PL191239B1 - Peptydy, analogi hormonu przytarczyc - Google Patents

Abstract

Peptydy, analogi hormonu przytarczyc o wzorach: [Cha22,23, Glu25, Lys26,30, Leu28, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2; [Cha22,23, Glu25, Lys26,30, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25, Leu23,28,31, Lys26, Aib29, Nle30]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25, Leu23,28,30,31, Lys26, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25,29, Leu23,28,30,31, Lys26]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25,29, Leu23,28,31, Lys26, Nle30]hPTHrP(1-34)NH2; [Ser1, Ile5, Met8, Asn10, Leu11,23,28,31, His14, Cha15, Glu22,25, Lys26,30, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25, Cha23, Lys26, Leu28,31, Aib29, Nle30]hPTHrP(1-34)NH2; [Cha22,23, Glu25, Lys26,30, Leu28,31' Aib29]hPTHrP(1- 34)NH2; [Cha22, Leu23,28,31, Glu25,29, Lys26, Nle30]hPTHrP(1-34)NH2; [Cha7,11,15]hPTHrP(1-34)NH2; [Cha7,8,15]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22, Cha23, Aib25,29, Lys26,30, Leu28,31]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22, Cha23, Aib25,29, Lys26, Leu28]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22, Leu23,28, Aib25,29, Lys26]hPTHrP(1-34)NH2; [Aib29]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25, Cha23, Lys26, Leu28,31, Aib29, Nle30]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25, Cha23, Lys26,30, Aib29, Leu31]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25, Leu23,28,31, Lys26, Aib29,30]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25, Leu23,28,31, Lys26, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25, Leu23,28,31, Aib26,29, Lys30]hPTHrP- (1-34)NH2; [Glu22,25, Cha23, Lys26,30, Leu28,31, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25, Cha23, Lys26,30, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu22,25, Cha23, Lys26,30, Leu28, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2; [Leu27, Aib29]hPTH(1-34)NH2; albo ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy peptydów, analogów hormonu przytarczyc.

Hormon przytarczyc („PTH”) jest polipeptydem produkowanym przez przytarczyce. Dojrzała, krążąca postać hormonu obejmuje 84 reszty aminokwasowe. Działanie biologiczne PTH można odtworzyć z użyciem jego N-końcowego fragmentu peptydowego (np. reszt aminokwasowych 1 do 34). Białko pokrewne hormonowi przytarczyc (parathormonowi) jest białkiem o długości od 139 do 173 aminokwasów o końcu N homologicznym do PTH. PTHrP wykazuje wiele efektów biologicznych takich samych jak PTH, w tym wiązanie z receptorem wspólnym dla PTH/PTHrP. Tregear, i in., Endocrinol., 93:1349 (1983).Scharakteryzowano wiele peptydów PTH pochodzących z różnych organizmów np., człowieka, bydła, szczura, kury. Nissenson, i in., Receptor, 3:193 (1993).

Wykazano, że PTH poprawia zarówno masę jak i jakość kości. Dempster, i in., Endocrine Rev., 14:690 (1993); i Riggs, Amer. J. Med., 91 (Suppl. 5B): 37S (1991). Efekt anaboliczny u mężczyzn i kobiet cierpią cych na osteoporozę obserwowano przy przerywanej terapii zarówno w trakcie jednoczesnej terapii antyresorpcyjnej, jak i bez niej. Slovik; i in., J. Bone Miner. Res., 1:377 (1986); Reeve; i in., Br. Med. J., 301:314 (1990); i Hesch, R-D., i in., Calcif. Tissue Int'l, 44:176 (1989).

