PL191312B1

PL191312B1 - Wyizolowany szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, układ gospodarz-wektor, sposób wytwarzania polipeptydu, oczyszczony polipeptyd, oligonukleotyd, sposób otrzymywania przeciwciał, przeciwciała, zastosowanie kwasu nukleinowego, zastosowanie przeciwciał, sposób oznaczania związku chemicznego, kompozycja, sposób wytwarzania kompozycji, zastosowanie kompozycji, sposób skriningu płynów ustrojowych i szczepionka

Info

Publication number: PL191312B1
Application number: PL345203A
Authority: PL
Inventors: Chong Jin Oon; Gek Keow Lim; Ai Lin Leong; Yi Zhao; Wei Ning Chen
Original assignee: Government Of The Republic Of
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2006-04-28
Also published as: TR200003778T2; AU756858B2; NO20006457D0; YU80500A; MXPA00012724A; BR9815912A; NZ508892A; CN1304453A; UA73475C2; CA2332173A1; US7038035B1; HUP0103258A3; WO1999066047A1; AR020092A1; KR20010106128A; MY135991A; KR100498117B1; CN1255540C; IS5777A; IL140363A0

Abstract

1. Wyizolowany szczep wirusa zapalenia w atroby typu B, okre slony jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia w atroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na arginin e) zdeponowany pod numerami dost epu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r. 2. Wyizolowany kwas nukleinowy koduj acy polipeptyd, który jest zmutowanym g lównym an- tygenem powierzchniowym wirusa zapalenia w atroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencj e aminokwasów, która ró zni si e od sekwencji aminokwasów g lównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia w atroby typu B tym, ze aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna. 3. Wyizolowany kwas nukleinowy wed lug zastrz. 2, w przypadku którego polipeptyd jest ko- dowany przez nukleotydy 155 - 835 sekwencji kwasu nukleinowego okre slonej jako SEQ ID NO: 1. 4. Wyizolowany kwas nukleinowy wed lug zastrz. 3, zawieraj acy nukleotydy „AGA" w pozy- cjach 587 - 589. 12. Wektor zawieraj acy wyizolowany kwas nukleinowy koduj acy polipeptyd, który jest zmu- towanym g lównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia w atroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencj e aminokwasów, która ró zni si e od sekwencji aminokwasów g lównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia w atroby typu B typu dzikiego tym, ze aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, i jest funkcjonalnie po laczony z promotorem transkrypcji RNA. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są wyizolowany szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, układ gospodarz-wektor, sposób wytwarzania polipeptydu, oczyszczony polipeptyd, oligonukleotyd, sposób otrzymywania przeciwciał, przeciwciała, zastosowanie kwasu nukleinowego, zastosowanie przeciwciał, sposób oznaczania związku chemicznego, kompozycja, sposób wytwarzania kompozycji, zastosowanie kompozycji, sposób skriningu płynów ustrojowych i szczepionka.

W szczególności wynalazek dotyczy genomu ludzkiego wirusa zapalenia wą troby typu B z mutacją indukowaną przez szczepionkę w reszcie aminokwasu 145 w głównym antygenie powierzchniowym, jego sekwencji nukleotydów, wydedukowanej sekwencji aminokwasów czterech głównych białek, antygenu, przeciwciała, układów detekcji, opracowania skutecznych szczepionek i środków przeciwwirusowych.

Wirus zapalenia wątroby typu B został wykryty po raz pierwszy w 1963 r. jako wirus ludzki, który jest przekazywany pozajelitowo. Choć te wirusy nie są szczególnie cytotoksyczne i nie prowadzą do rozległej śmierci komórek, były przyczyną poważnej choroby zakaźnej dotykającej zarówno dorosłych i małych dzieci na całym ś wiecie. Obecność antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B służyła jako główny marker do detekcji nosicieli wirusa zapalenia wątroby typu B, a więc osób mogących przekazywać wirus. Przeciwnie, występowanie przeciwciała przeciwko antygenowi powierzchniowemu oznacza odpowiedź immunologiczną, która może prowadzić w końcu do wyzdrowienia. W pobudzaniu takiej odpowiedzi immunologicznej bardzo pomagają szczepionki przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu B firmy Merck, Sharp & Dohme, która już uzyskała licencję. Te szczepionki zawierają główny antygen powierzchniowy albo w postaci naturalnej (pochodzącej z osocza) albo zrekombinowanej (oczyszczonej z komórek drożdży) i okazały się skuteczne i bezpieczne w neutralizacji wirusa zapalenia wątroby typu B. W Singapurze dzięki aktywnemu programowi szczepień w skali całego kraju osiągnięto znaczące zmniejszenie ostrych zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu B i częstości pierwotnego raka wą trobowo-komórkowego. To zmniejszenie było z kolei związane ze zwiększoną odpornością w populacji.

Główny antygenowy epitop wirusa zapalenia wątroby typu B jest wysoce konserwatywnym regionem obejmującym 23 reszty aminokwasów i zlokalizowanym od pozycji aminokwasu 124 do 147 głównego antygenu powierzchniowego. Ten mały region określany jako specyficzna determinanta grupowa „a jest spotykany we wszystkich podtypach i izolatach genomów wirusa zapalenia wątroby typu B. Jego właściwości antygenowe wydają się wynikać z jego proponowanej struktury podwójnej pętli, do której wiąże się indukowane przez szczepionkę neutralizujące przeciwciało.

W przeciwień stwie do losowych mutacji wprowadzanych do genomów wirusa zapalenia wą troby typu B podczas replikacji wirusa przez wadliwą pod względem działalności naprawczej odwrotną transkryptazę, mutacje indukowane po szczepieniu zachodzą głównie w epitopie „a głównego antygenu powierzchniowego. Te zmutowane wirusy są szczególnie interesujące, gdyż wykazują zmniejszone powinowactwo do przeciwciała neutralizującego i są więc zdolne do niezależnej replikacji. Wśród tych mutantów, które uciekły przed szczepionką, mutacja w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę) w drugiej pętli głównego antygenu powierzchniowego jest najbardziej istotna, gdyż jest stabilna, powoduje zmiany konformacyjne w epitopie „a i została znaleziona na całym świecie w Ameryce Północnej, Europie, Japonii i Azji Południowo-Wschodniej. Tak np. w Singapurze takie mutanty są najczęstszym wariantem po szczepieniu. Zidentyfikowano dwanaście zakaźnych wariantów wśród 41 przełomów jako mających mutację argininową w reszcie aminokwasu 145 głównego antygenu powierzchniowego. Istnieją dowody pionowego przekazu z jednego z tych 12 wariantów i ten wariant był także związany z czynną chorobą wątroby. Jest znaczące, że niektóre z tych wariantów są obecnie spotykane w losowej bezobjawowej populacji dorosłych.

Istnienie tego replikacyjnego mutanta indukowanego przez szczepionkę i jego zdolność do nieulegania detekcji przy stosowaniu standardowych odczynników jest powodem do poważnej troski, gdyż spowodowała wystąpienie ostrego zapalenia wątroby typu B we Włoszech i Singapurze. Ta sytuacja wymaga więc w sposób naglący opracowania specyficznych układów detekcji, jak również skutecznych profilaktycznych i terapeutycznych szczepionek i środków przeciwwirusowych. Określenie sekwencji nukleotydów tego indukowanego przez szczepionkę zmutowanego wirusa stanowi pierwszy krok do osiągnięcia tych celów i na pewno będzie pomocne w realizacji powyższych zamierzeń.

Wynalazek dotyczy wyizolowanego szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, określonego jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore

PL 191 312 B1 (glicyna na argininę) zdeponowanego pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r.

Wynalazek dotyczy również wyizolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna.

Szczególnie jest to kwas nukleinowy, w przypadku którego polipeptyd jest kodowany przez nukleotydy 155 - 835 sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako SEQ ID NO: 1, a zwłaszcza wyizolowany kwas nukleinowy, zawierający nukleotydy „AGA w pozycjach 587 - 589 zamiast „GGA.

Ten wyizolowany kwas nukleinowy stanowi DNA lub RNA, a zwłaszcza cDNA lub genomowy DNA.

Szczególnie jest to również kwas nukleinowy, w przypadku którego polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zasadniczo identyczną z resztami aminokwasów 174 - 400 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.

Wynalazek dotyczy także wyizolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który to polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.

Wynalazek dotyczy także wyizolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.

Wynalazek dotyczy również wektora zawierającego wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, i jest funkcjonalnie połączony z promotorem transkrypcji RNA.

Wynalazek dotyczy również wektora zawierającego wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który to polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.

W przypadku obu wyżej określonych wektorów, każdy z nich szczególnie zawiera wirusowy DNA.

Wynalazek dotyczy również układu gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu, który to układ zawiera każdy z wektorów określonych powyżej.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania polipeptydu, zgodnie z którym układ gospodarz-wektor hoduje się w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu, przy czym hoduje się układ gospodarz-wektor określony powyżej i odzyskuje się tak wytworzony polipeptyd.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania polipeptydu w postaci oczyszczonej, polegającego na tym, że:

(a) wprowadza się wektor określony powyżej do komórki gospodarza;

(b) hoduje się powstałą komórkę gospodarza do wytworzenia polipeptydu;

(c) odzyskuje się polipeptyd wytworzony w etapie (b); i (d) oczyszcza się tak odzyskany polipeptyd.

Wynalazek dotyczy ponadto oczyszczonego polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, zdeponowanego pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r., który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna.

Wynalazek dotyczy ponadto oczyszczonego polipeptydu otrzymanego sposobem obejmującym:

(a) wprowadzenie wektora zawierającego wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, zdeponowanego pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r., który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego z tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, i jest funkcjonalnie po łączony z promotorem transkrypcji RNA, do odpowiedniej komórki gospodarza;

PL 191 312 B1 (b) hodowanie powstałej komórki gospodarza do wytworzenia polipeptydu;

(c) odzyskanie polipeptydu wytworzonego w etapie (b); i (d) oczyszczenie tak odzyskanego polipeptydu.

Wynalazek dotyczy ponadto oczyszczonego polipeptydu, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów obejmującą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.

(a) wprowadzenie wektora zawierającego wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który zawiera co najmniej część zmutowanego głównego antygenu powierzchniowego szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, zdeponowanego pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r., który to polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1, do odpowiedniej komórki gospodarza;

(b) hodowanie powstałej komórki gospodarza do wytworzenia polipeptydu;

Wynalazek dotyczy ponadto oligonukleotydu o długości co najmniej 15 nukleotydów, zdolnego do specyficznej hybrydyzacji z unikatową sekwencją nukleotydów w obrębie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, bez hybrydyzowania do jakiejkolwiek sekwencji nukleotydów w obrębie kwasu nukleinowego, który koduje główny antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego.

W szczególności ten oligonukleotyd zawiera nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.

