PL187090B1 - Sposób wytwarzania czynnika farmaceutycznego - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania czynnika farmaceutycznego do leczenia pacjenta, który do- znal urazu wielonarzadowego, znamienny tym, ze terapeutycznie skuteczna ilosc prze- ciwciala przeciwko selektynie wlacza sie do farmaceutycznie dopuszczalnego nosnika. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wlacza sie przeciwciala przeciwko L-selektynie. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze przeciwcialo przeciwko selektynie jest przeciwcialem humanizowanym. 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze humanizowane przeciwcialo jest przeciwcialem HuDreg 55 lub HuDreg 200 przeciwko L-selektynie. 5. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze do farmaceutycznie dopuszczalnego nosnika wlacza sie ilosc przeciwciala przeciwko selektynie do podawania od 1 do 5 razy po doznaniu urazu wielonarzadowego zawierajaca sie od 1,0 - 10 mg/kg masy ciala pacjenta. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czynnika farmaceutycznego do leczenia pacjenta, który doznał urazu wielonarządowego, przez włączenie terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała przeciwko selektynie do farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika.

Uszkodzenie wielonarządowe należy rozumieć jako uszkodzenie wielu tkanek (kości lub tkanek miękkich). W trakcie uszkodzenia wielonarządowego są aktywowane układy mediatorów (np. cytokiny, produkty przemian kwasu arachidonowego, rodniki tlenowe, proteazy) jak również leukocyty i inne komórki. Prowadzi to do wtórnego uszkodzenia narządowego (np. uszkodzenia struktury tkankowej przez uwolnione proteazy). Takie wtórne uszkodzenie narządowe może pojawić się w całym organizmie niezależnie od miejsca wystąpienia pierwotnego urazu.

Uszkodzenie wielonarządowe może również być związane ze wstrząsem krwotocznym. Wstrząs krwotoczny należy rozumieć jako wstrząs charakteryzujący się szybką i znaczącą wewnętrzną lub zewnętrzną utratą krwi. Obecnie wstrząs krwotoczny może być skutecznie leczony przy zastosowaniu intensywnej terapii, a szczególnie uzupełnienia objętości i transfuzji krwi. Połączenie wstrząsu krwotocznego i urazu jest określane jako wstrząs krwotoczno-urazowy. W przeciwieństwie do czystego wstrząsu krwotocznego nie istnieje obecnie żadna specyficzna metoda leczenia wstrząsu urazowego i krwotoczno-urazowego i nie ma postępowania profilaktycznego zabezpieczającego przed następową niewydolnością narządową występującą po urazie wielonarządowym.

Niewydolność wielonarządowa (MOF) jest poważnym problemem występującym często po urazie wielonarządowym. Im więcej narządów jest nią dotkniętych tym jest większa śmiertelność.

187 090

Narządy i układy, które mogą stać się niewydolne obejmują serce, płuca, nerki, wątrobę, żołądek, jelita i ośrodkowy układ nerwowy. Jakkolwiek w ostatnich latach stało się możliwe zmniejszenie bardzo wysokiej śmiertelności pacjentów po urazach do około 20% przez polepszenie funkcjonowania służb ratunkowych i pomocy lekarskiej w nagłych wypadkach, to jak dotąd nie ma swoistego leczenia niewydolności narządowej.

Marzi i in., J. Trauma 35:110-119 (1993) ujawnia, że dyzmutaza nadtlenkowa może być podawana 24 godziny po urazie. Jakkolwiek wyniki nie są niejednoznaczne i wykazują niewielki trend w kierunku częściowej poprawy. Jednakże nie obserwowano znaczącego zmniejszenia śmiertelności i MOF. Mileski W. J i in., Surgery 108:206-212 (1990) ujawnia, że wiązanie granulocytów obojętnochłonnych lub ich agregatów przyczynia się znacząco do rozwoju wstrząsu krwotocznego po uszkodzeniu narządowym. W tym przypadku zwierzętom doświadczalnym podawano przeciwciała anty-CD18 bezpośrednio po 90 minutowym okresie wstrząsu krwotocznego. Metody terapeutyczne leczenia niewydolności wielonarządowej po urazie wielonarządowym nie zostały opisane przez Mileskiego. Vedder N.B. i in., Surgery 106: 509-516 (1989) również proponuje zastosowanie przeciwciał anty-CD18 do leczenia wstrząsu krwotocznego.

Ujawniono, że selektyny takie jak: selektyna L, E i P są również związane z uszkodzeniem tkankowym w trakcie trwania niedokrwienia i reperfuzji. Granulocyty obójętnochłonne grają istotną rolę w tym związku. Należy przypuszczać, że selektyna jest konieczna do rekrutacji granulocytów obojętnochłonnych. Najwyraźniej selektyna L jest konieczna do pełnego rozwoju uszkodzenia zarówno w mięśniach szkieletowych jak i w płucach (Seekamp A i in., Am. J. Pathol. 11: 592-5998 (1994). Mulligan M.S i in., J. Immunol. 151+ 832-840 (1994) opisali podobne zjawisko).

Wytwarzanie humanizowanych przeciwciał przeciwko selektynie L jest opisane w zgłoszeniu WO 94/12215, włączonym tutaj jako odnośnik. Zaproponowano zastosowanie takich przeciwciał w leczeniu chorób zapalnych i w szczególności w leczeniu zawału serca. Zaproponowano dawkę 1-50 mg do zapobiegania ostrej niewydolności płucnej. Jednakże, nie opisano sposobu zapobiegania wystąpienia MOF po urazie wielonarządowym.

Tak więc, istnieje potrzeba uzyskania skutecznej terapii zapobiegającej wystąpieniu i/lub leczącej niewydolność wielonarządową po urazie wielonarządowym.

Ostre uszkodzenie narządowe może również wystąpić w trakcie operacji układu sercowo-naczyniowego, takiej jak żylne pomostowanie aortalno-wieńcowe lub operacja zastawki serca, gdzie wykorzystuje się krążenie pozaustrojowe przez sztuczne płuco-serce. Obszar uszkodzenia zależy od czasu wykorzystywania aparatury podczas zabiegu. Może prowadzić do np. niewydolności płuc wymagającej konieczności podłączenia do respiratora po operacji (Bimbaum D. i in., Z. Kardiol. 79, Suppl. 4:87-93 (1990)). Inne narządy takie jak serce, nerki, wątroba lub układy takie jak krwionośny i układ krzepnięcia mogą również być uszkodzone i niewydolne.

Wiadomo z publikacji Mulligana M. S i in., J. Immunol. 151: 832-840 (1994), że cząsteczki promujące adhezję takie jak selektyny L, E i P biorą udział w ostrych procesach zapalnych. Cząsteczki te pośredniczą w procesach adhezji leukocytów i komórek śródbłonka. W tym połączeniu, selektyna L wydaje się odgrywać istotną rolę w fazie początkowej (toczenie) ostrych wewnątrzpłucnych reakcji zapalnych. Mulligan stwierdza następnie, że przeciwciała przeciwko selektynie L skracają czas trwania uszkodzenia płuc wyzwalanego przez selektynę L.

Jednakże, aż do tej pory nieznana jest metoda terapii, która mogła by być zastosowana do zapobiegania ostremu uszkodzeniu narządowemu wywoływanemu przez pozaustrojowe krążenie krwi. Tak więc, istnieje potrzeba uzyskania skutecznego sposobu leczenia zapobiegającemu ostremu uszkodzeniu narządowemu wywoływanemu przez pozaustrojowe krążenie krwi.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czynnika farmaceutycznego do leczenia pacjenta, który doznał urazu wielonarządowego, charakteryzujący się tym, że terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała przeciwko selektynie włącza się do farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku włącza się przeciwciała przeciwko L-selektynie.

187 090

W szczególności, w sposobie według wynalazku przeciwciało przeciwko selektynie jest przeciwciałem humanizowanym.

Korzystniej humanizowane przeciwciało jest przeciwciałem HuDreg 55 lub HuDreg 200 przeciwko L-selektynie.

Ponadto korzystnie w sposobie według wynalazku do farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika włącza się ilość przeciwciała przeciwko selektynie do podawania od 1 do 5 razy po doznaniu urazu wielonarządowego zawierającą się od 1,0 -10 mg/kg masy ciała pacjenta.

W szczególności, korzystnie w sposobie według wynalazku włącza się przeciwciało przeciwko selektynie w ilości wyliczonej do podawania w przedziale czasowym do 8 godzin po doznaniu urazu wielonarządowego.

