PL189998B1

PL189998B1 - Zastosowanie szczepu Lactobacillus Reuteri

Info

Publication number: PL189998B1
Application number: PL97330324A
Authority: PL
Inventors: Ivan A. Casas; Bo Mollstam
Original assignee: Biogaia Biolog Ab
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1997-06-03
Publication date: 2005-10-31
Also published as: DE69731540T2; EP0923293A1; DE69731540D1; CA2257077A1; JP4861500B2; EP0923293A4; EP0923293B1; US5837238A; ES2232869T3; PL330324A1; BR9710689A; JP2010265303A; WO1997046104A1; JP2000512634A; AU734194B2; ATE281840T1; AU3154897A; CA2257077C; PT923293E

Abstract

1. Zastosowanie szczepu Lactobacillus Raeuteri do wytwarzania kompozycji odzyw czej lub farmaceutycznej do hamowania odwodnienia u mlodych ssaków, zwlaszcza mlo dych osobników, w przebiegu ostrej biegunki. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepu Lactobacillus Reuteri w leczeniu zakaźnego zapalenia żołądka i jelit.

Prawidłowe środowisko bakteriologiczne odgrywa istotną rolę w ochronie gospodarza przed chorobami układu żołądkowo-jelitowego (GI) (Fueller, R., Gut 1991; 32:439-42; Salminen, S. i in., Dig Dis Sei 1992; 10:227-38). W trakcie trwania ostrej biegunki prawidłowe środowisko bakteryjne układu pokarmowego jest całkowicie zmienione. Zmiany te obejmują zmniejszenie liczby bakterii Lactobacilh, Bacterodes i Bifidobacteria (Salminen, S. i in., Dig Dis Sei 1992; 10:227-38; Tazume S. i in., Glin Infect Dis 1993; 16 (2 suplement): 77-82S); Mitsuoka T., w Woood BJB, Londyn: Elsevier Applied Science 1992, 1:69-114; Salminen S. i in., Chemiotherapy, w druku).

Lactobacillus reuteri jest najczęściej występującym gatunkiem Lactobacillus znalezionym w układzie GI u ludzi i innych zwierząt (Kandier O. i in., Zbl Bakt Abt Orig 1980;

Cl:264-9). Podobnie jak inne Lactobacilh, L. reuteri wytwarza kwaśne końcowe produkty

189 998 metabolizmu (kwasy mlekowy i octowy) posiadające znaczną aktywność antybakteryjną (Axelson L. T. i in., Microb Ecology Health Dis 1989; 2: 131-6). Zastosowanie leczenia komórkami L. reuteń w innych celach niż probiotyczne tj. poprawiające stan gospodarza przez poprawę własnej flory bakteryjnej lub antybiotyczne, jest nieznane.

Wiele badań wskazywało na to, że podawanie czynników probiotycznych może zmieniać stan równowagi mikrobiologicznej gospodarza i łagodzić ostre stany biegunkowe (Pearce J. L. i in., J. Pediatr 1974; 84:261-2; Brunser O. i in., Acta Paediator Scand 1989, 778:259-64; Boudraa G. i in., J. Pediatr Gaestroenterol Nutr. 1990; 11:509-12). Wykazano, że szczep GG Lactobacillus casei przyczynia się do powrotu do zdrowia dzieci w przypadku nieżytu żołądkowo-jelitowego wywołanego przez rotawirusa i zwiększa jelitową ochronę immunologiczną (Isolaurie E. i in., Pediatrics 1991; 88:90-7; Kaila M. i in., Int. Pediatr. Research Foundation, Inc. 1992;32:141-4; Majamaa H. i in., J. Pediatr. Gastroenterol Nutr. 1995; 20:333-S). Inne dostępne na rynku preparaty' bakterii kwasu mlekowego, takie jak L. casei podgatunek rhamnosus (Lactophilus), L delbruckii podgatunek bulgaricus i inne są również wykorzystywane do leczenia ostrej biegunki, nawet jeśli ich skuteczność nie została oficjalnie potwierdzona (Majamaa H. i in., J Pediatr Gastroenterol Nutr 1995; 20:333-8). Wykazano, że L. reuteri można bezpiecznie podawać zdrowym osobnikom (Wolf B.W. i in., Micro Ecology Health Dis 1995;8:41-50) jak również ma możliwości terapeutyczne w przypadku szczurzego modelu nieżytu jelitowego (Fabia R i in., Scand J Gastroenterol 1993;28:155-62).

Wiadomo, że L. reuteri produkuje substancję antybakteryjną. o szerokim spektrum zwaną reuteryną (Axelson L.T. i in., Microb Ecology Health Dis 1989;2:131-6), które może być odpowiedzialna za zahamowanie patogennych mikroorganizmów w przewodzie pokarmowym.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem obecnego wynalazku jest zastosowanie jednego lub więcej szczepów Lactobacillus reuteri izolowanego z osobnika tego samego gatunku, do wytwarzania kompozycji odżywczej lub farmaceutycznej stosowanej do zahamowania odwodnienia młodych ssaków, zwłaszcza młodych osobników. Korzystnie podaje się przynajmniej 10⁷ komórek L. reuteri przez okres obejmujący przynajmniej jeden dzień, zależnie od nasilenia objawów nieżytu żołądkowo-jelitowego. Wynikiem jest szybkie, drastyczne zmniejszenie biegunki i wymiotów osobnika, wcześniej nie osiągane przy stosowaniu innych metod leczenia.

