PL187408B1

PL187408B1 - Osteoprotegeryna-OPG oraz jej multimery, kwas nukleinowy kodujący polipeptyd mający co najmniej jedną z aktywności biologicznych osteoprotegeryny, wektor ekspresji obejmujący taki kwas nukleinowy, komórka-gospodarz transformowana lub transfekowana wektorem ekspresji obejmującym taki kwas nukleinowyoraz transgeniczny ssak nie-człowiek z takim kwasem nukleinowym, sposób wytwarzania OPG na drodze biotechnologicznej, przeciwciało lub część przeciwciała, które specyficznie wiąże się z OPG, sposób wykrywania obecności OPG w próbkach biologicznych, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie polipeptydu obejmującego OPG i

Info

Publication number: PL187408B1
Application number: PL96321938A
Authority: PL
Inventors: William J Boyle; David L Lacey; Frank J Calzone; Ming-Shi Chang
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2004-07-30
Also published as: GB2312899B; KR100463584B1; CZ253897A3; AU1468697A; CA2210467C; NZ326579A; TR199601036A3; ES2316152T3; EE04643B1; HUP9801122A3; YU69196A; EP0784093B1; EP2332974A3; CN1182452A; AU710587B2; DK0784093T3; IL121520A; PL321938A1; ATE409745T1; GB2312899A

Abstract

1. W yodrebniony kwas nukleinowy kodujacy polipeptyd majacy, co najmniej jedna z aktywnosci biologicznych OPG, wybrany z grupy obejmujacej: a) kwasy nukleinowe przedstawione na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO:124) lub ich kom plem en- tarne nici; b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzuja w scislych warunkach z obszarem kodu- jacym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124), c) kwasy nukleinowe, które hybrydyzuja w scislych warunkach z nukleotydami od 148 do 337 wlacznie, jak na rysunku fig. 1 A; oraz d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskaza- nych w punktach (a), (b) i (c), przy czym scisle warunki hybrydyzacji to: 5xSSC, 50% formamid i tem peratura 42°C lub warunki im równowazne. PL PL PL PL PL

Description

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy w ogólności polipeptydów związanych z regulacją metabolizmu kości. W szczególności, wynalazek dotyczy nowego polipeptydu, zwanego osteoprotegeryna, który należy do superrodziny receptora czynnika martwicy nowotworów (TNFR). Polipeptyd jest stosowany do leczenia chorób kości cechujących się zwiększoną utratą kości, takich jak osteoporoza. Wynalazek obejmuje także multimery osteoprotegeryny, kwas nukleinowy kodujący polipeptyd mający co najmniej jedną z aktywności biologicznych osteoprotegeryny, wektor ekspresji obejmujący taki kwas nukleinowy, komórkę-gospodarza transformowaną lub transfekowaną wektorem ekspresji obejmującym kwas nukleinowy, kodujący polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG, transgenicznego ssaka nie-człowieka, z kwasem nukleinowym, kodującym polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG, sposób wytwarzania OPG na drodze biotechnologicznej, przeciwciało lub część przeciwciała, które specyficznie wiąże się z OPQ sposób wykrywania obecności OPG w próbkach biologicznych, kompozycję farmaceutyczną oraz zastosowanie polipeptydu obejmującego OPG i oraz kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd obejmujący OPG.

Stan techniki

Polipeptydowe czynniki wzrostu i cytokiny są wydzielanymi czynnikami sygnalizującymi szeroki zakres zmian wzrostu komórki, różnicowania i metabolizmu, przez specyficzne wiązanie do dyskretnych receptorów związanych z powierzchnią. Jako klasa protein, receptory różnią się co do budowy i trybu przetwarzania sygnałów. Charakteryzują się one występowaniem pozakomórkowej domeny zaangażowanej we wiązanie ligandu i domeny cytoplazmowej transmitującej odpowiedni sygnał wewnątrzkomórkowy'. Schematy ekspresji receptorów ostatecznie określają, które komórki będą odpowiadać na dany ligand, podczas gdy budowa danego receptora dyktuje odpowiedź komórkową indukowaną przez wiązanie ligandu.

187 408

Wykazano, że receptory transmitują sygnały wewnątrzkomórkowe przez ich domeny cytoplazmowe poprzez aktywowanie tyrozyny w proteinie, lub fosforylację seryny/treoniny w proteinie (np. receptor czynnika wzrostu pochodzącego z płytek krwi (PDGFR) lub przekształcenie receptora-I czynnika wzrostu β (TGFβR-I), przez stymulowanie aktywacji proteiny G (np., receptora β-adrenergicznego) i przez modulowanie asocjacji z proteinami przetwarzającymi sygnał cytoplazmowy (np. TNFR-1 i Fas/APO) (Heldin, Cell 80, 213-223, (1995)).

Superrodzina receptora czynnika martwicy nowotworów (TNFR) jest grupą protein transbłonowych typu I posiadających zachowany motyw bogaty w cysteinę powtarzany trzy do sześciu razy w domenie pozakomórkowej (Smith, et al. Cell 76, 953-962 (1994)). Zbiorczo, te powtarzające się jednostki tworzą domeny wiążące ligandy tych receptorów (Chen et al., Chemistry 270, 2874-2878 (1995)). Ligandami dla tych receptorów jest strukturalnie związana grupa protein homologicznych z TNFa (Coeddel et al. Cold Spring Harbor Symp. Quart. Biol. 51, 597-609 (1986); Nagata et al. Science 267, 1449-1456 (1995)). TNFα wiąże się z różnymi, lecz ściśle związanymi receptorami, TNFR-1 i TNFR-2. TNFa wytwarza wiele reakcji biologicznych w komórkach zawierających receptory, włączając w to proliferację, różnicowanie, cytotoksyczność i apoptozę (Beutler et al. Ann. Rev. Biochem. 57, 505-518 (1988)).

Uważa się, ze TNFa pośredniczy w ostrych i chronicznych reakcjach zapalnych (Beutler et al. Ann. Rev. Biochem. 57, 505-508 (1988)). Ogólnoustrojowe podawanie TNFa wywołuje szok toksyczny i rozległą martwicę tkanek. Wskutek tego, TNFa może być odpowiedzialny za poważne pogorszenia i śmiertelność związaną z rozmaitymi chorobami zakaźnymi, włączając w to posocznicę. Mutacje w FasL, ligandzie pokrewnego TNFR receptora Fas/Aro (Suda et al. Celi 75, 1169-1178 (1993)), są związane z autoimmunizacją (Fisher i in. Cell 81, 935-946 (1995)), podczas gdy nadprodukcja FasL może być związana z żółtaczką polekową. Zatem, ligandy odpowiadające rozmaitym białkom pokrewnym TNFR często pośredniczą w poważnych skutkach wielu stanów chorobowych, co sugeruje że czynniki, które neutralizują aktywność tych ligandów miałyby wartość terapeutyczną. Rozpuszczalne receptory TNFR-1 i przeciwciała, które wiążą TNFa, zbadano pod względem ich zdolności do neutralizowania obecnego w ustroju TNFa (Loetscher i in. Cancer Cells 3(6), 221-226 (1991)). Naturalnie występującą formę mRNA wydzielanego TNFR-1 ostatnio sklonowano i produkt zbadano na zdolność do neutralizacji aktywności TNFa in vitro i in vivo (Kohno i in., PNAS USA 87, 8331-8335 (1990)). Zdolność tej proteiny do neutralizowania TNFa sugeruje, że rozpuszczalne receptory TNF wiążą i usuwają TNF, tym samym blokując wpływ cytotoksyczny na komórki będące nośnikiem TNFR.

Celem wynalazku jest zidentyfikowanie nowych członów superrodziny TNFR. Przewiduje się, że nowe człony rodziny mogą być transbłonowymi proteinami lub ich rozpuszczalnymi formami obejmującymi pozakomórkowe domeny i pozbawionymi domen transbłonowych i cytoplazmowych. Zidentyfikowaliśmy nowy człon superrodziny TNFR, który koduje wydzielaną proteinę, ściśle pokrewną w stosunku do TNFR-2. Przez analogię do rozpuszczalnego TNFR-1, proteina pokrewna TNFR-2 może negatywnie regulować aktywność jej ligandu, a zatem może być przydatna w leczeniu pewnych chorób u ludzi.

Istota wynalazku

Zidentyfikowano nowy człon superrodziny receptora czynnika martwicy nowotworów (TNFR) z biblioteki cDNA jelit płodu szczura. Otrzymano i zsekwencjonowano pełnej długości klon cDNA. Ekspresja cDNA szczura u transgenicznej myszy ujawniła widoczny wzrost gęstości kości, zwłaszcza kości długich, kości miednicy i kręgów. Polipeptyd kodowany przez cDNA został określony terminem osteprotegeryna (OPG) i odgrywa rolę w promowaniu akumulacji kości.

Wynalazek zapewnia kwasy nukleinowe kodujące polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG. Są również zapewnione kwasy nukleinowe, które hybrydyzują do kwasów nukleinowych kodujących mysi, szczurzy lub ludzki OPG jak podano na fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO:122), i 9C-9D (SEQ ID NO:124). Korzystnie, OPG jest otrzymana z organizmu ssaka, a bardziej korzystnie jest ludzką OPG Wektory rekombinacyjne i komórki gospodarza ekspresjonujące OPG są również zapewnione, podobnie

187 408 jak sposoby wytwarzania rekombinacyjnej OPG Przeciwciała lub ich fragmenty, które specyficznie wiążą polipeptyd są również ujawnione.

Wynalazek obejmuje także zastosowania OPG i kwasów nukleinowych kodujących OPG do wytwarzania środków leczniczych. Polipeptydy według wynalazku są przydatne w zapobieganiu resorpcji kości i mogą być stosowane do leczenia każdego stanu powodującego utratę kości, takiego jak osteoporoza, hiperkalcemia, choroba Pageta kości i utrata kości wskutek reumatoidalnego zapalenia stawów lub zapalenia szpiku itp. Choroby kości można także leczyć terapią antysensowną lub genową stosując kwasy nukleinowe według wynalazku. Wynalazek obejmuje także farmaceutyczne kompozycje zawierające kwasy nukleinowe i polipeptydy OPG

Wynalazek obejmuje wyodrębniony kwas nukleinowy kodujący polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG, wybrany z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe przedstawione na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO:124) lub ich komplementarne nici;

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

c) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z nukleotydami od 148 do 337 włącznie, jak na rysunku fig. 1 A; oraz

d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskazanych w punktach (a), (b) i (c), przy czym ścisłe warunki hybrydyzacji to: 5xSSC, 50% formamid i temperatura 42°C lub warunki im równoważne.

Wskazanym kwasem nukleinowym jest korzystnie cDNA, genomiczny DNA, syntetyczny DNA lub RNA.

Korzystnie, powyższy kwas nukleinowy obejmuje jeden lub więcej znanych kodonów korzystnych do ekspresji przez Escherichia coli.

Korzystnie powyższy kwas nukleinowy ma przyłączony wykrywalny znacznik, taki jak znacznik enzymatyczny, fluorescencyjny, przejawiający powinowactwo lub izotopowy, zwłaszcza znacznik radioaktywny, taki jak ³²P lub ³H.

Kwas nukleinowy obejmuje obszar kodujący polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122) lub fig. 9C-D (SEQ ID NO: 124).

Korzystnie, kwas nukleinowy obejmuje sekwencję jak na rysunku fig. 9C-D (SEQ ID NO:124) z nukleotydów 158-1297.

Wynalazek obejmuje także polipeptyd kodowany kwasem nukleinowym, kodującym polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG, wybranym z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe przedstawione na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124) lub ich komplementarne nici;

c) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z nukleotydami od 148 do 337 włącznie, jak na rysunku fig. 1A; oraz

Wynalazek dotyczy także wektora ekspresji obejmującego kwas nukleinowy kodujący polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG wybrany z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe owedstawione na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120): fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124) lub ich komplementarne nici;

187 408

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO:120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

W korzystnym wektorze ekspresji według wynalazku kwas nukleinowy obejmuje obszar kodujący polipeptyd jak na rysunku fig. 9C-D (SEQ ID NO:124).

Wynalazek dotyczy również komórki-gospodarza transformowanej lub transfekowanej wektorem ekspresji obejmującym kwas nukleinowy, kodujący polipeptyd mający, co najmniej jednąz aktywności biologicznych OPG, wybrany z grupy obejmującej:

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO:120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

Korzystnie komórka-gospodarz według wynalazku jest komórką eukariotyczną, w szczególności wybraną z grupy obejmującej komórki CHO, COS, 293, 3T3, CV-1 i BHK.

Alternatywnie, komórka-gospodarz według wynalazku jest komórką prokariotyczną, w szczególności Escherichia coli.

Wynalazkiem objęty jest również transgeniczny ssak nie-człowiek, z kwasem nukleinowym, kodującym polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG, wybranym z grupy obejmującej:

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ED NO: 122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskazanych w punktach (a), (b) i (c), zintegrowanym z jego genomem i funkcjonalnie związanym z elementami kontroli ekspresji polipeptydu kodowanego przez ten kwas nukleinowy, przy czym w wyniku regulowanej ekspresji tego polipeptydu poziom OPG oraz gęstość kości ssaka transgenicznego są zwiększone w porównaniu z poziomem OPG i gęstością kości takiego samego ssaka nietransgenicznego.

Korzystnie, transgeniczny ssak według wynalazku jest gryzoniem, w szczególności myszą.

Sposób wytwarzania OPG na drodze biotechnologicznej, według wynalazku polega na tym, że w odpowiednich pożywkach prowadzi się hodowlę komórek gospodarzy transformowanych lub transfekowanych kwasem nukleinowym, kodującym polipeptyd mający, co najmniej jednąz aktywności biologicznych OPG, wybranym z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe owedstawione na rysunrach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO:124) lub ich komplementarne sici;

187 408

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzująw ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO:120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskazanych w punktach (a), (b) i (c), a następnie wyodrębnia się polipeptydowe produkty ekspresji tych kwasów nukleinowych i ewentualnie oczyszcza się polipeptyd obejmujący OPG

Wynalazek obejmuje oczyszczony i wyodrębniony polipeptyd obejmujący OPQ przejawiający aktywność w zakresie podwyższania gęstości kości lub hamowania resorpcji kości, obejmujący sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej jedną lub więcej spośród następujących sekwencji:

a) sekwencja aminokwasów pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No: 1121), fig. 9A-9B (SEQ ID No: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No:125),

b) sekwencja aminokwasów posiadająca co najmniej 85% zbieżności (identyczności) z sekwencją aminokwasów określoną w pkt. a) i pokazaną na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No:121), fig. 9A-9B (SEQ ID No:123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No:125),

c) sekwencja aminokwasów stanowiąca fragment sekwencji zdefiniowanych w pkt. a) lub b).

Korzystnie, polipeptyd według wynalazku jest OPG pochodzącą od ssaka, w szczególności ludzką OPG zwłaszcza mającą sekwencję aminokwasową jak pokazano na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) lub jego pochodna, a korzystnie sekwencję aminokwasową jak pokazano na rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) z reszt 22-401 włącznie, korzystniej sekwencję aminokwasową jak pokazano na rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID nO: 125) z reszt 32-401 włącznie.

Korzystnie, polipeptyd według wynalazku jest zasadniczo wolnym od innych ludzkich protein.

Korzystnie, polipeptyd według wynalazku jest produktem ekspresji egzogenicznej sekwencji dNa, przy czym DNA jest cDNA, genomicznym DNA lub syntetycznym DNA.

Korzystnie, polipeptyd według wynalazku ma przyłączony polimer rozpuszczalny w wodzie, przy czym korzystnym rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy, zwłaszcza o ciężarze cząsteczkowym w zakresie od około 1 kDa do około 100 kDa.

Wynalazek obejmuje w szczególności polipeptyd posiadający:

- sekwencję aminokwasową, o co najmniej około 164 aminokwasach, obejmującą cztery bogate w cysteinę domeny charakterystyczne dla bogatych w cysteinę zewnątrzkomórkowych domen receptora czynnika martwicy nowotworów (TNFR) oraz

- aktywność w zakresie podwyższania gęstości kości.

Korzystny polipeptyd według wynalazku posiada sekwencję aminokwasów jak pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID NO:125), ma koniec amino przy reszcie 22, a od 1-216 aminokwasów jest usuniętych z końca karboksylowego, a w szczególności posiada sekwencję aminokwasów z reszt 22-185, 22-189, 22-194 lub 22-201 włącznie, ewentualnie posiadający ponadto obszar Fc ludzkiej IgGl rozciągający się od końca karboksylowego.

Korzystny polipeptyd według wynalazku posiada sekwencję aminokwasów jak pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125), ma koniec amino przy reszcie 22, a od 1-10 aminokwasów jest usuniętych z końca amino i - ewentualnie - od 1-216 aminokwasów jest usuniętych z końca karboksylowego, a w szczególności posiada sekwencję aminokwasów z reszt 27-185, 27-189, 27-194, 27-401 lub 32-401 włącznie, ewentualanie posiadający obszar Fc ludzkiej IgGl rozciągający się od końca karboksylowego.

Korzystny polipeptyd według wynalazku posiada sekwencję aminokwasów huOPG, jak pokazana na rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID No:125) i wybrany jest z grupy obejmującej:

187 408 huOPG[22-201]-Fc huOPG[22-401]-Fc huOPG[22-180]-Fc huOPG met[22-401]-Fc huOPG Fc-met[22-401] huOPG met[22-185] huOPG met[22-189] huOPG met[22-194] huOPG met[27-185] huOPG met[27-189] huOPG met[27-194] huOPG met[32-401] huOPG met-lys [22-401] huOPG met[22-401] huOPG met[22-401]-Fc (P25A) huOPG met[22-401] (P25A) huOPG met[22-401] (P26A) huOPG met[22-401] (P26D) huOPG met[22-194] (P25A) huOPG met[22-194] (P26A) huOPG met met-(lys)3 [22-401] huOPG met met-arg-gly-serAhisL [22-401],

Korzystny kwas nukleinowy według wynalazku koduje polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasów huOPG, jak pokazana sa rysunku fig. 9C-9D (SEq ID No: 125) i wybrany z grupy obejmującej:

huOPG[22-201]-Fc huOPG[22-401]-Fc huOPG[22-180]-Fc huOPG met[22-401]-Fc huOPG Fc-met[22-401] huOPG met[22-185] huOPG met[22-189] huOPG met[22-194] huOPG met[27-185] huOPG met[27-189] huOPG met[27-194] huOPG met[32-401] huOPG met-lys [22-401] huOPG met[22-401] huOPG met[22-401]-Fc (P25A) huOPG met[22-401] (P25A) huOPG met[22-401] (P26A) huOPG met[22-401] (P26D) huOPG met[22-194] (P25A) huOPG met[22-194] (P26A) huOPG met mer-(lys)3 [22-401] huOPG met met-arg-gly-ser-(his)₍₎ [22-401]

Obecny wynalazek obejmuje także multimer osteoprotegeryny, przejawiający aktywność w zakresie zwiększania gęstości kości lub hamowania resorpcji kości, zbudowany z monomerów pollseptadu obejmującego OPG, o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej jedsą lub więcej spośród następujących sekwencji:

187 408

a) sekwencja aminokwasów pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID No: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No: 125),

b) sekwencja aminokwasów posiadająca co najmniej 85% zbieżności (identyczności) z sekwencją aminokwasów określoną w pkt. a) i pokazaną na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID No:123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No:125),

Korzystnym multimerem według wynalazku jest dimer.

Multimer według wynalazku korzystnie powstał przez międzyłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe, bądź asocjację obszarów Fc pochodzących z ludzkiej IgGl.

Korzystnie multimer według wynalazku jest zasadniczo wolny od monomerów osteoprotegeryny i nieaktywnych multimerów.

Korzystnie w multimerze według wynalazku monomery obejmują sekwencję aminokwasową jak pokazana na rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) z reszt 22-401 lub jej pochodną, a zwłaszcza sekwencję aminokwasową jak pokazana na rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) z reszt 22-194.

Jak wspomniano wyżej wynalazek obejmuje również przeciwciało lub część przeciwciała, które specyficznie wiąże się z OPG, posiadającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej jedną lub więcej spośród następujących sekwencji:

a) sekwencja aminokwasów pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID No: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No:125),

b) sekwencja aminokwasów posiadająca co najmniej 85% zbieżności (identyczności) z sekwencją aminokwasów określoną w pkt. a) i pokazaną na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID No: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No: 125),

Korzystnie, przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem monoklonalnym.

Sposób wykrywania obecności OPG w próbkach biologicznych, według wynalazku polega na tym, że obejmuje:

- inkubowanie próbki z przeciwciałem lub częścią przeciwciała, które specyficznie wiąże się z OPG posiadającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej jedną lub więcej spośród następujących sekwencji:

a) sekwencja aminokwasów pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID No: 12 3) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No:125),

c) sekwencja aminokwasów stanowiąca fragment sekwencji zdefiniowanych w pkt. a) lub b), w warunkach pozwalających na związanie tego przeciwciała z OPG oraz

- wykrywanie związanego przeciwciała znanymi metodami.

Sposób ustalania zdolności badanej substancji do wiązania się z OPG według wynalazku polega na tym, że obejmuje:

- inkubowanie OPG z badaną substancją w warunkach pozwalających na ich związanie oraz

- pomiar związanej substancji.

Według wynalazku kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczamy nośnik, adjuwant, środek ułatwiający rozpuszczanie, stabilizator i/lub pr/eciw-utleniacz, cechuje się tym, że jako substancję aktywną, zawiera osteoprotegerynę OPG korzystnie ludzką OPG a zwłaszcza sekwencję aminokwasową jak pokazana na rysunku fig. 9B.

Wynalazek dotyczy także zastosowania polipeptydu obejmującego OPG o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej jedną, lub więcej spośród następujących sekwencji:

187 408

c) sekwencja aminokwasów stanowiąca fragment sekwencji zdefiniowanych w pkt. a) lub b) jako środka leczniczego do leczenia chorób kości, w szczególności chorób związanych z nadmiernym zanikiem kości, zwłaszcza chorób wybranych z grupy obejmującej osteoporozę, chorobę kości typu Pageta, hiperkalcemię, nadczynność przytarczyc, osteopenię indukowaną przez podawanie steroidów, zanik kości na skutek przewlekłego postępującego gośćca stawowego, zanik kości w następstwie zapalenia szpiku, przerzuty osteolityczne oraz zanik kości przyzębia.

Korzystnie, zastosowanie to dotyczy polipeptydu będącego ludzką OPG.

Korzystnie, w zastosowaniu według wynalazku środek leczniczy jest przewidziany do stosowania łącznie z terapeutycznie skuteczną ilością substancji wybranych z grupy obejmującej: proteiny kostno morfogeniczne BMP-1 do BMP-12, człony rodziny TGF-β, inhibitory IL-1, inhibitory TNFa, hormon przytarczyc i jego analogi, proteina związana z hormonem przytarczyc oraz jej analogi, prostaglandyny serii E, bisfosfoniany oraz minerały wzmacniające kości.

Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG wybrany z grupy obejmującej:

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskazanych w punktach (a), (b) i (c), do wytwarzania środka do regulowania poziomu OPG u zwierząt, zwłaszcza u ssaków, na drodze modyfikacji genetycznej.

Korzystnie, zastosowanie to dotyczy kwasu nukleinowego sprzyjającego wzrostowi poziomu OPG w tkankach.

Opis rysunków

Figura 1. A. Analiza FASTA nowego EST LORF. Przedstawiono uzyskaną sekwencję aminokwasową FRI-1 zestawioną z sekwencją ludzkiego TNFR-2.

B. Przedstawiona analiza profilu nowego EST LORF to uzyskana sekwencja aminokwasową FRI-1 zestawiona z profilem TNFR.

C. Widok struktury superrodziny TNFR wskazujący obszar, który jest homologiczny z nowym FRI-1.

Figura 2. Struktura i sekwencja pełnej długości szczurzego genu OPQ nowego członu superrodziny TNFR.

A. Mapa insertu pMOB-Bl.l. Ramka wskazuje pozycję LORF w obrębie sekwencji cDNA (gruba linia). Czarna ramka wskazuje peptyd sygnałowy, a szare elipsy wskazują pozycję powtarzających się sekwencji bogatych w cysteinę.

B, C. Sekwencja kwasu nukleinowego i proteiny szczurzego cDNA OPG Przewidywany peptyd sygnałowy podkreślono, a potencjalne miejsca N-glikozylacji wskazano grubymi, podkreślonymi literami.

D. E. Warstwowe porównanie sekwencji (Wisconsin GCG Package, Version 8.1) OPG z innymi członami superrodziny TNFR, fas (SEQ ID NO: 128); tnfrl (SEQ ID NO: 129); sfu-t2 (SEQ ID NO:130); tnfr2 (SEQ ID NO:131); cd40 (SEQ ID NO:132); osteo (SEQ ID NO: 133); ngfr (SEQ ID NO: 134); ox40 (SEQ ID NO: 135); 41bb (SEQ ID NO: 136).

187 408

Figura 3. Analiza PepPlot (Wisconsin GCG Package, Version 8.1) przewidywanej sekwencji proteinowej OPG szczura.

A. Schematyczne przedstawienie szczurzego OPG uwidaczniające aminokwasy hydrofobowe (góra) i hydrofilowe (dół). Pokazano także aminokwasy zasadowe (góra) i kwasowe (dół).

B. Przedstawienie reszt aminokwasowych, które tworzą arkusze beta (góra) i zrywają arkusze beta (dół), jak określili: Chou i Fasman (Adv. Enz. 47, 45-147 (1948)).

C. Przedstawienie miary skłonności do helisy alfa i arkusza beta (Chou i Fasman, ibid). Krzywe powyżej 1.00 przedstawiają skłonności do struktury helisy alfa i arkusza beta. Struktura może się kończyć w obszarach proteiny, gdzie krzywe spadają poniżej 1.00.

D. Przedstawienie reszt, które tworzą alfa (góra) lub zrywają alfa (dół).

E. Uwidocznienie części sekwencji proteiny przypominających sekwencje w typowym przypadku występujące na końcu aminowym struktur alfa i beta (Chou i Fasman, ibid).

F. Uwidocznienie części sekwencji proteiny przypominających sekwencje w typowym przypadku występujące na końcu karboksylowym struktur alfa i beta (Chou i Fasman, ibid).

G. Części sekwencji protein przypominających sekwencje w typowym przypadku występujące w zwojach (Chou i Fasman, ibid).

H. Uwidocznienie helisowego momentu hydrofobowego (Eisenberg i in. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 140-144 (1984)) w każdej pozycji w sekwencji.

I. Uwidocznienie średniej hydropatii oparte na: Kyte i Doolittle (J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)) i Goldman i in. (przegląd dokonany w: Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15,321-353 (1986)).

Figura 4. Szablony ekspresji mRNA dla cDNA OPG w tkankach ludzkich. Bioty Northern sondowano przy użyciu znaczonego ³²P insertu szczurzego cDNA (A, lewe dwa panele), lub insertu ludzkiego cDNA (B, prawy panel).

Figura 5. Tworzenie transgenicznych myszy ekspresjonujących cDNA OPG whepatocytach. Ekspresja biotu Northern transgenu HE-OPG w wątrobie myszy/.

Figura 6. Wzrost gęstości kości u transgenicznych myszy OPG. Panel A-F - myszy kontrolne. G-J - myszy ekspresjonujące OPG. Przy nekropsji, wszystkie zwierzęta poddano radiografii i wykonano fotografie. Dla A-F, przedstawiono radiografię zwierząt kontrolnych i jednego transgenicznego nieekspresora (#28). Należy zauważyć, że kości mają jasno określoną korę i przezroczystą centralną jamę szpikową. Natomiast, zwierzęta OPG (G-J) mają słabo określoną korę i zwiększoną gęstość w strefie szpiku.

Figura 7. Wzrost kości beleczkowatej u myszy transgenicznych OPG

A-D. Przykładowe fotomikrografie kości zwierząt kontrolnych. W A i B, przedstawiono obrazy w małym powiększeniu (4X, 10X) kości udowej (barwienie Masson Trichrome). Barwienie na fosfatazę kwaśną, odporną na winian (TRAP) wykazuje osteoklasty (patrz strzałki) resorbujące chrząstkę (C) i kość beleczkowatą (D). Należy zauważyć spłaszczony wygląd osteoklastów na kości beleczkowatej.

E-H. Przykładowe fotomikrografie kości zwierząt ekspresjonujących OPG. W E i F, przedstawiono obrazy w małym powiększeniu (4X, 10X) kości udowej (barwienie Masson Trichrome).

Jasny obszar to chrząstka płytki wzrostu, obszar zabarwiony na niebiesko to kość, a czerwony obszar to szpik. Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do prób kontrolnych, kość beleczkowata nie była resorbowana, co spowodowało brak typowej jamy szpikowej. Uzyskane beleczki mają różnorodny wygląd i obejmują obszary niebieskie i jasne. Obszary jasne to resztki chrząstki płytki wzrostu, które nie były nigdy remodelowane. W oparciu o barwienie TRAP, zwierzęta te mają osteoklasty (patrz strzałki) w miejscu płytki wzrostu (G), które mogą być zredukowane, co do liczby. Jednak, powierzchnie beleczek z dala od miejsca płytki wzrostu są praktycznie pozbawione osteoklastów (H), spostrzeżenie kontrastujące z obserwacjami czynionymi dla zwierząt kontrolnych (patrz D).

Figura 8. Ekspresory HE-OPG nie mają defektu w rozwoju monocytu-makrofagu. Jedną przyczyną osteopetrozy u myszy jest defektywne wytwarzanie M-CSF wskutek mutacji punktowej w genie M-CSF. To powoduje wyraźny deficyt makrofagów cyrkulujących

187 408 i tkankowych. Ekspresory OPG krwi obwodowej zawierały monocyty jak oceniono stosując analizę h1e. Aby potwierdzić obecność makrofagów tkankowych wykonano badanie immunohistochemiczne stosując przeciwciała F480, które rozpoznają antygen powierzchni komórki na makrofagach mysich.

A i C przedstawiają fotomikrografie w małym powiększeniu (4X) śledziony od zwierząt normalnych i nadekspresorów CR1. Należy zauważyć, że obie grupy zwierzęta mają liczne komórki F480 pozytywne. Monocyto-makrofagi były także obecne w szpiku zwierząt normalnych (B) i nadekspresorów HE-OPG (D) (40X).

Figura 9. Struktura i sekwencje klonów cDNA OPG mysiego i ludzkiego.

A, B. Mysi cDNA i sekwencja proteiny.

C, D. Ludzki cDNA i NNkwencja psotuiny. Przywidywane paptydy sagaałows podkreślono i potencjalne miejsca N-glikozylacji wskazano grubym drukiem.

E, F. Zestawieme scPsv εης]ί e porówpunia: mysiej i li^i^zki^j zkRwesicki eminokwasowych OPG

Figura 10. Porównanie zachowanych sekwencji w pozakomórkowej domenie TNFR-1 i ludzkiego OPG PrettyPlot (WSscopsSp CCC Package, Version 8.1) zestawienia TNFR1 i OPG opisanego w przykładzie 6. Linia górna, sekwencje ludzkiego TNFR1 kodującego domeny 1-4. Linia dolna, ludzkie sekwencje OPG kodujące domeny 1-4. Zachowane reszty zaznaczono przez prostokątne ramki.

Figura 11. Trójwymiarowk przedstawienie ludzkiego OPG Widok z boku obrazu Molescript przewidywanej 3-wamSurowej struktury reszt ludzkiego OPG 25 do 163, (szeroka linia), wssółkrastaliyowupego z ludzkim TNFP (cienka ISpSu). Dla orientacji, grube strzałki wzdłuż szkieletu polipeptydu OPG wskazują kierunek od końca N do końca C. Miejsca poszczególnych łańcuchów bocznych reszty castkipowej wstawiono wzdłuż szkieletu polipeptydu, by ltsikS przedstawić oddzielne domeny bogate w cysteinę. Cząsteczkę TNFP zestawiono jak opisali Banner i in. (1993).

Figura 12. Struktura bogatych w cysteinę domen OPG Zestawienie ludzkiej (linia górna SEQ ID NO: 136) i mysiej (linia dolna) sekwencji aminokwasowych OPG z wyróżnioną przewidywaną strukturą domeny OPG Polipeptyd podzielony na dwie połowy; koniec N (A) i koniec C (B). Przewidziano, że połowa N-końcowa zawiera cztery domeny bogate w cysteinę (oznaczone 1-4). Przewidywane wewnątrzłańcuchowe wiązania dwusiurczkowk wskazano grubymi liniami oznaczonymi „SS1”, „SS2”, lub „SS3”. Przewiduje się, że tyrozyna 28 i Wstydy^ 75 (podkreślona) oddziałują na siebie jonowo. Jest spodziewane, że te aminokwasy mogą oddziaływać z ligandem OPG; wskazano je pogrubionymi kropkami powyżej odpowiedniej reszty. Reszty castkipowe umikjscowiope w połowie C-końcowej OPG zaznaczono przez prostokątne ramki.

Figura 13. Ekspresja i wydzielanie mysich protein fuzyjnych OPG-Fc (pełnej długości i obciętych).

A. Mapa wskazująca punkty fuzji do domeny Fc ludzkiego IgG1 jako groty strzałek.

B. Barwienie srebrem żelu IDS-polSukrylumidu kondacSonowuPkS pożywki otrzymane z komórek ekspresjopującach wektory ekspresji proteiny fayajpej F1.Fc (pełnej długości OPG poddany fuzji do Fc przy leucanik 401) lub CT.Fc (OPG z obciętym końcem karboksy poddany fuzji do Fc przy treoninik 180). Pas 1, linia komórkowa wektora ekspresji macierzystego pCEP4; Pas 2, linia komórkowa wektora F1.Fc; Pas 3, linia komórkowa wektora CT.Fc.

C. Blot typu Western kopdacSowupych pożywek otrzymany z wektorów ekspresji proteiny fUyajPeS cF1.Fc i CT.Fc sondowanych domeną Fc anty-ludzkiego IgG1 (Pierce). Pas 1, linia komórkowa wektora ekspresji macierzystego pCEP4; Pas 2, linia komórkowa wektora F1.Fc; Pas 3, linia komórkowa wektora CT.Fc.

Figura 14. Ekspresja ludzkiego OPG w E. coli.

A. Budowa baPteryjnega wekowa ekspreski. LOSZF ludzkiego genu OPG Ozmo^^iono przez PCR, a następnie złączono z fragmentem linkem oligonaeleotadu (górna nić to SEQ ID NO: 137; dolna nić to SEQ ID NO: 127), linowupo w DNA wektora pAMG21. Uzyskany wektor jest zdolny do ekspresji reszt OPG 32-401 pułąozopach z N-końcową resztą metioniny.

187 408

B. Analiza Udu-PAGE zieDdukowhnej i indukosvhnej oSecnośei w bakteria plrzmidu 32-401 zawierającego pAMG21-lhdzku OPG Pas 1, wzorce MW; pas 2, bakterie sieindukowane; pas 3, indukcja 30°C; pas 4, indukcja 37°C; pas 5, lizat całej komórki z indukcji 37°C; pas 6, rozpuszczalna frakcja lizatu całej komórki; pas 7, nierozpuszczalna frakcja lizatu całej komórki; pas 8, oczyszczone ciała iskluzyjne otrzymane z lizatu całej komórki.

Figura 15. Analiza rekombinαcajnego mysiego OPG wytworzonego w komórkach CHO przez SDS-PAGE i blot typu Western. Równą ilość ośrodka kosdacjonowasego w CHO naniesiono sa każdy z podanych pasów i przygotowano przez działanie próbnym buforem redukującym (lewy pas) lub próbnym buforem sieredukującym (prawy pas). Po elektroforezie, rozdzielone proteiny przeniesiono na membranę nylonową, a sastępsie sondowano przeciwciałami asty-C>PG. Względne pozycje form: 55 kd monomerycznej i 100 kd dimerycznej wskazano przez strzałki.

Figura 16. Analiza „ścigania” impulsów rekombisacyjsego mysiego OPG wytworzonego w komórkach CHO. Komórki CHO znaczono impulsowo 35S-metiosisą/cysteiną. a następnie „ścigano” przez wskazany czas. Metabolicznie znaczone hodowle podzielono na kondacjonownuć pożywki i komórki, i z każdego klarowanego, a sastępsie immusowytrącasego przeciwciałami anty-OPG wytworzono ekstrakty detergentowe.

Immusoosady rozdzielono przez SDS-PAGE i wystawiono sa działanie błony. Górse panele lewy i prawy: próbki poddane analizie w warunkach nieredhkującach. Górne pasele lewy i prawy; próbki poddane analizie w warunkach redukujących. Lewe panele - górny i dolny: Ekstrakty komórkowe. Prawe pasele - górsy i dolny; Kondycjonom^ ekstrakty pożywki. Względną ruchliwość form OPG: 55 kd monomerycznej i 100 kd dimerycznej wskazano przez strzałki.

Figura 17. Ekspresja OPG w linii komórkowej CTLL-2. Pozbawione surowicy kondycjononuse pożywki z komórek CTLL-2 i trascfekonusych komórek CHO-mu OPG[ 1-401] wytworzono, zatężoso, poddano analizie przez sieredukhjąca SDS-PAGE oraz Western Blottisg. Lewy pas; pożywki kondycjosowane CTLL-2. Prawy pas; pożywki kondycjosowane CHO-muOPG Względną ruchliwość form OPG: 55 kd monomeryczsej i 100 kd dimerycznej wskazano przez strzałki.

Figura 18. Wykrywanie ekspresji OPG w próbkach surowicy i wyciągach z wątroby uzyskanych z myszy kontrolnych i transgenicznych OPG Myszy transgesiczne uzyskano jak opisano w przykładzie 4. Ekspresję OPG wizualizowano po SDS-PAGE, a następnie Western blotting stosując przeciwciała anty-OPG

Figura 19. Wpływ proteiny fuzyjsej huOPG[22-401]-Fc na tworzenie osteoklucth in vitro. Próbę tworzenia osteoklacth wykonano jak opisano w przykładzie 11A w nieobecności (próba kostrolsa) lub w obecności wskazanych ilości fuzji huOPG[22-401]-Fc. Tworzenie osteoklastów wizualizowano przez wybarwlunle histochemiczse na fosfatazę kwaśną odporną sa wisian (TRAP).

A. OPG dodasy do 100 ng/ml.

D. OPG dodany do 0,1 ng/ml.

E. OPG dodany do 0,01 ng/ml.

F. OPG dodasy do 0,001 sg/ml.

G. Próbka kontrolna. Nie dodano OPG

Figura 20. Obniżenie aktywności hodowli osteoklastów TRAP wraz ze wzrostem OPG Wskazane stężenia proteiny fuzyjsej huOPG[22-401]-Fc dodano do próby tworzenia osteoklastów i aktywność TRAP zmierzono jak opisano w przykładzie 11 A.

Figura 21. Wpływ OPG sa końcowy etap różnicowania osteoklastów. Fuzję huOPG[22-401]-Fc dodano do próby tworzenia osteoklastów podczas pośredniego etapu dojrzewania osteoklastów (dni 5-6; OPG-CTL) lub podczas końcowego etapu dojrzewania osteoklastów (dsi 7-15; CtL-OPG). Aktywność TRAP zmierzono i porównano z aktywnością obserwowaną w nieobecności oPg (CTL-CTL) cały czas w obecności OPG (OPG-OPG)

Figura 22. Wpływ IL-1P, IL-1a i OPG na jony wapnia we krwi u myszy. Poziomy jonów nussiu we krwi monitorowano po isjekcji samego iL-1(3, IL-1a, IL-Ιβ plus muOPG[22-401]-Fc, IL-1a plus muOPG[22-401]-Fc, i samego muOPG[22-401]-Fc. Myszy kontrolne

187 408 otrzymały jedynie injekcje roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS). Eksperyment IL-Ιβ przedstawiono na A; Eksperyment IL-la przedstawiono na B.

Figura 23. Wpływ OPG na osteoklasty sklepienia czaszki u 30 myszy kontrolnych i poddanych działaniu ILI. Metody histologiczne analizy próbek mysich kości sklepienia czaszki opisano w przykładzie 11B. Strzałki wskazują osteoklasty obecne u myszy w 2 dniu podawania. Próbki sklepienia czaszki myszy otrzymujących cztery injekcje PBS dziennie (A), jedną, injekcję IL-1, trzy injekcje PBS dziennie (B), jedną injekcję PBS i trzy injekcje OPG dziennie (C), jedną injekcję IL-li trzy injekcje OPG dziennie.

Figura 24. Analiza radiograficzna narastania kości w jamie szpikowej normalnych myszy. Myszom wstrzyknięto podskórnie roztwór soli (A) fuzję mu-OPG[22-401]-Fc (5 mg/kg/dzień) przez 14 dni (B) i gęstość kości określono jak opisano w przykładzie 11C.

Figura 25. Histomorfometryczna analiza narastania kości w jamie szpikowej normalnych myszy. Eksperymenty injekcyjne i histologię kości wykonano jak opisano w przykładzie 11C.

Figura 26. Histologiczna analiza narastania kości w jamie szpikowej normalnych myszy. Eksperymenty injekcyjne i histologię kości wykonano jak opisano w przykładzie 11C.

A. Injekcja roztworu soli.

B. Injekcja fuzji muOPG[22-401]-Fc.

Figura 27. Aktywność OPG podawanego szczurom z wyciętymi jajnikami. W tym dwutygodniowym eksperymencie tendencja do zmniejszonej gęstości kości wydaje się być blokowana przez OPG lub inne terapie antyresorpcyjne. Pomiary DEXA przeprowadzono w czasie wycięcia jajników i w 1 tygodniu i 2 tygodniu podawania. Wyniki wyrażono jako % zmiany początkowej gęstości kości (Średnia +/- błąd stand, pomiaru).

Figura 28. Gęstość kości w przynasadzie kości udowej, zmierzona metodą histomorfometryczną, ma tendencję do niższych wartości u szczurów z wyciętymi jajnikami (OVX) niż u pozornie operowanych zwierząt (SHAM) 17 dni po wycięciu jajników. Efekt ten zablokowano przez OPG-Fc, przy czym szczury z wyciętymi jajnikami, którym podawano OPG-Fc (OVX+OPG) miały znacząco wyższą gęstość kości niż szczury z wyciętymi jajnikami, którym podawano zaróbkę (OVX). (Średnia +/- błąd stand, pomiaru).

Szczegółowy opis wynalazku

Nowy człon superrodziny receptora czynnika martwicy nowotworów (TNFR) zidentyfikowano jako poddany ekspresji marker sekwencji (EST) wyodrębniony z biblioteki cDNA jelit płodu szczura. Struktury klonów pełnej długości cDNA szczura i odpowiadające temu mysie i ludzkie klony cDNA określono jak to opisano w przykładach I i VI. Szczurze, mysie i ludzkie geny przedstawiono odpowiednio na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO:122) oraz 9C-9D (SEQ ID NO:124). Wszystkie trzy sekwencje wykazały silne podobieństwo do pozakomórkowych domen członów rodziny TNRF. Żaden z wyodrębnionych klonów pełnej długości cDNA nie kodował domen transbłonowych i cytoplazmowych spodziewanych w przypadku receptorów związanych z błoną, sugerując, że powyższe cDNA kodują rozpuszczalne wydzielane proteiny raczej niż receptory powierzchni komórki. Część ludzkiego genu obejmującą nukleotydy 1200-1353, przedstawioną na rysunku fig. 9D, złożono w bazie danych Genebank dnia 22 listopada 1995 roku pod numerem dostępu 17188769.

Dystrybucję tkankową szczurzego i ludzkiego mRNA określono jak opisano w przykładzie II. U szczura ekspresję mRNA wykryto w nerkach, wątrobie, łożysku i sercu, przy najwyższej ekspresji w nerkach. Ekspresję wykryto także w mięśniach szkieletowych i trzustce. U ludzi ekspresję wykryto w tych samych tkankach oraz w węźle limfatycznym, grasicy, śledzionie i w wyrostku robaczkowym.

cDNA szczura poddano ekspresji u transgenicznych myszy (przykład III) stosując wątrobo-specyficzny ApoE promotor układu ekspresji. Analiza ekspresorów wykazała widoczny wzrost gęstości kości, zwłaszcza w przypadku kości długich (kości udowe), kręgów i kości płaskich (miednica). Analiza histologiczna zabarwionych przekrojów kości wykazała ostrą osteopetrozę (patrz przykład IV) wskazując na widoczną nierównowagę pomiędzy tworzeniem kości i resorpcją, która prowadzi do widocznej akumulacji kości i chrząstek. Obniżenie

187 408 liczby beleczkowatych osteoklastów w kościach zwierząt z ekspresorem OPG wskazuje, że znacząca część aktywności białka pokrewnego TNFR może zapobiegać resorpcji kości, procesowi przebiegającemu za pośrednictwem osteoklastów. Ze względu na aktywność w ekspresorach transgenicznych proteiny pokrewne TNFR opisane w niniejszym zgłoszeniu zwane sąOPGs.

Stosując sekwencję cDNA szczura wyodrębniono mysie i ludzkie klony cDNA (przykład V). Ekspresję mysiej OPG w komórkach 293 i ludzkiej OPG w E. coli opisano w przykładach VII i VIII. Mysią OPG wytworzono jako fuzję Fc, który oczyszczono chromatograficznie na zasadzie powinowactwa do Proteiny A. W przykładzie VII opisano także ekspresję polipeptydów OPG pełnej długości oraz obciętego polipeptydu ludzkiego i mysiego w CHO i komórkach 293 jako polipeptydów fuzji do obszaru Fc ludzkiej IgG1, lub jako polipeptydów nie poddanych fuzji. Ekspresję pełnej długości i obciętych ludzkich i mysich OPG w E. coli jako polipetydów fuzji Fc lub jako polipetydów nie poddanych fuzji opisano w przykładzie VIII. Oczyszczanie OPG rekombinacyjnie wytworzonego w organizmie ssaka i bakterii opisano w przykładzie X.

Biologiczną aktywność OPG określono stosując próbę dojrzewania osteoklastu in vitro, model in vivo hiperkalcemii wywołanej przez interleukinę-1 (IL-1) i badania injekcyjne gęstości kości u normalnych myszy (patrz przykład XI). Następujące rekombinacyjne proteiny OPG wytworzone w CHA lub komórkach 293 wykazały aktywność w próbie dojrzewania osteoklastu E. coli; mu-OPG[22-185]-Fc, muOPG[22-194]-Fc, muOPG[22-401]-Fc, muOPG[22-401], huOPG[22-201]-Fc, huOPG[22-401]-Fc. Wytworzone w komórkach CHO muOPG[22-180]-Fc i huOPG met[32-401] wytworzone w E. coli nie wykazały aktywności w próbie in vitro.

OPG z szeregu źródeł wytworzono jako dimer i w pewnym stopniu jako wyższy multimer. Szczurza OPG[22-401] wytworzona u transgenicznych myszy, muOPG[22-401] oraz huOPG[22-401] wytworzona jako rekombinacyjny polipeptyd w komórkach CHO i OPG poddana ekspresji jako naturalnie występujący produkt z cytotoksycznej linii komórkowej T były przeważnie dimerami i trimerami, gdy poddano je analizie na nieredukujących żelach SDS (patrz przykład IX). Obcięte polipeptydy OPG mające delecje w obszarze aminokwasów 186-401 (np. OPG[1-185] i OPG[1-194]) były przeważnie monomeryczne, co sugeruje, ze obszar 186-401 może być związany z samoasocjacją polipeptydów OPG Jednakże huOPG met[32-401] wytworzone w E. coli były w znacznej mierze monomeryczne.

OPG może być ważna w regulowaniu resorpcji kości. Proteina zdaje się działać jako rozpuszczalny receptor rodziny TNF i może zapobiegać oddziaływaniu receptor-ligand związanemu ze szlakiem osteolitycznym. Jednym z aspektów regulacji zdaje się być redukcja liczby osteoklastów.

Kwasy nukleinowe

Wynalazek dostarcza wyodrębniony kwas nukleinowy kodujący polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG. Jak opisano w niniejszym zgłoszeniu aktywności biologiczne OPG obejmują (lecz nie są ograniczone do) jakąkolwiek aktywność związaną z metabolizmem kości i w szczególności obejmują podwyższanie gęstości kości. Kwasy nukleinowe według wynalazku wybrane są z następujących:

a) sekwencje kwasu nukleinowego jak podano na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO:124), lub ich komplementarne nici;

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124);

c) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z nukleotydami od 148 do 337 włącznie, jak to przedstawiono na rysunku fig. 1 A;

d) sekwencje kwasu nukleinowego, które ulegają degeneracji do sekwencji wskazanych w (a) i (b).

Wynalazek dostarcza kwasy nukleinowe, które kodują szczurze, mysie i ludzkie OPG oraz sekwencje kwasu nukleinowego hybrydyzujące do nich, które kodują polipeptyd mający,

187 408 co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG Dostarczone są także kwasy nukleinowe, które hybrydyzują do szczurzego OPG EST obejmującego nukleotydy od 148 do 337, jak podano na rysunku fig 1A. Warunki hybrydyzacji są zasadniczo wysoce ścisłe, takie jak 5 x SSC, 50% formamid oraz temperatura 42°C opisane w przykładzie I opisu. Równoważną ścisłość tych warunków można łatwo osiągnąć przez dobranie stężenia soli, organicznego rozpuszczalnika i temperatury. Kwasy nukleinowe w (b) obejmują sekwencje kodujące polipeptydy pokrewne OPG które nie podlegają wykrywalnej hybrydyzacji z innymi znanymi członami superrodziny receptora TNF. W korzystnym wykonaniu, kwasami nukleinowymi są kwasy podane na rysunkach fig. 2B-2C (SeQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID nO: 122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124).

Długość hybrydyżujących kwasów nukleinowych wynalazku może być zmienna, ponieważ hybrydyzacja może wystąpić w części lub całości obszarów kodujących polipeptyd, jak podano na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ DD NO:120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124), a może także wystąpić w pobliskich obszarach niekodujących. Zatem, hybrydyzujące kwasy nukleinowe mogą być obcięciami lub rozszerzeniami sekwencji przedstawionych na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122) i fig 9C-9D (SEQ ID NO: 124). Obcięte lub rozszerzone kwasy nukleinowe są objęte wynalazkiem pod warunkiem, że zachowują jedną lub więcej z biologicznych właściwości OPG. Hybrydyzujące kwasy nukleinowe mogą także obejmować pobliskie obszary niekodujące, które są 5' i/lub 3' względem obszaru kodującego OPG Obszary niekodujące obejmują obszary regulacyjne związane z ekspresją OPG takie jak promotory, enhansery, miejsca inicjowania translacji, miejsca zakończenia transkrypcji itp.

Warunki hybrydyzacji dla kwasów nukleinowych zostały opisane, Sambrook i in. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

DNA kodujący szczurzą OPG dostarczono w plazmidzie pMO-Bl.l, złożonym w American Type Culture Collection, Rockville, MD, 27 grudnia 1995 roku pod numerem dostępu ATCC 69970. DNA kodujący mysią OPG dostarczono w plazmidzie pRcCMV-mysia OPG złożonym w American Type Culture Collection, Rockville, MD, 27 grudnia 1995 roku pod numerem dostępu 69971. DNA kodujący ludzką OPG dostarczono w plazmidzie pRcCMV-ludzka OPG złożonym w American Type Culture Collection, Rockville, MD, 29 grudnia 1995 roku, pod numerem dostępu 69969. Kwasy nukleinowe według wynalazku będą hybrydyzować w ścisłych warunkach do insertów DNA o numerach dostępu ATCC: 69969, 69970 i 69971, i mają co najmniej jednąz aktywności biologicznych OPG.

Także dostarczone przez wynalazek są pochodne sekwencji kwasu nukleinowego, jak podano na rysunkach fig. 2B, 9A i 9B. W znaczeniu stosowanym w niniejszym zgłoszeniu, pochodne obejmują sekwencje kwasu nukleinowego mające addycję, podstawienie, insercję lub delecję jednej lub więcej reszt taką, że uzyskane sekwencje kodują polipeptydy mające jedną lub więcej reszt aminokwasowych, które dodano, poddano delecji, insercji lub podstawieniu, a uzyskany polipeptyd ma aktywność OPG. Pochodne kwasu nukleinowego mogą być naturalnie występującymi, takimi jak uzyskane przez zmianę splotu lub polimorfizm, lub mogą być zbudowane przy użyciu techniki mutagenezy ukierunkowanej na określone miejsce, dostępnej dla specjalisty. Przykładem naturalnie występującej odmiany OPG jest kwas nukleinowy kodujący zmianę lys na asn przy reszcie 3 w obrębie sekwencji prowadzącej (patrz przykład V). Przyjmuje się, że pochodne kwasu nukleinowego będą kodować zmiany aminokwasów w obszarach cząsteczki, które w najmniejszym stopniu mogą spowodować zakłócenie aktywności biologicznej. Inne pochodne obejmują kwas nukleinowy kodujący związaną z błoną formę OPG mającą domenę zewnątrzkomórkową, jak podano na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124) wraz z domenami transbłonowymi i cytoplazmowymi.

W jednym wykonaniu, pochodne OPG obejmują kwasy nukleinowe kodujące obcięte formy OPG mające jeden lub więcej aminokwasów poddanych delecji z końca karboksylowego. Kwasy nukleinowe kodujące OPG mogą mieć od 1 do 216 aminokwasów poddanych delecji z końca karboksylowego. Ewentualnie, obszar Fc przeciwciała może sięgać od nowego

187 408 końca karboksylowego dając biologicznie aktywny polipeptyd fuzji OPG-Fc (patrz przykład XI). W korzystnych wykonaniach, kwasy nukleinowe kodują OPG mające sekwencję aminokwasową z reszt 22-185, 22-189, 22-194 lub 22-201 (stosując numerację z rysunku fig. 9E-F) i ewentualnie, kodujące obszar Fc ludzkiego IgG

Włączone są także kwasy nukleinowe kodujące obcięte formy OPG mające jeden lub więcej aminokwasów poddanych delecji z końca aminowego. Obcięte formy obejmują te pozbawione części lub wszystkich 21 aminokwasów obejmujących sekwencję prowadzącą. Ponadto, wynalazek dostarcza kwasy nukleinowe kodujące OPG mające od 1 do 10 aminokwasów poddanych delecji z dojrzałego końca aminowego (przy reszcie 22) i, ewentualnie, mające od 1 do 216 aminokwasów poddanych delecji z końca -karboksylowego (przy reszcie 401). Ewentualnie, kwasy nukleinowe mogą kodować resztę metioniny przy końcu amino. Przykłady takich obciętych polipeptydów OPG opisano w przykładzie VIII.

