PL188628B1

PL188628B1 - Zastosowanie oligonukleotydu specyficznego dla c-myc lub c-myb, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia przeszczepu naczyniowego

Info

Publication number: PL188628B1
Application number: PL96323046A
Authority: PL
Inventors: Andrew Zalewski; Yi Shi
Original assignee: Univ Jefferson
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2005-03-31
Also published as: US6323184B1; PL323046A1; AU5553296A; WO1996032966A1; DE69637593D1; EP0871496B1; HUP9800729A3; NO974824D0; CN1177615C; JP3958362B2; EP0871496A4; JPH11503911A; CZ330297A3; ATE400301T1; KR19990007864A; HU225244B1; HUP9800729A2; CA2215631A1; NO974824L; EP0871496A1

Abstract

1. Zastosowanie oligonukleotydu specy- ficznego dla c-myc lub c-myb, do wytwarza- nia kompozycji farmaceutycznej do leczenia przeszczepu naczyniowego. FIG. 1 PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie oligonukleotydu specyficznego dla c-myc lub c-myb, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia przeszczepu naczyniowego. Korzystnie wspomniany przeszczep naczyniowy wybrany jest z grupy obejmującej przetokę protetyczną, przetokę tętniczo-żylną, przetokę z żyły rodzimej, przeszczepy żylne, przeszczep allogeniczny poddany immunosupresji, heteroprzeszczep poddany immunosupresji oraz autogeniczny przeszczep żylny. Ponadto w korzystnym przypadku wspomniany przeszczep naczyniowy zapewnia miejsce dostępu do wykonania hemodializy, przy czym korzystnie miejsce dostępu do wykonania hemodializy jest wybrane z grupy obejmującej przetokę BresciaCimino. przetokę tabakierową, przetokę ramienno-głowową, przeszczep do hemodializy z PTFE, przeszczep bydlęcej tętnicy szyjnej i przeszczepy autogeniczne. W innym korzystnym wariancie wspomniany przeszczep jest wyciętą żyłą odpowiednią do przyjęcia przez człowieka, przy czym korzystnie wycięta żyła odpowiednia do przyjęcia przez człowieka jest wybrana z grupy obejmującej żyłę odpiszczelową, żyłę odpromieniową, żyłę odłokciową, żyłę ramieniową i żyłę udową. Korzystnie oligonukleotyd stosuje się w stężeniu od 10 do 200 μΜ. W jednym z korzystnych wariantów przedmiotowego wynalazku oligonukleotyd jest specyficzny dla c-myc, korzystnie zaś jest wybrany z grupy złożonej z oligonukleotydów o numerach identyfikacyjnych SEQ ID NO: 1, 6 i 7. W innym korzystnym wariancie realizacji przedmiotowego wynalazku oligonukleotyd jest specyficzny dla c-myb, korzystnie zaś jest oligonukleotydem o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 5. Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku wspomniany wyżej oligonukleotyd jest umieszczony we wszczepie lub w zbiorniku przeznaczonym do umieszczenia w tkance okołonaczyniowej, przy czym korzystnie zbiornik zawiera od 0,5 do 10 mg oligonukleotydu, zaś w możliwie korzystnym przypadku zbiornik umieszcza się po stronie żylnej miejsca dostępu do wykonania hemodializy. Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku wspomniany wyżej oligonukleotyd występuje, w co najmniej jednej warstwie przeszczepu naczyniowego, przy czym korzystn i e warstwa ta jest wybrana z grupy obejmującej warstwę śródbłonkową, mięśniówkę, przydankę i tkankę okołonaczyniową. a ponadto w korzystnym wariancie realizacji przedmiotowego wynalazku stężenie oligonukleotydu we wnętrzu komórki tej warstwy wynosi, co najmniej 1 μΜ.

Zastosowanie według przedmiotowego wynalazku jest szczególnie przydatne w przypadku zapobiegania niewydolności lub utraty drożności przeszczepów tętniczo-żylnych i żylnych, jak również nawrotu zwężenia naczyń, ostrego uszkodzenia naczyń, zazwyczaj po angioplastyde człowieka.

Zastosowanie według przedmiotowego wynalazku uzupełniono rysunkiem, który przedstawia przykłady działania oligonukleotydów stosowanych według wynalazku; przy czym:

na fig. 1 przedstawiono przykład tętniczo-zylnego przeszczepu przed i po unaczynieniu tętniczym oraz spadek drożności w zylnej części przeszczepu; na fig. 2a pokazano zdjęcie przekroju normalnej żyły świńskiej barwionej preparatem Verhoffa (powiększenie 10 x); na fig. 2b pokazano przekrój unaczynionej tętniczo żyły świńskiej barwionej preparatem Yerhoffa (powiększenie 5 x); na fig. 3a pokazano zdjęcie przekroju normalnej żyły świńskiej

188 628 barwionej czerwienią Sirius (powiększenie x 5); na fig. 3b pokazano zdjęcie przekroju unaczynionej tętniczo żyły świńskiej barwionej czerwienią Sirius (powiększenie x 5); na fig. 4a pokazano zdjęcie przekroju normalnej żyły świńskiej barwionej przeciwciałami względem a-aktyny (powiększenie x 10); na fig. 4b pokazano zdjęcie przekroju unaczynionej tętniczo żyły świńskiej barwionej przeciwciałami względem a-aktyny (powiększenie x 5); na fig. 4c pokazano zdjęcie przekroju normalnej żyły świńskiej barwionej przeciwciałami względem desminy (powiększenie x 10); na fig. 5a pokazano zdjęcie przekroju unaczynionej tętniczo żyły świńskiej barwionej przeciwciałami względem jądrowego antygenu mnożącej się komórki (PCNA) (powiększenie x 25); na fig. 5b pokazano zdjęcie przekroju unaczynionej tętniczo żyły świńskiej barwionej preparatem Verhoffa (powiększenie x 25); na fig. 5c pokazano zdjęcie przekroju unaczynionej tętniczo żyły świńskiej barwionej czerwienią Sirius (powiększenie x 25); na fig. 6a pokazano zdjęcie przekroju ludzkiej żyły z przeszczepu tętniczowieńcowego, barwionej preparatem Verhoffa (powiększenie x 5); na fig. 6b pokazano zdjęcie przekroju ludzkiej żyły z przeszczepu tętniczo-wieńcowego, barwionej czerwienią Sirius (powiększenie x 5); na fig. 6c pokazano zdjęcie przekroju ludzkiej żyły z przeszczepu tętniczowieńcowego. barwionej przeciwciałami względem a-aktyny (powiększenie x 5); na fig. 6d pokazano zdjęcie przekroju ludzkiej żyły z przeszczepu tętniczo-wieńcowego, barwionej przeciwciałami względem PCNA (powiększenie x 50); na fig. 7a pokazano zdjęcie przekroju hodowli ze świńskiej żyły, poddanej działaniu PDG (czynnika wzrostowego pochodzącego z płytek krwi), barwionej przeciwciałami względem PCNA (jądrowego antygenu mnożącej się komórki oraz przeciw-barwionej hematoksyliną i eozyną (powiększenie x 25); na fig. 7b pokazano zdjęcie przekroju hodowli ze świńskiej żyły, bez obróbki PDGF, barwionej przeciwciałami względem PCNA (jądrowego antygenu mnożącej się komórki) oraz przeciwbarwionej hematoksyliną i eozyną (powiększenie x 25); na fig. 7c pokazano zdjęcie przekroju unaczynionej tętniczo żyły świńskiej, poddanej działaniu PDG i oligonukleotydu (SEQ Id nr 1), barwionej przeciwciałami względem PCNA (jądrowego antygenu mnożącej się komórki) oraz przeciw-barwionej hematoksyliną i eozyną (powiększenie x 50); na fig. 8a pokazano zdjęcie przekroju hodowli ludzkiej żyły poddanej działaniu oligonukleotydu (SEQ ID NO:l) znaczonego na końcu fluoresceiną przez 2 s (powiększenie x 25); na fig. 8b pokazano zdjęcie przekroju hodowli ludzkiej żyły poddanej działaniu oligonukleotydu (SEQ Id nr 1) znaczonego na końcu fluoresceiną przez 30 minut (powiększenie x 25); na fig. 8c pokazano zdjęcie przekroju hodowli ludzkiej żyły inkubowanej z oligonukleotydem (SEQ Id nr 1) znaczonym na końcu fluoresceiną przez 1 godzinę (powiększenie x 25); na fig. 8d pokazano zdjęcie przekroju hodowli ludzkiej żyły inkubowanej z oligonukleotydem (SEQ Id nr 1) znaczonym na końcu fluoresceiną przez 2 godziny (powiększenie x 25); na fig. 9a pokazano zdjęcie przekroju żyły świńskiej z okołonaczyniowo wstrzykniętym oligonukleotydem (SEQ Id nr 1) znaczonym na końcu fluoresceiną, po 2 godzinach (powiększenie x 50); na fig. 9b pokazano zdjęcie przekroju żyły świńskiej z okołonaczyniowo wstrzykniętym oligonukleotydem (SEQ Id nr 1) znaczonym na końcu fluoresceiną, po 30 minutach (powiększenie x 50); na fig. 9c pokazano zdjęcie przekroju żyły świńskiej z okołonaczyniowo podaną fluoresceiną i znaczonym oligonukleotydem (SEQ Id nr 1), w 2 godziny po iniekcji (powiększenie x 50); na fig. 10 pokazano zdjęcie przekroju przykładowej kontrolnej (czyli takiej, której wstrzyknięto sensowny oligomer) świńskiej tętnicy wieńcowej w miesiąc po uszkodzeniu; na fig. 11 pokazano zdjęcie przekroju przykładowej świńskiej tętnicy wieńcowej poddanej działaniu antysensowego oligomeru; na fig. 12 przedstawiono maksymalną powierzchnię nowej błony wewnętrznej naczynia w funkcji stopnia uszkodzenia; na fig. 13 przedstawiono wpływ anty sensowych oligonukleotydów ukierunkowanych na obszar inicjacji transalacji mRNA c-myc na pozakomórkowe poziomy prokolagenu I, prokolagenu III i fibronektyny w komórkach ludzkich mięśni gładkich po zlaniu. Prokolagen I i prokolagen III w kondycjonowanym ośrodku oznaczono techniką blottingu Westerna, a fibronektynę oznaczano metodą immunostrącania; na fig. 14 przedstawiono specyficzny względem sekwencji wpływ antysensowych oligonukleotydów c-myc na kolagen typu I. Komórki ludzkich mięśni gładkich inkubowano z różnymi kontrolnymi oligonukleotydami (16 μΜ) obejmującymi oligonukleotydy sensowne, z niesparowanymi 4 bp oraz o rozrzuconych sekwencjach, a także antysensowe oligonukleotydy (16 (iiM) ukierunkowane na różne obszary mRNA c-myc przez 24 godziny. Poziom kolagenu I w ośrodku oznaczano

188 628 po kondycjonowanym trawieniu pepsyną z wykorzystaniem blottingu Westerna. Obrazek górny: Bioty przestawiające α-łańcuchy kolagenu. Ścieżka 1: bez oligonukleotydów; Ścieżka 2: sensowe oligonukleotydy; Ścieżka 3: ODN z niesparowanymi 4 bp (określany jako „oligonukleotyd”); Ścieżka 4: oligonukleotydy o rozrzuconych sekwencjach; Ścieżka 5: oligonukleotyd antysensowy ukierunkowany na obszary inicjacji translacji mRNA c-myc (pozycje 559-573, AS1); Ścieżka 6: oligonukleotyd antysensowy ukierunkowany na egzon 1 (pozycje 400-419, AS2) oraz Ścieżka 7: oligonukleotyd antysensowy ukierunkowany na obszar ulegający translacji w egzonie 3 (pozycje 1264-1283, AS3). Obrazek dolny: Histogramy przedstawiające procentową zmianę w stosunku do wielkości kontrolnych (bez oligonukleotydów) uzyskane z pomiarów densytometrycznych w 3 odrębnych doświadczeniach (średnia ± średni błąd pomiaru, SEM). Mis: oligonukleotydy z niesparowanymi 4 bp; Ser: oligonukleotydy o rozrzuconych sekwencjach; na fig. 15 przedstawiono hamowanie białka c-myc przez antysensowy oligonukleotydy (AS1). Komórki mięśni gładkich po zlaniu inkubowano z dodatkiem lub bez antysensowych oligonukleotydów przez 24 godziny. p62 c-myc oznaczano metodą immunostrącania ekstraktów jądrowych znaczonych [³³S] metioniną przedstawiając go na autoradiogramie SDS-żelu poliakryloamidowego; na fig. 16 przedstawiono stan metaboliczny komórek mięśni gładkich po działaniu oligonukleotydów. Komórki wstępnie inkubowano z dodatkiem lub bez oligonukleotydów (16 μΜ) przez 4 godziny i znaczono ^³S] metioniną przez 16 godzin. Białka znakowane radioaktywnie oznaczano po strącaniu TCA. Antysensowne oligonukleotydy nie wywierają wpływu na wbudowywanie się metioniny do białek, co wykazuje normalną metaboliczną aktywność komórek mięśni gładkich. Wyniki podano w dpm/10³ komórek (średnia ± SEM dla 2 odrębnych doświadczeń); S: sensowne; MIS: nie dopasowane; SCR: rozrzucone; AS1: antysensowe oligonukleotydy ukierunkowane na obszar inicjacji translacji mRNA c-myc; na fig. 17 przedstawiono odzysk kolagenu typu I po usunięciu bezwodnych oligonukleotydów c-myc (AS1). Komórki mięśni gładkich inkubowano z dodatkiem lub bez oligonukleotydów (16 μM) przez 24 godziny. Po trzykrotnym przemyciu dodano ośrodek bez oligonukleotydów, a zbioru dokonano po 25 godzinach. Kolagen typu I oznaczano metodą blottingu Westerna po trawieniu pepsyną. Pełny odzysk kolagenu typu I obserwuje się po usunięciu antysensowego oligonukleotydu c-myc; na fig. 18 przedstawiono wpływ antysensowego oligonukleotydu c-myc poziomy mRNA prokolagenu 0.)(1) i prokolagenu 02(1). Pełny RNA wydzielono z komórek mięśni gładkich inkubowanych z dodatkiem lub bez oligonukleotydów (16 μM) przez 24 godziny i analizowano metodą blottingu Northerna (10 μg/ścieżkę). Antysensowy oligonukleotyd (AS 1) nie wywierał wpływu na poziomy mRNA prokolagenu O](I) i prokolagen 02(1). Doświadczenia wykonane w 6 godzin po obróbce antysensowej dały podobne wyniki. 7S RNA nie wykazał zmian; na fig. 19 przedstawiono pozakomórkowe i wewnątrzkomórkowe białka znaczone [¹⁴C] proliną. Ludzkie komórki mięśni gładkich inkubowano z dodatkiem lub bez oligonukleotydów przez 16 godzin, po czym znaczono [^l4C] proliną przez dodatkowe 4 godziny w ośrodku wolnym od surowicy. Białka znaczone [^uC] proliną analizowano na żelach poliakrylamidowych SDS. Zaobserwowano zahamowanie powstawania białek znakowanych radioaktywnie w kondycjonowanych ośrodkach, czemu towarzyszył wzrost poziomu wewnątrzkomórkowego prokolagenu ai(I) i az(I) po obróbce antysensowym c-myc, na fig. 20 przedstawiono zawartość hydroksyproliny w poddanych obróbce antysensowej i kontrolnych ludzkich komórkach mięśni gładkich; na fig. 21 przedstawiono wpływ obróbki antysensowym c-myc na poziom pozakomórkowego kolagenu typu I w ludzkich fibroblastach skóry; na fig. 22 przedstawiono poziom wewnątrzkomórkowego i pozakomórkowego prokolagenu związanego z poddanymi obróbce antysensowym c-myc i kontrolnymi ludzkimi fibroblastami skóry; na fig. 23 przedstawiono stabilność cieplną wewnątrzkomórkowego prokolagenu w ludzkich fibroblastach skóry. Oczyszczany pepsyną prokolagen z komórek poddanych obróbce z dodatkiem lub bez oligonukleotydów inkubowano z trypsynąi chymotrypsyną w podanych temperaturach przez 2 minuty, po czym wykonywano elektroforezę na żelach poliakrylamidowych SDS. Podobne temperatury topnienia (około 41°C) zaobserwowano niezależnie od obróbki, co sugeruje normalną potrójną spiralną konformację łańcuchów prokolagenu, a po obróbce antysensowymi oligonukleotydami c-myc; na fig. 24 przedstawiono poziom mRNA prokolagenu ai(I) w poddanych obróbce antysensowym oligonukleotydem c-myc i kontrolnych ludzkich fibroblastach skóry; na fig. 25

188 628 przedstawiono odzysk kolagenu typu I w poddanych obróbce antysensowym oligonukleotydem c-myc i kontrolnych ludzkich fibroblastach skóry w 24 godziny po obróbce oligonukleotydami i wystawieniu na działanie świeżego ośrodka bez oligonukleotydów; na fig. 26 przedstawiono widok w przekroju świńskiej tętnicy wieńcowej i tkanek okołonaczyniowych. Rozkład antysensowego oligonukleotydu c-myc (SEQ ID No:l) oceniano w ściance naczynia i w sąsiednich tkankach okołonaczyniowych (powiększenie x 20); na fig. 27 A-F przedstawiono rozkład c-myc antysensowego (SEQ ID No:l) ODN w tętnicach wieńcowych w 30 minut po podaniu przez cewnik. Panele A i B: Mikrofotografie mikroskopowe z kontrastem fazowym i fluorescencyjne tej samej sekcji wykazują przezścienną lokalizację oligonukleotydów znaczonych fluoresceiną. Antysensowne oligonukleotydy występują w ośrodku, przydatkach i tkankach okołonaczyniowych. Panele C i D; Mikrofotografie mikroskopowe z kontrastem fazowym i fluorescencyjne przedstawiające nie przezścienny, rozkład oDn pod błoną wewnętrzną naczynia. Oligonukleotydy są wykrywalne tylko w ośrodku. Obrazki E i F: Mikrofotografie mikroskopowe z kontrastem fazowym i fluorescencyjne wykazujące obecność wewnątrzściennego, nie przezściennego ODN, powiększenie x 62,5; na fig. 28 A i B przedstawiono obecność antysensowych oligonukleotydów c-myc w ściance tętniczej w 3 dni po podaniu przez cewnik. Obrazki A i B: Mikrofotografie mikroskopowe z kontrastem fazowym fluorescencyjne tej samej sekcji (powiększenie x 62,5); na fig. 29 przedstawiono wykres słupkowy ilustrujący związaną z naczyniem i okołonaczyniową radioaktywność po śródściennym podaniu c-myc antysensowego oligonukleotydu z fosforotionianem znakowanym ³³S. Podobną całkowitą zawartość ODN stwierdzono po 30 minutach (pusty słupek; n = 6) i po 3 dniach (pełny słupek; n = 4) po podaniu z uwagi na przemieszczanie się ODN z przestrzeni okołonaczyniowej w kierunku ścianki naczynia. Wyniki przedstawiono jako średnie ± SEM; na fig. 30 A-D przedstawiono zachowanie struktur naczyniowych po podaniu przez cewnik antysensowego oligonukleotydu c-myc. Panel A: fluorescencyjnie znaczone oligonukleotydy są wyraźnie widoczne w ściance tętnicy wieńcowej w 30 minut po iniekcji. Panel B: sąsiednie sekcje wykazują zachowanie wewnętrznej błony sprężystej tętnic oraz normalną orientację tkanek sprężystych, bez pęknięć (barwienie preparatem Verhoeffa). Panel C: zaobserwowano łagodny spadek barwienia cytoplazmy i piknozę jądra w miejscu zachowania ODN (barwienie hematoksyliną i eozyną). Panel D: sekcja sąsiadująca z sekcją przedstawioną na fig. 19, z uwidocznionym rozdziałem powyższych zmian, w 3 dni po podaniu oligonukleotydów (barwienie hematoksyliną i eozyną, powiększenie x 50); na fig. 31 przedstawiono wewnątrzkomórkową lokalizację znaczonych fluoresceiną antysensowych oligonukleotydów c-myc, ocenianą na podstawie współogniskowej mikroskopii naczyniowych komórek mięśni gładkich in vitro\ na fig. 32 przedstawiono wewnątrzkomórkową lokalizację znaczonych fluoresceiną antysensowych oligonukleotydów c-myc 30 minut podaniu śródściennym oligonukleotydów in vivo, lokalizacja jąder jest widoczna w środkowych komórkach mięśni gładkich; na fig. 33 przedstawiono wewnątrzkomórkową lokalizację znaczonych fluoresceiną antysensowych oligonukleotydów c-myc 30 minut podaniu śródściennym oligonukleotydów in vivo, lokalizacja jąder jest widoczna w komórkach przydankowych.

Określenie „kolagen” w użytym znaczeniu dotyczy klasy cząsteczek syntetyzowanych z prokolagenu. Kolagen syntetyzowany jest w z prokolagenu pozakomórkowo, poprzez rozszczepienie końców N- i C- poza komórką. Przeciwciała względem potrójnego heliakalnego obszaru kolagenu mogą rozpoznawać również potrójny heliakalny obszar prokolagenu. Zastosowane przeciwciała są specyficzne względem kolagenu I i prokolagenu I, albo kolagenu El i prokolagenu HI. Kolagen można również zsyntetyzować in vitro z prokolagenu przez trawienie pepsyną.

Określenie „przeszczep” w użytym znaczeniu dotyczy przeszczepu naczyniowego, takiego jak przeszczep tętniczo-żylny lub żylny.

Określenie „nukleozyd” w użytym znaczeniu obejmuje naturalne nukleozydy, w tym formy 2'-dezoksy i 2'-hydroksylowe, np. opisane w pracy Komberg i Baker, DNA Replication, wyd. (Freeman, San Francisco, 1992). Określenie „analogi” w odniesieniu do nukleozydów obejmuje syntetyczne nukleozydy zawierające zmodyfikowane grupy zasad i/lub zmodyfikowane grupy cukrów, np. ogólnie opisane przez Scheita, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980). Do takich analogów należą syntetyczne nukleozydy, których zadaniem jest zwiększenie zdolności wiązania, np. stabilności dupleksu lub tripleksu, specyficzności, itp.