Przedmiotem wynalazku są peptydy o następujących wzorach: [Cha^22,23, Glu

Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Cha^22,23, Glu²⁵, Lys^26,30, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25

Aib²⁹, Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25, Leu^23,28,30,31, Lys²⁶, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2 22,25,29 23,28,31

Leu

Met

Leu [Cha

23,28,30,31

Asn¹

Lys

Leu [Glu² ]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu² His¹⁴, Cha¹⁵, Glu² , Lys^26,30, Leu²⁸ _Leu ^23,28,31, Lys²⁶ 22,25,29

Aib²

Leu

Nle 23,28,31 ]hPTHrP(1-34)NH2

Glu

25,29

Lys [Cha^7,8,15]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²², Cha Aib^25,29, Lys²⁶, [Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu

Leu²⁸]hPTHrP(1-34)NH [Cha

Nle

Aib

Lys

22,23

Leu

26,30

Lys²⁶, Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH2

22,25 [Glu [Ser

Ile⁵

Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu^22,25, Cha²³, Lys

26,30

28,31

Glu²⁵, Lys^26,30, Leu^28,31' Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2 ]hPTHrP(1-34)NH2 Lys^26,30, Leu^28,31]hPTHrP(1-34)NH2

23,28

25,29

Cha² [Glu²

Lys² Leu²

34)NH2; [Glu [Cha^7,11,15]hPTHrP(1-34)NH₂ [Glu²², Cha²³

Lys²⁶]hPTHrP(1-34)NH ₂; [Glu²², Leu^23,28, Aib ^22,25 Cha²³, Lys²⁶, Leu^28,31, Aib²⁹, ^22,25, Leu^23,28,31, Lys²⁶,

Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25, Leu^23,28,31, Aib^26,29, Lys^26,30, Leu^28,31, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25,

Aib²⁹, Leu³¹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²

22,25

Lys

Cha

Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu

22,25

Cha²³, Lys

26,30

Leu

Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu^22,25

Aib^29,30]hPTHrP(1-34)NH₂ 30

Lys³⁰]hPTHrP(1 Cha²³, Lys^26,30

Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; albo [Leu²⁷

Aib²⁹]hPTH(1-34)NH2; albo ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Z wyją tkiem aminokwasów koń ca N, wszystkie skróty (np. Ala) aminokwasów w niniejszym ujawnieniu mają budowę -NH-CH(R)-CO-, w której R oznacza łańcuch boczny aminokwasu (np. CH3 dla Ala). Dla aminokwasów końca N, skróty oznaczają budowę =N-CH(R)-CO-, w której R oznacza łańcuch boczny aminokwasu. β-Nal, Nle, Dap, Cha, Nva, Amp, Pal, Ahc, i Aib są skrótami następujących α-aminokwasów, odpowiednio: e-(2-naftylo)alanina, norleucyna, kwas α,β-diaminopropionowy, cykloheksyloalanina, norwalina, 4-amino-fenyloalanina, e-(3-pirydynylo)alanina, kwas 1-amino-1-cyklo-heksanokarboksylowy i kwas α-aminoizomasłowy. Acc oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej kwas 1-amino-1-cyklopropanokarboksylowy;

kwas 1-amino-1-cyklobutanokarboksylowy; kwas 1-amino-1-cyklopentanokarboksylowy; kwas 1-amino-1-cykloheksanokarboksylowy; kwas 1-amino-1-cykloheptanokarboksylowy; kwas 1-amino-1-cyklooktanokarboksylowy; i kwas 1-amino-1-cyklononanokarboksylowy.

W powyższym wzorze, hydroksyalkil, hydroksyfenyloalkil, i hydroksynaftyloalkil może obejmować podstawniki 1-4 hydroksylowe. Również, COE₁ oznacza -C=O^E₁. przykłady -C=O^E₁ obejmują, choć nie są ograniczone do, acetylu i fenylopropionylu.