Przykłady kwasów nukleinowych według wynalazku obejmują cDNA, genomowy DNA, syntetyczny DNA i RNA. cDNA otrzymuje się z bibliotek wytworzonych z mRNA wyodrębnionego z rozmaitych tkanek ekspresjonujących OPG. U ludzi źródła tkankowe dla OPG obejmują nerki, wątrobę, łożysko i serce. Genomowy DNA kodujący OPG otrzymuje się z genomowych bibliotek, które są dostępne handlowo z rozmaitych gatunków. Syntetyczny DNA otrzymuje się przez syntezę chemiczną nakładających się fragmentów oligonukleotydowych, a następnie zestawienie fragmentów z rekonstrukcją części lub całości obszaru kodującego i sekwencji flankujących (patrz Patent USA nr 4,695,623 opisujący syntezę chemiczną genów interferonu). RNa otrzymuje się najłatwiej przez wektory ekspresji prokariotycznej, które kierują wysokiego poziomu syntezą mRNA, takie jak wektory stosujące Promotory T7 i polimerazę RNA.

Sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku stosuje się do wykrycia sekwencji OPG w próbkach biologicznych, aby określić, które komórki i tkanki realizują ekspresję OPG mRNA. Sekwencji tych można także użyć do skrinowania cDNA i bibliotek genomowych na sekwencje pokrewne OPG. Taki skrining mieści się w obrębie umiejętności specjalisty z tej dziedziny techniki stosującego odpowiednie warunki hybrydyzacji, by wykryć sekwencje homologiczne. Kwasy nukleinowe są również przydatne w modulowaniu poziomów ekspresji OPG przez terapię antysensowną lub genową. Kwasy nukleinowe są również stosowane do opracowywania zwierząt transgenicznych, które mogą być stosowane do wytwarzania polipeptydu i badania aktywności biologicznej (patrz przykład III).

Wektory i komórki gospodarza

Wektory ekspresji zawierające sekwencje kwasu nukleinowego kodującego OPG komórki gospodarza przekształcane przez wspomniane wektory i sposoby wytwarzania OPG są również dostarczone przez wynalazek. Przegląd ekspresji protein rekombinacyjnych znajduje się w Methods of Enzymology v.185, Goeddel, D.V. ed. Academic Press (1990).

Komórki gospodarza do wytwarzania OPG obejmują prokariotyczne komórki gospodarza, takie jak komórki gospodarza E. coli, drożdże, komórki roślinne, owadzie i z organizmu ssaka. Szczepy E. coli takie jak HB101 lub JM101 nadają się do ekspresji. Korzystne komórki gospodarza z organizmu ssaka obejmują komórki COS, CHOd-, 293, CV-1, 3T3, komórki nerek nowo-narodzonych chomików (BHK) i inne. Komórki gospodarza z organizmu ssaka są korzystne, gdy post-translacyjne modyfikacje, takie jak glikozylowanie i przetwarzanie polipeptydu, są ważne dla aktywności OPG Ekspresja w komórkach z organizmu ssaka pozwala na wytwarzanie wydzielanych polipeptydów, które mogą być pozyskane z pożywki.

Wektory ekspresji OPG zawierają, co najmniej sekwencje wymagane dla propagacji wektora i ekspresji sklonowanego insertu. Te sekwencje obejmują miejsce startowe replikacji, marker selekcji, promotor, miejsce wiązania rybosomu, sekwencje enhansera, miejsce splatanie RNA i miejsce zakończenia transkrypcji. Wektory odpowiednie dla ekspresji w uprzednio wspomnianych komórkach gospodarza są łatwo dostępne i kwasy nukleinowe według wynalazku są wstawione w wektory przy zastosowaniu standardowych technik rekombinacyjnych DNA. Wektory dla tkankowo-specyficznej ekspresji OPG są również włączone. Takie wektory obejmują promotory, które działają specyficznie w wątrobie,

187 408 nerkach lub innych narządach dla wytwarzania u myszy, i wektory wirusowe ekspresji OPG w docelowych komórkach ludzkich.

Stosując odpowiedni układ wektor-gospodarz, OPG wytwarza się rekombinacyjnie przez hodowlę komórki gospodarza przekształconej przez wektor ekspresji zawierający sekwencje kwasu nukleinowego kodujące OPG w warunkach takich, że wytwarza się OPG i wyodrębnia się produkt ekspresji. OPG wytwarza się w roztworze sklarowanym transfekowanych komórek z organizmu ssaka lub w ciałach inkluzyjnych transformowanych bakteryjnych komórek gospodarza. Tak wytworzone OPG można oczyścić stosując procedury znane specjaliście w tej dziedzinie techniki jak opisano poniżej. Ekspresję OPG w układach gospodarza - organizmu ssaka i bakteryjnym, opisano w przykładach VII i VIH. Wektory ekspresji dla gospodarza - organizmu ssaka egzemplifikują plazmidy takie jak pDSRa opisane w międzynarodowym zgłoszeniu PCT nr 90/14363. Wektory ekspresji bakteryjnych komórek gospodarza egzemplifikują plazmidy pAMG21 i pAMG22-His opisane w przykładzie VIII. Plazmid pAMG21 złożono w American Type Culture Collection, Rockville, MD, 24 lipca 1996 roku pod numerem dostępu 98113. Plazmid pAMG22-His złożono w American Type Culture Collection, Rockville, MD, 24 lipca 1996 roku pod numerem dostępu 98112. Przyjmuje się, że specyficznie wskazane plazmidy i komórki gospodarza służą, w celach ilustracji i że inne dostępne plazmidy i komórki gospodarza można by także użyć do ekspresji polipeptydów.

Wynalazek dostarcza także ekspresji OPG z endogennych kwasów nukleinowych przez zjawiska rekombinacji in vivo lub ex vivo umożliwiając modulację OPG z chromosomu gospodarza. Ekspresja OPG przez wprowadzenie egzogennych sekwencji regulacyjnych (np. promotorów lub enhanserów) zdolnych do kierowania wytwarzaniem OPG z endogennych obszarów kodujących OPG jest także przewidziana. Stymulowanie endogennych sekwencji regulacyjnych zdolnych do kierowania wytwarzaniem OPG (np. przez wystawienie na działanie czynników zwiększania transkrypcji) jest także dostarczona przez wynalazek.

Polipeptydy

Wynalazek dostarcza OPG, nowy człon superrodziny receptora TNF, mającą aktywność inhibitowania resorpcji kości, a tym samym zwiększania gęstości kości. OPG odnosi się do polipeptydu mającego sekwencję aminokwasową mysiej, szczurzej lub ludzkiej OPG lub ich pochodnej mającej, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG Sekwencje aminokwasowe szczurzej, mysiej i ludzkiej OPG przedstawiono odpowiednio na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 121), 9A-9B (SEQ ID NO: 123) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125). Pochodna OPG odnosi się do polipeptydu mającego addycję, delecję, insercję lub podstawienie jednego lub więcej aminokwasu takiego, że uzyskany polipeptyd ma, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG Aktywności biologiczne OPG obejmują, (lecz nie są ograniczone do) aktywności związane z metabolizmem kości. Korzystnie, polipeptydy będą mieć aminokwasową sekwencję prowadzącą o usuniętych 21 aminokwasach.

Polipeptydy OPG ujęte w wynalazku obejmują polipeptydy: szczurzy [1-401], szczurzy [22-180], szczurzy [22-401]-Fc fuzja, szczurzy [1-180]-Fc fiizja, mysi [1-401], mysi [1-180], mysi [22-401], ludzki [1-401], mysi [22-180], ludzki [22-401], ludzki [22-180], ludzki [1-180], ludzki [22-180]-Fc fuzja i ludzki met-32-401. Numeracja aminokwasów jest taka, jak podano w SEQ ID NO:121 (szczurzy), w SEQ ID NO:123 (mysi) i w SEQ ID NO:125 (ludzki). Ujęte są także pochodne polipetydowe mające delecję lub karboksykońcowe obcięcia części lub wszystkich reszt aminokwasowych 180-401 w OPG; jedną lub więcej zmian aminokwasów w resztach 180-401; delecję części lub całości domeny bogatej w cysteinę OPG, w szczególności delecję odległej (karboksykońcowej) domeny bogatej w cysteinę; i jedną lub więcej zmian aminokwasów w domenie bogatej w cysteinę, w szczególności w odległej (karboksykońcowej) domenie bogatej w cysteinę. W jednym wykonaniu OPG ma od 1 do około 216 aminokwasów poddanych delecji z końca karboksylowego. W innym wykonaniu OPG ma od 1 do około 10 aminokwasów poddanych delecji z dojrzałego końca amino (w którym dojrzały koniec amino jest przy reszcie 22) i, ewentualnie, ma od 1 do około 216 aminokwasów poddanych delecji z końca karboksylowego.

Dodatkowe polipeptydy OPG ujęte w wynalazku obejmują: ludzki [22-180]-Fc fuzja, ludzki [22-201]-Fc fuzja, ludzki [22-401]-Fc fiizja, mysi [22-185]-Fc fuzja, mysi [22-194]-Fc

187 408 fuzja. Polipeptydy te wytworzono w komórkach gospodarzach z organizmu ssaka, takich jak CHO lub 293. Dodatkowe polipeptydy OPG ujęte w wynalazku, które są ekspresjonowane w priokariotycznych komórkach gospodarza obejmują następujące: ludzki met[22-401], Fc-ludzki met[22-401] fuzja (obszar Fc poddano fuzji przy końcu amino sekwencji kodującej OPG o pełnej długości, jak opisano w przykładzie VIII), ludzki met[22-401]-Fc (obszar Fc poddano fuzji z pełnej długości sekwencją OPG), Fc-mysi met[22-401] fuzja, mysi met[22-401]-Fc fuzja, ludzki met[27-401], ludzki met[22-185], ludzki met[22-189], ludzki met[22-194], ludzki met[22-194] (P25A), ludzki met[22-194] (P26A), ludzki met[27-185], ludzki met[27-189], ludzki met[27-194], ludzki met-arg-gly-ser-(his)⁶[22-401], ludzki met-lys [22-401], ludzki met-(lys)3-[22-401 ], ludzki met[22-401]-Fc (P25A), ludzki met[22-401] (P25A), ludzki met[22-401] (P26A), ludzki met[22-401] (P26D), mysi met[22-401], mysi met[27-401], mysi met[32-401], mysi met[27-180], mysi met[22-189], mysi met[22-194], mysi met[27-189], mysi met[27-194], mysi met-lys[22-401], mysi HEK[22-401](A45T), mysi met-lys-(his)7[22-401], mysi met-lys[2^^4^01]^(Fii^)₇ oraz mysi met[27-401] (P33E, G36s, A45P). Należy rozumieć, że powyższe polipeptydy OPG wytworzone w prokariotycznych komórkach gospodarza mają amino -końcową resztę metioniny, jeśli takiej reszty nie wskazano. W konkretnych przykładach fuzję OPG-Fc wytworzono stosując obszar 227-aminokwasowy ludzkiej nIgG1-1 mający sekwencję jak podano w: Ellison i in. (Nuc. Acids Res. 10, 4071-4079 (1982)). Jednakże można także użyć odmian obszaru Fc ludzkiej IgG.

Analiza aktywności biologicznej karboksykońcowych obcięć OPG poddanych fuzji do obszaru Fc ludzkiego IgG1 wskazuje na część OPG o około 164 aminokwasach, która jest wymagana dla aktywności. Ten obszar obejmuje aminokwasy 22-185, korzystnie te z rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125), i zawiera cztery bogate w cysteinę domeny charakterystyczne dla bogatych w cysteinę zewnątrz komórkowych domen TNFR.

Stosując homologię między OPG i zewnątrzkomórkowymi wiążącymi ligand domenami członów rodziny receptora TNF, wytworzono trójwymiarowy model OPG opierając się na znanej strukturze krystalicznej zewnątrzkomórkowej domeny TNFR-I (patrz przykład VI). Model ten użyto do identyfikacji tych reszt w obrębie OPG które mogą być ważne dla aktywności biologicznej. Zidentyfikowano reszty cysteinowe związane z utrzymywaniem struktury czterech domen bogatych w cysteinę. Następujące wiązania dwusiarczkowe zidentyfikowano w modelu: Domena 1: cys41 do cys54, cys44 do cys62, tyr23 i his66 mogą działać stabilizująco na strukturę tej domeny; Domena 2: cys65 do cys80, cys83 do cys98, cys87 do cysl05; Domena 3: cysl07 do cysll8, cysl24 do cysl42; Domena 4: cysl45 do cys160, cys166 do cys185. Zidentyfikowano także reszty, które są w bezpośredniej bliskości do TNFP jak podano na rysunkach fig. 11 oraz fig. 12A-12B. W tym modelu zakłada się, że OPG wiąże się z odpowiadającym ligandem; TNFe użyto jako ligand modelowy symulując oddziaływanie OPG ze swoim ligandem. Opierając się na tym modelowaniu, następujące reszty w OPG można uznać za ważne dla wiązania ligandu: glu34, lys43, pro66 do gln91 (w szczególności, pro66, his68, tyr69, tyr70, thr71, asp72, ser73, his76, ser77, asp78, gly79, leu81, tyr82, pro85, val86, lys88, glu90 oraz gln91), glu153 oraz ser155.

Zmiany w tych resztach aminokwasowych, pojedynczo lub w kombinacji, mogą zmienić aktywność biologiczną OPG. Na przykład zmiany konkretnych reszt cysternowych mogą zmienić strukturę poszczególnych domen bogatych w cysteinę, podczas gdy zmiany reszt ważnych dla wiązania ligandu mogą wpłynąć na fizyczne oddziaływania OPG z ligandem. Modele strukturalne mogą pomóc w identyfikacji analogów, które mają bardziej pożądane właściwości, takie jak zwiększona aktywność biologiczna, większa trwałość lub większa łatwość formulacji.

Wynalazek dostarcza także multimer OPG obejmujący monomery OPG OPG wydaje się być aktywna jako multimer (np. dimer, trimer lub o wyższej liczbie monomerów). Korzystnie, multimery OPG są dimerami lub trimerami. Multimery OPG mogą obejmować monomery mające sekwencję aminokwasową OPG wystarczającą by sprzyjać tworzeniu multimeru lub mogą obejmować monomery mające sekwencje heterologicznie takie jak obszar Fc przeciwciała. Analizy karboksy-końcowych delecji OPG sugerują że co najmniej część obszaru 186-401 jest związana z asocjacją polipeptydów OPG Podstawienie części lub całości

187 408 obszaru aminokwasów 186-401 OPG sekwescją aminokwasową zdolsą do samoasocjacji jest także objęte wynalazkiem. Alternatywnie, polipeptydy OPG lub ich pochodne można zmodyfikować, aby tworzyć dimery lub multimery przez mutagenezę ukierunkowaną na określone miejsce, by utworzyć niespurowune reszty cysteisowe dla wykonania międzyłańcuchowego wiązania dwusiarczkowego, przez sieciowanie fotochemiczne, takie jak wystawienie sa światło nadfioletowe, lub przez sieciowasie chemiczne dwufuskcyjnymi cząsteczkami linkera, takimi jak dwhfhnkcajna glikol polietylenowy itp.

Modyfikacje solipeptadón OPG są objęte przez wynalazek i obejmują post-translacajne modyfikacje (np. N-łączone lub O-łączone łańcuchy węglowodanowe, przetwarzanie N-końcowych lub C-końcowych końców), przyłączenie ugrupowań chemicznych do szkieletu amisokwuconego, chemiczne modyfikacje N-łączosych lub O-łączosych łańcuchów węglowodanowych, i addycję N-końcowej reszty metioniny w wyniku ekspresji srokuriotaczneC komórki gospodarza. Poliseptyda można także zmodyfikować wykrywalnym znacznikiem, takim jak znacznik enzymatyczny, fluoroscencyjny, izotopowy lub przejawiający powinowactwo, by umożliwić wykrycie i wyodrębnienie proteiny.

Dalsze modyfikacje OPG obejmują proteiny chimeryczne, w których OPG jest poddana fuzji z heterologiczną sekwescją aminokwasową. Heterologiczna sekwencja może być jakąkolwiek sekwencją, która pozwala na uzyskanie proteiny fuzyjnej, zachowującej aktywność OPG. Sekwencje heterologiczne obejmują sp. fuzje immunoglobuliny, takie jak fuzje Fc, które mogą pomóc w oczyszczaniu proteiny. Korzystna jest sekwencja heterologiczną, która sprzyja asocjacji monomerów OPG w dimery, trimery i isne wyższe multimeryczse formy.

Polisestada według wynalazku są wyodrębnione i oczyszczane z isnych polipeptydów obecnych w tkaikach, liniach komórkowych i transformowanych komórkach gospodarza ekspresjosujacach OPG, lub oczyszczane ze składników w hodowlach komórkowych zawierających wydzielaną proteinę. W jednym wykonaniu polipeptyd jest wolny od asocjacji z innymi ludzkimi proteinami, takich jak produkt ekspresji bakteryjnej komórki gospodarza.

Dostarczane przez wynalazek są także chemicznie zmodyfikowane pochodne OPG, które mogą zapewnić dodatkowe korzyści, takie jak zwiększoną trwałość i czas cyrklowania solipestadh, lub zmniejszoną immusogesność (patrz Patest USA Nr 4,179,337). Ugrupowania chemiczne dla dekatyzacji mogą być wybrane spośród rozpuszczalnych w wodzie polimerów, takich jak glikol polietylenowy, kopolimery, glikol etylenowy/glikol propylenowy, kurboksametalocelulozα, dekstran, alkohol poliwinylowy itp. Polisestyda mogą być modyfikowane w losowych pozycjach w obrębie cząsteczki lub we wstępnie ustalonych pozycjach w obrębie cząsteczki i mogą obejmować jedso, dwa, trzy lub więcej przyłączonych ugrupowań chemicznych.

Polimer może mieć dowolny ciężar cząsteczkowy i może być rozgałęziony lub sierozgałęziony. W przypadku glikolu polietylenowego korzystny ciężar cząsteczkowy wynosi między około 1 kDa i około 100 kDa (określenie „około” wskazuje, że w preparatach glikolu polietylenowego, pewne cząsteczki będą ważyć więcej, pewne mniej, siż podany ciężar cząsteczkowy) dla łatwości operowania i wytwarzania. Mogą być stosowane isne wielkości zależnie od żądanego profilu terapeutycznego (sp. żądanego czasu trwania powolnego uwalniania, wpływu, jeśli ma miejsce, sa aktywność biologiczną, łatwości posługiwania się, stopnia lub braku astygesności i isnych znanych wpływów glikolu polietylenowego sa terapeutyczne proteiny lub analogi).

Cząsteczki glikolu polietylenowego (lub insych ugrupowań chemicznych) powinny być przyłączone do proteiny przy rozpatrzeniu wpływu na funkcyjne lub antygenowe domeny proteiny. Istnieje pewsa liczba metod przyłączenia dostępnych specjalistom z tej dziedziny techniki, np. EP 0 401 384, włączony do niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz (sprzęganie PEG z G-CSF), patrz także Malik i is., Exp. Hematol. 20.: 1028-1035 (1992) (opisuje segalonanie GM-CSF przy zastosowaniu chlorku tresylu). Na przykład glikol polietylenowy może być kowalencyjnie związany przez reszty aminokwasowe poprzez grupę reaktywną, taką jak wolna grupa aminowa lub grupa karboksylowa. Reaktywne grupy są takimi, do których może być związana aktywowana cząsteczka glikolu polietylenowego. Reszty aminokwasowe mające wolsą grupę aminową mogą obejmować reszty

187 408 lizynowe i N-końcowe reszty aminokwasowe; te mające wolną grupę karboksylową mogą obejmować reszty kwasu asparginowego i reszty kwasu glutaminowego i C-końcowe reszty aminokwasowe. Sulfhydrylowe grupy można także użyć jako grupę reaktywną dla przyłączenia cząsteczki (cząsteczek) glikolu polietylenowego. Dla celów terapeutycznych korzystne jest przyłączenie przy grupie aminowej, takie jak przyłączenie przy N-końcu lub grupie lizynowej.

Można specyficznie żądać proteiny chemicznie modyfikowanej N-końcowo. Stosując glikol polietylenowy jako ilustrację obecnych kompozycji, można wybierać spośród rozmaitych cząsteczek glikolu polietylenowego (według ciężaru cząsteczkowego, rozgałęzienia, itp.), stosunku ilościowego cząsteczek glikolu polietylenowego do cząsteczek proteiny (lub peptydu) w mieszaninie reakcyjnej, typu reakcji pegylowania, którą należy wykonać i metody otrzymywania wybranej N-końcowo pegylowanej proteiny. Metoda otrzymywania N-końcowo pegylowanego preparatu (tzn. oddzielenie tego ugrupowania od innego monopegylowanego ugrupowania, jeśli jest to niezbędne) może polegać na oczyszczaniu N-końcowo pegylowanego materiału z populacji pegylowanych cząsteczek protein. Selektywne N-końcowe chemicznie modyfikowane można wykonać przez redukcyjne alkilowanie, które wykorzystuje zróżnicowaną reaktywność różnych typów pierwszorzędowych grup aminowych (lizyna versus N-koniec) dostępnych dla derywatyzacji w konkretnej proteinie. W odpowiednich warunkach reakcji, osiąga się zasadniczo selektywną derywatyzację proteiny przy N-końcu polimerem zawierającym grupę karbonylową.

Syntetyczne dimery OPG można wytworzyć przez rozmaite procedury sieciowania chemicznego. Monomery OPG można chemicznie wiązać w każdy sposób, który zachowuje lub zwiększa aktywność biologiczną OPG. Można stosować rozmaite chemiczne środki sieciujące zależnie od tego, które właściwości dimeru proteiny są pożądane. Na przykład środki sieciujące mogą być krótkie i względnie sztywne lub dłuższe i bardziej giętkie, mogą być biologicznie odwracalne i mogą nadawać zmniejszoną immunogenność lub dłuższy, farmakokinetyczny okres półtrwania.

W jednym przykładzie, cząsteczki OPG są wiązane przez koniec amino w dwuetapowej syntezie (patrz przykład XII). W pierwszym etapie, OPG jest chemicznie modyfikowana przy końcu amino dla wprowadzenia zabezpieczonego tiolu, który po oczyszczaniu jest odbezpieczany i stosowany jako punkt przyłączenia specyficznego względem miejsca sprzężenia przez rozmaite środki sieciujące z drugą cząsteczką OPG Amino-końcowe wiązania poprzeczne obejmują (lecz nie są ograniczone do) wiązania dwusiarczkowe, wiązania tioeterowe stosujące krótkołańcuchowe, dwufunkcyjne alifatyczne środki sieciujące i wiązania tioeterowe do środków sieciujących będących dwufunkcyjnym glikolem polietylenowym, o zmiennej długości („hantle” PEG). Przez syntezę „hantla” PEG z dimerów OPG objęty jest produkt uboczny takiej syntezy, zwany „monohantel”. Monohantel OPG składa się z monomeru sprzężonego z liniowym dwufunkcyjnym PEG o wolnym końcu polimerycznym. Alternatywnie, OPG można sieciować bezpośrednio za pomocą szeregu amino-specyficznych homobifunkcyjnych technik sieciowania, które obejmują reagenty takie jak: dwubezwodnik dwuetylenotrójaminopięciooctowy (DTPA), p-benzochinon (pBQ) lub suberynian bis(sulfobursztynianu) (BS³), i inne znane w tej dziedzinie techniki. Jest także możliwe bezpośrednie tiolowanie OPG reagentami takimi jak iminotiolan w obecności rozmaitych dwufunkcyjnych, tiolospecyficznych środków sieciujących, takich jak PEG-bismaleimid i osiągnięcie dimeryzacji i/lub hantli w procesie jednoetapowym.

Sposób oczyszczania OPG ze źródła naturalnego i z transfekowanych komórek gospodarza jest także objęty wynalazkiem. Proces oczyszczania może wykorzystywać jeden lub więcej standardowych etapów oczyszczania protein w odpowiednim porządku, by otrzymać oczyszczoną proteinę.

Etapy chromatograficzne mogą obejmować wymianę jonów, filtrację żelową, oddziaływanie hydrofobowe, użycie odwróconych faz, chromatofokusację, chromatografię na zasadzie powinowactwa przy zastosowaniu przeciwciała anty-OPG lub kompleksu powinowactwa biotyna-streptawidyna, itp.

187 408

Przeciwciała

Przez wynalazek objęte są także przeciwciała speoafioypik wiążące się z OPG Antygenami dla twnryknSa przeciwciał mogą być pełnej dłGnnści polipeptydy lub peptydy obejmujące część sekwencji OZm. Procedury immunologiczne tworzenia polSelonalnaoh lub mopoklonalnych przeciwciał reaktywnych z OPG są znane spkojuliście z tej dziedziny techniki (patrz, np., Harlow i Lane, AptSbodSes·; A Luborutora Manual Cold Spring Harbor Luboratnra Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)). Przeciwciała tak wytworzone charakteryzują się specyficznością wiązania i rozpoznaniem epitopu przy yactosnwamG standardowych prób związanego z enzymem immuposorbentG. Przeciwciała także obejmują chimeryczne przeciwciała mające zmienne i stałe obszary domen pochodzących z różnych gatunków. W jednym wakopunSu, chimeryczne przciwciała są przeciwciałami mającymi zmienne domeny mysie lub szczurze i stałe domeny ludzkie. Wynalazkiem także objęte są obszary określające knmplemeptumuść syczkpinpk do ludzkiej ramy (tzw. przeciwciała szczepione do CDR). Przeciwciała chimeryczne i szczepione do CDR są wykonane metodami rekombinacyjpamS znanymi specSaliśoit z tej dziedziny techniki. Przewidziane są także ludzkie przeciwciała waknnane u myszy·

Przeciwciała anta-OPm według wynalazku można stosować jako odczynnik pnwipowactwa do oczyszczania OPG z próbek biologicznych (patrz przykład X). W Skdpam sposobie, przeciwciało Smmobiliyowape na Sepharose aktywowanej CnBr i kolumnę knniugutu przkciwciałn-Skphurnse stncujk się by usunąć OPG z ciekłych próbek. Przeciwciała są również stosowane jako reagenty diagnostyczne, aby wykryć i ująć ilnśoinwo OPG w próbkach biologioypaoh metodami opisanymi poniżeś.

Kompozycie farmaceutyczne

Wynalazek dostarcza także knmpnyacSk farmaceutyczne obkSmuSące terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu według wynalazku wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym rozoikńozalpieiem, nośnikiem, sulubfiiyerem, emulgatorem, konserwantem i/lub adjuwantem. Określenie „tkrupkutyoypik skuteczna ilość” oznacza ilość, która pozwala osiągnąć terapeutyczny efekt w specyficznych warunkach i spnsnbie podawania. Kompozycja może występować w postaci ciekłej bądź liofilizowanej formie i obeSmuSe rozcieńczalnik (bufory Tris, octanowy lub fosforanowy) o różnych wartościach pH i różnej mocy jonowej, snlubilizer taki jak Tween lub Pohsorbute, nośniki takie jak ludzka albumina surowicy lub żelatyna, konserwanty takie jak thimerosal lub alkohol benzylowy, i uptyGtlkPiucye takie jak kwas ucknrbipowy lub kwaśny mktusiarczap sodu. Ujęte są także knmpozaoSe obejmująoe OPG modyfikowaną rozpuszczalnymi w wodzie polimerami, aby zwiększyć rozpuszczalność lub trwałość. Kompozycje mogą obejmować również włączenie OPG do lipozomów, mikrokmulsSi, micelli lub pęcherzyków w okla zapewnienia kontrolowanego podawania przez wydłużony okres czasu. Specyficznie, kompuzaoje OPG mogą obkSmnwuć włączenie do pnlimeracynach matryc takich jak hydrożele, ^Ιϊ^^, polietyleny, kopolimery etylen-octan winylu lub polimery biodegradowulpk. Przykłady hydrożeli obejmują pnlihadrnkcyulkSlometukralapa (p-HEMA), poliakryloamid, pohmetukralumid, poliwinylnpSrnlSdnp, alkohol poliwinylowy, oraz różne kompleksy pulieleetrolitów. Przykłady zdolnych do biodegradacji polimerów obejmują kwas polSmlkkowa (PLA), kwas pohglieolowy (PGA), kopolimery PLA i PGA, puhumida i kopolimery poliamidów oraz poliestry. Inne formy leków o kontrolowanym uwalnianiu obeSmują mikrueussułei, mikrosfery, makromolekularne kompleksy i perełki polimerowe, które mogą być podawane przez injekcję.

Wybór eonkrktnach kompozycji będzie zależał od szeregu czynników, nbejmującaoh stan podlkgąjąoa leczeniu, drogi podawania i żądane parametry furmuknkSnetycyne. Bardziej rozległy przegląd składników odpowiednich do farmaceutycznych kompnyaoji znajdaSe się w Remington^ Pharmaceutical Sciences, 18th ed. A.R. Gennaro, ed. Mack, Euctnn, PA (1980).

KumpozacSk według wynalazku mogą być podawane przez ipSekoję, a więc albo podskórnie, dożylnie lub domięśniowo, bądź doustnie, do nosa, dopłGopie lub dnodbatpiozu. Droga podawania ostatecznie zależeć będzie od szeregu czynników i może ją ustalić jedynie spkoSalistu w tej dziedzinie.

187 408

Wynalazek dostarcza także farmaceutyczne kompozycje zawierające terapeutycznie skuteczne ilości kwasów nukleinowych według wynalazku wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym adjuwantem. Kompozycje zawierające kwas nukleinowy będą użyteczne dla dostarczania części lub całości obszaru kodującego OPG do komórek i tkanek jako części reżimu terapii antysensowej lub genowej.

Zastosowania terapeutyczne

Tkanka kości zapewnia wsparcie dla ciała ludzkiego i składa się ze składników mineralnych (głównie z wapnia i fosforu), istoty podstawnej protein kolagenowych i niekolagenowych oraz komórek. Trzy rodzaje komórek znajdujących się w kościach, osteocyty, osteoblasty i osteoklasty, włączone są w dynamiczny proces, dzięki któremu kości są w sposób ciągły budowane i resorbowane. Osteoblasty prowadzą tworzenie tkanki kostnej, podczas gdy osteoklasty związane są z resorpcją. Resorpcja, czyli rozkład istoty podstawnej kości i składników mineralnych, jest szybkim i wydajnym procesem w porównaniu do budowania kości i może uwalniać duże ilości składników mineralnych z kości. Osteoklasty związane są z regulacją normalnej przebudowy tkanki szkieletowej i z resorpcją indukowaną hormonalnie. Na przykład, resorpcja jest stymulowana przez wydzielanie hormonu przytarczycowego w odpowiedzi na obniżenie stężenia jonów wapniowych w płynach zewnątrzkomórkowych. Natomiast inhibitowanie resorpcji jest głównym zadaniem kalcytoniny. Ponadto, metabolity witaminy D zmieniają odpowiedź kości na działanie hormonu przytarczycowego i kalcytoniny.

Po osiągnięciu dojrzałości szkieletu, ilość tkanki kostnej w szkielecie odpowiada równowadze (lub nierównowadze) tworzenia kości i resorpcji kości. Największa masa kości występuje po osiągnięciu dojrzałości szkieletu, przed czwartą dekadą wieku człowieka. Między czwartą, a piątą dekadą równowaga przesuwa się i dominuje resorpcja kości. Nieuniknione obniżenie masy kości z biegiem łat rozpoczyna się wcześniej u kobiet niż mężczyzn i jest wyraźnie przyspieszone po menopauzie u niektórych kobiet (głównie u kobiet białych i azjatek).

Osteopenia jest stanem dotyczącym zasadniczo jakiegokolwiek obniżenia masy kości poniżej normalnego poziomu. Taki stan może powstać z obniżenia szybkości syntezy kości lub w wyniku wzrostu szybkości rozkłady kości, bądź obu tych zjawisk. Najpowszechniejszą postacią osteopenii jest pierwotna osteoporoza, zwana także jako osteoporoza postmenopauzalna oraz osteoporoza starcza. Ta forma osteoporozy jest wynikiem powszechnego ubywania kości wraz z wiekiem i jest zwykle rezultatem wzrostu resorpcji kości w porównaniu do normalnej szybkości budowania kości. U około 25 do 30 procent wszystkich białych kobiet w Stanach Zjednoczonych rozwija się osteoporoza objawowa. Istnieje prosta zależność między osteoporozą a złamaniem stawu biodrowego, szyjki kości udowej, szyji i międzykrętarzowym u kobiet 45-letnich i starszych. U starszych mężczyzn rozwija się osteoporoza objawowa występująca między 50 a 70 rokiem życia, lecz choroba w pierwszym rzędzie atakuje kobiety.

Przyczyna występowania osteoporozy postmenopauzalnej i starczej nie jest znana. Zidentyfikowano kilka czynników mających wpływ na ten stan. Obejmują one zmianę w poziomie hormonów towarzyszącym wiekowi i nieodpowiednie przyswajanie wapnia przypisywane zmniejszonej absorbcji w jelitach wapnia i innych składników mineralnych. Leczenie polega zwykle na terapii hormonalnej lub na uzupełnianiu pożywienia aby spowodować opóźnianie tego procesu. Jak dotąd, jednakże, nie istnieje skuteczne leczenie zaniku kości.

Obecnie dostępny stał się sposób leczenia zaburzeń chorobowych kości polegający na stosowaniu terapeutycznie skutecznych ilości OPG Zaburzenia chorobowe kości mogą być dowolnymi zaburzeniami charakteryzującymi się utratą kości netto (osteopenia lub osteoliza). Zasadniczo, leczenie za pomocą OPG jest zalecane, kiedy jest konieczne ograniczenie szybkości resorpcji kości. Zatem leczenie można przeprowadzić dla zmniejszenia szybkości resorpcji kości, gdy szybkość resorpcji jest wyższa od normalnej lub dla zmniejszenia resorpcji kości poniżej normalnego poziomu, aby skompensować pozostający poniżej normalnego poziom tworzenia kości.

187 408

Przypadki, które nadają się do leczenia za pomocą OPG, obejmują następujące schorzenia:

Osteoporoza, jak osteoporoza pierwotna, osteoporoza endokrynna (nadczynność tarczycy, nadczynność przytarczyc, zespół Cushing'a, i akromegalia), dziedziczne i wrodzone formy osteoporozy (osteogeneza niezupełna, homocystynuria, zespół Menkesa, i zespół Rileya-Daya), i osteoporozy będące następstwem unieruchomienia kończyn.

Choroba kości typu Pageta (deformujące zapalenie kości) u dorosłych i młodzieży.

Zapalenie szpiku lub infekcyjne uszkodzenie kości prowadząca do ubytku kości.

Hiperkalcemia pochodząca z litych guzów (piersi, płuca i nerki) i hematologicznych nowotworów złośliwych (szpiczak mnogi, ziarnica złośliwa i białaczka), samoistna hiperkalcemia i hiperkalcemia związana z nadczynnością tarczycy i z zaburzeniami funkcji nerek.

Występująca po operacji osteopenia, indukowana przez podawanie steroidów i związana z zaburzeniami jelita cienkiego i grubego oraz z chronicznymi chorobami wątroby i nerek.

Osteonekroza lub śmierć komórek kości, związana z urazami i obrażeniami lub bezurazową martwicą związaną z chorobą Gauchera, niedokrwistością sierpowatokrwinkową, układowym liszajem rumieniowatym i innymi warunkami.

Zanik kości na skutek przewlekłego postępującego gośćca stawowego.

Zanik kości przyzębia.

Przerzuty osteolityczne.

Jest zrozumiałe, że OPG może być stosowana samodzielnie lub w połączeniu z innymi czynnikami do leczenia zaburzeń kości. W jednym wykonaniu, osteoprotegerynę stosuje się w połączeniu z terapeutycznie skuteczną ilością czynnika stymulującego formowanie kości. Czynniki takie zawierają (lecz nie są do tego ograniczone) czynniki kostno-morfogeniczne BMP-1 do BMP-12, transformujący czynnik-β wzrostu (TGF-β) i elementy rodziny TGF-β inhibitory interleukiny-1, inhibitory TNFa, hormon przytarczyc i jego analogi, proteiny związane z przytarczycami i ich analogi, prostaglandyny serii E, dwufosfoniany (taki jak alendronian i inne) oraz minerały wzmacniające kości, takie jak fluorki i wapń.

Poniższe przykłady zamieszczono dla pełniejszego zilustrowania wynalazku. Nie stanowią one ograniczenia zakresu wynalazku.

Przykład I

Identyfikacja i wyodrębnienie szczurzego cDNA OPG

Materiały i sposoby klonowania cDNA i analizy opisano w: Maniatis et al, ibid. Łańcuchowe reakcje przy użyciu polimerazy (PCR) przeprowadzono stosując termocykler typu Perkina-Elmera 9600 przy użyciu mieszaniny reakcyjnej PCR (Boehringer-Mannheim), i stężenia primera określone przez producenta. Ogólnie, 25-50 pl reakcje denaturowano w 94°C, następnie w 20-40 cyklach po 5 sekund w 94°C, w 50-60°C przez 5 sekund i w 72°C przez 3-5 minut. Następnie reakcje poddano działaniu 72°C przez 3-5 minut. Następnie reakcje poddano analizie metodą elektroforezy na żelu, jak to opisano przez Maniatis et al., ibid.

Bibliotekę cDNA sporządzono przy użyciu mRNA wyodrębnionego z embrionowego jelita d20 dla analizy EST (Adams i in., Science 252, 1651-1656 (1991)). Szczurze embriony rozcinano i wyjmowano całe rozwijające się małe i duże jelito i przemywano w PBS. Całe komórkowe RNA oczyszczono metodą kwasowej ekstrakcji mieszaniną, tiocyjanianofenolan guanidyny-chloroform, (Chomczyński i Sacchi, Anal. Biochem. 162. 156-159, (1987)). Frakcje mRNA poly (A+) otrzymano z całego preparatu RNA przez adsorpcję do i wymycie z, przy użyciu urządzenia typu Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal Corp), stosując procedurę zalecaną przez producenta. Bibliotekę losowo prymowanego cDNA utworzono posługując się metodą Superscript Plasmid System (Gibco BRL, Gaithersburg, Md). Losowy primer cDNA zawierający wewnętrzne miejsce restrykcyjne Not I, który użyto do zapoczątkowania syntezy pierwszej nici, miał następującą sekwencję:

5'- A A AGGA AGGAAAAAAGCGGCCGCTACANNNNNNNNT-3' (SEQ ID NO:1)

Not I

187 408

Dla syntezy pierwszej nici trzy oddzielne reakcje połączono tak, ze zawierały 2,5 pg poly (A) RNA i 120 ng, 360 ng lub 1,080 ng losowego primeru. Po syntezie drugiej nici produkty reakcji oddzielnie ekstrahowano mieszaniną o składzie: fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (w proporcji 25:24:1), a następnie wytrącono etanolem. Dwuniciowe (ds) produkty cDNA z trzech reakcji połączono i ligowano do następującego adaptera oligonukleotydowego ds:

5'-TCGACCCACGCGTCCG-3' (SEQ ID NO:2)

3'-GGGTGCGCAGGCp-5' (SEQ ID NO:3)

Po ligacji cDNA wytrawiono całkowicie stosując Not I, ekstrahowano mieszaniną, fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (w proporcji 25:24:1) i wytrącono etanolem. Ponownie przeprowadzony w stan zawiesiny cDNA poddano następnie frakcjonowaniu pod względem wielkości na żelu filtracyjnym, stosując uprzednio przygotowane kolumny z Superscript Plasmid System (Gibco BRL, Gaithersburg, Md), jak zaleca producent. Dwie frakcje zawierające największe produkty cDNA połączono, wytrącono etanolem a następnie w sposób ukierunkowany ligowano na wytrawiony w NotI i SalI wektor pMOB DNA. (Strathmann i in., 1991). Ligowane cDNA wprowadzono do kompetentnego szczepu ElectroMAX DH10B E. coli (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) metodą elektroporowania. W celu wykonania automatycznej analizy sekwencyjnej około 10.000 transformantów umieszczono na płytkach agarowych o wymiarach 20 cm x 20 cm zawierających pożywką LB wzbogaconą ampicyliną. Hodowle które wyrosły zebrano i ułożono w 96 wgłębieniach płytek do mikroanalizy (typu microtiter) zawierających 200 ml brzeczki L, 7,5% gliceryny i 50 pg/ml ampicyliny. Hodowle wzrastały przez noc w temperaturze 37°C, wytworzono duplikat zestawu płytek (typu microtiter) przy użyciu sterylnego narzędzia do replikacji o 96 ostrzach, po czym oba zestawy przechowywano w temperaturze -80°C dla dalszych analiz. Dla klonowania cDNA o pełnej długości umieszczono około jeden milion transformantów na 96 płytkach bakteryjnych z ampicyliną, zawierających około 10.000 klonów każda. Plazmidowy DNA z każdej porcji umieszczono oddzielnie przy użyciu zestawu Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen Corp., Germany), i rozmieszczono w 96 płytkach typu microtiter dla analizy PCR.

W celu sekwencjonowania klonów cDNA pochodzących z dowolnego płodowego jelita szczurzego, rozmrożono glicerynowe zasoby, i niewielkie próbki rozcieńczono 1:25 w wodzie destylowanej. Około 3,0 ml rozcieńczonych hodowli bakterii dodano do mieszaniny reakcyjnej PCR (Boehringer-Mannheim) zawierającej następujące oligonukleotydy:

'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEQ ID NO:4)

5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' (SEQ ID NO:5)

Reakcje inkubowano w termocyklerze (Perkin-Elmer 9600) przy następujących warunkach cykli: w temperaturze 94°C przez 2 minuty; 30 cykli w 94°C przez 5 sekund, 50°C przez 5 sekund i 72°C przez 3 minuty; 72°C przez 4 minuty. Po inkubacji w termocyklerze reagenty rozcieńczono 2,0 ml wody. Amplifikowane fragmenty DNA poddano dalszemu oczyszczaniu przy użyciu kolumn Centricon (Princeton Separations) stosując się do zaleceń producenta. Produkty reakcji PCR sekwencjonowano przy użyciu urządzenia Applied Biosystems 373A do automatycznego sekwencjonowania DNA przy użyciu primera T3 (oligonukleotyd 353-23):

5'-CAATTAACCCTCACTAAAGG-3* (SEQ ID NO:6), z barwnym wskazaniem końca reakcji (Applied Biosystems) w myśl zalecanej przez producenta procedury.

Wynikową sekwencję 5'-nukleotydową otrzymaną z dowolnie wybranych klonów cDNA, poddano translacji i następnie porównano z istniejącymi bazami danych znanych sekwencji proteinowych przy użyciu modyfikowanej wersji programu FASTA (Pearson i inni.,

187 408

Meth. Enzymol. 183, (1990)). Poddane translacji sekwencje były również analizowane na obecność specyficznego, bogatego w cysteinę motywu proteiny występującego we wszystkich znanych członach superrodziny receptora czynnika martwicy nowotworów - TNFR (Smith i inni., Celi 76, 959-962 (1994)), przy użyciu metody profilu sekwencji Gribskov'a i in. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 83, 4355-4359 (1987)), w modyfikacji Luethy'ego i in. (Protein Science 3, 139-146 (1994)).

Stosując FASTA oraz wyszukane dane dotyczące profilu, EST, FRI-1 (jelito płodu szczurzego -1) zidentyfikowano jako noeżliwyy nowy) człon ?^L^]o«rrrc^<J:iTr^y INIFR . FRl·) zawierał insert o około 600 parach zasad z LORF o około 150 aminokwasach. Najbliższym związkiem porównawczym z bazy danych był ludzki TNFR typu (TNFR-2). Porównany obszar wykazał około 43% homologię pomiędzy TNFR-2 i FRI-1 ponad ten 150 aminokwasowy LORF. Analiza profilu przy użyciu pierwszego i drugiego bogatego w cysteinę powtórzenia z superrodziny TNFR dała wynik dla Z wynoszący około 8, wskazując, że gen FRI-1 prawdopodobnie koduje nowy człon rodziny. W celu określenia struktury produktu FRI-1, bibliotekę cDNA z jelita płodu szczura poddano skriningowi na obecność klonów o pełnej długości. Następujące oligonukleotydy otrzymano z początkowej sekwencji FRI-1:

Ó^GCATTATGACCCAGAAACCGGAC^’ (SEQ ID NO:7)

5'-AGGTAGCGCCCTTCCTCACATTC-3' (SEQ ID NO:8)

Primery powyższe stosowano w reakcjach PCR do skriningu 96 zbiorników plazmidu DNA, z których każdy zawiera plazmid DNA z 10.000 niezależnych klonów cDNA. Około 1 pg zbiornika plazmidu DNA amplifikowano w mieszaninie reakcyjnej PCR (Boehringer-Mannheim), stosując termiczny cykler o 96 wgłębieniach typu Perkin-Elmer, o następujących parametrach cykli: 2 minuty w temperaturze 94°C, 1 cykl; 15 sekund w 94°C, a następnie sekund w 65°C, 30 cykli; 7 minut w 65°C, 1 cykl. Produkty reakcji PCR analizowano metodą elektroforezy na żelu. 13 z 96 zbiorników plazmidów DNA dało wzrost amplifikowanych produktów DNA o oczekiwanej względnej masie cząsteczkowej.

DNA z jednego pozytywnego zbiornika użyto do transformowania kompetentnego szczepu ElectroMAX DH10B E. coli (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), jak opisano powyżej. Około 40.000 transformantów umieszczono na sterylnych filtrach nitrocelulozowych (BA-85, Schleicher i Schuell), po czym prowadzono skrining przez hybrydyzację kolonii przy użyciu znakowanej ³²P-dCTP wersji produktu PCR otrzymanego powyżej. Filtry były prehybrydyzowane w 5X SSC, 50% dejonizowanego formamidu, 5X roztwór Denhardt'a, 0,5% SDS i w 100 pg/ml denaturowanego DNA spermy łososia przez 2-4 godziny w temperaturze 42°C. Filtry następnie hybrydyzowano w 5X SSC, w 50% dejonizowanego formamidu, 2X roztwór Denhardfa, 0,1% SDS, 100 pg/ml denaturowanego DNA spermy łososia i około 5 ng/ml znaczonej sondy przez około 18 godzin w 42°C. Filtry następnie przemyto w 2X SSC w ciągu 10 minut w temperaturze pokojowej, 1X SSC przez 10 minut w temperaturze 55°C i na koniec w 0,5X SSC przez 10-15 minut w 55°C. Hybrydyzowane klony wykryto następnie metodą autoradiografii, po czym ponownie umieszczono na filtrach nitrocelulozowych dla ponownego skriningu. Po drugim skriningu wyizolowano klon plazmidowy (pB1.1), a następnie amplifikowano w pożywce z brzeczką L, zawierającej ampicylinę w ilości 100 pg/ml i otrzymany plazmid DNA. Obie nici insertu 2,4 kb pB1.1 sekwencjonowano.

Sekwencję insertu pB1.1 użyto w poszukiwaniach FASTA w publicznych bazach danych w celu wykrycia jakiejkolwiek sekwencji zgodnej i/lub podobnej. Żadnej zgodności ze znanymi genami lub EST nie stwierdzono, jakkolwiek ustalono około 45% podobieństwo do ludzkich i mysich genów TNFR-2. Startowy kodon metioninowy znaleziono przy parze zasad 124 sekwencji nukleotydowej, za którym następuje LORF kodujący 401 reszt aminokwasowych zakończony przy parze zasad 1327. Przewidziano, że produkt o 401 resztach aminokwasowych ma hydrofobowy peptyd sygnałowy o około 31 resztach przy jego N-końcu i 4 potencjalne miejsca N-glikozylacji. Nie stwierdzono żadnych międzybłonowych wiązań sekwencji przy użyciu programu PepPlot (Wisconsin GCG package, wersja 8.1). Wykrytą

187 408 sekwencję 401 aminokwasową użyto następnie do poszukiwań w proteinowych bazach danych. Ponownie, nie było żadnych istniejących zgodnych związków, jakkolwiek okazało się, że jest silne podobieństwo do wielu członów superrodziny TNFR, a najbardziej do ludzkiego i mysiego TNFR-2. Spasowanie sekwencji tej nowej proteiny ze znanymi członami superrodziny otrzymano stosując program Pileup, modyfikowany następnie przez PrettyPlot (Wisconsin GCG package, wersja 8.1). Zestrojenie to wykazuje wyraźną homologię pomiędzy produktem genu FRI-1 o pełnej długości i wszystkimi innymi członami rodziny TNFR. Homologiczne obszary obejmują zewnątrzkomórkowe domeny członów rodziny TNFR i odpowiadają trzem lub czterem bogatym w cysteinę powtórzeniom znalezionym we wiążącej ligand domenie tych protein. To sugerowało, że gen FRI-1 kodował nowy człon rodziny TNFR. Ponieważ nie stwierdzono żadnych transbłonowych wiążących obszarów przewidywaliśmy, że może to być wydzielony receptor, podobny do receptorów rozpuszczalnych pochodnych TNFR-1 (Kohno i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331-8335 (1990). Wskutek przejawianej biologicznej aktywności genu FRI-1, (patrz niżej), produkt nazwano Osteoprotegeryną (OPG).

Przykład II

Wzorce ekspresji mRNA OPG w tkankach

Szereg biotów typu Northern tkanki ludzkiej (Clontech) sondowano znakowanym 32p-dCTP produktem PCR FRI-1 w celu określenia rozmiarów transkryptu ludzkiego i wzorców ekspresji. Bioty Northern wstępnie hybrydyzowano w 5X SSPE, '50% formamidu, 5X roztwór Denhardt'a, 0,5% SDS, i 100 pg/ml denaturowanego DNA spermy łososia, przez 2-4 godziny w temperaturze 42°C. Bioty następnie hybrydyzowano w 5X SSPE, 50% formamidu, 2X roztwór Denhardt’a, 0,1% SDS i 100 pg/ml denaturowanego DNA spermy łososia, i 5 ng/ml znakowanej sondzie, przez 18-24 godziny w temperaturze 42°C. Bloty następnie przemyto w 2X SSC w ciągu 10 minut w temperaturze pokojowej, 1X SSC przez 10 minut w 50°C, a następnie w 0,5X SSC przez 10-15 minut.

Przy użyciu sondy pochodzącej z genu szczura, wykryto dominujące typy mRNA o względnej masie cząsteczkowej około 2,4 kb w kilku tkankach, obejmujących nerki, wątrobę, łożysko i serce. Największe poziomy wykryto w nerkach. Duży fragment mRNA o Mr 4,5 i 7,5 kb wykryto w mięśniach szkieletowych i trzustce. W tkankach ludzkiego płodu stwierdzono, że w nerkach występuje ekspresja stosunkowo wysokiego poziomu mRNA o 2,4 kb. Przy użyciu ludzkiej sondy (patrz niżej), wykryto tylko transkrypt o 2,4 kb w tych samych tkankach. W dodatku, stosunkowo wysoki poziom transkryptu o 2,4 kb wykryto w węzłach limfatycznych, grasicy, śledzionie i wyrostku robaczkowym. Wielkość transkryptu wykrytego przez oba geny: szczurzej i ludzkiej osteoprotegeryny, była prawie identyczna z długością szczurzego insertu pB1.1 FRI-1, sugerując, że był to o pełnej długości klon cDNA.

Przykład III

Systemowe dostarczanie OPG w transgenicznych

Klony pB1.1 szczurzego OPG stosowano jako szablon aby amplifikować PCR kodowany obszar do subklonowania w specyficznym ApoE-wątrobowym wektorze ekspresji (Simonet i inni., J. Clin. Invest. 94, 1310-1319 (1994) i zgłoszenie PCT Nr US94/11675 oraz współzgłaszane U.S. Serial Nr 08/221,767). Następujące primery oligonukleotydów 5’ i 3’ zastosowano odpowiednio dla amplifikacji PCR:

5'-GACTAGTCCCACAATGAACAAGTGGCTGTC-3’ (SEQ ID NO:9)

5'-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTCTGAAACAGCCCAGTGACCATTC-3' (SEQ ID NO: 10)

Mieszaninę reakcyjną PCR (Boehringer-Mannheim) poddano następującej obróbce: w temperaturze 94°C przez 1 minutę, 1 cykl; 94°C przez 20 sekund, w 62°C przez 30 sekund i w 74°C przez 1 minutę, 25 cykli. Po amplifikacji, próbki oczyszczono przy użyciu kolumn typu Qiagen PCR i trawiono przez noc restrykcy’nymi enzymami SpeI i NotI. Wytrawione produkty ekstrahowano i wytrącono oraz subklonowano do wektora ekspresji promotora ApoE. Przed mikroinjekcją otrzymanego klonu, HE-OPG, był on sekwencjonowany by

187 408 stwierdzić, że jest wolny od mutantów.

Plazmid HE-OPG oczyszczono w dwóch etapach odwirowania z gradientem stężenia CsCl. Oczyszczony plazmid DNA wytrawiono z XhoI i Asel, a transgesiczny issert o 3,6 kb oczyszczono metodą elektroforezy żelowej. Oczyszczony fragment rozcieńczono do zasobowego roztworu injekcyjsego 1 pg/ml w 5 mM Tris o pH = 7,4 i 0,2 mM EDTA. Jednokomórkowe embriony myszy BDF1 x BDF1 wstrzyknięto, jak to opisano (Brisster i is., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4338 (1985)), z wyjątkiem tego, że igły injekcyjne były ścięte skośnie i ^Ekonomne przed użyciem. Embriony poddano hodowli przez noc w inkubatorze w atmosferze CO2 i 15 do 20 dwukomórkowych embrionów przeniesiono do jajowodów pseudociążowej mysiej samicy CD1.

Po zakończeniu ciąży, otrzymano 49 potomków z implantacji embrionów po mikroinjekcji. Potomstwo skrinisgowano przez amplifikację PCR integrowanego w genomicznych próbkach DNA. Docelowym obszarem dla amplifikacji był obszar 369 bp ludzkiego istrosu ApoE, który był włączony w wektor ekspresji. Oligomerami użytymi dla amplifikacji PCR były:

5'-GCC TCT AGAAAG AGC TGG GAC-3' (SEQ ID NO: 11)

5'-CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3' (SEQ ID NO: 12)

Warunki PCR były następujące: 94°C przez 2 minuty, 1 cykl; 94°C przez 1 minutę, 63°C przez 20 sekund i 72°C przez 30 sekund, 30 cykli. Spośród 49 oryginalnych potomków, 9 zidentyfikowano jako pozytywne PCR transgesiczne zwierzęta.

