PL185830B1

PL185830B1 - Sposób selekcji świń, starter do badania obecnościSposób selekcji świń, starter do badania obecności polimorficznego miejsca oraz DNA polimorficznego miejsca oraz DNA

Info

Publication number: PL185830B1
Application number: PL97331353A
Authority: PL
Inventors: Max F.Rothschild Max F. Rothschild; Amy L.Vincent Amy L. Vincent; Christopher K.Tuggle Christopher K. Tuggle
Original assignee: Univ Iowa State Res Found Inc
Priority date: 1996-07-19
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 2003-08-29
Also published as: US5935784A; JP2001509006A; HK1024269A1; CN1230227A; CN1158390C; HUP0003264A3; DE69732536D1; WO1998003682A1; EP0958376B1; EP0958376A4; HUP0003264A2; AU727542B2; AU3513297A; CA2261158C; RO120411B1; PL331353A1; EP0958376A1; CA2261158A1; BR9710875A; KR20000067924A

Abstract

1. Sposób selekcji swin predysponowa- nych do osiagania liczniejszego miotu, w którym pobiera sie próbki materialu gene- tycznego swini, z n a m ie n n y ty m , ze prób- ke bada sie na obecnosc genotypu, w któ- rym wystepuje polimorficzne miejsce re- strykcyjne AluI w obszarze 3’ genu kodu- jacego receptor prolaktyny u swini, zwia- zanego z wiekszym miotem albo zwiaza- nego z utrzymywaniem ciezaru porodowe- go w liczniejszym miocie. F ig . 1 PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób selekcji świń predysponowanych do osiągania liczniejszego miotu, w którym pobiera się próbki materiału genetycznego świni. Istotą wynalazku jest badanie obecności genotypu, w którym występuje polimorficzne miejsce restrykcyjne Alul w obszarze 3’ genu kodującego receptor prolaktyny u świni, związanego z większym miotem albo związanego z utrzymywaniem ciężaru porodowego w liczniejszym miocie. Korzystnie w sposobie według wynalazku analizuje się polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), heterodupleksy, polimorfizm konformacyjny pojedynczych nici (SSCP), elektroforezę żelową w gradiencie denaturującym (DGGE) lub elektroforezę żelową w gradiencie temperaturowym (TGGE). Materiał genetyczny może być trawiony enzymem restrykcyjnym Alul, który trawi gen kodujący receptor prolaktyny świni w przynajmniej jednym miejscu; następnie rozdzielane są fragmenty uzyskane w wyniku trawienia i określany jest układ prążków tworzonych przez te fragmenty, po czym ten układ prążków jest porównywany z drugim układem prążków restrykcyjnych genu kodującego receptor prolaktyny świń uzyskanym z zastosowaniem tego samego enzymu, przy czym drugi układ prążków restrykcyjnych jest związany z liczniejszym miotem, korzystnie układy prążków restrykcyjnych są porównywane i identyfikowane są określone fragmenty na podstawie ich wielkości oraz porównanie wielkości tych fragmentów. W korzystnym rozwiązaniu, przed trawieniem amplifikuje się gen kodujący receptor prolaktyny lub jego fragment, który zawiera polimorfizm.

W sposobie według wynalazku stosuje się korzystnie sekwencje starterów zgodnego i odwrotnego, które umożliwiają amplifikację regionu genu kodującego receptor prolaktyny, który zawiera polimorficzne miejsce Alul. Startery mogąbyć wybrane w oparciu o sekwencję SEQ ID NO:3, w tym startery o sekwencji SEQ ID NO:4 oraz SEQ ID NO:5, korzystnie stosuje się starter zgodny wybrany spośród SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO:4, starter odwrotny wybrany spośród SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:5, korzystniej stosuje się zestaw starterów składający się z SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO:2.

Sposób korzystnie obejmuje etapy, w których rozdziela się porównywane fragmenty stosując elektroforezę żelową w obecności kontrolnego fragmentu DNA o znanej długości; po czym kontaktuje się rozdzielone fragmenty z sondą która hybrydyzuje z fragmentami tworząc kompleks fragment-sonda; oraz określa się długość rozdzielonych fragmentów wykrywając obecność kompleksów fragment-sonda i określa się ich względną pozycję w odniesieniu do kontrolnego fragmentu DNA. Korzystnie polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych uzyskuje się z grupy zawierającej fragment o długości 110 par zasad i 90 par zasad.

Kolejną odmianą wynalazku jest starter do badania obecności polimorficznego miejsca Alul w genie receptora prolaktyny świń, znamienny tym, ze zawiera sekwencję wybraną spośród SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 oraz SEQ ID NO:5.

Kolejnąodmianą wynalazku jest DNA o sekwencji odpowiadającej sekwencji 3’ regionu poddawanego translacji i regionu nie podlegającego translacji genu kodującego receptor prolaktyny świń, przy czym sekwencja ta obejmuje SEQ ID NO:3, korzystnie starter do amplifikacji polimorficznego miejsca restrykcyjnego Alul genu kodującego receptor prolaktyny świń zawierający przynajmniej 4 kolejne zasady z SEQ ID NO:3 albo starter będący starterem odwrotnym uzyskanym z SEQ ID NO:3.

Używane tu określenie „liczniejszy miot” oznacza znaczące zwiększenie i liczebności miotu powyżej średniej osiąganej w danej populacji. Dlatego, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu selekcji świń, mającej na celu wybranie tych zwierząt, które są bardziej predyspono

185 830 wane do otrzymywania liczniejszego miotu, i/lub tych które są mniej predysponowane do osiągania liczniejszych miotów.

Odpowiednie figury, dołączone do opisu w celu jego uzupełnienia, ilustrują jedną z realizacji wynalazku i wraz z opisem podają wyjaśnienie istoty wynalazku.

Figura 1 podaje sekwencję 3’-rejonu kodującego oraz regionu nie podlegającego translacji genu kodującego receptor prolaktyny świń (SEQ ID NO:3). Fragment wzmocniony techniką PCR przy użyciu starterów króliczych/ludżkich został oczyszczony za pomocą Amicon Mocrocon Filters stosując się do instrukcji producenta i (Ammicon, Inc.). Sekwencjonowanie przeprowadzono dzięki pomocy Uniwersytetu Stanu Iowa. Regiony sekwencji przedstawione kursywą stanowią niejasności w sekwencji i mogąbyć sekwencją ccaaaactac (SEQ ID NO:3) -> startery PCR świń -sekwencja królicza/ ludzka.

Figura 2 prezentuje polimorficzne układy prążków uzyskanych w wyniku trawienia produktu PCR enzymem Alul. Zgodny starter 5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG -3’ i odwrotny starter 5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA-3’ użyto w następujących warunkach prowadzenia reakcji PCR: 93°C przez 3 minuty, 6 36 cykli 93°C przez 30 sekund, 60°C przez 1 minutę, 70°C przez 1 minut i na końcu 72°C przez 3 minuty. Polimeraza Taq była dodawana dopiero, gdy próby osiągnęły temperaturę 8Ó°C. Produkty reakcji PCR trawiono Alul (New England Biolabs) i rozdzielano na 6% żelu agarozowym NuSieve (FMC) przy napięciu 120 V przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Żel wybarwiano bromkiem etydyny. Prążek 1 jest 1-kd wzorcem wagowym, ścieżki 2-4 odpowiadają trzem różnym genotypom.

Figura 3 prezentuje lokalizację PRLR na chr 16 świni. Sprzęganie wielopunktowe przeprowadzono przy pomocy CriMap uzyskując odpowiadające płciom najlepsze mapy, przy czym rozważano jako znaczące tylko 3 lub więcej punktów LOD.

Figura 4 jest diagramem prezentującym fragmenty otrzymane w teście PCR z zastosowaniem starterów o sekwencjach SEQ ID NO: 1 oraz 2.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU.

Zostaną teraz przedstawione szczegółowo wspomniane realizacje wynalazku, które wraz z przykładami, stanowią wyjaśnienie istoty wynalazku.