Peptydy według wynalazku oznaczone są formatem, np. [Ahc^7,11]hPT(1-34)NH2, przy czym w nawiasach umieszczono aminokwasy podstawione za aminokwasy sekwencji naturalnej (np. Ahc⁷ za Leu⁷, i Ahc¹¹ za Leu¹¹ w hPTH). Skrót hPTH oznacza ludzki PTH, hPTHrP oznacza ludzki PTHrP, rPTH oznacza szczurzy PTH, zaś bPTH oznacza bydlęcy PTH. Liczby w nawiasach dotyczą liczby aminokwasów występujących w peptydzie (np. hPTH(1-34) oznacza aminokwasy od 1 do 34 sekwencji peptydowej ludzkiego PTH). Sekwencja dla hPTH(1-34), hPTHrP(1-34), bPTH(1-34), i rPTH(1-34) podana jest w Nissenson, i in., Receptor, 3:193 (1993). Oznaczenie „NH2” w PT(1-34)NH2 oznacza, że koniec C peptydu jest amidowany. Z drugiej strony, PTH(1-34), ma wolny koniec C.

PL 191 239 B1

Peptyd według wynalazku jest zdolny do pobudzania wzrostu kości u osobnika (tj. ssaka takiego jak pacjent ludzki). Tak więc, w leczeniu osteoporozy i złamań kości przydatne jest gdy podaje się je same albo równocześnie z leczeniem przeciwresorpcyjnym, np., bisfosfonianami i kalcytoniną.

Peptydy według wynalazku można dostarczyć w postaci soli dopuszczalnych farmaceutycznie. Przykłady takich soli obejmują, choć nie są ograniczone do wytworzonych z kwasami organicznymi (np. octowym, mlekowym, jabłkowym, cytrynowym, maleinowym, askorbinowym, bursztynowym, benzoesowym, metanosulfonowym, toluenosulfonowym albo pamowym), kwasami nieorganicznymi (np. chlorowodorowym, siarkowym albo fosforowym), i kwasami polimerycznymi (np. taninowym, karboksymetylocelulozą, polimlekowym, poliglikolowym albo kopolimerami kwasów polimlekowoglikolowego).

Terapeutycznie skuteczna ilość peptydu według wynalazku i nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie (np. węglanu magnezu, laktozy albo fosfolipidem z którymi związek czynny może przybrać postać micelli) razem tworzą kompozycję terapeutyczną (np. pigułka, tabletka, kapsułka albo ciecz) do podawania (np. doustnie, dożylnie, przezskórnie, dopłucnie, dopochwowo, podskórnie, donosowo, jontoforetycznie albo dokomorowo). Pigułki, tabletki albo kapsułki do podawania doustnego można pokrywać substancjami do ochrony kompozycji czynnej przed kwasem żołądkowym albo enzymami jelitowymi w żołądku, przez czas odpowiedni do umożliwienia dojścia w stanie niestrawionym do jelita cienkiego. Kompozycja terapeutyczna może być również w postaci ulegającej biodegradacji albo nie ulegającego biodegradacji preparatu o przedłużonym uwalnianiu do podawania podskórnego albo domięśniowego. Patrz, opis patentowy USA nr 3,773,919 i 4,767,628 oraz zgłoszenie PCT nr WO 94/15587. Ciągłe dostarczanie można również osiągnąć stosując wszczepialne albo zewnętrzne pompy (np. pompa INFUSAID™). Podawanie można również przeprowadzić w sposób przerywany, np. przez pojedyncze codzienne wstrzyknięcia, albo w sposób ciągły w niskich dawkach, np. w postaci preparatu o przedłużonym uwalnianiu.

Dawka peptydu do leczenia powyższych chorób i zaburzeń różni się w zależności od sposobu podawania, wieku i masy ciała osobnika, oraz stanu leczonego osobnika i zawsze będzie określana przez prowadzącego lekarza albo weterynarza.

Peptyd według wynalazku znajduje również zastosowanie w leczeniu chorób albo zaburzeń związanych z niedoborem wzrostu kości itp., np. osteoporozy albo złamań.

Inne cechy i zalety wynalazku staną się jasne w oparciu o poniższy szczegółowy opis i zastrzeżenia.

Szczegółowy opis wynalazku

W oparciu o niniejszy opis, wynalazek moż na wykorzystać w pełni. Poniższe szczegółowe przykłady mają jedynie ilustrować, a nie ograniczać pozostałości opisu w żaden sposób. Dalej, wszystkie wymienione publikacje są włączone jako odnośniki.

