PL191355B1

PL191355B1 - Sposób ochrony rośliny przed atakiem patogenu

Info

Publication number: PL191355B1
Application number: PL334342A
Authority: PL
Inventors: John Andrew Ryals; Scott Joseph Uknes; Fernandez Antonio Molina; Leslie Bethards Friedrich
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1997-12-23
Publication date: 2006-05-31
Also published as: RU2224023C2; PL334342A1; ZA9711558B

Abstract

1. Sposób ochrony rosliny przed atakiem patogenu, przez nadanie tej roslinie synergistycznej opornosci na choroby, polegajacy na dostarczeniu immunomodulowanej rosliny majacej pierwszy poziom opornosci na chorobe i naniesieniu na te immunomodulowana rosline co najmniej jednego mikrobicydu, który nadaje jej drugi poziom opornosci na chorobe, przy czym naniesienie srodka mikrobójczego na juz immunomodulowana rosline nadaje jej synergistycznie wzmozony trzeci poziom opornosci na chorobe, który jest wiekszy niz suma pierwszego i drugiego poziomu oporno- sci na chorobe, znamienny tym, ze jako immunomodulowana rosline stosuje sie: (i) rosline mutanta (cim) o konstytutywnej odpornosci, (ii) rosline mutanta imitujacego uszkodzenia lub (iii) rosline uzyskana przez rekombinowana ekspresje genu SAR. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób ochrony rośliny przed atakiem patogenu. Ochronę tę uzyskuje się przez nałożenie mikrobicydu na uprzednio immunomodulowaną roślinę.

Rośliny są ciągle narażone na oddziaływanie różnych patogennych organizmów, w tym wirusów, bakterii, grzybów i nicieni. Szczególnie podatne na choroby są rośliny uprawne, ponieważ hodowle prowadzone są na ogół jako monokultury genetycznie jednorodne i gdy choroba zaatakuje tego rodzaju uprawę, straty są zazwyczaj bardzo poważne. Jednak większość roślin ma wrodzone mechanizmy obrony przed patogenami. Ta naturalna oporność na patogeny roślinne, zakodowana genetycznie, jest znana hodowcom roślin i patologom i jest wykorzystywana do ochrony wielu roślin uprawnych. Naturalne geny oporności na choroby często dają wysokie poziomy oporności lub odporności na patogeny.

Ogólnoustrojowa nabyta oporność (SAR) jest jednym ze składników złożonego systemu, który rośliny stosują by bronić się przed patogenami (Hunt i Ryals, Crit. Rev. in Plant Sci. 15, 583-606 (1996); Ryals i wsp., Plant Cell 8, 1809-1819 (1996); opis patentowy US Nr 5 614 395).

SAR jest szczególnie ważnym aspektem odpowiedzi roślina-patogen, ponieważ jest indukowalną przez patogen opornością ogólnoustrojową, obejmującą szeroki zakres czynników zakaźnych, wtym wirusy, bakterie i grzyby. Gdy szlak transdukcji sygnału SAR jest zablokowany, rośliny stają się bardziej wrażliwe na patogeny wywołujące choroby i stają się też wrażliwe na pewne czynniki zakaźne, które normalnie nie wywołują choroby (Gaffney i wsp., Science 261, 754-756 (1993); Delaney i wsp., Science 266, 1247-1250 (1994); Delaney i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6602-6606 (1995); Delaney, Plant Phys. 113, 5-12 (1997); Bi i wsp., Plant J. 8, 235-245 (1995); Mauch-Mani i Slusarenko, Plant Cell 8, 203-212 (1996)). Te obserwacje wskazują, że szlak transdukcji sygnału SAR jest niesłychanie istotny przy utrzymywaniu zdrowia roślin.

Koncepcyjnie odpowiedź SAR może być podzielona na dwie fazy. W fazie inicjacji rozpoznawana jest infekcja przez patogen i uwalniany jest sygnał, który wędruje poprzez łyko do odległych tkanek. Ogólnoustrojowy sygnał jest postrzegany przez komórki docelowe, które reagują przez ekspresję zarówno genów SAR i oporności na choroby. Faza utrzymania SAR dotyczy okresu czasu, od tygodni do całego życia rośliny, w czasie którego roślina jest w stanie quasistacjonarnym, w którym utrzymywana jest oporność na chorobę (Ryals i wsp.,1996).

Do transdukcji sygnału SAR wydaje się być wymagana akumulacja kwasu salicylowego (SA). Rośliny, które nie potrafią akumulować SA ze względu na traktowanie specyficznymi inhibitorami, epigenetyczną represję liazy fenyloalanina-amoniak lub transgeniczną ekspresję hydroksylazy salicylanu, która specyficznie degraduje SA, też nie potrafią indukować ani ekspresji genów SAR, ani oporności na chorobę (Gaffney i wsp., 1993; Delaney i wsp., 1994; Mauch-Mani i Slusarenko 1996; Mahrer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7802-7806 (1994)). Choć sugerowano, że SA może działać jako sygnał ogólnoustrojowy, jest to obecnie kontrowersyjne, i dotychczas na pewno wiadomo tylko, że jeśli SA nie może się akumulować wówczas zablokowana jest transdukcja sygnału SAR (Pallas i wsp., 1996; Shulayev i wsp., Plant Cell 7, 1961-1701 (1995); Vernooij i wsp., Plant Cell 6, 959-965 (1994)).

Niedawno Arabidopsis okazała się być układem modelowym do badania SAR (Uknes i wsp., Plant Cell 4, 645-656 (1992); Uknes i wsp., Mol. Plant-Microbe Interact. 6, 692-698 (1993); Cameron i wsp., Plant J. 5 715-725 (1994); Mauch-Mani i Slusarenko, Mol. Plant-Microbe Interact. 7, 376-383 (1994),

Dempsey i Klessig, Bulletin de Hnstitut Pasteur, 167-186 (1995)). Wykazano, że SAR może być aktywowany u Arabidopsis zarówno przez patogeny jak i związki chemiczne takie jak SA, kwas 2,6-dichloro-izonikotynowy (INA) i ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiadiozolo-7-karbotionowego (BTH) (Uknes i wsp., 1992; Vernooij i wsp., Mol. Plant-Microbe Interact. 8, 228-234 (1995); Lawdon i wsp., Plant J.10, 71-82 (1996)). Po traktowaniu albo INA albo BTH lub przez zakażenie patogenem przynajmniej trzy geny kodujące białka związane z patogenezą (PR), a mianowicie PR-1, PR-2 i PR-5 ulegają indukcji skoordynowanej wraz z początkiem oporności (Uknes i wsp., 1992, 1993). U tytoniu, gatunku najlepiej scharakteryzowanego, traktowanie patogenem lub związkiem immunizującym indukuje przynajmniej dziewięć zestawów genów (Ward i wsp., Plant Cell3, 1085-1094 (1991)). Transgeniczne rośliny oporne na chorobę uzyskano przez transformację roślin różnymi genami SAR (opis patentowy US 5 614395).

Uzyskano pewną ilość mutantów Arabidopsis, które mają zmodyfikowaną transdukcję sygnału SAR (Delaney, 1997). Pierwsze z tych mutantów to tak zwane mutanty Isd (lesions simulating disease - uszkodzenia symulujące chorobę) i mutanty acd2 (accelerated cell death - przyspieszona śmierć komórek) (Dietrich i wsp., Cell 77, 565-577 (1994); Greenberg i wsp., Cell 77, 551-563 (1994)). Te wszystkie mutanty mają jakiś stopień spontanicznego wytwarzania uszkodzeń nekrotycznych na swoich

PL 191 355 B1 liściach, podwyższone poziomy SA, akumulację mRNA dla genów SAR i znacznie zwiększoną oporność na choroby. Wyizolowano i scharakteryzowano przynajmniej siedem różnych mutantów (Dietrich i wsp., 1994; Weymann i wsp., Plant Cell 7, 2013-2022 (1995)). Inna interesująca klasa mutantów to mutanty cim (constitutive immunity - odporność konstytutywna) (Lawton i wsp., „The molecular biology of systemic acquired resistance” w The Mechanisms of Defence Responses in Plants, B. Fritig i M. Legrand, red. (Dordrecht, Holandia, Kluwer Academic Publishers, str. 422-432 (1993) oraz WO 94/16077. Podobnie do mutantów Isd i acd2, mutanty cim mają podwyższony SA i ekspresję genów SAR oraz oporność ale w przeciwieństwie do Isd lub acd2 nie wykazują wykrywalnych uszkodzeń na swoich liściach, cpr1 (constitutive expresser of PR genes - konstytutywnie eksprymujący geny PR) może być rodzajem mutanta cim, jednak ze względu na obecność mikroskopijnych uszkodzeń na liściach cpr1 nie zostało wykluczone. cpr1 może być typem mutanta Isd (Bowling i wsp., Plant Cell 6, 1845-1857 (1994)).