188 628

Określenie „oligonukleotyd” w użytym znaczeniu obejmuje liniowe oligomery naturalnych lub zmodyfikowanych monomerów lub połączeń, w tym dezoksyrybonukleozydy, rybonukleozydy, ich formy a-anomeryczne, poliamidokwasy nukleinowe, itp., zdolne do specyficznego wiązania się z docelowym polinukleotydem poprzez regularny układ oddziaływań monomer-monomer taki, jak parowanie zasad typu Watsona-Cricka, parowanie zasad typu Hoogsteen'a lub odwrotne parowanie Hoogsteen'a, itp. Zazwyczaj monomery połączone są wiązaniami fosfodiestrowymi lub ich analogami, tworząc oligonukleotydy o wielkości w zakresie od kilku, np. 3-4 merów, do kilkuset merów. Gdy oligonukleotyd przedstawiony jest za pomocą sekwencji liter takiej, jak „ATGCCTG” należy zdawać sobie sprawę, że nukleotydy są przedstawione od lewej do prawej w kolejności 5'- > 3, oraz ze „A” oznacza dezoksyadenozynę, „C” oznacza dezoksycytydynę, „G” oznacza dezoksyguanozynę, a „T” oznacza tymidynę, o ile nie zaznaczono tego inaczej. Do analogów wiązań fosfodiestrowych należy fosforotionian, fosforoditionian, fosforoselenian, fosforodiselenian, fosforoanilotionian, fosforanilidan, fosforoamidan, 3' —* 5' fosforoamidan itp., jako to zostanie dokładniej opisane poniżej.

„Stabilność” w odniesieniu do tworzenia dupleksu lub tripleksu oznacza jak silnie oligonukleotyd antysensowy wiąże się z przewidzianą sekwencją docelową.; bardziej precyzyjnie oznacza ona energię swobodną tworzenia dupleksu lub tripleksu w warunkach fizjologicznych. Temperatura topnienia w standardowych warunkach, np. takich, jak podane poniżej, stanowi dogodną miarę stabilności dupleksu i/ lub tripleksu. Korzystnie antysensowe oligonukleotydy według wynalazku dobrane są tak, aby ich temperatura topnienia wynosiła, co najmniej 50°C w standardowych warunkach podanych poniżej; w warunkach fizjologicznych oraz w przy korzystnych stężeniach tworzenie się dupleksu lub tripleksu będzie zasadniczo faworyzowane w porównaniu ze stanem, w którym antysensowy oligonukleotyd i jego cel są zdysocjowane. Należy zdawać sobie sprawę, że trwały dupleks lub tripleks może w pewnych rozwiązaniach obejmować brak dopasowania pomiędzy parami zasad i/lub pomiędzy tripletami zasad w przypadku tripleksów. Jest tak w przypadku SEQ ID No:l, która stanowi ludzką sekwencję z jedną zasadą niedopasowaną w ostatnim nukleotydzie w odniesieniu do porównywalnej sekwencji świńskiej. Korzystnie antysensowe oligonukleotydy według wynalazku tworzą idealnie dopasowane dupleksy i/lub tripleksy z docelowymi polinukleotydami.

Określenie „synteza” w użytym znaczeniu w kontekście biologicznym dotyczy procesu zachodzącego przy wytwarzaniu cząsteczek biologicznych, w szczególności pozakomórkowych cząsteczek matrycowych i pozakomórkowych białek matrycowych. Określenie „synteza” obejmuje procesy zarówno wewnątrz jak i na zewnątrz komórki, których rezultatem jest cząsteczka biologiczna takie, jak, ale nie wyłącznie, transkrypcja mRNA, translacja mRNA, potranslacyjna modyfikacja białka, glikozylowanie, rozszczepianie peptydazą, pozakomórkowe rozszczepianie peptydazą, wewnątrzkomórkowe rozszczepianie peptydazą, transport białka, wydzielanie białka i fosforylowanie białka. Korzystnie wynalazek zapewnia hamowanie translacji białek pozakomórkowych cząsteczek matrycowych, potranslacyjne przetwarzanie białka, wydzielanie białka lub wewnątrzkomórkowe trawienie peptydazą.

Zastosowanie według wynalazku służy hamowaniu niewłaściwej syntezy pozakomórkowych białek matrycowych w tkance, zwłaszcza kolagenu, przede wszystkim kolagenu typu I i typu III.

Cząsteczki, na które skierowane są antysensowe oligonukleotydy c-myc według wynalazku obejmują alleliczne formy protoonkogenów. Korzystnie sekwencje antysensowych związków c-myc dobrane są tak, aby ilość zasad G-C stanowiła, co najmniej 60%. Korzystnie sekwencje oligonukleotydów są wybrane spośród 12-15 sąsiadujących zasad SEQ. ID No. 1, 5-7 lub 8-11. Do korzystnych docelowych mRNA należy miejsce końcowe 5', miejsce wiązania startera tRNA, miejsce kodonu inicjacyjnego, miejsce podstawiania donora mRNA, miejsce podstawiania akceptora mRNA itp.

Dobierając antysensowe oligonukleotydy ukierunkowane na miejsce inicjowania ATG ludzkiego c-myc w drugim egzonie podawać można antysensowe oligonukleotydy o kolejnych sekwencjach stosując oligonukleotydy o 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 lub 35 zasadach, wybrane z obszaru zawierającego 25 zasad po którejkolwiek ze stron miejsca ATG (ludzka sekwencja):

5' cccgc tccagcagcc tcccgcgacg ATG cccctcaacg ttagcttcac caaca 3'

188 628

Korzystnie antysensowe oligonukleotydy będą zawierać miejsce ATG. Można także wykorzystać przy doborze oligonukleotydów o wielkości podanej w tym akapicie, obszary o 25 zasadach po którejkolwiek ze stron SEQ ID No: 6 i 7.

Antysensowy oligonukleotyd stosowany w przedmiotowym wynalazku może stanowić związek polimeryczny zdolny do specyficznego wiązania się z docelowym polinukleotydem z wykorzystaniem regularnego układu oddziaływań monomer/nukleozyd, takich, jak parowanie zasad typu Watsona-Cricka, parowania zasad typu Hoogsteena lub odwrotnego typu Hoogsteen itp. Antysensowne związki mogą również zawierać boczne grupy lub podstawniki, jako część podstawowej jednostki polimeru, albo osobno, w celu zwiększenia specyficzności, odporności na działanie nukleaz, dostarczania lub innych właściwości związanych ze skutecznością. takie jak grupy cholesterolowe, wtrącenia dupleksowe takie, jak akrydyna, poli-L-lizyna, „zakończenia łańcuchów z jednym lub więcej odpornymi na nukleazę grupami łącznikowymi takimi, jak fosforotionian, itp. Sekwencje pewnych reprezentatywnych oligonukleotydów przydatnych w rozwiązaniach według wynalazku podano poniżej w załączonym zestawieniu sekwencji.

Do antysensowych związków stosowanych w przedmiotowym wynalazku należą ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, w tym sole metali ziem alkalicznych, np. sole sodowe i magnezowe, amonowe lub NX4^_, gdzie X oznacza alkil C1-C4. Do innych farmaceutycznie dopuszczalnych soli należą sole organicznych kwasów karboksylowych takich, jak kwas octowy, mlekowy, winowy, jabłkowy, izetionowy, laktobionowy i bursztynowy, organicznych kwasów sulfonowych takich, jak kwas metanosulfonowy, etanosulfonowy i benzenosulfonowy, oraz kwasów nieorganicznych takich, jak kwas chlorowodorowy, siarkowy, fosforowy i sulfaminowy. Farmaceutycznie dopuszczalne sole związków zawierających grupy hydroksylowe obejmują aniony takich związków w kombinacji z odpowiednim kationem takim, jak Na+, NH4+, itp.

Korzystnie odporność na nukleazę nadaje się antysensowym związkom stosowanym w przedmiotowym wynalazku wprowadzając odporne na nukleazę wiązania międzynukleozydowe np. fosforotioniany, fosforoditioniany, fosforoamidany, np.- OP(=O)(NR'IR²)-0-, gdzie każdy z R1 i R² oznacza atom wodom lub C1-C3 alkil; 3' —+ 5' fosforoamidany, peptydowe kwasy nukleinowe, metylofosfoniany oraz P-chiralne połączenia różnych typów, zwłaszcza fosforotioniany; oraz inne połączenia np. fosforoselenian, fosforodiselenian, fosforoanilotionian, fosforanilidan, triester alkilofosforowy taki, jak triester metylo- i etylotOsfoiojwy; węglan taki, jak ester karboksymetylowy, karbaminian, morfolinokarbaminian, 3'-tioformacetal, związki sililowe takie, jak dialkilo(Ci-^Có)- lub difenylosilil, ester sulfaminianowy, itp. Korzystnie w związkach stosowanych w przedmiotowym wynalazku stosuje się fosforowe analogi połączenia fosfodiestrowego, takie jak fosforotionian, fosforoditionian, fosforoamidan lub metylofosfonian. Jeszcze korzystniej fosforotionian stosuje się jako połączenie odporne na nukleazę. Zrozumiałe jest, że oprócz korzystnych grup łącznikowych związki stosowane w przedmiotowym wynalazku mogą zawierać dodatkowe modyfikacje, np. borowane zasady, grupy cholesterolowe, 5-propenylowo modyfikowane pirymidyny, itp.

Korzystnie antysensowe związki stosowane w przedmiotowym wynalazku syntetyzuje się w dostępnych w handlu zautomatyzowanych DNA syntetyzatorach, np. syntetyzator DNA/RNA z Applied Biosystems (Foster City, CA) model 380B, 392 lub 394. Korzystnie wykorzystuje się chemizm fosforoamidynu.

W rozwiązaniach, w których pożądane jest tworzenie tripleksu istnieją ograniczenia odnośnie doboru sekwencji docelowych. Ogólnie wiązanie trzeciej nici zasocjowanej poprzez wiązanie typu Hoogsteena jest najtrwalsze wzdłuż układów homopirymidyna-homopuryna w dwuniciowej cząsteczce docelowej. Zazwyczaj tryplety zasad tworzą się w motywach T-A*T lub C-G*C (gdzie oznacza parowanie Watsona-Cricka, q „*” oznacza typ wiązania Hoogsteena); możliwe sąjednak również inne motywy. Tak np. parowanie zasad Hoogsteena umożliwia równoległe i antyrównoległe orientacje pomiędzy trzecią nicią (nicią Hoogsteena) i wzbogaconą w purynę nić dupleksu, z którą wiąże się trzecia nić, zależnie od warunków i składu nici. W literaturze znaleźć można wiele wskazówek odnośnie dobom odpowiednich sekwencji, orientacji, warunków, typu nukleozydu (np. odnośnie stosowania nukleozydów rybozowych lub dezoksyrybozowych), modyfikacji zasad (np. stosowania metylowanej cytozyny

188 628 itp.) w celu osiągnięcia maksimum lub regulowania w inny sposób stabilności tripleksu pożądanej w konkretnych rozwiązaniach.

Grupy oligonukleotydowe są wystarczająco długie, aby być pewnym, ze specyficzne wiązanie będzie zachodzić tylko przy pożądanym docelowym polinukleotydzie, a nie w innych przypadkowych miejscach. Górny zakres długości określony jest przez szereg czynników takich, jak niedogodność i kosztowność syntetyzowana i oczyszczania oligomerów o długości przekraczającej około 30-40 nukleotydów, większa tolerancja dłuższych oligonukleotydów na niedopasowania niż krótszych oligonukleotydów, obecność modyfikacji zwiększających wiązanie lub specyficzność, wymagania odnośnie wiązania dupleksowego lub tripleksowego, itp. Zazwyczaj antysensowe związki według wynalazku wykazują długość w zakresie od około 12 do 60 nukleotydów. Jeszcze korzystniej antysensowe związki według wynalazku wykazują długość w zakresie od około 15 do 40 nukleotydów; a najkorzystniej ich długość wynosi od około 18 do 30 nukleotydów.

Zgodnie z przedmiotowym wynalazkiem stosowane związki wykorzystuje się do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania syntezy pozakomórkowych białek matrycowych, zawierającej farmaceutycznie dopuszczalny wypełniacz i antysensowy oligonukleotyd specyficzny względem jądrowego protoonkogenu w ilości wystarczającej do hamowania syntezy pozakomórkowych białek matrycowych po podaniu wymagającemu tego osobnikowi. Oligonukleotydy antysensowe stosowane w przedmiotowym wynalazku stosuje się jako jeden lub więcej składników takiej kompozycji farmaceutycznej. Składniki kompozycji farmaceutycznych otrzymywanych według wynalazku zależą od szeregu czynników, obejmujących charakter choroby lub leczonego stanu, lokalizacja schorzeń, przewidziany sposób dostarczania i/lub podawania leku; ten ostatni czynnik może obejmować podawanie in vivo przez cewnik do docelowego schorzenia lub narządu, podawanie miejscowe, podawanie donosowe, podawanie przez wszczepianie lub z wykorzystaniem przezskómych układów o przedłużonym działaniu, itp.

W skład kompozycji farmaceutycznych otrzymywanych według wynalazku wchodzi farmaceutyczny nośnik, który może zawierać szereg składników spełniających różne funkcje, np. regulujących stężenie leku, regulujących rozpuszczalność, zapewniających stabilizację chemiczną, regulujących lepkość, zwiększających wchłanianie, regulujących pH, itp. Przykładowo, w przypadku preparatów rozpuszczalnych w wodzie kompozycja farmaceutyczna korzystnie zawiera bufor taki, jak bufor fosforanowy albo inną sól kwasu organicznego, korzystnie o pH w zakresie od około 7 do 8. W przypadku preparatów zawierających słabo rozpuszczalne związki antysensowe stosować można mikroemulsje, np. z wykorzystaniem niejonowego środka powierzchniowo czynnego takiego, jak Tween 80 w ilości 0,04-0,05% (wagowo/objętościowych), w celu zwiększenia rozpuszczalności. Do innych składników mogą należeć przeciwutleniacze takie, jak kwas askorbinowy, polimery hydrofilowe takie, jak monocukry, dwucukry i inne węglowodany takie, jak celuloza lub jej pochodne, dekstryny, środki chelatujące takie, jak EDTA i inne podobne składniki dobrze znane w farmacji; patrz np. Remington^ Pharmaceutical Science, ostatnie wydanie (Mack Publishing Company, Easton, PA).

Do układów o przedłużonym uwalnianiu odpowiednich do stosowania z farmaceutycznymi kompozycjami otrzymywanymi według wynalazku należą półprzepuszczalne matryce polimerowe w postaci błon, mikrokapsułek itp., np. z polilaktydów, kopolimerów kwasu L-glutaminowego i y-etylo-L-glutaminianu, polimetakrylanu 2-hydroksyetylu) i inne podobne materiały; patrz np. Rosenberg i inni, międzynarodowe zgłoszenie PCT7US92/05305. Do układów o przedłużonym uwalnianiu należą również antysensowe związki uwięzione w liposomach, np. opisane w Liposome Technology, Vol. II, Incorporation of Drugs, Proteins i Genetic Materiał (CRC Press).

Skuteczna ilość antysensowego oligonukleotydu c-myc w konkretnych zastosowaniach zależy od szeregu czynników takich, jak chemiczny charakter antysensowego oligonukleotydu, leczone zaburzenie, sposób podawania, itp. Korzystnie skuteczna ilość będzie zapewniać stężenie antysensowego oligonukleotydu c-myc od około 1 do 100 μΜ przy docelowym polinukleotydzie; a jeszcze korzystniej skuteczna ilość będzie zapewniać stężenie antysensowego oligonukleotydu c-myc od około 1 do 10 pM przy docelowym polinukleotydzie.

188 628

W przypadku zaburzeń naczyniowych takich, jak nawrót zwężenia naczyń, antysensowe oligonukleotydy specyficzne względem jądrowych protoonkogenów korzystnie podaje się miejscowo do uszkodzonej tętnicy przez cewnik. Korzystnie antysensowe oligonukleotydy podawane do uszkodzeń typu nawrotu zwężenia naczyń są specyficzne względem c-myc i/ lub c-myb; jeszcze korzystniej kombinację antysensowych oligonukleotydów specyficznych względem zarówno c-myc, jak i c-myb stosuje się w celu hamowania syntezy pozakomórkowego białka matrycowego związanej z nawrotem zwężenia naczyń. Zazwyczaj nawrót zwęzenia naczyń występuje po procedurze takiej, jak przezskóma transluminalna angioplastyka wieńcowa (PTCA), która powoduje miejscowe zniszczenie lub uszkodzenie ścianki tętniczej. W reakcji na takie uszkodzenie często pojawia się uszkodzenie okluzyjne związane z następującymi zjawiskami: stan zapalny tętnicy w miejscu uszkodzenia, zakrzepica, nagromadzanie się komórek mięśni gładkich na skutek migracji i proliferacji, oraz synteza macierzy pozakomórkowej przez komórki mięśni gładkich i fibroblasty.

W przypadku zaburzeń typu przeszczepu naczyniowego oligonukleotydy korzystnie wprowadza się do tkanki łącznej otaczającej przeszczep, aby zapobiec niewydolności przeszczepu. Zazwyczaj niewydolność przeszczepu występuje, gdy spadek drożności osiągnie 50% lub powyżej. Należy zdawać sobie sprawę, że podawanie oligonukleotydów opisanymi technikami można ukierunkować na przeszczepy tętniczo-żylne takie, jak ale nie wyłącznie, przetoki protetyczne (w tym z PTFE (Gortex lub Impra), poli(eterouretanu), dakronu, ludzkiej pępowiny, żył zmodyfikowanych genetycznie i naczyń immunosupresyjnych (bydlęcych lub świńskich), przeszczepy tętniczo-żylne, rodzime przetoki żylne, takie, jak przeszczepy tętnica promieniowa-żyła odpromieniowa (Brescia-Cimino), tętnica łokciowa promieniowa-zyła odłokciowa. tętnica ramienna-żyła odpromieniowa lub odłokciowa oraz tętnica udowa-żyła odpiszczelowa) i przeszczepy żylne takie, jak ale nie wyłącznie, przeszczepy żylne z wykorzystaniem poddanych immunosupresji aloprzeszczepów żyły odpiszczelowej, poddanych immunosupresji aloprzeszczepów żył pępkowych, żył zmodyfikowanych genetycznie, poddanych immunosupresji heteroprzeszczepów i autoprzeszczepów żylnych oraz dowolnych innych żył przyjmowanych przez ludzi, np. tkanki przeszczepowej i materiałów, które można przeszczepiać na ludzką tkankę.

W przypadku okołonaczyniowego podawania oligonukleotydów w celu zapobieżenia niewydolności przeszczepu naczyniowego, zwłaszcza niewydolności przeszczepu tętniczozylnego. oligonukleotydy wykorzystywane według wynalazku zazwyczaj wstrzykuje się do tkanki okołonaczyniowej otaczającej miejsce przewidzianego zastosowania. W przypadkach, gdy wskazana jest ciągła infuzja oligonukleotydów, np. u pacjentów ze znaną historią ostrego i szybkiego spadku drożności przeszczepu tętniczo-żylnego, zastosować można innego typu układy dozujące takie, jak podskórne pompy infuzyjne, żele i matryce ulegające degradacji biologicznej uformowane na przeszczepie, korzystnie wymieszane z ludzką albuminą surowiczą w-stosunku oligonukleotydu do białka od 1:10 do 1:100, żele (takie, jak żele pluronic, Hydron, lub z kopolimeru etylen-octan winylu), żele (np. takie, które opisali Edelman i inni, Circulation Research 76:176-182 (1995] oraz Edelman i inni., Proc. Natl. Aca. Sci. 87:3773-3777 (1990), przy czym opisane metody wprowadza się jako odnośniki), układy cewników założonych na stałe (takie, jak cewniki Broviac lub układy założonych całkowicie na stałe zbiorniczków cewnikowych, np. takie, które opisali Poleni i inni, J. Neurosurg. 55: 581-584, przy czym opisane metody wprowadza się jako odnośniki), impregnowane rurki z PTFE, inne impregnowane materiały biokompatybilne lub inne kompozycje i układy do doprowadzania leku, przedstawione w opisie. Należy zdawać sobie sprawę, że zastosować można zbiorniczek uwalniający oligonukleotyd w bliskim sąsiedztwie docelowego miejsca, tak aby wydłużyć czas podawania oligonukleotydu. Zbiorniczek można po prostu stworzyć wstrzykując oligonukleotyd do tkanki okołonaczyniowej podczas lub po operacji chirurgicznej, ale przed zamknięciem się rany, lub na drodze przezskómej iniekcji po wyczuciu przeszczepu tętniczozylnego. np. w przypadku tętniczo-żylnej przetoki, lub na drodze iniekcji śledzonej znanymi sposobami, np. za pomocą sonogramów. Iniekcje można powtarzać w celu przedłużenia okresu leczenia, np. w miejscach dostępu do wykonania hemodializy. Nie jest konieczne ani pożądane usuwanie przydanki z naczynia, gdyż tkanka okołonaczyniowa może działać jako depot lub zbiorniczek oligonukleotydu o stosunkowo małej szybkości dyfuzji. Oligonukleotyd

188 628 w zbiorniczku jest również wolniej wynoszony przez układ krążenia niż przy podawaniu przez cewnik skierowany przez światło. W przypadku podawania przezskórnego lub okołonaczyniowego podawana dawka wynosi od 0,1 do 100 mg/naczynie, korzystnie od 0,25 do 50 mg, ajeszcze korzystniej od 0,5 mg do 10 mg na jedno dozowanie.

