PL187846B1 - Agoniści interleukiny-4 wybiórczy dla limfocytów T - Google Patents

Description

1. Dziedzina wynalazku

Wynalazek ogólnie dotyczy dziedziny farmakologii i immunologii. Konkretniej, wynalazek dotyczy nowych kompozycji substancji swoiście pobudzającej limfocyty T i wykazującej zmniejszoną aktywację komórek śródbłonka albo fibroblastów. Nowe kompozycje obejmują odmiany rodziny cytokin, w szczególności ludzkiej interleukiny-4 (IL-4).

2. Opis pokrewnego stanu techniki

Interleukina 4 (IL-4) jest plejotropową cytokiną, wykazującą aktywności wobec komórek układu odpornościowego, śródbłonka i komórek fibroblastoidalnych. Opisywane efekty podawania Π.-4 in vitro obejmują proliferację limfocytów B, przełączenie klas immunoglobulin w limfocytach B. Interleukina 4 aktywuje proliferację limfocytów T po uprzedniej aktywacji mitogenami i ujemnie reguluje wytwarzanie IFN-γ. W monocytach, IL-4 indukuje ekspresje cząsteczek MHC klasy II, uwolnienie tPA indukowanego lipopolisacharydem i ekspresję CD23. W komórkach śródbłonka (EC) IL-4 indukuje ekspresję VCAM-1 i uwolnienie IL-6 oraz zmniejsza ekspresję ICAM-1 (Maher i in., Human Interleukin-4: An Immunomodulator with Potential Therapeutic Applications, Progres in Growth Factor Research, 3:43-56 (1991)).

Z powodu swej zdolności do pobudzania proliferacji limfocytów T aktywowanych przez ekspozycję na IL-2, proponuje się leczenie przy użyciu IL-4. Przykładowo, IL-4 wykazuje działanie przeciwnówótwórówe w modelu zwierzęcym raka nerki, oraz wywołuje zmniejszenie guza u myszy (Bosco i in., Low doses of IL-4 injected perilymphatically in tumour-bearing mice inhibits the growth of poorly and apparently nonimmunogenic tumors and induce a tumom specific immune memory, J. Immunol. 145:3136-43 (1990)). Jednakże, jej toksyczność ogranicza stosowanie u ludzi (Margolin i in., Phase II studies of humanrecombinant interleukin-4 in advanced renal cancer and malignant melanoma, J. Immunother. 15:147-153 (1994)).

Z powodu swej aktywności immunomodulacyjnej, dla IL-4 sugeruje się wiele klinicznych zastosowań. Wśród tych zastosowań znajdują się zaburzenia spowodowane zaburzeniem równowagi układu odpornościowego, w szczególności spowodowane zaburzeniem równowagi reakcji na antygen limfocytów T pomocniczych (Th). Choroby te obejmują pewne choroby autoagresyjne, choroby reumatyczne, choroby dermatologiczne i choroby zakaźne. Znaczna ilość doświadczeń pozwoliła ustalić, że limfocyty Th dzielą się na dwie klasy oznaczone Th1 i Th2 (Mosmann i in., Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins, J. Immunol. 136:2348-2357 (1986); Mosmann, Cytokines, dUferentiation and functions of subsets of CD4 and CD8 cells, Behring Inst. Mitt. 1 -6 (1995)). Te klasy limfocytów T określane są przez limfokiny, które wytwarzają: limfocyty Th1 wytwarzają IL-2, IFN-γ i TNF-α., zaś limfocyty Th2 wytwarzają IL-4 i IL-5. Limfocyty Th1 i Th2 powstają z naiwnych limfocytów T CD4+. Różnicowanie na podtypy Th1 i Th2 zalżzy od cytokin obecnych podczas pobudzenia antygenem: IFN-γ i IL-12 kierują różnicowanie naiwnych limfocytów w fenotyp Th1, zaś IL-4 kieruje różnicowanie w kierunku fenotypu Th2. O ile podtypy Th1 i Th2 mogą stanowić skrajności w kontinuum fenotypów limfocytów Th (przykładowo, opisywano limfocyty Th0, które wyrażały niskie poziomy zarówno IFN-γ jak i IL-4), klasyfikacja ta stanowi główny paradygmat w dziedzinie immunologii, opisujący charakter reakcji odpornościowej. Obserwowano, ze niektóre narządowo-swoiste choroby autoagresyjne związane są przede wszystkim z reakcją limfocytów Th1 na autoantygen (Liblau i in., Th1 and Th2 CD4+ T cells in the patogenesis of organspecific autoimmune diseases, Immunol. Today 16:34-38 (1995)). Jedną z takich chorób autoagresyjnych jest cukrzyca insulinozalezna (IDDM), choroba charakteryzująca się niszczeniem trzustkowych komórek β za pośrednictwem limfocytów T. Niektóre dowody świadczą, ze za zniszczenie komórek β

187 846 trzustki głównie odpowiadają limfocyty Th1 (opisane szerzej przez Tisch i in., Review· Insulin-dependent diabetes mellitus, Cell 85:291-297 (1996)). Podawanie IL-4 myszom NOD, które służą jako model IDDM ujemnie reguluje populację limfocytów Th1 i istotnie opóźnia wystąpienie cukrzycy (Rapoport i in., IL-4 reverses T cell proliferation unresponsiveness and prevents the onset of diabetes in NOD mice, J. Exp. Med. 178:87-99 (1993)). Inną taką chorobą autoagresyjną jest stwardnienie rozsiane (MS), choroba, która charakteryzuje się atakiem autoagresyjnym na otoczkę mielinową otaczającą komórki nerwowe. Badania na ludziach z MS wykazały, ze zaostrzenie MS związane jest z obecnością swoistych wobec autoantygenu limfocytów Th1 i Th0, zaś remisja związana jest z obecnością swoistych wobec autoantygenu limfocytów Th2 i Th0 (Correale i in., Patterns of cytokine secretion by autoreactive proteolipid protein-specific T cell clones during the course of multiple sclerosis, J. Immunol. 154:29592968)). Myszy z doświadczalnym autoagresyjnym zapaleniem opon mózgowych i mózgu (EAE), stanowiące zwierzęcy model SM, wykazują również polaryzację w kierunki Th1 (Cua i in., J. Immunol. 155:4052-4059 (1995)). Pośrednie dowody z badań nad EAE sugerują, że IL-4 odgrywa kluczową rolę w łagodzeniu choroby wynikającej z leczenia peptydem toleryzującym (Brocke i in., Treatment of experimental encephalomyelitis with peptide analogue of myelin basie protein, Nature 379:343-346 (1996)).

Inne choroby autoagresyjne takie jak reumatoidalne zapalenie stawów (RA) stanowią również cel terapii opartej na IL-4. Modele zwierzęce RA wykazały rozprzęgnięcie równowagi profili komórkowych w kierunki limfocytów Th1, oraz u myszy, które nadmiernie wyrażają TNF-α, przeciwciała przeciwko TNFa łagodzą chorobę, wskazując, że terapia IL-4, która powoduje ujemną regulację populacji limfocytów Th1 może również wywierać efekt anty-TNF-a (patrz, Feldmann i in., Review: Rheumatoid arthritis, Cell 85:307-310 (1996)).

Łuszczyca jest przewlekłą chorobą dermatologiczną charakteryzującą się naciekaniem zajętej skóry monocytami i limfocytami T. Niektóre doniesienia wskazują, ze limfocyty T naciekające zmiany skórne i PBL mają głównie fenotyp Th1 (Uyemura i in., The cytokine network in lesional and lesionfree psoriatic skin is characterized by T-helper type 1 cell-mediated response, J. Invest. Dermatol. 101:701-705 (1993); Schlaak i in., Tcells involved in psoriasis vulgaris belong to the Th1 subset, J. Invest. Dermatol. 102:145-149 (1994)). Ponadto, mono-metyloiumaran, lek który opisywano jako przynoszący poprawę kliniczną pacjentom z łuszczycą, wybiórczo pobudza wydzielenie cytokin Th2 z PBMC (de Jong i in., Selective stimulation of T helper 2 cytokine responses by the anti-psoriatic agent monomethylofumarate, Eur. J. Immunol., 26:2067-2074 (1996)). Stąd, IL-4 powinna odwracać polaryzację Th i przynosić korzyści w łuszczycy.

Pewne choroby zakaźne są związane ze spolaryzowaną reakcją limfocytów Th na czynnik zakaźny. Reakcje Th2 związane są czasami z opornością na czynnik zakaźny. Ludzie zakazem B. burgdorferi wykazują głównie profil cytokin typu Th1 (Oksi i in., Decreased interleukin-4 and increased gamma interferon production by peripherial blood mononuclear cells of patients with Lyme borreliosis, Infect. Immun. 64:3620-3623 (1996)). W mysim modelu zapalenia stawów wywołanego B. burgdorferi, odporność na chorobę związana jest z wytwarzaniem IL-4, podczas gdy podatność związana jest z wytwarzaniem IFN-γ (Matyniak i in., T helper phenotype and genetic susceptibility in experimental Lyme disease, J. Exp. Med. 181(3):1251-1254 (1995); Keane-Myers i in., Role of IL-4 and IFN-γ in modulation of immunity to Borrelia burgdorferi-infected mice, J. Immunol. 155:2020-2028 (1995)). Leczenie myszy zakazonych B. burgdorferi przy użyciu IL-4 wzmaga oporność na zakażenie (Keane-Myers i in., Recombinant IL-4 augments resistance to Borrelia burgdorferi infection in both normal susceptible and antibody-defficient susceptible mice, J. Immunol. 156-2488-2494 (1996)).

Opisywano, ze IL-4 wywiera bezpośredni wpływ na hamowanie wzrostu chłoniaków i białaczek (Akashi, The role of interleukin-4 in the negative regulation of leukemia celi growth, Leuk. Lymphoma 9:205-209 (1993)). Przykładowo opisywano, ze IL-4 wywołuje apoptozę w komórkach pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną (Manabe i in., Interleukin-4 induces programmed cell death (apoptosis) in cases of high-risk acute lymphoblastic Leukemia, Blood 83:1731-7 (1994)) i hamuje wzrost komórek u pacjentów z nie-Hodgkinowskim

187 846 chłoniakiem z limfocytów B (Defrance i in., Antiproliferative effects of interleukin-4 on freshly isolated non-Hodgkin malignant B-lymphoma cells, Blood 79:990-6 (1992)).

Opisywano również, ze IL-4 wykazuje aktywność, która sugeruje, że może przynosić poprawę kliniczną w zapaleniu kostno-stawowym. Zapalenie kostno-stawowe jest chorobą, w której podstawową patologią jest zniszczenie chrząstki (Sack i in., Osteoarthritis: A continuing challenge, West. J. Med., 163:579-86 (1995); Oddis, New perspectives on osteoarthritis, Am. J. Med., 100:10S-15S (1996)). IL-4 hamuje wytwarzanie TNF-α i IL-1 beta przez monocyty i synowiocyty pacjentów z zapaleniem kostno-stawowym (Bendrups i in., Reduction of tumour necrosis factor alpha and interleukin-1 beta levels in human synovial tissue by interleukin-4 and glucocorticoid, Rheumatol. Int. 12:217-20 (1993), Seitz i in., Production of interleukin-1 receptor antagonist, inflammatory chemotactic proteins and prostaglandin E by rheumatoid and osteoarthritic synoviocytes-regulation by IFN-gamma and IL-4, J. Immunol. 152:2060-5 (1994)). Oprócz tego, opisywano, że IL-4 bezpośrednio blokuje niszczenie chrząstki w eksplantach chrząstki in vitro (Yeh i in., Interleukin-4, an inhibitor of cartilage breakdown in bovine articular cartilage explants, J. Rheumatol. 22:1740-6 (1995)). Aktywności te wskazują, ze IL-4 powinna przynosić korzyść kliniczną w zapaleniu kostno-stawowym.

Jednakże, kliniczne zastosowanie IL-4 jest ograniczone ze względu na jej ostrą toksyczność, która manifestuje się zespołem przeciekania naczyń (Margolin i in., Phase II studies of human recombinant interleukin-4 in advanced renal cancer and malignant melanoma, J. Immunother., 15:147-153 (1994)). Nie ma w literaturze opisu, jaki jest mechanizm toksyczności IL-4, ani nie ma opisu analogów albo mutantów IL-4, które zachowują aktywność immunoregulacyjnąprzy zmniejszonej ostrej toksyczności.

Znane są zmutowane białka IL-4 (muteiny). Muteina IL-4, 1L-4/Y124D jest antagonistą limfocytów T (Kruse i in., Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by single amino acid replacement, EMBO J. 11:3237-44 (1992)).