Również korzystnie w sposobie według wynalazku dawkę przeciwciała przeciwko selektynie włączonego do farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika ustala się na podstawie stężenia przeciwciał przeciwko selektynie w surowicy lub osoczu pacjenta w przedziałach od 6 do 24 godzin po podaniu poprzedniej dawki, przy czym kiedy stężenie przeciwciał przeciwko selektynie jest mniejsze niż 10 mm/ml surowicy lub osocza tego pacjenta, włącza się dawkę przynajmniej tak wysoką jak poprzednia, a kiedy stężenie przeciwciał przeciwko selektynie wynosi od 10 mm/ml do 50 mm/ml surowicy lub osocza tego pacjenta, włącza się dawkę wynosząca połowę poprzedniej dawki.

Czynnik terapeutyczny otrzymany sposobem według wynalazku może być stosowany do zapobiegania ostremu uszkodzeniu narządowemu po zastosowaniu krążenia pozaustroj owego.

Figura 1 pokazuje masę wilgotną płuc zwierząt doświadczalnych w odniesieniu do czasu obserwacji.

Figura 2 pokazuje wskaźnik sercowo-naczyniowy CO (pojemność minutowa serca) w odniesieniu do czasu dla różnych zwierząt doświadczalnych.

Figura 3 pokazuje wskaźnik sercowo-naczyniowy MAP (średnie ciśnienie krwi tętniczej) w odniesieniu do czasu dla zwierząt doświadczalnych.

Figura 4 pokazuje wartość BE (nadmiar zasad w krwi tętniczej) w odniesieniu do czasu dla zwierząt doświadczalnych.

Figura 5 pokazuje liczbę białych krwinek w odniesieniu do czasu dla różnych zwierząt doświadczalnych.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania czynnika farmaceutycznego do leczenia pacjenta, który doznał urazu wielonarządowego, przez zastosowania przynajmniej jednego przeciwciała przeciw selektynie. Czynnik farmaceutyczny otrzymany sposobem według wynalazku może być wykorzystany do zapobiegania ostremu uszkodzeniu narządowemu wywołanemu przez krążenie pozaustrojowe u pacjentów, których krew przepływa przez sztuczne płuco-serce, przy czym czynnik farmaceutyczny otrzymany sposobem według wynalazku dodaje się pozaustrojowo do systemu cewników sztucznego płuco-serca na 1 do 30 minut przed zakończeniem krążenia pozaustroj owego. Tak więc środek farmacetyczny otrzymany sposobem według wynalazku może być przeznaczony do podawania pozaustrojowo, tj. bezpośrednio do układu cewników sztucznego płuco-serca, a nie jedynie do organizmu pacjenta.

Nieoczekiwanie, ostremu uszkodzeniu narządowemu u pacjenta po zastosowaniu krążenia pozaustroj owego można w dużym stopniu zapobiec poprzez prewencyjne podanie pozaustrojowe czynnika farmaceutycznego otrzymanego sposobem według wynalazku.

Korzystnie przeciwciałem stosowanym w sposobie według wynalazku jest przeciwciało przeciwko L-selektynie. Poliklonalne lub monoklonalne mysie, ludzkie, chimeryczne lub humanizowane przeciwciała/immunolgloguliny i ich fragmenty wiążące mogą być zastosowane jako przeciwciała przeciw selektynie.

Określenie „przeciwciała przeciw selektynie” w znaczeniu tu użytym, odnosi się do każdego przeciwciała wiążącego się z selektyną. Korzystne są przeciwciała, które wiążą się swoiście z selektyną L, selektyną E albo z selektyną P, jak również z ich kombinacjami. Szczególnie korzystne są przeciwciała wiążące się z L-selektyną. W sposobie według wynalazku mogą być również stosowane przeciwciała, które reagują z więcej niż jedną selektyną, takie jak przeciwciała reagujące z obiema selektynami L i E. Selektyną L jest znaną glikoproteiną, która ulega ekspersji konstytutywnej na wszystkich leukocytach. Zarówno selektyną L

187 090 jak i ich mysie homologi GP90 i Mell4 są włączone w normalną recyrkulację limfocytów każdy pośredniczy w oddziaływaniach pomiędzy krążącymi limfocytami i Ugandami naczyniowymi (często określanymi jako „adresyny”) na żyłkach wysokosródbłonkowych (HEV) narządów limfatycznych. (L.A. Lasky i in., Celi 69: 927-938 (1992); E.L. Berg i in., J. Celi. Biol. 114: 343-349 (1991)). Dodatkowo oprócz jej roli jako receptora adresującego (ang. homing) limfocytów, selektyna L jest również zaangażowana w adhezję leukocytów do tkanek nie limfatycznych, takich jak śródbłonek podczas zapalenia. Selektyna L jest złuszczana z powierzchni leukocytów po ich aktywacji (T.K Kishimoto i in., Science 245: 1238-1241 (1989)) i może byó to istotny proces w zatrzymywaniu leukocytów w miejscu zapalenia. Selektyna L posiada amino-końcową domenę rozpoznającą węglowodany (CRD), która posiada znaczną homologię z lektynątypu C (K. Trickhamer, J. Biol. Chem. 263: 9557-9560 (1988)), po której następuje pojedyncza domena podobna do nabłonkowego czynnika wzrostu, domeny regulujące dopełniacz, pojedynczy polipeptyd śródbłonowy i C-końcowa domena cytoplazmatyczna. Selektyna L oddziałuje z pokrewnymi jej ligandami poprzez przez amino-końcową CRD w sposób zależny od wapnia.

W sposobie według wynalazku znajdują zastosowanie przeciwciała przeciw selektynie, które modulują, bardziej korzystnie hamują oddziaływania pomiędzy domeną CRD i odpowiednimi receptorami węglowodanowymi na powierzchni komórek. Takie receptory węglowodanowe są opisane przez R.B, Parekh'a, Tibtech 12:339-345 (1994) i włączone jako odnośnik.

Takie receptory węglowodanowe mogą byó fosforylowanymi lub sulfonowanymi cukrami.

W sposobie według wynalazku mogą być też użyte przeciwciała przeciwko selektynie P i/lub selektynie E zamiast, lub jako dodatek do przeciwciała przeciwko selektynie L. Takie przeciwciała mogą byó wytwarzane z wykorzystaniem selektyny P lub E (opisane przez R.B. Parekh'a iT.F. Teddera, FASEB Journal 9:866-873 (1995)), włączone tu przez odniesienie). Korzystnie zastosowane przeciwciała przeciwko selektynie P i/lub E wykazują znaczącą reaktywność krzyżową z przeciwciałami przeciwko selektynie L, w szczególności z przeciwciałem HuDreg-55 lub HuDreg-200.

W znaczeniu tu użytym „immunoglobulina humanizowana” odnosi się do immunoglobuliny obejmującej ludzki zrąb, przynajmniej jeden region określający komplementamość (CDR) z przeciwciała nie pochodzącego od człowieka i w którym występujący region stały jest zasadniczo identyczny ze stałym regionem ludzkiej immunoglobuliny tj. przynajmniej wokoło 85-90%, korzystnie przynajmniej wokoło 95% identyczny. Stąd wszystkie części humanizowanej immunoglobuliny, za wyjątkiem ewentualnych CDR, są zasadniczo identyczne z odpowiednimi częściami jednej lub więcej sekwencji natywnej immunoglobuliny. Na przykład, humanizowana immunoglobulina nie będzie zawierać przeciwciała chimeryczny mysi region zmienny/ludzki region stały. Patrz np. European Patent Application EP A 451216, włączony tu jako odnosienie.

Czynnik terapeutyczny otrzymany sposobem według wynalazku zmniejszenia MOF i śmiertelność po urazach wielonarządowych. Nieoczekiwanie okazało się, że jest możliwe zapobieganie niewydolności wielonarządowej, gdy czynnik farmaceutyczny otrzymany sposobem według wynalazku, zawierający przeciwciała przeciwko selektynie, szczególnie przeciwciała przeciwko selektynie L, jest podawany bardzo szybko po urazie wielonarządowym. Jest to również nieoczekiwane ponieważ nie ma żadnych ostrych objawów we wczesnym stadium po urazie wielonarządowym.

W sposobie według wynalazku, do farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika włącza się przeciwciała przeciw selektynie w dawkach 1,0-10 mg/kg masy ciała pacjenta, a otrzymany czynnik farmaceutyczny jest przeznaczony do podawania 1 do 5 razy, po doznaniu urazu wielonarządowego. Pierwsze podanie powinno mieć miejsce tak wcześnie jak to jest możliwe, korzystnie do 8 godzin po urazie wielonarządowym.