Wyizolowano także mutanty, które są zablokowane w sygnalizacji SAR. ndr1 (non-race specific disease resistance - oporność na choroby niezależna od rasy) jest mutantem, który pozwala na wzrost zarówno Pseudomonas syringae zawierającego różne geny awirulencji i także normalnych awirulentnych izolatów Peronospora parasitica (Century i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6597-6601 (1995)). Mutant ten wydaje się być zblokowany wcześnie w sygnalizacji SAR. nprl (nonexpresser of PR genes - niewyrażający genów PR) jest mutantem, który nie potrafi indukować ekspresji szlaku sygnalizacji SAR po traktowaniu INA (Cao i wsp., Plant Cell 6, 1583-1592 (1994)). Mutanty eds (enhanced disease susceptibility - wzmożona wrażliwość na choroby) zostały wyizolowane na podstawie ich zdolności do podtrzymywania infekcji przez bakterie po inokulacji niskim stężeniem bakterii (Glazebrook i wsp., Genetics 143, 973-982 (1996); Parker i wsp., Plant Cell 8, 2033-2046 (1996)). Pewne mutanty eds są fenotypowo bardzo podobne do npr1, i niedawno wykazano, że eds5 i eds53 są alleliczne z nprl (Glazebrook i wsp., 1996). nim1 (noninducible immunity - nieindukowalna odporność) jest mutantem, który utrzymuje wzrost P. parasitica (czynnika powodującego chorobę mączniaka rzekomego) po traktowaniu INA (Delaney i wsp., 1995; WO 94/16077). Choć nim1 może akumulować SA po infekcji patogenem nie może indukować ekspresji genów SAR ani oporności na chorobę, co sugeruje, że mutacja blokuje szlak poniżej SA. nim1 jest także defektywny w swej zdolności do reagowania na INA lub BTH, co sugeruje, że blok istnieje poniżej działania tych związków chemicznych (Delaney i wsp., 1995; Lawton i wsp., 1996).

Niedawno wyizolowano i scharakteryzowano dwa alleliczne geny Arabidopsis, w których mutanty są odpowiedzialne odpowiednio za fenotypy nim1i npr1 (Ryals i wsp., Plant Cell 9, 425-439 (1997); Cao i wsp., Cell 88, 57-63 (1997)). Produkt genu typu dzikiego NIM1 bierze udział w kaskadzie transdukcji sygnału prowadzącej zarówno do SAR i oporności gen-na-gen na choroby u Arabidopsis (Ryals i wsp., 1997). Ryals i wsp., 1997 donoszą także o izolacji pięciu dodatkowych alleli nim1, które wykazują zakres fenotypów od słabo uszkodzonego w chemicznie indukowanej ekspresji genów PR-1 i oporności na grzyby do bardzo silnie zablokowanej. Transformacja genu dzikiego typu NPR1 do mutantów npr1 nie tylko komplementowała mutanty, przywracając odpowiedź indukcji SAR odnośnie ekspresji genów PR i oporności na choroby ale także czyniła rośliny transgeniczne bardziej opornymi na zakażenie P. syringae w nieobecności indukcji SAR (Cao i wsp., 1997).

Szlaki transdukcji sygnału NF-κΒ/ΙκΒ były implikowane w reakcjach oporności na choroby w zakresie organizmów od Drosophila do ssaków. U ssaków transdukcja sygnału NF-kB/IkB może być indukowana przez szereg różnych bodźców, w tym kontakt komórek z lipopolisacharydem, czynnikiem martwicy nowotworów, interleukiną 1 (IL-1) lub infekcją przez wirus (Bauerle i Baltimore, Cell87, 13-20 (1996); Baldwin, Annu. Rev. Immunol. 14, 649-681 (1996)). Zaktywowany szlak prowadzi do syntezy pewnej ilości czynników związanych z reakcjami zapalnymi i odpornościowymi, takimi jak IL-2, IL-6, IL-8 i czynnik stymulujący kolonie granulocytów/makrofagów (deMartin i wsp., Gene 152, 253-255 (1995)). W badaniach myszy transgenicznych usunięcie (nokaut) transdukcji sygnału NF-kB/IkB prowadzi do defektywnej odpowiedzi immunologicznej, w tym zwiększonej wrażliwości na patogeny bakteryjne i wirusowe (Beg i Baltimore, Science 274, 782-784 (1996); Van Antwerp i wsp., Science 274, 787-789 (1996); Wang i wsp., Science 274, 764-787 (1996); Bauerle i Baltimore (1996)). U Arabidopsis SAR jest funkcjonalnie analogiczny do zapalenia z tym, że normalne procesy oporności są umożliwiane po aktywacji SAR doprowadzającej do wzmożonej oporności na choroby (Bi i wsp., 1995; Cao i wsp.,1994; Cao i wsp., 1995; Delaney i wsp., 1995; Delaney i wsp., 1994; Gaffney i wsp., 1993; Mauch-Mani iSlusarenko 1996; Delaney, 1997). Co więcej inaktywacja szlaku prowadzi do wzmożonej wrażliwości na patogeny bakteryjne, wirusowe i grzybowe. Jest interesujące, że doniesiono, że SA blokuje aktywację NF-kB w komórkach ssaków (Kopp i Ghosh, Science 265, 956-959 (1994), podczas gdy SA aktywuje

PL 191 355 B1 transdukcję sygnału u Arabidopsis. Infekcja bakteryjna Drosophila aktywuje kaskadę transdukcji sygnału prowadzącą do syntezy pewnej ilości białek przeciwgrzybowych takich jak cerkropina B, defensyna, dipteryzyna i drosomycyna (Ip i wsp., Cell 75, 753-763 (1993); Lemaitre i wsp., Cell 86, 973-983 (1996)). Ta indukcja zależy od produktu genu dorsal i dif, dwóch homologów NF-κΒ i jest reprymowana przez kaktus, homolog IkB u muchy. Mutanty, które mają zmniejszoną syntezę białek przeciwgrzybowych i przeciwbakteryjnych mają dramatycznie zmniejszoną oporność na zakażenie.

Mimo wielu badań i stosowania zaawansowanych i intensywnych środków ochrony roślin, w tym genetycznej transformacji roślin, straty spowodowane przez choroby to nadal miliardy dolarów. Tak więc istnieje ciągła potrzeba opracowania nowych środków ochrony roślin opartych nawciąż rosnącym zrozumieniu genetycznych podstaw oporności na choroby u roślin.

W świetle powyższego korzystny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy nowego sposobu ochrony roślin przed atakiem patogenu przez nadanie roślinie synergistycznej oporności na choroby, uzyskanej przez zastosowanie mikrobicydu na immunomodulowane rośliny. Immunomodulowane rośliny to takie, w których SAR jest zaktywowany, typowo wykazując ekspresję genów SAR większą niż u typu dzikiego. Rośliny te są określane jako rośliny z włączonym SAR (SAR-on). Immunomodulowane rośliny do stosowania w sposobie według wynalazku mogą być uzyskane: przez nanoszenie na rośliny chemicznego induktora SAR takiego jak BTH, INA lub SA; poprzez selektywny program hodowli, w którym wybiera się rośliny w oparciu o selektywną ekspresję genów SAR i/lub fenotypu opornego na chorobę; lub przez genetyczną inżynierię roślin przez transformację ich jednym lub więcej genami SAR takimi jak funkcjonalna forma genu NIM1. Mikrobicyd stosowany na rośliny immunomodulowane może być albo konwencjonalnym mikrobicydem takim jak fungicyd metalaksyl, lub o ile jest on stosowany do immunomodulowanych roślin uzyskanych przez selekcyjną hodowlę lub inżynierię genetyczną, mikrobicyd może być chemicznym induktorem SAR takim jak BTH, INA lub SA.

Immunomodulacja zapewnia pewien poziom oporności na chorobę u rośliny. Podobnie, pewnego poziomu oporności na chorobę dostarcza nałożenie mikrobicydu na roślinę. Spodziewanym wynikiem połączenia immunomodulacji z zastosowaniem mikrobicydu byłby poziom stanowiący sumę tych oporności. Jednak w rzeczywistości nałożenie mikrobicyduna roślinę immunomodulowaną zwiększa nieoczekiwanie oporność na chorobę synergistycznie, tzn. poziom oporności na choroby jest dużo większy niż oczekiwane addytywne zwiększenie poziomu oporności.

Zgodnie z wynalazkiem sposób ochrony rośliny przed atakiem patogenu, przez nadanie tej roślinie synergistycznej oporności na choroby, polega na dostarczeniu immunomodulowanej rośliny mającej pierwszy poziom oporności na chorobę i naniesieniu na tę immunomodulowaną roślinę co najmniej jednego mikrobicydu, który nadaje jej drugi poziom oporności na chorobę, przy czym naniesienie środka mikrobójczego na już immunomodulowanąroślinę nadaje jej synergistycznie wzmożony trzeci poziom oporności na chorobę, który jest większy niż suma pierwszego i drugiego poziomu oporności na chorobę i charakteryzuje się tym, że jako immunomodulowaną roślinę stosuje się:

(i) roślinę mutanta (cim) o konstytutywnej odporności, (ii) roślinę mutanta imitującegouszkodzenia lub (iii) roślinę uzyskaną przez rekombinowaną ekspresję genu SAR.

