PL186586B1

PL186586B1 - Rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa, wektor, gospodarz komórkowy, zastosowanie rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej, sposób otrzymywania aktywnego enzymu rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków i jej pochodnej, modyfikowany materiał roślinny i jego zastosowanie, LGC rekombinacyjny aktywnyenzymatycznie, LGH rekombinacyjny aktywny enzymatycznie, ekstrakt roślinny o aktywności enzymatycznej, kompozycja farmaceutyczna, funkcjonalny środekspożywczy oraz preparat enzymatyczny

Info

Publication number: PL186586B1
Application number: PL96322874A
Authority: PL
Inventors: Philippe Lenee; Véronique Gruber; Sylvie Baudino; Bertrand Merot; Claude Benicourt; Claire Cudrey
Original assignee: Park Davies
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2004-01-30
Also published as: JP4077875B2; IL117955A0; HUP9801438A2; DE69635611D1; AR004482A1; EP0822988B1; JP2007325590A; JPH11504207A; PL322874A1; FR2733249A1; AU5696796A; AU718905B2; BG101959A; WO1996033277A2; US6573431B1; WO1996033277A3; HUP9801438A3; EP0822988A2; CA2218418A1; MX9707973A

Abstract

1. Rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa, znamienna tym, ze zawiera cDNA kodujacy lipaze preduodenal- na, zwlaszcza zoladkowa, ssaków lub jej pochodna, wybrana sposród lipaz, których kodujace sekwencje nukleotydowe wykazuja wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwlaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazuja wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwlaszcza co najmniej 80%, ko- rzystnie co najmniej 90%, i posiadaja odpornosc na kwasy i aktywnosc przy pH od okolo 1 do okolo 5, a zwlaszcza przy pH od okolo 1,5 do okolo 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roslinnej, zwlaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roslinnych. 8. Wektor, zwlaszcza plazmid, znamienny tym, ze zawiera rekombinacyjna sekwencje nukleotydowa zawieraja- ca cDNA kodujacy lipaze preduodenalna zwlaszcza zoladkowa ssaków lub jej pochodna wybrana sposród lipaz, któ- rych kodujace sekwencje nukleotydowe wykazuja wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwlaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazuja wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwlaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadaja odpornosc na kwasy i aktywnosc przy pH od okolo 1 do okolo 5, a zwlaszcza przy pH od okolo 1,5 do okolo 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roslin- nej, zwlaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roslinnych. 22. Zastosowanie rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierajacej cDNA kodujacy lipaze preduodenalna zwlaszcza zoladkowa ssaków lub jej pochodna wybrana sposród lipaz, których kodujace sekwencje nukleotydowe wykazuja wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwlaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazuja wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwlaszcza co najmniej 80%, ko- rzystnie co najmniej 90%, i posiadaja odpornosc na kwasy i aktywnosc przy pH od okolo 1 do okolo 5, a zwlaszcza przy pH od okolo 1,5 do okolo 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roslinnej, zwlaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roslinnych, do transformacji komórek roslinnych w celu otrzymania aktywnego enzymu rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa, charakteryzująca się tym, że zawiera cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają, odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych.

Korzystnie rekombinacyjna sekwencja nukleotydową zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną, korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną

Korzystnie rekombinacyjna sekwencja nukleotydową zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.

Korzystnie rekombinacyjna sekwencja nukleotydową zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.

Korzystnie rekombinacyjna sekwencja nukleotydową zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.

Korzystnie rekombinacyjna sekwencja nukleotydową jest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

186 586

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5’ -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEAl-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —» 3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pGEAó Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5’ —> 3’ promotor pARIAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na. fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.

Korzystnie rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

186 586

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens,_ sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.

Przedmiot wynalazku stanowi także wektor, zwłaszcza plazmid, charakteryzujący się tym, że zawiera rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, w tym również postacie korzystne.

Przedmiotem wynalazku jest również gospodarz komórkowy, zwłaszcza bakteria, w szczególności Agrobacterium tumefaciens, transformowana wektorem zawierającym rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, przy czym korzystnie wektor ten jest plazmidem, w tym również postacie korzystne.

Przedmiot wynalazku stanowi również zastosowanie rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, w tym jej postaci korzystnych, do transformacji komórek roślinnych w celu otrzymania aktywnego enzymu rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej.

Wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania aktywnego enzymu rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej obejmującego:

- transformację komórek roślinnych, zwłaszcza za pomocą gospodarza komórkowego, zwłaszcza bakterii, w szczególności Agrobacterium tumefaciens, transformowanego wektorem zawierającym rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, w taki sposób, aby włączyć w genom tych komórek tą rekombinacyjną sekwencję nukleotydową,

- ewentualnie uzyskiwanie z transformowanych komórek roślinnych roślin transgenicznych,

186 586

- Odzyskiwanie enzymu rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej i/lub jej pochodnych wytworzonych w transformowanych komórkach lub roślinach transgenicznych, zwłaszcza przez ekstrakcję, i ewentualnie dalsze oczyszczanie.

Korzystnie stosuje się rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.

Korzystnie stosuje się rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną

Korzystnie stosuje się rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą:

Korzystnie stosuje się rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.

Korzystnie stosuje się rekombinacyjną sekwencję nukleotydową wybraną spośród:

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pGEAó Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

186 586

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pARIAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pSP Agrobacterium. tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.

Przedmiot wynalazku stanowi również modyfikowany materiał roślinny, charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, w tym również jej postaci korzystnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidora, marchewki, pszenicy, jęczmienia, ziemniaków, soi, słonecznika, sałaty, ryżu, lucerny, buraka, lub części tych roślin.

Przedmiotem wynalazku jest również LGC rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 2, lub jego pochodna, korzystnie polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (A4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2.

Przedmiotem wynalazku jest również LGH rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 5, lub jego pochodna, korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (M4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5.

Przedmiot wynalazku stanowi także ekstrakt roślinny o aktywności enzymatycznej, charakteryzujący się tym, że zawiera LGC rekombinacyjny i/lub jego pochodną zwłaszcza poli186 586 peptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2; i/lub zawiera LGH rekombinacyjny i/lub jego pochodną, korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5.

Korzystnie procent wagowy polipeptydów rekombinacyjnych aktywnych enzymatycznie stanowi około 0,1% do 20%, zwłaszcza około 1% do około 15%, całkowitego ciężaru białek obecnych w ekstrakcie, co odpowiada aktywności enzymatycznej od około 0,5 U do około 1000 U na g wagi świeżych liści, zwłaszcza około 10 U/g PF do około 300 U/g PF liści, lub też od około 1 do około 5000 U/g PF ziaren, zwłaszcza od około 10 do około 1000 U/g PF ziarna.

Przedmiot wynalazku stanowi także zastosowanie modyfikowanego materiału roślinnego zawierającego co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, w tym również jej postaci korzystnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidora, marchewki, pszenicy, jęczmienia, ziemniaków, soi, słonecznika, sałaty, ryżu, lucerny, buraka, lub części tych roślin, lub produktów z niego izolowanych do otrzymywania środków leczniczych przeznaczonych do ułatwienia absorpcji tłuszczów zwierzęcych lub roślinnych przyjmowanych przez osobnika zdrowego lub dotkniętego przez jedną lub więcej patologii wpływających lub nie na poziom wytwarzania lipazy żołądkowej i/lub trzustkowej, zwłaszcza u osobników poddawanych działaniu medycznemu zmieniającemu mechanizm absorpcji tłuszczów, lub ponadto u osób starszych, zwłaszcza dla otrzymywania środków leczniczych przeznaczonych do leczenia patologii związanych z niedoborem lipazy (zwłaszcza lipazy (lipaz) żołądkowych i/lub trzustkowych) w organizmie, a zwłaszcza patologii takich jak mukowiscydoza i zewnątrzwydzielnicza niewydolność trzustki.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera LGC rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 2, lub jego pochodną, korzystnie polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2; i/lub LGH rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 5, lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5; i/lub jeden lub więcej ekstraktów enzymatycznych zawierających LGC rekombinacyjny i/lub jego pochodną zwłaszcza polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2; i/lub LGH rekombinacyjny i/lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5, korzystnie w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.

186 586

Przedmiot wynalazku stanowi również zastosowanie modyfikowanego materiału roślinnego zawierającego co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną zwłaszcza żołądkową ssaków lub jej pochodną wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, w tym również jej postaci korzystnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidorą marchewki, pszenicy, jęczmienią ziemniaków, soi, słoneczniką sałaty, ryżu, lucerny, buraką lub części tych roślin, lub produktów z niego izolowanych do otrzymywania środków spożywczych przeznaczonych do odżywiania ludzi łub zwierząt, zwłaszcza funkcjonalnych środków spożywczych, zwłaszcza przeznaczonych do ułatwienia absorpcji tłuszczów zwierzęcych łub roślinnych przyjmowanych przez osobnika zdrowego lub dotkniętego jedną lub więcej patologii wpływających lub nie na poziom wytwarzania lipazy żołądkowej i/lub trzustkowej.

Przedmiotem wynalazku jest również funkcjonalny środek spożywczy, charakteryzujący się tym, że zawiera modyfikowany materiał roślinny zawierający co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną zwłaszcza żołądkową ssaków lub jej pochodną wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, w tym również jej postaci korzystnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidorą marchewki, pszenicy, jęczmienią ziemniaków, soi, słoneczniką sałaty, ryżu, lucerny, buraka, lub części tych roślin; lub LGC rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 2, lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2; i/lub LGH rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 5, lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5; i/lub jeden lub więcej ekstraktów enzymatycznych zawierających LGC rekombinacyjny i/lub jego pochodną zwłaszcza polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2 i/lub LGH rekombinacyjny i/lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie modyfikowanego materiału roślinnego zawierającego co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej

186 586 ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną zwłaszcza żołądkową ssaków lub jej pochodną wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, w tym również jej postaci korzystnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidorą marchewki, pszenicy, jęczmienia, ziemniaków, soi, słoneczniką sałaty, ryżu, lucerny, buraką lub części tych roślin, lub produktów z niego izolowanych do prowadzenia reakcji enzymatycznych w przemyśle rolno-spożywczym lub przetwórstwie, zwłaszcza w przemyśle tłuszczowym, chemii tłuszczów i przemyśle mleczarskim.

Przedmiot wynalazku stanowi także preparat enzymatyczny, do prowadzenia reakcji enzymatycznych w przemyśle rolno-spożywczym lub przetwórstwie, zwłaszcza w przemyśle tłuszczowym, chemii tłuszczów i przemyśle mleczarskim, charakteryzujący się tym, że zawiera modyfikowany materiał roślinny zawierający co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną zwłaszcza żołądkową ssaków lub jej pochodną wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 15%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, w tym również jej postaci korzystnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidorą marchewki, pszenicy, jęczmienią ziemniaków, soi, słoneczniką sałaty, ryżu, lucerny, buraką lub części tych roślin; lub LGC rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 2, lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2; i/lub LGH rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 5, lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5; i/lub jeden lub więcej ekstraktów enzymatycznych zawierających LGC rekombinacyjny i/lub jego pochodną zwłaszcza polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2 i/lub LGH rekombinacyjny i/lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH; ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie modyfikowanego materiału roślinnego zawierającego co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną zwłaszcza żołądkową ssa36

186 586 ków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii ćo najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, w tym również jej postaci korzystnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidora, marchewki, pszenicy, jęczmienia, ziemniaków, soi, słonecznika, sałaty, ryżu, lucerny, buraka, lub części tych roślin, lub produktów z niego izolowanych do prowadzenia przemysłowych reakcji biokonwersji enzymatycznych lub biokataliz, zwłaszcza hydrolizy lub transestryfikacji enzymatycznej.

Korzystnie zmodyfikowany materiał roślinny jest wykorzystywany równocześnie jako źródło enzymatyczne i substrat reakcji.

Korzystnie zmodyfikowany materiał roślinny jest wykorzystywany do otrzymywania biopaliwa, korzystnie obejmującego estry roślinnych kwasów tłuszczowych, zwłaszcza ester metylowy kwasu oleinowego.

Korzystnie zmodyfikowany materiał roślinny jest wykorzystywany do otrzymywania estru metylowego kwasu oleinowego.

Wynalazek poniżej zilustrowano za pomocą następujących figur:

- fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową cDNA, którego nukleotydy usytuowane w pozycjach 1 do 1137 kodują LGC przedstawione na fig. 2 i odpowiadają SEQ ID NO 2,

- fig. 2 przedstawia sekwencję aminokwasów LGC i odpowiada SEQ ID NO 2,

- fig. 3 przedstawia sekwencję nukleotydów pochodzących z cDNA przedstawionego na fig. 1 i odpowiadającą SEQ ID NO 1, nukleotydy usytuowane w pozycjach 1 do 1137 wspomnianej sekwencji pochodnej kodują LGC, taką jak przedstawiona na fig. 2 i odpowiadają SEQ ID NO 2,

- fig. 4 przedstawia sekwencję nukleotydową cDNA, w której nukleotydy usytuowane w pozycjach 47 do 1240 kodują prekursor LGH o 398 aminokwasach, i nukleotydy usytuowane w pozycjach 104 do 1240 kodują dojrzale LGH o 379 aminokwasach,

- fig. 5 przedstawia sekwencję aminokwasów LGH, prekursor LGH ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 1 i 398, przy czym dojrzały LGH jest ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 20 i 398,

- fig. 6, 7 i 8 przedstawiają wyniki badania immunodetekcji typu Western polipeptydów rekombinacyjnych wytworzonych przez liście i ziarna tytoniu Xanthi, ziarna rzepaku, i przez liści i owoce pomidora, transformowane za pomocą sekwencji rekombinacyjnych według wynalazku,

- fig. 9 i 10 przedstawiają odpowiednio analizę przez elektroforezę na żelu poliakryloamidowym i wynik przeniesienia tego żelu na membranę nitrocelulozową i wywołanie wychodząc z przeciwciała anty-lipazy żołądkowej psa, LGC oczyszczonego wychodząc z liści tytoniu,

- fig. 11 przedstawia przykład wykrycia na membranie reszt glikanowych rekombinacyjnego LGC,

- fig. 12 przedstawia analizę przez elektroforezę na żelu poliakryloamidowym LGC oczyszczonego wychodząc z ziarna rzepaku,

- fig. 13, 14 i 15 ilustrują różne próby wykonane w zakresie otrzymania estru metylowego kwasu oleinowego wychodząc z ziaren transformowanych według wynalazku.

Rekombinacyjne sekwencje nukleotydowe według wynalazku zawierają jedną lub więcej sekwencji kodujących peptyd odpowiedzialny za adresowanie polipeptydów rekombinacyjnych według wynalazku (rekombinacyjnego LGC lub polipeptydów pochodnych) w oló-eślonym przedziale komórki roślinnej, zwłaszcza w retikulum endoplazmatycznym lub w wakuolach, lub też na zewnątrz komórki, w ściance pektocelulozowej lub w przestrzeni pozakomórkowej także zwanej apoplazmą.

186 586

Spośród terminatorów transkrypcji zdatnych do wykorzystania dla transformacji komórek roślinnych w zakresie niniejszego wynalazku, można wymienić terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMY), opisany w artykule: Franek et al., 1980, lub terminator polyA NOS, który odpowiada obszarowi w 3' nie kodującemu genu syntazy nopalinowej plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens - szczep na nopalinę (Depicker et al., 1982).

Spośród promotorów transkrypcji zdatnych do wykorzystania dla transformacji komórek roślinnych w zakresie niniejszego wynalazku, można wymienić:

- promotor 35S, lub korzystnie promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) CaMV, przy czym te promotory umożliwiają ekspresję polipeptydów rekombinacyjnych według wynalazku w zespole rośliny otrzymanej wychodząc z komórek transformowanych według wynalazku, i opisano je w artykule Kay et al., 1987,

- promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi umożliwiający ekspresję polipeptydów rekombinacyjnych wynalazku wyłącznie w nasionach (lub ziarnach) rośliny otrzymanej wychodząc z komórek transformowanych według wynalazku, i opisany w artykule Depigny-This et al., 1992,

- promotory pGEAl i pGEAó odpowiadające obszarowi 5' nie kodującemu genów proteiny zapasowej ziarna, GEA1 i GEA6, odpowiednio, Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993), i umożliwiające ekspresję specyficzną w ziarnach,

- promotor chimeryczny super-promotor pSP (PCT/US94/12946), utworzony z fuzji trzykrotnego powtórzenia elementu aktywatora transkrypejnego promotora genu syntazy oktopinowej Agrobacterium tumefaciens, elementu aktywatora transkrypcyjnego promotora genu syntazy mannopinowej i promotora syntazy mannopinowej Agrobacterium tumefaciens,

- promotor aktynowy ryżu, po którym następuje intron aktynowy ryżu (pAR-IAR) zawarty w plazmidzie pActl-F4 opisanym przez McElroy et al. (1991),

- promotor genu yzeiny kukurydzy (pyzeina) zawarty w plazmidzie py63 opisany w: Reina et al. (1990), i umożliwiający ekspresję w białku nasion kukurydzy.

Sekwencje kodujące peptyd adresowania zastosowane w zakresie niniejszego wynalazku, mogą być pochodzenia roślinnego, ludzkiego lub zwierzęcego.

Spośród sekwencji kodujących peptyd adresowania pochodzenia roślinnego, można wymienić:

- sekwencję nukleotydową o 69 nukleotydach (wskazana w przykładach poniżej) kodującą prepeptyd (peptyd sygnałowy) o 23 aminokwasach sporaminy A w patacie słodkiej, przy czym ten peptyd sygnałowy umożliwia wejście polipeptydów rekombinacyjnych wynalazku w układ wydzielania komórek roślinnych transformowanych według wynalazku (mianowicie głównie w retikulum endoplazmatycznym),

- sekwencję nukleotydową o 42 nukleotydach (wskazana w przykładach poniżej) kodująca propeptyd N-terminalny adresowania wakuolamego o 14 aminokwasach sporaminy A w patacie słodkiej, umożliwiając nagromadzenie polipeptydów rekombinacyjnych wynalazku w wakuolach komórek roślinnych transformowanych według wynalazku,

- sekwencję nukleotydową o 111 nukleotydach (wskazana w przykładach poniżej) kodującą prepropeptyd o 37 aminokwasach sporaminy A utworzony z części N-końcowej w kierunku części C-końcowej 23 aminokwasów peptydu sygnałowego wspomnianego powyżej po czym następuje 14 aminokwasów propeptydu wspomnianego powyżej, przy czym ten prepropeptyd umożliwia wejście polipeptydów rekombinacyjnych wynalazku w układ wydzielania i ich nagromadzenie w wakuolach komórek roślinnych transformowanych według wynalazku; trzy sekwencje wspomniane powyżej opisano w artykułach Murakami et al., 1986, i Matsuoka i Nakamura, 1991,

- propeptyd karboksyterminalny lektyny jęczmienia opisany w szczególności w artykułach: Schroeder et al., 1993, i Bednarek i Ralkhel, 1991.

Spośród sekwencji kodujących peptyd adresowania pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, można wymienić sekwencje kodujące peptyd sygnałowy lipazy żołądkowej ludzkiej (LGH) taki jak opisany w patencie europejskim nr 0 191 061, lub lipazy żołądkowej królika (LGL), taki jak opisano w zgłoszeniu patentu europejskiego nr 0 542 629, którego sekwencję wskazano w przykładach poniżej, lub lipazy trzustkowej ludzkiej (LPH) lub lipazy żołądko38

186 586 wej psa (LGC). Można również przytoczyć spośród sekwencji kodujących peptyd adresowania, sekwencję kodującą tetrapeptyd KDEL, i umożliwiający adresowanie w retikulum endoplazmatycznym.

Rekombinacyjne sekwencje nukleotydowe według wynalazku zawierają również sekwencję nukleotydową przydatną do zaznaczenia sekwencji rekombinacyjnych, zwłaszcza dla zróżnicowania (a zatem wyselekcjonowania) tych komórek roślinnych, które są transformowane przez wspomniane sekwencje rekombinacyjne od tych, które nie są. Korzystnie, taka sekwencja nukleotydowa przydatna do znaczenia sekwencji rekombinacyjnych, jest wybrana spośród genów odporności na antybiotyki, zwłaszcza genu odporności na kanomycynę.

W sposobie według wynalazku, transformację komórek roślinnych można wykonać przez przeniesienie rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej wynalazku w protoplastach, zwłaszcza po inkubowaniu tych ostatnich w roztworze glikolu polietylenowego (PEG) w obecności kationów dwuwartościcwych (Ca²⁺) według metody opisanej w artykule: Krens et al, 1982.

Transformację komórek roślinnych można również wykonać przez elektroporację, zwłaszcza według metody opisanej w artykule: Fromm et al., 1986.

Transformację komórek roślinnych można również wykonać przez zastosowanie działa dla genu, umożliwiającego wyrzucanie z bardzo dużą prędkością cząstek metalicznych pokrytych rekombinacyjnymi sekwencjami nukleotydowymi według wynalazku, dostarczając zatem geny do wnętrza jądra komórkowego, zwłaszcza techniką opisaną w artykule: Sanford, 1988.

Inną metodą transformacji komórek roślinnych jest metoda mikroiniekcji cytoplazmatycznej lub jądrowej, takiej jak opisana w artykule: De La Penna et al., 1987.

Według korzystnego wykonania wyżej wspomnianego sposobu według wynalazku, komórki roślinne są transformowane przez umieszczenie tych ostatnich w obecności gospodarza komórkowego transformowanego przez wektor według wynalazku, przy czym gospodarz komórkowy jest zdatny do infekowania komórek roślinnych umożliwiając włączenie w genom tych ostatnich, rekombinacyjnych sekwencji nukleotydowych wynalazku początkowo zawartych w genomie wyżej wspomnianego wektora.

Według jednego wykonania sposobu według wynalazku, komórki roślinne transformowane według wynalazku hoduje się in vitro, zwłaszcza w bioreaktorach według metody opisanej w artykule: Brodelius, 1988, w pożywce płynnej lub według metody opisanej w artykule: Brodelius et al., 1979, w formie immobilizowanej lub według metody opisanej w artykule: Deno et al., 1987, wykonując hodowlę korzeni transformowanych in vitro.

Pożywki hodowli in vitro wspomniane powyżej odzyskuje się następnie w celu wyekstrahowania i, w danym przypadku, oczyszczenia zwłaszcza przez chromatografię rekombinacyjnego LGC i/lub polipeptydu lub polipeptydów pochodnych określonych powyżej, wytworzonych przez wspomniane transformowane komórki hodowane in vitro.

Według korzystnego wykonania sposobu według wynalazku, po transformacji komórek roślinnych następuje etap otrzymywania roślin transformowanych przez hodowle wspomnianych komórek transformowanych w odpowiedniej pożywce. Rekombinacyjne LGC i/lub jeden lub więcej polipeptydów pochodnych wytworzonych w tak otrzymanych komórkach całych roślin są odzyskiwane przez ekstrakcję wykonywaną przy użyciu całych roślin lub części tych roślin (zwłaszcza przy użyciu liści, łodyg lub owoców) lub przy użyciu nasion uzyskanych z tych roślin, przy czym w danym przypadku po ekstrakcji następuje etap oczyszczania rekombinacyjnego LGC i/lub jednego lub więcej polipeptydów pochodnych.

Transformowanymi roślinami wykorzystywanymi dla odzyskania rekombinacyjnego LGC i/lub jednego lub więcej polipeptydów pochodnych w zakresie wyżej wspomnianego sposobu są komórki pokolenia TO, mianowicie komórki uzyskane z hodowli transformowanych komórek wynalazku w odpowiedniej pożywce lub korzystnie komórki następnych pokoleń (Tl, T2 itd.) otrzymane przez autozapłodnienie roślin poprzedniego pokolenia i w których rekombinacyjne sekwencje nukletydowe wynalazku ulegają reprodukcji według praw Mendla.

Aktywność lipazową (lipolityczną) roślin lub części roślin i ekstraktów roślinnych o aktywności enzymatycznej według wynalazku można zmierzyć metodą Gargouri (Gargouri

186 586 et al., 1986) stosując trójgliceryd o krótkim łańcuchu (taki jak tributyryna) jako substrat. Aktywność enzymatyczna jest podawana w jednostkach U, przy czym jedna jednostka U odpowiada ilości enzymu potrzebnej dla uwolnienia 1 pmola wolnych kwasów tłuszczowych na 1 minutę w 37°C w warunkach optymalnego pH.

Tytułem ilustracji, polipeptydy rekombinacyjne według wynalazku wykazują aktywność lipazową około 10 U/mg polipeptydów rekombinacyjnych do około 1000 U/mg, korzystnie około 100 U/mg do około 600 U/mg.

Ekstrakty roślinne o aktywności enzymatycznej według wynalazku korzystnie są takie, by zawartość enzymatycznie aktywnych polipeptydów rekombinacyjnych w % wagowych wynosiła około 0,1% do 20%, zwłaszcza od około 1% do 15% względem całkowitego ciężaru protein zawartych w tych ekstraktach, co odpowiada zmierzonej aktywności enzymatycznej około 0,5 U/g ciężaru świeżego (PF) do około 1000 U/g PF liści, zwłaszcza od około 10 U/g PF do około 300 U/g PF lub zwłaszcza około 1 U/g PF ziaren do około 5 000 U/g PF, zwłaszcza od około 10 U/g PF ziaren do około 1 000 U/g PF ziaren.

Ekstrakty roślinne według wynalazku są w szczególności o następujących aktywnościach enzymatycznych:

- ekstrakty liści i/lub owoców i/lub ziaren roślin takie jak otrzymane przez transformację komórek eksplantów tych roślin sekwencjąpd35S-PSLGL-LGC lub sekwencjąpd35S-PSLGC lub sekwencją pd35S-PPS-LGC, według jednego ze sposobów opisanych powyżej i zawierające rekombinacyjny LGC i/lub polipeptyd (Δ54) i/lub polipeptyd (Δ4), a zwłaszcza

- ekstrakt liści tytoniu, taki jak otrzymany przez transformację komórek eksplantów liści tytoniu sekwencją pd35S-PS-LGC lub sekwencją pd35S-PPS-LGC, według jednego ze sposobów opisanych powyżej i zawierający polipeptyd (Δ54) w połączeniu z polipeptydem (Δ4), przy czym zawartość procentowa ciężaru mieszaniny tych dwóch polipeptydów względem całkowitego ciężaru protein zawartych w tym ekstrakcie wynosi od około 0,1% do około 20%, a aktywność enzymatyczna wspomnianego ekstraktu wynosi od około 100 U/g PF do około 300 U/g PF,

- ekstrakt liści lub owoców pomidora, taki jak otrzymany przez transformację komórek eksplantów liści pomidora sekwencją pd35S-PS-LGC lub sekwencją pd35S-PPS-LGC, według sposobu opisanego powyżej i zawierający polipeptyd (Δ54) w połączeniu z polipeptydem (Δ4), przy czym zawartość procentowa ciężaru mieszaniny tych dwóch polipeptydów względem całkowitego ciężaru protein zawartych w tym ekstrakcie wynosi od około 0,1% do około 20%, a aktywność enzymatyczna wspomnianego ekstraktu wynosi od około 100 U/g PF do około 300 U/g PF,

- ekstrakt liści tytoniu, taki jak otrzymany przez transformację komórek eksplantów liści tytoniu sekwencjąpd35S-PSLGL-LGC, według sposobu opisanego powyżej i zawierający polipeptyd (Δ4), przy czym zawartość procentowa ciężaru tego polipeptydu względem całkowitego ciężaru protein zawartych w tym ekstrakcie wynosi od około 0,1% do około 20%, a aktywność enzymatyczna wspomnianego ekstraktu wynosi od około 100 U/g PF do około 300 U/g PF,

- ekstrakt ziaren tytoniu, taki jak otrzymany przez transformację komórek eksplantów liści tytoniu sekwencją pd35S-PS-LGC lub sekwencją pd35S-PPS-LGC, według sposobu opisanego powyżej i zawierający polipeptyd (Δ54), przy czym zawartość procentowa ciężaru polipeptydu (Δ54), względem całkowitego ciężaru protein zawartych w tym ekstrakcie wynosi od około 0,1% do około 1%, a aktywność enzymatyczna wspomnianego ekstraktu wynosi od około 10 U/g PF do około 300 U/g PF,

- ekstrakty ziaren roślin, takie jak otrzymane przez transformację komórek eksplantów tych roślin sekwencją pCRU- PS-LGC lub sekwencją pCRU-PPS-LGC lub sekwencją pGEAl-PSLGL- LGC lub sekwencja pGEA6-PSLGL-LGC według jednego ze sposobów opisanych powyżej i zawierające rekombinacyjny LGC i/lub polipeptyd (Δ54) i/lub polipeptyd (Δ4), a zwłaszcza:

- ekstrakt ziaren rzepaku taki jak otrzymane przez transformację komórek eksplantów liści rzepaku sekwencją pCRU-PS-LGC lub sekwencją pCRU-PPS-LGC lub sekwencją pGEAl-PSLGL-LGC lub sekwencja pGEA6-PSLGL-LGC według sposobu opisanego powy40

186 586 żej i zawierający polipeptyd (Δ54), przy czym zawartość procentowa ciężaru polipeptydu (Δ54), względem całkowitego ciężaru protein zawartych w tym ekstrakcie wynosi od około 0,1% do około 1%, a aktywność enzymatyczna wspomnianego ekstraktu wynosi od około 10 U/g PF do około 1000 U/g PF,

- ekstrakty nasion roślin takie jak otrzymane przez transformację komórek eksplantów tych roślin sekwencją pAR-IAR-PSLGL-LGC i/lub sekwencją pyzeina-PSLGL-LGC lub sekwencją pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL według jednego ze sposobów opisanych powyżej i zawierające rekombinacyjny LGC i/lub polipeptyd (A54) i/lub polipeptyd (A4), a zwłaszcza:

- ekstrakt nasion kukurydzy taki jak otrzymany przez transformację komórek kukurydzy (zwłaszcza twardzin kukurydzy) sekwencją pAR-IAR-PSLGL-LGC i/lub sekwencją pyzeinaPSLGL-LGC lub sekwencją pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL według sposobu opisanego powyżej i zawierający polipeptyd (A54), przy czym zawartość procentowa ciężaru polipeptydu (A54), względem całkowitego ciężaru protein zawartych w tym ekstrakcie wynosi od około 0,1% do około 1%, a aktywność enzymatyczna wspomnianego ekstraktu wynosi od około 10 U/g PF do około 1000 U/g PF.