Wynalazek obejmuje markery genetyczne wielkości miotu i świń. Wynalazek dotyczy sposobu selekcji świń w celu stwierdzenia, które z nich są predysponowane do osiągania liczniejszego miotu w hodowli, polegającego na identyfikowaniu obecności lub nieobecności polimorfizmu genu kodującego receptor prolaktyny, który jest kojarzony z liczniejszym miotem. Używany tu termin „liczniejszy miot” oznacza biologicznie znaczący wzrost liczebności miotu powyżej średniej osiąganej przez daną populację.

Zatem, wynalazek obejmuje markery genetyczne i sposoby identyfikowania tych markerów u świni z określonej rasy, szczepu, populacji czy grupy, przy czym samica tej świni jest predysponowana do osiągania liczniejszego miotu w porównaniu ze średnią wielkością miotu uzyskiwaną w danej rasie, szczepie, populacji czy grupie. Jako metody służące do identyfikacji obecności bądź absencji takiego markera mogąbyć stosowane różne metody, przykładowo analiza polimorfizmu konfirmacyjnego pojedynczych nici (SSCP), analiza RFLP, analiza heterodupleksów, elektroforeza żelowa w gradiencie denaturującym, elektroforeza żelowa w gradiencie temperaturowym, reakcja łańcuchowa ligazy lub nawet bezpośrednie sekwencjonowanie genu kodującego receptor prolaktyny oraz poszukiwanie miejsc rozpoznawanych przez Alul w rejonie 3’ obszaru poddawanego translacji.

Inne możliwe techniki to systemy bezżelowe takie jak TaqMan™ (Perkin Elmer). W tym systemie oligonukleotydowe startery projektuje się w taki sposób, aby flankowały analizowaną mutację i przeprowadza się amplifikację regionu techniką PCR. Trzeci oligonukleotyd jest zaprojektowany w taki sposób, aby hybrydyzował z regionem zawierającym zasadę różniącą [Biijrózne allele genu. Sonda ta jest wyznakowana barwnikiem fluorescencyjnym zarówno na 5’ jak i 3’ końcu. Barwniki te są wybrane tak aby fluorescencja każdego z nich wygaszała się wzajemnie gdy są one w pobliżu siebie i nie mogła być wykrywana. Przedłużanie przez DNA polimerazę Taq startera PCR umieszczonego po stronie 5’ matrycy względem sondy prowadzi do trawienia barwnika przyłączonego do końca 5’ hybrydyzującej sondy za sprawą akty wno

185 830 ści nukleazy 5’ polimerazy DNA Taq. Usuwa to efekt wygaszania, pozwalając na wykrywanie fluorescencji barwnika na 3’ końcu sondy.

Rozróżnienie między różnymi sekwencjami DNA wynika z faktu, że gdy zachodzi niekompletna hybrydyzacja sondy z matrycą, tj. występuje błędne sparowanie, nie dochodzi do odcinania barwnika. W związku z tym, w przypadku gdy sekwencja sondy nukleotydowej jest całkowicie komplementarna z matrycą nie zachodzi wygaszanie. Mieszanina reakcyjna może zawierać dwie różne sekwencje sond, z których każda została zaprojektowana odpowiednio do dwu różnych alleli, co pozwala na ich wykrycie w jednej reakcji.

Stosowanie technik RFLP jest korzystną metodą służącą do wykrywania polimorfizmu. Jednakże, ponieważ stosowanie analizy RFLP zależy zasadniczo od polimorfizmu i rozmieszczenia miejsc restrykcyjnych wzdłuż cząsteczki kwasu nukleinowego, mogą być użyte również inne metody wykrywania polimorfizmu. Metody takie opierają się na analizie polimorfizmu odpowiedniego produktu, bądź też wykrywaniu końcowych różnic w analizowanych produktach genowych.

Ogólnie mówiąc, technika ta obejmuje otrzymywanie próbki DNA, trawienie endonukleazami restrykcyjnymi, rozdzielanie otrzymanych fragmentów i wykrywanie fragmentów różnych genów.

W niniejszym wynalazku otrzymuje się próbkę materiału genetycznego świni. Próbki mogąbyć pobierane z krwi, tkanek, nasienia etc. Komórki krwi są używane jako źródło materiału genetycznego, którym jest DNA. Odpowiednie ilości komórek dostarczają wystarczającą ilość DNA potrzebnego do analizy. Ilość ta może być łatwo określona przez fachowca. DNA izoluje się z komórek krwi znanymi specjalistom technikami.

Wybór odpowiednich starterów powinien umożliwiać amplifikowanie rejonu 3’ regionu kodującego oraz regionu nie poddawanego translacji z genu kodującego receptor prolaktyny świń, tak jak to przedstawiono na fig. 2. Podobne startery mogą zostać zaprojektowane przez fachowców w oparciu o dołączone wskazówki.

Wyizolowany DNA jest następnie trawiony endonukleazą restrykcyjną która nacina lub rozcina DNA w miejscu o specyficznej sekwencji nukleotydowej, zwanej miejscem restrykcyjnym. Takie endonukleazy, zwane także enzymami restrykcyjnymi są dobrze znane fachowcom. Do obecnego wynalazku, powinno się wybrać taki enzym, który tnie odpowiednio region kodujący gen kodujący receptor prolaktyny świń przynajmniej wjednym miejscu, dając przynajmniej dwa fragmenty genu. Określa się czy takie fragmenty są polimorficzne, czy też nie oraz czy polimorfizm (RFLP) jest związany z liczbą miotu, stosując w tym celu znane techniki i wskazówki zawarte w tym opisie. Korzystnie restrykcyjną endonukleazą jest Alul. Alul tnie dwuniciowe DNA, rozpoznając sekwencję 5’-AGCT-3’. Dodawana ilość enzymu do próbki DNA świni i inne odpowiednie warunki prowadzenia testu są jasne dla fachowców w oparciu o niniejsze wskazówki.

Fragmenty restrykcyjne są następnie analizowane znanymi technikami, które ogólnie zawierają rozdział fragmentów i ich wizualizowanie poprzez wybarwianie lub następnie przeniesienie na membranę i hybrydyzację w celu otrzymania szczególnego układu prążków lub określenia różnych rozmiarów fragmentów. Metoda ta pozwala zidentyfikować 1 lub więcej fragmentów (markerów) liczniejszego miotu świni. Preferowaną techniką rozdziału jest elektroforeza żelowa.

W technice tej, strawione fragmenty są rozdzielane w środowisku nośnika pod wpływem zastosowanego pola elektrycznego ze względu na ich rozmiar. Żele takie jak agaroza lub akrylamid są zwykle używane jako ośrodek nośnikowy. Próba zawierająca fragmenty restrykcyjne jest nakładana na koniec żelu. Ponadto nakłada się także wzorce mas cząsteczkowych, co pozwala w przybliżeniu określić wielkość fragmentów restrykcyjnych. Procedura ta pozwala ogólnie na rozróżnienie rozdzielanych fragmentów, różniących się od siebie nawet tylko o 1 lub 2 pary zasad.

W innej realizacji wynalazku, fragmenty są denaturowane i przenoszone fizycznie z żelu na nośnik stały, korzystnie będący nylonową membraną poprzez kontaktowanie żelu z filtrem w obecności odpowiednich odczynników i w odpowiednich warunkach, które są sprzyjające dla przenoszenia DNA. Takie odczynniki i warunki są dobrze znane fachowcom. Dzięki temu

185 830 zachowane jest względne położenie fragmentów DNA (układ prążków) otrzymane w wyniku rozdziału.

Kolejny etap obejmuje wykrywanie różnych kategorii układów prążków odpowiadających odpowiednim fragmentom, lub alternatywnie identyfikowanie fragmentu o ściśle określonej wielkości. Fragment ten jest szczególnie istotny, gdyż stanowi on genetyczny marker liczniejszego miotu. Najlepiej znane metody polegają na wybarwianiu fragmentów za pomocą bromku etydyny lub podobnych barwników.