Dawka i czas drugiego i następnych podań zapobiegawczych jest wybrana zależnie od stężenia przeciwciał przeciw selektynie we krwi i w osoczu lub surowicy pacjenta. Stężenie w osoczu przeciwciał przeciw selektynie powinno być utrzymywane na poziomie 10-100 mg/ml wciągu 7-10 dni po urazie wielonarządowym. To stężenie jest równoważne około 10-100 krotnemu stężeniu rozpuszczalnej selektyny w osoczu. Dawka i czas drugiego i następnych

187 090 podań są określane zależnie od oznaczenia stężenia przeciwciał przeciw selektynie we krwi, surowicy lub osoczu w odstępach 6-24 godzinnych po podaniu poprzedniej dawki. Jeżeli stężenie przeciwciał przeciwko selektynie jest mniejsze niż 10 mm/ml surowicy lub osocza pacjenta, włącza się dawkę przynajmniej tak wysoką jak poprzednia. Gdy stężenie przeciwciał waha się pomiędzy 10 i 50 mg/ml, włącza się dawkę wynoszącą połowę poprzedniej dawki, a gdy stężenie przeciwciała wynosi między 50 a 100 mg/ml nie podaje się dalszej dawki czynnika farmaceutycznego. W takim przypadku jedynie stężenie przeciwciała jest dalej monitorowane.

Stężenie przeciwciał przeciw selektynie we krwi, osoczu lub surowicy jest określane przy użyciu zwykłych metod, korzystnie immunologicznych metod określania stężenia.

Sposoby takie znane są specjalistom w dziedzinie wiedzy. Przykładowo, oznaczenie można wykonać przy użyciu testu ELISA, w którym znakowane przeciwciało przeciwko selektynie, korzystnie przeciwciało, które jest również przydatne terapeutycznie, współzawodniczy o konkretną selektynę. W kolejnym etapie, ilość znakowanego przeciwciała, które związało się z antygenem jest określana i na tej podstawie określa się stężenie przeciwciała przeciwko selektynie w próbce.

Czynnik farmaceutyczny otrzymany sposobem według wynalazku jest zwykle przeznaczony do podawania pozajelitowo, np. dożylnie, dotętniczo, dootrzewnowe, podskórnie albo domięśniowo. Korzystne jest podawanie dożylne (i.v.). Składniki czynne czynnika farmaceutycznego mogą być stosowane w postaci płynnej albo stałej, korzystnie w postaci liofilizowanej i mogą być stosowane wraz z odpowiednim rozcieńczalnikiem albo nośnikiem takim jak woda albo roztwory wodne chlorku sodu, dekstrozy, buforów itp. Mogą być również dodawane inne odpowiednie farmaceutyczne substancje pomocnicze.

Przeciwciała przeciwko selektynie znane są w stanie techniki i opisane przykładowo wEP-A 0 386 906, WO 93/00111 i WO 94/12215 oraz w Kishimoto i in., Blood 78:805-811 (1991) iPNAS USA 87:2241-2248 (1990), załączone tu przez odniesienie. Selektyna L jest również oznaczana w literaturze jako LECAM-1, Mel 14 albo Lam-1. Klonowanie i sekwencję Lam-1 opisano w WO 93/02698. Przydatne są przeciwciała, które wiążą się swoiście z selektyną. Korzystnie w sposobie według wynalazku znajdą zastosowanie humanizowane przeciwciała, zwłaszcza HuDreg 200, które jest opisane w WO 94/12215 i załączone tu jako odnośnik. Inne przeciwciała, które wiążą się selektyną, takie jak HuDreg 55, (sekwencja: Identyfikator Sekw. nr 1-4), są również szczególnie korzystne.

„Przeciwciało” w znaczeniu tu zastosowanym należy rozumieć jako białko, które składa się z jednego albo wielu łańcuchów polipeptydowych, które są zasadniczo kodowane przez geny przeciwciała. Geny przeciwciała kodują regiony zmienne swoiste dla antygenu oraz kodują regiony stałe. Przeciwciałami w rozumieniu wynalazku są również różne pochodne i fragmenty przeciwciał, takie jak Fv, Fab i F(ab)2 oraz pojedyncze łańcuchy przeciwciała (Houston i in., PNAS USA 85:5879-5883 (1988), Bird i in., Science 242:423-426 (1988), Hood i in., Immunology, Benjamin NY, wyd. 2 (1984), Hunkapiller i Hood, Nature 323:15-16 (1986)). Przeciwciała monoklonalne i ich fragmenty są korzystnie stosowane, zaś szczególnie korzystne są przeciwciała chimeryczne albo humanizowane, korzystnie podtypu IgGl albo IgG4.

Przeciwciała korzystnie zawierają przynajmniej dwa łańcuchy polipeptydowe lekkie i dwa łańcuchy polipeptydowe ciężkie. Każdy z łańcuchów zawiera region zmienny (zwykle część N-końcowa łańcucha polipeptydowego), która z kolei zawiera domenę wiążącą antygen. Łańcuchy lekkie i ciężkie zawierają region stały polipeptydu (zwykle część C-końcowa), która uczestniczy w wiązaniu przeciwciała z leukocytami (neutrofilami, limfocytami itp.). Zwykle łańcuchy lekkie i ciężkie są łańcuchami kompletnych przeciwciał, które zbudowane są z regionu zmiennego i regionu stałego. W tym połączeniu, regiony zmienne i regiony stale mogą pochodzić z różnych przeciwciał, przykładowo, o różnych izotypach. Przykładowo polipeptyd, który zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała przeciwko selektynie izotypu g-1 może być połączony z regionem stałym łańcucha ciężkiego przeciwciała innej klasy (albo podklasy).

Przydatne są również przeciwciała przeciwko selektynie, w których zastąpiono jeden lub kilka aminokwasów. W tym wypadku, aminokwasy są korzystnie zastąpione przez inny aminokwas o podobnej charakterystyce (np. kwasowy aminokwas Asp przez kwasowy aminokwas Glu).

187 090

Charakterystyka strukturalna oryginalnej sekwencji nie ulega zmianie przez takie zastąpienie. Przykłady takich polipeptydów opisane są w Proteins, Structure and Molecular Principles, wyd. Creighton, Freeman and Company, New York (1984); Introduction to Protein Structure, Brandon i Tooze, Garland Publishing, New York (1981); Thornton i in., Nature 354:105 (1991). Ogólnie, przeciwciałami przydatnymi jako przeciwciała przeciwko selektynie są takie, które wiążą się z jedną z selektyn L, selektyn E i selektyn P i/lub hamują toczenie się leukocytów (np. neutrofilów).

Oprócz opisanych tu immunoglobulin humanizowanych, można zaprojektować i wytwarzać z wykorzystnaiem różnych technik rekombinacji DNA znanych specjalistom inne „zasadniczo homologiczne” zmodyfikowane immunoglobuliny. Przeciwciała ludzkie, obejmujące przykładowo przeciwciała Eu i GAL, jak również inne ludzkie przeciwciała znane w dziedzinie wiedzy można zastosować jako sekwencje szkieletowe. Takie sekwencje szkieletowe powinny wykazywać wysokiego stopnia identyczność sekwencji z domenami mysich regionów zmiennych Dreg 55 i Dreg 200, z których pochodzą CDR. Regiony zrębowe części zmiennych łańcuchów lekkich i ciężkich mogą pochodzić z różnych sekwencji przeciwciał ludzkich. Istotnie, regiony zrębowe łańcuchów ciężkich i lekkich mogą pochodzić z więcej niż jednego przeciwciała ludzkiego. Sekwencje przeciwciała ludzkiego mogą być sekwencjami ludzkich przeciwciał występujących naturalnie albo mogą być sekwencjami zgodności kilku ludzkich przeciwciał, patrz, Carter i in., WO 92/22653 (1992), załączone tu przez odniesienie.