Środki spożywcze według wynalazku, określane też jako środki spożywcze funkcjonalne są w szczególności przeznaczone do ułatwienia absorpcji tłuszczów zwierzęcych lub roślinnych przyjmowanych przez osobnika zdrowego lub zaatakowanego jedną lub więcej patologiami wpływającymi lub nie na poziom wytwarzania lipazy żołądkowej i/lub trzustkowej. Z tego względu środki spożywcze lub kompozycje spożywcze według wynalazku są korzystnie stosowane jako odżywki uzupełniające.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku korzystnie stosuje się u osobników podlegających kuracji leczniczej zmieniającej mechanizm absorpcji tłuszczów lub u osób starszych.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są też w szczególności przeznaczone do leczenia patologii związanych z niedoborem lipaz (zwłaszcza lipazy (lipaz) żołądkowej i/lub trzustkowej) w organizmie a zwłaszcza patologii takich jak mukowiscydoza i zewnątrzwydzielnicza niewydolność trzustkowa.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku korzystnie podaje się drogą doustną i występują zwłaszcza w formie kapsułek, tabletek lub proszków do rozcieńczania.

Dawka dzienna w przypadku człowieka wynosi korzystnie od około 200 mg do około 1000 mg, podzielona korzystnie na czas głównych posiłków, podczas gdy wspomniane kompozycje farmaceutyczne zawierają polipeptydy rekombinacyjne według wynalazku w formie zasadniczo czystej.

Rośliny o aktywności enzymatycznej lub części tych roślin, zwłaszcza liście i/lub owoce i/lub nasiona, lub komórki roślinne według wynalazku, są wykorzystywane jednocześnie jako źródło enzymatyczne i substrat reakcji.

Sposób otrzymywania biopaliw polega na dodaniu alkoholu, zwłaszcza metanolu lub etanolu, do przemiału całości lub części roślin transformowanych według wynalazku, korzystnie do przemiału ziarna rzepaku, słonecznika lub soji, transformowanych według wynalazku, i odzyskanie biopaliw, zwłaszcza przez filtrację.

Wynalazek zilustrowano poniżej szczegółowym opisem, obejmującym otrzymywanie rekombinacyjnych sekwencji nukleotydowych, takich jak opisane powyżej, oraz transformowanych roślin wytwarzających polipeptydy rekombinacyjne według wynalazku, i sposób otrzymywania biopaliw.

I. Konstruowanie genów chimerycznych kodujących proteinę rekombinacyjną lipazy żołądkowej psa i umożliwiających ekspresję w liściach i ziarnach psiankowatych.

1-A) Konstruowanie genów chimerycznych kodujących LGC rekombinacyjny i umożliwiających ekspresję w tytoniu.

Ekspresja w liściach i ziarnach tytoniu genu kodującego lipazę żołądkową psa (LGC) wymaga następujących sekwencji regulacyjnych:

1. Podwójny promotor konstytutywny 35S (pd35S) CiMY (wirus mozaiki kalafioaa).

Odpowiada on zdublowaniu sekwencji aktywujących transkrypcję usytuowanych w górę od elementu TATA promotora 35S naturalnego (Lay et al., 1987);

186 586

2. Sekwencja końcowa transkrypcji, terminator polyA 35S, która odpowiada obszarowi 3' niekodującemu sekwencji wirusa DNA dwułańcuchowego kolistego mozaiki kalafiora wytwarzającego transkrypt 35S (Franek et al., 1980). Konstrukcje różnych plazmidów przez wykorzystanie technik rekombinacyjnego DNA (Sambrook et al., 1989) pochodzą z pBIOC4. Ten plazmid binarny pochodzący od pGA492 (An, 1986), który zawiera między prawym i lewym brzegiem, pochodzące od plazmidu pTiT37 Agrobacterium tumefaciens, na swoim transferowym DNA, następujące sekwencje:

promotor konstytutywny genu nos kodującego syntazę nopalinową (Depicker et al., 1982), sekwencja kodująca genu nptll kodującego fosfotransferazę neomycynową Π (Berg i Berg, 1983) o usuniętym obszarze 8 pierwszych kodonów, którego kodon inicjator metioniny ATG i uległy fuzji do sekwencji 14 pierwszych kodonów sekwencji kodującej genu nos (Depicker et al., 1982), sekwencja kodująca genu nos pozbawiona obszaru 14 pierwszych kodonów, terminator nos (Depicker et al., 1982), obszar zawierający miejsca wielokrotne klonowania (określany też jako polilinker) (HindIII-XbaI-SacI-HpaI-Kpnl-ClaI-BglII) poprzedzając gen cat kodujący acetylotransferazę chloramfenikolową (Close i Rodriguez, 1982) i sekwencje końcowe genu 6 plazmidu pTiA6 Agrobacterium tumefaciens (Liu et al., 1993). W celu wyeliminowania quasi-całości sekwencji kodującej genu cat, plazmid pGA492 podwójnie wytrawiono przez SacI (miejsce restrykcyjne polilinkera) i przez Scal (miejsce restrykcyjne obecne w sekwencji genu cat), a następnie poddano działaniu enzymu polimerazy T4 DNA (New England Biolabs) według rekomendacji producenta. Ligację zmodyfikowanego plazmidu (20 ng) wykonano w pożywce reakcyjnej 10 μΐ zawierającej 1 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham); 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 12 pg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Następnie, miejsce restrykcyjne Hindni DNA plazmidowego zachowanego klonu zmodyfikowano w miejscu restrykcyjnym EcoRI za pomocą fosforylowanego łącznika HindM-EcoRI (Stratagene Cloning Systems). By wykonać tę modyfikację, 500 ng DNA plazmidowego zachowanego klonu wytrawiono przez Hindin, defosforylowano przez enzym fosfatazy alkalicznej z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta i współwytrącono w obecności 1500 ng DNA łącznika Hindlll-EcoRI, 1/10 objętości octanu sodu 3M pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w -80°C podczas 30 min. Po odwirowaniu przy 12000 g podczas 30 min, wytrącony DNA przemyto etanolem 70%, osuszono, rozpuszczono w 8 μΐ wody, utrzymywano w 65°C podczas 10 min, a następnie ligowano w obecności 1 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Po inaktywacji T4 ligazy DNA w 65°C podczas 10 min, mieszaninę reakcyjną ligacji wytrawiono przez EcoRI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w -80°C podczas 30 min, odwirowano przy 12000 g podczas 30 min, przemyto etanolem 70%, osuszono, a następnie ligowano jak opisano powyżej.

Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 12 μg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne, zwłaszcza przez HindUI i EcoRI. Otrzymany plazmid binarny, posiadający tylko 9 ostatnich kodonów sekwencji kodującej genu cat i którego miejsce EcoRI jest jedyne, nazwano pBIOC4.

Kasetę ekspresji, składającą się z promotora pd3 5 S i terminatora poły A 35S, wyodrębniono wychodząc z plazmidu pJIT163A Plazmid pJIT163A pochodzi z plazmidu pJIT163, który sam pochodzi z plazmidu pJIT60 (Guerineau iMullineaux, 1993). Plazmid pJ!T163 posiada kodon ATG między miejscami Hindin i Sali polilinkera. W celu usunięcia tego ATG i otrzymania plazmidu pJIT163A, DNA plazmidowe pJIT163 wytrawiono podwójnie przez HindlU i Sali, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5

186 586 objętości etanolu absolutnego w-80°C podczas 30 min, odwirowano przy 12000 g podczas 30 min, przemyto etanolem 70%, osuszono, poddano działaniu enzymu Klenowa (New England Biolabs) według rekomendacji producenta, deproteinowano przez ekstrakcję z 1 objętością układu fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1), a następnie 1 objętością układu chlorofonn:alkohol izoamylowy (24:1), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w -80°C podczas 30 min, odwirowano przy 12000 g podczas 30 min, przemyto etanolem 70%, osuszono, i na koniec, ligowano w obecności 1 pl buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 50 pg/ml ampicyliny wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. W celu wyodrębnienia kasety ekspresji składającej się z promotora pd35S i terminatora polyA 35S (fragment SacI-Xhol), DNA plazmidowe zachowanego klonu pJIT163A wytrawiono przez SacI iXhoI. Fragment SacI-XhoI, zawierający kasetę ekspresji oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w -80°C podczas 30 min, odwirowano przy 12000 g podczas 30 min, przemyto etanolem 70%, osuszono, a następnie poddano działaniu enzymu Mung Bean Nuclease (New England Biolabs) według zaleceń producenta. Ten oczyszczony insert (200 ng) klonowano w DNA plazmidowym pBIOC4 (20 ng), wytrawiono przez EcoRI, poddano działaniu enzymu Mung ,Bean Nuclease i defosforylowano enzymem fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Reakcję ligacji wykonano w 20 pl w obecności 2 pl buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 pl 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy dNa (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 12 pl/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Otrzymany plazmid nazwano pBIOC21.

Lipaza żołądkowa psa(LGC) jest naturalnie syntetyzowana w formie prekursora. Dojrzała proteina LGC składa się z 379 aminokwasów. DNA komplementarny LGC klonowano w miejscach BgllI i SalI wektora ekspresji pRU3O3 prowadząc do wektora pDGL5.303 opisanego w zgłoszeniu międzynarodowym nr WO 94/13816. Wykorzystano go dla skonstruowania plazmidów binarnych pBIOC25 zawierających PS-LGc i pBIOC26 zawierających PPS-LGC gdzie sekwencja kodująca dojrzały LGC jest poprzedzona sekwencją kodującą peptyd sygnalowy(PS) lub prepropeptyd (PPS tzn. peptyd sygnałowy, a po nim sekwencje Nkońcowe adresowania wakuolamego pochodzenia roślinnego, odpowiednio. Sekwencje PS i PPS, składające się odpowiednio z 23 i 37 aminokwasów, są sekwencjami proteiny zapasowej korzeni bulwiastych pataty słodkiej: sporamina A (Murakami et al., 1986; Matsukoa i Nakamura, 1991).

W celu uproszczenia fuzji między sekwencją, dojrzałego LGC i sekwencją sygnałów adresowania, PS lub PPS, plazmid pDGL5.303 zmodyfikowano przez wprowadzenie dodatkowego miejsca restrykcyjnego Hindffl w czwartym i piątym kodonie sekwencji dojrzałego LGC przez mutagenezę kierowaną przez PCR wykorzystując 2 oligodezoksynukleotydy, 5' caggagatc TTG TTT GGA AAG CTT CAT CCC 3' (zawierający jedyne miejsce BglH w plazmidzie i wnoszący dodatkowe miejsce Hindffl) i 5' CAT aTt CCT CAG CTG GGT ATC 3' (zawierający jedyne miejsce PvuII w plazmidzie). Amplifikację przez PCR fragmentu BglII-PvuII wykonano w 100 pl środowiska reakcyjnego obejmującego 10 pl buforu Taq polimerazy DNA x 10 (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 9,0 i 1% Triton x 100), 6 pl 25 mM MgCl₂, 3 pl 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP i dTTP), 100 pM każdego z 2 oligodezoksynukleotydów opisanych powyżej, 5 ng matrycy DNA (wektor ekspresji pRU303 zawierający DNA komplementarny LGC), 2,5 U Taq polimerazy DNA (Promega) i 2 krople oleju wazelinowego. DNA zdenaturowano w 94°C podczas 5 min, poddano 30 cyklom składającym się każdy z 1 min denaturacji w 94°C, 1 min hybrydyzacji w 50°C i 1 min wydłużania

186 586 w 72°C, a następnie wydłużanie w 72°C kontynuowano przez 5 min. Tę reakcję PGR wykonano w aparacie DNA Thermal Cycler PERKIN ELMER CETUS. Olej usunięto przez ekstrakcję w chloroformie. Następnie, fragmenty DNA zawarte w pożywce reakcyjnej wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w80°C podczas 30 min, odwirowano w 12000 g podczas 30 min, przemyto w etanolu 70%, osuszono i wytrawiono przez 2 enzymy restrykcyjne Bglll i PvuÓ. Wytrawione fragmenty DNA pochodzące z PGR oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 2%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w -80°C podczas 30 min, odwirowano w 12000 g podczas 30 min, przemyto w etanolu 70%, osuszono, a następnie ligowano w DNA plazmidowym wektora pDGL5.303 podwójnie wytrawionego przez Bglll i PvuII, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano, poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono i defosforylowano enzymem fosfatazy alkalicznej z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano przy użyciu 100 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 50 ng fragmentów wytrawionego DNA pochodzących z amplifikacji przez PGR opisaną powyżej w pożywce reakcyjnej 10 μΐ w obecności 1 μΐ buforu T4 łigazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5ct uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 50 μg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. DNA plazmidowe pewnych zachowanych klonów zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencj ono wania T7™ sprzedawanego przez Pharmacia według metody didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). Wprowadzenie tego miejsca restrykcyjnego Hindlll nie zmodyfikowało kodu genetycznego LGC. W istocie sekwencja naturalnego LGC AAA TTA (Lys-Leu) staje się AAG CTT (Lys-Leu). Uzyskany plazmid nazwano pBIOC22 i zawiera sekwencję dojrzałej proteiny LGC odpowiadającej:

LEU PHE GLY LYS LEU.....THR ASP ASN LYS AMB agatcTTG TTT GGA AAG CTT- - - -ACA GAT AAT AAG TAG TTCTAGA

Bgin Hindni Xbal jedyne miejsce restrykcyjne jedyne miejsce restrykcyjne

LEU: pierwszy kodon dojrzałego LGC, AMB: stop kodon. a. Konstruowanie plazmidu binarnego pBIOC25 zawierającego PS-LGC.

Plazmid pBIOC22 wytrawiono całkowicie przez Bglll i częściowo przez Hindlll w celu usunięcia sekwencji kodującej polipeptyd Leu-Phe-Gly-Lys (4 pierwsze aminokwasy) dojrzałej proteiny LGC. Sekwencję tę zastąpiono przez sekwencję kodującą peptyd sygnałowy PS o 23 aminokwasach (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC) uległy fuzji do sekwencji 4 pierwszych kodonów sekwencji kodującej dojrzałej proteiny LGC (PS-4 pierwsze kodony dojrzałego LGC). Sekwencję PS-4 pierwsze kodony dojrzałego LGC amplifikowano przez PCR wychodząc z plazmidu pMAT103 (Matsuoka i Nakamura, 1991) przy pomocy 2 następujących oligodezoksynukleotydów:

5' caggagatctgATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3 ’ i 5’ G ATG AAG

CTT TCC AAA CAA GGA ATG GGC TGG ATT GGG GAG G 3', postępując według protokołu amplifikacji PCR opisanego powyżej w paragrafie I. Po podwójnym wytrawianiu enzymatycznym przez Bglll i Hindlll, fragmenty DNA pochodzące z amplifikacji PCR oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 2%, elektroeluowa.no (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w -80°C podczas 30 min, odwirowano przy 12000 g podczas 30 min, przemyto etanolem 70%, osuszono, a następnie ligowano z DNA plazmidowym pBIOC22 podwójnie wytrawionego przez Bglll i Hindlll, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono i defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) we44

186 586 dług rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 100 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 50 ng wytrawionych fragmentów DNA pochodzących z amplifikacji PCR opisanej powyżej w pożywce reakcyjnej 10 μΐ w obecności 1 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, selekcjonowanych na 50 μg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. DNA plazmidowe pewnych zachowanych klonów zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) według metody didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). Sekwencje PS i dojrzałego LGC klonowano w obecnie otwartych ich fazach odczytu. Sekwencją rozszczepienia między sekwencjami PS i dojrzałego LGC jest Ser-Leu. Otrzymany plazmid nazwano PBIOC23. Wychodząc z pBIOC23, fragment BglII-XbaI zawierający sekwencję PS-LGC wyodrębniono przez podwójne wytrawianie enzymatyczne przez Bg1II iXbaI, oczyszczanie przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroelucję (Sambrook et al., 1989), wytrącanie alkoholem, suszenie. Następnie, ten fragment DNA poddano działaniu enzymu Klenowa według rekomendacji producenta i ligowano z DNA plazmidowym pBIOC21 wytrawionym w miejscu HindlII, poddano działaniu Klenowem i de^ftosfoi^llowiu^o enzymem - fosfatazą allki^lli^c.nn^. z jelit wołu ((Boehringer Marnnieim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 200 ng fragmentów dNa zawierających PS-LGC opisane powyżej w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, selekcjonowanych na 12 μg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany klon nazwano pBIOC25. Sekwencję nukleotydową fragmentu kodującego proteinę rekombinaeyjnąPS-LGC zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ sprzedawanego przez Pharmacia metodą didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). DNA plazmidowe wektora binarnego pBIOC25 wprowadzono przez bezpośrednią transformację wszczepie LBA4404 Agrobacterium tumefaciens według metody Holstersa et al. (1978). Ważność zachowanego klonu zweryfikowano przez wytrawianie enzymatyczne wprowadzonego DNA plazmidowego.

b. Konstruowanie plazmidu binarnego pBIOC26 zawierającego PPS-LGC.

Plazmid pBIOC22 wytrawiono całkowicie przez Bg1II i częściowo przez HindIII w celu usunięcia sekwencji kodującej polipeptyd Leu-Phe-Gly-Lys dojrzałej proteiny LGC. Tę sekwencję zastąpiono przez sekwencję kodującą peptyd sygnałowy PPS o 37 aminokwasach (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT

CCA GCC CAT TCC AGG TTC AAT CCC ATC CGC CTC CCC ACC ACA CAC GAA CCC GCC) uległy fuzji do sekwencji 4 pierwszych kodonów proteiny dojrzałego LGC (PPS-4 pierwsze kodony dojrzałego LGC). Sekwencję PPS-4 pierwsze kodony dojrzałego LGC amplifikowano przez PCR wychodząc z plazmidu pMAT103 (Matsuoka iNakamura, 1991) za pomocą 2 następujących oligodezoksynukleotydów, 5'caggagatctgATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3' i 5'G ATG AAG CTT TCC AAA CAA GGC GGG TTC GTG TGT GGT TG 3', postępując według protokołu amplifikacji PCR opisanego powyżej w paragrafie

I. Po podwójnym wytrawianiu enzymatycznymi przez BglII i HindIII, fragmentyDNA pochodzące z amplifikacj i PCR oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 2%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w-80°c podczas 30 min, odwirowano przy 12000 g podczas 30 min, przemyto etanolem 70%, osuszono, a następnie ligowano z dNa plazmidowym pBIOC22 podwójnie wytrawionym przez BglII i HindIn, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano, poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono

186 586 i defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 100 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 50 ng wytrawionych fragmentów DNA pochodzących z amplifikacji PCR opisanej powyżej w pożywce reakcyjnej 10 μΐ w obecności 1 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia Coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. DNA plazmidowe pewnych zachowanych klonów zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawanego przez Pharmacia) według metody didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). Sekwencje PPS i dojrzałego LGC klonowano obecnie otwartych ich fazach odczytu. Sekwencją rozszczepienia między dwiema sekwencjami jest Ala-Leu.

Uzyskany plazmid nazwano pBIOC24. Wychodząc z pBIOC24, fragment BglII-XbaI zawierający sekwencję PPS-LGC wyodrębniono przez podwójne wytrawianie enzymatyczne przez Bglll i Xbal, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w alkoholu, osuszono. Następnie, ten fragment DNA poddano działaniu enzymu Klenowa według rekomendacji producenta i ligowano w DNA plazmidowym pBIOC21 wytrawionym w miejscu HindIII, poddano działaniu Klenowa i defosforylowano enzymem fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Manriheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 200 ng fragmentów DNA zawierających PPS-LGC opisane powyżej w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°Ć podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 12 pg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany klon nazwano pBIOC26. Sekwencję nukleotydową fragmentu kodującego proteinę rekombinacyjną PPS-LGC zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) według metody didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). DNA plazmidowe wektora binarnego pBIOC26 wprowadzono przez bezpośrednią transformację w szczepie LBA4404 Agrobacterium tumefaciens według metody Holstersa et al. (1978). Ważność otrzymanego klonu zweryfikowano przez wytrawianie enzymatyczne wprowadzonego DNA plazmidowego.

C. Konstruowanie plazmidu binarnego pBIOC41 zawierającego PSLGL-LGC.

Lipazę żołądkową królika zsyntetyzowano w formie prekursora złożonego z peptydu sygnałowego z 22 aminokwasów, usytuowanego na skraju NH₂-końca i poprzedzającego sekwencję polipeptydową dojrzałej lipazy, klon pJOlOl zawierający pełny cDNA kodujący lipazę żołądkową królika jest opisany w zgłoszeniu patentu europejskiego nr 92 403 055.4 złożonym 12.11.92 przez Institut de Recherche Jouveinal pt. Kwasy nukleinowe kodujące lipazę żołądkową królika i pochodne polipeptydy, ich wykorzystanie do wytwarzania tych polipeptydów, i kompozycje farmaceutyczne na podstawie tych ostatnich.

Porównanie sekwencji polipeptydowych lipazy żołądkowej psa i prekursora lipazy żołądkowej królika wykazało że sekwencja LFGK jest obecna w dwóch proteinach. W sekwencji polipeptydowej lipazy królika oznaczonej wychodząc z oczyszczonej proteiny naturalnej (Moreau et al., 1988), trzy pierwsze reszty L, F i G są nieobecne i stanowią część peptydu sygnałowego o 22 aminokwasach LGL. W konsekwencji, peptyd sygnałowy lipazy żołądkowej królika pozbawiony tych trzech wspólnych aminokwasów poddano fuzji do dojrzałej sekwencji proteinowej lipazy żołądkowej psa. Ta sekwencja polipeptydową składa się z następujących 19 aminokwasów: MWVLFMVAALLSALGITHG.

Plazmid pBIOC22 wytrawiono całkowicie przez Bglll i częściowo przez HindIII w celu usunięcia sekwencji kodującej polipeptyd Leu-Phe-Gly-Lys (4 pierwsze aminokwasów) dojrzałej proteiny LGC. Tę sekwencję zastąpiono przez sekwencję kodującą peptyd sygnałowy

186 586

PSLGL lipazy żołądkowej królika o 19 aminokwasach (ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT) uległą fuzji do 4 pierwszych kodonów dojrzałej proteiny LGC (PSLGL-4 pierwsze kodony dojrzałego LGC). Sekwencję PSLGL-4 pierwsze kodony dojrzałego LGC amplifikowano przez PCR wychodząc z plazmidu pJO101 za pomocą 2 następujących oligodezoksynukleotydów: 5' aggagatctcaacaATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG 3' i 5' G ATG AAG CTT TCC AAA CAA ACC ATG TGT AGT TCC AAG TG 3', postępując według protokołu amplifikacji PCR opisanego powyżej w paragrafie I. Po podwójnym wyrawianiu enzymatycznym przez BgOII i Hindlll, fragmenty DNA pochodzące z amplifikacji PCR oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 2%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 0/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w -80°C podczas 30 min, odwirowano przy 12000 g podczas 30 min, przemyto etanolem 70%, osuszono, a następnie ligowano z DNA plazmidowym pBIOC22 podwójnie wytrawionym przez Bg1.II i HindlH, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook el al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono i defosforylowano enzymem -fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 100 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 50 ng fragmentów wytrawionego DNA pochodzących z amplifikacji PCR opisanych powyżej w pożywce reakcyjnej 10 pl w obecności 1 μ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane w środowisku zawierającym 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. DNA plazmidowe pewnych zachowanych klonów zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) metodą didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977).

Sekwencje du PSLGL i dojrzałego LGC klonowano w ich obecnie otwartych fazach odczytu (tzn., takiego rodzaju, że tworzą one fazę otwartą jedynego odczytu). Sekwencją rozszczepienia między sekwencjami PSLGL i dojrzałego LGC jest Gly-Leu. Otrzymany plazmid nazwano pBIOC40. Wychodząc zpBIOC40, fragment BgIII-XbaI zawierający sekwencję PSLGL-LGC wyodrębniono przez podwójne wytrawianie enzymatyczne przez Bg1II i Xbal, oczyszczanie przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroelucję (Sambrook et al., 1989), wytrącanie alkoholem, suszenie. Następnie, ten fragment DNA poddano działaniu enzymu Klenowa według rekomendacji producenta i ligowano z DNA plazmidowym pBIOC21 wytrawionym w miejscu HindIII, poddano działaniu Klenowa i defosforylowano enzymem fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 200 ng fragmentów DNA zawierających PSLGL-LGC opisane powyżej w pożywce reakcyjnej 20 pl w obecności 2 pl buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 pl 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia Coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na pożywce zawierającej 12 pg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Otrzymany klon nazwano pBIOC41. Sekwencję nukleotydową fragmentów kodujących proteinę rekombinacyjną PSLGL-LGC zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) metodą didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). DNA plazmidowe wektora binarnego pBIOC41 wprowadzono przez bezpośrednią, transformację w szczep LBA4404 Agrobacterium tumefaciens według metody Holstersa et al. (1978). Ważność zachowanego klonu zweryfikowano przez wytrawianie enzymatyczne wprowadzonego DNA plazmidowego.

I-B) Konstruowanie genów chimerycznych kodujących rekombinacyjne LGC i umożliwiających ekspresję w pomidorze.

186 586

Wykorzystanymi konstrukcjami są takie jak cytowane dla transformacji genetycznej tytoniu, a mianowicie plazmidy pBIOC25, pBIOC26 i pBIOC41.

II. Konstruowanie genów chimerycznych kodujących proteinę rekombinacyjną lipazy żołądkowej psa i umożliwiającą ekspresję w ziarnach rzepaku.

a) Konstruowanie plazmidu binarnego pBIOC28 zawierającego promotor pCRU.

Ekspresja w ziarnach rzepaku lipazy żołądkowej psa (LGC) wymaga wstawienia cDNA kodującego LGC między następującymi sekwencjami regulacyjnymi:

1. Promotor pCRU odpowiadający obszarowi 5' niekodującemu genu proteiny zapasowej ziama - krucyferyna A rzodkwi (Depigny-This et al., 1992) i umożliwiając ekspresję specyficzną w ziarnach;

2. Sekwencja kończąca transkrypcji, terminator polyA 35S, który odpowiada obszarowi 3' niekodującemu sekwencji wirusa o dwułańcuchowym kolistym DNA mozaiki kalafiora wytwarzającym transkrypt 35S (Franek et al., 1980).

W celu otrzymania plazmidu binarnego podobnego do pBIOC21 lecz którego promotor pd35S zastąpiono przez promotor pCRU, fragment EcoRI na który podziałano KlenowBarnHI, zawierający promotor pCRU wyodrębniono wychodząc z plazmidu pBI221CRURSP pochodzącego z pBI221 (sprzedawany przez Clontech) przez zastąpienie promotora 35S przez promotor pCRU.

Fragment EcoRI na który podziałano Klenow-BamHI zawierający promotor pCRU oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono i ligowano z DNA plazmidowym pJIT163 (opisany w paragrafie 1), wytrawiono przez Kpnl, podziałano T4 polimerazą DNA (New England Biolabs) według rekomendacji producenta, a następnie wytrawiono BamHI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono i defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mamiheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 200 ng fragmentów DNA EcoRI na który podziałano Klenow-BamHI opisanych powyżej w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na pożywce zawierającej 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Otrzymany plazmid nazwano pBIOC27.

Kasetę ekspresji, złożoną z promotora pCRU i terminatora polyA 35S wyodrębniono wychodząc z pBIOC27 przez całkowite wytrawianie Xhol, a następnie wytrawianie częściowe EcoRI. Kasetę oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, electroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono, podziałano Klenowem (New England Biolabs) według rekomendacji producenta i ligowano z DNA plazmidowym pBIOC24 w miejscu EcoRI, na które podziałano Klenowem i defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 200 ng fragmentów DNA XhoI-EcoRI opisanych powyżej w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione uprzednio kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na pożywce zawierającej 12 pg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Otrzymany plazmid nazwano pBIOC28.

186 586

b) Konstruowanie plazmidu binarnego pBJOC29 zawierającego PPS-LGC.

Wyodrębnienie fragmentu BgIII-XbaI zawierającego sekwencję PPS-LGC wychodząc zPBIOC24 już opisano wI-A-b. Ten fragment ligowano w DNA plazmidowe pBIOC28 w miejscu EcoRI, na które podziałano Klenowem i defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 200 ng fragmentów DNA Bg11I-XbaI zawierających PPS-LGC w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności bufom T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia Coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na pożywce zawierającej 12 μg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany plazmid nazwano pBIOC29. Sekwencję nukleotydową proteiny rekombinacyjnej PPS-LGC zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) metodą didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). DNA plazmidowe wektora binarnego pBIOC29 wprowadzono przez bezpośrednią transformację w szczep LBA4404 Agrobacterium tumefaciens według metody Holstersa et al. (1978). Ważność zachowanego klonu zweryfikowano przez wytrawianie enzymatyczne wprowadzonego DNA plazmidowego.

c) Konstruowanie plazmidów binarnych pBIOC90 ipBIOC91 zawierających promotor pGEAlD.