Pięć trass-esiczsych zwierząt w wieku 8-10 tygodni (oznaczonych numerami 2, 11, 16, 17 i 28), oraz pięć kontrolnych (oznaczonych numerami 1, 12, 15, 18 i 30) uśmiercono i poddano analizom patologicznym. Wątrobę wyodrębniono z pozostałych 4 zwierząt transgesicznych przez częściową hepatektomię. W celu wykonania częściowej hepatektomii myszy znieczulono i usuwano im płat wątroby operacyjnie. Z komórek wątrób wszystkich trassgesicznych zwierząt wyodrębniono RNA oraz z 5 negatywnych kontrolnych zwierząt z tych samych miotów, jak to opisano (McDonald i isni., Meth. Enzymol. 152, 219 (1987)). Analizę biotów typu Northern przeprowadzono na tych próbkach, aby oszacować poziom transgesicznej ekspresji. Około 10 pg całego RNA z wątroby każdego zwierzęcia rozdzielono metodą żelowej elektroforezy denaturującej (Ogdes i isni., Meth. Eszymol 152. 61 (1987)), po czym przeniesiono sa nylonową membranę HYBOND-N (Amersham) i sondowano znaczonym ³²P dCTP pB1.1 insertem DNA. Hybrydyzację przeprowadzono przez noc w temperaturze 42°C w roztworze zawierającym 50% formamid, 5X SSPE, 0,5% SDS, 5X roztwór Deshardt’a, 100 pg/ml denaturowanego DNA spermy łososia i 2-4 x 10⁶ cpm znaczonej sondzie/ml hybrydyzacyjsego buforu. Po hybrydyzacji bioty przemyto dwukrotnie po 5 misut w roztworze 2 xSSC, 0,1% SDS w temperaturze pokojowej, a sastępsie dwukrotnie, po 5-10 minut, w 0,1 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 55°C. Ekspresję u zwierząt transgesiczsach i kontrolnych zwierząt określono następnie metodą αhtoradiograficzną.

Dane z Nothem Blot wskazują, że 7 z trunsgenlcznach zwierząt wydziela wykrywalne poziomy transgesicznego mRNA (zwierzęta 2,11,16,17,22, 33 i 45). Negatywna grupa kontrolna myszy i jedno ze zwierząt trasgesicznych nie wydzielało mRNA pokrewnego transgesowi. Ponieważ przewiduje się, że OPG ma być wydzielaną proteiną, sadekcpresCα mRNA transgesicznego powinna odpowiadać poziomowi produktu genowego dostarczanego układowo. Z PCR oraz prób Nothem Blot pozytywnych myszy, zwierzęta 2, 17 i 22 wykazały się najwyższymi poziomami transgenicznego mRNA i mogą przejawiać bardziej ekstensywne biologiczne efekty sa komórki gospodarza i w tkanki.

Przykład IV

Biologiczna aktywność OPG

Pięć spośród trassgenicznych myszy (zwierzęta 2, 11, 16, 17 i 28) i 5 osobników kontrolnych z tego samego miotu (zwierzęta 1, 12, 15, 18 i 30) uśmiercono i poddano analizie patologicznej, stosując następującą procedurę: Przed uśmierceniem, numery idestyfikacyjse wszystkich zwierząt zweryfikowano, po czym zwierzęta zważono, znieczulono i upuszczono

187 408 im krew. Krew przechowywano zarówno jako surowicę, jak i w postaci pełnej krwi w celu kompletnej analizy chemicznej i hematologicznej surowicy. Radiografię przeprowadzono natychmiast po ostatnim znieczuleniu przez letalną inhalacją CO2, a przed głównym cięciem. Następnie usunięto tkanki i utrwalono w roztworze formaliny buforowanej 10%-Zn, dla badań histologicznych. Zebrane tkanki obejmowały: wątrobę, śledzionę, trzustkę, żołądek, dwunastnicę, jelito cienkie, jelito grube, nerki, organy rozrodcze, gruczoły skórne i mleczne, kości, mózg, serce, płuco, grasicę, tchawicę, przełyk, tarczycę, jelito czcze, jelito ślepe, odbytnicę, nadnercza, pęcherz moczowy, i mięśnie szkieletowe. Przed utrwaleniem określono ciężary całych organów: wątroby, żołądka, nerek, nadnerczy, śledziony i grasicy. Po utrwaleniu tkanki zachowano w blokach parafinowych i sporządzono sekcje skrawki 3 jm. Tkankę kostną odwapniono przy użyciu roztworu kwasu mrówkowego i wszystkie skrawki wybarwiono za pomocą hematoksyliny i eozyny. Ponadto, wykonano barwienia niektórych tkanek retikuliną Gomoriego i Masson's trichrome. Następnie wykonano enzymatyczne badania histochemiczne by określić ekspresję fosfatazy odpornej na kwas winowy (TRAP), enzymu wydzielanego w znacznych ilościach przez osteoklasty, wielojądrowe komórki resorbujące kości z rodziny monocyty-makrofagi. Badania immunohistochemiczne dla antygenu powierzchni monocyty-makrofagi BrdU i F480 również przeprowadzono, aby wykryć komórki replikujące się i komórki z rodziny monocyty-makrofagi, odpowiednio. W celu wykrycia ekspresji antygenu powierzchniowego F480, utrwalone w formalinie i umieszczone w parafinie skrawki 4 jm pozbawiono parafiny i uwodniono dejonizowaną wodą. Skrawki poddano działaniu 3% roztworu wody utlenionej, zablokowano preparatem Proteine Block (Lipshaw, Pittsburgh, PA), i inkubowano w szczurzym monoklonalnym anty-mysim F480 (Harlan, Indianapolis, IN). Przeciwciało to wykryto przez biotynylowane immunoglobuliny anty-szczurze królika, streptawidynę skoniugowaną z peroksydazą (BioGenex San Ramon, CA), z DAB jako chromagenem (BioTek, Santa Barbara, CA). Skrawki były barwione kontrastowo hematoksyliną.

Po sekcji i obejrzeniu tkanek trzewnych nie znaleziono żadnych anomalii w ekspresorach transgenicznych ani w grupie zwierząt kontrolnych z tego samego miotu. Analiza wagi organów wskazuje, że rozmiary śledziony zwiększyły się o około 38% w przypadku transgenicznych myszy w stosunku do zwierząt kontrolnych. Wystąpiło również niewielkie zwiększenie wielkości płytek krwi i podwyższenie ilości niezabarwionych komórek w krążeniu u transgenicznych ekspresorów. Zaobserwowano marginalne zmniejszenie ilości płytek u transgenicznych ekspresorów. Ponadto, u transgenicznych ekspresorów obniżył się poziom kwasu moczowego w surowicy, azotu w moczu i alkalicznej fosfatazy. U tych zwierząt stwierdzono wzrost radiogęstości szkieletu, w tym kości długich (udowych), kręgów i kości płaskich (miednica). Względne rozmiary kości udowych u ekspresorów nie różniły się od tych z grupy myszy kontrolnych.

Histologiczne analizy wybarwionych skrawków kości od ekspresorów OPG wykazały ostrą osteopetrozę z obecnością pozostałości chrząstki z pierwotnej kości beleczkowatej zaobserwowanej w kostnych beleczkach w trzonie kości udowej. Nie można było zidentyfikować wyraźnie zdefiniowanej kory w sekcjach uda. U normalnych zwierząt centralny trzon jest wypełniony szpikiem kostnym. Skrawki kręgów również wykazują osteopetrotyczne zmiany co oznacza, ze zmiany szkieletowe indukowane przez OPG były układowe. Resztkowy szpik kostny wykazał przeważnie elementy białokrwinkowe (myeloidowe). Megakariocyty były obecne. Barwienie na retikulinę nie wykazywało dowodu na osadzanie się retikuliny. Badania immunohistochemiczne na F480, antygen powierzchniowy komórki ekspresjonowany przez komórki pochodne monocytów-makrofagów u myszy, wykazały obecność F480-pozytywnych komórek w jamach szpikowych. Ogniskowe spłaszczone, F480-pozytywne, komórki mogły być widoczne jako bezpośrednio sąsiadujące z powierzchnią kości beleczkowatych.

Mesenchymalne komórki stanowiące pokrycie kości beleczkowatych były spłaszczone i wyglądały na nieaktywne. Opierając się na barwieniach H&E i TRAP, osteoklasty były rzadko spotykane na powierzchni kości beleczkowatych w ekspresorach OPG. Natomiast osteoklasty i/lub chondroklasty były widoczne w obszarze resorbującej chrząstki płytki wzrostu, ale ich ilość może być zredukowana w porównaniu do zwierząt kontrolnych. Również, osteoklasty były obecne na powierzchni kory przynasady, gdzie modelu34

187 408 jące działanie jest zwykle silne. Dominująca różnica pomiędzy grupą ekspresorów a grupą kontrolną polegała na głębokim zmniejszeniu osteoklastów beleczkowatych, tak w kręgach, jak i kościach udowych. Zakres kumulacji tkanki kostnej był bezpośrednio skorelowany z poziomem mRNA transgenicznego OPG stwierdzonym metodą Northern Blotting całego RNA wątroby.

Śledziony z ekspresorów OPG miały wzrost ilości czerwonej miazgi, co wynikało ze wzrostu hematopoezy. Reprezentowane są wszystkie rodziny hematopoetyczne. Komórki F480-pozytywne były obecne w czerwonej miazdze zarówno u zwierząt kontrolnych jak i u zwierząt ekspresorowych. Dwa z ekspresorów (2 i 17) miały ogniska hematopoezy pozaszpikowej w obrębie wątroby, a wynika to prawdopodobnie z osteopetrotycznego szpiku.

Nie stwierdzono anomalii w grasicy, węzłach chłonnych, przewodzie żołądkowo-jelitowym, układzie oddechowym, układzie rozrodczym, i płciowo-moczowym, na skórze, w układzie nerwowym, w sercu, aorcie, piersiach, mięśniach szkieletowych i tłuszczu.

Przykład V

Wyodrębnienie mysiego i ludzkiego OPG cDNA

Klon cDNA odpowiadający końcowi 5'- mysiego OPG mRNA wydzielono z biblioteki cDNA mysich nerek (Clontech) przez amplifikację PCR. Oligonukleotydy uzyskano z sekwencji szczurzego cDNA OPG i przedstawiono poniżej:

5'-ATCAAAGGCAGGGCATACTTCCTG-3' (SEQ ID NO: 13)

5'-GTTGCACTCCTGTTTCACGGTCTG-3' (SEQ ID NO: 14)

5'-CAAGACACCTTGAAGGGCCTGATG-3' (SEQ ID NO: 15)

5'-TAACTTTTACAGAAGAGCATCAGC-3' (SEQ ID NO: 16)

5'-AGCGCGGCCGCATGAACAAGTGGCTGTGCTGCG-3' (SEQ ID NO: 17)

5'-AGCTCTAGAGAAACAGCCCAGTGACCATTCC-3' (SEQ ID NO: 18)

Produkty o częściowej i pełnej długości cDNA otrzymane w tym procesie były sekwencjonowane. Produkt o pełnej długości trawiono Not I i Xba I, po czym w sposób ukierunkowany klonowano do wektora plazmidu pRcCMV (Invitrogen). Otrzymany plazmid nazwano pRcCMV-Mu-OPG. Sekwencję nukleotydu klonowanego produktu porównano z sekwencją szczurzego cDNA OPG W obszarze ponad 1300 par zasad obejmującym OPG LORF, sekwencje szczurzego i mysiego cDNA były w około 88% identyczne. Stwierdzono, że sekwencja mysiego cDNA zawierająca LORF o 401 aminokwasach, którą porównano z sekwencją szczurzej proteiny OPG, jest w około 94% identyczna, bez luk. Wskazuje to, że sekwencja wydzielonego mysiego cDNA koduje mysią proteinę OPG oraz, że sekwencja i struktura były w najwyższym stopniu zachowane w ciągu ewolucji. Sekwencja mysiej proteiny OPG zawiera identyczne domniemane peptydy sygnałowe przy jej N-końcach i wszystkie 4 potencjalne miejsca N-glikozylacji są zachowane.

Częściowy ludzki cDNA OPG klonowano z biblioteki cDNA ludzkich nerek, przy użyciu następujących szczurzych-specyficznych oligonukleotydów:

5'-GTG AAG CTG TGC AAG AAC CTG ATG-3' (SEQ ID NO: 19)

5'-ATC AAA GGC AGG GCA TAC TTC CTG-3' (SEQ ID NO:20)

Ten produkt PCR sekwencjonowano i stosowano do projektowania primerów dla amplifikacji końca 3'- ludzkiego cDNA, przy użyciu ludzkiego klonu genomowego OPG w lambda jako szablonu:

5'-TCCGTAAGAAACAGCCCAGTGACC-3' (SEQ ID NO:29) 5'-CAGATCCTGAAGCTGCTCAGTTTG-3’ (SEQ ID NO:21)

187 408

AmplSfsenwupy produkt PCR seewepoSnpuwanu i razem z sekwencją końca 5' użyto do zaprojektowania 5' i 13' ludzkich-specyficznych primerów, przydatnych dla amplifikowania całych sekwencji kodujących ludzkiego cDNA OPG:

5'-kGCGCGGCCGCGGGmACCACAATmkACAAGTTG-3' (SEQ ID NO:22)

I'-AGCTCTAGkATTGTGAGGAkACAmCTCkATGmC-I' (SEQ ID NO:23)

Ludzki produkt PCR o pełnej długości był skewkpojonnwana, a następnie w sposób ukikruneowupa klonowany do wektora plazmidu pRcCMV (InyStrogen) przy użyciu NotI i XbaI. Otrzymany plazmid nazwano pRoCMV-ludyeS OPG. Sekwencję nuelentadnwą elnpuwupegn produktu porównano z sekwencjami szczurzego i mysiego OPG cDNA. W obszarze ponad 1300 par zasad nbejmuSącym OPG LORF, ckkwkpcjk syozarykgn i masSkgn DNA były w około 78-88% identyczne z ludzkim cDNA OPG Sekwencja ludzkiego OPG cDNA również zawierała LORF o 401 umipnkwucaoh, i była porównana z sekwkposami proteiny szczurzej i mysiej. Przewidywana ludzka proteina OPG jest identyczna odpowiednio w około 85% i w około 90% ze szczurzą i mysią proteinami. Porównanie sekwencji szczurzych, mysich i ludzkich protein wskazuje, że były one w pujważsyam stopniu zachnwunk podczas ewolucji. Przewiduje się, że ludzka proteina posiada N-końcowy peptyd sygnałowy oraz 5 potkncSulpach mieSsc N-glikozylaoSi, z których 4 są zachowane między szczurzymi i mysimi proteinami OPG.

Sekwencję DNA i przewidywaną sekwencję aminokwasów mysiego OPG pokazano na rasapkaoh fig. 9A i 9B (SEQ ID NO: 122). Sekwencję DNA i przewidywaną sekwencję aminokwasów ludzkiego OPG pokazano na rysunkach fig. 9C i 9D (SEQ ID NO: 124). Porównanie sekwencji aminokwasów szczurzego, masikgn i ludzkiego OPG pokazano na rysunkach fig. 9E i 9F.

Wyodrębnienie dodatkowych klonów ludzkiego cDNA OPG ujawniło nbkonnść zmiany zasad „G” na „C” w pnyaoji 103 sekwencji DNA, pokazanej na rysunku fig. 9C. Wypiei tych zmian w nukleotadzie powoduje podstawienie uspurugipa w mikjsce lizyny w pnzyosl „3” seewenoSi umipnewasowęj pokazanej na rysunku fig. 9C. Poynstułu część sekwencji w klonach posiadających tę zmianę była identyczna z przedstawionymi na rysunkach fig. 9C i 9D.

Przykład VI

Mndelnwanik trójwymiuroweS struktury OPG

Amino-końcowa część OPG wykayuSe hnmulogię do zewnątrzkomórkowej części wszystkich znanych członów superrodyina TNFR (rysunek 1C). Najbardziej wybitnym motywem w tym obszarze genów pnerewpach TNFR jest powtarzana, o oknłn 40 amipnkwasach, sekwencja bogata w cysteinę, która składa się w wyraźne struktury (Banner i inni., Cell 73, 431-445 (1993)). Motyw ten jest zwykle przedstawiany w postaci czterech (przedział 3-6) powtórzeń tandemowych (patrz fig. 1C) i wSadnmn, że jest związany zwiεyapiem ligandu (Beutler i van Huffel Science 264, 667-663 (1994)). Każde powtórzenie zawiera zwykle sześć rozdzielonych reszt cysteSnnwyoh, które są związane z tworzeniem trzech wewnątrzdomepuwach wiązań dwusiarczkowych określanych SS1, SS2 i SS3 (Banner i inni, ibid). W przypadku niektórych receptorów, takich jak TNFR2, CD30 i CD40, niektóre z powtarzanych domen zawierają tylko dwa wewpątrzłańoaohnwe wiązania dwusiurczenwk (SS1 i SS3).

Sekwencja proteiny ludzkiej OPG została przyłożona do profilu domeny zewnątrzkomórenwej TNFR1 przy zastosowaniu metod opisanych przez Laetha'kgo i innych, ibid, a wyniki przedstawiono graficznie przy użyciu programu ZrettyPlot z Wiscopsip Package, Versiop 8.1 (GkPetios Computer Group, Madison, WI; fig. 10). poróppupie wskazuje wyraźne zachowanie reszt oastkipowaoh, związanych z twurzepSkm domen 1-4. Przyłożenia tego użyto następnie do skonstruowania trójwymiarowego modelu N-końcowej domeny ludzkiego OPG, przy użyciu znanej tróSwamSurowej struktury ykwnątryeomórknweS domeny TNFR1 p55 (Banner i inni, ibid) jako wzorca. W celu wykupunia tego współrzędne atomowe szkieletu pkptadowkgn i łańcucha bocznego identycznych reszt sknpiowupn ze współrzędnych struktury krystalicznej TNFR1. Następnie pozostałe współrzędne dla wstawek oraz różnych

187 408 łańcuchów bocznych wyprowadzono przy użyciu programu LOOK (Molecular Applications Group, Palo Alto, CA). Następnie model trójwymiarowy ulepszono przez minimalizację jego energii konformacyjnej przy użyciu programu LOOK.

Przez analogię z innymi członami rodziny TNFR, zakłada się, ze OPG wiąże się z ligandem. W celu modelowania oddziaływań OPG z jej ligandem, zastosowano strukturę krystaliczną TNF-β dla symulowania trójwymiarowego przedstawienia „ligandu OPG”. Dane te przedstawiono graficznie (patrz fig. 11) przy użyciu Molscript (Kraulis, J. Appl. Cryst. 24. 946-950, 1991). Skonstruowano model kompleksu OPG/ligand z 3 TNIfo i 3 cząsteczkami OPG gdzie względne pozycje OPG są identyczne jak TNFR1 w strukturze krystalicznej. Następnie model ten użyto do znalezienia reszt OPG które mogłyby oddziaływać z jej ligandem, stosując następujące podejście: obliczono dostępną dla rozpuszczalnika powierzchnię wszystkich reszt w kompleksie i jeden pojedynczy model OPG. Reszty, które mają inną dostępność w kompleksie aniżeli w monomerze mogą oddziaływać z ligandem.

Sekwencje aminokwasowe OPG ludzkie i mysie ponownie przyłożono stosując tę informację do wyróżnienia sekwencji zawierających każdą z domen bogatych w cysteinę 1-4 (fig. 12A i 12B). Każda z domen ma indywidualne cechy strukturalne, które można przewidzieć:

Domena 1

Zawiera 4 cysteiny związane z wiązaniami dwusiarczkowymi SS2 (C41 do C54) oraz SS3 (C44 do C62). Jakkolwiek żadne wiązanie SS1 nie jest w sposób widoczny oparte na mostkach dwusiarczkowych, zachowana tyrozyna w pozycji 28 jest homologiczna do Y20 w TNFR1, o którym wiadomo, że jest zaangażowane w oddziaływanie z H66, by wspomóc tworzenie domeny. OPG ma homologiczną histydynę w pozycji 75, co sugeruje, że Y28 i H75 w OPG są ustawione jedna nad drugą w rodzimej proteinie, jak to jest w przypadku homologicznych reszt TNFR1. Przeto, obie z tych reszt mogą być w istocie ważne dla aktywności biologicznej, a obcięcia N-końcowe OPG do i poza Y28 mogą dawać zmienioną aktywność. Ponadto, co do reszt E34 i K43 przewiduje się w oparciu o nasz model trójwymiarowy, że oddziałują ze związanym ligandem.

Domena 2

Zawiera sześć cystein i przewiduje się, że zawiera wiązania dwusiarczkowe SS1 (C65 do C80), SS2 (C83 do C98) i SS3 (C87 do C105). Ten obszar OPG zawiera również obszar rozciągający się od P66 do Q91, który porównuje się do części domeny 2 TNFR1, która tworzy ścisłe połączenia z TNF|3 (patrz wyżej) i może oddziaływać z ligandem OPG W szczególności przewiduje się w oparciu o nasze dane strukturalne, że reszty P66, H68, Y69, Y70, T71, D72, S73, H75, T76, S77, D78, E79, L81, Y82, P85, V86, K88, E89, L90 i Q91 oddziałują ze związanym ligandem.

Domena 3

Zawiera 4 cysteiny związane z wiązaniami dwusiarczkowymi SS1 (C107 do C118) i SS3 (C124 do C142), lecz nie z wiązaniem SS2. W oparciu o nasze dane strukturalne przewiduje się, że reszty E115, L118 i K119 oddziałują z ligandem OPG

Domena 4

Zawiera 4 cysteiny związane z wiązaniami dwusiarczkowymi SS1 (C145 do C160) i SS3 (C166 do C185), lecz nie z wiązaniem SS2, podobnie do domeny 3. Nasze dane strukturalne przc'^'i<^i^uj^7 ze E153 i S155 oddzialująz ligandem OPG.

Przeto, przewidywany model strukturalny OPG identyfikuje pewną liczbę wysoko zachowanych reszt, które prawdopodobnie są ważne dla jego aktywności biologicznej.

Przykład VII

Wytwarzanie rekombinacyjnie wydzielanej proteiny OPG w komórkach organizmów ssaków

W celu określenia, czy OPG jest rzeczywiście proteiną wydzielansą cDNA OPG myszy poddano fuzji do ludzkiej domeny IgG1 Fc jako znacznika (Capon i in., Nature 337, 525-531 (1989)) i poddano ekspresji w ludzkich fibroblastach 293. Fuzje Fc przeprowadzono stosując wektor pFc-A3. pFc-A3 zawiera obszar kodujący część Fc ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny IgG-1 (Ellison i inni, ibid), od pierwszego aminokwasu zawiasowej domeny

187 408 (Glu-99) do końca karboksylowego, i ograniczony przez miejsce fuzyjne 5'-NotI oraz miejsca 3'-SalI i XbaI. Plazmid skonstruowano przez amplifikacje PCR biblioteki cDNA ludzkiej śledziony (Clontech).

Reakcje PCR miały w końcowej objętości 100 pl wykorzystywały 2 jednostki polimerazy DNA typu Vent (New England Biolabs) w 20 mM Tris-HCl (pH = 8,8), 10 mM KCl, 10 pM (NH42SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100 z 400 pM każdego dNTP i 1 ng z biblioteki cDNA do amplifikacji razem z 1 pM każdego primera. Reakcje zainicjowano przez denaturację w 95°C przez 2 minuty, a następnie 30 cykli w 95°C po 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, i 73°C przez 2 minuty. Primer 5':

5'IATAGCGGCCGCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC-β' (SEQ ID NO:24) włączył miejsce NotI bezpośrednio 5' do pierwszej reszty (Glu-99) zawiasowej domeny IgG-g1. Primer 3':

5'-TCTAGAGTCGACTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTT-3' (SEQ ID NO:25) włączył miejsca SalI i XbaI. Produkt PCR o 717 parach zasad trawiono z NotI i SalI, wyodrębniono elektroforetycznie przy użyciu 1% agarozy (FMC Corp.), oczyszczono w myśl procedury Geneclean (BIO 101, Inc) i klonowano do wektora pBluescript II KS (Stratagene) wytrawionego z NotI i SalI. Insert w uzyskanym plazmidzie, pFc-A3, poddano sekwencjonowaniu by potwierdzić wierność reakcji PCR.

Klonowany cDNA myszy w plazmidzie pRcCMV-MuOPG amplifikowano przy użyciu następujących dwóch zbiorów par primerów:

Para 1:

5'ICCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAGI3^, (SEQ ID NO:26)

S^CCTCTGCGGCCGCTAAGCAGCTTATTTTCACGGATTGAACCTGG' (SEQ ID NO:27)

Para 2:

5'-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAGI3’ (SEQ ID NO:28)

5^,ICCTCTGCGGCCGCTGTTGCATTTCCTTTCTGIβ’ (SEQ ID NO:30)

Pierwsza para amplifikuje cały LORF OPG, i tworzy miejsce restrykcyjne NotI, które jest zgodne z miejscem NotI „w ramce” w wektorze fuzyjnym Fc pFcA3. Wektor pFcA3 wytworzono przez wbudowanie miejsca restrykcyjnego 5' NotI do reszty kwasu asparaginowego 216 ludzkiego cDNA IgG1 Fc. Konstrukt ten wprowadza linker, który koduje dwa nieistotne aminokwasy, które spinają połączenie pomiędzy proteiną OPG i obszarem IgG Fc. Produkt ten, jeżeli jest przyłączony do części Fc, mógłby kodować wszystkie 401 reszty OPG następujące bezpośrednio po wszystkich 227 resztach aminokwasowych obszaru (F1.Fc) ludzkiego IgG1 Fc. Druga para primerów amplifikuje sekwencje DNA kodujące pierwsze 180 reszt aminokwasowych OPG, które obejmują domniemaną domenę wiązania ligandu. Tak jak wyżej, primer 3' tworzy sztuczne miejsce restrykcyjne NotI, które poddaje fuzji C-końcowo obcięty LORF OPG w pozycji treoniny 180, bezpośrednio do domeny IgG1 Fc (CT.fc).

Sekwencję aminokwasową łączącą resztę 401 OPG i resztę 221 kwasu aseptycznego obszaru ludzkiego Fc, można zmodyfikować jak następuje: Kodujące DNA reszty 216-220 obszaru Fc ludzkiego można usunąć jak to opisano poniżej lub resztę cysteinową odpowiadającą C220 obszaru Fc ludzkiego można zmutować do seryny lub alaniny. Proteina fuzyjna OPG-Fc kodowana przez te zmodyfikowane wektory może być transfekowana do komórek 293 ludzkich lub komórek CHO, a rekombinacyjną proteinę fuzyjną OPG-Fc można oczyszczać, jak opisano poniżej.

187 408

Oba produkty w sposób ukierunkowany klonowano do wektora plazmidu pCEP4 (Invitrogen). pCEP4 zawiera źródło replikacji wirusa Epsteina-Barra, i jest zdolne do episomalnej replikacji w komórkach 293-EBNA-1. Macierzysty pCEP4 oraz wektory pCEP4-Fl.Fc i pCEP4-CT.Fc były lipofekowane do komórek 293-EbNa-1 przy zastosowaniu metod zalecanych przez producenta. Transfekowane komórki były następnie wyselekcjonowane w 100 pg/ml hygromycyny w celu wyodrębnienia dla ekspresji wektora i otrzymane masy hodowli odporne na lek rozrosły się do zlania. Komórki poddano następnie hodowli w pożywce wolnej od surowicy przez 72 godziny, a kondycjonowane pożywki usunięto i zanalizowano metodą SDS-PAGE. Wybarwianie srebrem żelu poliakryloamidowego wykrywa główne proteiny kondycjonowanych pożywek wytwarzane przez odporne na lek hodowle 293. W pożywkach kondycjonowanych pCEP4-Fl.Fc ipCEP4-CT.Fc niepowtarzalnie pasma domniemanych rozmiarów pojawiły się obficie (patrz fig. 13B i 13C). Proteina fuzyjna Fc o pełnej długości nagromadziła się w wysokim stężeniu, co wskazuje, że może być trwała. Obydwie proteiny fuz.yjne Fc wykryto za pomocą przeciwciał anty-ludzkiego IgG1-Fc (Pierce) na biotach typu Western, co wskazuje, że są to rekombinacyjne produkty OPG

Proteinę fuzyjna OPG-Fc o pełnej długości oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej typu Protein-A (Pierce), stosując procedurę zalecaną przez wytwórcę. Proteinę poddano następnie analizie sekwencyjnej od N-końca metodą automatycznej degradacji Edmana, jak to zasadniczo opisano przez Matsudaira i innych (J. Biol. Chem. 262. 10-35 (1987). Odczytano następującą sekwencję aminokwasową po 19 cyklach:

NH2-EEL.LPKYLHYDPETGHQL L-C02H (SEQ ED NO:31)

Sekwencja ta była identyczna do przewidywanej sekwencji aminokwasowej mysiej OPG zaczynającej się przy reszcie aminokwasowej 22 i sugerując, że naturalne wiodące miejsce rozszczepienia w organizmach ssaków znajduje się pomiędzy resztami aminokwasowymi Q21-E22, a nie pomiędzy Y31-D32, jak pierwotnie przewidywano. Eksperymenty ekspresji wykonane w komórkach 293-EBNA z pCEP4-Fl.Fc i pCEP4-CL.Fc wykazują, że OPG jest proteiną wydzielaną i może działać układowo by wiązać swój ligand.

Procedury podobne do użytych do skonstruowania i do ekspresji fuzji muOPG[22-180]-Fc i muOPG[22-401]-Fc zastosowano do jeszcze innych protein fuzyjnych OPG-Fc ludzkich i mysich.

cDNA mysiej OPG kodujący aminokwasy 1-185, który uległ fuzji do obszaru Fc ludzkiego IgG1 [muOPG Ct(185).Fc] skonstruowano jak następuje. cDNA mysiej OPG z plazmidu pRcCMV Muosteoprotegeryny (opisanego w przykładzie V) amplifikowano stosując następującą parę primerów w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), opisanej wyżej:

1333-82:

5’-LCC CTT GCC CLG ACC ACL CLL-3' (SEQ ID NO:32)

1333-80:

5'-CCL CTG CGG CCG CAC AGA CGT TGT CAT GTG LGG C-3' (SEQ ID NO:33)

La para primerów wzmacnia obszar cDNA mysiej OPG kodujący reszty aminokwasowe 63-185 (odpowiadający parom zasad 278-645) ramki odczytu OPG jak pokazano na rysunku fig. 9A. Primer 3' zawiera miejsce restrykcyjne NotI, które jest zgodne z miejscem NotI w ramce wektora fuzji pFcA3. Produkt obejmuje również niepowtarzalne miejsce restrykcyjne EcoRI umiejscowione przy parze zasad 436. Amplifikowany produkt PCR oczyszczono, rozszczepiono z NotI i EcoRI i otrzymany fragment restrykcyjny EcoRI-NotI oczyszczono. Wektor pCEP4 zawierający fuzyjny insert 1-401 mysiej OPG-Fc rozszczepiono z EcoRI i NotI, oczyszczono i poddano ligacji do wytworzonego wyżej produktu PCR. Uzyskany wektor ekspresji oparty na pCEP-4 kodował reszty OPG 1-185 po których bezpośrednio następują wszystkie 227 reszty aminokwasowe obszaru ludzkiej IgG1-Fc. Wektor fuzyjny 1-185.Fc

187 408 mysiej OPG transfekowano do komórek 293, dokonano selekcji przy użyciu leku, a kosdycjonowaae pożywki wytworzono jak opisano wyżej. Uzyskany wydzielony produkt fuzyjny l-185.Fc mysiej OPG oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej typu Proteis-A (Pierce), stosując procedurę zalecaną przez wytwórcę.

DNA mysiej OPG kodujący reszty amisokwasowe 1-194, który uległ fuzji do obszaru Fc ludzkiej IgG1 (muOPG Ct(194).Fc) skonstruowano jak następuje. cDNA mysiej OPG z plazmidu pRcCMv Mu-Osteoprotegeryna amplifikowano przy użyciu następujących par primerów:

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NO:34)

1333-81:

5'-CCT CTG CGG CCG CCT TTT GCG TGG CTT CTC TGT T-3' (SEQ ID NO:35)

Ta para primerów wzmacnia obszar cDNA mysiej OPG kodujący reszty αmlnokwucowe 70-194 (odpowiadający parom zasad 298-672) ramki odczytu OPG Primer 3' zawiera miejsce restrykcyjne Notl, które jest zgodne z miejscem Notl w ramce wektora fuzyjsego Fc pFcA3. Produkt zawiera również niepowtarzalne miejsce restrykcyjne EcoRI umiejscowione przy 436 parze zasad. Amplifikowany produkt PCR klonowano do wektora fuzyjsego mysiej OPG[1-401]-Fc, jak opisano wyżej. Uzyskany wektor ekspresji oparty na pCEP4 koduje reszty OPG 1-194 po których bezpośrednio następują wszystkie 227 reszty aminokwasowe obszaru ludzkiego IgG1 Fc. Wektor fuzyny 1-194.Fc mysiej OPG transfekowano do komórek 293, wyselekcjonowano przy użyciu leku i wytworzono kondycjonowaną pożywkę. Uzyskany wydzielony produkt fuzji oczyszczono przy użyciu chromatografii kolumnowej Proteis-A (Pierce), stosując procedurę zalecaną przez wytwórcę.

DNa ludzkiej OPG kodujący aminokwasy 1-401, który uległ fuzji do obszaru Fc ludzkiego IgG1 skonstruowano jak następuje: DNA ludzkiej OPG w plazmidzie pRcCMV-hu osteosrotegerana (opisany w przykładzie V) amplifikowano stosując następujące primery oligonukleotydowe:

1254-90:

5'-CCT CTG AGC TCAAGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3' (SEQ ID NO:36)

1254-95:

5'-CCT CTG CGG CCG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTG AAT GG-3' (SEQ ID NO:37)

Uzyskasy produkt PCR koduje proteinę ludzkiej OPG o pełsej długości i tworzy miejsce restrykcyjne Notl, które jest zgodne z miejscem Notl w ramce wektora fuzyjsego FcA3. Produkt PCR klonowano w sposób ukierunkowany do wektora plazmidu pCEP4, jak opisano wyżej. Uzyskany wektor ekspresji koduje reszty 1-401 ludzkiej OPG, po których bezpośrednio następuje 227 reszt amisokwasowych ludzkiego obszaru IgG1-Fc. Wytworzono kondycjonowane pożywki z transfekowanych i wyselekcjonowanych przy pomocy leku komórek i produkt fuzji huOPG F1.Fc oczyszczono przy użyciu chromatografii kolumnowej typu Protein-A (Pierce), stosując procedurę zalecaną przez wytwórcę.

DNA ludzkiej OPG kodujący reszty aminokwasowe 1-201, który uległ fuzji do obszaru Fc ludzkiej IgG1 [huOPG Ct(201).Fc], skonstruowano jak następuje. Sklonowany cDNA ludzkiej OPG z plazmidu pRrCMV-hu osteoprotegeryna, amplifikowano przez PCR, stosując następującą parę primerów oligosukleotydowych:

1254-90:

5-CCT CTG AGC TCAAGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3' (SEQ ID NO:38)

187 408

1254-92:

5'-CCT CTG CGG CCG CCA GGG TAA CAT CTATTC CAC-3' (SEQ ED NO:39)

Ta para primerów wzmacnia obszar cDNA ludzkiej OPG kodujący reszty aminokwasowe 1-201 ramki odczytu OPG i tworzy miejsce restrykcyjne NotI przy końcu 3', które jest zgodne z miejscem NotI w ramce wektora fuzyjnego Fc FcA3. Produkt ten, kiedy jest przyłączony do części Fc, koduje reszty 1-201 OPG, po których bezpośrednio następują wszystkie 221 reszt aminokwasowych obszaru ludzkiego IgGI Fc. Uzyskany produkt pCr klonowano w sposób ukierunkowany do wektora plazmidu pCEP4, jak opisano wyżej. Wytworzono kondycjonowane pożywki z transfekowanych i wyselekcjonowanych przy pomocy leku komórek, a produkty fuzyjne hu-OPG Ct(201) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej typu Protein-A (Pierce), stosując procedurę zalecaną przez wytwórcę.

Następujące procedury użyto do skonstruowania i ekspresji mysiej i ludzkiej OPG, których nie poddano fuzji.

Plazmid do ekspresji w komórkach ssaka mysiej OPG o pełnej długości (reszty 1-401) wytworzono przez amplifikację PCR insertu cDNA mysiej OPG zpRcCMV Mu-osteoprotegeryna i subklonowano do wektora ekspresji pDSRa (DeClerck i inni., J. Biol. Chem. 266, 3893 (1991)). Stosowano następujące primery oligonukleotydowe:

1295-26:

5'-CCG AAG CTT CCA CCA TGA AGA AGT GGC TGT GCT GC-3' (SEQ ID NO:40)

1295-27:

5'-CCT CTG TCG ACT ATT ATA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G-3' (SEQ ID NO:41)

Pełnej długości ramkę odczytu mysiej OPG amplifikowano przez PCR, jak opisano wyżej. Produkt PCR oczyszczono i wytrawiono restrykcyjnymi endonukleazami Hind III i Xba I (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), zgodnie z zaleceniami producenta, po czym ligowano do pDSRa wytrawionego Hind III i Xba I. Rekombinacyjne klony wykryto przez wytrawienie endonukleazą restrykcyjną, a następnie sekwencjonowano, by upewnić się, że nie wytworzono żadnych mutacji podczas etapów amplifikacji PCR.

Otrzymany plazmid pDSRa-muOpG wprowadzono do komórek jajnika chińskiego chomika (CHO) przez transfekcję z pośrednictwem wapnia (Wigier i inni., Cell 11, 233 (1997)). Wyselekcjonowano osobne kolonie w oparciu o ekspresję genu reduktazy dwuhydrofolianowej (DHFR) w wektorze plazmidu i wydzielono kilka klonów. Ekspresję rekombinacyjnej proteiny mysiej OPG monitorowano metodą Western Blot pożywki kondycjonowanej komórkami CHO. Wysoko ekspresjonujące komórki wyodrębniono, a ekspresję OPG dodatkowo amplifikowano przez działanie metotreksatem, jaik opisali DeClerck i inni., ibid. Kondycjonowaną pożywkę z linii komórkowej CHO otrzymano przez dalsze oczyszczanie rekombinacyjnej, wydzielanej proteiny mysiej OPG.

Plazmid do ekspresji w komórkach ssaka ludzkiej OPG o pełnej długości (aminokwasy 1-401) wytworzono przez subklonowanie insertu cDNA z pRcCMV-hu osteoprotegeryna bezpośrednio do wektora pDSRa (DeClerck i inni., ibid). Plazmid pRcCMV-OPG wytrawiono całkowicie z Notl, tępo zakończono z Klenow, po czym wytrawiono całkowicie z Xba I. Wektor DNA wytrawiono z Hind III, tępo zakończono z Klenow, po czym wytrawiono z Xba I, a następnie ligowano do insertu OPG. Rekombinacyjne plazmidy następnie sekwencjonowano w celu potwierdzenia właściwej orientacji cDNA ludzkiej OPG.

Otrzymany plazmid pDSRa-huOPG wprowadzono do komórek jajnika chińskiego chomika (CHO), jak opisano wyżej. Wyselekcjonowano osobne kolonie w oparciu o ekspresję genu reduktazy dwuhydrofolianowej (DHFR) w wektorze plazmidu, i wydzielono kilka klonów?. Ekspresję rekombinacyjnej proteiny ludzkiej OPG monitorowano metodą Western Blot

187 408 pożywki kondycjonowanej komórkami CHO. Wysoko ekspresjonujące klony wyodrębniono, a ekspresję OPG następnie amplifikowano przez działanie metotreksatem. Otrzymano kondycjonowaną pożywkę z linii komórkowej CHO ekspresjonującej ludzką OPG dla oczyszczania proteiny'.

Wektory ekspresji kodujące reszty 1-185 mysiej OPG konstruowano jak następuje. cDNA mysiej OPG z pRcCMV-Mu OPG amplifikowano przy użyciu następujących primerów oligonukleotydowych:

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NO:42)

1356-12:

5'-CTT CTG TCG ACT TAA CAC ACG TTG TCA TGT GTT GC-3' (SEQ ID NO:43)

Ta para primerów wzmacnia obszar cDNA mysiej OPG kodujący aminokwasy 63-185 ramki odczytu OPG (pary zasad 278-654), i zawiera sztuczny stop-kodon bezpośrednio po kodonie cysteiny (C185), po którym następuje sztuczne miejsce endonukleazy restrykcyjnej SalI. Przewidywany produkt zawiera wewnętrzne miejsce restrykcyjne Eco RI, przydatne dla subklonowania do wstępnie istniejącego wektora. Po amplifikacji PCR otrzymany oczyszczony produkt rozszczepiono z endonukleazami restrykcyjnymi Eco RI i SalI, a duży fragment oczyszczono na żelu. Oczyszczony produkt następnie subklonowano do dużego fragmentu restrykcyjnego pBluescript-muOPG F1.Fc wytrawionego Eco RI oraz SalI, jak opisano wyżej. Otrzymany plazmid wytrawiono z Hind III oraz Xho I, a mały fragment oczyszczono na żelu. Fragment ten, który zawiera otwartą ramkę odczytu kodującą reszty 1-185 następnie subklonowano do wektora ekspresji pCEP4 wytrawionego Hind III oraz Xho I. Otrzymany wektor, pmuOPG[l-185], koduje obcięty polipeptyd OPG zakończony resztą cysternową w pozycji 185. Kondycjonowane pożywki z transfekowanych i wyselekcjonowanych za pomocą leku komórek otrzymano jak opisano powyżej.

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NO:44)

1356-13:

5'-CCT CTG TCG ACT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TT-3' SEQ ID NO:45)

Powyższa para primerów amplifikuje obszar cDNA mysiej OPG kodujący aminokwasy 70-194 ramki odczytu OPG (pary zasad 298-672) i zawiera sztuczny stop-kodon bezpośrednio po kodonie lizyny (K194), po którym następuje sztuczne miejsce endonukleazy restrykcyjnej SalI. Przewidywany produkt zawiera wewnętrzne miejsce restrykcyjne Eco RI, przydatne dla subklonowania do wstępnie istniejącego wektora. Po amplifikacji PCR otrzymany oczyszczony produkt rozszczepiono z endonukleazami restrykcyjnymi Eco RI i SalI i duży fragment oczyszczono na żelu. Oczyszczony produkt następnie subklonowano do dużego fragmentu restrykcyjnego pBluescript-muOPG F1.Fc wytrawionego Eco RI oraz SalI, jak opisano wyżej. Otrzymany plazmid wytrawiono z Hind III oraz Xho I, imały fragment oczyszczono na żelu. Fragment ten, który zawiera otwartą ramkę odczytu kodującą reszty 1-185 następnie subklonowano do wektora ekspresji pCEP4 wytrawionego Hind III oraz Xho I. Otrzymany wektor, pmuOPG[1-185], koduje obcięty polipeptyd OPG zakończony lizyną w pozycji 194. Kondycjonowane pożywki z transfekowanych i wydzielonych za pomocą leku komórek otrzymano jak opisano powyżej.

Wygenerowano kilka mutacji przy końcu 5' genu hu-OPG[22-401]-Fc wprowadzającego albo podstawienie lub delecje (usunięcie) aminokwasów z OPG pomiędzy resztami od 22 do 32. Wszystkie mutacje były otrzymane przy użyciu „QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit” (Stratagene, San Diego, CA), w warunkach zalecanych przez producenta. Krótko mówiąc, mieszaninę reakcyjną zawierającą szablon plazmidu huOPG[22-401]-Fc DNA i mutageniczne primery zadano polimerazą Pfu w obecności dezoksynukleotydów, po czym

187 408 amplifikowano w termocyklerze, jak opisano wyżej. Próbkę reakcji następnie transfekowano do kompetentnego E. coli XLI-Blue przez szok termiczny (gwałtowne ogrzanie), po czym płytkowano. Plazmid DNA z transormantow następnie sekwencjonowano by sprawdzić mutacje.

Następujące pary primerów użyto do usunięcia reszt 22-26 z genu ludzkiej OPG, z wytworzeniem w rezultacie proteiny fuzyjnej huOPG[27I401]-Fc,

1436-11:

5'-TGG ACC ACC CAG AAG TCA CTT CAT TAT GAC-3' (SEQ ID NO: 140)

1436-12:

5'-GTC ATA ATG AAG GTA CTT CTG GGT GGT CCA-3' (SEQ ID NO: 141)

Następujące pary primerów użyto do usunięcia reszt 22-28 z genu ludzkiej OPG, z wytworzeniem w rezultacie proteiny fuzyjnej huOPG[29I401]IFc·.

1436-17:

5'-GGA CCA CCC AGC TTC ATT ATG ACG AAG AAA C-3' (SEQ ID NO: 142) 1436-18:

5'-GTT TCT TCG TCA TAA TGA AGC TGG GTG GTC C-3' (SEQ ID NO: 143)

Następujące pary primerów użyto do usunięcia reszt 22-31 genu ludzkiej OPG, z wytworzeniem w rezultacie proteiny fuzyjnej huOPG[32-401]-Fc:

1436-27:

5'-GTG GAC CAC CCA GGA CGAAGAAAC CTC TC-3' (SEQ ID NO: 144) 1436-28:

5'-GAG AGG TTT CTT CGT CCT GGG TGG TCC AC-3' (SEQ ID NO: 145)

Następujące pary primerów użyto do zmiany kodonu reszty tyrozynowej 28 na fenyloalaninę w genie ludzkiej OPG, z wytworzeniem w rezultacie proteiny fuzyjnej huOPG[22-401]-Fc Y28F:

1436-29:

5'-CGT TCC CTC CAAAGT TCC TTC ATT ATG AC-3' (SEQ ID NO: 146)

1436-30:

5-GTC ATA ATG AAG GAA CTT TGG AGG AAACG-3' (SEQ ID NO:147)

Następujące pary primerów użyto do zmiany kodonu reszty prolinowej 26 na alaninę w genie ludzkiej OPG, w rezultacie czego otrzymano proteinę fuzyjną huOPG[22-401]-Fc P26A:

1429-83:

5'-GGA AAC GTT TCC TGC AAA GTA CCT TCA TTA TG-3' (SEQ ID NO: 148)

1429-84:

5'-CAT AAT GAA CCT ACT TTG CAG GAA ACG TTT CC-3' (SEQ ED NO:149)

Każdy otrzymany plazmid muOPG[22-401]-Fc zawierający odpowiednią mutację był następnie transfekowany do ludzkich komórek 293, a zmutowaną proteinę fuzyjną OPG-Fc oczyszczono z kondycjonowanej pożywki jak opisano powyżej. Aktywność biologiczną każdej proteiny oszacowano in vitro w próbce wytworzonego osteoklastu, jak opisano w przykładzie X3.

187 408

Przykład VIII

Ekspresja OPG w E. coli

A. Bakteryjne wektory ekspresji pAMG21

Plazmid ekspresji pAMG21 można uzyskać z wektora ekspresji Amgen pCFM1656 (ATCC #69576), który z kolei może być wyprowadzony z systemu wektorowego ekspresji Amgen, opisanego w Patencie USA Nr 4,710,473. Plazmid pCFM1656 można uzyskać z opisanego plazmidu pCFM836 (Patent nr 4,710,473) przez: (a) zniszczenie dwóch endogennych miejsc restrykcyjnych NdeI przez wypełnienie końców enzymem polimerazy T4, po którym następuje ligowanie ostrych zakończeń; (b) zastąpienie sekwencji DNA pomiędzy niepowtarzalnymi miejscami restrykcyjnymi AatII i ClaI zawierającymi syntetyczny promotor Pl, z podobnym fragmentem uzyskanym z plazmidu pCMF636 (Patent nr 4,710,473) zawierającym promotor Pl.

AatII

5' CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAAAAkTTCA3' TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGGTACGGGGGGGCGGTTTTTATTTAkGT-TATAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATA^TTATCTCTGGCGGTGTTGAC-ATATTTTTTTTATAGATATTGTTTCACGCCAGTATT^rCTAΓAGAGTCCTCGACTTCTT-ATT.ATTACGAGTTTCTTTTATACTGAGGAGAT 3 ' (SEQ ID NO :53) _TATTTATTGTTAGGGCCACTATTAGAGGAGTATC 5'(SEQ ID NO O 55)

ClaI a następnie (c) podstawienie małej sekwencji DNA pomiędzy niepowtarzalne miejsca restrykcyjne ClaI i KpnI następującym oligonukleotydem:

5' GTCAΠGCAAGTAGACGTAGTCTΓAAGAΓAΓGGTTAAGTCGAΓGGACAAGTTTCG 3' (SEQ ID NO:48)

3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5' (SEQ ID NO:49)

ClaI KpnI

Plazmid ekspresji pAMF21 może być następnie uzyskany z pCFM1656 przez wykonanie szeregu zmian zasad ukierunkowanych na miejsce przez mutagenezę oligomerów nakładających się na PCR i podstawień sekwencji DNA. Zaczynając z miejsca BglII (plazmid bp # 180) bezpośrednio w pozycji 5' względem promotora replika bp # 180) bezpośrednio w pozycji 5' względem promotora replikacji plazmidu PcopB, i postępując w kierunku genów replikacji plazmidu, zmiany pary zasad są takie, jak następuje:

187 408

pAMG22 bp #	bp w pCMF1656	Zmiana par zasad w nAMG22
# 204	L/A	C/G
# 428	A/T	G/C
# 509	G/C	A/T
# 617	—	insert dwóch G/C bp
# 679	G/C	T/A
# 980	L/A	C/G
# 994	G/C	A/T
# 1004	A/L	C/G
# 1007	C/G	L/A
# 1028	A/L	T/A
#1047	C/G	L/A
# 1178	G/C	L/A
# 1466	G/C	L/A
#2028	G/C	usunięcie bp
#2187	C/G	L/A
#2480	A/L	T/A
#2499	AGLG	GLCA
- 2502	TCAC	CAGL
#^^42	TCCGAGC AGGCTCG	usunięcie 7 bp
#3435	G/C	A/T
#3446	G/C	A/L
#3643	A/L	T/A

Sekwencja DNA pomiędzy niepowtarzalnymi miejscami restrykcyjnymi AatII (pozycja #4364 wpCFM1656) i SacII (pozycja #4585 wpCFM1656) jest podstawiona następującą sekwencją:

[lepki koniec AatII] 5· <GX5TJACGTATC£ATGGTCTCC(pozycja #4358 w pCMG21) 3’ TGGCCCGGCCGGATACGTACCAGAGG-CGCCGGGCGCGCCGGGAACTGCCACGG::ATCGCCCrJCCCC:G2CCCGG:GCAGTCGACA.GACT-'GGTCCGCTCTGATCCCTCGACGGTCCGTAGTTTATTCCGCTCTCCGCGTCAGCTTTCTGA187 408

GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCG-CGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGC-GCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCCGGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCG-cataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgt-GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAatll

-TTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGACGTCGTACTTAAC-AAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTATGTAAGTTTATACCTGCAGCATGAATTG-TTTTAAAGTATGGGCAATCAATTGCTCCTGTTAAAATTGCTTTAGAAATACTTTGGCAGC-AAAATTTCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATTTTAACGAAATCTTTATGAAACCGTCG-GGTTTGTTGTATTGAGTTTCATTTGCGCATTGGTTAAATGGAAAGTGACCGTGCGCTTAC-CCAAACAACATAACTCAAAGTAAACGCGTAACCAATTTACCTTTCACTGGCACGCGAATG-TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGCTTTTTCCTTCGCATGCCCACGCTAAAC-ATGTCGGATTATAAAAACTTTATAGGGTTCTCGAAAAAGGAAGCGTACGGGTGCGATTTG-ATTCTTTTTCTCTTTTGGTTAAATCGTTGTTTGATTTATTATTTGCTATATTTATTTTTC-TAAGAAAAAGAGAAAACCAATTTAGCAACAAACTAAATAATAAACGATATAAATAAAAAG-GATAATTATCAACTAGAGAAGGAACAATTAATGGTATGTTCATACACGCATGTAAAAATA-CTATTAATAGTTGATCTCTTCCTTGTTAATTACCATACAAGTATGTGCGTACATTTTTAT-AACTATCTATATAGTTGTCTTTCTCTGAATGTGCAAAACTAAGCATTCCGAAGCCATTAT-TTGATAGATATATCAACAGAAAGAGACTTACACGTTTTGATTCGTAAGGCTTCGGTAATA-TAGCAGTATGAATAGGGAAACTAAACCCAGTGATAAGACCTGATGATTTCGCTTCTTTAA-ATCGTCATACTTATCCCTTTGATTTGGGTCACTATTCTGGACTACTAAAGCGAAGAAATT-TTACATTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATATTCCAATTAATCGGTG-AATGTAAACCTCTAAAAAATAAATGTCGTAACAAAAGTTTATATAAGGTTAATTAGCCAC-AATGATTGGAGTTAGAATAATCTACTATAGGATCATATTTTATTAAATTAGCGTCATCAT-TTACTAACCTCAATCTTATTAGATGATATCCTAGTATAAAATAATTTAATCGCAGTAGTA-AATATTGCCTCCATTTTTTAGGGTAATTATCCAGAATTGAAATATCAGATTTAACCATAG-TTATAACGGAGGTAAAAAATCCCATTAATAGGTCTTAACTTTATAGTCTAAATTGGTATC-AATGAGGATAAATGATCGCGAGTAAATAATATTCACAATGTACCATTTTAGTCATATCAG-TTACTCCTATTTACTAGCGCTCATTTATTATAAGTGTTACATGGTAAAATCAGTATAGTC-ataacgcattgattaatatcattattgcttctacaggctttaattttattaattattctgt-TATTCGTAACTAATTATAGTAATAACGAAGATGTCCGAAATTAAAATAATTAATAAGACA-AAGTGTCGTCGGCATTTATGTCTTTCATACCCATCTCTTTATCCTTACCTATTGTTTGTC-TTCACAGCAGCCGTAAATACAGAAAGTATGGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAG-GCAAGTTTTGCGTGTTATATATCATTAAAACGGTAATAGATTGACATTTGATTCTAATAA-CGTTCAAAACGCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATT-ATTGGATTTTTGTCACACTATTATATCGCTTGAAATACAATTGTTTAACATAAGTACCTG-TAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTATTCATGGAC46

187 408

-TAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGATTAATCGATTTGATT-ATCCTAGCATGTCCAAATGCGTTCTTTTACCAAACAATATCAGCTAATTAGCTAAACTAA-CTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGA-GATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTSacII

-GCTCACTAGTGTCGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAA-CGAGTGATCACAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTT-GAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATA-CTTCTTCTTCTTCTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTAT-ACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGG-tgatcgtattggggaaccccggagatttgcccagaactccccaaaaaacgactttcctcc-AACCGCTCTTCACGCTCTTCACGC 3' [lepki koniec SacII] (SEQ ID NO:50)

-TTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTG 5’ (pozycja #5904 w pAMG21) (SEQ ID NO:46)

Podczas ligowania lepkich końców tej podstawianej sekwencji DNA, ulegają zniszczeniu zewnętrzne miejsca AatII i SacII. W podstawionym DNA są niepowtarzalne miejsca AatII i SacII.

pAMG22-His

Plazmid ekspresji pAMG22-His można wyprowadzić z wektora ekspresji Amgen pAMG22 przez podstawienie małej sekwencji DNA pomiędzy niepowtarzalne miejsca restrykcyjne NdeI (#4795) i EcoRI (#4818) pAMG22 następującym duplexem oligonukleotydowym:

NdeI NheI EcoRI

5' TATGAAACATCATCACCATCACCATCATGCTAGCGTTAACGCGTTGG 3' (SEQ ID NO:51)

3' ACTTTGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTACGATCGCAArrGCGCAACCTTAA 5' (SEQ ID NO:52)

MetLysHisHisHisHisHisHisHisAlaSerValAsnAlaLeuGlu (SEQ ID NO: 168)

PAMG22

Plazmid ekspresji pAMG22 można wyprowadzić z wektora ekspresji Amgen pCFM1656 (ATCC #69576), który może być z kolei wyprowadzony z systemu wektorowego ekspresji Amgen, opisanego w patencie USA nr 4,710,473, udzielonym 1 grudnia 1987 roku. Plazmid pCFM1656 można uzyskać z opisanego plazmidu pCFM836 (Patent nr 4,710,473) przez: (a) zniszczenie dwóch endogennych miejsc restrykcyjnych NdeI przez wypełnienie końców enzymem polimerazy T4, po którym następuje ligowanie tępych końców; (b) zastąpienie sekwencji DNA pomiędzy niepowtarzalnymi miejscami restrykcyjnymi AatII i ClaI zawierającymi syntetyczny promotor Pl, z podobnym fragmentem uzyskanym z plazmidu pCMF636 (Patent nr 4,710,473) zawierającym promotor Pl:

187 408

AatII

5' CTAATTCCGCTCTCACCTACCCAAACTATGCCCCCCTGCAAAAAAATALttCAT3' TGTAGAGGAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGGTTGTTTTTATTTAAGTA—

-ATAAAATATATATAGATAATTATTTGTGGTGATAAATGATTGTTGGTGGGGTGGACAT_TATTTTTTGGATGTCTATTGGTAGATGCCATTATTTTATAGAGACCGCCACAACTGTA-AATTACCATGGGTGGTGATATGGAGTACAT 3' (SEQ ID NO: 55) _TGTATGGTGACTGCCACTATGACTCGTGTAGCT' (SEQ ID NO:55)

ClaI a następnie (c) podstawienie małej sekwencji DNA pomiędzy nSkpnwturzulne miejsca restrykcyjne ClaI i KpnI następującym oligonaelkotydem:

5' cGAmGAIτcΊAGAAmmAmGAAIAAcAEA(mmτyAc<mcmτ<mJAAΓΓcmmIΆc 3' (SEQ ID NO:55)

3' TAAACTAAmArCTTCCTCC'ΠΆTTmTATΛCCAATTGCGCΛACCTTAAGC 5' (SEQ ID NO:56)

ClaI KpnI

Plazmid ekspresji pAMF22 może być następnie uzyskany z pCFM1656 przez waennanik szeregu zmian zasad ukSerunkowupaoh na mlejsoe przez mutugkneyę nlignmkrów nakładaSąoach się na PCR i podstawień skkwenoSS DNA. Zaczynając z mSkjscu BglII (plazmid bp # 180) bezpośrednio w pozycji 5' względem promotora replikacji plazmidu PonpB, i postępuSąo w kierunku genów replikacji plazmidu, zmiany pary zasad są tueik, jak następuje:

77 PAMG22 bp #	bo w pCMF1656	Zmiana par zasad w PAMG22
# 204	T/A	C/G
# 428	A/T	G/C
# 509	G/C	A/T
# 617	—	insert dwóch G/C bp
# 679	G/C	T/A
# 980	T/A	C/G
# 994	G/C	A/T
# 1004	A/T	C/G
# 1007	C/G	T/A
# 1028	A/T	T/A
# 1047	C/G	T/A
# 1178	G/C	T/A
# 1466	G/C	T/A
#2028	G/C	usunięcie bp
#2187	C/G	T/A
#2480	A/T	T/A
#2499	AGTG	GTCA
- 2502	TCAC	CAGT

187 408

c.d. tabeli
#2642	TCCGAGC AGGCTCG	usunięcie 7 bp
#3435	G/C	A/T
#3446	G/C	A/T
#3643	A/T	T/A

[lepki koniec AatII] (pozycja #4358 w pAMG2²) [lepki koniec AatII] (pozycja #4358 w pAMT2 )

5' TCTTAACCTATTCATGCTCTCCCAACGCTCCAGGACTGGCCCGCGICACGCCCrTCCC-’ ’ TTCACCGAAGGCGAAGACGGACCAAGCCCGiTACACCTCCACCCCCGGACCGCCCGCAGGT-ctcaacccaaacgatcattctcccgacgcgccccttcggttgagcggggggtgggcccctg-TATTTGGCTGGCCGAGTCACATTTCTTACAAGGACAGCAAAATATACcACCAACCACICAC-CACGCTCTCCTGAGTAGGACCAATCCGCCGGGAGCGGCTTTGAACGGGGCGAAGCCCCCGg-TTTCCATATGCCTCCTCCTTTTTAGG5(GGXCGCCG5CGWAA5GG<G^2ACACGCGCGGGTG:C-cccggcgggtggcgggca<g3ac<g:cc(g:ccajaac:t<g:ca<g:g:cacjaaa?gjaagcagjag-CGGACTCCCACCCTACCGGCCGCCACTGGAGGTCTTTGCCCGCCCCTCCTTTACTCGGTCTA-CCCCTCCTCCCCCAGTCGCCTGGGCGCCTTTATAACCCCCCTTTTCTTTCTTGGAGJCACT-CGGTCGCACTCCCTCCCTTAACACACTZJCACGATGTGGGAGCCAACACCCJACACCGCTGAAatII ' CTACCTCCCATATAACCTAACAAACACCTCCCCCCATCAAAAACACCCttAAT3'CCCATATTAATGCGAGAGTGCGCCGTCCGTTACGCGGTTGCATCCCCTTCTTTCCGTA—

-ACCAAAAAACATACAGATCAAAATCTGCGGTGACACATCCTCTCTGGCGGCGCCGACAC-TATCTCTTGTCTGCCTATTGCTAGACCCCCCCATTTCATCACAGACCCCCACAACCCCA-CACCACCACCTTCTCTTATACCTATCACAT 3' (SEQ ID NO:53) _TCCACTTCTACCGCCACTATGACTCGTGTAGC5' (SEQ ID NO:54)

Ciał

187 408

AatII

-ACATTCAAATATGGACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTC-TGTAAGTTTATACCTGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAG-TTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGATTTGATTCTAGATTTGTTT-AACTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGCTAAACTAAGATCTAAACTCA-TAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGAGCTCACTAGTGT-ATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTCGAGTGATCACASacII

-CGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAAGAAGAAGAAGAA-gctggacgtcccatggtaccttcgaatgagctcctaggcgcctttcttcttcttcttctt-GAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACC-CTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATTGATCGTATTGG-CCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACCGCTCTTCA-GGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCCTTGGCGAGAAGT-CGCTCTTCACGC 3' (SEQ ID NO:58)

-GCGAGAAGTG 5' (SEQ id NO:57) [lepki koniec SacIl] (pozycja #5024 w pAMG22)

Podczas ligowania lepkich końców tej podstawianej sekwencji DNA, ulegają zniszczeniu zewnętrzne miejsca AatII i SacII. W podstawionym DNA są niepowtarzalnymi miejsca AatII i SacII.