Korzystnie z populacji roślin wybiera się mutanta cim rośliny, przy czym kolejno: (a) ocenia się ekspresję genów SAR w niezakażonych roślinach, które są fenotypowo normalne przez to, że wymienione niezakażone rośliny nie mają fenotypu imitującego uszkodzenie i następnie (b) wybiera się niezakażone rośliny, które konstytutywnie wyrażają geny SAR pod nieobecność infekcji wirusowej, bakteryjnej lub grzybowej.

Korzystnie też z populacji roślin wybiera się roślinę będącą mutantem imitującym uszkodzenia, przy czym kolejno: (a) ocenia się ekspresję genów SAR w niezakażonych roślinach, które mają fenotyp imitujący uszkodzenie i następnie (b) wybiera się niezakażone rośliny, które konstytutywnie wyrażają geny SAR pod nieobecność infekcji wirusowej, bakteryjnej lub grzybowej.

Według wynalazku korzystnie stosuje się gen SAR, który jest funkcjonalną formą genu NIM1 kodującego białko NIM1, związane z kaskadą transdukcji sygnału prowadzącej do nabytej ogólnoustrojowej oporności u roślin i w szczególności wytwarza się białko NIM1, o sekwencji aminokwasów przedstawionej jako SEQ ID NO:2 lub wytwarza się białko NIM1, które jest kodowane przez cząsteczkę DNA zawierającą sekwencję kodującą przedstawioną jako SEQ ID NO:1.

Według wynalazku korzystnie też stosuje się gen SAR, który koduje zmienioną formę białka NIM1, wykazującą konstytutywną ekspresję genu SAR w roślinie transgenicznej, a w szczególności:

PL 191 355 B1 wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która ma alaniny zamiast seryn w pozycjach aminokwasów odpowiadających pozycjom 55 i 59 w SEQ ID NO:2, a zwłaszcza zmienioną formę białka NIM1, która obejmuje sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO:8, albo która jest kodowana przez cząsteczkę DNA, która obejmuje sekwencję nukleotydów przedstawioną jako SEQ ID NO:7; albo wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która ma przy N-końcu odcięte aminokwasy, odpowiadające w przybliżeniu pozycjom aminokwasów 1-125 w SEQ ID NO:2, a zwłaszcza zmienioną formę białka NIM1, która obejmuje sekwencję aminokwasów przedstawioną jako SEQ ID NO:10 albo wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która jest kodowana przez cząsteczkę DNA, która obejmuje sekwencję nukleotydów przedstawioną jako SEQ ID NO:9; albo wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która przy C-końcu ma odcięte aminokwasy odpowiadające w przybliżeniu pozycjom aminokwasów 522-593 w SEQ ID NO:2, a zwłaszcza zmienioną formę białka NIM1, która obejmuje sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO:12 albo zmienioną formę białka NIM1, która jest kodowana przez cząsteczkę DNA, która obejmuje sekwencję nukleotydów przedstawioną jako SEQ ID NO:11; albo wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, które przy N-końcu ma odcięte aminokwasy odpowiadające w przybliżeniu pozycjom aminokwasów 1-125 w SEQ ID NO:2, a przy C-końcu ma odcięte aminokwasy odpowiadające w przybliżeniu pozycjom aminokwasów 522-593 w SEQ ID NO:2, a zwłaszcza wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, które obejmuje sekwencję aminokwasów przedstawioną jako SEQ ID NO:14, albo która jest kodowana przez cząsteczkę DNA, która obejmuje sekwencję nukleotydów przedstawioną jako SEQ ID NO:13; albo wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która składa się zasadniczo z motywów ankyrynowych odpowiadających w przybliżeniu pozycjom aminokwasów 103-362 w SEQ ID NO:2, a zwłaszcza wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która obejmuje sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO:16 albo zmienioną formę białka NIM1, która jest kodowana przez cząsteczkę DNA, obejmującą sekwencję nukleotydów przedstawioną jako SEQ ID NO:15.

We wszystkich wymienionych wyżej wykonaniach sposobu według wynalazku korzystne jest jeżeli jako mikrobicyd stosuje się fungicyd wybrany z grupy obejmującej:

4-[3-(4-chlorofenylo)-3-(3,4-dimetoksyfenylo)akryloilo]morfolinę („dimetomorf”); 5-metylo-1,2,4-triazolo-[3,4-b][1,3]benzotiazol („tricyklazol”); 3-alliloksy-1,2-benzotiazolo-1,1-dioksyd („probonazol”); a-[2-(4-chloro-fenylo)etylo]-a(1,1-dimetyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („tebukonazol”); 1-{[3-(2-chlorofenylo)-2-(4-fluoro-fenylo)oksyran-2-yl]metylo}1H-1,2,4-triazol („epoksykonazol”); α-(4-chlorofenylo)-α-(1 -cyklopropyloetylo-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („cyprokonazol”); 5-(4-chlorobenzylo)-2-2-dimetylo-1-(1H-1,2,4-triazolo-1-lmetylo)-cyklopentanol („metkonazol”); 2-(2,4-dichlorofenylo)-3-(1 H-1 ,2,4-triazol-1-ylo)propylo-1 ,1 ,2,2-tetrafluoroetylo-eter („tetrakonazol”); metylo-(E)-2-{2-[6-(2-cyjanofenoksy)pirymidyn-4-yl-oksy]fenylo}-3-metoksyakrylan („ICI A 5504”, „azoksystrobina”); metylo-(E)-2-metoksyimino-2-[α-(o-toliloksy)-o-tolilo]octan („BAS 490 F”, „metylkrezoksymu”); 2-(2-fenoksyfenylo)-(E)-2-metoksyimino-N-metyloacetamid; [2-(2,5-dimetylofenoksymetylo)-fenylo]-(E)-2-metoksyimino-N-metyloacetamid; (1R,3S/1S,3R)-2,2-dichloro-N-[(R)-1-(4-chlorofenylo)etylo]-1-etylo-3-metylocyklopropanokarboksamid („KTU 3616”); kompleks polimerycznego etylenobis(ditio-karbaminianu) manganawego z solami cynku („mankozeb”); 1-[2-(2,4-dichlorofenylo)-4-propylo-1,3-diokso-lan-2-ylmetylo]-1H-1,2,4-triazol („propikonazol”); 1-[2-[2-chloro-4-(4-chlorofenoksy)fenylo]-4-metylo-1,3-dio-ksolan-2-yl-metyl]-1H-1,2,4-triazol („difenokonazol”); 1-[2-(2,4-dichlorofenylo]pentylo-1H-1,2,4-triazol („penkonazol”); cis-4-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo]-2,6-dimetylomorfolinę („fenpropimorf”); 1-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo]-piperydynę („fenpropidyna”); 4-cyklopropylo-6-metylo-N-fenylo-2-pirymidyn-aminę („cyprodynyl”); ester metylowy (RS)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („metalaksyl”); ester metylowy (R)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („R-metalaksyl”); 1,2,5,6-tetrahydro-4H-pirolo[3,2,1,ij]chinolino-4-on („pirochilon”) oraz fosfonian wodorku etylu („fosetyl”), przy czym szczególnie korzystnie jako fungicyd stosuje się metalaksyl.