Wynalazek dotyczy także sposobu otrzymywania przeciwciał dla polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, a nie dla głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, przy czym ten sposób polega na tym że:

(a) otrzymuje się polipeptyd w postaci oczyszczonej;

(b) immunizuje się organizm zdolny do wytwarzania przeciwciał przeciw oczyszczonemu polipeptydowi;

(c) zbiera się wytworzone przeciwciała;

(d) łączy się wytworzone przeciwciała z oczyszczonym polipeptydem do wytworzenia kompleksu; i (e) ustala się, które wytworzone przeciwciała tworzą kompleks z oczyszczonym polipeptydem, z otrzymaniem przeciwciał dla polipeptydu.

W szczególności otrzymuje się polipeptyd kodowany przez nukleotydy 155 - 835 sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako SEQ ID NO: 1.

W innej postaci, polipeptyd ma sekwencję zasadniczo identyczną do reszt aminokwasów 174 - 400 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.

W szczególności immunizuje się organizm królika lub myszy.

Wynalazek dotyczy też sposobu otrzymywania przeciwciał dla polipeptydu, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów obejmującą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3, przy czym ten sposób polega na tym, że:

(a) otrzymuje się polipeptyd w postaci oczyszczonej;

(c) zbiera się wytworzone przeciwciała;

W szczególności immunizuje się organizm królika lub myszy.

Wynalazek dotyczy ponadto przeciwciał, korzystnie przeciwciał monoklonalnych, otrzymanych sposobem określonym powyżej.

PL 191 312 B1

Wynalazek dotyczy ponadto przeciwciał zdolnych do wykrywania polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, i niezdolnych do wykrywania głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego.

Wynalazek dotyczy ponadto przeciwciał zdolnych do wykrywania polipeptydu, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, do ustalania, czy osobnik jest zakażony szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, określonym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę), przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki kwasu nukleinowego od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę kwasu nukleinowego z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna.

Gdy próbka kwasu nukleinowego w etapie (a) zawiera mRNA odpowiadający transkryptowi DNA kodującemu polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, etap ustalania (b) obejmuje:

(i) kontaktowanie mRNA z oligonukleotydem określonym powyżej, w warunkach umożliwiających wiązanie mRNA z oligonukleotydem, do wytworzenia kompleksu;

(ii) izolację tak wytworzonego kompleksu, i (iii) identyfikację mRNA w wyizolowanym kompleksie, dla ustalenia czy mRNA stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.

Ponadto, gdy próbka kwasu nukleinowego w etapie (a) zawiera mRNA odpowiadający transkryptowi DNA kodującemu polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, etap ustalania (b) obejmuje:

(i) translację mRNA w takich warunkach otrzymywania sekwencji aminokwasów; i (ii) porównanie sekwencji aminokwasów z etapu (i) z sekwencją aminokwasów kodowaną przez wyizolowany kwas nukleinowy określony powyżej, dla ustalenia czy próbkę kwasu nukleinowego stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.

W opisanym powyżej zastosowaniu zazwyczaj etap ustalania (b) obejmuje:

(i) amplifikację kwasu nukleinowego obecnego w próbce w etapie (a); i (ii) wykrywanie obecności polipeptydu w otrzymanym zamplifikowanym kwasie nukleinowym.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania przeciwciał, które rozpoznają polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, określanego jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę), do ustalania czy osobnik jest zakażony szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę), przy czym takie ustalanie obejmuje:

PL 191 312 B1 (a) uzyskanie próbki od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przez skontaktowanie próbki w warunkach wiązania z przeciwciałami określonymi powyżej, dla ustalenia czy osobnik jest zakażony.

W szczególności wyizolowany kwas nukleinowy, oligonukleotyd lub przeciwciało są znakowane wykrywalnym markerem, który stanowi zwłaszcza radioaktywny izotop, fluorofor lub enzym.

W szczególności uzyskana próbka to krew, surowice lub tkanka, taka jak tkanka wątroby. Wynalazek dotyczy ponadto sposobu oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do leczenia zakażenia przez szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, określany jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę), który to sposób polega na tym, że:

(a) kontaktuje się polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, ze związkiem chemicznym w warunkach umożliwiających wiązanie polipeptydu ze związkiem chemicznym;

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny wiąże się z polipeptydem, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do leczenia zakażenia przez szczep wirusa 'S'-145 Singapore.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do zapobiegania zakażeniu przez szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, określany jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę), który to sposób polega na tym, że:

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny wiąże się z polipeptydem, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do zapobiegania zakażeniu przez szczep wirusa 'S'-145 Singapore.

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji, która zawiera polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, zdeponowanego pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r., który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przy czym ilości takiego polipeptydu są skuteczne do stymulacji lub wzmagania wytwarzania przeciwciał u osobnika, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji, która zawiera polipeptyd mający sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 320 SEQ ID NO: 3, przy czym ilości takiego polipeptydu są skuteczne do stymulacji lub wzmagania wytwarzania przeciwciał u osobnika, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Sposób wytwarzania kompozycji polega na tym, że identyfikuje się związek chemiczny sposobem określonym powyżej i łączy się ten związek z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania kompozycji określonej powyżej, albo wytworzonej sposobem opisanym powyżej, do leczenia osobnika zakażonego szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę).

PL 191 312 B1

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania kompozycji wytworzonej sposobem określonym powyżej, albo wytworzonej sposobem opisanym powyżej, do zapobiegania zakażeniu szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę) u osobnika.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu skriningu płynów ustrojowych od osobnika pod kątem szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, określanego jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę), przy czym ten sposób polega na tym, że:

(a) uzyskuje się próbkę płynu ustrojowego od osobnika; i (b) ustala się obecność polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, w próbce z etapu (a), dla potwierdzenia ewentualnej obecności tego szczepu.

Jako płyn ustrojowy zazwyczaj stosuje się krew, surowice lub próbkę kwasu nukleinowego z krwi lub surowic.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania przeciwciał, które rozpoznają polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, do ustalania predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego, przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki kwasu nukleinowego od osobnika; i (b) ustalenie, czy próbkę kwasu nukleinowego z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przez skontaktowanie próbki w warunkach wiązania z przeciwciałami określonymi powyżej, dla ustalenia predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego.

Gdy w etapie (a) stosuje się próbkę kwasu nukleinowego zawierającą mRNA kodujący polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, etap ustalania (b) obejmuje:

W opisanym powyżej zastosowaniu zazwyczaj etap ustalania (b) obejmuje:

(i) amplifikację kwasu nukleinowego obecnego w próbce z etapu (a) i (ii) wykrywanie obecności polipeptydu w powstałym zamplifikowanym kwasie nukleinowym.

PL 191 312 B1 (a) uzyskanie próbki od osobnika; i (b) ustalenie, czy próbkę z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przez skontaktowanie próbki w warunkach wiązania przeciwciał określonych powyżej, dla ustalenia predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego.

W szczególnoś ci oligonukleotyd lub przeciwciał o są znakowane wykrywalnym markerem, który stanowi zwłaszcza radioaktywny izotop, fluorofor lub enzym.

W szczególności uzyskana próbka to krew, surowice lub tkanka, taka jak tkanka wątroby. Wynalazek dotyczy ponadto sposobu oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do leczenia raka wątrobowo-komórkowego, przy czym ten sposób polega na tym, że:

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny wiąże się z polipeptydem, dla zidentyfikowania związku chemicznego zdolnego do leczenia raka wątrobowo-komórkowego.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu, przy czym ten sposób polega na tym, że:

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się, czy związek chemiczny wiąże się z polipeptydem, dla zidentyfikowania związku chemicznego zdolnego do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania kompozycji, polegającego na tym, że identyfikuje się związek chemiczny sposobem określonym powyżej i łączy się ten związek z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania kompozycji określonej powyżej do wytwarzania leku do leczenia raka wątrobowo-komórkowego.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania kompozycji określonej powyżej do wytwarzania leku do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu.

Wynalazek dotyczy ponadto szczepionki na wirusowe zapalenie wątroby typu B, która to szczepionka zawiera zmutowany główny antygen powierzchniowy szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, zdeponowanego pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r., który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna.

Korzystnie ta szczepionka zawiera ponadto adiuwant.

Wynalazek umożliwia realizację sposobu leczenia osobnika z rakiem wątrobowo-komórkowym lub zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu, przez podawanie skutecznej ilości opisanych powyżej kompozycji.

W opisanych powyżej kompozycjach konkretna skuteczna ilość będzie zależała od wielkości polipeptydu, zdolności polipeptydu do biodegradacji, bioaktywności polipeptydu i biodostępności polipeptydu. Jeśli polipeptyd nie ulega szybko degradacji, jest biodostępny i wysoce aktywny, wymagana skuPL 191 312 B1 teczna ilość będzie mniejsza. Skuteczna ilość będzie znana fachowcom, będzie też zależała od postaci polipeptydu, wielkości polipeptydu i bioaktywności polipeptydu. Tak np. dzięki użyciu adiuwantu można zmniejszyć wymaganą ilość polipeptydu. Fachowiec mógłby rutynowo wykonać empiryczne testy aktywności, aby określić bioaktywność w biooznaczeniach i w ten sposób określić skuteczną ilość.

Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki są dobrze znane fachowcom i należą do nich, ale nie wyłącznie, 0,01 - 0,1 M, korzystnie 0,05 M bufor fosforanowy lub 0,8% roztwór soli. Ponadto takie farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą stanowić roztwory, zawiesiny i emulsje wodne lub niewodne. Do przykładowych niewodnych rozpuszczalników należą glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak olej oliwkowy i estry organiczne do wstrzyknięć, takie jak oleinian etylu. Do wodnych nośników należą woda, roztwory alkoholowo/wodne, emulsje lub zawiesiny, w tym sól fizjologiczna i buforowane ośrodki. Do nośników pozajelitowych należą roztwory chlorku sodu, dekstroza Ringera, dekstroza i chlorek sodu, mleczanowy roztwór Ringera lub utwardzone oleje. Do nośników dożylnych należą uzupełniacze płynu i składników odżywczych, uzupełniacze elektrolitów, takie jak oparte na dekstrozie Ringera itp. Mogą być też obecne konserwanty i inne dodatki, takie jak np. środki przeciwdrobnoustrojowe, przeciwutleniacze, związki chelatujące, gazy obojętne itp.

W cał ym opisie odnoś niki do konkretnych nukleotydów dotyczą nukleotydów obecnych na nici kodującej kwasu nukleinowego. Dla określenia konkretnych nukleotydów w całym opisie stosowane są następujące standardowe skróty: C - cytozyna, A - adenozyna, T - tymidyna, G - guanozyna.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono sekwencję nukleotydów genomu wirusa zapalenia wątroby typu B, który niesie mutację w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę) głównego antygenu powierzchniowego złożonego z 3215 nukleotydów (fig. 3) kodujących 4 zachodzące na siebie białka przedstawione na fig. 4 - 7.

W szczególności ujawniono sekwencje czterech głównych białek wirusa obejmujących polimerazę DNA, antygen powierzchniowy duży/średni/główny, rdzeniowe i transaktywujący X. Te białka mogą być wytwarzane z zastosowaniem techniki rekombinacji i stosowane w opracowaniu przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych.

Wynalazek zapewnia także układ diagnostyczny wirusa zapalenia wątroby typu B, specyficzny w stosunku do mutacji w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę) głównego antygenu powierzchniowego, z wykorzystaniem opisanych tu sekwencji nukleotydów lub białek albo przeciwciał.