Oprócz tkanki okołonaczyniowej do podawania oligonukleotydów w celu zapobieżenia niewydolności przeszczepu wykorzystać można inne struktury anatomiczne takie, jak warstwa nabłonkowa, mięśniówka i przydanka jako miejsca stanowiące zbiorniczek, zwłaszcza wtedy, gdy oligonukleotydu nie wprowadza się ze światła naczynia. Takie naturalne miejsca tworzące zbiorniczki, w tym tkanka okołonaczyniowa, są zwłaszcza przydatne w przypadku przeszczepów tętniczo-żylnych, ajeszcze częściej przetok tętniczo-żylnych, gdy mięśniówka lub błona sprężysta jest nienaruszona i nie została odcięta, pomimo uszkodzeń chirurgicznych. Dogodne jest zwłaszcza wykorzystywanie miejsc w sąsiedztwie części żylnej przeszczepu tętniczozylnego, przede wszystkim części żylnej przetoki tętniczo-żylnej. Część zylna przetoki tętniczo-żylnej tworzy część zylną przetoki, co zaznaczono przykładowo na fig. 1 strzałką. Należy zdawać sobie sprawę, że nie występujące w naturze zbiorniczki mogą również dostarczać niewydolnemu przeszczepowi oligonukleotyd, co przedstawiono jako szary obszar na fig. 1, rozwiązanie, które stanowi przykład dyskutowany w opisie. Gdy stosuje się nie występujące w naturze zbiorniczki, to korzystnie ulegają one degradacji lub dają się ponownie napełniać. Korzystne są zbiorniczki do ponownego napełniania dwóch typów: 1) zbiorniczek do ponownego napełniania przymocowany w górę od części żylnej przeszczepu tętniczo-żylnego, wewnątrz lub wokół rurki z PTFE lub innego materiału biokompatybilnego, oraz 2) zbiorniczek umocowany w tkance okołonaczyniowej otaczającej przeszczep tętniczo-żylny, korzystnie na odcinku do 5 cm części żylnej przeszczepu tętniczo-żylnego, ajeszcze korzystniej na odcinku 2 cm, ponownie napełniany za pomocą igły na drodze przezskórnej iniekcji. Takie nie występujące w naturze okołonaczyniowe zbiorniczki można wszczepiać podczas operacji przy wykonywaniu przeszczepu tętniczo-żylnego. Okołonaczyniowe zbiorniczki do ponownego napełniania można wykonać z materiałów stosowanych w implantach piersi, przy czym korzystnie są one stosowane w połączeniu z półprzepuszczalną membraną, która umożliwia dyfuzję oligonukleotydu do tkanki okołonaczyniowej.

Przy zastosowaniu ex vivo oligonukleotydów do zapobiegania niewydolności przeszczepów naczyniowych wykonanych z żył, zwłaszcza przy wykonywaniu obejść, żyły kontaktuje się ex vivo z oligonukleotydem komplementarnym z mRNA jądrowego protoonkogenu. Zazwyczaj żyły inkubuje się przez, co najmniej 10 minut w temperaturach od 20 do 37°C w sterylnym i fizjologicznie tolerowanym buforze. Dopuszczalne są krótsze czasy, zwłaszcza przy wysokich stężeniach. Dłuższe czasy inkubowania, od 30 do 90 minut, są również odpowiednie i zgodne z przerwą czasową pomiędzy usunięciem żyły i wykonaniem przeszczepu w takich procedurach. Inkubowanie można także przeprowadzić w niższych temperaturach, np. w 4°Ć,-zwłaszcza wtedy, gdy żyła musi być transportowana z odległego miejsca dostawy, zazwyczaj przy wyższych stężeniach oligonukleotydu. Zazwyczaj stężenia wahają się od 5 do 500 μΜ w zależności od czasu inkubacji, typu oligonukleotydu i temperatuiy. Korzystme czas inkubacji wynosi od 30 do 60 minut w temperaturach w zakresie od 22 do 37°C. Korzystnie stężenie oligonukleotydu będzie wynosić od 10 do 100 μΜ, ajeszcze korzystniej od 25 do 100 μΜ. Należy zdawać sobie sprawę, zastosować można wiele typów buforów, pod warunkiem, że są one fizjologicznie tolerowane, np. 0,9% roztwór soli (NaCl) lub roztwór soli buforowany fosforanem, a także inne wspomniane bufory i sole. Należy zdawać sobie sprawę, że według wynalazku wykorzystać można wiele typów żył, w tym żyły nie pochodzące od ludzi, żyły od zmodyfikowanych genetycznie ssaków, zwłaszcza świń, oraz wiele ludzkich żył w celu uzyskania aloprzeszczepów i autoprzeszczepów (takie, jak żyła odpiszczelowa, żyła odpromieniowa, żyła odłokciowa, żyła ramieniowa i żyła udowa).

Przy podawaniu donaczyniowym (np. w celu zapobieżenia nawrotowi zwęzenia naczyń po angioplastyce), antysensowe oligonukleotydy korzystnie podawane są na obrzezu uszkodzenia przez cewnik z wnętrza światła przewodu, lub przez przydankę (czyli najbardziej zewnętrzną warstwę ścianki naczynia) z materiałami ułatwiającymi powolne uwalnianie antysensowego związku, stosując np. układ z żelem pluronic, opisany np. przez Simonsa i innych, Naturę, 359:67-70 (1992) lub balonik porowaty albo balonik jontoforetyczny, jak to opisali

188 628

A. Femandez-Ortiz i inni, Circulation, 89:1518-1522 (1994), przy czym metody te wprowadza się jako odnośniki. Do innych technik powolnego uwalniania przy podawaniu miejscowym należą powlekane rurki umieszczane w przewodzie z antysensowym związkiem, np. z wykorzystaniem środka wiążącego lub żelu, które opisali Wilensky i inni, Trends in Cardiovascular Med., 3: 163-170 (1993). Dawka wprowadzana do docelowego uszkodzenia wynosi od 1 pg do 10 mg każdego lub obydwu antysensowych związków stosowanych w kompozycji farmaceutycznej. Korzystnie dawka wynosi od 1 fig do 1 mg; a jeszcze korzystniej dawka wynosi od 1 pg do 10 pg. Korzystnie czas podawania wynosi od około 30 s do 60 minut, a jeszcze korzystniej od około 30 s do około 1-2 minut; patrz np. Zalewski i inni, str. 79-87 w publikacji Goldberg (red), Coronary Angioplasty (Davis, Philadelphia, 1988).

Przy podawaniu przez cewnik stosuje się dawkę w ilości w zakresie od 0,1 mg do 10 mg/tętnicę, korzystnie od 0,25 mg do 4 mg/tętnicę, ajeszcze korzystniej od 0,5 mg do 2 mg/tętnicę. Podawaną dawkę stanowi ilość leku podana do tkanki, przy czym „dawkę podaną do docelowego uszkodzenia” stanowi ilość leku w tkance po podaniu go do tej tkanki.

Techniki angioplastyki wieńcowej są dobrze znane specjalistom i opisane szczegółowo w takich podręcznikach, jak Clark, Coronary Angioplasty (Liss, New York, 1987), Vlietstra i inni (op.cit.), itp.

W przypadku nadmiernego bliznowacenia skóry, np. powstawania blizn pooperacyjnych, keloidozy, itp., korzystne jest podawanie miejscowe lub doskóme w celu zahamowania syntezy pozakomórkowego białka matrycowego, zwłaszcza syntezy kolagenu przez fibroblasty skórne.

Przy stosowaniu miejscowym podawana dawka (ilość leku wprowadzanego do tkanki) będzie zazwyczaj wynosić od 0,01 pg do 10 mg leku/cm², korzystnie od 0,2 jag do 7 mg leku/cm², ajeszcze korzystniej od 0,5 do 4 mg leku/cm2. Podawana dawka przy stosowaniu wraz z opatrunkami pooperacyjnymi wynosi korzystnie od 0,2 mg do 4 mg leku/cm2. Podawana dawka przy stosowaniu w kremach w przypadku obtarcia skóry, uszkodzeń skóry, trądzika i postępowania pooperacyjnego wynosi korzystnie od 0,05 mg do 3 mg leku/cm².

Przy zaburzeniach urologicznych związanych z bliznowaceniem lub zwężeniem cewkowym, moczowodowym lub pęcherzowym korzystne jest podawanie miejscowe przez cewnik lub w postaci implantów powleczonych antysensowym oligonukleotydem.

W przypadku nadmiernego bliznowacenia narządów wewnętrznych zawierających komórki mięśni gładkich i fibroblasty takich, jak narządy żołądkowo-jelitowe, przewody żółciowe, płuca i wątroba antysensowe związki można podawać układowo lub miejscowo. Podawanie miejscowe obejmuje bezpośrednią iniekcję antysensowego oligonukleotydu do docelowego narządu, podawanie we wszczepianych żelach lub polimerach lub powolne uwalnianie z powlekanych rurek umieszczanych w przewodach, albo z innych materiałów protetycznych.

W przypadku każdego z zaburzeń opisanych powyżej kryteria odnośnie doboru pacjentów do prowadzenia leczenia oraz sposoby oceny punktów końcowych terapii są dobrze znane w literaturze dotyczącej konkretnych zaburzeń. W przypadku nawrotu zwężenia naczyń do czynników związanych z podatnością na takie stany należy płeć męska, rozszerzanie z uwagi na zwęzanie się przeszczepów obejściowych, serce kanadyjskie (Canadian Heart) klasy 3 lub 4 przy linii podstawowej oraz historia zawału mięśnia sercowego, Holmes i inni, rozdz. 12 w publikacji Vlietstra i inni (red), PTCA (Davis Company, Philadelphia, 1987). Skuteczność leczenia ocenia się w taki sam sposób, jak w dowolnej technice PTCA. Zazwyczaj wyniki ocenia się wzrokowo, choć dostępne są również inne techniki. Oceny niewydolności miejsca dostępu do wykonania hemodializy dokonuje się z wykorzystaniem barwnej ultrasonografii dopplerowskiej, angiografii kontrastowej i ultrasonografii (np. Dousset i inni, Radiology 181:89 (1991), Nonnast-Daniel i inni, Lancet 339 (8786):143 (1992) oraz Davidson i inni, Kidney International 40: 91-95 (1991), przy czym metody te wprowadza się jako źródła literaturowe, oraz na podstawie objawów fizycznych takich, jak szmery o wysokim tonie wokół miejsca dostępu albo szybkie i wysokie tętno). Ocenę ostrości zwężenia lub nawrotu zwęzenia naczyń (przy ustalaniu kandydatów do wykonania PTCA lub wyników PTCA) wykonuje się metodami począwszy od obserwacji wzrokowej schorzenia aż do złozonej komputerowej analizy wymiarów określonej tętnicy, np. na podstawie danych tomograficznych, przepływu w oddalonym łożysku naczyniowym, charakterystyki densytometryczne zwężenia albo lokalne

188 628 zmiany w ruchu ścianki w strefie schorzenia; patrz np. Bove, rozdz. 9 w publikacji Vlietstra i inni (op.cit).

Korzystnie stabilność termiczną antysensowych oligonukleotydów stosowanych według wynalazku wyznacza się z krzywych topnienia lub dysocjacji nici. Temperaturę, w której zdysocjowane jest 50% nici, przyjmuje się jako temperaturę topnienia, Tm, która z kolei stanowi dogodną miarę stabilności. Pomiary Tm zazwyczaj wykonuje się w roztworze soli przy obojętnym pH przy stężeniach docelowych i antysensowych oligonukleotydów około l,0-2,0 μΜ. Typowe warunki są następujące: 150 mM NaCl i 10 mM MgCb w 10 mM fosforanie sodu jako buforze (pH 7,0) lub w 10 mM buforze Tris-HCl (pH 7,0); lub w innych podobnych warunkach. Dane dotyczące temperatury topnienia zbiera się ogrzewając próbkę kompleksu antysensowy oligonukleotyd/docelowy polinukleotyd od temperatury pokojowej do około 85-90°C. W miarę jak temperatura próbki wzrasta rejestruje się absorbancję światła przy 260 nm, co 1°C, np. stosując spektrofotometr LTV/VIS - Cary (Australia) model 1E lub Hewlett-Packard (Palo Alto, CA) model HP 8459 i oraz regulator temperatury HP model 89100A, lub inne podobne aparaty. Takie techniki stanowią dogodne sposoby pomiaru i porównania siły wiązania antysensowych oligonukleotydów o różnych długościach i składach.

Przykład I. Przebudowa arterializowanej żyły świńskiej - model in vivo utraty drożności przeszczepów tętniczo-zylnych

W celu wykazania skuteczności oligonukleotydu stosowanego według wynalazku w zmniejszaniu wytwarzania pozakomórkowego białka matrycowego w żylnej części przeszczepu tętniczo-żylnego opracowano najpierw model in vivo na świniach. Model ten umożliwia śledzenie drożności przeszczepu tętniczo-żylnego, w tym żylnej części przeszczepu.

W przypadku świńskiego modelu arterializowanej żyły odpiszczelowe żyły wycięto, a następnie zespolono końcami z tętnicami szyjnymi. Po zakończeniu operacji przywrócono przepływ krwi tętniczej pod normalnymi tętniczymi ciśnieniami (Violaris i inni., Ann. Thorac. Surg., 53: 667-71 (1995) oraz Angelini i inni, J. Thorac. Cardiovas. Surg, 99:433-9 (1990), przy czym sposoby te wprowadza się jako odnośnik). Wysokie ciśnienie tętnicze w połączonym końcami przeszczepie żyły odpiszczelowej symuluje narażenie żyły na wysokie ciśnienie tętnicze w przeszczepie tętniczo-żylnym lub przeszczepie żylnym. Części żylne przeszczepów żylnych (n = 7) usunięto w 8 dni po wykonaniu przeszczepu i pocięto na sekcje do analizy histologicznej, o ile nie zaznaczono tego inaczej. Dla porównania stosowano normalne lewe żyły żołądkowe, nie narażone na ciśnienie tętnicze i nie przeszczepione.

Normalne żyły, nie narażone na ciśnienie tętnicze i nie przeszczepione, nie wykazywały pogrubionej tkanki okołonaczyniowej, okołonaczyniową przestrzeń z niewielką ilością tkanki łącznej i luźną tkanką tłuszczową, oraz cienką i nie popękaną mięśniówkę, co pokazano na fig. 2a (barwienie preparatem Verhoeffa). Części żylne przeszczepów wykazywały wzrost w tkance okołonaczyniowej otaczającej mięśniówkę jako kołnierz z dużą ilością ziarniny. Uwidoczniono to dzięki barwieniu preparatem Verhoeffa, co pokazano na fig. 2b. Ta sama sekcja wykazuje również nie naruszony i nie popękany fragment pozbawiony mięśniówki. W pewnych sekcjach zaobserwowano tworzenie się nowej błony wewnętrznej naczynia w 8 i 14 dni po operacji.

Normalne żyły, nie narażone na ciśnienie tętnicze i nie przeszczepione, wykazywały niewielką ilość luźnej tkanki okołonaczyniowej i mięśniówki przy barwieniu czerwienią Sirius, co pokazano na fig. 3a. W tym przypadku żylne części przeszczepów wykazywały wzrost w osadzaniu się kolagenu w tkance okołonaczyniowej już po 8 dniach. Duże ilości gęstego okołonaczyniowego kolagenu zabarwiły się czerwienią Sirius, specyficznym barwnikiem dla kolagenu włóknistego (w tym typu I i III), co pokazano na fig. 3b. Mięśniówka zabarwiła się słabiej niz tkanka okołonaczyniowa. W sekcjach z nową błoną wewnętrzną naczynia kolagen był wyraźnie widoczny.

Normalne żyły. nie narażone na ciśnienie tętnicze i nie przeszczepione, nie wykazywały a-aktyny w tkance okołonaczyniowej i warstwach przydankowych przy zastosowaniu przeciwciał α-aktynowych. Tylko komórki mięśni gładkich w mięśniówce zabarwiły się dodatnio względem a-aktyny, co pokazano na fig. 4a. Natomiast żylne części przeszczepów wykazywały wzrost syntezy a-aktyny w mięśniówce i w przydance. Duże ilości a-aktyn w mięśniówce zabarwiono przeciwciałami specyficznymi względem a-aktyn, co pokazano na fig. 4b.

188 628

Zabarwienie w mięśniówce oznacza obecność komórek mięśni gładkich syntetyzujących a-aktynę w mięśniówce. Przydanka również wykazała barwienie a-aktynowe, co oznacza, ze miofibroblasty syntetyzują a-aktynę. Również tkanka okołonaczyniowa wykazywała pewne zabarwienie a-aktynowe.

Wykonano również barwienie żył względem desminy, eksprymowanej przez naczyniowe komórki mięśni gładkich, stosując przeciwciała przeciw desminie. Normalna żyła, nie narażona na ciśnienie tętnicze i nie przeszczepiona, wykazywała barwienie desminowe tylko w mięśniówce, co pokazano na fig. 4c. Również żylne części przeszczepów żylnych wykazywały barwienie desminowe komórek mięśni gładkich tylko w mięśniówce. Duże ilości komórek mięśni gładkich w mięśniówce zabarwiły się dodatnio przeciwciałem względem desminy, wyników nie pokazano. Nie zaobserwowano barwienia desminowego w tkance okołonaczyniowej lub w przydance, co świadczy o dwóch populacjach komórek syntetyzujących a-aktynę; jedna populacja zlokalizowana jest w mięśniówce (komórki mięśni gładkich; desmino-dodatnie, a-aktyno-dodatnie), a druga populacja zlokalizowana jest w przydance (fibroblasty i miofibroblasty; desmino-ujemne, a-aktyno-dodatnie).

Części żylne przeszczepów wykazywały wzrost proliferacji komórek w mięśniówce i tkance okołonaczyniowej. Duże ilości rosnących komórek w mięśniówce i w tkance okołonaczyniowej barwiły się przeciwciałami specyficznymi względem jądrowego antygenu mnożącej się komórki (PCNA), markera proliferacji komórek, co pokazano na fig. 5a. Dla porównania podobną sekcję zabarwiono odczynnikiem Verhoffa, fig. 5b oraz czerwienią Sirrius, fig. 5c. W sekcji tej zaobserwować można wczesne powstawanie nowej błony wewnętrznej naczynia na fig. 5b jako cienką ciemną warstwę z kilku komórek od światła 1 przeszczepionej żyły: Normalnie nowa błona wewnętrzna naczynia w żyle nie występuje. Silniejsze zabarwienie kolagenu w tkance okołonaczyniowej w porównaniu z mięśniówką jest bardziej widoczne przy większym powiększeniu, co pokazano na fig. 5c. Barwienie PCNA oceniono również ilościowo: 30% komórek w przeszczepionej żyle zabarwiło się dodatnio względem PCNA, podczas, gdy mniej niz 1% komórek w nie przeszczepionej żyle zabarwiło się dodatnio względem PCNA.

Wyniki te potwierdzają stosunkowo wczesny wzrost wytwarzania pozakomcirkowej matrycy przez fibroblasty, miofibroblasty i komórki mięśni gładkich w tkance łącznej i w ściance naczynia przeszczepionej żyły w reakcji na wysokie ciśnienia tętnicze. Wzrost grubości tkanki i proliferacja komórek wokół żyły, w tym w tkance łącznej w przestrzeni okołonaczyniowej (powstawanie blizn), może zapobiec korzystnemu rozszerzaniu się żyły w reakcji na ciśnienie krwi tętniczej.

Hamowanie tworzenia pozakomórkowej matrycy w komórkach naczyniowych (np. w komórkach mięśni gładkich i fibroblastach), np. syntezy kolagenu, przedstawiono w przykładach VI, DC i XIII.

Przykład II. Ludzka arterializowana żyła - model utraty drożności przeszczepów tętniczo-żylnych

W celu wykazania nasilenia się powstawania pozakomórkowej matrycy na.skut.ek arterializacji żyły u ludzi, zbadano ludzkie żyły arterializowane na drodze chirurgii obejściowej. Wyniki w przypadku ludzi są zaskakujące, gdyż zasadniczo nie wykryto proliferacji komórek, z tym, że znaczące barwienie kolagenu zaobserwowano w ściance naczynia.

Ludzkie żyły odpiszczelowe żyły służące jako obejściowy przeszczep aorto-wieńcowy usunięto pacjentowi w około 2 lata po stwierdzeniu okluzji. Przepływ krwi tętniczej naraża żyłę na normalne ciśnienia tętnicze. Części żyły przeszczepu aorto-wieńcowego pocięto do analizy histologicznej.

Części ludzkiej żyły z przeszczepów aorto-wieńcowych wykazywały wzrost grubości w tkance okołonaczyniowej i nowej błonie wewnętrznej naczynia. Uwidoczniono to przez barwienie według Verhoeffa, co pokazano na fig. 6a. Należy zauważyć wzrost grubości nowej błony wewnętrznej naczynia zastępującej mięśniówkę i spadek drożności żyły. Ta konkretna zyla jest częściowo zaokludowana na skutek zmniejszania się średnicy wewnętrznej żyty. Natomiast w przypadku normalnej ludzkiej żyły odpiszczelowej, nie narażonej na ciśnienie tętnicze i nie przeszczepionej, nie zaobserwowano zgrubienia tkanki okołonaczyniowej, oraz cienką, nie uszkodzoną i nie odciętą mięśniówkę; wyników nie pokazano.

188 628

Części ludzkiej żyły z aorto-wieńcowych przeszczepów również wykazywały znaczną ilość kolagenu w tkance okołonaczyniowej i mięśniówce. Duże ilości kolagenu zabarwiły się dodatnio czerwienią Sirius, specyficznym środkiem barwiącym dla kolagenu włóknistego (w tym typu I i III), w tkance okołonaczyniowej i mięśniówce, co pokazano na fig. 6b.

Części ludzkiej żyły z przeszczepów wykazywały niewielką ilość a-aktyny w nowej błonie wewnętrznej naczynia oraz brak a-aktyny w tkance okołonaczyniowej, z wyjątkiem dodatniego barwienia w vasa vasorum, z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych względem a-aktyny, co pokazano na fig. 6c. Brak zabarwienia w mięśniówce i w tkance okołonaczyniowej oznacza, że niewiele komórek wytwarza a-aktynę. Zamiast specyficznego względem a-aktyny sekcje te, co pokazano na fig. 6b, intensywniej barwiły się względem kolagenu, co oznacza, ze tkanka bliznowacąca wypełniła zarówno tkankę okołonaczyniowąjak i ściankę naczynia..

Części ludzkiej żyły przeszczepów tetniczo-żylne nie wykazywały proliferacji komórek w mięśniówce i tkance okołonaczyniowej. W mięśniówce i tkance okołonaczyniowej nie stwierdzono komórek barwiących się za pomocą przeciwciał specyficznych względem jądrowego antygenu mnożącej się komórki (PCNA), markera proliferacji komórek, co pokazano na fig. 6d. Nawet przy powiększeniu 25 x zaobserwowano niewiele dodatnio barwiących się komórek. Barwienie PCNA oceniono również ilościowo stwierdzając, że mniej niz 1% komórek w przeszczepionej ludzkiej żyle barwi się dodatnio względem PCNa.