Jest też korzystne jeżeli we wszystkich wymienionych wyżej wykonaniach sposobu według wynalazku jako mikrobicyd stosuje się albo związek benzotiadiazolu, albo związek kwasu izonikotynowego, albo związek kwasu salicylowego, ale też równie korzystne jest jeżeli na immunomodulowaną roślinę nakłada się równocześnie dwa mikrobicydy, z których jeden jest fungicydem wybranym z grupy obejmującej 4-[3-(4-chlorofenylo)-3-(3,4-dimetoksyfenylo)akryloilomorfolinę („dimetomorf”); 5-metylo-1,2,4-triazolo[3,4-b][1,3]benzotiazol („tricyklazol”); 3-alliloksy-1,2-benzotiazolo-1,1-dioksyd („probonazol”);

PL 191 355 B1 a-[2-(4-chlorofenylo)-etylo]-a(1,1-dimetyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („tebukanozol”); 1-{[3-(2-chloro-fenylo)-2-(4-fluorofenylo)oksyran-2-yl]metylo}-1H-1,2,4-triazol („epoksykonazol”); a-(4-chlorofenylo)-a-(1-cyklopropyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („cyprokonazol”); 5-(4-chlorobenzylo)-2-2-dimetylo-1-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmetylo)cyklopentanol, („metkonazol”); 2-(2,4-dichlorofenylo)-3-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)-propylo-1,1,2,2-tetrafluoroetyloeter („tetrakonazol”); metylo-(E)-2-{2-[6-(2-cyjanofenoksy)pirymidyn-4-yloksy]fenylo}-3-metoksyakrylan, („ICI A 5504”, „azoksystrobina”); metylo-(E)-2-metoksyimino-2-[a-(o-toliloksy)-o-tolilo]octan („BAS 490 F”, „metyl krezoksymu”); 2-(2-fenoksyfenylo)-(E)-2-metoksyiminoN-metyloacetamid; [2-(2,5-dimetylofenoksymetylo)-fenylo]-(E)-2-metoksymino-N-metyloacetamid; (1R,3S/1S,3R)2,2-dichloro-N-[(R)-1-(4-chlorofenylo)etylo]-1-etylo-3-metylocyklopropanokarboksamid („KTU 3616”); kompleks polimerycznego etylenobis(ditiokarbaminianu) manganawego z solami cynku („mankozeb”); 1-[2-(2,4-dichlorofenylo)-4-propylo-1,3-dioksolan-2-ylometylo]-1H-1,2,4-triazol („propikonazol”); 1-{2-[2-chloro-4-(4-chlorofenoksy)fenylo]-4-metylo-1,3-dioksolan-2-yl-metyl}-1H-1,2,4-triazol („difenokonazol”); 1-[2-(2,4-dichlorofenylo}pentylo-1H-1,2,4-triazol („penkonazol”); cis-4-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylo-propylo]-2,6-dimetylomorfolinę („fenpropimorf”); 1-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo-piperydynę („fenpropidyna”); 4-cyklopropylo-6-metylo-N-fenylo-2-pirymidynaminę („cyprodynyl”); ester metylowy (RS)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („metalaksyl”); ester metylowy (R)-N-(2,6-dimety-lofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („R-metalaksyl”); 1,2,5,6-tetrahydro-4H-pirolo[3,2,1,ij]chinolino-4-on („pirochilon”) oraz fosfonian wodorku etylu („fosetyl”).

Szczególnie jest korzystne gdy wymienionym fungicydem jest metalaksyl, a drugi mikrobicyd jest związkiem benzotiadiazolu.

W sposobie według wynalazku korzystnie wytwarza się białko NIM1 albo jego zmienioną formę stosując cząsteczkę DNA, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydów przedstawionej jako SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 13 lub 15 w następujących warunkach: 1% BSA; 520 mM NaPO4, pH 7,2; 7% siarczan laurylu, sól sodowa; 1 mM EDTA; 250 mM NaCI w 55°C przez 18-24 godz. i płukanie w 6xSSC przez 15 min (X3) 3xSSC przez 15 min (X1) w 55°C. W tym przypadku jako jeden z mikrobicydów stosuje się zwłaszcza fungicyd wybrany z grupy obejmującej: 4-[3-(4-chlorofenylo)-3-(3,4-dimetoksyfenylo)akryloilomorfolinę („dimetomorf”); 5-metylo-1,2,4-triazolo[3,4-b][1,3]benzotiazol („tricyklazol”); 3-alliloksy-1,2-benzotiazolo-1,1-dioksyd („probonazol”); α-[2-(4-chlorofenylo)-etylo]-α(1,1-dimetyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („tebukanozol”); 1-{[3-(2-chlorofenylo)-2-(4-fluorofenylo)oksyran-2-yl]metylo}-1H-1,2,4-triazol („epoksykonazol”); α-(4-chlorofenylo)-α-(1-cyklopropyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („cyprokonazol”); 5-(4-chloro-benzylo)-2-2-dimetylo-1-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmetylo)cyklopentanol, („metkonazol”); 2-(2,4-dichlorofenylo)-3-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)-propylo-1,1,2,2-tetrafluoroetylo-eter, („tetrakonazol”); metylo-(E)-2-{2-[6-(2-cyjano-fenoksy)pirymidyn-4-yloksy]fenylo}-3-metoksyakrylan, („ICI A 5504”, „azoksystrobina”); metylo-(E)-2-meto-ksyimino^-fa^o-toliloksy^o-tolilofcctan („BAS 490 F”, „metyl krezoksymu”); 2-(2-fenoksyfenylo)-(E)-2-metoksyimino-N-metyloacetamid; [2-(2,5-dimetylofenoksymetylo)-fenylo]-(E)-2-metoksymino-N-metylo-acetamid; (1R,3S/1S,3R)2,2-dichloro-N-[(R)-1-(4-chlorofenylo)etylo]-1-etylo-3-metylocyklopropano-karboksamid („KTU 3616”); kompleks polimerycznego etylenobis(ditiokarbaminianu) manganawego z solami cynku („mankozeb”); 1-[2-(2,4-dichlorofenylo)-4-propylo-1,3-dioksolan-2-ylometylo]-1H-1,2,4-triazol („propikonazol”); 1-{2-[2-chloro-4-(4-chlorofenoksy)fenylo]-4-metylo-1 ,3-dioksolan-2-yl-metyl}-1 H-1 ,2,4-triazol („difenokonazol”); 1-[2-(2,4-dichlorofenylo}pentylo-1H-1,2,4-triazol („penkonazol”); cis-4-[3-(4-tert-butylo-fenylo)-2-metylopropylo]-2,6-dimetylomorfolinę („fenpropimorf”); 1-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo-piperydynę („fenpropidyna”); 4-cyklopropylo-6-metylo-N-fenylo-2-pirymidynaminę („cyprodynyl”); ester metylowy (RS)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („metalaksyl”); ester metylowy (R)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („R-metalaksyl”); 1 ,2,5,6-tetrahydro-4H-pirolo-[3,2,1 ,ij]-chinolino-4-on („pirochilon”) oraz fosfonian wodorku etylu („fosetyl”).

Jako szczególnie korzystny fungicyd spośród wymienionych powyżej stosuje się metalaksyl, a jako szczególnie korzystne mikrobicydy stosuje się albo związek benzotiadiazolu, albo związek kwasu izonikotynowego, albo związek kwasu salicylowego. Korzystne jest też gdy na immodulowaną roślinę nakłada się równocześnie dwa mikrocybidy, z których jeden jest fungicydem wybranym z grupy obejmującej: 4-[3-(4-chlorofenylo)-3-(3,4-dimetoksyfenylo)akryloilomorfolinę („dimetomorf”); 5-metylo-1,2,4-triazolo[3,4-b][1,3]benzotiazol („tricyklazol”); 3-alliloksy-1,2-benzotiazolo-1,1-dioksyd („probonazol”); α-[2-(4-chlorofenylo)etylo]-α(1,1-dimetyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („tebukanozol”); 1-{[3-(2-chloro-fenylo)-2-(4-fluorofenylo)oksyran-2-yl]metylo}-1H-1,2,4-triazol („epoksykonazol”); α-(4-chlorofenylo)-α-(1-cyklopropyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („cyprokonazol”); 5-(4-chlorobenzylo)-2-2-dimetylo-1-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmetylo)cyklopentanol, („metkonazol”); 2-(2,4-dichlorofenylo)-3-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)-propylo-1,1,2,2-tetrafluoroetylo-eter, („tetrakonazol”); metylo-(E)-2-{2-[6-(2-cyjanofenoksy)pirymidyn-4PL 191 355 B1

-yloksy]fenylo}-3-metoksyakrylan, („ICI A 5504”, „azoksystrobina”); metylo-(E)-2-metoksyimino-2-[a-(o-toliloksy)-o-tolilo]octan („BAS 490 F”, „metyl krezoksymu”); 2-(2-fenoksyfenylo)-(E)-2-metoksyimino-N-metyloacetamid; [2-(2,5-dimetylofenoksymetylo)-fenylo]-(E)-2-metoksymino-N-metyloacetamid; (1R,3S/1S,3R)2,2-dichloro-N-[(R)-1-(4-chlorofenylo)etylo]-1-etylo-3-metylocyklopropanokarboksamid („KTU 3616”); kompleks polimerycznego etylenobis(ditiokarbaminianu) manganawego z solami cynku („mankozeb”); 1-[2-(2,4-dichlorofenylo)-4-propylo-1,3-dioksolan-2-ylometylo]-1H-1,2,4-triazol („propikonazol”); 1-{2-[2-chloro-4-(4-chlorofenoksy)fenylo]-4-metylo-1,3-dioksolan-2-yl-metyl}-1H-1,2,4-triazol („difenokonazol”); 1-[2-(2,4-dichlorofenylo}pentylo-1H-1,2,4-triazol („penkonazol”); cis-4-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo]-2,6-dimetylomorfolinę („fenpropimorf”); 1-[3-(4-tert-butylo-fenylo)-2-metylopropylopiperydynę („fenpropidyna”); 4-cyklopropylo-6-metylo-N-fenylo-2-pirymidynaminę („cyprodynyl”); ester metylowy (RS)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („metalaksyl”); ester metylowy (R)-N-(2,6-dimetylo-fenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („R-metalaksyl”); 1,2,5,6-tetrahydro-4H-pirolo[3,2,1,ij]chinolino-4-on („pirochilon”) oraz fosfonian wodorku etylu („fosetyl”),a drugi mikrobicyd jest albo związkiem benzotiadiazolu, albo związkiem kwasu izonikotynowego albo związkiem kwasu salicylowego. Szczególnie korzystnie wymieniony fungicyd jest metalaksylem, a drugi mikrobicyd jest związkiem benzotiadiazolu.