Ekspresja w ziarnach rzepaku genu zwierzęcego kodującego lipazę żołądkową psa (LGC) wymaga następujących sekwencji regulacyjnych:

1. promotor pGEA 1 odpowiadający obszarowi 5' niekodującemu genu proteiny zapasowej ziarna, GEA1 Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993), i umożliwiający ekspresję specyficzną w ziarnach

W celu otrzymania plazmidu binarnego pBIOC9O podobnego do pBIOC21, lecz którego promotor pd35S zastąpiono przez promotor pGEAlD, fragment HindIII -BaniHI na który podziałano Klenowem, zawierający promotor pGEAI, wyodrębniono wychodząc z plazmidu pGUS2-pGEAl. Klon pGU8-2-pGEAl pochodzący z pB 1221 przez zastąpienie promotora p358 przez promotor pGEAI, zawiera 2 ATG w fazie: AtG genu GEA1 (Em2) i ATG genu gus. ATG genu GEA1 został zniszczony. Fragment DNA zawarty między miejscem Sail i sekwencją w górę ATG genu GEA1 klonu pGUS-2-pGEAl amplifikowano przez PCR za pomocą 2 oligonukleotydów 5' CAAACGTGTACAATAGCCC 3' i 5' CCCGGGGATCCTTTTTTG 3'. Temperaturę hybrydyzacji dopasowano. Fragment amplifikowany przez PCR wytrawiono przez SalI i BamiII, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 2%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w-80°C podczas 30 min, odwirowano przy 12000g podczas 30 min, przemyto etanolem 70%, osuszono, a następnie ligowano z dNa plazmidowym pGUS2-GEA1 podwójnie wytrawionym przez SalI i BamHI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono. Ligację wykonano z 100 ng wektora i 50 ng wytrawionych fragmentów DNA pochodzących z amplifikacji PCR, opisanej powyżej, w pożywce reakcyjnej 10 μΐ w obecności 1 μΐ bufom T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Makterie, Escherichia Coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 50 μg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Pewne zachowane klony zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) według metody didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). Uzyskany klon nazwano pGUS-2-pGEAlD.

186 586

Fragment Hindin - BamHI zawierający promotor pGEAID wyodrębniono wychodząc z pGUS-2-pGEAlD, poddano działaniu Klenowa według rekomendacji producenta (Biolabs), oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono i ligowano z DNA plazmidowym pBIOC21 w miejscach Kpnl iHindill na które podziałano enzymem T4 polimerazy DNA (Biolabs) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego pBIOC21 i 200 ng fragmentów DNA XhoI-EcoRl opisanych powyżej w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 12 pg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Otrzymany plazmid nazwano pBIOC90. W celu otrzymania plazmidu binarnego pBIOC91, kasetę ekspresji pGEAID tNOS, wyodrębniono wychodząc z pBSII-pGEAlD, wprowadzono w plazmid binarny pSCY1.2 sam otrzymany przez klonowanie fragmentu HindlH zawierającego kasetę ekspresji p35S - nptll - tNOS opisaną przez: Fromm et al. (1986) w miejscu Hindlll pSCVl skonstruowanego przez Edwardsa G.A. w 1990 postępując według zwykłych procedur klonowania. Plazmid pBSII-pGEAID otrzymano w dwóch etapach

- z jednej strony, fragment SacI-EcoRI zawierający tNOS (terminator genu syntazy nopalinowej) Agrobacterium tumefaciens, poddano działaniu enzymu T4 polimerazy DNA (Biolabs) według rekomendacji producenta i oczyszczono, klonowano w miejscu EcoRY pBSIISK+ (sprzedawany przez Stratagene), defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z jelit wolu (Boehringer Manriheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora i 200 ng fragmentów DNA zawierających tNOS opisane powyżej w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Pewne zachowane klony zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) metodą didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). Otrzymany plazmid nazwano pBSII-tNOS.

- z drugiej strony, fragment zawierający pGEAID wytrawiony podwójnie przez Hindin poddano działaniu enzymu Klenowa i BamHI, oczyszczono, klonowano w miejscach Xbal, na które podziałano Klenowem i BamHI plazmidu pBSU-tNOS. Ligację wykonano z 100 ng wektora opisanego powyżej i 50 ng fragmentów DNA opisanego powyżej w pożywce reakcyjnej 10 μΐ w obecności 1 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie, Escherichia Coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany plazmid nazwano pBSII-pGEAID.

Następnie kasetę ekspresji pGEAID - tNOS zawartą we fragmencie XbaI-HindIII, na które podziałano Klenowem, klonowano w miejscu Smal pSCV1.2 defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego pSCV1.2 i 200 ng fragmentów zawierających kasetę ekspresji pGEAID - tNOS, w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie, Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą

186 586 lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany plazmid nazwano pBIOC91.

d) Konstruowanie plazmidu binarnego pBIOC92 zawierającego promotor pGEA6D.

1. Promotor pGEA6 odpowiadający obszarowi 5' niekodującego genu proteiny zapasowej ziarna, GEA6 Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993), i umożliwiający ekspresję specyficzną w ziarnach;

2. sekwencja kończąca transkrypcji, terminator polyA 35S, który odpowiada obszarowi 3' niekodującemu sekwencji wirusa o dwułańcuchowym kolistym DNA mozaiki kalafiora wytwarzającemu transkrypt 35S (Franek et al., 1980).

W celu otrzymania plazmidu binarnego pBIOC92 podobnego do pBIOC21, lecz którego promotor pd35S zastąpiono przez promotor pGEA6D, fragment EcoRI - BamHI poddano działaniu Klenowa, zawierającemu promotor pGBAó, wyodrębniono wychodząc z plazmidu pGUS2-pGEA6. Klon pGUS-2-pGEA6 pochodzący od pUC18 zawiera 2 ATG w fazie: ATG genu GEA6 (Em6) i ATG genu gus. ATG genu GEA6 zniszczono. Fragment DNA zawarty między miejscem Acci i sekwencją w górę ATG genu GEA6 klonu pGUS-2-pGEA6 amplifikowano przez PCR za pomocą 2 oligonukleotydów: 5’ AAGTACGGCCACTACCACG 3’ i 5' CCCGGGGATCCTGGCTC 3'. Temperaturę hybrydyzacji dopasowano.

Fragment amplifikowany przez PCR wytrawiono przez Acci i BamHI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 2%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w -80°C podczas 30 min, odwirowano przy 12000g podczas 30 min, przemyto etanolem 70%, osuszono, a następnie ligowano z DNA plazmidowym pGUS-2-GEA6 podwójnie wytrawionym przez Acci i BamHI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano w wytrącaniu alkoholem, osuszono. Ligację wykonano z 100 ng wektora opisanego powyżej i 50 ng wytrawionych fragmentów DNA pochodzących z amplifikacji PCR opisanej powyżej w pożywce reakcyjnej 10 μΐ w obecności 1 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie, Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Pewne zachowane klony zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) według metody didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). Otrzymany klon nazwano pGUS-2-pGEA6D.

Fragment EcoRI - BamlH zawierający promotor pGEA6D wyodrębniono wychodząc z pGUS-2-pGEA6D, poddano działaniu. Klenowa według rekomendacji producenta (Biolabs), oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono i ligowano w miejscu Xhol poddano działaniu enzymu Klenowa o zmodyfikowanym DNA plazmidowym pBIOC21. Zmodyfikowany plazmid pBIOC21 otrzymany przez podwójne wytrawianie przez Hindul poddano działaniu Klenowa iKpnl pBIOC21 w celu usunięcia fragmentu zawierającego promotor pd35S i zastąpienia przez fragment KpnI-EcoRV zawierający polilinker złożony z miejsc KpnI-XhoI-SalT-ClaI-Hindni-BamHI-SmaI-EcoRI-EcORVpBSHSK+.

Ligację wykonano z 20 ng zmodyfikowanego defosforylowanego pBIOC21 i 200 ng fragmentów DNA EcoRi-Bamill, opisanych powyżej, w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie, Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 12 pg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Otrzymany plazmid nazwano pBIOC92.

186 586

e) Konstruowanie plazmidów binarnych pBIOC93, pBIOC94, pBIOC95, pBIOC96 i pBIOC97 zawierających PSLGL-LGC.

Plazmid pBIOC40 opisano powyżej. Plazmid ten zawiera fragment BglIII-XbaI zawierający sekwencję PSLGL-LGC. Ten fragment wyodrębniono przez podwójne wytrawianie enzymatyczne przez Bgłll iXbaI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowanc, poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono, poddano działaniu Klenowa i ligowano z pBIOC28 (opisany powyżej) wytrawionym przez EcoRI, poddano działaniu Klenowa i defosforylowano; pBIOC90 wytrawiony przez EcoRI poddano działaniu Klenowa i defosforylowano; pBIOC91 wytrawiono przez Smal i defosforylowano; pBIOC92 wytrawiono przez Hindill, poddano działaniu Klenowa i defosforylowano, aby otrzymać, odpowiednio, pBIOC93, pBIOC94, pBIOC95 i pBIOC96.

Plazmid pBIOC97 uzyskany z klonowania fragmentu Kpnl-EcoRV zawierający kasetę ekspresji pGEA6D-PSLGL-LGC-t35S, poddano działaniu enzymu T4 polimerazy DNA, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano, poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono i ligowano zpSCV1.2, wytrawiono Smal i defosforylowano. Kaseta ekspresji „pGEA6D-PSLGL-LGC-t35S pochodzi od pBIOC92

ΙΠ. Konstruowanie genów chimerycznych kodujących proteinę rekombinacyjną lipazy gastrycznej ludzkiej i umożliwiającej ekspresję konstytutywną np. w liściach i ziarnach tytoniu.

a) Konstruowanie plazmidu binarnego pBIOC82 zawierającego promotor chimeryczny SUPER-PROMOTOR.

Ekspresja w liścich tytoniu genu kodującego lipazę żołądkową (LGH) wymaga następujących sekwencji regulacyjnych:

1. Promotor chimeryczny super-promotor (pSP ; PCT/US94/12946). Składa się z potrójnego powtórzenia elementu aktywatora transkrypcyjnego promotora genu syntazy oktopinowej Agrobacteriun tumefaciens, elementu aktywatora transkrypcyjnego promotora genu syntazy mannopinowej i promotora syntazy mannopinowej Agrobacterium tumefaciens.

2. sekwencja kończąca transkrypcji, terminator poły A 35S, który odpowiada obszarowi 3' nie kodującemu sekwencji wirusa DNA dwułańcuchowego mozaiki kalafiora wytwarzającego transkrypt 35S (Franek et al.).

Aby otrzymać plazmid binarny podobny do pBIOC21 lecz którego promotor zastąpiono przez promotor pSP, fragment pvuÓ-SaI poddano działaniu Klenowa, zawierającego promotor pSP, wyobrębniono wychodząc z plazmidu pBISNl (PCT/US94/12946), oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 1%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono i ligowano z DNA plazmidowym pBIOC81 podwójnie wytrawionego przez Kpnl i EcoRI poddano działaniu polimerazy T4 DNA i defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Plazmid pBIOC81 odpowiada pBIOC21, którego miejsce Xbal poddano delecji. Aby to wykonać, plazmid pBIOC21 wytrawiono Xbal, następnie poddano działaniu enzymu Klenowa i ligowano przez działanie T4 ligazy DNA.

Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 200 ng fragmentów DNA zawierających pSP opisanych powyżej w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherischia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 12 pg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany plazmid nazwano pBIOC82.

Lipaza żołądkowa ludzka jest naturalnie syntetyzowana w formie prekursora opisanego w publikacji: Bodmer et al., 1987. Dojrzała proteina LGH składa się z 379 aminokwasów. Jej peptyd sygnałowy (PSLGH) jest złożony z 19 aminokwasów. Miejscem rozszczepiania między PSLGH i LGH jest Gly-Leu. Sekwencję kodującą prekursor LGH wykorzystano do skonstruowania plazmidów binarnych pBIOCSS zawierających PSLGH-LGH, PBIOC87 zawierających PSL-LGH i pBIOC89 zawierających PSLGL-LGH, gdzie sekwencja kodująca LGH

186 586 jest poprzedzona przez sekwencję kodującąjej naturalny peptyd sygnałowy, peptyd sygnałowy ludzkiej lipazy trzustkowej (PSLPH; Giller et al., 1992) i peptyd sygnałowy lipazy żołądkowej królika (PSlGL; już uprzednio opisany; patent europejski nr 92.403055.4), odpowiednio.

Sekwencję kodującą prekursor LGh wyodrębniono przez podwójne wytrawianie Pstl i Dral, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3m octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w-80°C podczas 30 min, odwirowano przy 12000g podczas 30 min, przemyto etanolem 70% i osuszono. Następnie sklonowano ją w miejscach pstll i Spel (poddanych działaniu enzymu polimerazy T4 DNA (Biolabs) według rekomendacji producenta) plazmidu pBSIISK (sprzedawany przez Stratagene). Ligację wykonano 100 ng wektora i 50 ng fragmentów DNA zawierających sekwencję kodującą prekursor LGH, opisany wyżej, w pożywce reakcyjnej 10 μΐ w obecności 1 μl buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Echerischia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 50 μg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doly, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany plazmid nazwano pBIOC83. Sekwencję kodującą dojrzały LGH zmodyfikowano przez wprowadzenie miejsca BamHI, uprzednio nieistniejącego, w dziewiątym i dziesiątym kodonie, przez kierowaną mutagenezę przez PCR stosując 2 oligodezoksy nukleotydy, 5' aaactgcaggctcgag TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT GaA GTG ACT ATG 3' (zawierający jedyne miejsca Pstl, XhoI i BamHI) i 5' AAT GGT GGT GCC CTG GGA ATG GCC AAC ATA GTG TAG CTG C 3' (zawierający jedyne miejsce Mscl w plazmidzie pBIOC83).

Amplifikację PCR fragmentu Pstl-Mscl wykonano w 100 μΐ w pożywce reakcyjnej zawierającym 10 μΐ buforu Taq polimerazy DNA x 10 (500 mM Kcl, 100 mM Tris-HCl, pH9,0 i 1% Triton x 100), 6 μΐ 25 mM MgCl₂, 3 μΐ 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP i dTTP), 100 pM każdego z 2 oligodezoksynukleotydów opisanych powyżej, 5 ng matrycy DNA (wektor pBIOC83), 2,5 U Taq polimerazy DNA (Promega) i 2 krople oleju wazelinowego. DNA zdenaturowano w 94°C podczas 5 min, poddano 30 cyklom składającym się każdy z 1 min denaturacji w 94°C, 1 min hybrydyzacji w 65°C i 1 min wydłużania w 72°C, a następnie wydłużanie w 72°C kontynuowano przez 5 min. Tę reakcję PCR wykonano w aparacie DNA Thermal Cycler PERKIN ELMER CETUS. Olej usunięto przez ekstrakcję w chloroformie. Następnie, fragmenty DNA zawarte w pożywce reakcyjnej wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w -80°C podczas 30 min, odwirowano w 12000 g podczas 30 min, przemyto w etanolu 70%, osuszono i wytrawiono przez 2 enzymy restrykcyjne Pstl i Mscl. Wytrawione fragmenty DNA pochodzące z amplifikacji przez PCR oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 2%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w -80°C podczas 30 min, odwirowano w 12000 g podczas 30 min, przemyto w etanolu 70%, osuszono, a następnie ligowano w DNA plazmidowym wektora pBIOC83 podwójnie wytrawionego przez Pstl i MscI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano, poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono. Ligację wykonano przy użyciu 100 ng wektora i 50 ng fragmentów wytrawionego DNA pochodzących z amplifikacji przez PCR, opisaną powyżej, w pożywce reakcyjnej 10 μΐ w obecności 1 μί buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów wyselekcjonowane na 50 μg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doly, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Pewne z zachowanych klonów zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) według metody didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). Wprowadzenie miejsca restrykcyjnego BamHI nie modyfikuje kodu genetycznego LGH. W istocie sekwencja naturalnego LGH GGA AGC (GlySer) staje się GGA TTC (Gly-Ser). Uzyskany plazmid nazwano pBIOC84..

186 586

b) Konstruowanie plazmidu binarnego pBIOC85 zawierającego PSLGH-LGH.

Fragment Pstl-Xbal zawierający sekwencję PSLGH-LGH wyodrębniono przez podwójne wytrawianie enzymatyczne przez Pstl i Xbal wychodząc z pBIOC83, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem i osuszono. Następnie ten fragment DNA poddano działaniu enzymu polimerazy T4 DNA (Biolabs) według rekomendacji producenta i ligowano z DNA plazmidowym pBIOC82 wytrawionym w miejscu Xbal, poddano działaniu Klenowa (Biolabs) i defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora i 200 ng fragmentów DNA zawierających PSLGH-LGH, opisanych powyżej, w środowisku reakcji 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowy otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 12 pg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i zanalizowano przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany klon nazwano pBIOC85. Sekwencję nukleinową fragmentu kodującego proteinę rekombinacyjną PSLGH-LGH zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) według metody didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). Sekwencją rozszczepiania między sekwencjami PSLGH i dojrzałego LGH jest Gly-Leu. DNA plazmidowy wektora binarnego pBIOC85 wprowadzono przez bezpośrednią transfomację do szczepu LBA4404 Agrobacterium tumefaciens według metody Holstersa et al., (1978). Ważność zachowanego klonu zweryfikowano przez wytrawianie enzymatyczne wprowadzonego DNA plazmidowego.

c) Konstruowanie plazmidu binarnego pBIOC86 zawierającego PSLPH-LGH.

Plazmid pBIOC84 wytrawiono podwójnie przez Pstl iBamHI w celu usunięcia sekwencji kodującej peptyd sygnałowy PSLGH i 8 pierwszych aminokwasów proteiny dojrzałego LGH (Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly). Tę sekwencję zastąpiono przez sekwencję kodującą peptyd sygnałowy PSLPH o 16 aminokwasach (ATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA) uległą fuzji do sekwencji kodującej 8 pierwszych kodonów proteiny dojrzałego LGH (PSLPH - 8 pierwszych kodonów dojrzałego LGH). Sekwencję PSLPH - 8 pierwszych kodonów dojrzałego LGH wzmocniono przez PĆR wychodząc z matiycy 5' aaactgcaggctcgagaacaATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3' za pomocą 2 oligodezoksynukleotydów, 5' aaactgcaggctcgagaacaATG C 3’ i 5’ C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3', postępując według protokołu amplifikacji PCR opisanego uprzednio (patrz paragraf I powyżej). Temperaturę hybrydyzacji dopasowano. Po podwójnym wytrawianiu enzymatycznym przez Pstl i BamHI, fragmenty DNA pochodzące z amplifikacji PCR oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 2%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w -80°C podczas 30 min, odwirowano przy 12000 g podczas 30 min, przemyto etanolem 70%, osuszono, następnie ligowano z DNA plazmidowym pBIOC84 podwójnie wytrawionym przez Pstl iBamHI, oczyszczonym przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono. Ligację wykonano z 100 ng wektora i 50 ng wytrawionych fragmentów DNA pochodzących z amplifikacji PCR, opisanych powyżej, w pożywce reakcyjnej 10 μΐ w obecności 1 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Pewne z zachowanych klonów zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) według metody didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). Sekwencje PSLPH i dojrzałego LGH sklonowano obecnie w ich fazach otwartego odczytu

186 586 (tzn. tego rodzaju, że stanowią one fazę otwartąjedynego odczytu). Sekwencją rozszczepiania między sekwencjami PSLPH i LGH jest Gly-Leu. Uzyskany plazmid nazwano pBIOC86.

Wychodząc z pBIOC86, fragment Pstl - Xbal zawierający sekwencję PSLPH-LGH wyodrębniono przez podwójne wytrawianie enzymatyczne przez Pstl i Xbal, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook i in., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem i osuszono. Następnie ten fragment DNA poddano działaniu enzymu polimerazy T4 DNA (Biolabs) według rekomendacji producenta i ligowano z DNA plazmidowym pBIOC82 wytrawionym w miejscu Xbal, poddano działaniu Klenowa (Biolabs) i defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora opisanego powyżej i 200 ng fragmentów DNA zawierających PSLPH-LGH opisanych powyżej w pożywce reakcyjnej 20 pl w obecności 2 pl buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 14 h. Bakterie Escherichia coli DH5a, uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 12 μg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doly, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany klon nazwano pBIOC87. Sekwencję nukleinową fragmentu kodującego proteinę rekombinacyjną PSLPH-LGH zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) metodą didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). DNA plazmidowe wektora binarnego pBIOC87 wprowadzono przez bezpośrednią transformację do szczepu LBA4404 Agrobacterium tumefaciens według metody Holstersa et al. (1978). Ważność zachowanego klonu zweryfikowano przez wytrawianie enzymatyczne wprowadzonego DNA plazmidowego.

d) Konstruowanie plazmidu binarnego pBIOC89 zawierającego PSLGL-LGH.

Plazmid pBIOC84 wytrawiono podwójnie przez Pstl i BamHI w celu usunięcia sekwencji kodującej peptyd sygnałowy PSLGH i 8 pierwszych aminokwasów proteiny dojrzałego LGH (Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly). Tą sekwencję zastąpiono przez sekwencję kodującą peptyd sygnałowy PSLGL o 19 aminokwasach (AtG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT) uległy fuzji do sekwencji kodującej 8 pierwszych kodonów proteiny dojrzałego LGH (PSLGL - 8 pierwszych kodonów dojrzałego LGH). Sekwencję „PSLGL - 8 pierwszych kodonów dojrzałego LGH wzmocniono przez PGR wychodząc z matrycy 5' aaactgcaggctcgagaacaATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGTTTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3' za pomocą 2 oligodezoksynukleotydów, 5' aaactgcaggctcgagaacaATG TGG 3' i 5' C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3', postępując według protokołu amplifikacj i PGR opisanego uprzednio (patrz paragraf I powyżej). Temperaturę hybrydyzacji dostosowano. Po podwójnym wytrawianiu enzymatycznym przez Pstl i BamHI, fragmenty DNA pochodzące z amplifikacj i PGR oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 2%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), wytrącono w obecności 1/10 objętości 3M octanu sodu pH 4,8 i 2,5 objętości etanolu absolutnego w80°C podczas 30 min, odwirowano przy 12000 g podczas 30 min, przemyto etanolem 70%, osuszono, następnie ligowano z DNA plazmidowym pBIOC84 podwójnie wytrawionym przez Pstl i BamHI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono. Ligację wykonano 100 ng wektora i 50 ng wytrawionych fragmentów DNA pochodzących z amplifikacji PGR, opisanych powyżej, w pożywce reakcyjnej 10 μΐ w obecności 1 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersjham) w 14°C podczas 14 h. Bakterie Escherichia coli DH5a, uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doly, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Pewne zachowane klony zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do seklwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) metodą didezoksynukleotydów (Tanger et al., 1977). Sekwencje

186 586

PSL i dojrzałego LGH sklonowano obecnie w ich fazach otwartego odczytu (tzn. tego typu, że stanowią one fazę otwartą jedynego odczytu).

Sekwencją rozszczepiania między sekwencjami PSLGL i dorzałego LGH jest Gly-Leu. Uzyskany plazmid nazwano pBIOC88. Wychodząc z pBIOC88, fragment Pstl - Xbal zawierający sekwencję PSLGL-LGH wyodrębniono przez podwójne wytrawianie enzymatyczne przez Pstl i Xbal, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroeluowano (Sambrook et al., 1989), poddano wytrącaniu alkoholem i osuszono. Następnie ten fragment DNA poddano działaniu enzymu polimerazy T4 DNA (Biolabs) według rekomendacji producenta i ligowano z DNA plazmidowym pBIOC82 wytrawionym w miejscu Xbal, poddano działaniu Klenowa (Biolabs) i defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z jelit wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producenta. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora i 200 ng fragmentów DNA zawierających PSLGL-LGH, opisane powyżej, w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 12 gg/ml tetracykliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany klon nazwano pBIOC89. Sekwencję nukleinową fragmentu, kodującego proteinę rekombinacyjną PSLGL-LGH zweryfikowano przez sekwencjonowanie za pomocą zestawu do sekwencjonowania T7™ (sprzedawany przez Pharmacia) metodą didezoksynukleotydów (Sanger et al., 1977). DNA plazmidowy wektora binarnego pBIOC89 wprowadzono przez bezpośrednią transformację w szczep LBA4404 Agrobacterium tumefaciens według metody Holstersa et al. (1978). Ważność zachowanego klonu zweryfikowano przez wytrawianie enzymatyczne wprowadzonego DNA plazmidowego.

IV. Konstruowanie genów chimeiycznych kodujących proteinę rekombinacyjną lipazy żołądkowej psa i umożliwiających ekspresję w nasionach kukurydzy.

a) Konstruowanie plazmidów pB10C98 ipBIOC99 zawierających PSLGL-LGC i umożliwiających ekspresję konstytutywną w nasionach kukurydzy.

Ekspresja konstytutywna w nasionach kukurydzy genu zwierzęcego kodującego lipazą żołądkową psa (LGC) wymaga następujących sekwencji regulacyjnych:

1. jeden z dwóch promotorów umożliwiających ekspresję konstytutywną:

- promotor aktynowy ryżu, po którym następuje intron aktynowy ryżu (pAR-IAR) zawarty w plazmidzie pActl-F4 opisany przez McElroy'a et al. (1991);

- podwójny promotor konstytutywny 35S (pd35S) CaMV (wirus mozaiki kalafiora). Odpowiada on zdublowaniu sekwencji aktywujących transkrypcję usytuowanych w górę elementu TATA promotora naturalnego 35S (Kay et al., 1987);

2. jeden z dwóch terminatorów:

-sekwencja kończąca transkypcji, terminator polyA 35S, która odpowiada obszarowi w 3 nie kodującemu sekwencji wirusa o kolistym, dwułańcuchowym DNA mozaiki kalafiora, wytwarzająca transkrypt 35S (Franek et al., 1980);

- sekwencja kończąca transkrypcji, terminator polyA NOS, która odpowiada obszarowi w 3' niekodującemu genu syntazy nopalinowej plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens szczep na nopalinę (Depicker et al., 1982).

Plazmid pBIOC98, gdzie sekwencja kodująca PSLGL-LGC jest umieszczona pod kontrolą pAR-IAR, otrzymano przez klonowanie fragmentu Bglll-Xbal zawierającego sekwencję koduj ącą PSLGL-LGC w miejscach „Ncol i Sali” pBSII-pAR-IAR-tNOS. Fragment BgłII-XbaI zawierający sekwencję kodującą PSLGL-LGC wyodrębniono wychodząc zpBIOC40 (opisanego poniżej) przez podwójne wytrawianie enzymatyczne przez Bglll i Xbal,oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym 0,8%, elektroełuowano, poddano wytrącaniu alkoholem, osuszono, następnie poddano działaniu enzymem Klenowa. Plazmid pBSII-pAR-IAR-tNOS wytrawiono podwójnie przez Sali i Ncol, oczyszczono, poddano działaniu enzymu Mung Bean Nuclease (Biolabs) i defosforylowano enzymem - fosfatazą alkaliczną z wołu (Boehringer Mannheim) według rekomendacji producentów. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora i 200 ng fragmentów DNA zawierających sekwencję kodującą PSLGL-LGC, opi56

186 586 saną powyżej, w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a, uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany plazmid 30 nazwano pBIOC98.

Plazmid pBSII-pAR-IAR-tNOS wynika z klonowania w miejscach Eco0109I poddanych działaniu Klanowa i KpnI pBSII-tNOS fragmentu SnaBI-KpnI zawierającego sekwencję odpowiadającą pAR-IAR-początek sekwencji kodującej gen gus wyizolowanemu wychodząc z plazmidu pActl-F4. Ligację wykonano z 100 ng wektora i 50 ng fragmentów DNA, opisanych powyżej, w pożywce reakcyjnej 10 μΐ wytrawionych w obecności 1 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowane na 50 (pg/ml ampicyliny wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne.

Plazmid pBSII-tNOS otrzymano przez klonowanie w miejscu EcoRV derosforylowanym z pBSIISK (sprzedawany przez Stratagene), fragmentu SacI-EcoRI zawierającego sekwencję tNOS wyodrębnioną wychodząc zpBI121 (sprzedawany przez Clontech) przez podwójne wytrawianie enzymatyczne przez SacI i EcoRV, poddano oczyszczaniu przez elektroforezę na żelu agarozowym 2% i poddano działaniu enzymu polimerazy T4 DNA. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora i 200 ng fragmentów DNA zawierających sekwencję tNOS, opisanych powyżej, w pożywce reakcyjnej 20 μΐ w obecności 2 μΐ bufom T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherischia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne.

Plazmid pBIOC99 lub sekwencję kodującą PSL-LGC umieszczony pod kontrolą pd35S otrzymano przez klonowanie w miejscach KpnI i BamHI plazmidu pBSII-t35S, fragmentu Kpnl-BamHI zawierającego sekwencję odpowiadającą pd35S-PSLGL-LGC wyodrębnionego wychodząc zpBIOC41, opisanego powyżej. Ligację wykonano z 100 ng wektora i 50 ng fragmentów DNA opisanych powyżej w pożywce reakcyjnej 10 μΐ wytrawionych w obecności 1 ml bufom T4 ligazy DNA x 10 (Amersham) i 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherischia coli DK5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne.