Altematywąjest użycie technik hybrydyzacyjnych. Odpowiednią sondą jest oligonukleotyd lub polinukleotyd, który jest wystarczająco komplementarny lub homologiczny do fragmentów hybrydyzujących z nimi, tworząc kompleksy sonda fragment.

Bardziej korzystne jest stosowanie sondy cDNA. Oligonukleotydy znakuje się dającym się wykryć znacznikiem. Pozwala to wykryć fragmenty restrykcyjne, które hybrydyzują z sondami. Sondy znakuje się różnymi technikami, takimi jak znakowanie radioizotopowe, enzymatyczne, fluorescencyjne, biotynąi podobnymi znacznikami.

Sondy kontaktuje się odpowiednio długo z membraną nylonową, która zawiera fragmenty restrykcyjne, przy czym cały proces prowadzony jest w warunkach odpowiednich dla hybrydyzacji sond z fragmentami. Filtr jest następnie płukany w celu usunięcia niezwiązanych sond i innych niepożądanych materiałów.

Kompleksy sonda-fragment, które są związane z filtrem, są następnie wykrywane znanymi technikami. Przykładowo, jeśli sonda znakowana była radioaktywnie (³²P) detekcja polega na kontaktowaniu membrany nylonowej z błoną czułą na promieniowanie. Po upłynięciu odpowiedniego czasu ekspozycji, odpowiednie fragmenty są wizualizowane.

Etap detekcji dostarcza układów prążków, powstających w wyniku rozdzielenia fragmentów o różnych wielkościach. Porównywanie tych fragmentów z fragmentami kontrolnymi wzorca wagowego, które są dokładnie znane i rozdzielane na tym samym żelu, co pozwala na oszacowanie rozmiaru różnych grup fragmentów. Poszczególne polimorfizmy genu kodującego receptor prolaktyny świni są następnie określane poprzez porównanie układu prążków powstałych w wyniku podobnej analizy DNA pochodzącego z wielu świń.

Dla pewnych osobników, układ prążków będzie się różnił od tego, który otrzymuje się zwykle dla większości innych świń. Powodem może być polimorfizm długości jednego lub więcej fragmentów restrykcyjnych otrzymywanych w wyniku trawienia endonukleazą, która tnie gen kodujący receptor prolaktyny świń. Wskazuje to na różnice w sekwencji par zasad u takiej świni.

Zidentyfikowano szczególny fragment RFLP, tj. fragment restrykcyjny określonej długości, sonda specyficzna do tego fragmentu może zostać skonstruowana przy użyciu znanych technik. Umożliwia to szybką i wieloraką detekcję takiego polimorfizmu. Próba jest kontaktowana z sondą chwytającą, która jest zimmobolizowana na nośniku stałym. Sonda łączy się z fragmentem. Nośnik jest następnie przemywany i dodawana jest znaczona sonda detekcyjna. Po kolejnym przemywaniu, bada się obecność sondy detekcyjnej, która dowodzi obecności pożądanego fragmentu.

W innej realizacji wynalazku, bada się układ prążków RFLP lub pewien fragment polimurficzny i porównuje się z drugim, znanym układem prążków RFLP lub fragmentem, który jest związany ze wzrostem wielkości miotu. Ten drugi układ prążków lub fragment są określane również dla genu kodującego receptor prolaktyny świń, przy użyciu tej samej endonukleazy restiykcyjnej co poprzednio i tej samej sondy bądź jej odpowiednika w takich samych warunkach.

W innej realizacji wynalazku, fragmenty restrykcyjne mogą być wykrywane poprzez hybrydyzacje w roztworach. W tej technice, fragmenty są najpierw poddawane hybrydyzacji z sondą a następnie rozdzielane. Oddzielony kompleks sonda-fragment jest następnie wykrywany w sposób opisany powyżej. Zwykle, takie kompleksy są wykrywane w żelu, bez przenoszenia ich na membranę.

W najkorzystniejszej realizacji polimorfizm jest określany poprzez zastosowanie PCR, bez korzystania z sondy.

W tym sposobie startery są konstruowane , tak aby amplifikowany był region wykazujący polimorfizm. Odpowiednie startery zawierające korzystnie 4-30 zasad opierają się na sekwencjach otaczających region polimorficzny i obejmują zgodny starter 5’ oraz odwrotny

185 830 lub anty-sensowny starter dla regionu polimorficznego starter 3’. Startery nie muszą być ściśle komplementarne i zasadniczo zgodne sekwencje są również akceptowalne. Następnie dodawana jest polimeraza DNA taka jak polimeraza Taq (wiele takich polimeraz jest znanych i dostępnych w sprzedaży), trójfosforany czterech nukleozydów oraz często czynnik buforujący. Detekcja jest przeprowadzana przez wybarwianie próby, takimi środkami jak bromek etydyny, i stwierdzanie obecności produktu o długości wynikającej z długości regionu amplifikowanego. Czas reakcji, reagenty i odpowiednie startery są znane dla specjalistów z tej dziedziny techniki. Ponadto PCR może zostać użyty w połączeniu z badaniem polimorfizmu) konformacyjnego pojedynczych nici (SSCP).

Mimo iż powyższe sposoby zostały opisane przewidując użycie jednego enzymu restrykcyjnego i jednego zestawu starterów, nie są one w ten sposób ograniczone. Może zostać użyte, jeśli to pożądane, jeden lub więcej dodatkowych enzymów restrykcyjnych i/lub sond i/lub starterów. Dodatkowe enzymy, projektowane i sondy i startery mogą być określone w rutynowych eksperymentach.

Markery genetyczne wielkości miotu u świni są określane w sposób następujący. Kojarzy się samce i samice tej samej rasy lub krzyżówki lub zwierzęta pochodzące z podobnych linii genetycznych. Określa się ilość potomstwa dawanego przez każdą z samic świń. Przeprowadza się analizę RFLP rodzicielskiego DNA w sposób opisany powyżej w celu określenia polimorfizmu genu kodującego receptor prolaktyny u każdej świni. Polimorfizmy są kojarzone z liczbą potomstwa. Badania te prowadzi się dla co najmniej 20 samic, korzystnie co najmniej 40 samic. Liczba powtórzeń miotu (tj. parowań) wynosi przynajmniej 1. Korzystnie, cykle rozrodcze i porodowe powtarza się przynajmniej 2-krotnie, najkorzystniej przynajmniej 3-krotnie.

Gdy prowadzi się analizę i określa polimorfizm poprzez analizę PCR RFLP przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej Alul, startery do amplifikacji mogą zostać zaprojektowane przy użyciu analogicznych sekwencji ludzkiej lub króliczej prolaktyny dzięki wysokiej homologii regionu otaczającego polimorfizm, lub mogą zostać zaprojektowane przy użyciu znanych danych sekwencyjnych genu prolaktyny świń co zaprezentowano na Fig. 1 lub nawet zaprojektowane w oparciu o sekwencje otrzymane z połączenia danych dotyczących blisko położonych genów. Zgodnie z wynalazkiem zaprojektowano zestaw starterów służący do amplifikacji regionu fragmentu o długości 457 par zasad (starter zgodny 5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG-3’ (SEQ ID NO:1) i starter odwrotny 5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA-3’ (SEQ ID NO:2)) co daje po cięciu fragmenty polimorficzne o długości 124, 110, 79, 77, oraz 67 par zasad. Miejsce polimorficzne jest ulokowane we fragmencie o długości 110 par zasad. Gdy obecne jest polimorficzne miejsce cięcia otrzymywany jest fragment o długości 90 par zasad. Wykazano, ze fragmenty polimorficzne są allelami i są związane ze wzrostem liczebności miotu u różnych hodowli. W związku z tym, świnie heterozygotyczne posiadają następujący układ prążków odpowiadających fragmentom po cieciu Alul: 124, 110, 90, 79, 77 i 67. Homozygoty pod względem polimorficznego miejsca cięcia wykazują układ prążków 124, 90, 79, 77, 67 bądź 124, 110, 79, 77, 67. Genotyp związany z liczniejszym miotem występuje naprzemiennie u różnych odmian. Wynik ten jest podobny do sytuacji ujawnionej w opisie patentowym U.S.A 5,374,523 zatytułowanym „Warianty alleli genu wołowej somatotropiny: markery genetyczne zwiększonej produkcji mleka u krów”, w którym wynalazcy odkryli polimorfizm alleli genu somototropiny, przy czym jedna z form alleli występowała u krów jersey natomiast forma odmienna u krów rasy Holstein.