Tak więc wynalazek dotyczy ochrony roślin przed atakiem patogenu, hodowli immunomodulowanych roślin i stosowania do nich odpowiedniej ilości konwencjonalnego mikrobicydu. Szczególnie korzystne postacie wynalazku dotyczą roślin genetycznie zmanipulowanych tak, aby zawierały i wyrażały funkcjonalną postać genu NIM1lub jego homologu lub wariantu.

Przykłady docelowych roślin do wskazań tu ujawnionych obejmują, ale nie ograniczają się do, następujących gatunków roślin: zboża (kukurydza, pszenica, jęczmień, żyto, owies, ryż, sorgo i pokrewne rośliny uprawne); buraki (burak cukrowy i burak pastewny); owoce twarde, owoce pestkowe i owoce miękkie (jabłka, gruszki, śliwki, brzoskwinie, migdały, czereśnie, truskawki, maliny i jeżyny); rośliny motylkowe (fasola, soczewica, groch, soja); rośliny oleiste (rzepak, musztarda, mak, oliwki, słoneczniki, kokos, rośliny rycyny, ziarno kakaowe, orzeszki arachidowe); rośliny ogórka (kabaczki, ogórki, melony); rośliny włókniste (bawełna, len, konopie, juta); owoce cytrusowe (pomarańcze, cytryny, grejpfruty, mandarynki); jarzyny (szpinak, sałata, szparagi, kapusta, marchew, cebula, pomidory, ziemniaki, papryka); laureaceae (awokado, cynamon, kamfora); lub rośliny takie jak tytoń, orzechy, kawa, trzcina cukrowa, herbata, winorośl, chmiel, banany, naturalne rośliny gumy, jak i rośliny ozdobne (kwiaty, krzewy, drzewa o szerokich liściach i wiecznie zielone, takie jak szpilkowe). Ta lista nie stanowi żadnego ograniczenia.

Sposób według niniejszego wynalazku może być użyty by nadać oporność na szeroki zestaw patogenów roślinnych, które obejmują, ale nie ograniczają się do: wirusy lub wiroidy takie jak wirusy mozaiki tytoniu lub ogórka, wirus „ringspot lub nekrozy, wirus liściozwoju pelargonii, wirus plamistości czerwonej kukurydzy, wirus krzaczastej karłowatości pomidora i podobne wirusy; grzyby z grupy workowców takie jak rodzaje Venturia, Podosphaera, Erysiphe, Monolinia, Mycosphaerella i Uncinula; grzyby z Basidiomycetes takie jak z rodzajów Hemileia, Rhizoctonia i Puccinia; Fungi imperfecti takie jak rodzaje Botyris, Herlminthosporium, Rhynchosporium, Fusarium (m.in. F. monoforme), Septoria, Cercospora, Alternaria, Pyricularia i Pseudocercosporella (m.in. P. herpotrichoides); grzyby z Oomycetestakie jak z rodzajów Phytophthora(m.in. P. parasitica), Peronospora(m.in. P. tabacina), Bremia, Pythium, i Plasmopara; jak i inne grzyby takie jak Sclerophthora macrospora, Sclerophthora rayissiae,

Sclerospora graminicola, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora sacchari i Peronosclerospora maydis, Physopella zeae, Cercospora zeae-maydis, Colletotrichum graminicola, Gibberella zeae, Exserohilum turcicum, Kabatiellu zeae, i Bipolaris maydis; bakterie takie jak Pseudomonas syringae, Pseudomonas tabaci, i Erwinia stewartii; owady takie jak mszyce np. Myzus persicae i lepidopteratakie jak Heliothus spp., i nicienie takie jak Meloidogyne incognita.

Uzyskiwanie roślin immunomodulowanych

Wszystkie trzy z następujących trzech ogólnych sposobów uzyskiwania roślin immunomodulowanych są pokrewne ponieważ wszystkie pasują do modelu transdukcji SAR podanego w Ryals i wsp. (1996). Po aktywacji szlaku transdukcji sygnału SAR aby uzyskać oporność na chorobę, ten sam zestaw genów SAR jest włączony i powstaje oporność na chorobę, niezależnie od tego którą z trzech podanych poniżej dróg się wybierze. Różnice między tymi trzema drogami dotyczą tylko do którego punktu jest włączony SAR w szlaku, końcowy wynik jest taki sam w tych trzech drogach. Tak więc analizy i wyniki obserwowane w stosunku do immunomodulowanych roślin uzyskanych na jednej drodze mogą być ekstrapolowane i stosowane do immunomodulowanych roślin uzyskanych na innej drodze.

PL 191 355 B1

A. Zastosowanie chemicznego induktora nabytej oporności ogólnoustrojowej

Pierwsza droga uzyskiwania immunomodulowanych roślin obejmuje podanie roślinie związku chemicznego zdolnego do indukcji SAR. Szczególnie silnymi chemicznymi induktorami SAR są benzotiodizaole takie jak ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiadiazolo7-karbotiowego (BTH). Pochodne benzotiadizaoli, które mogą być dalej używane jako regulatory są opisane w Patentach US Nr 5,523,311 i 5,614,395, z których oba są tu włączone w postaci odniesienia. SAR indukowany przez BTH, który nadaje ochronę w polu przeciwko szerokiemu zakresowi chorób w różnych roślinach jest opisany szczegółowo w Freidrich i wsp., Plant Journal 10(1), 61-70 (1996); Lawton i wsp. Plant Journal 10(1), 71-82 (1996); i Gorlach i wsp., Plant Cell8, 629-643 (1996) z których każdy jest tu włączony w postaci odniesienia. Inne chemiczne induktory SAR, które mogą być użyte do uzyskania immunomodulowanej rośliny dla stosowania w sposobie według wynalazku obejmują związki kwasu izonikotynowego takie jak kwas 2,6-dichloroizonikotynowy (INA) i niższe jego estry alkilowe, jak i związki kwasu salicylowego (SA). Przykłady odpowiednich związków INA i SA są opisane w Patencie US 5,614,395.

B. Hodowla roślin mutantów o konstytutywnej oporności (ClM)

Druga droga uzyskiwania roślin immunomodulowanych jest poprzez selektywne programy hodowli opisane na konstytutywnej ekspresjigeny SAR i/lub fenotypu oporności na chorobę. Liczne dane wykazująścisłą korelację między ekspresją genów SAR i samą ogólnoustrojową nabytą opornością (Ward i wsp. (1991); Uknes i wsp. (1992); Ukres i wsp. (1993); Lawton i wsp. (1993); i Alexander i wsp. (1993) PNAS USA 90, 7327-7331, włączone tu w postaci odniesienia. U Arabidopsis przykłady dobrze scharakteryzowanych genów SAR to PR-1, PR-2, PR-5, przy czym PR-1 wyrażany jest na najwyższym poziomie z najniższym tłem.

Aby zidentyfikować i wybrać rośliny które konstytutywnie eksprymują geny SAR, przeprowadza się analizę typu Northern aby wykrywać detekcję genów SAR. Znane sekwencje DNA SAR mogą być używane za pomocą krzyżowej hybrydyzacji jak opisano w Uknes i wsp. (1992). Sposoby hybrydyzacji i klonowania sekwencji kwasów nukleinowych są dobrze znane w dziedzinie (patrz na przykład Molecular Cloning, A Laboratory Manual wyd. 2, Tomy 1-3,. Sambrook i wsp. (red) Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) i tam cytowane odnośniki). Wyizolowano przynajmniej dwie klasy mutantów sygnału transdukcji SAR, które konstytutywnie eksprymują geny SAR. Jedną z klas określono jako mutanty „Isd”(Isd -lesion simulating disease - uszkodzenia symulujące choroby), które są także określane jako mutanty „cim klasy 1”. Patrz WO 94/16077. Mutanty Isd (cim klasa l) tworzą spontaniczne uszkodzenia na liściach, akumulują podwyższone stążenia SA, wysokie poziomy mRNA PR-1, PR-2, i PR-5 i są oporne na patogeny grzybowe i bakteryjne (Dietrich i wsp., 1994; Weymann i wsp., 1995). Drugą klasę określono jako mutanty „cim” (cim = constitutive immunity - odporność konstytutywna), które są także określane jako mutanty „cim klasy II”. Patrz WO 94/16077. Mutanty cim mają wszystkie cechy mutantów Isd poza spontanicznymi uszkodzeniami. Tak więc mutanty cim wydają sią fenotypowo normalne.