Zastosowania terapeutyczne IL-4 u pacjentów albo zgłoszenia patentowe obejmują: zastosowanie IL-4 do nasilania działania przeciwnowotworowego środków chemioterapeutycznych, w szczególności w horobie Hodgkina i chłoniakach nie-Hodkinowskich (patrz, WO 96/07422); zastosowanie fragmentów antygenowych IL-4 do wytworzenia przeciwciał do leczenia chorób związanych z IL-4 przez hamowanie albo imitowanie aktywności wiążącej IL-4 (patrz, WO 95/24481) oraz do wykrywania, pomiaru i oczyszczania immunologicznego IL-4 (WO 93/17106); do indukowania różnicowania prekursorów limfocytów B do wydzielania immunoglobulin, przez dojrzałe limfocyty B przydatne do przywracania funkcji odpornościowych u pacjentów z zaburzeniami odporności (patrz, WO 94/04658); w połączeniu z IL-10 do leczenia białaczek, chłoniaków, choroby zapalnej jelita grubego i nadwrażliwości typu późnego (np. wrzodziejącego zapalenia okrężnicy i choroby Crohn'a) (patrz, WO 94/04180); leczenia zakażeń HIV przez podanie IL-4 w celu zahamowania replikacji wirusa w monocytach i makrofagach, oraz do zwiększania ich cytotoksyczności wobec niektórych komórek nowotworowych (patrz, WO 94/04179); do pobudzania do proliferacji fibroblastów skórnych do leczenia ran u pacjentów z cukrzycą i zaburzeniami odporności (patrz, WO 92/11861); do zwiększania pierwotnej odpowiedzi odpornościowej po podaniu szczepionek bakteryjnych, toksoidowych albo wirusowych, zwłaszcza szczepionki toksoidu tężca (patrz, WO 92/11030); do hamowania proliferacji nowotworowych limfocytów B wywołanej IL-2, zwłaszcza przewlekłej białaczki limfatycznej złośliwego chłoniaka nie-Hodkinowskiego (patrz, WO 92/10201); zastosowanie IL-4 do leczenia czerniaków, raków nerki i podstawnokomórkowych (patrz, WO 92/04044).

Literatura patentowa ujawnia białka IL-4 i niektóre muteiny, ale żadna nie dotyczy leczenia IL-4 o zmniejszonych efektach ubocznych. Patent USA nr 5,017,691 Lee i in., („patent 691”) dotyczy białek ssaków i mutein ludzkiej IL-4, które wykazują zarówno aktywność czynnika wzrostowego limfocytów B jak i aktywność czynnika wzrostowego limfocytów T. Ujawnia on kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy wykazujące aktywność IL-4, jak również same polipeptydy i sposoby ich wytwarzania. Ujawnione są muteiny IL-4 typu dzikiego pozycji aminokwasowych, które zachowują zdolność do pobudzania proliferacji zarówno limfocytów B i T in vitro. Jednakże, Lee i in. nie sugerują mutein IL-4 swoistych wobec limfocytów T, przeciwnych

187 846 aktywacji EC albo przeciekaniu naczyń charakterystycznemu dla podawania IL-4. Tak więc, IL-4 nie nadaje się do stosowania leczniczego z powodu swej toksyczności ograniczającej dawkowanie.

Patent USA nr 5,013,824 opisuje pochodną peptydową hIL-4 obejmującą od 6 do 40 aminokwasów natywnej hIL-4. Ujawnia również immunogeny obejmujące koniugaty peptydów i nośników. Nośniki obejmują erytrocyty, bakteriofagi, białka, cząstki syntetyczne albo dowolne substancje zdolne do wywołania wytwarzania przeciwciał przeciwko sprzęgniętemu peptydowi. Nie są ujawnione muteiny IL-4.

WO 96/04306-A2 ujawnia pojedyncze muteiny, które są antagonistami albo częściowymi agonistami hIL-2 i hIL-13. Nie ma danych ujawniających muteiny IL-4. WO 95/27052 ujawnia mutanty składania IL-2 i IL-4 zawierające egzony 1, 2 i 4.

Istnieje potrzeba ulepszonych cząsteczek IL-4 o zmniejszonej toksyczności i lepiej tolerowanych.

Streszczenie wynalazku

Wynalazek dotyczy mutein ludzkiej IL-4 numerowanych według IL-4 typu dzikiego wykazujących aktywność pobudzającą limfocyty T, ale wykazujących zmniejszoną zdolność aktywowania komórek śródbłonka. W szczególności, muteiny ludzkiej IL-4 w których reszty powierzchniowe helisy D IL-4 typu dzikiego są zmutowane w taki sposób, ze dają muteiny pobudzające proliferację limfocytów T, i powodujące zmniejszone wydzielanie IL-6 przez HUVEC, względem IL-4 typu dzikiego. Wynalazek daje muteinę IL-4 o zmniejszonej toksyczności, która umożliwia większe zastosowanie terapeutyczne tej interleukiny.

Dalej, wynalazek dotyczy mutein IL-4 o pojedynczej, podwójnej i potrójnej mutacji oznaczonych R121A, R121D, R121E, R121F, R121H, R121I, R121K, R121N, R121P, R121W, Y124A, Y124Q, Y124R, Y124S, Y124T, Y124A/S125A, T13D/R121E i R121T/E122F/Y124Q, w których to oznaczeniach numeracja pokrywa się z IL-4 typu dzikiego (His=1). Wynalazek obejmuje również polinukleotydy kodujące muteiny według wynalazku, wektory zawierające te polinukleotydy, transformowane komórki gospodarza, kompozycje farmaceutyczne obejmujące muteiny i sposoby leczenia.

Wynalazek dotyczy również wektora obejmującego polinukleotyd kodujący muteinę według wynalazku, wektora kierującego ekspresją muteiny ludzkiej IL-4 o aktywności pobudzającej limfocyty T, ale wykazującej zmniejszoną aktywność pobudzającą komórki śródbłonka, wektora zdolnego do transfekowania docelowego organizmu i następującej potem ekspresji in vivo muteiny ludzkiej IL-4 kodowanej przez polinukleotyd.

Wynalazek dotyczy również sposobu selekcji muteiny ludzkiej IL-4 numerowanej według IL-4 typu dzikiego wykazującej działanie pobudzające limfocyty T, ale o zmniejszonej aktywności pobudzającej komórki śródbłonka, obejmującej mutowanie reszt powierzchniowych helisy D IL-4 typu dzikiego, przy czym powstała muteina powoduje proliferację limfocytów T i powoduje zmniejszenie wydzielania IL-6 przez HUVEC, w stosunku do typu dzikiego.

Wynalazek dotyczy również sposobu leczenia pacjenta dotkniętego chorobą uleczalną IL-4 przez podawanie skutecznej terapeutycznie ilości muteiny ludzkiej IL-4 numerowanej według IL-4 typu dzikiego wykazującej działanie pobudzające limfocyty T, ale o zmniejszonej aktywności pobudzającej komórki śródbłonka. Sposób ten można zastosować w stanach uleczalnych IL-4 takich jak choroba autoagresyjna, rak, choroba zakaźna, choroba chrząstki i łuszczyca.

Krótki opis rysunków

Figura 1 pokazuje sekwencję aminokwasową (Id. Sekw. nr 1) dojrzałej ludzkiej IL-4 typu dzikiego zastosowanej w tym badaniu. Helisy podkreślono i zaznaczono kolejno A, B, C i D. Pozycje, które zmutowane dawały agonistów IL-4 swoistych komórkowo, zaznaczono czcionką wytłuszczoną.

Figura 2 stanowi graficzne przedstawienie koncepcji wybiórczego agonisty limfocytów T.

Figura 3 stanowi złożoną krzywą zalezności od dawki dla wybiórczego agonisty w teście wydzielania IL-6 przez HUVEC. Panel A: O, IL-4 typu dzikiego; ·, R121E; V, R121P; ♦R121T/E122F/Y124Q. Panel B: O, IL-4 typu dzikiego; ·, Y124Q; V, Y124R; ♦, Y124A/S125A.

187 846

Figura 4 stanowi pojedyncze krzywe reakcji na dawkę wybiórczych agonistów muteinowych w teście wydzielania IL-6 przez HUVEC. Panel A: O, IL-4 typu dzikiego; • , R121E. Panel B: O, IL-4 typu dzikiego; •, R121P. Panel C: O, IL-4 typu dzikiego; •, R124Q. Panel D: O, IL-4 typu dzikiego; • , R124r. Panel E: O, IL-4 typu dzikiego; • , R124A/S125A. Panel F: O, IL-4 typu dzikiego; •, R121T/E122F/Y124Q.

Figura 5 stanowi złożoną krzywą reakcji na dawkę dla wybiórczych agonistów muteinowych w reakcji biologicznej na muteinę IL-4 w teście proliferacji 1° limfocytów T. Panel A: O, IL-4 typu dzikiego; ·, R121E; V, R121P; ♦R121T/E122F/Y124Q. Panel B: O, IL-4 typu dzikiego; ·, Y124Q; V, Y124R; ♦, Y124A/S125A.

Figura 6 stanowi pojedyncze krzywe reakcji na dawkę dla wybiórczych agonistów muteinowych w reakcji biologicznej na muteinę IL-4 w teście proliferacji 1° limfocytów T. Panel A: O, IL-4 typu dzikiego; •, R121E. Panel B: O, IL-4 typu dzikiego; •, R121P. Panel C: O, IL-4 typu dzikiego; • , R124Q. Panel D: O, IL-4 typu dzikiego; •, R124r. Panel E: O, IL-4 typu dzikiego; • , R124A/S125A. Panel F: O, IL-4 typu dzikiego; •, R121T/E122F/Y124q.

Figura 7 stanowi indywidualne krzywe reakcji na dawkę pokazujące antagonizm wywołanego IL-4 wydzielania IL-6 przez HUVEC przez wybiórczych wobec limfocytów T agonistów IL-4, muteiny R121E (•) i Y124Q (V). Reakcję na dawkę antagonisty IL-4 R121D/Y124D (O) dołączono jako kontrolę.

Figury 8A i 8B stanowią pojedyncze krzywe reakcji na dawkę. Panel A pokazuje reakcję biologiczną na muteinę R121D w teście proliferacji 1° limfocytów T (O = IL-4, • = R121D); Panel B pokazuje niezdolność R121D do wywołania wydzielenia IL-6 przez HUVEC (O = IL-4, • = R121D).

Figura 9A stanowi pojedyncze krzywe reakcji na dawkę dla IL-4 (O) oraz wybiórczych wobec limfocytów T agonistów, muteiny R121D (A) i T13D/R121E (♦) w teście proliferacji 1° limfocytów T.

Figura 9B stanowi pojedyncze krzywe reakcji na dawkę pokazujące antagonizm wywołany IL-4 wydzielenia IL-6 przez HUVEC wywołany wybiórczymi wobec limfocytów T agonistami, muteinąR121E (A) i T13D/R121E (♦).

Opis korzystnych wykonań

A. Podstawa

Wykazano, ze IL-4 pośredniczy w wielu różnych reakcjach komórkowych in vitro, w tym różnych efektach wobec limfocytów B, limfocytów T i monocytów, jak również komórek śródbłonka (Maher i in., Human Interleukin-4: An Immunomodulator with Potential Therapeutic Applications, Progres in Growth Factor Research, 3:43-56 (1991); Powrie, Coffman: Cytokine regulation of T cell function: potential for therapeutic intervention, Immunol. Today l4'270-4 (1993)). W szczególności, dodatnia regulacja cząsteczki adhezyjnej 1 komórek śródbłonka (VCAM-1; (Swerlick i in., Regulation of vascular cell adhesion molecule 1 on human dermal microvascular endothelial cells, J. Immunol. 149:698-705 (1992)) i indukcja IL-6 (Colotta i in., Interleukin 4 amplifies monocyte chemotactic protein and interleukin 6 production by endothelial cells, Cytokine 4:24-8, 1992) i białko chemoatrakcyjne 1 monocytów (MCP-1; Colotta i in., Interleukin 4 amplifies monocyte chemotactic protein and interleukin 6 production by endothelial cells, Cytokine 4:24-8, 1992; Rollins, Pober, Interleukin-4 induces the synthesis and secretion of MCP-1/JE by human endothelial cells, Am. J. Pathol., 138:1315-9 (1991)) stanowią bezpośredni wpływ IL-4 na hodowane komórki śródbłonka; dodatnia regulacja VCAM-1 koreluje ze zwiększoną adhezją limfocytów in vitro (Carlos i in., Vascular cell adhesion molecułe-1 mediates lymphocyte adherence to cytokine-activated cultured human endothelial cells, Blood 76:965-70 (1990); Thornhill i in., Tumor necrosis factor combines with IL-4 or IFN-gamma to selectively enhance endothelial cell adhesivenes for T cells. The contribution of vascular cell adhesion molecule-1-dependent and -independent binding mechanisms. J. Immunol. 146:592-8 (1991) i in vivo (Briscoe i in., Effects of tumor necrosis factor, lipopolysacharide and IL-4 on the expression of vascular cell adhesion molecule-1 in vivo. Correlation with CD3 + T cell infiltration, J. Immunol. 149:2954-60, 1992).

Muteina IL-4, IL-4/Y124D (zastąpienie tyrozyny kwasem asparginowym w pozycji 124) jest antagonistą limfocytów T (Kruse i in., Conversion of human interleukin-4 into a high affinity

187 846 antagonist by single amino acid replacement, EMBO J. 11:3237-44 (1992)). Doświadczenia in vivo przeprowadzone przez wynalazców wykazały, ze IL-4/Y124D wykazuje u małp ostrą toksyczność podobną do IL-4 typu dzikiego, obserwacja nie opisana do tej pory. Zjawiska komórkowe związane z toksycznością IL-4 typu dzikiego i IL-4/Y124D obejmują dodatnią regulację VCAM-1, dodatnią regulację MCP-1 w surowicy, wzrost krążących monocytów wraz z równoczesnym obniżeniem krążących limfocytów i wzrostem hematokrytu. Podobne przesunięcia komórkowe obserwowano w badaniach klinicznych IL-4 na ludziach (Wong i in., Administration of recombinant IL-4 to humans regulates gene expresion, phenotype and function in circulating monocytes, J. Immunol. 148:2118-25 (1992)). Z powodu swych właściwości jako antagonisty limfocytów T, wyniki te wskazują, ze toksyczność wykazywana przez IL-4/Y124D spowodowana jest aktywnością agonistyczną i zachodzi przez komórki inne niż limfocyty T Obserwowane toksyczności in vivo z użyciem IL-4/Y124D i znane efekty IL-4 wobec komórek śródbłonka są zgodne z mechanizmem, przez który zachodzi in vivo toksyczność IL-4 przez bezpośredni wpływ IL-4 na śródbłonek naczyń.