Plazmid pBSII-t35S otrzymano przez klonowanie w miejscu Spel poddanym działaniu Klenowa, defosforylowanym plazmidem pBSIISK (sprzedawany przez Stratagene), fragmentu SmaI-EcoRV zawierającego sekwencję t35S wyodrębnioną wychodząc zpJIT163 (opisany powyżej) przez podwójne wytrawianie enzymatyczne przez Smal i EcoRV, poddano oczyszczaniu przez elektroforezę na żelu agarozowym 2%. Ligację wykonano z 20 ng defosforylowanego wektora i 200 ng fragmentów DNA zawierających sekwencję t35S, opisanych powyżej, w pożywce reakcyjnej. 20 μΐ w obecności 2 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2 μΐ 50% glikolu polietylenowego 8000 i 5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherischia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doły, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne.

186 586

b) Konstruowanie plazmidów pBIOClOO ipBIOClOl zawierających PSLGL-LGC i PSLGL-LGC-KDEL, odpowiednio, i umożliwiających ekspresję w białku nasion kukurydzy.

Ekspresja w białku nasion kukurydzy genu zwierzęcego kodującego lipazę żołądkową psa (LGC) wymaga następujących sekwencji regulacyjnych:

1. promotor genu yzeiny kukurydzy (pyzeina) zawarty w plazmidzie ργ63 opisano w : Reina et al., 1990. Plazmid ργ63 jest wynikiem klonowania pyzeiny w.miejscach Hindlll i Xbal plazmidu pUCIS obejmującego między jego miejscami Hindlll i EcoRI, kasetę ekspresji p353-gus-tNOS pBI221 sprzedawanego przez Clontech. Umożliwia on ekspresję białku w nasionach kukurydzy.

2. sekwencja kończąca transkrypcji, terminator polyA NOS, która odpowiada obszarowi w 3' niekodującemu genu syntazy nopalinowej plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens szczep na nopalinę (Depicker et al., 1982.).

Plazmid pBIOClOO, gdzie sekwencja kodująca PSLGL-LGC jest usytuowana pod kontrolą pyzeiny, został otrzymany w miejscach „SacI poddany działaniu enzymu polimerazy T4 DNA i BamHI plazmidu py63, fragmentu Xbal poddanego działaniu Klenowa -Bglll wyodrębnionego wychodząc z pBIOC40 (opisanego powyżej).

Ligację wykonano z 100 ng wektora i 50 ng fragmentów DNA opisanych powyżej w pożywce reakcyjnej 10 μΐ w obecności 1 μΐ buforu T4 ligazy DNA x 10 (Amersham), 2,5 U enzymu T4 ligazy DNA (Amersham) w 14°C podczas 16 h. Bakterie Escherichia coli DH5a uczynione najpierw kompetentnymi, transformowano (Hanahan, 1983). DNA plazmidowe - otrzymanych klonów, wyselekcjonowanych na 50 pg/ml ampicyliny, wyekstrahowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim i Doly, 1979) i poddano analizie przez wytrawianie enzymatyczne przez enzymy restrykcyjne. Uzyskany klon nazwano pBIOClOO. Plazmid pBIOClOl jest wynikiem podstawienia fragmentu Ncol-Aflll pBIOClOO przez fragment Ncol-Aflll zawierający sekwencję tetrapeptydu KDEL (umożliwiający adresowanie w retikulum endoplazmatycznym) umieszczono przed kodonem stop otrzymanym przez amplifikację PCR według metod opisanych powyżej. 2 oligodezoksynukleotydami użytymi podczas tej reakcji były: 5' AAT CAC TTG GAC TTT ATC TGG Gcc atg gAT GCC 3' 0'edyne miejsce Ncol) oraz 5' AAT ctt aag AAA CTT TAT TGC CAA ATG TTT GAA CGA TCG GGG AAA TTC GAC GCG TCT AGA ACT ATA GCT CAT CCT TAT TAT CTG TTC CCA TCA TGG 3' (sekwencja kodująca KDEL i jedyne miejsce Aflll). Temperatura hybrydyzacji wyniosła 70°C. Klonowanie wykonano jak opisano uprzednio.

V. Przykład otrzymania roślin rzepaku transgenicznego.

Ziarna rzepaku wiosennego (Brassica napus cv WESTAR lub linie Limagrain) zdezynfekowano podczas 40 min w roztworze Domestos 15%. Po czterech płukaniach wodą sterylną ziarna pozostawiono do kiełkowania w porcjach 20 ziaren na doniczkę o średnicy 7 cm i wysokości 10 cm, na pożywce mineralnej Murashige i Skoog (Sigma M5519) z 30 g/l sacharozy przy użyciu żelu agarowego (5 g/l). Doniczki te umieszczono w komorze do hodowli w 26°Ć przy fotookresie 16 h/8h i przy natężeniu światła rzędu 80 μΕ m'² S-l. Po 5 dniach kiełkowania pobrano sterylnie liścienie tnąc każdą szypułkę około 1 mm powyżej zawiązka liścieniowego.

Równolegle wykonano prehodowlę szczepu Agrobacterum tumefaciens LBA4404, zawierającego plazmid pBIOC29 (lub pBIOC25), a mianowicie plazmid pGAZE, w którym wstawiono sekwencję kodującą lipazę żołądkową psa poddaną fuzji do sekwencji kodującej sygnał adresowania PPS (lub PS) pod kontrolą promotora pCRU (lub pd35S) w kolbie płaskodennej 50 ml podczas 36h w 28°C w 10 ml pożywki bakteryjnej 2YT (Sambrook et al., 1989) uzupełnionego antybiotykami przydatnymi w selekcji stosowanego szczepu.

Ta prehodowla służy do zaszczepienia do 1% nowej hodowli bakteryjnej wykonanej w tych samych warunkach. Po upływie 14h hodowle odwirowano przez 15 min przy 3000g i bakterie wprowadzono do równoważnej objętości płynnej pożywki do kiełkowania. Zawiesinę tę rozprowadzono na płytkach Petriego o średnicy 5 cm po 5 ml/płytkę. Ucięte zakończenie szypułki zanurzonona kilka sekund w roztworze tak przyrządzonych agrobakterii, a następnie szypułkę wsunięto na kilka milimetrów w pożywkę do regeneracji. Pożywka ma ten sam skład podstawowy co pożywka do kiełkowania dodatkowo z 4 mg/l benzyloaminipu58

186 586 ryny (BAP), fitohormonu sprzyjającego nowemu tworzeniu kiełków. 10 eksplantów (liścień z szypułką) umieszczono w hodowli na płytkach Petriego o średnicy 9 cm (Greiner odsyłacz nr 664102).

Po dwóch dniach współhodowli w tych samych warunkach środowiska jak przy kiełkowaniach eksplanty repikowano do szalek phytatray (Sigma, odsyłacz P1552) zawierających uprzednią pożywkę uzupełnioną czynnikiem selektywnym: 45 mg/l siarczanu kanamycyny (Sigma, odsyłacz K4000) i bakteriostatycznym : mieszanina 1/6 (wagowo) soli potasowej kwasu klawulanowego i 5/6 soli sodowej amoksycyliny (Augmentin injectable) przy 600 mg/l.

Dwa razy kolejno w odstępie trzech tygodni eksplanty repikowano do nowego środowiska w tych samych warunkach.

Zielone pączki, które pojawiły się pod koniec drugiego lub trzeciego repikowania oddzielono od eksplantu i umieszczono pojedynczo w hodowli w przezroczystych doniczkach o średnicy 5 cm i wysokości 10 cm zawierających pożywkę identyczną z poprzednią lecz pozbawioną BAP. Po trzech tygodniach hodowli transformowana łodyga pączka została pocięta i pączek repikowano do doniczki ze świeżą pożywką, Przy końcu 3 do 4 tygodnia korzenie są dość rozwinięte by umożliwić aklimatyzację zarodka roślinnego w fitotronie. Pączki, które nie są zielone lub pozbawione korzeni wyeliminowano. Te zarodki roślinne transplantowano zatem do małych doniczek o boku 7 cm wypełnionych próchnicą (norma NF U44551:40% torfu brunatnego, 30% przesianego wrzosu i 30% piasku) nasyconego wodą. Po dwóch tygodniach aklimatyzacji w fitotronie (temperatura 21°C, fotookres 16h/8h i 84% wilgotności względnej) zarodki roślinne powtórnie umieszczono w doniczkach o średnicy 12 cm wypełnionych tym samym podłożem wzbogaconym nawozem o opóźnionym działaniu (Osmocote, porcja 4 g/l podłoża), następnie przetransportowano do szklarni (klasa S2) nastawionej na 18°Ć, przy dwóch nawadnianiach codziennie 2 minuty w wodzie.

Od pojawienia się kwiatów są one otoczone woreczkami (Crispac, odsyłacz SM 570y 300 mm * 700 mm), tak by przeszkodzić zapłodnieniu krzyżowemu.

Gdy łuszczyny osiągnęły dojrzałość, zebrano je, osuszono, a następnie ubito. Uzyskane ziama służą do oznaczania aktywności biochemicznej. Selekcja potomstwa transgenicznego odbywa się przez kiełkowanie w pożywce zawierającej siarczan kanamycyny przy porcji od 100 do 150 mg/l (według genotypów). Warunki operacyjne są identyczne z tymi opisanymi powyżej oprócz tego, że kiełkowania wykonano w probówkach szklanych z pojedynczym ziarnem w probówce. Jedynie zarodki roślinne rozwijające korzenie wtórne w trzech pierwszych tygodniach zaklimatyzowano w fitotronie przed przeniesieniem do szklarni.

VI. Przykład otrzymania roślin transgenicznych psiankowatych.

Otrzymanie roślin transgenicznych tytoniu.

Rośliny tytoniu użyte w badaniach transformacji (Nicotiana tabacum var. Xanthi NC i PDB6) wyhodowano in vitro na pożywce zasadowej Murashige i Skoog (1962) z dodatkiem witamin Gamborg et al. (1968, Sigma, odsyłacz M0404) sacharozy przy 20 g/l i agaru (Merck) przy 8 g/l. pH pożywki doprowadzono do 5,8 roztworem wodorotlenku potasu przed operacją w autoklawie w 120°C podczas 20 min. Zarodki roślinne tytoniu repikowano przez rozsadę międzywęźla przez wszystkie 30 dni na tej pożywce do namnażania MS20.

Wszystkie hodowle in vitro wykonano w komorze klimatyzowanej w warunkach określonych powyżej:

-natężenie świetlne 30 pE.m-2.S-l; fotookres 16h;

-termookres 26°C w dzień, 24°C w nocy.

Zastosowana technika transformacji pochodziła od techniki Horscha et al. (1985).

Prehodowlę Agrobacterium tumefaciens szczep LBA4404 zawierającego plazmidy pBIOC29 lub pBIOC26 wykonano podczas 48 h w 28°C utrzymując mieszanie w pożywce LB (Sambrook et al., 1989) z dodatkiem odpowiednich antybiotyków (rifampicyna i tetracyklina). Prehodowlę następnie rozcieńczono 50-krotnie w tej samej pożywce i hodowano w tych samych warunkach. Po jednej nocy, hodowlę odwirowano (10 min, 3000 g), bakterie powtórnie wprowadzono do równoważnej objętości płynnej pożywki MS30 (30 g/l sacharozy) i tę zawiesinę rozcieńczono 10-krotnie.

186 586

Wycięto eksplanty o około 1 cm² wychodząc z liści opisanych wyżej zarodków roślinnych. Następnie doprowadzono je do kontaktu z zawiesiną bakteryjną podczas 1 h, następnie szybko osuszono na bibule filtracyjnej i umieszczono w pożywce współhodowli (stały M330).

Po 2 dniach, eksplanty przeniesiono na płytkach Petriego do pożywki regeneracyjnej MS30 zawierającej czynnik selektywny, kanamycynę (200 mg/1), bakteriostatyczny, augmentin (400 mg/1) i hormony niezbędne do indukowania pączków (BAP, 1 mg/1 i ANA, 0,1 mg/1). Repikowanie eksplantów wykonano w tej samej pożywce po 2 tygodniach hodowli. Po dodatkowych 2 tygodniach, pączki repikowano na płytkach Petriego w pożywce rozwojowej złożonej z pożywki M320 z dodatkiem kanamycyny i augmentinu.

Po 15 dniach pączki repikowano z połowy. Ukorzenienie zajmuje około 20 dni, po którym to czasie zarodki roślinne można klonować przez rozsadę międzywęźla lub przenieść do szklarni.

b) Otrzymanie roślin transgenicznych pomidora.

Ziarna pomidora cv. UC82B wysterylizowano podczas 15 min wDomestos 10% i trzy razy płukano wodą sterylną. Ostatnie płukanie wykonano podczas 10 min utrzymując mieszanie.

Tak wysterylizowane ziarna pozostawiono do kiełkowania na pożywce MSSV/2 (pożywka zasadowa Murashige i Skoog (1962, Sigma - odsyłacz M6899)/2 z dodatkiem witamin Nitsch (Thomas i Pratt, 1981), sacharozy (30 g/l), agaru (Merck) (8 g/l), pH5,9, podczas 7 lub 8 dni w komorze klimatyzowanej (przy natężeniu światła rzędu 30 μΕ m'² s-1, przy fotookresie 16 h/8h, w 26°C).

Zastosowana technika transformacji pochodzi od metody Fillatti et al. (1987).

Prehodowlę Agrobacterum tumefaciens szczep LBA4404, zawierającego plazmidy pBIOC25 lub pBIOC26 wykonano podczas 24 h w 28°C utrzymując mieszanie w pożywce LB z dodatkiem odpowiednich antybiotyków (rifampicyna i tetracyklina).

Prehodowlę następnie rozcieńczono 50-krotnie w tej samej pożywce i hodowano w tych samych warunkach przez noc.

Zmierzono DO (gęstość optyczną) przy 600 nm, agrobakterie odwirowano (10 min, 3000 g) i wprowadzono do płynnej pożywki KCMS (opisanej w publikacji: Fillatti et al., 1987), tak by otrzymać DO przy 600 nm: 0,8.

Na pewnych etapach protokołu Fillattiego et al. (1987) wprowadzono ulepszenia techniczne.

Prehodowlę eksplantów i współhodowlę wykonano jak opisano w: Fillatti et al. (1987) oprócz tego, że pożywkę KCMS uzupełniono acetosyringonem (200 mM).

Pożywka do mycia 2Z różni się dodatkiem cefotaksimu (500 mg/1) w miejsce karbenicyliny. Użyta pożywka rozwojowa jest złożona z pożywki zasadowej Murashige i Skoos (Sigma MS6899) z dodatkiem witamin Nitsch, sacharozy (20 g/l), kanamycyny (50 mg/1), augmentinu (200 mg/1), ANA (1 mg/1) i zeatyny (0,5 mg/1).

VII. Otrzymanie roślin transgenicznych kukurydzy.

a) Otrzymanie i wykorzystanie twardziny kukurydzy jako przedmiotu transformacji genetycznej.

Transformacja genetyczna kukurydzy jaką bądź zastosowaną metodą (elektroporacja; Agrobacterium, mikrowłókna, działo do cząstek), wymaga zasadniczo zastosowania niezróżnicowanych komórek o szybkich podziałach z zachowaną zdolnością do regeneracji całych roślin. Ten typ komórek stanowi kruchą twardzinę embriogenną (tzw. typu II) kukurydzy. Te twardziny otrzymuje się wychodząc z niedojrzałych embrionów genotypu HI Π lub (A 188 x B73) według metody i na pożywkach opisanych przez Armstronga (Malze Handbook; (1994) M. Freeling, V. Walbot (red.); str. 665-671). Tak uzyskane twardziny są zwielokrotnione i utrzymywane przez kolejne repikowania co piętnaście dni w pożywce początkowej. Następnie zarodki roślinne są regenerowane wychodząc z tych twardzin modyfikując równowagę hormonalnąi osmotyczną komórek wedle metody opisanej przez Vain et al. (Plant Cell Tissue and Organ Culture (1989, 18:143-151). Rośliny te są ostatecznie aklimatyzowane w szklarni lub mogą być krzyżowane lub autozapładniane.

186 586

b) Zastosowanie działa do cząstek dla transformacji genetycznej kukurydzy.

W poprzednim paragrafie opisano otrzymywanie i regenerację linii komórkowych niezbędnych do transformacji: tu opisuje się metodę transformacji genetycznej prowadzącej do trwałej integracji zmodyfikowanych genów w genomie rośliny. Metoda ta opiera się na wykorzystaniu działa do cząstek identycznego z opisanym w: J. Finer (Plant Cell Report (1992) 11: 323-328); rozpatrywane komórki są fragmentami twardzin opisanych w paragrafie 1. Te fragmenty o powierzchni od 10 do 20 nmr rozmieszczono, 4 h przed bombardowaniem, po 16 fragmentów na płytkę w środku płytki Petriego zawierającym pożywkę hodowli identyczną z pożywką początkową, z dodatkiem 0,2 M mannitolu + 0,2 M sorbitolu. Plazmidy zawierające geny do wprowadzenia oczyszczono na kolumnie Qiagen®, postępując według instrukcji producenta. Następnie je wytrącono na cząstkach wolframu (M10) postępując według protokołu opisanego przez Kleina (Naturę (1987) 327:70-73). Tak otoczone cząstki wyrzucano za pomocą działa na rozpatrywane komórki i według protokołu opisanego w: J. Finer (Plant Celi Report (1992) 11:323-328). Następnie pudełka tak zbombardowanych twardzin szczelnie zamknięto za pomocą Scellofrais®, a następnie hodowano w ciemności w 27°C. Pierwsze repikowanie miało miejsce po 24 h, następne co piętnaście dni podczas 3 miesięcy na pożywce identycznej z pożywką początkową z dodatkiem czynnika selektywnego, którego charakter i stężenie mogą się zmieniać stosownie do użytego genu (patrz paragraf 3). Stosowalne czynniki selektywne składają się zasadniczo ze związków aktywnych pewnych herbicydów (Basta®, Round up®) lub pewnych antybiotyków (Hygromycyna, Kanamycyna...).

Po trzech miesiącach lub niekiedy wcześniej, otrzymuje się twardziny, których wzrost nie jest inhibitowany przez czynnik selekcji, zwykle i przeważnie złożone z komórek uzyskanych z podziału komórki z włączonymi w swoim dziedzictwie genetycznym jedną lub więcej kopiami genu selekcji. Częstość otrzymania takich twardzin wynosi około 0,8 twardziny na bombardowane pudełko.

Te pudełka zidentyfikowano, rozróżniono, amplifikowano, a następnie hodowano, tak by zregenerować zarodki roślinne (por. paragraf a). W celu uniknięcia wszelkich zakłóceń z komórkami nie transformowanymi wszystkie operacje przeprowadzano w pożywkach hodowli zawierających czynnik selektywny.

Tak regenerowane rośliny aklimatyzuje się, a następnie hoduje w szklarni, gdzie mogą być krzyżowane lub samozapładniane.

VIII. Analiza ekspresji lipazy żołądkowej psa w roślinach transgenicznych tytoniu, a) Protokół.

Protokół ekstrakcji lipazy wychodząc z liści tytoniu pobranych z roślin w szklarni jest następujący: 1 g liści (ciężar świeży) rozdrabnia się w ciekłym azocie, a następnie w 4°C w 5 ml buforu Tris-HCl 25 mM pH 7,5, dodaje się EDTA 1 mM i merkaptoetanol 10 mM (bufor A) lub bufor glicyna-HCl 25 mM pH 3, dodaje się EDTA 1 mM, β-merkaptoetanol 10 mM, Triton x-100 0,2% i NaCl 250 mM (bufor B). Całkowity przemiał jest bezpośrednio odwirowywany w 4°C podczas 15 min przy 10000 g. W przypadku ziaren tytoniu, ekstrakcję wykonuje się w buforze B przy ilości 0,1 g ziaren na 4 ml buforu.

Aktywność lipazowa jest oznaczana za pomocą pH-STAT metodą miareczkową (Gargouri et al., 1986), w której użytym substratem jest tributyryna. Emulsję trybutyryny (4 ml na 30 ml emulsji) wykonuje się wworteksie w obecności soli żółciowych (1,04 g/l) albuminy bydlęcej (0,1 g/l) i NaCl (9 g/l). Oznaczanie składa się ze zobojętniania kwasu masłowego uwolnionego w wyniku działania na lipazę roztworem sody przy zadanej wartości pH 5,5 i przy 37°C. Jednostka lipazy odpowiada ilości enzymu powodującej uwolnienie mikromola kwasu tłuszczowego w 1 min w 37°C i w warunkach optymalnego pH (5,5). Naturalna lipaza żołądkowa psa (oczyszczona) ma aktywność specyficzną 570 jednostek/mg proteiny. Aktywność lipazy można zmierzyć na całkowitym przemiale, na osadzie lub na roztworze sklarowanym po odwirowaniu.

W przypadku roztworu sklarowanego po odwirowaniu (bufor A), oznaczanie całości rozpuszczalnych protein jest wykonywana metodąBradforda (1976).

Test ELISA w sandwichu (Carriere et al., 1993) jest również wykonywany na roztworze sklarowanym po odwirowaniu z 2 populacjami przeciwciał monoklonalnych naturalnego an186 586 ty-LGC. Pierwsza populacja obejmuje przeciwciała reagujące z lipazą żołądkową ludzką i oczyszczone przez powinowactwo wychodząc z całości antysurowicy na lipazie żołądkowej ludzkiej szczepionej na kolumnie Affigel 10 (Aoubala et al., 1993). Te przeciwciała są wykorzystywane dla otworów płytek ELISA przy stężeniu 1 pg/ml. 2-ga populacja obejmuje przeciwciała, które nie znają lipazy ludzkiej. Są one później oczyszczane na kolumnie Sepharose sprzęgane z proteiną A, następnie sprzęgane z biotyną. Umocowanie przeciwciała jest wykazane za pośrednictwem koniugatu streptawidyna/peroksydaza, którego aktywność enzymatyczna jest ujawniona za pomocą substratu ofenylenodiaminy. Uzyskane wyniki mają wartość jakościową i są zaznaczone za pomocą symboli + i -.

Wydajność ekstrakcji można zwiększyć dodając do buforu ekstrakcyjnego detergent typu CHAPS (3-(3-cholamidopropylo)dimetylo-ammonio-l-propanosulfonian)(SIGMA). W istocie, w tym przypadku, wydajności reakcji w roztworze sklarowanym zwiększają się o około 100% (por. tabela 1)

Tabela 1

Aktywność lipazy (U/gPF) w ekstraktach uzyskanych wychodząc z 4 roślin tytoniu pochodzących z transformacji genetycznej z pBIOC25 w obecności CHAPS 1%.

Rośliny	NaCl 0,2 M/EDTA 1 mM pH3,0	NaCl 0, 2M/EDTA ImM pH 3,0 + CHAPS1%
1	80	112
2	40	104
3	43	109
4	54	92

b) Ekspresja przy użyciu roślinnych peptydów sygnałowych; oznaczanie na liściach i ziarnach tytoniu transformowanego pBIOC25 i pBIOC26; test ELISA.

Wyniki uzyskane w przypadku 98 roślin TO genotypu Xanthi (stadium 15 do 20 liści) podano w tabeli 2. Wszystkie oznaczenia wykonano na przemiałach liści lub ziaren przed odwirowywaniem. W przypadku każdego konstruktu, zmierzone aktywności dają dużą zmienność stosownie do transformantów. Około 20% roślin nie wykazuje żadnej aktywności lub aktywność zbyt słabą, by można było ją zauważyć. Średnie aktywności i aktywności maksymalne podano w tablicy 2.

Ilości całkowite protein są podobne w przypadku trzech konstruktów ze średnimi 7 i 8 mg/g PF w liściach i 34, 31 i 38 mg/g PF w ziarnach.

Średnia aktywność lipazy w liściach transformowanych konstruktem pBIOC26 wynosi 34 U/g PF bądź 0,8% ekspresji względem całości protein. W przypadku ziaren, średnia aktywność wynosi 36 U/g PF bądź 0,2%. Maksymalna aktywność uzyskana dla jednego z transformantów wynosi 146 U/g PF (liście; 2,5% ekspresji) i 148 U/g PF (ziarna; 0,7% ekspresji).

Aktywności enzymatyczne zanalizowane w przypadku roślin transformowanych konstruktem pBIOC25 są podobne. Średnia aktywność w liściach wynosi 34 U/g PF (0,8% ekspresji), a aktywność maksymalna wynosi 134 U/g PF (3% całości protein). W przypadku ziaren średnia aktywność wynosi 42 U/g PF (0,3%), a aktywność maksymalna 159 U/g PF (1%). W przypadku roślin transformowanych konstruktem pBIOC29, w liściach nie zauważono żadnej aktywności (promotor nasiono-specyficzny). W przypadku ziaren, średnia aktywność wynosi 12 U/g PF (0,1% ekspresji), a aktywność maksymalna 137 U/g PF (0,7%).

Ekspresja w liściach i ziarnach tego samego zdarzenia transformacji jest zasadniczo dobrze skorelowana.

186 586

Wyniki prób ELISA zgadzają się również z wynikami oznaczeń aktywności enzymatycznej, tzn. jeśli roślina wykazująca aktywność lipazy daje pozytywny wynik próby ELISA.

Wyniki uzyskane później na tych samych roślinach pokazuj że aktywność lipazowa jest zdatna na zmianę przebiegu rozwoju rośliny. W istocie roślina, której ekspresja względem całości protein wynosiła 3% w stadium 12-15 liści, wykazała ekspresję 6% podczas późniejszego oznaczenia (starsza roślina mająca kwiaty).

Tabela 2:

Ekspresja lipazy w liściach i ziarnach tytoniu Kanthi.

Konstrukt	Organ	Całość protein mg/g PF min-max (wartość średnia)	Aktywność lipazy
U/g PF min-max (wartość średnia)	Ekspresja (% całości protein) min-max (wartość średnia)
pBIOC26	Liście (n = 34)	3-15 (7)	0 - 145,6 (34,4)	0 - 2,5 (0,8)
	Ziarna (n = 34)	24 - 43 (34)	0 - 147,6 (36,3)	0 - 0,7 (0,2)
pBIOC25	Liście (n = 35)	3-18 (8)	0 - 133,5 (34)	0-3 (0,8)
	Ziarna (n = 35)	17-35 (31)	0 - 158,5 (41,9)	0-1 (0,3)
pBIOC29	Ziarna (n = 29)	29 - 55 (38)	0-137,4(11,8)	0-0,7 (0,1)

PF, ciężar świeży; min., najmniejsza wartość uzyskana dla zdarzenia transformacji; max., największa wartość uzyskana dla zdarzenia transformacji; n, liczba zdarzeń analizowanych transformacji.

c) Ekspresjazpeptydem jdpnałownmLGL; oznaczemaaktywnotcilipajy na liściach tytoniu.

Wyniki uzyskane dla 44 roślin TO genotypów Xanthi i pBD6 (stadium 15 do 20 liści) są następujące:

Wszystkie oznaczenia wykonano na przemiałach liści przed odwirowaniem. Zanalizowane aktywności wykazują znaczną zmienność stosownie do transformantów. Około 20% roślin nie wykazuje żadnej aktywności lub zbyt małą aktywność, by mogła być zauważona. Średnia aktywność lipazy w liściach transformowanych konstruktem pBIOC41 wynosi 38 U/g PF dla genotypu xanthi i 48 U/g PF dla genotypu PDB6. Aktywności maksymalne wynoszą odpowiednio 152 i 226 U/gPF.

IX. Analiza ekspresji lipazy żołądkowej psa w roślinach transgenicznych pomidora.

a) Protokół.

Protokół ekstrakcji lipazy wychodząc z liści i owoców pomidora jest podobny do opisanego dla liści tytoniu, oprócz tego, że 1 g świeżego materiału jest wprowadzany do 4 ml buforu B. Aktywność lipazy jest oznaczona jak opisano dla liści tytoniu.

b) Oznaczanie w liściach pomidora.

Poddano analizie owoce trzydziestki pierwotnych transformantów.

Oznaczona aktywność lipazy w liściach jest zmienna zależnie od owoców dla tego samego transformanta. Średnio wynosi 5 U/g PF dla owoców dojrzałych i 35 U/g PF dla owoców zielonych, niezależnie od badanego konstruktu (pBIOC25 lub pBIOC26). Należy odnotować, że w trakcie dojrzewania owocu, aktywność się zmniejsza. Np. W przypadku danego transformantu pierwotnego, aktywność lipazy wynosi 132 U/g PF dla owocu zielonego 0 średnicy 10 mm, 44 U/g PF dla owocu jzprwonoziplonego o średnicy 33 mm i 36 U/g PF dla owocu czerwonego o średnicy 45 mm.

X. Immunodetekcja typr Western rekombinacyjnego LGC.

a) LGC pksprpseonowtnp w liściach i ziarnach transgenicznych : tytoniu i rzepaku.

a.l) Ekspresja z roślinnymi peptydami sygnałowymi; immunodetekcja w liściach i ziarnach tytoniu i rzepaku transformowanych pBIOC25, pBIOC26 i pBIOC29.

Badania immunodetekcji typu western (westem-blots) (Renart i Spndovall, 1984) lipazy gastrycznej psa wykonano na proteinach liści tytoniu i ziaren tytoniu i rzepaku wyeks186 586 trahowanych buforami A i B (patrz protokół ekstrakcji powyżej). Aby wykonać te badania, wyekstrahowane proteiny (30 pg całości protein na próbkę) najpierw oddziela się na żelu poliakrylamidowym denaturującym (12,5%) według techniki Laemmli U. K. (1970), a następnie przenosi na membranę z nitrocelulozy. Otrzymane przeciwciało poliklonalne antylipazy psa świnki morskiej stosuje się jako sondę i wyłóycia dokonuje się za pomocą przeciwciała antiIgG (świnka morska) znaczonego fosfatazą alkaliczną.