Budowa

Opisywano, że PTH(1-34) i PTHrP(1-34) obejmuje dwie amfofilowe domeny helis alfa. Patrz, np. Barden i in., Biochem. 32:7126 (1992). Pierwsza helisa α jest utworzona przez reszty aminokwasowe od 4 do 13, podczas gdy druga helisa α jest utworzona przez aminokwasy od 21 do 29. Niektóre peptydy według wynalazku są podstawione innym aminokwasem w jednej albo więcej resztach wewnątrz albo w pobliżu tych dwóch regionów PTH(1-34) i PTHrP(1-34) (w pierwszej helisie α albo w drugiej helisie α ).

Synteza

Peptydy według wynalazku można wytwarzać standardową syntezą na fazie stałej. Patrz, np. Stewart J.M. i in., Solid Phase Synthesis (Pierce Chemical Co., wyd. 2, 1984). Peptydy według wynalazku syntetyzowano i oczyszczano również zgodnie z procedurami dobrze znanymi w tej dziedzinie, w sposób analogiczny do przedstawianego poniż ej dla peptydu o wzorze [Glu^22,25, Leu^23,28, Lys^26,30, Aib²⁹, Ahc³¹]hPTH(1-34)NH2. Inne peptydy według wynalazku specjalista w dziedzinie może wytworzyć w sposób analogiczny.

Kwas 1-[N-tert-butoksykarbonylo-amino]-1-cykloheksanokarboksylowy (Boc-Ahc-OH) syntetyzowano w następujący sposób:

19,1 g (0,133 mola) kwasu 1-amino-1-cykloheksanokarboksylowego (Acros Organics, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) rozpuszczono w 200 ml dioksyny i 100 ml wody. Do tego dodano 67 mg 2 N NaOH. Roztwór schłodzono w łaźni wodnej z lodem. Do tego roztworu dodano 32,0 g (0,147 mola) ditert-butylo-dikarbonianu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie dioksynę usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałego roztworu dodano 200 ml

PL 191 239 B1 octanu etylu. Mieszaninę schłodzono w łaźni wodnej z lodem. pH warstwy wodnej ustalono na około 3 przez dodanie 4N HCl. Warstwę organiczną oddzielono. Warstwę wodną ekstrahowano octanem etylu (1 x 100 ml). Połączono dwie warstwy organiczne i płukano wodą (2 x 150 ml), suszono nad bezwodnym MgSO4, filtrowano i zatężano do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rekrystalizowano w octanie etylu/heksanach. Otrzymano 9,2 g czystego produktu z wydajnością 29%. Inne chronione aminokwasy Acc specjalista w dziedzinie może wytworzyć w analogiczny sposób.

Peptyd syntetyzowano na syntezatorze peptydowym Applied Biosystems (Foster City, CA) model 430A, modyfikowanym do syntezy na fazie stałej metodą przyspieszoną Boc. Patrz, Schnoize i in., Int. J. Peptide Protein Res., 90:180 (1992). Zastosowano żywicę 4-metylobenzylo-hydryloaminy (MBHA) (Peninsula, Belmont, CA) z podstawieniem 0,93 mmol/g. Zastosowano aminokwasy Boc (Bachem, CA, Torrance, CA; Nova Biochem., LaJolla, CA) z następującymi łańcuchami bocznymi chronionymi grupami: Boc-Ala-OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Glu(OcHex)-OH, BocHis(DNP)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Lys (2Clz)-OH, Boc-Ahc-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH i Boc-Aib-OH. Syntezę przeprowadzono w skali 0,14 mmol. Grupy Boc usunięto przez traktowanie 100% TFA 2x1 min. Aminokwasy Boc (2,5 mmol) wstępnie aktywowano HBTU (2,0 mmol) i DIEA (1,0 ml) w 4 ml DMF i sprzęgnięto bez poprzedzającej neutralizacji soli peptyd-żywica TFA. Czasy sprzęgania wynosiły 5 minut, z wyjątkiem Boc-Aib-OH i jego reszty Boc-Leu-OH, oraz Boc-Ahc-OH i jego reszty Boc-Lys (2Clz)-OH, kiedy to czas sprzęgania dla tych reszt wynosił 2 godziny.