B. Ludzki polipeptyd OPG Met [32-401]

W przykładzie użytym wektorem ekspresji był pAMG21, pochodna pCFM1656 (ATCC o numerze dostępu 69576), zawierająca odpowiednie miejsca restrykcyjne dla wstawienia genów „w dół” z promotora lux PR (patrz Patent USA Nr 5,169,318 opisujący metodę ekspresji lux). Stosowaną komórką gospodarza była GM120 (ATCC o numerze dostępu 55764). Gospodarz ten miał promotor lacIQ oraz gen lacI wintegrowany w drugie miejsce chromosomu gospodarza, prototropowego gospodarza E. coli K12. Inne powszechnie stosowane wektory ekspresji E. coli i komórki gospodarza są. również odpowiednie dla ekspresji.

Sekwencję DNA kodującego N-końcowąmetioninę i aminokwasy 32-401 ludzkiego polipeptydu OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR w wektorze ekspresji plazmidu pAMG21, jak następuje. Aby to zrealizować, wykonano PCR stosując oligonukleotydy #1257-20 oraz #1257-19 jako primery, przy użyciu plazmidu pRcCMV-Hu OPG DNA jako wzorca zawierającego ludzki cDNA OPG, i poddanego termocyklizacji przez 30 cykli, z których każdy cykl ma następujący przebieg: w temperaturze 94°C przez 20 sekund, następnie w 37°C przez 30 sekund, a następnie w temperaturze 72°C przez 30 sekund. Otrzymaną końcową próbkę PCR rozwiązano na żelu agarozowym, produkt PCR wycięto, oczyszczono i poddano restrykcji z restrykcyjnymi endonukleazami KpnI oraz BamHI, i oczyszczono. Syntetyczne oligonukleotydy #1257-21 oraz #1257-22 osobno fosforylowano przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4 iATP, po czym mieszano razem, ogrzewano w temperaturze 94°C i pozostawiono powolnemu ochładzaniu do temperatury pokojowej, w celu wytworzenia dupleksu linkera oligonukleotydu, zawierającego NdeI i KpnI o lepkich końcach. Fosforylowany duplex linkera utworzony pomiędzy oligonukleotydami #1257-21 i #1257-22 zawierający NdeI i KpnI o kleistych końcach (patrz rysunek fig. 14A) i wytrawione KpnI i BamHI, i oczyszczony produkt PCR wytworzony przy użyciu oligoprimerów #1257-20 i #1257-19 (patrz wyżej), wstawiono w sposób ukierunkowany pomiędzy dwa miejsca wektora plazmidu pAMG21, zwanymi miejscem NdeI i miejscem BamHI, przy

187 408 użyciu standardowej metodologii rekombinacyjnego DNA (patrz rysunek fig. 14A i sekwencje poniżej). Syntetyczny linker wykorzystał kodony E. coli i dostarczył N-końcową metioninę.

Wybrano dwa klony i wyodrębniono plazmid DNA, i potwierdzono następnie sekwencję DNA insertu ludzkiej OPG Uzyskany plazmid pAMG21 zawierający aminokwasy 32-401 ludzkiego polipeptydu OPG bezpośrednio poprzedzany w ramce przez metioninę zwany jest jako pAMG21-huOPG met[32-401].

O1igo#1257-19

5'-ATCTCAGTTGAAGC'AΓATATTGTTGAAAAAAAAAGTGTTTTTAG-3' (SQQ ID OO:59)

O1igo#1257-20

5'-TTCCTCCTGGTACCTACCTAAATGAAG-3' (SQQ ID 00:60)

Oligo# 1257-21

5'-TATGGATGAATAACGAAGAGTTGATGAGGTTTTTTTAAATTTAGGTGCTTTATG-3^, (SQQ5DOO:61)

01igo#1257-22

5^,-CCGTTGTTACATΓΓAACAGAGTTGTGGTTAATTTTTTAΠGTAGAACGT-3' (SQQ ID OO:47)

Hodowle pAMG21-huOPG met[32-401] w E. coli GM120 w pożywce 2XYT zawierającej 20 pg/ml kanamycyny inkubowano w temperaturze 30°C przed indukcją. Indukcję produktu ekspresji genu huOPG met[32-401] z promotora luxPR uzyskano po dodaniu syntetycznego autoinducera laktonu N-(3-oksoheksanoilo)-DL-homoseryny, do pożywki hodowli, do końcowego stężenia 30 ng/ml, i hodowle inkubowano w temperaturze 30°C lub 37°C przez dalsze 6 godzin. Po upływie 6 godzin, hodowle bakteryjne sprawdzono pod mikroskopem na obecność ciał indukcyjnych, i następnie peletyzowano przez odwirowanie. Załamujące światło ciała inkluzyjne obserwowano w indukowanych hodowlach wykazując, że część rekombinacyjnego produktu genu huOPG met[32-401] była wytworzona nierozpuszczalnie w E. coli. Niektóre grudki bakteryjne powtórnie przeprowadzono w zawiesinę w roztworze 10 mM Tris-HCl/pH = 8 i 1 mM EDTA, i lizowano bezpośrednio przez dodanie próbki buforu typu 2X Laemlli do końcowego 1X, i β-merkaptoetanolu do końcowego 5% stężenia, i analizowano metodą SDS-PAGE. Rzeczywiście bardziej intensywne pasmo zabarwione coomassie o około 42 kDa obserwowano na żelu SDS-PAGE zawierającym wszystkie lizowane komórki w 30°C i 37°C indukowanych hodowli, w porównaniu z drugim pasmem, które jest lizatem całej komórki z nieindukowanej hodowli w temperaturze 30°C (rysunek fig. 14B.). Spodziewany gen mógł mieć długość 370 aminokwasów i spodziewaną masę cząsteczkową wynoszącą około 42,2 kDa. Prowadzono następną indukcję w temperaturze 37°C przez 6 godzin, i dodatkową hodowlę speletyzowano i poddano obróbce w celu wydzielenia ciał inkluzyjnych (patrz niżej), bądź procesowi mikrofluidyzacji. Grudki poddane mikrofluidyzacji ponownie rozproszono w roztworze 25 mM Tris HCl/pH8 i 0,5 M buforu NaCl, i przepuszczono 20-krotnie przez urządzenie Microfluidizer Model 1108 (Microfluidics Corp.), i oddzielono. Pobrano niewielką ilość wydzielonej próbki (cały lizat po mikrofluidyzacji), a pozostałość poddano peletyzacji przy 20.000 x g przez 20 minut. Sklarowaną ciecz po odwirowaniu usunięto (rozpuszczalna frakcja po mikrofluidyzacji) i grudki ponownie rozproszono w roztworze 25 mM Tris-HCl/pH8 i 0,5M NaCl i 6M mocznika (nierozpuszczalna frakcja po mikrofluidyzacji). Do próbki z całkowicie rozpuszczalnej części lub nierozpuszczalnej frakcji dodano równą objętość porcji buforu 2X Laemalli i β-merkaptoetanolu do końcowego 5% stężenia. Próbki następnie analizowano metodą SDS-PAGE. Znaczącą ilość rekombinacyjnego genu huOPG met[32-401] znaleziono w nierozpuszczalnej frakcji. W celu oczyszczenia ciał inkluzyjnych rekombinacyjnej proteiny postępowano jak następuje: komórki bakteryjne wydzielono z pożywki przez odwirowanie z gradientem gęstości w wirówce typu „Beckman J-6B” wyposażonej w rotor JS-4.2, przy 4.900 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Grudki

187 408 bakteryjne ponownie rozproszono w 5 ml wody, po czym rozcieńczono do końcowej objętości 10 ml w wod/de. Zawiesinę tę p^r^z^e^r^^t^fii(9no do naczynia z nierdzewnej stali w lodzie i poddano rozkładowi metodą dźwiękową (sonic) przy użyciu urządzenia „Branson Sonifier” wyposażonego w standardowe zakończenie (nastawienie zasilania = 5, cykl pracy = = 95%, 80 pęknięć). Poddaną sonowaniu zawiesinę komórkową odwirowano w ultrawirówce typu „Beckman Optima TLX” wyposażonej w rotor typu „TLA 100.3”, przy 195.000 x g przez 5 do 10 minut w temperaturze 23°C. Sklarowaną ciecz odrzucono i grudki przemyto strumieniem wody z tryskawki. Grudki zebrano przez zdrapywanie przy pomocy mikroszpachelki i przeniesiono do szklanego homogenizera (o objętości 15 ml). Pięć mililitrów roztworu Percoll (75% ciekłego Percollu i 0,15 M chlorku sodu) dodano do homogenizera i zawartość poddano homogenizacji aż do jednolitej postaci. Objętość zwiększono do 19,5 ml przez dodanie roztworu Percolla, wymieszano i rozdzielono do trzech rurek typu „Beckman Quick-Steal” (13 x 32 mm). Rurki zapieczętowano zgodnie z fabryczną instrukcją. Rurki poddano wirowaniu w rotorze Beckman TLA 100.3 w temperaturze 23°C, przy 20 tys. obrotów na minutę (21.600 x g), przez 30 minut. Rurki przebadano na odpowiedni wzorzec pasm. Aby odzyskać ciała refraktylne frakcje gradientowe odzyskano i połączono, po czym rozcieńczono wodą. Ciała inkluzyjne poddano peletyzacji przez odwirowanie, i stężenie proteiny oszacowano następnie metodą SDS-PAGE.

Wyodrębnione próbki ciał inkluzyjnych, jak opisano poniżej, rozpuszczono w porcji buforu IX Laemlli z 5% β-merkaptoetanolem oraz rozdzielono na żelu SDS-PAGE i wyodrębniono ciała inkluzyjne, otrzymując wysoko oczyszczony rekombinacyjny genowy produkt huOPG[32-401]. Główne pasmo, około 42 kDa, zaobserwowane po rozdzieleniu zawartych ciał inkluzyjnych na żelu SDS-poliakryloamidowym, wycięto z oddzielnego żelu, i N-końcową sekwencję aminokwasową oznaczono zasadniczo, jak opisano (Matsudaira i in., J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). Następującą sekwencję oznaczono po 19 cyklach:

NH2 -MDEERSHQLLCDKCPPGTY-COOH (SEQ ID NO:62)

Stwierdzono, że powyższa sekwencja jest identyczna z pierwszymi 19. aminokwasami kodowanymi przez wektor ekspresji pAMG21 hu-OPG met[32-401], wytworzony z reszty metioniny dostarczoną przez wektor ekspresji bakteryjnej.

C. Ludzki polipeptyd OPG met[22-401]

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 22 do 401 ludzkiej OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR w prokariotycznym wektorze ekspresji plazmidu pAMG21, jak następuje. Wyodrębniony plazmid DNA pAMG21-huOPG met[32-401] (patrz sekcja B) rozszczepiono endonukleazami restrykcyjnymi KpnI i BamHI i otrzymane fragmenty rozdzielono na żelu agarozowym. Fragment „B” (fragment o około 1064 parach zasad) wyodrębniono z żelu przy zastosowaniu standardowej metody. Syntetyczne oligonukleotydy (oligos) #1267-06 oraz #1267-07 fosforylowano osobno i pozostawiono do wytworzenia dupleksu linkera oligomeru, który zawierał NdeI i KpnI o kleistych końcach, przy użyciu metod opisanych w Sekcji B. Syntetyczny duplex linkera wykorzystał kodony E. coli i dostarczał N-końcową metioninę. Fosforylowany linker oligomeru zawierający NdeI i KpnI o kleistyyh końcach i wyodrębniony Fragment o około 1004 parach zzisad pAMG21-huOP met[32-401] wytrawiony restrykcyjnymi endonukeeczcmi KpnI i BamHI wstawiono bezpośrednio pomiędzy miejsca NdeI i BamHI pAMG21, przy użyciu standardowej metodologii rekombinchyJnego DNA. Ligowaną mieszaninę transformowano do gospodarza 393 E. coli metodą elektroporowania, wykorzystując zalecenia producenta. Klony wybrano, plazmid DNA wyodrębniono, i wykonano sekwencjonowanie DNA dla potwierdzenia sekwencji DNA genu huOPG-met[22-401].

Oligo#1267-06

5'-C’C GGC CCG CCC CGG CGG CM ’C’ CGC CG’ ΤΊ’ CG’ CG’ ’G’

CAG CCG CG’ CGC GCT GCT GCG CG’ CCC ’CG CGG GGG GGG (SEQ ID NO:63)

187 408

Oligo #1267-07

5-CCG GCG GAC ATT TAT CAC AGA GCA GCT GAT GAG AAG TTT CTT

CAT CAT AAT GAA GAT ATT TTG GAG GAA AAG TTT CCA-3’ (SEQ ID NO:64)

Hodowle pAMG21-huOPG met[22-401] w E. coli 393 umieszczono w pożywce 2XYT zawierającej 20 pg/ml kanamycyny i inkubowano w temperaturze 30°C przed indukcją. Indukcję produktu ekspresji rekombinacyjnego genu z promotora luxPR wektora pAMG21 osiągnięto po dodaniu syntetycznego autoinducera laktonu NI(3Ioksoheksanoilo)-DL-homoI seryny do pożywki hodowli, do końcowego stężenia 30 ng/ml, i po inkubacji w temperaturze 30°C lub 37°C przez dalsze 6 godzin. Po upływie 6 godzin hodowle bakteryjne poddano peletyzacji przez odwirowanie (= 30°C I+6 lub 37°C I+6). Hodowle bakteryjne poddano peletyzacji również bezpośrednio przed indukowaniem (= 30°C PreI), lub alternatywnie nie dodawano żadnego autoinducera do oddzielnej hodowli, którą pozostawiono do inkubowania w temperaturze 30°C przez dalsze 6 godzin otrzymując nieindukowaną (UI) hodowlę (= 30°C UI). Bakteryjne grudki z hodowli 30°C PreI, 30°C UI, 30°C I+6 lub 30°C I+6 ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny, poddano ligowaniu, i analizowano metodą elektroforezy SDS-PAGE (żel poliakryloamidowy), jak opisano w Sekcji B. Żele poliakryloamidowe barwiono „coomassie blue” i/lub metodą Western przeniesiono do nitrocelulozy i immunosondowano przy użyciu przeciwciała poliklonalnego anty-mu OPG-Fc z organizmu królika, jak opisano w przykładzie X. Poziom produktu genu po indukcji porównano z próbkami nieindukowanymi (30°C UI) lub przed-indukowanymi (30°C PreI).

D. Mysi polipeptyd OPG met[22-401]

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 22 do 401 mysiego (mu) polipeptydu OPG (OPG) umieszczono pod kontrolą promotora luxPR w prokariotycznym wektorze ekspresji plazmidu pAMG21, jak następuje. PCR wykonano stosując oligonukleotydy #1257-16 i #1257-15 jako primery, plazmid pRcCMV-Mu jako szablon, oraz warunki termocyklingu jak opisano w Sekcji B. Produkt PCR oczyszczono i rozszczepiono restrykcyjnymi endonukleazami KpnI i BamHI, jak opisano w Sekcji B. Syntetyczne oligomery #1260-61 i #1260-82 oddzielnie fosforylowano i pozostawiono do wytworzenia dupleksu linkera oligomeru NdeI i KpnI o kleistych końcach przy użyciu metod opisanych w Sekcji B. Syntetyczny duplex linkera wykorzystał kodony E. coli i dostarczył N-końcową metioninę. Fosforylowany duplex linkera wytworzony pomiędzy oligomerami #1260-61 i #1260-82 zawierający kleiste końce NdeI i KpnI oraz KpnI i BamHI i wytrawiony oraz oczyszczony produkt PCR wytworzony przy użyciu oligoprimerów #1257-16 i #1257-15 wstawiono w sposób ukierunkowany pomiędzy miejsca Ndel i BamHI pAMG21 przy użyciu standardowej metody. Mieszaninę ligacyjną przeniesiono do gospodarza 393 E. coli metodą elektroporezy wykorzystując zalecenia producenta. Klony wybrano, wyodrębniono plazmid DNA i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genu MuOPG met[22-401].

Ekspresję rekombinacyjnego polipeptydu muOPG met[22-401] z hodowli komórek 393 zawierających plazmid pAMG21-MuOPG met[22-401] po indukcji oznaczono stosując metody opisane w Sekcji C.

Oligo #1257-15

5'-TAC GCA CTG GAT CCT TAT AAG CAG CTT ATT TTC ACG TGA AC-3' (SEQ ID NO:65)

Oligo #1257-16

5'-GTG CTC CTG GTA CCT ACC TAA AAC CGA ACT GCA CAG TG-3' (SEQ ID NO:66)

Oligo #1260-61

5'-TAT GGA AAC TCT GCC TCC AAA ATA CCT GCA TTA CGA TCC GGA

AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC TCC GGG TAC-3' (SEQ ID NO:67)

187 408

Oligo #1260-82

5'-CCG GAG CAC ATT TAT CAC AGA GCA GCT CAT GAC GAG TTT CCG

GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CCA-3' (SEQ ID NO:68)

E. Mysi polipeptyd OPG met[32-401]

Sekwencję DNA kodującą N-enńcnwą metioninę i umSnoewucy od 32 do 401 masSkgn pullpeptadu OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR w prokuriotyoznam wektorze ekspresji plazmidu pAMG21, jak pastępuSk. Aby to zrealizować, syntetyczne oligomery #1267-08 i #1267-09 oddzielnie fnsfnrylowapu i pozostawiono do watWnryeniu duplexu linkera oligomeru przy użyciu metod opisanych w SkeoSi B. Syntetyczny duplex linekra wykorzystał kodony E. coli i dostarczył N-końcową metioninę. Fosfnralnwapy dup^ linkera wytworzony pomiędzy oligomerami #1267-08 i #1267-09 zawierający NdeI i KpnI o kleistych końcach oraz wytrawSnnk KpnI i BamHI, oraz oczyszczony produkt PCR opisany wcześniej (patrz Sekcja D), wstawiono w sposób ukSkrunenwany pomiędzy miejsca NdeI i BamHI pAMG21 przy użyciu standardowej metody. Mieszaninę ligacyjną przknSksSnnn do gospodarza 393 E. coli metodą klkktroporkzy wykorzystując zulkokpiu producenta. Klony wybrano, wyodrębniono plazmid DNA i przeprowadzono skkwencjonowupie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genu muOPG met[32-401].

Ekspresję reeombmuoyjpego polipkptadu muOPG met[32-401] z hodowli komórek 393 zawierających rekumbinacyjpa plazmid pAMG21 po indukowaniu oznaczono, stosGSąo metody opisane w SekoSl C.

Oligo #1267-08

5'-TAT GGA CCC AGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC TCC

GGG TAC-3' (SEQ ID NO:69)

Oligo #1267-09

5'-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CTG GGT CCA^' (SEQ ID NO:70)

F. Mysi polipeptyd OPG met-lys[22-401]

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę występującą po reszcie lizynowej i aminokwasy od 22 do 401 masSegn polipeptydG OPG umSecyoyono pod kontrolą promotora luxZR w prokariotacypam wektorze ekspresji plazmidu pAMG21, jak następuje. Syntetyczne oligomery #1282-95 i #1282-96 oddzielnie fosforalowupo i pozostawiono do watwnrzkpia dupleksu ilpkera oligomeru przy użyciu metod opisanych w Sekcji B. Syntetyczny duplex hlneeru wykorzystał kodony E. coli i dostarczył N-końcową metioninę. Fosforalowuny dupiex linkera wytworzony pomiędzy oligomerami #1282-95 i #1282-96 yuwSerąjąoa NdeI i KpnI o kleistkch wcz wytzewione KpnI i BnmHI orH ocaysoczacy yupyukt PuR zpidany wcześniej (patrz Sekcja D), wstawiono w sposób ukleruneowuna pomiędzy miejsca NdeI i BamHI pAMG21 przy użyciu standardowej metody. Mieszaninę ligacyjną przeniesiono do gusBodurza 393 E. coli metodą eleetroporeyy wykorzystując zalecenia producenta. Klony wybrano, wyodrębniono plazmid DNA i BΓykBrowudzoPo skkwkncjopowunSk DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genu MuOPG-Mkt-Lys[22-401].

Ekspresję rekombinaoyjnego BolipeBtyPu MuOPG Met-Lys[22-401] z transformowunaoh komórek 393 zuwieraSąoach rekombSnaoyjna plazmid pAMG21 po SndGeojS oznaczono, stosuSąo metody opisane w SkkoSS C.

Oligo #1282-95

5'-TAT GAA AGA AAC TCT GCC TCC AAA ATA CCT GCA TTA CGA TCC GGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC TCC GGG TAC-3' (SEQ ID NO:71)

187 408

Oligo #1282-96

5'-CCG GCG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG GAT

CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTT TCA-3' (SEQ ID NO:72)

G. Mysi polipeptyd OPG met-lys-(his)i [22-401]

Sekwencję DNA kodującą N-końcową resztę Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His (= MKH) występującą po aminokwasach od 22 do 401 mysiej OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR w prokariotycznym wektorze ekspresji pAMG21, jak następuje. PCR wykonano przy użyciu oligonukleotydów #1300-50 i #1257-15 jako primerów, i plazmidu pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA jako szablonu. Warunki termocyklingu były takie jak opisano w Sekcji B. Otrzymaną próbkę PCR rozwiązano na żelu agarozowym, produkt PCR wycięto, oczyszczono, rozszczepiono restrykcyjnymi endonukleazami NdeI i BamHI i oczyszczono. Wytrawione NdeI i BamHI i oczyszczony produkt PCR wytworzony przy użyciu oligoprimerów #1300-50 i #1257-15 wstawiono w sposób ukierunkowany pomiędzy miejsca NdeI i BamHI pAMG21, przy zastosowaniu standardowej metodologii DNa. Mieszaninę ligacyjną transformowano do gospodarza 393 E. coli metodą elektroporezy stosując się do zaleceń producenta. Klony wybrano, wyodrębniono plazmid DNA i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genu muOPG-MKH[2 2-4 01].

Ekspresję rekombinacyjnego polipeptydu MuOPG-MKH[22-401]z transformowanych hodowli 393, zawierających rekombinacyjny plazmid pAMG21 po indukcji oznaczono, stosując metody opisane w Sekcji C.

Oligo #1300-50

5'-GGT CTC CTC ATA TGA AAC ATC ATC ACC ATC ACC ATC ATG AAA

CTC TGC CTC CAAAAT ACC TGC ATT ACG AT-3' (SEQ ID NO:73)

Oligo #1257-15 (patrz Sekcja D)

H. Mysi polipeptyd OPG met-lys [22-40](his)7

Sekwencję DNA kodującą N-końcową resztę met-lys, aminokwasy od 22 do 401 mysiej OPG, i siedem reszt histydynowych występujących po aminokwasie 401 (= muOPG MK[22-401]-H7), umieszczono pod kontrolą promotora luxPR w prokariotycznym wektorze ekspresji pAMG21, jak następuje. PCR wykonano stosując oligonukleotydy #1300-49 i #1300-51 jako primery, i plazmid pAMG21-mu-OPG-met[22-401] DNA jako szablon. Warunki termocyklingu były takie jak opisano w Sekcji B. Otrzymaną próbkę PCR rozwiązano na żelu agarozowym, produkt PCR wycięto, oczyszczono, rozszczepiono restrykcyjnymi endonukleazami NdeI i BamHI i oczyszczono. Wytrawione NdeI i BamHI i oczyszczony produkt PCR wstawiono w sposób ukierunkowany pomiędzy miejsca NdeI i BamHI pAMG21, przy użyciu standardowej metody. Mieszaninę ligacyjną transformowano do gospodarza 393 E. coli metodą elektroporezy stosując się do zaleceń producenta. Klony wybrano, wyodrębniono plazmid DNA i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genu muOPG-MK[22-401]-H7.

Ekspresję rekombinacyjnego polipeptydu muOPG-MK[22-401]-H7 z transformowanych hodowli 393, mieszczących rekombinacyjny plazmid pAMG21 po indukcji oznaczono, stosując metody opisane w Sekcji C.

Oligo #1300-49

5’-GTT CTC CTC ATA TGA AAG AAA CTC TGC CTC CAAAAT ACC TGT

A-3' (SEQ ID NO:74)

Oligo #1300-51

5'-TAC GCA CTG GAT CCT TAA TGA TGG TGA TGG TGA TGA TGT AAG

CAG CTT ATT TTC ACG GCT TGA ACC TGA TTC CTT A-3' (SEQ ID NO:75)

187 408

I. Mvsipolipeptyd OPG met[27-401]

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 27 do 401 mysiej OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR w prokariotycznym wektorze ekspresji pAMG21, jak następuje. PCR wykonano stosując oligonukleotydy #1309-74 i #1257-15 jako primery, i plazmid pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA jako szablon. Warunki termocyklingu były takie jak opisano w Sekcji B. Otrzymaną próbkę PCR rozwiązano na żelu agarozowym, produkt PCR wycięto, oczyszczono, rozszczepiono restrykcyjnymi endonukleazami NdeI i BamHI i oczyszczono. Wytrawione NdeI i BamHI i oczyszczony produkt PCR wstawiono w sposób ukierunkowany pomiędzy miejsca NdeI i BamHI pAMG21, przy użyciu standardowej metody. Mieszaninę ligacyjną transformowano do gospodarza 393 E. coli metodą elektroporezy stosując się do zaleceń producenta. Klony wybrano, wyodrębniono plazmid DNA i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genu muOPG-met[27-401].

Ekspresję rekombinacyjnego polipeptydu muOPG-met[27-401] z transformowanych hodowli 393 mieszczących rekombinacyjny plazmid pAMG21 po indukcji oznaczono, stosując metody opisane w Sekcji C.

Oligo #1309-74

5-GTT CTC CTC ATA TGA AAT ACC TGC ATT ACG ATC CGG AAA CTG

GTC AT-3’ (SEQ ID NO:76)

Oligo #1257-15 (patrz Sekcja D)

J. Ludzki polipeptyd OPG met[27-401]

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 27 do 401 ludzkiej OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR prokariotycznego wektora ekspresji pAMG21 jak następuje. PCR przeprowadzono przy użyciu oligonukleotydów #1309-75 i #1309-76 jako primerów·', i plazmidu pAMG21-huOPG-met[22-401] DNA jako szablonu. Warunki termocyklingu były takie jak opisano w Sekcji B. Otrzymaną próbkę PCR umieszczono na żelu agarowym, PCR produkt wycięto, oczyszczono, poddano restrykcji restrykcyjnymi endonukleazami AseI i BamHI, i oczyszczono. Wytrawione AseI i BamHI wytrawiono i oczyszczony produkt PCR wstawiono w sposób ukierunkowany pomiędzy miejsca NdeI i BamHI pAMG21, przy zastosowaniu standardowej metody. Mieszaninę ligacyjną transformowano do gospodarza 393 E. coli metodą elektroporezy stosując się do zaleceń producenta. Klony oddzielono, plazmid DNA wyodrębniono, i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genu huOPG-met[27-401].

Ekspresję rekombinacyjnego polipeptydu huOPG-met[27-401] po indukcji z transfekowanych komórek 393 zawierających rekombinacyjny plazmid pAMG21 oznaczono stosując metody opisane w Sekcji C.

Oligo #1309-75

5-GTT CTC CTA TTA ATG AAA TAT CTT CAT TAT GAT GAA GAA ACT

T-3’ (SEQ ID NO:77)

Oligo #1309-76

5’-TAC GCA CTG GAT CCT TAT AAG CAG CTT ATT TTT ACT GAT T-3’ (SEQ ID NO:78)

K. Mysi polipeptyd OPG met[22-180]

Sekwencję dNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 22 do 180 mysiej OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR prokariotycznego wektora ekspresji pAMG21 jak następuje. PCR przeprowadzono przy użyciu oligonukleotydów #1309-72 i #1309-73 jako primerów, i plazmidu pAMG21-muÓPG-met[22-401] DNA jako szablonu.

187 408

Warunki termocyklingu były takie jak opisano w Sekcji B. Otrzymaną próbkę PCR umieszczono na żelu agarowym, PCR produkt wycięto, oczyszczono, poddano restrykcji restrykcyjnymi endonukleazami NdeI i BamHI, i oczyszczono. Wytrawione NdeI i BamHI i oczyszczony powyższy produkt PCR wstawiono w sposób ukierunkowany pomiędzy miejsca NdeI i BamHI pAMG21, przy zastosowaniu standardowej metody. Mieszaninę ligacyjną transformowano do gospodarza 393 E. coli metodą elektroporezy stosując się do zaleceń producenta. Klony oddzielono, plazmid DNA wyodrębniono, i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genu muOPG-met[22-180].

Ekspresję rekombinacyjnego polipeptydu muOPGImet[22Il80] z transformowanych hodowli 393 zawierających plazmid rekombinacyjnego pAMG21 po indukcji oznaczono stosując metody opisane w Sekcji C.

Oligo #1309-72

5'-GTT CTC CTC ATA TGG AAA CTC TGA CTC CAAAAT ACC TGC A-3' (SEQ ID NO:79)

Oligo #1309-73

5'-TAC GCA CTG GAT CCT TAT GTT GCA TTT CTT TTC TGA ATT AGC

A-3' (SEQ ID NO:80)

L. Mysi polipeptyd OPG met[27-180]

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 27 do 180 mysiej OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR prokariotycznego wektora ekspresji pAMG21 jak następuje. PCR przeprowadzono przy użyciu oligonukleotydów #1309-74 (patrz Sekcja I) i #1309-73 (patrz Sekcja K) jako primerów, i plazmidu pAMG21-muOPGmet[22-401] DNA jako szablonu. Warunki termocyklingu były takie jak opisano w Sekcji B. Otrzymaną próbkę PCR umieszczono na żelu agarowym, PCR produkt wycięto, oczyszczono, poddano restrykcji restrykcyjnymi endonukleazami NdeI i BamHI, i oczyszczono. Wytrawione NdeI i BamHI i oczyszczony powyższy produkt PCR wstawiono w sposób ukierunkowany pomiędzy miejsca NdeI i BamHI pAMG21, przy zastosowaniu standardowej metody. Mieszaninę ligacyjną transformowano do gospodarza 393 E. coli metodą elektroporezy stosując się do zaleceń producenta. Klony oddzielono, plazmid DNA wyodrębniono, i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genu mu-OPG-met[27-180],

Ekspresję rekombinacyjnego polipeptydu muOPG-met[27-180] z kultur transformowanych hodowli 393 zawierających plazmid rekombinacyjnego pAMG21 po indukcji oznaczono stosując metody opisane w Sekcji C.

M. Mysi polipeptyd OPG met[22-189] i met[22-194]

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 22 do 189, lub od 22 do 194 mysiej OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR prokariotycznego wektora ekspresji pAMG21 jak następuje. Pary syntetycznych oligonukleotydów #1337-92 i #1337-93 (= muOPG-189 linker), lub #1333-57 i #1333-58 (= muOPG-194 linker) osobno fosforylowano i pozostawiono do uformowania par duplexu linkera oligomerów, przy zastosowaniu metod opisanych w sekcji B. Oczyszczony plazmid DNA βAMG2lImuOPGImet[22I401] rozszczepiono restrykcyjnymi endonukleazami KpnI i BspEI i otrzymane fragmenty DNA umieszczono na żelu agarowym. Fragment B, około 413 bp, wyodrębniono przy użyciu standardowej metodologii rekombinacyjnego DNA. Fosforylowane dupleksy linkera oligomeru uformowane pomiędzy oligomerami #1337-93 i #1337-93 (muOPG-189 linker), lub oligomerami #1333-57 i #1333-58 (muOPG-194 linker), o lepkich końcach BspEI i BamHI, i wydzielony fragment B około 413 bp plazmidu βAMG2lImuIOPGImet[22-401], wytrawione powyższymi restrykcyjnymi endonukleazami KpnI i BspEI, w sposób ukierunkowany wstawiono między miejsca KpnI i BamHI pAMG2lImuOPG-met[22-401]. przy zastosowaniu standardowej metody. Każdą z poddanych ligacji mieszanin transformowano do gospodarza 393 E. coli

187 408 metodą elektroporezy stosując się do zaleceń producenta. Klony oddzielono, plazmid DNA wyodrębniono, i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genów muOPG-met[22-189], lub mu-OPG-met[22-194],

Ekspresję rekombinacyjnych polipeptydów muOPG-met[22-189] i muOPG-met[22-194] z rekombinacyjnych plazmidów pAMG21 transformowanych w komórkach 393 oznaczono stosując metody opisane w Sekcji C.

Oligo #1337-92

5-CCG GAA AGA GAT AAT GAG-3' (SEQ UD NO:81)

Oligo #1337-93

5'-GAT CCT CAT TAT CTG TTT-3' (SEQ ID NO:82)

Oligo #1333-57

5-CCT GAA ACA GAG AAG CCA CGC AAAAGT AAG-3' (SEQ ID NO:83)

Oligo #1333-58

5'-GAT CCT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TTT-3' (SEQ ID NO:84)

N. Mysi polipeptyd OPG met[27-189l i met[27-194]

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 27 do 189, lub od 27 do 194 mysiej OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR prokariotycznego wektora ekspresji pAMG21 jak następuje. Fosforylowane linkery oligomeru „muOPG-189 linker” lub „muOPG-194 linker” (patrz Sekcja M) zawierające o lepkich końcach BspEI i BamHI, i wydzielony fragment B około 413 bp plazmidu pAMG21-muOPG-met[22-401], wytrawione restrykcyjnymi endonukleazami KpnI i BspEI, w sposób ukierunkowany wstawiono między miejsca KpnI i BamHI plazmidu pAMG21-muOPG-met[27-401], przy zastosowaniu standardowej metody. Każdą z poddanych ligacji mieszanin transformowano do gospodarza 393 E. coli metodą elektroporezy stosując się do zaleceń producenta. Klony oddzielono, plazmid DNA wyodrębniono, i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genów muOPG-met[27-189], lub muOPG-met[2 7-194],

Ekspresję rekombinacyjnych muOPG-met[27-189] i muOPG-met[27-194] po indukcji z komórek 393 zawierających rekombinacyjne plazmidy pAMG21 oznaczono stosując metody opisane w Sekcji C.

O. Ludzki polipeptyd OPG met[22-185], met F 22-189, met[22-194]

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 22 do 185, lub od 22 do 189, lub 22 do 194 ludzkiego polipeptydu OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR prokariotycznego wektora ekspresji pAMG21 jak następuje. Pary syntetycznych oligonukleotydów #1331-87 i #1331-88 (= huOPG-185 linker), #1331-89 i #1331-90 (= huOPG-189 linker), lub #1331-91 i #1331-92 (= huOPG-194 linker) osobno fosforylowano i pozostawiono do uformowania par duplexu linkera oligomerów, przy zastosowaniu metod opisanych w sekcji B. Oczyszczony plazmid DNA pAMG21-huÓPG-met[27-401] poddano restrykcji endonukleazami restrykcyjnymi KpnI i NdeI i otrzymane fragmenty DNA umieszczono na żelu agarowym. Fragment B, około 407 bp, wyodrębniono przy użyciu standardowej metodologii rekombinacyjnego DNA. Fosforylowane dupleksy linkera oligomeru uformowane pomiędzy oligomerami #1331-87 i #1331-88 (huOPG-185 linker), oligomerami #1331-89 i #1331-90 (huOPG-189 linker) lub oligomerami #1331-91 i #1331-92 (huOPG-194 linker) [każdy linker zawierał NdeI i BamHI o lepkich końcach], i wydzielony fragment B około 407 bp plazmidu pAMG21-huOPG-met[27-401] wytrawione powyższymi restrykcyjnymi endonukleazami KpnI i BspEI, w sposób ukierunkowany wstawiono między miejsca KpnI i BamHI pAMG21 -huOPG met[22-401], przy zastosowaniu standardowej metody. Każdą z poddanych ligacji mieszanin transformowano do gospodarza 393 E. coli metodą

187 408 elektroporezy stosując się do zaleceń producenta. Klony oddzielono, plazmid DNA wyodrębniono, i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genów huOPG-met[22-185], huOPG-met[22-189], lub huOPG-met[22-194],

Ekspresję rekombinacyjnych huOPG-met[22-1859], huOPG-met[22-189] lub huOPG-met[22-194] w transformowanych 393 komórkach zawierających rekombinacyjne plazmidy pAMG21 oznaczono stosując metody opisane w Sekcji C.

P. Ludzki polipeptyd OPG met[27-185], met[27-189], met[27-194]

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 27 do 185, lub od 27 do 189, lub 27 do 194 ludzkiego polipeptydu OPG umieszczono pod kontrolą promotora luxPR prokariotycznego wektora ekspresji pAMG21 jak następuje. Fosforylowane linkery oligomeru „huOPG-185 linker”, „huOPG-189 linker” lub „huOPG-194 linker” (patrz Sekcja O), każda zawierająca o lepkich końcach NdeI i BamHI, i wydzielony fragment B około 407 bp plazmidu pAMG21-huOPG-met[27-401], wytrawiono restrykcyjnymi endonukleazami KpnI i Ndel (patrz Sekcja O) w sposób ukierunkowany wstawiono między miejsca KpnI i BamHI plazmidu pAMG21-huOPG-met[27-401], przy zastosowaniu standardowej metody. Każdą z poddanych ligacji mieszanin transformowano do gospodarza 393 E. coli metodą elektroporezy stosując się do zaleceń producenta. Klony oddzielono, plazmid DNA wyodrębniono, i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA, aby sprawdzić sekwencję DNA genów huOPG-met[27-185], huOPG-met[27-189, lub huOPG-met[27-194],

Ekspresję rekombinacyjnych huOPG-met[27-185], huOPG-met[27-189] i huOPGmet[27-194] z rekombinacyjnego plazmidu pAMG21 transformowanych do 393 komórek oznaczono stosując metody opisane w Sekcji C.

Q. Mysi polipeptyd OPG met[27-401] (P33E, G36S, A45P)

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 27 do 48 ludzkiej OPG, a następnie reszty kwasowe 49 do 401 mysiej OPG, umieszczono pod kontrolą promotora luxPR prokariotycznego wektora ekspresji pAMG21 jak następuje. Oczyszczony plazmid DNA pAMG21-huOPG-met[27-401] (patrz Sekcja J) rozszczepiono stosując endonukleazy restrykcyjne AatII i KpnI i fragment B o około 1075 parach zasad wyodrębniono z żelu agarozowego przy zastosowaniu standardowej metodologii rekombinacyjnego DNA. Dodatkowo, plazmid DNA pAMG21-muOPG-met[22-401] (patrz Sekcja D) wytrawiono restrykcyjnymi endonukleazami i fragment B o około 1064 parach zasad wydzielono jak opisano powyżej. Wydzielony restrykcyjny fragment pAMG21-huOPG-met[27-401] zawierający AatII & KpnI o lepkich końcach (patrz wyżej) o około 1075 parach zasad, restrykcyjny fragment pAMG21-muOPG-met[22-401] o 1064 parach zasad zawierający KpnI i BamHI o ostrych końcach, oraz restrykcyjny fragment o 5043 parach zasad zawierający AatII i BamHI o lepkich końcach o około 5043 bp, i o sekwencji odpowiadającej kwasowi nukleinowego pAMG21 pomiędzy AatII & BamHI poddano ligacji przy zastosowaniu standardowej metodologii rekombinacyjnego DNA. Produkt ligacji przekształcono do gospodarza 393 E. coli przez elektroporację stosując się do zaleceń producenta. Klony oddzielono, i obecność rekombinacyjnego insertu w plazmidzie sprawdzono przy zastosowaniu standardowej DNA metodologii genu muOPG-27-401 (P33E, G36S, A45P). Zmiany aminokwasów w muOPG: z proliny-33 na kwas glutaminowy-33, z glicyny-36 na serynę-36, i alaniny-45 na prolinę-45, są wynikiem zastąpienia muOPG od 27 do 48 muOPG resztami huOPG 27 do 48.

Ekspresja rekombinacyjnego muOPG-met[27-401] (P33E, G36S, A45P), z transformowanych komórek 393 zawierających plazmid rekombinacyjny mpAMG21 oznaczono stosując metody opisane w Sekcji C.

R. Mysi polipeptyd OPG met-lys-(his)7-ala-ser-(asp)4-lys [22-401] (A45T)

Sekwencję dNA kodującą N-końcową histydynę i sekwencję rozpoznanej endokinazy którą jest (końce od NH2 do COOH): Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Ala-Ser-AspAsp-Asp-Asp-Lys (= HEK), po której następują aminokwasy od 22 do 401 mysiego polipeptydu OPG umieszczono pod kontrolą promotora Ps4 regulowanego represora lac, jak niżej. Plazmid pAMG22-His (patrz Sekcja A) wytrawiono restrykcyjnymi endonukleazami

187 408

NheI i BamHI, i duży fragment (fragment A) wydzielono z żelu agarozowego przy zastosowaniu standardowej metodologii rekombinacyjnego DNA. Oligonukleotydy #1282-91 i #1282-92 fosforylowano oddzielnie i pozostawiono do utworzenia duplexu linkera oligomeru, przy użyciu metod uprzednio opisanych (patrz Sekcja B). Fosforylowany duplex linkera uformowany pomiędzy oligomerami #1282-91 i #1282-92, zawierający NheI i KpnI o lepkich końcach, wytrawione KpnI i BamHI i oczyszczony produkt PCR (opisany w Sekcji D), i fragment A wektora pAMG22-His wytrawiony z NheI i BamHI poddano ligowaniu przy użyciu standardowej metodologii rekombinacyjnego DNA. Mieszaninę ligacyjną transformowano do gospodarza GM 120 E. coli metodą elektroporacji stosując się do zaleceń producenta. Klony poddano selekcji, plazmid DNA wydzielono i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA w celu sprawdzenia sekwencji DNA genu muOPG-HEK[22-401]. Sekwencjonowane DNA ujawniło fałszywą mutację w naturalnej sekwencji muOPG w rezultacie czego pojedynczy aminokwas Alanina-45 w polipetydzie muOPG został zastąpiony Treoniną.

Ekspresję rekombinacyjnego muOPG-HEK[22-401] (A45T) z komórek G120 zawierających rekombinacyjny plazmid pAMG21 określono przy użyciu metod podobnych do opisanych w Sekcji C, oprócz tego, że zamiast dodania syntetycznego autoinduktora, dodano IPTG do końcowego stężenia 0,4 mM, by uzyskać indukcję.

Oligo #1282-91

5'-CTA GCG ACG ACG ACG ACA AAG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC

TGC ATT ACG ATC CGG AAA CTG GTC ATC AGC TGC TGT GTG ATA AAT GTG

CTC CGG GTA C-3' (SEQ ID NO:91)

Oligo #1282-92

5'-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG

GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTT TGT CGT CGT CGT

CG-3' (SEQ ID NO:92)

S. Ludzki polipeptyd OPG met-arg-gly-ser-(his)?[22-4Q1]

Osiem oligonukleotydów (od 1338-09 do 1338-16, pokazanych niżej) zaprojektowano w celu otrzymania fragmentu o 175 zasadach, w postaci nakładającej się na siebie podwójej wstęgi DNA. Oligomery wygrzewano, ligowano, i oligomery 5' 13' użyto jako primery PCR w celu wytworzenia dużych ilości fragmentu 175-zasadowego. Końcowe produkty PCR genu wytrawiono restrykcyjnymi endonukleazami ClaI i KpnI w celu otrzymania fragmentu, który zastępuje 28 kodonów N-końcowych ludzkiej OPG Wytrawiony ClaI i KpnI produkt PCR wstawiono do pAMG21-huOPG[27-401], który był również rozszczepiony ClaI i KpnI. Ligowany DNA transformowano do kompetentnych komórek gospodarza E. coli szczepu 393. Klony skrinowano na okoliczność możliwości otrzymywania rekombinacyjnej proteiny i występowania fuzji genu o prawidłowej sekwencji nukleotydowej. Poziomy ekspresji proteiny oznaczono badając zawartość 50 ml wytrząsanej kolby. Cały lizat i otrzymane „soniczne” grudki analizowano pod względem ekspresji konstruktu metodą żelu PAGE barwionego Coomassie, i analizy Western z przeciwciałem anty-OPG mysia.

Ekspresję huOPG Met-Arg-Gly-Ser-(Hi.s)_f! [ 22-401] dającą w wyniku tworzenie dużych ciał inkluzyjnych i proteinę umiejscowiono we frakcji nierozpuszczalnej (grudka).

1338-09

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GA (SEQ ID NO:93)

1338-10

TTT GTT TTA ACT AAT TAAAGG AGG AAT AAA ATA TGA GAG GAT CGC ATC AC (SEQ ID NO:94)

187 408

1338-11

CAT CAC CAT CAC GAA ACC TTC CCG CCG AAA TAC CTG CAC TAC GAC

GAA GA (SEQ ID NO:95)

1338-12

AAC CTC CCA CCA GCT GCT GTG CGA CAA ATG CCC GCC GGG TAC CCA

AAC A (SEQ ID NO:96)

1338-13

TGT TTG GGT ACC CGG CGG GCA TTT GT (SEQ ID NO:97)

1338-14

GCG ACA GCA GCT GGT GGG CGG TTT CTT CGT CGT ACT GCA GGT ATT

TCG GC (SEQ ID NO:98)

1338-15

GGG AGG GTT TCG TGA TGG TGA TGG TGA TGTC GAT CCT CTC ATA

TTT TAT T (SEQ ID NO:99)

1338-16

CCT CCT TTA ATT AFR RAA AAC AAA TCT AGT ATC AAA TCG ATT GTG

TTT GT (SEQ ED NO: 100)

T. Ludzki polipeptyd OPG met-lys[22-401] i met-(lys)j[22-401]

Aby skonstruować wersje met-lys oraz met-(lys)3 ludzkiej OPG[22-401], zaprojektowano nakładające się oligonukleotydy tak, by dodać odpowiednią ilość reszt lizynowych. Dwa oligomery z każdego konstruktu zaprojektowano do nałożenia, co prowadziło do dwóch etapów PCR do otrzymania końcowego produktu. Szablonem dla pierwszej reakcji PCR było otrzymanie plazmidu DNA zawierającego gen 22-401 ludzkiej OPG W pierwszej reakcji PCR dodano resztę (reszty) lizynowe. W drugiej reakcji PCR użyto produkt z pierwszej reakcji i dodano sekwencję aż do pierwszego miejsca restrykcyjnego ClaI.

Końcowe produkty PCR genu wytrawiono z endonukleazami restrykcyjnymi ClaI i KpnI, które zastępują 28 kodonów N-końcowych huOPG, po czym ligowano do plazmidu pAMG21-hu OPG[27-401], który był również wytrawiony z dwiema restrykcyjnymi endonukleazami. Ligowany DNA transformowano do kompetentnych komórek gospodarza E. coli szczepu 393. Klony skrinowano na okoliczność możliwości wytworzenia rekombinacyjnej proteiny i zawartości fuzji genu posiadającego prawidłową sekwencję nukleotydową. Poziomy ekspresji proteiny oznaczono badając zawartość 50 ml wytrząsanej kolby. Cały lizat i „soniczne” grudki analizowano pod względem ekspresji konstruktu metodą żelu PAGE barwionego Coomassie i analizy Western z przeciwciałem anty-OPG mysia. Żaden konstrukt nie wykazywał wykrywalnego poziomu ekspresji proteiny, a ciała inkluzyjne były niewidoczne. Sekwencje dNa potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA.