Celem wynalazku jest zapewnienie leczenia ostrej biegunki, które szybciej i skuteczniej hamuje odwodnienie młodych pacjentów w porównaniu z wcześniejszymi metodami.

Przedmiotem wynalazku jest więc zastosowanie szczepu Lactobacillus reuteri do wytwarzania kompozycji odżywczej lub farmaceutycznej do hamowania odwodnienia u młodych ssaków, zwłaszcza młodych osobników, w przebiegu ostrej biegunki.

Zastosowanie to polega na przygotowaniu przynajmniej jednej porcji zawierającej liofilizowane komórki i następnie obejmuje etap wybrany z grupy obejmującej zawieszenie liofilizowanych komórek w płynie, liofilizowanie komórek zamkniętych w żelatynowej kapsułce i liofilizowanie komórek zamkniętych przed podaniem pacjentowi w pojemniku do przechowywania nie przepuszczającym wilgoci.

Korzystnie przynajmniej jedną porcję komórek szczepu zawierającą około 107-lO¹⁰ komórek podaje się ssakowi tak szybko jak jest to możliwe po rozpoznaniu biegunki, zwłaszcza co najmniej około 10 komórek podaje się ssakowi raz dziennie aż do uzyskania całkowitego ustąpienia objawów biegunki.

Korzystnie przygotowanie przynajmniej jednej porcji obejmuje liofilizowanie komórek.

Korzystnie liofilizowane komórki są zawieszane w płynie przed podaniem, przy czym płyn jest wybrany z grupy obejmującej soki, produkty mleczne i wodę.

Korzystnie zamyka się liofilizowane komórki w żelatynowych kapsułkach do podawania ssakom.

Korzystnie zamyka się liofilizowane komórki w nieprzepuszczających wilgoci pojemnikach, do przechowywania aż do czasu podania ssakom.

Korzystnie biegunka jest związana z zakażeniem rotawirusowym, zaś ssakiem jest człowiek.

Korzystnie szczep jest izolowany z tego samego gatunku ssaka, co ssak, któremu to leczenie jest dostarczane, zwłaszcza szczep jest izolowany od człowieka.

Korzystnie szczep jest izolowany z ludzkiego mleka.

189 998

Krótki opis rysunków

Figura 1 graficznie pokazuje częstość wodnistych stolców w ciągu 24 godzin u pacjentów otrzymujących L. reuteri lub placebo, przedstawia je jako całkowitą liczbę stolców biegunkowych (fig. la) i procentowe zmniejszenie w porównaniu z ilością przy przyjęciu (fig. lb). Pełne kwadraty odpowiadają leczeniu L. reuteri, a puste odpowiadają leczeniu placebo.

Figura 2 pokazuje częstość wymiotów w ciągu 24 godzin u pacjentów otrzymujących L. reuteri lub placebo, przedstawia je jako całkowitą liczbę wymiotów (fig. 2a) i procentowe zmniejszenie w porównaniu z ilością przy przyjęciu (fig. 2b). Pełne kwadraty odpowiadają leczeniu L. reuteri a puste odpowiadają leczeniu placebo.

Figura 3 pokazuje całkowitą liczbę pałeczek kwasu mlekowego w kale dzieci otrzymujących placebo (drugi słupek, w każdej parze słupków) i L. reuteri (pierwszy słupek w każdej parze słupków).

Figura 4 pokazuje liczbę L. reuteri w kale dzieci otrzymujących placebo (drugi słupek, w każdej parze słupków) i L. reuteri (pierwszy słupek w każdej parze słupków·').

Figura 5 pokazuje liczbę L. reuteri jako procent całkowitej populacji pałeczek kwasu mlekowego w kale dzieci otrzymujących placebo (drugi słupek, w każdej parze słupków) i L. reuteri (pierwszy słupek w każdej parze słupków).

Szczegółowy opis wynalazku i korzystne jego wykonania

Niniejszy wynalazek wykorzystuje się w leczeniu ssaków cierpiących z powodu biegunki, obejmującym określenie jaki ssak ma biegunką lub jakiemu zagraża wystąpienie biegunki; wybranie szczepu Laćtobacilluś reuteri; przygotowanie przynajmniej jednej porcji szczepu zawierającej około 10⁷-10¹⁰ komórek; korzystnie przynajmniej około 10⁸ komórek do podawania ssakowi; i doustne podanie przynajmniej jednej porcji ssakowi tak szybko jak to możliwe po rozpoznaniu biegunki. Próbki mogą zawierać liofilizowane komórki, które są zawieszane w płynie do podawania ssakom. Płynem może być woda, sok owocowy, produkty mleczne takie jak mleko lub jogurt i inne, które nie są szkodliwe dla ssaków. Liofilizowane komórki mogą być pakowane w opakowanie nie przepuszczające wilgoci, takie jak opakowania foliowe lub w znane kapsułki żelatynowe. Alternatywą do podawania ssakom komórek w postaci płynu, komórki mogą być pakowane w kapsułki żelatynowe i podawane w takiej postaci. Korzystnie szczep Lactobacillus reuteri jest szczepem wyizolowanym z takiego samego gatunku ssaka, ja ten który jest leczony. Następnie wynalazek obejmuje lecznicze preparaty zmniejszające objawy biegunki, które w każdej porcji podawanej ssakowi zawierają przynajmniej 107 żywych komórek szczepu L. reuteri.