Gdy rośliny, które konstytutywnie wyrażają geny SAR są wybrane mogą być stosowane w programach hodowli aby włączyć konstytutywną ekspresję genów SAR i oporności na patogeny do linii roślin. Potomstwo do dalszych krzyżówek jest wybierane w oparciu o ekspresję genów SAR i oporności na choroby jak i ze wzglądu na inne cechy ważne dla produkcji i jakości według sposobów dobrze znanych specjalistom w dziedzinie hodowli roślin. Na przykład ponieważ mutanty Isd wykazują tworzenie uszkodzeń i nekrozę, mutanty cim z ich normalnymi fenotypami są korzystne do stosowania w takich programach hodowli i w sposobie według niniejszego wynalazku, choć można by stosować mutanty Isd o ile by było to pożądane.

C. Transformacja roślin genami SAR

Trzecia droga otrzymania roślin immunomodulowanych to transformacja roślin genem SAR, korzystnie funkcjonalną postacią genu NIM1.

1. Zrekombinowana ekspresja genu NIM1 typu dzikiego

Zrekombinowana nadekspresja dzikiego typu NIM1 (SEQ ID NO:1) daje rośliny transgeniczne o fenotypie opornym na chorobę. Patrz, równoczesne Zgłoszenie Patent US Numer Serii 08/880,179 włączone tu w postaci odniesienia. Zwiększone poziomy aktywnego białka NIM1 dają ten sam efekt oporności na chorobę jak indukcja chemiczna indukującymi związkami chemicznymi takimi jak BTH, INA i SA. Korzystnie ekspresja genu NIM1 jest na poziomie, który jest przynajmniej dwukrotnie powyżej poziomu ekspresji genu NIM2 w roślinach typu dzikiego i jest bardziej korzystnie przynajmniej dziesięć razy powyżej poziomu ekspresji dzikiego typu. Sekcja poniżej pod tytułem „Technologia Zrekombinowanego DNA” podaje protokoły, które mogą być stosowane do zrekombinowanej ekspresji

PL 191 355 B1 genu NIM1 typu dzikiego w roślinach transgenicznych na poziomach wyższych niż w typie dzikim. Alternatywnie, rośliny mogą być transformowane genem NPR1 typu dzikiego do produkcji roślin opornych na choroby jak opisano w Cao i wsp. (1997).

2. Zrekombinowana ekspresja zmienionej postaci genu NIM1

Immunomodulowane rośliny do stosowania w sposobie niniejszego wynalazku mogą być też stworzone za pomocą zrekombinowanej ekspresji zmienionej postaci genu NIM1, przez co zmiana genu NIM1 wykorzystuje zarówno stwierdzenie, że szlak SAR u roślin wykazuje funkcjonalne analogie do schematu regulacji NF-κΒ/ΙκΒ u ssaków i much, jak i wykrycie, że produkt genu NIM1 jest strukturalnym homologiem czynnika transdukcji sygnału ssaków IkB podklasy α. Patrz równocześnie zgłoszone PCT „Sposoby stosowania genu NIM1 do nadawania oporności na choroby u roślin” tu włączone w postaci odniesienia.

Sekwencję genu NIM1 (SEQ ID NO:1) zastosowano w przeszukiwania BLAST i zidentyfikowano zgodności w oparciu o homologię wysoce konserwowanej domeny w sekwencji genu NIM1 do domen ankyryny znajdowanych w szeregu białek takich jak spektryny, ankyryny, NF-kB i IkB (Michaely i Bennett, Trends Cell Biol. 2, 127-129 (1992)). Przeprowadzono parami porównanie na oko między białkiem NIM1 (SEQ ID NO:2) i 70 znanymi białkami zawierającymi ankyryny i stwierdzono uderzające podobieństwa do członków klasy ^α klasy regulatorów transkrypcji (Bauerle i Baltimore 1996; Baldwin 1996). Jak pokazano w figurze 1, białko NIM1 (SEQ ID NO:2) ma znaczącą homologię do białek ^α z myszy, szczura i świni (odpowiednio SEQ ID NO:3, 4 i 5). NIM1 zawiera kilka ważnych domen strukturalnych ^α poprzez całą długość białka, w tym domen ankyryny (pokazane przez kreskowane linie w figurze 1), 2 seryny N-końcowe (aminokwasy 55 i 59 NIM1), i parę lizyn (aminokwasy 99 i 100 NIM1) i kwaśny C-koniec. Ogólnie, NIM1 i ^α mają 30% identyczności reszt i mają konserwatywne podstawienia w 50% reszt. Tak więc istnieje homologia między ^α i NIM1 wśród białek i ogólne podobieństwo 80%.

Jednym ze sposobów działania ^α w transdukcji sygnału jest wiązanie do cytosolowego czynnika transkrypcyjnego NF-kB i uniemożliwianie mu wejścia do jądra i zmiany transkrypcji genów docelowych (Bauerle i Baltimore, 1996; Baldwin, 1996). Docelowe geny NFkB regulują (aktywują lub hamują) kilka procesów komórkowych, w tym odpowiedzi śmierci komórki przeciw wirusom i mikroorganizmom (Bauerle i Baltimore, 1996). Gdy zaktywowany jest szlak transdukcji sygnału, ^α jest fosforylowany na dwóch resztach seryny (aminokwasy 32 i 36 mysiego ^α). To programuje ubikwitynację na podwójnych lizynach (aminokwasy 21 i 22 mysiego ^α). Po ubikwitynacji kompleks NF-kB/IkB jest kierowany do proteosomu, gdzie ^α jest degradowany i NF-kB jest uwolniony do jądra.

Fosforylowane reszty seryny ważne w funkcji ^α są konserwowane w NIM1 w obrębie dużego ciągłego bloku konserwowanej sekwencji aminokwasów 35 do 84 (figura 1). W przeciwieństwie do ^α gdzie podwójna lizyna jest zlokalizowana około 15 aminokwasów w kierunku N-końca białka, w NIM1 podwójna lizyna jest umieszczona 40 aminokwasów w kierunku C-końca. Co więcej, istnieje wysoki stopień homologii między NIM1 i ^α w domenie C-końcowej bogatej w serynę/treoninę, która jak wykazano jest ważna w tempie przemiany podstawowej (Sun i wsp., Mol. Cell. Biol. 16, 1058-1065 (1996)). Według niniejszego wynalazku w oparciu o analizie homologii strukturalnej i w obecności elementów, o których wiadomo, że są ważne dla funkcji ^α, oczekuje się, że NIM1 będzie działać tak jak ^α mając analogiczne efekty na regulację genów roślin.

Gdy rośliny zawierające gen typu dzikiego NIM1 są traktowane indukującymi związkami chemicznymi oczekuje się, że będą miały więcej produktu genu NIM1 (homolog IkB) lub mniej fosforylacji produktu genu NIM1 (homolog IkB). Zgodnie z tym modelem wynikiem tego jest, że roślinny homolog NF-kB jest utrzymywany poza jądrem i pozwala na ekspresję genów SAR i odpowiedzi odpornościowe. W roślinach mutantów nim1, homolog NF-kB może swobodnie iść do jądra i reprymować oporność i ekspresję genów SAR.

Zgodnie z tą koncepcją, komórki zwierzęce traktowane kwasem salicylowym wykazują wzmożoną stabilność i ilość IkB i zmniejszenie aktywnego NF-kB w jądrze (Kopp i Ghosh, 1994); znane są mutacje IkB o których wiadomo, że działają jako superrepresory lub czynniki dominujące negatywne (Britta-Mareen Traenckner i wsp., EMBO 14:2876-2883 (1995); Brown i wsp., Science 267:1485-1488 (1996); Brockman i wsp., Molecular and Cellular Biology 15:2809-2818 (1995); Wang i wsp., Science 274: 784-787 (1996)). Te zmutowane postacie IkB wiążą się do NF-kB ale nie są fosforylowane ani ubikwitynowane więc nie ulegają degradacji. NF-kB pozostaje związany z IkB i nie może przemieścić się do jądra.