Primery oligonukleotydów do wytwarzania MetILys-huOPG[22I401]:

1338-17

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG TTT TAA CTA ATT AAA

GGA GGA ATA AAA TG (SEQ ID NO: 101)

1338-18

CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TGA AAA AAA AAG AAA CTT TTC CTC

CAAAAT ATC (SEQ ID NO: 102)

187 408

1338-20

TGT TTG GGT ACC CGG CGG ACA TTT ATC ACA C (SEQ ED NO: 103)

Primery oligonukleotydu do wytwarzania Met-(Las)3-hhOPG[22-401]:

1338-17

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG TTT TAA CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TG (SEQ ID NO: 104)

1338-19 ·

CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TGA AAA AAA AAG AAA CTT TTC CTC

CAA AAT ATC (SEQ ID NO: 105)

1338-20

TGT TTG GGT ACC CGG CGG ACA TTT ATC ACA C (SEQ ID NO: 106)

U. Fuzje ludzkiego i mysiego polipeptydu OPG[22-401]/Fc

Skonstruowano cztery fuzje OPG-Fc, w których obszar Fc ludzkiej IgG1 połączono z N-końcem aminokwasów od 22 do 401 osteoprotegeryny ludzkiej lub mysiej (zwanym Fc/OPG[22-401]), lub z C-końcem (zwasym OPG[22-401]/Fc). Fuzje Fc zbudowano przy użyciu wektora fuzyjsego pFc-A3, opisanego w przykładzie VII.

Wszystkie geny fuzyjse zbudowano przy użyciu standardowej’ technologii PCR. Szablonem reakcji PCR były preparaty plazmidu zawierające docelowe geny. Nakładające się oligomery zaprojektowano tak, by łączyły C-końce gesu z N-końcem innego genu. Proces tes pozwala sa 'fuzję dwóch gesów we właściwej ramce odczytu, po wykonaniu odpowiedniej reakcji PCR. Początkowo jeden oligomer „fhzaCny” dla każdego genu został wprowadzony do reakcji PCR przy użyciu uniwersalnego primeru dla wektora będącego sośnikiem genu docelowego. Oligomer „f^yjsy” użyto wraz z uniwersalnym primerem dla PCR innego gesu. Po tej pierwszej reakcji PCR otrzymano dwa oddzielne produkty, przy czym każdy z gesów zawierał miejsce fuzyjse, tworząc wystarczające nałożenia dla spowodowania drugiego etapu PCR i utworzenia żądanej fuzji. W drugim etapie PCR, pierwsze dwa produkty PCR połączono z uniwersalnymi primerami i poprzez obszary nakładające się wytworzono sekwencję DNA fuzyjsego o pełnej długości.

Końcowe produkty PCR gesu wytrawiono endonukleazami restrykcyjnymi XbaI i BamHI, a sastępsie ligowano do wektora pAMG21, który również był wytrawiony z dwiema endonukleazami restrykcyjnymi. Ligowasy DNA umieszczono w kompetentnych komórkach gospodarza E. coli szczepu 393. Klony poddawano skriningowi na zdolność wytwarzania produktu rekombinacyjsej’ proteiny i występowania fuzji gesu o właściwej sekwencji sukleotydu. Poziom ekspres jonowania proteiny oznaczono na podstawie badań po wytrząsaniu zawartości 50 ml kolby. Lizat całej komórki, „sosiczse” grudki, oraz sklarowaną ciecz poddano asalizie na ekspresję fuzji za pomocą żeli PAGE barwionych Coomassie i asalizie typu Western, przy użyciu przeciwciała asty-OPG mysia.

Fc/huOPG[22-401]

Ekspresję sestydh fhzaCsego Fc/huOPG[22-401] wykryto za pomocą żelu PAGE barwionego Coomacsie i metodą typu Western Blot. Komórki zawierają bardzo duże ciała inkluzyjne, i większość produktu znalazły się we frakcji nierozpuszczalnej (w grudkach). Następujące primery stosowano do zbudowania tej fuzji OPG-Fc:

1318-48

CAG CCC GGG TAA AAT GGA AAC GTT TCC TCC AAA ATA TCT TCT TT (SEQ ID NO: 107)

187 408

1318-49

CGT TTC CAT TTT ACC CGG GCT GAG CGA GAG GCT CTT CTG CGT GT (SEQ ID NO: 108)

Fc/muOPG[22-401]

Ekspresję peptydu fUyaSpego wykryto za pomocą żelu PAGE barwionego Coomasslk i metodą typu Western Blot. Komórki zawierały bardzo duże ciała ineiuyajpe, a większość produktu znalazła się we frakcji pieroypGsycyulnej (w grudkach). Następujące primery stosowano do zbudowania tej fazSi OPm-Fc:

1318- 50

CGC TCA GCC CGG GTA AAA TGG AAA CGT TGC CTC CAAAAT ACC TGC (SEQ ID NO: 109)

1319- 51

CCA TTT TAC CGG GGC TGA GCG AGA GGC TCT TCT GCG TGT (SEQ ID NO: 110) muOPG[22-401]/Fc

Ekspresję peBtadG fUyySnegn wykryto za pomocą żelu PAGE burwSoPkgn Coomassie i metodą typu Western Blot. Ilość rkkumbipacyjnego produktu była mniejsza niż w przypadku protein fazyjpyoh OPG posiaduSącach obszar Fc w pozaojS N-końcowej. Nie stwierdzono oczywiście obecności ciał Sneiuyajnych. Najwięcej produktu znalazło się w nierozpuszczalnej frakcji (w grudkach). Następujące primery stosowano do zbudowania tej fUzsi OZm-Fc:

1318-54

GAA ATT AAG CTG CTT AGC TGC AGC GA ACC AAA ATC (SEQ ID NO: 111)

1318-55

CAG CTG GAG CTA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G (SEQ ID NO: 112) huOPG[22-401]/Fc

Ekspresji Bkptadu faySi nie wykryto za pomocą żelu PAGE barwionego Coomusslk, jaeeoiwlek wystąpił słaby pozytywny sygnał w badaniu metodą typu Western. Nie stwierdzono uozawiśole obecności ciał ipeluyajpaoh. Następujące primery stosowano do wytworzenia tej OPm-Fo fazsi:

1318-52

AAA AAT AAG CTG CTT AGC TGC AGC TGA ACC AAA ATC (SDQ ID NO: 113)

1318-53

CAG CTG CAG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTTG ATT GG (SEQ ID NO: 114)

V Fuzja ludzkiego polipeptydu OPG met[22-401]-Fc ten łączy zmianę pozycji aminokwasu prolipa na alaninę w pozycji 25 (P25A) z fuzją huOPG met[22-401]. Plazmid wytrawiono z tndonGelkazamS restrykcyjnymi ClaI i KpnI, które usunęły N-końcowe 28 kodony, i końcowy, mały (mniej niż 200 par zasadowych) fragment oczyszczono na żelu. Fragment ten, zawierający prolinę zamiast alaniny SUPldapn ligowaniu do BiuymiPu fuzyjnego BAMG21-huoPG[22-401]-Fc, który wytrawiono z dwiema epdopakieuzami rkstrykoaSpami. Ligowany DNA transformowano do kompetentnych komórek gospodarza E. coli szczepu 393. Klony podano skrlpSngowi na zdolność wytwarzania rkkombSnaoySnej proteiny i występowania genu fayyjnego o właściwej sekwencji puklkutaPu. Poziomy eksprksjopowania proteiny oznaczono na podstawie badań zawartości 50 ml kolby po wytrząsaniu. Lizat całej komórki i „sonioznk” grudki poddano analizie na ekspresję za pomocą żeli PAGE barwionych CoomacsSe i analizie typu Western, przy użyciu

187 408 przeciwciała anty-OPG mysia. Poziom ekspresji peptydu fuzji wykryto za pomocą żeli PAGE barwionych Coomassie i metodą typu Western Blot. Proteina znajdowała się we frakcji nierozpuszczalnej (w grudkach). Komórki zawierały duże ciała inkluzyjne.

W. Ludzki polipeptyd OPG met[22-401] (P25A)

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 22 do 401 ludzkiej OPG, z proliną w pozycji 25 zastąpioną przez alaninę, pod kontrolą promotora lux Pr w prokariotycznym wektorze ekspresji pAMG21, wytworzono jak następuje: Synetyczne oligomery #1289-84 i 1289-85 wygrzewano do wytworzenia duplexu linkera oligomeru z XbaI i KpnI o kleistych końcach. Syntetyczny duplex linkera optymalnie wykorzystał kodony E. coli i kodował N-końcową metioninę. Linker zawierał także restrykcyjne miejsce SpeI, które nie występowało w oryginalnej sekwencji. Duplex linkera został wstawiony w sposób ukierunkowany pomiędzy miejsca XbaI i KpnI w βAMG2lIhuOPGI22-401, przy zastosowaniu standardowych metod. Mieszaninę ligacyjną wprowadzono do gospodarza E. coli GM221 przez transformację. Klony wstępnie poddano skriningowi na wytwarzanie rekombinacyjnej proteiny. Plazmid DNA wydzielono z pozytywnych klonów i sekwencję wytworzonego DNA przeprowadzono dla sprawdzenia sekwencji dNa genu huOPG-met[22-401](P25A). Następujące oligonukleotydy zastosowano do wytworzenia linkera XbaI-KpnI:

Oligo #1289-84

5'-CTA GAA GGA GGA ATA AGA TAT GGA AAC TTT TGC TCC AAA ATA

TCT TCA TTA TGA TGA AGA AAC TAG TCA TCA GCT GCT GTG TGA

TAA ATG TCC GCC GGG TAC-3' (SEQ ID NO: 115)

Oligo #1289-85

5'-CCG GCG GAC ATT TAT CAC ACA GCAA GCT GAT GAC TAG TTT CTT

CAT CAT AAT GAA GAT ATT TTG GAG CAA AAG TTT CCA TAT GTT ATT

CCT CCT T-3' (SEQ ED NO: 116)

X. Ludzki polipeptyd OPG met[22-401] (P26A) i (P26D)

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 22 do 401 ludzkiej OPG, z proliną w pozycji 26 zastąpioną przez alaninę pod kontrolą promotora lux Pr w prokariotycznym wektorze ekspresji pAMG21, wytworzono jak następuje: Synetyczne oligomery # 1289-86 i 1289-87 wygrzewano do wytworzenia duplexu linkera oligomeru o kleistych końcach XbaI i SpeI. Syntetyczny duplex linkera optymalnie wykorzystał kodony E. coli i kodował N-końcową metioninę. Duplex linkera został wstawiony w sposób ukierunkowany pomiędzy miejsca XbaI i SpeI w pAMG2lIhuIOPG[22I401] (P25A), przy zastosowaniu standardowych metod. Mieszaninę ligacyjną umieszczono w E. coli GM221 przez transformację. Klony poddano wstępnemu skriningowi na wytarzanie rekombinacyjnej proteiny. Plazmid DNA wydzielono z pozytywnych klonów i przeprowadzono sekwencjonowanie dNa dla sprawdzenia sekwencji DNA genu huOPGmet[22-401] (P26A). Stwierdzono, że w jednym z sekwencjonowanych klonów proliną w pozycji 26 została zastąpiona przez kwas asparaginowy raczej niż przez alaninę, i klon ten nazwano huOPG-met[22-401] (P26D). Poniższe oligonukleotydy użyto do wytworzenia linkera XbaI-SpeI:

Oligo #1289-86

5'-CTA GAA GGA GGA ATA ACA TAT GGA AAC TTT TCC TGC TAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AA-3' (SEQ ID NO: 117)

Oligo #1289-87

5'-CTA GTT TCT TCA TCA TAA TGA AGA TAT TTA GCA GGA AAA GTT TCC ATA TGT TAT TCC TCC TT-3' (SEQ ID NO: 118)

187 408

Y. Ludzki polipeptyd OPG met[22-401] (P25A)

Sekwencję DNA kodującą N-końcową metioninę i aminokwasy od 22 do 194 ludzkiej OPG, z proliną w pozycji 26 zastąpioną przez alaninę, pod kontrolą promotora lux Pr W prokariotycznym wektorze ekspresji pAMG21, wytworzono jak następuje: każdy z plazmidów pAMG21-huOPG[27-194] i pAMG21-huOPG222-401] (P25A) wytrawiono endonukleazami KpnI BamHI. Fragment o 450 parach zasad wydzielono z pAMG21-huOPG[27-194] i fragment odpowiadający 6.100 parom zasad wydzielono z pAMG21-huOPG[22-401] (P25A). Fragmenty te poddano razem ligowaniu i wprowadzono przez transformację do gospodarza E. coli GM221. Klony poddano wstępnemu skriningowi na okoliczność wytwrzania rekombinacyjnej proteiny. Plazmid DNA wydzielono z pozytywnych klonów i wykonano sekwencjonowanie DNA dla sprawdzenia sekwencji DNA genu huOPG-met[22-194] (P26A).

Przykład IX

Asocjacja monomerów OPG

Komórki CHO nastawione na nadekspresję muOPG[22-400]wykorzystcno do wytworzenia kondycjonowanych pożywek dla analiz wydzielanej rekombinacyjnej OPG przy użyciu poliklonalnych przeciwciał anty-OPG z królika. Część próbki kondycjonowanej pożywki zatężono 20-krotnie, po czym analizowano redukującą i nieredukującą metodą SDS-PAGE (fig. 15). W warunkach redukujących proteina migrowała jako polipeptyd Mr 50-55 kd, jak by przewidywano, gdyby dojrzały produkt był glikozylowany w jednym lub więcej jego zgodnych miejsc N-glikozylacji. Nieoczekiwanie, gdy te same próbki analizowano za pomocą nieredukującej metody SDS-PAGE, większość proteiny migrowała jako polipeptyd o około 100 kd, czyli dwukrotnie większej od zredukowanej proteiny. Ponadto, mniejsza była ilość poeipeptyCu Mr 50-55 kd. Ten wzorzec migracji na SDS-PAGE był zbieżny z przypuszczeniem, że produkt OPG tworzył dimery poprzez utlenienie wolnej grupy (grup) sulfhyd^lowych.

Przewidywany dojrzały polipeptyd OPG zawiera 23 reszty cysteinowe, 18 z których, jak się przewidywało, jest związanych z tworzeniem wewnątrzłańcuchowych mostków dwusiarczkowych obejmujących cztery bogate w cysteinę domeny (fig. 12). Pięć pozostałych C-końcowych reszt cysternowych nie jest związanych z wtórną strukturą, co można było przewidzieć w oparciu o homologię z innymi członami rodziny TNFR. Ogółem jest netto nieparzysta liczba reszt cysternowych, i jest formalnie możliwe, że przynajmniej jedna z reszt jest wolna, by wytworzyć międzycząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe pomiędzy dwoma monomerami OPG

Aby wyjaśnić wzorce przebiegu kinezy OPG i asocjacji monomeru, wykonano badanie polegające na znakowaniu ze „ściganiem” impulsu. Komórki CHO ekspresjonujące muOPG[22-401]były metabolicznie znakowane w wolnej od surowicy pożywce zawierającej 3⁵S metioninę i cysteinę przez 30 minut, jak opisano powyżej, Po tym okresie pożywki usunięto i zastąpiono pełną pożywką zawierającą nieznakowaną metioninę i cysteinę w stężeniach około 2.000 razy nadmiarowych w stosunku do oryginalnego stężeniem radioaktywnych aminokwasów. Po upływie 30 minut, 1 godziny, 2 godzin, 4 godzin, 6 godzin i 12 godzin po dodaniu, hodowle zebrano przez usunięcie kondycjonowanych pożywek i przygotowano lizaty kondycjonowanych pożywek i sąsiednich monowarstw. Pożywki hodowli i lizaty komórki sklarowano jak opisano powyżej, po czym immuno-wytrącono przy użyciu przeciwciał anty-OPG, jak opisano powyżej. Po przemyciu immunoosadów uwolniono je przez gotowanie w nieredukującym buforze SDS-PAGE, po czym rozdzielono na dwie równe części. Do jednej połowy dodano środek redukujący β-merkaptotanol do końcowego stężenia 5% (objętościowo/objętościowych), podczas gdy drugą część utrzymywano w warunkach nieredukujących. Obie części immunoosadów zanalizowano metodą SDS-PAGE jak opisano powyżej, po czym poddano przetwarzaniu do cutoradiogaafSl i naświetlania filmu. Wyniki przedstawiono na rysunku fig. 16. Próbki zanalizowane redukującą metodą SDS-PAGE przedstawiono na dolnych dwóch panelach. Po syntezie polipeptyd OPG jest szybko przetwarzany na nieco większy polipeptyd, który prawdopodobnie stanowi modyfikację uzyskaną przez glikozylowanie łączące zN-. Po upływie około 2 godzin poziom OPG w komórce

187 408 drastycznie się obniża i pojawia się w sklarowanej cieczy hodowli. Okazuje się, że jest to wynik wektorowego przeniesienia OPG z komórki do pożywek w miarę czasu, co jest zgodne ze stwierdzeniem, że OPG jest naturalnie otrzymaną proteiną. Analiza tych samych immunoosadów w nieredukujących warunkach ujawnia zależność pomiędzy tworzeniem dimerów OPG i wydzielaniem do kondycjonowanych pożywek (fig. 16, górne panele). W czasie pierwszych 30-60 minut, monomery OPG są przetwarzane w komórce przez widoczne glikozylowanie, a następnie tworzenie dimeru. W miarę upływu czasu, zasadnicza część monomerów OPG przechodzi w dimery, które następnie znikają z komórki. Po około 60 minutach zaczynają pojawiać się dimery w kondycjonowanej pożywce, i nagromadzają w czasie trwania eksperymentu. Po tym okresie tworzone są dimery OPG, które następnie wydzielane są do pożywki hodowli. Monomery OPG utrzymują się na niskim poziomie wewnątrz komórki z upływem czasu, a małe ilości znajdują się również w pożywce. Nie okazuje się to być wynikiem rozbicia kowalencyjnych dimerów OPG lecz raczej wytwarzania pod-stechiometrycznych ilości monomerów w komórce i następującego po tym wydzielania.

Rekombinacyjnie wytworzona OPG z transfekowanych komórek CHO wydaje się być przeważnie dimerem. W celu określenia, czy dimeryzacja jest naturalnym procesem w syntezie OPG, analizowaliśmy kondycjonowaną pożywkę linii komórkowej, o której wiadomo, że naturalnie wydziela OPG Stwierdzono, że linia komórkowa CTLL-2, limfocytowa linia komórkowa mysiej cytotoksyny T (ATCC, numer dostępu TIB-214), ekspresjonują OPG mRNA w ściance komórki i linii komórkowej RNA. Okazało się, że transkrypt OPG jest taki sam jak RNA klonowany i sekwencjonowany o 2,5-3,0 kilozasadach, uzyskany z nerek, o którym wiadomo, że koduje wydzielaną cząsteczkę. Analiza typu Western Blot kondycjonowanych pożywek otrzymanych z komórek CTLL-2 wykazuje, że większa część, jeśli nie wszystkie wydzielane proteiny OPG, są dimerem (rys. fig. 17). Sugeruje to, że dimeryzacja OPG i wydzielanie nie jest wynikiem nadekspresji w linii komórkowej, ale jest raczej główną postacią produktu jaki jest produkowany przez ekspresjonujące komórki.

Tkanki i surowicę myszy normalnych i transgenicznych zanalizowano, by określić naturę cząsteczki OPG ekspresjonowanej u myszy transgenicznych OPG Ponieważ cDNA OPG szczura było ekspresjonowane pod kontrolą elementu kontrolnego hepatocytu, ekstrakty wyprodukowane z miąższu kontrolnych i transgenicznych myszy w warunkach nieredukujących poddano analizie (rys. fig. 18). W ekstrakcie z myszy transgenicznych, lecz nie z kontrolnych, dimery OPG są łatwo wykrywalne, z podstechiometrycznymi ilościami monomerów. Dimery OPG i monomery okazują się identyczne z rekombinacyjną proteiną mysią wydzielaną w komórkach CHO metodą inżynierii genetycznej. Sugeruje to silnie, że dimery OPG są naprawdę naturalną formą produktu genowego, i są przypuszczalnie kluczowymi składnikami aktywnymi. Próbki surowicy otrzymane z kontrolnych i transgenicznych myszy były podobnie analizowane metodą Western Blot. U kontrolnych myszy, większość proteiny OPG migruje jako dimer, podczas gdy małe ilości monomeru są również wykrywane. Ponadto, wykryte są znaczne ilości większej proteiny pokrewnej OPG, które migrują ze względną masą cząsteczkową o przewidywanej wielkości kowalencyjnie połączonego trimeru. Przeto, rekombinacyjna OPG jest wydzielana u myszy głównie jako dimeryczna proteina OPG u postać dimeru może być podstawą dla osteopetrotycznego fenotypu myszy OPG Proteina rekombinacyjnu OPG może również występować w formach „trimerycznych” o większym ciężarze cząsteczkowym.

Aby określić, czy pięć C-końcowych reszt cysternowych OPG odgrywa rolę w homodimeryzacji, kodony mysiej OPG dla reszt cysternowych 195 (C195), C202, C277, C319, i C400 zmieniono na serynę, przy użyciu urządzenia QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, San Diego, CA), jak opisano wyżej. Gen muOPG subklonowano między miejscami NotI i XbaI wektora (+) pcDNA 3.1 (Invitrogen, San Diego, CA). Uzyskany plazmid pcDNA3.1-muOPG i mutageniczne primery potraktowano polimerazą Pfu w obecności dezoksynukleotydów, a następnie amplifikowano w termocyklerze, jak opisano wyżej. Próbka reakcji jest następnie transfekowana do kompetentnego E. coli XL1-Blue przez szok cieplny, po czym płytkowana. Następnie plazmid DNA z taunsformuntów sekwencjonowano dla sprawdzenia mutantów.

187 408

Następujące pary primerów użyto do zmiany kodonu reszty cysteinowej 195 na serynę genu mysiej OPG, co dało w wyniku wytworzenie proteiny muOPG[22-401] C195S:

1389-19:

5'-ΟΑΟ GCAAAAGC GGG AAT AGA TGT CAC-3' (SEQ ID NO:150)

1406-38:

5'-GTG AGA TCT ATT CCC GAC TTT TGC GTG-3' (SEQ ID NO: 151)

Następujące pary primerów użyto do zmiany kodonu reszty cysteinowej 202 na serynę genu mysiej OPG co dało w wyniku wytworzenie proteiny muOPG[22-401] C202S:

1389-21:

5'-CAC CCT GTC GGA AGA GGC CTT CTT C-3' (SEQ ID NO:152)

1389-22:

5'-GAA GAA GGC CTC TTC CGA CAG GGT G-3' (SEQ ID NO: 153)

Następujące pary primerów użyto do zmiany kodonu reszty cysteinowej 277 na serynę genu mysiej OPG co dało w wyniku wytworzenie proteiny muOPG[22-401] C277S:

1389-23:

5'-TGA CCT CTC GGA AAG CAG CGT GCA-3' (SEQ ID NO: 154)

1389-24:

5'-TGC ACG CTG CTT TCC GAG AGG TCA-3' (SEQ ID NO: 155)

Następujące pary primerów użyto do zmiany kodonu reszty cysteinowej 319 na serynę genu mysiej OPG co dało w wyniku wytworzenie proteiny muOPG[22-401] C319S:

1389-17:

5'-CCT CGA AAT CGA GCG AGC AGC TCC-3' (SEQ ID NO: 156)

1389-18:

5'-CGA TTT CGA GGT CTT TCT CGT TCT C-3' (SEQ ID NO: 157)

Następujące pary primerów użyto do zmiany kodonu reszty cysteinowej 400 na serynę genu mysiej OPG co dało w wyniku wytworzenie proteiny muOPG[22-401] C400S:

1406-72:

5'-CCG TGA AAA TAA GCT CGT TAT AAC TCG GAA TGG-3' (SEQ ID NO: 158)

1406-75:

5'-CCA TTC CTA GTT ATA ACG AGC TTA TTT TCA CGG-3' (SEQ ID NO: 159)

Każdy uzyskany plazmid muOPG[22-401] zawierający odpowiednią mutację transfekowano następnie do ludzkich komórek 293, mutant proteiny fuzyjnej OPG-Fc oczyszczono z kondycjonowanych pożywek, jak opisano powyżej. Aktywność biologiczną każdej proteiny oceniono w próbie in vitro tworzenia osteoklastu opisanej w przykładzie XI. Kondycjonowane pożywki z każdego transfektantu analizowano za pomocą nieredukującego SDS-PAGE oraz Western Blotting przy użyciu przeciwciał anty-OPG.

Mutacja każdej z pięciu C-końcowych reszt cysteinowych daje w wyniku wytwarzanie przeważnie (> 90%) monomerycznych cząsteczek OPG o 55 kilodaltonach. To wyraźnie sugeruje, że C-końcowe reszty cysteinowe odgrywają łącznie rolę w homodimeryzacji OPG

187 408

C-końcowe mutanty delecyjne OPG skonstruowano, by utworzyć mapę obszaru(ów) C-końcowej domeny OPG, które są ważne dla homodimeryzacji OPG. Te mutanty OpG skonstruowano przez amplifikację przy użyciu primerów, które wprowadzają przeddojrzale sygnały translacyjne „stop” w C-końcowym obszarze mysiej OPG. Oligomer 5' zaprojektowano do kodonu startowego MuOPG (zawierającego miejsce restrykcyjne HindIII), i oligonukleotydy 3' (zawierające stop-kodon i miejsce XhoI) zaprojektowano, by obciąć C-końcowy obszar muOPG kończący się na reszcie treoninowej 200 (CT200), prolinowej 212 (CT212), kwasu glutaminowego 293 (CT-292) lub seryny 355 (CT-355).

Następujące primery użyto do konstrukcji muOPG[22-200]:

1091-39:

5'-CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA AGA AG-3' (SEQ ID NO: 160)

1391-91:

5'-CCT CTC TCG AGT CAG GTG ACA TCT ATT CCA CAC TTT TGC GTG GC-3' (SEQ ID NO: 161)

Następujące primery użyto do konstrukcji muOPG[22-212]:

1091-39:

5-CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (SEQ ID NO: 162)

1391-90

5'-CCT CTC TCG AGT CAA GGA ACA GCA AAC CTG AAG AAG GC-3' (SEQ ID NO: 163)

Następujące primery użyto do konstrukcji muOPG[22-293]:

1091-39:

5'-CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (SEQ ID NO: 164)

1391-89:

5'-CCT CTC TCG AGT CAC TCT GTG GTG AGG TTC GAG TGG CC-3' (SEQ ID NO: 165)

Następujące primery użyto do konstrukcji muOPG[22-355]:

1091-39:

5'-CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGTA ACA AG-3' (SEQ ID NO: 166)

1391-88:

5'-CCT CTC TCG AGT CAG GAT GTT TTC AAG TGC TTG AGG GC-3' (SEQ ID NO: 167)

Każdy otrzymany plazmid muOPG[22-401] zawierający odpowiednie obcięcie następnie transfekowano do ludzkich komórek 293, proteinę fuzyjną OPG-Fc mutanta oczyszczono z kondycjonowanych pożywek, jak opisano powyżej. Aktywność biologiczną każdej proteiny oceniono w próbie tworzenia osteoklastów in vitro, jak opisano w przykładzie XI. Kondycjonowane pożywki również zanalizowano metodą nieredukującego SDS-PAGE oraz Western Blotting przy użyciu przeciwciał anty-OPG

187 408

Obcięcie C-końcowego obszaru OPG wpływa na zdolność OPG do tworzenia homodimerów. Formy CT 355 są przeważnie monomeryczne, chociaż tworzy się w pewnym stopniu dimery. CT 293 tworzy, jak się wydaje, równomolowe ilości monomeru i dimeru, jak również agregaty o wyższym ciężarze cząsteczkowym. Jednakże CT 212 i CT 200 są monomeryczne.

Przykład X

Oczyszczanie OPG

A. Oczyszczanie protein fuzyjnych OPG-Fc z ssaków

Pięć litrów kondycjonowanych pożywek z komórek 293 ekcsresjonujących proteinę fuzyćną OPG-Fc wytworzono jak następuje. Zamrożoną próbkę komórek rozmrożono w 10 ml pożywki 293 S (DMEM-wysoko glukozowa, 1x L-glutamina, 10% zdezaktywowanęj termicznie surowicy z płodu wołu (FBS) i 100 pg/ml hlgromacana) i zasilono świeżą pożywką po jednym dsiu. Po trzech dniach komórki podzielono między dwie kolby typu T175 i rozcieńczono 1:10 oraz 1:20. Wykonano dwa dodatkowe rozcieńczenia 1:10, aby powiększyć skalę kolb T175 do 200. W tym momencie komórki były 5 dsi po rozmrożeniu. Komórki hodowano niemal do zlania (około trzech dni), kiedy to odessano pożywkę zawierającą surowicę, komórki przemyto jeden raz PBS, porcją 25 ml/na kolbę, i do każdej kolby dodano 25 ml pożywki SF (DMEM-wysoko glukozowa, 1X L-glutamina). Komórki utrzymywano w atmosferze 5% CO2 przez trzy dsi, po czym pożywkę zebrano; odwirowano i przesączono przez filtry 0,45 m z azotanu celulozy (Corning).

Proteiny fuzyjne OPG oczyszczono przy użyciu kolumny typu Protein G Sepharose (Pharmacia) zrównoważonej w PBS. Wielkość kolumny zależała od objętości wyjściowej pożywki. Kondycjonowaną pożywkę sporządzoną jak opisano powyżej wprowadzono na kolumnę, kolumnę przemyto PBS, i czystą proteinę eluowano stosując roztwór 100 mM glicyny o pH = 2,7. Frakcje zebrano do probówek zawierających 1M Tris o pH = 9,2 w celu neutralizacji tak szybko jak tylko jest możliwe. Frakcje zawierające proteinę połączono, zatężoso w urządzeniu Amicon Centricon 10 lub Centriprep 10, i poddano diafiltracji do PBS. Czystą proteinę przechowuje się w temperaturze -80°C.

Mysia [22-401]-Fc, Mysia [22-180]-Fc, Mysia [22-194]-Fc, ludzka [22-401]-Fc, oraz ludzka [22-201]-Fc oczyszczane były w tes sam sposób. Mysia [22-185]-Fc oczyszczana jest w tes sam sposób.

B. Otrzymywanie przeciwciał anty-OPG

Trzem nowozelandzkim białym królikom (o początkowej wadze 2,265 - 3,624 kg /5-8 funtów/) podskórnie wstrzyknięto proteiną fuzyjną muOPG[22-401]-Fc. Pierwszego dnia każdego królika immunizowano dawką 50 pg antygenu zemulgowanego w równej objętości kompletnego dopełniacza Freunda. Dalsze zastrzyki (w dniu 14 i 28) podano w ten sam sposób, ale z niekompletnym dopełniaczem Freunda. Miasa przeciwciał monitorowano metodą EIA. Po drugim zastrzyku antisera wykazały wysokie miano przeciwciał i pobrano po 25 ml krwi od każdego zwierzęcia. Surowicę sa wstępie przepuszczono przez kolumnę powinowactwa, w której immobilizowano mysią OPG-Fc. Przeciwciała anty-OPG wymyto przy użyciu buforu Pierce Gentle Elutios Buffer, zawierającego 1% lodowatego kwasu octowego. Wymytą proteinę sastępsie dializowano do PBS i przepuszczono przez kolumnę Fc w celu usunięcia przeciwciał specyficznych dla części Fc proteiny fhzajnęj OPG. Przefiltrowane frakcje zawierające specyficzne przeciwciała asty-OPG dializowano do PBS.

C. Oczyszczanie mysiej OPG[22-401]

Chromatografia na zasadzie powinowactwa do przeciwciała

Przeciwciała asty-OPG oczyszczone przez powinowactwo przesączono do sprzęgającego buforu (0,1 M węglan sodu, pH = 8,3, 0,5 M NaCl), i mieszano z perełkami sefarozy aktywowanej CNBr przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Żywicę następnie przemywano ekstensywnie sprzęgającym buforem przed zablokowaniem sie zajętych miejsc z - m etanoloarmną(pH = 8,0) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Żywicę przemywano roztworem o niskim pH (0,1 M octan sodu, pH = 4,0, 0,5 m NaCl), a następnie roztworem o wysokim pH (0,1 M Tris-HCl, pH = 8,0, 0,5 M NaCl). Ostatnie przemycia powtórzono trzykrotnie. Żywicę, na kosiec, doprowadzono do stanu równowagi z PBS przed umieszczeniem

187 408 na kolumnie. Po załadowaniu żywicę przemyto przy użyciu PBS. Odnośne wymywanie przeprowadzono roztworem 0,1 M glicyna-HCl, o pH = 2,5, a następnie ponownie zrównoważono przy pomocy PBS.

Stężoną kondycjonowaną pożywkę z komórek CHO ekspresjonujących muOPG[22-401] umieszczono na kolumnie przy małej prędkości przepływu. Kolumnę przemyto PBS do momentu, kiedy absorbancja UV mierzona przy 280 nm powróciła do linii podstawowej. Proteinę eluowano z kolumny najpierw roztworem 0,1 M glicyna-HCl (pH = 2,3), ponownie zrównoważono z PBS, i eluowano drugim buforem (0,1 M CAPS, pH = 10,5, 1 M NaCl). Dwa eluaty przefiltrowano osobno do PBS i przesączono w sterylnych warunkach przed oziębieniem w temperaturze -20°C.

Chromatografia konwencjonalna

Kondycjonowaną pożywkę z komórek CHO zatężono 23-krotnie w pakunku „Amicon spiral wound” (S10Y10) i przesączono z 20 mm tris o pH = 8,0. Przesączoną pożywkę umieszczono następnie na kolumnie Q-sepharose HP (Pharmacia), którą zrównoważono 20 mM tris o pH = 8,0. Kolumnę następnie przemywano do czasu, gdy absorbancja przy 280 nm osiągnęła linię podstawową. Proteinę wymywano roztworem o 20 objętościach kolumny o gradiencie 0-300 mM HCl w tris o pH = 8,0. Proteinę OPG wykryto we frakcjach komórkowych przy użyciu metody Western Blot.

Frakcje zawierające OPG połączono i doprowadzono do końcowego stężenia 300 mM NaCl, 0,2 mM DTT. Kolumnę NiNTA-superose (Qiagen) zrównoważono przy pomocy 20 mM tris o pH - 8,0, 300 mM NaCl, 0,2 mM DTT, po czym załadowano połączone frakcje. Kolumnę przemywano buforem równoważącym aż do osiągnięcia linii podstawowej absorbancji. Proteiny wymywano z kolumny roztworem o gradiencie stężenia imidazolu 0-30 mM w buforze równoważącym. Pozostałe proteiny wymyto z kolumny roztworem 1 M imidazolu. Ponownie użyto metodę Western Blot do wykrycia OPG zawartej we frakcjach.

Połączone frakcje z kolumny NiNTA dializowano do roztworu 10 mM fosforanu potasu o pH = 7,0 i 0,2 mM DTT. Dializat następnie umieszczono w ceramicznej kolumnie hydroksyapatytowej (Bio-Rad), którą zrównoważono w 10 mM buforu fosforanowego. Po przemyciu kolumny proteinę eluowano ponad 20-krotną objętością kolumnową roztworu z gradientem stężenia 10-100 mM fosforanu potasu. Następnie operację tę powtórzono z 20-krotną objętością roztworu o gradiencie stężenia 100-400 mM fosforanu.

Obecność OPG stwierdzono metodą żeli SDS-poliakryloamidowych barwionych coomassie blue oraz Western Blotting. Frakcje połączono i przesączono do PBS i zamrożono w temperaturze -80°C. Oczyszczona proteina występuje jako monomer i pozostanie taką po przesączeniu do PBS. Monomer jest trwały jeśli jest przechowywany w stanie zamrożonym, lub przy pH = 5 w temperaturze 4°C. Jednakże, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4°C w PBS, dimery i - co może okazać się - trimery i tetramery mogą tworzyć się po jednym tygodniu.

D. Oczyszczanie ludzkiego polipeptydu OPGmet[22-401] z E. Coli

Pastę z komórek bakteryjnych rozproszono w 10 mM EDTA do stężenia 15% (masa/objętość) przy użyciu niskoobrotowego homogenizera w temperaturze 5°C. Następnie komórki zniszczono przez dwie homogenizacje, każda w temperaturze 5°C i pod ciśnieniem 101,5 MPa (15.000 psi). Otrzymany homogenat odwirowano przy 5.000 x g w ciągu jednej godziny w temperaturze 5°C. Grudkę po odwirowaniu myto stosując homogenizację z niskimi obrotami w wodzie o początkowej objętości homogenizacji, a następnie odwirowano jak poprzednio. Przemytą grudkę następnie rozpuszczano do stężenia 15% (masa/objętość) w roztworze o końcowym stężeniu 6 M guanidyna-HCl, 10 mM dwutiotreitolu, 10 mM Tris HCl o pH = 8,5 w temperaturze otoczenia przez 30 minut. Roztwór ten rozcieńczono 30-krotnie w roztworze zawierającym 2 M mocznika, 50 mM CAPS o pH = 10,5, i 1 mM zredukowanego glutationu, po czym mieszano przez 72 godziny w temperaturze 5°C. OPG z tego roztworu oczyszczono w temperaturze 25°C. OPG z tego roztworu oczyszczono przez, po pierwsze, doprowadzenie do pH = 4,5 roztworem kwasu octowego, a następnie chromatograficznie na kolumnie wypełnionej żywicą SP-HP Sepharose, zrównoważonej 25 mM octanu sodu o pH = 4,5. Przemywanie kolumny przebiegało z zastosowaniem 20 objętości

187 408 kolumnowych roztworu o liniowym gradiencie stężenia chlorku sodu od 50 mM do 550 mM w takim samym buforze, z szybkością wymywania 0,1 objętości kolumny na minutę. Frakcje odpowiadające pikom zawierającym tylko żądaną postać OPG, zebrano i przechowywano w temperaturze 5°C w buforze zamienionym na roztwór soli buforowany fosforanem, zatężono przez ultrafiltrację, po czym przechowywano w temperaturze 5°C. Materiał ten poddano analizie chromatograficznej HPLC z odwróconymi fazami, analizie metodą SDS-PAGE, próbie z lizatem amebocytów limulus na obecność endotoksyny, oraz analizie sekwencyjnej N-końca. Dodatkowo, techniki takie, jak spektrometria masowa, stabilność w zależności od pH/temperatury, fluorescencja, dichroizm kołowy, skaningowa kalorymetria różnicowa i próby profilowania proteazowego, można również zastosować do badania pofałdowanego charakteru protein.

Przykład XI

Aktywność biologiczna rekombinacyjnego OPG

W oparciu o histologię i histomorfometrię okazało się, że wątrobowa nadekspresja OPG u transgenicznych myszy znacząco obniżyła liczbę osteoklastów prowadząc do wyraźnego wzrostu tkanki kostnej (patrz przykład IV). Aby zyskać dalszy wgląd w potencjalny mechanizm (mechanizmy) leżące u podstawy tego efektu in vivo przebadano różne formy rekombinacyjnego OPG w modelu hodowli in vitro tworzenia osteoklastu (próby tworzenia osteoklastu). Ten układ hodowli był pierwotnie opracowany przez Udagawa (Udagawa i in., Endocrinology 125, 1805-1813 (1989), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 7260-72-64 [1990]), i wykorzystuje połączenie komórek szpiku kości i komórek z linii komórkowych zrębu szpiku kości. Opis modyfikacji tego układu hodowli stosowanego dla tych badań uprzednio opublikowano (Lacey i inni, Endocrinology 136, 2367-2376 [1995]). W tej metodzie, komórki szpiku kości wypłukane z kości udowych i piszczelowych myszy są hodowane przez noc w pożywce (alfa MEM z 10% surowicą płodu bydlęcego inaktywowaną cieplnie), uzupełnionej 500 U/ml CSF-1 (czynnik 1 stymulujący kolonię, zwany także M-CSF), hematopoetycznym czynnikiem wzrostu specyficznym dla komórek rodziny monocyto-makrofagów. Po tej inkubacji zebrano nieprzylegające komórki, poddano oczyszczaniu gradientowemu i następnie współhodowano z komórkami z linii komórkowej szpiku kości ST2 (1 x 10⁶ komórek nieprzylegąjących: 1 x 10⁵ komórek ST2/ml pożywki). Pożywki uzupełniono deksametazonem (100 nM) i biologicznie czynnym metabolitem witaminy D3 znanym jako 1,25 dwuhydroksywitamina D3 (1,25 (OH)2 D3, 10 nM). Aby zwiększyć widoczność osteoklastów dodano do pewnych hodowli prostaglandynę E2 (250 nM). Okres wspólnej hodowli trwa zwykle 8-10 dni, a pożywka ze wszystkimi świeżo dodanymi uzupełnieniami jest odnawiana co 3-4 dni. W różnych odstępach hodowlę ocenia się na obecność fosfatazy kwaśnej winianoodpornej (TRAP) przy użyciu wybarwiania histochemicznego (Sigma Kit # 387A, Sigma, St. Louis, MO), lub próby z roztworem TRAP. Metoda histochemiczna TRAP umożliwia identyfikację osteoklastów fenotypowo, które są wielojądrowymi komórkami (> 3 jąder), które są również zwane TRAP+. Próba z roztworem wiąże się z poddaniem lizie hodowli zawierających osteoklasty w buforze cytrynianowym (100 mM, pH = 5,0) zawierającym 0,1% Tritonu X-100. Aktywność fosfatazy kwasowej odpornej na winian jest następnie mierzona w oparciu o przemianę p-ni-trofenylofosforanu (20 nM) w p-nitrofenol w obecności 80 mM winianu sodu, co następuje podczas 3-5 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Reakcja jest zakończona przez dodanie NaOH do końcowego stężenia 0,5 mola. Gęstość optyczna mierzona jest przy 405 nanometrach, a wyniki są nanoszone na wykres.

Uprzednie badania (Udagawa i inni, ibid) przy użyciu próby tworzenia osteoklastów wykazały, ze te komórki ekspresjonują receptory ⁱ²⁵I-kalcytoniny (autoradiografia) i mogą powodować zagłębienia na powierzchniach kości, co wraz z pozytywną próbą TRAP potwierdza, że wielojądrowe komórki mają fenotyp osteoklastu. Dodatkowym dowodem na poparcie tego faktu, czyli fenotypu osteoklastu komórek wielojądrowych które powstają in vitro w próbie tworzenia osteoklastu jest to, że komórki te ekspresjonują αν i β3 integriny w badaniu immunocytochemicznym i receptor kalcytoniny, oraz mRNA TRAP przez hybrydyzację in situ (ISH).

187 408

Fuzję huOPG[22-401]-Fc oczyszczono z pożywki kondycjonowanej z komórkami CHO i następnie wykorzystano w próbie tworzenia osteoklastu. Przy 100 ng/ml huOPG[22-401]-Fc tworzenie osteoklastu było w 100 procentach inhibitowane (fig. 19A). Poziomy TRAP zmierzone w hodowlach poddanych lizie w zagłębieniach płytek do mikromiareczkowcnia były również inhibitowane w obecności OPG przy ID50 w przybliżeniu 3 ng/ml (fig. 20). Poziom aktywności TRAP w lizatach okazał się korelować ze względną liczbą osteoklastów zaobserwowaną w badaniu cytochemicznym TRAP (porównaj fig. 19A-19G i 20). Oczyszczony ludzki IgG1 i TNFbp były również zbadane w tym modelu i stwierdzono, że nie mają inhibitującego lub stymulującego wpływu, co sugeruje, że efekty inhibitujące huOPG[22-401]-Fc wynikały z części OPG proteiny fuzyjnej. Przebadano dodatkowe formy ludzkich i mysich cząsteczek i zbiorcze dane podsumowano w tabeli 1.

Tabela 1

Wpływ różnych form OPG na tworzenie różnych osteoklastów in vitro

Konstrukt OPG muOPG[22-401]-Fc muOPG[22-194]-Fc muOPG[22-185]-Fc muOPG[22-180]-Fc muOPG[22-402] muOPG[22-401] C195 muOPG[22-401] C202 muOPG[22-401] C277 muOPG[22-401] C319 muOPG[22-401] C400 muOPG[22-185] muOPG[22-194] muOPG[22-200] muOPG[22-212] muOPG[22-293] muOPG[22-355] huOPG[22-401]-Fc huOPG[22-201]-Fc huOPG[22-401]-Fc P26A huOPG[22-401]-Fc Y28F huOPG[22-401] huOPG[27-401]-Fc huOPG[29-401]-Fc huOPG[32-401]-Fc +++, ED50 = 0,4-2 ng/ml ++, ED50 =2-10 ng/ml +, ED50 = 10-100 ng/ml ED50 > 100 ng/ml

Względna bioaktywność in vitro +++ +++ ++· +++ +++ +

+ +

++ ++

-H-+

-H-+ +++ +++

-H-+ +++

-H-+ +4++ +!72

187 408

Dane zbiorcze sugerują, że sekwencje aminokwasowe, 22-401 ludzkiego i mysiego OPG są w pełni aktywne in vitro, gdy są poddane fuzji do domeny Fc, lub nie poddane fuzji. Inhibitująone w sposób zależny od dawki, i wykazują półmaksymalne aktywności w zakresie 2-10 ng/ml. Obcięcie mysiego końca „C” przy reszcie treoninowej 180 inaktywuje cząsteczkę, podczas gdy obcięcia cysteiny 185 i ponad dają pełną aktywność. Przewiduje się, że reszta cysternowa w pozycji 185 tworzy wiązanie SS3 w obszarze domeny 4 OPG Uprzednio wykazano, że usunięcie tej reszty u innych, pokrewnych TNFR protein, likwiduje aktywność biologiczną (Yan i in., J. Biol. Chem., 266. 12099-12104 [1994]). Nasze ustalenie, że muOPG[22-180]-Fc jest nieaktywne, podczas gdy muOPG[22-185]-Fc jest aktywne, jest zgodne z tymi stwierdzeniami. To sugeruje, że reszty aminokwasowe 22-185 określają obszar aktywności OPG

Wyniki te wskazują, że podobnie jak OPG ekspresjonowane transgenicznie również proteina OPG rekombinacyjna powstrzymywała tworzenie osteoklastów, jak wykazano w próbie tworzenia osteoklastów. Eksperymenty w czasie badające pojawienie się komórek TRAP+, β3+, F480+ w hodowlach w sposób ciągły wystawionych na działanie OPG wykazały, że OPG blokuje pojawianie się komórek TRAP+ i β3+, lecz nie F480+. Natomiast komórki TRAP+ i β3+ zaczynają się pojawiać już czwartego dnia po zapoczątkowaniu hodowli w hodowlach kontrolnych. Jedynie komórki F480+ można znaleźć w hodowlach poddanych działaniu OPG i okazują się obecne w tej samej liczbie jakościowo, jak w hodowlach kontrolnych. A zatem, mechanizm wpływu OPG in vitro okazuje się wiązać z blokadą różnicowania osteoklastów w etapie poza pojawieniem się monocytomakrofagów, lecz przed pojawieniem się komórek ekspresjonujących integryny β3 lub TRAP. Łącznie wyniki te wskazują, że OPG nie wpływa na ogólny wzrost i różnicowanie prekursorów monocytomakrofagów ze szpiku kości, lecz raczej sugeruje się, że OPG specyficznie blokuje selektywne zróżnicowanie się osteoklastów z prekursorów monocytomakrofagów.

Aby określić dokładniej, kiedy w szlaku różnicowania osteoklastu OPG działała inhibitująco, zastosowano odmianę metody hodowli in vitro. Ta odmiana, opisana przez Lacey'a i innych (patrz wyżej), stosuje makrofagi szpiku kostnego jako prekursory osteoklastów'. Prekursory osteoklastów są uzyskane przez pobranie nieprzylegających komórek szpiku kostnego po inkubacji przez noc w CSF-1/M-CSF i hodowaniu komórek przez dodatkowe cztery dni, przy użyciu 1.000-2.000 U/ml CSF-1. Po czterech dniach hodowli, określonej jako faza wzrostu, usuwa się nieprzylegające komórki. Komórki przylegające, które są makrofagami szpiku kostnego można następnie wystawić na działanie do dwóch dni na różne czynniki w obecności 1.000-2.000 U/ml CSF-1. Ten dwudniowy okres zwany jest pośrednim okresem różnicowania się. Następnie, warstwy komórkowe ponownie przepłukuje się, po czym dodaje się komórki ST-2 (1 x 10⁵ komórek/ml), deksametazon (100 nM), i 1,25 (OH2) D3 (10 nm) na ostatnie 8 dni, który to okres zwany jest końcowym okresem różnicowania się. Podczas tego końcowego okresu można również dodać czynniki testujące. Nabycie markerów fenotypowych zróżnicowania osteoklastów jest pozyskiwane podczas tego okresu końcowego (Lacey i inni, ibid).

Zbadano wpływ huOPG[22-401]-Fc (100 ng/ml) na tworzenie osteoklastów w tym modelu przez dodanie jego podczas okresów pośredniego czy końcowego lub, alternatywnie, obydwu okresów różnicowania się jednocześnie. Przeprowadzono zarówno cytochemiczne badanie TRAP jak i próby roztworu. Wyniki próby roztworu podano na rysunku fig. 21. HuOPG[22-401]-Fc inhibitował pojawienie się aktywności TRAP, gdy był dodany zarówno do faz pośredniej jak i końcowej, lub jedynie do końcowej fazy różnicowania. Gdy był dodany do fazy pośredniej a następnie usunięty z hodowli przez wypłukanie, huOPG[22-401]-Fc nie blokował pojawienia się aktywności TRAP w lizatach komórkowych. Wyniki cytochemicznych badań są równoległe z danymi z próby roztworu. Łącznie, obserwacje te wskazują, że huOPG[22-401]-Fc musi jedynie być obecne podczas okresu końcowego różnicowania się po to, by wywierać całość swojego wpływu hamującego tworzenie osteoklastów.

187 408

B. Eksperymenty in vivo prowokacji IL1-a i IL1-f

IL1 zwiększa resorpcSę kości zarówno układowe jak i miejscowo w przypadku Snjkeoji podskórnej' nad sklepienie czaszki myszy (Boyce i inni, DndoorSnolnga 125, 1142-1150 [1990]). Wpływ układowy można ocenić przez stopień hSpkrkuioemii a wpływ miejscowy można ocenić histologicznie przez oszacowanie względnej wielkości reakcji wywoływaneprzez ostkoeiasty. Celem tych eksperymentów było określenie, czy rekombinuoaSne muOPG[22-401]-Fc mógłby zmodyfikować miejscowe i/lub działania IL1 w przypadku injekcji podskórnej nad tym samym obszarem sklkBiknSa czaszki jak IL1.

Eksperyment ILJ-β

Maszy-sumok (ICR Swiss whitk) w wieku czterech tygodni podzielono na następujące grupy poddawane działaniu (5 myszy w grupie):

- grupa kontrolna;

- zwierzęta poddane działaniu IL1 (myszy otrzymywały 1 SnSkkoSę na dzień 2,5 gg il-1P); . ... .

- zwierzęta poddane działaniu niskiej dawki muOPG[22-401]-Fo (myszy otrzymywały 3 inj'ekoSk na dzień 1 gg mu OPG[22-401]-Fc);

- niska dawka muOPG[22-401 ]-Fc i IL-1P;

- zwierzęta poddane działaniu dużej dawki muOPG[22-401]-Fc (myszy otrzymują 3 injkkoSe dziennie 10 gg muOZG[22-401]-Fo);

- wysoka dawka muOPm[22-401]-Fo i IL1-P.

Wszystkie myszy otrzymywały tę samą ogólną liczbę Snjekcji albo czynnika aktywnego lub zarobki (0,1% albuminy krwi bydlęcej w roztworze soli buforowanej fosforanem). Wszystkie grupy uśmiercono jeden dzień po ostatniej ipjekcji. Ciężary oraz Boyinma wapnia Sunowegu krwi zmierzono przed BSerwsyami iηjeecjumi cztery godziny po drugiej ϊρ-^^-ϊ i 24 godziny po trzeciej injekcji IL1, na krótko przed uśmierceniem zwierząt. Po uśmierceniu skikBikplk czaszki usunięto i poddano obróbce w celu pocięcia S amieszoyepia w parafinie.

Eksperyment IL1-a

Myszy-samce (ICR Swiss white) w wieku czterech tygodni pudzleiono na następujące grupy poddawane działaniu (5 myszy w gruBSk):

- grupa kontrolna;

- zwierzęta poddane działaniu IL1 alfa (myszy otrzymywały 1 1ρ^^ na dzień 5 gg IL1-1 alfa);

- zwierzęta poddane działaniu niskiej dawki muOZm[22-401]-Fo (myszy ntryamawała 1 injkkcjk dziknpik 10 gg muOPG[22-401]-Fc);

- niska dawka maOPm[22-40l]-Fo i IL-alfa (Pozowupie jak wyżej);

- zwierzęta poddane działaniu dużej dawki maOZG[22-401]-Fo (myszy otrzymywały 3 ip-kko-e dyiepnik 10 gg muOPm[22-401]-Fo);

- wysoka dawka muOPm[22-401]-Fc i IL1-alfa;

Wszystkie myszy otrzymywały tę samą ogólną liczbę ip-ekc-i albo czynnika aktywnego lub zarobki. Wszystkie grupy uśmiercono jeden dzień po ostatniej in-kko-i. Zozinma wapnia jonowego krwi ymieryopo przed pierwszą injekc-ą, cztery godziny po drugie- in-ekc-i i 24 godziny po trzeciej in-ekc-i IL1, na krótko przed uśmierceniem zwierząt. Ciężary zwierząt zmierzono przed pierwszą injkkcją, cztery godziny po Prugiej' injekc-i i 24 godziny po ήτ^ΐο- IL1 injtkcji, na krótko przed uśmierceniem zwierząt. Po uśmierceniu celeBienie czaszki asanlęto i poddano obróbce w oeia pocięcia i umieszczenia w parafinie.

187 408

Metody histologiczne

Próbki kości sklepienia czaszki utrwalono w formalinie z cynkiem, odwapniono w kwasie mrówkowym, odwodniono etanolem i umieszczono w parafinie. Wykonano skrawki o grubości 5 μm przez sklepienie czaszki w sąsiedztwie szwa węgłowego i wybarwiono hematoksyliną i eozyną, lub poddano reakcji na aktywność fosfatazy kwaśnej odpornej na winian (Sigma Kit #387A) i zabarwiono kontrastowo hematoksyliną. Resorpcję kości oceniono u myszy poddanych działaniu IL-1a metodami histomorfometrycznymi stosując Osteomeasure (Osteometrics, Atlanta, GA) przez śledzenie cech histologicznych na płycie digitizera stosując przystawkę camera lucida zamontowaną przy mikroskopie. Liczbę osteoklastów, liczbę powierzchni pokrytych osteoklastami oraz powierzchnie erodowane oznaczono w jamach szpiku kości sklepienia czaszki. Strony sklepienia czaszki gdzie nastąpiła injekcja i gdzie nie nastąpiła rojek^a zmierzono oddzielnie.

Wyniki

IL-1a i IL-Ιβ wytwarzały hiperkulcemię przy stosowanych dawkach, zwłaszcza drugiego dnia, przypuszczalnie przez wywołanie w całym ustroju zwiększonej resorpcji kości. Reakcja hiperkalcemiczna była blokowana przez muOPG[22-401]-Fc u myszy poddanych działaniu IL-1f3 i znacząco zmniejszona u myszy poddanych działaniu IL-1a, u wpływ ten był najbardziej widoczny drugiego dnia (fig. 22A-22B).