Niniejszy wynalazek korzystnie wykorzystuje się w leczeniu ostrej biegunki u ludzi obejmującego podawanie Lactobacillus reuteri. Korzystnie leczenie trwa przez okres przynajmniej 7 dni, korzystnie rozpoczyna się tak szybkoiak to możliwe po rozpoznaniu biegunki, przy czym utrzymywany jest poziom podawania 10-10^¹ komórek dziennie. Im szybciej zostanie rozpoczęta terapia tym szybciej podawanie L. reuteri może usunąć objawy biegunki.

W podanym tu podsumowaniu podstawowego badania oceniającego wpływ szczepu Lactobacillus (Lactobacillus reuteri szczep SD 2112) ustąpienie objawów ostrej biegunki (75% rotawirusowej) badano 40 pacjentów w wieku od 6 do 36 mięsiecy. Szczep L. reuteri wyizolowano pierwotnie z ludzkiego mleka i złożono zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego 7 grudnia 1995 w American Type Culture Collection jako ATCC NR 55730.

Po uzyskaniu zgody rodziców, pacjentów losowo przydzielono do jednej z dwóch grup, w jednej otrzymywały od 1010do ciii L. reuteri, w drugiej odpowiadające placebo, raz dziennie przez czas trwania hospitalizacji lub przez 5 dni. Leczenie podawano w 50 ml do 100 ml płynu. Średni okres (SD) trwania biegunki po włączaniu leczenia w grupie L. reuteri wynosił 1,7 [1,6] dni, w grupie placebo 2,9 [2,3] dni (p = 0,07). Drugiego dnia leczenia jedynie 26% pacjentów otrzymujących L. reuteri miało wodnista biegunkę w porównaniu z 81% z grupy otrzymującej placebo (p = 0,0005). Hodowle pałeczek kwasu mlekowego uzyskane z próbek stolca wykazały, że podawana L. reuteri stanowi więcej niż 75% całkowitej liczby pałeczek kwasu mlekowego znalezionej u dzieci otrzymujących ten produkt. Wnioskując, L. reuteri jest skutecznym czynnikiem leczniczym w przypadku ostrej biegunki u dzieci.

Wyniki kliniczne poparte przez analizę kału, wskazują że kolonizacja układu pokarmowego przez L. reuteri powoduje skrócenie czasu trwania i poprawę przebiegu ostrej biegunki

189 998 głównie o etiologii rotawirusowej. Pozytywne efekty leczenie L. reuteri obserwowano w ciągu 24 godzin od rozpoczęcia leczenia, po tym jak u większości pacjentów obserwowano zmniejszenie ilości wodnistych stolców. Zaobserwowano, że drugiego dnia leczenia 74% leczonych pacjentów nie miało objawów biegunki, a w grupie placebo jedynie 19% ma oczywiste znaczenie kliniczne. Wynik jest korzystnie porównywalny z wcześniejszymi doświadczeniami nad Lactobacillus GG (Isolauri E i in., Pediatrics 1991; 88:90-7; Majama H i in., J. Pediatr Gastroeneterol Nutr 1995;20:333-8), który z kolei jest klinicznie skuteczniejszy niż kombinacja Streptoccocus termophilus i L. debruckki podgatunek Bulgaricus (Yalacta) i L. Casei podgatunek Rhamnosus (Lactophilus) w leczeniu ostrej biegunki. Niniejsze wyniki mogą dalej zostać poprawione przez wcześniejsze podawanie L. reuteri. W podanym tutaj podstawowym badaniu, leczenie L. reuteri rozpoczynano stosunkowo późnym stadium biegunki u pacjentów wymagających hospitalizacji i jedynie w stadium odwodnienia i po prawnym zabezpieczeniu uzyskaną zgodą rodziców. W wielu przypadkach opóźnienie było znaczne.

Wyniki kliniczne potwierdziły znaleziska bakteriologiczne, które wskazywafy na niską liczbę całkowitą pałeczek kwasu mlekowego i faktyczny brak L. reuteri w grupie przyjmującej placebo i wysoką liczbę całkowitą pałeczek kwasu mlekowego i kolonizację L. reuteri w grupie leczonej. Dane mówiące o kolonizacji sugerowały, że obecność L. reuteri w układzie żoładkowo-jelitowym poprawia ekologię przewodu pokarmowego poprzez ułatwianie wzrostu innym korzystnym mikroogranizmom (Fuller R, Gut 1991;32:439-42).

Cechy i korzyści uzyskane dzięki obecnemu wynalazkowi będą lepiej zrozumiałe na podstawie poniższych przykładów, które jednakże nie mogą ograniczać niniejszego wynalazku.