Dzięki tym (i pokrewnym) badaniom, wynalazcy odkryli, że na komórkach śródbłonka (EC) może być obecny nowy receptor IL-4. Ta możliwość doprowadziła do wysiłków w celu syntetyzowania mutein IL-4, które by wybiórczo pobudzały limfocyty T, ale nie EC. O ile limfocyty T wyrażają receptor IL-4 składający się z podjednostek IL-4Ra i IL-2Ry, wynalazcy odkryli, ze ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) wyrażają IL-4Ra ale nie IL-2Ry. Badania sieciowania wykazały, ze dwa łańcuchy receptora wyrażane są na powierzchni komórek HUVEC: ciężar cząsteczkowy jednego jest zgodny z EL-4a, zaś drugiego jest mniejszy. Wyniki te wskazują, ze nowy składnik receptora IL-4 działa podobnie do IL-2Ry, ale różni się sekwencją, i ulega ekspresji na HUVEC. Różnice swoistych struktur cząsteczkowych pomiędzy tymi dwoma receptorami były wykorzystane do wytworzenia odmiany IL-4, która działa wybiórczo wobec jednego receptora w stosunku do drugiego (np. wybiórczy agonista limfocytów T).

Figura 2 pokazuje graficznie koncepcję agonisty wybiórczego. Jak widać, receptor IL-4 limfocytów T obejmuje podjednostkę IL-4Ra/IL-2Ry, zaś receptor IL-4 komórek śródbłonka obejmuje IL-4Ra/podjednostkę przypominającą γ. Jakkolwiek przedstawione tu jedynie w celu zilustrowania, oba receptory dla IL-4 ulegają ekspresji na różnych rodzajach komórek. Receptor limfocytów T zbudowany jest z IL-4Ra i IL-2Rr; wiązanie IL-4 wywołuje tworzenie heterodimera w podobny sposób co na EC, z takim wyjątkiem, że receptor dla IL-4 zbudowany jest z IL-4Ra i składnika przypominającego podjednostkę y. Składnik przypominający γ jest inny niz IL-2Ry. Wybiórczymi wobec limfocytów T agonistami IL-4 są takie odmiany IL-4, które zachowują zdolność do oddziaływania z receptorem limfocyta T IL-4Ra/IL-2Rr, ale są niezdolni do wywołania heterodimeryzacji, a w ten sposób do sygnalizowania nie będącego na limfocytach T receptora IL-4Ra/podjednostki przypominającej y. Tacy wybiórczy wobec limfocytów T agoniści IL-4 zachowują swoją zdolność do oddziaływania z IL-4a; posiadają zdolność do rozróżniania pomiędzy IL-2Rr i podjednostką przypominającą y, która to zdolność nadaje im ich właściwości wybiórczej aktywacji.

Dwa składniki receptora limfocyta T, IL-4Ra i IL-2Ry stykają się z różnymi regionami cząsteczki IL-4, stąd wynalazcy skupili się na modyfikacji małego regionu IL-4. Podejrzewając, ze nowa podjednostką receptora kontaktuje się z tym samym regionem IL-4 co IL--2Ry, wynalazcy wykonali szereg zastąpień w helisie D, w szczególności reszt 121, 124 i 125.

Helisę D wiąże się z oddziaływaniem z IL-2Rr, jak i z domniemanym nowym receptorem na HuVeC (zwłaszcza, ze muteina IL-4, R121D/Y124D jest antagonistą HUVEC). Muteiny zawierające modyfikacje helisy D wobec IL-4 (reszty 110 do 126; His = 1) badano przesiewowo pod względem ich zdolności do pobudzania proliferacji limfocytów T i wydzielania IL-6 przez HUVEC. Muteiny, które wywoływały różną reakcję limfocytów T w stosunku do HUVEC charakteryzowano dalej przez dalszą mutagenezę.

Początkowe skanowanie helisy D przeprowadzono w celu określenia potencjalnych obszarów oddziaływania. Oprócz tego, przeprowadzono zastępowanie alaniną w pętli Ab, ponieważ ten region uważany jest za związany z oddziaływaniem cytokiny z ligandem oraz podjednostką receptora oddziałującą z helisą D. W szczególności, badano powierzchniowe reszty

187 846

Glu-110, Asn-111, Glu-114, Arg-115, Lys-117, Thr-118, Arg-121, Glu-122, Tyr-124, Ser-125 i Lys-126 i stanowią one cel dla analizy mutagenezą. Miejsca 118-126 są bardziej korzystne, zaś najkorzystniejsze są miejsca 121-125. Porównanie pomiędzy IL-2, IL-4, IL-7 i IL-15 w tym regionie zidentyfikowało również różnice pomiędzy IL-2, IL-4, IL-7 i IL-15, co zasugerowało reszty prawdopodobnie odpowiedzialne za oddziaływanie z receptorem HUVEC. Konkretne podstawienia pochodzące z porównania pomiędzy IL-2 i IL-4 wprowadzono do IL-4. Obejmowały one: zmianę Arg-115 na Phe, Lys-117 na Asn, Glu-122 na Phe, Lys-126 na Ile oraz trzy równoczesne zmiany Arg-121 na Thr, Glu-122 na Phe i Tyr-124 na Gln.

Mutacje wprowadzono przy użyciu ukierunkowanej mutagenezy do cDNA ludzkiej IL-4 typu dzikiego. Prawidłowe klony klonowano do wektora ekspresyjnego przydatnego do ekspresji w układzie heterologicznym (np. E. coli, bakulowirusowym albo komórek CHO). Oczyszczone białka badano w teście proliferacji limfocytów T i wydzielania cytokin przez HUVEC (IL-6). Różnice reakcji wywołanej przez poszczególne muteiny w tych testach, zarówno w EC 50 jak i reakcji maksymalnej (plateau) wskazują muteiny, które wywołują te aktywności. Konkretnie, muteiny, które pobudzają względnie silną reakcję w teście z limfocytami T (w stosunku do IL-4 typu dzikiego) w porównaniu z reakcją HUVEC (w stosunku do IL-4 typu dzikiego) sugeruje pozycje, które są bardziej istotne dla oddziaływania IL-4 z IL-2Ry, niż oddziaływanie IL-4 z nowym receptorem IL-4 HUVEC. Dalsza analiza i mutageneza (np. zmiany kombinatoryjne, zastępowanie wszystkich aminokwasów) zidentyfikowanych pozycji daje muteiny IL-4 o wybiórczych właściwościach agonistycznych wobec receptora IL-4 limfocytów T. Białko to będzie również wybiórczym antagonistą reakcji HUVEC wywołanej przez IL-4.

B. Definicje

Opisano tu nowe muteiny i mechanizm dostarczania nowych mutein IL-4 o właściwościach wybiórczego agonisty wobec limfocytów T i zmniejszonej toksyczności. Podobną strategię można zastosować w celu identyfikacji wybiórczych antagonistów limfocytów T.

W znaczeniu tu zastosowanym, „IL-4 typu dzikiego” oznacza IL-4 natywną albo rekombinowaną posiadającą sekwencję 129 normalnie występujących aminokwasów natywnej IL-4, jak pokazana na np. fig 1.

W znaczeniu tu zastosowanym „muteina IL-4” oznacza polipeptyd, w którym dokonano swoistych zastąpień białka ludzkiej dojrzałej IL-4. Konkretnie, ujawniono zastąpienie reszty argininy (R) w pozycji 121 (Arg-121), przy zachowaniu numeracji IL-4 typu dzikiego, przez alaninę (A), asparaginian (D), glutaminian (E), fenyloalaninę (F), histydynę (H), izoleucynę (I), lizynę (K), asparaginę (N), prolinę (P), treoninę (T) albo tryptofan (W), albo glutaminianu (E) w pozycji 122 przez fenyloalaninę (F); albo resztę tyrozyny w pozycji 124 przez alaninę (A), glutaminę (Q), argininę (R), serynę (S) albo treoninę (T); albo serynę (S) w pozycji 125 przez alaninę (A). Najkorzystniejsze muteiny IL-4 mają sekwencję aminokwasową identyczną z IL-4 typu dzikiego w innych, nie zastąpionych resztach aminokwasowych. Jednakże, muteiny IL-4 według wynalazku mogą się również charakteryzować insercjami, delecjami, zastąpieniami i modyfikacjami w jednym albo wielu miejscach w innych resztach natywnego łańcucha polipeptydowego IL-4. Według wynalazku, dowolna z takich insercji, delecji, zastąpień albo modyfikacji daje muteinę IL-4, która zachowuje aktywność wybiórczą wobec limfocytów T, przy zmniejszonej zdolności do aktywacji komórek śródbłonka.

Korzystne są konserwatywne modyfikacje i zastąpienia w innych pozycjach IL-4 (tj. takich, które wywierają minimalny wpływ na-drugorzędową albo trzeciorzędową strukturę muteiny). Takie zakonserwowane zastąpienia obejmują opisane przez Dayhoffa w The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) oraz Argos eMbO J., 8:779-785 (1989). Przykładowo, aminokwasy należące do jednej z poniższych grup stanowią zmiany zakonserwowane:

- ala, pro, gly, gin, asn, ser, thr;

- cys, ser, tyr, thr;

- val, ile, leu, met, ala, phe;

- lys, arg, his;

- phe, tyr, trp, his; i

- asp, glu

187 846

Korzystne są również modyfikacje i zastąpienia, które nie wprowadzają miejsc dodatkowego sieciowania międzycząsteczkowego albo nieprawidłowego tworzenia mostków disiarczkowych. Przykładowo, wiadomo, ze IL-4 posiada sześć reszt cys, w pozycjach 3, 24, 46, 65, 99 i 127 sekwencji typu dzikiego.

Przez „numerację według IL-4 typu dzikiego” rozumie się identyfikację wybranych aminokwasów w odniesieniu do pozycji, w której aminokwas normalnie występuje w IL-4 typu dzikiego. Gdy w muteinie IL-4 dokonuje się insercji albo delecji, specjalista zauważy, ze ser (S) normalnie występująca w pozycji 125, przy numeracji według IL-4 typu dzikiego ulegnie przesunięciu w muteinie. Jednakże, położenie przesuniętej ser (S) można łatwo stwierdzić przez badanie i korelację otaczających aminokwasów z otaczającymi ser w IL-4 typu dzikiego.

Muteiny IL-4 według wynalazku można wytworzyć dowolną odpowiednią metodą znaną w dziedzinie wiedzy. Metody takie obejmują konstruowanie sekwencji DNA kodujących muteiny IL-4 według wynalazku i wyrażanie tych sekwencji w odpowiednio transformowanym gospodarzu. Sposób ten powinien pozwolić uzyskać rekombinowane muteiny według wynalazku. Jednakże, muteiny według wynalazku można również wytworzyć, jakkolwiek mniej korzystnie, przez syntezę chemiczną albo kombinację syntezy chemicznej i techniki rekombinacji DNA.

W jednym wykonaniu rekombinacyjnej metody wytwarzania muteiny według wynalazku, konstruuje się sekwencję DNA przez izolowanie albo syntezę sekwencji DNA kodującej IL-4 typu dzikiego, a następnie zmianę kodonu argl21 na kodon dla alaniny (A), asparaginianu (D), glutaminy (E), fenyloalaniny (F), histydyny (H), izoleucyny (I), lizyny (K), asparaginy (N), proliny (P) treoniny (T) albo tryptofanu (W) przez kierowaną mutagenezę. Technika ta jest znana. Patrz, np. Mark i in., Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-5666 (1984); patent USA nr 4,588,585, załączone tu jako odnośnik.

Inny sposób konstruowania sekwencji DNA kodującej muteiny IL-4 według wynalazku obejmuje syntezę chemiczną. Przykładowo, gen który koduje pożądaną muteinę IL-4 można syntetyzować sposobem chemicznym stosując syntetyzer oligonukleotydów. Takie oligonukleotydy projektuje się w oparciu o sekwencję aminokwasową pożądanej muteiny IL-4 i korzystnie selekcjonuje kodony, które są korzystne w komórce gospodarza, w którym będzie wytwarzana rekombinowana muteina W tym względzie, wiadomo powszechnie, ze kod genetyczny jest zdegenerowany, tzn. aminokwas może być kodowany przez więcej niż jeden kodon. Przykładowo, phe (F) kodowana jest przez dwa kodony, TTC albo TTT, tyr (Y) kodowana jest przez TAC albo TAT, zaś his (H) kodowana jest przez CAC albo CAT. Trp (W) kodowany jest przez pojedynczy kodon, TGG. Nawiązując, wiadomo, że dla danej sekwencji DNA kodującej konkretną muteinę IL-4, będzie wiele zdegenerowanych sekwencji DNA, które kodują tę muteinę. Przykładowo, wiadomo, ze oprócz korzystnej sekwencji DNA dla muteiny R121E pokazanej na Id. Sekw. nr 3, istnieje wiele zdegenerowanych sekwencji DNA które kodują pokazaną muteinę. Te zdegenerowane sekwencje DNA uważane są za pozostające w zakresie wynalazku. Stąd, „zdegenerowane odmiany” w kontekście wynalazku oznaczają wszystkie sekwencje DNA, które kodują konkretną muteinę.

