PL188838B1

PL188838B1 - Zastosowanie kliochinolu do wytwarzania środka farmaceutycznego i środek farmaceutyczny

Info

Publication number: PL188838B1
Application number: PL97331822A
Authority: PL
Inventors: Panayotis Nikolas Gerolymatos
Original assignee: P N Gerolymatos Sa
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-08
Publication date: 2005-04-29
Also published as: KR100489969B1; NZ334124A; IL128416A0; CN1230115A; SI0959888T1; DK0959888T3; SK17999A3; IL128416A; CN1114407C; CZ295118B6; IS4972A; NO316768B1; WO1998006403A1; HK1022437A1; SK283117B6; AU3632497A; EP0959888B1; PT959888E; NO990595D0; DE69706566T2

Abstract

1. Zastosowanie kliochinolu do wy- twarzania srodka farmaceutycznego do le- czenia choroby Alzheimera. 13. Srodek farmaceutyczny, zna- mienny tym, ze zawiera kliochinol i wi- tamine B 12. F IG . 1 PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są zastosowanie klidchindle do wytwarzania środka farmaonutycznego i środek farmaceutyczny, zwłaszcza do leczenia choroby Alzheimera.

Choroba Alzheimera jest przewlekłym nnurdOngenerαoyjnym schorzeniem występującym przeważnie u osób w starszym wieku.

Klinicznym wskaźnikiem choroby Alzheimera jest występowanie i akumulacja złogów amyldiddwtoh w mózgu. Amyloid znajduje się głównie w końcowych obszarach neuronów w postaci niejednorodnych morfologicznie złogów, znanych również jako płytki starcze. Powstawanie płytek starczych wiąże się z występowaniem podmiotowych i przedmiotowych objawów choroby, w tym amnezji. Po utworzeniu płytki starczej powstają splątki nnerdfibrylame w neuronach. Powstawanie splątków nnerdfibrylzmyoh wiąże się z nasileniem amnezji i innych objawów demencji.

Podstawowym składnikiem złogów amyldiddwyoh jest polipeptyd zwany AP (αmyldi0 β). A β w normalnych warunkach jest rozpuszczalnym składnikiem płynu mózgdWd-rOzenidwegd, gdzie występuje w stężeniu około 3-5 nM. A|3 może zawierać 39 - 43 aminokwasów, zazwyczaj 40 aminokwasów, w postaci dojrzałej i jest produktem proteolitycznego rozszczepienia białka powierzchniowego błony komórkowej, nazywanego prekersdrdwym białkiem amyldiddwym (APP) (Kang i inni 1987). Fizjologiczna rola AP nie jest obecnie znana, ale może ona

188 838

Wykazano, że precypitację syntetycznego Αβ wywołuje szereg czynników środowiskowych, w tym niskie pH, wysokie stężenia soli oraz obecność metali, np. cynku, miedzi i rtęci (Bush i inni, 1995). Stwierdzono, że sam Αβ swoiście i wysycająco wiąże cynk w stosunku molowym 1:1 (cynk: Αβ) z wysokim powinowactwem wiązania (K_D =107 nM) (Bush i inni, 1994a). Wiązanie zachodzi przy fizjologicznym stężeniu cynku (Bush i inni, 1994b).

Istnieją uzasadnione przypuszczenia, że usunięcie złogów amyloidowych u pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera spowoduje złagodzenie objawów tej choroby. Podjęto zatem szereg prób wytworzenia leku mającego zdolność usuwania złogów amyloidowych.

W WO 93/10459 ujawniono sposób leczenia choroby Alzheimera przez podawanie środka wiążącego cynk. Jako korzystne związki wymieniono kwas fitynowy, desferioksaminę, cytrynian sodu, EDTA, l,2-dietyło-3-hydroksypirydyn-4-on i l-hydroksyetylo-3-hydroksy-2-metylopirydyn-4-on.

W DE 39 32 338 ujawniono zastosowanie środka chelatującego, takiego jak 8-hydroksychinolina, w leczeniu choroby Alzheimera.

W US 5373021 ujawniono disulfiram i jego sole oraz analogi jako związki przenikające barierę krew-mózg. Ujawnione związki można stosować do zmniejszania uszkodzeń neurologicznych wywoływanych np. przez chorobę Alzheimera.