Za „przeciwciała, które są zdolne do wiązania w sposób równoważny” rozumieć należy przeciwciała, które wiążą się z tym samym epitopem albo z epitopem nakładającym się selektyny. Nakładanie się epitopów można stwierdzić metodami znanymi w dziedzinie wiedzy, przykładowo w układzie testu kompetycyjnego. Test wiązania kompetycyjnego można przeprowadzić przy użyciu np. HuDreg 55 w celu stwierdzenia wiązania unieruchomionego antygenu selektyny L. W tym celu, selektynę L, unieruchomioną w odpowiedni sposób (korzystnie selektynę L na leukocytach) inkubuje się z HuDreg 55 w postaci znakowanej oraz badanym przeciwciałem. Wielkość wiązania badanego przeciwciała z selektyną L w porównaniu z HuDreg 55 określa się przez pomiar znacznika związanego z leukocytami. Jeżeli znakowane HuDreg 55 jest wypierane przynajmniej w 50% przez badane przeciwciało, oznacza to, że występuje nakładanie się epitopów. Przeciwciała, które wiążą się w sposób równoważny z HuDreg 55 są korzystne do zastosowania w wynalazku.

„Przeciwciała, które są zdolne do wiązania w sposób równoważny” można również zidentyfikować w teście przesiewowym badającym zdolność do blokowania oddziaływania komórek śródbłonka z neutrofilami. Prosty test wizualny do wykrywania takiego oddziaływania został opisany przez Kishimoto i in., (Blood 78:805 (1991)). Pokrótce, jednowarstwy ludzkich komórek pępowiny są pobudzane interleukiną 1. Neutrofile, uprzednio traktowane albo nie badanym przeciwciałem dodaje się do jednowarstwy w określonych warunkach i określa się mikroskopowo liczbę przylegających neutrofilów. W jednej z metod, neutrofile pochodzą od pacjentów z niedoborem adhezji neutrofilów, patrz Anderson i in., Ann. Rev. Med., 38:175 (1987). Neutrofile od takich pacjentów pozbawione są receptorów integrynowych, których wiązanie z neutrofilami może maskować efekt blokowania wiązania selektyny L.

Przeciwciała mogą być zastosowane jako kompletne przeciwciała monoklonalne, ich fragmenty (Fv, (Fv)2, Fab', F(ab')2), przeciwciała chimeryczne, humanizowane albo ludzkie. Krótkie fragmenty przeciwciał, które zawierają jedynie regiony CDR albo ich części, które wiążą się swoiście z selektyną L mogą być również zastosowane.

Wytwarzanie przeciwciał, zaś w szczególności przeciwciał monoklonalnych i ich fragmentów jest znane specjalistom w dziedzinie i opisane przykładowo w Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988), Bessler i in., Immunobiol. 170:239-244 (1985), Jung i in., Angewandte Chemie 97:883 (1985), Cianfiglia i in., Hybridoma 2:451-457 (1993).

Przeciwciała przeciwko selektynie, które mogą być zastosowane zgodnie ze sposobem według wynalazku mogą być również wytworzone metodą rekombinacyjną. Procesy takie opisano w Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd 2 (1989), Cold Spring Harbor Press, New York; Berger i Kimmel, Methods in Enzymology, vol. 152; Guide

187 090 to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press Inc., San Diego, CA, załączone tu przez odniesienie. Takie przeciwciała rekombinowane mogą być wytworzone w komórkach prokariotycznych albo eukariotycznych procesami znanymi w stanie techniki. Komórki ssaków; zwłaszcza linie komórkowe pochodzące z limfocytów, są korzystne jako komórki gospodarza. Metodą rekombinacyjną są wytwarzane korzystnie przeciwciała chimeryczne, humanizowane i ludzkie. Regiony wybrane jako regiony nie wiążące antygenu przeciwciał są opisane przykładowo w Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institutes of Health, Bethesda, MD. Wytwarzanie rekombinowanych przeciwciał przeciwko selektynie L, humanizowanych albo ludzkich, opisano w WO 94/12215, załączonym tu przez odniesienie. Szczególnie korzystnym humanizowanym przeciwciałem przeciwko selektynie L jest przeciwciało HuDreg 55, które może być wytworzone w sposób analogiczny jak opisane tam HuDreg 200, i obejmuje dwa łańcuchy lekkie o sekwencji opisanej w Identyfikatorze Sekw. nr 2 i dwa łańcuchy ciężkie o sekwencji opisanej w Identyfikatorze Sekw. nr 4.

Korzystnymi humanizowanymi immunoglobulinami są takie, które wiążą się z selektyną z powinowactwem wiązania wynoszącym przynajmniej 1x107 M'¹ w standardowych warunkach wiązania (np. roztwór soli buforowany fosforanem z 2% surowicą płodową bydlęcą w 25°C). Przykładami takich humanizowanych immunoglobulin są HuDreg 55 i HuDreg 200. Korzystniejsze są przeciwciała humanizowane, które w standardowych warunkach wiązania wiążą się z ludzką selektyną z powinowactwem równym przynajmniej lxl08 M'¹, zaś jeszcze korzystniej z powinowactwem równym przynajmniej lxlO9 M1 zaś najkorzystniej z powinowactwem równym przynajmniej 1x10 ™ M'¹ albo wyższym. Zwykle, powinowactwo wiązania humanizowanej immunoglobuliny wynosi 3-10 krotność mysiej immunoglobuliny, z której pochodzi. Przykładowo, powinowactwo mysiego przeciwciała Dreg 200 wynosi około 10⁸ M, zaś mysiego Dreg 200 około 109 m1

Poniższe przykłady, protokoły sekwencji, publikacje i figury wyjaśniają dalej wynalazek. Opisane procesy należy rozumieć jako przykładowe, nie zaś jako ograniczające, i również po modyfikacjach opisujące przedmiot wynalazku.

Przykład 1.

Zastosowanie przeciwciał przeciwko selektynie L w celu zmniejszenia pourazowej niewydolności narządów

Wykazano ochronne działanie humanizowanych przeciwciał przeciwko selektynie L (antyselektyna-L) w zmniejszaniu pourazowego uszkodzenia narządów, które zwykle występuje po urazie u pacjentów z ciężkim uszkodzeniem wielonarządowym. Jako przeciwciało zastosowano humanizowane przeciwciało przeciwko selektynie L (HuDreg 55). Reaguje ono również z selektyną L pawiana. Mysią postać tego przeciwciała opisano w Kis-himoto PNAS USA 87 (1990) 2244-2248. Humanizowaną sekwencję pokazano w Identyfikatorze Sekw. nr 1-4.

Przeciwciała HuDreg 55 i HuDreg 200 reagują z selektyną L na leukocytach ludzkich; jednakże jedynie HuDreg 55 reaguje z selektyną L na leukocytach pawiana. Tak wiec, zastosowano HuDreg 55. Ponieważ HuDreg 55 i HuDreg 200 wiążą się z ludzkimi leukocytami w tym samym zakresie stężeń (np. w analizie FACS), wpływ HuDreg 55 na pawiany jest prawdopodobnie równoważny z wpływem HuDreg 200.

Jako model, u pawianów wywołano ciężkie uszkodzenie tkanek z towarzyszącą hipowolemią (= utrata płynów albo krwi do wewnątrz i/lub na zewnątrz). Czysta utrata krwi z następującym wstrząsem (wstrząs krwotoczny) jest mniej istotny dla uszkodzenia płuc (Pretorius i in., J. Trauma 1987, 27:1344-1353; Schlag i in., str. 384-402, w Schlag, Redl: Patophysiology of Shock, Sepsis and Organ Failure, Springer Verlag, Berlin, 1993). Jest to zgodne z doświadczeniem klinicznym pokazującym, że powikłania płucne występują bardzo rzadko w czystym wstrząsie krwotocznym (Schlag i in., 1993, patrz wyżej).

W celu określenia częstości i ciężkości pourazowej niewydolności płuc, konieczna była obserwacja zwierząt (nazwanych SELEC 971, SELEC 979 (leczone) i Co 968, Co 969, Co 970 (kontrola)) w ciągu kilku dni; jednakże, ze względów etycznych, nie było możliwości wywołania złamania kości u przytomnych zwierząt i pozostawienie ich bez leczenia przez kilka dni, tak więc w tym modelu subchronicznym symulowane jest uszkodzenie tkanek. Aktywacja

187 090 układu dopełniacza wydaje się być najwcześniejszym wyzwalaczem dla aktywacji układów komórkowych i odgrywa rolę w gwałtownym wystąpieniu niebakteryjnej reakcji zapalnej organizmu (Schlag^i in., 1993, wyżej). Stąd, w modelu dopełniacz jest aktywowany przez czynnik jadu kobry. Śmiertelność uszkodzenia wielonarządowego po ciężkim urazie wynosi według literatury 15-30%. W niniejszym modelu zwierzęcym ciężkości uszkodzenia została zwiększona do stopnia, w którym śmiertelność była przynajmniej dwukrotnie wyższa i występowała wcześniej niż u ludzi. Stąd, okres obserwacji był ograniczony do trzech dni.