Sekwencja DNA kodująca muteinę IL-4 według wynalazku, wytworzona przez ukierunkowaną mutagenezę, syntezę albo innym sposobem, może ale nie musi obejmować sekwencji DNA, które kodują sekwencję sygnałową. Taka sekwencja sygnałowa, jeżeli występuje, powinna być rozpoznawana przez komórkę wybraną do ekspresji muteiny IL-4. Mozę ona być prokariotyczna, eukariotyczna albo może być kombinacją tych dwóch. Może być również sekwencją sygnałową natywnej IL-4. Włączenie sekwencji sygnałowej zależy od tego, czy jest pożądane aby muteina IL-4 była wydzielona z rekombinowanej komórki w której jest wytwarzana. Jeżeli wybrana komórka jest prokariotyczna, ogólnie korzystne jest aby sekwencja DNA kodowała sekwencję sygnałową. Jeżeli wybrana komórka jest eukariotyczna, jest korzystne aby sekwencja sygnałowa była kodowana, zaś szczególnie korzystne jest, zęby była to sekwencja sygnałowa natywnej IL-4.

W celu syntezy genu kodującego muteinę IL-4 według wynalazku można zastosować standardowe sposoby. Przykładowo, w celu skonstruowania genu ulegającego translacji wstecznej

187 846 można zastosować kompletną sekwencję aminokwasową. Oligomer DNA zawierający sekwencję nukleotydową kodującą muteinę IL-4 można zsyntetyzować. Przykładowo, można syntetyzować kilka małych oligonukleotydów kodujących części pożądanego polipep-tydu, po czym poddać je ligacji. Poszczególne oligonukleotydy zwykle zawierają dodatkowe zasady na końcach 5' i 3' zapewniające komplementamość.

Po połączeniu (przez syntezę, ukierunkowaną mutagenezę albo innym sposobem), sekwencje DnA kodujące muteinę IL-4 według wynalazku wprowadza się do wektora ekspresyjnego i łączy funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję odpowiednią do ekspresji muteiny IL-4 w pożądanym transformowanym gospodarzu. Prawidłowe łączenie można potwierdzić przez sekwencjonowanie nukleotydów, mapowanie restrykcyjne i ekspresję biologicznie czynnego polipeptydu w odpowiednim gospodarzu. Wiadomo, ze w celu uzyskania wysokiego poziomu ekspresji transfekowanego genu w gospodarzu, gen musi być połączony funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi transkrypcję i translację, które działają w wybranym gospodarzu ekspresyjnym.

Wybór sekwencji kontrolujących ekspresję i wektora ekspresyjnego zależeć będzie od wyboru gospodarza. Można wykorzystać wiele kombinacji wektora ekspresyjnego/gospodarza. Przydatne wektory ekspresyjne dla gospodarzy eukariotycznych obejmują, przykładowo, wektory obejmujące sekwencje kontrolujące ekspresję z SV40, bydlęcego wirusa brodawczaków, adenowirusa i cytomegalowirusa. Przydatne wektory ekspresyjne dla gospodarzy bakteryjnych obejmują znane plazmidy bakteryjne, takie jak pochodzące z E. coli, w tym col E1, pCR1, pER32z, pMB9 oraz ich pochodne szeroki zakres plazmidów takich jak RP4, DNA fagowe, takie jak M13 i jednoniciowe DNA fagów nitkowatych. Przydatne wektory dla komórek owadów obejmują pVL941. Korzystny jest pFastBac™ (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Cate i in., Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expresion of the Human Gene in Animal Cells, Cell 45:685-98 (1986).

Oprócz tego, można zastosować w tych wektorach dowolną spośród szerokiego zakresu sekwencji kontrolujących Takie przydatne sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują sekwencje kontrolujące ekspresję związane z genami strukturalnymi powyższych wektorów ekspresyjnych. Przykłady przydatnych sekwencji kontrolujących ekspresję obejmują, przykładowo, wczesne i późne promotory SV40 albo adenowirusa, układ lac, układ trp, układ TAC albo TRC, główny operator i główny promotor faga lambda, przykładowo PL, regiony kontrolne białka otoczki fd, promotor kinazy 3-fosfoglicerynowej albo innych enzymów glikolitycznych, promotory fosfatazy kwaśnej, np. PhoA, promotory układu kopulacyjnego A drożdży, promotor poliedrozy Baculowirusów i inne sekwencje, o których wiadomo, że kontrolują ekspresję genów komórek prokariotycznych albo eukariotycznych albo ich wirusów i ich różnych kombinacji.

Do wytwarzania mutein IL-4 według wynalazku można wykorzystać dowolnego przydatnego gospodarza, w tym bakterie, grzyby (również drożdże), rośliny owady, ssaki albo inne odpowiednie komórki zwierzęce albo linie komórkowe, jak również transgeniczne zwierzęta albo rośliny. Konkretniej, gospodarze ci mogą obejmować dobrze znanych gospodarzy prokariotycznych albo eukariotycznych, takich jak E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, grzyby, drożdże, komórki owadów takie jak Spodoptera frugiperda (Sf9), komórki zwierzęce takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) i komórki mysie takie jak NS/O, komórki afrykańskiej małpy zielonej takie jak COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 i BNT 10, oraz komórki ludzkie, jak również komórki roślinne w hodowli. Do ekspresji w komórkach zwierzęcych, korzystne są komórki CHO i COS 7 w hodowli, zaś szczególnie linia komórek CHO (DHFR-).

Należy oczywiście rozumieć, ze nie wszystkie wektory i sekwencje kontrolujące ekspresję będą działały równie dobrze przy ekspresji opisanych tu sekwencji DNA. Podobnie, nie wszyscy gospodarze będą działali równie dobrze z danym układem ekspresyjnym. Jednakże, specjalista może dokonać samodzielnie wyboru wśród wektorów, sekwencji kontrolujących ekspresję i gospodarzy bez niepotrzebnych doświadczeń. Przykładowo, przy wyborze wektora należy uwzględnić gospodarza ponieważ wektor musi się w nim namnażać. Należy również uwzględniać liczbę kopii wektora, zdolność do kontrolowania liczby kopii, oraz ekspresję

187 846 innych białek kodowanych przez wektor takich jak znaczniki oporności na antybiotyki. Przykładowo, korzystne wektory do zastosowania według wynalazku obejmują takie, które umożliwiają amplifikację znacznej liczby kopii DNA kodującego muteiny IL-4. Takie wektory zdolne do amplifikacji są znane. Obejmują one, przykładowo, wektory zdolne do namnożenia się przez amplifikację DHFR (patrz, Kaufman, patent USA nr 4,470,461, Kaufman i Sharp, Construction of a modular dihydrofolate reductase cDNA gene: Analysis of signals utilized fo efficient expression, Mol. Cell. Biol. 2:1304-19 (1982)) albo amplifikację syntazy glutaminowej (GS) (patrz, patent USA nr 5,122,464 oraz europejskie opublikowane zgłoszenie 338,841).

Przy wyborze sekwencji kontrolującej ekspresję, można rozważać różne czynniki. Obejmują one, przykładowo, względną siłę sekwencji, możliwości jej kontrolowania oraz jej zgodność z aktualną sekwencją dNa kodującą muteinę IL-4 według wynalazku, szczególnie w odniesieniu do potencjalnych struktur drugorzędowych. Gospodarzy należy wybierać przy uwzględnieniu ich zgodności z wybranym wektorem, toksyczności produktu kodowanego przez sekwencje DNA według wynalazku, ich charakterystyki wydzielania, ich zdolności do prawidłowego fałdowania polipeptydów, ich wymagań dotyczących fermentacji albo hodowli oraz łatwości oczyszczania produktu kodowanego przez sekwencje DNA.

W obrębie tych parametrów, specjalista może wybrać różne kombinacje wektora/sekwencji kontrolującej ekspresję/gospodarza, która będzie wyrażać pożądane sekwencje DNA podczas fermentacji albo hodowli komórek na wielką skalę, przykładowo z użyciem komórek COS 7 albo CHO.

Muteiny IL-4 otrzymane według wynalazku mogą być glikozylowane albo nie glikozylowane, zależnie od organizmu gospodarza zastosowanego do wytwarzania muteiny. Jeżeli jako gospodarz zostanie wybrana bakteria, wtedy wytwarzana muteina IL-4 będzie nie glikozylowana. Komórki eukariotyczne będą glikozylowały muteinę IL-4, jakkolwiek niekoniecznie w ten sam sposób co natywną IL-4.

Muteinę IL-4 wytworzoną przez transformowanego gospodarza można oczyszczać dowolnym sposobem. Znane są różne metody oczyszczania IL-4, patrz, np. patent USA nr 5,013,824, 5,017,691 i WO 96/04306-A2. Korzystne jest oczyszczanie przez powinowactwo immunologiczne. Patrz, np. Okamura i in., Human fibroblastoid interferon: immunosorbent column chromatography and N-terminal amino acid sequence, Biochem. 19:3831-35 (1980).

Aktywność biologiczną mutein IL-4 według wynalazku można ocenić dowolną znaną przydatną metodą. Testy takie obejmują neutralizację przeciwciałami aktywności przeciwwirusowej, indukcję kinazy białkowej, aktywności oligoadenylano 2,5-A syntazy albo fosfodiesterazy, jak to opisano w EP-B1-41313. Takie testy obejmują również testy immunomodulujące (patrz, patent USA nr 4,753,795), testy zahamowania wzrostu, testy proliferacji limfocytów T, indukcji IL-6 (MCP-1 albo VCAM-1) na EC i pomiar wiązania z komórkami, które wyrażają receptory IL-4. Patrz również Spits i in., Recombinant interleukin-4 promotes the growth of human T cells, J. Immunol. 139:1142-47 (1987).

Muteinę IL-4 według wynalazku podaje się w dawkach w przybliżeniu równych albo wyższych od stosowanych w terapii przy użyciu natywnej albo rekombinowanej IL-4. Korzystnie podaje się skuteczną ilość muteiny IL-4. Określenie „skuteczna ilość” oznacza ilość zdolną do zapobieżenia albo osłabienia ciężkości albo rozprzestrzenienia się leczonej choroby albo stanu. Oczywiste dla specjalisty jest, ze skuteczna ilość muteiny IL-4 zależeć będzie, między innymi, od choroby, dawki, schematu podawania muteiny IL-4, czy muteina IL-4 podawana jest sama czy w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi, od okresu półtrwania kompozycji oraz od stanu ogólnego pacjenta.

Muteinę IL-4 korzystnie podaje się w kompozycji obejmującej nośnik dopuszczalny farmaceutycznie. „Nośnik dopuszczalny farmaceutycznie” oznacza nośnik, który nie powoduje żadnego niepożądanego efektu u pacjenta, któremu go się podaje. Takie nośniki dopuszczalne farmaceutycznie są dobrze znane. Korzystny jest 2% HSA/PBS, pH 7,0.

Muteiny IL-4 według wynalazku można wytwarzać w postaci kompozycji farmaceutycznej znanymi sposobami. Patrz, np. Remington's Pharmaceutical Science, Martin, załączone tu jako odnośnik. Kompozycja farmaceutyczna muteiny IL-4 może przybierać różne postacie,

187 846 w tym płynne, żelowe, liofilizowane, albo inne przydatne postacie. Przydatna postać będzie zależała od konkretnego leczonego wskazania i jest oczywista dla specjalisty.

Kompozycję farmaceutyczną muteiny IL-4 można podawać doustnie, w rozpylaczu, dożylnie, domięśniowo, dootrzewnowo, śródskórnie albo podskórnie, albo w dowolny inny dopuszczalny sposób. Korzystny sposób podawania zależy od konkretnego wskazania i jest oczywisty dla specjalisty. Kompozycję farmaceutyczną muteiny IL-4 można podawać w połączeniu z innym środkiem farmaceutycznym. Środki te można włączać jako części tej samej kompozycji farmaceutycznej albo można podawać oddzielnie z muteiną IL-4, równocześnie albo według innego dopuszczalnego schematu leczenia. Oprócz tego, kompozycję farmaceutyczną IL-4 można zastosować w celu wspomagania innych terapii.

Nawiązując, wynalazek dostarcza kompozycji i sposobów leczenia chorób odpornościowych, raków i nowotworów, nienormalnego wzrostu komórek, albo immunomodulacji u dowolnego zwierzęcia, korzystnie ssaka, najkorzystniej człowieka. Jak uprzednio zaznaczono, IL-4 wywiera szereg efektów. Niektórymi z nich jest stymulacja proliferacji limfocytów T, różnicowanie limfocytów T pomocniczych, indukcja aktywacji i proliferacji ludzkich limfocytów B oraz kierowane limfokiną przełączenie klas immunoglobulin. Wpływ na układ odpornościowy obejmuje zwiększenie ekspresji antygenu MHC klasy II (Noelle i in., Increased expression od Ia antigen on resting B cells: a new role for B cell growth factor, PNAS USA 81:6149-53 (1984), i CD23 na limfocytach B (Kikutani i in., Molecular structure of human lymphocyte receptor for immunoglobulin, Cell 47:657-61 91986)). Limfocyty T pomocnicze typu 1 (Th1) i typu 2 (Th2) związane są z reakcją odpornościową. Pobudzone limfocyty Th2 wydzielają IL-4 i blokują progresję Th1. Tak więc, dowolną chorobę związaną z Th1 można leczyć IL-4 i jej analogami.

Uwzględniane jest również zastosowanie sekwencji DNA kodujących muteiny IL-4 według wynalazku do terapii genowej. Uwzględniane zastosowanie w terapii genowej obejmuje leczenie tych chorób, w których oczekuje się, że IL-4 zapewni skuteczną terapię z powodu swej aktywności immunomodulacyjnej, np. w stwardnieniu rozsianym (SM), cukrzycy insulinozaleznej (IDDM), reumatoidalnym zapaleniu stawów (RA), układowym toczniu rumieniowatym (SLE), zapaleniu jagodówki, zapaleniu jąder, pierwotnym zwłóknieniu wątroby, malarii, trądzie, chorobie Lyme, kontaktowym zapaleniu skóry, łuszczycy, chłoniaku z limfocytów B, ostrej białaczce limfoblastycznej, chłoniaku nie-Hodkinowskim, raku, zapaleniu kostno-stawowym i chorobach, które w inny sposób reagują na IL-4 albo czynniki zakaźne wrażliwe na reakcję odpornościową za pośrednictwem IL-4.

