGCAT	AAACATTTCA	CACTGCAACA	AGCTGAAGAA	TGTCTCATGG	2400
GTTCAGAAAC	TCCCAAAGCT	AGAGGTGATT	GAACTGTTCG	ACTGCAGAGA	GATAGAGGAA	2460
TTGATAAGCG	AACACGAGAG	TCCATCCGTC	GAAGATCCAA	CATTGTTCCC	AAGCCTGAAG	2520
ACCTTGAGAA	CTAGGGATCT	GCCAGAACTA	AACAGCATCC	TCCCATCTCG	ATTTTCATTC	2580
CAAAAAGTTG	AAACATTAGT	CATCACAAAT	TGCCCCAGAG	TTAAGAAACT	GCCGTTTCAG	2640
GAGAGGAGGA	CCCAGATGAA	CTTGCCAACA	GTTTATTGTG	AGGAGAAATG	GTGGAAAGCA	2700
CTGGAAAAAG	ATCAACCAAA	CGAAGAGCTT	TGTTATTTAC	CGCGCTTTGT	TCCAAATTGA	2760

185 748

TATAAGAGCT AAGAGCACTC	TGTACAAATA	TGTCCATTCA	TAAGTAGCAG	GAAGCCAGGA	2820
AGGTTGTTCC AGTGAAGTCA	TCAACTTTCC	ACATAGCCAC	AAAACTAGAG	ATTATGTAAT	2880
CATAAAAACC AAACTATCCG	CGA				2903

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 885 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2:

Lys Lys Glu Arg Glu Ile Ile Glu Met Asp Phe Ile Ser Ser Leu Ile 15 1015

Val Gly Cys Ala Gin Val Leu Cys Glu Ser Met Asn Met Ala Glu Arg 20 2530

Arg Gly His Lys Thr Asp Leu Arg Gin Ala Ile Thr Asp Leu Arg Ile 35 4045

Gin Gin Asp Gly Leu Glu Gly Arg Ser Cys Ser Asn Arg Ala Arg Glu 50 5560

Trp Leu Ser Ala Val Gin Val Thr Glu Thr Lys Thr Ala Leu LeuLeu

70 7580

Val Arg Phe Arg Arg Arg Glu Gin Arg Thr Arg Met Arg Arg ArgTyr

9095

Leu Ser Cys Phe Gly Cys Ala Asp Tyr Lys Leu Cys Lys Lys Val Ser 100 105110

Ala Ile Leu Lys Ser Ile Gly Glu Leu Arg Glu Arg Ser Glu Ala Ile 115 120125

Lys Thr Asp Gly Gly Ser Ile Gin Val Thr Cys Arg Glu Ile Pro Ile 130 135140

Lys Ser Val Val Gly Asn Thr Thr Met Met Glu Gin Val Leu GluPhe

145 150 155160

Leu Ser Glu Glu Glu Glu Arg Gly Ile Ile Gly Val Tyr Gly ProGly

165 170175

185 748

Gly Val Gly Lys Thr Thr 180

Thr Lys Gly His Gin Tyr 195

Glu Phe Gly Glu Cys Thr 210

Leu Ser Trp Asp Glu Lys

225 230

Tyr Arg Ala Leu Arg Gin 245

Trp Glu Glu Ile Asp Leu 260

Glu Asn Lys Cys Lys Val 275

Asn Asn Met Gly Ala Glu 290

Lys His Ala Trp Glu Leu 305 310

Leu Glu Ser Ser Ser Ile 325

Cys Gly Gly Leu Pro Leu 340

His Arg Glu Thr Glu Glu 355

Arg Phe Pro Ala Glu Met 370

Lys Phe Ser Tyr Asp Asn 385 390

Leu Tyr Cys Ala Leu Phe 405

Leu Val Glu Tyr Trp Val 420

Val Asn Thr Ile Tyr Lys 435

Leu Met Gin Ser Ile 185

Asp Val Leu Ile Trp 200

Ile Gin Gin Ala Val 215

Glu Thr Gly Glu Asn 235

Lys Arg Phe Leu Leu 250

Glu Lys Thr Gly Val 265

Met Phe Thr Thr Arg 280

Tyr Lys Leu Arg Val 295

Phe Cys Ser Lys Val 315

Arg Arg Leu Ala Glu 330

Ala Leu Ile Thr Leu 345

Glu Trp Ile His Ala 360

Lys Gly Met Asn Tyr 375

Leu Glu Ser Asp Leu 395

Pro Glu Glu His Ser 410

Gly Glu Gly Phe Leu 425

Gly Tyr Phe Leu Ile 440

Asn Asn Glu Leu Ile 190

Val Gin Met Ser Arg 205

Gly Ala Arg Leu Gly 220

Arg Ala Leu Lys Ile 240

Leu Leu Asp Asp Val 255

Pro Arg Pro Asp Arg 270

Ser Ile Ala Leu Cys 285

Glu Phe Leu Glu Lys 300

Trp Arg Lys Asp Leu 320

Ile Ile Val Ser Lys 335

Gly Gly Ala Met Ala 350

Ser Glu Val Leu Thr 365

Val Phe Ala Leu Leu 380

Leu Arg Ser Cys Phe 400

Ile Glu Ile Glu Gin 415

Thr Ser Ser His Gly 430

Gly Asp Leu Lys Ala 445

185 748

Ala Cys 450

Leu

Glu Thr

Gly Asp Glu 455

Lys Thr

Gin 460

Val

Lys

Met

His

Asn 465

Val

Arg

Ser

Phe 470

Ala

Leu

Trp

Met

Ala 475

Ser

Glu

Gin

Gly

Thr 480

Tyr

Lys

Glu

Leu

Ile 485

Leu

Val

Glu

Pro

Ser 490

Met

Gly

His

Thr

Glu 495

Ala

Pro

Lys

Ala

Glu 500

Asn

Trp

Arg

Gin

Ala 505

Leu

Val

Ile

Ser

Leu 510

Leu

Asp

Asn

Arg

Ile 515

Gin

Thr

Leu

Pro

Glu 520

Lys

Leu

Ile

Cys

Pro 525

Lys

Leu

Thr

Leu 530

Met

Leu

Gin

Asn 535

Ser

Leu

Lys

Lys 540

Ile

Pro

Thr

Gly

Phe 545

Phe

Met

His

Met

Pro 550

Val

Leu

Arg

Val

Leu 555

Asp

Leu

Ser

Phe

Thr 560

Ser

Ile

Thr

Glu

Ile 565

Pro

Leu

Ser

Ile

Lys 570

Tyr

Leu

val

Glu

Leu 575

Tyr

His

Leu

Ser

Met 580

Ser

Gly

Thr

Lys

Ile 585

Ser

Val

Leu

Pro

Gin 590

Glu

Leu

Gly

Asn

Leu 595

Arg

Lys

Leu

Lys

His 600

Leu

Asp

Leu

Gin

Arg 605

Thr

Gin

Phe

Leu

Gin 610

Thr

Ile

Pro

Arg

Asp 615

Ala

Ile

Cys

Trp

Leu 620

Ser

Lys

Leu

Glu

val 625

Leu

Asn

Leu

Tyr

630

Ser

Tyr

Ala

Gly

Trp 635

Glu

Leu

Gin

Ser

Phe 640

Gly

Glu

Asp

Glu

Ala 645

Glu

Leu

Gly

Phe 650

Ala

Asp

Leu

Glu

655

Leu

Glu

Asn

Leu

Thr 660

Thr

Leu

Gly

Ile

Thr 665

Val

Leu

Ser

Leu

Glu 670

Thr

Leu

Lys

Thr

Leu 675

Phe

Glu

Phe

Gly

Ala 680

Leu

His

Lys

His

Ile 685

Gin

His

Leu

His

Val 690

Glu

Cys

Asn

Glu 695

Leu

Tyr

Phe

Asn 700

Leu

Pro

Ser

Leu

Thr 705

Asn

His

Gly

Arg

Asn 710

Leu

Arg

Leu

Ser 715

Ile

Lys

Ser

Cys

His 720

185 748

Asp Leu

Glu Tyr

Pro Ser

Ile Asn

Lys Leu

770

Glu Glu 785

Leu Phe

Leu Glu 740

Ile Ser 755

Pro Lys

Leu Ile

Pro Ser

Asn Ser

Val Ile

Arg Thr

850

Lys Ala 865

Ile Leu

820

Thr Asn 835

Gin Met

Leu Glu

Leu Val 725

Val Leu

His Cys

Leu Glu

Ser Glu

790

Leu Lys 805

Pro Ser

Cys Pro

Asn Leu

Lys Asp 870

Thr Pro

Thr Leu

Asn Lys 760

Val Ile 775

His Glu

Thr Leu

Arg Phe

Arg Val 840

Pro Thr 855

Gin Pro

Ala Asp 730

His Ser 745

Leu Lys

Glu Leu

Ser Pro

Arg Thr

810

Ser Phe 825

Lys Lys

Val Tyr

Asn Glu

Phe Glu

Leu His

Asn Val

Phe Asp 780

Ser Val 795

Arg Asp

Gin Lys

Leu Pro

Cys Glu 860

Glu Leu 875

Asn Asp

Asn Leu 750

Ser Trp 765

Cys Arg

Glu Asp

Leu Pro

Val Glu 830

Phe Gin 845

Glu Lys

Cys Tyr

Trp Leu 735

Arg Cys

Val Gin

Glu Ile

Pro Thr

800

Glu Leu 815

Thr Leu

Glu Arg

Trp Trp

Leu Pro

880

Arg Phe Val Pro Asn

885 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

Glu His Ser Val Gin Ile Cys Pro Phe Ile Ser Ser Arg Lys Pro Gly

10 15

Arg Leu Phe Gin

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4:

Ser His Gin Leu Ser Thr 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5:

Arg Leu Cys Asn His Lys Asn Gin Thr Ile Arg 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2Θ aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0	NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6:
Ser Lys Arg Lys Ser Glu Lys Ser	Ser Lys Trp Ile Ser Ser His Leu
1 5	10 15
Leu Ser Leu Ala Val Leu Arg Cys	Cys Val Asn Leu

25

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7:

Ile Trp Arg Arg Glu Glu Asp Ile Arg Leu Ile Leu Asp Lys Pro Ser 15 10 15

Leu Ile Leu Lys Gin Pro Ser Val Thr 20 25 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 8:

Arg Pro Tyr Val Met Thr (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 9:

Leu Tyr Gly Ser Asn Lys Thr Val 1 5

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 10:

Arg Asp Glu Ala Ala Gin Ile Val Pro Glu Ser Gly Leu Val Arg Cys 15 10 15

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 11:

Arg Arg Leu Lys Gin Pro Tyr Phe 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 12:

Gly Leu Gly Val Gly Asn Arg Gly Arg Glu 15 10

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 13:

Gly Gly Asp Thr Ser Val Val Ser Val Val Pro Thr Thr Asn Cys Ala 15 10 15

Arg Arg Phe Leu Pro Tyr 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 14:

Arg Ala Leu Val Ser 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 15:

Glu Asn Ala Leu Lys Leu Ser Lys Gin Met Ala Gly Gin Phe Lys 15 10 15

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 16:

Leu Val Glu Arg Tyr Pro Ser Ser Pro Leu Ser Glu Ile Pro Arg 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 29 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 17:

Trp Asn Arg Phe Trp Asn Phe Ser Val Lys Lys Lys Lys Glu Glu Ser 15 10 15

Leu Val Phe Met Asp Leu Val Gly Leu Gly Arg Gin Arg 20 25 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 18:

Cys Arg Ala Leu Thr Thr Ser

5

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 19:

Ser Gin Lys Asp Ile Ser Met Met Tyr 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 36 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 20:

Phe Gly Phe Lys Cys Pro Glu Asn Ser Ala Ser Val Gin Phe Ser Lys 15 10 15

Pro Leu Glu His Gly Trp Val Tyr Leu Gly Thr Arg Arg Arg Pro Ala 20 25 30

Lys Thr Glu Leu 35 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 21:

Arg Tyr Thr Glu Leu

5

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 22:

Asp Arg Asn Val Ser Cys Cys Cys 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 23:

Met Met Ser Gly Lys Arg 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 24:

Thr Trp Arg Lys Leu Glu Phe Leu Asp Leu Thr Gly Lys Thr Asn Ala 15 10 15

Arg

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 25:

Cys Ser Arg His Gly Leu 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 26:

His Tyr Ala Thr Ile Trp Val Arg Asn Thr Ser 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 27:

Glu Trp Ser Phe Trp Arg Arg Asn Thr Arg Gly Ser Cys Ser Val Val 15 10 15

Arg Tyr Gly Glu Lys Ile Phe 20

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 28:

Ser His His Gin Phe Ala Gly Ser Arg Arg Leu 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 29:

Val Asn Val Glu Asp Cys His 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 30:

Glu Glu Pro Trp Leu Ile Glu Arg Gin Lys Lys Ser Gly Ser Met Leu 15 10 15

Val Lys Phe

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 31:

Leu Asp Phe Gin Gin Arg 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 32:

Thr Met Tyr Leu Pro Phe 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 27 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 33:

Asn Ser Ala Thr Thr Thr Ser Arg Val Ile Cys Phe Gly Leu Val Ser 15 10 15

Cys Thr Ala Leu Tyr Ser Gin Lys Asn Ile Leu 20 25

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 34:

Lys Arg His Val Cys Trp Lys Pro Glu Met Arg Lys His Arg 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 33 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 35:

Arg Ser Ser Ser Leu Leu Ser Thr Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro 15 10 15

Ala Pro Met Ala Leu Thr Pro Phe Thr Arg Asp Ile Phe Ser Leu Gly 20 25 30

Ile (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 36:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 36:

Arg Cys Ile Met Trp Ser Glu Ala Leu His Cys Gly Trp His Leu Asn

10 15

185 748

Arg Gly Leu Ile Arg Ser 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 37:

Leu Ser Leu Ala Trp Asp Ile Leu Lys Leu Leu Lys Gin Lys Thr Gly 15 10 15

Asp Lys Arg Trp 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 38:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 38:

Ile Thr Glu Ser Arg Pro Cys Leu Lys Asn Ser Tyr Ala Arg Asn

10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 39:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 39:

Cys Ser Asn Arg Thr Ala Leu 1 5

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 40:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 46 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 40:

Arg Arg Phe Gin Gin Gly Phe Ser Cys Ile Cys Leu Phe Ser Glu Ser 15 1015

Trp Thr Cys Arg Ser Gin Val Ser Leu Arg Phe Arg Cys Leu Ser Ser 20 2530

Ile Trp Trp Ser Cys Ile Ile Cys Leu Cys Gin Glu Gin Arg 35 4045 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 41:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 41:

Val Tyr Cys His Arg Ser Leu Gly Ile Leu Glu Asn 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 42:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 42:

Ser Ile Trp Thr Tyr Lys Glu Leu Ser Phe Phe Arg Arg Ser His Glu 15 10 15

185 748

Met Pro Tyr Val Gly 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 43:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 43:

Ala Ser Ser Arg Phe 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 44:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 44:

Thr Cys Thr Thr Val Thr Pro Val Gly Asn Cys Arg Ala Leu Glu Lys 15 10 15

Met Lys Gin Lys Asn Ser Asp Ser Leu Thr Trp Asn Thr Trp Lys Thr 20 25 30 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 45:

Pro His Ser Val Ser Leu Phe Ser His Trp Arg Pro 15 10

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 46:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 46:

Lys Leu Ser Ser Ser Ser Val Leu Cys Ile Asn Ile Tyr Ser Ile Ser 15 10 15

Thr Leu Lys Ser Ala Met Asn Ser Ser Thr Ser Ile Ser His His Ser 20 25 30

Leu Thr Met Ala Gly Thr 35 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 47:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 47:

Glu Asp Leu Ala Leu Lys Val Ala Met Thr Trp Ser Thr Trp Ser His 15 10 15

Pro Gin Ile Leu Lys Met Ile Gly Phe Arg Val

25 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 48:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

185 748 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 48:

Arg Tyr Thr Ala Phe Thr Thr 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 49:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 49:

Pro Glu Cys Gly Glu Ile Leu 1 5 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 50:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 50:

Phe Arg Asn Ser Gin Ser 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 51:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 51:

Ala Lys Ile Val Cys Gly Ile Ser Val Ala 15 10

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 52:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 52:

Thr Phe His Thr Ala Thr Ser 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 53:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 53:

Leu Asn Cys Ser Thr Ala Glu Arg 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 54:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 54:

Ala Asn Thr Arg Val His Pro Ser Lys Ile Gin His Cys Ser Gin Ala 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 55:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa

185 748 (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 55:

Glu Leu Gly Ile Cys Gin Asn 1 5 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 56:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 56:

Thr Ala Ser Ser His Leu Asp Phe His Ser Lys Lys Leu Lys His 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 57:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 57:

Ser Ser Gin Ile Ala Pro Glu Leu Arg Asn Cys Arg Phe Arg Arg Gly 15 10 15

Gly Pro Arg (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 58:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 47 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa

185 748 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 58:

Thr Cys Gin Gin Phe Ile Val Arg Arg Asn Gly Gly Lys His Trp Lys 15 1015

Lys Ile Asn Gin Thr Lys Ser Phe Val Ile Tyr Arg Ala Leu Phe Gin 20 2530

Ile Asp Ile Arg Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Lys Tyr Val His Ser 35 4045 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 59:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 33 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZA0’ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 59:

Val Ala 1	Gly Ser Gin Glu Gly Cys Ser Ser Glu Val	Ile Asn	Phe Pro 15
5	10
His Ser	His Lys Thr Arg Asp Tyr Val 20 25	Ile Ile Lys	Thr Lys 30	Leu Ser

Ala (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 60:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 60:

Val Lys Glu Arg Ala Arg Asn His Arg Asn Gly Phe His Leu Ile Ser 15 10 15

Tyr Arg Trp Leu Cys Ser Gly Val Val

25

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 61:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 61:

Ile Tyr Glu Tyr Gly Gly Glu Lys Arg Thr 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 62:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 62:

Leu Glu Gly His Thr 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 63:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 63:

Pro Asp Phe Thr Asp Pro Thr Arg Arg Ser Arg Gly Thr Lys Leu Leu 15 10 15

Lys Ser Cys Gin Arg Val Ala 20

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 64:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 64:

Cys Gly Ala Ser Asn Gly Asp 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 65:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 65:

Asn Ser Pro Thr Phe Ser Glu Val 1 5 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 66:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 35 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 66:

Ala Ser Gly Thr Glu Asp Ala Asn Glu Glu Glu Ile Pro Gin Leu Phe 15 10 15

Arg Leu Cys Arg Leu Gin Thr Val Gin Glu Gly Phe Cys His Ile Glu 20 25 30

Glu His Trp 35

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 67:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 67:

Ala Glu Arg Thr Leu 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 68:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 68:

Ser Tyr Gin Asn Arg Trp Arg Val Asn Ser Ser Asn Leu 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 69:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 69:

Arg Asp Thr His Gin Val Arg Cys Arg Lys Tyr His Asp Asp Gly Thr 15 10 15

Gly Phe Gly Ile Ser Gin 20

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 70:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 70:

Arg Arg Arg Lys Arg Asn His Trp Cys Leu Trp Thr Trp Trp Gly Trp 15 10 15

Glu Asp Asn Val Asn Ala Glu His 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 71:

Gin Arg Ala Asp His Lys Arg Thr Ser Val 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 72:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 55 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 72:

Cys Thr Asp Leu Gly Ser Asn Val Gin Arg Ile Arg Arg Val Tyr Asn 15 10 15

Ser Ala Ser Arg Trp Ser Thr Val Gly Phe Ile Leu Gly Arg Glu Gly 20 25 30

185 748

Asp Arg Arg Lys Gin Ser Phe Glu Asp Ile Gin Ser Phe Glu Thr Glu 35 40 45

Thr Phe Leu Val Val Ala Arg 50 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 73:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 73:

Cys Leu Gly Arg Asp Arg Leu Gly Glu Asn Trp Ser Ser Ser Thr 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 74:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 74:

Arg Asp Arg Arg Arg Val Asp Pro Cys 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 75:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 41 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 75:

Gin Gly Lys Gin Met Gin Gly Asp Val His Asp Thr Val Tyr Ser Ile 15 10 15

185 748

Met Gin Gin Tyr Gly Cys Gly Ile Gin Val Glu Ser Gly Val Ser Gly 20 25 30

Glu Glu Thr Arg Val Gly Ala Val Leu 35 40 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 76:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 76:

Gly Met Glu Lys Arg Ser Phe Arg Val Ile Ile Asn Ser Pro Ala Arg 15 10 15

Gly Asp Tyr Ser Glu 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 77:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 77:

Met Trp Arg Ile Ala Thr Ser Val Asp His Phe Arg Arg Ser His Gly 15 10 15

Ser (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 78:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

185 748 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 78:

Ile Ser Ser Arg Asp Glu Gly Tyr Glu Leu Cys Ile Cys Pro Phe Glu 15 10 15

Ile Gin Leu Arg Gin Pro Arg Glu 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 79:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 79:

Ser Ala Ser Val Leu Phe Leu Val Leu Arg Phe Ile Pro Arg Arg Thr 15 10 15

Phe Tyr Arg Asp Arg Ala Ala Cys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 80:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 80:

Val Leu Gly Arg Arg Arg Val Ser His Gin Leu Pro Trp Arg 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 81:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

185 748 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 81:

His His Leu Gin Gly Ile Phe Ser His Trp Gly Ser Glu Ser Gly Met 15 10 15

Phe Val Gly Asn Arg Arg 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 82:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 82:

Glu Asn Thr Gly Glu Asp Ala

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 83:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 43 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 83:

Lys Thr His Met Pro Glu Thr Asp Asn Thr Asp Ala Pro Thr Glu Gly 15 1015

Leu Phe Glu Glu Asp Ser Asn Arg Val Phe His Ala Tyr Ala Cys Ser 20 2530

Gin Ser Leu Gly Leu Val Val His Lys Tyr His

3540 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 84:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa

185 748 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 84:

Cys Gly Gin Lys Leu Cys Ile Val Asp Gly Ile 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 85:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) .TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 85:

Gly Ala Asp Pro Ser 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 86:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 86:

Ser Arg Lys Leu Ala Thr Ser Val Gly Asp Leu Ile Val Arg 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 87:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 87:

Gin Asn Pro Asp Leu Ala 1 5

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 88:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 88:

Asp Ser Val Val Tyr Gin Val Phe Gly Gly Val Val Ser Ser Val Tyr 15 10 15

Val Arg Asn Lys Asp Lys Cys Ile Ala Thr Gly Ala Trp Glu Ser 20 25 30 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 89:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 47 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

(xi)

OPIS SEKWENCJI:

SEKWENCJA O

NUMERZE

IDENTYFIKACYJNY!

4 89:

Lys 1

Thr

Glu

Ala

Ser 5

Gly

Pro

Thr

Lys

Asn 10

Ser

Val

Ser

Asp Asp 15

Pro

Thr

Arg

Cys 20

His

Met

Leu

Ala

Glu 25

Gin

Ala

Arg

Gly

Ser 30

Glu Leu

Val

Leu

Gin 35

Leu

Arg

Leu

Gly 40

Thr

Ala

Glu

Leu

Trp 45

Arg

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI Ó NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 90:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

185 748 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 90:

Ser Arg Arg Thr Arg Ile Arg 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 91:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 91:

Leu Gly Ile Leu Gly Lys Pro Asn His Thr Arg Tyr His Cys Ser Leu 15 10 15

Ile Gly Asp Pro Lys Asn Ser Leu Arg Val Arg Cys Phe Ala 20 25 30 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 92:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 92:

Thr Tyr Thr Ala Ser Pro Arg (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 93:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

185 748 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 93:

Thr Pro Leu Leu Gin Ser Pro Ile Thr His 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 94:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 94:

Pro Trp Gin Glu Pro Glu Lys Thr 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 95:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 95:

Leu Gly Val Pro Gly His Thr Arg Arg Phe 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 96:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 58 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 96:

Leu Ala Ser Glu Ser Arg Gly Ser Asp Val Thr Gin Pro Ser Gin Leu 15 10 15

185 748

Asn Gin Ser Val Gly Lys Phe Cys Lys Pro Arg Leu Ser Ala Glu Tyr 20 2530

Pro Leu His Lys His Phe Thr Leu Gin Gin Ala Glu Glu Cys Leu Met 35 4045

Gly Ser Glu Thr Pro Lys Ala Arg Gly Asp 5055 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 97:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

(xi)	OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE	IDENTYFIKACYJNYM 97:
Thr	Val Arg Leu Gin Arg Asp Arg Gly Ile	Asp Lys Arg Thr Arg Glu
1	5 10	15
Ser	Ile Arg Arg Arg Ser Asn Ile Val Pro	Lys Pro Glu Asp Leu Glu

25 30

Asn (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 98:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 98:

Gly Ser Ala Arg Thr Lys Gin His Pro Pro Ile Ser Ile Phe Ile Pro 15 10 15

Lys Ser

185 748 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 99:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 99:

Asn Ile Ser His His Lys Leu Pro Gin Ser 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 100:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 100:

Glu Thr Ala Val Ser Gly Glu Glu Asp Pro Asp Glu Leu Ala Asn Ser 15 10 15

Leu Leu (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 101:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 101: GGTAGTGAGT AGAGAATAAC 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 102:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów

185 748 (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 102:

Glu Leu Arg Ala Leu Cys Thr Asn Met Ser Ile His Lys 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 103:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 103:

Gin Glu Ala Arg Lys Val Val Pro Val Lys Ser Ser Thr Phe His Ile 15 10 15

Ala Thr Lys Leu Glu Ile Met 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 104:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 104:

Lys Pro Asn Tyr Pro Arg (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 105:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1491 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa

185 748 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 105:

ATCGATTGAT CTCTGGCTCA GTGCGAGTAG TCCATTTGAG AGCAGTCGTA GCCCCGCGTG60

GCGCATCATG GAGCTATTTG GAATTTTCGC AGGGTTATCG ATTCGTAGTG GGAACCCATT120

CATTGTTTGG AACCACCAAC GGACGACTTA ACAAGCTCCC CGAGGTGCAT GATGAAAATT180

GCTCCAGTTG CCATAAATCA CAGCCCGCTC AGCAGGGAGG TCCCGTCACA CGCGGCACCC240

ACTCAGGCAA AGCAAACCAA CCTTCAATCT GAAGCTGGCG ATTTAGATGC AAGAAAAAGT300

AGCGCTTCAA GCCCGGAAAC CCGCGCATTA CTCGCTACTA AGACAGTACT CGGGAGACAC360

AAGATAGAGG TTCCGGCCTT TGGAGGGTGG TTCAAAAAGA AATCATCTAA GCACGAGACG420

GGCGGTTCAA GTGCCAACGC AGATAGTTCG AGCGTGGCTT CCGATTCCAC CGAAAAACCT480

TTGTTCCGTC TCACGCACGT TCCTTACGTA TCCCAAGGTA ATGAGCGAAT GGGATGTTGG540

TATGCCTGCG CAAGAATGGT TGGCCATTCT GTCGAAGCTG GGCCTCGCCT AGGGCTGCCG600

GAGCTCTATG AGGGAAGGGA GGCGCCAGCT GGGCTACAAG ATTTTTCAGA TGTAGAAAGG660

TTTATTCACA ATGAAGGATT AACTCGGGTA GACCTTCCAG ACAATGAGAG ATTTACACAC720

GAAGAGTTGG GTGCACTGTT GTATAAGCAC GGGCCGATTA TATTTGGGTG GAAAACTCCG780

AATGACAGCT GGCACATGTC GGTCCTCACT GGTGTCGATA AAGAGACGTC GTCCATTACT840

TTTCACGATC CCCGACAGGG GCCGGACCTA GCAATGCCGC TCGATTACTT TAATCAGCGA900

TTGGCATGGC AGGTTCCACA CGCAATGCTC TACCGCTAAG TAGCAGGGTA TCTTCACGTG960

GCGGCATCAT GACAAGCCCA TGATGCCGCC AGCAGCTACC TGAATGCCGT CTGGCTTTTT1020

GGTCCCTATT GTCGTATCCG GAAGATGACG TCAAAGAATC TCGGCAAGAG CTTTCTTGCT1080

CGACTCCTCA GCTTCCGGAT CGATCAGGTC GCTTGCCAGA GCGCGCTTGT CCATGAGCAT1140

CTGCCACAGC TGCTGGTCGA TGGTGTCCTC AGCTAAAGGG ATTTTGACGA CAACCATGCG1200

CAACTGCCCG TTGCGATACG CTCGATCCTG AAGCCCCGGT GTCCATGGCA GCCCCAAGAA1260

AAAGACATAG TTCGCCGCTG TGAGGTTGTA GCCTGTGCCG GCGGCCGACC TGGTCCCGAT1320

AAACACCCTG CAGTCCGGAT CCTGCTGGAA AGCATCAATC GCCTTCTGCC GCTTCTTGGG1380

CGAGTCACTG CCCACCAACG TCACGCACCC GACGCCAAGC TTGAGGCAGT GCTCCCGCAA1440

185 748

CGTGGCCACG GATTCCTGAT ACTCGCAGAA GAGGATCACC TTGTCGTCGA C (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 106:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 255 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa

1491 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0

Met Lys Ile Ala Pro Val Ala Ile 15

Val Pro Ser His Ala Ala Pro Thr 20

Ser Glu Ala Gly Asp Leu Asp Ala 3540

Glu Thr Arg Ala Leu Leu Ala Thr 5055

Ile Glu Val Pro Ala Phe Gly Gly 6570

His Glu Thr Gly Gly Ser Ser Ala 85

Ser Asp Ser Thr Glu Lys Pro Leu 100

Val Ser Gin Gly Asn Glu Arg Met 115120

Met Val Gly His Ser Val Glu Ala 130135

Leu Tyr Glu Gly Arg Glu Ala Pro 145150

Val Glu Arg Phe Ile His Asn Glu 165

NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI06:

Asn His Ser Pro Leu Ser Arg Glu 1015

Gin Ala Lys Gin Thr Asn Leu Gin 2530

Arg Lys Ser Ser Ala Ser Ser Pro 45

Lys Thr Val Leu Gly Arg His Lys 60

Trp Phe Lys Lys Lys Ser Ser Lys 7580

Asn Ala Asp Ser Ser Ser Val Ala 9095

Phe Arg Leu Thr His Val Pro Tyr 105110

Gly Cys Trp Tyr Ala Cys Ala Arg 125

Gly Pro Arg Leu Gly Leu Pro Glu 140

Ala Gly Leu Gin Asp Phe Ser Asp 155 160

Gly Leu Thr Arg Val Asp Leu Pro 170 175

Asp Asn Glu Arg Phe Thr His Glu Glu Leu Gly Ala Leu Leu Tyr Lys

180 185 190

185 748

His

Gly

Pro 195

Ile

Phe

Gly Trp 200

Lys

Thr Pro

Asn Asp 205

Ser

Trp

His

Met

Ser

Val

Leu

Thr

Gly

Val

Asp

Lys

Glu

Thr

Ser

Ile

Thr

Phe

210

215

220

His

Asp

Pro

Arg

Gin

Gly

Pro

Asp

Leu

Ala

Met

Pro

Leu

Asp

Tyr

Phe

225

230

235

240

Asn

Gin

Arg

Leu

Ala

Trp

Gin

Val

Pro

His

Ala

Met

Leu

Tyr

Arg

245 250 255

185 748

---------ĘW11E4 - — EW3H? ' YUP11F11

EW9C3

EW11D£ — |HPS2|

H7-47---— E4-19----H7-26 —---— E4-11-----H7-48 ----— E4-6 --------.

H7-49^{1 1} - E4-4 **

- - |PPŚJ(28-35 kb)~ 8 kb

3.2 ‘2.3 <8^l 4.5

TG. 1 F #5 #4 #6 #8 #7 #9 ’ 2.2 3.1 & 3.8 2.0 1.7 1.3 2.9

Fig. 1

185 748

AAGTAAAAGAAAGAGCGAGAAATeATCGAAATGCATTTCATCTCATCTCTTATCGTrGCJC 1---------o---------o------------------_----------_----------a X»KKEREXIE®DFISSLIVG b SKRKSEKSSKWISSHLLSŁAc VKERARNHRNGFHLXSYRWLTCTGCTCAGGTCTTCTCTCAATCTATGAATATGGCGGACACAAGAGaiCATAAGACTGAT

51----------------—------------------------------♦---------♦ 120 a CAQVLCE£«NMAERRGHKT0 b VLRCCVNŁ⁰JWRREED2RLic cscyy^iYSYocaRRT^D^sCTTAGACAAGCCATCACTGATCTTGAAACAGCCATCGGTGACTrcAAGGCCATACGTGAT 121--------------------------------------♦—------------------o 180

GAATCTGTrCGGTAGTGACTAGAACTTTGTCGGTAGCCACTCAACTTCCGGTATCCACTA tr » n u* β>

LROAITDLETAIGDLKAIRD LDXPSŁILKQPSVT®RPYVM^β T S Η Η * S *NS8R*ŁEC'XT^V » GACCTGACTTTACCGATCCAACAACACGGTCTAGAGGGACGAAGCTGCTCAAATCCTCCC 181-----------------—------------------------------------------ 240

DŁTLRIQCDGLEGRSCSHRA T»LYGSNKTV’RD£AAQIVP e PDFTDPTRRSRGTKLLKSCeAGAGAGTGGCTTAGTCCGGTGCAAGTAACGGAGACTAAAACAGCCCTACTTTTAGTGAGG 201---------o-----—— ---—-----O---------♦--------->---------- 300

TCTCTCACCGAATCACGCCACGTTCATTGCCJCTCATnTGTCGGGAt^GAAAATCACTeC a REWŁSAVQVTETKTALŁLVR b ESCLVRCK’RRŁXQPYF’,^eCe RVX«CCASNGD’NSP?FSEVTTTAGGCGTCGCCAACAGAGGACGCGAATOAGCAGGAGATACCTCAG-rTGTTTeGGTrcT 301-----------------------------_----------*-----------------—♦ 350

AAATCCCCAGCCCTTCTCTCCTGCGCTTACTCCTCCTCTATGGACTC.\ACAAAGCCAACA a FRRRE5RTRMRRRYLSCFGC b ŁGVGNRGRE’GGDTSVVSVVe »asctedaneeeipq ;frlcGCCGACTACAAACTOTGCAA£»AGGTrTCYCCCATATTCAAGAGCATrCGTCAGCTGAGX

FIG.

185 748

3ί1-----——-ο----—-------------~---------------ο—-------- 420 a AOYXŁCKKVSAXŁXSIGEŁR b PTTMCARRFLPY^RAŁYS^Ec RLQTYQEGFCHXEEHW’AERGAACGCTCTGAAGCTATCAAAACAGATGGCGGGTCAATTCAAGTAACTOCTAGAGAGATA 421 ——————4go a BRSEAIKTDGGSXQVTXREI b NAŁKŁSKOMAGOFK^LYERYC TŁ*SY6NRWRVNSSNL*RDTCCCATCAAGTCCGTXCTCCGAAATACCACGATGATO3AACAGGTTTTGGXATTTCTCAGT 481----------------------------------------------------------+ S40

GGGTAGTTCAGGCAACAGCCTTTATGGTCCTACTACCTTGTCCAAAACCTTAAACAGTCA a PIKSVVGNTTMMEQVLEFŁS b PSSPLSEXPR°WNRFWNPSVc KQVRCRKYHDDGTGFGXSQ»GAAGAAGAAGAAAGAGGAATCATTGGTGTTTATGGACCTGGTGGGGTJGCGAAGACAACC 541---------------——♦-----——♦---------♦-------— ---------- SCO

CTTCTTCTTCTTICTCCTTAGTAACCACAAATACCTCGACCACCCCAACCCTTCTGTTGC a EEEERGXIGVYG PGGVGXTT b RKXKEESLVFMDŁVGLGRCRc RRRKRNHWCLWTWWGWEDNYTTAATCCAGAGCATTAACAACGAGCTGATCACAAAAGGACATCAGTATGATGTACTGATT 501--------------------------------------------------·>-=-------- «50