PL 191 355 B1

W świetle powyższego, można uzyskać zmienione formy NIM1, które działają jako dominującenegatywne regulatory szlaku transdukcji sygnału SAR. Rośliny transformowane tymi dominującyminegatywnymi formami NIM1 mają przeciwny fenotyp jak rośliny zmutowane nim1 w tym, że rośliny transformowane zmienionymi postaciami NIM1 wykazują konstytutywną ekspresję genów SAR i tak więc fenotyp ClM, tzn. rośliny transgeniczne są immunomodulowane. Ze względu na pozycję, którą gen NIM1 zajmuje w szlaku transdukcji sygnału SAR oczekuje się, że pewna ilość zmian w tym genie, poza tymi tu specyficznie ujawnionymi, da konstytutywną ekspresję genów SAR i tak więc fenotyp CIM. Sekcja poniżej nazwana „Technologia zrekombinowanego DNA” podaje protokoły, które mogą być stosowane do zrekombinowanego wyrażania zmienionych postaci genu NIM1 w roślinach transgenicznych na poziomach wyższych niż w dzikim typie. Poniżej opisano kilka zmienionych postaci genu NIM1, które działają jako dominujące-negatywne regulatory szlaku transdukcji sygnału SAR.

a. Zmiany reszt seryny 55 i 59 na reszty alaniny

Fosforylacja reszt seryny w ludzkim ^α jest wymagana do aktywowanej przez bodziec degradacji ^α w ten sposób aktywując NF-kB. Mutageneza reszt seryny (S32 i S36) w ludzkim ^α do reszt alaniny hamuje fosforylację indukowaną przez bodziec w ten sposób degradację ^α z udziałem proteosomu (Traenckner i wsp., 1995; Brown i wsp., 1996; Brockman i wsp., 1995; Wang i wsp. 1996). Ta zmieniona forma ^α może działać jako dominująca negatywna forma przez zatrzymywanie NF-kB w cytoplazmie, w ten sposób blokując zdarzenia przekazu sygnału poniżej. W oparciu o porównanie aminokwasów między NIM1 i IkB pokazane w figurze 1, seryny 55 (S55) i 59 (S59) w NIM1 (SEQ ID NO:2) są homologiczne do S32 i S36 w ludzkim ^α. Aby skonstruować dominujące negatywne formy NIM1, mutagenizuje się seryny w pozycji aminokwasów 55 i 59 do reszt alaniny. Tak więc w korzystnej postaci, gen NIM1 jest tak zmieniony, że kodowane białko ma alaniny zamiast seryn w pozycjach aminokwasów odpowiadających pozycjom 55 i 59 sekwencji aminokwasów NIM1 Arabidopsis (SEQ IDNO:2).

b. Delecja N-końca

Delecja aminokwasów 1-36 (Brockman i wsp. 1995; Sun i wsp. 1996) lub 1-72 (Sun i wsp. 1998) ludzkiego ^α, która obejmuje ubikwitynowane reszty K21 i K22 jak i miejsca fosforylacji S32 i S36 daje w efekcie dominujący negatywny fenotyp ^α w transfekowanych hodowlach komórek ludzkich. N-końcowa delecja pierwszych 125 aminokwasów produktu genu NIM1 usuwa osiem reszt lizyny, które mogłyby służyć jako miejsca ubikwitynacji jak i przypuszczalne miejsca fosforylacji S55 i S59 omówione powyżej. Tak więc w korzystnej postaci gen NIM1 jest zmieniony tak, że w kodowanym produkcie brakuje około pierwszych 125 aminokwasów w porównaniu z natywną sekwencją aminokwasów NIM1 Arabidopsis (SEQ ID NO:2).

c. Delecja C-końca

Delecja aminokwasów 261-317 ludzkiego ^α może spowodować zwiększenie endogennej stabilności przez zablokowanie konstytutywnej fosforylacji reszt seryny i treoniny na C-końcu. Oczekuje się, że ta zmieniona forma ^α będzie działała jako postać dominująca negatywna. Obszar bogaty w serynę i treoninę jest obecny przy aminokwasach 522-593 na C-końcu NIM-1. Tak więc w korzystnej postaci gen NIM-1 jest tak zmieniony, że w kodowanym produkcie brak około jego części C-końcowej, w tym aminokwasów 522-593 w porównaniu z natywną sekwencją aminokwasów NIM1 Arabidopsis (SEQ ID NO:2).

d. Hybryda delecja N-końca-delecja C-końca i domeny ankyryny

Zmienione formy produktu genu NIM1 mogą też być wytworzone w wyniku delecji odcinków C-końcowych i N-końcowych delecji lub hybryd. W jeszcze jednej postaci niniejszego wynalazku, dostarczone są konstrukty obejmujące domeny ankyryny genu NIM1.

3. Zrekombinowana ekspresja innych genów SAR

Immunomodulowane rośliny do stosowania w sposobie niniejszego wynalazku mogą być wytworzone przez zrekombinowaną ekspresję różnych genów SAR tak jak te opisane w Ward i wsp. (1991). Patrz na przykład Patent US Nr 5,614,395, który opisuje rośliny oporne na choroby stworzone przez nadekspresję jednego lub więcej genów białek PR. Choć odnosi się do zrekombinowanej ekspresji w szczególności form genu NIM1, część poniżej nazwana „Technologia zrekombinowanego DNA” przedstawia protokoły które mogą być też wykorzystane do wyrażania w sposób zrekombinowany innych genów SAR takich jak geny białek PR w roślinach transgenicznych na poziomach wyższych niż dziki.

Technologia zrekombinowanego DNA

Dzika lub zmieniona forma genu NIM1 nadającego oporność na choroby roślinom poprzez zwiększenie ekspresji SAR może być włączona do komórek roślinnych stosując konwencjonalną technologię zrekombinowanego DNA. Na ogół obejmuje to wstawienie cząsteczek DNA kodujących wybraną

PL 191 355 B1 postać NIM1 opisaną powyżej do układu ekspresyjnego dla którego cząsteczka DNA jest heterologiczna (tzn. nie jest normalnie obecna) stosując standardowe techniki klonowania znane w dziedzinie. Wektor zawiera potrzebne elementy dla transkrypcji i translacji wstawionych sekwencji kodujących białko. Może być stosowana duża ilość układów ekspresyjnych znanych w dziedzinie, takich jak plazmidy, bakteriofagowe wirusy i inne zmodyfikowane wirusy. Odpowiednie wektory obejmują, ale nie ograniczają się do, wektory wirusowe takie jak systemy wektorów lambda λgt1, λgt10 i Charon 4; wektory plazmidowe takie jak pBI121, pBR322, pACYC177, pACYC184, seria pAR, pKK223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pRK290, pKC37, pKC101, pCDNAII i inne podobne systemy. Składniki systemu ekspresyjnego mogą także być zmodyfikowane w celu zwiększenia ekspresji. Na przykład mogą być stosowane skrócone sekwencje, podstawienia nukleotydów lub inne modyfikacje. Opisane tu układy ekspresyjne mogą być stosowane do transformacji w zasadzie każdej rośliny uprawnej w odpowiednich warunkach. Transformowane komórki mogą być regenerowane do całych roślin tak, że wybrana forma genu NIM1 aktywuje SAR w roślinach transgenicznych.

A. Konstrukcja roślinnych kaset ekspresyjnych

Sekwencje genów mających ulec ekspresji w roślinach transgenicznych są najpierw składane w kasety ekspresyjne za odpowiednim promotorem mogącym ulegać ekspresji w roślinach. Kaseta ekspresyjna może także obejmować dowolne inne sekwencje wymagane lub wybrane dla ekspresji transgenu. Takie sekwencje obejmują, ale nie ograniczają się do, terminatory transkrypcji, zewnętrzne sekwencje do wzmagania ekspresji takie jak introny, istotne sekwencje, sekwencje mające na celu adresowanie produktu genu do specyficznych organelli i kompartymentów komórki. Te kasety ekspresyjne mogą następnie łatwo być przeniesione do wektorów do transformacji roślin opisanych powyżej. Następujące to opis różnych składników typowych dla kaset ekspresyjnych.

1. Promotory

Wybór promotora stosowanego w kasetach ekspresyjnych określi wzór ekspresji przestrzennej i czasowej transgenu w roślinie transgenicznej. Wybrane promotory będą wyrażać transgeny w specyficznych typach komórek (takich jak komórki naskórka liścia, komórki mezofilu, komórki kory korzenia) i selekcja będzie odbiciem pożądanej lokalizacji akumulacji produktu genu. Odmiennie, wybrany promotor może sterować ekspresją genu w różnych warunkach indukcji. Promotory mają różną moc tzn. zdolność do promowania transkrypcji. W zależności od stosowanego systemu gospodarza, może być stosowany dowolny z odpowiednich promotorów. Poniżej podano nieograniczające przykłady promotorów, które mogą być stosowane w kasetach ekspresyjnych.