Miejscowe dostarczanie mutein IL-4 przy użyciu terapii genowej może dostarczyć środek terapeutyczny do obszaru docelowego. Uwzględniane są metodologie terapii genowej w vitro i in vioo. Znanychjest kilka sposobów przenoszenia potencjalni e terapeutycznych genów do określonej populacji komórkowej, patrz, Melligkz, The basic sciznyz of gene therapy, Science 260:926-31 (1993). Sposoby te obejmują:

1) bezpośredni transfer genu, patrz, np. Wolff i in., Direct gene transfer into mouse muscle in vivo, Science 247:1465-68 (1990);

2) transfer genu za pośrednictwem liposomów, patrz, np. Caplen i in., Lipρspme-mediated SFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis, Nature Med. 3:39-46 (1995); Crystal, The gene as a drug, Nature Med. 1:15-17 (1995); Gao i Huang, A zovz1 catiliposome reagent for efficiezt trknsfzctipz of mammalian cells, Biochem. B^p^s. Res. Comm. 179 280-85 (1991);

3) transfer DNA za pośrednictwem retrowirusa, patrz, np Kay i in., In vivo gene ^rapy of hemoahilik B: sustkized partial correction in factor IX-deficient dogs, Science 262.117-19 (1993); Andersen, Human gene therapy, Science 256:808-13 (1992).

4) transfer DNA za pośrednictwem wirusów. Takie wirusy obejmują ade^w^^y (korzystnie, wektory oparte na Ad-2 albo Ad-5), wirusy herpes (korzystnie wektory oparte na wirusie he^es simp^) i parwowirusy (korzystnie wektory oparte na pkrwowirusach „defektnwznch” albo zieautozomicsznch, jeszcze korzystniej wektory oparte na wirusach towarzyszących kdzanwirusom, najkorzystniej wektory oparte na AAV-2). Patrz, np. Ali i in , The use

187 846 of DNA viruses as vectors for gene therapy, Gene Therapy 1:367-84 (1994); patent USA nr 4,797,368, załączony tu jako odnośnik oraz patent USA nr 5,139,941, załączony tu jako odnośnik.

Wybór konkretnego układu wektora do przeniesienia interesującego genu zależeć będzie od różnych czynników. Jednym z istotnych czynników jest natura docelowej populacji komórkowej. Jakkolwiek wektory retrowirusowe bada się intensywnie i stosuje w wielu zastosowaniach terapii genowej, wektory te ogólnie nie nadają się do zakazania komórek nie dzielących się. Oprócz tego, retrowirusy są potencjalnie onkogenne.

Adenowirusy mają zaletę szerokiego zakresu gospodarzy, mogą zakazać komórki spoczynkowe i zróżnicowane końcowo, takie jak neurony albo hepatocyty, i wydają się być zasadniczo nie onkogenne, patrz, np. Ali i in., wyżej. Adenowirusy prawdopodobnie nie integrują się z genomem gospodarza. Ponieważ bytują pozachromosomalnie, ryzyko mutagenezy insercyjnej jest znacznie zmniejszone, Ali i in., wyżej.

Wirusy związane z adenowirusami wykazują podobne zalety co wektory oparte na adenowirusach. Jednakże, AAV wykazują swoistą miejscowo integrację z ludzkim chromosomem 19, Ali i in., wyżej.

W najkorzystniejszym wykonaniu DNA kodujący muteinę IL-4 według wynalazku stosuje się w terapii genowej chorób autoagresyjnych takich jak SM, IDDM i RA, chorób zakaźnych takich jak choroba z Lyme i trąd, nowotworów takich jak chłoniak nie-Hodgkinowski i ALL, chorób chrząstki takich jak zapalenie kostno-stawowe i łuszczycy.

Według tego wykonania, terapia genowa przy użyciu DNA kodującego muteiny IL-4 według wynalazku dostarczany jest potrzebującemu pacjentowi równocześnie z albo bezpośrednio po diagnozie.

Podejście to korzysta z wybiórczej aktywności mutein IL-4 według wynalazku do zapobiegania niepożądanemu pobudzeniu autoagresyjnemu. Specjalista zauważy, ze zgodnie z tym wykonaniem można zastosować dowolny przydatny wektor zawierający DNA dla muteiny IL-4. Techniki konstruowania takich wektorów są znane. Patrz, np. Ohno i in., wyżej; Chang i in., wyżej. Wprowadzenie wektora zawierającego DNA kodującego muteinę IL-4 można osiągnąć przy użyciu znanych technik, np. jak opisano w Ohno i in., wyżej.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku podano poniższe przykłady. Przykłady te podane są jedynie w celu zilustrowania i nie są uwzględniane w żaden sposób jako ograniczenie zakresu wynalazku.

187 846

Przykłady

Ogólnie

Sekwencja aminokwasową dojrzałej ludzkiej IL-4 zastosowanej w tym badaniu pokazana jest poniżej. Aminokwasy, których zastąpienie daje agonistów wybiórczych wobec limfocytów T zaznaczono wytłuszczoną czcionką:

His

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

Leu

Gin

Glu

Ile

Ile

Lys

Thr

Leu

Am

1

5

10

15

Ser

Leu

Thr

Glu

Gin

Lys

Thr

Leu

Cys

Thr

Glu

Leu

Thr

Val

Thh

20

255

30

Asp

Ile

Phe

Ala

Ala

Ser

Lys

Asn

Thr

Thr

Glu

Lys

Glu

Thr

PPe

35

40

45

Cys

Arg

Ala

Ala

Thr

Val

Leu

Arg

Gin

Phe

Tyr

Ser

His

His

Glu

50

555

60

Lys

Asf)

Thr

Arg

Cys

Leu

Gly

Ala

Thr

Ala

Gin

Gin

Phe

His

A^

65

70

75

His

Lys

Gin

Leu

Ile

Arg

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Asp

Arg

Asn

Leu

80

80

90

Trp

GGy

Leu

Ala

Gly

Leu

Asn

Ser

Cys

Pro

Val

Lys

Glu

Ala

Am

95

100

110

Gin

Ser

Thr

Leu

Glu

Asn

Pite

Leu

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Ile

Met

110

110

110

Arg

Glu

Lys

Tyr

Ser

Lys

Cys

Ser

Ser

125

Id. Sekw. nr 1

Muteiny wyrażano w układzie bakulowirusowym, oczyszczano do homogenności i badano w testach biologicznych, które odzwierciedlały różne zastosowania receptora IL-4. W celu zbadania aktywności wybiórczych agonistów zastosowano dwa testy: test wydzielania IL-6 przez HUVEC pobudzone IL-4 i test proliferacji 1° limfocytów T wobec aktywności IL-4. Związki, które miały zdolność indukowania proliferacji 1 limfocytów T, przy zmniejszonej zdolności wywoływania wydzielenia IL-6 są wybiórczymi wobec limfocytów T agonistami IL-4 i lezą w zakresie wynalazku. Konkretniej, w celu oceny aktywności przez alternatywny receptor iL-4 (IL-4Ra/składnik przypominający γ) zastosowano ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC).

187 846

Przykład 1. Wytwarzanie mutein.

Muteiny wytwarzano przez ukierunkowaną mutagenezę, stosując startery zawierające kodony odpowiadające pożądanej mutacji zasadniczo jak to opisano w Kunkel i in., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotype selection (1987) Methods Enzymol. 154.367-382. Pokrótce, cDNA dla ludzkiej IL-4 zawierający miejsce enzymu restrykcyjnego BamHI i Xbal klonowano do wektora fagowego M13 mp19 (New England Biolabs, Beverly, MA) stosując to samo miejsce. cDNA IL-4 typu dzikiego otrzymano stosując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z puli cDNA wytworzonej z mRNA izolowanego z ludzkich limfocytów krwi obwodowej, indukowanych 24 godziny PMA (10 ng/ml). Zastosowanymi starterami były, dla końca 5' otwartej ramki odczytu IL-4

5'-CGC GGA TCC ATG GGT CTC ACC TCC-3' (Id. Sekw. nr 22); i dla końca 3' otwartej ramki odczytu IL-4 '-CGC TCTAGA CTA GCT CGA ACA CTT TGA AT-3' (Id. Sekw. nr 23).

Do każdego oligonukleotydu włączono miejsca restrykcyjne BamHI (koniec 5') i XbaI (koniec 3') co zaznaczono kursywą. Zastosowane warunki PCR: 1 minuta w 94°C, 1 minuta w 58,7°C i 1 minuta w 72°C przez 25 cykli. Prawidłowość sekwencji cDNA IL-4 potwierdzono przez sekwencjonowanie stosując zestaw Sequenase® (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) jak opisano przez producenta. Pojedynczą nić DNA zawierającą uracyl (U-DNA) otrzymano przez transformowanie Π. coli szczepu CJ236 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) M13mp19 zawierającym cDNA dla IL-4. Ukierunkowana mutageneza wykorzystywała ogólnie startery zawierające po 15 nukleotydów homologicznych z matrycą U-DNA 5' od kodonu docelowego dla mutagenezy, nukleotydy obejmujące pożądaną zmianę i dodatkowe 10 nukleotydów homologicznych do matrycy U-DNA 3' od zmienionego nukleotydu.

Starterami były:

R121A: CTAAAGACGA TCATGGCTGA GAAATATT (Id. Sekw. nr 24)

R121D: GCTAAAGACG ATCATGGACG AGAAATATTC (Id. Sekw. nr 225)

R121E: GCTAAAGACG ATCATGGAAG AGAAATATTC (M. SSkw. rn 26)

R121F: CTAGAGATGA TCATGTTTGA GAAGTATT Ad. Sedw. rn 27n

R121H: CTAAAGACGA TCATGCACGA GAAATATT Ild. Sekw. nr 28)

R121I: CTAAAGACGA TCATGATAGA GAAATATT(Id. Sklcw. nr 9))

R121K: CTAAAGACGA TCATGAAAGA GAAATATT (Η Ski™. mT))

R121N: CTAAAGACGA TCATGAACGA GAAATATT Gd. Skl^ nr31)

R121P: GCTAAAGACG ATCTTGCGAG AGAAATATAC (Id. Sekw. nr 32)

R121T: CTAAAGACGA TCATGACTGA GAAATATT Gd. Sekw. nc 3))

R121W: CTAAAGACGA TCATGTGGGA GAAATATT Gd. Skl^. nr 3))

Y124A: ATCATGAGAG AGAAAGCATC AAAGTGTT <dd. Skkw. nr 3))

Y124Q: ATCATGAGAG AGAAACAATC AAAGTGTT Gd . Skkw . n( 36)

Y124R: A TC A TGA GAG AGAAACGATC AAAGTGTT . Skkw . nr 37)

Y124S: ATCATGAGAG AGAAATCATC AAAGTGTT Gd . Skkw . nr 38)

Y124T: ATCATGAGAG AAAGTGTT Gd . Skkw. nr 39)

Y^A/S^A: CGAACATGAG ATTTATTGCT GGTTAGAGAd CGA (Id. Sekw. nr 40)

T13D: CAGGAGATCA TCAAAGATTT GAACAGCC Gd · Skkw. nr U)

R121T/Π122F/Y123Q: TGTAATTTGT TTGATGAGCT AGAAACAGTC AAAG (Id. Sekw. nr 42).

Podkreślono regiony zmutowanych nukleotydów. Startery fosforylowaro przy użyciu kinazy polmukleotydowej T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) według instrukcji producenta. Po przyłączeniu startera do matrycy U-DNA i wydłużeniu polimerazą DNA T7 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) komórki E coli szczepu DH5a™ (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) transformowano 5 pl mieszaniny reakcyjnej i wysiano na podłoże LB zawierające 0,7% agar. Po inkubacji w 37°C, kolonie namnożono przez pobranie pojedynczych kolonii i przeniesienie do 2 ml pożywki LB i hodowanie przez noc w 37°C Jednomciowy DNA wyizolowano stosując zestaw do oczyszczania M13 (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) według instrukcji producenta, po czym klony zawierające pożądaną mutację zidentyfikowano przez sekwercjorokarle

187 846 jednoniciowego DNA przy użyciu zestawu Sequenase® (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) według instrukcji producenta. cDNA muteiny IL-4 w postaci replikującego DNA odpowiadającego koloniom zawierającym prawidłową zmutowaną sekwencję wyizolowano stosując BAMHI i Xbal i klonowano do wektora plazmidowego pFastBac™l (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Po klonowaniu, wytworzono rekombinowany bakulowirusowy DNA (określany dalej jako Bacmid) przez transformowanie pFastBac™l zawierający cDNA muteiny do E. coli szczepu DH10Bac™ (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) według instrukcji producenta. Muteiny wyrażano w komórkach Spodoptera frugiperda (Sf) 9, stosując układ ekspresji Bac-to-Bac (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) według instrukcji producenta. Wszystkie inkubacje komórek owadów prowadzono w 28°C. Pokrótce, 2 ml hodowli komórek Sf9 transfekowano 5 μί rekombinowanego Bacmidu przy użyciu CellFECTIN (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Nadsącz zebrano 60 godzin po transfekcji i zastosowano do zakażenia 100-200 ml hodowli 1x10⁶ komórek Sf9/ml w pożywce Grace'a (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Nadsącz zebrano, według instrukcji producenta, w 48-60 godzin po zakażeniu, odwirowano przy 5000 obrotach na minutę w wirówce Sorvall® RC-5B przy użyciu rotora GSA (DuPont Instrument Co., Willmington, DE) i badano na miano wirusa (zwykle otrzymywano >1x10⁸ pfu/ml). W celu wytwarzania białka, 2-3x106 komórek Sf9/ml w 500 ml pożywki SF900II (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) zakazano w wielokrotności zakażenia równej 4-10 i zbierano nadsącz po 60-72 godzinach od zakazenia, przez odwirowanie przy 5000 obrotach na minutę w wirówce Sorvall® RC-5B przy użyciu rotora GSA (DuPont Instrument Co., Willmington, DE) i filtrowano przez sterylny filtr 0,2 Mm.