Dorosłe pawiany o ciężarze ciała (BW) między 18 i 22 kg włączono do badania po trzymiesięcznej kwarantannie. Zwierzęta na czczo uśpiono ketaminą (6-8 mg/kg), zaintubowano i podłączono do respiratora w trybie CPAP (ciągłe dodatnie ciśnienie w drogach oddechowych) (zawartość tlenu we wdychanym powietrzu = 25±2%). Znieczulenie utrzymywano podawaniem 1-3 mg/kg/godz. pentobarbitalu. Zwierzęta oddychały spontanicznie. Do tętnicy płucnej wprowadzono przez prawą żyłę udową cewnik Swan-Ganz'a. Cewnik do pobierania krwi i pomiaru ciśnienia wprowadzono do prawej tętnicy ramiennej. Do tętnicy udowej wprowadzono gruby cewnik do okresowego pobierania krwi. Cewnik do wlewów, podawania leków i pobierania krwi wprowadzono do lewej żyły ramiennej. Pęcherz cewnikowano w celu pomiaru wytwarzania moczu. Cewnik Swan-Ganz'a i cewnik tętniczy pozostawiono przez 3 dni. W celu utrzymania równowagi płynowej podczas fazy znieczulenia zwierzęta otrzymywały 5 ml/kg/godz. płynu Ringera (roztwór elektrolitów do pozajelitowej substytucji płynów). Temperaturę krwi zwierząt utrzymywano na poziomie > 37°C przy użyciu lamp podczerwonych. Przeprowadzano analizy gazów krwi (pC>2, pCC— pH, BE, HCO3') i oznaczano parametry hemodynamiczne (MAP, RAP, PAP, CO, HR).

Czynność płuc określano przy użyciu częstości oddechów (RR) i CO2 w końcowej fazie wydechu. Próbki krwi pobierano w celu pomiaru liczby krwinek białych (WBC). Czynnik z jadu kobry podawano w dawce 10 U/kg i.v. na początku retransfuzji i ponownie w dawce 5 U/kg w godzinę po rozpoczęciu retransfuzji krwi. Pobieranie krwi w celu wywołania hipowolemii regulowano w taki sposób, że MAP (średnie ciśnienie tętnicze) wynosiło pomiędzy 40 i 50 mm Hg, zaś CO (pojemność wyrzutowa serca) zmniejszała się do 50-70%. Zwykle pobierano w tym celu około 50 ml/kg krwi i przechowywano w celu retransfuzji. Upośledzone krążenie krwi utrzymywano przez dwie do trzech godzin, i kontrolowano w taki sposób, że zasób zasad wynosił nie więcej niż -5 do -7 mEq. Na zakończenie tej fazy wstrząsu, rozpoczynano retransfuzję uprzednio pobranej krwi. Faza ta trwała 4 godziny.

Retransfuzję uzupełniono dodatkowo podaniem roztworu Ringera. Humanizowane przeciwciało HuDreg 55 albo odpowiednią objętość roztworu soli, jako placebo, podawano dożylnie w 15 minut po rozpoczęciu retransfuzji. Przeciwciało przeciwko selektynie L podawano w dawce 2 mg/kg. Na zakończenie retransfuzji zwierzęta wyprowadzano ze znieczulenia i umieszczano w ich klatkach w celu obserwacji. W 24, 48 i 72 godziny wywoływano ponownie znieczulenie niewielkiego stopnia i rejestrowano parametry oraz pobierano krew. Jeżeli zwierzęta nie padły przed zakończeniem okresu obserwacji, zabijano je i poddawano sekcji. Głównymi punktami docelowymi badania były: śmiertelność, okres przeżycia i uszkodzenie narządów, przykładowo, płuc.

W pierwszym doświadczeniu, trzy zwierzęta kontrolne otrzymały placebo, zaś dwa roztwór humanizowanego przeciwciała HuDreg 55. Spośród trzech zwierząt kontrolnych, dwa padły przed zakończeniem trzydniowego okresu obserwacji, w 38 i 41 godzinie, podczas gdy oba zwierzęta leczone przeciwciałem przeciwko selektynie L przeżyły. Ciężar płuc, jako wyraz uszkodzenia płuc, był niemal normalny u zwierząt leczonych przeciwciałem (wartości normalne 7-8 g/kg BW), podczas gdy zwiększał się on znacznie u trzech zwierząt kontrolnych leczonych placebo (fig. 1). Spowodowane to było naciekaniem płynu po zaburzeniu przesączania. Parametry sercowo-naczyniowe CO2 i MAP (fig. 2 i 3) w 24 godzinie były lepsze u zwierząt przeżywających niż u zwierząt kontrolnych. Padłe zwierzęta kontrolne miały również ujemny zasób zasad krwi tętniczej (BE) co wskazuje na zaburzenia równowagi kwasowozasadowej (fig. 4). Leukocytoza (wzrost białych krwinek) obserwowana u zwierząt kontrolnych, nie występowała u zwierząt otrzymujących przeciwciała (fig. 5).

187 090

Przykład 2.

Zastosowanie przeciwciał przeciwko selektynie L w celu zmniejszenia śmiertelności pourazowej

Doświadczenia opisane w przykładzie 1, wyżej, kontynuowano i rozszerzono do 28 pawianów, które losowo przydzielono do jednej z dwóch grup doświadczalnych opisanych w przykładzie 1. Pawiany otrzymywały 2 mg/kg i.v. przeciwciała przeciwko selektynie L albo odpowiednią objętość-dawkę placebo, jako kontrolę w 15 minut po rozpoczęciu reperfuzji po okresie niedokrwienia. Głównym punktem końcowym doświadczenia do analizy statystycznej była śmiertelność pod koniec trzydniowego okresu obserwacji i czas przeżycia. Do analizy śmiertelności zastosowano test dokładny Fishera, zaś do analizy okresu przeżycia zastosowano logarytmiczny test rangowania. Zaobserwowano jednostronne wartości p (zmniejszenie śmiertelności albo przedłużenie okresu przeżycia przez aktywne leczenie). Hipoteza zerowa mogła być odrzucona jedynie gdyby prawdopodobieństwo (p) obliczonej statystyki wynosiło p<0,05.

Przeciwciało przeciwko selektynie L zmniejszało (p<0,05) śmiertelność z 10 spośród 14 (=71%) pawianów w grupie kontrolnej, do 3 spośród 14 (=21%) pawianów w grupie leczonej na poziomie istotności statystycznej. Oprócz tego, okres przeżycia w grupie leczonej przeciwciałem przeciwko selektynie L był wydłużony do 64,4 godzin, podczas gdy zwierzęta w grupie kontrolnej padały wcześniej (p<0,05), średnio po 42,1 godzinach. Różnica ta była istotna statystycznie.

W Tabeli podsumowano wyniki:

	Śmiertelność	Okres przeżycia (godz.)
Przeciwciało przeciwko selektynie L	3/14*	64,4±4, T
Kontrola - placebo	10/14	42,4±5, 7

Średnia ± błąd standardowy średniej; n = 14 w grupie;

*, p<0,05 w teście dokładnym Fishera;

+, p<0,05 w logarytmicznym teście rangowania;

Okres obserwacji wynosił 72 godziny.

Dane pokazują, że wczesne rozpoczęcie leczenia pawianów cierpiących na uszkodzenie wynikłe z niedokrwienia/reperfuzji z powodu wstrząsu krwotoczno-urazowego, przez podanie przeciwciał przeciwko selektynie L istotnie przedłuża czas przeżycia w porównaniu z kontrolą leczoną placebo.

Przykład 3.

Zastosowanie przeciwciała przeciwko selektynie L w celu zmniejszenia uszkodzenia narządów po zastosowaniu krążenia pozaustroj owego

Badano ochronne działanie humanizowanego przeciwciała przeciwko selektynie L, korzystnie HuDreg 55, w zmniejszaniu uszkodzenia narządów po krążeniu pozaustroj owym krwi, które zwykle występuje po długim okresie operowania w chirurgii serca z użyciem sztucznego płuco-serca.