Na zakończenie łączenia łańcucha peptydowego, żywicę traktowano roztworem 20% merkaptoetanolu/10% DIEA w DMF 2 x 30 minut, w celu usunięcia grup DNP po stronie His łańcucha. Grupę Boc końca N usunięto przez traktowanie 100% TFA 2x2 minuty. Częściowo odblokowany kompleks peptyd-żywica płukano DMF i DCM, po czym suszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Końcowe odcięcie przeprowadzono przez mieszanie peptydu-żywicy w 10 ml HF zawierającego 1 ml anizolu i ditiotreitol (24 mg) w 0°C przez 75 minut. HF usunięto pod strumieniem azotu. Pozostałość płukano eterem (6 x 10 ml) i ekstrahowano 4 N HOAc (6 x 10 ml).

Mieszaninę peptydu w ekstrakcie wodnym oczyszczono przez preparatywną wysokociśnieniową chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (HPLC) stosując kolumnę z odwróconymi fazami Vydac™ C18 (Nest Group, Southborough, MA). Kolumnę eluowano liniowym gradientem (10% do 45% roztworu B w ciągu 130 minut) przy prędkości przepływu 10 ml/min (roztwór A = 0,1% wodny roztwór TFA; roztwór B = acetonitryl zawierający 0,1% TFA). Frakcje zebrano i sprawdzano analityczną HPLC. Frakcje zawierające czysty produkt połączono i liofilizowano do suchości. Otrzymano 85 mg białego ciała stałego. W oparciu o analizę analityczną HPLC, czystość wynosiła >99%. Analiza spektrometrii mas dała masę cząsteczkową równą 3972,4 (co było zgodne z wyliczoną masą cząsteczkową 3972,7).

Pełne nazwy zastosowanych tu skrótów brzmią następująco: Boc, t-butylokarbonyl; HF, fluorowodór; Fm, mrówczan; Xan, ksantyl; Bzl, benzyl; Tos, tosyl; DNP, 2,4-dinitrofenol; DMF, dimetyloformamid; DCM, dichlorometan; HBTU, heksafluorofosforan 2-(1H-benzotriazolo-1-il)-1,1,3,3-tetrametylouronium; DIEA, diizopropyloetyloamina; HOAc, kwas octowy; TFA, kwas trifluorooctowy; 2Clz, 2-chlorobenzylooksykarbonyl i OcHex, O-cykloheksyl.

Do wolnej aminy aminokwasu końca N standardowymi sposobami można przyłączać podstawniki takie jak, przykładowo, grupy alkilowe, np. grupy C1-12 alkilowe, można przyłączać stosując alkilację redukcyjną. Grupy hydroksyalkilowe, np. C1-12 hydroksyalkilowe, można przyłączać stosując alkilację redukcyjną, w której wolne grupy hydroksylowe są chronione estrem t-butylowym. Grupy acylowe, np. COE1, można przyłączać przez związanie wolnego kwasu, np. E1COOH, do wolnej aminy aminokwasu końca N, przez mieszanie zakończonej żywicy z 3 równoważnikami molowymi wolnego kwasu i diizopropylokarbodiimidu w chlorku metylenu przez godzinę i przeprowadzenie powstałej żywicy przez etapy (a) do (f) powyższego programu płukania. Jeżeli wolny kwas zawiera wolne grupy hydroksylowe, np. kwas p-hydroksyfenylopropionowy, to sprzęganie powinno się prowadzić z dodatkowymi 3 równoważ nikami molowymi HOBT.

Inne peptydy według wynalazku specjalista w dziedzinie może wytworzyć w sposób analogiczny.