Przykład 2. Oczyszczanie mutein.

Przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-4 C400.1 i C400.17 wytworzono stosując standardowy protokół, na myszach przy użyciu ludzkiej rekombinowanej IL-4 (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA) jako immunogen, wytworzono jako płyn wysiękowy, oczyszczono i sprzęgnięto z Sepharozą aktywowaną CNBr (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) według instrukcji producenta. Nadsącz komórek Sf9 wytworzony przez zakażenie komórek Sf9 rekombinowanym baculowirusem zawierającym odpowiednią muteinę IL-4 wprowadzono do 1 ml kolumny złoża o powinowactwie do IL-4, płukano 100 mM NaHC O3, 500 mM NaCl, pH 8,3, płukano wodą w celu usunięcia soli i eluowano 8 objętościami kolumny 100 mM Glicyny, pH 3,0. Frakcje zebrano do silikonowanych probówek zawierających 0,1 objętość 1 M Tris, pH 8,0. Białko muteiny dalej oczyszczano przez chromatografię w odwróconych fazach stosując kolumnę Dynamax®-300 A C18 (Rainin Instrument Co. Woburn, MA) objętość gradientem 0-100% Bufora A do Bufora B (Bufor A, woda; Bufor B, acetonitryl, 0,1% kwas trifluorooctowy). Frakcje badano przez SDS-Page i liofilizowano frakcje zawierające muteinę w celu dalszego przechowywania, i rozpuszczano w sterylnym roztworze soli buforowanym fosforanem do testów. Oczyszczona w ten sposób muteina w SDS-PAGE stanowiła zwykle pojedynczy prążek (barwiony srebrem) i oznaczano ją ilościowo przez analizę aminokwasów dokładność zwykle >90%).

Przykład 3. Test proliferacji 1⁰ limfocytów T.

Pierwotne limfocyty T otrzymano ze świeżej krwi normalnych dawców i oczyszczano przez odwirowanie z użyciem Ficoll-Paque® Plus (Pharmacia, Upsalla, Szwecja) zasadniczo jak to opisano w Kruse i in., Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by single amino acid replacement, EMBO J. 11:3237-44 (1992)). Oczyszczone komórki jednojądrzaste krwi obwodowej inkubowano przez 7 dni z 10 Mg/ml fitohemaglutyniny (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), zebrano przez odwirowanie i płukano w pożywce RPMI 1640 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). 5x10⁴ aktywowanych limfocytów T/studzienkę (blasty PHA) inkubowano w różnych ilościach IL-4 albo muteiny, w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% surowicę płodową bydlęcą, pH 7,5, 2 mM L-glutaminę, 100 jednostek/ml penicyliny G i 100 Mg/ml siarczanu streptomycyny w 96-studzienkowych płytkach przez 72 godziny w 37°C, pulsowano 1 mCi ³H-tymidyny (DuPont NEN®, Boston, MA)/studzienkę przez 6 godzin, zebrano i mierzono radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym TopCount™ (Packard Instrument Co., Meriden, CT).

187 846

Przykład 4. Test wydzielania IL-6 przez HUVEC.

Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) otrzymano z Clonetics® Corp. (San Diego, CA) i utrzymywano według instrukcji producenta. Komórki (pasaż od 3 do 6) zebrano przez inkubację z trypsyną/EDTA, płukano i wysiano w gęstości osiągającej zlewność w 48-studzienkowych płytkach w pożywce EGM® (Clonetics® Corp. San Diego, CA), zawierającej ekstrakt bydlęcego mózgu (BBE, Clonetics® Corp. San Diego, CA). Po osiągnięciu zlewności (3-4 dni w 37°C) pożywkę usunięto i zastąpiono pożywką EGM® bez BBE. 24 godziny później, do komórek dodano różne stężenia IL-4 albo muteiny w świeżej EGM bez BBE i inkubowano przez dalsze 24 godziny. Nadsącze zebrano i analizowano stężenia IL-6 stosując ELISA dla ludzkiej IL-6. Warunki były identyczne z takim wyjątkiem, ze w testach antagonistów różne stężenia mutein dodawano do stałego stężenia IL-4 równego 100 pM. Pokrótce, 96-studzienkowe płytki Immulon®2 (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, Va) pokryto 5 pg/ml przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiej IL-6 (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA) #1618-01, przez noc w 4°C. Standard ludzkiej IL-6 (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA) albo próbki miareczkowano w podwójnym powtórzeniu i inkubowano na pokrytych płytkach; po płukaniu dodano wtórne poliklonalne królicze przeciwciało przeciwko ludzkiej IL-6 (Caltag Laboratories, South San Francisco, CA, nr kat. PS-37) w rozcieńczeniu 1:1000. Obecność związanych króliczych przeciwciał przeciwko ludzkiej IL-6 wykrywano stosując ośle przeciwciała przeciwko króliczym Ig sprzęgnięte z fosfatazą alkaliczną (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, nr kat. 711-055-152), rozcieńczone 1:2000 i wykrywano stosując pNPP (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO, nr kat. N2770 albo N1891). Absorbancję odczytywano przy długości 405 nm stosując kinetyczny czytnik płytek Vmax™ (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA).

Przykład 5. Aktywności mutein.

Tabela 1 podsumowuje wyniki mutein w dwóch testach opisanych wyżej. „EC 50, pM” oznacza stężenie skuteczne, które daje 50% reakcji maksymalnej mierzonej w stężeniu pikomolamym. Aktywność jest funkcją zarówno siły (EC50) jak i reakcji maksymalnej (Rmax). Muteiny wybiórcze komórkowo wykazywały różną aktywność wyrażającą się względnym zmniejszeniem Rmax i/lub względnym zmniejszeniem siły (wzrost EC50) w teście HUVEC w porównaniu z testem z limfocytami T. „Rmax, %wt” oznacza maksymalną reakcję mierzoną względem IL-4 typu dzikiego. Z definicji, IL-4 typu dzikiego dawała 100% reakcji. Wszystkie muteiny były aktywne w teście proliferacji limfocytów T. Muteiny R121D, R121E, R121P oraz R121 t/E 122F/Y124Q były silniejsze niż IL-4 typu dzikiego w tym teście, jednakże muteina R121t/E122F/Y124Q wykazywała zmniejszoną reakcję maksymalną. Muteiny Y124Q, Y124R i Y124A/S125A wykazywały 2-3-krotny wzrost wartości EC 50 w porównaniu z typem dzikim, jak również zmniejszoną reakcję maksymalną. Jednakże, wydają się zachowywać istotną proporcję aktywności IL-4 na limfocytach T. Muteiny R121E, Y124Q i R121T/W122F/Y124Q nie wykazywały mierzalnej aktywności w teście HUVEC, co czyni z nich wybiórcze wobec IL-4, a więc czyni je wyraźnie wybiórczymi wobec limfocytów T, tak więc, wybiórcze wobec receptora IL-4, a stąd wybiórcze wobec receptora IL-4 wyrażanego na limfocytach T (IL-4Ra/IL-Ry). Muteiny te są antagonistami komórek śródbłonka ponieważ oddziałują normalnie z IL-Ra, nie aktywują kompleksu IL-4Ra/podjednostka przypominająca y. Muteiny R121P i Y124R wykazują aktywność wobec HUVEC, ale ich wartości EC50 są wskazane pomiędzy 50-150-krotnie i wykazują zmniejszenie maksymalnej reakcji względem ich zdolności do pobudzania limfocytów T. Jakkolwiek te dwa białka nie wydają się być całkowicie wybiórcze wobec limfocytów T, są one preferencyjne dla ich aktywacji receptora IL-4 u limfocytów T w stosunku do receptora IL-4 na HUVEC.

187 846

	Proliferacja 1° limfocytów T	HUYEC, wydzielenie IL-6
Muteina	EC50, pM	Rmax, %wt	EC50, pM	Rmax, %wt
IL-4 typu dzikiego	150	100	20	100
R121A	150	100	20	65
R121D	100	40	-	0
R121E	65	100	-	0
R121F	150	100	20	60
R121H	150	80	40	70
R121I	100	100	40	50
R121K	150	100	100	75
R121N	150	100	35	50
R121P	100	100	650	45
R121T	150	100	20	75
R121W	150	100	80	35
Y124A	150	50	65	50
Y124Q	250	15	200	25
Y124R	750	30	250	25
Y124S	425	15	350	20
Y124T	300	15	350	35
Y124A/S125A	600	60	200	30
R121T/E122F/Y124Q	15	13	-	0

Przykład 6. Reakcja biologiczna na muteiny IL-4 w teście z HUVEC.

Figury 2A i B pokazują szereg wykresów zależności od dawki wydzielania IL-6 z HUVEC przez agonistów wybiórczych wobec limfocytów T względem typu dzikiego. IL-4 włączono jako wewnętrzny standard na każdej płytce zastosowanej do zmierzenia aktywności muteiny, stanowiącej reprezentatywną krzywą: Fig. 4A stanowi krzywą reakcji na dawkę dla R12E w stosunku do IL-4 typu dzikiego. Podobnie, fig. 4B-F są krzywymi reakcji na dawkę dla, odpowiednio, R121P, Y124Q, Y124R, Y124A/S125A i R121T/E122F/Y124Q, w stosunku do IL-4 typu dzikiego. Aktywności normalizowano względem reakcji kontrolnych na IL-4. Muteiny R121E, Y124Q i R121T/E122F/Y124Q nie wykazywały aktywności w tym teście. Muteiny R121P i Y124R, jakkolwiek wykazujące częściowo aktywność agonistyczną w tym teście, są względnie słabsze od IL-4 typu dzikiego niż w teście z 1° limfocytami T. Tak więc, mimo ich aktywności, wykazują wybiórczą aktywację receptora IL-4 limfocytów T.

187 846

Przykład 7. Reakcja biologiczna mutein IL-4 w teście z 1° limfocytami T.

Figury 4A i B pokazują krzywe reakcji na dawkę mutein agonistycznych, wybiórczych wobec limfocytów T w reprezentatywnym teście z użyciem komórek od normalnych dawców. IL-4 włączono jako kontrolę wewnętrzną w każdej płytce w celu badania aktywności muteiny; pokazano reprezentatywne krzywe. Fig. 6 A jest krzywą reakcji na dawkę dla R12E w stosunku do IL-4 typu dzikiego. Podobnie, fig. 6B-F są krzywymi reakcji na dawkę dla, odpowiednio, R121P, Y124Q, Y124R, Y124A/S125A i R121T/E122F/Y124Q, w stosunku do IL-4 typu dzikiego. Aktywności normalizowano względem reakcji kontrolnych na IL-4. Muteiny R121E, R121P i R121 T/E 122F/Y124Q są silniejsze niż IL-4 typu dzikiego, jakkolwiek R12łT/E122F/Y124Q jest tylko częściowym agonistą w tym teście. Mimo iz nie tak silne jak IL-4 typu dzikiego w tym teście, muteiny Y124Q, Y124R i R121T/E122F/Y124Q są skutecznymi częściowymi agonistami (wartości Rmax rzędu 60-70% typu dzikiego). Na fig. 6, aktywność jest względna w stosunku do reakcji na IL-4 obserwowana na tej samej płytce dla każdej z mutein. Szczególnie warte odnotowania są muteiny R121E i Y124Q, które wykazują istotną aktywność w teście z limfocytami T, zaś brak aktywności w teście HUVEC. Każda z tych mutein jest wyraźnym agonistą wybiórczym wobec limfocytów T.

Przykład 8. Antagonizm wydzielania IL-6 przez HUVEC pobudzane IL-4 przez muteiny wybiórcze wobec limfocytów T.

Muteiny IL-4 wybiórcze wobec limfocytów T R121E (•) i Y124Q (V) oraz antagonista IL-4 R121DfY124D(O) (fig. 7) miareczkowano wobec stałego stężenia 100 pM IL-4. Antagonista IL-4 R121D/Y124D antagonizował IL-4 ze stałą Ki rzędu 1,5 nM w tych warunkach. HUVEC nie wyrażały IL-2Ry, ale wyrażały podjednostkę receptora IL-4 przypominającą y. Zastąpione reszty R121E i Y124Q znajdują się na helisie D IL-4, a więc zakłócają jedynie oddziaływanie IL-4 z IL-2Ry (oddziaływanie funkcjonalne), zaś podjednostka przypominająca y (oddziaływanie niefunkcjonalne) nie zakłóca oddziaływania mutein z IL-4Ra. Tak więc, agoniści wybiórczy wobec limfocytów T R121E i Y124Q dzięki zdolności do wybiórczego oddziaływania z IL-2Ry na limfocytach T bez aktywowania, podjednostki przypominającej y na komórkach śródbłonka są zdolni do współzawodnictwa z reakcją wywołaną IL-4 na komórkach śródbłonka (Kj rzędu 08-1,0 nM). Taki antagonizm przez muteiny IL-4 wybiórcze wobec limfocytów T może antagonizować efekty endogennie wytwarzanej IL-4 na komórkach śródbłonka podczas leczenia skierowanego na IL-4 przy użyciu tych mutein.