Jako model, spowodowano ciężkie uszkodzenie płuc u pawianów przez włączenie ich krążenia do sztucznego płuco-serca na kilka godzin, które przejęło funkcje płuc i serca po zatrzymaniu krążenia. Po wyłączeniu maszyny, kiedy przywrócono akcję serca i wywołano własne krążenie i oddychanie, masywny naciek leukocytów w krążeniu płucnym spowodował ciężkie uszkodzenie płuc. Leukocyty obecne w krążeniu uwalniały miejscowo toksyczne mediatory w dużym stężeniu, co prowadziło do uszkodzenia śródbłonka, a w konsekwencji zwiększenie przepuszczalności. W procesie tym, płyn przenika z przestrzeni naczyniowej do pęcherzyków płucnych (najmniejszych pęcherzyków płucnych), co prowadzi do gromadzenia się płynu w płucach. Powoduje to zmniejszenie wymiany gazów w płucach i niezbędnym staje się prowadzenie sztucznego oddychania. Zapotrzebowanie na tlen zwiększa się wraz ze wzrostem zaburzenia wymiany gazów, i dalej nasila się przez transformację fibroproliferacyjną bariery

187 090 pęcherzykowo-śródbłonkowej. Tak więc, w szczególnie ciężkich przypadkach, stężenie wdychanego tlenu w drogach oddechowych, które zwykle wynosi około 20% musi być zwiększone do około 100%. Mimo to, w pewnych przypadkach, podawanie czystego tlenu jest niewystarczające do utrzymania stężenia tlenu w krwi tętniczej albo ciśnienia parcjalnego tlenu we krwi (paO2) na odpowiednim poziomie.

Proces transformacji fibroproliferacyjnej i obrzęk płuc powodują wzrost ciśnienia w tętnicy płucnej, co prowadzi do przeciążenia prawego serca. Jeżeli proces ten posuwa się dalej, prowadzi do śmierci z powodu niewydolności płucno-sercowej.

Dorosłe pawiany o ciężarze ciała (BW) między 18 i 22 kg włączono do badania po trzymiesięcznej kwarantannie. Zwierzęta na czczo uśpiono ketaminą (6-8 mg/kg), zaintubowano i podłączono do respiratora w trybie CPAP (ciągłe dodatnie ciśnienie w drogach oddechowych) (zawartość tlenu we wdychanym powietrzu = 25±2%). Znieczulenie utrzymywano podawaniem 1 -3 mg/kg/godz. pentobarbitalu. Zwierzęta oddychały spontanicznie. Do tętnicy płucnej wprowadzono przez prawą żyłę udową cewnik Swan-Ganz'a. Cewnik do pobierania krwi i pomiaru ciśnienia wprowadzono do prawej tętnicy ramiennej. Do tętnicy udowej wprowadzono gruby cewnik do okresowego pobierania krwi. Cewnik do wlewów, podawania leków i pobierania krwi wprowadzono do lewej żyły ramiennej. Pęcherz cewnikowano w celu pomiaru wytwarzania moczu. W celu utrzymania równowagi płynowej podczas fazy znieczulenia zwierzęta otrzymywały 5 ml/kg/godz. płynu Ringera. Temperaturę krwi zwierząt utrzymywano na poziomie > 37°C przy użyciu lamp podczerwonych. Przeprowadzano analizy gazów krwi (pC>2, pCO2, pH, BE, HCO3') i oznaczano parametry hemodynamiczne (MAP, RAP, PAP, CO, HR). Czynność płuc określano przy użyciu częstości oddechów (RR) i CO2 w końcowej fazie wydechu. Próbki krwi pobierano w celu pomiaru liczby krwinek białych (WBC).

Na początku doświadczenia, otworzono tchawicę (torakotomia) i wyłoniono żyłę główną i aortę. Następnie, kaniulowano najpierw żyłę główną, a następnie aortę w taki sposób, że krew wypływała z żyły głównej do sztucznego płuco-serca i wracała z powrotem do aorty. Pompa perystaltyczna zapewniała funkcję serca w sztucznym płuco-sercu i zapewniała gradient ciśnienia niezbędny do utrzymania krążenia. Wymianę tlenu i wiązanie dwutlenku węgla uzyskiwano przez oksyganację membranową. Krew heparynizowano aby zapobiec zatkaniu drenów i naczyń krwionośnych. Krew powracała do aorty układem drenów i rozprowadzana była w organizmie drogą układu naczyniowego.

Sztuczne płuco-serce przejmuje funkcje serca i płuc. Gdy maszyna pracuje, serce zatrzymywane jest aby chirurg mógł wykonywać, przykładowo, zabieg na zastawkach serca (wszczepianie sztucznych zastawek).

Piętnaście minut przed zakończeniem czterogodzinnego krążenia pozaustroj owego, bezpośrednio do układu drenów sztucznego płuco-serca podawano placebo albo dawkę 2 mg/kg HuDreg 55. Zwierzęta poddawano obserwacji przez dalsze 4 godziny po zakończeniu krążenia pozaustrojowego. Pomiary przeprowadzano kolejno przed, w trakcie i po zakończeniu krążenia pozaustroj owego. W szczególności, rejestrowano parametry gazów krwi tętniczej i równowagi kwasowo-zasadowej i oznaczano parametry sercowo-naczyniowe takie jak średnie ciśnienie krwi tętniczej, ciśnienie w prawym przedsionku, ciśnienie w tętnicy płucnej, objętość wyrzutową serca i częstość pracy serca, parametry płuc (np. CO2 w powietrzu wydychanym) oraz pobierano próbki krwi do badań hematologicznych, kliniczno-chemicznych (np. czynność nerek i wątroby) oraz biochemicznych. Oprócz tego, mierzono wytwarzanie moczu (czynność nerek). Dalej, określano parametry zaburzeń przesączania do płuc. Na zakończenie doświadczenia, zwierzęta zabito i przeprowadzono sekcję oraz badanie histologiczne w celu określenia stopnia uszkodzenia różnych narządów i układów, takich jak serce, płuca, wątroba, nerki, jelita, OUN, krew itp. Oczekuje się, że zwierzęta leczone HuDreg 55 doznają mniejszego uszkodzenia narządów niż zwierzęta leczone placebo.

187 090

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(^ZGŁASZAJĄCY: Martin, Ulrich i in.

(ii) TYTUŁ WYNTJAZKU: Przeciwci air pcieciasalertynowedo zapobiegania niewydolności wiodonartądowoj spowodowanej prtot uetkodtonio wiolonartądowo i do tapobiogania oetromu uetkodtoniu nartądowomu epowodowanomu taetoeowaniom krążonia potauetrojowego.

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 4 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRES: Folfto & Lynch

Attn: Norman D. Haneon (B) ULICA: 805 Third Avonuo (C) MIASTO: Nowy York (D) STAN: Nowy York (E) KRAJ: U.S.A.

(F) KOD: 10022 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: dyekiotka komputorow 3,5 (B) KOMPUTER: IBM PC compatible (C) SYSTEM OPERACYJNY:: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: ASCII (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA: 20-GRUDZIEŃ-1995 (C) KLASYFIKACJA: 530 (vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: EP 95 112 895.8 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 17-SIERPIEŃ-1995 (A) NUMER ZGŁOSZENIA: EP 95 114 969.9 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 19-WRZESIEŃ-1995 (A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08 578 953 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 27-GRUDZIEŃ-1995 (viii) DANE DOTYCZĄCE RZECZNIKA PATENTOWEGO (A) NAZWA: Haneon Norman (B) NUMER REJESTRACYJNY: 30, 946 (C) NUMER SPRAWY: BOER 1059-PFF/NDH (ix) IIN^(^]RM^C^,J3 TELEKOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFON: (212) 688-9200 (B) TELEFAX: (212) 838-3884

187 090 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIIATTOA. SEWENCII NR:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 654 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa

	(ii)	ODCAAJ CZĄSEECZI::	cNAA
	(ix)	CECHA:
		(A) NADWA/KLUCC: CDS
		(B) LOKALICACCA: 1	. . 654
	(xi)	OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:
GAC ATT CAG	ATG	ACC CAA TCT CCG AGC	TCT TTG TCT GCG TCT GTA GGG 08
Asp Ile Gln	Met	Thr Gln Ser Pro Ser	Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1		S	10 15
GAT AGG GTC	ACT	ATC ACC TGC AAG GCC	AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT 96
Asp Arg Val	Thr	lle Thr Cys Lys Ala	Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
	20	2 5	30
GGT GAT AGT	TAT	ATG AAC TGG TAC CAA	CAGG AAA CCA GGA 51AG GCCA CCC 114
Gly Asp Ser	Tyr	Met Asn Trp Tyr Gln	Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35		40	45
AAG CTT CTC	ATC	TAT GCT GCA TCC AAC	CTA GAA TCT GGT ATC CCA TCC 192
Lys Leu Leu	Ile	Tyr Ala Ala Ser Asn	Leu Glu Ser Gly lle Pro Ser
50		55	60
AGG TTT AGT	GGC	AGT GGG TCT GGG ACA	GAC TTC ACC CTC ACC ATC TCT 200
Arg Phe Ser	Gly	Ser Gly Ser Gly Thr	Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser
65		70	75 80
TCT CTG CAG	CCG	GAG GAT TTC GCA ACC	TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT 288
Ser Leu Gln	Pro	Glu Asp Phe Ala Thr	Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
		85	90 95
GAA GAT CCG	TGG	ACG TTC GGT CAA GGC	ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGA 336
Glu Asp Pro	Trp	Thr Phe Gly Gln Gly	Thr Lys Val Glu lle Lys Arg
	100	105	111
ACT GTG GCT	GCA	CCA TCT GTC TTC ATC	TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG 380
Thr Val Ala	Ala	Pro Ser Val Phe lle	Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115		120	122
TTG AAA TCT	GGA	ACT GCC TCT GTT GTG	TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT 032
Leu Lys Ser	Gly	Thr Ala Ser Val Val	Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130		135	110

187 090

CCC Pro 145

AGA GAG

GCC AAA

GTA (CCG TGG

CAAG GTG

GAT aac CCsp Asn 155

GCC Ala

CTC CCCC Leu Gln

TCG Ser 160

480

Arg

Glu

Al :a

Lys

Val ISO

Gln Τη?

Lys

Val

GGT

AAC

TCC

CAG

AGT

GTC

AGA

GAG

ccc;

GAC

AGC

cacc

GAC

AGC

ACC

528

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Vcp

Cer

Lys

CAp

Ser

Thr

165

170

175

TAC

AGC

CTC

AGC

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

ccc:

gcc:

GAC

TGC

CAG

ccc:

576

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Lee

VSe

Cys

CAL u

CA 13

iGy

Clu

Ces

180

185

190

CAC

AAA

GTC

tac:

gcc

TGC

GJAA

GTC

ACC

ccc

ccc

CGl

CCG

aac

CGG

CCC

624

His

Lys

Val

Tyx

OALa

Ctys

Glu

Vva

VTh

VHi

Glu

Cly

Ceu

CSe

Sss

Sro

195

200

205

GTC

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

llA

GAG

TlT

65 -i

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

lly

llu

Cys

210

215

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2:

(i) CffiARAKTERYSTYIKA SEjEKWSNCAI :

(A) DŁUGOŚĆ: 218 (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJCZĄSTCCZKI: białOo

	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	IDENTYFIKATOR SEKW.	NR: 2:
Asp 1	Ile Gln Met	Thr Gln Ser Pru 5	Ser Los Osu cer A1s 10	0sr Val Tir 15
Asp	Arg Vai Thr 20	Ile Thr Cys Lts	Ala Ssc GLy Ser TaS 25	Osp Tyr Tic 30
Gly	Asp Sru Cyr 35	Met: Asn Tt lys 40	Gln Gln Lyy Cro U1c 45	lVs Ala Sss
Lys	Leu Llu Cle 50	TyrAla tyLa Ser 55	Asn Leu GSu Cer Gly 60	IVe Pro lis
Arg 65	Phe Ser Gly	Ser Gly Ser GSu 7S	Chr Asp OCe Thr sec 7V	Tho SiT 80
Ser	Leu Gln Pro	Glu Asp Phe APa 85	Chr Tyr Tyr Cys GOv 90	GTs Sss TlG 95
Glu	Asp Pro Trp 100	Thr Phe Gly Gln	Gly Ghr Lys Val Glu 105	Ile Lys Aog 110

187 090

Thr

Val Ala 115

Aia

Pro

Ser

Val

Phe 120

Ile

hhe

Pro

Pro

Ssr 111

SAsp

Glu Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

SAn

Asn

Phe

Tyr

130

135

110

Pro

Arg

Glu

Aia

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

Ser

545

10S

15S

160

Gly

Asn

Seir

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

165

170

175

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Tłus

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

180

185

110

His

Lys

Val

Tyr

SAu

Cys

Glu

vva

Thr

His

Gin

Gly

Llu

Ssr

Ssr

Pro

195

210

215

Val

Thr

Lys

Ssr

Phe;

SAn

SArg

Gly

Siu

Cys

210 215 (2) LFFORMCCJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:3:

(i) CiNUKNTCERYSTSAOISEIDEKSCJC i (A) DŁUGOŚĆ: 1329 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ :CDS (B) LOKALIZACJA: 1..1329 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ :matiPeptide (B) LOKALIZACJA: 1 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDDNAYFIEKAON SDEW. NO: 3:

GAA Glu 1

GTG Val

ety ccg

GTG Val 5

GAG TCT Gin; TGG GGG TTA GTG

CAG Gln

CCT GGA

GGA Gly

48

Gln

neu

Giu

Ssu

Gly

Gil

Tiy 10

Leu

Val

Pro

Gly 15

AGC

TTG

AGA

ACG

TCC

TTG

tgc.

TGC

TGT

TGG

SGC

ACT

GGC

AGT

ACC

TAT

96

Ser

Leu

Arg

gLu

Ser

Ccs

SAu

SAu

Ssr

Gil

Phe

Thr

Phe

Ser

Tler

Tyr

10

15

30

Gyy

ATG

TCT

ggg

ggg

CGC

CAG

GCT

CCAS

GGG

JAG

GGAS

CTC

GAG

TGG

GTC

144

Ala

Met

Ssr

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Giu

Tip

Vvl

35

40

45

187 090

GCA TCC ATT AGT ACT GGT GGT AGC

ACC Thr

TAC Tyr

TAT Tyr

CCC P ro 60

GAC Asp

AGT GTG Ser Val

CAAG Lys

102

Ala Ser Ile 50

Ser Thr Gly Gly Ser 55

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

ACA

GAT

AAT

GCC

AAG

AAC

ACC

CTG

TAC

CTG

240

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

iyr

Leu

65

70

70

88

CAA

ATG

AAT

TCT

CTG

AGG

GCT

GAG

GAC

ACG

GCC

GTG

TJAT

TAC

TGT

GOCA

280

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Al Al

Val

pTso

TTyr

ccs

CA a

85

0 0

95

AGA

GAC

TAT

GAC

GGG

TAT

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

COCA

AGSC

ACC

CCT

CTC

036

Arg

Asp

Tyr

Asp

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

G On

Gly

Tt^r

Ceu

OlA

100

10S

m

ACA

GTC

TCC

TCA

GCT

TCC

ACC

AAG

GGC

CCA

Tcc

GOG

CTC

CCC

CCT

CGC

084

Thr

VaP

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

See

Vol

Pile

Ppo

Ceu

CAP

115

110

125

CCC

TGC

TCC

AGG

AGC

ACC

TCC

GAG

AGC

ACA

GCC

GCG

CCT

C^G

CCT

CCT

032

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala.

AOa

Aeu

OGp

Ccs

Leu

130

135

140

GTC

AAG

GAC

TAC

TTC

CCC

GAA

CCG

GTG

ACG

GTG

TCG

TGG

AAC

TCCA

CTC

48 0

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Tir?

Asn

Ser

Gly

145

150

155

110

GCC

CTG

ACC

AGC

GGC

GTG

CAC

ACC

TTC

CCG

GCT

GTC

CTA

(CAG

TCC

TCCA

552

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Ser

165

170

115

GGA

CTC

TAC

TCC

CTC

AGC

AGC

GTG

GTG

ACC

GTG

CCC

TCC

AGC

AGC

TTG

556

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Leu

180

118

110

GGC

ACG

AAG

ACC

TAC

ACC

TGC

AAC

GTA

GAT

CAC

AAG

CCC

AGC

CAAC

ACC

604

Gly

Thr

Lys

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

Lys;

Pro

Ser

CAn

TlhV

195

220

220

AAG

GTG

GAC

AAG

AGA

GTT

GAG

TCC

AAA

TAT

GGT

CCC

CCCA

TT^C

CCCA

TCCA

600

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Ser

Lys

Tyr

Gly

Pro

Ppo

Ccs

Opo

Oeu

210

211

222

TGC

CCA

GCA

CCT

GAG

TTC

CTG

GGG

GGA

CCA

TCA

GTC

CTC

CCG

CTT

CCC

002

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Phe

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

PPh

Ceu

CPh

Opo

225

220

220

224

CCA .