Poniżej opisano figury rysunku dla dokładniejszego przedstawienia wynalazku.

Figura 1. Struktura czterech otwartych ramek odczytu genomu ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B wyizolowanego od 11-letniego chłopca z Singapuru (z mutacją glicyna na argininę w reszcie aminokwasu 145 głównego antygenu powierzchniowego, zaznaczoną gwiazdką). Główne białka wirusowe: polimeraza DNA, antygen powierzchniowy duży/średni/główny, przedrdzeń, rdzeń i transaktywują cy X są określone odpowiednio jako PreS1/PreS2/S, PreC, C i X.

Figura 2. Strategia klonowania i określania sekwencji tego samego genomu wirusa zapalenia wątroby typu B.

Figura 3. Pełna sekwencja nukleotydów ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B, wyizolowanego od 11-letniego dziecka urodzonego w Singapurze, którego matka miała wirus typu dzikiego. Dziecko otrzymało standardową immunoglobulinę na wirusa zapalenia wątroby typu B (HBIG) i szczepionkę HB i zostało zakażone przez zmutowany szczep rok później. Ten szczep niesie mutację w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę) głównego antygenu powierzchniowego (SEQ ID NO: 1). Mutacja jest przedstawiona w kwasach nukleinowych oznaczonych 587 - 589.

Figura 4. Wydedukowana sekwencja aminokwasów polimerazy DNA z sekwencji nukleotydów fig. 3 (SEQ ID NO: 2).

Figura 5. Wydedukowana sekwencja aminokwasów dużego antygenu powierzchniowego z sekwencji nukleotydów fig. 3. Zmutowana reszta aminokwasu (G na R) ma numer 319 (SEQ ID NO: 3).

Figura 6. Wydedukowana sekwencja aminokwasów białka rdzenia z sekwencji nukleotydów fig. 3. (SEQ ID NO: 4).

Figura 7. Wydedukowana sekwencja aminokwasów transaktywującego białka X z sekwencji nukleotydów fig. 3. (SEQ ID NO: 5).

Figura 8. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca miejscu inicjacji regionu kodującego polimerazy DNA, w pozycji 2307 genomu wirusa, która odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny) (SEQ ID NO: 6).

Figura 9. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca pozycji 250 sekwencji nukleotydów wirusa, która odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny) (SEQ ID NO: 7).

PL 191 312 B1

Figura 10. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca pozycji 250 sekwencji nukleotydów wirusa, która odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny) (SEQ ID NO: 8).

Figura 11. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca kodonowi stop regionu kodującego polimerazy DNA, w pozycji 1623 genomu wirusa, która odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny) (SEQ ID NO: 9).

Figura 12. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca pozycji 1420 genomu wirusa, która odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny) (SEQ ID NO: 10).

Figura 13. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca pozycji 2340 genomu wirusa, która odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny) (SEQ ID NO: 11).

Niniejszy wynalazek zilustrowano w poniższej części opisu dotyczącej przeprowadzonych doświadczeń, dla przedstawienia i lepszego zrozumienia wynalazku, bez ograniczania jego zakresu. W sposobie opisanym poniżej wyizolowano ludzki wirus zapalenia wątroby typu B niosący mutację w pozycji aminokwasu 145 głównego antygenu powierzchniowego i określono jego sekwencję nukleotydów.

Próbkę surowicy (20/815c) uzyskano od 11-letniego dziecka urodzonego w Singapurze, którego matka miała wirus typu dzikiego. Po urodzeniu stwierdzono, że dziecko było negatywne pod względem antygenu powierzchniowego i podano mu łącznie immunoglobulinę wirusa zapalenia wątroby typu B (HBIG) i szczepionkę pochodzącą z osocza. Po roku w teście dziecko okazało się dodatnie pod względem antygenu powierzchniowego i miało mutację argininową w reszcie aminokwasu 145 w gł ównym antygenie powierzchniowym. Wirusowy DNA wyekstrahowano przed okreś leniem jego sekwencji w opisany sposób.

Jak opisano w przykładach poniżej, genom tego zmutowanego wirusa zapalenia wątroby typu B niosącego mutację w reszcie aminokwasu 145 głównego antygenu powierzchniowego składa się z 3215 nukleotydów, które są identyczne z nukleotydami wirusa typu dzikiego tego samego podtypu (adw). Otwarte ramki odczytu (ORF) kodujące główne białka wirusowe znajdują się w odpowiadających pozycjach, w porównaniu z wirusem typu dzikiego. Pozycja 1 w genomie zmutowanego wirusa zapalenia wątroby typu B jest określana według wirusa typu dzikiego i odpowiada miejscu restrykcyjnemu EcoRI, które jest nieobecne u opisanego wirusa zapalenia wątroby typu B ze względu na zmiany w sekwencji nukleotydów.

Struktura różnych ORF w genomie zmutowanego ludzkiego wirusa jest tu opisana i przedstawiona na fig. 1. Pozycje wskazano w sposób następujący.

- Gen polimerazy DNA rozpoczyna się w pozycji 2307 i koń czy się w pozycji 1623, tak wię c składa się z 2532 nukleotydów i koduje 843 reszty aminokwasów;

- Gen dużego antygenu powierzchniowego rozpoczyna się w pozycji 2848 i kończy w pozycji 835, składa się więc z 1203 nukleotydów i koduje 400 reszt aminokwasów. Ten duży antygen powierzchniowy zachodzi na średni antygen powierzchniowy, który zaczyna się w pozycji 3205 i główny antygen powierzchniowy, który zaczyna się w pozycji 155. Zarówno średni (złożony z 281 reszt aminokwasów) i główny (złożony z 226 reszt aminokwasów) antygen powierzchniowy kończy się w tej samej pozycji jak duży antygen powierzchniowy;

- Gen rdzeniowy zaczyna się w pozycji 1814 i koń czy w pozycji 2452, zawiera wię c 639 nukleotydów i koduje 212 reszt aminokwasów.

- Gen transaktywujący X zaczyna się w pozycji 1374 i kończy się w pozycji 1838, zawiera więc 465 nukleotydów i koduje 154 reszty aminokwasów.

Co więcej, analiza sekwencyjna ustaliła, że ten zmutowany wirus zapalenia wątroby typu B należy do podtypu adw, na co wskazuje reszta lizyny w obu pozycjach 122 i 160 w głównym antygenie powierzchniowym. Zgodnie z uprzednią analizą epitopu „a przez bezpośrednie sekwencjonowanie mutacja indukowana przez szczepionkę (glicyna na argininę) jest znajdowana przy reszcie 145 aminokwasu głównego antygenu powierzchniowego.

W porównaniu z dzikim wirusem zapalenia wątroby typu B zdeponowanym w bazie danych Genbank (numer dostępu D00329), identyczność tego szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B wynosi 89,4% dla sekwencji nukleotydów. Identyczność różnych białek wirusowych obecnego zmutowanego wirusa zapalenia wątroby typu B w porównaniu z jego odpowiednikiem wirusem typu dzikiego wynosi odpowiednio 88,3%, 87,7%, 93,4% i 87% odpowiednio dla białek polimerazy DNA (PIR - Protein Identification Resources, numer dostępu P93460), dużego antygenu powierzchniowego (PIR numer dostępu A93460), rdzenia (PIR numer dostępu C93460) i transaktywującego X (PIR numer dostępu A31289).

PL 191 312 B1

Genom wirusa zapalenia wątroby typu B, niosący mutację indukowaną przez szczepionkę w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę ) gł ównego antygenu powierzchniowego mo ż na stosować jako materiał do zaprojektowania oligonukleotydów specyficznych dla zmutowanego genomu wirusa. Te oligonukleotydy można stosować jako materiał do wysoce specyficznych środków diagnostycznych, które wykrywają wirus niosący indukowaną przez szczepionkę mutację w reszcie aminokwasu 145 głównego antygenu powierzchniowego.

Genom wirusa zapalenia wątroby typu B, z indukowaną przez szczepionkę mutacją w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę) głównego antygenu powierzchniowego można stosować jako materiał do wytwarzania białek zgodnych z wynalazkiem przez ekspresję wektora, który niesie odpowiedni region kodujący i może namnażać się w komórkach takiego gospodarza jak Escherichia coli, drogą standardowej techniki rekombinacji DNA.

Białka zgodne z wynalazkiem są użyteczne jako materiał do wysoce specyficznych środków diagnostycznych zdolnych do detekcji wirusa zapalenia wątroby typu B niosącego indukowaną przez szczepionkę mutację w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę) głównego antygenu powierzchniowego. Stosując znane metody takie same białka można stosować do wytwarzania poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał .

Poliklonalne i monoklonalne przeciwciała można stosować jako materiał do środków diagnostycznych do detekcji z wysoką specyficznością antygenów wirusa zapalenia wątroby typu B z indukowaną przez szczepionkę mutacją w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę) głównego antygenu powierzchniowego.

Układ detekcji, w którym stosuje się każde białko zgodne z wynalazkiem lub białka z częściowym zastąpieniem aminokwasów i układ detekcji, w którym stosuje się monoklonalne lub poliklonalne przeciwciała na takie białka, są użyteczne jako wysoce specyficzne środki diagnostyczne zdolne do detekcji ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z indukowaną przez szczepionkę mutacją w reszcie aminokwasu 145 głównego antygenu powierzchniowego i są skuteczne do detekcji i skriningu tego wirusa z krwi do transfuzji lub pochodnych krwi. Białka lub przeciwciała takich białek można stosować jako materiał dla rozwoju profilaktycznych i terapeutycznych szczepionek przeciw temu szczepowi wirusa.

Dobrze wiadomo, że jeden lub większa liczba nukleotydów w sekwencji DNA może być podstawionych innymi nukleotydami i wytwarzać takie samo białko. Możliwe są także takie zmiany nukleotydów, że kodowane białka są zgodne z wynalazkiem. Wiadomo równie dobrze, że jeden lub większa liczba aminokwasów w sekwencji białka może być zastąpionych przez inne analogiczne aminokwasy, zdefiniowane przez ich właściwości hydrofilowe lub ładunki, z wytworzeniem analogu sekwencji aminokwasów. Można stosować dowolne analogi białek zgodnych z wynalazkiem, obejmujące zastąpienia, delecje, izostery (zmodyfikowane aminokwasy, które wykazują bliskie podobieństwo strukturalne i przestrzenne do aminokwasów biał ek), addycje aminokwasów lub addycje izosterów, o ile wynikają ce sekwencje wywołują powstanie przeciwciał rozpoznających wirus zapalenia wątroby typu B z indukowaną przez szczepionkę mutacją w aminokwasie 145 (glicyna na argininę) głównego antygenu powierzchniowego.

P r z y k ł a d y

Sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z indukowaną przez szczepionkę mutacją w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę) głównego antygenu powierzchniowego określono w sposób następujący.