Znane dotychczas związki, proponowane do stosowania w leczeniu choroby Alzheimera, wykazują szereg niekorzystnych właściwości, toteż nie znajdują one powszechnego zastosowania. Przykładowo, większość z tych związków nie może przenikać przez barierę krew-mózg, a zatem tylko w niewielkim stopniu dociera do obszarów, w których są obecne złogi amyloidowe. Niekorzystna właściwość disulfiramu, który może przenikać przez barierę krew-mózg, polega na tym, że związek ten wchodzi w niekorzystną interakcję z alkoholem.

Najlepiej zbadanym chelatorem jest EDTA. Jednakże chelatujące działanie EDTA jest stosunkowo słabe wobec cynku i miedzi. Ponadto EDTA nie może przenikać przez barierę krew-mózg i jest uważany za związek stosunkowo toksyczny.

Istniała zatem potrzeba wskazania nowego zastosowania znanego związku farmaceutycznego do wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia choroby Alzheimera, który to związek ma zdolność przenikania bariery krew-mózg, skutecznie chelatuje metale ciężkie, co zapobiega agregacji amyloidu, oraz rozpuszcza złogi amyloidowe. Nieoczekiwanie stwierdzono, że w takim nowym zastosowaniu użytecznym związkiem jest kliochinol.

Tak więc wynalazek dotyczy zastosowania kliochinolu do wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia choroby Alzheimera.

Korzystnie ten środek farmaceutyczny nadaje się do podawania kliochinolu w ilości 10-250 mg raz do trzech razy dziennie.

Korzystnie wraz z kliochinolem lub po podaniu kliochinolu podaje się metale śladowe i/lub grupy prostetyczne, a zwłaszcza witaminę Bi?.

Korzystnie środek farmaceutyczny zawierający kliochinol jest przeznaczony do podawania z przerwami.

W szczególności środek farmaceutyczny zawierający kliochinol jest przeznaczony do podawania przez okres od jednego do trzech tygodni, po czym następuje okres wydalania od jednego do czterech tygodni i ewentualnie w okresie wydalania podaje się metale śladowe i/lub grupy prostetyczne, a zwłaszcza witaminę Bi2.

W przypadku stosowania środka farmaceutycznego zawierającego kliochinol okres leczenia może być przedłużony do dziesięciu lat.

Korzystnie środek farmaceutyczny zawierający kliochinol ma postać preparatu do podawania doustnego, pozajelitowego lub śródskómego.

Środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera kliochinol i witaminę Bi2.

Stosowane tutaj pojęcie „leczenie choroby Alzheimera” dotyczy profilaktyki, kontroli i terapii choroby Alzheimera w dowolnym stadium jej rozwoju.

Nazwa chemiczna kliochinolu to 5-chloro-7-jodo-8-hydroksychinolina, należąca do grupy hydroksychinolonów. Znane jest zastosowanie kliochinolu jako miejscowego środka do zwalczania zakażeń. Kliochinol jest szczególnie skuteczny w leczeniu amebiazy i biegunki zakaźnej. Kliochinol jest tylko w niewielkim stopniu rozpuszczalny w wodzie w zakresie pH 7 -11. Poza tym zakresem możliwe jest uzyskanie odpowiednich stężeń.

188 838

Wiadomo, że kliochinol ma zdolność chelatowania Fe, Co, Ni i Zn (Kidani i inni, 1974, oraz Tateishi i inni, 1973). Analiza metodą spektrofotometrii masowej wykazała, że liczba koordynacyjna dla kliochinolu w przypadku Co(II), Ni(II), Cu(II) i Ζη(Π) wynosi 2, a liczba koordynacyjna w przypadku Fe(ni) wynosi 3. Preparaty kliochinolu po wstrzyknięciu przenikają przez barierę krew-mózg i osiągają stężenie w mózgu rzędu 20 μ/ml przy podawaniu w dawkach 10-20 mg/kg (Tateishi i inni, 1975 oraz Tamura, 1975). Stwierdzono także wysokie stężenie kliochinolu w pewnych obszarach mózgu, np. w hipokampie, wcześnie atakowanym przez chorobę Alzheimera.