Reagenty użyteczne w stosowanej w wynalazku metodzie mogą być pakowane w postaci dogodnych zestawów. Zestawy dostarczają potrzebnych materiałów, pakowanych do odpowiednich pojemników. W wersji minimalnej, zestaw zawiera reagenty pozwalające zidentyfikować polimorfizm genu kodującego receptor prolaktyny świń, który jest związany z liczniejszym miotem . Korzystnie, reagenty, które hybrydyzująz genem receptora prolaktyny świń lub jego fragmentem, tworzą zestaw do przeprowadzania PCR (zestaw starterów wraz z polimerazą DNA i 4 trój fosforanami nukleozydów). Korzystnie, zestaw zawiera układ do PCR oraz enzym restrykcyjny trawiący w co najmniej jednym miejscu gen kodujący receptor prolaktyny świń, przy czym startery korzystnie mają sekwencje: SEQ ID NO: 1 oraz SEQ ID NO:2, a enzymem restrykcyjnym jest Alul. Korzystnie, zestaw zawiera ponadto dodatkowe

185 830 elementy, takie jak reagenty, służące do detekcji lub pomiaru wykrywanych jednostek lub dostarczających próbę kontrolną. Inne reagenty, takie jak użyteczne do hybrydyzacji, prehybrydyzacji, ekstrakcji DNA, wizualizacji itp. mogą również, gdy jest to pożądane wchodzić w skład zestawu.

Sposoby i zestawy według wynalazku mogą również być użyte bardziej ogólnie do oceny DNA świń, typu genetycznego poszczególnych osobników, oraz do wykrywania genetycznych różnic wśród świń. W szczególności, próba DNA genomowego świni może być oceniana poprzez odniesienie to jednej lub więcej próby kontrolnej w celu określenia obecności polimorfizmu genu kodującego receptor prolaktyny. Korzystnie, analiza RFLP jest prowadzona w odniesieniu do genu kodującego receptor prolaktyny świń, a wyniki są porównywane z próbą kontrolną.

Kontrola jest rezultatem analizy RFLP genu kodującego receptor prolaktyny innej świni, dla której znany jest polimorfizm genu kodującego receptor prolaktyny. Podobnie genotyp genu kodującego receptor prolaktyny świni może być określany poprzez otrzymywanie próbki jej DNA genomowego, przeprowadzanie analizy RFLP genu kodującego receptor prolaktyny w DNA i porównywanie wyników z próbą kontrolną. Również kontrola jest rezultatem analizy RFLP genu kodującego receptor prolaktyny świń u innej świni. W efekcie określamy typ genetyczny świni poprzez oznaczenie polimorfizmu jej genu kodującego receptor prolaktyny.

Ponadto, genetyczne zróżnicowanie wśród świń, może być oznaczane poprzez otrzymywanie próby genomowego DNA z co najmniej dwóch świń, oznaczanie obecności lub braku polimorfizmu genu kodującego receptor prolaktyny i porównywanie wyników.

Takie postępowanie jest przydatne w identyfikowaniu markerów genetycznych odnoszących się do wielkości miotu, jak to opisano powyżej, dla identyfikacji innych polimorfizmów w genie receptora prolaktyny, który może być skorelowany z innymi cechami oraz w ogólnej analizie badawczej genotypów i fenotypów świń.

Markery genetyczne, metody oraz zestawy według wynalazku są także użyteczne w programach hodowlanych w ulepszaniu wielkości miotu u hodowanych ras, linii i populacji świń. Ciągła selekcja i reprodukowanie macior, które są przynajmniej heterozygotami, a korzystnie homozygotami pod względem polimorfizmu związanego ze zwiększoną wielkością powinno prowadzić do ras, linii, lub populacji dających większą liczbę potomstwa w każdym miocie u samic należących do tej rasy lub linii. Stąd, takie markery są narzędziami selekcyjnymi.

Jest także zrozumiałe, że zastosowanie wskazówek niniejszego wynalazku w określonych zagadnieniach leży w zakresie wiedzy specjalisty z tej dziedziny.

Przykłady realizacji produktów i sposobów według niniejszego wynalazku zostały zilustrowane następującymi przykładami.

Przykład 1.

Dzięki wysokiej homologii sekwencji i podobieństwa w procesach dojrzewania transkryptów, do zaprojektowania zdegenerowanych starterów ograniczających region kodujący 3’ oraz region nie poddawany translacji, użyto ludzką (Boutin i wsp. 1989) oraz króliczą (Edery i wsp. 1989) sekwencję cDNA kodującą receptor prolaktyny. Stosując startery amplifikowano fragment o długości około 500 par zasad pochodzący z prób DNA genomowego świni oraz ludzkiego, użytego jako próba kontrolna. Starter zgodny 5’-TCA CAA GGT CAA/TAA AGA TG-3’ (SEQ ID NO:4) oraz odwrotny starter 5’-TGG/A AGA AAG/A AGG CAA G/ATG GT-3’ (SEQ ID NO:5) były użyte w następujących warunkach prowadzenia reakcji PCR: 93°C przez 3 minuty, 6 cykli 93°C przez 30 sekund, 47°C przez 2 minuty. 72°C przez 3 minuty, 36 cykli 93°C przez 30 sekund, 53°C przez 2 minuty, 72°C przez 5 minut i na końcu 72°C przez 5 minut. Polimeraza Taq była dodawana dopiero gdy próby osiągnęły temperaturę 80°C.

Fragmenty z dwu zwierząt oczyszczano i sekwencjonowano je w obydwu kierunkach. Region kodujący sekwencji pochodzącej od świni zamieniano na aminokwasy i porównywano ze znanymi sekwencjami. Poszukiwania w bazach danych wykazały, że sekwencje króliczego i ludzkiego PRLR posiadają najwyższe podobieństwo, tj. odpowiednio 82% i 74% zgodności. Bazując na sekwencji DNA świni, zaprojektowano startery (starter zgodny 5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG-3’ i starter odwrotny 5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA-3’ (SEQ ID NO:2)) które amplifikowały fragment o długości 457 par zasad (Figura 1). Do trawienia produktu amplifikacji użyto endonukleaz restrykcyjnych: Taq 1, Sau3a, PvuII, Mspl oraz Alul, w wyniku czego wykryto polimorfizm przy trawieniu Alu I w regionie kodującym genu. Roz

185 830 dział fragmentów uzyskano metodą elektroforezy w żelu agarozowym (figura 2). Długości fragmentów uzyskanych w wyniku opisanego PCR-RFLP wynosi około 124, 110, 79, 77 oraz 67 par zasad, przy czym miejsce cięcia związane z polimorfizmem jest zlokalizowane we fragmencie o długości 110 par zasad.

W następstwie cięcia związanego z polimorfizmem uzyskuje się fragment o długości 90 par zasad. Patrz figura 4 pokazująca uzyskiwany układ prążków. Ustalono genotypy względem odnośnikowych PiGMaP rodzin (Archibald i wsp. 1995), zawierających informacje o wszystkich dostępnych rodzinach. Analizowano genotypy stosując 2-punktowe sprzężenie przy użyciu oprogramowania CriMap (Green i wsp. 1990), zakładając znaczące punkty LOD powyżej 3. Loci PRLR został w przybliżeniu ustalony w sprzężeniu z trzema markerami, które znajdują się na 16 chromosomie opublikowanej mapy sprzężeń PiGMaP. Analiza wielopunktowa posłużyła także do uzyskania lepszej mapy chromosomu 16 (Figura 3) zawierającej wszystkie markery sprzężeń.