Przykłady

Badanie kliniczne pacjentów

Badanie przeprowadzono między 29 stycznia a 3 lipca 1995 roku zgodnie z okresem epidemicznym rotawirusa. Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet Etyczny Tampere University Hospital, Tampere, Finland. Było to badanie randomizowane, badanie podwójnie ślepej próby. Badani osobnicy to 41 prawidłowo odżywionych pacjentów (61% chłopców), między 6 a 36 miesiącem życia kolejno przyjmowani do Oddziału Pediatrii, Tampere University Hospital, z powodu ostrej biegunki trwającej przynajmniej 7 dni z więcej niż jednym wodnistym stolcem w ciągu ostatnich 24 godzin. Dzieci były włączane lub wyłączane z badania o oparciu na następujących kryteriach włączenia lub wyłączenia. Pacjenci, których można było włączyć do badania, musieli być w wieku między 6 a 36 miesiącem, przyjęci z powodu ostrej biegunki, przyjmowali w wywiadzie krowie produkty mleczne (mleko, jogurt, mieszankę niemowlęcą itd.) jako składnik ich zwykłej diety i posiadali rodzica łub prawnego opiekuna, który podpisze zezwolenie po wyjaśnieniu. Pacjentów wyłączano z badania, jeśli przyjmowali leczenie immunosupresyjne lub cierpieli z powodu braku odporności, mieli w wywiadzie alergię na mleko krowie, biegunka była wywołana poważną chorobą zasadniczą, przyjmowali badany produkt w ciągu poprzedzającego miesiąca lub ich rodzice albo prawni opiekunowie odmówili podpisania zezwolenia po wyjaśnieniu.

Schemat randomizacji przygotowano tak by przynajmniej 50% pacjentów zostało włączonych do każdej grupy leczonej (Z. reuteri lub placebo). Numery randomizacyjne przydzielano pacjentom kolejno w miarę włączania do badania.

Dane zebrane przed rozpoczęciem badania

W trakcie przyjęcia dzieci ważono, przeprowadzano badanie kliniczne i oceniano ciężkość stanu odwodnienia. Ostrą utratę wagi obliczano jako różnice między wagą oczekiwaną (według indywidualnych kart wzrostu) i wagą zaobserwowaną. Niedobór płynów (procent odwodnienia) określano następnie wykorzystując objawy kliniczne i ostrą utratę wagi ze zmniejszeniem od 0,5% do 1% na każdy dzień biegunki trwającej przynajmniej 3 dni celem oddania spadku wagi związanego z niewielkim dostarczaniem organizmowi kalorii. Poziomy potasu i sodu w surowicy jak również równowagę kwasowo-zasadową oceniano na podstawie próbek krwi pobranych przy przyjęciu.

Leczenie

Po przyjęciu do szpitala, pacjentom zapewniano standardowa opiekę medyczną, po pierwsze doustne uzupełnienie płynów, po którym następowało szybki powrót do pełnego karmienia (Isolauri E. i in., J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2985; 4:366-74), lecz nie podawano

189 998 leków przeciwbiegunkowych. Doustne uzupełnienie płynów uzyskiwano w ciągu 6 godzin przez podawanie roztworu zawierającego Na+ (60 mmal_l^1) i glukozy (84 mmol^i^i) podawanemu dwukrotnie przy deficycie płynów przynajmniej 30 ml/kg (Rautanen T. i in., Acta Paediotr. 1993;82:52-4).

Pacjentów identycznie roπdzminawoπz do jednej z dwóch grup. Grupa 1 (n = 19) otrzymywała od 1O¹⁰ do 10“ cfu L. reuteri szczepu Sd 2112 raz dziennie. Grupa druga otrzymywała raz dziennie odpowiadające placebo. Placebo składało się z odtłuszczonego mleka w proszku. Preparaty L. reuteri i placebo były przygotowywane w sposób koπtrzlawoπr i zapewniający jakość przed wysyłką przez BiaGsiα Biologies, Inc. (Railegh, North Carolina, USA). Każdą jsdnzgramawą dawkę (10“ do 10¹¹ cfu/g) L. reuteri pakowano w liafilinowansj postaci w sterylnie zamknięte plastikowe probówki z wykorzystaniem odtłuszczonego mleka w proszku jako nośnika. Jedπogramawrm liofilizowane preparatom L. reuteri lub placebo przywracano pierwotną postać stosując wybrany płyt w ilości 50 do 100 ml. Ciepły pokarm rozdrabniano przez zmieszanie z preparatem. Karmienie określonym preparatem rozpoczynano od razu po uzyskaniu zgody. Pacjenci otrzymywali L. reuteri lub placebo przez 5 dni lub przez okres hospitalizacji jeśli był krótszy.

Pacjentów ważono codziennie w oddziale. Liczba oraz rodzaj stolców i wymiotów była śledzona przez pracujące pielęgniarki. Stolce oznaczano jako wodniste, luźne lub uformowane. Czas trwania biegunki liczono od ostatniego pojawienia się wodnistego stolca. Czas trwania biegunki liczono jako dni i ich dziesiętne części. Pacjentów wypisywano zgodnie z kliniczną oceną stanu przez prowadzącego lekarza. Proszono ich o kontakt z badającym w razie powtórnego pojawienia się biegunki w ciągu najbliższego miesiąca, po którym powtórnie pobierano pacjentom próbki krwi.

Zebrane dane dotyczące pacjentów

Stężenia w surowicy potasu i sodu i równowagę kwasowo-zasadową określano stosując standardowe procedury w laboratorium szpitalnym.

Obecność antygenu rotowirusowego wykazywano stosując dostępny na rynku test immuπo-snzrmoircznr (Dokoeotts Asp-, Dania) w Zakładzie Wirusologii, Szkoły Medycznej, University of Tampere. Próbki krwi πο serologię rotawirusa pobierano w dniu przyjęcia lub następnego dnia i cztery tygodnie później po potwierdzeniu obecności przeciwciał przeciwko rotawirusom. Przeciwciało klasy IgA przeciwko rotowirusom oznaczono metodą ELlSA (Isolourie i in., 1995;13:310-2).