AATTACCTCTeGTAATTGTTGCTCGACTAGTGTTTTCCTGTAGTCATACTACATGACTAA a LMQSINNELITXGHQYDVLI b ’CRAŁTTS»SgKDXSMMY»Fc NAEH°QRXDHXRTSV’-CTDŁTGGGTICAAATCTCCAGAGAATTCGGCGAGTGTACAATTCAGCAAGCCGTTGGAGCACGG 561-------—♦------ *------—*-------------------—------ 720

ACCCAAGTTTACAGGTCTCTTAAGCCGeTCACATGTTAAGTCGTTCCCCAACCTCGTGCC a WVOMSREFGECTIQQAVGAR b GFXCPENSASVCFSKPLEHGc G$NVQRIRRVYNSASRWSTVTTCGGTTTATCTTGGGACGAGAAGGAGACCCGCGAAAACAGAGCTTTCAAGATATACAGA 721------------------- —---------------------------<·---------* 780

AACCCAAATAGAACCCTGCmTCCTCTGGCCGCnTrGTCTCCAAACTTCTATATGTCT a LGLSWDERETGENRALKIYR b WVYŁGTRRRPAKTEL*RYTEC GFXŁGREGDRRKQSPEDXQSACAGAAAUU1 i *<- X k AM A Αμα. A ΑΜΑ IMA XV AM ΧμΜΜ^ΛΜΑμΑΧΑμΑΜΧ Am 781----------------------------------------*---------*---------4 840

CGAAACTCTGTCTTTCCAAAGAACAACAACGATCTACTACAGACCCTrCTCTATCTGAAC a ALRQXRFLLLLDDVWEEIDL b L»DRNVSCCC'MMSGKR*TWc FETETFŁVVAR*CLGRDRŁCfig. 2 (ciąg dalszy)

185 748 β Λ Ο « Λ U «Λ U ΟΛΟ ΟΛΟ «Λ

GAGAAAACTGCACTTCCTaUCCTGACAGGGAAAACAAATCCAAGGTGATCTTCACGACA 841--------------------------—-+-----——+----—---♦-----——♦ J00

CTCTTTTGACCTCAAGGAGCTGGACTGTCCCnTTGlTTACGTrCCACrACAAGTGCTGT

EKTGVPRPDRENXCKVWFTT RKLEFLDLTGKTNAR’CSRHENWSSST’QGRQMQCDVHDTCCGTCT3.rACCAlTATGCAACMTAKXGTCCQGAATACAAGTTGAGAGT«»GTTTCTC 901-------------------*---------► ->-------------------------- 950

RSIALCNNMGAEYKŁRVEFŁ GL °HYATXWVRNTS ° E W S F W VYSXMQQYGCGXQVESGVSGGAGAAGAAACACGCGTGGGAGCTGTTCTGTAGTAAGGrATGGAGAAAACATCTTTTAGAG 961-------------------_--------------------_---------------------- 1020

CTCTTCrrTCTGCGCACCCTCGACAAGACATCATTĆCATACCTCTTJTGTAGAAAATCTC

E K kawelfcskvwrxdłle RR'.'TRGSCSVVRYCEX I F * Γ EETRVGAVL®*GMEXRSFRVTCATCATCAATTeCCCGGCTCGCGGAGATTATAGTGAGTAAATGTGGAGGATIGCCACTA 1021--------------------------------------►---------o---------- 1080

AGTAGTAGTTAAaCGGCCGAGCGCCTCTAATATCACTCATTTACACCrCCTAACGGTGAT

SSSIRRLAEXIVSXCGGLPL « HHQFAGSRRL®*VNVEDCH®I I N S PARGDYSE“MWR X λ T S GCCTIOATCACTTrAGGAGGAGCCATGGCTCATAGAGAGACAGAJUSAACAGTGCATCCAT· 1081-------------------------------------------------—--------- 1140

CGCAACTAGTGAAATCCTCCTCGGTACCGAGTATCTCTCTGTCTTCTTCTCACCTAGGTA

ALITLGGAMAHRETEEEWIH R*SŁ®EEPWLIERQRXSGSMVDHFRRSHGS»RDRRi:VDPCGCTAGTGAAGTTCTGACTAGATTTCCAGCAGAGATGAAGGGTATCAACTATGTATTTGCC 1141-----------------------------O-----------------------------* 1200

CGATCACnCAAGACTGATCTAAAGGTCGTCTCTACTrCCCATACTrcATACATAAACGG

ASEVLTRFPAEMKGMNYVFA LVKF®LDFQQR»RV’TMYLP~ c «*SSD«ISSRDEGYELCICPCTTTTGAAATICAGCTACGACAACCTCGAGAGTCATCTGCTrCGGTCTTGTTreTTGTAC 1201-----------------------------*------—--------------------* 1260

GAAAZkCTTTAAGTCGATGCTGTTGGAGCTCTCACTAGACGAAGCCAGAACAAAGAACATG a LLKFSYDNLESDLLRSCFŁY b ’NSATTTSRVICFQLVSCTc FEIQLR2PRE'SASVLFLVLTGCGCTTTATTCCCAGAAGAACATTCTATAGAGATCGAGCAGCTTCTrGAGTACTGGGTC 2ΖΣ1---------*-----------------------------k-------------------- 1320

ACGCGAAATAAGGGTCTTCTTGTAAGATATCTCTAGCTCGTCGAACAACTCATGACCCAC a CALFPEEHSIEIEQLVEYWV fig. 2 (ciąg dalszy)

185 748 b ALYSgKNIŁ^RSSSŁ.LSTGSc rfiprrtfyrdraac*vlgr1321---------*---------«-------------------------------------* υβό

CCGCTTCCCAAAGAGTGGTCGAGGGTACCGCAATrGTGGTAAATGTTCCClJlTAAAAGAG * GEGFLTSSHGVNTXYKGYFL b AKGFSPAPMALTPFTROIFSc RRVSHQŁPWR^eHHLQGJFSHAITCGGGATCTGAAAGCGGCATGTITGTICGAAACCGGAGATGAGAAAACACAGGTGAAG 1381-------------------*--------—------------------------------ 1440

TAACCCCTAGACTrTCGCCGTACAAACAACCTTTGGCCTCTACTCTrnrGTGTCCACTTC

A IGDLXAACLLETGDEXTgVK b LGI«KRHVCWKPEMRXRR^eRc WCSESGMFVGNRR^eEHTGEDATGUkTAATGTGGTCAGAAGCTTTCCATTGTGCATGGCATCTGAACAGGGGACTrATAAG 1441---------------------------—♦-------------------♦---------- 1500

TACGTA7TACAGXA5TCTICC2JJ.CGTAACACCTACCGTAGACTTCTCCCCTCAATATTC a MHNVVRSFXLWMASEQGTYK b CXMWSEALHCCWKLNRCLXRc A®CGQKŁCXVOGI®TGDL*GGAGCTGATCCTAGTTGAGCCTAGCATGGGACATACTGAAGCTCCTAAAGCAGAAAACTGG 1501---------*---------♦ -------------------- ---------------o 1550

CTCGACTAGGATCAACTCCCATCGTACCCTGTATCACTTCGAGGATTTCGTCTTTTGACC a ELILVEPSMGHTEAPKKENW b S“S’ŁSLAWOIŁXLLKQKTGc AOPS»A»KGTY»SS»SRKLACGACAAGCGTKKTGATCTCATIGTrAGATAACAGAATCCAGACCTTGCCTOAAAAACrC 1561---------♦---------_φ---------_----------*---------» —-------₊ 1620

GCTGTrCGCAACCACTAGAGTAACAATCTATTGTCTTAGGTCTGGAACGGACTTITTGAG a RQAŁVISLLDNRIQTLPEKL b DKRW’SKC«ITESRPCLKNSc TSVGDŁIVR^eQNPDLA*KTHATATGCCCGAAACTGACAACACTCATGCTCCAACAGAACAGCTCTTTCAAGAAGATTCCA 1621---------t---------*.........*-------------------♦---------* 1680

TATACGGGCTTTGACTGTTGTGACTACGAGGTTCTCTTGTCGAGAAACTrCTTCTAAGGT a ICPKŁTTLMLSCNSSŁKKIP b YARN»QH«CSNRTAL’RRFQc HPETDNTDAPTEQLFEBDSN1681---------♦-------------------------------------------------- 1740

TGTCCCAAAAAGTACGTATACCCACAAGAGTCTCAGAACCTGAACAGCAAGTGTTCATAG a 7GFFMHMPVLRVL·DL·SFTSr b QGFSCXCLFSESWTCRSQVSc RV?HAYACSQSLGLVVHKYH1741-------------------*......... *-------------------* 1800

TCACTCTAAGGCAACAGATAGTrCATAAACCACCTCAACATAGTAGACAGATACAGTCCT fig. 2 (ciąg dalszy)

185 748 a TEIPLSIKYŁVEŁYHŁSKSG b LRFRCŁSSIWWSCIICLCQEC * D S V V Y Q V F G a V V S S V Ϋ V R N ACAAAGATAAGTGTATTGCCACAGGAGCTTCGGAATCTTAGAAAACTGAAGCATCTGGAC 1801------------------------------------♦---------♦---------- 1850