Proteiną-próbką kontrolną jest lipaza żołądkowa psa naturalnego (LC, fig. 6), które migruje w formie pojedynczego pasma pozornego ciężaru cząsteczkowego około 50 kDa. Migracja lipazy żołądkowej psa jest lekko opóźniona w obecności ekstraktu nietransformowanych liści tytoniu (fig. 6, LC + T). Nie wykryto żadnego pasma w ekstraktach proteinowych liści i ziaren nietransformowanych: tytoniu i rzepaku. Wytworzona lipaza w liściach tytoniu uwidacznia się w formie 2 pasm.

Pasmo ważniejsze ilościowo ma pozorny ciężar cząsteczkowy około 37 kDa i odpowiada polipeptydowi (Δ54) uprzednio wspomnianemu. Mniejsze pasmo ma pozorny ciężar cząsteczkowy około 49 kDa i odpowiada polipeptydowi (Δ4) uprzednio wspomnianemu (fig. 6F). W ekstraktach proteinowych ziaren, jest widoczne jedynie pasmo mniejszego ciężaru cząsteczkowego (fig. 6, GT i GC).

a. 2) Ekspresja z peptydem sygnałowym lgl; immnodetjca w kiściach i ziarnach tytoniu transformowanego pezez pBIOC41;

Próby Western Biot (Renart i Sandoval, 1984) wykonano na proteinach liści i ziaren tytoniu wyekstrahowanych buforem B (patrz protokół ekstrakcji powyżej). Wyekstrahowane proteiny są najpierw oddzielane na żelu poliakrylamidowym danaturującym (SDS-PAGE) według techniki Laemmli (1970), a następnie przeniesione na membranę z nitrocelulozy. Otrzymane przeciwciało poliklonaine anty-lipazy psa u świnki morskiej wykorzystano jako sondę i wykrycie wykonano za pomocą przeciwciała anty-świnka morska znaczonego fosfatazą alkaliczną.

Przykład western biot liści tytoniu przedstawiono na fig. 7. Proteina- próbka kontrolna jest lipazą żołądkową psa, która migruje w formie pojedynczego pasma cząsteczkowego widocznego przy około 50 kDa. Nie wykryto żadnego pasma w ekstraktach proteinowych liści tytoniu nietransformowanego (T). Wytworzona lipaza w ekstraktach liści jest widoczna w formie głównego pasma pozornego ciężaru cząsteczkowego około 49 kDa i odpowiada wyżej wspomnianemu polipeptydowi (D4). W ziarnach tytoniu transformowanego konstruktem pBIOC41, lipaza rekombinacyjna jest widoczna w takiej samej formie jak w liściach.

b) LGC w ekstrakcie protein liści tytoniu transformowanego: badanie deglikozylacji.

Protokół ekstrakcji protein dla badań deglikozylacji jest następujący: 0,5 g liści (ciężar świeży) rozdrabnia się w ciekłym azocie, a następnie w 4°C w 1 ml buforu denaturującego (bufor fosforanowy 100 mM pH 7,5, dodaje się β-merkaptoetanol 1%, EDTA 25 mM i SDS 1%). Przemiał jest odwirowywany w 4°C podczas 15 min przy 10000 g. Roztwór sklarowany jest inkubowany podczas 5 min w 100°C wcelu wykonania denaturacji protein, a następnie odwirowywany 2 min przy 10000 g. Następnie roztwór sklarowany jest rozcieńczony 10-krotnie w buforze do deglikozylacji (bufor fosforanowy 100 mM pH 7,5, dodaje się β-merkaptoetanol 1%, EDTA 25 mM, SDS 0,1% i oktyloglukozyd 1%). Enzym (N-glikozydaza F, PNGase Boehringer) jest dodawany w ilości 1 U na 100 μΐ roztworu sklarowanego. Próbka kontrolna bez enzymu jest wykonywana dla każdej próbki. Deglikozylacja proteiny-próbki kontrolnej (lipaza żołądkowa psa lub królika) ma miejsce w tych samych warunkach. Różne próbki proteinowe są inkubowane w temperaturze otoczenia przez 8 h. Następnie proteiny są oddzielane przez elektroforezę na żelu poliakryloamidowym i przenoszone na membranę nitrocelulozową jak opisano w poprzednim paragrafie.

Według wyników techniki western biot, lipaza żołądkowa użyta jako próbka kontrolna ma pozorny ciężar cząsteczkowy około 50 kDa. Po deglikozylacj i, jego ciężar cząsteczkowy wyniósł tylko około 43 kDa.

Lipaza wytworzona w liściach tytoniu, po inkubacji bez PNGazy w warunkach opisanych powyżej uwidacznia się w formie 3 pasm o pozornych ciężarach cząsteczkowych 49 (polipeptyd (Δ4), 37 (polipeptyd Δ54) i 28 kDa. Pasmo o ciężarze cząsteczkowym 28 kDa jest

186 586 bez wątpienia wynikiem proteolizy mającej miejsce podczas inkubowania przez 8 h w temperaturze otoczenia. Po deglikozylacji, ciężary cząsteczkowe 3 pasm są mniejsze o około 1 do 2 kDa, co wykazuje, że proteiny wytworzone w liściach tytoniu są glikozylowane.

c) LGC ekspresjonowane w liściach i owocach pomidorów transgenicznych.

Badania immunodetekcji typu WESTERN lipazy żołądkowej psa wykonano na proteinach z liści i owoców pomidora wyekstrahowanych buforem B (patrz protokół ekstrakcji powyżej). W celu wykonania badań proteiny wyekstrahowane (15 gg i 6 gg całości protein rozpuszczalnych odpowiednio w przypadku liści i owoców) rozdzielono na żelu denaturującym poliakryloamidowym jak opisano w paragrafie X.a). Proteiną- próbką kontrolną jest naturalna lipaza żołądkowa (ścieżka 4, fig. 8), która migruje w formie pojedynczego pasma o pozornym ciężarze około 50 kDa.

Nie wykryto żadnego pasma w ekstraktach proteinowych liści i owoców pomidorów nie transformowanych.

Lipaza wytworzona w liściach i owocach pomidora występuje w formie dwóch pasm niezależnie od użytego konstruktu (pBIOC25 lub pBIOC26). Najważniejsze ilościowo pasmo ma pozorny ciężar około 37 kDa i odpowiada wyżej wspomnianemu polipeptydowi (Δ54). Mniejsze pasmo ma pozorny ciężar cząsteczkowy około 49 kDa i odpowiada wyżej wspomnianemu polipeptydowi (Δ4) (fig. 8).

XI. Oczyszczanie lipazy żołądkowej psa wychodząc z roślin, a) Oczyszczanie LGC wychodząc z liści tytoniu.

Aktywność wytworzonej lipazy żołądkowej psa w liściach tytoniu oznaczono metodą miareczkową pH ustalono na 5,5 oraz temperaturę 37°C za pomocą pH-statu (Mettler-Toledo-DL25) stosując jako substrat tributyrynę: 1 ml tributyryny emulgowano w 29 ml wodnego roztworu NaCl 0,15M w worteksie. Oznaczenie polega na zobojętnieniu uwolnionego kwasu masłowego pod działaniem lipazy przez dodanie sody 0,02N, podczas gdy emulsja jest utrzymywana przez intensywne mieszanie mechaniczne. Jednostka lipazy odpowiada 1 mikromolowi uwolnionego kwasu tłuszczowego na minutę w tych warunkach pH i temperatury.

Po pierwszym etapie chromatograficznym aktywność lipazy (przy pobraniu próbki 0,5 ml) jest wykazana w emulsji 1 ml tributyryny w 29 ml roztworu 0,15 M w NaCl, 2 mM Taurodeoxycholanu sodu i 1,5 μΜ albuminy surowicy bydlęcej zgodnie z oznaczeniem opisanym przez Gargouri et al. (1986).

Gram liofilizowanych liści rozdrobniono w 4°C w 30 ml buforu glicynowego 20 mM pH 2,5 i pozostawiono przy łagodnym mieszaniu przez 15 min. Podczas maceracji utrzymano pH 2,5 przez dodanie IN HCl. Produkt maceracji odwirowano przy 15000 g podczas 5 min. pH roztworu sklarowanego doprowadzono do 4 przez IN NaOH. Po sączeniu przez MIRACLOTH (Calbiochem) całość roztworu sklarowanego wprowadzono na kolumnę z kationowym wymieniaczem jonowym (żywica S-Sepharose Fast Flow-Pharmacia) 10 ml (średnica 1,6 cm) doprowadzoną do stanu równowagi w buforze octanu sodu 20mM pH 4,0, NaCl 20 mM przy przepływie 1 ml/min. Zbierano frakcje 2 ml. Po przepuszczeniu roztworu sklarowanego kolumnę przemyto 40 ml buforu równoważącego. Proteiny zatrzymane na kolumnie wymyto według poniższego protokołu:

- gradient liniowy buforu octanu sodu 20 mM pH 4,0 od 20 mM do 21O.mM NaCl w ciągu 30 min dla wymycia pierwszej grupy pików protein niewykazujacych aktywności lipazowej; próbę wykonano na próbkach 1 ml.

- plateau przy 210 mM NaCl w ciągu 20 min,

- gradient liniowy buforu octanu sodu 20 mM pH 4,0 od 210 mM do 500 mM NaCl w ciągu 30 min dla wymycia drugiej grupy pików. Aktywność lipazy zmierzoną dla próbek 0,5 ml wymyto podczas tego drugiego gradientu przy sile jonowej między 300 i 400 mM.

Frakcje aktywne zebrano, zatężono stosując komorę stężeniową OMEGACELL o granicy ciężaru cząsteczkowego 30 kDa (Filtron Technology Corporation).

Koncentrat dializowano przez 12 h wobec bufora Tris-HCl 10 mM pH 8 a następnie wprowadzono na kolumnę z wymieniaczem anionowym (MonoQ HR 5/5 o średnicy 0,5 cm i wysokości 5 cm-Pharmacia) doprowadzoną do równowagi przy użyciu bufora Tris-HCl 10 mM pH 8. Aktywność lipazy zmierzono pobierając próbkę 0,5 ml. Utrzymywano przepływ

186 586 ml/min, ciśnienie 2,0 Mpa. Po wymyciu frakcji niezatrzymanej i przemyciu kolumny 10 ml bufora Tris-HCl 10 mM pH 8, zastosowano gradient liniowy siły jonowej od 0 do 400 mM NaCl przez 60 min. Aktywność lipazy wymyto przy sile jonowej między 100 i 200 mM.

Frakcje aktywne zebrano, zatężono stosując komorę stężeniową. OMEGACELL o granicy ciężaru cząsteczkowego 30 kDa. Koncentrat stanowi oczyszczoną formę lipazy żołądkowej psa wyekstrahowanej z liści tytoniu.

Oznaczenie stężenia protein wykonano według metody M.Bradforda (1976) na zatężonych roztworach sklarowanych i według metody O.H. Lowry'ego dla roztworów po pierwszej chromatografii jonowymiennej.

Różne etapy oczyszczania analizowano przez elektroforezę na denaturującym żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE 12,5%) według techniki U.K. Laemmli (1970). Tak rozdzielone proteiny na żelu poliakryloamidowym są z jednej strony wywołane przez barwienie błękitem coomassie a z drugiej strony przeniesione na membranę nitrocelulozową techniką półsuchego elektrotransferu (Transbłot SD, BIORAD) w buforze Tris Base 20 mM, glicyna 150 mM i etanol 20% przy 2,3 mA na cm² membrany. Rekombinacyjną lipazę żołądkową psa przeniesioną na membranę nitrocelulozową wykrywa się przez immunodetekcję według następującego protokołu:

- znakowanie rozpatrywanej proteiny przez przeciwciało poliklonalne antylipazy żołądkowej psa otrzymane przez świnkę morską i rozcieńczone 1/5000-krotnie w buforze PBS z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka w proszku i Tween 20 0,1% podczas 1 h w temperaturze otoczenia,

- przemycie membrany 3 kolejnymi porcjami bufora PBS z dodatkiem 1% odtłuszczonego mleka w proszku i Tween 20 0,1 % w podczas 10 min dla każdej porcji,

- znakowanie przez przeciwciało anty-świnka morska sprzężone z peroksydazą (Sigma) irozcieńczone 1/2000-krotnie w buforze PBS z dodatkiem 1% odtłuszczonego mleka w proszku i Tween 20 0,1% podczas 1 h w temperaturze otoczenia,

- przemycie membrany 3 kolejnymi porcjami bufora PBS z dodatkiem 1% odtłuszczonego mleka w proszku i Tween 20 0,1% podczas 10 min dla każdej porcji,

- wywołanie przez działanie peroksydazy na 4-chloro-1-naftol (Sigma) w obecności HAJ by wytworzyć niebieskie zabarwienie trwałe w czasie.

Lipaza wytworzona w liściach występuje w formie dwóch pasm o około 49 (polipeptyd (Δ4)) kDa i 37 (polipeptyd (Δ54)) kDa.

b) WariWtocnyszczaniaLGC LGChodzączlićci tytoniu.

Aktywność lipazy żołądkowej psa wytworzonej w liściach tytoniu oznaczono metodami miareczkowymi opisanymi przez Gargouri et al. (1986) za pomocą pH-statu (METTLERTOLEDO DL25).

Oznaczanie trójglizerydów o krótkich łańcuchach wykonuje się stosując jako substrat tributyrynę: 1 ml tributyryny emulgowano w 29 ml roztworu wodnego Na C 1 0,15 M, albuminy krwi bydlęcej (BSA) 1,5 pM i tauroZeoxdzholanu sodu (NaTDC) 2 mM. Ustalono pH na 5,0, a temperaturę na 37°C.

Oznaczenie polega na zobojętnieniu uwolnionego kwasu masłowego pod działaniem lipazy przez dodanie sody 0,02N podczas gdy emulsja jest utrzymywana przez intensywne mieszanie mechaniczne.

Oznaczanie tiOjglicerydów' o długich łańcuchach wykonuje się stosując jako substrat emulsję wodną o 30% oleju soji oczyszczonej, 1,2% oczyszczonych fosfolipidów jaja, 1,67% bezwodnej gliceryny (Intralipid™ 30% - PHARMACIA AB Stockholm, Szwecja). Dziesięć ml tej zawiesiny emulgowano w 20 ml wodnego roztworu NaCl 0,15 M, BSA 30 pM i CaCf 3,5 pM. pH ustawiono na 4,0, temperaturę na 37°C.

Oznaczenie polega na zobojętnieniu kwasów tłuszczowych uwolnionych pod działaniem lipazy przez dodanie sody 0,2N po skoku wartości pH z 4 na 9, podczas gdy emulsja jest utrzymywana przez intensywne mieszanie mechaniczne. Jednostka lipazy odpowiada 1 mikromolowi uwolnionego kwasu tłuszczowego na minutę w określonych warunkach pH i temperatury dla każdego z substratów.

186 586

Dwa gramy liofilizowanych liści rozdrobniono w 4°C w 60 ml NaCl 0,2 M, pH 3 i po zostawiono przy łagodnym mieszamu ρινεζ 115 min w4^:(^. Podczas tej mioceracji utrzymano pH 3 przez dodanie 1 N HCl. Produkt maceracji (homogenizat) odwirowano przy 10 000 g podczas . 10 min. Po sączeniu przez MIRACLOtH (Calbiochem) i filtr MILLIPORE 0,45 pl, całość roztworu sklarowanego wstrzyknięto na kolumnę z kationowym wymieniaczem jonowym (RESOURCE S 6 ml -Pharmacia - 16 mm d.i. x 30 mm) doprowadzoną do stanu równowagi w buforze octanu sodu 20mM, NaCl 0,2 mM pH 3 przy przepływie 8 ml/min (240 cm h-1).

Po przepuszczeniu frakcji nie zatrzymanej, kolumnę przemyto jej 30-krotną objętością buforu równoważącego. Proteiny zatrzymane na kolumnie wymyto gradientem liniowym buforu octanu sodu 20 mM pH 3 od 0,2 M NaCl do 0,5 M NaCl (7 objętości kolumny). Zebrano frakcje 4 ml.

Aktywność lipazy zmierzoną w próbkach 0,5 wymyto przy sile jonowej 0,35 M NaCl.

Frakcje aktywne zebrano i zatężono stosując komorę stężeniową OMEGACELL o granicy ciężaru cząsteczkowego 30 kDa (Filtron Technology Corporation).

Oznaczenie stężenia protein wykonano według metody O.H. Lowry'ego (1951).

Przykład żelu poliakryloamidowego i wynik przeniesienia tego żelu na membranę nitrocelulozowy oraz wywołanie wychodząc z przeciwciała anty-lipazy żołądkowej psa wykazały (fig. 9 i 10). Wywołanie wykonano przez działanie peroksydazy na Luminol w obecności aktywatora (ECL western Blotting AMERSHAM LIFE SCIENCE) i ekspozycję filmu fotograficznego.

- Obecność reszt glikanowych w proteinie oznaczono według następującego protokołu:

- immobiłizowanie proteiny na membranie nitrocelulozowej

- działanie nadjodanem

- reakcja specyficzna ze streptawidyna sprzężoną z fosfatazą alkaliczną,

- reakcja barwna fosfatazy alkalicznej (Glycotrack-OXFORD GLYLOSYSTEM).

Przedstawiono przykład membrany detekcyjnej dla reszt glikanowych (fig. 11).

Czystość frakcji zapewniono przez wysokosprawną chromatografię cieczową.

Chromatograf WATERS 625 LC.

Detektor z układem diod WATER 991

Kolumna VYDAC C4

Warunki wymywania:

Czas (min)	Przepływ (ml/min)	% A	% B
0	1	100	0
35	1	40	60
40	1	40	60
45	1	20	80
50	1	100	0

Tp A : 89,9% H₂O 10% Acetonitryl, 0,1% kwas trifluorooctowy TpB: 100% acetonitryl.

Tabela oczyszczania: rekombinacyjny LGC

	Jednostki ogółem	mg protein	Aktywność właściwa	Współczynnik oczyszczania	Wydajność
Homogen izat	3200	/	/	/	/
Roztwór sklarowany	2800	230	13	1	88%
Wyjście Zasoby	1600	6	250	20	50%

*) Jednostki tributyryny.

186 586

Porównane aktywności właściwe naturalnej lipazy żołądkowej psa (n-LGC) i rekombinacyjnej lipazy żołądkowej psa (r-LGC)

	n-LGC*	r-LGC wyekstrahowane z liści tytoniu
Tributyryna	570 U/mg	250 U/mg
Intralipid 30%	1000 U/mg	950 U/mg

ods.: Carriere et al (1991) Eur. J. Bioche, 202, 75-83

c) Oczyszczanie LGC wychodząc z ziaren rzepaku

Aktywność rekombinacyjnego LGC wytworzonego w ziarnach rzepaku oznaczono w ten sam sposób jak w przypadku ekstrakcji wychodząc z liści.

Dziesięć gramów ziaren rzepaku rozdrobniono w ciekłym azocie. Otrzymaną mąkę odtłuszczono w heksanie przez pierwszą macerację w 4°C łagodnie przez 12 h. Całość zdekantowano, heksan usunięto. Mąkę płukano dwukrotnie 100 ml heksanu łagodnie mieszając w4°C w przypadku każdego płukania. Heksan usunięto przez dekantację. Mąkę osuszono w wyparce rotacyjnej (HEIDOLPH 94200). Odtłuszczoną mąkę przechowuje się w -20°C. Ekstrakcję LGC wykonuje się wychodząc z odtłuszczonej mąki przez macerację w 4°C w wodnym roztworze 0,2 M NaCl pH 3 (HCl IN) podczas 30 min przy porcjach 2 mlc roztworu wodnego na 0,1 g mąki, Wynik maceracji odwirowano przy 10 000 g podczas 10 min w 4°C.

Osad odrzucono. Osad sklarowany stanowił ekstrakt ziaren. Ekstrakt ziaren dializowano wobec buforu octanu sodu 10 mM pH 4, NaCl 140 mM, Kcl 3 mM, a następnie wprowadzono na kolumnę immunopowinowactwa utworzoną przez przeciwciała poliklonalne anty-lipazy żołądkowej psa otrzymane w śwince morskiej, sprzężonej z żywicą (hydrazide Avidgel BIOPROBE INTERNATIONAL, Inc.).

Kontakt żywica/ekstrakt ziaren trwał 30 min w 4°C przy łagodnym mieszaniu. Następnie żywicę opłukano (10 objętościami kolumny) buforem octanowym 10 mM, pH 4, NaCl 150 mM, Kcl 3 mM. LGC wymyto (5 objętościami kolumny) buforu glicyno wego 0,2 M, pH 2,8, NaCl 150 mM. Zebrane frakcje miały objętość równą 1 objętości kolumny i zawierały 1/20-tą V/V buforu Tris IM pH9. Analiza przez elektroforezę na żelu poliakryloamidowym w, środowisku denataurującym (por. fig. 12) wykazuje proteinę o ciężarze cząsteczkowym około 37 kDa.

XII. Synteza estrów kwasów tłuszczowych.

Próby wykonano dla ziaren rzepaku nietransformowanego, przy czym lipaza była wniesiona:

- w formie preparatu enzymatycznego immobilizowanego (lipozyra (NOVO)) lub wolnego (lipaza gastryczna królika (JO 4002)),

- bądź w formie ziaren tytoniu transformowanego genem lipazy żołądkowej psa (tytoń T14-44 0,85% ekspresji).

Reakcje estryfikacji przeprowadza się w 37°C przez 16 h w hermetycznie zamkniętych naczyniach szklanych umieszczonych na pulpicie do mieszania (250 obr/min). Użytym rozpuszczalnikiem organicznym jest heksan, w którym są rozpuszczalne kwasy tłuszczowe. Metanol jest dodawany w proporcji stechiometrycznej do teoretycznej ilości triacyloglicerolu zawartego w ziarnach rzepaku. Głównym składnikiem kwasów tłuszczowych rzepaku jest kwas oleinowy, także próbką kontrolną odniesienia jest wybrany ester metylowy kwasu oleinowego. Śledzenie syntezy odbywa się przez chromatografię cienkowarstwową (CCM). Rozpuszczalnik migracyjny jest mieszaniną heksanu eteru dietylowego i wody (70:10:1). Wywołanie płytek odbywa się na ciepło po rozpyleniu kwasu siarkowego (5%) w etanolu.

W pierwszej próbie, do 0,2 g oleju rzepakowego (0,22 mmole) dodaje się 27 μΐ metanolu (0,66 mmoli) i 0,02 g lipozymu; nie pojawił się żaden ślad na poziomie estru metylowego kwasu oleinowego jako odniesienia (fig. 13, kolumna 2). W drugiej próbie, olej rzepakowy zastępuje się przez 0,5 g rozdrobnionych na sucho ziaren rzepaku i dodaje się 1 ml heksanu; jest tu synteza estru metylowego (fig. 13, kolumna 5).

186 586

W następujących próbach, powyższe warunki zastosowano z następującymi modyfikacjami: ilość lipozymu zmniejszono do 0,006 g i lipozym zastąpiono przez lipazę żołądkową królika (0,007 g JO 4002). Zsyntetyzowanoester metylowy kwasu oleinowego w obecności lipozymu lecz nie w obecności JO 4002 (fig. 14, kolumna 2).

Na koniec, w ostatnich próbach, lipaza jest wnoszona przez ziarna transformowanego tytoniu (1 g ziaren tytoniu). Pojawiła się charakterystyczna plama estru metylowego (fig. 15, kolumna 3).

W konkluzji, opisane powyżej wyniki pokazują, że gdy w obecności ekstraktów ziaren rzepaku umieści się alkohol i rekombinacyjną lipazę żołądkową psa wytworzoną przez tytonie transgeniczne, uzyskuje się reakcję estryfikacji, która prowadzi do syntezy estru metylowego, który może być wykorzystany jako biopaliwo.

Opis figur:

- fig. 1: sekwencja nukleotydowa DNA kodująca LGC,

- fig. 2: sekwencja aminokwasowa LGC,

- fig. 3: sekwencja nukleotydowa wyprowadzona z DNA kodującego LGC i kodująca LGC przedstawiony na fig.2,

- fig. 4: sekwencja nukleotydowa DNA kodująca LGH i sekwencja aminokwasowa

LGH,

- fig. 5: sekwencja aminokwasowa LGH,

- fig. 6: immunodetekcja polipeptydów rekombinacyjnych wytworzonych przez liście i ziarna tytoniu Xanthi, i ziaren rzepaku przekształconych konstruktami pBIOC26, pBIOC25 ipBIOC29; E, rząd ciężaru cząsteczkowego;. LG: , lipaza żołądkowa psa: F, liście tytoniu i GT, ziarna tytoniu transformowane konstruktem pBIOC25; GC, ziarna rzepaku transformowane konstruktem pBIOC29; T, liście tytoniu nie transformowane,

- fig. 7: immunodetekcja polipeptydów rekombinacyjnych wytworzonych przez liście tytoniu przekształcone konstruktami pBIOC25 ipBIOC41; E, rząd ciężaru cząsteczkowego; LC: lipaza żołądkowa psa: 1 i 3, liście tytoniu transformowane konstruktem pBIOC41; 2, liście tytoniu transformowane konstruktem pBIOC25; T, liście tytoniu nie transformowane,

- fig. 8: immunodetekcja polipeptydów rekombinacyjnych wytworzonych przez liście i owoce pomidorów transformowanych konstruktami pBIOC25 i pBIOC26;

Tl: nie przekształcony owoc pomidor

1i 3: przekształcone owoce pomidora

2: przekształcony liść pomidora

E, rząd ciężaru cząsteczkowego

LC: lipaza żołądkowa psa

T2: nie przekształcony liść pomidora

- fig. 9: analiza przez elektroforezę na żelu poliakryloamidowym w środowisku denaturującym (SDS PAGE)

1: ekstrakt ziaren rzepaku,

2: rekombinacyjna lipaza żołądkowa psa wytworzona wychodząc z liści tytoniu

3: naturalna lipaza żołądkowa psa

4: rząd ciężaru cząsteczkowego

- fig. 10: wywołanie immunologiczne poprzedniej analizy po przeniesieniu na membranę nitrocelulozową.

1: naturalna lipaza żołądkowa psa

3: ekstrakt ziaren rzepaku,

- fig. 11: wywołanie obecności reszt glikanowych wychodząc z żelu poliakryloamidowego po przeniesieniu na membranę nitrocelulozową.

1: ekstrakt ziaren rzepaku,

3: naturalna lipaza żołądkowa psa

- fig. 12: analiza SDS-PAGE immunooczyszczania r-DGL wytworzonego w ziarnach rzepaku.

186 586

1: naturalna lipaza żołądkowa psa

2: rekombinacyjna lipaza żołądkowa psa do 6: frakcje nie zatrzymane wymywane z kolumny immunooczyszczania.

- fig. 13: wywołanie plamy CCM 1: olej rzepakowy, brak enzymu; 2: olej rzepakowy + lipozym; 3: ester metylowy kwasu oleinowego 4: ziarna rzepaku, brak enzymu; 5: ziarna rzepaku + lipozym,

- fig. 14: wywołanie plamy CCM: 1 i 4: ziarna rzepaku bez enzymu, 2: ziarna rzepaku + J04002; 3: ester metylowy kwasu oleinowego; 5: ziarna rzepaku + lipozym,

- fig. 15: wywołanie plamy CCM: 1: monooleina, dioleina, trioleina; 2: ester metylowy kwasu oleinowego; 3: ziarna rzepaku + ziarna tytoniu transformowane.

Odsyłacze bibliograficzne

An et al, Plant Physiol., 81, 301-305 (1986).

An G., Plant Physiol., 81, 86-91 (1986).

Aoubala M., Daniel C., De Caro A., Ivanova M.G., Him M., Sarda L. i Verger R., Eur. J. Biochem. 211, 99-104 (1993).

Barta et al., Plant Mol. Biol., 6, 347-357 (1986).

Bednarek S. Y. i Raikhel Ν. V., The Plant Cell, 3,1195-1206 (1991).

Berg D.E., Berg C.M., Biotechnology, 1, 417-435 (1983).

Bernard C., C.R. Acad. Sci., 28, 249-253 (1849).

Bevan et al., Nature, 304, 184-187 (1983).

Bevan M., Nucleic Acids. Res., 12, 8711-8721 (1984).

Bimboim H.C., Doly J., Nuci. Acids. Res., 7,1513-1523 (1979).

Bodmer M.W. et al., Biochem Biophys. Acta, 909, 237-244 (1987).

Bradford M., Anal Biochem., 72, 248 (1976).

Brodelius et al., FEBS Letters, 103, 93-97 (1979).

Brodelius, w: Moo-Young M. (Ed),

Bioreactor Immobilized Enzymes and Cells: Fundamentals and Applications, Elsevier, Londres (1988).

Carriere et al., Eur. J. Biochem., 202, 75-83 (1991).

Carriere F., Laugier R., Barrowman J.A., Douchet I.

Piymenko N. i Verger R., Scand. J. Gastroenterology, 28, 443-454 (1993).

Close J.J., Rodriguez R.L., Gene, 20, 305-316 (1982).

De La Penna et al., Nature, 325, 274-216 (1987).

Deno et al., J. Plant. Physiol., 131, 315-322 (1987).

Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet., 1, 561-573 (1982).

Depigny-This et al., Plant. Mol. Biol., 20,467-479 (1992).

De Zoeten et al., Virology, 172, 213-222 (1989).

Docherty A.J.P. et al., Nuci. Ac. Res., 13,1891-1903 (1985).

Edelbaum et al., J. of Interferon Research, 12, 449-453 (1992).