Przykład III. Hodowle ludzkich i świńskich naczyń krwionośnych - model do badania skuteczności nieluminalnego dostarczania oligonukleotydu i hamowania reakcji naczynia na uszkodzenie

W celu wykazania skuteczności oligonukleotydu według wynalazku w hamowaniu wytwarzania pozakomórkowego białka matrycowego i upośledzenia naczyniowego po przetoce tętniczo-żylnej lub obejściu opracowano najpierw model hodowli narządów. Model ten umożliwia śledzenie wchłaniania oligonukleotydu, pobudzania komórek naczyniowych przez łańcuch B czynnika wzrostowego pochodzącego z płytek krwi (oznaczany w opisie jako „PDGF”) oraz hamowanie pobudzania przez PDGF komórek naczyniowych przez oligonukleotydy stosowane według wynalazku.

W przypadku hodowli świńskich naczyń krwionośnych wycięto wewnętrzne sutkowe lub szyjne tętnice (n = 3) i pocięto na pierścienie o szerokości około 5-15 mm. Pierścienie inkubowano w warunkach hodowli narządów przez różne okresy czasu zaznaczone poniżej. W przypadku modelu hodowli ludzkich naczyń krwionośnych odpiszczelowe żyły wycięto pacjentom, u których wykonywano obejścia chirurgiczne. Po wycięciu niewykorzystane fragmenty żyły pocięto na pierścienie o szerokości około 5-15 mm.

Aby ocenić wpływ oligonukleotydów c-myc na proliferację świńskie pierścienie naczyniowe inkubowano w 37°C w pożywce pozbawionej surowicy (DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's-Medium) z antybiotykami i 1% środka Neutrodoma) przez 4 dni z dodatkiem lub bez 100 ng/ml PDGF, o ile nie zaznaczono tego inaczej. PDGF normalnie pobudza komórki naczyniowe, np. komórki mięśni gładkich i fibroblasty, do proliferacji i, jak to stwierdzono, uwalniany jest przez płytki krwi po uszkodzeniu tkanki, aby przyspieszyć gojenie się ran. Proliferację komórek wy wołaną przez PDGF określano na podstawie barwienia PCNA w opisany sposób. Nawet po 4 dniach pierścienie zachowywały morfologię.

Świńskie naczynia krwionośne w hodowli narządów reagują na pobudzanie PDGF. Świńskie naczynia krwionośne w hodowli narządów zawierają komórki barwiące się dodatnio względem PCNA w przydance i mięśniówce, co pokazano na fig. 7a. Brunatne zabarwienie jądrowe reprezentuje komórki zabarwione PCNA, natomiast komórki zabarwione na czerwono są barwione hematoksyliną i eozyną jako przeciwbarwienie. Procent dodatniego barwienia komórek względem PCNA wynosił 15 ± 5% (n = 3). Kontrolne naczynia krwionośne inkubowane tylko pożywce bez PDGF nie wykazywały znaczącego barwienia PCNA. Mniej niż 1% komórek zabarwiło się dodatnio względem PCNA, co pokazano na fig. 7b.

Oligonukleotydy stosowane według wynalazku hamują wywołane przez PDGF pobudzanie hodowli świńskich naczyń krwionośnych. Dodatek oligonukleotydu (SEQ ID No:l) w stężeniu 16 μΜ hamował wywołaną przez PDGF proliferację komórek, co pokazano na

188 628 fig. lc. Po inkubowaniu przez 4 dni z oligonukleotydami barwienie PCNA wynosiło 2 ± 0,2% (n = 3; p < 0,001 w porównaniu z samym PDGF).

Aby umożliwić dyfuzję oligonukleotydów do ścianki naczynia ludzkiej żyły, ludzkie żyły odpiszczelowe inkubowano z oligonukleotydem. Oligonukleotydy stosowane według wynalazku szybko dyfundują do ludzkiej żyły w hodowlach narządów. Dodatek oligonukleotydu znaczonego na końcach fluoresceiną (SEQ ID No:l) w stężeniu 100 pM do hodowli narządów powodował szybką, zależną od czasu dyfuzję znaczonego oligonukleotydu do ludzkiej żyły przy czasach inkubacji 2 s (w temperaturze pokojowej), 30 minut (37°C), 1 godzina (37°C) i 3 godziny (37°C), co pokazano odpowiednio na fig. 8a - 8d. Znaczone oligonukleotydy dyfundowały zarówno przez światłową powierzchnię żyły jak i okołonaczyniową powierzchnię żyły. Z czasem oligonukleotydy umiejscowiają się zarówno w komórkach jak i jądrach komórkowych. Inkubowane bez oligonukleotydów w celach kontrolnych ludzkie żyły wykazywały niewielką autofluorescencją nawet przy czasach ekspozycji przez migawkę 2-3 razy dłuższych niż w przypadku żył inkubowanych z oligonukleotydem.

Dane te potwierdzają, ze oligonukleotydy stosowane według wynalazku hamują wywołane przez PDGF pobudzanie komórek naczyniowych w ściance naczynia. Dane te wykazują również skuteczność podawania oligonukleotydu od strony tkanki okołonaczyniowej naczynia krwionośnego zamiast odświatłowego podawania oligonukleotydów. W szczególności podawanie oligonukleotydu do tkanki okołonaczyniowej można wykorzystać ex vivo do dostarczania oligonukleotydów do wyciętej żyły lub tętnicy stosowanej w żylnych przeszczepach oraz mnych typach przeszczepów naczyniowych. Ponadto tkankę okołonaczyniową można poddać działaniu oligonukleotydów według wynalazku in vivo, aby umożliwić transport oligonukleotydów do ścianki naczynia, aby zapobiec pogrubianiu ścianki naczynia i tkanki okołonaczyniowej.

Przykład IV. Dwa świńskie modele in vivo wykazujące okołonaczyniowe podawanie oligonukleotydów

W celu wykazania skuteczności okołonaczyniowego podawania oligonukleotydów stosowanych według wynalazku zbadano dwa świńskie modele in vivo. W pierwszym modelu odsłonięto chirurgicznie świńską żyłę udową i oligonukleotyd wstrzyknięto wokół tkanki łącznej tkanki okołonaczyniowej. W drugim modelu nie wykonywano zabiegu chirurgicznego i oligonukleotyd wstrzyknięto przezskómie do tkanki łącznej wokół świńskiej żyły. Modele te umożliwiają śledzenie wchłaniania oligonukleotydu po podaniu przez 1) okołonaczyniową iniekcją przed lub po wykonaniu przeszczepu tętniczo-żylnego, ale przed zamknięciem miejsca operacji lub 2) przezskórną iniekcję do tkanki okołonaczyniowej w przypadku, gdy wymagane jest powtórne podawanie pooperacyjne. Znaczone na końcach fluoresceiną oligonukleotydy (SEQ ID No:l) wstrzykiwano w stężeniu 100 pM (10 mg) w przypadku obydwu modeli stosując igłę nr 22.

Wchłanianie in vivo oligonukleotydu następowało szybko po bezpośrednim, okołonaczyniowym podaniu oligonukleotydu do chirurgicznie odsłoniętej żyły. Fluorescencję można zaobserwować w jądrach komórek zlokalizowanych w naczyniu i tkance okołonaczyniowej wciągu 30 minut (wyników nie pokazano) i po 2 godzinach (fig. 9a), co świadczy o tym, ze oligonukleotydy przedyfundowały przez bariery dyfuzyjne ścianki naczynia i tkanki okołonaczyniowej.

Wchłanianie in vivo oligonukleotydu następowało również szybko po przezskórnej iniekcji. Fluorescencję można zaobserwować w jądrach komórek zlokalizowanych w naczyniu i tkance okołonaczyniowej w ciągu 30 minut (fig. 9b) i po 3 godzinach (fig. 9c), co świadczy o tym, że oligonukleotydy przedyfundowały przez bariery dyfuzyjne ścianki naczynia i tkanki okołonaczyniowej.

Wyniki te potwierdzają, że okołonaczyniowe podawanie stanowi odpowiedni sposób wprowadzania oligonukleotydów stosowanych według wynalazku do przeszczepów, zwłaszcza okołonaczyniowe podawanie oligonukleotydów do przeszczepów tętniczo-zylnych i zylnych. Oligonukleotydy można zasadniczo wstrzykiwać w pokazany sposób, albo też oligonukleotydy można podawać innymi sposobami zapewniającymi doprowadzenie oligonukleotydu do tkanki okołonaczyniowej takimi, jak wszczepialne zbiorniczki, żele lub matryce zapewniające przedłużone uwalnianie, oraz impregnowane oligonukleotydem tkanki albo elementy

188 628 takie, jak rurki z PTFE, jak to przedstawiono w opisie. Tego typu sposoby podawania dookolonaczyniowego można wykorzystać do dostarczania oligonukleotydów według wynalazku w celu zapobiegania pogrubianiu się tkanki okołonaczyniowej lub ścianki naczynia w przeszczepach tętniczo-zylnych, zwłaszcza w żylnej części miejsca dostępu do wykonywania hemodializ u pacjentów, którym wykonuje się hemodializę. Powodzenie przezskómych iniekcji oznacza również skuteczność powtarzanego podawania oligonukleotydów do przeszczepu tętniczo-żylnego, zwłaszcza do żylnej części miejsca dostępu do wykonywania hemodializ u pacjentów', którym wykonuje się hemodializę. Oprócz zapewniającego powodzenie doprowadzania oligonukleotydów od okołonaczyniowej strony żyły, odświatłowe dostarczanie do tętnic przedstawiono w przykładach VIII, XVIII i XIX.

Przykład V. Procedura klinicznego miejsca dostępu do wykonywania hemodializy

Pacjentom wymagającym po raz pierwszy miejsca dostępu do wykonywania hemodializ lub zastąpienia niewydolnych miejsc będzie się podawać oligonukleotydy stosowane według wynalazku. Dotyczyć to może przetoki typu PTFE lub przetoki Brescia-Cimino.

Pacjenci będą otrzymywać oligonukleotydy o sekwencjach SEQ ID No. 1, 5 lub 6. Oligonukleotydy będą zawierać połączenia fosforotionianowe lub połączenia amidanowe. Liofilizowane oligonukleotydy fosforotionianowymi połączeniami zawiesza się w buforze w podany sposób. Oligonukleotydy z fosforotionianowymi lub amidanowymi połączeniami syntetyzuje się zgodnie z podanymi procedurami i utrzymuje się w sterylnych warunkach. Oligonukleotydy z różnymi sekwencjami będą podawane osobno, a pacjenci będą otrzymywać tylko jedną sekwencję podczas leczenia.

Pacjentom podaje się 1-10 mg oligonukleotydu podczas wykonywania miejsca dostępu do wykonania hemodializy. Oligonukleotydy wstrzykuje się do tkanki okołonaczyniowej po stronie żylnej przetoki tętniczo-żylnej za pomocą znormalizowanej igły nr 22 lub niniejszej. Operację kończy się po iniekcji. Pacjentom powtarzalnie podaje się 1-10 mg oligonukleotydów na drodze przezskómych iniekcji w odstępach tygodniowych przez 6 miesięcy. Przezskóme iniekcje u pacjentów z trudno wyczuwalnymi żyłami będą monitorowane z wykorzystaniem sonogramów. W innych przypadkach iniekcje będą naprowadzane przez wyczuwanie obszaru przetoki tętniczo-żylnej, zwłaszcza żylnej części przetoki.

Pacjentów monitoruje się pod względem drożności miejsc dostępu do wykonania hemodializy przez pierwszy rok. Sonogramy lub angiogramy wykonuje się po 1 tygodniu oraz po 3, 6 i 12 miesiącach. Szybkości przepływu można określić technikami dopplerowskimi i ultrasonograficznymi, przedstawionymi w opisie.

Oligonukleotyd wykorzystywany do podawania dobiera się i syntetyzuje w opisany i znany sposób. Sekwencje i metody przedstawione w tym przykładzie oraz w innych przykładach nie mogą być uważane za ograniczenia wynalazku, ale jedynie za jego konkretne rozwiązania. Inne oligonukleotydy muszą jedynie odpowiadać zaproponowanej stmkturze. W przypadku oligonukleotydów nie jest niezbędne, aby działały one zgodnie z konkretnym zaproponowanym mechanizmem, o ile działanie oligonukleotydów zostanie potwierdzone na zastosowanych modelach in vitro i in vivo.

Przykład VI. Hamowanie syntezy kolagenu w ludzkich komórkach mięśni gładkich

W przykładzie tym eksplantowane ludzkie komórki mięśni gładkich zdolne do syntetyzowania kolagenu potraktowano antysensowym oligonukleotydem c-myc lub c-myb i porównano z komórkami kontrolnymi nie traktowanymi i/lub traktowanymi „sensownym” oligonukleotydem.

Ludzkie komórki mięśni gładkich (SMC) pochodziły z odpiszczelowej żyły pacjentów, u których wykonano rutynową chirurgię obejściową. Komórki wydzielono metodą eksplantowama. Eksplanty umieszczono na szalkach do hodowli tkankowych zawierających pożywkę Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) uzupełnioną 20% zdezaktywowanej na ciepło płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 IU/ml penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny i 2 mM/ml glutaminy (CM-20). Hodowle trzymano w 37°C w wilgotnościowym klimatyzatorze w atmosferze z 5% CO2. Komórki wykazywały typowe charakterystyki morfologiczne naczyniowych komórek mięśni gładkich, czyli wrzecionowy kształt z układem szczytów i dolin. Identyfikacja naczyniowych komórek mięśni gładkich została potwierdzona na podstawie barwienia

188 628 in situ a-aktyną mięśni gładkich. Komórki hodowano do zlania i wykonywano podhodowle, co 7 dni. W doświadczeniach wykorzystywano tylko ludzkie komórki mięśni gładkich z 3 lub 4 pasazowania.

Doświadczenia wykonywano na ludzkich komórkach mięśni gładkich przed zlaniem i po zlaniu. Komórki wysiewano w ilości 10 000/cm (przed zlaniem) lub 25 000/cm² (po zlaniu) z uzupełnieniem CM-20. 3 dni po wysianiu dodawano CM-20 zawierający kwas askorbinowy (50 jig/ml). Do hodowli dodano następujące oligonukleotydy (16 μΜ) w różnych doświadczeniach:

antysensowy (('-AACGTTGAGG GGCAT) (SEQ ID No:l 1;

sensowne oligomery (5'-ATGCCCCTCA ACGTT) (SeQ ID No:2);

oligomer o niesparowanych 4 bp (5'AACGTGGATT GGCAG) (SEQ ID No:3);

oligomer rozrzucony (5'-GAACGGAGAC GGTTT) (SEQ ID No:4);

c-myb antysensowy (5-TATGCTGTGC CGGGGTCTTC GGGC)( SEQ ID No:5).

Po upływie 24 godzin pożywkę zbierano do wykonania blottingu Western, a komórki zbierano do wykonania analizy RNA. W każdym doświadczeniu wykonywano test wykluczenia z błękitem trypanowym.

Kolagen oznaczano w sposób następujący: Próbki po obróbce pepsyną (trójspiralna część kolagenu I) lub nie poddane obróbce pepsyną poddawano blottingowi Western w celu oznaczenia kolagenu. Próbki inkubowano w 4°C przez noc z pepsyną (1 mg/ml) i kwasem octowym (0,5 mola). Równe objętości próbek zatężano następnie w szybkiej wirówce próżniowej, po czym próbki rozpuszczano w buforze obciążającym żel DS. (50 mM tris HC1, pH 6,8, 100 mM ditiotreitolu, 2% SDS, 0,1% błękitu bromofenolowego i 10% gliceryny) i ogrzewano we wrzeniu przez 10 minut. Po wirowaniu przy 11 000 g przez 10 minut próbki poddawano elektroforezie przez 7,5% żel SDS-poliakrylamid i przenoszono na filtr z nitrocelulozy. Po inkubowaniu w roztworze blokującym filtry zawierające próbkę inkubowano ze znaczonym biotyną pierwotnym przeciwciałem przeciw ludzkiemu kolagenowi I i III (Southern Biotech. SC.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Filtry przemywano, a następnie inkubowano ze streptawidyną znaczoną peroksydazą chrzanową. Po dodaniu substratu reakcji filtry nakładano na błonę rentgenowską. Doświadczenia wykonywano, co najmniej dwukrotnie na odrębnych próbkach.

Ludzkie komórki mięśni gładkich stosowane we wszystkich doświadczeniach przeszły 3-4 pasaże. Uznano, że fenotyp tych komórek jest nieodwracalnie syntetyczny i jest związany z różnymi stanami chorobowymi. Wykazano, że nienormalne gromadzenie się kolagenu w ściance naczynia jest powodowane głównie przez te syntetyczne komórki. Komórki mięśni gładkich zarówno przed zlaniem jak i po zlaniu wytwarzały kolageny typu I i typu III przy pobudzaniu surowicą.

W przypadku komórek mięśni gładkich przed zlaniem następował spadek o 80% syntezy kolagenu typ I po dodaniu antysensowego oligonukleotydu c-myc w porównaniu z komórkami kontrolnymi (bez dodanego oligonukleotydu) i takimi, do których dodano sensowny oligonukleotyd c-myc. W przypadku komórek mięśni gładkich po zlaniu liczby komórek zliczanych w liczniku Coulter były podobne dla komórek kontrolnych oraz traktowanych oligonukleotydem antysensowym i sensownym. Żywotność komórek kontrolnych oraz traktowanych antysensowym i sensownym oligonukleotydem w teście wykluczenia z błękitem trypanowym wynosiła odpowiednio 97%, 96% i 95%. Kolagen typu I był niewykrywalny w komórkach poddanych działaniu antysensowego c-myc. W przypadku komórek poddanych działaniu sensownego oligomeru c-myc nie występowały różnice w poziomie kolagenu typu I w porównaniu z grupą kontrolną. Trój spiralny kolagen typu I oznaczano po trawieniu stwierdzając. ze w tym przypadku występują takie same tendencje, jak dla próbek nie traktowanych pepsyną..

W przypadku komórek mięśni gładkich przed zlaniem następował spadek o 80% syntezy prokolagenu typ I po dodaniu antysensowego oligonukleotydu c-myc w porównaniu z komórkami kontrolnymi (bez dodanego oligonukleotydu) i takimi, do których dodano sensowny oligonukleotyd c-myc. W przypadku komórek mięśni gładkich po zlaniu kolagen typu I był

188 628 niewykrywalny w komórkach poddanych działaniu antysensowego c-myc. W przypadku komórek poddanych działaniu sensownych oligonukleotydów c-myc oraz oligonukleotydów z niesparowanymi 4 bp nie stwierdzono zmniejszenia poziomu wytwarzania kolagenu w porównaniu z komórkami kontrolnymi (bez dodanego oligonukleotydu). Zmniejszenie ilości kolagenu typu I w mnożących się i będących w stanie po zlaniu komórkach mięśni gładkich sugeruje, ze hamowanie syntezy kolagenu przebiega niezależnie od hamowania wzrostu komórek przez antysensowe związki. Różne dawki (4, 8, i 16 pM) antysensowego oligonukleotydu powodowały zalezne od dawki zmniejszenie syntezy prokolagenu typu I. Żywotności komórek po działaniu różnych oligonukleotydów były porównywalne, o czym świadczy test wykluczenia z błękitem trypanowym. Ponad 90% komórek zachowało żywotność we wszystkich grupach.

W przypadku komórek mięśni gładkich po zlaniu synteza kolagenu typu I była eliminowana przez antysensowy oligonukleotyd c-myb w stężeniu 16 pM. W komórkach kontrolnych (bez dodanego oligonukleotydu) i takich, do których dodano sensowny oligonukleotyd c-myc, poziomy kolagenu typu I byłypodobne.

Wyniki te zostały dodatkowo potwierdzone w przykładach IX, XIII i XVII.

Przykład VII. Hamowanie syntezy kolagenu w ludzkich komórkach fibroblastów skóry

W tym przykładzie eksplantowane ludzkie komórki fibroblastów skóry (ludzkie FBC) potraktowano antysensowym oligonukleotydem c-myc lub c-myb i porównano z komórkami kontrolnymi nie traktowanymi i/lub traktowanymi „sensownym” oligonukleotydem. Ludzkie FBC otrzymano od pacjentów, którym wykonywano przeszczepy skóry, wydzielając je metodą eksplantacji. Eksplantowane FBC hodowano w sposób opisany powyżej dla ludzkich komórek mięśni gładkich, a antysensowe i kontrolne oligonukleotydy stosowano w identyczny sposób. W doświadczeniach wykorzystywano ludzkie FBC z 3-10 pasażowania. Syntezę kolagenu oznaczano w sposób opisany w przykładzie VI.

W przypadku ludzkich FBC po zlaniu antysensowy oligonukleotyd c-myc (8 i 16 pM) zmniejszał syntezę prokolagenu typu I w sposób zależny od dawki. Komórki potraktowane oligonukleotydem sensowym c-myc, o 4 niesparowanych zasadach rozrzuconym wykazywały podobne poziomy kolagenu typu I jak w przypadku komórek kontrolnych (bez dodanego oligonukleotydu).

Wyniki te zostały potwierdzone w przykładzie XIII.