TGTTTCTATTCACATAACGGTGTCCTCGAACCCTJAGAATCTTTTGACSTCGTAGACCTC ?KISVLPQELGNLRKLKHLD QR°VYCHRSLGILEN*SXWTKDKC IATGAWES ’ K T E A S G P CTACAAAGAACTCAGTTTCTTCAGACGATCCCACGAGATCCCATATGTOGGCTGAGCAAG 1861-----------------------------+---------₊------—----------- 1920

GATGTTTCTTGAGTCAAAGAAGTCTGCTAGGGTCCTCTACGGTATACAACCGACTCCTTC

ŁQRTQFLQTIPRDAJCWŁSK YXELSFFRRSHEMPYVG*AS c TKNSVSSDDPTRCHMLAEQACTCGAGGTTCTCAACTTGTACTACAGITACCCCGGTrGGGAACTGCAGAGCnTGGAGAA 1221---------------------------------------.---------♦---------- 1980

GAGCTGCAAGACTTGAACATCATGTCAATGCGGCCAtóCCTTGACGTCTCGAAACCTCTT a L.EVLNLYYSYACWELQ-SFGE b SRF’TCTTVTPVGNCRALEKC RGSEŁVŁQLRRLGTABLWRRGATGAAGCACAAGAACTCGGATTeGCTGACTTCGAATACTTCGAARAOCTAXCCACACTC 1981------------------------------------------------------------- 2040 a DEAEEŁGFADŁEYLENŁTTL b MXQKNSDSLTWNTWKT*PHSC *SRRTRXR*ŁGILGKFNHTRGGTATCACTGTTCTCTCATTCGAGACCCTAAAAACTCTCTTCGAGTTCGGTGCTTTGCAT 2041 ---------*---------*---------*----------------------------- 2100

CCATAGTGACAAGAGAGTAACCTCTCGGATTTrTGAGAGAAGCTCAAGCCACCAAACGTA a GITVŁSŁETŁKTLFEFGALH b VSŁFSHWRP’KLSSSSVLCIc YHCSL1CDPKNSLRVRCFA»AJUlCATATACAGCATCIYXXCGTTGAAGAGTCCAATGAACTeCTCTACTTCAATCTCCCX 2101-------—--------------------------------------------------* 2160

TTTGTATATCTCGTAGAeiTGCAAOTCTCACGTrACTTGAGGAGATGAAGTTAGAGGG·!

a KHIQHLHVEECNELLYFHLP b NIYSISTŁKSAMNSSTSISHc ΤΥΤΑ5ΡΜ’Ενδ»ΤΡΕΰΟ5Ρ1TCACTCACTAACCATGGCAGGAACCTGAGAAGACTTAGCATrAAAAGTTGCCATGACTK· 2161---------------------------------------*-------------------* 2220 a SLTNHGRNLRRLSIKSCHDL b HSŁTMAGT’EDLALKVAMTWc TH*PWQEPEKT*H*K»P*LC fig. 2 (ciąg dalszy)

185 748

2221 2280

CTCATOGACCAGTSTGGGCGTCTAAAACTTTTACTAACCCAAKCiCĄGATCTCCAAGAC a 8YŁVTPA0FENDWLPSŁEVL b STWSHPQSŁKMSGFRV°RPoc YPGHTRRF^K^ŁASESRGSDACGTTACACAGCCTTCACAACTTAACCAGAGTGTGGGGAAATTCTCTAAGCCAAGATTGT 2281 2340

TCCAATGTGTCGGAAGTCTTCAATTGGTCTCACACCCCTTTAAGACAITCGGTrCTAACA β TŁHSLHNLTRVWGWSVSQDC b RYTAFTT«PECGEIŁ«AKIVC VTQPSQLNgSVCKFCEPRŁSCTGCGGAATATCCGTTGCATAAACATTTCACACTCCAACAAGCTGAAGAATGTeTCAiGG 2341-----------------------------►--------------------f---------- 2400 a ŁRNIRCINISHCMKLK-WVSW b eCISVA^eTFHTATS'RMSHCc AEYPLHKHFTLOOAEECŁMGCTCCAGAAACTCCCAAAGCrAGACGTGATTGAACTUTTCGACTCCAGAGAGATACAGGAA 2401 ------------------------------------------------------------- 2460

CAAGTCTITGAGGGTTrCGATCTCeACTAACTTGACAAGCTGACGTCTCTCTATCTCCTT

VQKLPKLEVIEŁFDCREIEE FRNSQS»R«LNC’STARR°RNSETPKARGD’TVRŁQKDRGICTGATAAGCGAACACGACAGTCCATCCGTCGAAGATCCAACATTGTrcCCAAGCCTGAAG 2461 ---------*---------♦---------------------------------------- 2520

AACTATTCGCTrGTGCTCTCAGGTAGGCAGCTTCTAGGTTGTAACAAGGGTTCGGACTTC

LISEHESPSVEOPTLFPSLK ®^łANTRVHPSKIQHCSQA*Rc DKRTRESIRRRSHIVPXPEDACCTTGAGAACTAGGGATCTCCCAGAACTAAACAGCATCCTCCCATCTCGATMTCATTC 2521 ------------------*---------------------------------------- 2580

TCCAACTCTTGATCCCTAGACGGTCTrGATTTGTCGTAGGAGGGTAGAGCTAAAAGTAAG a TŁRTRDŁPELNS1LPSRFSF b P*ELGIC«N»TASSHLDFHSc LEN^GSARTRgHPPISIFIPCAAAAAGTTGAAACATTAGTCATeACAAATTCCCCCAGAGTTAAGAAACTGCeGTTTCAG' 2581 ---------—--------o----------------—----------*---------- 2640

GTTTTTCAACTTrcTAATCAGTAGTCTITAACCGGGTCTCAATTCTnCACGCCAAAGTC a OXVETLVITHCPRVKKLPFQ b KKŁKH’SSgiAPELRNCRFRc KS’NISHHKLPQS*E3AVSGGAGAGGAGGACCOlGATGAACTTGCCAACAGTrrATTGTGAGGAGAAATGGTGGAAAGCA 2641 -------------------1·... —---------* 2700

CTCTCeTCCTCGGTCTACTTGAACGGTTGTOAATAACACTCCTCTITACCACCTTTCGT a ERRTQMNLPTVYCEEKWWXA b RGGPR’’TCQQFIVRRNGCXHc EEDPDELXNSLL’GEMVESTFIG. 2 (ciąg dalszy)

185 748

CTOakWAaaieaAcc&aacajuaaflCTJTOTOACTTaccacacTT^^ 3701---om^imaooełłogo^^aawoccaa^aanaaaaaaAaftffiaaaaaeiAao^^^-, Ώ τι ~BQ

OACCITXTrcCTaTTaSWSQCT?CKGJUAaUTMATC3CQCa8^^ & ŁS83QPMggŁCYŁP&yV?K« b H88JKQTKSFVXYB&ŁPSXBa ŚZRSTKaaAŁŁFT^ŁCeKŁS. TXTMM»OCTWU»eCAe?eT5TACJ^TaTOTCCXTTGATJtóflT2^acaeQ»ASCCa£KA 2761 ····—-•♦«-«~~·«^·~······*···»*«·,·*····~···*·»··«_β·βψ, 3838 λΤλΤΚΤεθλΤΧ'εϊΕΘΤβΛ3Α£Λ7ΟΤΤΤλΤΛεΑΟβΤλλβΤΛ'ϊ??ελ2θή^,Τ6δΤΤ^ιε®ΤθεΤ.

a YXS<*SH8YQXC?F!SS!BXPe “ b Σ1λΚ8ΤΪ4Υ£ΥνΗ3'’νλ.β398« β ® 2 Ł a A ł e Ϊ w a S X K K Q g A Ę K o ^TTSTTC£A£TSMSTCX7OACTn^CACMAflCeACAW^affimTTM^MT

TCCJUUCJUlOOTCAeYTeAOTAflTTOAAAOOTOTATCOOTOTTTTOATCTCTaATACATSSR a aŁFe»SKQŁ8T’P«W^e-aŁCM 1» β€832νΣΗ?ΡΗ8ΗΧΤ»ΒΥνΐ e vvgVKea?yaxaTRŁ2XM»g-o

Caę&AWA66AAaSTATCC3eSA /_SEQ TD N0:l) 2881 ----------------♦— 3303 ssATmT^yTTaATAeGceeę a S K ® a τ i a - (^SEQ ^{ID N0: 2-}5) b Σ K T K Ł S λ - <^SEQ ^{ID N0: 6-59}>

β »KPWYPR - (SEQ ID NO: 60-104)

Enzymy dokonujące cięcia: Żadne

Enzymy nie dokonujące cięcia:

ΚρηΣ

FXC. 2 (ciąg dalszy)

185 748

-146 ......

ATCGATTGATCTCTGGCTCAGTGCGAGTAGTCCATTTGAGAGCAGTCGTAGCCCCGCGTG - 8 6

GCGCATCATGGAGCTATTTGGAATTTTCGCAGGGTTATCGATTCGTAGTGGGAACCCATT -26 . . 1 . . . .