Przykład 2. Test PCR dla genetycznego markera receptora prolaktyny.

Reakcja ampliflkacji PCR była prowadzona w następujących warunkach.

Startery:

starter zgodny 5’CCCAAAACAGCAGGAGAACG-3’ (SEQ ID NO:1) starter odwrotny 5’-GGCAAGTGGTTGAAAATGGA-3’ (SEQ ID NO:2)

Warunki PCR:

mieszanina reakcyjna („cocktail mix”)

X PCR bufor (Promega) mM MgCl₂ (Promega) mM dNTP (Boehringer Mannheim) pmol/μΐ starter zgodny pmol/μΐ starter odwrotny dd sterylna H₂O

12,5ng/pl DNA polimeraza Taq (Promega) μΐ reakcji

2,5 μΐ

2,0 μΐ

0,5 μΐ

17,5 μΐ

1,5 μΐ 0,125μ1.

Pierwsze 6 składników powinno zostać zmieszane i dodane do każdej probówki reakcyjnej. Następnie dodaje się DNA i pokrywa powierzchnię roztworu kroplą sterylnego oleju mineralnego. Umieszcza się probówki reakcyjne w termocyklerze i ogrzewa do 80°C. Miesza się polimerazę Taq ze wspomnianą mieszaniną i dodaje po 5 μΐ do probówek reakcyjnych, upewniając się, że końcówka pipety zanurzyła się poniżej oleju.

Program termocyklera:

1. 93 °C 3 minuty

2. 93°C 30 sekund

3. 60°C 1 minuta

4. 72°C 1 minuta^v

5. wróć do etapu 2 przez 34 cykle

6. 72°C 3 minuty

Ί. 4°C stale μΐ produktów PCR wraz z 2 μΐ 6X barwnika do elektroforezy nanoszono na 1% żel agarozowy. Rozdzielano pod napięciem 120V przez 30 minut i wybarwiano bromkiem ety dyny.

Trawienie Alul·.

mieszanina do trawień (na 20 μΐ produktu PCR) 10X NEBuffer 2 (New England Biolabs) 8U/pl Alul (New England Biolabs) dd sterylna H₂O

Każdorazowo:

2,5 μΐ

0,5 μΐ

2,0 μΐ

Mieszano reagenty i dodawano po 5 μΐ do każdej probówki. Próby inkubowano przez noc w 37°C.

Elektroforeza żelowa:

Rozdzielano fragmenty dodając 5 μΐ 6X barwnika do elektroforezy do produktów trawienia na 6% NuSteve (FMC) żelu agarozowym pod napięciem 120V przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Żel wybarwiano bromkiem etydyny.

185 830

Długości fragmentów uzyskanych w wyniku PCR-RFLP wynoszą około 124, 110, 79, 77 oraz 67 par zasad, przy czym miejsce cięcia związane z polimorfizmem jest ulokowane we fragmencie o długości 110 par zasad. Gdy obecne jest miejsce cięcia związane z polimorfizmem uzyskuje się fragment o długości 90 par zasad. Stąd dla heterozygot uzyskiwano prążki 124, 110, 90, 79, 77 oraz 67. W przypadku homozygot otrzymywano odpowiednio prążki 124, 90, 79, 77 i 67 oraz 124, 110, 79, 77 oraz 67.

Figura 4 prezentuje diagram fragmentów otrzymywanych z testu PCR. (A odpowiada allelowi nie posiadającemu miejsca Alu I, B odpowiada allelowi posiadającemu miejsce Alu I).

Przykład 3. Związek genotypu z wielkością miotu.

Przeprowadzano reakcję PCR jak opisano powyżej w przykładzie 2 dla kilku macior z Pig Improvement Company (PIC). Użyte zwierzęta były maciorami linii PIC 19, które prosiły się co 6 miesięcy i loszek które rodziły się w tym okresie co może zostać uznane za inwentarz hodowlany. Pobierano próbki krwi i tkanek i przewożono do laboratorium gdzie oczyszczano DNA używane do testów PRLR PCR. Samice podawano analizie od 1 do 3 razy. Określano „szacunkową wartość hodowlaną w całkowitej ilości narodzin” ( BV TNB od ang. Estimated Breeding Value for Total Number Bom) używając mieszanego modelu liniowego w którym każde udane parowanie lochy traktowano jako jednorazowy zbiór danych. Używano tylko pierwszych trzech parowań maciory. Model obejmował współzmienność wieku w gnieździe prosiaków z parowaniem, ustalał efekt parowania, typ obsługi ( naturalna lub Al), miesiąc prosienia, oraz stały losowy efekt środowiskowy i zwierzęcy. Założono trend h² równy 0,10 oraz powtarzalność 0,21. Przeciętna liczba narodzin ( AV NB ) została wyliczona jako średnia arytmetyczna ze wszystkich parzeń (1-3) dla każdej samicy. Porównania genotypowe przeprowadzono dla (BV TNB) oraz (AV NB) poprzez uśrednienie BV TNB oraz AV NB dla każdego genotypu. Wyniki zostały zgromadzone w tabeli 1.

Tabela 1

Średnie dla próby zwierząt LI9 o różnych genotypach PRLR

Genotyp BB
(n=18)	BV TNB	AVNB
średnia	0,2036	10,32
odchylenie standardowe	0,3984	1,746193
błąd standardowy	0,0939	0,411838
Genotyp AB
(n=75)	BV TNB	AV NB
średnia AB	0,1203	9,66
odchylenie standardowe AB	0,5317	2,77238
błąd standardowy AB	0,0622	0,320136
Genotyp AA
(n=109)	BV TNB	AV NB
średnia AA	0,0755	9,75
odchylenie standardowe AA	0,5757	2,513279
błąd standardowy AA	0,0551	0,243064

P r z y k ł a d 4. Podsumowanie analizy receptora prolaktyny u linii „Wielka Biała”, „Meishan Syntetic” oraz „Landrace”

Analizie wielkości miotu poddano w sumie 2,714 protokołów miotów u 1,077 macior. Obserwowano takie cechy jak całkowita liczba narodzin (TNB) oraz liczba narodzin żywych

185 830 (NBA) u pięciu linii PIC. Tymi pięcioma liniami były : „Wielka Biała” ( dwa różne pochodzenia) i źródło „Landrace”, jak i sztuczne linie: „I’ Duroc”, „E Wielka Biała” oraz źródło „Wielka Biała/Meishan”. Genotyp PRLR tłumaczył statystycznie znaczne zróżnicowanie wielkości miotu u trzech testowanych linii. Dwie linie nie wykazały znaczącego statystycznie efektu ( P.0,1, wyniki nie zaprezentowane). Najmniejsze odchylenia średniokwadratowe dla TNB i NBA u każdej z trzech statystycznie znaczących linii zostały podsumowane w tabeli 2.

DNA otrzymywano z krwi i tkanki ogona. DNA poddawano analizie jak opisano w przykładzie 2 powyżej.

Modele posiadały ustalone efekty: pory zganiania, rodzaju obsługi, receptora prolaktyny, parowania (1,2, 3+) oraz współzmienność: ESR (receptor estrogenu) i efekt losowy: ojciec.

Oddziaływania w obrębie stada, ESR oraz receptor prolaktynowy testowano także pod kątem ich znaczenia. Dziedziczenie cechy miotu oszacowano jako 0,10 a powtarzalność jako 0,21. Efekt zamiany alleli oszacowano przez zastąpienie genotypu 5 PRLR współzmiennąheterozygotą która zawierała określoną liczbę obecnych alleli A (0,1, lub 2). Efekt dominujący oszacowano jako odchylenie średnie heterozygot od przeciętnej średnich genotypów homozygot.

Główne wnioski:

sztuczna „Wielka Biała”

Wskazanie na efekt dominujący.