Stolce pobierano od każdego osobnika i poddawano analizie w kierunku całkowitej ilości pałeczek kwasu mlekowego i L. reuteri. Próbki kału zbierano no początku przed włączeniem do leczenia badanym produktem, 48 godzin po podaniu badanego produktu i przy wypisie ze szpitola. Pobierano nie mniej niż 2 g stolca do analizy bakteriologicznej. Próbki homogenizowano i rozcieńczono w 0,1% peptonie do końcowego rozcieńczenia 1:5. Pięć porcji po 1,6 ml dobrze wymieszonego preparatu każdo szybko zamrożono i trzymano w -70°C. Rozcieńczone próbki stolca wysyłano do BioGoia Biologies, Inc. Raileigh, NC USA celem oznaczenia całkowitej ilości kołowych pałeczek kwasu mlekowego i L. reuteri.

Aktywności w kole enzymów ureazy, ((-glukuronidozy i β-ghikozydoz.y oznaczono w laboratorium Clinical Nutrition Departament of University of Kuopio w sposób wcześniej opisany (Ling W.H. i in., AnnNutr Metob 1992;36:162-6).

Metody statystyczne

Analizę statystyczną przeprowadzono stosując test t Studenta i onolizę zmienności (Anovo) w Celu oceny różnic statystycznych między grupami. Po porównoniu powtarzalnych oznaczeń stosowano sparowany test t Studenta i test Anovo dla powtarzalnych pomiarów.

tt J miu

Czterdziestu jeden pacjentów zostało początkowo włączonych do badania. Jedno dziecko z grupy placebo wypadło z badania, ponieważ w próbce kału wykazano obecność L. reuteri. Jej siostro również było włączono do badania do grupy L. reuteri. Jest oczywiste, że doszło do krzyzowej kontami-nacji pomiędzy tymi dziećmi. Pozostałe 40 dzieci, 19 i 21 pacjentów włączono odpowiednio do grup L. reuteri i placebo. U trzydziestu pacjentów (75%) wykazano obecność antygenu rotswirusowegz w próbkach kołu testem immuπoeπnymsiyczπrm. Rotawirus został znaleziony u 12 pacjentów grupy L. reuteri (63%) i u 18 w grupie placebo (86%).

189 998

Charakterystykę kliniczną cech odnoszących się do badania całej grupy badanej (n = 40) pokazano w tabeli 1:

Tabela 1

Charakterystyka Kliniczna Dzieci Hospitalizowanych z Powodu Ostrej Biegunki i Włączonych do Badania.

Badania kliniczne	Średnia ±	SD	Zakres
Wiek (miesiące)	3,0	1,7	od 6 do 36
Czas trwania biegunki przed leczeniem (dni)	3,4	1,4	od 1 do 7
Odwodnienie (%)	371	188	od 0 do 71
Ostra utrata wagi (g)	138	3,1	od 150 do 891
Surowica
Na+ (mmol/L)	7,35	0,06	od 130 do 144
Krew
Aktualne pH	-7,1	4,4	od 7,24 do 7,46
Nadmiar zasad (mmol/L)	16,5	8,8	od -15 do +2,3

Średnia (SD) trwania biegunki do rozpoczęcia leczenia wynosiła 3,0 (1,7) dni. Przy przyjęciu większość pacjentów wykazywało łagodne odwodnienie, średnio 3,4 (1.4)%, Poziom sodu w surowicy wynosił między 130 a 144 mmol/L, ze średnia 138 mmol/L. Biegunka u pacjentów wykazujący obecność rota-wirusa trwała w domu 2,6 (1,5) dni w porównaniu z pacjentami nie wykazującymi obecności rotawirusa 3,1 (1,9) (różnica nie znamienna). Stopień odwodnienia u dzieci rotawirus-dodatnich nie był znacząco cięższy niż u dzieci rotawirus-ujemnych, lecz wykazywały one większą kwasicę metaboliczną (niedobór zasad 7.8 (4,3) mmol/L) niż odpowiednio pacjenci bez obecności rotawirusa (średni niedobór zasad 4,8 (3,8) mmol/L), (p = 0,07).

Charakterystyka pacjentów otrzymujących L. reuteri lub placebo została pokazana w tabeli 2. Przy przyjęciu, obie grupy były porównywalne za wyjątkiem tego, że w dzieci w grupie L. reuteri były bardziej odwodnione niż w grupie placebo. Przybór wagi po nawodnieniu był podobny w obu grupach, podobnie jak wyrównanie kwasicy metabolicznej.

Tabela 2

Charakterystyka Kliniczna Dzieci Otrzymujących L. reuteri lub Placebo przy Przyjęciu

Badania kliniczne	Grupa L. reuteri n = 19 Grupa Placebo N = 21
Średnia ±	SD	Średnia ±	SD	P
Wiek (miesiące)	16,8	8,1	16,3	9,5	0,86
Ostra utrata wagi (g)	415	190	328	181	0,15
Odwodnienie (%)	3,9	1,3	3,0	1,2	0,025
Czas trwania biegunki przed leczeniem (dni)	3,1	1,7	2,8	1,8	0,66
Krew
Aktualne pH	7,36	0,06	7,36	0,06	0,96
Nadmiar zasad (mmol/L)	-7,6	4,4	-6,6	4,4	0,50
Surowica
Na+ (mmol/L)	138	3,1	139	3,2	0,56

189 998

Osiągnięty wynik leczenia w obu grupach był podobny w zakresie przyrostu wagi, wyrównania kwasicy i poziomów elektrolitów (tabeli 3).