Przykład VIII. Zmniejszenie tworzenia nowej błony wewnętrznej w świńskim modelu odsłonięcia wieńcowego

Skuteczność antysensowych związków c-myc w hamowaniu tworzenia się nowej błony wewnętrznej naczynia zbadano podając specyficzny wobec c-myc antysensowy fosforotnian oligonukleotydu (SEQ ID No:l) i placebo (SEQ ID No:21) do miejsca angioplastyki wieńcowej na standardowym świńskim modelu z wykorzystaniem konwencjonalnych procedur; patrz np. Karaś i inni, J. Am. Coli. Card., 20:467-74 (1992); oraz Schwartz i inni, Circulation, 82:2190-2200 (1990). Krzyżówkowym świniom domowym (Sus scrofa) podano wstępnie doustnie aspirynę (650 mg), przed badaniem. Ogólne znieczulenie obejmowało domięśniową iniekcję ketaminy (12 mg/kg) i ksylazyny (8 mg/kg). Dodatkowe dawki środka znieczulającego podawano dożylnie w czasie doświadczenia. Po chirurgicznym odsłonięciu zewnętrznej tętnicy szyjnej świni podano dożylnie heparynę (10 000 jednostek) oraz dopoliczkowo nifedypinę (10 mg). Stosując cewnik wiodący 8 French SAL 1 (Medtronic Interventional Vascular, Inc., Danvers, MA) wykonano cewnikowanie ujść wieńcowych z wykorzystaniem monitorowania fluoroskopowego. Po dowieńcowej iniekcji nitrogliceryny (100 pg), ale przed podaniem antysensowego c-myc i placebo, nadwymiarowy balonik do angioplastyki zastosowano do uszkodzenia warstw błony wewnętrznej i mięśniówki ścianki naczynia, nadmuchując go do ciśnienia 6-10 atm, zaleznie od wielkości tętnicy, która wahała się od 2,0 do 3,5 mm, utrzymując ten stan przez 30 s, kolejno 3 razy. Bezpośrednio po usunięciu balonika do angioplastyki wykonano śródścienne iniekcje (1 mg/naczynie) do tętnic wieńcowych, z wykorzystaniem odrębnego porowatego balonika. Wstępnie ustalono, ze śródścienne podawanie leku było bezpieczne, gdy ciśnienie iniekcji nie przekraczało 4 atm (4053 hPa), objętość perfuzatu wynosiła 2 ml, a stosunek balonika do tętnicy wynosił około 1,4:1. c-myc antysensowe (13 replikacji) i placebo (12 replikacji) oligomery wstrzykiwano pod ciśnieniem 4 atm (4053 hPa), przy

188 628 czym podawanie trwało średnio 27 s. Dawka oligomeru wynosiła 1 mg/uszkodzoną tętnicę wieńcową. Nie stwierdzono niekorzystnych efektów związanych z podawaniem oligomerów. W miesiąc po podaniu zwierzęta uśmiercano oznaczano maksymalną powierzchnię nowej błony wewnętrznej (NA max), grubość nowej błony wewnętrznej (NT max) oraz resztkowy prześwit (RL) w miejscu uszkodzenia z wykorzystaniem morfometrii. Wyniki (średnia ± SEM) podano poniżej w tabeli 1:

Tabela 1

Oligomer (%)	Replikaty	NA max (mm²)	NT max (mm)	RL
placebo ± 6	12	0,80 + 0,17	0,48 ± 0,09	64
antysensowe ± 5	13	0,24 ± 0,06	0,20 + 0,04	81
p < 0,05		< 0,01	< 0,01

Na fig. 10 pokazano fotografię przekroju przykładowej kontrolnej (czyli, przy zastosowaniu iniekcji oligomeru sensownego) tętnicy wieńcowej w miesiąc po uszkodzeniu. Zaobserwować można znaczącą grubość nowej błony wewnętrznej naczyniowej (strzałki). Na fig. 11 pokazano fotografię przekroju przykładowej tętnicy wieńcowej, do której wprowadzono związek antysensowy Zaobserwować można znaczące zmniejszenie tworzenia się nowej błony wewnętrznej naczynia. Przy analizie maksymalnej powierzchni nowej błony wewnętrznej naczynia analizuje się w funkcji stopnia uszkodzenia (fig. 12), linie regresji reprezentujące zalezność pomiędzy powierzchnią nowej błony wewnętrznej naczynia i stopniem uszkodzenia (czyli ostrości uszkodzenia) wykazują znacząco różne nachylenia (p < 0,01). Jak to pokazano na fig. 12. antysensowe oligomery znacząco zmniejszają tworzenie się nowej błony wewnętrznej naczynia, zwłaszcza w przypadku poważniejszych uszkodzeń.

Przykład IX. Hamowanie tworzenia pozakomórkowej matrycy przez ludzkie komórki mięśni gładkich przez zastosowanie antysensowego oligonukleotydu c-myc

Przykład ten dokładniej ilustruje skuteczności zastosowania antysensowego oligonukleotydu c-myc do hamowania syntezy pozakomórkowego białka matrycowego przez ludzkie komórki mięśni gładkich, zwłaszcza prokolagenu I i III. Przykład ten potwierdza ponadto ustalenia z przykładu VI. Antysensowna obróbka znacząco zmniejsza poziomy pozakomórkowego prokolagenu w pobudzanych ludzkich komórkach mięśni gładkich (po obróbce 20% FBS).

A. Pomiar prokolagenu I i prokolagenu III metodą blottingu Western.

W celu dokładniejszego ustalenia, czy c-myc antysensowy oligonukleotyd hamował syntezę pozakomórkowych białek matrycowych, prokolagen I i III oznaczono w ludzkich komórkach mięśni gładkich.

Zarówno wewnątrzkomórkowy, jak i pozakomórkowy prokolagen (typu I i III) oznaczono z wykorzystaniem w Western. Pozostające w spoczynku ludzkie komórki mięśni gładkich utrzymywano w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z 0,5% FBS (płodowej surowicy bydlęcej). Ludzkie komórki mięśni gładkich pobudzano z dodatkiem lub bez oligonukleotydów w pożywce zawierającej 20% FBS i kwas askorbinowy (50 pg/ml). FBS jest znanym środkiem pobudzającym syntezę prokolagenu w ludzkich komórkach mięśni gładkich. W 20 godzin po dodaniu oligonukleotydów przemyto 3 razy roztworem soli buforowanym fosforanem (PBS) i wolną od surowicy pożywkę zawierającą 0,1% BSA, kwas askorbinowy i oligonukleotydy dodano do hodowli na 4 godziny. Kondycjonowany ośrodek (ośrodek z komórkami i oligonukleotydy) zebrano i dodano inhibitory proteinazy obejmujące fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF, 0,5 mM), pepstatynę (1 pg/ml) i leupeptynę (1 pg/ml). Odpowiednią warstwę komórek przemyto 3 razy zimnym PBS i przeprowadzono liżę w próbce buforu do SDS-PAGE zawierającej 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8. 20% gliceryny, 2% SDS, 5% α-merkaptoetanolu przez 30 minut w 4°C. Lizaty komórek ogrzewano następnie we wrzeniu

188 628 przez 5 minut w celu zdezaktywowania proteinaz i supematanty zebrano po odwirowaniu przy 10 000 obrotów/minutę przez 10 minut w 4°C. W wybranych doświadczeniach komórki inkubowano z oligonukleotydami w 20% FBS-DMEM przez 24 godziny i próbki hodowli poddawano przez noc trawieniu pepsyną (0,1 mg/ml) w 0,5 M kwasie octowym w 4°C. Poszczególne próbki zatęzano przez 10-krotnie odwirowanie przez kolumnę Microcon-30 (Amicon, Beverly, MA) i przechowywano w -20°C. Próbki poddawano elektroforezie na 6% (wagowo/objętościowych) żelach poliakrylamid-SDS z 4% obszarami zbierania. Rozfrakcjonowane białka przeniesiono z wykorzystaniem metod elektrycznych na membrany PolyScreen PVDF (DuPont NEN, MA) w buforze przenoszenia zawierającym 192 mM glicyny, 25 mM Tris, 0,01% SDS i 20% metanolu. Bioty blokowano w 5% odtłuszczonym mleku i inkubowano z przeciwciałami przeciw kolagenowi typu I (poliklonalne przeciwciało znaczone biotyną, Southern Biotechnology Associates, Inc. AL) i przeciw kolagenowi typu III (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) w 2,5% BSA. Membrany przemywano 3 razy PBST (PBS zawierający 0,1% Tween 20) i inkubowano z biotinylowanymi drugorzędowymi przeciwciałami (dla typu III). Bioty przemywano, a następnie inkubowano z koniugatem streptawidyna-peroksydaza (Boehringer Mannheim, Germany) przez 30 minut. Po przemyciu bioty inkubowano z odczynnikiem chemiluminescencyjnym Renaissance (DuPont NEN, MA) przez 10 s i nałożono na błonę Kodak X-Omat na 30 s - 2 minuty. Uzyskane fluorogramy analizowano metodą densytometru laserowej (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ. We wszystkich przykładach zastosowano antysensowy oligonukleotyd c-myc odpowiadający SEQ ID No:l, o ile nie zaznaczono tego inaczej.

B. Hamowanie wydzielania pozakomórkowego prokolagenu I i prokolagenu III przez antysensowe oligonukleotydy c-myc

Poziomy prokolagenu oznaczano w komórkach mięśni gładkich po zlaniu, czyli przy ustalonej gęstości, aby ograniczyć do minimum wpływ różnych szybkości wzrostu pomiędzy podgrupami doświadczeń. Znaczące zmniejszenie (90%) pozakomórkowego prokolagenu I i pozakomórkowego prokolagenu III w kondycjonowanych ośrodkach po dodaniu antysensowego oligonukleotydu c-myc, jak to wykazała analiza metodą blottingu Western (fig. 13). Wpływ ten był zależny od stężenia w zakresie 4-16 pM i wystąpił już w 3 godziny po inkubacji komórek mięśni gładkich z antysensowym oligonukleotydem c-myc (wyników nie pokazano); na zmniejszenie ilości pozakomórkowego prokolagenu I po dodaniu antysensowych oligonukleotydów nie wpływał dodatek β-aminopropionitrylu wykluczający możliwość pobudzanego przez antysensowy oligonukleotyd sieciowania kolagenu (wyników nie pokazano).

C. Antysensowe fosforotionianowe oligonukleotydy c-myc względem egzonów 1, 2 i 3 stanowią skuteczne inhibitory syntezy pozakomórkowych białek matrycowych

Aby jeszcze dokładniej potwierdzić specyficzne względem sekwencji działanie antysensowych oligonukleotydów c-myc fosforotionianowych, komórek mięśni gładkich poddano działaniu szeregu sekwencji kontrolnych obejmujących oligonukleotydy sensowne, z niesparowanymi 4 pb i rozrzucone (w doświadczeniach użyto fosforotionianowe oligonukleotydy, o ile nie zaznaczono tego inaczej). Ich wpływ na poziomy prokolagenu I w kondycjonowanych ośrodkach porównano z wpływem 3 antysensowych sekwencji ukierunkowanych przeciw różnym obszarom c-myc mRNA. Jak to pokazano na fig. 14, a znaczące zmniejszenie ilości pozakomórkowego prokolagenu I zaobserwowano po dodaniu różnych antysensowych oligonukleotydów, podczas gdy sekwencje kontrolne nie zapewniały tego efektu.

Tabela 3

SEQ.ID NO	Sekwencja oligonukleotydowa (5'-—3')	Lokalizacja ludzkiego nukleotydu c-myc\ typ oligonukleotydu
I	2	3
1	AACGTTGAGG GGCAT	559-573,	Antysensowy
2	ATGCCCCTCA ACGTT	559-573	sensowny

188 628 c d tabeli 3

1	2	3
3	AACGTGGAΤΓGGCAG	559-573	4 zasady niesparowane
4	GAACGGAGAC GGTTT	Rozrzucone
5	TATGCTGTGC CGGGGTCTTC GGGC	c-myb	Antysensowy
6	GGGAGAGTCG CGTCCTTGCT	400-419	Antysensowy
7	TCATGGAGCA CCAGGGGCTC	1264-2383	Antysensowy

D. Immunostrącanie pozakomórkowej fibronektyny i jądrowego białka c-myc

W celu zbadania wpływu sekwencji oligonukleotydów na syntezę białka, pozakomórkowej fibronektyny i białka c-myc, komórki mięśni gładkich po zlaniu inkubowano z dodatkiem lub bez oligonukleotydów ośrodku wolnym od metioniny przez 4 godziny. Następnie dodano [3⁵S]metioninę (25 μΟ/πΠ, DuPont NEN, MA) na 16 godzin i liczbę komórek zliczono w liczniku Coulter. Pozakomórkową fibronektynę w kondycjonowanym ośrodku i białko c-myc w ekstraktach z jąder komórkowych oznaczano metodą immunostrącania po znakowaniu metabolicznym.

Kondycjonowany ośrodek zebrano po dodaniu inhibitorów proteinazy i próbki zawierające równe miana inkubowano z przeciwciałami przeciw fibronektynie (Becton Dickinson, Bedford, MA) przez 4 godziny, a następnie z perełkami akrylamidowymi z białkiem A. Staphylococcus przez kolejne 2 godziny·'. Po odwirowaniu osady przemyto 3 razy, ogrzewano w temperaturze wrzenia z próbką buforu do SDS-PAGE przez 5 minut i poddano elektroforezie na 6% żelu poliakrylamid-SDS. Warstwy znakowanych komórek przemyto 3 razy zimnym PBS, po znakowaniu i lizie w 0,1% NP-40, 10 mM Tris (pH 7,9), 10 mM MgCE, 15 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 μg/ml leupeptyny i 1 μ g/ml pepstatyny.

Równolegle do testów z pozakomórkową fibronektyną wyekstrahowano jądra komórek na drodze wirowania, z wykorzystaniem nieznanych procedur. Stężenie białka w ekstraktach jądrowych oznaczono i próbki zawierające po 500 μg białka inkubowano z przeciwciałem przeciw c-myc, pan-myc, (dar od G.I. Evana), przez 12 godzin, a następnie z perełkami akrylamidowymi z białkiem A. Staphylococcus przez kolejne 90 minut. Po przemyciu perełki zebrano i ogrzewano we wrzeniu z próbką buforu do SDS-PAGE, a następnie rozpuszczalną frakcję poddano elektroforezie na SDS-PAGE. Żel wysuszono i nałożono na błonę KodakOmat w -70°C przez 5-7 dni.

E. Poziomy pozakomórkowej fibronektyny nie zostały zmienione przez antysensowe oligonukleotydy c-myc, podczas gry poziomy białka c-myc obniżyły się

W przeciwieństwie do znaczącego zmniejszenia ilości pozakomórkowych prokolagenów, poziomy pozakomórkowej fibronektyny w kondycjonowanym ośrodku nie zmieniły się znacząco (fig. 13), co wskazuje na selektywne działanie antysensowych oligonukleotydów. Inkubowame komórek mięśni gładkich po zlaniu z antysensowym oligonukleotydem c-myc (16 μM) spowodowała regulację w dół białka c-myc w ekstraktach jądrowych (fig. 15).

Przykład X. Antysensowne oligonukleotydy c-myc nie wpływają na ogólny metabolizm ludzkich komórek mięśni gładkich

W celu upewnienia się, że oligonukleotydy nie powodują innych zmian w funkcjonowaniu komórek mięśni gładkich, przeprowadzono testy integralności błony komórkowej, metabolizmu komórki i indukcji genów związanych z syntezą kolagenu lub szlakami degradacji.

Testy integralności błony komórkowej ludzkich komórek mięśni gładkich przeprowadzono z wykorzystaniem błękitu trypanowego. Ponad 95% komórek zachowało żywotność po obróbce różnymi oligonukleotydami (16 μM) w teście wykluczenia z błękitem trypanowym.

W celu ustalenia całkowitej syntezy białek próbki z kondycjonowanych ośrodków wytrącano zimnym 10% kwasem trichlorooctowym (TCA) przez 30 minut w 4°C, po czym osad przemyto 2 razy 5% TCA. Osad rozpuszczono w Solvable™ (DuPont NEN, MA) i wprowadzoną radioaktywność zmierzono w liczniku scyntylacyjnym (Pharmacia LKB Biotechnology

188 628

Inc. Piscataway, NJ). Całkowita synteza białka oznaczona poprzez wbudowanie (³⁵S)metioniny w podany sposób była porównywalna w przypadku komórek mięśni gładkich inkubowanych z dodatkiem lub bez antysensowych (SEQ ID No:1) oligonukleotydów (fig. 16). Należy podkreślić, ze pobudzanie 20% FBS spowodowało znaczący wzrost syntezy białka w porównaniu z komórkami nie pobudzanymi, do których dodano jedynie 0,5% fBs. Zastosowanie antysensowych oligonukleotydów c-myc nie powoduje zmniejszenia syntezy białka w porównaniu z próbkami kontrolnymi zawierającymi oligonukleotydy sensowne, niesparowane oraz bez oligonukleotydów.

Na dodatek poziom prokolagenu I w kondycjonowanym ośrodku został przywrócony do poziomów kontrolnych w 24 godziny po usunięciu antysensowych oligonukleotydów c-myc (fig. 17). Wyniki te wskazują, że antysensowe (SEQ ID No:1) oligonukleotydy powodują selektywne, ale odwracalne zmniejszenie ilości pozakomórkowych prokolagenów z zachowaniem normalnej aktywności metabolicznej komórek naczyniowych mięśni gładkich.

W związku z tym, że antysensowe oligonukleotydy mogą wywoływać ekspresję niedocelowych genów, zbadano aktywność kolagenolityczną i poziom γ-interferonu po obróbce antysensowymi oligonukleotydami c-myc, aby wykluczyć takie działanie niespecyficzne.

Komórki mięśni gładkich po zlaniu inkubowano z wolnym od surowicy ośrodkiem z dodatkiem lub bez oligonukleotydów Próbki ośrodka zebrano po upływie 24 godzin. Aktywność metaloproteinazy matrycowej oznaczono po selektywnej tkankowego inhibitora metaloproteinazy za pomocą ditiotreitolu i jodoacetamidu. Uśpione kolagenazy wytwarzane przez ludzkie komórki mięśni gładkich uaktywniono octanem aminofenylortęciowym, a następnie przeprowadzono inkubowanie z kolagenem typu I lub żelatyną, oznaczając produkty ro/s/czepiania metodą SDS-PAGE (metody: D.D. Dean, i inni, J. Clin. Invest., 84:678-685 (1989) oraz P.E. Desrochers, i inni, J. Biol. Chem 267:5005-5012 (1992), które wprowadza się jako źródła). Metaloproteinazy scharakteryzowano na podstawie elektroforezy żelowej SDS-substrat (czyli zymografii) w warunkach nie powodujących denaturacji, stosując jako substrat β-kazeinę lub żelatynę. Porównywalną aktywność kolagenolityczną w stosunku do kolagenu typu I i żelatyny uzyskano w kondycjonowanym ośrodku z kontrolnymi komórkami mięśni gładkich oraz po działaniu sensownymi i antysensowymi (SEQ ID No:1) oligonukleotydami (wyników nie pokazano), co sugeruje, że antysensowe oligonukleotydy c-myc nie zwiększają endogennej aktywności kolagenolitycznej.

W celu sprawdzenia, czy γ-interferon c-myc, a silny inhibitor syntezy kolagenu typu I, nie został nieumyślnie uaktywniony, oznaczono γ-interferon w ośrodku hodowli i w ludzkich komórkach mięśni gładkich. γ-Interferon był niewykrywalny w kondycjonowanym ośrodku hodowli oraz w lizatach komórek po inkubowaniu z antysensowymi (SEQ ID No:1) oligonukleotydami c-myc w metodzie ELISA.

Przykład XI. Antysensowne oligonukleotydy c-myc nie wpływają na mRNA prokolagenu-ai(I), a₂(I) i αι(III) w ludzkich komórkach mięśni gładkich,

Przykład ten wykazuje, że obróbka antysensowymi oligonukleotydami c-myc nie zmniejsza ilości mRNA prokolagenów w ludzkich komórkach mięśni gładkich.

W celu oznaczenia mRNA prokolagenu komórki mięśni gładkich po zlaniu inkubowano z dodatkiem lub bez oligonukleotydów przez 24 godziny, przemyto 3 razy zimnym PBS i przeprowadzono lizę w 4M izotiocyjanianie guanidyniowym. Całkowity mRNA wydzielono przez ekstrakcję fenolem-chloroformem, po czym przeprowadzono wytrącanie izopropanolem. Całkowity mRNA oznaczono na podstawie spektrofotometrycznej absorbancji przy 260 nm. Próbki z jednakowymi ilościami RNA (10 pg) zdenaturowano i rozdzielono na żelach 0,8% agarozy/formaldehyd, a plamy przeniesiono na membrany nitrocelulozowe. RNA zsieciowano z membranami za pomocą środka sieciującego UV (Stratagene, CA). Bioty hybrydyzowano w 42°C przez 24 godziny z sondami cDNA ludzkiego prokolagenu αι (I) (ATCC) i ludzkiego prokolagenu α₂(I) (dar od H. Kuivaniemi). Sondę dla rybozomowego RNA 7S zastosowano w celach kontrolnych. Sondy znaczono za pomocą 3²P-CTP na drodze nick-translacji do osiągnięcia aktywności właściwej ponad 10⁸ zliczeń na minutę/pg DNA. Bioty przemyto następnie w 2x, 1x, 0,5x i 0,1 x SSC-0,1% SDS w 42°C przez 15 minut. Każde przemywanie powtarzano dwukrotnie. Bioty nałożono na błonę Kodak-Omat w -70°C z ekranem intensyfikującym, na okres czasu od 6 godzin do 3 dni.

188 628

Regulacja w dół białka c-myc po obróbce antysensowymi oligonukleotydami zwiększa prawdopodobieństwo transkrypcyjnej regulacji ekspresji kolagenu. Z tego względu analizowano poziomy mRNA prokolagenu ai(I) i prokolagenu ct2(I) w komórkach mięśni gładkich po inkubowaniu z dodatkiem lub bez oligonukleotydów, z wykorzystaniem blottingu Northern. Jak to pokazano na fig. 18, antysensowy oligonukleotyd nie wpływa na poziom mRNA prokolagenu cc (I) i prokolagenu ct2(I). Podobne poziomy mRNA prokolagenu oc (III) zaobserwowano także dla układu z dodatkiem lub bez antysensowych oligonukleotydów c-myc (wyników nie pokazano). 7S RNA pozostaje w stanie nie zmienionym w warunkach wszystkich 3 doświadczeń.

Przykład XII. Wewnątrzkomórkowe nagromadzanie się protokolagenu w ludzkich komórkach mięśni gładkich poddanych działaniu antysensowych oligonukleotydów c-myc

Przykład ten wykazuje, że obróbka antysensowym oligonukleotydem c-myc powoduje wzrost poziomu prokolagenu wewnątrz ludzkich komórek mięśni gładkich. Są to wyniki zgodne z zaobserwowanym obniżaniem się syntezy prokolagenu w pozakomórkowej matrycy w obecności antysensowego oligonukleotydu c-myc.

A. Wewnętrzkomórkowe poziomy prokolagenu zwiększają się przy obróbce antysensowym c-myc

W celu zbadania mechanizmu odgrywającego rolę przy zmniejszaniu poziomu pozakomórkowego prokolagenu przez antysensowe oligonukleotydy c-myc oznaczono wydzielony i wewnątrzkomórkowy prokolagen po 4-godzinnym znakowaniu [¹⁴C] proliną.