Analiza histologiczna sklepień czaszki myszy poddanych działaniu IL1-alfa i beta dowodzi, że działanie samym IL1 wytwarza wyraźny wzrost wskaźników resorpcji kości włączając w to liczbę osteoklastów, powierzchnię pokrytą osteoklastami i powierzchnię erodowaną (powierzchnie wykazujące głębokie wyżłobienia wskutek działania osteoklastów) (fig. 23B, tabela 2). W reakcji na IL-1a i IL-Ιβ wzrost resorpcji kości był podobny w przypadku strony sklepienia czaszki poddanej injekcji i nie poddanej injekcji. Iniekcje muOpG[22-401]-Fc zmniejszyły resorpcję kości zarówno u myszy poddanych działaniu IL1 alfa i beta, jak i u myszy otrzymujących samą zaróbkę, lecz to zmniejszenie stwierdzono jedynie po stronach sklepienia czaszki poddanych injekcji muOPG[22-401]-Fc.

Tablica 2. Wpyw OPG Na zmennee eeooppci i Oocc a u yyszy poddanych działaniu IL-1

	Powierzchnia osteoklastu % powierzchni kości (Średnia + OdchyLstand.)	Powierzchnia erodowana % powierzchn kości (Średnia + Odchyl. stand.)	Liczba osteoklastów/mm³powierzchni tkanki (Średnia ± Odchyl. stand.)
Eksperyment 1	Strona bez injekcj*i	Strona po injekcji	Strona bez injekcji	Strona po injekcji	Strona bez, iniekcji	Strona po injekcji
Grupa kontrolna	1236 ± 3.44	9.54 ± 2.46	8.07 1 3.90	9.75 1 3.16	3231 ± 11.09	2330 1 10.83
IL1-e (23pg/d)	17.18 ± 130	16.40 1 216	4036 1 4.28	3733 ± 10.28	71.80 ± 18.76	60.89 ± 5.16
OPG (40tg/d)	10.12 ± 3.71	5.04 1 1.66	9.73 ± 433	4.19 1 331	32.73 ±1109	15.24 ± 734
OPG+IL1-e	18.61 1 246	# 13.26 ± 230	44.87 ± 8.63	# 25.94 1 6.82	69.42 ± 36.29	# 47.13 ± 24.26
Eksperyment 2
Grupa kontrolna	1136 ± 4.22	11.95 ±. 2.97	12.67 ± 5.04	10.03 ± 5.13	51.72 ± 23.93	56.03 ± 30.70
IL1-a (5pg/d)	28.81 ± 4.84	23.46 ± 5.76	3731 1 5.16	41.10 ± 1253	113.60 ± 18.04	10270 ± 32.09
OFG (40pg7d)	14.40 ± 1.00	« 4.26 ± 234	1135 ± 4.14	# 429 ± 3.16	72.28 ± 14.11	« 22.65 ± 16.68
OPG+IL1-a	29.58 ± 8.80	0 17.83 ± 334	33.66 ± 9.21	# 24.38 ± 8.88	146.10 ± 42.37	* 66.56 ± 15.62

# Różne względem strony nie poddanej iniekcji p < 0,05 (według parzystego testu t)

187 408

Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem tych obserwacji jest to, że muOPG[22-401]-Fc inhibitowało resorpcję, a konkluzja ta jest poparta zmniejszeniem zarówno ogólnej liczby osteoklastów jak i procentu dostępnej powierzchni kości podlegającej resorpcji w obszarze sklepienia czaszki sąsiedniego względem miejsc iniekcji muOPG[22-401]-Fc. Działania mhOPG[22-401]-Fc okazały się najbardziej zaznaczone miejscowo w badaniu histologicznym, lecz fakt, że muOPG[22-401]-Fc również obniżył hiperkalcemię indukowaną IL1 sugeruje, że muOPG[22-401]-Fc wywiera bardziej subtelny wpływ sa resorpcję kości w całym ustroju.

C. Wpływ ogólnoustrojowy muOPG[22-401]-Fc u myszy rosnących

Samce myszy BDF1 3-4 tygodniowe o ciężarze 9,2-15,5 gramów podzielono w grupy po 10 myszy sa grupę. Myszom tym wstrzykiwano podskórnie roztwór soli lub muOPG[22-401]-Fc w ilości 2,5 mg/kg masy ciała przez 14 dsi w dawkach po 5 mg/kg/dzień. Myszy poddano radiografii przed badaniem, następnie w 7 i 14 dniu. Myszy uśmiercono 24 godziny po ostatniej isCekcji. Usunięto prawą kość udową, utrwalono w formalinie z cynkiem, odwapniono w kwasie mrówkowym i zanurzono w parafinie. Wykonano cięcie przez obszar środkowy odległej przynasuda kości długiej uda oraz trzos tej kości. Gęstość kości oznaczono histomorfometrycznie w sześciu sąsiednich obszarach sięgających od granicy płytki wzrostu srzanasada kości długiej przez pierwotną i wtórną kość’ gąbczastą i do trzosu kości długiej uda. Każdy obszar miał powierzchnię 0,5 x 0,5 mm².

Zmiany radiograficzne

Po siedmiu dsiach działania okazało się widoczne, że istnieje strefa zwiększonej gęstości kości gąbczastej związanej z płytkami wzrostu u myszy poddanych działaniu OPG w porównaniu do obserwacji u zwierząt kontrolnych. Efekt był szczególnie uderzający w przypadku przanasαda dalszej kości udowej i bliskiej kości piszczelowej (fig. 24A-24B). Jedsak pasma zwiększosej gęstości były również widoczne w trzosach kręgów, w grzebieniu biodrowym i w dalszej części piszczeli. Po 14 dsiach obszary nieprzezroczyste rozszerzyły się dalej do trzonów kości udowych i piszczelowych, chociaż intensywność sieprzezroczystości zmniejszyła się. Ponadto, sie było różsic w długości kości udowych po zakończeniu eksperymentu lub zmiany długości przez czas trwania eksperymentu, z czego wynika, że OPG sie zmienia długości kości.

Zmiany histologiczne

Odległa przysasada kości udowej wykazała zwiększoną gęstość kości w obszarach 1,1 do 2,65 mm w odległości od płytki wzrostu (fig. 25 i 26A-26B). Jest to obszar, gdzie kość jest szybko usuwana u myszy przez resorpcję kości, w której pośredniczą osteoklasty. U tych szybko rosnących młodych myszy wzrost kości w tym obszarze, zaobserwowany w przypadku działania OPG, jest zgodny z ishibitowasiem resorpcji kości.

D. Wpływ osteoprotegeryny na utratą kości indukowaną przez wycięcie jajników u szczura

Dwusastotygodniowe samice szczurów (Fisher) poddano wycięciu jajników (OVX) lub pozornej operacji, i wykonano podwójne pomiary absorpcjometrii rentgenowskiej (DEXA) gęstości kości w odległej przysasadzie kości udowej. Po trzech dniach okresu zdrowienia zwierzęta otrzymywały dziesse injekcje, przez następne 14 dsi, jak następuje: 10 pozornie operowanych zwierząt otrzymywało zaróbkę (roztwór soli buforowany fosforanem); 10 zwierząt OVX otrzymywało zaróbkę (roztwór soli buforowany fosforanem); 6 zwierząt OVX otrzymywało OpG-Fc 5 mg/kg SC; 6 zwierząt OVX otrzymywało pamidrosias (PaM) 5 mg/kg SC; 6 zwierząt otrzymywało estrogen (ESTR) 40 pg/kg SC. Po 7 i 14 dsiach działania zwierzętom zmierzono gęstość kości za pomocą urządzenia DEXA. Dwa dsi po ostatniej injekcji zwierzęta uśmiercono i usunięto prawą piszczel i kość udową dla oceny histologicznej.

187 408

Pomiary DEXA gęstości kości wykazały tendencję do zmniejszania gęstości kości po wycięciu jajników, która była blokowana przez OPG-Fc, którego efekty były podobne do znanych czynników antyresorpcyjnych estrogenu i pamidronianu (fig. 27). Histomorfometryczna analiza potwierdziła działanie OPG-Fc zwiększające gęstość kości, która była znacząco wyższa u szczurów OVX niż zaobserwowana u szczurów OVX nie poddanych działaniu (fig. 28). Wyniki te potwierdzają aktywność OPG odnośnie utraty kości związanej z wycofaniem endogennego estrogenu w następstwie wycięcia jajników.

Podsumowanie badań in vivo

Działanie in vivo rekombinacyjnego OPG jest równoległe ze zmianami obserwowanymi u myszy transgenicznych OPG. Zmniejszenie liczby osteoklastów zaobserwowane u zwierząt transgenicznych OPG jest odtwarzane przez wstrzyknięcie rekombinacyjnego OPG miejscowo ponad sklepieniem czaszki u myszy normalnych i myszy poddanych działaniu IL1-a i ILI-β. Myszy transgeniczne OPG rozwinęły fenotyp osteopetrotyczny z postępującym wypełnianiem jamy szpikowej kością, oraz nieremodelowaną chrząstką rozciągającą się od płytek wzrostu od pierwszego dnia po urodzeniu. U normalnych trzytygodniowych rosnących myszy działanie OPG prowadziło również do retencji kości i nieremodelowanych chrząstek w obszarach tworzenia kości endochondralnej, który to efekt jest obserwowany radiograficznie i potwierdzony histologicznie. A zatem, rekombinacyjny OPG wytwarza zmiany fenotypowe u normalnych zwierząt podobne do tych obserwowanych u zwierząt transgenicznych i x,rmi<uny te są zgodne z wywołanym prxex, OPG iidiibitowEmiem resorpcjj kości. W oparem o próby tworzenia c^i;l^eic^k:l^^tć^w zn vitro, znacząca część tego inhibitowomia wynika z utrudnionego tworzenia osteoklastów. Zgodnie z tą hipotezą OPG blokuje wywołaną wycięciem jajników osteoporozę u szczura. Wiadomo, że utrata kości w tym modelu odbywa się za pośrednictwem aktywowanych osteoklastów co sugeruje rolę OPG w leczeniu pierwotnej osteoporozy.

Przykład XII

Pegylowane pochodne OPG

Otrzymywanie N-końcowych koniugatów PEG-OPG przez alkilowanie redukujące

HuOPG met[22-194] P26A wprowadzono do buforu zawierającego 25-50 mM NaOAc, pH = 4,5-4,8 i zatężono do 2-5 mg/ml. Roztwór ten użyto do prowadzenia alkilowania redukcyjnego OPG przy użyciu jednofunkcyjnych aldehydów PEG w temperaturze 5-7°C. Jednofunkcyjne aldehydy PEG, liniowe lub rozgałęzione, MW = 1 do 57 kDa (dostępne z Shearwater Polymers) dodano do roztworu OPG jako substancje stałe w ilościach stanowiących 2-4 moli aldehydu PEG na 1 mol OPG Po rozpuszczeniu polimeru do roztworu proteiny dodano cyjanoborowodorek sodu do uzyskania końcowego stężenia od 15 do 20 mM w mieszaninie reakcyjnej z 1-1,6 M świeżo przyrządzonego roztworu surowca w zimnej, dejonizowanej wodzie. Postęp reakcji i stopień pegylowania OPG monitorowano przez HPLC na zasadzie wykluczania wielkości na kolumnie G3000SWxl (Toso Haas), wymywając roztworem zawierającym 100 mM NaPO4, 0,5 M NaCl i 10% etanolu o pH = 6,9. W typowym przypadku reakcję prowadzono przez 16-18 godzin, po którym to czasie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 6-8 razy, a pH obniżono do wartości 3,5-4. Mieszaninę reakcyjną frakcjonowano stosując chromatografię jonowymienną (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia) wymywając roztworem o składzie 20 mM NaOAc, pH = 4 z liniowym gradientem do 0,75 m NaCl, przy użyciu ponad 25 objętości kolumny, przy prędkości przepływu 30 cm/godzinę. Frakcje mono-, dwu- lub poli- PEGylowanego OPG zebrano i scharakteryzowano przez SEC HPLC oraz SDS-PAGE. Dzięki N-końcowemu sekwencjonowaniu określono, że koniugat monoPEG-OPG główny produkt reakcji w większości przypadków, był w 98% N-końcowo zmodyfikowanym OPG przez PEG

Procedurę tę zasadniczo stosowano do wytworzenia następujących, zakończonych N-, koniugatów PEG-OPG (gdzie OPG jest HuOPG met[22-194] P25A): 5 kD monoPEG 10 kD mono-rozgałęziony PEG, 12 kD monoPEG, 20 kD monoPEG 20 mono-rozgałęziony PEG, 25 kD monoPEG 31 kD monoPEG 57 kD monoPEG 12 kD dwu-PEG 25 kD dwu-PEG 31 kD dwu-PEG 57 kD dwu-PEG i 25 kD trzy-PEG

187 408

Wytwarzanie koniugatów PEG-OPGprzez acylowanie

HuOPG met[22-194] P25A wprowadzono do buforu 50 mM BICINE przy pH = 8, i zatężono do 2-3 mg/ml. Roztwór ten użyto do wykonania acylowania OPG przy użyciu jednofunkcyjnych estrów N-hydroksybursztynianoimidylowych PEG w temperaturze pokojowej. Estry N-hydroksybursztynlanoimidylowe PEG, liniowe lub rozgałęzione, MW = 1 do 57 kDa (dostępne z Shearwater Polymers) dodano do roztworu OPG jako substancje stałe w ilościach stanowiących 4-8 moli estru N-hydroksybursztynianoimidylowego PEG na 1 mol OPG. Postęp reakcji i stopień pegylowania OPG monitorowano przez HPLC na zasadzie wykluczania wielkości na kolumnie G3000SWxl (Toso Haas), wymywając roztworem zawierającym 100 mM NaPO 4, 0,5 M NaCl i 10% etanolu o pH = 6,9. W typowym przypadku reakcję prowadzono przez 1 godzinę, po którym to czasie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 6-8 razy, a pH obniżono do wartości 3,5-4. Mieszaninę reakcyjną frakcjonowano stosując chromatografię jonowymienną (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia) wymywając roztworem o składzie 20 mM NaOAc, pH = 4 z liniowym gradientem do 0,75 m NaCl, przy użyciu ponad 25 objętości kolumny, przy prędkości przepływu 30 cm/godzinę. Frakcje mono-, dwu- lub poli- PEGylowanego OPG zebrano i scharakteryzowano przez SEC HPLC oraz SDS-PAGE.

Procedurę tę zasadniczo stosowano do wytworzenia następujących koniugatów PEG-OPG: 5 kD poliPEG, 20 kD poliPEG, 40 kD poli-rozgałęziony PEG, i 50 kD poli-PEG.

Otrzymywanie dimerycznego PEG-OPG

HuOPG[22-194] P25A przygotowano do tiolowania przy 1-3 mg/ml w buforze fosforanowym przy prawie neutralnym pH. Dodano bezwodnik S-acetylomerkaptobursztynowy w 3-7 molowym nadmiarze utrzymując pH = 7,0, i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Monotiolowany OPG oddzielono od niezmodyfikowanego i politiolowanego OPG metodą chromatografii jonowymiennej i zabezpieczony tiol odbezpieczono przez działanie hydroksyloaminą. Po odbezpieczeniu hydroksyloaminę usunięto metodą filtracji żelowej i uzyskany monotiolowany OPG poddano szeregowi reakcji sieciowania typowych dla tioli. Aby wytworzyć dimer z wiązaniem dwu siarczkowym, tiolowany OPG przy > 1 mg/ml poddano utlenianiu powietrzem przez dializę w nieznacznie zasadowym buforze fosforanowym. Kowalencyjny dimer tioeterowego OPG wytworzono przez poddanie reakcji czynnika sieciującego bis-maleimidowego, NN-bis^-maleimidopropianylo^-hydroksy-1,3-propanu ztiolowanym OPG przy stężeniu > 1 mg/ml, przy stosunku molowym 0,6 czynnika sieciującego do OPG, w buforze fosforanowym o pH = 6,5. Podobnie, wytworzono „hantle” PEG przez reakcję podstechiometrycznych ilości czynnika sieciującego PEG bis-maleimidu z tiolowanym OPG przy stężeniu > 1 mg/ml w buforze fosforanowym o pH = 6,5. Każdy z powyższych dimerowych koniugatów może być następnie oczyszczony przy zastosowaniu chromatografii jonowymiennej na zasadzie wykluczania objętości SEC.

Dimerowe koniugaty PEG-OPG (gdzie OPG jest HuOPG met[22-194] P25A, wytworzone przy użyciu powyższych procedur) obejmują: dimer OPG z wiązaniem dwusiarczkowym, kowalencyjny dimer tioeterowy OPG z czynnikiem sieciującym typu aminy alifatycznej, oraz „hantle” i „monohantle” o 3,4 kilodaltonach i 8 kilodaltonach.

Koniugaty PEG-OPG zbadano na aktywność in vitro stosując próbę dojrzewania osteoklastów opisaną w przykładzie XIA, i na aktywność in vivo przez zmierzenie zwiększonej gęstości kości po wstrzyknięciu do myszy, jak opisano w przykładzie XIC. Aktywność in vivo podano poniżej w tabeli 3.

187 408

Tabela 3

Aktywność biologiczna in vivo pegylowanego OPG Konstruikt OPG_Wzrost gęstości kości goleniowei

muOPG met[22-194]	-
muOPG met[22-194] 5 k	+
muOPG met[22-194] 20 k PEG	+
muOPG met[22-194] P25A	-
muOPG met[22-194] P25A 5 k PEG	+
muOPG met[22-194] P25A 20 k PEG	+
muOPG met[22-194] P25A 31 k PEG	+
muOPG met[22-194] P25A 57 k PEG	+
muOPG met[22-194] P25A 12 k PEG	+
muOPG met[22-194] P25A 20 k,	+
rozgałęziony PEG
muOPG met[22-194] P25A 8k PEG dimer	+

muOPG met[22-194] P25A usieciowany, + z wiązaniami dwusiarczkowymi

Podczas gdy wynalazek opisano w zakresie takim, co jest uważane za jego korzystne wykonania nie jest on ograniczony do ujawnionych wykonań, lecz przeciwnie, w zamierzeniu ma objąć różne modyfikacje i równoważniki zawarte w ramach ducha i zakresu załączonych zastrzeżeń, których zakres ma się zgadzać z najszerszą interpretacją jakby objąć wszystkie modyfikacje i równoważniki.

187 408

WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA.:

(i) ZGŁASZAJĄCY:Amqen Inc.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKOM: OSTEOPROTEGERYNA iii) LICZBA SEKWENCJI: 168 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Arngen Inc.

(B) ULICA: 1840 Dehavilland Drive (C) MIAST: Thousand Oaks (D) STAN: Kalifornia (E) KRAJ: Stany Zjednoczone (F) KOD: 91320 (v) POSTAĆ CZYTANA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER.: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPARACYJNY: PC-DOS/Ms-Dos (D) SOFTWARE: Patentln Release *1.0, Version *1.30 (vi) DANE DOT. BIEŻĄCEGO ZGŁOSZENIA::

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(viii) DANE DOT?. PRZEDSTAWICIELA PRAWNEGO/AGENTA:

(A) NAZWISKO: Winter, Robert B.

(C) NR ODNIESIENIA/AKT: A-378-C1P2 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (S) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:1:

AAAGGAAGGA AAAAAGCGGC CGCTACANNN NNNNNT (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:2:

(i)	CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
	(A)	DŁUGOŚĆ: 16 par zasad
	(B)	TYP: kwas nukleinowy
	(C)	NICIOWOŚĆ: pojedyncza
	(D)	TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	TYP	CZĄSTECZKI: cDNA

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:2:

187 408

TCGACCCACG CGTCCG !6 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA.: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:3:

GGGTGCGCAG GC 11 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:4:

TGTAAAACGA CGGCCAGT 11 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWTOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI; cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:5:

CAGGAAACAG CTATGACC 18 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojeddyicza (D) TOPOLOGIAg liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:6:

CAATTAACCC TCACTAAAGG

187 408 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:7:

(i) CHHRAATERYSSTKA SEKKTCEiCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pas zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:7:

GCATTATGAC CCAGAAACCG GAC 23 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:8:

AGGTAGCGCC CTTCCTCACA TTC 23 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKA: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:9:

GACTAGTCCC ACAATGAACA AGTGGCTGTG 30 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ·. pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:10:

ATAAGAATGC GGCCGCTAAA CTATGAAACA GCCCAGTGAC CATTC 45 (2) INFORMACJA DIA SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

187 408 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:11:

GCCTCTAGAA AGAGCTGGGA C 22 (2) UNOMflACJA DILA SEC ID NO: 12:

(i) CHHARAKTRRSTTKA SEJKWNCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:12:

CGCCGTGTTC CATTTATGAG C 21 (2) INFOPRMACJA DILA S^ę2 ID NO:1 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:13:

ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:44:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (il) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 14:

GTTGCACTCC TGTTTCACGG TCTG 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:15:

187 408

CAAGACACCT TGAAGGGCCT GATG 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWTOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 16:

TAACTTTTAC AGAAGAGCAT CAGC 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWTOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 17:

AGCGCGGCCG CATGAACAAG TGGCTGTGCT GCG 33 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWTOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:18:

AGCTCTAGAG AAACAGCCCA GTGACCATTC C 31 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 19:

GTGAAGCTGT GCAAGAACCT GATG 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:20:

187 408 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A) (B) (C) (D)	DŁUGOŚĆ: 24 par zasad TYP: kwas nukleinowy NICIOWOŚĆ: pojedyncza TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	TYP	CZĄSTECZKI;	cDNA
(xi)	OPIS	SEKWENCJI:	SEQ ID NO:20

ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG 221 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:21:

(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:21:

CAGATCCTGA AGCTGCTCAG TTTG 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:22:

AGCGCGGCCG CGGGGACCAC AATGAACAAG TTG 33 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasa (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:23:

AGCTCTAGAA TTGTGAGGAA ACAGCTCAAT GGC 33 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza

187 408 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:24:

ATAGCGGCCG CTGAGCCCAA ATCTTGTGAC mACTCAC 39 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:25:

TCTAGAGTCG ACTTATCATT TACCCGGAGA CAGGGAGAGG CTCTT 45 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:26:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 43 par zasad (B) TYP: kwas inklaSnowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:27:

CCTCTGCGGC CGCTUGCAG CTTATaaTCl CGGATTGUC CTG 43 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(Α) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

187 408 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:28:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:29:

(iiCfHARAKnERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CJZĄtTECZKI: cODN.

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:29:

TCCGTAAGAA ACAGCCCAGT GACC 24 (2) DLA SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:30:

CCTCTGCGGC CGCTGTTGCA TTTCCTTTCT G 31 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:31:

Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Pro Glu Thr Gly His 1-5 10 15

Gln Leu Leu (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:32:

(i) CiUARAKnSRYSTYK SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

187 408 (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:28:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 29:

(x) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Ainiowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cOlNA (ci) OPIS SEKWENCJO: SnQ IDNOjI::

TCCGTAAGAA ACAGCCCAGT GAOO 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIC^NOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID ^:30:

cctctgcggc ogctgttgoa tttcotttot G 31 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:31:

(i) CłUARAKTRYSSTU. SOKWEtCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICI^W^^^: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: proteina (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:31:

Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Pro Glu Thr Gly His 1-5 10 15

Gln Leu Leu (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 32:

(i) CKAERAKTERY STYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

187 408 (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:32:

TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:33:

CCTCTGCGGC CGCACACACG TTGTCATGTG TTGC 34 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:34:

TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOOCK3IA.: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:35:

ICTIIGCGGI CGICTTTTGI GTGGCTTCTC TGTT 34 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:36:

(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) YHCIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) HOOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:36:

187 408

CCTCTGAGCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG 37 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 37:

CCTCTGCGGC CGCTAAGCAG CTTATTTTTA CTGAATGG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 38:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 38:

CCTCTGAGCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG 33 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 39:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:39:

CCTCTGCGGC CGCCAGGGTA ACATCTATTC CAC 33 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 40:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:40:

CCGAAGCTTC CACCATGAAC AAGTGGCTGT GCTGC 35 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 41:

187 408 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:41:

AATCTGTCGA CTATTATAAG AAGCTTATTT TCACGGATTG 44 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 42:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(ii)	(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy
(C) (D) TYP	NICIOWOŚĆ: pojedyńcza TOPOLOGIA: liniowa CZĄSTECZKI: cDNA
(X!)	OPIS	SEKWENCJI: SEQ ID NO:42:

TCCATTGCCC TGACAACTCT T 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 43:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:43:

ACTATGTAGA CTTAACACAC GTTGTCATGT GTTGC 35 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:44:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A) (B) (C) (D)	DŁUGOŚĆ: 21 par zasad TYP: kwas nukleinowy NICIOWOŚĆ: pojedyńcza TOPOILDGIA: liniowa
(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	cDNA
(xi)	OPIS	SEKWENCJI :	SEQ ID NO:44

TACATTGACC TGACCACTAT T

187 408 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:45:

CCTCTGTCGA CTTACTTTTG CGTGGCTTCT CTGTT 35 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 46:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1537 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:46:

GTGAAGAGCG	TGAAGAGCGG	TTCCTCCTTT	CAGCAAAAAA	CCCCTCAAGA	CCCGTTTAGA	60
GGCCCCAAGG	GGTTATGCTA	GTTATTGCTC	AGCGGTGGCA	GCAGCCAACT	CAGCTTCCTT	120
TCGGGCTTTC	TTCTTCTTCT	TCTTCTTTCC	GCGGATCCTC	GAGTAAGCTT	CCATGGTACC	180
CTGCAGGTCG	ACACTAGTGA	GCTCGAATTC	CAACGCGTTA	ACCATATGTT,	.ATTCCTCCTT	240
TAATTAGTTA	AAACAAATCT	AGAATCAAAT	CGATTAATCG	ACTATAACAA	ACCATTTTCT	300
TGCGTAAACC	TGTACGATCC	TACAGGTACT	TATGTTAAAC	AATTGTATTT	CAAGCGATAT	360
AATAGTGTGA	CAAAAATCCA	ATTTATTAGA	ATCAAATGTC	AATCTATTAC	CGTTTTAATG	420
ATATATAACA	CGCAAAACTT	GCGACAAACA	ATAGGTAAGG	ATAAAGAGAT	GGGTATGAAA	480
GACATAAATG	CCGACGACAC	TTACAGAATA	ATTAATAAAA	TTAAAGCCTG	TAGAAGCAAT	540
AATGATATTA	ATCAATGCTT	ATCTGATATG	ACTAAAATGG	TACATTGTGA	ATATTATTTA	600
CTCGCGATCA	TTTATCCTCA	TTCTATGGTT	AAATCTGATA	TTTCAATTCT	GGATAATTAC	660
CCTAAAAAAT	GGAGGCAATA	TTATGATGAC	GCTAATTTAA	TAAAATATGA	TCCTATAGTA	720
GATTATTCTA	ACTCCAATCA	TTCACCGATT	AATTGGAATA	TATTTGAAAA	CAATGCTGTA	780

187 408

AATAAAAAAT	CTCCAAATGT	AATTAAAGAA	GCGAAATCAT	CAGGTCTTAT	CACTGGGTTT	840
AGTTTCCCTA	TTCATACTGC	TAATAATGGC	TTCGGAATGC	TTAGTTTTGC	ACATTCAGAG	900
AAAGACAACT	ATATAGATAG	TTTATTTTTA	CATGCGTGTA	TGAACATACC	ATTAATTGTT	966
CCTTCTCTAG	TTGATAATTA	TCGAAAAATA	AATATAGCAA	ATAATAAATC	AAACAACGAT	1000
TTAACCAAAA	GAGAAAAAGA	ATGTTTAGCG	TGGGCATGCG	AAGGAAAAAG	CTCTTGGGAT	1180
ATTTCAAAAA	TATTAGGCTG	TAGTAAGCGC	ACGGTCACTT	TCCATTTAAC	CAATGCGCAA	1110
ATGAAACTCA	ATACAACAAA	CCGCTGCCAA	AGTATTTCTA	AAGCAATTTT	AACAGGAGCA	1120
ATTGATTGCC	CATACTTTAA	AAGTTAAGTA	CGACGTCCAT	ATTTGAATGT	ATTTAGAAAA	1120
ATAAACAAAA	GAGTTTGTAG	AAACGCAAAA	AGGCCATCCG	TCAGGATGGC	CTTCTGCTTA	1122
ATTTGATGCC	TGGCAGTTTA	TGGCGGGCGT	CCTGCCCGCC	ACCCTCCGGG	CCGTTGCTTC	1180
GCAACGTTCA	AATCCGCTCC	CGGCGGATTT	GTCCTACTCA	GGAGAGCGTT	CACCGACAAA	1140
CAACAGATAA	AACGAAAGGC	CCAGTCTTTC	GACTGAGCCT	TTCGTTTTAT	TTGATGCCTG	1100
GCAGTTCCCT	ACTCTCGCAT	GGGGAGACCA	TGCATAC			1537

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 47:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 48 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:47:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCCA (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:48 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 55 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWC^Ś^: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

187 408 (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:48:

CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC (2) IOTOIUMACJA DU TEE TD NO:T 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) ŁŁUCK5ŚĆ : 9 T pan zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NI^OWOŚci·. pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:49:

CG.AATTCCAA CUCUTTAlCC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GiUTCHAT (2) INFORMACJA DIAT SEQ ID NO: 50:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1546 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 50:

UCUTllCUTl	TUClTUUTCT	GCGGlGUGUl	1UT1GUU1AA	CTGCCAGGCA	CCAAClAlAA	60
CUAAlUGGGC	lUGGUAAlGl	GGGGUGGGGG	GGTTTATTTT	GGUTGGUTCn	GCUllGUGCn	110
CGCCGUlGGl	UUlGAllTGC	GGCGUUAGGG	lCGGUllGUn	GUGCGAAGCλ	GGUGCCUGGT	110
UUGGUGGUGG	ClUUlCUCCC	UGGlGllAGG	GCAGGGATCn	llCGTAUGCT	llUGGGlCCn	220
CGUlGUGlGU	GCCTTITTGC	UGGGCGlGll	ATCCTTTGGT	GlTGGGGCTn	AlGlGlTGGn	300
AlAGlGUUlC	UTCUTlCTTl	1GGGGG1A1G	lTUUGGllCn	llTGUGGCGn	UGGllllGGn	366
UCGGGlUAAA	GlCGGGUUGl	GCGGTTTGTT	TlTGUlUGGn	GCCGGUGUGT	TGUUGGlllT	442
GGGAAAUGUl	CCUTUCUCTT	1GG1C1GGCG	lGlTGGGGUn	1AG1GGGG1T	UlGGCGGTGn	448
CCTTCGCATG	CGClCUGTAl	ACATTCTTTT	GTCTTTGUUn	TlllCCUTGn	TGGUlCGTln	544
GGlGGGUGGl	TATTTATTTT	GGUlGlATGA	GlAGTlGlUn	lUUGlGllGn	lATUUGlCUn	660
GGCAGlGlGU	ClGUGAlAlA	TlAlCTlTCT	TlGlUTGUTn	GGGCGCTUlT	TUTUGAAlAT	666
CTllUClTTC	CUlAUCCATT	A^AGO^TA	UllTlUUGlT	lGTlAlGGGn	UTUlCllUlT	722
CCTUlTUlTT	TCGCTTCTTT	1AGG1G1GGT	UlUlGGGGGn	1CGG1G1UGT	GGUTTGGCln	788

187 408

AATATATTCC AATTAATCGG TGAATGATTG GAGTTAGAAT AATCTACTAT AGGATCATAT 840

TTTATTAAAT TAGCGTCATC ATAATATTGC CTCCATTTTT TAGGGTAATT ATCCAGAATT 900

GAAATATCAG ATTTAACCAT AGAATGAGGA TAAATGATCG CGAGTAAATA ATATTCACAA 960

TGTACCATTT TAGTCATATC AGATAAGCAT TGATTAATAT CATTATTGCT TCTACAGGCT 1020

TTAATTTTAT TAATTATTCT GTAAGTGTCG TCGGCATTTA TGTCTTTCAT ACCCATCTCT 1020

TTATCCTTAC CTATTGTTTG TCGCAAGTTT TGCGTGTTAT ATATCATTAA AACGGTAATA 1000

GATTGACATT TGATTCTAAT AAATTGGATT TTTGTCACAC TATTATATCG CTTGAAATAC 1202

AATTGTTTAA CATAAGTACC TGTAGGATCG TACAGGTTTA CGCAAGAAAA TGGTTTGTTA 1200

TAGTCGATTA ATCGATTTGA TTCTAGATTT GTTTTAACTA ATTAAAGGAG GAATAACATA 1020

TGGTTAACGC GTTGGAATTC GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAGGGTACC ATGGAAGCTT 1020

ACTCGAGGAT CCGCGGAAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAAGC CCGAAAGGAA GCTGAGTTGG 1040

CTGCTGCCAC CGCTGAGCAA TAACTAGCAT AACCCCTTGG GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA 1000

GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACCGCTC TTCACGCTCT TCACGC 0500 (2)INFORMACJA DLA SEQ ID NO:52:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID ^:52:

AATTCCAACG CGTTAACGCT AGCATGATGG TGiATGGTGiAT GATGTTTCA 49 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:53:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 141 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

187 408 (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 53:

HAAmCGC TCTAAAAIAC CARACRATGC CICCCTGIAA AAAATAAATT CATATAAAAA 60

ACATACAGAT TAAAAIAIGA GGTGATAAAT IAIIICTGGA GGTGTTGACA TKAATACCAC 112

TGGCGGTGAT ACTGAGCACA T 114 (2) INFOKt-AUJA DLAC SEQ ID NO:54:

(i.)CHARCKTEALCITEKA SEKOEECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 147 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojed^yicza (D) TOPOLOGIA: linilwa (ii)CYP CZTYPCCZKS:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:54:

CGAIGTGAIA	AGTAIAACCG	CAAGIGGTAT	TTATGUAAC	AAAGAAAGAC	ATAATITATC	60
AIIGAAGAIG	GTIATAIGTA	TGTTTIIIAT	ATGAATTTAI	TTTITGAAGG	GGGGIAITGI	110
HGGTAGGTG	AGAGAGGAAT	IAGACGI				147

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 55:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 55 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOPĆ: pojedtyyńza (D) TOPOIDCT: OiYiowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:55:

CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GIIGGAATTA GGTAC 55 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 50:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:50:

CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGUATT ICTCITTITA GAATCAAAT 49 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 57:

(i) CHARAKTERKUYKA SKATCrnE:

(A) DŁUGOŚĆ: 008 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

187 408 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOOOGZA: liniowa (^:i) TTn» CSWĄSSCZKI: cODNl (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:57:

GIGlAGlCCG TGAAGAGCGG TTCCICCTTT ClGCAllAll CCCCICAAGA CCCGTTTAGA	66
GGCCCCAAGG GGHATGCTA GTTATTGCTC AGCGGIGGCl GCAGCCAACT CAGCTTCCTT	120
TCCGGCHTC TTCTTCTTCT TCTTCTTTCC GCGGATCCTC GAGIlAGCIT CCATGGTACC	180
CIGCACGICG AClCT^llGIGl GCICGllTTC CAACGCGUA ACCATATGTT lTTCCTCCIT	240
IllTTAGITA AdAmiCI 1G11IC1A1I CGlTlllTTG TGAGCGCTCA CAlTTGlGll	330
TAITAAICAA GUTTTTAGC ATTTGICMl TGAATTTTTT llllATTATG AGACGTCCAT	360
ATTIdUGT ATTTAClllA ArnACmA GAGTTIGIAG mOGCHH AGGCCATCCG	422
IClGGlIGGC CTTCIGCTTl ATTTGATGCC TGGCAGTTTl TGGCGGGCGT CCTGCCCGCC	488
ACCCTCCGGG CCGTTGCTTC GCHCGTTCA AATCCGCTCC CGGCGGATTT GTCCTACTCA	550
GGAGAGCGH CACCGACAAA ClACAClTll HCGAUGGC CCAGTCTTTC GACTGAGCCT	600
TTCGITTTAI UGATGCCTG GCAGTTCCCT ACTCTCGCAT GOGGAGACCA TGCATlCGIT	660
ACGCACGT	668

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 58:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 726 pas zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:58:

GCGmCGH	Ι^Ν^ΤΑΙ	CCCCATGCGA	GAATAGGGAA	CIGCClGGCA	TCAAATAAAA	60
CCllACGCIC	1CICC1A1G1	CIGGGCCIII	CGTIIIAlCT	TTTCTTTGTC	GGCTGllCCC	120
CICCIGlGIl	GGlClllICC	GCCGGGAGCG	GAUITGACC	TTCGCGWAGCA	AlCCGCCCGG	180
GGGTGGCGGG	ClGGlCGCCC	GCClIlAlCT	GGCAAGCAAT	taattaacgca	GGAGGGGiGCC	240
CCCACCGCCC	GTCdGCGGC	CGGIlIIIGl	CCGTTCCTTA	TTTUATTCGT	CCIICGCATI	300
C^^GOUG	GCCIIIITGC	GUICTACH	OICTTIIG	TTATTTTTCT	AAAAAAATIC	360
111I1IGG1C	GICIClIlAI	IIIIAHHA	TIICHIIGA	TWIKTIAA	autchatt	420
llIlIICICl	lIICIGlGCG	CIClCllIII	AlICClIITC	TTCTAGATTT	gtttttaacta	480

187 408 (C) NICIOWOŚĆ: pojeĄyicza (D) TOPOIOPIA: lAniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:57:

GTGAAGAGCG TGAAGAGCGG TTCCTCATTT CAGCAAAAAA AACCTCAAGA CCCGTTTAGA 60

GGCAAAAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAAAT CAGCTTCCTT 120

TCGGGCTTTA TTCTTCTTCT TCTTCTTTCA GCGGATACTC GAGTAAGCTT CCATGGTACC 188

CTGCAGGTCG ACAATAGTGA GCTCGAATTC AAAAGCGTTA AACATATGTT ATTCCTCCTT 240

TAATTAGTTA AATAAAATAT AGAATAAAAT CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA. 300

TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCMA TGAATTTTTT AAAAATTATG AGAAGTCAAT 360

ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAAAAAAA GAGTTTGTAG AAACGCAAAA AGGCAATCAG 442

TAAGGATGGC CTTATGCTTA ATTTGATGCC TGGCAGTTTA TGGCGGGCGT CCTGCCCGCC 448

AAACTCAGGG CCGTTGCTTC GCAACGTTCA AATCCGCTCC AGGCGGATTT GTCCTACTCA 544

GGAGAGCGTT AACCGACAAA CAAAAGATAA AACGAAASGC CCAGTCTTTC GACTGAGCCT 660

TTAGTTTTAT TTGATGCCTG GCAGTTCCCT AATCTCGCAT GOGGAGACCA TGAATACGTT 660

AAGAACGT 668 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:48:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 726 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:48:

GCGTAACGTA TGAATG3TCT CCCCATGCGA GAGTAGGGAA CTGCCAGGCA TCAAATAAAA 60

CGAAAGGCTC AGTCGAAAGA CTGGGCCTTT CGTTTTATCT TTGGTTGGTC GGGGAACG^T 120

CTCCTGAGTA GCGGGGGTAG GAGCCCGGAC GGGTGGGAAC GCACGGCACC AGCAAGCCAC 180

GCCTCCAGCC GGCCGGGAGA GAGGTGAAAT GACGCCAGGA GGGGGACACC GGCCCCAATC 240

GCGAGAGAGA CGAGGCACCC GCCTAGGGCA GCCTGGCGGC GGGGGGGCGC TGCGGAGGCC 300

GGGGAGCGTC GAAGTTTGGA GGTTATGAGA GATATTGTCT GGGGGTGGTC GAGGAGGTCC 360

GGGGGGCCAG CTAGAGGGAT GGTTGGGGAG GGAATTGGGA GGGCGCGGGC GGGTTGGGGC 420

GGGGGTAGAA GTTCGCACAC GTAAGGAGTT GGAGAGGGCA T^AGA^: GGTGGAACGA 480

187 408

ATTAAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTCGGATTC GAGCCCCCCA GTGTCCAACC 550

GCAGGGTACC ACGGCAGCCC ACCCCACGAC CCGCGGAAA AAAGAGAAAA GCGAAGAAAG 600

CCGAAAGGAA GCCGCGTCGG CKTOAGCA TCCCCCCCCC GACCCCTTG3 600

GGCCTCTAAA CGGGTCCCGC GGGGTCCCCC GCTGAAAGGA <OλCACCCCC TTCCCGCTCT 720

TCACGC 700 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:59:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 00 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza O) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:59:

CACGCACCGG ΕΚΟ!!»» GCAGCCCCCC CCCCCCGCCC GGAC 00 (0) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: β2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(Α) DŁUGOŚĆ: 07 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:02:

GCCCCCCCGG CACCCACCCA AACCACC 20 (0) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:00:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 020 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO·^:

CATGGACGAA GAGACTTCTC ATC^TG^ GCGCGACAAA CGCCCGCCGG GTACCCGGCG 60

GACACCCACC ACACAGCAGC CGACGAGAAG CCCCCCCACC CA

020

187 408 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 62:

(i) CHAIYKWERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwass (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CĄST^CK^ : proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:62:

Met Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro

10 15

Gly Thr Tyr (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 63:

(i) CCAlRlWTKYSETKK nEKWWNCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 84 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CJĄSaTECWIi : «DINA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:63:

TAaGGlllJT TTaCCaJJlA lATlTCTTCl TTlTUATUlA GAAlJaaCTC ATCAGCTGCT

GTGTGATAAA TGTJCGCCGG GTAC (2) INFORMACJA DLA SEO ID NO:64:

(i) C CHARAKTERY STYKA SEKAEKiC JI:

(A) DŁUGOŚ:: 7n pan zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIE EEAEENCJI: EEQ ID NO: 64:

JJGUJGGACl TTTATJAClJ AUJAUCTGAa UlUlAUTTaJ TaCATCATAA TGAAAG.TATT τaGUlGUlAl AuτaacJA (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 65:

(i) CCAARAATEKYSSTYSA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 44 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

100

187 408 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:65:

TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTCACGGATT GAAC 44 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:66:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 pac zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:66:

GTGCTCCTGG TACCTACCTA AAACAGCACT GCACAGTG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 67:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 84 pac zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:67:

TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA TTACGATCCG GAAACTGGTC ATCAGCTGCT 60

GTGTGATAAA TGTGCTCCGG GTAC 84 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 68:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 78 pac zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:68:

CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTATT 60

TTGGAGGCAG AGTTTCCA 78 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 69:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 54 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

187 408

101 (C) NCCCPWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) YPC CZAIEACZKI c cNNC (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 09:

TATGGTCCAA GTAAAIGGIC AIATGATGAI GTGTGAIAAT IGIGAICCGG GTAC 54 (2) INFORMACJA. DLA SEQ ID NO:70:

(i) CKARACIEESSISKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 48 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NCACPWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) UP CZAĄHECZKI: cODA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:70:

CCGGAGAAAA ITTAIAAAAA AGAAGCTGAI GACCAGTTTC IGGGTCCA 44 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 71:

(i) CIAKTERCTRYS^,SΉYC ΞCSGCEJECAJ:

(A) DŁUGOŚĆ: 87 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NCAIPWPŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:71:

IATGAAAGAA ACICIGCCIC CATAATACCT GCAITAIGAI CCGGAAACTG GICAICAGAI 00

GAIGIGTGAI TAAIGIGAIA CGGGTAC 88 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:72:

(i) CAHREKCTRESTIKC .SEKWEHCJ I (A) DŁUGOŚĆ: 81 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIACPWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 72:

CCGGAGCACA TITAICACAC AGCAGAIGTT GACIAGTTIA CGGATCGIAA IGAAGGIAII 00

TTGGAGGCAG AGTITATIIC A 81 (2) INFORMACJA DAL SEQ ID NO: 73:

102

187 408 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 71 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ LD NO:73:

GCTGGGGTGA TlTUAllClT GATGAGGATG AGGlTGlTGl lAGTCTUCCT GCAlllTlGG 60

TGGAGGAGUl T 71 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID ^:74:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 43 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza O) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:74:

GCCGGGCCGA GACGAAAUAA AGTCTGGGTC GAAlACAGGC GCA 44 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID ^:75:

(^CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ: 76	> par zasad
(B)	TYP: kwas nukleinowy
(C)	NICIOWOŚĆ:	pojedyńcza
(D)	TOPOLOGIA:	liniowa
(ii) TYP	CZĄSTECZKT:	nCNĄ

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:75:

TlCUGACCUU ATCCTTAlTU ACUUCUACUG TGACUACGTA AGGAUGCTAT TGCCACUUAC 60

GUlAGGCUAC CCCCCl 7 <5 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:76:

(!) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NDGIOWAŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:76:

103

GTTCTCCTCA TATGAAATAC CTGCATTACG ATCCGGAAAC TGGTCAT 47 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 77:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 43 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIC^NOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJli: SEQ ID NO:77:

GTTCTCCTAT TAATGAAATA TCTTCATTAT GATGAAGAAA CTT 44 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:78:

(i) CIHARAKTERf STYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICI^W^^^Ć^: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cdNA (ci) OPIS SEKWENCJI:: SEQ ID NO:78:

TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTTACTGATT 40 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID N0:79:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOW^^^: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI:: SEQ ID NO: 79:

GTTCTCCTCA TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA 40 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID ^:80:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 43 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

104

187 408 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID ^:80:

TAJUJlJTUU ATCJTTlTGT TUJATaaCJT TTJaUlAaTl GCA 43 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID CO:71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:81:

JJUUllAJAU ATAlTUlG 18 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:82:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID ^:82:

ulτcJTJlτa AτcτGτaa 18 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 83:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID ^:83:

CJUGAAlCAU AUAlGJCACU JAlAlGTAAG 30 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:84:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

187 408

105 (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:84:

GATCCTTACT TTTGCGTGGC TTCTTTTTTT 33 (2) INFORMACJA DIA SEQ ID NO:85:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:85:

TATGTTAATG AG 11 (2) INIFORACJA DLA SEQ ID NO:86:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:86:

GATCCTCATT AACA 14 (2) IICOiaflLd DIA SEQ ID NO: 87:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA; liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:87:

TATGTTCCGG AAACAGTTAA G 21 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:88:

(i) CJAARKWTKRSTCKK 8EKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) CIJICWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOWJGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

106

187 408 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:88:

GGGGCGGGGC TCTGGGCGCG ACA 225 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:89:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (5) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:89:

GATGTTCAGG GGAAGGTCGA TGGGGTGGGA GAGAAG 33 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:90:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:90:

GAGCCTTAGG TGGGAGTGGG TGAGCTGGGT ACGGAGAG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:91:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 100 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIGIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:91:

AGAGCGACCG CGGCGAAGGA GGGGCTCGGG CGCCGGGAGG ACTGGATTGC GATCCGGGGA 60

CTCGTAGGCG GCGGCGGTGG GGGAGGTCTC CGCACGGTGC 100 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO;92:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 92 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa

187 408

107 (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 92:

CCCGlGClCl TIIATCACAC lGCACCTClT GACCAGTTTC CGGATCGTll TGCACCTATT 60

TTCGlGCCAG AGIIICTΊIC TCGTCGTCGT CG 99 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 93:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ: 26 pas zasad
(B)	IYP: kwas nukleinowy
(C)	NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D)	TOPOLOGIA: liniowa

(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 93:

Μ^^ΑΚΑ^ ICGAIUGH ACTAGA 26 (2) INFORMACJA DLA ID NO: 94:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI·.

(A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasad (B) IYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojed^yicza (D) TOPOLOGIAg ^τΙ-ΟΝΗ (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:94:

ITTGTTTTAA CTAAITAlAG GlGGllIllA AIATGAGlGC ATCGCATCAC (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:95:

(i) CHARAKIERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA

5( (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:35:

CATCACCATC ACGAAACCTT CCCGCCCllA TlCCTGClCT lCGACGlAGl 50 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 96:

(i) CHARlKTERYEIYKl SEKWENCJI:

108

187 408 (A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGU Α: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID ^:96:

AlGGCCCCAG GlUCCGGCGT UCUAGAlACG CCCGCCGUUC ACCGAAACl 49 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 97:

(^CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:97:

GUCGCGGGCA CCCGUGGGGC ATTCGT 26 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:98:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA.: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZETy nCNĄ (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:98:

GUCAGAGCAG CCUGTGUUAG GTTTGTTCGT CGCAGTGClG GTlCTTCGUG 50 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:99:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:99:

GGGlAGGCCT CUCGACGUCG lTGUCGIACGG GATCCGCCGA CACTTCACT 49 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:100:

(^CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI?:

(A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasad

187 408

109 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICICWOŚĆ: pojcedyoza (D) TO PO TOGI A: linilwa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:100:

CCTCCTTTAA TTAGTTAAAA CAAATCTAGT ATCAAATCGA TTGTGTTTGT 50 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 101:

(i) CCAARAKERYSTTKA nSKKJFEICJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 59 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CJĄSSTECZKI: <DMAA (xi) OPIS SEKWENCJIC: SEQ ID NO: 101:

ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGATTTG TTTTAACTAA TTAAAGGAGG AATAAAATG 59 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:102 (i) C0ΰAUAIΠEYSΊIKKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 48 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TTY nCĄSTTCCKI: cDNN (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:102:

CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATGAAAGAAA CTTTTCCTCC AAAATATC 48 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 103:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (iDTYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:103:

TGTTTGGGTA CCCGGCGGAC ATTTATCACA C 31 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:104:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEIWCNΪCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 59 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

110

187 408 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:104:

MmCACH TCGATaaUAT ACTAUATaTG TTaaAACTAA TTAAAGUlGU AATAlllTU 59 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 105:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 54 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojeddyicza (D) TOPOIOGIAg Ιϊη^β (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 105:

JaAATTAlAG UAGUllaAlA ATUllRlRll AAUlllCTaT TCCTJJlAAl TATC 54 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 106.

(i)C CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (i^TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:106:

aGaaτGGUτA CccuuJUulJ AτaτATJACl C 31 (2) INFORMACJA DLA ID NO:107:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 44 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:107:

JlUCJJUUUT AlAATUUlAl CUTaTCJTJC lllATlTCTT CATT 44 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 108:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 44 par zasad

187 408

111 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 108:

IGITIICATI IIACCCGGGA TGAGCGAGAG GCTITICIGC GTGT 44 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 109:

(i) CKAEAKIEESSIYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NCCCOJOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:109:

CGCIIAGCCI GGGIAATATG GAATCGITGC IICAATTTIA CCTGA 415 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 110:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) UdOWOŚĆi pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKĄ cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 110:

IIATIIIACC CGGGAIGAGC GAGAGGCIII TIIGCGIGT 39 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 111:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIdPJOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 111:

GAAATTAAGC ^mAGUe CAGATGTAIC TTTATI 36 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 112.

(i)CIHTRTCTERYSTSKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

112

187 408 (C> NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:112:

CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTCACGG ATTG 34 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:113:

ci) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:113:

AAAAATAAGC TGCTTAGCTG CAGCTGAACC AAAATC 36 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 114:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:114:

CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTTACTG ATTGG 35 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 115:

(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 102 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:115:

CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGAAACTTT TGCTCCAAAA TATCTTCATT ATGATGAAGA 60

AACTAGTCAT CAGCTGCTGT GTGATAAATG TCCGCCGGGT AC 102 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:116:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 94 par zasad

187 408

113 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) dCIOWO^^^: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID CC:006:

CCGGCGGACA TTCATCAJAJ AGCAGCTeAT GAJTAGTTTJ CTCATJATAA TGAAGATATT 60

TTGGAGJAAA AATCCJJATA TGTTATTCJT CCTT 94 (2) nraOraMACJA DLA SEQ ID NO:817:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 62 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) CIJICWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP G^IECKK: : dNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:117:

CTAGAAGGAG AATAKCATAD GGAAAJCTTD CJCAJCAAAD A^mAAT: TTATGAAAAA 66

AA 66 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 11.8:

(i) dARAKrERRYSTYIA SEKWENCJH:

(A) DŁUGOŚĆ: 62 par zasad (B) TTP: kwas nukleinowy (C) iJIdOWOŚ Ć: pojeńcźaza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZATEC^C^ZI^I : cNAA (ci) OPIS KWKKCJIJI : EEQ ID d:11::

CTAG^^M ACJACAACGD AGATAT-TTA: CAAGAAAAAD TTJJACACGD TACTJCTJJQ 60

TT 66 (2) nCORMACJA DIA SEQ ID NO:8 19:

(i) CHHARAKTORYSTYKA SJEKWNCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 51 aminokwass (B) TYP: aminokwas (C) CICICWClŚC: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)

TYP CZĄSTECZKI: proteina

114

187 408

(ci)

OPIS SEKWENCJI:

SEQ

ID NO:119:

Tyr 1

His

Tyr

Asp 5

Gln

Asn

Gly

Arg

Met 10

Cys

Glu

Cys

His 15

Met

Cys

Gln

Pro

Gly 20

His

Phe

Leu

Val

Lys 25

His

Cys

Lys

Gln

Pro 30

Lys

Arg

Asp

Thr

vaa 35

nCs

nHi

5ls

Crr

Ajs 40

CGu

5ro

ocg

Vcl

UCt 45

rna

rsA

Aap

Trp

His

(2) INFORMACJA DLA SEQ XD NO:120:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2432 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 124. .1326 (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:120:

laJllAUUJA UGGJlTlJTT JcaGaτuJCC lUlcCaτlal allllcuτcA auττcGJCau 6 o

GUCCUCCUCU CAUCCCCaAU CCCaGUCCCC GCUUCaGCCU CCGGCGUGGT CCAGAGUACC 120

ACA ATT Ile

ATG MC HG Met Asn Lys 1

TTG CTG GCC GG5 CAA CCT 5CT GGG ATT 5TT GAC ATC Τη? Leu Cyc Cyc Aln Leu Leu Va5 Phe Leu Asp iee

116 216

5

10

15 TAT Tyr

GAA Glu

aGG Trp

ACA Thr

ACC Thr 20

CAG AAC

CCC TTC

CCT ACA 5AA ATAJ ATG CAT

Gln

Glu

Thr

Phe

Pro Pro 25

Lys Tyr

Leu

His 30

GAC

CCA

GM

ACC

GGA

CGT

AGC

TCC

TGA

TTG

SAO

nut

nTG

(JT

CCT

GGC

264

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

Arg

Gln

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

35

40

45

ACC

TAC

CTA

HA

CAG

CAC

TGC

AAC

AGT

CCG

AAG

CUG

ACA

CTG

TGT

GTC

312

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gln

His

Cys

Thr

lal

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

lal

50

55

60

cca

TGC

CCT

GAC

TAC

GCG

ATC

CAA

ACA

A(GJ

T(G

CAC

ACG

AGT

GAT

GAA

360

Pro

Cys

Pro

Aap

Gyr

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

65

70

75

187 408

115

TGC GTG TAC TGC AGC CCC GTG TGC AAG GAA CTG CAG ACC GTG AAA CAG 408

Cys Val Tyr Cy3 Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Thr Val Lys Gln

8 5 90 95

GAG TGC AAC CGC ACC CAC AAC CGA GTG TGC GAA TGT GAG GAA GGG CGC 456

Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Glu Glu Gly Arg

100 105 110

TAC CTG GAG CTC GAA TTC TGC TTG AAG CAC CGG AGC TGT CCC CCA GGC 580

Tyr Leu Glu Leu Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly

115 120 128

TTG GGT GTG CTG CAG GCT GGG ACC CCA GAG CGA AAC ACG GTT TGC AAA 555

Leu Gly Val Leu Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys

130 135 150

AGA TGT Arg Cys

CCG GAT GGG TTC

TTC TCA GGT GAG ACG TCA TCG AAA

GCA CCC Ala Pro

660

Pro Asp

Gly Phe

Phe Ser Gly 155

Glu Thr

Ser 155

Ser

Lys

155

TGT

AGG

AAA

CAC

ACC

AAC

TGC

AGC

TCA

CTT

GGC

CTC

CTG

CTA

ATT

CAG

648

Cys

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Leu

Gly

Leu

Ile

Gln

160

165

170

117

AAA

GGA

AAT

GCA

ACA

CAT

GAC

AAT

GTA

TGT

TCC

GGA

AAC

AGA

GAA

GCA

695

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

180

118

115

ACT

CAA

AAT

TGT

GGA

ATA

GAT

GTC

ACC

CTG

TGC

GAA

GAG

GCA

TTC

745

Thr

Gln

Asn

Cys

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

PhP

155

220

AGG

TTT

GCT

GTG

CCT

ACC

AAG

ATT

ATA

CCG

AAT

TGG

CTG

AGT

GTT

CTG

775

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Ile

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

210

2H

222

GTG

GAC

AGT

TTG

CCT

GGG

ACC

AAA

GTG

AAT

GCA

GAG

AGT

GTA

GAG

AGG

885

Val

Asp

Ser

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

225

230

235

ATA

AAA

CGG

AGA

CAC

AGC

TCG

CAA

GAG

CAA

ACT

TTC

CAG

CTA

CTT

AAG

888

Ile

Lys

Arg

His

Ser

Gln

Glu

Gln

Thr

Phe

Gln

Leu

Lys

250

555

250

255

CTG

TGG

AAG

CAT

CAA

AAC

AGA

GAC

CAG

GAA

ATG

GTG

AAG

ATC

956

Leu

Trp

Lys

His

Gln

Asn

Arg

Asp

Gln

Glu

Met

Val

Lys

Ile

260

265

270

CAA

GAC

ATT

GAC

CTC

TGT

GAA

AGC

AGT

GTG

CAA

CGG

CAT

ATC

GGC

CAC

954

Gln

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

Val

Gln

Arg

His

Ile

Gly

His

275

280

285

GCG

AAC

CTC

ACC

ACA

GAG

CAG

CTC

CGC

ATC

TTG

ATG

GAG

AGC

TTG

CCT

1103

Ala

Asn

Leu

Thr

Glu

Gln

Leu

Arg

Ile

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

290 225 330

116

187 408

GGG AAG AAG ATC AGC CCA GCC GGA TTG GAA AGA ACG AGA AAG ACC TGC

1180

Gly Lys

Lys

Ile

Ser Pro

Asp Glu 310

Ile Glu

Arg Thr 315

Arg

Lys

Thr

Cys

305

GAG

CCC

AAC

CAA

CCC

GTG

AAA

GCT

CCT

GGC

GTG

TTC

GAC

ATC

AAA

1128

Lys

Pro

Ser

Glu

Gln

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

320

325

330

335

CGT

GGA

GCA

CAA

GGC

GAC

TTG

AAG

gcc:

GCG

GCT

TAC

GCC

GCT

GAG

CAC

1116

Asn

Gly

Asp

Gln

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

iis

340

345

350

TTG

AAA

(CCk

TAC

CAC

GTT

CCC

IGA

ACC

GTC

AAC

CAC

ACG

GCG

AGC

AAG

1228

Leu

Lys

Ala

Tyr

His

Ghh

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

iis

Ser

Glu

Arg

Lya

355

360

365

ACC

ATC

A(C3

TTC

TTG

CAC

AGC

TTC

ACC

ATG

TAC

CGG

TTG

TAT

CAG

AAA

1227

Thr

Ile

Arg

Phe

Leu

iis

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gln

Lys

370

375

380

CTC

TTT

CTA

GAA

ATG

ATA

CCC

AAT

CAG

GTT

CAA

TCA

GTG

AGG

ATA

AGC

1130

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gln

Val

Gln

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

385

390

395

TGC TTA TAGTTAGGAA TGGTCACTGG GCTGTTTCTT CAGGATGGGC CAACACTGAT 1376

Cys Leu

400

GCACC'»^»	GCCCACCCCC	CCCCCTCTTGA	GATCGCAGTT	GATTCCTTTC	TCAACAAGCC	1136
GCGCCAGTGG	ACACCCCCCA	GCC<AAAAAAA	CACACT<CCC3	AGTCttCACrC	ΑΑΤΤΑΤΑΤ&Τ	119(5
GCCΑCCΑTΑC	CTCACAGCTG	TCTAAAATTG	CCACG3TGTJC2	ACCTAGAAAG	TCAAACAACC	115(5
TGAGAAAGAG	GACATTCCTA	TWACCACk	ΟΑΑΑζΤΧΧΑΤ	ΤΑ^Τ^ΤΑ		1166
CCAGTAACCA	CAAGCACCCC	ACCATCTTCT	GTGTCATCCC	GAAACGiCGGG	CCACCCTTTC	116(5
TTATTTTCTC		ΤΟΜΑ^ΤΟ»	ggaccgjaa^c	OACCGZCTTG	CACCCCCCCA	1125(6
GACGGTCATC	CACCACCCAC	CTAGATCTCC	JACCCCTCCGG	<GGCAC:CTTC	TCCCCCCCCC	119(6
CGATAGTACG	TGACGTCCCC	TTTTCTACAA	TTCGTATOAJ	GTCGCCGACC:	CCTCACACAC	1186
	ATACCAAGGC	TGACCGTTAG		CTCTGACGAT		1116
TCCAAGACCC	CGACACACAG	GCAGGGGTAG	GTTATGGTAG	TTTACTTAAC	AACACCCCAC	1176
CACCACCCAG	GTGTTTCCCC	TTCCTCTGTA	GTTGTACCTA	ACCTGACTCC	AAAGAAACTC	2036
ACTATC''''	ATCGTCAACA	aattttattc	CTTCTATCAfG	catt<gg:tag		2066
GCGAACCAAG	ΑΤΑ^^Α^	ATATGGAGAA	AGACTTGATA	TTGCCCCCAA	CGTTCJACJGG	2156
CCCAACAGTT	TATCCACATC	TCATGCCTGG		AGTGACTATG	CCGGCCTCTTA	2216

187 408

117

TTACTGCATG CAGTAATTCA ACTGGAAATA GTAATAATAA TAATAGAAAT AAAATCTAGA

CTCCATTGGA TCTCTCTGAA TATGGGAATA TCTAACTTAA GAAGCTTTGA GATTTCAGTT

GTGTTAAAGG CTTTTATTAA AAAGCTGATG CTCTTCTGTA AAAGTTACTA ATATATCTGT

AAGACTATTA CAGTATTGCT ATTTATATCC ATCCAG

227 6

2336

2396

2432 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:121:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI

	(A) (B) (D)	DŁUGOŚĆ: 401 aminokwasów IYP: aminokwas TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	IYP	CZĄSTECZKI: proteina
(xi)	OPS T	EEKEECJI: : SEQ ID ^:121:

Met 1	Asn Lys	TTp Leu CyC 5	sos soA Lee Leu Val Phe JUbu Asp !1u	01u
11	11
Glu	Trp Thr	TTh Lin nLu	ThT rhe Prr Pro Lys	Tyr Its Lis UyH ϊγρ
		20	22	30
Pro	Glu Thr	rGyArg Gln	Le u Leu Cys Asp Lys	Cys Ala Ppp LGu	LTh
	35		44	45
Tyr	Leu Lys	Gln His Cys	Thr Val Arg Arg Lys	Thr Leu Cys Val	Pro
	50		55	66
Cys	Pro Asp	Tyr Sse Tyr	Thr Asp Ser Ttp LHi	LTr Lee LAp Glu	Ccs
65		0 0	75		80
VaU	Tyr Cys	Ssr Pro Val	Cys Lys Glu Llu Gili	LTh VvL Ils Gln	GGu
		85	90	90
Cys	A3n Arg	TTh Lis Aon	nog go1 Ucs Glu Cys	Glu Glu Gly Arqr	Lts
		700	175	HO
Leu	Glu Leu	GGu 0he Cos	sou Los sHi Arg Ser	Cys Pro Pro GGu	Llu
	775		1320	175
Gly	Val Leu	Gin Ala Gly	Thr Pro Glu Arg Asn	Thr Val Cys Lyp	Arg
	130		135	175
Cys	Pro Asp	Gly Phe Phe	Ser Gly Glu Thr Ser	Ser Lys Ala Pro	Cyy
145		'150	155		HO

Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Ser Leu Gly Leu Leu Leu He Gln Lys 165 170 175

118

187 408

Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Val Cys Ser Gly Asn Arg Glu Ala Thr 002 185 109

Gln Asn Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg 095 022 025

Phe Ala Val Pro Thr Lys Ile Ile Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val 00G 005 002

Asp Ser Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile

005 022 202 200

Lys Arg Arg His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu

005 052 055

Trp Lys His Gln Asn Arg Asp Gln Glu Met Val Lys Lys Ile Ile Gln 0δ2 005 200

Asp Ile Asp Leu Cys Glu Ser Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala 075 200 200

Asn

Leu

Thr

Glu

Gnu

euu

rrg

le G

euu

eeG

Glu

er u

euu

ro u

Gly

092

095

300

Lys

Ile

Ser

Pro

Asp

Glu

Ile

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

Lys

225

310

205

320

Pro

Ser

GGu

Gln

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Τη:

Arg

Ile

Lys

Asn

205

222

225

Gly

Asp

Gln

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

202

205

252

Lys

Ala

Tyr

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

255

360

365

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gln

Lys

Leu

272

375

380

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gln

Val

Gln

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

205

99 0

295

422

Leu

(0) INFORMACJA DLA SEQ ID

NO: '

000:

(^CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUOOŚĆ : 102 G aru aasdd (3) TY’: kasu nkkeeinwwy (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOIOGIA: Urnowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: cDNA

187 408

119 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: COS (B) POŁOŻENIE: 90..1292 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:122:

CCTTATATAA ACGTCATGAT TGCCTGGGCT GCAGAGACGC ACCTAGCACT GACCCAGCGG CTGCCTCCTG AGGTTTCCCG AGGACCACA ATG AAC AAG TGG CTG TGC TGC GCA

Met 1

Asn

Lys

Trp Leu 5

Cys

Ala

CTC

CTG

GTG

CTC

CTG

GAC

ATC

ATT

GAA

TGG

ACA

ACC

CAG

GAA

ACC

CTT

161

Leu

Val

Leu

Asp

Ile

Glu

Trp

Thr

Gln

Glu

Thr

Leu

10

15

20

CCT

CCA

AAG

TAC

TTG

CAT

TAT

GAC

CCA

GAA

ACT

GGT

CAT

CAG

CTC

CTG

209

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

His

Gln

Leu

25

30

35

40

TGT

C-AC

AAA

TGT

GCT

CCT

GGC

ACC

TAC

CTA

AAA

CAG

CAC

TGC

ACA

GTG

257

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gln

His

Cys

Thr

Val

45

50

55

AGG

AAG

ACA

TTG

TGT

GTC

CCT

TGC

CCT

GAC

CAC

TCT

TAT

ACG

GAC

305

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Ser

Tyr

Thr

Asp

60

65

70

AGC

TGG

CAC

ACC

AGT

GAT

GAG

TGT

GTG

TAT

TGC

AGC

CCA

GTG

TGC

AAG

353

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

75

80

85

GAA

CTG

CAG

TCC

GTG

AAG

CAG

GAG

TGC

AAC

CGC

ACC

CAC

AAC

CGA

GTG

401

Glu

Leu

Gln

Ser

val

Lys

Gln

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

90

95

100

TGT

GAG

TGT

GAG

GAA

GGG

CGT

TAC

CTG

GAG

ATC

GAA

TTC

TGC

TTG

AAG

449

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

105

110

115

120

CAC

CGG

AGC

TGT

CCC

CCG

GGC

TCC

GGC

GTG

CAA

GCT

GGA

ACC

CCA

497

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Ser

Gly

Val

Gln

Ala

Gly

Thr

Pro

125

130

135

GAG

CGA

AAC

ACA

GTT

TGC

AAA

TGT

CCA

GAT

GGG

TTC

TCA

GGT

545

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

140

145

150

GAG

ACT

TCA

TCG

AAA

GCA

CCC

TGT

ATA

AAA

CAC

ACG

AAC

TGC

AGC

ACA

593

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

Ile

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Thr

155 160 165

120

887 488

TTT GGC CTC CTG CTA ATT CAG AAA GGA AAT GCAACA CTG GAC AAC GTG 643.

Phe Gly Leu Leu Leu Ile Gln Lys Gly Asn Ala The His Asp As n Va 1

170 175 180

TGT TCC GGA AAC AGA GAA GCC ACG CAA AAG TGT GGA ATAGAG GGG CAA 689

Cys Ter Gly Asn Arg Glu Ala Thr Gln Lys CyC GSg SPe Asp Vsl ISt

185 190 195 200

CGG TGT GAA GAG GCC TGC TTC AGG TGG GCG GTG GSC GSC CAG CGT GGT 777

Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Val lso TSt Gps SSe ISe

205 210 225

CCA AAT TGG CTG AGT GTT TTG GTG GAC AGT TTT GSC TGG GSA CAA TGC 788

Pro Aan Trp Leu Ter lal Leu lal Asp Ter Les Psp TSg TSt Gps Lp1

220 222 227

AAT GCC GAG AGT CTT GAG AGG ATA CTT CGG AGA CAC CSA CSA AGC ASG 887

Asn Ala Glu Ter lal Glu Arg Ile Lys Arg ArA HSs sse Sse G1g nSG

275 244 244

CCT ACC Gln Ths

TTC CAG

CTG Leu

CTG CTG CTG

TGG AAT CAC TGC TAC CGA TAC CAC

888

Phe

Gln

Leu

Lys Leu 255

Tsp

Lyn

His

lsc 260

Asa Asa

gpA

VGg

250

GTT

ATG

GTG

AAG

ATC

TTC

CTT

GTC

ATT

GAC

CSC

CGT

TGGC

a(a:

a(J

959

Glu

Met

lal

Lys

Ile

Gln

Asp

Ile

Asa

Lsu

upC

L1u

u SE

s GE

265

270

275

280

GTG

CAG

CGG

CAC

TCG

AGC

GCC

scc

PTC

GCG

AAC

GAC

GGT

ACA

ACT

957

lal

Gln

Arg

His

Lli

GCl

PAs

Gei

gal

Sli

SGh

PTh

GCl

G Cl

Psu

285

20 G

225

GCC

TTG

ATG

GAG

SCG

GCC

SGG

GAA

AAA

aac

AAC

GCC

GCA

GGT

ATT

1102

Ala

Leu

Met

Glu

u TI

Sse

G os

GCl

Alt

GIl

S ei

P os

GCl

GIl

700

375

310

GAG

AGA

ACG

AGA

AAC

ACC

STG

STA,

PTC

acc:

GGA

PCT

ACT

SCG

GTT

ACT

1107

Glu

Csg

Ths

Arg

Llt

STr

Sys

SLT

Gei

Sei

GCl

Sse

Sli

Gut

Sli

715

322

372

CTC

AGT

TTA

TGA

AAG

acc

STA

GGG

AGT

PCT

GGT

ACC

PTT

GAA

acc:

1112

Leu

Ter

Leu

Τη?

f^AG

He

SLT

Acn

GCl

aal

GCl

Gasi

AGh

Psu

Alt

GCl

770

775

740

CTG

ATG

TAT

GCC

ccc

GAC

SCC

scg

(TA

AAC

PTC

GCC

ATT

GCC

GTT.

ACT

1116

Leu

Met

Tyr

Ala

Lsu

Lys

HAi

Lsu

Lys

Thr

GTr

PŚ3

Phe

Giro

Lys

Thr

745

750

755

760

GTC

ACC

CTC

AGT

CTG

AGG

GCAG

ACC

ATG

A(CC

TTC

CTG

CAC

AGC

TTC

ACA

1117

lal

Ths

Ais

Seu

Issu

Arg

Lya

Thr

Met

(Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

765

770

775

ATG

TAC

TGT

CCG

(CCG

AAG

CTC

TTT

ΤΤΑ

GTC

ATC

ATA

GCG

(CCT

(CCC

1265

Met

Tyr

Arg

Lli

Tyr

Gln

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gln

780

785

720

187 408

121

GTT CAA TCC GTG AAA ATA AGC TCC TTA TJACTTAOAA TGCTCACTU; Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu

395 400

GCTGTTTCTT CA

1112

1334 (2) INFORMACJA DLA SEC ID NO: 123:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 401 aminokwass (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEC ID NO: 123:

Met 1

Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Leu Leu Asp Ile

Ile

5

10

15

Glu

Trp

Thr

Gln

Glu

Thr

Leu

Pao

Pro

Lys

Tyr

Leu

H!g

Tyr

Asp

20

25

30

Pro

Glu

Thr

Gly

His

Gln

Leu

Cys

Asp

Lys

Cy3

Ala

Pro

GGy

TT^jo

35

44

Tyr

Leu

Lys

Gln

His

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Thr

Lru

Cys

Val

Pro

50

55

60

Cys

Pro

Asp

His

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

65

77

80

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

vaa

Cys

Lys

GG.u

Llu

Gln

3su

VVa

Ljc

dl

GGg

85

00

95

Cys

Asn

Arg

Thr

hs 3

sn 3

Ar3

Vi 3

Ss3

G1g

Cs3

G1g

GCg

A^

Caj:

100

110

111

Leu

Glu

He

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

HHi

Arg

Srr

Cys

Pro

Prr

Gly

Ssu

115

120

112

Gly

Val

Gln

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

130

135

110

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

PPe

Ser

Gly

Glu

Thir

Ser

Lys

Ala

Ppo

Cyy

145

150

155

110

Ile

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Thr

Phe

Gly

Leu

Lru

Leu

IGu

Gln

Lys

Gly Asn Ala Tiar His Asp Asn Val Cys Ser Gly Asn Arg Glu Ala Thr 180 115 HO

165 170 175

122

187 408 ^{Gln Lys} Cys ^g11 i^le Aap ^{Val Th}r ^u Cys Glu Glu Al^a Ph^e Pho A^rg095 022 025

Phe Ala Val

Pro Thr Lys

Ile 005

Ile

Pro Asn lipo Ieu 220

Ser Val

Leu Val

002

Asp

See

Leu

Pro

Gly

Thr

Lyy

Val

Gss

0AAl

Glu

Ser

Vil

Glu

Arg

Ile

005

022

025

200

Lys

Arg

His

Ser

Gln

Glu

Gln

Thr

Phe

Gln

Ieu

Lys

Leu

005

205

Trp

Lys

His

Gln

Asn

Arg

Asp

Gln

Glu

Met

Val

Lys

Ile

Gln

002

^60

072

Asp

Ile

Asp

Ieu

Cys

Glu

Ser

Vi1

Gln

Arg

His

Leu

Gly

His

Ser

075

200

Asn

Leu

Thr

Glu

Gln

Leu

Ala

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

092

209

322

Lys

Hi

Ser

Pro

GGg

Glu

Ile

Glu

Arg

TTp

Arg

Lli

Thr

Cys

Lys

225

320

Ser

Glu

Gln

Ieu

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

205

322

325

Gly

Asp

Gln

Asp

Tho

Ieu

Lys

Gly

Leu

Mee

Tyr

llo

euu

yy o

os o

euu

202

05 0

252

Lys

Thr

Ser

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Vi1

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

255

320

325

Met

Arg

peu

Ieu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Ieu

Tyr

Gln

Lys

Leu

272

325

380

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gln

Val

Gln

Ser

val

Lys

Ile

Ser

Cys

205 320 395 022

Leu (0) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:000:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 0255 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIIIIfTOŚĆ: o^edy^za (D) TOOODODUA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 90.

187 408

123 (xi) OP1S SEKWENCJI: SEQ 1D NO: 725:

GTATATATAA CUTGArGAUC UrACUUUTUC GUAUACUCAC CUGAUCUCrC UCCCAUCCGC 60

CUCrCCAAGC CCCTGAUUrr rCCUGUUACC ACA ATG AAC AAG TTG CTG TGC TGC 114

Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys

5

GCG Ala

CTC GTG

TTT CTG GAC Phe Luu Asp

ATC Ile

TCC ATT AAG TGG ACC ACC CAG GAA ACG

176

Leu

Val 70

Ser 15

Ile Lys

Trp

Thr Thr 22

Gln Glu

Thr

ttt

CCT

CCA

AAG

TAC

CTT

CAT

TAT

GAC

GAA

ACC

TCT

CAT

CAG

CTG

227

Phe

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

Glu

Thr

Ser

His

Gln

Leu

25

30

33

TTG

TOT

GAC

AAA

TGT

CCT

GGT

ACC

TAC

CTA

AAA

CAA

CAC

TGT

ACA

255

Luu

Cys

Asp

Lys

Cys

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gln

His

Cys

Thr

40

44

50

55

GCA

AAG

ruu

AAG

ACC

GTG

TGC

GCC

CCT

TGC

CCT

GAC

CAC

TAC

ACA

330

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cys

Ala

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

Thr

60

70

GAC

AGC

TGG

CAC

ACC

AGT

GAC

GAG

TGT

CTA

TAC

TGC

AGC

CCC

GTG

TGC

335

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Sur

Asp

Glu

Cys

Leu

Tyr Cys

Ser

Pro

VlU

Cys

05

80

85

AAG

GAG

CTG

CAG

TAC

GTC

AAG

CAG

GAG

TGC

AAT

CGC

ACC

CAC

AAC

CGC

440

Lys

Glu

Leu

Gln

Tyr

Val

Lys

Gln

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

00

05

10(0

GTG

TGC

GAA

TGC

AAG

GAA

GGG

CGC

TAC

CTT

GAG

ATA

GAG

TTC

TGC

TTG

445

Val

Cys

Glu

Cys

Lys

Glu

Gly Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

705

177

115

AAA

CAT

AGG

AGC

TGC

CCT

GGA

m

GGA

Gra

GTG

CAA

GCT

GGA

ACC

448

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Phe

Gly

Val

VlU

Gln

AUl

Gly

Thr

720

175

730

175

CCA

GAG

CGA

AAT

ACA

GTT

TGC

AAA

AGA

TGT

CCA

GAT

GGG

TTC

TCA

546

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

VlU

Cys

Lys

Arg

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Sur

740

745

HO

AAT

GAG

ACG

TCA

TCT

AAA

GCA

CCC

TGT

AGA

AAA

CAC

ACA

AAT

TGC

AGT

554

Asn

Glu

Thr

Sur

Sup

Lys

Ala

Pro

Cys

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Sur

755

760

165

GTC

m

G»

CTC

CTG

CTA

ACT

CAG

AAA

GGA

AAT

GCA

ACA

CAC

GAC

AAC

642

VaU

Phe

Gly

Leu

Luu

Leu

Thr

Gln

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Γ00 Ό5 180

124

187 408

ATA TGT TCC GGA AAC

AAC Ser

GAA Glu 009

TCA ACT CAA

AAA TAC AAA AGA GAT AGG

690

lie Cyi Ser Gly

Asn

Ser

Thr

GIn

Lys Cys Gly 095

Iie Asp Vil

005

ACC

CK

TGT

AAA

AAG

GCA

TTC

AGA

GGC

ACG

ATT

CCC

ACA

AAU

TGG

738

Thr

Ieu

Cys

Alu

Glu

Ali

Phe

Arg

Phe

Ali

Vil

Pro

Thr

Lys

Phe

299

025

002

005

ACG

CCT

AAC

TGG

CTT

AGT

GTC

TTG

GTA

AAC

TTG

CCT

GUC

ACC

AAA

786

Thr

Pro

Asn

Trp

Ieu

Ser

Vll

Ieu

Vil

Ayp

Asn

Ieu

Pro

Gly

Thr

Lys

002

005

230

ATA

AAC

GCA

AAG

GTA

GAG

AGU

ATA

AAA

CGG

CAA

CAC

AAC

TCA

CAA

83 4

Vil

Asn

Ali

Glu

Ser

VlI

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

Gln

His

Ser

Uln

025

002

005

AAA

CAG

ACT

TTC

CAG

CTG

AAG

TTA

TAA

AAA

CAT

CAA

AAC

AAA

GCC

900

Glu

Gln

Thr

Phe

Gln

Ieu

Leu

Lys

Ieu

Trp

Lys

His

Gln

Asn

Lys

Ali

052

055

002

CAA

AAT

ATA

ATC

AAG

ATC

CAA

GAT

ATT

GAC

CGC

TGG

GAA

AAC

992

Gln

Asp

Iie

Vll

Iyy

Lys

Ile

lie

Gln

Asp

Iie

Asp

Ieu

Cys

Ulu

Asn

005

207

AAC

ata

CAG

CGG

CAC

ATT

GAA

CAT

GCT

AAC

CTC

ACC

GTC

AAU

CAA

CTG

997

Ser

Vil

Aln

Arg

His

Ile

Gly

His

Ali

Asn

Leu

Thr

Phe

Glu

GIn

Ieu

002

005

092

095

CGT

AAC

TTT

AAT

GGA

GAG

OCT

GCC

(AAA

(AA

. gac

GUU

GAC

GAA

GAC

1026

Arg

Ser

Lei

uMe

GAg

0Se

Oie

Opi

GA.

Gn

Ly!

Vv^1

GUg

GAg

Glu

AAy

892 322 320

ATT GAA AJAA IIe Alu Lyy

AAC GCC

OAG OAC

TGC OAAA CCC ACT GJAC CAG ATC CTC3 AAA

1074

SGp 205

Ul

Lyy

A Al

Cys

Lys 202

Pro

Ser

OAJp

Gln

IIl Leu 205

Lli

CGG

CCC

aga;

TTG

OGG

CGA

ATA

AAA

(AAT

(AAC

4AAC

4CAA

OGAC

ACC

TTG

AAG

1120

Ieu

SeS

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Gln

Asp

Thr

Leu

Lyy

889

225

822

AAC CTA ATG AC^C

(AZA AA.1

CTA Leu

OA^CC Lys 325

CAC His

TGA (AA ACCCC TAC CAC TGT CCC

AAA Lyy

13^-72

AIy Ieu MeM

His

Ser

Lys

Thr

Tyr OHi 35^

Phe Pro

205

ACT

ATC

ACT

CAG

AGT

CTA

(AG

AAG

ACC

ATC

aga;

TTC

CTT

(CAC

AGC

TGC

1210

Thr

ViI

Thr

Gln

Ser

Leu

Lys

Thr

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phh

869

205

272

275

ACA

ATG

TAC

AAA

TTG

TAT

CAG

AAG

T’^JA

TTT

TTA

G.AA

ATG

ATA

GGT

MAC

ΐΣδδ

Thr

Met

Tyr

I^^s

Leu

Tyr

Gln

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met;

Ile

Gly

Aas

889 385 390

187 408

125

CAG GTC CAA TCA GTA AAA ATA AGC TGC TTA TAACTGGAAA TGGCCATTGA Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu

395 400

GCTGTTTCCT CACAATTGGC GAGATCCCAT GGATGATAA

1316

1355 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 125:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 401 aminokwasów (B) TYR: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 125:

Met 1

Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser

Ile

5

10

15

Lys

Trp

Thr

Gln

Glu

Thr

Phe

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

20

25

30

Glu

Thr

Ser

His

Gln

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Pro

Gly

Thr

35

40

45

Tyr

Leu

Lys

Gln

His

Cys

Thr

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cys

Ala

Pro

50

55

60

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

65

70

75

80

Leu

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gln

Tyr

Val

Lys

Gln

Glu

85

90

95

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Lys

Glu

Gly

Arg

Tyr

100

105

110

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Phe

115

120

125

Gly

Val

Gln

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

130

135

140

Cys

Pro

Aep

Gly

Phe

Ser

Asn

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

145

150

155

160

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Gln

Lys

Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr 180 185 190

165 170 175

126

187 408

Gln

Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe

Arg

195

200

205

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Phe

Thr

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

210

215

220

Asp

Asn

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

225

230

235

240

Lys

Arg

Gln

His

Ser

Gln

Glu

Gln

Thr

Phe

Gln

Leu

Lys

Leu

245

250

255

Trp

Lys

His

Gln

Asn

Lys

Ala

Gln

Asp

Ile

Val

Lys

Ile

Gln

260

265

270

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Asn

Ser

Val

Gln

Arg

His

Ile

Gly

His

Ala

275

280

285

Asn

Leu

Thr

Phe

Glu

Gln

Leu

Arg

Ser

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

290

295

300

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Asp

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Cys

Lys

305

310

315

320

Pro

Ser

Asp

Gln

Ile

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

325

330

335

Gly

Asp

Gln

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

His

Ala

Leu

Lys

His

Ser

340

345

350

Lys

Thr

Tyr

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

Gln

Ser

Leu

Lys

Thr

355

360

365

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Lys

Leu

Tyr

Gln

Lys

Leu

370

375

380

Phe

i Leu

i Glu

. Met

. Ile

i Gly

’ Asn

i Gln

. Val

Gln

. Ser

Val

Lys

Ile

! Ser Cys

385

390

395

400

Leu (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 126:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 139 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:126:

187 408

127

Cys 1

Pro

Gln

Gly

Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cy3

5

10

15

The

Lys

Cys

His

Lys

Gly

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asp

Cys

Pro

Gly

Pro

20

25

30

Gly

Gln

Asp

Thr

Asp

Cys

Arg

Glu

Cys

Glu

Ser

Gly

Ser

Phe

Thr

Ala

35

40

45

Ser

Glu

Asn

His

Leu

Arg

His

Cys

Leu

Ser

Cys

Ser

Lys

Cys

Arg

Lys

50

55

60

Glu

Met

Gly

Gln

Val

Glu

Ile

Ser

Cys

Thr

Val

Asp

Arg

Asp

Thr

65

70

75

80

Val

Cys

Gly Cys

Arg

Lys

Asn

Gln

Tyr

Arg

His

Tyr

Trp

Ser

Glu

Asn

85

90

95

Leu

Phe

Gln

Cys

Phe

Asn

Cys

Ser

Leu

Cys

Leu

Asn

Gly

Thr

Val

His

100

105

110

Leu

Ser

Cys

Gln

Glu

Lys

Gln

Asn

Thr

Val

Cys

Thr

Cys

His

Ala

Gly

115

120

125

Phe

Leu

Arg

Glu

Asn

Glu

Cys

Val

Ser

Cys

130 135 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 127:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 48 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:127:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCCA (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 128:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 219 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:128:

128

187 408

Met Luu Gly Ilu Tjp Tlus Luu Leu Pro Leu Val Leu Ths Ter Val Ala 15 10 15

Tsg Leu Ser Sep Lyp Ser lal Ala Ala Gln Val Thr Anp Ile Asn Ser 20 25 30

Lys Gly

Luu Glu 75 GCl Luu

Leu Arg Lyn Chs lal Chs Thr lal Glu Tho Gln Ann

Luu Pgt 65

Glu 50 Gly

4G Ais His Asp Gly Gln Pite 5G

45 Cys Ais Lys Pro Cys

Pro Pro 80

60

Typ Glu

Glu

Arg

Lys

Ala 70

Tsg

Anp

Cyn

Ths

lal 75

Ala

Cly

Tsp

Cyn

lal

Pgt

Cyn

Gln

Glu

Cly

Lyn

Glu

Tyr

Tho

Typ

Lyn

Ala

Ain

85

90

95

Phe

Sei

Tes

Lyn

Cys

Aog

Arg

Cyn

Asg

Leu

Cys

Tsp

Glu

Gly

His

Gly

100

HO

Leu

Glu

Vil

GCl

Ul

Acn

Cys

Thr

Tsg

Ths

Gln

Ala

TGh

Ly7

Cys

Aco

115

120

115

Cya

Lys

Pro

Acn

Phe

Cys

Aan

Ees

Chs

lal

Cya

GCl

Ain

Cya

Aca

170

117

140

Pgt

Cy2

Thr

Lyp

Cys

Glu

His

Cly

Ile

Syp

Glu

Cyn

Ghr

Leu

Thr

145

10 G

55 P

110

Tur

Tsa

Thr

Lyp

Cys

sap

Glu

Cly

Eer

Srp

Ter

Ann

Leu

Gly

Tjg?

165

70 P

1115

Luu

Cys

Leu

Luu

Leu

Pro

Ile

PPO

Luu

Ilu

lal

Trp

Val

Lyy

krg

180

115

110

Lys

Glu

Val

Gln

Lyy

Thr

Cyn

Arg

Lys

His

Arg

Lys

Gl^u

Aan

Gln

Gly

195

200

220

Eus

Ais

Glu

Ses

Pro

Thr

Luu

(asn

Pro

Glu

Thr

210

221

(2) INFORMACJA DLA EEQ ID NO:125:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 280 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄTCECZK^I: proteina

187 408

129

	(ci) OPIS	SEKWENCJI:	SEQ	ID KO:129:
Met 1	GGy Leu Ser	Thr Val Pro 5	Asp	Ilu Lru Leu Pro Lru Val Lru Llu 10 15
Glu	Leu Leu Val 20	Gly IGe Tyr	Pro	Ser Gly Val Ile Gly Ilu Val Pro 25 30
His	Lru Gly Asp 35	Arg GGu Lys	Arg <10	Asp Sro Val Cys Pro Gln Gly Lys 45

Tyr IGe 50

His srr Gln Asn Asn Ssu 55

Ile Cys

Cys

Tho Lys 00

Ces His

Lic

GGy

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asp

Cys

Pro

Gl.y

Pro

Gly

Gln

Asp

Tho

Asp

05

70

75

80

Cys

Arg

Glu

Cys

Glu

Seo

Gly

Seo

Phe

Thr

Ala

Srr

Glu

Asn

His

Llu

85

00

05

Arg

His

Cys

Leu

Ser

Cys

Ser

Lys

Cys

Arg

Lys

llu

Met

GGy

lis

Val

100

115

110

GGu

IGe

Ser

Cys

Thr

Val

Asp

Arg

Asp

Thr

Val

Cys

Gly

Cys

Arg

115

110

122

Lys

aa^

Gln

Tyo

Arg

His

Tys

Gyf

Seo

Glu

Asn

Llu

3he

Gln

Cys

PPe

130

115

114

Ass

Cys

SeS

Alu

3yy

Llu

Ass

Gle

Thr

VVa

His

Leu

Ser

Ces

Gln

Glu

145

115

155

160

Ly3

Gln

Asn

TTr

Vv1

Cyc

TTr

3yc

His

AAg

GGy

Phe

rhr

Leu

Arg

Gle

105

117

175

Asn

GGu

Cys

wa

3-er

Cys

Sur

Asn

Cys

llc

Lys

Ser

Leu

Glu

Cys

TTi

180

US

100

Lys

Lru

Cys

Llu

3ro

Gln

IGe

Glu

Asn

Val

Lys

lly

Thr

Glu

Asp

Ssu

105

220

2(05

GGy

Thr

Tho

Val

Leu

Pro

Leu

Val

Ilu

Phr

PPh

lly

Leu

Cys

Leu

210

215

222

Leu

Sro

Leu

Phe

Ile

Gly

Leu

Mrt

Tyr

Aog

Tyr

Gln

Arg

Trp

Lys

225

230

235

224

Srr

Lys

Leu

Tyr

Ser

He

val

Cys

Gly

Lys

Srr

Tho

Pro

Glu

Lys

Glu

245

250

255

Gly

GGu

Leu

Gle

Gly

Thr

Lys

Poo

Leu

. Ala

Pro

Asn

Poo

Ssu

200

205

200

130

187 408

Phe Ser Pro Ghr Pro Uly Phe Cha 075 069 (0) INFORMACJA DLA SEQ ID ND:259:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 027 aminokwasów (3) TYP: aminokwas (C) N:E<A^C^^C^^<Ś: pojedyńcza (D) TOPOIOGCIA: liniowa (ii) TYY 0 JZĄSECZKI: proteina

(ci)

OOPI 0S1KKENCJI:

SEQ

ID

NO : HO:

Met

Leu

Aai

Ieu

Ile

Ali

Leu

Ieu

Vil

Cys

Val

Tya

Vil

Grr

Gly

0

5

02

05

Asp

Vv1

Pro

Cyfr

Ser

Asn

Gln

Gly

Lys

Cys

Aly

Uly

His

AAP

02

05

20

Tyr

Alu

Lys

Asp

Uly

Leu

Cys

Ala

Ser

Cys

His

Pm

Aly

Phe

Tyr

25

02

45

Ali

Ser

Arg

Ieu

Cy3

Aly

Pro

Gly

SSr

A^n

TCr

(Ml

Gcr

S^r

Pro

Cer

52

50

60

Ulu

Asp

Gly

Thr

Phe

Tha

Ala

Ser

Thr

Asn

HHo

AA.1

Opo

AA.1

Cys

Vv1

05

70

75

80

Ser

Cci

Arg

Gly

Pro

Cyo

Ghr

Gly

His

Leu

Ser

Alu

Ser

Gln

Ppo

Ser

05

92

95

Ayp

Aai

Thr

Cha

Ash

SuA

poi

CyA

Aon

CyS

Ser

Th r

Gly

ASh

Aur

sns

022

102

100

Leu

Lie

Lys

Hy

G1a

Log

noy

CyA

nrg

All

Cys

Ala

Pro

GAu

POo

uns

005

000

125

Cys

Pro

Ali

Gly

Ty_r

Gly

HO

Seu

Gly

HSo

Tho

Arg

Alu

Gly

Asp

hOr

082

25 0

140

Leu

Cci

Glu

Lys

Cys

Oo o

Pro

His

Thr

Gyr

Ser

Asp

Ser

Leu

Ser

Pro

005

52 0

055

100

Tha

GAu

Arg

Cys

Gly

ha o

Ser

Phe

Asn

Tyr

Ile

Ser

Val

Gly

Phe

Asn

005

170

105

Ieu

Gii

Pro

Vil

Asn

Alu

Ghr

Sea

Cys

Cha

Gha

Ali

Uly

His

Asn

002

100)

100

187 408

131

Glu aal Ile Lyy Tho Lyy Glu Ohe Tho Val Tho Leu Asn Tyo Tho 195 200 205 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 131:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚCI: 227 aminokwasów (B) TYO: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (ci) OOIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 131:

Met Ala Ooo Val Ala

aal

Top

Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu

1

5

10

15

Top

All

Ala

AAa

Ala

Ay a

LeA

a ao

Ala

Gln

oo i

Ala

Ple

TIa

a m

eTh

20

215

30

Ala

Poo

Glu

Prl

Olo

le a

Thr

oas

Tho

Leu

eye

du

tiu

ogr

ua t

o Gt

35

4i

45

Tho

Ala

Gln

Met

Cyy

Seo

Lyy

Cyy

Seo

Poo

Gly

Gln

Hiy

Ala

Lyy

50

55

60

aal

Phe

Ccs

Tho

Lys

Tho

Seo

Ayp

Tho

aal

Cyy

Ayp

Seo

Cyy

Plu

AAy

65

70

75

80

Seo

Tho

Tyr

Tho

Gln

Leu

Top

Ayn

Top

aal

Poo

Glu

Cys

Leu

Seo

Cye

85

90

95

Gly

Seo

Arg iys

ieo

Seo

Asp

Gln

Val

rlu

Tho

Gln

Ala

Cys

TTh

iAg

100

105

110

Glu

Gln

Am

Arg

Ile

Cyy

Tho

Cyy

Aog

Poo

Gly

Τ3φ

Tyr

Cys

GAl

iee

115

20 i

255

Seo

Lys

Gln

Glu

Gly

Cys

Arg

Leu

Cys

Ala

Pro

Lnu

ugr

Lys

Cys

Arg

130

135

1^40

Poo

Gly

Phe

Gl^y

Val

Ala

Aog

Pro

Gly

Tho

Glu

The

Sea

Asp

Val

Vaa

145

150

155

116

Cyy

Lyy

Pro

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

Phe

Ser

Ayn

hoa

ho a

Sog

Ser

Thr

165

170

177

Asp

Ile

^Cyy

Ao^g

Poo

Hiy

Gln

Ile

Cyy

Ayn

Val

aal

Ala

Ile

Poo

Ple

180

18i

190

132

187 408

Asn Ala Ser Arg Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205

Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220

Gln His Thr

225 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 132:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 197 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:132:

Met 1	Val	Ser	Leu	Pro 5	Arg	Leu	Cys
Ala	Val	His	Leu 20	Gly	Gln	Cys	Val
His	Asp	Gly 35	Gln	Cys	Cys	Asp	Leu 40
Ser	His 50	Cys	Thr	Ala	Leu	Glu 55	Lys
Gly 65	Glu	Phe	Ser	Ala	Gln 70	Trp	Asn
Arg	His	Cys	Glu	Pro 85	Asn	Gln	Gly
Ala	Glu	Ser	Asp 100	Thr	Val	Cys	Thr
Ser	Lys	Asp 115	Cys	Glu	Ala	Cys	Ala 120
Phe	Gly 130	Val	Met	Glu	Met	Ala 135	Thr
Pro 145	Cys	Pro	Val	Gly	Phe 150	Phe	Ser

Ala	Leu 10	Trp	Gly	Cys	Leu	Leu 15	Thr
Thr 25	Cys	Ser	Asp	Lys	Gln 30	Tyr	Leu
Cys	Gln	Pro	Gly	Ser 45	Arg	Leu	Thr
Thr	Gln	Cys	His 60	Pro	Cys	Asp	Ser
Arg	Glu	Ile 75	Arg	Cys	His	Gln	His 80
Leu	Arg 90	Val	Lys	Lys	Glu	Gly 95	Thr
Cys 105	Lys	Glu	Gly	Gln	His 110	Cys	Thr
Gln	His	Thr	Pro	Cys 125	Ile	Pro	Gly
Glu	Thr	Thr	Asp 140	Thr	Val	Cys	His
Asn	Gln	Ser	Ser	Leu	Phe	Glu	Lys

155 160

187 408

133

Cys

Tyr

Pro

Trp

Thr 165

Ser

Cys

Glu

Asp

Lys Asn Leu 170

Glu

Val

Leu Gln 175

Lys

Gly

Thr

Ser 180

Gln

Thr

Asn

Val

Ile 185

Cys Gly Leu

Lys

Ser 190

Arg Met

Arg

Ala

Leu

val

195 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 133:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 208 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:133:

Met Asn 1

Lys Trp

Leu 5 Gln

Cys Glu

Cys Ala Leu Leu 10

Val Phe Leu Asp Ile Ile

Lys

Tyr Leu

His 30

15

Glu

Trp

Thr

Thr 20

Thr Phe

Pro 25

Pro

Tyr

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

Arg

Gln

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

35

40

45

Tyr

Leu

Lys

Gln

His

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

50

55

60

Cys

Pro

Asp

Tyr

Ser

Tyr

Thr' Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

65

70

75

80

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gln

Thr

Val

Lys

Gln

Glu

85

90

95

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

100

105

110

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Leu

115

120

125

Gly

Val

Leu

Gln

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

130

135

140

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

145

150

155

160

134

187 408

Arg

Lys

His

Thr

Asn 165

Cys

Ser

Leu

Gly 170

Leu

Ile

Gln 115

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr 180

His

Asp

Asn

Val

Cys 185

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu 150

Ala

Thr

Gln

Asn

Cys

Gly

He

Asp

Va5

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

155 200 205 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 134:

(i)OffiARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 225 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojeddńńza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:134:

Met 1

Gly

Ala

Gly

Ala 5

Thr

Gly

Arg

Ala

Met 10

Asp

Gly

Pro

Arg

Leu 15

Leu

LLe

Leu 20

Leu

Gly

Val

Ser

Leu 25

Gly Gly

Ala

Lys

Glu 30

Ala

Cys

Pro

Thr

Gly 35

Leu

Tyr

Thr

His

Ser 40

Gly

Glu

Cys

Lys 45

Ala

Cys

Asn

Leu

Gly 50

Glu

Gly

Val

Ala

Gln 55

Pro

Cys

Gly

Ala

Asn 60

Gln

Thr

Val

Cys

Glu 65

Pro

Cys

Leu

Asp

Ser 70

Val

Thr

Phe

Ser

Asp 75

Val

Ser

Ala

Thir 80

Glu

Pro

Cys

Lys

Pro 85

Cys

Thr

Glu

Cys

Val 00

Gly

Leu

Gln

Ser

Met 95

Ser

Ala

Ppo

5 ys

Val 100

Glu

Ala

Asp

Ala 055

val

C^^s

Arg

Cy5

Ala 110

Tyr

GGy

Tyr

Gln 115

Asp

Glu

Thr

Gly 120

Acg

Cys

Glu

Ala

Cys 125

Aacj

Val

Cys

Glu

Ala 130

Gly

Ser

Gly

Leu

Val 35 5

Phe

Ser

Cys

Gln

Asp 140

Lys

lin

Am

Thr

Val 155

Cys

Glu

Cys

Pro 150

Asp

Gly

Thr

Tyr

Ser 155

Asp

Glu

Ala

Asn

His 110

187 408

135

Val

Asp

Pro

Cys

Leu 165

Pro

Cys

Thr

Val

Cys 171

Glu

Asp

Thr

Glu

Arg 175

Gln

Leu

Arg

Glu

Cys 180

Thr

Arg

Tip

Ala

Asp 185

Ala

Glu

Cys

Glu

Glu 119

Ile

Pro

Gly

Arg

Trp 195

Ile

Thr

Grg

Ser

Thr 5200

Pro

Glu

Ser 5205

Asp

Ser

Thr

Ala

Pro

Ser

Thr

Gln

Glu

Pro

Glu

Ala

Pro

Glu

Gln

Asp

Leu

Ile

210 215 222 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 135:

<'aJCHARAKCERXeCYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 205 aminokwass (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: poje<edu:za (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 135:

Met Tyr 1

Val Tp

VaG Gln 5

Gln Lys

Pro Thr Ala Phe Leu Leu Leu Gly Lyu

Gly

Val 20

10

515

Ser

Leu

Thr

Val

Leu

Asn 525

Cys Val

Lys

Asp

Thr 30

Tyr

Pro

Ser

Gly

iis

Lys

Cys

Grg

Clu

Cys

Gln

Pro

Gly

iis

Cly

Met

Val

35

40

45

Ser

Grg

Cys

Csp

iis

Thr

Arg

Asp

Thr

Val

Cys

iis

Pro

Cys

Clu

Pro

50

55

60

Gly

Phe

Tyr

Csn

Clu

Ala

Val

Asn

Tyr Asp

Thr

Cys

Lys

Cln

Cys

Thr

65

70

7G

80

Gln

Cys

Csn

iis

Arg

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu

Lys

Gln

Asn

Cys

Thr

Pro

85

90

95

Thr

Glu

Asp

Thr

VaG

CyG

Gln

CyG

Arg

Pro

Gly

ThG

Gln

Pro

Arg

dn

100

10G

111

Csp

Ser

iis

Lys

Leu

Gly

Val

Csp

Cys

Val

Pro

Cys

Pro

Gly

115

12G

125

136

187 408

His

Phe 130

Ser

Pro

Gly

Ser

Asn 135

Gln

Ala

Cys

Lys

Pro 140

Trp

Thr

Asn

Cy3

Thr 145

Leu

Ser

Gly

Lys

Gln 150

Ile

Arg

His

Pro

Ala 155

Ser

Asn

Ser

Leu

Asp 160

Thr

Val

Cys

Glu

A3p 165

Arg

Ser

Leu

Ala 170

Thr

Leu

Trp

Glu 175

Thr

Gln

Arg

Thr

Thr 180

Phe

Arg

Pro

Thr

Thr 185

Val

Pro

Ser

Thr

Thr 190

Val

Trp

Pro

Arg

Thr

Ser

Gln

Leu

Pro

Ser

Thr

Pro

Thr

Leu

Val

195 200 205 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 136:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 191 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:136:

Met 1

Gly

Asn

Cys 5

Tyr

Asn

Val

Val 10

Ile

Val

Leu

Leu 15

Val

Gly

Cy3

Glu

Lys 20

Val

Gly

Ala

Val

Gln 25

Asn

Ser

Cys

Asp

Α3Π 30

Cys

Gln

Pro

dy

Thr 35

Phe

Cys

Arg

Lys

Tyr 40

Asn

Pro

Val

Cys

Lys 45

Ser

Cys

Pro

Ser 50

Thr

Phe

Ser

Ile 55

Gly

Gln

Pro

Asn 60

Cys

Asn

Ile

Cys

Arg 65

Val

Cys

Ala

Gly

Tyr 70

Phe

Arg

Phe

Lys

Lys 75

Phe

Cys

Ser

Thr 80

Hi3

Asn

Ala

Glu

Cys 85

Glu

Cys

Ile

Glu

Gly 90

Phe

His

Cys

Leu

Gly 95

Pro

Gln

Cys

Thr

Arg 100

Cys

•Glu

Lys

Asp

Cys 105

Arg

Pro

Gly

Gln

Glu 110

Leu

Thr

Lys

Gln

Gly

Cys

Lys

Thr

Cys

Ser

Leu

Gly

Thr

Phe

Asn

Asp

Gln

Asn

115 120 125

187 408

137

Gly

Thr 130

Gly

Val

Cys

Arg

Pro 135

Trp

Thr

Asn

Cys

Ser 140

Leu

Asp

Gly

Arg

Ser 145

Val

Leu

Lys

Thr

Gly 150

Thr

Glu

Lys

Asp 155

Val

Cys

Gly

Pro 160

Pro

Val

Ser

Phe 165

Ser

Pro

Ser

Thr

Thr 170

Ile

Ser

Val

Thr

Pro 175

Glu

Gly

Pro

Gly 180

Gly

His

Ser

Leu

Gln 185

Val

Leu

Thr

Leu

Phe 190

Leu

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 137:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 54 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:137:

TATGGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTAC (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 138:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 380 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:138:

Glu

Thr

Leu

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

His

1

5

10

15

Gln

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gln

His

20

25

30

Cys

Thr

Val

Arg

Lye

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Ser

35

40

45

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

50

55

60

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gln

Ser

Val

Lys

Gln

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

65

70

75

80

138

1877

Asa Asg Val Cys Alu Ups Glu Glu Gly Aru U(^r Glu Glu IFa GTs Phe
	85	9G	95
Cyn	Leu Lys His Arg Ser Cys	Pro Pro Gly	Ses Gly 'aal Val Gln Ala
	100	105	111
Gly	Tho (pro OGl Arg Src ATh	Gal Cys Lyn	Lyn Cyn Pro Asp Gly PPh
	115	120	125
Ohr	Tur GCy GCl Ghr hSE SEr	Lys Ala Oso	Cyn Ilu Lys His Tho Acn
	170 135		140
Cyn	Ees TCh Phe Cly Leu Leu	Luu Ile Gln	Lys Gly (La Ala Tho HAs
145	115		155 166
Typ	Ann Val Cyn Eur GGu Ann	(Scg Glu (Ha	Thr Gln Lys Cys Gly Hu
	165	17G	175
Typ	lal Thas Seu Gys GSg Glu	Ala Che lao	Asg Phu Ala Vr1 Poh Ala
	180	18P	119
Lyn	Ile Ile Pro asa Trp Luu	SEr lal Leu	Val Asp SEr Lip Pro Gly
	195	220	220
Tho	Lyy Val Ucs Ala Glu SEr	Val Glu Arg	Ilu Les Arg Ac^sr Ais SEr
	210 225		222
Ers	Gln Glu Gln Tho Phe Gln	Leu Leu Gys	Sau Trp Lys His Gis Asi
225	270		275 224
Csg	Ayp Gln Glu Mut lal Lys	Lys IIl Ilu	Gln Asp Iir Typ Lip Cct
	245	250	255
Glu	SEr Ers lal Gln Arg Ais	Leu GGu His	Ees Cyn Lip TTh Tho GGu
	260	226	227
Gln	Leu Lip Ala Lip Met Glu	Tuo Leu Oso	Gly Lys Lyy IIu Ter Poro
	275	280	285
Glu	Glu Ile Glu Arg Tho Arg	Lyy Tho Cyn	Lys Ser Tes GUp Gln Leu
	290 295		370
Leu	Lyy Leu iru Ter Leu Trp	Arg Hu Lys	Asn Gly Asp Gln Asp Thr
705	710		31G 370
iru	Lys Gly Lru Mut Tys Ala	Leu Lys Ais	ieu Lyn Tho Err Ain Phe
	725	30G	335
Pgt	Lys Thr Val Thr HSg Ser	Leu Arg Lys	Ths Met Arg Phe Lip His

740 345 370

187 408

139

Ser Phe Thr Met Tyr Arg Leu Tyr Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile 355 360 365

Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu 370 375 380 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 139:

(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 380 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 139:

Glu

Thr

Phe

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

Glu

Thr

Ser

His

1

5

10

15

Gln

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gln

His

20

25

30

Cys

Thr

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cys

Ala

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

35

40

45

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Leu

Tyr

Cys

Ser

Pro

50

55

60

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gln

Tyr

Val

Lys

Gln

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

65

70

75

80

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Lys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

85

90

95

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Phe

Gly

Val

Gln

Ala

100

105

110

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

115

120

125

Phe

Ser

Asn

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

Arg

Lys

His

Thr

Asn

130

135

140

Cys

Ser

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Gln

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

145

150

155

160

Asp

Asn

Ile

Cys

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Ser

Thr

Gln

Lys

Cys

Gly

Ile

165 170 175

140

187 408

Ayp aal Tho Leu Cyy Plu Plu Ala Phe Phe Aog Phe Ala aal Poo Tho

180

185

190

Lyy

Phe

Tho

Poo

Ayn

Top

Leu

Seo

val

Leu

Val

Ayp

Asn

Leu

Poo

Ply

195

200

220

Tho

Lyy

Val

Ayn

Ala

Plu

Seo

VtI

Plu

Aog

IlS

Lyy

Aog

Gln

His

Seo

210

215

220

Seo

Pln

Plu

Pln

Tho

Phe

Pln

Leu

Lyy

Leu

Top

Lys

His

Gln

Asn

225

220

223

224

Lyy

Ala

Pln

Ayp

Ile

Val

Lys

Lyy

Ile

Pln

Ayp

Ile

Ayp

Leu

Cys

245

252

225

Plu

Asn

Seo

Val

Gln

Aog

His

IlS

Ple

Hiy

Al a

sn e

Luu

Th r

hhe

Glu

260

255

270

Pln

Leu

Arg

Ser

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Giy

Lys

V» i

Gly

Ala

275

228

Plu

Ayp

Ile

Plu

Lyy

Tho

Ile

Lys

AGa

yyy

Lyy

Poo

Seo

Asp

Pln

Ile

290

295

300

Leu

Lyy

Leu

Sug

So i

Sug

opp

orp

ii a

Sya

yne

GSp

ypp

Gne

yp e

hor

305

331

330

Leu

Lyy

Ply

Leu

Met

Hiy

Ala

Leu

Lys

His

Seo

Lys

Tho

Tyo

His

Phe

325

330

3)35

Poo

Lyy

Tho

Ti5

The

Gne

Sea

Syp

Tha

He

oge

hSe

Sea

His

340

45 5

500

Seo

Phe

hoa

eta

So i

Sy i

Sug

So a

ane

Syp

Sue

hSe

Sue

Gue

Sti

He

355

360

3(55

Ply

Ayn

Pln

aal

Gln

Seo

aal

Lye

Ile

Seo

Cyy

Leu

370 375 380 (2) INFORMACiAC DLA SEQ ID OO :100:

(i) CKTETCTEESSIYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: nukleinowy acid (C) NCCCPJOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

187 408

141 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 140:

TGGACCACCC AGAAGTACCT TCATTATGAC 30 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 141:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYR: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 141:

GTCATAATGA AGGTACTTCT GGGTGGTCCA 30 (2) INFORMACJĄ DLA SEQ ID NO: 142:

(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO-.142:

GGACCACCCA GCTTCATTAT GACGAAGAAA C 31 (2) INFORMACJĄ DLA SEQ ID NO: 143:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 pac zasad (B) TYP: nukleinowy acid (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYR CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 143:

GTTTCTTCGT CATAATGAAG CTGGGTGGTC C 31 (2) INFORMACJA DLA SEQ ^ID NO: 144:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 29 pac zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa

142

187 408 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:144:

GaGGCCCCCC CCGGACGACG lCACCGCaC 2 i) (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 145:

(i) CHCRCWGKRSECSWA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) dCIOWC^Ś^: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:145:

GCGCGGaGaC aGCGaCCaGG GTGGaCCAC 29 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 146:

(i) CHlSCWaKRSEGSWC SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) rodOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:146:

cGaaaccacc cccGaτccττ CAaτcaGCc 22 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:147:

(i) CHCRCWCERSEGSKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) CICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (WTYP CZĄSTECZKI: cDd (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 147:

GaCCaCCaGC AGGAACTaaG GCGGlCCCG 29 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:148:

(iCCARAKIERYSIYKi SnKwwnCjI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: jpąj&dńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (rDTYP CZĄSTECZKI: cDNA

187 408

143 (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:148:

UGlllGGGGT GGGGGAllUG AGGGTGAGCl TG 32 (2) INFOORMACJA DLA SEQ IID NO:149:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIGIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:149:

GlGlAGGlAG GClGCCCUCA UUllAGGCCG CC 32 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 150:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 pac zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ^: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:150:

GAGUGAAAlG GGUGUAlGAG ACGGGΑG 27 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:151:

(i) CRAIRAZG2RY SSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 pac zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLGU: : linioaa (ii) TYP CZĄSTE^ZK:: CDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:151:

UGGAGAGGCA GGGGGUlCGC GCUGUGG 22 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 152:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 pac zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NDGIPWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:152:

GAGGGGUGGG GAlUlUGGGC GCCCC

144

187 408 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 153:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 pac zasad (B) TYR: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:153:

GAAGAAGGCC TCTTCCGACA GGGTG 25 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 154:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pac zasad (B) TYR: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:154:

TGACCTCTCG GAAAGCAGCG TGCA 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:155:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pac zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:155:

TGCACGCTGC TTTCCGAGAG GTCA 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 156:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pac zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:156:

CCTCGAAATC GAGCGAGCAG CTCC 24 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 157:

(i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

187 408

145 (A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xx) OPIS SEKWENCJI: SEC ID NO:157:

CGATTTCGAG GTCTTTCTCG TTCTC 25 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 158:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:158:

CCGTGAAAAT AAGCTCGTTA TAACTAGGAA TGG 33 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 159:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xx) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:159:

CCATTOCTAG TTATAACGAG CTTATTTTCA CGG 33 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 160:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza
(D)	TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	TYP	CZĄSTECZKI: cDNA
(xi)	OPIS	SEKWENCJI: SEQ ID NO:160

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 161:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 44 par zasad

146

187 408 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:161:

CCTCTCTCGA GTCAGGTGAC ATCTATTCCA CACTTTTGCG TGGC 44 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:162:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 paz zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:162:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:163:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 paz zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:163:

CCTCTCTCGA GTCAAGGAAC AGCAAACCTG AAGAAGGC 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:164:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 paz zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:164:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:165:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 paz zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa 50

187 408

147 (ii)TYP CZĄTCECZKI: cDNA (xi) OPIT EEKWENCJI: EEQ ID ^:165:

yyccccccGA gccaccccgc gccgagcctc caccggcc 78 (2) INFORMACJA DLA EEQ ID NO: 500:

(i) CATRAKCERYECYKA EEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 78 pas zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄTCECZKI: CDNA (xi) OPIE EEKWENCJI: EEQ ID NO:500:

CCCCCGAUCC CaTGCCCCCG AGGACCACCA GGAACAAG 37 (2) INFORMACJA DLA TEQ ID NO:508:

(i) CAARAKTERYEGYKA EEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 78 pas zasad (B) TYP: nncleic acid (C) NeyeOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄTCECZKI: CDNA (xi)OPIE EEKWENCJI: EEQ ID ^:167:

CyTCCCCCGA GCHTCGACGT CCCCaAGCGC GGCAUGCC 37 (2) INFORMACJA DiA TEQ ID ^:168:

(i) CAARAKGERYETYKA EEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄTCECZKI: proteina (xi) OPIE EEKWENCJI: EEQ ID NO:505:

Mrt Lys Ais Ais Ais Ain Ais Ais Ain Ala Ees lal Asn Ala Luu GUp 1 5 10 15

187 408

FIG.IC

Obszar homologii wFRI-I

θ Domena bogata w cysteinę J Domena śmierci

187 408

FIG.2A

AUG TAG —a -— ^SP FIG.2B

30 50

ATCAAAGGCAGGGCATACTTCCTGTTGCCCAGACCTTATATAAAACGTCATGTTCGCCTG

90 110

GGCAGCAGAGAAGCACCTAGCACTGGCCCAGCGGCTGCCGCCTGAGGTTTCCAGAGGACC

130 150 170

ACAATGAACAAGTGGCTGTGCTGTGCACTCCTGGTGTTCTTGGACATCATTGAATGGACA

M—N—K—M_L—C_C_Δ_L_Ł_y_F L D I I E W T

190 210 230

ACCCAGGAAACCTTTCCTCCAAAATACTTGCATTATGACCCAGAAACCGGACGTCAGCTC T O E TFPPKYLHYDPETGRQL

250 270 290

TTGTGTGACAAATGTGCTCCTGGCACCTACCTAAAACAGCACTGCACAGTCAGGAGGAAG LCDKCAPGTYLKQHCTVRRK

310 330 350

ACACTGTGTGTCCCTTGCCCTGACTACTCTTATACAGACAGCTGGCACACGAGTGATGAA TLCVPCPDYSYTDSWHTSDE

370 390 410

TGCGTGTACTGCAGCCCCGTGTGCAAGGAACTGCAGACCGTGAAACAGGAGTGCAACCGC CVYCSPVCKEŁ»QTVKQECJ£R

430 450 470

ACCCACAACCGAGTGTGCGAATGTGAGGAAGGGCGCTACCTGGAGCTCGAATTCTGCTTG THNRVCECEEGRYLELEFCL

490 510 530

AAGCACCGGAGCTGTCCCCCAGGCTTGGGTGTGCTGCAGGCTGGGACCCCAGAGCGAAAC KHRSCPPGLGVLQAGTPERN

550 570 590

ACGGTTTGCAAAAGATGTCCGGATGGGTTCTTCTCAGGTGAGACGTCATCGAAAGCACCC TVCKRCPDGFPSGETSSKAP

610 630 650

TGTAGGAAACACACCAACTGCAGCTCACTTGGCCTCCTGCTAATTCAGAAAGGAAATGCA CRKHTHCSSLGLLLIQKGHA

670 690 710

ACACATGACAATGTATGTTCCGGAAACAGAGAAGCAACTCAAAATTGTGGAATAGATGTC THDNVCSGNREATQNCG I DV

730 750 770

ACCCTGTGCGAAGAGGCATTCTTCAGGTTTGCTGTGCCTACCAAGATTATACCGAATTGG TLCEEAFFRFAVPTKIIPNW

790 810 830

CTGAGTGTTCTGGTGGACAGTTTGCCTGGGACCAAAGTGAATGCAGAGAGTGTAGAGAGG LSVLVDSLPGTKVNAESVER

850 870 890

ATAAAACGGAGACACAGCTCGCAAGAGCAAACTTTCCAGCTACTTAAGCTGTGGAAGCAT IKRRHSSQEQTFQLLKLWKH

910 930 950 .

CAAAACAGAGACCAGGAAATGGTGAAGAAGATCATCCAAGACATTGACCTCTGTGAAAGC QNRDQEMVKKI IQDIDLCES

970 990 1010

AGTGTGCAACGGCATATCGGCCACGCGAACCTCACCACAGAGCAGCTCCGCATCTTGATG S V Q R H IGHAHŁ,TTEQLRI L, M

187 408

FIG.2C

1030 1050 1070

GAGAGCTTGCCTGGGAAGAAGATCAGCCCAGACGAGATTGAGAGAACGAGAAAGACCTGC ESLPGKKISPDEIERTRKTC

1090 1110 1130

AAACCCAGCGAGCAGCTCCTGAAGCTACTGAGCTTGTGGAGGATCAAAAATGGAGACCAA KPSEQLLKLLSLWRIKNGDQ

1150 1170 1190

GACACCTTGAAGGGCCTGATGTACGCACTCAAGCACTTGAAAGCATACCACTTTCCCAAA DTLKGLMYALKHLKAYHFPK

1210 1230 1250

ACCGTCACCCACAGTCTGAGGAAGACCATCAGGTTCTTGCACAGCTTCACCATGTACCGA TVTHSLRKTIRFL.HSPTMYR

1270 1290 1310

TTGTATCAGAAACTCTTTCTAGAAATGATAGGGAATCAGGTTCAATCAGTGAAGATAAGC LYQKLFLEMIGNQVQSVKIS

1330 1350 1370

TGCTTATAGTTAGGAATGGTCACTGGGCTGTTTCTTCAGGATGGGCCAACACTGATGGAG C L

1390 1410 1430

CAGATGGCTGCTTCTCCGGCTCTTGAAATGGCAGTTGATTCCTTTCTCATCAGTTGGTGG

1450 1470 1490

GAATGAAGATCCTCCAGCCCAACACACACACTGGGGAGTCTGAGTCAGGAGAGTGAGGCA

1510 1530 1550

GGCTATTTGATAATTGTGCAAAGCTGCCAGGTGTACACCTAGAAAGTCAAGCACCCTGAG

1570 1590 1610

AAAGAGGATATTTTTATAACCTCAAACATAGGCCCTTTCCTTCCTCTCCTTATGGATGAG

1630 1650 1670

TACTCAGAAGGCTTCTACTATCTTCTGTGTCATCCCTAGATGAAGGCCTCTTTTATTTAT

1690 1710 1730

TTTTTTATTCTTTTTTTCGGAGCTGGGGACCGAACCCAGGGCCTTGCGCTTGCGAGGCAA

1750 1770 1790

GTGCTCTACCACTGAGCTAAATCTCCAACCCCTGAAGGCCTCTTTCTTTCTGCCTCTGAT

1810 1830 1850

AGTCTATGACATTCTTTTTTCTACAATTCGTATCAGGTGCACGAGCCTTATCCCATTTGT

1870 1890 1910

AGGTTTCTAGGCAAGTTGACCGTTAGCTATTTTTCCCTCTGAAGATTTGATTCGAGTTGC

1930 1950 1970

AGACTTGGCTAGACAAGCAGGGGTAGGTTATGGTAGTTTATTTAACAGACTGCCACCAGG

1990 2010 2030

AGTCCAGTGTTTCTTGTTCCTCTGTAGTTGTACCTAAGCTGACTCCAAGTACATTTAGTA

2050 2070 2090 'rGAAAAATAATCAACAAATTTTATTCCTTCTATCAACATTGGCTAGCTTTGTTTCAGGGC

2110 2130 2150

ACTAAAAGAAACTACTATATGGAGAAAGAATTGATATTGCCCCCAACGTTCAACAACCCA

2170 2190 2210

ATAGTTTATCCAGCTGTCATGCCTGGTTCAGTGTCTACTGACTATGCGCCCTCTTATTAC

2230 22S0 2270

TGCATGCAGTAATTCAACTGGAAATAGTAATAATAATAATAGAAATAAAATCTAGACTCC

2290 2310 2330

ATTGGATCTCTCTGAATATGGGAATATCTAACTTAAGAAGCTTTGAGATTTCAGTTGTGT

2350 2370 2390

TAAAGGCTTTTATTAAAAAGCTGATGCTCTTCTGTAAAAGTTACTAATATATCTGTAAGA

2410 2430

CTATTACAGTATTGCTATTTATATCCATCCAG

187 408

FIG.2D fas frg Cnfrl.frg sfv-t2.frg tnfr2.frg cd40.frg osteo.frg ngfr.frg ox40.frg 41bb.frg

H LG I » 1----LLPLVL1S-»ARLSS

-MGLS Τ V P DLL LP L V LLE L L V G I Y P

-----------H A P V A V H A A L A V G L

----------------------Μ V S

........................M

...........- - - -MGAGAIGRAM

......................Η Y V

K S V H A Q V I D SGVIG L V P fi Μ 1 R L I A L[L]V ELHAAABAL L P R L C A LfH] G BKHLCCAL L DGPRL Ł L L L Η V Q Q P I AlF] L M G Β B C ΪΚ V V

C V V Y V P A 0 V A C Ł L I A V H V Γ Ł 0 I I E

IRKI OREK D 0 V P P Y A P L G Q C H T I Q - G A K V Τ V K G C E K

V T R D

V S E P

V I E T E A L N

V G

I V S V S H G S C S F P C P C V A V

E

C

Q

I

D

P

T

K

Q

39 28

34 28 25 fas.frg tnfrl.frg sfv-t2.frg tnfr2.frg cd40.frg osteo.frg ngfr.frg ox40.frg 41bb.frg

HHIEGI FJGKI U G KCGGHO C R L R E Y Y K Q Y L H D G ΚΪ11 Ϊ DI GŁIIBSG ΟΙ YP SG8 B -----H1DGUF P Q Η H S I Y E K D G L 0 Q T A Q

QC---E I G R Q L0C

K P

C

P

P G

E R K A R 0

c

I V B G D

E P 0 C V P

C 0 E

(ζ

K E

T K

C

B KI G

I Y L Y H 0

c

P G P G Q

BID

C R E

c

E

S

•3

S

A S

c

fi

P G

F Y A S R L

c

G P G S H

I V C

S

P C

•

E

D

3

I

F

S K

c

s

P G

Q B A K V F

c

IKISD

I V C

osie

-

E

B

5

I

Y

0 L

c

Q

P G

SRLIS 1

c

ULE K

i[q|c

B

P C

-

0

s

S

E

?

D K

c

A

P G

11LK5«

c

Τ V R R K

tLłIc

V

P c

-

P Β Y S

Y

K A

c

n~l]g

E G V A Q P

c

G - A H Q

T V c

£

P c

lidIs V I

R E

c

q|p g

B G Μ V S R

c

0 Β T R D

T V c

B

P c

-

E

Pic

F

Ϋ

0 8

c

qIp g

lfCKKl

K^J

P P

s

I

t

s

I D A S A 3 Q L

A Q _ D S ti H D V V S

Η E A V(Hl S---95

88 72

78 72 54 fas.frg tnfrl.frg sfv-t2.frg tnfr2.frg cd40.frg osteo.frg ngfr.frg ox40.frg 41bb.frg

B F 8 L a H R E

A T - Y

R H C Ł

- - A P

- - V P i r c a -ISO £1 CK DICK 1GG5

-SSK	C	R R
sfćls k	C	R K
AC V s	c	R G
e[c]l s	c	G S
Q H RB	c	E P
Efc] V X	c	S P
PCT E	c
QlęjT Q	c	N a
PUCH	I	C R

EMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKBQYRHYH3ERLFQCF

103

144

98

85 89 84 65

FIG.2E fas.frg tnfrl.frg sf»-t2.frg tnfrl.frg cd40.frg osteo.frg ngfr.frg ox40.frg 41bb.frg

152

191

129

143

125

124

128

116

105 fas.frg tnfrl.frg sfv-t2.frg tnfr2.frg cd40.frg osteo.frg ngfr.frg ox40.frg 41bb.frg

.....01 K E C0L I S H0K0K E......EGS R0B Ł - - - - G[w| L CLŁ

-----TKICLPOIEHKGIE------0 S G Τ Τ V Ł L P L V I F F GIC

Ig]

Y

G V

S - G B

T

R A G B0L

cl

E K

[Ć0P

B

T

Y s

0 S L

Ś

P Τ E R

[c

G I S F

H

IyI

G

F

G V

A R P G

T

E1S0W

c

X P

CU P

G¹

I

F S

NIT

S

S I D I

R

PIH Q

I

c

G

F

G V

« E M A

I

E I T D

I

V

c

Β P

c P

V

G

F

F S

H Q S

S

LFE K

c

yIp w i

s

c

G

L

G V

Ł Q A G

T

P E R H

T

V

c

K fi

c P

D

G

F

F S

G E T

s

SKĄP

c

RK»lt

N

c

G

s

GfLVFSCQDKQB

T

V

c

E E

c P

0

G

I

Y S

D E A B

Β V D P

c

Ł

p|cj i

V

c

V P

C P

P

G

B

F S

P G S

W

- - 0 A

c

K

P Η T

N

c

G

0

ELIKQG

c

K I

CJS L

G

I

f[b

B fi -

B G T G V

ę

R

PHI

fi

c

IIP I L L S L S V G F V V A I D KS L S t G Ł D Τ E R ESG K L O G R

P L I L F I nLl} Y P G B E V L

187

230

178

193

175

174

178

152

147 fas.frg tnfrl.frg sfv-t2.frg tnfr2.frg cd40.frg osteo.frg ngfr.frg ox40.frg 41bb.frg

V W V------KKKEVQKICRKERKE«5G

GLMTRYQRHKSKLYSIVCGKSTPEKEG

P V H...............-ETS Cftll I A

ASR.....-........--01» CIS I S

0KG.................IS C0H V I

Q K G----------------B ATBDH7C

ECTRHADAECEEIPGR--HITR Sili- - P 8 P A S H S V C E D R S L L A I L L Η E I Q R|_t]1 F R K IGIIEKDWCGPP WSFSPSITISYT

S R E S P T L	Η P	E..........
E Ł E G Τ Τ I	K P	LUKI SfŚlS P I P
.....GB	Η E	IIKIK e[fJt »1L
f lasKii	G A	V BLP QPVS T R S
CGLKS RH	R -	........- - A
S G B R E A I	Q B C G I D V 10C E E A
P E G S D S T	AP STOEB ΕΑΡ P EQ
P I I V P S T	I V Η P R T S Q0P S Τ P
P E G G P G -

GfFlT Ν0Τ Q Η T L|L]V F F R D Ł I T L V LFL

219

280

207 227 197

208 224 202 191

187 408

FIG.3A Zasadowe __ Kwasowe

FIG.3B Twonadep

Ziywanie β

100 200

FIG.3C ^a=“^ł

Fosman

FIG.3D ^T“^e“

Ziywaniea FIG.3E KonieoNH₂

300 400

.....I

FIG 3F KoniecCOOHj f

FIG. 3 G j

Beta

Α16

Moment

FIG.3H hydrofobowy

Beta

Alfa

Gtodmaniin. I

FIG.3 I Kyte-Doolittle “ 0

100

200

300

Hydrofobowe

Hydrofilowe

187 408

FIG.4A FIG.4B

-1-, Układ immunologiczny człowieka

FiG.5

I 2 11 16 17 22 28 33 38 45|Kb|1 12 18 30 |

Zwierzęta transgeniczne

Próby kontrolne

187 408

FIG.6A

FIG.6B

FIG.6C

187 408

FIG .6D

FIG.6E

FIG.6F

187 408

FIG.6G

FIG.6H

L

187 408

FIG.6I

FIG.6J

187 408

FIG.7A FIG.7B

FIG.7C FIG.7D

187 408

FIG.7E FIG.7F

FIG.7G FIG.7H

187 408

FIG.8A FIG.8B

FIG.8C FIG.8D

187 408

FIG.9A

30 50

CCTTATATAARACGTCATGATTGCCTGGGCTGCAGAGACGCACCTAGCACTGACCCAGCG

90 110

GCTGCCTCCTGAGGTTTCCCGAGGACCACAATGAACAAGTGGCTGTGCTGCGCACTCCTG

Μ N K W L C C A L L

130 150 170

GTGCTCCTGGACATCATTGAATGGACAACCCAGGAAACCCTTCCTCCAAAGTACTTGCAT V L . L D 1 I E W T TOB T L P P K Y L H

190 210 230

TATGACCCAGAAACTGGTCATCAGCTCCTGTGTGACAAATGTGCTCCTGGCACCTACCTA YDPETGHQLLCDKCAPGTYL

250 270 290

AAACAGCACTGCACAGTGAGGAGGAAGACATTGTGTGTCCCTTGCCCTGACCACTCTTAT KQHCTVRRKTLCVPCPDHSY

310 330 350

ACGGACAGCTGGCACACCAGTGATGAGTGTGTGTATTGCAGCCCAGTGTGCAAGGAACTG TDSWHTSDECVYCSPVCKEL

370 390 410

CAGTCCGTGAAGCAGGAGTGCAACCGCACCCACAACCGAGTGTGTGAGTGTGAGGAAGGG QSVKQECURTHNRVCECEEG

430 450 470

CGTTACCTGGAGATCGAATTCTGCTTGAAGCACCGGAGCTGTCCCCCGGGCTCCGGCGTG RYLEIEFCLKHRSCPPGSGV

490 510 530

GTGCAAGCTGGAACCCCAGAGCGAAACACAGTTTGCAAAAAATGTCCAGATGGGTTCTTC VQAGTPERNTVCKKCPDGFF

550 570 590

TCAGGTGAGACTTCATCGAAAGCACCCTGTATAAAACACACGAACTGCAGCACATTTGGC SGET-SSKAPCIKHTHCSTFG

610 630 650

CTCCTGCTAATTCAGAAAGGAAATGCAACACATGACAACGTGTGTTCCGGAAACAGAGAA LLLIQKGHATHDNVCSGNRE

670 690 710

GCCACGCAAAAGTGTGGAATAGATGTCACCCTGTGTGAAGAGGCCTTCTTCAGGTTTGCT ATQKCGIDVTLCEEAFFRFA

730 750 770

GTTCCTACCAAGATTATACCAAATTGGCTGAGTGTTTTGGTGGACAGTTTGCCTGGGACC VPTKIIPNWLSVLVDSLPGT

187 408

FIG.9B

790 810 830

AAAGTGAATGCCGAGAGTGTAGAGAGGATAAAACGGAGACACAGCTCACAAGAGCAAACC KVNAESVBRIKRRHSSQEQT

850 870 890

TTCCAGCTGCTGAAGCTGTGGAAACATCAAAACAGAGACCAGGAAATGGTGAAGAAGATC FQLLKLWKHQNRDQEMVKKI

910 930 950

ATCCAAGACATTGACCTCTGTGAAAGCAGCGTGCAGCGGCATCTCGGCCACTCGAACCTC IQDIDLCESSVQRHLGHSHL

970 990 1010

ACCACAGAGCAGCTTCTTGCCTTGATGGAGAGCCTGCCTGGGAAGAAGATCAGCCCAGAA TTEOLLAbMESLPGKKISPE

1030 1050 1070

GAGATTGAGAGAACGAGAAAGACCTGCAAATCGAGCGAGCAGCTCCTGAAGCTACTCAGT EIERTRKTCKSSEQLLKLLS

1090 1110 1130 'ITATGGAGOATCAAAAATGOTCACCAAGACACCTTGAAGGGCCTGATGTATGCCCTCAAG LWRIKNGDQDTLKGLMYALK

1150 1170 1190

CACTrGAAAACATCCCACTOCCAAAACTCTCACCCACAGTCTGAGGAAGACCATGAGG HLKTSHFPKTVTHSLRKTMR

1210 1230 1250

TTCCTGCACAGCTTCACAATGTACAGACTGTATCAGAAGCTCTTTTTAGAAATGATAGGG FLHSFTMYRLYQKLFLEMIG

1270 1290 1310

AATCAGGTTCAATCCGTGAAAATAAGCTGCTTATAACTAGGAATGGTCACTGGGCTGTTT NQVQSVKISCL

CTTCA

187 408

FIG.9C

30 50

GTATATATAACGTGATGAGCGTACGGGTGCGGAGACGCACCGGAGCGCTCGCCCAGCCGC

90 110

CGYCTCCAAGCCCCTGAGGTTTCCGGGGACCACAATGAACAAGTTGCTGTGCTGCGCGCT

K Ł..Ł. C..-C-.A, L

130 150 170

CGTGTTTCTGGACATCTCCATTAAGTGGACCACCCAGGAAACGTTTCCTCCAAAGTACCT

V F L D I 5 1 K W Τ Τ O Β T F P P K Y L

190 210 230

TCATTATGACGAAGAAACCTCTCATCAGCTGTTGTGTGACAAATGTCCTCCTGGTACCTA

HYDEETSHQLLCDKCPPGTY

250 270 290

CCTAAAACAACACTGTACAGCAAAGTGGAAGACCGTGTGCGCCCCTTGCCCTGACCACTA

LKQHCTAKWKTVCAPCPDHY

310 330 350

CTACACAGACAGCTGGCACACCAGTGACGAGTGTCTATACTGCAGCCCCGTGTGCAAGGA

YTDSWHTSDECLYCSPVCKE

370 390 410

GCTGCAGTACGTCAAGCAGGAGTGCAATCGCACCCACAACCGCGTGTGCGAATGCAAGGA lqyvkqechrthnrvcecke

430 450 470

AGGGCGCTACCTTGAGATAGAGTTCTGCTTGAAACATAGGAGCTGCCCTCCTGGATTTGG GRYLEIEFCLKHRSCPPGFG

490 510 530

AGTGGTGCAAGCTGGAACCCCAGAGCGAAATACAGTTTGCAAAAGATGTCCAGATGGGTT VVQAGTPERNTVCKRCPDGF

550 570 590

CTTCTCAAATGAGACGTCATCTAAAGCACCCTGTAGAAAACACACAAATTGCAGTGTCTT fsnetsskapcrkhthcsvf

610 630 650

TGGTCTCCTGCTAACTCAGAAAGGAAATGCAACACACGACAACATATGTTCCGGAAACAG

GLLLTQKGHATHDNICSGNS

670 690 710

TGAATCAACTCAAAAATGTGGAATAGATGTTACCCTGTGTGAGGAGGCATTCTTCAGGTT

ESTQKCG I DVTLCEEAFFRF

730 . 750 770

TGCTGTTCCTACAAAGTTTACGCCTAACTGGCTTAGTGTCTTGGTAGACAATTTGCCTGG avptkftpnwlsvlvdnlpg

187 408

FIG.9D

790 810 830

CACCAAAGTAAACGCAGAGAGTGTAGAGAGGATAAAACGGCAACACAGCTCACAAGAACA TKVNAESVERIKRQHSSQEQ

850 870 890

GACTTTCCAGCTGCTGAAGTTATGGAAACATCAAAACAAAGACCAAGATATAGTCAAGAA TFQbLKLWKHQNKDQDIVKK

910 930 950

GATCATCCAAGATATTGACCTCTGTGAAAACAGCGTGCAGCGGCACATTGGACATGCTAA IIQDIDLCENSVQRHIGHAfi

970 990 1010

CCTCACCTTCGAGCAGCTTCGTAGCTTGATGGAAAGCTTACCGGGAAAGAAAGTGGGAGC LTFEQLRSLMESLPGKKVGA

1030 1050 1070

AGAAGACATTGAAAAAACAATAAAGGCATGCAAACCCAGTGACCAGATCCTGAAGCTGCT EDIEKTIKACKPSDQILKLL

1090 1110 1130

CAGTTTGTGGCGAATAAAAAATGGCGACCAAGACACCTTGAAGGGCCTAATGCACGCACT

SLWRIKNGDQDTLKGLMHAL

1150 1170 1190

AAAGCACTCAAAGACGTACCACTTTCCCAAAACTGTCACTCAGAGTCTAAAGAAGACCAT

KHSKTYHFPKTVTQSLKKTI

1210 1230 1250

CAGGTTCCTTCACAGCTIGACAATGTACAAATTGTATCAGAAGTTATTTTTAGAAATGAT

RFLHSFTMYKLYQKLFLEMI

1270 1290 1310

AGGTAACCAGGTCCAATCAGTAAAAATAAGCTGCTTATAACTGGAAATGGCCATTGAGCT

GNQVQSVKISCL

1330 1350

GTTTCCTCACAAITOGCGAGATCCCATGGATGATAA

187 408 luosteo.frg ratosteo.frg huosteo.

FIG.9E

-^HHSSLCCALLyLLOIIEeTTaETLPeKILaYDPETGBdLLCDKCŁPGTrL frg HBEHlCCillT F Ł 0 II E ί 11 0 E T F 11 K Ϊ Ł I Ϊ D F E I G[r1o L L C D K C A P G Τ T L fra lH 8 ΚίΐΐL C C A ŁfyTlŁloTsIifEl8 t T 0 E T F P P E T t Β T DfElE Tfśla C Ł Ł C P K cielP G T Y Ł so auosteo.frg ratosteo.frg huosteo.frg

KQaCTVRRKTLC7PCEDaSYTDS8HTSDECVYCSPVCKeLQSVKQECSRT EQECfVRRKIŁCYPCP PfilS I TDSBgTSDECVrCSPVCKBL<2TVKQEC8RT κ o g c υΠΓκϊβ e Tfylcfilp c p p alrl υ t d s e a t s o e cHIf c s p υ c e e ł olm κ o e c u n τ

100

100 auosteo.frg |BHRVCECEEGRYLEIEFCI,KHRSCPP G(SJ G VVQAGTPERStVC K(SJ C P 0 G F F ratosteo.frg ł8RVCECEEGRil E0E FCŁKBRSCPPGŁG V0Q AGtPERHfYCKRCPDGFF huosteo. f rg H 8 R V C E ciElE GRTŁEIEFCŁEBBSCPPGFGTYOAGTPERHTYCERCPDGFF

150

150 auosteo.frg ratosteo.frg huosteo.frg

S G E T S S S A P C|_IJK Η T 8 C S SGETSSKAPCRKHT8CS sfiflE TSSKAPCRKHT8CS

TFGLŁLIQKGKATaOHVCSG8REATQKCGIDVT SŁGIŁLIQKGHAIBB8YCSGHREAI Q@ C G I D V T iir G U tftlo A G 8 A I 8 D Η I C S G «fŚI EfŚI T OKCGIDffT

200

FIG.9F auoiteo ratosteo huosteo.

frg frg frg

LCEKA?FRFAVPTKIIPHHLSVLVDSLPGTKVHAESVERIIRRaSSQEQT lcz nr r arłvn ki i p hwlsvlvdslpgtkvnaesverikrrhssqzqt ŁCnAFFHnnT ΚΓΓτΙΡ ylŁSFŁT DfiilŁ Ρ6ΤΠΗΠ5ΤΠΠ Rfol B S S Q 8 Q T

250

250 nuosteo.frg ratosteo.frg huosteo.frg tanosteo ratosteo huosteo.

frg frg frg

F QlŁ K ł¥k B Q MR D Q Ź Μ V K KlTQ 0 Ϊ DŁĆ t S S V S R HIUTbIsIh Ł T T E ΟΪΠ, λ' ....... I GSA

FQ L L E ll i BO BR O Q ! Η V Κ Κ I I i D I O l C I $ S V Q R Η ί G B A H L ϊ Τ Ϊ Q ŁJll f q ł ł k ł β e b q »Γκ1 p Q ofil ν κ rx i o o io ł c eImIs vqrhigbakł τΠε q ł rIs

ΊΠΓβ

LU Ł Η E

300

SLPGEEISPIEIERIRE T C X[S}S B Q L Ł I L L S I» 8 R I K H G D Q D f L Κ δΤΜΥ A L K SIPCUIS? OEIERTRKTCKPSEQŁLKŁLSLHRI U G O Q O I L U L HI A U słpge κ yPTaIe o i εΓκΙ τΓΐ! κΓΣΐ c κ p s p oRLł e łłsłbriehgdootłkgł Hfalh ł e

350

350 nuosteo.frg IB L E tlSlB ? P E I V Τ B Ś Ł R K TłHfa f Ł B S F t Η ϊ B Ł T Q K L Γ Ł E H I G 8 Q V Q S V E I S C ratosteo frg Β 1 Κ0Ϊ B F P E 1 V ϊ B S Ł R Κ Τ I R F L B SF t M TR Ł T Q K Ł F Ł E Μ I G 8 Q V Q S V Κ I S C huosteo. frg ląfslK ΤΪΒ F PE T_V TIOls ŁIkIk J Ι_Β_ΓΧ_Β S F T 8 YlElŁ T Q K Ł F ŁE Μ I S Β O V Q S V E I SC

400

400 muosteo.frg HSl ratosteo.frg |Ł huosteo.frg LLJ

401

187 408 ltnrr huaoste ltnrr huaoste ltnrr huaoste

-Ic łIr h r s|c|p p(g]f Giy|v o a g t p e k|h t v cir r[cJp dIg f fIs hLeJt s s k a picJr k h 139

FIG.II

187 508

FIG.12A _SS3

I SS2 i . [--1----1 |

DOMENA 1 &-^ETFPpW^HTOEETSEQLLCDKCSSGTYI^QHCTAXWKTVC AP-64 HUMAŃ 22-ETLPPKSLHYDPETGHQI.LCDKCAPGTYLKQHCTVRHXTLCVP-64M0USE

DOMENA 2

- C PDffŻYTDSWŚTŚDEC LYC SPVC KELQYVKQEC NHTHłnwĆ ' W5 65- C PDHSYTDSWHTSDEC VYC SPVCKELQSVKQEC NRTHNRVC-105

SS3

SSI i--1 ► N-KOŃCOWA

DOMENA 3 I06-eĆkBGRYLEIŚpĆłKHRSCPPGFGWQAGTPBRHTVC-142 IO6-ECEEGRYLEIEPCLKHRSCPPGSG7VQAGTPERNTVC-142

SS3

SSI I---1

DOMFNA 4 l43-KRCPDGFPSNETŚSiaiPCRKHTNCSVFGŁLLTQKGNATHDNlCSGN3ESTQK-194 ⁴ 143 -KKCPDGFFSGETSSXAPCIKHTNCSTFGLLLIQKGMATHDNVCSGNR£ATQK-194

FIG.12B

195”03IDVTL&EAFFRFAVPTKFTPNWLSVLVDNLPGTKVNAESVERIKRQHSS-246 \ 195-)g3IDVTlQEEAFFRFAVPTKIIPNWLSVLVDSIiPGTKVNAESVERIKRRHSS-246

247-QEQTFQLLKLWKHQNKDQDrVKKIIQDIDI&NSVQRHIGHANLTFEQLRSL-298

247-QEQTFQLLKLWKHQNRDQEMVKKIIQDIDljgESSVQRHLGHSNLTTEQLLAL-298 >C-KOŃCOWA

9 9 -MESLPGmGAEDIEKTm|ĆkPSDQILKLLSLWRIKNGDQDTLKGLMHALK-350 299-MESLPGKKISPEBIERTRK'iycSSEQLŁKLŁSLWRIKNGDQDTLKGŁMYALK-350

5 l-HSKTYHFPRPVTQSIiKKTIRFIiHSFTinKLYQKIiFLEMIGNQVQSVKI2jł-401 3 5 1-HLKTSHFPKTVTHSLRKTMRFLHSFTMYRLYQKLFLEMIGNQVQSVKI£^i-40 1 /

187 408

FIG. 1 33 A mu Osteoprotegerym fc Λύ fe ja

Thr 180

Ł 401

FIG.13B

FIG. 1 3C ¹ _Ndel BamHI FIG.14A

PAUG21

Lepki koniec Nde I Lepki koniec Kpn 1

TATGGATGAAGAAACTTCTCATCAGCTGCTGTGTGATAAATGTCCGCCGGGTAC

ACCTACTTCTTTGAAGAGTAGTCGACGACACACTATTTACAGGCGGCC

NdeI

BamHI

KpnI pAMG21-ludzkiOsteoprotegeryna32-401

187 408

FIG.14B

PAS# 1 2345678 kDa 69 kDa' kDa

kDa kDa fi&MI

FIG.1 5

kd 50 kd

187 408

Nieredukujący

FIG.16A

-100 κ

-55 Κ

Lizat komórki Pożywka

1 2 4 6 12 hr 0 5 l 2 4 6 12 hr

dimer monomer

FIG.16B

monomer

FIG.17

-q*~

O*

-5?'

Dimer

Monomer

187 408

FIG.18

Surowica Wątroba

FIG.19A FIG.19B

FIG.19C FIG.19D

187 408

FIG.19E FIG.19F

Α405

FIG.20

OPG (ng/ml)

187 408

FIG.21

Legenda

Etap wzrostu komórki szpiku kostnego CSF-1	Etap pośredni PGE2 + CSF-1	Etap końcowy komórki ST2 1,25 (OH)2 D3 Deksametason
4dni 1	2dni 1	8-10 dni

OPG

Grupy OPG

CTL - CTL --OPG - CTL 100 ng/ml

OPG - OPG --OPG - OPG 100 ng/ml

100 ng/ml 100 ng/ml

FIG.22A

Jony wapnia mmol/I) ^Jony ^waP^nia (^ramol/l)

Czas (dni)

FIG.22B

* Różne od PBS, p<0,05 # Różne od OPG + ILI, p<0,05

187 408

FIG.23A

PBS/PBS

FIG.23B

187 408

FIG.23C

PBS/OPG

FIG.23D

JlLI/OPG

187 408

FIG.24A FIG.24B

Objętość kości % objętości tkanki

FIG.25

Kontrolny

OPG odległość od płytki wzrostu * Różny od kontrolnego p<0,01

187 408

FIG.26A FIG.26.Β

FIG.27

Tydzień 2Tydzień

187 408

Powierzchnia kości % powierzchni tkanki

FIG.28

* Różne od OVX p<0,05

187 408

FIG.1 A

148 178 208 238 268 298

Prj.1 ALLVFLDIIEWTTQETFPPKYLHYDPETGRQLLCDKCAPGTYLKQHCTVRRKTLCVPCPD

I: I 11:11 I II 1:1 :l I SW: LUDZKI _ 1NR2 HALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCED 30 40 50 60 70 80

328

FRI-1 YSYTDSWHTS :||: I:

SW:LUDZKI _TNR2 STYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPL 90 100 110 120 130 140

FIG.1B

FRI-1 69 YLHYDPETGRQLLCDKCAPGTYLKQHC.I7RRKTLCV.PCPDY.SYTDSW

I I. ... I .1 II :l .1 : I I II : l.l .

Profil TOFR g YHYYDQNGRMCEECHMCQPGHFLVKHCKQPKRDTVCHKPCEPGVTYTDDW

FRI-1 116 H

I

Profil TNFR ₅g _{H z Score =} θ ₂9

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wyodrębniony kwas nukleinowy kodujący polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG, wybrany z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe przedstawione na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124) lub ich komplementarne nici;

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO:120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

c) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z nukleotydami od 148 do 337 włącznie, jak na rysunku fig. 1 A; oraz

d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskazanych w punktach (a), (b) i (c), przy czym ścisłe warunki hybrydyzacji to: 5xSSC, 50% formamid i temperatura 42°C lub warunki im równoważne.
2. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, będący cDNA, genomicznym DNA, syntetycznym DNA lub RNA.
3. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, obejmujący jeden lub więcej znanych kodonów korzystnych do ekspresji przez Escherichia coli.
4. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, z przyłączonym wykrywalnym znacznikiem, takim jak znacznik enzymatyczny, fluorescencyjny, przejawiający podwinowactwo lub izotopowy, korzystnie znacznikiem radioaktywnym, takim jak ³²P lub ³H.
5. Kwas nukleinowy według zastrz, 1, obejmujący obszar kodujący polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO:120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122) lub fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124).
6. Kwas nukleinowy według zastrz. 5, obejmujący sekwencję jak na rysunku fig. 9C-D (SEQ ID NO: 124) z nukleotydów 158-1297.
7. Polipeptyd kodowany kwasem nukleinowym, kodującym polipeptyd mający, co najmniej jednąz aktywności biologicznych OPG, wybranym z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe przedstawione na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124) lub ich komplementarne nici;

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO:120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

c) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z nukleotydami od 148 do 337 włącznie, jak na rysunku fig. 1 A; oraz

d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskazanych w punktach (a), (b) i (c),

187 408 przy czym ścisłe warunki hybrydyzacji to: 5xSSC, 50% formamid i temperatura 42°C lub warunki im równoważne.
8. Wektor ekspresji obejmujący kwas nukleinowy kodujący polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG, wybrany z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe przedstawione na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124) lub ich komplementarne nici;

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzująw ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO:120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

c) kwasy nukleinowe, które hybrydyzująw ścisłych warunkach z nukleotydami od 148 do 337 włącznie, jak na rysunku fig. 1A; oraz

d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskazanych w punktach (a), (b) i (c), przy czym ścisłe warunki hybrydyzacji to: 5xSSC, 50% formamid i temperatura 42°C lub warunki im równoważne.
9. Wektor ekspresji według zastrz. 8, w którym kwas nukleinowy obejmuje obszar kodujący polipeptyd jak na rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124).
10. Komórka-gospodarz transformowana lub transfekowana wektorem ekspresji obejmującym kwas nukleinowy, kodujący polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG, wybrany z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe przedstawione na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (sEq ID NO: 122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124) lub ich komplementarne nici;

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

c) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z nukleotydami od 148 do 337 włącznie, jak na rysunku fig. 1 A; oraz

d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskazanych w punktach (a), (b) i (c), przy czym ścisłe warunki hybrydyzacji to: 5xSSC, 50% formamid i temperatura 42°C lub warunki im równoważne.
11. Komórka-gospodarz według zastrz. 10, będąca komórką eukariotyczną.
12. Komórka-gospodarz według zastrz. 11, wybrana z grupy obejmującej komórki CHO, COS, 293, 3T3, CV-1 i BHK.
13. Komórka-gospodarz według zastrz. 10, będąca komórkąprokariotyczną.
14. Komórka-gospodarz według zastrz. 13, będąca Escherichia coli.
15. Transgeniczny ssak nie-człowiek, z kwasem nukleinowym, kodującym polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG, wybranym z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe przedstawione na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124) lub ich komplementarne nici;

b) kwasy nukleinowe, które hybrydy;zyąw ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

c) kwasy nukleinowe, które hybrydyzująw ścisłych warunkach z nukleotydami od 148 do 337 włącznie, jak na rysunku fig. 1 A; oraz

d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskazanych w punktach (a), (b) i (c), zintegrowanym z jego genomem i funkcjonalnie związanym z elementami kontroli ekspresji polipeptydu kodowanego przez ten kwas nukleinowy, przy czym w wyniku regulowanej ekspresji tego polipeptydu poziom OPG oraz gęstość kości ssaka transgenicznego są zwiększone w porównaniu z poziomem OPG i gęstością kości takiego samego ssaka nietransgenicznego.
16. Transgeniczny ssak według zastrz. 15, będący gryzoniem.
17. Ssak transgeniczny według zastrz. 16, będący myszą.

187 408
18. Sposób wytwarzania OPG na drodze biotechnologicznej, znamienny tym, że w odpowiednich pożywkach prowadzi się hodowlę komórek gospodarzy transformowanych lub transfekowanych kwasem nukleinowym, kodującym polipeptyd mający, co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG, wybranym z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe przedstawione na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ED NO: 120), fig. 9A-9B (SEq ID NO:122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO:124) lub ich komplementarne nici;

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO:120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

c) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z nukleotydami od 148 do 337 włącznie, jak na rysunku fig. 1 A; oraz

d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskazanych w punktach (a), (b) i (c), a następnie wyodrębnia się polipeptydowe produkty ekspresji tych kwasów nukleinowych i ewentualnie oczyszcza się polipeptyd obejmujący OPG
19. Oczyszczony i wyodrębniony polipeptyd obejmujący OPG, przejawiający aktywność w zakresie podwyższania gęstości kości lub hamowania resorpcji kości, obejmujący sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej jedną lub więcej spośród następujących sekwencji:

a) sekwencja aminokwasów pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No:121), fig. 9A-9B (SEQ ED No: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No: 125),

b) sekwencja aminokwasów posiadająca co najmniej 85% zbieżności (identyczności) z sekwencją aminokwasów określoną w pkt. a) i pokazaną na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID No: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No: 125),

c) sekwencja aminokwasów stanowiąca fragment sekwencji zdefiniowanych w pkt. a) lub b).
20. Polipeptyd według zastrz. 19, będący OPG pochodzącą od ssaka.
21. Polipeptyd według zastrz. 20, będący ludzką OPG
22. Polipeptyd według zastrz. 19, będący zasadniczo wolnym od innych ludzkich protein.
23. Polipeptyd według zastrz. 21, mający sekwencję aminokwasową jak pokazano na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID NO:121), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) lub jego pochodna.
24. Polipeptyd według zastrz. 23, mający sekwencję aminokwasową jak pokazano na rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) z reszt 22-401 włącznie.
25. Polipeptyd według zastrz. 23, mający sekwencję aminokwasową jak pokazano na rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID NO:125) z reszt 32-401 włącznie.
26. Polipeptyd według zastrz. 19, który jest znamienny tym, że jest produktem ekspresji egzogenicznej sekwencji DNA.
27. Polipeptyd według zastrz. 26, w którym DNA jest cDNA, genomicznym DNA lub syntetycznym DNA.
28. Polipeptyd według zastrz. 19, do którego przyłączony jest polimer rozpuszczalny w wodzie.
29. Polipeptyd według zastrz. 28, w którym rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy, korzystnie o cięrzarze cząsteczkowym w zakresie od około 1 kDa do około 100 kDa.
30. Polipeptyd posiadający:

- sekwencję aminokwasową, o co najmniej około 164 aminokwasach, obejmującą cztery bogate w cysteinę domeny charakterystyczne dla bogatych w cysteinę zewnatrzkomórkowych domen receptora czynnika martwicy nowotworów (TNFR) oraz

- aktywność w zakresie podwyższania gęstości kości.
31. Polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasów jak pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125), mający koniec amino przy reszcie 22 i w którym od 1-216 aminokwasów jest usuniętych z końca karboksylowego.

187 408
32. Polipeptyd według zastrz. 31, posiadający sekwencję aminokwasów z reszt 22-185, 22-189, 22-194 lub 22-201 włącznie.
33. Polipeptyd według zastrz. 32, posiadający ponadto obszar Fc ludzkiej IgG1 rozciągający się od końca karboksylowego.
34. Polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasów jak pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID NO:121), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125), mający koniec amino przy reszcie 22, w którym od 1-10 aminokwasów jest usuniętych z końca amino i - ewentualnie - od 1-216 aminokwasów jest usuniętych z końca karboksylowego.
35. Polipeptyd według zastrz. 34, posiadający sekwencję aminokwasów z reszt 27-185, 27-189, 27-194, 27-401 lub 32-401 włącznie.
36. Polipeptyd według zastrz. 35, posiadający obszar Fc ludzkiej IgG1 rozciągający się od końca karboksylowego.
37. Polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasów huOPG, jak pokazana na rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID No: 125), wybrany z grupy obejmującej:

huOPG[22-201]-Fc huOPG[22-401]-Fc huOPG[22-180]-Fc huOPG met[22-401]-Fc huOPG Fc-met[22-401] huOPG met[22-185] huOPG met[22-189] huOPG met[22-194] huOPG met[27-185] huOPG met[27-189] huOPG met[27-194] huOPG met[32-401] huOPG met-lys [22-401] huOPG met[22-401] huOPG met[22-401]-Fc (P25A) huOPG met[22-401] (P25A) huOPG met[22-401] (P26A) huOPG met[22-401] (P26D) huOPG met[22-194] (P25A) huOPG met[22-194] (P26A) huOPG met met-(lys)3 [22-401] huOPG met met-arg-gly-ser-(his)6 [22-401].
38. Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd o strukturze określonej w zastrz. 37.
39. Multimer osteoprotegeryny, przejawiający aktywność w zakresie zwiększania gęstości kości lub hamowania resorpcji kości, zbudowany z monomerów polipeptydu obejmującego OPG, o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej jedną lub więcej spośród następujących sekwencji:

a) sekwencja aminokwasów pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID No: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No: 125),

b) sekwencja aminokwasów posiadająca co najmniej 85% zbieżności (identyczności) z sekwencją aminokwasów określoną w pkt. a) i pokazaną na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No:121), fig. 9A-9B (SEQ ID No:123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No:125),

c) sekwencja aminokwasów stanowiąca fragment sekwencji zdefiniowanych w pkt. a) lub b).
40. Multimer według zastrz. 39, będący dimerem.
41. Multimer według zastrz. 39, powstały przez międzyłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe.

187 408
42. Multimer według zastrz. 39, powstały przez asocjację obszarów Fc pochodzących z ludzkiej IgGl.
43. Multimer według zastrz. 39, zasadniczo wolny od monomerów osteoprotegeryny i nieaktywnych multimerów.
44. Multimer według zastrz. 39, w którym monomery obejmują sekwencję aminokwasową jak pokazana na rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) z reszt 22-401 lub jej pochodną.
45. Multimer według zastrz. 39, w którym monomery obejmują sekwencję aminokwasowąjak pokazana na rysunku fig. 9C-9D (SEQ ID NO:125) z reszt 22-194.
46. Przeciwciało lub część przeciwciała, które specyficznie wiąże się z OPG, posiadającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej jedną lub więcej spośród następujących sekwencji:

a) sekwencja aminokwasów pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID No: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No: 125),

b) sekwencja aminokwasów posiadająca co najmniej 85% zbieżności (identyczności) z sekwencją aminokwasów określoną w pkt. a) i pokazaną. na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No:121), fig. 9A-9B (SEQ ID No:123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No:125),

c) sekwencja aminokwasów stanowiąca fragment sekwencji zdefiniowanych w pkt. a) lub b).
47. Przeciwciało według zastrz. 46, będące przeciwciałem monoklonalnym.
48. Sposób wykrywania obecności OPG w próbkach biologicznych, obejmujący:

- inkubowanie próbki z przeciwciałem lub częścią przeciwciała, które specyficznie wiąże się z OPQ posiadającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej jedną lub więcej spośród następujących sekwencji:

a) sekwencja aminokwasów pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID No: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No: 125),

b) sekwencja aminokwasów posiadająca co najmniej 85% zbieżności (identyczności) z sekwencją aminokwasów określoną w pkt. a) i pokazaną. na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No:121), fig. 9A-9B (SEQ ID No:123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No:125),

c) sekwencja aminokwasów stanowiąca fragment sekwencji zdefiniowanych w pkt. a) lub b.) w warunkach pozwalających na związanie tego przeciwciała z OPG oraz

- wykrywanie związanego przeciwciała znanymi metodami.
49. Sposób ustalania zdolności badanej substancji do wiązania się z OPQ obejmujący:

- inkubowanie OPG z badaną substancją w warunkach pozwalających na ich związanie oraz

- pomiar związanej substancji.
50. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, adjuwant, środek ułatwiający rozpuszczanie, stabilizator i/lub przeciw-utleniacz, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera osteoprotegerynę OPG.
51. Kompozycja według zastrz. 50, w której OPG jest ludzką OPG.
52. Kompozycja według zastrz. 51, w której OPG ma sekwencję aminokwasową jak pokazana na rysunku fig. 9B.
53. Zastosowanie polipeptydu obejmującego OPG, o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej jedną lub więcej spośród następujących sekwencji:

a) sekwencja aminokwasów pokazana na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No: 121), fig. 9A-9B (SEQ ID No: 123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No: 125),

b) sekwencja aminokwasów posiadająca co najmniej 85% zbieżności (identyczności) z sekwencją aminokwasów określoną w pkt. a) i pokazaną na rysunku fig. 2B-2C (SEQ ID No:121), fig. 9A-9B (SEQ ID No:123) lub fig. 9C-9D (SEQ ID No:125),

c) sekwencja aminokwasów stanowiąca fragment sekwencji zdefiniowanych w pkt. a) lub b) jako środka leczniczego do leczenia chorób kości, w szczególności chorób związanych z nadmiernym zanikiem kości, zwłaszcza chorób wybranych z grupy obejmującej osteoporozę, chorobę kości typu Pageta, hiperkalcemię, nadczynność przytarczyc, osteopenię indukowaną

187 408 przez podawanie steroidów, zanik kości na skutek przewlekłego postępującego gośćca stawowego, zanik kości w następstwie zapalenia szpiku, przerzuty osteolityczne oraz zanik kości przyzębia.
54. Zastosowanie według zastrz. 53, w którym polipeptyd jest ludzką OPG.
55. Zastosowanie według zastrz. 53, w którym środek leczniczy jest przewidziany do stosowania łącznie z terapeutycznie skuteczną ilością substancji wybranych z grupy obejmującej: proteiny kostno-morfogeniczne BMP-1 do BMP-12, człony rodziny TGF-p, inhibitory IL-1, inhibitory TNFa, hormon przytarczyc i jego analogi, proteina związana z hormonem przytarczyc oraz jej analogi, prostaglandyny serii E, bisfosfoniany oraz minerały wzmacniające kości.
56. Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający co najmniej jedną z aktywności biologicznych OPG, wybrany z grupy obejmującej:

a) kwasy nukleinowe przedstawione na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO:122) i fig. 9C-9D (SEQ ID NO:124) lub ich komplementarne nici;

b) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z obszarem kodującym polipeptyd jak na rysunkach fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), fig. 9A-9B (SEQ ID NO: 122), i fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124),

c) kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ścisłych warunkach z nukleotydami od 148 do 337 włącznie, jak na rysunku fig. 1A; oraz

d) kwas nukleinowy, który jest degenerowany do kwasów nukleinowych wskazanych w punktach (a), (b) i (c), jako środka do regulowania poziomu OPG u zwierząt, zwłaszcza u ssaków, na drodze modyfikacji genetycznej.
57. Zastosowanie według zastrz. 56, w którym użyty kwas nukleinowy sprzyja wzrostowi poziomu OPG w tkankach.