Próba składała się z 400 macior dających 1197 protokołów miotów. Zwierzęta AA posiadały przeciętnie o 0,66 świni / miot więcej w NBA w porównaniu z pozostałymi dwoma genotypami (p.<0,05). Wykazano efekt dominujący allelu B.

sztuczna „Meishan”

Znaczny efekt dominujący (nad-dominacja) w trakcie wszystkich parowań, ale głównie przy pierwszym parowaniu.

Próba składała się z 261 macior dających 832 protokoły miotów. Wykazano dodatni efekt dla TNB (P < 0,05 ) i NBA (P < 0,05 ) oraz efekt nad-dominacji dla NBA ( < 0,01) u tej linii.

sztuczna „Landrace”

Wskazanie na efekt dominujący.

Próba składała się z 416 macior dających 685 protokołów miotów. Stwierdzono różnicę o ponad jedną świnię na miot między dwoma homozygotycznymi genotypami zarówno dla TNB (P < 0,05 ) jak i dla NBA (P < 0,1), przy czym allel A jest faworyzowany.

Efekty TNB wykazują ten sam trend co NBA dla każdej z populacji. Wyniki z Tabeli 2 wskazują że PRLR daje znaczący efekt w wielkości miotu mierzonej jako

TNB i NBA u trzech komercyjnych linii. Jest widoczne, że tło genetyczne u poszczególnych linii wpływa na sposób i rozmiar wyrażania cechy. Ponadto, niestwierdzono znaczących różnic dla przeciętnych Wag Porodowych wśród testowanych linii. Jest to potencjalnie wartościowe spostrzeżenie ponieważ zwykle obserwuje się odwrotną zależność między rozmiarem miotu a szacunkową wagą porodową. Dlatego też gen kodujący receptor prolaktyny dostarcza sposobu zwiększania wagi porodowej w liczniejszym miocie.

Tabela 2

Najmniejsze odchylenia średniokwadratowe u każdego genotypu PRLR wśród wszystkich parowań oznaczone dla TNB, NBA, przeciętnej wagi porodowej (ABW) u trzech komercyjnych linii świń.

Linia komercyjna	genotyp PRLR	TNB	NBA
1	2	3	4
sztuczna „Wielka Biała”	AA	12,51	12,39
	AB	12,35	11,73
	BB	12,71	11,73
			P.<0,05
efekt	a	0,10	-0,33^b
	d	-0,26	-0,33^a
sztuczna „Meishan”	AA	13,64	12,94

185 830

Dalszy ciąg tabeli 2

1	2	3	4
	AB	14,35	13,74
	BB	13,96	13,27
		P.<0,05	P.<0,05
efekt	a	0,16^b	0,16^b
	d	0,55^b	0,63^c

sztuczna „Landrace”	AA	12,13	11,33
	AB	11,72	10,92
	BB	10,98	10,31
		P.<0,08	P.<0,10
efekt	a	0,5 l^b	0,47^b
	d	0,17	0,10

a= efekt dodatni; d = efekt dominujący; efekty są znaczące przy ^aP<0,l, ^bP<0,05 , ^cP<0,01

Przykład 5. Zmienność w obrębie różnych ras.

Ponadto, wytypowano próby z siedmiu ras, obejmujące występujące w USA rasy Chester White, Duroc, Hampshire, Landrace, oraz Yorkshire, występującą w Chinach Meishan oraz europejską „Wielką Białą” (tabela 3).

Tabela 3

rasa	częstość genotypu	częstość alleli
	AA	AB	BB	A	B
Landrace n=9	,56	,33	,H	,72	,28
Duroc n=10	,5	,5	0	,79	,21
Yorkshire n=12	0	,75	,25	,37	,63
Chester Whie=10	,1	,3	,6	,25	,75
Hampshire n=ll	0	,09	,91	,05	,95
Meishan n=9	,33	,44	,22	,56	,44
Wielka Biała n=ll	,09	,46	,45	,32	,68

Istnieją pewne różnice pomiędzy rasami dotyczące częstości genu PRLR.

Istnienie polimorfizmu zlokalizowanego w 3'regionie genu jest interesujące ponieważ alternatywne składanie PRLR przebiega w tym regionie genu u innych gatunków. Różnice w częstości alleli pomiędzy rasami sugerują, że jeden allel może zostać wyizolowany w pewnych populacjach, natomiast w innych nie jest to możliwe.

185 830

Następujące publikacje zostały w całości włączone do niniejszego opisu przez ich przywołanie:

1. Archibald, A., Haley, C, Brown, J., Couperwhita, S., McQueen, H., Nichoison, D., Coppieters, W., Van de Weghe, A., Stratil, A., Wintero, A., Fredholm, M., Larsen, N., Nielsen, V., Milan, D., Wołoszyn, N., Robie, A., Dalens, M., Riquet, J., Gellin, J., Caritez, J.C., Btugaud, G., Ollivier, L., Bidanel, J.P., Vaiman, M., Renard, C., Geldermann, H., Davoli, R., Ruyter, D., Verstege, E., Groenen, M., Davies, W., Hoyheim, B., Keisarud, A., Andersson, L., Ellegren, H., Johansson, M., Marklund, L., 5 Miller, J., Anderson Dear, D., Signer, E., Jeffreys, A., Moran, G., Le Tissier, P., Muladno., R,othschild, M., Tuggle, C., Vaske, D., Heim, J., Liu, Fi.C., Rahrnan, A., Yu, T.P., Larson, R.G., Schmitz, C. (1995) PiGMaP Całościowa mapa sprzężeń świni (Sus scofa). Mamm.Genome 6, 157-175.

2. Boutin, J., Edery, M., Shirota, M., Jolicoeur, C., LeSueur, L., Ali, S., Gould, D., Djiane, J., Kelly, P. (1989). Zidentyfikowanie cDNA kodującego długą formę receptora prolaktyny w ludzkich komórkach Hepatoma i komórkach raka piersi. Mol. Endpcrinol. 3, 1455-1461.

3. Edery, M., Jolicoeur, C., Levi-Meyrueis, C., Dusanter-Fourt, L, Petridou, B., Boutin, J., le Sueur, L., Kelly, P., Djiane, J. (1989) Zidentyfikowanie i analiza sekwencji drugiej formy receptora prolaktyny za pomocą klonowania komplementarnego DNA z króliczych gruczołów mlecznych. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2112-2116.

4. Green, P., Falls, K., Crooka S. (1990). Dokumentacja CR.IMAP, wersja 2.4. Washington University School of Medicine, St. Louis.

5. Jammes, H, Schisar, A., Djiane, J (1985) Układy różnicujące receptor prolaktyny luteicznej i receptor LH podczas dojrzewania macior i wieprzów. J. Reprod Fertil. 73, 27-35.

ó. Kelly, P., Djiane, J., Postel-Vinay, M., Edery, M. (1991). Rodzina receptorów prolaktyny/hormonu wzrostu. Endocrin. Rev. 12.235-251.

7. Lebrun, J., Ali, S., Groffin, V., Ullrich, A., Kelly, P. (1995). Pojedyncza reszta tyrozynfosforanowa receptora prolaktyny jest odpowiedzialna za aktywację trankrypcji genu. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 40314035.

8. LeSueur, L., Edery, M., Ali, S., Pały, J., Kelly, P. (1991). Porównanie długiej i krótkiej formy receptora prolaktyny w transkrypcji genów białek mleka indukowanej przez prolaktynę. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 824-828.

9. Rothschild, M., Jacobson, C., Vaske, D., Tuggle, C., Wang, L., Short, T. Eckardt, G., Sasaki, S., Vincent, A., McLaren, D., Southwood, O, van der Steen, H. Mileham, A., Piastów, G. (1996). Loci receptora estrogenu jest związane z głównym genem kształtowania wielkości miotu u świń. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 201-205.