1. Izolacja wirusowego DNA

Wirusowy DNA wyizolowano z próbki surowicy (20/815c) uzyskanej z surowicy 11-letniego chińskiego dziecka, którego matka wykazywała antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego. Mimo negatywnych wyników po urodzeniu, dziecku podano łącznie HBIG i szczepionkę pochodzą c ą z osocza i po roku dziecko okazało się być dodatnie pod wzglę dem antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B. Analiza sekwencji epitopu „a wykazała obecność zaindukowanej przez szczepionkę mutacji w reszcie aminokwasu 145 w głównym antygenie powierzchniowym.

Stosowano następującą metodę izolacji.

Dodano 200 μΐ próbki surowicy z 400 μΐ buforu do lizy (chlorek Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM i dodecylosiarczan sodu 2%) i 25 μl proteinazy K (20 mg/ml) i prowadzono inkubację w 65°C przez 3 godziny. Wirusowy DNA następnie wyekstrahowano za pomocą fenolu/chloroformu i strącono etanolem.

PL 191 312 B1

2. Amplifikacja wirusowego DNA drogą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

Genom wirusa według wynalazku zamplifikowano drogą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z uż yciem 3 zestawów zachodzą cych na siebie oligonukleotydów, które zaprojektowano na podstawie wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego podtypu adw. Włączono różne miejsca restrykcyjne aby ułatwić klonowanie produktów PCR. Pozycję tych oligonukleotydów przedstawiono na fig. 2 i wskazano w sposób następujący:

- Flag 1 (ATAAGCTTATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGA) (SEQ ID NO: 6} rozpoczyna się przy miejscu inicjacji regionu kodującego polimerazy DNA w pozycji 2307 sekwencji nukleotydów wirusa i odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny). Podkreślono dodatkowe miejsce restrykcyjne Hindlll;

- Xba3 (GAGTCTAGACTCTGCGGTATTGTGA) (SEQ ID NO: 7) rozpoczyna się przy wewnętrznym miejscu restrykcyjnym Xbal w pozycji 250 sekwencji nukleotydów wirusa i odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny). Podkreślono dodatkowe miejsce restrykcyjne Xbal;

- Xba5 (GAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCT) (SEQ ID NO: 8) rozpoczyna się przy wewnętrznym miejscu Xbal w tej samej pozycji jak miejsce startu oligonukleotydu Xba3 ale odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny). Podkreślono dodatkowe miejsce restrykcyjne Xbal;

- Common 3 (TGAGAATTCTCACGGTGGTCTCCATGCGACGT) (SEQ ID NO: 9) rozpoczyna się przy kodonie stop polimerazy DNA w pozycji 1623 sekwencji nukleotydów wirusa i odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny). Podkreślono dodatkowe miejsce restrykcyjne EcoRI;

- V11 (TTTGTTTACGTCCCGT) (SEQ ID NO: 10) rozpoczyna się blisko miejsca inicjacji genu X w pozycji 1420 sekwencji nukleotydów wirusa i odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny);

- HindlllADW3 (CTAAGCTTAGTTTCCGGAAGTGTTGAT) (SEQ ID NO: 11) rozpoczyna się blisko miejsca inicjacji polimerazy DNA w pozycji 2340 i odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny). Podkreślono dodatkowe miejsce restrykcyjne Hindlll.

Zastosowano wirusowy DNA jako matrycę i przeprowadzono PCR w termocyklerze do DNA (Perkin-Elmer, Cetus) przez 35 cykli z użyciem polimerazy Pfu (Stratagene, USA), przy czym każdy cykl trwał 1,5 minuty w temperaturze denaturującej 94°C, 2 minuty w temperaturze hybrydyzacji 53°C i 4 minuty w temperaturze elongacji 72°C. Stosowano następujące połączenia oligonukleotydów: Flag1/Xba3, Xba5/Common 3 i V11/HindIIIADW3, z generacją produktów amplifikacji o wielkości odpowiednio 1,2 kb, 1,4 kb i 1,1 kb.

3. Klonowanie fragmentów zamplifikowanego wirusowego DNA

Zamplifikowany fragment wirusowego DNA z Flag1/Xba3 (1,2 kb) poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Xbal przed klonowaniem w plazmidzie pBluescript potraktowanym wstępnie takimi samymi enzymami restrykcyjnymi. Podobne trawienie Xbal i EcoRI zastosowano w przypadku produktu PCR z Xba5/Common 3 (1,4 kb), przed sklonowaniem w plazmidzie pBluescript trawionym Xbal i EcoRI. Natomiast fragment DNA zamplifikowany z V11 i HindlllADW (1,1 kb) wklonowano bezpośrednio do plazmidu ZeroBlunt, opracowanego przez InvitroGen (USA) do klonowania fragmentów o tępych końcach.

4. Określenie sekwencji nukleotydów

Sekwencję nukleotydów ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B indukowanego przez szczepionkę według wynalazku określono na matrycy z plazmidowego DNA za pomocą inhibitorów terminujących łańcuch, z użyciem zestawu Sequenase DNA Sequencing Kit (United States Biochemical Corp.). Aby ułatwić procedury sekwencjonowania opracowano różne oligonukleotydy wewnętrzne (od V1 do V13) według cech wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego i ich pozycje wskazano na fig. 2.

Na podstawie analizy opisanej powyżej, określono sekwencję nukleotydów pełnej długości wirusa zapalenia wątroby typu B niosącego indukowaną przez szczepionkę mutację w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę) głównego antygenu powierzchniowego, jak przedstawiono na fig. 3. Wydedukowane sekwencje aminokwasów kodujące główne białka wirusowe przedstawiono na fig. 4 - 7: polimeraza DNA wirusa zapalenia wątroby typu B (fig. 4), duży antygen powierzchniowy (fig. 5), białko rdzenia (fig. 6) i transaktywujące białko X (fig. 7).

Porównanie sekwencji wirusa według wynalazku z innymi sekwencjami wirusa zapalenia wątroby typu B dostępnymi w bazie danych GenBank wykaże specyficzne różnice sekwencji, które z kolei można wykorzystać do zaprojektowania sond DNA. Można wówczas opracować układ detekcji z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Takie reakcje PCR będą obejmowały połączenia oligonukleotydów specyficznych w stosunku do wirusa zapalenia wątroby typu B, z indukowaną przez szczepionkę mutacją w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę) głównego antygenu poPL 191 312 B1 wierzchniowego, co umożliwia wysoce specyficzną detekcję tego zmutowanego wirusowego DNA. Pokrótce, wirusowy DNA można wyekstrahować jak to przedstawiono w opisie. Można przeprowadzić reakcje PCR stosując specyficzne oligonukleotydy i podobne warunki cykli jak opisane powyżej. Wyniki można wówczas analizować po rozdziale produktów PCR w 1% żelu agarozowym.

Zgodnie ze znanymi procedurami immunologicznymi można określić epitopy z sekwencji białek, takich jak te na fig. 4 - 7. Określenie tych epitopów specyficznych dla wirusa zapalenia wątroby typu B niosącego indukowaną przez szczepionkę mutację w reszcie aminokwasu 145 głównego antygenu powierzchniowego umożliwi syntezę peptydów znanymi metodami inżynierii genetycznej, syntezę białek, produkcję przeciwciał, opracowanie specyficznych odczynników diagnostycznych, opracowanie profilaktycznych i terapeutycznych szczepionek i środków przeciwwirusowych.

Można opracować układ detekcji dla przeciwciał przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu B niosącemu indukowaną przez szczepionkę mutację w reszcie aminokwasu 145 głównego antygenu powierzchniowego, stosując poliwinylowe płytki do mikromianowania i metodę typu „sandwich. Pokrótce, 50 μΐ peptydu w stężeniu 5 μg/ml z wirusa zapalenia wątroby typu B (mutant indukowany przez szczepionkę) można umieścić w każdej studzience płytek do mikromianowania i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w celu konsolidacji. Podobne procedury można stosować do białka 's' oczyszczonego z komórek gospodarza, takiego jak Escherichia coli. Płytki do mikromianowania można przemyć pięć razy fizjologicznym roztworem soli, zawierającym 0,05% Tween 20. Dla pokrycia można do każdej studzienki dodać 100 μl buforu NaCl zawierającego 30% (obj.) surowicy cielęcej i 0,05% Tween 20 (bufor CS) i odrzucić po inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Aby określić przeciwciała specyficzne dla indukowanego przez szczepionkę zmutowanego wirusa zapalenia wątroby typu B w surowicy można przeprowadzić reakcję podstawową tak, że można umieścić 50 μl buforu CS i 10 μl próbki surowicy w każdej studzience płytki do mikromianowania i inkubować z użyciem wibratora do mikropłytek przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przeprowadzeniu reakcji podstawowej płytki do mikromianowania przemywa się pięć razy jak opisano powyżej.

W reakcji wtórnej 1 ng monoklonalnych mysich, przeciwludzkich przeciwciał IgG, znakowanych peroksydazą chrzanową, rozpuszczonych w 50 μl surowicy cielęcej, można rozmieścić w każdej studzience mikropłytek i inkubować z użyciem wibratora do mikropłytek przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu można przemyć studzienki pięć razy w taki sam sposób. Po dodaniu nadtlenku wodoru (jako substratu) i 50 μl roztworu O-fenylenodiaminy (do wywołania barwy) do każdej studzienki i po inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej można dodać 50 μl 4 M kwasu siarkowego do każdej studzienki aby zapobiec dalszemu pogłębianiu się barwy i odczytać absorbancję przy 490 nm.

Wynalazek umożliwia detekcję zmutowanych wirusów zapalenia wątroby typu B indukowanego przez szczepionkę, w szczególności tych, które niosą mutację w reszcie aminokwasu 145 głównego antygenu powierzchniowego. Takie zmutowane wirusy zapalenia wątroby typu B dotychczas nie były wykrywane tradycyjnymi metodami opartymi na przeciwciałach i wynalazek zapewnia także układy detekcji zdolne do wysoce specyficznej i czułej detekcji we wczesnym stadium infekcji.

Dodatkowo te cechy pozwalają na dokładną diagnozę pacjenta we wczesnym stadium choroby, a także pomagają w usuwaniu z wyższą skutecznością krwi skażonej przez indukowany przez szczepionkę zmutowany wirus zapalenia wątroby typu B, w wyniku stosowania skriningu krwi dawców.

Białka i ich przeciwciała według wynalazku można stosować do opracowania szczepionek profilaktycznych i terapeutycznych, a także farmaceutyków immunologicznych. Informacja o strukturalnych genach tych zmutowanych wirusów będzie pomocna w opracowywaniu układów detekcji odnośnych antygenów białkowych i przeciwciał.

Kompleksy antygen-przeciwciało można wykrywać znanymi sposobami. Specyficzne przeciwciała monoklonalne i poliklonalne można otrzymać przez immunizację zwierząt, takich jak myszy i króliki, peptydami lub białkami, specyficznymi w stosunku do zmutowanych wirusów zapalenia wątroby typu B indukowanych przez szczepionkę. Można zaprojektować hamujące środki przeciwwirusowe i ukierunkować je na te białka i cząsteczki w hodowli komórkowej lub in vivo.