Przy użyciu metod mikroautoradiograficznych wykazano w próbach na małpach, że kliochinol tworzy chelaty cynku w hipokampie. Chelaty Zn(II) wytryto głównie w aksonodendrytycznych zakończeniach włókien nerwowych kiciastych w móżdżku. Niezwiązany kliochinol niezwykle szybko penetruje do układu nerwowego po wstrzyknięciu dożylnym, przy czym praktycznie nie istnieje bariera krew-mózg (Shiraki, 1979).

Nawet znając działanie chelatujące kliochinolu i jego zdolność przenikania przez barierę krew-mózg nie można było przewidzieć, że kliochinol ma również zdolność rozpuszczania Αβ wytrąconego z cynkiem. Zgodnie z wynalazkiem, na tym nieoczekiwanym odkryciu oparte jest nowe zastosowanie kliochinolu do wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia choroby Alzheimera.

Obecnie uważa się, że kliochinol i Αβ kompetycyjnie chelatują cynk i inne metale ciężkie. Uważa się, że kliochinol jest najsilniejszym chelatorem, a więc będzie wychwytywał przede wszystkim metale ciężkie. Zatem Αβ z wytrąconego z cynkiem Αβ zostanie rozpuszczony w otaczającym płynie, gdyż kliochinol wychwyci jony cynku. Kompleks kliochinolu z cynkiem przeniknie przez barierę krew-mózg i zostanie usunięty z organizmu.

Ponieważ kliochinol jest stosunkowo silnym chelatorem, może on również chelatować jony metali w enzymach lub grupach prostetycznych. Zatem może być pożądane uzupełnianie jonów metali śladowych lub grup prostetycznych u pacjentów leczonych kliochinolem, szczególnie w przypadkach długotrwałej terapii.

Witamina B12 zawiera kobalt. Poprzednie opisy przypadków podostrej neuropatii rdzeniowo-ocznej (SMON) u Japończyków, którym podawano kliochinol w dawkach większych niż zalecane oraz przez dłuższy czas, wskazują na istnienie zależności pomiędzy przedłużonym leczeniem kliochinolem a niedoborem witaminy B12. Obecnie udowodniono interakcję kliochinolu z witaminą B12 w badaniach prowadzonych in vitro i in vivo. Może zatem okazać się korzystne podawanie witaminy B12 wraz z kliochinolem lub po jego podaniu w celu zapobieżenia powstaniu niedoboru witaminy Bi2.

Kliochinol można podawać w dowolnej odpowiedniej ilości w dowolnym odpowiednim preparacie galenowym i według dowolnego trybu podawania.

Korzystnie, podawana dawka dzienna kliochinolu będzie wynosić od 10 mg do 750 mg w zależności od stanu pacjenta.

Typową dawką dzienną jest 100 mg. Alternatywnie można podawać kliochinol w dawce 10 - 250 mg, korzystnie 100 mg, trzy razy dziennie. Uważa się, że dawka dzienna do 750 mg stosowana przez okres dwóch tygodni nie stwarza ryzyka neurotoksyczności lub innych działań ubocznych.

W celu zapobieżenia wystąpieniu podmiotowych i przedmiotowych objawów choroby Alzheimera, względnie opóźnienia wystąpienia tych objawów w rozwoju choroby, kliochinol w dawkach dziennych 10 - 100 mg można podawać przez dłuższy czas, np. do 10 lat.

Konkretną ilość podawanego kliochinolu powinien wskazać lekarz prowadzący w zależności od różnych czynników dotyczących danego pacjenta, takich jak wiek, stan ogólny, wywiad itp. Wyniki tutaj przedstawione sugerują, że istnieje „okno” dla podawanej ilości kliochinolu, w obrębie którego osiąga się najlepsze wyniki rozpuszczania amyloidu. Takie okno może być określone przez lekarza po przeprowadzeniu rutynowych eksperymentów.

Gdy zachodzi potrzeba podawania kliochinolu przez dłuższy czas, najlepiej jest podawać ten związek z przerwami. W pierwszym okresie kliochinol można podawać np. przez jeden do trzech tygodni, po czym następuje okres wydalania, potrzebny dla ustąpienia ewentualnych niepożądanych działań ubocznych kliochinolu. Długość okresu wydalania może wynosić od jednego do czterech tygodni. Podczas okresu wydalania korzystne jest podawanie

188 838 witaminy B12 i innych grup prostetycznych i/lub metali śladowych. Po okresie wydalania można powtórzyć pierwszy okres. Długotrwała terapia przerywana zapewni nie tylko rozpuszczenie agregatów cynku i A β, ale również zapobiegnie powstawaniu nowych agregatów cynku i A β.