Tabela 3

Wynik Leczenia Pacjentów Otrzymujących L. reuteri lub Placebo

Badania kliniczne	Grupa L. reuteri n = 19	Grupa Placebo	N = 21
Średnia ±	SD	Średnia ±	SD	P
Przyrost wagi po nawodnieniu	188	270	122	145	0,40
Przyrost wagi przy wypisie	-4,4	293	-4,7	166	0,99
Czas trwania biegunki w szpitalu (dni)	1,7	1,6	2,9	2 3	0,07
Krew
pH po nawodnieniu	7,38	0,04	7,39	0,03	0,49
Nadmiar zasad (mmol/L) po nawodnieniu	-2,7	3,3	-3,3	2,8	0,59
Nadmiar zasad przy wypisie	-0,6	2,5	-1,6	3,4	0,44
Surowica
Na+ (mmol/L)	139	2,0	138	2,9	0,56
po nawodnieniu	139	1,9	139	3,0	0,63

Czas trwania wodnistej biegunki był krótszy w grupie leczonej L. reuteri (p = 0,07). Dni 0, 12, 3, 4, 5 obliczano jako 24 godzinne okresy przed lub po przyjęciu L. reuteri lub placebo. Wpływ L. reuteri na czas trwania wodnistej biegunki zostanie dalej zaprezentowany w tabeli 4 i na figurze 1a i 1b.

Tabela 4

Procent Pacjentów z Wodnistą Biegunką

Dzień leczenia1	Wszyscy Pacjenci n = 40 Współczynnik (%)^{1 2 3}	Grupa L. reuteri n = 19 Współczynnik (%)²	Grupa Placebo n = 21 Współczynnik (%)2	P3
Dzień-0	40/40(100)	19/19 (100)	21/21 (100)
Dzień- 1	37/40 (93)	16/19(84)	21/21 (100)	0,06
Dzień-2	22/40 (55)	5/19 (26)	17/21 (81),	0,0005
Dzień-3	13/40 (33)	2/19 (11)	11/21 (53),	0,004
Dzień-4	9/40 (23)	3/19(16)	6/21 (24)	0,33
Dzień-5	5/40 (13)	2/19(11)	3/21 (14)	0,71
Dzień-6	5/40(13)	2/19(11)	3/21 (14)	0,71

odpowiednio dzień 0, 12, 3, 4, 5, i 6 odnoszą się do 24 godzin przed przyjęciem i 24, 48, 72, 96, 120 i 144 godzin po przyjęciu z pacjenci z biegunką/wszyscy pacjenci ³ porównanie grup L. reuteri i placebo

Drugiego dnia leczenia wodnista biegunka utrzymywała się jedynie u 26% przyjmujących L. reuteri w porównaniu do 81% w grupie przyjmujących placebo. Drugiego dnia częstość wodnistych stolców zmniejszyła się w grupie leczonej L. reuteri; średnia wynosiła 1,0 (SD 2,3) w grupie L. reuteri i 2,5 (SD 2,3) w grupie placebo (p = 0,05) (figura 1a). Trzeciego dnia średnia częstość wodnistych stolców wynosiła 0,5 (SD 1,9) w grupie L. reuteri i 1,7 (SD 2,6) w grupie placebo (p = 0,12).

189 998

Od drugiego dnia leczenia mniej pacjentów otrzymujących L. reuteri w porównaniu z tymi, którzy otrzymywali placebo wymiotowała (tabela 5)

Tabela 5

Procent pacjentów wymiotujących

Dzień leczenia¹	Wszyscy Pacjenci n = 40 Współczynnik2 (%)	Grupa L. reuteri n = 19 Współczynnik2 (%)	Grupa Placebo n = 21 Współczynnik2 (%)	P3
Dzień-0	23/40 (58)	1/19(37)	16/21 (76)	0,01
Dzień-1	12/40 (30)	6/19 (32)	16/21 (29)	0,83
Dzień-2	4/40 (10)	0/19(0)	4/21 (19)	0,04
Dzień-3	6/40(15)	119(5)	5/21 (24)	0,18
Dzień-4	4/40(10)	0/19(0)	4/21 (19)	0,04
Dzień-5	2/40 (5)	0/19(0)	2/21 (10)	0,16
Dzień-6	2/40 (5)	0/19(0)	2/21 (10)	0,16

¹ odpowiednio dzień 0, 1, 2, 3, 4, 5 i 6 odnoszą się do 24 godzin przed przyjęciem i 24, 48, 72, 96, 120 i 144 godzin po przyjęciu ² pacjenci wymiotujący/wszyscy pacjenci ³ test χ2 (Test chi kwadrat)

Figura 2a i 2b rónież pokazuje wyniki dotyczące wymiotów. Wymioty w praktyce ustąpiły po pierwszym dniu leczenia w grupie L. reuteri, podczas gdy w grupie placebo przeciągały się do 6 dnia.

Podawanie L. reuteri powodowało stan dobrej kolonizacji przewodu pokarmowego (fig.

3-5 i tabela 6).

Tablica 6

Całkowita liczba kałowych pałeczek kwasu mlekowego u pacjentów leczonych L. reuteri lub placebo.