Franek et al. Cell, 21, 285-294 (1980).

Fillatti J.J., Kiser J., Rosę R. i Comai L., Biotechnologie, 5, 726-730 (1987).

Gamborg O.L., Miller R.A. i OjimaK., Exp. Cell. Res., 50, 151-158 (1968).

Gargouri Y., Pieroni G., Riviere C., Sauniere J-F., Lowe

P.A., Sarda L.i VergerR., Gastroenterology, 91, 919-925 (1986).

Gargouri Y. et al., Biochem. Biophys. Act., 1006, 255-271 (1989).

Gaubier et al., Mol. Gen. Genet., 238, 409-418 (1993).

Giller et al., J. Biol. Chem., 267, 16509-16516 (1992).

Guerineau F., Mullineaux P., Plant Molecular Biology LABFAK, Groy R.R.D. (Fd), Nios. Scientific Publishers, Blackwell Scientific Publications, 121-147 (1993).

Hanahan D., J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983).

Hein R., International Meeting of Production of Recombinant Proteins in 35 Plants, Leicester, p. 22 (1994).

Herrera-Estrella et al., Nature, 303, 209-213 (1983a).

Herrera-Estrella et al., EMBO J., 2, 987-995 (1983b).

186 586

Hiatt i Ma, FEBS, 307, 71-15 (1992).

Hiatt et al., Naturę, 342, 76-79 (1989).

Higo et al., Biosci. Biochem., 57,1477-1481 (1993).

Holsters et al., Mol. Gen. Genet., 163,181-187 (1978).

Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N. L., Eichholtz D. iRogers S.G., Science, 227, 1229-1231 (1985).

Jouanin et al., Plant Sci., 53, 53-63 (1981).

Kay et al., Science, 236, 1299-1302 (1987).

Laemmli U.K., Naturę, 227, 680-685 (1970).

Liu et al., Mol. Plant Microb. Interactions, 6,144-156 (1993).

Lowry O.H., J. Biol. Chem., 173, 265-275 (1951).

Ma et al., International Meeting of Production of Recombinant Proteins in Plants, Leicester, p. 39-40 (1994).

McElroy et al., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160 (1991).

Marc, Science, 216,1305-1307 (1982).

Mason et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,11745-11749 (1992).

Matsuoka K., Nakamura K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 834-838 (1991).

Moloney et al., International Meeting of Production of Recombinant Proteins in Plant,

Leicester, p. 36-38 (1994).

Moreau H. et al., Biochem. Biophys. Act., 960, 268-293 (1988).

Murakami et al., Plant Mol. Biol., 7, 343-355 (1986).

Murashige T. et Skoog F., Physiol. Plantarum, 15, 473-497 (1962).

Niet al., Plant J„ 7, 661-676 (1995).

Reina et al., Nucleic Acid Research, 18, 6426 (1990).

Renart J. i Sandoval I.V., Meth. Enzymol., 104, 455-460 (1984).

Russel D., International Meseting of Production of Recombinant Proteins in Plants, Leicester, p. 43 (1994).

Sambrook et al., Molecular Cloning Iaboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Sanford J.C., Trends in Biotechnology, 6, 299-302 (1988).

Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977).

Schroeder M. R., Borkhsenious O. N., Matsuoka K., Nakamura K. i Ralkhel Ν. V., Plant Physiol., 101, 451-458 (1993).

Shonheyder F., i Volquartz K., Acta Physiol. Scand., 9, 57-67 (1945).

Sijmons et al., Biotechnology, 8, 217-221 (1990).

Thomas B.R. i Pratt D., Theor. Appl. Genet., 59, 215-219 (1981).

Truve et al., Biotechnology, 11,1048-1052 (1993).

Vandekerckhove et al., Biotechnology, 7, 929-932 (1989).

Yolhard F., Z. Klin. Med:, 42, 414-429 (1901).

186 586

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA (1) SKŁADAJĄCY:

(A) NAZWA: BIOCEM S.A.

(B) ULICA: 24, avenue des Landais (C) VILLE: AUBIERE (E) KRAJ: FRANCJA (F) KOD POCZTOWY: 63170 (A) NAZWA: INSTITUT DE RECHERCHE JOUVEINAL (B) ULICA.: 3-9, rue de la Loge (C) MIASTO : FRESNES.

(E) KRAJ: FRANCE (F) KOD POCZTOWY: 94265 CEDEX (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: LIPAZY PREDUODENALNE REKOMBINACYJNE I POLIPEPTYDY POCHODNE WYTWORZONE PRZEZ .ROŚLINY, SPOSOBY ICH OTRZYMYWANIA I ICH ZASTOSOWANIA (iii) LICZBA SEKWENCJI: 6 (iv) FORMA CZYTELNA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPuTEk: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEME OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (vi) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER DEPOZYTU: FR 9504754 (B) DATA DEPOZYTU: 20-APR-1995 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1528 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA dla mRNA (ix) CHARAKTERYSTYKA DODATKOWA:

(A) . NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE: 1..1137 <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 1:

TTG

TTT

GGA

AAG

CTT

CAT

CCC

ACA

AAC

CCT

GAA

GTG

ACC

ATG

AAT

ATA

Leu 1

Phe

Gly

Lys

Leu 5

His

Pro

Thr

Asn

Pro 10

Glu

Val

Thr

Met

Asn 15

Ile

AGT

CAG

ATG

ATC

ACC

TAC

TGG

GGA

TAC

CCA

GCT

GAG

GAA

TAT

GAA

GTT

Ser

Gin

Met

Ile 20

Thr

Tyr

Trp

Gly

Tyr 25

Pro

Ala

Glu

Tyr 30

Glu

Val

GTG

ACC

GAA

GAC

GGT

TAT

ATC

CTT

GGG

ATC

GAC

AGA

ATT

CCT

TAT

GGG

Val

Thr

Glu 35

Asp

Gly

Tyr

Ile

Leu 40

Gly

Ile

Asp

Arg

Ile 45

Pro

Tyr

Gly

AGG

AAA

AAT

TCA

GAG

AAT

ATA

GGC

CGG

AGA

CCT

GTT

GCA

TTT

TTG

CAA

Arg

Lys 50

Asn

Ser

Glu

Asn

Ile 55

Gly

Arg

Pro

Val 60

Ala

Phe

Leu

Gln

144

192

186 586

CAC

GGT

TTG

CTC

GCA

TCA

GCC

ACA

AAC

TGG

ATC

TCC

AAC

CTG

CCC

AAC

240

His 65

Gly

Leu

Ala

Ser 70

Ala

Thr

Asn

Trp

Ile 75

Ser

Asn

Leu

Pro

Asn 80

AAC

AGC

CTG

GCC

TTC

ATC

CTG

GCC

GAC

GCC

GGG

TAC

GAC

GTG

TGG

CTG

288

Asn

Ser

Leu

Ala

Phe 85

Ile

Leu

Ala

Asp

Ala 90

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp 95

Leu

GGG

AAC

AGC

AGG

GGC

AAC

ACC

TGG

GCC

AGG

AAT

CTG

TAC

TCG

336

Gly

Asn

Ser

Arg 100

Gly

Asn

Thr

Trp

Ala 105

Arg

Asn

Leu

Tyr 110

Tyr

Ser

CCC

GAC

TCC

GTC

GAA

TTC

TGG

GCT

TTC

AGC

TTT

GAC

GAG

ATG

GCT

AAA

384

Pro

Asp

Ser 115

Val

Glu

Phe

Trp

Ala 120

Phe

Ser

Phe

Asp

Glu 125

Met

Ala

Lys

TAT

GAC

CTT

CCC

GCC

ACC

ATT

GAC

TTC

ATC

TTG

AAG

AAA

ACG

GGA

CAG

432

Tyr

Asp 130

Leu

Pro

Ala

Thr

Ile 135

Asp

Phe

Ile

Leu

Lys 140

Lys

Thr

Gly

Gin

GAC

AAG

CTA

CAC

TAC

GTT

GGC

CAT

TCC

CAG

GGC

ACC

ATT

GGT

TTC

480

Asp 145

Lys

Leu

His

Tyr

Val 150

Gly

His

Ser

Gln

Gly 155

Thr

Ile

Gly

Phe 160

ATC

GCC

TTT

TCC

ACC

AAT

CCC

AAG

CTG

GCG

AAA

CGG

ATC

AAA

ACC

TTC

528

Ile

Ala

Phe

Ser

Thr 165

Asn

Pro

Lys

Leu

Ala 170

Lys

Arg

Ile

Lys

Thr 175

Phe

TAT

GCA

TTA

GCT

CCC

GTT

GCC

ACC

GTG

AAG

TAC

ACC

GAA

ACC

CTG

TTA

576

Tyr

Ala

Leu

Ala 180

Pro

Val

Ala

Thr

Val 185

Lys

Tyr

Thr

Glu

Thr 190

Leu

AAC

AAA

CTC

ATG

CTC

GTC

CCT

TCG

TTC

CTC

TTC

AAG

CTT

ATA

TTT

GGA

624

Asn

Lys

Leu 195

Het

Leu

Val

Pro

Ser 200

Phe

Leu

Phe

Lys

Leu 205

Ile

Phe

Gly

AAC

AAA

ATA

TTC

TAC

CCA

CAC

TTC

TTT

GAT

CAA

TTT

CTC

GCC

ACC

572

Asn

Lys 210

Ile

Phe

Tyr

Pro

His 215

His

Phe

Asp

Gin 220

Phe

Leu

Ala

Thr

GAG

GTA

TGC

TCC

CGC

GAG

ACG

GTG

GAT

CTC

TGC

AGC

AAC

GCC

CTG

720

Glu 225

Val

Cys

Ser

Arg

Glu 230

Thr

Val

Asp

Leu

Leu 235

Cys

Ser

Asn

Ala

Leu 240

TTT

ATC

ATT

TGT

GGA

TTT

GAC

ACT

ATG

AAC

TTG

AAC

ATG

AGT

CGC

TTG

768

Phe

Ile

Cys

Gly 245

Phe

Asp

Thr

Met

Asn 250

Leu

Asn

Met

Ser

Arg 255

Leu

GAT

GTG

TAT

CTG

TCA

CAT

AAT

CCA

GCA

GGA

ACA

TCG

GTT

CAG

AAC

GTG

816

Asp

Val

Tyr

Leu 260

Ser

His

Asn

Pro

Ala 265

Gly

Thr

Ser

Val

Gin 270

Asn

Val

CTC

CAC

TGG

TCC

CAG

GCT

GTT

AAG

TCT

GGG

AAG

TTC

CAA

GCT

TTT

GAC

864

Leu

His

Trp 275

Ser

Gin

Ala

Val

Lys 280

Ser

Gly

Lys

Phe

Gin 285

Ala

Phe

Asp

TGG

GGA

AGC

CCA

GTT

CAG

AAC

ATG

CAC

TAT

CAT

CAG

AGC

ATG

CCT

912

Trp

Gly 290

Ser

Pro

Val

Gin

Asn 295

Met

His

Tyr

His 300

Gin

Ser

Met

Pro

CCC

TAC

AAC

CTG

ACA

GAC

ATG

CAT

GTG

CCA

ATC

GCA

GTG

TGG

AAC

960

Pro 305

Tyr

Asn

Leu

Thr 310

Asp

Met

His

Val

Pro 315

Ile

Ala

Val

Trp

Asn 320

GGT

GGC

AAC

GAC

TTG

CTG

GCC

GAC

CCT

CAC

GAT

GTT

GAC

CTT

TTG

CTT

1008

Gly

Asn

Asp

Leu 325

Leu

Ala

Asp

Pro

His 330

Asp

Val

Asp

Leu

Leu 335

Leu

TCC

AAG

CTC

CCC

AAT

CTC

ATT

TAC

CAC

AGG

AAG

ATT

CCT

TAC

AAT

1056

Ser

^Lys

Leu

Pro 340

Asn

Leu

Ile

Tyr

His 345

Arg

Lys

Ile

Pro

Pro 350

Tyr

Asn

CAC

TTG

GAC

TTT

ATC

TGG

GCC

ATG

GAT

GCC

CCT

CAA

GCG

GTT

TAC

AAT

1104

His

Leu

Asp 355

Phe

Ile

Trp

Ala

Met 360

Asp

Ala

Pro

Gin

Ala 365

Val

Tyr

Asn

GAA Glu

ATT Ile

GTT Val

TCCęATG Ser Met

ATG Met

GGA Gly

ACA Thr

GAT Asp

AAT Asn

AAG Lys

TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT

1157

186 586

370 TATTCTTTTA	TTGTTCCAAA	375 ATACGTTCTT	CTCTCACA.CG	TOGATraTCATr	TCATGTTTCC	11217
GACACGGTGA	TTGTTCCCAT	^TTTTG^TT	TCACAGAAAT		AΔAAAATAAT	11277
CATTGGTAAT	TTTTGAATTT	AAAATGATTT	TTTAATATTT	GGGATCCTGG	TGGCTCAGTT	1337
GGCTAAGTCG	TCTGCCTTGG	CTTAAGTCAT	GATCTCCCGGi	TCCTAGGAAG	GAGGCCTGTG	1397
TCTGGGCTCC	TGCCGGGGCG	GGGGTCTGCT	TCTCCTCCTG	CTCCTCCCCC	TACCTTCCTT	1457
GTGCACACAC	GCTCTCTCTC	TCTCAAATAA	ATATA^TATA^AA	AAATACTTTA	TTAAATTAAA	1517
AAAAAAAAAA	A					1528

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 379 aminokwasów (B) TYPE: aminokwasowa (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 2:

Leu 1

Phe

Gly

Lys

Leu 5

His

Pro

Thr

Asn

Pro 10

Glu

Val

Thr

Met

Asn 15

Ile

Ser

Gin

Met

Ile 20

Thr

Tyr

Trp

Gly

Tyr 25

Pro

Ala

Glu

Tyr 30

Glu

Val

Thr

Glu 35

Asp

Gly

Tyr

Ile

Leu 40

Gly

Ile

Asp

Arg

Ile 45

Pro

Tyr

Gly

Arg

Lys 50

Asn

Ser

Glu

Asn

Ile 55

Gly

Arg

Pro

Val 60

Ala

Phe

Leu

Gin

His 65

Gly

Leu

Ala

Ser 70

Ala

Thr

Asn

Trp

Ile 75

Ser

Asn

Leu

Pro

Asn 80

Asn

Ser

Leu

Ala

Phe 85

Ile

Leu

Ala

Asp

Ala 90

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp Leu 95

Gly

Asn

Ser

Arg 100

Gly

Asn

Thr

Trp

Ala 105

Arg

Asn

Leu

Tyr 110

Tyr

Ser

Pro

Asp

Ser 115

Val

Glu

Phe

Trp

Ala 120

Phe

Ser

Phe

Asp

Glu 125

Met

Ala

Lys

Tyr

Asp 130

Leu

Pro

Ala

Thr

Ile 135

Asp

Phe

Ile

Leu

Lys 140

Lys

Thr

Gly

Gin

Asp 145

Lys

Leu

His

Tyr

Val 150

Gly

His

Ser

Gln

Gly 155

Thr

Ile

Gly

Phe 160

Ile

Ala

Phe

Ser

Thr 165

Asn

Pro

Lys

Leu

Ala 170

Lys

Arg

Ile

Lys

Thr 175

Phe

Tyr

Ala

Leu

Ala 180

Pro

Val

Ala

Thr

Val 185

Lys

Tyr

Thr

Glu

Thr 190

Leu

Asn

Lys

Leu 195

Met

Leu

Val

Pro

Ser 200

Phe

Leu

Phe

Lys

Leu 205

Ile

Phe

Gly

Asn

Lys 210

Ile

Phe

Tyr

Pro

His 215

His

Phe

Asp

Gin 220

Phe

Leu

Ala

Thr

Glu 225

Val

Cys

Ser

Arg

Glu 230

Thr

Val

Asp

Leu

Leu 235

Cys

Ser

Asn

Ala

Leu 240

Phe

Ile

Cys

Gly 245

Phe

Asp

Thr

Met

Asn 250

Leu

Asn

Met

Ser

Arg 255

Leu

Asp

Val

Tyr

Leu

Ser

His

Asn

Pro

Ala

Gly

Thr

Ser

Val

Gin

Asn

Val

186 586

Leu

His

Trp

260 Ser

Gin

Ala

Val

Lys

265 Ser

Gly

Lys

Phe

Gln

270 Ala

Phe Asp

Trp

Gly

275 Ser

Pro

Val

Gin

Asn

280 Met

Met

His

Tyr

His

285 Gin

Ser

Met

Pro

290 Tyr

Tyr

Asn

Leu

Thr

295 Asp

Met

His

Val

Pro

300 Ile

Ala

Val

Trp

Asn

305 Gly

Gly

Asn

Asp

Leu

310 Leu

Ala

Asp

Pro

His

315 Asp

Val

Asp

Leu

320 Leu

Ser

Lys

Leu

Pro

325 Asn

Leu

Ile

Tyr

His

330 Arg

Lys

Ile

Pro

335 Tyr

Asn

His

Leu

Asp

340 Phe

Ile

Trp

Ala

Met

345 Asp

Ala

Pro

Gin

Ala

350 Val

Tyr

Asn

Glu

Ile 370

355 Val

Ser

Met

Gly 375

360 Thr

Asp

Asn

Lys

365

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1048 par zasad (B) TYPE: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: podwójna (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) <ix) CHARAKTERYSTYKA DODATKOWA :

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE: 1..975 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 3:

ATA GGC CGG AGA CCT GTT GCA TTT TTG CAA CAC GGT TTG CTC GCA TCA 48

Ile Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gin His Gly Leu Leu Ala Ser

10 15

GCC ACA AAC TGG ATC TCC AAC CTG CCC AAC AAC AGC CTG GCC TTC ATC 96

Ala Thr Asn Trp Ile Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Phe Ile

25 30

CTG GCC GAC GCC GGG TAC GAC GTG TGG CTG GGG AAC AGC AGG GGC AAC 144

Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Val Trp Leu Gly Asn Ser Arg Gly Asn

40 45

ACC TGG GCC AGG AGG AAT CTG TAC TAC TCG CCC GAC TCC GTC GAA TTC 192

Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Asp Ser Val Glu Phe

55 60

TGG GCT TTC AGC TTT GAC GAG ATG GCT AAA TAT GAC CTT CCC GCC ACC 240

Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro Ala Thr

70 75 80

ATT GAC TTC ATC TTG AAG AAA ACG GGA CAG GAC AAG CTA CAC TAC GTT 288

Ile Asp Phe Ile Leu Lys Lys Thr Gly Gin Asp Lys Leu His Tyr Val

90 95

GGC CAT TCC CAG GGC ACC ACC ATT GGT TTC ATC GCC TTT TCC ACC AAT 336

Gly His Ser Gin Gly Thr Thr Ile Gly Phe Ile Ala Phe Ser Thr Asn

100 105 110 CCC AAG CTG GCG AAA CGG ATC AAA ACC TTC TAT GCA TTA GCT CCC GTT 384

Pro Lys Leu Ala Lys Arg Ile Lys Thr Phe Tyr Ala Leu Ala Pro Val

115 120 125

GCC ACC GTG AAG TAC ACC GAA ACC CTG TTA AAC AAA CTC ATG CTC GTC 432

Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met Leu Val

130 135 140

186 586

CCT

TCG

TTC

CTC

TTC

AAG

CTT

ATA

TTT

GGA

AAC

AAA

ATA

TTC

TAC

CCA

480

Pro 145

Ser

Phe

Leu

Phe

Lys 150

Leu

Ile

Phe

Gly

Asn 155

Lys

Ile

Phe

Tyr

Pro 160

CAC

TTC

TTT

GAT

CAA

TTT

CTC

GCC

ACC

GAG

GTA

TGC

TCC

CGC

GAG

528

His

Phe

Asp 165

Gln

Phe

Leu

Ala

Thr 170

Glu

Val

Cys

Ser

Arg 175

Glu

ACG

GTG

GAT

CTC

TGC

AGC

AAC

GCC

CTG

T1T

ATC

ATT

TGT

GGA

TTT

576

Thr

Val

Asp

Leu 180

Leu

Cys

Ser

Asn

Ala 185

Leu

Phe

Ile

Cys 190

Gly

Phe

GAC

ACT

ATG

AAC

TTG

AAC

ATG

AGT

CGC

TTG

GAT

GTG

TAT

CTG

TCA

CAT

624

Asp

Thr

Met 195

Asn

Leu

Asn

Met

Ser 200

Arg

Leu

Asp

Val

Tyr 205

Leu

Ser

His

AAT

CCA

GCA

GGA

ACA

TCG

GTT

CAG

AAC

GTG

CTC

CAC

TGG

TCC

CAG

GCT

672

Asn

Pro 210

Ala

Gly

Thr

Ser

Val 215

Gln

Asn

Val

Leu

His 220

Trp

Ser

Gln

Ala

GTT

AAG

TCT

GGG

AAG

TTC

CAA

GCT

TTT

GAC

TGG

GGA

AGC

CCA

GTT

CAG

720

Val 225

Lys

Ser

Gly

Lys

Phe 230

Gln

Ala

Phe

Asp

Trp 235

Gly

Ser

Pro

Val

Gln 240

AAC

ATG

CAC

TAT

CAT

CAG

AGC

ATG

CCT

CCC

TAC

AAC

CTG

ACA

768

Asn

Met

His

Tyr 245

His

Gln

Ser

Met

Pro 250

Pro

Tyr

Asn

Leu 255

Thr

GAC

ATG

CAT

GTG

CCA

ATC

GCA

GTG

TGG

AAC

GGT

GGC

AAC

GAC

TTG

CTG

816

Asp

Met

His

Val 260

Pro

Ile

Ala

Val

Trp 265

Asn

Gly Gly

Asn

Asp 270

Leu

GCC

GAC

CCT

CAC

GAT

GTT

GAC

CTT

TTG

CTT

TCC

AAG

CTC

CCC

AAT

CTC

864

Ala

Asp

Pro 275

His

Asp

Val

Asp

Leu 280

Leu

Ser

Lys

Leu 285

Pro

Asn

Leu

ATT

TAC

CAC

AGG

AAG

ATT

CCT

TAC

AAT

CAC

TTG

GAC

TTT

ATC

TGG

912

Ile

Tyr 290

His

Arg

Lys

Ile

Pro 295

Pro

Tyr

Asn

His

Leu 300

Asp

Phe

Ile

Trp

GCC

ATG

GAT

GCC

CCT

CAA

GCG

GTT

TAC

AAT

GAA

ATT

GTT

TCC

ATG

960

Ala 305

Met

Asp

Ala

Pro

Gln 310

Ala

Val

Tyr

Asn

Glu 315

Ile

Val

Ser

Met

Met 320

GGA ACA GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT TATTCTTTTA TTGTTCCAAA 1015

Gly Thr Asp Asn Lys

325

ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCA 1048 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 325 aminokwasów (Β) ΤΥΡΕ: aminokwasowa (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 4:

Ile 1

Gly Arg Arg

Pro 5

Val

Ala Phe Leu Gln His Gly Leu Leu Ala Ser

10

15

Ala

Thr

Asn

Trp

Ile

Ser

Asn

Leu

Pro

Asn

Ser

Leu

Ala

Phe

Ile

20

25

30

Leu

Ala

Asp

Ala

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp

Leu

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

Asn

35

40

45

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Leu

Tyr

Ser

Pro

Asp

Ser

Val

Glu

Phe

50

55

60

Trp

Ala

Phe

Ser

Phe

Asp

Glu

Met

Ala

Lys

Tyr

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

65

70

75

80

Ile

Asp

Phe

Ile

Leu

Lys

Thr

Gly

Gln

Asp

Lys

Leu

His

Tyr

Val

85

90

95

186 586

Gly

His

Ser

Gin 100

Gly

Thr

Ile

Gly 105

Phe

Ile

Ala

Phe

Ser 110

Thr

Asn

Pro

Lys

Leu 115

Ala

Lys

Arg

Ile

Lys 120

Thr

Phe

Tyr

Ala

Leu 125

Ala

Pro

Val

Ala

Thr 130

Val

Lys

Tyr

Thr

Glu 135

Thr

Leu

Asn

Lys 140

Leu

Met

Leu

Val

Pro 145

Ser

Phe

Leu

Phe

Lys 150

Leu

Ile

Phe

Gly

Asn 155

Lys

Ile

Phe

Tyr

Pro 160

His

Phe

Asp 165

Gin

Phe

Leu

Ala

Thr 170

Glu

Val

Cys

Ser

Arg 175

Glu

Thr

Val

Asp

Leu 180

Leu

Cys

Ser

Asn

Ala 185

Leu

Phe

Ile

Cys 190

Gly

Phe

Asp

Thr

Met 195

Asn

Leu

Asn

Met

Ser 200

Arg

Leu

Asp

Val

Tyr 205

Leu

Ser

His

Asn

Pro 210

Ala

Gly

Thr

Ser

Val 215

Gin

Asn

Val

Leu

His 220

Trp

Ser

Gin

Ala

Val 225

Lys

Ser

Gly

Lys

Phe 230

Gin

Ala

Phe

Asp

Trp 235

Gly

Ser

Pro

Val

Gin 240

Asn

Met

His

Tyr 245

His

Gin

Ser

Met

Pro 250

Pro

Tyr

Asn

Leu 255

Thr

Asp

Met

His

Val 260

Pro

Ile

Ala

Val

Trp 265

Asn

Gly

Asn

Asp 270

Leu

Ala

Asp

Pro 275

His

Asp

Val

Asp

Leu 280

Leu

Ser

Lys

Leu 285

Pro

Asn

Leu

Ile

Tyr

His

Arg

Lys

Ile

Pro

Tyr

Asn

His

Leu

Asp

Phe

Ile

Trp

290 295 300

Ala Met Asp Ala Pro Gln Ala Val ljrr Asn Glu Ile Val Ser Met Met 305 310 315 320

Gly Thr Asp Asn Lys

325 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 5 (I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1198 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: podwójna (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CHARAKTERYSTYKA DODATKOWA (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE: 1..1125 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 5:

CTT

CAT

CCC

ACA

AAC

CCT

GAA

GTG

ACC

ATG

AAT

ATA

AGT

CAG

ATG

ATC

48

Leu 1

His

Pro

Thr

Asn 5

Pro

Glu

Val

Thr

Met 10

Asn

Ile

Ser

Gin

Met 15

Ile

ACC

TAC

TGG

GGA

TAC

CCA

GCT

GAG

GAA

TAT

GAA

GTT

GTG

ACC

GAA

GAC

96

Thr

Tyr

Trp

Gly 20

Tyr

Pro

Ala

Glu

Glu 25

Tyr

Glu

Val

Thr 30

Glu

Asp

GGT

TAT

ATC

CTT

GGG

ATC

GAC

AGA

ATT

CCT

TAT

GGG

AGG

AAA

AAT

TCA

144

Gly

Tyr

Ile 35

Leu

Gly

Ile

Asp

Arg 40

Ile

Pro

Tyr

Gly Arg 45

Lys

Asn

Ser

GAG

AAT

ATA

GGC

CGG

AGA

CCT

GTT

GCA

TTT

TTG

CAA

CAC

GGT

TTG

CTC

192

Glu

Asn 50

Ile

Gly

Arg

Pro 55

Val

Ala

Phe

Leu

Gin 60

His

Gly

Leu

186 586

GCA

TCA

GCC

ACA

AAC

TGG

ATC

TCC

AAC

CTG

CCC

AAC

AGC

CTG

GCC

240

Ala 65

Ser

Ala

Thr

Asn

Trp 70

Ile

Ser

Asn

Leu

Pro 75

Asn

Ser

Leu

Ala 80

TTC

ATC

CTG

GCC

GAC

GCC

GGG

TAC

GAC

GTG

TGG

CTG

GGG

AAC

AGC

AGG

288

Phe

Ile

Leu

Ala

Asp 85

Ala

Gly

Tyr

Asp

Val 90

Trp

Leu

Gly

Asn

Ser 95

Arg

GGC

AAC

ACC

TGG

GCC

AGG

AAT

CTG

TAC

TCG

CCC

GAC

TCC

GTC

336

Gly

Asn

Thr

Trp 100

Ala

Arg

Asn

Leu 105

Tyr

Ser

Pro

Asp 110

Ser

Val

GAA

TTC

TGG

GCT

TTC

AGC

TTT

GAC

GAG

ATG

GCT

AAA

TAT

GAC

CTT

CCC

384

Glu

Phe

Trp 115

Ala

Phe

Ser

Phe

Asp 120

Glu

Met

Ala

Lys

Tyr 125

Asp

Leu

Pro

GCC

ACC

ATT

GAC

TTC

ATC

TTG

AAG

AAA

ACG

GGA

CAG

GAC

AAG

CTA

CAC

432

Ala

Thr 130

Ile

Asp

Phe

Ile

Leu 135

Lys

Thr

Gly

Gln 140

Asp

Lys

Leu

His

TAC

GTT

GGC

CAT

TCC

CAG

GGC

ACC

ATT

GGT

TTC

ATC

GCC

TTT

TCC

480

Tyr 145

Val

Gly

His

Ser

Gln 150

Gly

Thr

Ile

Gly 155

Phe

Ile

Ala

Phe

Ser 160

ACC

AAT

CCC

AAG

CTG

GCG

AAA

CGG

ATC

AAA

ACC

TTC

TAT

GCA

TTA

GCT

528

Thr

Asn

Pro

Lys

Leu 165

Ala

Lys

Arg

Ile

Lys 170

Thr

Phe

Tyr

Ala

Leu 175

Ala

CCC

GTT

GCC

ACC

GTG

AAG

TAC

ACC

GAA

ACC

CTG

TTA

AAC

AAA

CTC

ATG

576

Pro

Val

Ala

Thr 180

Val

Lys

Tyr

Thr

Glu 185

Thr

Leu

Asn

Lys 190

Leu

Met

CTC

GTC

CCT

TCG

TTC

CTC

TTC

AAG

CTT

ATA

TTT

GGA

AAC

AAA

ATA

TTC

624

Leu

Val

Pro 195

Ser

Phe

Leu

Phe

Lys 200

Leu

Ile

Phe

Gly

Asn 205

Lys

Ile

Phe

TAC

CCA

CAC

TTC

TTT

GAT

CAA

TTT

CTC

GCC

ACC

GAG

GTA

TGC

TCC

672

Tyr

Pro 210

His

Phe

Asp 215

Gln

Phe

Leu

Ala

Thr 220

Glu

Val

Cys

Ser

CGC

GAG

ACG

GTG

GAT

CTC

TGC

AGC

AAC

GCC

CTG

TTT

ATC

ATT

TGT

720

Arg 225

Glu

Thr

Val

Asp

Leu 230

Leu

Cys

Ser

Asn

Ala 235

Leu

Phe

Ile

Cys 240

GGA

TTT

GAC

ACT

ATG

AAC

TTG

AAC

ATG

AGT

CGC

TTG

GAT

GTG

TAT

CTG

768

Gly

Phe

Asp

Thr

Met 245

Asn

Leu

Asn

Met

Ser 250

Arg

Leu

Asp

Val

Tyr 255

Leu

TCA

CAT

AAT

CCA

GCA

GGA

ACA

TCG

GTT

CAG

AAC

GTG

CTC

CAC

TGG

TCC

816

Ser

His

Asn

Pro 260

Ala

Gly

Thr

Ser

Val 265

Gln

Asn

Val

Leu

His 270

Trp

Ser

CAG

GCT

GTT

AAG

TCT

GGG

AAG

TTC

CAA

GCT

TTT

GAC

TGG

GGA

AGC

CCA

864

Gln

Ala

Val 275

Lys

Ser

Gly

Lys

Phe 280

Gln

Ala

Phe

Asp

Trp 285

Gly

Ser

Pro

GTT

CAG

AAC

ATG

CAC

TAT

CAT

CAG

AGC

ATG

CCT

CCC

TAC

AAC

912

Val

Gln 290

Asn

Met

His

Tyr 295

His

Gln

Ser

Met

Pro 300

Pro

Tyr

Asn

CTG

ACA

GAC

ATG

CAT

GTG

CCA

ATC

GCA

GTG

TGG

AAC

GGT

GGC

AAC

GAC

960

Leu 305

Thr

Asp

Met

His

Val 310

Pro

Ile

Ala

Val

Trp 315

Asn

Gly

Asn

Asp 320

TTG

CTG

GCC

GAC

CCT

CAC

GAT

GTT

GAC

CTT

TTG

CTT

TCC

AAG

CTC

CCC

1008

Leu

Ala

Asp

Pro 325

His

Asp

Val

Asp

Leu 330

Leu

Ser

Lys

Leu 335

Pro

AAT

CTC

ATT

TAC

CAC

AGG

AAG

ATT

CCT

TAC

AAT

CAC

TTG

GAC

TTT

1056

Asn

Leu

Ile

Tyr 340

His

Arg

Lys

Ile

Pro 345

Pro

Tyr

Asn

His

Leu 350

Asp

Phe

ATC

TGG

GCC

ATG

GAT

GCC

CCT

CAA

GCG

GTT

TAC

AAT

GAA

ATT

GTT

TCC

1104

Ile

Trp

Ala

Met

Asp

Ala

Pro

Gln

Ala

Val

Tyr

Asn

Glu

Ile

Val

Ser

355 360 365

1155

ATG ATG GGA ACA GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT TATTCTTTTA Met Met Gly Thr Asp Asn Lys

186 586

370 375

TTGTTCCAAA ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCA (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 6 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 375 aminokwasów (B) TYR: aminokwasowa (D) KONFIGURACJA: liniowa

1198 (li) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 6:

Leu 1

His

Pro

Thr

Asn 5

Pro

Glu

Val

Thr

Met 10

Asn

Ile

Ser

Gin

Met 15

Ile

Thr

Tyr

Trp

Gly 20

Tyr

Pro

Ala

Glu

Glu 25

Tyr

Glu

Val

Thr 30

Glu

Asp

Gly

Tyr

Ile 35

Leu

Gly

Ile

Asp

Arg 40

Ile

Pro

Tyr

Gly

Arg 45

Lys

Asn

Ser

Glu

Asn 50

Ile

Gly

Arg

Pro 55

Val

Ala

Phe

Leu

Gin 60

His

Gly

Leu

Ala 65

Ser

Ala

Thr

Asn

Trp 70

Ile

Ser

Asn

Leu

Pro 75

Asn

Ser

Leu

Ala 80

Phe

Ile

Leu

Ala

Asp 85

Ala

Gly

Tyr

Asp

Val 90

Trp

Leu

Gly

Asn

Ser 95

Arg

Gly

Asn

Thr

Trp 100

Ala

Arg Arg

Asn

Leu 105

Tyr

Ser

Pro

Asp 110

Ser

Val

Glu

Phe

Trp 115

Ala

Phe

Ser

Phe

Asp 120

Glu

Met

Ala

Lys

Tyr 125

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr 130

Ile

Asp

Phe

Ile

Leu 135

Lys

Thr

Gly

Gin 140

Asp

Lys

Leu

His

Tyr 145

Val

Gly

His

Ser

Gin 150

Gly

Thr

Ile

Gly 155

Phe

Ile

Ala

Phe

Ser 160

Thr

Asn

Pro

Lys

Leu 165

Ala

Lys

Arg

Ile

Lys 170

Thr

Phe

Tyr

Ala

Leu 175

Ala

Pro

Val

Ala

Thr 180

Val

Lys

Tyr

Thr

Glu 185

Thr

Leu

Asn

Lys 190

Leu

Met

Leu

Val

Pro 195

Ser

Phe

Leu

Phe

Lys 200

Leu

Ile

Phe

Gly

Asn 205

Lys

Ile

Phe

Tyr

Pro 210 '

His

Phe

Asp 215

Gin

Phe

Leu

Ala

Thr 220

Glu

Val

Cys

Ser

Arg 225

Glu

Thr

Val

Asp

Leu 230

Leu

Cys

Ser

Asn

Ala 235

Leu

Phe

Ile

Cys 240

Gly

Phe

Asp

Thr

Met 245

Asn

Leu

Asn

Met

Ser 250

Arg

Leu

Asp

Val

Tyr 255

Leu

Ser

His

Asn

Pro 260

Ala

Gly

Thr

Ser

Val 265

Gin

Asn

Val

Leu

His 270

Trp

Ser

Gin

Ala

Val 275

Lys

Ser

Gly

Lys

Phe 280

Gin

Ala

Phe

Asp

Trp 285

Gly

Ser

Pro

Val

Gln 290

Asn

Met

His

Tyr 295

His

Gln

Ser

Met

Pro 300

Pro

Tyr

Asn

Leu 305

Thr

Asp

Met

His

Val 310

Pro

Ile

Ala

Val

Trp 315

Asn

Gly

Asn

Asp 320

Leu

Ala

Asp

Pro 325

His

Asp

Val

Asp

Leu 330

Leu

Ser

Lys

Leu 335

Pro

Asn

Leu

Ile

Tyr 340

His

Arg

Lys

Ile

Pro 345

Pro

Tyr

Asn

His

Leu 350

Asp

Phe

Ile Met

Trp Met 370

Ala 355 Gly

Met Thr

Asp Asp

Ala Asn

Pro Lys 375

Gin 360

Ala

Val

Tyr

Asn

Glu 365

Ile

Val

Ser

186 586

TTGTTTGGAA	AATTACATCC	CACAAACCCT	GAAGTGACCA	TGAATATAAG	TCAGATGATC	60
ACCTACTGGG	GATACCCAGC	TGAGGAATAT	GAAGTTGTGA	CCGAAGACGG	TTATATCCTT	120
GGGATCGACA	GAATTCCTTA	TGGGAGGAAA	AATTCAGAGA	ATATAGGCCG	GAGACCTGTT	180
GCATTTTTGC	AACACGGTTT	GCTCGCATCA	GCCACAAACT	GGATCTCCAA	CCTGCCCAAC	240
AACAGCCTGG	CCTTCATCCT	GGCCGACGCC	GGGTACGACG	TGTGGCTGGG	GAACAGCAGG	300
GGCAACACCT	GGGCCAGGAG	GAATCTGTAC	TACTCGCCCG	ACTCCGTCGA	ATTCTGGGCT	360
TTCAGCTTTG	ACGAGATGGC	TAAATATGAC	CTTCCCGCCA	CCATTGACTT	CATCTTGAAG	420
AAAACGGGAC	AGGACAAGCT	ACACTACGTT	GGCCATTCCC	AGGGCACCAC	CATTGGTTTC	480
ATCGCCTTTT	CCACCAATCC	CAAGCTGGCG	AAACGGATCA	AAACCTTCTA	TGCATTAGCT	540
CCCGTTGCCA	CCGTGAAGTA	CACCGAAACC	CTGTTAAACA	AACTCATGCT	CGTCCCTTCG	600
TTCCTCTTCA	AGCTTATATT	TGGAAACAAA	ATATTCTACC	CACACCACTT	CTTTGATCAA	660
TTTCTCGCCA	CCGAGGTATG	CTCCCGCGAG	ACGGTGGATC	TCCTCTGCAG	CAACGCCCTG	720
TTTATCATTT	GTGGATTTGA	CACTATGAAC	TTGAACATGA	GTCGCTTGGA	TGTGTATCTG	780
TCACATAATC	CAGCAGGAAC	ATCGGTTCAG	AACGTGCTCC	ACTGGTCCCA	GGCTGTTAAG	840
TCTGGGAAGT	TCCAAGCTTT	TGACTGGGGA	. AGCCCAGTTC	AGAACATGAT	GCACTATCAT	900
CAGAGCATGC	CTCCCTACTA	CAACCTGACA	. GACATGCATG	TGCCAATCGC	AGTGTGGAAC	960

GGTGGCAACG ACTTGCTGGC CGACCCTCAC GATGTTGACC TTTTGCTTTC CAAGCTCCCC 1020

AATCTCATTT ACCACAGGAA GATTCCTCCT TACAATCACT TGGACTTTAT CTGGGCCATG 1080

GATGCCCCTC AAGCGGTTTA CAATGAAATT GTTTCCATGA TGGGAACAGA TAATAAGTAG 1140

TTCTAGATTT AAGGAATTAT TCTTTTATTG TTCCAAAATA CGTTCTTCTC TCACACGTGG 1200

TTTTCTATCA TGTTTGAGAC ACGGTGATTG TTCCCATGGT TTTGATTTCA GAAATGTGTT 1260

AGCATCAACA ATCTTTCCAT TGGTAATTTT TGAATTTAAA ATGATTTTTA AATTTGGGGC 1320

ATCTGGGTGG CTCAGTTGGC TAAGTCGTCT GCCTTGGCTT AAGTCATGAT CTCGGGGTCC 1380

TAGGATGGAG CCTTGTGTCT GGGCTCCTGC CGGGGCGGGG GTCTGCTTCT CCTCCTGCTG 1440

CTCCCCCCTG CTGCTGTGTG CACACACGCT CTCTCTCTCT CAAATAAATA AATAAATAAA 1500

TACTTAATAA AATAAAAAAA AAAAAAAA 1528

Fig· 1

186 586

Leu 1

Phe

Gly

Lys

Leu 5

His

Pro

Thr

Asn

Pro 10

Glu

Val

Thr

Met

Asn 15

Ile

Ser

Gln

Met

Ile

Thr

Tyr

Trp

Gly

Tyr

Pro

Ala

Glu

Tyr

Glu

Val

20

25

30

Val

Thr

Glu

Asp

Gly

Tyr

Ile

Leu

Gly

Ile

Asp

Arg

Ile

Pro

Tyr

Gly

35

40

45

Arg

Lys

Asn

Ser

Glu

Asn

Ile

Gly

Arg

Pro

Val

Ala

Phe

Leu

Gln

50

55

60

His

Gly

Leu

Ala

Ser

Ala

Thr

Asn

Trp

Ile

Ser

Asn

Leu

Pro

Asn

65

70

75

80

Asn

Ser

Leu

Ala

Phe

Ile

Leu

Ala

Asp

Ala

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp

Leu

85

90

95

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

Asn

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Leu

Tyr

Ser

100

105

110

Pro

Asp

Ser

Val

Glu

Phe

Trp

Ala

Phe

Ser

Phe

Asp

Glu

Met

Ala

Lys

115

120

125

Tyr

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

Ile

Asp

Phe

Ile

Leu

Lys

Thr

Gly

Gln

130

135

140

Asp

Lys

Leu

His

Tyr

Val

Gly

His

Ser

Gln

Gly

Thr

Ile

Gly

Phe

145

150

155

160

Ile

. Ala

Phe

Ser

Thr

Asn

Pro

Lys

Leu

Ala

Lys

Arg

Ile

Lys

Thr

Phe

165

170

175

Tyr

Ala

Leu

Ala

Pro

Val

Ala

Thr

Val

Lys

Tyr

Thr

Glu

Thr

Leu

180

185

190

Asn

Lys

Leu

Met

Leu

Val

Pro

Ser

Phe

Leu

Phe

Lys

Leu

Ile

Phe

Gly

195

200

205

Asn

Lys

Ile

Phe

Tyr

Pro

His

Phe

Asp

Gln

Phe

Leu

Ala

Thr

210

215

220

Glu

Val

Cys

Ser

Arg

Glu

Thr

Val

Asp

Leu

Cys

Ser

Asn

Ala

Leu

225

230

235

240

Phe

Ile

Cys

Gly 245

Phe

Asp Thr

Met Asn 250

Leu

Asn

Met

Ser

Arg 255

Leu

Asp

Val

Tyr

Leu

Ser

His

Asn Pro

Ala Gly

Thr

Ser

Val

Gln

Asn

Val

260

265

270

Leu

His

Trp

Ser

Gln

Ala

Val Lys

Ser Gly

Lys

Phe

Gln

Ala

Phe

Asp

275

280

285

Trp

Gly

Ser

Pro

Val

Gln

Asn Met

Met His

Tyr

His

Gln

Ser

Met

Pro

290

295

300

Pro

Tyr

Asn

Leu

Thr

Asp Met

His Val

Pro

Ile

Ala

Val

Trp

Asn

305

310

315

320

Gly

Asn

Asp

Leu

Ala Asp

Pro His

Asp

Val

Asp

Leu

325

330

335

Ser

Lys

Leu

Pro

Asn

Leu

Ile Tyr

His Arg

Lys

Ile

Pro

Tyr

Asn

340

345

350

His

Leu

Asp

Phe

Ile

Trp

Ala Met

Asp Ala

Pro

Gln

Ala

Val

Tyr

Asn

355

360

365

Glu

Ile

Val

Ser

Met

Gly Thr

Asp Asn

Lys

370

375

Fig. 2

186 586

TTGTTTGGAA	AGCTTCATCC	CACAAACCCT	GAAGTGACCA	TGAATATAAG	TCAGATGATC	60
ACCTACTGGG	GATACCCAGC	TGAGGAATAT	GAAGTTGTGA	CCGAAGACGG	TTATATCCTT	120
GGGATCGACA	GAATTCCTTA	TGGGAGGAAA	AATTCAGAGA	ATATAGGCCG	GAGACCTGTT	180
GCATTTTTGC	AACACGGTTT	GCTCGCATCA	GCCACAAACT	GGATCTCCAA	CCTGCCCAAC	240
AACAGCCTGG	CCTTCATCCT	GGCCGACGCC	GGGTACGACG	TGTGGCTGGG	GAACAGCAGG	300
GGCAACACCT	GGGCCAGGAG	GAATCTGTAC	TACTCGCCCG	ACTCCGTCGA	ATTCTGGGCT	360
TTCAGCTTTG	ACGAGATGGC	TAAATATGAC	CTTCCCGCCA	CCATTGACTT	CATCTTGAAG	420
AAAACGGGAC	AGGACAAGCT	ACACTACGTT	GGCCATTCCC	AGGGCACCAC	CATTGGTTTC	480
ATCGCCTTTT	CCACCAATCC	CAAGCTGGCG	AAACGGATCA	AAACCTTCTA	TGCATTAGCT	140
CCCGTTGCCA	CCGTGAAGTA	CACCGAAACC	CTGTTAAACA	AACTCATGCT	CGTCCCTTCG	500
TTCCTCTTCA	AGCTTATATT	TGGAAACAAA	ATATTCTACC	CACACCACTT	CTTTGATCAA	560
TTTCTCGCCA	CCGAGGTATG	CTCCCGCGAG	ACGGTGGATC	TCCTCTGCAG	CAACGCCCTG	720
TTTATCATTT	GTGGATTTGA	CACTATGAAC	TTGAACATGA	GTCGCTTGGA	TGTGTATCTG	780
TCACATAATC	CAGCAGGAAC	ATCGGTTCAG	AACGTGCTCC	ACTGGTCCCA	GGCTGTTAAG	4 0
TCTGGGAAGT	TCCAAGCTTT	TGACTGGGGA	AGCCCAGTTC	AGAACATGAT	GCACTATCAT	SOG
CAGAGCATGC	CTCCCTACTA	CAACCTGACA	GACATGCATG	TGCCAATCGC	AGTGTGGAAC	960

GGTGGCAACG ACTTGCTGGC CGACCCTCAC GATGTTGACC TTTTGCTTTC CAAGCTCCCC 1020

AATCTCATTT ACCACAGGAA GATTCCTCCT TACAATCACT TGGACTTTAT CTGGGCCATG J.C8C

GATGCCCCTC AAGCGGTTTA CAATGAAATT GTTTCCATGA TGGGAACAGA TAATAAGTAG 1140

TTCTAGATTT AAGGAATTAT TCTTTTATTG TTCCAAAATA CGTTCTTCTC TCACACGTGG 120C

TTTTCTATCA TGTTTGAGAC ACGGTGATTG TTCCCATGGT TTTGATTTCA GAAATGTGTT 1260

AGCATCAACA ATCTTTCCAT TGGTAATTTT TGAATTTAAA ATGATTTTTA AATTTGGGGC 1320

ATCTGGGTGG CTCAGTTGGC TAAGTCGTCT GCCTTGGCTT AAGTCATGAT CTCGGGGTCC 138C

TAGGATGGAG CCTTGTGTCT GGGCTCCTGC CGGGGCGGGG GTCTGCTTCT CCTCCTGCTG 144 C

CTCCCCCCTG CTGCTGTGTG CACACACGCT CTCTCTCTCT CAAATAAATA AATAAATAAA 150C

TACTTAATAA AATAAAAAAA AAAAAAAA 3528

Fig. 3

186 586

AGAGAAACAG AATCCTAACT ATTTCTGAGG AAACTGCAGG TCCAAA ATG TGG CTG 55

CTT

TTA

ACA

ATG

GCA

AGT

TTG

ATA

TCT

GTA

CTG

GGG

ACT

ACA

CAT

GGT

103

TTG

TTT

GGA

AAA

TTA

CAT

CCT

GGA

AGC

CCT

GAA

GTG

ACT

ATG

AAC

ATT

151

AGT

CAG

ATG

ATT

ACT

TAT

TGG

GGA

TAC

CCA

AAT

GAA

TAT

GAA

GTT

199

GTG

ACT

GAA

GAT

GGT

TAT

ATT

CTT

GAA

GTC

AAT

AGA

ATT

CCT

TAT

GGG

247

AAG

AAA

AAT

TCA

GGG

AAT

ACA

GGC

CAG

AGA

CCT

GTT

GTG

TTT

TTG

CAG

295

CAT

GGT

TTG

CTT

GCA

TCA

GCC

ACA

AAC

TGG

ATT

TCC

AAC

CTG

CCG

AAC

343

AAC

AGC

CTT

GCC

TTC

ATT

CTG

GCA

GAT

GCT

GGT

TAT

GAT

GTG

TGG

CTG

391

GGC

AAC

AGC

AGA

GGA

AAC

ACC

TGG

GCC

AGA

AAC

TTG

TAC

TAT

TCA

439

CCA

GAT

TCA

GTT

GAA

TTC

TGG

GCT

TTC

AGC

TTT

GAT

GAA

ATG

GCT

AAA

487

TAT

GAC

CTT

CCA

GCC

ACA

ATC

GAC

TTC

ATT

GTA

AAG

AAA

ACT

GGA

CAG

535

AAG

CAG

CTA

CAC

TAT

GTT

GGC

CAT

TCC

CAG

GGC

ACC

ATT

GGT

TTT

583

ATT

GCC

TTT

TCC

ACC

AAT

CCC

AGC

CTG

GCT

AAA

AGA

ATC

AAA

ACC

TTC

631

TAT

GCT

CTA

GCT

CCT

GTT

GCC

ACT

GTG

AAG

TAT

ACA

AAA

AGC

CTT

ATA

679

AAC

AAA

CTT

AGA

TTT

GTT

CCT

CAA

TCC

CTC

TTC

AAG

TTT

ATA

TTT

GGT

727

GAC

AAA

ATA

TTC

TAC

CCA

CAC

AAC

TTC

TTT

GAT

CAA

TTT

CTT

GCT

ACT

775

GAA

GTG

TGC

TCC

CGT

GAG

ATG

CTG

AAT

CTC

CTT

TGC

AGC

AAT

GCC

TTA

823

TTT

ATA

ATT

TGT

GGA

TTT

GAC

AGT

AAG

AAC

TTT

AAC

ACG

AGT

CGC

TTG

871

GAT

GTG

TAT

CTA

TCA

CAT

AAT

CCA

GCA

GGA

ACT

TCT

GTT

CAA

AAC

ATG

919

TTC

CAT

TGG

ACC

CAG

GCT

GTT

AAG

TCT

GGG

AAA

TTC

CAA

GCT

TAT

GAC

967

TGG

GGA

AGC

CCA

GTT

CAG

AAT

AGG

ATG

CAC

TAT

GAT

CAG

TCC

CAA

CCT

1015

CCC

TAC

AAT

GTG

ACA

GCC

ATG

AAT

GTA

CCA

ATT

GCA

GTG

TGG

AAC

1063

GGT

GGC

AAG

GAC

CTG

TTG

GCT

GAC

CCC

CAA

GAT

GTT

GGC

CTT

TTG

CTT

1111

CCA

AAA

CTC

CCC

AAT

CTT

ATT

TAC

CAC

AAG

GAG

ATT

CCT

TTT

TAC

AAT

1159

CAC

TTG

GAC

TTT

ATC

TGG

GCA

ATG

GAT

GCC

CCT

CAA

GAA

GTT

TAC

AAT

1207

GAC

ATT

GTT

TCT

ATG

ATA

TCA

GAA

GAT

AAA

AAG

TAGTTCTGGA

TTTAAAGAAT

1260

TATCCGTTTG TTTTTCCAAA ATACTTTATT CTCTCATACA TAGTATTTTC ATAATGTTTG 1320

ACATGCAGTG CTTCTTTCTG TAATTTTGAC TTTAGAAATA TATTGGC 1367 fig. 4

186 586

Met 1

Trp

Leu

Leu Thr Met Ala Ser Leu Ile Ser Val Leu Gly Thr

5

10

15

Thr

His

Gly

Leu

Phe

Gly

Lys

Leu

His

Pro

Gly

Ser

Pro

Glu

Val

Thr

20

25

30

Met

Asn

Ile

Ser

Gln

Met

Ile

Thr

Tyr

Trp

Gly

Tyr

Pro

Asn

Glu

35

40

45

Tyr

Glu

Val

Thr

Glu

Asp

Gly

Tyr

Ile

Leu

Glu

Val

Asn

Arg

Ile

50

55

60

Pro

Tyr

Gly

Lys

Asn

Ser

Gly

Asn

Thr

Gly

Gln

Arg

Pro

Val

65

70

75

80

Phe

Leu

Gln

His

Gly

Leu

Ala

Ser

Ala

Thr

Asn

Trp

Ile

Ser

Asn

85

90

95

Leu

Pro

Asn

Ser

Leu

Ala

Phe

Ile

Leu

Ala

Asp

Ala

Gly

Tyr

Asp

100

105

110

Val

Trp

Leu

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

Asn

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Leu

115

120

125

Tyr

Ser

Pro

Asp

Ser

Val

Glu

Phe

Trp

Ala

Phe

Ser

Phe

Asp

Glu

130

135

140

Met

Ala

Lys

Tyr

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

Ile

Asp

Phe

Ile

Val

Lys

145

150

155

160

Thr

Gly

Gln

Lys

Gln

Leu

His

Tyr

Val

Gly

His

Ser

Gln

Gly

Thr

165

170

175

Ile

Gly

Phe

Ile

Ala

Phe

Ser

Thr

Asn

Pro

Ser

Leu

Ala

Lys

Arg

Ile

180

185

190

Lys

Thr

Phe

Tyr

Ala

Leu

Ala

Pro

Val

Ala

Thr

Val

Lys

Tyr

Thr

Lys

195

200

205

Ser

Leu

Ile

Asn

Lys

Leu

Arg

Phe

Val

Pro

Gln

Ser

Leu

Phe

Lys

Phe

210

215

220

Ile

Phe

Gly

Asp

Lys

Ile

Phe

Tyr

Pro

His

Asn

Phe

Asp

Gln

Phe

225

230

235

240

Leu

Ala

Thr

Glu

Val

Cys

Ser

Arg

Glu

Met

Leu

Asn

Leu

Cys

Ser

245

250

255

Asn

Ala

Leu

Phe

Ile

Cys

Gly

Phe

Asp

Ser

Lys

Asn

Phe

Asn

Thr

260

265

270

Ser

Arg

Leu

Asp

Val

Tyr

Leu

Ser

His

Asn

Pro

Ala

Gly

Thr

Ser

Val

275

280

285

Gln

Asn

Met

Phe

His

Trp

Thr

Gln

Ala

Val

Lys

Ser

Gly

Lys

Phe

Gln

290

295

300

Ala

Tyr

Asp

Trp

Gly

Ser

Pro

Val

Gln

Asn

Arg

Met

His

Tyr

Asp

Gln

305

310

315

320

Ser

Gln

Pro

Tyr

Asn

Val

Thr

Ala

Met

Asn

Val

Pro

Ile

Ala

325

330

335

Val

Trp

Asn

Gly

Lys

Asp

Leu

Ala

Asp

Pro

Gln

Asp

Val

Gly

340

345

350

Leu

Pro

Lys

Leu

Pro

Asn

Leu

Ile

Tyr

His

Lys

Glu

Ile

Pro

355

360

365

Phe

Tyr

Asn

His

Leu

Asp

Phe

Ile

Trp

Ala

Met

Asp

Ala

Pro

Gln

Glu

370

375

380

Val

Tyr

Asn

Asp

Ile

Val

Ser

Met

Ile

Ser

Glu

Asp

Lys

385 390 395

Fig, 5

186 586

Fig · 6

186 586

2 3 LC Ε Τ

Fig. 7

Tl 1 2 E LC T2 3

Fig. 8

186 586

3 4

Fig. 9

3

Fig,

186 586

2 3

Fig. n

2 3 4 5 6

Fig. 12

186 586

Fig. 13

186 586

Fig. 14

186 586

Fig. 15

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa, znamienna tym, że zawiera cDNA kodujący lipazę preduodenalną zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych.
2. Rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.
3. Rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.
4. Rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.
5. Rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.
6. Rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1, znamienna tym, że jest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

186 586

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEAl-PSLGL-LGC zawierającej wkierunku 5' -» 3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pGEAó Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej wkierunku 5' -> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
7. Rekombinacyjna sekwencja nukleotydową według zastrz. 1, znamienna tym, że jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej wkierunku 5' —» 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
8. Wektor, zwłaszcza plazmid, znamienny tym, że zawiera rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową,

186 586 ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych.
9. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną, korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.
10. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.
11. Wektor według zastrz. 8 albo 9, albo 10, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.
12. Wektor według zastrz. 8 albo 9, albo 10, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.
13. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5’ —» 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEAl-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe

186 586 aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pGEA6 Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
14. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydowąprzedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
15. Gospodarz komórkowy, zwłaszcza bakteria, w szczególności Agrobacterium tumefaciens, transformowana wektorem zawierającym rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą cDNA kodujący lipazę preduodenalną zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, przy czym korzystnie wektor ten jest plazmidem.
16. Gospodarz komórkowy według zastrz. 15, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną

186 586
17. Gospodarz komórkowy według zastrz. 15, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.
18. Gospodarz komórkowy według zastrz. 15 albo 16, albo 17, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor . konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.
19. Gospodarz komórkowy według zastrz. 15 albo 16, albo 17, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.
20. Gospodarz komórkowy według zastrz. 15, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMv,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' —— 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą. bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową. przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35s CaMV,

- sekwencji pGEA1-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pGEA1 Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pGEA6 Arabidopsis thaliana., sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

186 586

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
21. Gospodarz komórkowy według zastrz. 15, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydowąprzedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' —» 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
22. Zastosowanie rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, do transformacji komórek roślinnych w celu otrzymania aktywnego enzymu rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej.
23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną, korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.
24. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.
25. Zastosowanie według z zastrz. 22 albo 23, albo 24, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, łub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.

186 586
26. Zastosowanie według zastrz. 22 albo 23, albo 24, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.
27. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowąjest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą, bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA1-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pGEA1 Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5'-— 3' promotor pGEA6 Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego lGl składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —- 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą, bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej w kierunku 5' -- 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMY.