Testy funkcjonalne

A. Wiązanie receptora PTH

Peptydy według wynalazku badano na ich zdolność do wiązania receptora PTH obecnego na komórkach SaOS-2 (ludzki mięsak kości). Komórki SaOS-2 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA; ATCC #HBT 85) utrzymywano w pożywce RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, MO)

PL 191 239 B1 z dodatkiem 10% pł odowej surowicy bydlę cej (FBS) i 2 mM glutaminy w 37°C w nawilż onej atmosferze 5% CO2 w powietrzu. Pożywkę zmieniano co trzy-cztery dni, zaś komórki klonowano co tydzień przez trypsynizację.

Komórki SaOS-2 utrzymywano przez cztery dni do uzyskania wzrostu zlewnego. Pożywkę zastąpiono RPMI 1640 z 5% FBS i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z 10x10⁴ cpm mono-¹²⁵I-[Nle^8,18, Tyr³⁴(3-¹²⁵I)]bPTH(1-34)NH2 w obecności współzawodniczących peptydów według wynalazku w różnych stężeniach pomiędzy 10^-11 M i 10^-4 M. Komórki płukano trzykrotnie lodowatym PBS i poddano lizie w 0,1 M NaOH, po czym mierzono radioaktywność związaną z komórkami w liczniku scyntylacyjnym. Syntezę mono-¹²⁵I-[Nle^8,18, Tyr³⁴ (3-¹²⁵I)]bPTH(1-34)NH2 przeprowadzono w sposób opisany przez Goldman i in., Endocrinol., 123:1468 (1988).

Test wiązania przeprowadzono dla różnych peptydów według wynalazku i obliczono dla każdego peptydu wartość Kd (połowa maksymalnego zahamowania wiązania mono-¹²⁵I-[Nle^8,18, Tyr³⁴ (3-¹²⁵I)]bPTH(1-34)NH2).

Jak pokazano na tabeli I, wszystkie badane peptydy wykazują wysokie powinowactwo do receptora PTH na komórkach SaOS-2.

T a b e l a I

Peptyd	Kd (μΜ)	EC50 (nM)
[Glu22,25, Leu23,28, Lys26,30, Aib29, Ahc31]hPTHrP(1-34)NH2;	0,200	3,7
[Glu22’25, Ahc23, Lys26,30, Leu28,31, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2 ;	0,070	3,9
[Glu22,25, Leu23,28,31, Lys26,30, Ahc27, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2;	0,230	3,0
[Glu22,25,29, Leu23,28,31, Lys26, Ahc30]hPTHrP(1-34)NH2;	0,230	7
[Cha22, Leu23,28,31, Glu25, Lys26,30, Ahc27, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2;	0,060	2,0
[Glu22,25, Leu23,28,31, Ahc24, Lys26,30, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2;	0,006	0,5
[Glu22,29, Leu23,28,31, Aib25, Lys26,30, Ahc27]hPTHrP(1-34)NH2;		5
[Glu22, Leu23,28,31, Aib25,29, Lys26,30, Ahc27]hPTHrP(1-34)NH2;		2
[Ahc22, Leu23,28,31, Glu25, Lys26,30, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2		0,3
[Glu22,25, Leu23,31, Lys26,30, Ahc28, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2		0,5
[Cha22, Ahc23, Glu25, Lys26,30, Leu28,31, Aib29]hPTHrP(1-34)NH2		0,4

B. Pobudzanie aktywności cyklazy adenylowej

Mierzono zdolność peptydów według wynalazku do wywoływania reakcji biologicznej w komórkach SaOS-2. Konkretnie, pobudzenie cyklazy adenylowej badano przez pomiar poziomu syntezy cAMP (adenozyno-3',5'-monofosforanu) jak to opisano uprzednio w Rodan i in., J. Clin. Invest.