Przykład 9. Aktywność biologiczna muteiny IL-4 R121D.

Muteinę IL-4 R121D (Arg-121 zastąpiona przez Asp) wytworzono jak to opisano i badano w testach z 1° limfocytami T 1 HUVEC. W odniesieniu do fig. 8A i 8B, pokazano dane dla IL-4 (O) i R121D (•) w testach z limfocytami T (fig. 8 A) i HUVEC (fig. 8B). W teście z limfocytami T, R121D wykazywała EC50 równą około 100 pM zaś wartość Rmax równą około 60% względem IL-4 typu dzikiego. Była nieaktywna w teście z HUVEC (EC50 = ®; Rmax = O). Wartości te pokazują, ze pojedyncze zastąpienie Arg-121 ludzkiej IL-4 przez Asp daje białko, które wykazuje wybiórczą aktywność wobec limfocytów T i pozbawione jest zauwazalnej aktywności wobec komórek śródbłonka. Jakkolwiek muteina R121D jest częściowym agonistą w teście z limfocytami T, jest silniejsza niż IL-4 typu dzikiego. Jednakże, podobnie jak muteina R121E, R121D nie wykazuje aktywności w teście z HUVEC, wskazując, ze jest agonistą wybiórczym wobec limfocytów T.

Przykład 10. Aktywność biologiczna muteiny IL-4 T13D/R121E.

Muteinę T13D/R121E (Thr-13 zastąpiona przez Asp i Arg-121 zastąpiona przez Glu) wytworzono jak to opisano i badano w teście z 1° limfocytami T i HUVEC. W odniesieniu do figur 9A-B, w teście z limfocytami T (Panel A) T13D/R121E (♦) wykazywała EC50 równą około 100 pM, około 2-3 krotnie lepiej niż IL-4 (O) albo R121D (A), zaś wartość Rmax wynosiła 100% względem IL-4. W teście antagonistów HUVEC (Panel B) T13D/R121E (♦) była około 27-krotnie silniejszym antagonistą Ł-4 niż R121D (A) wykazując EC50 równą około 2,2 nM wobec około 60 nM. Zastąpienie Thr-13 przez Asp zwiększa siłę T13D/R121E względem R121E (zarówno jako agonisty w teście z limfocytami T, jak i w teście antagonizmu z HUVEC), podczas gdy zastąpienie Arg-121 przez Glu zapewnia aktywność swoistą wobec limfocytów T T13D/R121E (pełny agonista w teście z limfocytami T, antagonista IL-4 w teście z HUYEC)

187 846

Przykład 11. Badanie agnzisty wybiórczego wobec IL-4 w modelu patologii.

Dorosłe małpy cynomplgus (Macaca fasicularis, Charles River Primate Imports, Boston, Mass.) ważące około 4-6 kg wykorzystano w tych badaniach. Zwierzęta trzymano osobno w pomieszczeniach o środowisku koztrolowaznm w klatkach i dostarczano im pożywienie dwa razy dziennie i wodę ad libitum. Każde ze zwierząt głodzono przez około 12 godzin przed badaniem.

Do każdego badania zwierzęta usypiano przez domięśniowe wstrzyknięcie chlorowodorku ketaminy (Ketaset, 10 mg/kg). Górną powierzchnię grzbietu każdego ze zwierzą golono i przemywano roztworem betainy w 70% alkoholu. IL-4, wybiórczego agonistę IL-4 albo nośnik (0,2% albumina surowicy ludzkiej) wstrzykiwano śródskómie w grzbiet zwierząt w objętości 0,1 ml, stosując strzykawkę tuberkulinową. Miejsca wstrzyknięcia oddzielano co najmniej o 10 cm i szakowkzo markerem niecmnwklznm. Próbki tkanek otrzymano stosując biopsję igłową 6 mm, po czym umieszczano próbki w OCT i gwałtownie zamrazano stosując ciekły azot. Biopsje pobierano w 0, 4, 8 i 24 godcizn po wstrzyknięciu.

Reakcję układową na IL-4, agonistę wybiórczego wobec Ł-4 albo nośnik oceniano w następujący sposób. Badaną substancję podawano dwa razy dziennie (co około 10-12 godzin) przez 5 kolejnych dni w objętości 0,1 ml/kg w dawkach po 0, 2,5, 25 i 250 (ig/kg co dawało dzienną dawkę równą 0, 5, 50 i 500 pg/kg. Próbkę krwi obwodowej otrzymano od każdego ze zwierząt przed pierwszym wstrzyknięciem nośnika albo IL-4, oraz na początku każdego dnia badania i próbki azalicowkzo pod względem liczby komórek oraz analizą cytometrii przepływowej na znacznik na powierzchni komórek. Pozostałość próbki krwi wirowano i porcje osocza przechowywano w -70°C do dalszej analizy poziomu ^mokin.

Zamrożone skrawki preparowano i pozostawiono do wyrównania się temperatury, suszono na powietrzu i utrwalano w acetonie w 4°C przez 5 minut. Szkiełka przeniesiono do 10 mM PBS z 0,1% BSA przez 5 minut. VCAM-1 lokalizowano przy użyciu C313.3, przeciwciała mozoklozalnego przeciwko ludzkim VCAM-1. Jako kontrolę negatywną zastosowano nie związane przeciwciało o tym samym izotypie. Endogenną biotynę zablokowano stosując zestaw Vector Biotin (Vector Laboratories Burlingame., CA). Skrawki inkubowkzo przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w nawilżanej komorze ze wskazanymi surowicami odpornościowymi rozcieńczonymi w PBS 0,1% BSA i 1% normalną surowicą króliczą. Po trzech płukmiach, w PBS, skrawki barwiono zestawem Vector ABS Elite, według instrukcji producenta oraz koziugatzm przeciwciała wykrywano przez izkubowazie szkiełek w 3-kmizo-9-etnlokarOa-solo/zadtlenku wodoru (zestaw substratów AEC, Vector). Skrawki płukano w 0,1 M buforze octanowym, płukano w wodzie destylowanej i zatapiano w Lemer Aą^-Mount (Lemer Laboratories, Pittsburgh, PA).

Próbki oceniało dwóch niezależnych obserwatorów w sposób zakodowany, stosując zestaw ocen od 0 do 3+, prcezzaczozn do oceny intensywności jak również rozmieszczenia znakowania. Układ ocen dla ekspresji VCAM-1 wygląda następująco: 0, brak albo słabe barwienie niektórych naczyń; 1+, słabe barwienie niektórych naczyń; 2+, umiarkowane barwienie większości naczyń; 3+ intensywne barwienie większości naczyń. Naczynia krwionośne identyfikuje się w szeregu skrawków barwionych na czynnik voz Willebrandta (poliklonalne królicze przeciwciała przeciwko ludzkim VWF; Dakopatts, Ckraiateria, CA).

Analiza liczby erytrocytów, hematokryt, liczbę leukocytów i płytek przeprowadzono na hepkrnnisowannch próbkach krwi kZklisatorem Serono 9000 Blood A^yzer (Baker Diagnostics, Alleatowa, PA). Różnice w leukocytach badano rozmazami krwi barwionymi Quick-Diff, na około 2000 komórek i procenty każdego z rodzajów komórek zarejestrowano.

Analizę znaczników powierzchniowych jedzojądrskstych komórek krwi obwodowej (PBMC) przeprowadzono w następujący sposób. 4-ml próbkę krwi heparnzizpwkzej rozcieńczono w roztworze soli Hank'a (HBSS, bez Mg²⁺ albo Ca²⁺) i nawarstwiono na 4 ml Percolru (gęstość 1,070 g/ml). Probówki wirowano przy 1800 obrotów na minutę (Beckman, GS-6R) przez 20 minut w 1100 obrotów w 24°C Limfocyty w warstwie pobrano i odwirowano przy 1100 obrotów na minutę przez 10 minut. Powstały osad zawieszono w 6 ml roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS) zawierającego 0,1% azydek i 5% surowicę kozią. Porcje po 1 ml wykorzystano do kaklizn zaacsmków powierzchniowych jak opisano niżej.

187 846

Przeciwciała przeciwko CD2, CD4, CD8, CDI lb, CD16, CD25, CD49 i HLA-DR (R&D Systems, Minneapolis, MN) wykorzystano do analizy cytometrią przepływową. 20 (il przeciwciał inkubowano z 1 ml porcją zawiesiny komórek w ciemności przez 60 minut w 4°C i prówbki odwirowano (1000 obrotów na minutę 10 w 4°C). Osad płukano trzykrotnie po 1 ml PBS zawierającego 0,1% azydek i 5% surowicę kozią, a następnie analizowano przez FACS.

Osocze uzyskane podczas badania analizowano pod względem poziomu MCP-1 w teście ELISA. Pokrótce. 96-studzienkowe płytki (Nunc, Kamstrup, Dania) pokryto przy użyciu 50 (d/studzienkę króliczym przeciwciałem przeciwko MCP-1 przez 16 godzin w 4°C i płukano PBS, pH 7,5, 0,05% Tween-20 (bufor do płukania). Miejsca wiązania nieswoistego zablokowano 2% BSA w PBS (200 (il) i inkubowano płytki przez 90 minut w 37°C. Płytki przepłukano trzykrotnie buforem do płukania i rozcieńczono (nierozcieńczony, 1:5 i 1:10) próbki badane (50 (il) w podwójnym powtórzeniu, a następnie inkubowano przez godzinę w 37°C. Płytki płukano trzykrotnie i dodano 50 μΐ/studzienkę biotynowanego króliczego przeciwciała przeciwko MCP-1 przez 45 minut w 37°C. Płytki płukano 4-krotnie i dodano 100 (il substratu chromogennego (0,67 mg/ml dichlorek ortofenyloetylenodiaminy). Płytki inkubowano w 25°C przez 6 minut i zatrzymano reakcję przy użyciu 50 pEstudzienkę 3 M H2SO4 w buforze do płukania z dodatkiem 2% FCS. Płytki odczytywano przy długości fali 490 nm w czytniku ELISA. Standartami były 0,5 log. rozcieńczenia rekombinowanej MCP-1 od 100 ng/ml do 1 pg/ml (50 pl/studzienkę). ELISA wykrywała MCP-1 w stężeniu > 50 pg/ml.

Przykład 12. Leczenie stwardnienia rozsianego wybiórczym agonistą IL-4.

Zastosowanie zwierzęcego modelu jako wskaźnika przydatności farmakologicznej u ludzi jest uznanym narzędziem badawczym. Wstępne badanie wybiórczego agonisty IL-4 jako leku w stwardnieniu rozsianym przeprowadzono na modelu marmozety wykorzystując białko rekombinowanego, ludzkiego, wybiórczego agonisty IL-4. Badania te przeprowadzono w celu sprawdzenia efektu profilaktycznego i leczniczego na wywołanie choroby i na nasilenie zarówno ostrych objawów jak i przebiegu przewlekłej choroby z remisjami i nawrotami.

Doświadczalne, autoagresyjne zapalenie opon mózgowych i mózgu (EAE) jest autoagresyjną, zapalną chorobą ośrodkowego układu nerwowego, w której biorą udział limfocyty T CD4+. U małp gatunku marmozeta ważących od 300 do 400 g wywoływano indukcję EAE przez immunizację 200 mg homogenatu istoty białej (BH) zamrozonego bezpośrednio po śmierci ludzkiego mózgu z kompletnym adjuwantem Freunda (CFA) zawierającym 3 mg/ml zabitych Mycobacterium tuberculosis jak opisano przez Massacesi i in., Ann. Neurol. 37:519 (1995). W dniu immunizacji i powtórnie po 2 dniach podano dożylnie IO^W inaktywowanych komórek bakterii Bordetella pertussis w 10 ml roztworze.

EAE oceniano stosując kryteria kliniczne i patologiczne. Wykorzystywano standaryzowany układ punktacji dla oceny nasilenia objawów klinicznych choroby. 0 = prawidłowe badanie neurologiczne; 1 = letarg, brak apetytu, utrata wagi; 2 = ataksja i zarówno porażenie dwu- lub jednokończynowe, utrata czucia lub zespół pniowy obejmujący porażenie widzenia, jak i ślepotę; 3 = niedowład jedno- lub dwukończynowy; 4 - niedowład całkowity.

Okazało się, że rezonans magnetyczny (MRI) jest przydatną techniką do zobrazowania wczesnych i późnych wywołanych autoagresją uszkodzeń w MS (Stewart i in., Brain, 114:1069 (1991)). MRI jest przydatny do oceny zwierząt po immunizacji i do monitorowania przebiegu choroby. Dane MRI uzyskiwano w systemie Picker International NMR Crogenic „2000”, stosując pole o natężeniu 0,15 Tesli; cewka odbiorcza do uzyskiwania obrazów o otworze o średnicy 15 cm. Zastosowano wielowarstwowe spin-echi i sekwencje impulsów odwróconego powrotu Czas opóźnienia zarówno 40 i 60 ms, jak i 40 i 80 ms w sekwencjach spin-echo. Opóźnienie przerwy między impulsami 180-90 sekwencji odwróconego powrotu wynosiło 400 ms.

Marmozety usypiano chlorowodorkiem ketaminy i umieszczano w skanerze wykorzystując laser dla prawidłowego ułożenia pacjenta, takiego aby wewnętrzny kąt oka był prostopadły do statycznego pola magnetycznego. Zwierzęta skanowano przed immunizacją i następnie codziennie rozpoczynając od 9 dnia immunizacji. Codziennie przed skanowaniem zwierzęta badano w celu znalezienia uszkodzeń neurologicznych.