186 586
28. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
29. Sposób otrzymywania aktywnego enzymu rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej, znamienny tym, że obejmuje:

- transformację komórek roślinnych, zwłaszcza za pomocą gospodarza komórkowego, zwłaszcza bakterii, w szczególności Agrobacterium tumefaciens, transformowanego wektorem zawierającym rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą cDNA kodujący lipazę preduodenalną zwłaszcza żołądkową ssaków lub jej pochodną wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, w taki sposób, aby włączyć w genom tych komórek tą rekombinacyjną sekwencję nukleotydową

- ewentualnie uzyskiwanie z transformowanych komórek roślinnych roślin transgenicznych,

- odzyskiwanie enzymu rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej i/lub jej pochodnych wytworzonych w transformowanych komórkach lub roślinach transgenicznych, zwłaszcza przez ekstrakcję, i ewentualnie dalsze oczyszczanie.
30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że stosuje się rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.
31. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że stosuje się rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną
32. Sposób według zastrz. 29 albo 30, albo 31, znamienny tym, że stosuje się rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.
33. Sposób według zastrz. 29 albo 30, albo 31, znamienny tym, że stosuje się rekombinacyjną sekwencję nukleotydową zawierającą sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.

186 586
34. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że stosuje się rekombinacyjną sekwencję nukleotydową wybraną spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' —» 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35 S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —» 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEAl-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pGEAó Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5’ —> 3’ promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
35. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że stosuje się rekombinacyjną sekwencję nukleotydową wybraną spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośred186 586 nio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej wkierunku 5' —> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
36. Modyfikowany materiał roślinny, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidora, marchewki, pszenicy, jęczmienia, ziemniaków, soi, słonecznika, sałaty, ryżu, lucerny, buraka, lub części tych roślin.
37. Modyfikowany materiał roślinny według zastrz. 36, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydową zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną, korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.
38. Modyfikowany materiał roślinny według zastrz. 36, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydową zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.
39. Modyfikowany materiał roślinny według zastrz. 36 albo 37, albo 38, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydową zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.
40. Modyfikowany materiał roślinny według zastrz. 36 albo 37, albo 38, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydową zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.
41. Modyfikowany materiał roślinny według zastrz. 36, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydową jest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej wkierunku 5’ —> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej wkierunku 5' -» 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

186 586

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą, się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą, prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -^ 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEAl-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pGEA1 Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pGEA6 Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5'-— 3' promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej w kierunku 5' —>3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
42. Modyfikowany materiał roślinny według zastrz. 36, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej w kierunku 5' — 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się

186 586 z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
43. LGC rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 2, lub jego pochodna, korzystnie polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2.
44. LGH rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 5, lub jego pochodna, korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5.
45. Ekstrakt roślinny o aktywności enzymatycznej, znamienny tym, że zawiera LGC rekombinacyjny i/lub jego pochodną, zwłaszcza polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2; i/lub zawiera LGH rekombinacyjny i/lub jego pochodną, korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5.
46. Ekstrakt roślinny według zastrz. 45, znamienny tym, że procent wagowy polipeptydów rekombinacyjnych aktywnych enzymatycznie stanowi około 0,1% do 20%, zwłaszcza około 1% do około 15%, całkowitego ciężaru białek obecnych w ekstrakcie, co odpowiada aktywności enzymatycznej od około 0,5 U do około 1000 U na g wagi świeżych liści, zwłaszcza około 10 U/g PF do około 300 U/g PF liści, lub też od około 1 do około 5000 U/g PF ziaren, zwłaszcza od około 10 do około 1000 U/g PF ziarna.
47. Zastosowanie modyfikowanego materiału roślinnego zawierającego co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidora, marchewki, pszenicy, jęczmienia, ziemniaków, soi, słonecznika, sałaty, ryżu, lucerny, buraka, lub części tych roślin, lub produktów z niego izolowanych do otrzymywania środków leczniczych przeznaczonych do ułatwienia absorpcji tłuszczów zwierzęcych lub roślinnych przyjmowanych przez osobnika zdrowego lub dotkniętego przez jedną lub więcej patologii wpływających lub nie na poziom wytwarzania lipazy żołądkowej i/lub trzustkowej, zwłaszcza u osobników poddawanych działaniu medycznemu zmieniającemu mechanizm absorpcji tłuszczów, lub ponadto u osób starszych, zwłaszcza dla otrzymywania środków leczniczych przeznaczonych do leczenia patologii związanych z niedoborem lipazy (zwłaszcza lipazy (lipaz) żołądkowych i/lub trzustkowych) w organizmie, a zwłaszcza patologii takich jak mukowiscydozą i zewnątrzwydzielnicza niewydolność trzustki.
48. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną, korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.
49. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydową zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną przy czym sekwen14

186 586 cja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.
50. Zastosowanie według zastrz. 47 albo 48, albo 49, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA łub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.
51. Zastosowanie według zastrz. 47 albo 48, albo 49, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.
52. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5’ —> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEAl-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pGEA6 Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5’ —> 3’ promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierw186 586 szych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
53. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
54. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera LGC rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 2, lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2; i/lub LGH rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 5, lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5; i/lub jeden lub więcej ekstraktów enzymatycznych zawierających LGC rekombinacyjny i/lub jego pochodną zwłaszcza polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2; i/lub LGH rekombinacyjny i/lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5, korzystnie w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.
55. Kompozycja według zastrz. 54, znamienna tym, że procent wagowy polipeptydów rekombinacyjnych aktywnych enzymatycznie stanowi około 0,1% do 20%, zwłaszcza około 1% do około 15%, całkowitego ciężaru białek obecnych w ekstrakcie, co odpowiada aktywności enzymatycznej od około 0,5 U do około 1000 U na g wagi świeżych liści, zwłaszcza około 10 U/g PF do około 300 U/g PF liści, lub też od około 1 do około 5000 U/g PF ziaren, zwłaszcza od około 10 do około 1000 U/g PF ziarna.
56. Zastosowanie modyfikowanego materiału roślinnego zawierającego co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną zwłaszcza żołądkową ssaków lub jej pochodną wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator

186 586 transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidora, marchewki, pszenicy, jęczmienia, ziemniaków, soji, słonecznika, sałaty, ryżu, lucerny, buraka, lub części tych roślin, lub produktów z niego izolowanych do otrzymywania środków spożywczych przeznaczonych do odżywiania ludzi lub zwierząt, zwłaszcza funkcjonalnych środków spożywczych, zwłaszcza przeznaczonych do ułatwienia absorpcji tłuszczów zwierzęcych lub roślinnych przyjmowanych przez osobnika zdrowego lub dotkniętego jedną lub więcej patologii wpływających lub nie na poziom wytwarzania lipazy żołądkowej i/lub trzustkowej.
57. Zastosowanie według zastrz. 56, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną, korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.
58. Zastosowanie według zastrz. 56, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.
59. Zastosowanie według zastrz. 56 albo 57, albo 58, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-LAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.
60. Zastosowanie według zastrz. 56 albo 57, albo 58, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.
61. Zastosowanie według zastrz. 56, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowąjest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEAl-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5’ —> 3’ promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się

186 586 z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —» 3' promotor pGEAó Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
62. Zastosowanie według zastrz. 56, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' —» 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
63. Funkcjonalny środek spożywczy, znamienny tym, że zawiera modyfikowany materiał roślinny zawierający co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidora, marchewki, pszenicy, jęczmienia, ziemniaków, soi, słonecznika, sałaty, ryżu, lucerny, buraka, lub części tych roślin; lub LGC rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 2, lub jego pochodną, korzystnie poli18

186 586 peptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2; i/lub LGH rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 5, lub jego pochodną, korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5; i/lub jeden lub więcej ekstraktów enzymatycznych zawierających LGC rekombinacyjny i/lub jego pochodną, zwłaszcza polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2 i/lub LGH rekombinacyjny i/lub jego pochodną, korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5.
64. Funkcjonalny środek spożywczy według zastrz. 63, znamienny tym, że procent wagowy polipeptydów rekombinacyjnych aktywnych enzymatycznie stanowi około 0,1% do 20%, zwłaszcza około 1% do około 15%, całkowitego ciężaru białek obecnych w ekstrakcie, co odpowiada aktywności enzymatycznej od około 0,5 U do około 1000 U na g wagi świeżych liści, zwłaszcza około 10 U/g PF do około 300 U/g PF liści, lub też od około 1 do około 5000 U/g PF ziaren, zwłaszcza od około 10 do około 1000 U/g PF ziama.
65. Funkcjonalny środek spożywczy według zastrz. 63, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną, korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.
66. Funkcjonalny środek spożywczy według zastrz. 63, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.
67. Funkcjonalny środek spożywczy według zastrz. 63 albo 65, albo 66, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.
68. Funkcjonalny środek spożywczy według zastrz. 63 albo 65, albo 66, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.
69. Funkcjonalny środek spożywczy według zastrz. 63, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' —» 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' —» 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -+ 3' promotor pCRU krucyfeiyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

186 586

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEAl-PSLGL-LGC zawierającej wkierunku 5' -> 3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po ^: niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pGEAó Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pĄR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5’ —> 3’ promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej wkierunku 5' —> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z ,19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
70. Funkcjonalny środek spożywczy według zastrz. 63, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydową jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej wkierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej wkierunku 5' —> 3’ promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
71. Zastosowanie modyfikowanego materiału roślinnego zawierającego co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną zwłaszcza żołądkową ssaków lub jej pochodną wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich

186 586 sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidora, marchewki, pszenicy, jęczmienia, ziemniaków, soi, słonecznika, sałaty, ryżu, lucerny, buraka, lub części tych roślin, lub produktów z niego izolowanych do prowadzenia reakcji enzymatycznych w przemyśle rolno-spożywczym lub przetwórstwie, zwłaszcza w przemyśle tłuszczowym, chemii tłuszczów i przemyśle mleczarskim.
72. Zastosowanie według zastrz. 71, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną, korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.
73. Zastosowanie według zastrz. 71, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.
74. Zastosowanie według zastrz. 71 albo 72, albo 73, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.
75. Zastosowanie według zastrz. 71 albo 72, albo 73, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.
76. Zastosowanie według zastrz. 71, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' f 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

186 586

- sekwencji pGEAl-PSLGL-LGG zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pGEAó Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumafaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
77. Zastosowanie według zastrz. 71, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
78. Preparat enzymatyczny, do prowadzenia reakcji enzymatycznych w przemyśle rolno-spożywczym lub przetwórstwie, zwłaszcza w przemyśle tłuszczowym, chemii tłuszczów i przemyśle mleczarskim, znamienny tym, że zawiera modyfikowany materiał roślinny zawierający co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej powstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną zwłaszcza żołądkową ssaków lub jej pochodną wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, włą22

186 586 czonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidora, marchewki, pszenicy, jęczmienia, ziemniaków, soi, słonecznika, sałaty, ryżu, lucerny, buraka, lub części tych roślin; lub LGC rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 2, lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2; i/lub LGH rekombinacyjny aktywny enzymatycznie przedstawiony na fig. 5, lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5; i/lub jeden lub więcej ekstraktów enzymatycznych zawierających LGC rekombinacyjny i/lub jego pochodną zwłaszcza polipeptyd (Δ54) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 55 i 379 na fig. 2 albo polipeptyd (Δ4) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 5 i 379 na fig. 2 i/lub LGH rekombinacyjny i/lub jego pochodną korzystnie polipeptyd (A54LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 74 i 398 na fig. 5 albo polipeptyd (A4LGH) ograniczony przez aminokwasy usytuowane w pozycjach 24 i 398 na fig. 5.
79. Preparat enzymatyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że procent wagowy polipeptydów rekombinacyjnych aktywnych enzymatycznie stanowi około 0,1% do 20%, zwłaszcza około 1% do około 15%, całkowitego ciężaru białek obecnych w ekstrakcie, co odpowiada aktywności enzymatycznej od około 0,5 U do około 1000 U na g wagi świeżych liści, zwłaszcza około 10 U/g PF do około 300 U/g PF liści, lub też od około 1 do około 5000 U/g PF ziaren, zwłaszcza od około 10 do około 1000 U/g PF ziarna.
80. Preparat enzymatyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.
81. Preparat enzymatyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.
82. Preparat enzymatyczny według zastrz. 78 albo 80, albo 81, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.
83. Preparat enzymatyczny według zastrz. 78 albo 80, albo 81, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.
84. Preparat enzymatyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3’ promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

186 586

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEAl-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' 3' promotor pGEAl

Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pGEAó Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —» 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
85. Preparat enzymatyczny według zastrz. 78, znamienny tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' —» 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej w kierunku 5’ —> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
86. Zastosowanie modyfikowanego materiału roślinnego zawierającego co najmniej jeden aktywny enzym rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków lub jej pochodnej po24

186 586 wstający w wyniku ekspresji rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej zawierającej cDNA kodujący lipazę preduodenalną, zwłaszcza żołądkową, ssaków lub jej pochodną, wybraną spośród lipaz, których kodujące sekwencje nukleotydowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 75%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 85%, a ich sekwencje aminokwasowe wykazują wzajemny procent homologii co najmniej 70%, zwłaszcza co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, i posiadają odporność na kwasy i aktywność przy pH od około 1 do około 5, a zwłaszcza przy pH od około 1,5 do około 2, oraz elementy ekspresyjne aktywne w komórce roślinnej, zwłaszcza promotor i terminator transkrypcji rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny komórek roślinnych, włączonej trwale w genom, przy czym roślina została wybrana spośród: rzepaku, tytoniu, kukurydzy, grochu, pomidora, marchewki, pszenicy, jęczmienia, ziemniaków, soi, słonecznika, sałaty, ryżu, lucerny, buraka, lub części tych roślin, lub produktów z niego izolowanych do prowadzenia przemysłowych reakcji biokonwersji enzymatycznych lub biokataliz, zwłaszcza hydrolizy lub transestryfikacji enzymatycznej.
87. Zastosowanie według zastrz. 86, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 1 lub jego pochodną, korzystnie sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją LGC przedstawioną na fig. 2 lub jej pochodną.
88. Zastosowanie według zastrz. 86, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera cDNA przedstawiony na fig. 4 lub jego pochodną, przy czym sekwencja ta koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest identyczna z sekwencją ludzkiej lipazy żołądkowej (LGH) przedstawioną na fig. 5 lub jej pochodną.
89. Zastosowanie według zastrz. 86 albo 87, albo 88, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera:

- w dół od cDNA lub jego pochodnej, terminator polyA 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- w górę od cDNA lub jego pochodnej, promotor 35S, lub promotor konstytutywny podwójny 35S (pd35S) wirusa mozaiki kalafiora CaMV, lub promotor pCRU genu krucyferyny rzodkwi, lub promotor pAR-IAR ryżu lub promotor pyzeinowy kukurydzy.
90. Zastosowanie według zastrz. 86 albo 87, albo 88, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję kodującą peptyd odpowiedzialny za adresowanie ekspresjonowanego polipeptydu w określony przedział komórki roślinnej.
91. Zastosowanie według zastrz. 86, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydowa jest wybrana spośród:

- sekwencji pd35S-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pd35S-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —» 3 promotor pd35S CaMV, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PS-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PPS-LGC zawierającej w kierunku 5' -+ 3' promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą prepropeptyd sporaminy A, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pCRU-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5’ —> 3’ promotor pCRU krucyferyny, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierw186 586 szych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEAl-PSLGL-LGC zawierającej wkierunku 5' —> 3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pGEA6-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pGEAó Arabidopsis thaliana, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pAR-IAR-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -» 3' promotor pAR-IAR ryżu, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV, lub terminator polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC zawierającej w kierunku 5' -> 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pyzeina-PSLGL-LGC-KDEL zawierającej wkierunku 5' -» 3' promotor pyzeinowy kukurydzy, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1, lub na fig. 3, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
92. Zastosowanie według zastrz. 86, znamienne tym, że rekombinacyjna sekwencja nukleotydową jest wybrana spośród:

- sekwencji pSP-PSLGH-LGH zawierającej w kierunku 5' —> 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LGH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 355 CaMV,

- sekwencji pSP-PSLPH-LGH zawierającej w kierunku 5' —» 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy LPH, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV,

- sekwencji pSP-PSLGL-LGH zawierającej w kierunku 5' 3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekwencję kodującą część peptydu sygnałowego LGL składającą się z 19 pierwszych aminokwasów, przy czym 9 nukleotydów kodujących 3 ostatnie C-końcowe aminokwasy jest usunięte, następującą bezpośrednio po niej sekwencję nukletydową przedstawioną na fig. 4, a następnie terminator polyA 35S CaMV.
93. Zastosowanie według zastrz. 86, znamienne tym, że zmodyfikowany materiał roślinny jest wykorzystywany równocześnie jako źródło enzymatyczne i substrat reakcji.
94. Zastosowanie według zastrz. 86 albo 93, znamienne tym, że zmodyfikowany materiał roślinny jest wykorzystywany do otrzymywania biopaliwa, korzystnie obejmującego estry roślinnych kwasów tłuszczowych, zwłaszcza ester metylowy kwasu oleinowego.
95. Zastosowanie według zastrz. 86 albo 93, znamienne tym, że zmodyfikowany materiał roślinny jest wykorzystywany do otrzymywania estru metylowego kwasu oleinowego.

* * *

186 586

Wynalazek dotyczy rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej, wektora, zwłaszcza plazmidu, gospodarza komórkowego, zwłaszcza bakterii, zastosowania rekombinacyjnej sekwencji nukleotydowej, sposobu otrzymywania aktywnego enzymu rekombinacyjnej lipazy preduodenalnej ssaków i jej pochodnej, modyfikowanego materiału roślinnego i jego zastosowania, LGC rekombinacyjnego aktywnego enzymatycznie, LGH rekombinacyjnego aktywnego enzymatycznie, ekstraktu roślinnego o aktywności enzymatycznej, kompozycji farmaceutycznej, funkcjonalnego środka spożywczego oraz preparatu enzymatycznego do zastosowań agro-spożywczych lub przemysłowych.

Enzym lipazy żołądkowej psa (LGC) jest glikoproteiną o 379 aminokwasach (AA) o ciężarze cząsteczkowym około 50 kilodaltonów (kDa) zsyntetyzowaną w formie prekursora zawierającego peptyd sygnałowy skraju aminokońcowego (NH₂-koniec) i wydzielaną przez środkowe komórki błony śluzowej dna żołądka psa (Carriere F. et al., 1991).

Enzym lipazy żołądkowej ludzkej (LGH) jest naturalnie syntetyzowany w formie prekursora i jest opisany w publikacji: Bodmer M.W. et al., 1987. Proteina dojrzała LGH składa się z 379 aminokwasów. Jej peptyd sygnałowy (PSLGH) jest złożony z 19 aminokwasów.

Enzymy te należą do rodziny lipaz tzw. preduodenalnych, których pewne człony już oczyszczono i niekiedy nawet klonowano (Docherty A.J.P. et al., 1985; Bodmer M.W. et al., 1987; Moreau H. et al., 1988; Patenty europejskie nr 0191061 i nr 0261016).

Przez długi czas przyjmowano jako fakt, że hydroliza lipidów spożywczych następuje na poziomie jelita cienkiego dzięki działaniu enzymów wytworzonych przez trzustkę (Bernard C., 1849).

Jednak obserwacje pozwalały sądzić, że hydroliza trójglicerydów może się odbywać w żołądku za pośrednictwem enzymów preduodenalnych (Volhard, F., 1901; Shonheyder, F. i Volquartz, K., 1945). Te enzymy, a w szczególności lipaza żołądkowa psa, mają właściwości enzymatyczne i fizykochemiczne, które różnicują lipazy trzustkowe ssaków. Te różnice między lipazami żołądkowymi i trzustkowymi dotyczą zasadniczo następujących punktów: ciężar cząsteczkowy, skład aminokwasów, odporność na pepsynę, specyficzność substratu, pH optymalnego działania i trwałość w środowisku kwaśnym. Ponadto, in vitro, w pewnych warunkach, można udowodnić synergię działania między lipazą żołądkową i trzustkową przy hydrolizie trójglicerydów o długich łańcuchach (Gargouri, Y. et al., 1989).

Znane jest szereg sytuacji patologicznych (mukowiscydoza, zewnątrzwydzielnicza niewydolność trzustki) lub też pacjenci są całkowicie lub częściowo pozbawieni zewnątrzwydzielniczego wydzielania trzustkowego, a zatem enzymów niezbędnych do hydrolizy środków spożywczych (amylaz, lipaz, proteaz). Nieabsorbowanie tłuszczów na poziomie jelitowym, i zwłaszcza trójglicerydów o długich łańcuchach, wyraża się przez bardzo znaczne zwiększenie biegunki tłuszczowej u tych pacjentów i przez bardzo wrażliwe spowolnienie przybierania na wadze u młodych chorych. W celu skorygowania tego podaje się tym osobnikom ekstrakty trzustkowe wieprzowe w czasie posiłku. Skuteczność terapeutyczna tych ekstraktów mogłaby być wyraźnie poprawiona przez współprzepisywanie LGC dzięki jego specyficzności działania na trójglicerydy o długich łańcuchach.

W artykule Carriere et al. (1991) opisano oczyszczanie i oznaczenie sekwencji NH₂końca LGC. Sposób umożliwiający wyekstrahowanie tego enzymu wychodząc z żołądków psa jest również opisany w tej publikacji. Sposób ten składa się zasadniczo z poddania żołądków psa maceracji w środowisku kwaśnym, (pH 2,5) w obecności soli rozpuszczalnych w wodzie sprzyjających powtórnemu odrzuceniu lipazy we wspomnianym środowisku. Etapy filtracji na sitach molekularnych i chromatografia jonowymienna pozwalają oczyścić LGC do stanu ednorodności. Oczyszczone LGC otrzymane tymi sposobami jest glikoproteiną o ciężarze cząsteczkowym 49 000 daltonów, z których 6 000 odpowiada cukrom, a 43 000 części proteinowej. Oczywiste trudności zaopatrywania w żołądki psów utrudniają całe opracowanie tego sposobu na poziomie laboratorium, jak i na poziomie przemysłowym lub wymagają znalezienia sposobu, który umożliwi wytwarzanie LGC w dużych ilościach, co uczyni abstrakcją wykorzystanie żołądków psów.

Sekwencje nukleotydowe i peptydowe LGC oznaczono w celu przemysłowego, wytwarzania LGC sposobem odwołującym się do inżynierii genetycznej. Prace te są przedmiotem

186 586 zgłoszenia międzynarodowego nr WO 94/13816 złożonego 16 grudnia 1993. Sposób wytwarzania rekombinacyjnego LGC opisany w tym zgłoszeniu międzynarodowym ujawnia Escherichia coli (E. coli) jako transformowaną komórkę gospodarza mogąca wytwarzać LGC. Pewne trudności napotkane podczas wytwarzania rekombinacyjnego LGC przez E. coli, zwłaszcza potrzeba hodowli znacznych ilości E. coli w fermentatorze, o zwiększonych kosztach, doprowadziły wynalazców do badania innych procesów wytwarzania tego LGC. Komórki ssaków są, a priori, bardziej przystosowane do ekspresji genów ssaków. Ich wykorzystanie stwarza jednak problemy związane z dojrzewaniem protein. Wyposażenie enzymatyczne, które przeprowadza dojrzewanie post-translacyjne jest różne w zależności od tkanki, organu lub gatunku. Np., opisano, że dojrzewanie post-translacyjne proteiny plazmatycznej może być różne, gdy jest ona otrzymana wychodząc z krwi ludzkiej lub jest wytworzona przez komórki rekombinacyjne, takie jak komórki jajnikowe chomika lub w mleku zwierzęcia transgenicznego. Ponadto, słabe poziomy ekspresji otrzymane z komórek ssaków pociągają za sobą bardzo duże objętości hodowli in vitro o znacznych kosztach. Wytwarzanie protein rekombinacyjnych w mleku zwierząt transgenicznych (mysz, owca i krowy) pozwala zmniejszyć koszty wytwarzania i pokonać problemy na poziomie ekspresji. Jednak pozostają problemy etyczne i zanieczyszczeń wirusowych i sub wirusowych (priony). Z tych powodów, transgeneza genów ssaków w komórkach roślinnych mogłaby zaoferować drogę wytwarzania dużych ilości nowych protein rekombinacyjnych, o zmniejszonych kosztach wytwarzania i bez ryzyka zanieczyszczenia wirusowego lub subwirusowego. W 1983, szereg laboratoriów odkryło, że byłoby możliwe przeniesienie genu heterologicznego w genomie komórki roślinnej (Bevan et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983 a i b) i regenerowanie roślin transgenicznych wychodząc z tych komórek zmodyfikowanych genetycznie. Wszystkie komórki rośliny posiadają jednak charakter zmodyfikowany genetycznie, który jest przeniesiony na potomstwo przez zapłodnienie płciowe. Dzięki tym pracom, różne zespoły są zainteresowane wytwarzaniem protein rekombinacyjnych ssaków w komórkach roślinnych lub w roślinach transgenicznych (Barta et al., 1986; Mant, 1982). Pierwsze wyniki prawdziwie znaczące w tym zakresie to wytwarzanie przeciwciała w roślinach tytoniu transgenicznego (Hiatt et al., 1989). W celu ekspresji proteiny heterologicznej w ziarnie, miejscu składowania protein u roślin, zespół Vandekerckhove (1989) dokonał fuzji sekwencji kodującej leu-enkefalinę z genem kodującym albuminę 2S Arabidopsis thaliana. Z tej konstrukcji, wytworzono transgeniczne produkty, które dokonują ekspresji leuenkefaliny specyficznie w ziarnach o poziomach ekspresji rzędu 0,1% całości protein. W 1990, Sijmons i wsp. przenieśli gen albuminy surowicy ludzkiej do komórek tytoniu i ziemniaka. Jakie by nie było pochodzenie peptydów sygnałowych (ludzkie lub roślinne), w liściach, łodygach i bulwach ziemniaka otrzymano poziomy albuminy surowicy ludzkiej rzędu 0,02% ogółu protein.

Również inne proteiny rekombinacyjne ssaków wytworzono w roślinach: antygen powierzchniowy hepatitis B (Mason et al., 1992); interferony (De Zoeten et al., 1989; Edelbaum et al., 1992; Truve et al., 1993); przeciwciała myszy antiStreptococcus mutans, czynnik próchnicy zębów (Hiatt i Ma, 1992; Ma et al., 1994), fragmenty przeciwciała scFV przeciw komórkom nowotworowym (Russel D., 1994), przeciwciała antiHerpes (Russel D., 1994), hirudina (Moloney et al., 1994), toksyna cholery (Hem R., 1994) i czynnik wzrostu naskórka ludzkiego (E.G.F.) Higo et al., 1993).

Badania te umożliwiły wykazanie, że wytwarzanie protein rekombinacyjnych ssaków w komórkach roślinnych jest możliwe i że mechanizmy syntezy protein wychodząc z sekwencji DNA są podobne w komórkach zwierzęcych i komórkach roślinnych. Niemniej istnieje kilka różnic między komórkami roślinnymi i komórkami zwierzęcymi, zwłaszcza na poziomie dojrzewania glikanów polimannozydowych w glikanach złożonych, lub ponadto na poziomie miejsca rozszczepienia peptydów sygnałowych, nie umożliwiając zatem gwarancji otrzymywania aktywnych lub dostatecznie aktywnych protein ssaków przez transformację komórek roślinnych.

Wykazano, że wykorzystanie komórek roślinnych transformowanych przez sekwencję odpowiednich nukleotydów rekombinacyjnych, pozwala na otrzymanie rekombinacyjnego LGC, lub rekombinacyjnego LGH, lub pochodnych ich polipeptydów, wykazujących aktyw28

186 586 ność enzymatyczną wystarczającą dla możliwości ich opracowania dla zastosowań przemysłowych.

Wynalazek dostarcza zatem nowego sposobu otrzymywania rekombinacyjnych lipaz preduodenalnych ssaków, a zwłaszcza LGC lub LGH rekombinacyjnych, przez rośliny, lub polipeptydy pochodzące z tych ostatnich, wykazujących aktywność enzymatyczną, a zwłaszcza aktywność lipazową tak że wspomniane lipazy rekombinacyjne, lub ich polipeptydy pochodne mogą być wykorzystane przemysłowo.

Wynalazek dostarcza także narzędzi do zastosowania tego sposobu, zwłaszcza nowych rekombinacyjnych sekwencji nukleotydowych, komórek roślin transformowanych genetycznie, roślin lub części roślin (zwłaszcza liści, łodyg, owoców, nasion lub ziaren, korzeni) transformowanych genetycznie, i fragmentów tych roślin lub części roślin transformowanych genetycznie.

Wynalazek dostarcza także nowej (nowych) rekombinacyjnej (rekombinacyjnych) lipazy (lipaz) preduodenalnych ssaków, lub wszelkich polipeptydów pochodnych, enzymatycznie aktywnych i takich, które otrzymano wychodząc z komórek roślinnych lub roślin, transformowanych genetycznie, jak również nowych kompozycji enzymatycznych nadających się do wykorzystania w zakresie stosowania reakcji enzymatycznych, zwłaszcza na skalę przemysłową.

Wynalazek dostarcza również nowych kompozycji farmaceutycznych, zwłaszcza w zakresie leczenia patologii związanych z niedoborem wytwarzania lipazy w organizmie, takich jak mukowiscydoza.

W innym wykonaniu wynalazek dostarcza także nowych paliw, tzw. biopaliw, stanowiących korzyść ze względu na mniejsze zanieczyszczenie środowiska niż w przypadku paliw pochodnych ropy naftowej, i o niższych kosztach.