10. Rui, H., Djeu, J., Evans, G., Kelly, P., Farrar, W. (1992). Uwalnianie receptora prolaktyny. J. Biol. Chem. 267, 24076-24081.

ll. Yuan, W., Lucy, M. (1996). Wpływ hormonu wzrostu, prolaktyny, czynników wzrostu podobnych do insuliny i gonadotropiny na sekrecję progesteronu przez komórki jajnika świń. Celłs. J. Anim. Sci. 74, 866-872.

185 830

Samica

Uśredniony Samiec

aa ab

185 830

AAGTCAACAA AGATGGAGCA CTGGCGTTGC TCCCAAAACA GCAGGAGAAC

GGCGACCGGC CGGAGAAGGC TGGCGCCCCT GAAACCAGCA AGGAATACG >

CCCAGGTOTC CCGGGTGATG GATAACCACATCCTGGTGTT AGTGCAGGAT

CCGCGAGCTC GAAACGTGGC TCCGTTTGAAGAACCAACCA AGGAGACCCC GCC ATCęCGG CCGCAGAATC CAGCTGCGAA AGACCTGGCC G/AGCTTCACCA CGGCCCCGGG CCACTGCAGA CACCCGCTGG GTGGGCTGGA TTACCTCGAT CCCGCAGGCT TTATGCACTC CTTTCAGTGA GAGCTTGGTT CATGGGATGA TGGGTTACAA GGTGGGGTTT TrTTCAGGTC GCACTACGTG AAATGCACTC TACCAGAGAA AGCTCGAAAA TGGGGTTAGA ATGACACTAC CC4G4C7C4C AGTTCACTCC TCTTCATGCy CCArTTTCAA CCACTTGCCTCTT

G/A⁼G lub A w miejscu polimorficznym

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób selekcji świń predysponowanych do osiągania liczniejszego miotu, w którym pobiera się próbki materiału genetycznego świni, znamienny tym, że próbkę bada się na obecność genotypu, w którym występuje polimorficzne miejsce restrykcyjne Alul w obszarze 3’genu kodującego receptor prolaktyny u świni, związanego z większym miotem albo związanego z utrzymywaniem ciężaru porodowego w liczniejszym miocie.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że: analizuje się polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), heterodupleksy, polimorfizm konformacyjny pojedynczych nici (SSCP), elektroforezę żelową w gradiencie denaturującym (DGGE) lub elektroforezę żelową w gradiencie temperaturowym (TGGE).
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że trawi się materiał genetyczny enzymem restrykcyjnym Alul, który trawi gen receptora prolaktyny świni w przynajmniej jednym miejscu; rozdziela się fragmenty uzyskane w wyniku trawienia; określa się układ prążków tworzonych przez te fragmenty i porównuje się ten układ prążków z drugim układem prążków restrykcyjnych genu receptora prolaktyny świń uzyskanym z zastosowaniem tego samego enzymu, przy czym drugi układ prążków restrykcyjnych jest związany z większym miotem.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że porównuje się układy prążków restrykcyjnych i identyfikuje się określone fragmenty na podstawie ich wielkości oraz porównuje się wielkości tych fragmentów.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że przed trawieniem amplifikuje się gen receptora prolaktyny lub jego fragment, który zawiera polimorfizm.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się sekwencje starterów zgodnego i odwrotnego, które umożliwiają amplifikację regionu genu receptora prolaktyny, który zawiera polimorficzne miejsce Alul.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że startery wybiera się w oparciu o sekwencję SEQ ID NO:3.
8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym. że stosuje się startery o sekwencji SEQ ID NO:4 oraz SEQ ID NO:5.
9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się starter zgodny wybrany spośród SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:4 natomiast starter odwrotny wybrany spośród SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:5.
10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się zestaw starterów składający się z SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO:2.
11. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że rozdziela się porównywane fragmenty stosując elektroforezę żelową w obecności kontrolnego fragmentu DNA o znanej długości; po czym kontaktuje się rozdzielone fragmenty z sondą która hybrydyzuje z fragmentami tworząc kompleks fragment-sonda; oraz określa się długość rozdzielonych fragmentów wykrywając obecność kompleksów fragment-sonda i określa się ich względną pozycję w odniesieniu do kontrolnego fragmentu DNA.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych uzyskuje się z grupy zawierającej fragment o długości 110 par zasad i 90 par zasad.
13. Starter do badania obecności polimorficznego miejsca Alul w genie receptora prolaktyny świń, znamienny tym, że zawiera sekwencję wybraną spośród SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 oraz SEQ ID NO:5.
14. DNA o sekwencji odpowiadającej sekwencji 3’ regionu poddawanego translacji i regionu nie podlegającego translacji genu receptora prolaktyny świń, przy czym sekwencja ta obejmuje SEQ ID NO:3.

185 830
15. DNA według zastrz. 14 znamienny tym, że jest starterem do amplifikacji polimorficznego miejsca restrykcyjnego Alul genu receptora prolaktyny świń zawierającym przynajmniej 4 kolejne zasady z SEQ ID NO:3.
16. DNA według zastrz. 14 znamienny tym, że jest starterem do amplifikacji polimorficznego miejsca restrykcyjnego Alul genu receptora prolaktyny świń będący starterem odwrotnym uzyskanym z SEQ ID NO:3.

♦ * *

Wynalazek dotyczy wykrywania genetycznych różnic związanych ze zdolnością reprodukcyjną świń, a w szczególności użycia markera genetycznego, jakim jest gen kodujący receptor prolaktyny, którym przejawia się dziedziczna cecha liczniejszego miotu.

Zdolność reprodukcyjna, którą można zdefiniować jako liczba prosiąt rodzonych przez hodowaną samicę, jest głównym czynnikiem ograniczającym wydajność produkcji prosiąt. Liczba świń, które rodzą się żywe, wynosi w USA przeciętnie 9,5 osobników na miot. Dziedziczność wielkości dawanego miotu jest niska (10% - 15% ), a standardowe metody genetyczne doboru hodowanych samic na podstawie wielkości ich ostatniego miotu nie przynoszą pożądanych rezultatów. Stąd też, zaistniała konieczność opracowania metody selekcji poddawanych reprodukcji osobników opierającej się na badaniach na poziomie komórkowym lub DNA.

Świnie ras chińskich są znane z osiągania pełnej dojrzałości płciowej w młodym wieku i dużej wielkości miotów. Osobniki ras amerykańskich są znane z osiągania dużych rozmiarów i smukłości. Dlatego też było by pożądane połączenie najlepszych cech obydwu typów ras, aby w ten sposób ulepszyć produkcję prosiąt w U.S.A. Wysiłki te byłyby znacząco wsparte poprzez odkrycie markera genetycznego związanego z liczniejszym miotem u świń.

Analiza RFLP była używana przez wiele zespołów do badania DNA świń. Jung i wsp. Theor.Appl.Genet, 77:271-274 (1989), która to publikacja została włączona do niniejszego opisu poprzez odwołanie, ujawnia użycie techniki RFLP do wykazania genetycznego zróżnicowania między dwiema rasami świń. Polimorfizm został zaprezentowany dla genów antygenu leukocytuwego klasy I świń badanych ras. Hoganson i wsp., Skrót Dorocznego Zjazdu Sekcji Środkowowschodniej Amerykańskiego Towarzystwa Nauk o Zwierzętach, 26-18 marzec, 1990, donosi o polimorfizmie genów głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) u świń chińskich, który został zaprezentowany także przy użyciu analizy RFLP. Jung i wsp. w Animal Genetics, 26:79-91 (1989), dołączonym do niniejszego opisu poprzez odwołanie, opisują analizę genów SLA Klasy I pewnych knurów wykonaną techniką RFLP. Autor stwierdza, że wyniki sugerują że mogą istnieć pewne związki między klasą I SLA/MHC, a istnieniem i przejawianiem się pewnych cech u świni. Ponadto ustalili, że użycie fragmentów restrykcyjnych SLA klasy I w roli markerów genetycznych może być w przyszłości wykorzystane w ulepszaniu wzrostu świń.