Aby oznaczyć wewnątrzkomórkowy prokolagen po obróbce antysensowym oligonukleotydem c-myc, komórki inkubowano z dodatkiem lub bez cligonuklectydów przez 20 godzin w 20% FBS-DMEM. Pozbawiony surowicy ośrodek zawierający kwas askorbinowy (50 pg/ml), [l⁴C] prolinę (2,5 pCi/ml, DuPont NEN, MA) i oligonukleotydy dodawano do komórek na dodatkowe 4 godziny. Ośrodek hodowli zbierano i dodawano inhibitory proteinazy. Próbki ośrodka odwirowywano przez kolumnę Microcon-30 w celu usunięcia nie wbudowanego radioizotopu i zatężenia próbek do elektroforezy. Odpowiednie warstwy komórek przemyto następnie 3 razy zimnym PBS, zlizowano w buforze dla próbek SDS-PAGE i ogrzewano we wrzeniu przez 5 minut w celu zdezaktywowania proteinaz. Próbki zatężonego ośrodka, lizaty komórek (z równych ilości komórek) i oczyszczony prokolagen I z ludzkich komórek fibroblasowych skóry (dar od W. Arnolda) poddawano elektroforezie na żelach z 6% poliakrylamidu-SDS z 3% obszarami zbierania. Zele utrwalano przez 30 minut w 10% kwasie octowym, 20% metanolu, wysuszono i nakładano na błonę w -70°C na 7 dni.

Obróbka antysensowym c-myc obniżyła wydzielanie prokolagenu znaczonego [ C] proliną dając podobny wynik jak w przypadku blottingu Western DNA. Obróbka antysensowym c-myc znacząco zwiększa wewnątrzkomórkowe stężenie prokolagenu I w porównaniu z komórkami nie poddanymi obróbce oraz komórkami traktowanymi rozrzuconym oligonukleotydem (fig. 19).

B. Wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu prokolagenu nie jest spowodowany niezdolnością ludzkich komórek mięśni gładkich do hydroksylowania proliny po obróbce antysensowym oligonukleotydem c-myc

Wewnątrzkomórkowe nagromadzanie się prokolagenu może odzwierciedlać hamowanie potranslacyjnych modyfikacji niezbędnych do złożenia łańcuchów a prokolagenu w konformację potrójnej helisy. Z tego względu, aby wykluczyć tą możliwość, zmierzono wpływ obróbki antysensowym c-myc na aktywność 4-hydroksylazy prolilowej i zawartość hydrcksyproliny.

Komórki mięśni gładkich po zlaniu inkubowano z dodatkiem lub bez oligonukleotydów w 20% FBS-DMEM przez 24 godziny w sposób opisany powyżej. Warstwy komórek przemyto 3 razy zimnym PBS i przeprowadzono lizę ^w 0,2 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% Triton x-100, 0,1 M glicyny i 10 pM DTT (metody K.J. Kivirikko i inni, Methods in Enzymology, 82:245-364 (1982), które wprowadza się jako odnośniki). Lizaty poddawano obróbce ultradźwiękowej przez 30 s w lodzie i oznaczano stężenie białka. Pozostałe lizaty komórek odwirowywano przy 13 000 obrotach/minutę przez 20 minut w 4°C.

W próbkach supernatantu zbadano aktywność 4-hydroksylazy prolilowej mierząc powstawanie radioaktywnej 4-hydroksyproliny przy wykorzystaniu prokolagenu I znaczonego

188 628 [^l4C] proliną jako substratu (metoda K.J. Kivirikko, i inni., Anal. Biochem., 19:249-255 (1967), którą wprowadza się jako odnośnik). Próbki lizatu komórek hydrolizowano i hydroksyprolinę oznaczano zgodnie z określoną procedurą chemiczną.

Aktywność 4-hydroksylazy prolilowej, kluczowego enzymu regulującego powstawanie potrójnej helisy, była podobna w różnych podgrupach doświadczeń. Wynosiła ona 11,7 ± 0,1 (rozpadów na minutę/pig białka, średnia ± SD dla 2 odrębnych doświadczeń) w kontrolnych komórkach mięśni gładkich nie poddanych obróbce oligonukleotydami, 12 ± 2,3 w komórkach inkubowanych z rozrzuconymi oligonukleotydami (16 μΜ) i 10,5 ± 2,0 po obróbce antysensowymi oligonukleotydami c-myc (16 μΜ).

Zawartość hydroksyproliny była wyższa w przypadku komórek z antysensowymi c-myc (SEQ ID No:l) niż w przypadku komórek nie poddanych obróbce lub poddanych obróbce rozrzuconymi oligonukleotydami (fig. 20). Wzrost zawartości hydroksyproliny odzwierciedla wzrost poziomów prokolagenu będącego substratem dla 4-hydroksylazy prolilowej.

Przykład XIII. Hamowanie wytwarzania pozakomórkowej matrycy w ludzkich fibroblastowych komórkach skóry z wykorzystaniem antysensowych oligonukleotydów c-myc

Przykład ten dokładniej wykazuje skuteczność obróbki za pomocą antysensowego oligonukleotydu c-myc w hamowaniu syntez pozakomórkowych białek matrycowych przez ludzkie fibroblastowe komórki skóry, zwłaszcza prokolagenu I i III. Antysensowna obróbka znacznie zmniejsza pozakomórkowe poziomy prokolagenu w pobudzanych ludzkich fibroblastowych komórkach skóry (potraktowanych 20% FBS). Przykład ten potwierdza także ustalenia z przykładu VII.

A. Test na pozakomórkowy i wewnątrzkomórkowy kolagen I i III z wykorzystaniem blottingu Westema

W celu dokładniejszego sprawdzenia, czy antysensowe oligonukleotydy c-myc hamują syntezę pozakomórkowego i wewnątrzkomórkowego prokolagenu I i III w ludzkich fibroblastach skóry, oznaczono poziomy prokolagenu, w sposób podany dla ludzkich komórek mięśni gładkich w przykładach IX i XII. W doświadczeniach z ludzkimi komórkami fibroblastowymi skóry zastosowano komórki po zlaniu. Komórki otrzymano z hodowli jak w przykładzie VII, znanymi sposobami.

B. Szybkie hamowanie wydzielania pozakomórkowego kolagenu I i III przez obróbkę antysensowym oligonukleotydem c-myc

Doświadczenia te wykazują, że antysensowe oligonukleotydy c-myc hamują wydzielanie pozakomórkowego kolagenu I i III przez ludzkie fibroblasty skóry w sposób zależny od dawki i zależny od antysensowej sekwencji wraz z szybkim przebiegiem hamowania w czasie.

Aby dokładniej ustalić reakcję na dawkę oraz antysensową specyficzność antysensowych oligonukleotydów c-myc w hamowaniu powstawania pozakomórkowej matrycy, oznaczono pozakomórkowy kolagen I z wykorzystaniem blottingu Western białka z ludzkich komórek fibroblastowych wydzielonych z różnie traktowanych ludzkich fibroblastów. Ludzkie kompozycje fibroblastów poddano działaniu rozrzuconych oligonukleotydów (SEQ ID No:4; 16 μΜ), niesparowanych oligonukleotydów (SEQ ID No:3, 16 μΜ), antysensowych oligonukleotydów (SEQ ED No:l, 4, 8 i 16 μΜ) lub bez oligonukleotydów przez 24 godziny w opisany sposób i białka z tych komórek poddano analizie w celu oznaczenia kolagenu I w biotach Westerna przedstawionych na fig. 21, odpowiednio ścieżki 1-5. Podwójne pasmo odzwierciedla łańcuchy kolagenu OC|(I) i a₂(I), odpowiednio pasmo dolne i górne. Komórki po obróbce antysensowej wykazują spadek poziomu kolagenu I proporcjonalnie do wzrostu poziomów antysensowego oligonukleotydu c-myc, natomiast przy obróbkach kontrolnych (bez oligonukleotydu oraz z oligonukleotydem rozrzuconym i niesparowanym) ilości kolagenu są wyzsze niz przy zastosowaniu antysensowego oligonukleotydu c-myc w najnizszym stężeniu. Oligonukleotyd (SEQ ID No:l; 16 μΜ) hamował również proliferację komórek świeżo wysianych fibroblastach; w porównaniu z zastosowaniem 20% FBS i sensownego oligonukleotydu kontrolnego proliferacja komórek została zahamowana po 4 dniach odpowiednio o 25 i 50%. Wyniki te w połączeniu z innymi wynikami przedstawionymi w opisie, a zwłaszcza z brakiem regulacji w górę szlaków degradacji kolagenu i prokolagenu przez obróbkę antysensową c-myc, wykazują, że obróbka antysensowym c-myc powoduje hamowanie wytwarzania pozakomórkowej matrycy, zwłaszcza wydzielania prokolagenu I.

188 628

Badanie przebiegu w czasie wydzielania kolagenu I przy obróbce antysensowym oligonukleotydem c-myc ludzkich komórek fibroblastowych skóry wykazało szybkie hamowanie wydzielania nowo zsyntetyzowanego kolagenu I. W czasie 0 komórki fibroblastowe skóry poddano działaniu świeżego ośrodka (w użytym znaczeniu „świeży ośrodek” stanowi ośrodek zawierający 20% FBS i kwas askorbinowy (50 pg/ml) oraz inne wymienione składniki) bez oligonukleotydów, z rozrzuconymi oligonukleotydami albo z antysensowymi oligonukleotydami na 24 godziny (stężenie oligonukleotydów wynosiło 16 pM; SEQ ID Nr:1 i 3). Po 3, 6 i 24 godzinach pobrano próbki każdej z hodowli komórek i wykonano analizę w celu stwierdzenia obecności kolagenu I, metodą blottingu Westerna, w opisany sposób. Zmniejszenie poziomu kolagenu I zaobserwowano w przypadku komórek po obróbce antysensowej w porównaniu z komórkami kontrolnymi (bez obróbki lub z oligonukleotydem rozrzuconym) już po 3 godzinach. Po 24 godzinach komórki po obróbce antysensowej wydzieliło się, co najmniej 5-10 razy mniej kolagenu I niż komórki kontrolne. Po 6 godzinach uzyskano wyniki pośrednie.

Także wydzielanie kolagenu III przez ludzkie komórki fibroblastowe jest hamowane przez antysensowe oligonukleotydy c-myc. Ludzkie komórki fibroblastów zadano świeżym ośrodkiem nie zawierającym oligonukleotydów, 16 pM rozrzuconych oligonukleotydów lub 16 pM antysensowych oligonukleotydów c-myc na 24 godziny i obecność pozakomórkowego kolagenu III w ośrodku oceniano po upływie 24 godzin. Nie zaobserwowano kolagenu III w komórkach po obróbce antysensowej, podczas gdy komórki kontrolne (nie poddane obróbce lub po obróbce rozrzuconym oligonukleotydem) wykazywały obecność kolagenu III (co najmniej 10-100 razy wyższy poziom kolagenu III w porównaniu z komórkami po obróbce antysensowej).

Wyniki te w połączeniu z innymi wynikami przedstawionymi w opisie wykazują, że obróbka antysensowym c-myc powoduje hamowanie wytwarzania pozakomórkowej matrycy, zwłaszcza wydzielania prokolagenu I i III.

C. Nagromadzame wewnątrzkomórkowego prokolagenu I i równoczesne obniżanie pozakomórkowego prokolagenu I przez obróbkę aotyseosowymi oligonukleotydami c-myc

Hamowanie wydzielania prokolagenu w wyniku obróbki antysensowym c-myc ludzkich komórek fibroblastowych związane jest z nagromadzaniem się wewnątrzkomórkowego prokolagenu I. Ludzkie komórki fibroblastów zadano świeżym ośrodkiem nie zawierającym oligonukleotydów, 16 pM rozrzuconych ollgooukleotydók lub 16 pM antysensowych oligonukleotydów c-myc na 24 godziny i obecność pozakomórkowego kolagenu I oraz wewnątrzkomórkowego prokolagenu odpowiednio w ośrodku i ludzkich komórkach fibroblastów oznaczano z wykorzystaniem białkowych produktów syntezy znaczonych C¹⁴ proliną, rozdzielanych w opisany sposób. Na fig. 22 główne pasma na ścieżkach 1-3 dotyczą łańcuchów prokolagenu ai(I, III) i a₂(I). Ilość wydzielonego prokolagenu I jest 10-20 razy mniejsza w przypadku .komórek po obróbce antysensowej niż dla komórek kontrolnych (bez obróbki lub po obróbce rozrzuconymi oligonukleotydami, odpowiednio ścieżki 1 i 2). Górne pasmo na ścieżkach 1-3, o około 116 Kd („górne pasmo”) odpowiada prokolagenowi α (I, III); dolne pasmo na ścieżkach 1-3 (od lekej do prawej) o około 100 Kd odpowiada α₂(I). Na fig 22 poziom wewnątrzkomórkowego prokolagenu I jest, co najmniej 5 razy wyższy w przypadku komórek po obróbce antysensowej niż dla komórek kontrolnych (ścieżki 4 i 5). Na fig. 22 ścieżka 7 przedstawia markery ciężaru cząsteczkowego.

Tak więc wyniki te wykazują, że obróbka aotysensokym c-myc powoduje zmniejszenie wydzielania prokolagenu przez ludzkie komórki fibroblastoke oraz wzrost ilości proko^mu w komórkach.

Przykład XIV. Aotyseosowne oligonukleotydy c-myc nie zmieniają stabilności cieplnej wewnątrzkomórkowego prokolagenu w ludzkich fibroblastach skóry

Trzeciorzędowa struktura wewnątrzkomórkowego prokolagenu nie została zmieniona w wyniku obróbki aotysensokym c-myc. Ludzkie komórki fibroblastowe zadano świeżym ośrodkiem nie zawierającym oligonukleotydu albo zawierającym 16 pM rozrzuconych oligooóklrotydów lub 16 pM antyseosokych ollgonókleotydók c-myc, na 24 godziny. Temperaturę topnienia proko^mu w każdym doświadczeniu zmierzono w opisany i znany sposób. Na fig 23 pokazano, że profile topnienia dla komórek kontrolnych (nie poddanych obróbce

188 628 i po obróbce oligonukleotydami rozrzuconymi) oraz po obróbce antysensowej są podobne. Wyniki te wykazują, że prokolagen obecny w komórkach poddanych obróbce antysensowej zachowuje normalną konformację potrójnej helisy, taką samą jak w komórkach po obróbce kontrolnej.

Tak więc obróbka antysensowym c-myc nie prowadzi do wykrywalnych zmian struktury prokolagenu, która mogłaby doprowadzić do zwiększonej degradacji wewnątrzkomórkowej lub zmniejszenia wynoszenia białka z komórki.

Przykład XV. Działanie antysensowym oligonukleotydem c-myc nie zmienia poziomu mRNA prokolagenu α/I) w ludzkich fibroblastach skórnych

Przykład ten wykazuje, że obróbka antysensowym oligonukleotydem c-myc nie hamuje syntezy pozakomórkowego białka matrycowego przez ludzkie fibroblastowe komórki skórne, zwłaszcza prokolagenu I, poprzez zmniejszanie poziomu mRNA prokolagenu. Antysensowna obróbka nie zmniejsza poziomów mRNA prokolagenu w pobudzanych ludzkich fibroblastowych komórkach skórnych (potraktowanych 20% FBS).

A. Oznaczanie mRNA prokolagenu a,(I)

Wydzielanie RNA i analizę metodą blottingu Western przeprowadzono w sposób następujący: Komórki przemyto 3 razy zimnym buforem PBS i poddano lizie w 4M izotiocyjanianie guanidyniowym. RNA wyekstrahowano fenolem/chloroformem i oznaczono ilościowo spektrofotometrycznie na podstawie absorbancji przy 260/280 nm. Próbki RNA (20 pg) na żelach 0,8% agarozy/formaldehyd. Po przeniesieniu RNA na filtry nitrocelulozowe bioty utrwalono przez napromieniowanie nadfioletem. Bioty wstępnie hybrydyzowano w 5x standardowym roztworze soli z cytrynianem, 2x roztworze Denhardta, 0,1% SDS i 0,2 mg/ml zdenaturowanego DNA z ikry łososia przez, co najmniej 4 godziny w 65°C. Hybrydyzację prowadzono przez noc stosując ten sam bufor zawierający cDNA znaczony radiacyjnie 32P dCTP na drodze nick-translacji do uzyskania aktywności właściwej około 108-109 zliczeń na minutę/pg. Bioty przemywano w 65°C w 0,5x w standardowym roztworze soli z cytrynianem i 0,1% SDS. Filtry nałożono na błonę Kodak X-Omat w -70°C prowadząc ekspozycję przez 1-5 dni z ekranami intensyfikującymi. Autoradiografię uzyskanych biotów Northern oszacowano ilościowo na podstawie densytometru skaningowej i całkowania powierzchni pików. W badaniach tych zastosowano następujące sondy: 1,8 Kb pro-α 1(1) (HF-677) cDNA odpowiadający COOH-końcowemu propeptydowi i karboksylowej końcowej części obszaru potrójnej helisy ludzkiego łańcucha pro-α 1(1) prokolagenu typu I (Chu i inni, Nucleic Acids Res. 10:5925-5934,1982).

B. Obróbka antysensowym c-myc nie powoduje zmniejszania poziomów mRNA prokolagenu αι (I)

Obróbka antysensowym c-myc nie wpływa na poziom mRNA prokolagenu αι I w ludzkich komórkach fibroblastowych. Ludzkie komórki fibroblastowe zadano świeżym ośrodkiem nie zawierającym oligonukleotydów, 16 pM rozrzuconych oligonukleotydów lub 16 pM antysensowych oligonukleotydów c-myc na 24 godziny. mRNA oczyszczano dla każdego doświadczalnego przypadku i poddawano analizie w celu stwierdzenia obecności mRNA prokolagenu a I, w opisany i znany sposób. Na fig. 24 pokazano, że poziomy mRNA prokolagenu a I w komórkach kontrolnych (nie poddanych obróbce i po obróbce rozrzuconym oligonukleotydem; odpowiednio ścieżki 1 i 2) są podobne do poziomów mRNA prokolagenu α I w komórkach po obróbce antysensowej (ścieżka 3). Wyniki te wykazują, że obróbka antysensowym c-myc ludzkich komórek fibroblastowych nie powoduje regulacji w dół transkrypcji mRNA genu prokolagenu α I.

Tak więc wyniki dotyczące mRNA w połączeniu z innymi przedstawionymi wynikami wykazują, ze obróbka antysensowym c-myc zmniejsza wydzielanie prokolagenu I i III, białek, które prowadzą do syntezy kolagenu w matrycy pozakomórkowej.

Przykład XVI. Antysensowne oligonukleotydy c-myc nie wpływają na przywrócenie syntezy pozakomórkowego białka matrycowego po wygaśnięciu obróbki antysensowym oligonukleotydem c-myc ludzkich fibroblastów skórnych

Zdolność ludzkich komórek fibroblastowych do syntetyzowania kolagenu I po usunięciu stosowanego do obróbki antysensowego oligonukleotydu c-myc nie zostaje naruszona. Ludzkie komórki fibroblastowe zadano świeżym ośrodkiem nie zawierającym oligonukleotydów,

188 628 pM rozrzuconych oligonukleotydów lub 16 pM antysensowych oligonukleotydów c-myc na 24 godziny. Ludzkie komórki fibroblastowe z każdego z doświadczeń zadano następnie świeżym ośrodkiem nie zawierającym żadnego oligonukleotydu i zbadano obecność pozakomórkowego kolagenu I w opisany sposób. Na fig. 25 pokazano, że komórki kontrolne (nie poddane obróbce i po obróbce rozrzuconym oligonukleotydem) i komórki po obróbce antysensowej wytwarzają zbliżone ilości pozakomórkowego kolagenu I w 24 godziny po zaprzestaniu obróbki. Wyniki te wykazują, że po 24 godzinach następuje całkowite odtworzenie wytwarzania kolagenu przez ludzkie komórki fibroblastowe poddane obróbce antysensowym c-myc.

Tak więc obróbka antysensowym c-myc nie wywołuje efektów toksycznych, które mogłyby doprowadzić do niezdolności komórki do przywrócenia poziomów wydzielanego prokolagenu sprzed obróbki.

Przykład XVII. Hamowanie syntezy pozakomórkowej matrycy w świńskich tętnicach wieńcowych

Przykład ten dokładniej wykazuje skuteczność in vivo miejscowej obróbki antysensowym oligonukleotydem c-myc w zmniejszaniu postępu tworzenia pozakomórkowej matrycy po urazie tkankowym. Przykład ten wykazuje ponadto skuteczność in vivo obróbki antysensowym c-myc w zmniejszaniu postępu bliznowacenia wewnętrznego narządu, a także w zmniejszaniu postępu bliznowacenia tkanki związanego z syntezą cząsteczek pozakomórkowej matrycy, takich jak cząsteczki kolagenu.

A. Hamowame wytwarzania włóknistego matermłu pozakpmarkowej matrycm przcz pbróbkę αntzseósewym ellgoóukleotydem c-myc

W celu ustalenia wpływu obróbki antysensowym c-myc na postęp syntezy pozakomórkowej matrycy po urazie tkanki serca świń uszkodzono in vivo, zastosowano eligoóagleotydy w sposób opisany w przykładzie VIII (o ile nie zaznaczono tego inaczej) i uśmiercono po 3, 7 i 28 dniach od podania oligeóugleotydów. Zastosowano takie same antysensowe i sensowne ellgonugleotydy (SEQ ID No:l i 2) i dawki (1 mg/tętnicę), co w przykładzie VIII.