72:1511 (1983) i Goldman i in., Endocrinol., 123:1468 (1988). Zlewne komórki SaOS-2 w płytkach

24-studzienkowych inkubowano z 0,5 μθ [³H]-adeniny (26,9 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) w świeżej pożywce w 37°C przez 2 godziny i płukano dwukrotnie buforowanym roztworem soli Hank'a (Gibco, Gaithersburg, MD). Komórki traktowano 1 mM IBMX (izobutylometyloksantyną, Sigma, St. Louis, MO) w świeżej pożywce przez 15 minut, a następnie do pożywki dodawano peptydy według wynalazku i inkubowano przez 5 minut. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 1,2 M kwasu trichlorooctowego (TCA) (Sigma, St. Louis, MO), a następnie neutralizowano próbkę 4 N KOH. cAMP izolowano metodą chromatografii na dwóch kolumnach (Salmon i in., 1974, Anal. Biochem. 58, 541). Radioaktywność zliczano w liczniku scyntylacyjnym (Liquid Scintillation Counter 2200CA, Packard, Dovners Grove, IL).

Odpowiednie wartości EC50 (połowa maksymalnego pobudzenia cyklazy adenylowej) dla testowanych peptydów obliczono, jak to opisano na tabeli I. Stwierdzono, że wszystkie badane peptydy są silnymi stymulatorami aktywności cyklazy adenylowej, która jest wskaźnikiem szlaku biochemicznego proksymalnego sygnału proliferacji osteoblastów (np. wzrostu kości).

PL 191 239 B1

Inne wykonania

Należy rozumieć, że o ile wynalazek został opisany w powiązaniu z jego szczegółowym opisem, powyższy opis ma ilustrować, nie zaś ograniczać zakres wynalazku, który określony jest zakresem dołączonych zastrzeżeń. Inne aspekty, zalety i modyfikacje leżą w zakresie zastrzeżeń.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Peptydy, analogi hormonu przytarczyc o wzorach: [Cha^22,23, Glu Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Cha^22,23, Glu²⁵, Lys^26,30, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25, Leu _Lys ^26,30, Leu^{28 31}, Lys²⁶

   Leu^23,28,30,31, Lys²⁶, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25,29 Leu^23,28,30,31, Lys²⁶]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25,29, Leu^23,28,31, Lys²⁶, Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH2; [Ser¹, Ile⁵ Met⁸, Asn¹⁰, Leu^11,23,28,31, His¹⁴, Cha¹⁵, Glu^22,25, Lys^26,30, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25, Cha²³, Lys²⁶

   Aib²⁹, Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu^22,25

   Leu^28,31, Aib²⁹,

   Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Cha^22,23

   Glu²⁵, Lys

   26,30

   Leu^28,31' Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂;

   [Cha²², Leu^23,28,31, Glu^25,29, Lys²⁶, Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH2; [Cha^7,11,15]hPTHrP(1-34)NH2; [Cha^7,8,15]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²², Cha²³, Aib^25,29, Lys^26,30, Leu^28,31]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²², Cha²³

   Aib^25,29, Lys²⁶,

   Leu²⁸]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu²², Leu

   23,28

   Aib

   25,29

   Lys²⁶]hPTHrP(1-34)NH2;

   Nle³⁰]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu^22,25 [Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25, Cha²³, Lys²⁶, Leu^28,31, Aib Cha²³, Lys^26,30, Aib²⁹, Leu³¹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25, Leu^23,28,31, Lys²⁶, Aib^29,30]hPTHrP(1-34)NH₂;

   [Glu^22,25, Leu^23,28,31, Lys²⁶, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH₂; [Glu^22,25, Leu^23,28,31, Aib^26,29,

   34)NH₂; [Glu^22,25, Cha²³, Lys^26,30, Leu^28,31, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Glu^22,25, Cha²³, Lys^26,30, Leu²⁸, Aib²⁹]hPTHrP(1-34)NH2; [Leu²⁷, Aib²⁹]hPTH(1Lys³⁰]hPTHrP(1Cha²³, Lys^26,30

   34)NH2; albo ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

   Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.