Przerywane podawanie kliochinolu zmniejszy również toksyczny potencjał leku, co oznacza, że leczenie może być rozciągnięte w przebiegu rozwoju choroby.

Środek farmaceutyczny zawierający kliochinol może być dowolnym preparatem galenowym przeznaczonym do podawania jelitowego lub pozajelitowego, mającego na celu zapewnienie wystarczającego stężenia kliochinolu w mózgu. Korzystne jest podawanie kliochinolu przez wstrzyknięcie dożylne, gdy pożądane jest szybkie osiągnięcie wysokiego stężenia w mózgu. Ponieważ dogodniejsze jest podawanie środka farmaceutycznego drogą doustną, tę drogę podawania można stosować wówczas, gdy szybkie osiągnięcie wysokiego stężenia w mózgu nie jest istotne. Środek farmaceutyczny można również podawać śródskómie.

Środek farmaceutyczny zawierający kliochinol może również zawierać inne substancje czynne. W szczególności takie środki mogą zawierać metale śladowe lub grupy prostetyczne, takie jak witamina B12 i/lub inne środki terapeutyczne, które można stosować równocześnie w leczeniu choroby Alzheimera dla poprawienia stanu chorego lub złagodzenia objawów podmiotowych i przedmiotowych choroby Alzheimera, względnie opóźnienia wystąpienia tych objawów’. Alternatywnie, te inne substancje czynne można podawać w postaci oddzielnych środków farmaceutycznych i stosować wraz ze środkiem farmaceutycznym zawierającym kliochinol.

Zgodnie z wynalazkiem nowe zastosowanie kliochinolu umożliwia

1) leczenie pacjentów z już rozpoznaną chorobą Alzheimera w dowolnym stadium klinicznym,

2) zapobieganie chorobie u pacjentów z wczesnymi lub zwiastunowymi objawami podmiotowymi lub przedmiotowymi, i/lub

3) opóźnienie początku, rozwoju, zaostrzenia lub pogorszenia objawów podmiotowych i przedmiotowych choroby Alzheimera.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

Przykład 1

W 200 ml n-dekanu rozpuszczono 5,3 g kliochinolu w trakcie mieszania. Nierozpuszczoną substancję pozostawiono dla sedymentacji. Po odpędzeniu dekanu i zważeniu wysuszonego nierozpuszczonego kliochinolu stwierdzono, że tylko 2% kliochinolu rozpuściło się w dekanie. 100 ml (jasnożółtego) supematantu zmieszano z 100 ml PBS (solanki buforowanej fosforanami) o pH 7,4 i pozostawiono dla rozdzielenia się faz. Zebrany PBS (faza dolna) poddano filtracji w celu usunięcia pozostałości powstałej na powierzchni rozdziału faz podczas ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym. Przyjąwszy, że w n-dekanie rozpuściło się 2% kliochinolu, oraz że współczynnik rozdziału wynosi 1/1750 dla PBS w mieszaninie 1:1 dekan/kliochinol, to stężenie kliochinolu w PBS wynosiło 800 nM.

Pozyskano próbki mózgu, w którym histopatologicznie potwierdzono rozpoznanie choroby Alzheimera. Duplikaty próbek (0,5 g) pochodzące z kory nowej płata czołowego homogenizowano w 3 ml roztworu kliochinol/PBS w stężeniu 100%, 10% i 1% końcowego ekstraktu PBS/kliochinol oraz samego PBS.

Homogenaty poddawano wirowaniu przy 150 000 x g przez 30 minut, po czym zbierano supematanty i przechowywano na lodzie (frakcja „S”). Osad poddawano identycznemu procesowi homogenizacji i wirowania, a uzyskane supematanty ponownie zbierano (frakcja „P”).

Każdy supematant w ilości 1 ml zadano 200 pl lodowatego 10% TCA (kwasu trichlorooctowego) w celu strącenia wszystkich białek, w tym A[i. Uzyskany osad przemyto jednokrotnie 100% etanolem i ponownie rozpuszczono w 100 μΐ TPS (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4).