Ocena kliniczna	Grupa L. reuteri n= 19	Grupa Placebo n = 21	P¹
Średnia ±	SD	Średnia ±	SD
Całkowita liczba pałeczek kwasu mlekowego (log CFU/g)
próbki stolca przy przyjęciu	2,71	1,57	3,08	1,69	0,41
próbki stolca po 48 godz.	6,88	1,54	3,32	1,99	0,0001
próbki stolca przy wypisie	5,78	2,31	2,48	1,26	0,0025
Liczba L. reuteri (log CFU/g)
próbki stolca przy przyjęciu	1,86	0,06	1,85	0,00	0,29
próbki stolca po 48 godz.	6,70	1,48	1,85	0,00	0,001
próbki stolca przy wypisie	5,45	2,57	1,85	0,00	0,008
L. reuteri (%pałeczek kwsu mlekowego)
próbki stolca przy przyjęciu	0,02	0,04	0,001	0,00	0,29
próbki stolca po 48 godz.	78,7	33,9	0,01	0,00	0,0001
Próbki stolca przy wypisie	71,5	48,6	0,01	0,00.	0,0005

¹ test t studenta (p<0,05 - różnica znacząca statystycznie)

189 998

Jak pokazano, przyrost netto 10⁷ CFU/g L. reuteri w kale obserwowano po 48 godzinach od podania L. reuteri. Całkowite CFU pałeczek kwasu mlekowego również wykazuje przyrost 107 CFU/g L. reuteri w kale 48 godzin po pierwszej dawce L. reuteri (tabela 6). Liczba L. reuteri stanowiła więcej niż 75% pałeczek kwasu mlekowego wykrytych w próbkach kału. Całkowita liczba pałeczek kwasu mlekowego była niska w próbkach kału u dzieci z grupy leczonej placebo, L. reuteri nie wykrywano w tych próbkach. W trakcie badania całkowita liczba kałowych pałeczek kwasu mlekowego w grupie dzieci otrzymujących placebo wahała się w granicach od 10’do 10⁵ CFU/g.

Aktywność w kale enzymów bakteryjnych: ureazy, β-glukuronidazy (β-GLN) i β-glukozydazy (β-GLS) była niższa w grupie L. reuteri niż w grupie otrzymującej placebo (tabeli 7).

Tabela 7

Aktywności enzymów w kale: β-GLN, β-GLS i ureazy w grupach otrzymujących L. reuteri i placebo (mmol x min'¹ x mg białka'¹)

	Grupa L. reuteri	Grupa Placebo	P¹
n= 12 Mediana	Zakres IQR	n = 9 Mediana	Zakres IQR2
β-GLN-G	0,10	0-0,37	0,26	0,037-0,67	0,28
β-GLN^	0,27	0-0,1	0,17	0-1,16	0,54
(-GLN-3	0,11	0-0,22	0,29	0,01-1,27	0,33
	2 pacjentów	5 pacjentów
β-GLSO	0,47	0-1,29	0,39	0-2,32	0,72
β-GLS^	0,97	0-4,55	1,82	0,44-2,79	0,99
P-GLS-3	0,52	0-1,04	0,67	0,03-2,42	0,56
	2 pacjentów	5 pacjentów
Ureaza-0	0	0-2,09	1,23	0-23,66	0,22
Ureaza-2	0,96	0-6,05	4,25	0-7,72	0,64
Ureaza-3	0	0	12,12	1,90-18,62	0,12
	2 pacjentów	5 pacjentów

¹ test nie-parametryczny (Mann-Whitney U) ² wewnątrz 95% przedziału ufności

Przeciwciała przeciwko rotawirusom w klasie IgA (krążące) były podobne w obu grupach badanych. Przy przyjęciu średni poziom przeciwciał IgA przeciwko rotawirusom w grupie L. reuteri wynosił 22,5 (SD 39,8) immunojednostek enzymatycznych (E1U), a w grupie placebo 7,99 (SD 21,8) EIU (p=0,163). Cztery tygodnie później średni poziom przeciwciał przeciwko rotawirusom w klasie IgA wynosił odpowiednio 74,2 (SD 33,9) i 66,3 (SD 31,9) (p = 0,4705) w grupie L. reuteri i grupie placebo, co wskazuje na to, że objawy biegunki zmniejszyły się bez konieczności wzrostu poziomu przeciwciał IgA, w przeciwcieństwie do wyników obserwowanych z Lactobacillus GG.

Wczesne podawanie

Najlepiej podawać L. reuteri według wynalazku jak tylko wystąpią objawy biegunki.

Tak więc, gdy leczenie jak to omówiono wyżej, jest rozpoczęte pierwszego dnia wystąpienia objawów biegunki, to uzyskuje się znaczące zmniejszenie objawów takich jak wodnista biegunka i wymioty, w porównaniu z kontrolą. Ta różnica jest najsilniej zaznaczona w przypadku rotawirusowego nieżytu żołądkowo-jelitowego.

189 998

Niskie poziomy dawkowania

Pacjentom podawano różniące się poziomy L. reuteri, od 10⁷ do 10¹⁰ na dzień, które to sposoby leczenia zapewniły podobne złagodzenie objawów biegunki, z szybkością zdrowienia zwiększającą się przy wyższych dawkach.