Wynalazek jest oparty na badaniach genomu wyizolowanego wirusa zapalenia wątroby typu B niosącego indukowaną przez szczepionkę mutację w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę) głównego antygenu powierzchniowego. Wynalazek umożliwia wysoce specyficzną detekcję tego zmutowanego indukowanego przez szczepionkę wirusa zapalenia wątroby typu B i zapewnia materiał, taki jak białko, poliklonalne i monoklonalne przeciwciała, dla opracowania takiego układu detekcji.

PL 191 312 B1

Istnieją dowody wykazujące, że przy ekspresji w układzie ekspresji ssaków główny antygen powierzchniowy (HbsAg) zmutowanego HBV zgodnie z wynalazkiem jest wykrywany jako białko 22 kDa na barwionym błękitem Coomassiego żelu SDS-PAGE, podczas gdy białko typu dzikiego HbsAg jest wykrywane jako białko 25 kDa. Z uwagi na to, że jedyne miejsce glikozylacji na HbsAg znajduje się blisko (asparagina w pozycji 146) mutacji w pozycji 145, jest bardzo prawdopodobne, że drastyczna zmiana z glicyny na argininę w pozycji 145 wpł ywa na proces glikozylacji w zmutowanym HbSAg. Ten defektywny proces glikozylacji powinien z kolei dawać mniejsze białko, co zaobserwowano w badaniach. Ze względu na to, że na antygenowość białka niekorzystnie wpływa stopień jego glikozylacji, przewiduje się, że opisany zmutowany HbSAg jest bardziej antygenowy niż HbsAg typu dzikiego. To przewidywanie jest dodatkowo poparte analizą strukturalną z użyciem metody, którą opracowali Hopp i Woods.

Badania serologiczne także wskazują na znaczne różnice między nosicielami HBV typu dzikiego i nosicielami opisanego zmutowanego HBV; jedną z takich różnic stanowi to, że obciążenie surowicy wirusowym DNA jest znacząco niższe przy około 5 pg na ml, mierzone na podstawie oznaczenia z hybrydyzacją z 125I (Abbott Laboratories, USA). Przeciwnie, obciążenie DNA HBV typu dzikiego jest znacznie wyższe przy ponad 100 pg na ml. Ponadto poziom anty-antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (anty-HBs) jest wykrywalny przy 10 IU/ml w zmutowanym HBV przedstawionym w opisie, podczas gdy przeciwciała pozostają niewykrywalne u nosicieli HBV typu dzikiego.

W procesie określania sekwencji stwierdzono, że kilka oligonukleotydów (każdy o długości ponad 17 zasad) zaprojektowanych na podstawie sekwencji HBV typu dzikiego nie hybrydyzowało do zmutowanego DNA przedstawionego w opisie. Dwa takie nukleotydy są zlokalizowane w genomie w pozycjach 2711 do 2729 i 2902 do 2920. Wyniki wskazują wię c na róż nice strukturalne pomię dzy genomami HBV typu dzikiego i mutanta.

Pozycje literaturowe

1. Oon, C-J., „Viral hepatitis B in Singapore; epidemiology, prevention and control-monitoring the hepatitis B programme and management of carriers. J. Royal College Physic. London (1397), w druku.

2. Oon, C-J., „Issues associated with HBV mutant strains J. Royal College Physic. London (1997), w druku.

3. Oon, C-J., i inni „Hepatitis B surface antigen (HBsAg) mutants - their significance Annals Acad. Med. Singapore (1997), w druku.

4. Oon, C-J., „Molecular epidemiology of hepatitis B „a variants and mutants: significance in immune population JAMA (1996) 12: 5-6.

5. Goh, K-T, „Hepatitis B immunization in Singapore Lancet (1996) 348: 1385-1386.

6. Oon, C-J., i inni, „Natural history of hepatitis B surface antigen mutants in children Lancet (1996) 348: 1524-1525.

7. Harrison, T.J., „Genetic variation in hepatitis B virus, Eur. J. Gastroenter. & Hepatol. (1996) 8: 306-311.

8. Oon, C-J., i inni, „Molecular epidemiology of hepatitis B virus vaccine variants in Singapore Vaccine (1995) 13: 699- 702.

9. Carman, W., i inni, „Viral genetic variation; hepatitis B virus as a-clinical example Lancet (1993) 341; 349-353.

10. Harrison, T.J., „Variants of hepatitis B virus Vox Sang (1992) 63: 161-167.

11. Harrison, T. J. i inni., „Independent emergence of a vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus, J. Hepatol. (1991) 13: S105-107.

12. Carman, W.F. i inni, „Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus Lancet (1990)

336: 325-329.

PL 191 312 B1

WYKAZ SEKWENCJI (1) Informacja ogólna:

(i) Tytuł wynalazku: Zaindukowany przez szczepionkę szczep wirusa zapalenia wątroby typu B i jego zastosowanie (ii) Liczba sekwencji: 11 (2) Informacja o SEQ ID NO: 1: (Figura 3) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 3215 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: podwójna (D) Topologia: kolista (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 1:

CTCC&CCACT	TTCCACCAAA	CTCTTCAAGA	TCCCAGAGTC	AGGGCCCTGT	ACTTTCCTGC	60
TGGTGGCTCC	AGTTCAGGAA	CAGTGAGCCC	TGCTCAGAAT	ACTGTCTCTG	CCATATCGTC	120
AATCTTATCG	AAGACTGGGG	ACCCTGTACC	GAACATGGAG	AACATCGCAT	CAGGACTCCT	ISO
AGGACCCCTG	CTCGTGTTAC	AGGCGCGGTT	TT TCTTCTT G	ACAAAAATCC	TGACAATACC	240
GCAGAGTGCA	GACTCGTGGT	GGACTTCTCT	caattttcta	GGGGGAACAC	CCGTGTGTCT	300
TGGCCAAAAT	ICGCAGTCCC	AAATCTCCAG	TCACTCACCA	ACCTGTTGTC	CTCCAATTTG	360
TCCTGGTTAT	CGCTG5ATGT	CTCTGCGGCG	TTTTATCATC	TTCCTCTGCA	TCCTGCTGCT	420
ATGCCTCATC	TTCTTGTTGG	TTCTTCTGGA	CTATCAAGGT	ATGTTGCCCG	T T TGT C^TCT	450
AATTCCAGGA	TCAACAACAA	CCAGCACCGG	ACCATGCAAA	ACCTGCACAA	CTCCTGCTCA	540
AGGAACCTCT	ATGTTTCCCT	CATGTTGCTG	TACAAAACCT	ACGGACAGAA	ACTGCACCTG	600
TATTCCCATC	CCATCATCTT	GGGCTTTCGC	AAAATACCTA	TGGGAGTGGG	CCTCAGTCCG	660
111Libii ^rj<ł	CTCAGTTTAC	TAGTGCCATT	TGTTCAGTGG	TTCGTAGGGC	TTTCCCCCAC	720
TGTCTGGCTT	TCAGTTATAT	GGATGATGTG	GTTTTGGGGC	CCAAGTCTGT	ACAACAICTT	730
GAGTCCCTTT	ATGCCGCTGT	TKCCAATTTT	CTTTTGTCTT	TGGGTATACA	TTTAAACCCT	S40
CACAAAACAA	AAAGATGGGG	ATATTCCCTT	AACTTCATGG	GATATGTCAT	TGGGAGTTGG	900
GGCACATTGC	CACAGGAACA	TATTGTACAA	AAAATCAAAA	TGTGTTTTAG	GAAKCTTCCT	960
GTAAACAGGC	CTATTGATTG	GAAAGTATGT	CAACGAATTG	TGGGTCTTTT	GGGGTTTGCC	1020
GCCCCTTTCA	CGCAATGTGG	ATATCCTGCT	TTAATGCCTT	TATATGCATO	TATACAAOCA	1080
AAACAGGCTT	TTACTTTCTC	GCAAACTTAC	AASACCTTTC	TAAGTAAACA	GTATCTGAAC	1140
CT7TACCCCG	TTGCTCGGCA	ACGCCCTGGT	CTGTGCCAAG	TGTTTGCTGA	CGCAACCCCC	1200
ACTGGTTGGG	GCTTGGCCAT	AGGCCATCAG	CGCATGCGTG	GAACCTTTGT	GTCTCCTCTG	1260
CCGATCCATA	CTGCGGAACT	CCTAGCCGCT	TGTTTTCCTC	GCACCAGGTC	TGGGGCAAAA	1320
CTCATCCGCA	CTCACAATTC	TGTCGTGCTC	TCCCGCAACT	ATACATCATT	TCCATGGCTG	13Θ0
CTAGGCTGTG	CTGCCAACTG	GATCCTGCGC	GGGACGTCCT	TTGTTTACGT	CCCGTCGGCG	1440
CTGAATCCCC	CGCACGACCC	CTCCCGGGGC	CGCTTGGGGC	TCTACCGCCC	GCTTCTCCGC	1500

PL 191 312 B1

CTGTTATACC	GACCGACCAC	GGGGCGCACC	TCTCTTTACG	CGGACTCCCC	GTCTGTGCCT	1560
TCTCATCTGC	CGGACCGTGT	GCACTTCGCT	TCACCTCTGC	ACGTCGCATG	GAGACCACCG	1620
TGAACGCCCA	CGGGAACCTG	CCCAAGGTCT	TGCATAAGAG	GACTCTTGGA	CTTTCAGCAA	1680
TGTCAACGAC	CGACCTTGAG	gcatacttca	AAGACTGTGT	GTTTAATGAG	TGGGAGGAGT	1740
TGGGGCAGGA	GGITAGGTTA	AAGGTCTTTG	TACTAGGACG	CTGTAGGCAT	AAATTGGTGT	1800
GTTCACCATC	ACCATGCAAC	TTTTTCACCT	CTGCCTAATC	ATCTCATGTT	CATGTCCTAC	1860
TGTTCAAGCC	TCCAAGCTGT	GCCTTGGGTG	GCTTTGGGGC	ATGGACATTG	ACCCGTATAA	1920
AGAATTTGGA	GCTTCTGTGG	AGTTACTCTC	TTTTTTGCCT	TCTGACTTTT	TTCCTTCTAT	1980
TCGAGATCTC	CTCGACACCG	CCTCTGCTCT	GTATCGGGAG	GCCTTAGAGT	CTCCGCAACA	2040
TTGTTCACCT	CACCATACGG	CACTCAGGCA	AGCTATTCTG	AGTTGGGGTG	AGTTAATGAA	2100
TCTAGCCACC	TGGGTGGGAA	GTAATTTGGA	AGATCCAGCA	TCCAGGGAAT	TAGTAGTCAG	2160
CTATGTCAAC	gttaatatgg	GCCTAAAAAT	CAGACAACTA	TTGTGGTTTC	ACATTTCCTG	2220
TCTTACTTTT	GGGAGAGAAA	CTGTTCTTGA	ATATTTCGTG	TCTTTTGGAG	TGTGGATTCG	2280
CACTCCTCCT	GCATATAGAC	CACCAAATGC	CCCTATCTTA	TCAACACTTC	CGGAAACTAC	2340
TGTTGTTAGA	CGAAGAGGCA	GGTCCCCTAG	AAGAAGAACT	CCCTCGCCTC	GCAGACGAAG	2400
GTCTCAATCG	CCGCGTCGCA	GAAGATCTCA	ATCTCCGGAA	TCTCAATGTT	AGTATTCCTT	2460
GGACACATAA	GGTGGGAAAC	TTTACGGGGC	TTTATTCTTC	TACGGTACCT	TGCTTTAATC	2520
CTAAATGGCA	AACTCCTTCT	TTTCCGGACA	TTCATTTGCA	GGAGGACATT	CTTGATAGAT	2580
GTAAGCAATT	TGTGGGGCCC	CTTACAGTAA	ATCAAAACAG	GAGACTAAAA	TTAATTATGC	2640
CTGCTAGGTT	TTATCCAAAT	GTTACTAAAT	ATTTGCCCTT	AGATAAAGGG	ATCAAACCAT	2700
ATTATCCACA	GTATGTAGTT	aatcattact	TCCAGACGCG	ACATTATTTA	CACACTCTTT	2760
GGAAGGCGGG	GATCTTATAT	AAAAGAGAGT	CCACACGTAG	CGCCTCATTT	TGCGGGTCAC	2320
CATATTCTTG	GGAACAAGAT	CTACAGCATG	GGAGGITGGT	CTTCCAAACC	TCGAAAAGGC	2880
ATGGGGACAA	ATCTTTCTGT	CCCCAATCCC	CTGGGATTCT	TCCCCGATCA	TCAGTTGGAC	2940
CCTGCATTCA	AAGCCAACTC	AGAAAATCCA	GATTGGGACC	TCAACCCGCA	CAAGGACAAC	3000
TGGCCGGACG	CGAACAAGGT	GGGAGTGGGA	GCATTCGGGC	CACGGTTCAC	CCCTCCTCAT	3060
GCCGGACTGT	TGGGGTGGAG	CCCTCAGGCT	CAGGGCCTAC	TCACAACTGT	GCCAGCAGCT	3120
CCTCCTCCTG	CCTCCACCAA	TCGGCAGTCA	GGAAGGCAGC	CTACTCCCTT	ATCTCCACCT	3180
CTAAGCGACA	CTCATCCTCA	GGCCATGCAG	TGCAA			3215