W przekrojach tętnic wieńcowych po urazie (uszkodzeniu) świń po obróbce anty sensowej widoczne są różnice w mikroskopowej architekturze pozakemórkeweJ w porównaniu z pourazowymi tętnicami wieńcowymi po obróbce sensownej. Pourazowe tętnice wieńcowe z każdej grupy doświadczalnej zbadano jako ślepe próbki pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 20-62x. Tkanki zabarwiono odczynnikiem Verhoffa-Van-Giesoóa w znany sposób, aby uwidocznić komórki i matrycę pozakomórkową, oraz czerwienią Sirius, w znany sposób, aby uwidocznić kolagen. W przypadku naczyń poddanych obróbce aótyseósewym c-myc, w których widoczny był mniejszy obszar nowej błony wewnętrznej w porównaniu z naczyniami kontrolnymi, mniejsze było także zabarwienie na czerwono niż w przypadku naczyń kontrolnych (po obróbce sensownej). Tętnice wieńcowe po obróbce aótyseóSOweJ wykazywały mniej pozakomórkowego materiału włóknistego niż tętnice wieńcowe po obróbce sensownej; w przypadku tętnic wieńcowych po obróbce aótyseósowej mniejsze były również przestrzenie pezakomórkowe pomiędzy komórkami. Oceniono także proliferację komórek mięśni gładkich nowej błony wewnętrznej z wykorzystaniem immunobarwienia względem PCNA (jądrowego antygenu mnożącej się komórki) po obnażeniu balonikowym i wprowadzeniu przez cewnik sensownych (S) i aótyseósowych (AS) ollgeóukleotydów c-myc (1 mg) do świńskich tętnic wieńcowych, patrz tablica 4. Obróbka aótzsensowa' tętnic wieńcowych hamuje postęp proliferacji komórek mięśni gładkich spowodowaną przez uraz tkanki w porównaniu z obróbką sensowną tętnic wieńcowych. Barwienie PCNA umożliwiło ocenę liczby mnożących się komórek w danym przekroju nowej błony wewnętrznej. Zazwyczaj zliczano 200-1000 komórek, po czym wyliczano procent mnożących się komórek mięśni gładkich wyrażając go jako wskaźnik proliferacji. Wielkości wskaźnika proliferacji (PI), stosunku nowej błony wewnętrznej do mięśniówki (I/M) oraz zmniejszenia stosunku I/M (Al/M) były następujące:

188 628

Tabela 4

Dzień	Rx	n	P* (%)	Stosunek I/Μ	AI/Μ (%)
3	S	4	5 ± 2	0,09 ± 0,03
	AS	8	3 ± 5	0,05 ± 0,02	144
7	S	4	47 ± 13	0,28 ± 0,04
	AS	8	11± 13**	0,12 ±0,05**	157
28	S	6	N/A	1,19 ±0,51
	AS	4	N/A	0,47 ± 0,30*	161

P* - komórki mnożące się/całkowita liczba komórek x 100; *p < 0,05, **p, 0,01 N/A - me oznaczono

W tętnicach wieńcowych o zmniejszonym stosunku I/Μ średnica światła jest korzystniejsza. Wyniki te wykazują, że miejscowa obróbka antysensowym c-myc hamuje wzrost komórek mięśni gładkich i tworzenie się matrycy pozakomórkowej w czasie.

Tak więc miejscowa obróbka antysensowym c-myc hamuje postęp tworzenia się blizn w tkance pourazowej, np. tworzenie się blizn w tętnicach wieńcowych po urazie na skutek angioplastyki balonikowej powodującej proliferację komórek mięśni gładkich oraz tworzenie się matrycy pozakomórkowej.

Przykład XVIII. Szybka lokalizacja antysensowych oligonukleotydów w tętnicach wieńcowych świni

Przykład ten wykazuje skuteczność in vivo antysensowych oligonukleotydów c-myc w penetrowaniu tkanki naczyniowej i łącznej przy wykorzystaniu miejscowych elementów dozujących. W połączeniu z innymi przedstawionymi wynikami uzyskane rezultaty wykazują zdolność antysensowych oligonukleotydów c-myc do umiejscowienia się w jądrach komórek wciągu 30 minut, przed zainicjowaniem indukcji c-myc (co następuje wciągu 3-4 godzin). Lokalne rozprowadzanie antysensowych oligonukleotydów c-myc po miejscowym podaniu do ścianki naczynia tętnic wieńcowych zmniejsza tworzenie się blizn po angioplastyce balonikowej

A. Miejscowe dozowanie aatysensowych oligonukleotydów c-myc znaczonach karbol syfluoresceinąlub ³⁵S fosfetieniαkem

An^e^owne oligonukleetyda c-myc stosowane w tym przykładzie otrzymano w opisany sposób. Fosferotiekianowe aktysekseye oligekukleotada (SEQ ID No:1) ukierunkowane przeciw obszarowi ikicJowakiα translacji ludzkiego genu c-myc zastosowane w badaniach rozkładu znaczono karboksyflueresgeinαmi (wzbudzanie przy 480 nm, emisja przy 520 nm, Melecular Probes, Inc.) w sposób opisany uproedkio przez Demona i innych, Antisense Res. Dev. 2: 211-222 (1992), które to sposoby wprowadza się jako odnośniki. Do badań ilościowych eligonukleotydy znaczono d przy każdym połączeniu międzanukleotydoyam do uzyskania aktywności właściwej 1,8 x 10⁸ zliczeń na minutę/gmol.

Do doświadczeń wykorzystano i przygotowano w opisany sposób krzyżówkowe świnie domowe (Sus scrofa) Ujścia wieńcowe cewkikeyake cewnikiem wiodącym 9 French SAL 1 (Cordis Corp., Μία^ή, FL) z monitorowaniem fluoreskopowam. Po deyieńcowam wstrzyknięciu nitrogliceryny (100 gg) osiągnięto stan podstawowy angiografii wieńcowej; W wybranych częściach tętnic wieńcowych wykonano następnie odsłonięcie (urazy) kadyymiarowym balonikiem roodamakym 3 razy (6 atm) (6079,5 hPa) przez 30 s. Następnie aparat dozujący, Kaplon-Simpson Ikfusαsleeve (z Loco^e-, Palo Alto, CA) wstawiono na standardowy balonik do angioplastyki (balonik „nośny”) w ustalonym obszarze. Aporot ten zawiera yielekokOłowy obszar infuzji (18 mm) zowierający szereg otworów bocznych (40 gm), które ukierunkowuje się no ścionkę naczynia nadymając balonik nośny. Aporat zastosowany w badaniach

188 628 wtłacza roztwory przez sztywne, nie zapadające się kanaliki. Taka konstrukcja ogranicza do minimum przenikanie leku do prądu krwi i umożliwia odrębną regulację infuzji leku i umieszczenie aparatu dozującego lek w naczyniu. Po pełnym rozszerzeniu się wewnętrznego cewnika balonowego i fluoroskopowym sprawdzeniu lokalizacji części infuzyjnej wprowadzono antysensowe oligonukleotydy c-myc. Śródścienne iniekcje wykonano pod ciśnieniem zewnętrznym 100 funtów/cal² (około 6894,76 hPa). Całkowita wstrzyknięta objętość wynosiła 5-6 ml, przy podawaniu za pomocą zewnętrznej pompy z szybkością 40 ml/minutę. Podawana dawka wynosiła 1 mg/tętnicę. Po zakończeniu iniekcji aparat wyjmowano i rejestrowano końcowe angiogramy. W celu sprawdzenia prawidłowości warunków podawania oligonukleotydów wykonano szereg ilościowych angiografii wieńcowych w celu pomiaru średnicy światła wybranych tętnic wieńcowych, średnicy światła przed podaniem oligonukleotydów (czyli po wykonaniu urazu) i po podaniu oligonukleotydów. Zmierzono również średnice balonika urazowego i nośnego in situ. Cewnik wiodący zastosowano jako urządzenie skalujące we wszystkich pomiarach angiograficznych. W podanych okresach zwierzętom podawano śmiertelną dawkę pentopbarbitalu sodowego (100 mg/kg, dożylnie).

Jak to podano w tabeli 5, przeciętna średnica światła tętnicy w stanie podstawowym wyniosła 2.5 ±0,1 mm. Uszkodzenie tętnicy wieńcowej wykonano nadwymiarowym balonikiem (określanym także jako balonik odsłaniający) (średni stosunek balonika/tętnicy 1,1). Wszystkie naczynia zachowały drożność po rozciągnięciu balonikiem do przeciętnej średnicy światła 2.6 ± 0,1 mm. antysensowe oligonukleotydy c-myc podano przez rozszerzający się aparat dozujący osiągając bezpośredni kontakt z wewnętrzną powierzchnią światła naczynia (średni stosunek balonika/tętnicy 1,0).

Tabela 5

Angiograficzna charakterystyka oparta na ilościowejangiografii wieńcowej (n = 14)

Wewnętrzna średnica światła (mm)	2,5 ±0,1
Stosunek balonika odkształcającego do tętnicy	1,1 ± 0,0
Pourazowa średnica światła (mm)	2,6 ± 0,1
Stosunek balonika doprowadzającego do tętnicy	1,0 ± 0,0
Średnica światła po dozowaniu (mm)	2,6 ± 0,1

B. Ilościowa ocena dozowania oligonukleotydów

W celu określenia rozkładu fluorescencyjnie znaczonych oligonukleotydów po podaniu przez cewnik tętnice wieńcowe wycięto wraz z sąsiadującymi tkankami. Po przepłukaniu światła naczynia za pomocą PBS tętnice utrwalano w 10% buforowanej formalinie przez 6 godzin, po czym osadzono je w parafinie. Tętnice pocięto na szereg sekcji o grubości 4 pm (50 mm/naczynie, w tym 18 mm część, w której wykonano iniekcję). Badanie miejsca wykonania iniekcji oraz sąsiadujących i oddalonych części naczynia dostarczyło informacji odnośnie wzdłuznego rozkładu oligonukleotydów. Tętnica wieńcowa od tego samego zwierzęcia, w której nie wykonano iniekcji, służyła jako dodatkowa tętnica kontrolna. Sekcje odparafmowano i pokryto odczynnikiem zapobiegającym odbarwianiu SlowFade-Light (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Każdy preparat histologiczny zawierał fragment naczynia, tkankę okołonaczyniową i sąsiadujące osierdzie (fig. 17), co umożliwiało wyznaczenie głębokości penetracji oligonukleotydu. Fluorescencyjnie znaczone antysensowe oligonukleotydy wizualizowano pod mikroskopem Nikon Optiphot wyposażonym w epifluorescencyjny filtr XF-22. Zdjęcia wykonano na błonach Kodak Ektachrome PI 600.

W celu zanalizowania wewnątrzkomórkowej lokalizacji fluorescencyjnie znaczonych oligonukleotydów in vitro oraz in vivo zastosowano laserowy współogniskowy mikroskop skaningowy (model Zeiss Axiovert 100) wyposażony w kryptonowo-argonowy laser MRC-600

188 628 (Bio-Rad). Laser kryptonowo-argonowy emituje linie laserowe przy długości fali wzbudzenia 488 nm. Indukowane światło fluorescencyjne skanuje się przez obiektyw o powiększeniu 63x i przekształca się na sygnał wizyjny do wyświetlania na monitorze komputera. Obrazy fotografuje się z ekranu komputerowego na błonach Kodak Ektachrome 100. W badaniach in vitro w celu określenia przebiegu czasowego wchłaniania oligonukleotydów przez naczyniowe komórki mięśni gładkich komórki hoduje się na szkiełkach na pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej przez 2 dni, po czym dodaje się fluorescencyjnie znaczone oligonukleotydy (8 μΜ) na 2 minuty, 30 minut i 2 godziny. Komórki przemywa się następnie 3 razy za pomocą PBS i utrwala się ^w roztworze 50% acetonu/50% metanolu. W badaniach in vivo sekcje tętnic wieńcowych otrzymane w sposób opisany powyżej analizuje się metodą mikroskopii współogniskowej przy grubości optycznej 0,4-0,5 jm.

C. Rozkład antysensowych cligcnukleotydów w ściance naczynia

W celu ustalenia rozkładu oligonukleotydów w ściance tętniczej ich lokalizację w tętnicach wieńcowych oznaczano po 30 minutach i 3 dniach po podaniu śródściennym (n = 4). Oligonukleotydy znaczone fluoresceiną wykryto jedynie w obszarze iniekcji, nie wykrywając ich w odległych segmentach lub w tętnicach wieńcowych, w których nie wykonano iniekcji. Po 30 minutach 3 wyraźne ogniskowe układy rozkładu oligonukleotydów zaobserwowano w segmentach, w których wykonano iniekcję, uprzednio odkształconych przez balonik. Gęsta przezścienna lokalizacja obejmująca całą grubość mięśniówki połączona była z rzadziej rozsianym rozkładem w przydance i wokół naczynia (fig. 27A i 27B). W każdej sekcji oligonukleotydy skupiały się tylko w części obwodu tętnicy. Układ podbłonowy nie-przezścienny występował powszechnie; występował on między lokalizacją przezścienną lub na krawędziach obszaru iniekcji (fig. 27C i 27D). Układ śródścienny nie-przezścienny występował najrzadziej, w sąsiedztwie lokalizacji przezściennej (fig. 27E i 27F). Przydanki naczyniowe były pozbawione oligcnuklectydów w sekcjach wykazujących rozkład nie-przezścienny.

Zbadano także wpływ wcześniejszego uszkodzenia naczynia na rozkład antysensowych oligonukleotydów c-myc w ściance tętniczej. Analiza kolejnych preparatów potwierdziła, że rozkład przezścienny występuje najczęściej w obszarach sekcji z lokalizacją oligonukleotydów rozciągającą się na bezpośrednio sąsiadujące sekcje. Układ podbłonowy, nieprzezścienny był zazwyczaj związany z zachowaną integralnością naczynia. Po 3 dniach lokalizacja oligonukleotydów była wyraźnie przezścienna (fig. 28A i 28B). Rozkład podbłonowy, nie-przezścienny był mniej wyraźny, prawdopodobnie na skutek wymywania oligonukleotydów. Nie stwierdzono występowania liniowej „strumienio-podobnej” lokalizacji po 30 minutach i po 3 dniach.

Dane te łącznie wskazują na ogniskowy układ rozkładu śródściennego oligonukleotydów po podaniu pod ciśnieniem przez cewnik. Okazało się, że rozwarstwienie tętnicy wieńcowej na skutek wcześniejszego urazu balonikowego ułatwia wnikanie i przezścienny rozkład oligonukleotydów. Nie-przezścienny układ był często związany z nienaruszoną wewnętrzną błoną sprężystą.

D. Sródścienne przemieszczanie się oligonukleotydów w tętnicach wieńcowych

Zmierzono czasy przebywania cligcnuklectydów in situ w celu ustalenia, czy antysensowa obróbka prowadzi do zatrzymania oligonukleotydu. Aby ilościowo podejść do tego problemu ³ⁱS-znaczone antysensowe oligonukleotydy c-myc podano za pomocą cewnika do świńskich tętnic wieńcowych. Jak to pokazano na fig 29, w 30 minut po miejscowospecyficznym podaniu zmierzona radioaktywność tkanki odpowiadała zawartości oligonukleotydu 2510 ± 1436 zliczeń na minutę (n = 6) w ściance naczynia oraz 2163 ± 966 zliczeń na minutę (n = 6) w tkance okołonaczyniowej przy tle tkanki wynoszącym 17 ± 4 zliczeń na minutę. Po 3 dniach radioaktywność związana z oligonukleotydem wzrosła do 3595 ± 1672 (n = 4) w ściance naczynia, natomiast poziom w tkance okołonaczyniowej obniżył się do 432 ±201 (n = 4). Powyższy przedłużony w czasie poziom oligonukleotydów utrzymał się pomimo szybkiego klirensu w osoczu (1/2 15 ± 2 minuty). Ilość wykrytych oligonukleotydów po 30 minutach i po 3 dniach odpowiadała około 0,1% całkowitej podanej dawki. Wyniki te wskazują, ze ciśnieniowe podawanie przez cewnik prowadzi do osadzania się antysensowych oligonukleotydów w mięśniówce, w tkance przydankowej, a także w tkankach okołonaczyniowych.

188 628

E. Integralność naczyniowa po ś^^^ści^i^:nym podaniu oligonukleotydów

W związku z tym, że iniekcja pod ciśnieniem przez cewnik jakiegokolwiek środka terapeutycznego do ścianki tętniczej może wywołać uszkodzenie naczynia, zmierzono stopień tego uszkodzenia. Po pierwsze przy wykorzystaniu jakościowej angiografii wieńcowej zaobserwowano nie ograniczające przepływu rozwarstwienia wieńcowe w 1 spośród 14 śródściennych iniekcji w tętnicach wieńcowych świni oprócz wcześniejszego uszkodzenia nadwymiarowym balonikiem. Po drugie wykorzystano ilościową angiografię wieńcową do ustalenia średnicy światła po śródściennym podaniu oligonukleotydów (n = 14). Nie zaobserwowano znaczącej zmiany w średnicy światła po podaniu oligonukleotydów przez cewnik (tablica 5). Po trzecie oceniono wpływ iniekcji oligonukleotydów przez cewnik z wykorzystaniem mikroskopii optycznej. W tym celu oceniono sekcje tętnic wieńcowych z przezściennym rozkładem oligonukleotydów, bez widocznego rozwarstwienia, aby ustalić subtelne zmiany w składnikach komórkowych i matrycy pozakomórkowej ścianki naczynia. Jak to pokazano na fig. 30, przezścienny rozkład oligonukleotydów (fig. 30A) związany był z nienaruszoną wewnętrzną błoną sprężystą i ze sprężystymi tkankami w ściance naczynia (fig. 30B). Łagodne zmniejszenie barwienia cytoplazmy i piknozę jądra obserwowano w pewnych przypadkach w miejscu zachowania oligonukleotydów po 30 minutach (fig. 30C). Zmian tych nie stwierdzono w 3 dni po podaniu (fig. 30D).

Przykład XIX. Szybkie umiejscowienie w jądrze antysensowych oligonukleotydów c-myc w ludzkich komórkach mięśni gładkich in vitro oraz w świńskich komórkach mięśni gladkiqh in vivo

Przykład ten dokładniej wykazuje skuteczność obróbki anty sensowymi oligonukleotydami c-myc in vivo poprzez pokazanie szybkiego umiejscowienia antysensowych oligonukleotydów c-myc w jądrach komórek mięśni gładkich, zarówno in vitro (ludzkich), jak i in vivo (świńskich). Taki szybki przebieg w czasie umożliwia hamowanie uaktywniania genu c-myc, co, jak to stwierdzono uprzednio, trwa 3-4 godziny.

A. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja znaczonych karboksyfluoresceiną antysensowych oligonukleotydów c-myc

W celu zanalizowania wewnątrzkomórkowej lokalizacji znaczonych fluorescencyjnie antysensowych oligonukleotydów c-myc in vitro zastosowano laserowy współogniskowy mikroskop skaningowy (model Zeiss Axiovert 100) wyposażony w kryptonowo-argonowy laser MRC-600 (Bio-Rad). Laser kryptonowo-argonowy emituje promienie laserowe przy długości fali wzbudzenia 488 nm. Indukowane światło fluorescencyjne skanuje się przez obiektyw o powiększeniu 63x i przekształca się na sygnał wizyjny do wyświetlania na monitorze komputera. Obrazy fotografuje się z ekranu komputerowego na błonach Kodak Ektachrome 100. W badaniach in vitro w celu określenia przebiegu czasowego wchłaniania oligonukleotydów przez naczyniowe komórki mięśni gładkich komórki hoduje się na szkiełkach na pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej przez 2 dni, po czym dodaje się fluorescencyjnie znaczone oligonukleotydy (8 pM) na 2 minuty, 30 minut i 2 godziny. Komórki przemywa się następnie 3 razy za pomocą PBS i utrwala się w roztworze 50% acetonu/50% metanolu.

B. Wchłanianie antysensowych oligonukleotydów przez komórki

Po śródściennym podaniu antysensowych oligonukleotydów powinno nastąpić szybkie wchłanianie oligonukleotydów przez komórki, tak, aby umożliwić zahamowanie ekspresji docelowego genu, w danym przypadku c-myc. Jak to pokazano na fig. 31, naczyniowe komórki mięśni gładkich wykazują in vitro uprzywilejowaną lokalizację fluorescencji w jądrze w 30 minut po rozpoczęciu inkubacji z fluorescencyjnie znaczonymi oligonukleotydami. Również w 30 minut po podaniu świniom in vivo przez cewnik zaobserwowano lokalizację oligonukleotydów w jądrach w mięśniówce (fig. 32) oraz w przydance (fig. 33), co świadczy o stosunkowo szybkim wchłanianiu antysensowych oligonukleotydów in vivo. W związku z tym wewnątrzkomórkowe wchłanianie antysensowych oligonukleotydów przez naczyniowe komórki mięśni gładkich in vitro oraz in vivo zachodzi w krytycznym przedziale czasowym umożliwiającym modulowanie protoonkogenu c-myc, ważnego indukcyjnego genu regulującego proliferację komórek mięśni gładkich po uszkodzeniu ścianki naczynia.

188 628

Literatura (w kolejności cytowań):

Glover, red., Oócogenes (IRL Press, Oxford, 1989); Marcu i in., Aoo. Rev. Biochem., 61:809-860 (1992); Watt i in., Nature, 303:725-728 (1983); Battey i in., Cell, 34:779-787 (1983); Epstein i in., NTIS publication PB93-100576; Gewirtz i in., patent USA 5 098 890; Majello i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 79:9636-9640 (1986); Ulmann i in. (op.cit); Crooke (op.cit); Zamecnik i Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci, 75: 280-284 (1974); Goodchild i in., patent USA 4 806 463; Gazin i in., E.M.B.O. Jonmal 3:2:383-387 (1984); Zon i Geiser, AntiCancer Drug Design, 6: 539-568 (1991); Stec i in., patent USA 5 151 510; Hirschbein, patent USA 5 166 387; Bergot, patent USA 5 183 885; Marshall i in., Science, 259:1564-1570 (1993); Caurathers i Nielsen, międzynarodowe zgłoszenie PCT/US89/02293; Jager i in., Biochemistry, 27:7237-7246 (1988); Froehler i in., międzynarodowe zgłoszenie PCT/US90/03138, Gjyazóov i in., PCT/US9S/03585; Nielsen i in., Anti-cancer Drug Design, 8: 53-63 (1993), międzynarodowe zgłoszenie PCT/EP92/01220; Miller i in., patent USA 4 507 433, Ts'o i in., patent USA 4 469 863, Miller i in., patent USA 4 757 055; Stec i in., europejskie zgłoszenie patentowe 92301950.9; Lesnikowski, Bioorganic Chemistry, 21:127-155 (1993); Peyman i Ulmann (op.cit.); Milligan i in. (op.cit.); Matteucci i in., międzynarodowe zgłoszenie PCT/US91 /06855; Spielvogel i in., 5,130,302; Shea i in., Nucleic Acids Research, 18:3777-3783 (1990); Letsinger i in., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:6553-6556 (1989); Froehler i in., i Tetrahedron Lett., 33: 5307-5310 (1992); Beaucage i Iyer, Tetrahedron, 48:2223-2311 (1992); Molko i in., patent USA 4 980 460; Koster i in., patent USA 4 725 677; Caruthers i in., patenty USA 4 415 732; 4 458 066; i 4 973 679; Roberts i in. Proc. Natl. Acad. Sci., 88:9397-9401 (1991); Roberts i in., Science, 258:1463-1466 (1992); Distefano i in., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:1179-1183 (1993); Mergny i in., Biechemistry, 30:9791-9798 (1991); Cheng i in, J. Am. Chem. Soc., 114:4465-4474 (1992); Beal i Deryan, Nucleic Acids Research, 20:2773-2776 (1992); Beal i Dervan, J. Am. Chem. Soc., 114:4976-4982 (1992); Gievaóóαógeli i in., Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 8631-8635 (1992); Moser i Dervan, Science, 238:645-650 (1987); McShan i in., J. Biol. Chem., 267:5712-5721 (1992); Yeeó i in., Proc. Natl. Acad. Sci., 89:3840-3844 (1992); Blume i in., Nucleic Acids Research, 20:1777-1784 (1992); Rosenberg i in., międzynarodowe zgłoszenie PCT/US92/05305; Szostak i in., Meth. Eózymel. 68:419-429 (1979).