Ponadto, opis patentowy USA 5,550,024 Rothschild i wsp. ujawnia polimorfizm genu kodującego receptor estrogenu u świń, który jest wiązany z liczniejszym miotem, które to ujawnienie zostało włączone do niniejszego opisu poprzez odwołanie.

Innym hormonem świń związanym z powodzeniem reprodukcji jest prolaktyna. Prolaktyna (PRL) jest peptydowym hormonem wydzielanym przez przedni płat przysadki mózgowej związanym z różnymi aktywnościami hormonalnymi, kluczowym dla udanej reprodukcji. Jedną z lepiej scharakteryzowanych funkcji jest regulowanie produkcji mleka u dojrzałych ssaków. PRL jest konieczna do stymulowania laktogenezy, lub syntezy białek mleka. Ta aktywność jest przenoszona za pośrednictwem jej receptora (PRLR). PRLR należy do superrodziny cytokinin/GHR/PRLR. Po aktywowaniu przez PRL, PRLR rozpoczyna ścieżkę przenoszenia sygnału, która ostatecznie aktywuje transkrypcję genów kodujących takie białka jak β-kazeina i α-laktoglobulina. Po aktywowaniu przez PRL, PRLR rozpoczyna ścieżkę przenoszenia sygnału poprzez zaangażowanie kinazy tyrozynowej Jak2. Mutacje na C-końcu zmieniające tyrozynofosforanową resztę zabezpieczają receptor przed aktywacją Jak2 i ostatecznie zaburzają aktywację transkrypcji genu kodującego β-kazeinę (Lebrun). Długa i krótka

185 830 forma białka receptorowego oraz transkrypty o zróżnicowanej długości zostały odkryte u szczura, myszy, królika i człowieka. (Boutin, Edery, Lesueur). Wykazano, że krótka forma nie jest zdolna do aktywacji transkrypcji genów białek mleka. Opisane cząsteczki mRNA pochodziły z tego samego transkryptu pierwotnego i podlegały alternatywnemu składaniu, określającemu nie ulegające translacji regiony u ludzi i królika. Ostatnio wykazano, że PRL stymuluje produkcję progesteronu in vitro przez komórki luteinowe prosiąt, który jest wymagany do utrzymania ciąży. PRLR przypisuje się także pośredniczenie w działaniu wywoływanym przez iniekcje hormonu wzrostu (bST), podwyższonej produkcji mleka, dzięki czemu może być on przydatny w różnicowaniu produkcji mleka u świń. U człowieka i myszy, gen kodujący receptor hormonu wzrostu (GHR) i gen PRLR są mapowane blisko siebie (Arden i wsp., 1990; Barker i wsp. 1992), czyniąc prawdopodobnym przypuszczenie, że u świń te dwa geny są sprzężone. GHR został zmapowany u świni na 16 chromosomie, natomiast PRLR nie został jeszcze zmapowany i nie istnieją informacje dotyczące jego zmienności genetycznej.

Niniejszy wynalazek dostarcza genetyczny marker, opierając się na odkryciu polimorfizmu genu kodującego receptor prolaktyny, który jest związany z liczniejszym miotem u świń. Pozwala to na genetyczne typowanie świń ze względu na ich gen kodujący receptor prolaktyny i określanie związku między określonym wynikiem RFLP a liczniejszym miotem. Pozwala to także na identyfikowanie osobników męskich i żeńskich przenoszących gen liczniejszego miotu. W przypadku samic pozwala to na wybór samic, które będą dawały większy miot niz przeciętnie w danej rasie, a w przypadku samców pozwala przypuszczać, że samice z ich potomstwa będą predysponowane do liczniejszego miotu względem przeciętnej w danej rasie. Stąd też, markery takie mogą być używane jako narzędzie selekcyjne w programowej hodowli w uzyskiwaniu linii i ras, które będą osiągały mioty dające większą liczbę potomstwa.

Zgodnie z wynalazkiem korzystnie stosuje się technikę analizy RFLP, dobrze znaną specjalistom w dziedzinie. Przykładowo opis patentowy USA o numerze US 4,582,788 przyznany 15 kwietnia 1986 roku na rzecz Erlich i wsp., opis patentowy USA o numerze US 4,666,828 przyznany 19 maja 1987 roku na rzecz Gusella i wsp., opis patentowy USA o numerze US 4,772,549 przyznany 20 września 1988 roku na rzecz Frossard i wsp., opis patentowy USA o numerze US 4,861,708 przyznany 29 sierpnia 1989 roku na rzecz Frossard i wsp., które to opisy zostały włączone do niniejszego opisu przez odwołanie.

Region zawierający polimorfizm może być powielany przy użyciu starterów i technik standardowych, takich jak PCR. Technikę tę charakteryzuje opis patentowy USA o numerze US 4,683,195 przyznany 28 lipca 1987 roku na rzecz Mullis i wsp., opis patentowy USA o numerze US 4,683,202 przyznany 28 lipca 1987 roku na rzecz Mullis i wsp., opis patentowy USA o numerze US 4,800,159 przyznany 24 stycznia 1989 roku na rzecz Mullis i wsp., opis patentowy USA o numerze US 4,889,818 przyznany 26 grudnia 1988 roku na rzecz Gelfand i wsp., opisu patentu USA o numerze US 4,902,624 udzielonym 20 lutego 1990 roku na rzecz Clumbus i wsp., które to opisy zostały włączone do niniejszego opisu przez przywołanie.

Wybór odpowiednich starterów jest opisany w przywołanych publikacjach, startery powinny umożliwiać amplifikowanie rejonu 3’ regionu kodującego oraz regionu nie poddawanego translacji z genu kodującego receptor prolaktyny świń.

Specyficzna sonda do danego fragmentu może zostać skonstruowana przy użyciu znanych technik, jak ujawniono np. w patencie USA 4,486,539 przyznanym 04 grudnia 1994 Ranki i wsp. oraz w 4,563,419 przyznanym 7 stycznia 1986 Ranki i wsp., które to opisy zostały włączone do niniejszego opisu przez przywołanie.

Bardziej korzystne jest stosowanie sondy cDNA, jak przedstawiono w opisie patentu USA o numerze US 4,711,955 udzielonym 8 grudnia 1987 roku na rzecz Word i wsp., opis patentu USA o numerze US 4,868,103 udzielonym 19 września 1989 roku na rzecz Stavrianopoulos i wsp., które zostały włączone do niniejszego opisu przez przywołanie.

Trawienie DNA może być prowadzone metodą wielokrotnej hybrydyzacji. Takie podejście zostało ujawnione w patencie USA 4,486,539 przyznanym 04 grudnia 1994 Ranki i wsp. oraz w 4,563,419 przyznanym 7 stycznia 1986 Ranki i wsp., które to opisy zostały włączone do niniejszego opisu przez przywołanie. Gdy polimorfizm jest określany poprzez zastosowanie PCR, bez korzystania z sondy to procedura taka może być prowadzona jak ujawniono w pa

185 830 tencie U.S.A 4,795,699 zatytułowanym „DNA polimeraza” i patencie U.S.A 4,965,188 „Sposób amplifikowania, detekcji i/lub klonowania sekwencji nukleinowych przy użyciu termostabilnych enzymów” które to opisy zostały włączone do niniejszego opisu przez przywołanie.

Ponadto PCR może zostać użyty w połączeniu z badaniem polimorfizmu konformacyjnego pojedynczych nici (SSCP). Zostało to opisane w „Detekcja polimorfizmu ludzkiego DNA przy użyciu elektroforezy żelowej oraz badania polimorfizmu konformacyjnego pojedynczych nici, Orita w wsp. PNAS 86(8) kwiecień 1989 (2766-70); oraz Lessa i wsp. Mol. Ecol 2(2) p. 119-29 kwiecień 1993” Techniki skaningowe detekcji zmienności alleli w sekwencjach DNA” które to zostały włączone do niniejszego opisu przez przywołanie.