(2) Informacja o SEQ ID NO: 2: (Figura 4) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 843 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 2:

PL 191 312 B1

Met 1

Pro

Leu

Ser

Tyr 5

Gin

His

Phe

Arg Lys 10

Leu

Asp 15

Glu

Ala

Gly

Pro 20

Leu

Glu

GlU

Glu

Leu 25

Pro

Arg

Leu

Ala

Asp 30

Glu

Gly

Leu

Asn

Arg

Val

Ala

Glu

Asp

Leu

Asn

Leu

Gly

Asn

Leu

Asn

Val

35

40

45

Sec

Ile 50

Pro

Trp

Thr

His

Lys 55

Val

Gly

Asn

Phe

Thr 60

Gly

Leu

Tyr

ser

Sec

Thr

Val

Pro

Cys

Phe

Asn

Pro

Lys

Trp

Gin

Thr

Pro

Ser

Phe

Pro

65

70

75

80

Asp

Ile

His

Leu

Gin

Glu

Asp

Ile

Leu

Asp

Arg

Cya

Lys

Gin

Fhe

Val

85

90

95

Glu

Pro

Leu

Thr

Val

Aan

Glu

Aan

Arg

Leu

Lya

Leu

Ile

Met

Pro

100

105

110

Ala

Arg

Phe 115

Tyr

Pro

Asn

Val

Thr 120

Lya

Tyr

Leu

Pro

Leu 125

Asp

Lys

Gly

Ile

Lya

Pro

Tyr

Pro

Glu

Tyr

Val

Asn

His

Tyr

Phe

Gin

Thr

130

135

140

Arg 145

His

Tyr

Leu

His

Thr 150

Leu

Trp

Lya

Ala

Gly 155

Ile

Leu

Tyr

Lya

Arg 160

Glu

Sec

Thr

Arg

Ser

Ala

Ser

Phe

Cya

Gly

Ser

Pro

Tyr

Sec

Trp

Glu

165

170

175

Gin

Asp

Leu

Gin

His

Gly

Arg

Leu

Val

Phe

Gin

Thr

Ser

Lys

Arg

His

180

185

190

Gly

Asp

Lys 195

ser

Phe

Cya

Pro

Glu 200

Ser

Pro

Gly

Ile

Leu 205

Pro

Arg

Ser

Val 210

Gly

Pro

Cys

Ile

Gin 215

Ser

Gin

Leu

Arg

Lys 220

Ser

Arg

Leu

Gly

Pro 225

Gin

Pro

Ala

Gin

Gly 230

Gin

Leu

Ala

Gly

Arg 235

Gin

Gly

Ser 240

Gly

Ser

Ile

Arg

Ala

Arg

Val

His

Pro

Ser

Trp

Gly

Thr

Val

Gly

245

250

255

Val

Glu

Pro

Ser

Gly

Ser

Gly

Pro

Thr

His

Aan

Cys

Ala

Ser

260

265

270

sec

cys

Leu

His

Gin

Ser

Ala

Val

Arg

Lya

Ala

Tyr

Ser

Leu

275

280

285

Ile

Sec 290

Thr

Ser

Lys

Gly

His 295

Ser

Gly

His 300

Ala

Val

Glu

Leu

Hi· 305

His

Phe

Pro

Aan 310

Ser

Arg

Ser

Gin 315

Ser

Gin

Gly

Pro

Val 320

Len

Ser

Cy3

Trp

Leu

Gin

Phe

Arg

Asn

Ser

Glu

Pro

Cya

Ser

Glu

325

330

335

Tyr

Cys

Leu

Cys 340

His

Ile

Val

Asn

Leu 345

Ile

Glu

Asp

Trp

Gly 350

Pro

Cys

The

GlU

His 355

Gly

Glu

His

Arg

Ile 360

Arg

Thr

Pro

Arg

Thr 365

Pro

Ala

Arg

val

Thr

Gly

Val

Phe

Leu

Val

Asp

Lys

Asn

Pro

HiS

Asn

Thr

Ala

370

375

380

Glu 3S5

Ser

Arg

Leu

Val

Val 390

Asp

Phe

Ser

Gin

Phe 395

Sar

Arg

Gly

Asn

Thr 400

Arg

Val

Ser

Trp

Pro

Lys

Phe

Ala

Val

Pro

Asn

Leu

Gin

Ser

Leu

Thr

405

410

415

Aan

Leu

Ser

Asn

Leu

Ser

Trp

Leu

Ser

Leu

Asp

val

Ser .

Ala

420

425

430

Ala

Phe

Tyr

His

Leu

Pro

Leu

His

Pro .

Ala

Het

Pro

His

Leu :

Leu

435

440

445

PL 191 312 B1

Pal Gly ser 450	Ser Gly	Łeu	Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser	Asn
455	. 460
Ser Arg Ile	Asn Asn	Asn	Glu	His Arg Thr Het Glu Asn Łeu His	Asn
465		470		475	480
Ser Cye Ser	Arg Asn	Łeu	Tyr	Val ser Łeu Het Łeu Łeu Tyr Łys	Thr
	485			490 495
Tyr Gly Gin	Lya Łeu	His	Łeu	Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly	Phe
	500			505 SIO
Arg Lya Ile	Pro Het	Gly	Val	Gly Łeu Ser Pro Phe Łeu Łeu Ala	Gin
515				520 525
Phe Thr Ser	Ala Ile	Cys	Ser	Val Val Arg Arg Ala Phe Pro Hia	Cya
530			535	540
Łeu Ala Phe	Ser Tyr	Het	Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Łys Ser	Pal
54S		550		555	560
Gin His Łeu	Glu Ser	Łeu	Tyr	Ala Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu	Ser
	565			570 575
Łeu Gly Ile	His Łeu	Asn	Pro	Hia Lys Thr Łys Arg Trp Gly Tyr	Ser
	580			585 590
Łeu Asn Phe	Het Gly	Tyr	Val	Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro	Gin
595				600 605
Glu His Ile	Val Gin	Lya	Ile	Lya Met Cys Phe Arg Lya Leu Pro	val
610			615	620
Asn Arg Pro	Ile A3p	Trp Łys	Val Cya Gin Arg Ile Val Gly Leu	Leu
625		630		635	640
Gly Phe Ala	Ala Pro	Phe	Thr	Gin Cya Gly Tyr Pro Ala Leu Het	Pro
	645			650 655
Łeu Tyr Ala	Cya Ile	Gin	Ala	Lya Gin Ala Phe Thr Phe Ser Gin	Thr
	660			665 670
Tyr Łys Thr	Phe Łeu	Ser	Łys	Gin Tyr Leu Asn Łeu Tyr Pro Val	Ala
675				680 635
Arg Gin Arg	Pro Gly	Łeu	cys	Glu Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro	Thr
690			695	700
Gly Trp Gly	Łeu Ala	Ile	Gly	His Gin Arg Het Arg Gly Thr Phe	val
705		710		715	720
Ser Pra Łeu	Pro Ile	His	Thr	Ala Glu Łeu Łeu Ala Ala Cya Phe	Ala
	725			730 735
Arg Ser Arg	Ser Gly	Ala	Lya	Leu Ile Gly Thr Asp Asn Ser Val	Val
	740			745 750
Łeu Ser Arg	Łys Tyr	Thr	Ser	Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala	Ala
755				760 765
Asn Trp Ile	Łeu Arg	Gly	Thr	Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala	Leu
770			77S	760
Asn Pra Ala	Asp Asp	Pro	Ser	Arg Gly Arg Leu Gly Łeu Tyr Arg	Pro
785		790		795	800
Łeu Łeu Arg	Łeu Leu	Tyr	Arg	Pro Thr Thr Gly Arg Thr ser Leu	Tyr
	805			. 810 815
Ala Asp Ser	Pro Ser	Val	Pro	Ser His Łeu Pro Asp Arg Val Hia	Phe
	820			825 830
Ala Ser Pro	Leu His	Val	Ala	Trp Arg Pro Pro
S35				840
)rmacja o	SEQ ID NO:	3: (Figura 5)

PL 191 312 B1 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 400 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 3:

Het Gly Gly Trp 1

Ser Ser 5 Pro Łeu

Lya Gly Glu Ala 55 His

Pro Arg Lya Gly Mat Gly Thr 10 Phe Phe Pro Aap Hia Gin Leu

Aan Łeu 15 Kap Pro Pro Mis Phe Gly

Ser Val Pro Ala Phe Lya 35 Lya Aap Asn . 50

Aen 20 Ala Trp Thr

Asn Pro Pro

Ser Asp Pro 70

Asn 40 Asn Gly

25 Pro Asp Trp Aap Łeu 45

30 Aan Ala Ser

Lya Val

Gly Val 60

Gly Trp

Pro 65

Gly Phe

Gly

Łeu

Leu 75

Gly

Pro

Gin 80

Ala

Gin Gly

Leu

Łeu 85

Thr

Val

Pro

Ala 90

Ala

Pro

Ala 95

Ser

Thr

Aan Arg

Gin 100

Ser

Gly

Arg

Gin

Pro 105

Thr

Pro

Leu

Ser

Pro 110

Pro

Leu

Arg

Aap Thr 115

Kle

Pro

Gin

Ala

Het 120

Gin

Trp

Asn

Sec

Thr 125

Thr

Phe

His

Gin

Thr Leu 130

Gin

Asp

Pro

Arg 135

Val

Arg

Ala

Łeu

Tyr 140

Phe

Pro

Ala

Gly

Gly 145

Ser Ser

Ser

Gly

Thr 150

Val

Ser

Pro

Ala

Gin 155

Asn

Thr

Val

Ser

Ala 160

Ile

Ser Ser

Ile

Łeu 155

Ser

Lya

Thr

Gly

Asp 170

Pro

Val

Pro

Aan

Met 175

Glu

Aan

Ile Ala

Ser ISO

Gly

Leu

Gly

Pro 185

Leu

Val

Leu

Gin 190

Ala

Gly

Phe

Phe Łeu 195

Łeu

Thr

Lya

Ile

Łeu 200

Thr

Ile

Pro

Gin

Ser 205

Łeu

Aap

Ser

Trp

Trp Thr 210

Ser

Łeu

Aan

Phe 215

Łeu

Gly

Pro

Thr 220

Val

Cya

Leu

Gly

Gin 225

Asn Ser

Gin

Ser

Gin 230

Ile

Ser

His

Ser 235

Pro

Thr

Cya

Cys

Pro 240

Pro

Ile Cys

Pro

Cly 245

Tyr

Arg

Trp

Met

Cys 250

Łeu

Arg

Phe

Ile 255

Ile

Phe

Łeu Cys

Ile 260

Leu

Łeu

Leu

Cys

Łeu 265

Ile

Phe

Leu

Łeu

Val 270

Leu

Asp

Tyr Gin 275

Gly

Met

Łeu

Pro

Val 230

Cys

Pro

Leu

Ile

Pro 285

Gly

Ser

Thr

Thr Ser 290

Thr

Gly

Pro

Cys 295

Lys

Thr

Cys

Thr

Thr 300

Pro

Ala

Gin

Gly

Thr 305

Ser Het

Phe

Pro

Ser 310

Cys

cys

Thr

Lys 315

Pro

Thr

Asp

Arg

Asn 320

Cys

Thr Cya

Ile

Pro 325

Ile

Pro

Ser

Trp 330

Ala

Phe

Ala

Lys

Tyr 335

Leu

Trp

Glu Trp

Ala

Ser

Val

Arg

Phe

Ser

Trp

Łeu

Ser

Leu

Val

Pro

340 345 350

PL 191 312 B1

Phe

Val Cln 35S

Trp

Fhe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

Ser

Val

360

365

Ile

Trp

Hat

Mat

Trp

Phe

Trp

Gly

Pro

Ser

Len

Tyr

Aan

Ile

Leu

Ser

370

375

380

Pro

Fhe

Met

Pro

Leu

Pro

Ile

Ρίι·

Phe

Cya

Leu

Trp

Val

Tyr

Ile

385

390

395

400

(2) Informacja o SEQ ID NO: 4: (Figura 6) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 212 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 4:

Ket 1

Sin

Leu

Phe

Hia 5

Leu

Cys

Leu

Ile

Ila 10

Ser

Cya

Ser

Cys

Pro 15

Thr

Val

Gin

Ala

Ser 20

Lys

Leu

Cya

Leu

Gly 25

Trp

Leu

Trp

Gly

Met 30

Asp

Ile

Asp

Pro

Tyr 35

Lya

Glu

Phe

Gly

Ala 40

Ser

Val

Glu

Leu

Leu 45

Ser

Phe

Leu

Pro

Ser 50

Asp

Phe

Pro

Ser 55

Ile

Arg Aap

Leu

Leu GO

Asp

Thr

Ala

Ser

Ala 65

Leu

Tyr

Arg

Glu

Ala 70

Leu

Glu

Ser

Pro

Glu 75

Hia

Cya

Ser

Pro

His BO

Kia

Thr

Ala

Leu

Arg 65

Cln

Ala

Ile

Leu

Ser 90

Trp

Gly

Clu

Leu

Met 95

Aan

Leu

Ala

Thr

Trp 100

Val

Gly

Ser

Aan

Leu 10S

Glu

Asp

Pro

Ala

Ser 110

Arg

Glu

Leu

Val

Val 115

Ser

Tyr

Val

Aan

Val 120

Asn

Het

Gly

Leu

Lys 125

Ile

Arg

Gin

Leu

Leu 130

Trp

Phe

His

Ile

Ser 135

Cya

Leu

Thr

Phe

Gly Arg 140

Glu

Thr

Val

Leu 145

Glu

Tyr

Leu

Val

Ser 150

Phe

Gly

Val

Trp

Ile 155

Arg

Thr

Pro

Ala 160

Tyr

Arg

Pro

Asn 165

Ala

Pro

Ile

Leu

Ser 170

Thr

Leu

Pro

Glu

Thr 175

Thr

Val

Arg

Arg 180

Arg

Gly

Arg

Sec

Pro 195

Arg

Thr

Pro 190

Ser

Pro

Arg

Arg 195

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro 200

Arg Arg

Arg

Sar 205

Gin

Ser

Arg

Clu Ser Cln Cya 210 (2) Informacja o SEQ ID NO: 5: (Figura 7) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 154 aminokwasy (B) Typ: aminokwas

PL 191 312 B1 (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 5:

Met Ala Ala Arg Leu

Cys

Cys Gin Leu Asc Pro Ala Arg Asp Val

Leu

1

5

10

15

Cys

Leu

Arg

Pro

Val

Gly Ala

Glu

Ser

Arg

Gly Arg

Pro

Leu

Pro

Gly

20

25

30

Pro

Leu

Gly

Ala

Leu

Pro

Ala

Ser

Pro

Val

Ile

Pro

Thr

Asp

35

40

45

His

Gly

Ala

His

Leu

Ser

Leu

Arg

Gly

Leu

Pro

Val

Cys

Ala

Phe

Ser

50

55

GO

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Ala

Leu

Arg

Phe

Thr

Ser

Ala

Arg

Met

Glu

65

70

75

80

Thr

Val

Asn

Ala

His

Gly

Asn

Leu

Pro

Lys

Val

Leu

His

Lys

Arg

65

90

95

Thr

Leu

Gly

Leu

Ser

Ala

Met

Ser

Thr

Asn

Leu

Glu

Ala

Tyr

Phe

100

105

110

Lys

Asp

Cys

Val

Phe

Asn

Glu

Trp

Glu

Leu

Gly

Glu

Val

Arg

115

120

125

Leu

Lys

Val

Phe

Val

Leu

Gly Gly

cys

Arg

Hia

Lys

Leu

Val

Cys

Ser

130

135

140

Pro

Ser

pro

Cys

Asn

Phe

Thr

Ser

Ala

145

150

(2) Informacja o SEQ ID NO: 6: (Figura 8) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 35 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy

CC) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 6:

ATAAGCTTATG CCCCTATCTT ATCAACACTT CCGGA (2) Informacja o SEQ ID NO: Ί: (Figura 9) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 25 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 7:

PL 191 312 B1

GASTCTAGAC TCTGCGGTAT TGTGA (2) Informacja o SEQ ID NO: 8: (Figura 10) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 25 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 8:

gagtctaoac tcgtggtgga cttct (2) Informacja o SEQ ID NO: 9: (Figura 11) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 32 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza .. (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 9:

TGAGAATTCT CACGGTGGTC TCCATSCGAC GT (2) Informacja o SEQ ID NO: 10: (Figura 12) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 16 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 10:

TTTGTTTACG TCCCGT (2) Informacja o SEQ ID NO: 11: (Figura 13) (i) Charakterystyka sekwencji:

PL 191 312 B1 (A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 11:

CTAAGCTTAS TTTCCGGAAG TGTTGAT 21

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wyizolowany szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, określony jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę) zdeponowany pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r.
2. Wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna.
3. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 2, w przypadku którego polipeptyd jest kodowany przez nukleotydy 155 - 835 sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako SEQ ID NO: 1.
4. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 3, zawierający nukleotydy „AGA w pozycjach 587 - 589.
5. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 2, który to kwas nukleinowy stanowi DNA.
6. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 2, który to kwas nukleinowy stanowi RNA.
7. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 5, który to kwas nukleinowy stanowi cDNA.
8. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 5, który to kwas nukleinowy stanowi genomowy DNA.
9. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 2, w przypadku którego polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zasadniczo identyczną z resztami aminokwasów 174 - 400 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.
10. Wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który to polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.
11. Wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.
12. Wektor zawierający wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, i jest funkcjonalnie połączony z promotorem transkrypcji RNA.
13. Wektor zawierający wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który to polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.
14. Wektor według zastrz. 12 albo 13, który to wektor zawiera wirusowy DNA.
15. Układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu, znamienny tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 12.
16. Układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu, znamienny tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 13.

PL 191 312 B1
17. Sposób wytwarzania polipeptydu, w którym układ gospodarz-wektor hoduje się w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się układ gospodarz-wektor określony w zastrz. 15 i odzyskuje się tak wytworzony polipeptyd.
18. Sposób wytwarzania polipeptydu, w którym układ gospodarz-wektor hoduje się w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się układ gospodarz-wektor określony w zastrz. 16 i odzyskuje się tak wytworzony polipeptyd.
19. Sposób wytwarzania polipeptydu w postaci oczyszczonej, znamienny tym, że:

(a) wprowadza się wektor określony w zastrz. 12 do komórki gospodarza;

(b) hoduje się powstałą komórkę gospodarza do wytworzenia polipeptydu;

(c) odzyskuje się polipeptyd wytworzony w etapie (b); i (d) oczyszcza się tak odzyskany polipeptyd.
20. Sposób wytwarzania polipeptydu w postaci oczyszczonej, znamienny tym, że:

(a) wprowadza się wektor określony w zastrz. 13 do komórki gospodarza;

(b) hoduje się powstałą komórkę gospodarza do wytworzenia polipeptydu;

(c) odzyskuje się polipeptyd wytworzony w etapie (b); i (d) oczyszcza się tak odzyskany polipeptyd.
21. Oczyszczony polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, zdeponowanego pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r., który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna.
22. Oczyszczony polipeptyd otrzymany sposobem obejmującym:

(a) wprowadzenie wektora zawierającego wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, zdeponowanego pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r., który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, i jest funkcjonalnie połączony z promotorem transkrypcji RNA, do odpowiedniej komórki gospodarza;

(b) hodowanie powstałej komórki gospodarza do wytworzenia polipeptydu;

(c) odzyskanie polipeptydu wytworzonego w etapie (b); i (d) oczyszczenie tak odzyskanego polipeptydu.
23. Oczyszczony polipeptyd, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów obejmującą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.
24. Oczyszczony polipeptyd otrzymany sposobem obejmującym:

(a) wprowadzenie wektora zawierającego wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który zawiera co najmniej część zmutowanego głównego antygenu powierzchniowego szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, zdeponowanego pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r., który to polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1, do odpowiedniej komórki gospodarza;

(b) hodowanie powstałej komórki gospodarza do wytworzenia polipeptydu;

(c) odzyskanie polipeptydu wytworzonego w etapie (b); i (d) oczyszczenie tak odzyskanego polipeptydu.
25. Oligonukleotyd o długości co najmniej 15 nukleotydów, zdolny do specyficznej hybrydyzacji z unikatową sekwencją nukleotydów w obrębie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, bez hybrydyzowania do jakiejkolwiek sekwencji nukleotydów w obrębie kwasu nukleinowego, który koduje główny antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego.
26. Oligonukleotyd według zastrz. 25, zawierający nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.