AAA

CCC

AAA

GAC

ACT

CTC

ATG

ATC

TCC

CGG

ACC

CCT

GAG

GTC

ACG

700

Pro

Lys

Pro

Lls

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

0trg

Tho

Poo

Glu

Val

Thr

24S

220

225

187 090

TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAG GATT GAC CCC GAG

GTC (CS

ATC

;α^τ: ATs

816

Cys Val Val

Val 260

Asp Vil

Ser Gln Glu CSsp 265

Pro Glu

Val

GGu 270

TGG

TAC

GTG

GAT

GGC

GGT

AGA

AGT

AAT

;tst

GCC

gst;

ACC.

ATS

ACC

ACG

A64

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

via

GGu

Ali

Ais

Arn

Ala

Lys

nr

Lls

APr

Ast

275

280

285

GAG

GAG

CAG

TTC

AAC

ATG

AAC

ATS

ACG

AGT

GTC

AGC

GGT

ACT

ATC

AGT

Glu

Glu

Gln

Phe

Ars

SSe

GTh

ATT

Arg

Av1

Vii

SSr

Vii

Aee

ATh

AVi

290

29S

300

CTG

CAC

CAG

GAC

TGG

CTG

SSC

GGC

ATG

GAG

TTC

TAG

TGC

ATG

GTC

TCC

960

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

305

310

315

330

AAC

AAA

GGC

CTC

CCG

TCC

TCC

ATC

GAG

ATS

TCC

ATC

TCC

TTA

GCC

ATA

0008

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ser

Ser

lie

Glu

Lys

Thr

lie

Ser

Lys

Tli

Lys

325

330

333

GGG

CAG

CCC

CGA

GAG

CCA

CAG

GTG

TAC

TCC

CTG

CCC

CCS

TCC

CAG

GAG

0056

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Gln

Glu

340

345

335

GAG

ATG

ACC

AAG

AAC

CAG

GTC

AGC

CTG

TCC

TGC

CTG

GTC

ATA

GGC

TTC

0104

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

355

360

365

TAC

CCC

AGC

GAC

ATC

GCC

GTG

GAG

TGG

GAG

TGC

ATT

GGG

CAG

CCG

GAG

H52

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

370

377

338

AAC

AAC

TAC

AAG

ACC

ACG

CCT

CCC

GTG

CTG

GTC

TCC

GTC

GGC

TCC

TTC

0200

Asn

Asn

Tyg

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Vil

Leu

Tsp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

385

399

339

400

TTC

CTC

TAC

AGC

AGG

CTA

ACC

GTG

GTC

TAG

TGC

MG

TGG

CTG

GAG

GGG

0248

Phe

Leu

Tyr

Ser

Arg

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gln

Glu

Gly

405

410

440

AAT

GTC

TTC

TCA

TGC

TCC

GTG

ATG

CTT

GTG

GCT

CTG

CAC

ATC

CTC

TAC

0296

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Vil

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyg

420

425

433

ACA

CAG

AAG

AGC

CTC

TCC

CTG

TCT

CTG

GGT

TAA

H29

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Leu

Gly

Lys

435

440

187 090 (2) INNOiRMAJA KIA IDENTYFIKATORA lEKWWNCJI INR: l :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 443 (B) TYP: aminokwae (C) NICTOWOŚĆ: pojodyncta (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) ODDAJ:· CZATE^Z^ : bisłko (xi) OPIS SEKWENCJI: DEKNTYFDKATOA SEKW. NR: 4:

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Ser Ile S Sr Thr Gly Gly Ser Tir Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe TTh Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu TTyr Leu

70 775 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys AAl

90 95

Arg Asp Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Tir Leu Val 100 110 111

Thr Val Ser Ser ALa Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Ppo Leu Ala 115 122 112

Pro Cys Ser Arg Ser Tir: Ser Glu Seo Thr ALa ALa Leu Gil Gys Leu 130 135 110

Val Lys Asp Tyr Phe Ppo Glu Pro Val T!r Val Ser Trp: Asn Seo 105 115 115 116

Ala Leu Thr See Gly Vv1 His Tho Phe Pro AAl Val Leu Gln Ser See

165 110 115

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser SSe Val Val TTr Val Pro Ser Ser SSe Leu 100 110 115

Gly Thr Lys Thr Tyr Tho Cys Asn Val Asp His Lys Ppo SSe Ssn Tthr 155 200 220

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser 210 215 220

187 090

Cys 225

Pro

Ala

Pro Glu

Phe 230

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser 23T

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 220

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Tłhr

Leu

Met

IlT

Ser

.Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Tłu:

245

250

255

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

Gln

Glu

Aisp

Pro

Glu

Val

Gln

Phe

Asn

260

2^^T

270

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

AUa

Lys

Thr

Lys

Ppo

AAg

275

280

285

Glu

Glu

Gln

Phe

Asn

Ser

TłU

łyo

Arg

Val

Val

Ser

Val

Llu

TTh

Taa

290

295

300

Leu

His

Gln

Asp

Tpt

Leu

Asn

Gly

LsS^S

Glu

yo·

Lys

cys

Lys

Val

Ser

305

31T

31T

320

Asn

Lys

Gly

Leu

Pot

Ser

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

325

330

335

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr·

Thr

Leu

Pro

Pro

Srr

Gln

Glu

340

345

350

Glu

Mee

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Luu

Thr

(Cys

Leu

VaT

Lys

Gly

Phe

355

360

355

Tyr

Pro

T sr

TAp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gln

Ppo

Glu

370

375

380

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Tinr

Pro

Pro

Val

Leu

ASp

Ser

ASp

Gly

Ser

Phe

385

330

335

400

Phe

Leu

Tyr

Ser

AAg

Leu

Thr

Val

ASp

LyT

Ser

Arg

Tig

Gln

GIu

Gly

405

410

415

Asn

Val

Phh

Ter

cys

Ser

Val

MmT

His

Glu

AAa

Leu

His

Asn

Tii

Tyr

420

425

433

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440

187 090

FIG. 2

CN tx.

•’Τ ro ro

CN ro

LO

CN

CN θ'

CC ro

CC

LO

CN

CC

CN

CC

LO cc cc o

cc

- CN

LO

Czas (godz.

187 090

FIG. 3

CM r\

OY •'T co cc cc

CM cc

LC

CM

PCM •’Τ

Cć cc

Q£

UO

CM

Ctż

CM

C£

LC

C£

C£

CM

UC

OJ0 r

E ε

Czas (godz.

I

187 090

FIG.4

σ

LU ε

cn r\

Ναό

Ν’ ro ro

CN ro

LO

CN

Ν’

CN

Ν’

CC ro

CC

LO

CN

CC

CN

CC

LO

CC

CC

O cc

CN

LO

O

Czas (godz.

i

187 090

LO ό

CM

Γ\

ΟΥ τ

τ

CC

CC

CM cc

UC

CM

TT

CM

TT

CZ

CC cz uc

CM cz

CM

CZ uc

CZ cz o

cz

CM uc

O

Sr

Czas (godz.

I

187 090

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania czynnika farmaceutycznego, do leczenia pacjenta, który doznał urazu wielonarządowego, znamienny tym, że terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała przeciwko selektynie włącza się do farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że włącza się przeciwciała przeciwko L-selektynie.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że przeciwciało przeciwko selektynie jest przeciwciałem humanizowanym.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że humanizowane przeciwciało jest przeciwciałem HuDreg 55 lub HuDreg 200 przeciwko L-selektynie.
5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że do farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika włącza się ilość przeciwciała przeciwko selektynie do podawania od 1 do 5 razy po doznaniu urazu wielonarządowego zawierającą się od 1,0 - 10 mg/kg masy ciała pacjenta.
6. 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że włącza się przeciwciało przeciwko selektynie w ilości wyliczonej do podawania w przedziale czasowym do 8 godzin po doznaniu urazu wielonarządowego.
7. 7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że dawkę przeciwciała przeciwko selektynie włączonego do farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika ustala się przez stężenie przeciwciał przeciwko selektynie w surowicy lub osoczu pacjenta w przedziałach od 6 do 24 godzin po podaniu poprzedniej dawki, przy czym kiedy

   a) stężenie przeciwciał przeciwko selektynie jest mniejsze niż 10 pm/ml surowicy lub osocza tego pacjenta, włącza się dawkę przynajmniej tak wysoką jak poprzednia lub, kiedy

   b) stężenie przeciwciał przeciwko selektynie wynosi od 10 pm/ml do 50 pm/ml surowicy lub osocza tego pacjenta, włącza się dawkę wynosząca połowę poprzedniej dawki.