Zwierzęta zabijano w różnym czasie po immunizacji. Usuwano ośrodkowy układ nerwowy (CNS) i umieszczano go w 10% formalinie. Parafinowe skrawki mózgu i rdzenia kręgowego

187 846 preparowano i barwiono hematoksyliną z eozyną. Każdy poprzeczny przekrój mózgu i rdzenia kręgowego oceniano w kierunku histopatologicznych cech zapalenia i demielinizacji z zgodnie z przyjętą skalą: zapalenie; 0 = brak cech zapalenia; + = niewiele mankietów okołonaczyniowych/średni przekrój; ++ = umiarkowana ilość mankietów okołonaczyniowych/przekrój, możliwe cechy zapalenia opon mózgowych; +++ = liczne rozsiane mankiety okołonaczyniowe i śródmiąższowy naciek komórek zapalnych. Ocena demielinizacji: 0 = brak demielinizacji; + = nieliczne ogniska demielinizacyjne; ++ = umiarkowana demielinizacja; +++ = nasilona demielinizacja ze zlewnymi uszkodzeniami.

W badaniach przedobjawowego ostrego stanu chorobowego badany lek podawano podskórnie w dawce między 1 a 500 pg/kg, po którym następował schemat dawkowania od 1 dawki dziennie do 1 dawki tygodniowo przed wystąpieniem objawów chorobowych. W celach interwencji terapeutycznej istniejącej choroby badaną substancję podawano podskórnie w dawce od 1 do 500 (ig/kg, po którym następował schemat dawkowania od 1 dawki dziennie do 1 dawki tygodniowo przez okres kilku miesięcy.

Przykład 13. Leczenie reumatoidalnego zapalenia stawów.

Reumatoidalne zapalenie stawów jest zapalną upośledzającą chorobą, w której przewlekła aktywacja rezydujących i naciekających synowiocytów powoduje zniszczenie chrząstki i więzadeł i prowadzi do zwłóknienia i utraty funkcji. Cytokiny uwolnione z aktywowanych limfocytów T odgrywają rolę w utrzymaniu przewlekłego stanu zapalnego.

RA jest indukowana u myszy DBA/1 przy użyciu kolagenu typu II co opisano przez Joosten i in., Arth. Rheumat. 39:797 (1996). Zapalenie stawów wywołane kolagenem (CIA) indukowane jest przez immunizowanie myszy przez wstrzyknięcie podskórne w podstawę ogona 100 μ.1 emulsji zawierającej 100 pg kolagenu. Dnia 21 zwierzętom podaje się dootrzewnowo kolagen typu II (100 pg) rozpuszczony w PBS.

Oceny CIA dokonuje się przez badanie wizualne myszy pod kątem występowania zapalenia stawów obwodowych i ocenę ciężkości zapalenia stawów. Myszy uważa się za chore na zapalenie stawów, gdy istotne zmiany zaczerwienienia i/lub obrzęku zauwaza się na palcach i innych częściach minimum 2 kończyn.

Kliniczna ciężkość zapalenia stawów oceniana jest w skali 0-2 dla każdej łapy według zmian w zaczerwienieniu i obrzęku (0 = brak zmian, 0,5 = istotne, 1,0 = umiarkowane, 1,5 = znaczne i 2,0 = ciężkie). Ocena dokonuje się przez co najmniej dwóch nie poinformowanych obserwatorów.

Na zakończenie badania, niektóre ze zwierząt zabija się i wykorzystuje łapę i stawy do badania patologicznego i histopatologicznego. Tkanka poddawana jest obróbce do barwienia immunohistochemicznego (skrawki mrożone) i utrwalania i zatapiana w parafinie, skrawana i barwiona HE w celu analizowania nacieku komórkowego.

Badanie mysiego analogi agonisty wybiórczego względem IL-4 według wynalazku w modelu CIA przeprowadza się przez zastosowanie mysiego zamiennika cząsteczki białka. Specjalista może porównać budowę mysiej IL-4, wytworzyć model muteiny mysiej IL-4 i dokonać koniecznych poprawek w oparciu o testy in vitro z wykorzystaniem komórek wyrażających IL-4Ra/IL-2Ry albo IL-4Ra/podjednostkę przypominającą y, w sposób analogiczny do zastosowanego do zastosowania muteiny ludzkiej IL-4 z limfocytami T i HUVEC. Zwierzętom podaje się jedną dawkę przed podaniem dawki przypominającej kolagenu i utrzymuje dawkowanie od jednej dawki dziennie do jednej na tydzień przez czas trwania (ponad 40 dni) Zwierzęta otrzymują dawki IL-4 w zakresie od 1 do 100 pg/kg.

Przykład 14. Leczenie cukrzycy insulinozaleznej (IDDM).

Istnieją dowody na związek limfocytów Thl z IDDM u ludzi i w modelach zwierzęcych choroby ludzkiej. Nieotyłe (NOD) myszy wykorzystuje się do badania skuteczności zamienników mysiej IL-4 agonisty wybiórczego w leczeniu IDDM. Specjalista jest w stanie porównać budowę mysiej IL-4 z budową ludzkiej IL-4, wytworzyć muteiny mysiej IL-4 i dokonać niezbędnych poprawek w oparciu o reakcje w testach in vitro z wykorzystaniem linii komórkowych wyrażających IL-4Ra/IL-2Ry albo IL-4Ra/podjednostkę przypominającą y, w sposób analogiczny do zastosowanego do zastosowania muteiny ludzkiej IL-4 z limfocytami T i HUVEC. Myszy NOD (w wieku około 7 tygodni) wykazują brak reakcji proliferacyjnej in vitro po

187 846 pobudzeniu limfocytów T. Ograniczony brak reakcji proliferacyjnej nie jest związany z cukrzycą i trwa do momentu wystąpienia cukrzycy, co następuje w 24 tygodniu życia.

Badanie wybiórczego agonisty IL-4 na myszach NOD przeprowadza się w sposób podobny do badań opisywanych przez Rapoporta i in., J. Exp. Med. 178:87 (1993). Myszom NOD wstrzykuje się badaną substancję w wieku około 3 tygodni a następnie stosuje się schemat leczenia jedną dawką dziennie albo jedną dawką na tydzień przez 12 tygodni dopóki myszy nie osiągną 15 tygodni. Grupa kontrolna zwierząt otrzymuje leczenie nieaktywnym białkiem.

Myszy bada się na glikozurię stosując Tes-Tape i bada w kierunku cukrzycy przez określanie glikozurii przez co najmniej dwa kolejne tygodnie. Na zakończenie 52 tygodnia, zwierzęta się zabija w celu pozyskania różnych narządów i tkanek do badania patologicznego. Tkanki z trzustki, gruczołów ślinowych podżuchwowych i nerek od wszystkich myszy utrwala się i zatapia w parafinie, skrawa i barwi. W celu badania zahamowania nacieków komórek β w trzustce stosuje się barwienie fuksyną aldehydową. Śledzionowe leukocyty liczy się w analizie FACScan stosując przeciwciała przeciwko Thl .2, przeciwko CD4 i przeciwko CD8 jak to opisano w Zipris i in., J. Immunol. 146:3763 (1991)

Inne wykonania wynalazku staną się oczywiste dla specjalisty. Wynalazek naucza jak otrzymać muteiny nie konkretnie tu opisane, ale takie które mają zdolność aktywowania limfocytów T i zmniejszoną zdolność aktywacji komórek śródbłonka, stając się muteinami w zakresie wynalazku. Pomysł i podejście doświadczalne powinno nadawać się do zastosowania w dowolnej cytokinie wykorzystującej hetrologiczny układ receptorów podjednostkowych, w szczególności IL-2 i pokrewne cytokiny (np. IL-7, IL-9 i IL-15), IL-10, interferon a i interferon y.

Claims (45)

Zastrzeżenia patentowe

1. Muteina ludzkiej IL-4 numerowana zgodnie z IL-4 typu dzikiego o aktywności pobudzającej limfocyty T, ale wykazująca zmniejszoną aktyWność pobudzającą komórki śródbłonka.

2. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 1, znamienna tym, że reszty powierzchniowe helisy D IL-4 typu dzikiego zostały zmutowane w taki sposób, że powstała muteina powoduje proliferację limfocytów T oraz zmniejszone wydzielanie IL-6 z HUVEC, względem IL-4 typu dzikiego.

3. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 2, znamienna tym, że pozycja 121 jest zastąpiona w porównaniu z typem dzikim.

4. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona alaniną.

5. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona kwasem asparaginowym.

6. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona kwasem glutaminowym.

7. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona fenyloalaniną.

8. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona histydyną.

9. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona izoleucyną.

10. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona lizyną.

11. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona asparaginą.

12. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona proliną.

13. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona treoniną.

14. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 3, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona tryptofanem.

15. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 2, znamienna tym, ze pozycja 124 jest zastąpiona w porównaniu z typem dzikim.

16. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 15, znamienna tym, ze dana pozycja została zastąpiona alaniną.

17. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 15, znamienna tym, ze dana pozycja została zastąpiona glutaminą.

18. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 15, znamienna tym, ze dana pozycja została zastąpiona argininą.

19. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 15, znamienna tym, ze dana pozycja została zastąpiona seryną.

20. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 15, znamienna tym, że dana pozycja została zastąpiona treoniną.

21. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 2, znamienna tym, ze pozycje 124 i 125 są zastąpione w porównaniu z typem dzikim.

22 Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 21, znamienna tym, ze obie pozycje 124 i 125 zostały zastąpione alaniną.

187 846

23. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 2, znamienna tym, że pozycje 121, 122 i 124 są zastąpione w porównaniu z typem dzikim.

24. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 23, znamienna tym, że pozycja 121 została zastąpiona treoniną, pozycja 122 została zastąpiona fenyloalaniną, zaś pozycja 124 została zastąpiona glutaminą.

25. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 1, znamienna tym, że oprócz tego obejmuje przynajmniej jedno zastąpienie aminokwasu na powierzchni wiążącej helisy A albo C IL-4 typu dzikiego, w taki sposób, że muteina wiąże receptor IL-4Ra z powinowactwem przynajmniej większym niz natywna IL-4.

26. Muteina ludzkiej IL-4 według zastrz. 25, znamienna tym, że pozycja 13 została zastąpiona kwasem asparaginowym, zaś pozycja 121 została zastąpiona kwasem glutaminowym.

27. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje skuteczną ilość muteiny ludzkiej IL-4 numerowanej zgodnie z IL-4 typu dzikiego o aktywności pobudzającej limfocyty T, ale wykazującej zmniejszoną aktywność pobudzającą komórki śródbłonka w kombinacji z nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie.

28. Cząsteczka polinukleotydu kodująca muteinę ludzkiej IL-4 według zastrz. 1 i jej zdegenerowane odmiany.

29. Komórka gospodarza transformowana polinukleotydem według zastrz. 28.

30. Wektor obejmujący Polinukleotyd według zastrz. 28, kierujący ekspresją muteiny ludzkiej IL-4 o aktywności pobudzającej limfocyty T, ale wykazującej zmniejszoną aktywność pobudzającą komórki śródbłonka i umożliwiający transfekcję organizmu docelowego, a następnie ekspresję in vivo muteiny ludzkiej IL-4 kodowanej przez wymieniony Polinukleotyd.

31. Sposób selekcjonowania muteiny ludzkiej IL-4 numerowanej według IL-4 typu dzikiego o aktywności pobudzającej limfocyty T, ale wykazującej zmniejszoną aktywność pobudzającą komórki śródbłonka, znamienny tym, ze obejmuje mutowanie reszt powierzchniowych helisy D IL-4 typu dzikiego w taki sposób, że powstała muteina powoduje proliferację limfocytów T oraz zmniejszone wydzielanie IL-6 z HUVEC, względem IL-4 typu dzikiego.

32. Zastosowanie muteiny ludzkiej IL-4 numerowanej zgodnie z IL-4 typu dzikiego o aktywności pobudzającej limfocyty T, ale wykazującej zmniejszoną aktywność pobudzającą komórki śródbłonka do wytwarzania leku do leczenia chorób podatnych na leczenie IL-4.

33. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że stanem podatnym na leczenie IL-4 jest choroba autoimmunizacyjna.

34. Zastosowanie według zastrz. 33, znamienne tym, ze stanem autoimmunizacyjnym jest stwardnienie rozsiane.

35. Zastosowanie według zastrz. 33, znamienne tym, że stanem autoimmunizacyjnym jest reumatoidalne zapalenie stawów.

36. Zastosowanie według zastrz. 33, znamienne tym, że stanem autoimmunizacyjnym jest insulinozależna cukrzyca.

37. Zastosowanie według zastrz. 33, znamienne tym, ze stanem autoimmunizacyjnym jest układowy toczeń rumieniowaty.

38. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, ze stanem podatnym na leczenie IL-4 jest choroba zakaźna.

39. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, że chorobą zakaźną jest choroba z Lyme.

40. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że stanem podatnym na leczenie IL-4 jest choroba o polaryzacji Th1.

41. Zastosowanie według zastrz. 40, znamienne tym, ze chorobą o polaryzacji Th1 jest łuszczyca.

42. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że stanem podatnym na leczenie IL-4 jest nowotwór.

43. Zastosowanie według zastrz. 42, znamienne tym, ze nowotwór wybrany jest z grupy obejmującej ostrą białaczkę limfoblastyczną i chłoniak nie-Hodgkinowski.

187 846

44. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że stanem podatnym na leczenie IL-4 jest choroba chrząstki.

45. Zastosowanie według zastrz. 44, znamienne tym, ze chorobą chrząstki jest zapalenie kostno-stawowe.