Próbkę (S lub P) (7,5 μθ utrzymywano w stanie wrzenia przez 5 minut z jednakową objętością buforu do próbek tristricyny, zawierającego 4% SDS (dodecylosiarczan sodu), a następnie nanoszono na wstępnie uformowany żel Novex zawierający 10-20% tris-tricyny, po czym przenoszono metodą Western na nitrocelulozę. Sygnał dla A β wykrywano z użyciem mAb W02 (rozpoznającego reszty 5-16 A β) i wizualizowano z zastosowaniem ECL (elektroluminescencji). Czułość układu wykrywającego wynosiła 5-10 pg.

188 838

W celu potwierdzenia precypitacji A β przez TCA, 1 pg syntetycznego A β 1-40 dodano do 1 ml PBS zawierającego 10% BSA, a roztwór poddano obróbce tak jak opisano powyżej. Sygnał dla A β wykryto w osadzie, ale nie w supematancie.

Wynik przedstawiono na fig. 1 (rozpuszczanie amyloidu β, pod wpływem kliochinolu).

Jak można wynioskować z fig. 1, kliochinol w badanych stężeniach okazał się skutecznym środkiem ułatwiającym rozpuszczanie A β. Ponadto stwierdzono, że optymalne stężenie wynosi 10%, co sugeruje, że jedna z postaci agregatów A β, prawdopodobnie dimer, jest bardziej rozpuszczalna w PBS niż inne.

Jakkolwiek na fig. 1 przedstawiono dane dotyczące tylko jednej próbki, dane dla dalszych 19 próbek wykazują istnienie takiej samej tendencji, co wskazuje, że kliochinol jest skutecznym środkiem ułatwiającym rozpuszczanie Aβ.

Przykład 2

W tym przykładzie porównano aktywność chelatującą kliochinolu i EDTA.

Próbki 10 ng syntetycznego A β umieszczono na płytce wielostudzienkowej do mikromiareczkowania, a agregację wywołano poprzez dodanie 25 pM ZnCl. Agregaty przeniesiono następnie na nylonową błonę 0,2 pm poprzez filtrację. Agregaty przemyto 200 pl samego TBS, TBS zawierającego 2 pM EDTA oraz TBS zawierającego 2 pM kliochinolu. Błonę utrwalono, potraktowano 25 przeciwciałem monoklonalnym anty-Λβ 6E10 i poddano ekspozycji na błonie ECL. Mierzono transmitancję błony ECL, a względną, siłę sygnału obliczano w oparciu o 100% dla samego TBS. Względna siła sygnału wynosiła 66% dla EDTA i 49% dla kliochinolu.

Wyniki te wskazują, że kliochinol jest lepszym chelatorem niż EDTA wobec A β wytrąconego z cynkiem.

Przykład 3

W tym przykładzie wykazano, że kliochinol ponownie rozpuszcza istniejące agregaty.

Przygotowano 2,5 μΜ roztwór A β w TBS o pH 7,4. 95% A β było w stanie rozpuszczonym. Dodanie 30 μΜ cynku spowodowało wytrącenie rozpuszczonego Ap, przy czym tylko 43% A β pozostało w roztworze. Następnie do A β wytrąconego z cynkiem dodano 120 μΜ kliochinolu, co spowodowało wzrost stężenia rozpuszczonego A β do 70%.

Wyniki te wskazują, że kliochinol ma zdolność ponownego rozpuszczania AP wytrąconego z cynkiem.

Przykład 4

W tym przykładzie badano wpływ kliochinolu na witaminę B12 metodą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) in vitro.

Ponieważ kliochinol w zakresie pH 7 - 11 jest praktycznie nierozpuszczalny w wodzie, badanie przeprowadzono przy pH 13. Przygotowano trzy probówki. Pierwsza zawierała 1 mg kliochinolu w 0,5 ml, druga 1,4 mg cyjanokobalaminy (B12) w 0,5 ml, a trzecia zawierała 0,5 mg kliochinolu + 0,7 mg cyjanokobalaminy w 0,5 ml (stosunek molowy 3:1).

Widma 'H NMR rejestrowano z użyciem spektrofotometru DRX 400 MHz w temperaturze 20°C. Porównanie trzeciego widma z pierwszym i drugim wykazuje, że pewne częstości rezonansowe cyjanokobalaminy są przesunięte i to samo zaobserwowano dla dwóch częstości rezonansowych kliochinolu. Wyniki sugerująwzajemne oddziaływanie kliochinolu i cjanokobalaminy.