188 628

Zestawienie sekwencji (1) ogólna:

(i) Zgłaszający: Yi Shi i Andrew Zalewski (ii) Tytuł wynalazku: Kompozycja farmaceutyczna i zestaw stosowane w przeszczepach tętniczo-żylnych oraz sposób otrzymywania zestawu (iii) Liczba sekwencji: 11 (iv) Adres do korespondencji:

(A) Adresat: John D. Mendlein, Ph.D.

(B) Ulica: Five Palo Alto Square (C) Miasto: Palo Alto (D) Stan: California (E) Kraj: USA (F) Kod pocztowy: 94306 (v) Postać odczytywana komputerowo:

(A) Typ nośnika: dyskietka 3,5 cala (B) Komputer: kompatybilny z IBM (C) System operacyjny: Windows 3,1/DOS 5,0 (D) Oprogramowanie: Microsoft Word for Windows, wersja 2,0 (vi) .Dane dotyczące bieżącego zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia:

(B) Data zgłoszenia:

(C) Klasyfikacja:

(vii) Dane dntyczącc wcześniejsnych zgłoszeó:

(A) Numer zgłoszenia: Zgłoszenie PCT Application U594/1 1853

188 628 (H) Data zgłoszenia: 17 października 1994 (viii) Informacja o rzeczniku/pelnomocniku:

(A) Nazwisko: John D. Mendlein, Ph.D.

(B) Numer rejestracyjny: 38,770 (C) Numer sprawy u rzecznika: LYNX-014/O2US (ix) Informacje teiekomunikacyyne:

(A) Telefon: (415) 843-5020 (B) Faks: (415) 857-0663 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 1:

(1) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 15 nukleotydów (B) Typ: kwas nukleinowy (C) NIć: pojedyncza (D) Topologóa: liniowa.

xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 1:

AACGTTGAGG GGCAT 15 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 2:

(1) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 15 nukleotydów (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 2:

ATGCCCCTCA ACGTT 15 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO : 3 :

(i) Charakterystyka sekąeocjl.:

188 628 (A) Długość: 15 nukleotydów (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO : 3:

AACGTGGATT GGCAG 15 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 4:

(1) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 15 nukleotydów (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 4

GAACGGAGACGGTTT 15 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 5:

(1) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 24 nukleotydów (H) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 5:

TATGCTGTGC CGGGGTCTTC GGGC 24 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 6:

(i) Cnarakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 19 nukleotydów (B) Typ: kwas nukleinowy

188 628 (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 6:

GGGAGAGTCG CGTCCTTGCT 20 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 7:

(1) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 nukleotydów (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 7:

TCATGGAGCA CCAGGGGCTC 22 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 8:

(1) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 nukleotydów (H) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 8:

TCATGGAGCA CCAGGGGCTC 20 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO : 9 :

(i) Charrktejrctyka sskwencjii (A) Długość: 20 nukleotydów (H) Typ: ywas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa

188 628 (χί) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 9:

GGCCTTTTCA TTGTTTTCCA 20 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO : 10 :

(1) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 17 nukleotydów (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 10:

CATTGTTTTC CAACTCC 17 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 11:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 17 nukleotydów (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nić: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 11:

TTCATTGTTT TCCAATT

188 628

FIC. 4c

188 628

FIG. 6d

188 628

r*.

\# · ' .r

188 628

FIG. 9b

FIG. 9c

188 628

FIG. 10

188 628

FIG. 11

188 628

C\J

Powierzchnia nowej / błony wewnętrznej

FIG. 12 • o c·

188 628

Pro α ι(0 Pro α2θ)

Pro α -| (HO

Fibronektyna

FIG. 13

188 628 «1<'\ β₂(Ι)^ζ

2 3 4 5 6 7

% kontro!

FIG. 14

188 628

o o

<o c-myc — 52 kDa*“ g

w c

Φ co

FIG. 15

		3E
		=L
		<0
	£	·* Φ
	<0	ξ
Z		s
o	£>	s
o	O	<0
N ω	«Λ C	c
CO	Q> CO	<

FIG. 17

188 628 dpm/IO° komórek

FIG. 16

188 628 to

Φ c

o o

e

N

O

O O

N Φ

GQ &

7S s

dL to

Φ

C

O 0) c Φ <

Pro 04(1)

Pro <x₂(l)

O®

FIG. 18

188 628 =L (O

N

Φ ffl t*

N

O at

Φ £

o

0)

C

Φ «

* c

<

Pro a-j(l. III)

Wewnątrzkomórkowy

Pro «2(0

Pro α-ι(Ι.'ΙΙΙ)

Pozakomórkowy

Pro «2(1)

FIG. 19

150-i

Hydrokayprolina (pg/mg białka

Bez ODS

Rozrzucone (16 μΜ)

Antysensowne (16 μΜ)

FIG. 20

188 628

a «I

Rozrzucone 16μΜ

Niesparowane16 μΜ

Antysensowne 4 μΜ Antysensowne 8 μΜ

Antysensowne 16μΜ

bezODN

FIG. 21

188 628 μΜ

Pozskomórkowe

Wewnątrzkomórkowe

FIG. 22

188 628 bez ODN

Rozrzucone 16 μΜ

Antysensowne 16μΜ

Temp.(°C)

41 43

41 43 «•j (I) — -ββ» «** «2(0—

FIG.23

188 628

FIG. 24 FIG. 25

Antysensowne

188 628

FIG 26 i 1 ν*? ·

188 628

FIG. 27 A

FIG. 27 B

188 628

FIG. 27 D

188 628

FIG.27 E

FIG.27 F

188 628

FIG.28 B

188 628

8000H

6000 cpm/naczynia

4000 2000 0«

Ścianka naczynia

Tkanka Łącznie oketonaczyniowa

FIG.29

188 628

FIG. 30 A

FIG.30 B

188 628

FIG. 30 C

FIG.30 D

188 628

FIG. 31

188 628

FIG. 32

FIG. 33

188 628

PRZYKŁAD ZANIKU DROŻNOŚCI PRZESZCZEPU NACZYNIOWEGO

PRZED ARTERIALIZACJĄ

Ζ·\

PRZETOKA

Tętnica

POOPERACYJNY ZANIK DROŻNOŚCI Żyła Tętnica

ΖΊ

Przekrój żyły

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie oligonukleotydu specyficznego dla c-myc lub c-myb, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia przeszczepu naczyniowego.
2. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 1, znamienne tym, że przeszczep naczyniowy wybrany jest z grupy obejmującej przetokę protetyczną, przetokę tętniczo-żylną, przetokę z żyły rodzimej, przeszczep żylny, przeszczep allogeniczny poddany immunosupresji, heteroprzeszczep poddany immunosupresji oraz autogeniczny przeszczep żylny.
3. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 1, znamienne tym, że przeszczep naczyniowy zapewnia miejsce dostępu do wykonania hemodializy.
4. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 3, znamienne tym, że miejsce dostępu do wykonania hemodializy jest wybrane z grupy obejmującej przetokę Brescia-Cimino, przetokę tabakierową, przetokę ramienno-głowową, przeszczep do hemodializy z PTFE, przeszczep bydlęcej tętnicy szyjnej i przeszczepy autogeniczne.
5. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 1, znamienne tym, że przeszczep jest wyciętą żyłą odpowiednią do przyjęcia przez człowieka.
6. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 5, znamienne tym, ze wycięta żyła odpowiednia do przyjęcia przez człowieka jest wybrana z grupy obejmującej żyłę odpiszczelową, żyłę odpromieniową, żyłę odłokciową, żyłę ramieniową i żyłę udową.
7. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 1, znamienne tym, że oligonukleotyd stosuje się w stężeniu od 10 do 200 pM.
8. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 1, znamienne tym, że oligonukleotyd jest specyficzny dla c-myc.
9. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 8, znamienne tym, że oligonukleotyd jest wybrany z grupy złożonej z oligonukleotydów o numerach identyfikacyjnych SEQ ID NO: 1,6 i 7.
10. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 1, znamienne tym, że oligonukleotyd jest specyficzny dla c-myb.
11. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 10, znamienne tym, że oligonukleotyd jest oligonukleotydem o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 5.
12. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 1, znamienne tym, że oligonukleotyd jest umieszczony we wszczepie lub w zbiorniku przeznaczonym do umieszczenia w tkance okołonaczyniowej. ,
13. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 12, znamienne tym, że zbiornik zawiera od 0,5 do 10 mg oligonukleotydu.
14. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 13, znamienne tym, że zbiornik umieszcza się po stronie żylnej miejsca dostępu do wykonania hemodializy.
15. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 1, znamienne tym, że oligonukleotyd występuje w, co najmniej jednej warstwie przeszczepu naczyniowego.
16. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 15, znamienne tym, że warstwa jest wybrana z grupy obejmującej warstwę śródbłonkową, mięśniówkę, przydankę i tkankę okołonaczyniową.
17. Zastosowanie oligonukleotydu według zastrz. 16, znamienne tym, że stężenie oligonukleotydu we wnętrzu komórki tej warstwy wynosi, co najmniej 1 pM.

* * *

188 628

Kompozycje i zestawy zawierające oligonukleotyd specyficzny dla c-myc lub c-myb są stosowane jako środki terapeutyczne przy przeszczepach tętniczo-zylnych do hamowania syntezy pozakomórkowych białek matrycowych, zwłaszcza z fibroblastów i komórek mięśni gładkich.

Sztuczne przetoki tętniczo-zylne stanowią miejsca dostępu do układu krążeniowego umożliwiające hemodializę u wymagających tego pacjentów. Jednakże przetoki tętniczo-zylne z czasem przestają funkcjonować, co może powodować poważne komplikacje medyczne u ponad 300 000 pacjentów w świecie, którym wykonuje się hemodializę (G.E. Newnan, w Vascular Disease: Surgical and Interventional Therapy, E. Strandness, red. (1994)). W zależności od przeprowadzonych badań od 12 do 45% przetok tętniczo-żylnych przestaje funkcjonować w pierwszym roku (G.E. Newman, op. cit). Głównym powodem przestania funkcjonowania miejsca dostępu jest postępujące zwężanie się żył (Sedberg i inni, Circulation 80: 1726-1736 (1989)). Miejsca dostępu do przeprowadzenia hemodializy, które przestały funkcjonować lub działa nieprawidłowo, wymaga działań medycznych, na drodze chirurgicznej, w celu zastąpienia przetoki tętniczo-żylnej, albo interwencji przez cewnik (np. angioplastyki balonikowej lub wstawienia rurki) w celu powiększenia światła naczynia żylnego wychodzącego z przetoki (G.E. Newman (1994), op. cit). W efekcie pacjenci długotrwale poddawani zabiegom hemodializy, u których występują komplikacje z przetokami tętniczo-żylnymi, spędzają około 30 dni w roku w szpitalu w celu utrzymania drożności ich miejsc dostępu.

W związku z tym miejsca dostępu do przeprowadzenia hemodializy stanowią istotny problem dla pacjentów poddawanych hemodializie, nawet w przypadku niezbędnej odpowiedniej konstrukcji przetoki tętniczo-żylnej, zapewniającej dogodne wykonanie hemodializy. Przetoki tętniczo-żylne zwykle wykonane są jako tętniczo-żylne przetoki Brescia-Cimino lub przeszczepy z poli(tetrafluoroetylenu) (PTFE, Gor-Tex™). W większości przypadków żyłę łączy się chirurgicznie z tętnicą, bezpośrednio lub poprzez przeszczep z PTFE, w obszarze przedramienia, barku lub uda.

Przetoki tętniczo-żylne stanowią jedynie przykład przeszczepów tętniczo-zylnych, których stan stopniowo pogarsza się w czasie. Do innych typów przeszczepów (np. przeszczepów żylnych), w przypadku których powstają wymagające interwencji lekarskiej zaburzenia prawidłowego funkcjonowania należą: przeszczepy stanowiące obejście aortalno-wieńcowe, przeszczepy tętnicy szyjnej, przeszczepy biodrowo-udowe i przeszczepy udowo-podkolanowe. W przypadku takich przeszczepów segment żyły umieszcza się w układzie tętniczym. Jednym z najczęstszych stanów chorobowych dotyczących wszystkich typów przeszczepów tętniczo-zylnych oraz przeszczepów żylnych umieszczonych w układzie tętniczym, jest zmniejszanie się w czasie wewnętrznej średnicy naczynia. Zazwyczaj występuje to w części korpusu przeszczepu na wylocie z żyły (określanej w opisie jako „żyłowa część” przeszczepu). Uważa się, ze wystawienie żyły na działanie wysokiego ciśnienia tętniczego wywołuje w żyle zmiany morfologiczne; w szczególności zmniejsza się wewnętrzna średnica żyłowej części przeszczepu. Przeszczepy narażone są również na zakrzepicę i inne zaburzenia takie, jak infekcja.

Dotychczasowe sposoby postępowania z przeszczepami tętniczo-żylnymi i żylnymi charakteryzują się ograniczoną skutecznością i zazwyczaj wymagają interwencji inwazyjnej. Skupiały się one na mechanicznym zwiększeniu wewnętrznej średnicy przeszczepu w części o grubszych ściankach naczyń, takich, jak przestające funkcjonować miejsca dostępu do wykonania hemodializy. Inne sposoby oparte są po prostu na chirurgicznej korekcie niefunkcjonującego miejsca przeszczepu takiej, jak wymiana przetoki tętniczo-zylnej. Takie znane sposoby postępowania wymagają znaczącego nadzoru lekarskiego, często z konieczną hospitalizacją, a w przypadku pewnych miejsc dostępu do wykonania hemodializy może to ostatecznie doprowadzić do niemożliwości znalezienia odpowiedniego miejsca dostępu do wykonania hemodializy, jak to przedstawiono w opisie.

Szereg badań skoncentrowanych na morfologii żył w niefunkcjonujących przeszczepach, takich, jak przeszczepy tętniczo-zylne i przeszczepy żylne (np. obejścia aortalnowieńcowe) dostarczyły informacji odnośnie mechanizmu patologii w takich zaburzeniach. Cienkościenna żyła wcześnie reaguje na przepływ i ciśnienie krwi tętniczej. W żyle zaczyna tworzyć się nowa błona wewnętrzna naczynia. Reakcja na wysokie ciśnienie i przepływ

188 628 tętniczy prowadzi ostatecznie do znaczącego zwężenia światła, co z kolei powoduje znaczący spadek drożności żyły. W ośrodku i w nowej błonie wewnętrznej znajdują się przede wszystkim komórki naczyniowych mięśni gładkich. Fibroblasty znajdują się w przydance naczynia i w tkance okołonaczyniowej. Fibroblasty uczestniczą w ziarninowaniu tkanki okołonaczyniowej w czasie gojenia się rany żyły. W reakcji na uszkodzenie zarówno komórki mięśni gładkich, jak i fibroblasty zwiększają wytwarzanie białka matrycowego w ściance naczynia i tkance okołonaczyniowej. W efekcie żyła staje się węższa i sztywniejsza z uwagi na wzrost grubości ścianki naczynia oraz bliznowacenie w tkance okołonaczyniowej, co prowadzi do nieodwracalnego uszkodzenia przeszczepów, np. w przypadku przetoki tętniczo-żylnej lub przeszczepów zylnych.

Nieodpowiednia synteza pozakomórkowych białek matrycowych i/lub synteza zwyrodniałych form takich białek związana jest z wieloma różnymi szkodliwymi stanami takimi, które charakteryzują się tworzeniem np. niepożądanej włóknistej tkanki łącznej. Do takich stanów chorobowych należą np. zaburzenia stwardnieniowe, nawrót zwężenia naczyń, miażdżyca tętnic, aterogeneza, keloidoza, marskość wątroby, reumatoidalne zaburzenia stawów, bliznowacenie pooperacyjne, chirurgia plastyczna, itp., jak również rzadkie choroby dziedziczne, a także bardziej rozpowszechnione zaburzenia nabyte takie, jak utrata drożności przeszczepów tętniczo-żylnych i żylnych (Sedberg i inni, Circulation 80: 1726-1736 (1989)), zwłóknieniowa choroba skóry, zwłóknienie płuc, zapalenie kości i stawów, nawrót zwężenia naczyń, itp., patrz np. Weiss i Jayson, red., Collagen in Health and Disease (Churchill Livingstone, Edinburgh, 1982); Gardner, red., Pathological Basis of the Connective Tissue Diseases (Lea & Febiger, Philadelphia, 1992). Matryca pozakomórkowa składa się przede wszystkim z kolagenów; proteoglikanów, elastyny i fibronektyny.

Do tkanek, które mogą stanowić miejsce takiej nieodpowiedniej syntezy, należą komórki naczyniowych mięśni gładkich, komórki nabłonkowe, fibroblasty skóry i narządów, np. wkeloidozie lub przy pourazowym albo pochirurgicznym bliznowaceniu, a także komórki maziówkowe i inne składniki stawów.

Nawrót zwężenia naczyń jest związany z migracją komórek mięśni gładkich do błony wewnętrznej naczynia, proliferacją i syntezą pozakomórkowych składników matrycowych, patrz np. Holmes i inni, rozdz. 12 w Vlietstra i inni, red., PTCA (Davis Company, Philadelphia, 1987).

Wiele z tych stanów związanych jest z bardzo złożonymi reakcjami biologicznymi na urazy fizyczne, chemiczne i/lub biologiczne. Takie reakcje obejmują proliferację i migrację różnych typów komórek oraz syntezę czynników wzrostu, które uczestniczą w takiej reakcji lub modyfikująją. Tak np. zaburzenia naczyniowe takie, jak miażdżyca tętnic i nawrót zwężenia naczyń, związane są z miejscową proliferacją i migracją komórek, a także z wytwarzaniem szeregu klas białek strukturalnych i wielu czynników wzrostu, w tym czynnika wzrostowego pochodzącego z płytek krwi (PDGF), podstawowego wzrostowego czynnika fibroblastycznego, czynnika martwicy nowotworu a, interleukiny-1, prostaglandyn oraz szeregu protoonkogenów; patrz np. Ross, Nature, 362: 801-809 (1993); oraz Morishita i inni, Proc. Natl. Acad. Sei., 90:8474-8478 (1993). Niestety dokładna rola tych czynników w różnych procesach chorobowych nie jest dobrze rozpoznana.

Znaczące skutki zaburzeń związanych z niewłaściwym wytwarzaniem pozakomórkowych białek matrycowych, zwłaszcza zaburzeń naczyniowych, stanowiły silny bodziec dla opracowania leków i sposobów postępowania w celu wyleczenia lub złagodzenia ich osłabiających skutków. W tej grupie chorób, a także w innych zaburzeniach, w których stan chorobowy jest związany z wyraźną nienormalną ekspresją endogennego genu, zastosowanie tak zwanych związków antysensowych zapewnia wiele korzyści; patrz np. Milligan i inni, J. Med. Chem., 36:1923-1937 (1993); Uhlmann i Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990); Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 1:165-187 (1990); Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:329-376 (1992); Stein i inni, Science, 261:1004-1012 (1993); itp.

Szczególnie cenną zaletą takiego podejścia antysensowego jest to, że nie ma potrzeby przeprowadzania etapów wstępnego selekcjonowania w celu zidentyfikowania potencjalnych związków zdolnych do wiązania się z docelowym lekiem. Gdy wiadomo, że nienormalna ekspresja genu powoduje chorobę, dla której poszukuje się leku, struktury potencjalnych leków

188 628 antysensowych wyznacza się automatycznie z sekwencji nukleotydowej nienormalnie eksprymowanego genu. Należy jedynie dostarczyć oligonukleotyd lub jego analog zdolny do tworzenia stabilnego dupleksu lub tripleksu z takim genem, albo zasocjowany docelowy polinukleotyd, w oparciu odpowiednio o wiązanie Watsona-Cricka lub Hoogsteena. Należy zdawać sobie sprawę, ze wynalazek nie ogranicza się do konkretnego mechanizmu działania. Takie związki mogą wykazywać dodatkowe działanie nie-antysensowe, specyficzne względem sekwencji, oparte na innych mechanizmach takie, jak np. ale nie wyłącznie, działanie aptameryczne. Specyficznie związany związek antysensowy nadaje odpowiednim celom większą podatność na degradację enzymatyczną, blokuje translację lub przetwarzanie albo w inny sposób blokuje lub hamuje działanie docelowego polinukleotydu.

Wysoce pożądane byłoby, gdyby udało się zidentyfikować konkretne geny, których ekspresja jest przyczynowo związana z syntezą białek strukturalnych takich, jak kolagen, które odgrywają rolę w stanach chorobowych. Taka identyfikacja mogłaby natychmiast doprowadzić do perspektywy leczenia szeregu zaburzeń związanych z nadmierną syntezą takich białek, z wykorzystaniem podejścia antysensowego.