PL 191 312 B1
27. Sposób otrzymywania przeciwciał dla polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, a nie dla głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, znamienny tym, że:

(a) otrzymuje się polipeptyd w postaci oczyszczonej;

(b) immunizuje się organizm zdolny do wytwarzania przeciwciał przeciw oczyszczonemu polipeptydowi;

(c) zbiera się wytworzone przeciwciała;

(d) łączy się wytworzone przeciwciała z oczyszczonym polipeptydem do wytworzenia kompleksu; i (e) ustala się, które wytworzone przeciwciała tworzą kompleks z oczyszczonym polipeptydem, z otrzymaniem przeciwciał dla polipeptydu.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że polipeptyd jest kodowany przez nukleotydy 155 - 835 sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako SEQ ID NO: 1.
29. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że polipeptyd ma sekwencję zasadniczo identyczną do reszt aminokwasów 174 - 400 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.
30. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że immunizuje się organizm królika lub myszy.
31. Sposób otrzymywania przeciwciał dla polipeptydu, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów obejmującą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3, znamienny tym, że:

(a) otrzymuje się polipeptyd w postaci oczyszczonej;

(b) immunizuje się organizm zdolny do wytwarzania przeciwciał przeciw oczyszczonemu polipeptydowi;

(c) zbiera się wytworzone przeciwciała;

(d) łączy się wytworzone przeciwciała z oczyszczonym polipeptydem do wytworzenia kompleksu; i (e) ustala się, które wytworzone przeciwciała tworzą kompleks z oczyszczonym polipeptydem, z otrzymaniem przeciwciał dla polipeptydu.
32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że immunizuje się organizm królika lub myszy.
33. Przeciwciała, korzystnie przeciwciała monoklonalne, otrzymane sposobem określonym w zastrz. 27 albo 31.
34. Przeciwciała zdolne do wykrywania polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, i niezdolne do wykrywania głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego.
35. Przeciwciała zdolne do wykrywania polipeptydu, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.
36. Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, do ustalania czy osobnik jest zakażony szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, określonym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S' -145 Singapore (glicyna na argininę), przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki kwasu nukleinowego od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę kwasu nukleinowego z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna.

PL 191 312 B1
37. Zastosowanie według zastrz. 36, w którym próbka kwasu nukleinowego w etapie (a) zawiera mRNA odpowiadający transkryptowi DNA kodującemu polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przy czym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) kontaktowanie mRNA z oligonukleotydem określonym w zastrz. 25, w warunkach umożliwiających wiązanie mRNA z oligonukleotydem, do wytworzenia kompleksu;

(ii) izolację tak wytworzonego kompleksu, i (iii) identyfikację mRNA w wyizolowanym kompleksie, dla ustalenia czy mRNA stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.
38. Zastosowanie według zastrz. 36, w którym próbka kwasu nukleinowego w etapie (a) zawiera mRNA odpowiadający transkryptowi DNA kodującemu polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przy czym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) translację mRNA w warunkach otrzymywania sekwencji aminokwasów; i (ii) porównanie sekwencji aminokwasów z etapu (i) z sekwencją aminokwasów kodowaną przez wyizolowany kwas nukleinowy określony w zastrz. 9, dla ustalenia czy próbkę kwasu nukleinowego stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.
39. Zastosowanie według zastrz. 36, w którym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) amplifikację kwasu nukleinowego obecnego w próbce w etapie (a); i (ii) wykrywanie obecności polipeptydu w otrzymanym zamplifikowanym kwasie nukleinowym.
40. Zastosowanie przeciwciał, które rozpoznają polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, określanego jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S' -145 Singapore (glicyna na argininę), do ustalania czy osobnik jest zakażony szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S' -145 Singapore (glicyna na argininę), przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przez skontaktowanie próbki w warunkach wiązania z przeciwciałami określonymi w zastrz. 34 albo 35, dla ustalenia czy osobnik jest zakażony.
41. Zastosowanie według zastrz. 36, 37 albo 40, w którym wyizolowany kwas nukleinowy, oligonukleotyd lub przeciwciało są znakowane wykrywalnym markerem.
42. Zastosowanie według zastrz. 41, w którym wykrywalny marker stanowi radioaktywny izotop, fluorofor lub enzym.
43. Zastosowanie według zastrz. 36, w którym próbkę stanowią krew, surowice lub tkanka, taka jak tkanka wątroby.
44. Sposób oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do leczenia zakażenia przez szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, określany jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę), znamienny tym, że:

(a) kontaktuje się polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, ze związkiem chemicznym w warunkach umożliwiających wiązanie polipeptydu ze związkiem chemicznym;

PL 191 312 B1 (b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny wiąże się z polipeptydem, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do leczenia zakażenia przez szczep wirusa 'S'-145 Singapore.
45. Sposób oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do zapobiegania zakażeniu przez szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, określany jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę), znamienny tym, że:

(a) kontaktuje się polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, ze związkiem chemicznym w warunkach umożliwiających wiązanie polipeptydu ze związkiem chemicznym;

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny wiąże się z polipeptydem, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do zapobiegania zakażeniu przez szczep wirusa 'S'-145 Singapore.
46. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, zdeponowanego pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r., który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która: różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przy czym iloś ci takiego polipeptydu są skuteczne do stymulacji lub wzmagania wytwarzania przeciwciał u osobnika, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
47. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera polipeptyd mający sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 320 SEQ ID NO: 3, przy czym ilości takiego polipeptydu są skuteczne do stymulacji lub wzmagania wytwarzania przeciwciał u osobnika, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
48. Sposób wytwarzania kompozycji, znamienny tym, że identyfikuje się związek chemiczny sposobem określonym w zastrz. 44 i łączy się ten związek z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
49. Sposób wytwarzania; kompozycji, znamienny tym, że identyfikuje się związek chemiczny sposobem określonym w zastrz. 45 i łączy się ten związek z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
50. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 46 albo 47 do leczenia osobnika zakażonego szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę).
51. Zastosowanie kompozycji wytworzonej sposobem określonym w zastrz. 48 do leczenia osobnika zakażonego szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę).
52. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 46 albo 47 do zapobiegania zakażeniu szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę) u osobnika.
53. Zastosowanie kompozycji wytworzonej sposobem określonym w zastrz. 49 do zapobiegania zakażeniu szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę) u osobnika.
54. Sposób skriningu płynów ustrojowych od osobnika pod kątem szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, określanego jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-145 Singapore (glicyna na argininę), znamienny tym, że:

(a) uzyskuje się próbkę płynu ustrojowego od osobnika; i (b) ustala się obecność polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, w próbce z etapu (a), dla potwierdzenia ewentualnej obecności tego szczepu.

PL 191 312 B1
55. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że jako płyn ustrojowy stosuje się krew, surowice lub próbkę kwasu nukleinowego z krwi lub surowic.
56. Zastosowanie przeciwciał, które rozpoznają polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, do ustalania predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego, przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki kwasu nukleinowego od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę kwasu nukleinowego z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przez skontaktowanie próbki w warunkach wiązania z przeciwciałami według zastrz. 34, dla ustalenia predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego.
57. Zastosowanie zastrz. 56, w którym w etapie (a) stosuje się próbkę kwasu nukleinowego zawierającą mRNA kodujący polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przy czym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) kontaktowanie mRNA z oligonukleotydem określonym zastrz. 25, w warunkach umożliwiających wiązanie mRNA z oligonukleotydem, do wytworzenia kompleksu;

(ii) izolację tak wytworzonego kompleksu; i (iii) identyfikację mRNA w wyizolowanym kompleksie, dla ustalenia czy mRNA stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.
58. Zastosowanie według zastrz. 56, w którym próbka kwasu nukleinowego w etapie (a) zawiera mRNA odpowiadający transkryptowi DNA kodującemu polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przy czym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) translację mRNA w warunkach otrzymywania sekwencji aminokwasów; i (ii) porównanie sekwencji aminokwasów z etapu (i) z sekwencją aminokwasów kodowaną przez wyizolowany kwas nukleinowy określony w zastrz. 9, dla ustalenia czy próbkę kwasu nukleinowego stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.
59. Zastosowanie zastrz. 56, w którym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) amplifikację kwasu nukleinowego obecnego w próbce z etapu (a); i (ii) wykrywanie obecności polipeptydu w powstałym zamplifikowanym kwasie nukleinowym.
60. Zastosowanie przeciwciał, które rozpoznają polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, do ustalania predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego, przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, przez skontaktowanie próbki w warunkach wiązania przeciwciał określonych w zastrz. 35, dla ustalenia predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego.
61. Zastosowanie według zastrz. 57, 58 albo 60, w którym oligonukleotyd lub przeciwciało są znakowane wykrywalnym markerem.
62. Zastosowanie według zastrz. 61, w którym wykrywalny marker stanowi radioaktywny izotop, fluorofor lub enzym.

PL 191 312 B1
63. Zastosowanie według zastrz. 56, w którym próbkę stanowią krew, surowice lub tkanka, taka jak tkanka wątroby.
64. Sposób oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do leczenia raka wątrobowo-komórkowego, znamienny tym, że:

(a) kontaktuje się polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, ze związkiem; chemicznym w warunkach umożliwiających wiązanie polipeptydu ze związkiem chemicznym;

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny wiąże się z polipeptydem, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do leczenia raka wątrobowo-komórkowego.
65. Sposób oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu, znamienny tym, że:

(a) kontaktuje się polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna, ze związkiem chemicznym w warunkach umożliwiających wiązanie polipeptydu ze związkiem chemicznym;

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny wiąże się z polipeptydem, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu.
66. Sposób wytwarzania kompozycji, znamienny tym, że identyfikuje się związek chemiczny sposobem określonym w zastrz. 64 i łączy się ten związek z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
67. Sposób wytwarzania kompozycji, znamienny tym, że identyfikuje się związek chemiczny sposobem określonym w zastrz. 65 i łączy się ten związek z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
68. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 46 albo 47 do wytwarzania leku do leczenia raka wątrobowo-komórkowego.
69. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 66 do wytwarzania leku do leczenia raka wątrobowo-komórkowego.
70. Zastosowanie kompozycji według zastrz. 46 albo 47 do wytwarzania leku do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu.
71. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 66 do wytwarzania leku do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu.
72. Szczepionka na wirusowe zapalenie wątroby typu B, znamienna tym, że zawiera zmutowany główny antygen powierzchniowy szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, zdeponowanego pod numerami dostępu P97121504, P97121505 i P97121506 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r., który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B tym, że aminokwas w pozycji 145 takiego polipeptydu stanowi arginina, a nie glicyna.
73. Szczepionka według zastrz. 72, znamienna tym, że zawiera ponadto adiuwant.