Przykład 5

W tym przykładzie badano wpływ kliochinolu na witaminę Bn in vivo.

Sześciotygodniowym samcom myszy podawano wstępnie kliochinol przez trzy dni (50 mg/kg/dziennie). Myszy podzielono na dwie grupy, grupę kontrolną i grupę, której wstrzyknięto [⁵⁷Co]-cjanokobalaminę. W 48 godzin po wstrzyknięciu zwierzęta uśmiercono, po czym wycięto mózg, wątrobę i nerki oraz zliczano impulsy w liczniku gamma w tysiącach impulsów/g tkanki (mokrej masy) ± SEM. Radioaktywność w każdej z grup przedstawiono w poniższej tabeli.

Tabela

Leczenie	Mózg	Wątroba	Nerka
Kontrola	9,4 ± 0,9	97 ± 8	895 ± 207
[⁵⁷Co]-B₁₂	8,4 ± 1,5	85 ±21	252 ±61

188 838

Porównanie wyników pokazuje, że nie było istotnych zmian w akumulacji radioaktywności w mózgu i wątrobie. Widoczne było zmniejszenie ilości witaminy B12 w nerkach. Można wywnioskować, że kliochinol ma wpływ na stężenie witaminy B12 w niektórych narządach myszy.

Literatura

Kang i inni, (1987) Nature 325: 733-736.

Kirschner i inni, (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. 267: 6953-6597.

Kawahara M., Arispe N., Kuroda Y., Rojas E. (1997) Biopysical Journal 73/1, 67-75. Bush, A.I., Moir, R.D., Rosenkranz, K.M. i Tanzi, R.E. (1995) Science 268: 1921-1923. Bush A.I., Pettingell Jr., W.H., Paradis, M.D. i Tanzi, R.E. (1994a) J. Biol. Chem. 269:

12152-12158.

Bush A.I., Pettingell Jr., W.H., Multbaup, G, Paradis, M.D., Vonsattel, J.P., Gusella, J.F., Beyreuther, K., Ma-sters, C.L. i Tanzi, R.E. (1994b) Science 265: 1464-1467.

Esler, W.P., Stimson, E.R., Jennings, J.M., Ghilardi, J.R., Mantyh, P.W. i Maggio, J.E. (1996) Neurochem. 66: 723-732.

Kidani Y i inni, (1974) Jap. Analyst 23: 1375-1378.

Tateishi J. i inni, (1973) Psychiat. Neurol. Jap. 75: 187-196.

Shirilogi H. i inni, (1979) Handbook of Clinical Neurology, North Holland Publishing Company, 141-198.

Tamura Z., (1975), Jap. J. Med. Sei. Biol. Suppl 28: 69-77.

188 838

Rozpuszczanie amyloidu β pod wpływem kliochinolu

-<*- 8kD —4kD

Frakcja	S P	S P	S P	S P	1-40
Stężenie kliochinolu	0	100%	10%	1%

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosownnie kliochinolu do wtWwrzannia środaa frmaaeeutyznnego do lezennia choroby Alzheimera.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, do podawania klidohindle w ilości 10 - 250 mg raz do trzech razy dziennie.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym wraz z klidohindlem lub po pddznie kliopodaje się metale śladowe i/lub grupy prostetyczne.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym gπepąprt>stntycznąjest witamina B12.
5. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym środek farmaceutyczny zawierający kliochinol jest przeznaczony do podawania z przerwami.
6. Zastosowanie według zastrz. 5, w którym środek farmaceutyczny zawierający kliochinol jest przeznaczony do podawania przez okres od jednego do trzech tygodni, po czym następuje okres wydalania od jednego do czterech tygodni.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, w którym w okresie wydalania podaje się metale śladowe i/lub grupy prostetyczne.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, w którym grupą prostety^^/est witamina B12.
9. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, w którym okres leczenia jest przedłużony do dziesięciu lat.
10. Zastosowanie wed^g zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, w którym środek farmaceutyczny zawierający kliochinol ma postać preparatu do podawania doustnego.
11. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, w którym środek farmaceutyczny ma postać preparatu do podawania pozajelitowego.
12. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, w którym środek farmaceutyczny ma postać preparatu do podawania śródskórnego.
13. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera kliochinol i witaminę B12.