CATTGTTTGGAACCACCAACGGACGACTTAACAAGCTCCCCGAGGTGCATGATGAAAATT 35 MetŁyslle

GCTCCAGTTGCCATAKATCACAGCCCGCTCAGCAGGGAGGTCCCGTCACACGCGGCACCC 9 5

AlaProValAlaIl®AsELHisSerProLeuSerArgGluValProSerHisAlaAlaPro

ACTCAGGCAAAGCAAACCAACCTTCAATCTGAAGCTGGCGATTTAGATGCAAGAAAAAGT 155 ThrGlnAlaLysGlnThrAsnLeuGlnSerGluAlaGlyAspLeuAspAlaArgLysSer

AGCGCTTCAAGCCCGGAAACCCGCGCATTACTCGCTACTAAGACAGTACTCGGGAGACAC 215 SerAlaSerSerProGluThrArgAlaLeuLeuAlaThrLysTłiryalLeuGlyArgHis

AAGATAGAGGTTCCGGCCTTTGGAGGGTGGTTCAAAAAGAAATCATCTAAGCACGAGACG 27 5

Lys I leGluValPr oAlaPheGlyGlyTrpPheLy 8Ly sLysS er S erLy sHi s GluThr

GGCGGTTCAAGTGCCAACGCAGATAGTTCGAGCGTGGCTTCCGATTCCACCGAAAAACCT 335 GlyGlySerSerAlaAsnAlaAspSerSerSerYalAlaSerAspSerThrGluLysPro

TTGTTCCGTCTCACGCACGTTCCTTACGTATCCCAAGGTAATGAGCGAATGGGATGTTGG 395 LeuPheArgLeuThrHisValProTyrValSerGlnGlyAsnGluArgMetGlyCysTrp

TATGCCTGCGCAAGAATGGTTGGCCATTCTGTCGAAGCTGGGCCTCGCCTAGGGCTGCCG 455 TyrAlaCysAlaArgMetYalGlyHisSerYalGluAlaGlyProArgLeiiGlyLeuPro

GAGCTCTATGAGGGAAGGGAGGCGCCAGCTGGGCTACAAGATTTTTCAGATGTAGAAAGG 515 GluLeuTyrGluGlyArgGluAlaProAlaGlyLeuGlDAspPheSerAspValGluArg o · · · Λ ·

TTTATTCACAATGAAGGATTAACTCGGGTAGACCTTCCAGACAATGAGAGATTTACACAC 575 Phel 1 eHi sAsnGluGlyLeuThrAr gValAspLeuPr oAspAsnGluAr gPheThrHi s

Fig. 3A

185 748

GAAGAGTTGGGTGCACTGTTGTATAAGCACGGGCCGATTATATTTGGGTGGAAAACTCCG 635

GluGluLeuGlyAlaLeuLeuTyrLy sHi sGlyPr oll e 11 ePheGlyTrpLysThrPr o

AATGACAGCTGGCACATGTCGGTCCTCACTGGTGTCGATAAAGAGACGTCGTCCATTACT 695 AsnAspSerTrpHiBMetSerValLeiiThrGlyValAspLysGluThxSerSerIleThr

TTTCACGATCCCCGACAGGGGCCGGACCTAGCAATGCCGCTCGATTACTTTAATCAGCGA 755 PheHisAspProArgGlnGlyProAspLeiiAlaMetProLeuAspTyrPheAsnGlnArg

TTGGCATGGCAGGTTCCACACGCAATGCTCTACCGCTAAGTAGCAGGGTATCTTCACGTG 815

LeuAlaTrpGlnYalProHisAlaMetLeuTyrArgEnd (SEQ ID No:10 6)

GCGGCATCATGACAAGCCCATGATGCCGCCAGCAGCTACĆTGAATGCCGTCTGGCTTTTT 875 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GGTCCCTATTGTCGTATCCGGAAGATGACGTCAAAGAATCTCGGCAAGAGCTTTCTTGCT 935

CGACTCCTCAGCTTCCGGATCGATCAGGTCGCTTGCCAGAGCGCGCTTGTCCATGAGCAT 995

CTGCCACAGCTGCTGGTCGATGGTGTCCTCAGCTAAAGGGATTTTGACGACAACCATGCG 1055

CAACTGCCCGTTGCGATACGCTCGATCCTGAAGCCCCGGTGTCCATGGCAGCCCCAAGAA 1115

AAAGACATAGTTCGCCGCTGTGAGGTTGTAGCCTGTGCCGGCGGCCGACCTGGTCCCGAT 1175

AAACACCCTGCAGTCCGGATCCTGCTGGAAAGCATCAATCGCCTTCTGCCGCTTCTTGGG 1235

CGAGTCACTGCCCACCAACGTCACGCACCCGACGCCAAGCTTGAGGCAGTGCTCCCGCAA 1295

CGTGGCCACGGATTCCTGATACTCGCAGAAGAGGATCACCTTGTCGTCGAC 1346 (SEQ ID No:105)

Fig. 3B

185 748

RPS2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zasadniczo czysty DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego poliptydu odporności na patogen roślinny.
2. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że kodowany polipeptyd wywołuje superwrażliwą odpowiedź.
3. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że kodowany polipeptyd stanowi polipeptyd Rps.
4. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera gen Rps2 o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.
5. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że jest ono DNA genomowym.
6. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że DNA jest cDNA.
7. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że DNA pochodzi z rośliny rodzaju Arabidiopsis.
8. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że patogenem roślinnym są bakterie i grzyby.
9. Zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na fig. 2.
10. Zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.
11. Zasadniczo czysty DNA kodujący polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.
12. Zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym kodowany przez ten DNA polipeptyd zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny.
13. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że kodowany polipeptyd wywołuje super· wrażliwą odpowiedź.
14. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że DNA jest połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi ekspresji wspomnianego polipeptydu i tym, że sekwencje regulatorowe obejmują promotor.
15. DNA według zastrz. 14, znamienny tym, że promotor jest promotorem konstytutywnym.
16. DNA według zastrz. 14, znamienny tym, że promotor jest indukowany przez jeden lub więcej czynników zewnętrznych.
17. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że promotor jest specyficzny wobec typu komórki.
18. Wektor zawierający DNA kodujący polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR o zdolności do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny i kierowania ekspresją peptydu kodowanego przez DNA w komórkach zawierających ten wektor.

185 748
19. Wektor zawierający DNA zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na fig. 2.
20. Wektor zawierający zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.
21. Wektor zawierający zasadniczo czysty DNA kodujący polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR o zdolności do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu odporności na patogen roślinny, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.
22. Wektor zawierający zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 i zdolny do kierowania ekspresją polipeptydu kodowanego przez DNA w komórkach zawierających ten wektor.
23. Komórka zawierająca DNA kodujący polipetyd obejmujący pętłę-P i domenę LRR, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu odporności na patogen roślinny.
24. Komórka zawierająca DNA o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na fig. 2.
25. Komórka zawierająca zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.
26. Komórka zawierająca zasadniczo czysty DNA kodujące polipeptyd obejmujący pętlę i domenę LRR o zdolności do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.
27. Komórka zawierająca zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym kodowany przez ten DNA polipeptyd zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny.
28. Komórka według zastrz. 27, znamienna tym, że jest komórką roślinną.
29. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że komórka ta jest odporna na choroby spowodowane patogenem roślinnym niosącym gen braku zjadliwości wywołujący sygnał rozpoznawany przez polipeptyd Rps.
30. Komórka roślinna według zastrz. 29, znamienna tym, że patogen roślinny niesie gen avrRpt2.
31. Komórka roślinna według zastrz. 29, znamienna tym, że komórka ta pochodzi z grupy roślin obejmującej Arabidopsis, pomidora, soję, fasole, kukurydzę, pszenicę i ryż.
32. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że patogenem roślinnym jest Pseudomonas syringae.
33. Komórka roślinna według zastrz. 28, znamienna tym, że zawiera ponadto gen avrRpt2 połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi, przy czym wspomniane sekwencje regulatorowe obejmują promotor.
34. Komórka roślinna według zastrz. 33, znamienna tym, że promotor jest promotorem konstytutywnym.
35. Komórka r ślinna według zastrz. 33, znamienna tym, że promotor jest indukowalny przez jeden lub więcej czynników zewnętrznych.
36. Komórka roślinna według zastrz. 33, znamienna tym, że promotor jest specyficzny wobec typu komórki.
37. Rośliny trangeniczne, zawierające zasadniczo czysty DNA kodujący polipetyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu odporności na patogen roślinny, połączone w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi ekspresji polipeptydu obejmującymi pro

185 748 motor zintegrowany z genomem roślin, przy czym DNA ulega ekspresji w tych roślinach transgenicznych.
38. Rośliny transgeniczne zawierające zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na fig. 2, przy czym DNA ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.
39. Rośliny transgeniczne zawierające zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym DNA ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.
40. Rośliny transgeniczne zawierająca zasadniczo czysty DNA kodujący polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, a każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 i przy czym DNA ulega ekspresji we wspomnianej roślinie transgenicznej.
41. Rośliny transgeniczne zawierające zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny i przy czym DNA ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.
42. Rośliny transgeniczne utworzone z komórki roślinnej zawierającej DNA posiadające około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu odporności na patogen % roślinny i zawierające ponadto gen avrRpt2 połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi i charakteryzujący się tym, że sekwencje regulatorowe zawierają promotor, przy czym DNA i gen avrRpt2 ulegają ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.
43. Komórki z roślin transgenicznych zawierające zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na figurze 2, kodujący polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny.
44. Komórki z roślin transgenicznych zawierające zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję, aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na figurze 2 przy czym, DNA to ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.
45. Komórki z roślin transgenicznych zawierające zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym DNA to ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.
46. Komórki z roślin transgenicznych zawierające zasadniczo czysty DNA kodujący polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, a każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 i przy czym DNA to ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.
47. Komórki z roślin transgenicznych zawierające zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen % roślinny i przy czym DNA to ulega ekspresji we wspomnianych roślinach transgenicznych.
48. Komórki z roślin transgenicznych utworzone z komórek roślinnych zawierających DNA posiadające około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym kodowany przez to DNA polipeptyd zdolny jest do