Postać leczenia L. reuteri

Poza stosowaniem płynnej zawiesiny L. reuteri, pacjentom podawano raz dziennie zarówno świeżo wyhodowane lub liofilizowane komórki ponownie zawieszane w wybranym płynie, jak i tą samą ilość L, reuteri zamkniętą w żelatynowej kapsułce. Szczególnie ssakom, które wcześniej otrzymywały odżywki w postaci podobnej do pasty, L. reuteri można dołączyć do podawanej ssakom pasty przynajmniej raz dziennie, gdy zostaną zauważone objawy biegunki, lub gdy ssaki są szczególnie wrażliwe na wystąpienie biegunki (np. w czasie odstawiania od piersi). Te same wyniki, zmniejszenie objawów biegunki, obserwowano w przypadku każdego rodzaju formulacji.

Wielokrotne podawnie w ciągu dnia

W przypadkach gdy objawy biegunki są szczególnie ciężkie, na początku leczenia według wynalazku, wielokrotnym podawaniem porcji L, reuteri można zaradzić problemowi jakim jest wydzielenie L. reuteri z organizmu zanim ma szansę osiągnięcia zamierzonego skutku. Takie przypadki obejmują ciężkie niemowlęce i dziecięce biegunki.

Leczenie innych zwierząt

Takie samo zmniejszenie objawów biegunki przy stosowaniu leczenia według wynalazku obserwowano w innych, układach ssaczych. Tak więc podawanie dzienne około komórek prosiętom przed i/lub w trakcie odstawiania od matki zmniejsza u świń występowanie biegunki wywołanej przez rotawirusy.

Korzystne wykonanie wynalazku

Korzystnie sposób według wynalazku leczenia ostrej biegunki, takiej jak zakażenia wywołane przez rotawirusy, który to sposób skutecznie i szybko hamuje postęp odwodnienia u młodych pacjentów, obejmuje określenie czy pacjent cierpi z powodu biegunki, lub czy jest zagrożony wystąpieniem biegunki; wybór szczepu Lactobacillus reuteri', przygotowanie przynajmniej jednej porcji liofilizowanych komórek zawierających około 107-10¹⁰ komórek do podania pacjentowi; i doustne podanie przynajmniej jednej porcji pacjentowi tak szybko jak to możliwe po rozpoznaniu biegunki; i najkorzystniej następnie obejmujący etap wyboru z grupy zawierającej zawiesinę liofilizowanych komórek w płynie, zawierającej liofilizowane komórki zamknięte w żelatynowej kapsułce i zamknięte przed podaniem pacjentowi w pojemniku do przechowywania nie przepuszczającym wilgoci. Komórki mogą być zamknięte przed podaniem ssakowi w pojemniku do przechowywania nie przepuszczającym wilgoci. Komórki mogą być zawieszone w takim płynie jak woda, produkty mleczne i sok owocowy, lub mogą być umieszczone w żelatynowej kapsułce przed podaniem ich ssakowi.

Stosowalność przemysłowa

Niniejszy wynalazek można zastosować w leczeniu ostrej biegunki, które skuteczniej i szybciej hamuje odwodnienie młodych pacjentów niż wcześniejsze sposoby i dzięki temu oszczędza czas i poniesione przez system ochrony zdrowia koszty.

Chociaż wynalazek został opisany z odniesieniem do szczególnych jego wykonań, to będzie zrozumiałe, że jest możliwe wiele odmian, modyfikacji i wykonań i w związku z tym wszystkie takie odmiany, modyfikacje i wykonania odnoszą się do ducha i zakresu tego wynalazku.

189 998

FIGURA 2a.

FIGURA 2b.

189 998

FIGURA 3.

Dni po pierwszym podaniu leczenia

FIGURA 4.

Dni po pierwszym podaniu leczenia

189 998

FIGURA S.

Dni po pierwszym podaniu leczenia * FIGURA 1a.

FIGURA lb.

o

Cn

o o

V u

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie szczepu Lactobacillus Raeuteri do wytwarzania kompozycji odżywczej lub farmaceutycznej do hamowania odwodnienia u młodych ssaków, zwłaszcza młodych osobników, w przebiegu ostrej biegunki.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że polega na przygotowaniu przynajmniej jednej porcji zawierającej liofilizowane komórki i następnie obejmuje etap wybrany z grupy obejmującej zawieszenie liofilizowanych komórek w płynie, liofilizowanie komórek zamkniętych w żelatynowej kapsułce i liofilizowanie komórek zamkniętych przed podaniem pacjentowi w pojemniku do przechowywania nie przepuszczającym wilgoci.
3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że przynajmniej jedną porcję komórek szczepu zawierającą około 10⁷-10^l° komórek podaje się ssakowi tak szybko jak jest to możliwe po rozpoznaniu biegunki.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że co najmniej około 10 komórek podaje się ssakowi raz dziennie aż do uzyskania całkowitego ustąpienia objawów biegunki.
5. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że przygotowanie przynajmniej jednej porcji obejmuje liofilizowanie komorek.
6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że liofilizowane komórki są zawieszane w płynie przed podaniem.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że płyn jest wybrany z grupy obejmującej soki, produkty mleczne i wodę.
8. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że następnie obejmuje zamykanie liofilizowanych komórek w żelatynowych kapsułkach do podawania ssakom.
9. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że następnie obejmuje zamykanie liofilizowanych komórek w nieprzepuszczających wilgoci pojemnikach, do przechowywania aż do czasu podania ssakom.
10. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że biegunka jest związana z zakażeniem rotawirusowym.
11. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że ssakiem jest człowiek.
12. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że szczep jest izolowany z tego samego gatunku ssaka, co ssak, któremu to leczenie jest dostarczane.
13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że szczep jest izolowany od człowieka.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że szczep jest izolowany z ludzkiego mleka.