185 748 nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny i zawierające ponadto gen avrRpt2 połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami regulatorowymi, charakteryzujący się tym, że te sekwencje regulacyjne zawierają promotor, przy czym DNA i gen avrRpt2 ulegają ekspresji we wspomnianej roślinie transgenicznej.
49. Sposób wykrywania genu odporności w komórce roślinnej, znamienny tym, że kontaktuje się zasadniczo czysty DNA kodujący polipetyd, zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, obejmujący pętlę-P i domenę LRR lub jego część większą niż długość 18 nukleotydów z preparatem genomowego DNA z komórki roślinnej w warunkach hybrydyzacji zapewniających wykrywanie sekwencji DNA wykazujących identyczność sekwencji około 50% lub większą z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.
50. Sposób wykrywania genu odporności w komórce roślinnej, znamienny tym, że kontaktuje się zasadniczo czysty DNA posiadający sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na figurze 2 lub jego część większą niż długość 18 nukleotydów z preparatem genomowego DNA z komórki roślinnej w warunkach hybrydyzacji zapewniających wykrywanie sekwencji DNA wykazujących identyczność sekwencji około 50% lub większą z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.
51. Sposób wykrywania genu odporności w komórce roślinnej, znamienny tym, że kontaktuje się zasadniczo czysty DNA wykazujący około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jego część większą niż długość 18 nukleotydów z preparatem genomowego DNA z komórki roślinnej w warunkach hybrydyzacji zapewniających wykrywanie sekwencji DNA wykazujących identyczność sekwencji około 50% lub większą z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQIDnr 1.
52. Sposób wykrywania genu odporności w komórce roślinnej, znamienny tym, że kontaktuje się zasadniczo czysty DNA kodujący polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego polipeptydu oporności na patogen roślinny, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, lub jego część większą niż długość 18 nukleotydów z preparatem genomowego DNA z komórki roślinnej w warunkach hybrydyzacji zapewniających wykrywanie sekwencji DNA wykazujących identyczność sekwencji około 50% lub większą z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.
53. Sposób wykrywania genu odporności w komórce roślinnej, znamienny tym, że kontaktuje się zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny lub jego część większą niż długość 18 nukleotydów z preparatem genomowego DNA z komórki roślinnej w warunkach hybrydyzacji zapewniających wykrywanie sekwencji DNA wykazujących identyczność sekwencji około 50% lub większą z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1.
54. Sposób izolowania z roślin genu odporności na chorobę lub jego część wykazującą identyczność sekwencji z genem kodującym polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, znamienny tym, że przeprowadza się amplifikację genu odporności na chorobę lub jego części metodą PCR z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych które to startery oligonukleotydowe są

a) wszystkie są większe pod względem długości niż 13 nukleotydów;

b) wszystkie posiadają regiony komplementarne do przeciwległych nici DNA w regionie sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1; i

c) ewentualnie zawierają sekwencje zdolne do wytwarzania miejsca cięcia przez enzymy restrykcyjne w zamplifikowanym produkcie; i izoluje się gen odporności na chorobę lub jego część.

185 748
55. Sposób zapewniania roślinie odporności na patogen roślinny, znamienny tym, że

a) wytwarza się transgeniczną komórkę roślinną zdolną do ekspresji zasadniczo czystego DNA kodującego polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny; i hoduje się roślinę transgeniczną z komórki roślinnej, przy czym DNA ulega ekspresji w tej wspomnianej roślinie transgenicznej.
56. Sposób zapewniania roślinie odporności na patogen roślinny, znamienny tym, że

a) wytwarza się transgeniczną komórkę roślinną zdolną do ekspresji zasadniczo czystego DNA posiadającego sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na figurze 2; i hoduje się roślinę transgeniczną z komórki roślinnej, przy czym DNA ulega ekspresji w tej wspomnianej roślinie transgenicznej.
57. Sposób zapewniania roślinie odporności na patogen roślinny, znamienny tym, że

a) wytwarza się transgeniczną komórkę roślinną zdolną do ekspresji zasadniczo czystego DNA kodującego polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencjąpętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1; i hoduje się roślinę transgeniczną z komórki roślinnej, przy czym DNA ulega ekspresji w tej wspomnianej roślinie transgenicznej.
58. Sposób zapewniania roślinie odporności na patogen roślinny, znamienny tym, że

a) wytwarza się transgeniczną komórkę roślinną zdolną do ekspresji zasadniczo czystego DNA posiadającego około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1, przy czym polipeptyd ten zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny i hoduje się roślinę transgeniczną z komórki roślinnej, przy czym DNA ulega ekspresji w tej wspomnianej roślinie transgenicznej.
59. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że roślina trangeniczna jest odporna na patogen bakteryjny lub grzybowy.
60. Sposób zapewniania roślinie odporności na patogen roślinny, znamienny tym, że hoduje się roślinę transgeniczną z komórki roślinnej odpornej na choroby spowodowane patogenem roślinnym niosącym gen braku zjadliwości wywołujący sygnał rozpoznawany przez polipeptyd Rps zawierająca zasadniczo czysty DNA posiadający około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 i charakteryzującej się tym, że patogen roślinny niesie gen avrRpt2, przy czym wspomniany DNA i wspomniany gen avrRpt2 ulegają ekspresji w roślinie transgenicznej.
61. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, że roślina trangeniczna jest odporna na patogen bakteryjny lub grzybowy.
62. Sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego pętlę-P i domenę LRR i który jest zdolny do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny pochodzenia bakteryjnego i grzybowego, znamienny tym, że

a) dostarcza się komórkę transformowaną zasadniczo czystym DNA kodującym polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR umiejscowiony w tej komórce dla wywołania ekspresji;

b) hoduje się stransformowaną komórkę w warunkach odpowiednich dla ekspresji tego DNA; i

c) izoluje się wspomniany polipeptyd.
63. Sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego pętlę-P i domenę LRR i który jest zdolny do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, znamienny tym, że

a) dostarcza się komórkę transformowaną zasadniczo czystym DNA posiadającym sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1 lub jej zdegenerowane warianty i kodujący sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na figurze 2;

185 748

b) hoduje się stransformowaną komórkę w warunkach odpowiednich dla ekspresji tego DNA; i

c) izoluje się wspomniany polipeptyd.
64. Sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego pętlę-P i domenę LRR i który jest zdolny do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, znamienny tym, że

a) dostarcza się komórkę transformowaną zasadniczo czystym DNA wykazującym około 85% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją DNA o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1;

b) hoduje się stransformowaną komórkę w warunkach odpowiednich dla ekspresji tego DNA; i

c) izoluje się wspomniany polipeptyd.
65. Sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego pętlę-P' i domenę LRR i który jest zdolny do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen pochodzenia bakteryjnego i grzyby roślinny, znamienny tym, że

a) dostarcza się komórkę transformowaną zasadniczo czystym DNA kodujący polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR, przy czym każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR o sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1;

b) hoduje się stransformowaną komórkę w warunkach odpowiednich dla ekspresji tego DNA; i

c) izoluje się wspomniany polipeptyd.
66. Sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego pętlę-P i domenę LRR i który jest zdolny do nadawania roślinom z ekspresją tego peptydu oporności na patogen roślinny, znamienny tym, że

a) dostarcza się komórkę transformowaną zasadniczo czystym DNA posiadającym około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 1;

b) hoduje się stransformowaną komórkę w warunkach odpowiednich dla ekspresji tego DNA; i

c) izoluje się wspomniany polipeptyd.
67. Zasadniczo czysty polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego poliptydu oporności na patogen roślinny.
68. Polipeptyd według zastrz. 67, znamienny tym, że polipeptyd zdolny jest do wywołania superwrażliwej odpowiedzi.
69. Polipeptyd według zastrz. 67, znamienny tym, że polipeptyd stanowi polipeptyd Rps.
70. Polipeptyd według zastrz. 67, znamienny tym, że pochodzi z rośliny rodzaju Arabidiopsis.
71. Polipeptyd według zastrz. 67, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z sekwencją aminokwasową rozpoczynającą się od Met9 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID nr 2.
72. Zasadniczo czysty polipeptyd obejmujący pętlę-P i domenę LRR zdolny jest do nadawania roślinom z ekspresją tego poliptydu oporności na patogen roślinny pochodzenia bakeryjnego lub grzybowego, przy czy każda pętla-P i domena LRR zawiera około 50% lub więcej identyczności sekwencji z sekwencją pętli-P i domeny LRR polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasową otwartej ramki odczytu „a” przedstawionej na fig. 2.

* * *