a. Ekspresja konstytutywna, promotor CaMV 35S

Konstrukcja plazmidu pCGN1761 jest opisana w opublikowanym zgłoszeniu patentowym EP 0392 225 (przykład 23), które jest tu włączone w postaci odniesienia. pCGN1761 zawiera „podwójny” promotor 35S CaMV i terminator transkrypcji tml z unikalnym miejscem EcoRI między promotorem i terminatorem i ma szkielet typu pUC. Konstruuje się pochodną pCGN1761, która ma zmodyfikowany polilinker, który zawiera miejsca Notl i Xhol oprócz istniejącego miejsca EcoRI. Pochodna jest określana jako pCGN1761ENX. pCGN1761ENX jest użyteczny w klonowaniu sekwencji cDNA lub sekwencji genów (w tym sekwencji ORF mikroorganizmów) w swoim polilinkerze w celu ich ekspresji pod kontrolą promotora 35S w roślinach transgenicznych. Cała kaseta promotor 35S-sekwencja genu-terminator tml tak skonstruowana może być wycięta Hindlll, Sphl, Sall i Xbal od strony 5' promotora i Xbal, BamHI i Bgll 3' w stosunku do terminatora do przeniesienia do wektorów transformacyjnych takich jak opisane poniżej. Co więcej, fragment podwójnego promotora 35S może być usunięty przez cięcie 5'z Hindlll, Sphl, Sall,Xbal lub Pstl, i wycięcie 3'w którymkolwiek z miejsc restrykcyjnych polilinkera (EcoRI, Notl lub Xhol) w celu zastąpienia przez inny promotor. Jeśli jest to pożądane, można zrobić modyfikacje wokół miejsc klonowania przez wprowadzenie sekwencji, które mogą wzmagać translację. To jest szczególnie pożyteczne gdy pożądana jest nadekspresja. Na przykład pCGN1761ENX może być zmodyfikowany przez optymalizację miejsca inicjacji translacji jak opisano w przykładzie 37 Patentu US5,639,949 włączonego tu w postaci odniesienia.

b. Ekspresja pod promotorem regulowanym chemicznie/przez patogen

Podwójny promotor 35S w pCGN1761ENX może być zastąpiony przez każdy inny wybrany promotor, który da odpowiednio wysokie poziomy ekspresji. Jako przykład, jeden z chemicznie regulowanych promotorów opisany w Patencie USA Nr 5,614,395 może zastąpić podwójny promotor 35S. Wybrany promotor korzystnie wycina się z jego źródła za pomocą enzymów restrykcyjnych, ale może zamiennie być amplifikowany za pomocą PCR stosując primery, które niosą odpowiednie końcowe miejsca restrykcyjne. Jeśli podejmuje się amplifikację za pomocą PCR, promotor powinien być ponownie

PL 191 355 B1 sekwencjonowany aby sprawdzić błędy amplifikacji po klonowaniu zamplifikowanego promotora w wektorze docelowym. Regulowany przez związki chemiczne/patogen promotor tytoniu PR-1a wycina się z plazmidu pCIB1004 (konstrukcja, patrz przykład 21 w EP 0 332 104, włączony tu w postaci odniesienia) i przenosi do pCGN1761ENX (Uknes i wsp., 1992). pCIB1004 przecina się Hindlll i powstały fragment oczyszcza się z żelu i klonuje w pCHN1761ENX, z którego usunięto podwójny promotor 35S. Przeprowadza się to przez trawienie Xhol i stępienie polimeraząT4 a następnie cięcie Hindlll i izolację większego fragmentu zawierającego wektor-terminator do którego jest wklonowany fragment promotora pCIB1004. To generuje pochod ną pCGN1 76 1 ENX z promotorem PR-1a i terminatorem tml i między nimi polilinkerem z unikalnymi miejscami EcoRI i Notl. Wybrana sekwencja kodująca może być wstawiona do tego wektora, i produkty fuzji (tzn. promotor-gen-teminator) mogą następnie być przeniesione do dowolnego wybranego wektora do transformacji, w tym do opisanych poniżej. Różne regulatory chemiczne mogą być zastosowane aby zaindukować ekspresję wybranej sekwencji kodującej w roślinach transformowanych sposobem według niniejszego wynalazku, w tym związki benzotidiazolu, kwasu izonikotynowego, i kwasu salicylowego ujawnione w Patentach USA Nr 5,523,311 i 5,614,395.

c. Ekspresja konstytutywna, promotor aktyny

Wiadomo, że kilka izoform aktyny jest wyrażanych w większości typów komórek i w efekcie promotor aktyny jest dobrym wyborem promotora konstytutywnego. W szczególności, promotor z genu ryżu Act1 został sklonowany i scharakteryzowany (McEIroy i wsp. Plant Cell 2:163-171 (1990)). Stwierdzono, że fragment 1,3 kb promotora zawiera wszystkie elementy regulatorowe wymagane do ekspresji w protoplastach ryżu. Co więcej, liczne wektory ekspresyjne oparte na promotorze Act1 zostały skonstruowane specyficznie do stosowania u jednoliściennych (McEIroy i wsp. Mol. Gen. Genet. 231:150-160 (1991)). Włączają one intronl Act1, sekwencje 5' flankujące Adh1 i intron 1 Adh1 (z genu dehydrogenazy alkoholowej kukurydzy), i sekwencjonowane od promotora 35S CaMV. Wektory wykazujące najwyższą ekspresję były fuzjami 35S i intronu Act1 lub sekwencji 5' flankującej Act1 i intronu Act1. Optymalizacja sekwencji wokół inicjatorowego ATG (genu reporterowego GUS) też wzmaga ekspresję. Kasety ekspresyjne promotorowe opisane przez McEIroy i wsp. (Mol. Gen. Genet. 231:150-160 (1991)) mogą być łatwo zmodyfikowane dla ekspresji genów i są szczególnie odpowiednie do stosowania u gospodarzy jednoliściennych. Na przykład fragmentyzawierające promotor usuwa się z konstruktów McEIroy i stosuje do zastąpienia podwójnego promotora 35S w pCGN1761ENX, który jest wówczas dostępny dla insercji specyficznych sekwencji genów. Geny fuzyjne w ten sposób skonstruowane mogą być wówczas przeniesione do odpowiednich wektorów do transformacji. W odrębnym doniesieniu, stwierdzono, że promotor Act1 ryżu wraz ze swoim pierwszym intronem też steruje wysoką ekspresją hodowanych komórek jęczmienia (Chibbar i wsp. Plant CellRep. 12:506-509 (1993)).

d. Ekspresja konstytutywna, promotor ubikwityny

Ubikwityna jest innym produktem genu, o którym wiadomo, że akumuluje się w wielu typach komórek i jego promotor został sklonowany z kilku gatunków do stosowania w roślinach transgenicznych (np. słonecznik - Binet i wsp. Plant Science 79:87-94 (1991) i kukurydza - Christiansen i wsp. Plant Molec. Biol. 12:619-632 (1989)). Promotor ubikwityny kukurydzy został opracowany w układach transgenicznych jednoliściennych i jego sekwencja i wektory skonstruowane do transformacji jednoliściennych są ujawnione w publikacji patentowej EP 0 342 926 (dla Lubrizol), która jest tu włączona w postaci odniesienia. Taylor i wsp. (Plant Cell Rep. 12:491-495 (1993)) opisują wektor (pAHC25), który zawiera promotor i pierwszy intron ubikwityny kukurydzy oraz jego wysoką aktywność w zawiesinach komórek wielu roślin jednoliściennych po wprowadzeniu za pomocą bombardowania mikropociskami. Promotor ubikwityny jest odpowiedni do ekspresji genów w roślinach transgenicznych, w szczególności jednoliściennych. Odpowiednie wektory są pochodnymi pAHC25 lub dowolnego z wektorów do transformacji opisanych w niniejszym zgłoszeniu, zmodyfikowanych poprzez wprowadzenie odpowiedniego promotora ubikwityny i/lub sekwencji intronów.

e. Ekspresja specyficzna w stosunku do korzeni

Inny wzór ekspresji to ekspresja w korzeniach. Odpowiedni promotor korzeni jest opisany przez deFramond (FEBS 290:103-106 (1991)) i także w opublikowanym zgłoszeniu patentowym EP 0452 269, które jest tu włączone w postaci odniesienia. Ten promotor jest przeniesiony do odpowiedniego wektora takiego jak pCGN1761ENX dla wprowadzenia wybranego genui następnie przeniesienia całej kasety ekspresyjnej promotor-gen-terminator do interesującego wektora do transformacji.

PL 191 355 B1

f. Promotory indukowane przez zranienie

Promotory indukowane przez zranienie mogą także być odpowiednie do ekspresji genów. Opisano liczne takie promotory (np. Xu i wsp., Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann i wsp. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohreiner i Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek i wsp., Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), Warner i wsp. Plant J. 3:191-201 (1993)) i wszystkie są odpowiednie do stosowania z niniejszym wynalazkiem. Logemann i wsp. opisują sekwencje flankujące 5' genu wun1 dwuliściennego ziemniaka. Xu i wsp. pokazują, że indukowalny przez zranienie promotor z dwuliściennego ziemniaka (pin2) jest aktywny w jednoliściennym ryżu. Co więcej, Rohrmeier i Lehle opisują klonowanie cDNA Wip1 kukurydzy, który jest indukowany przez zranienie i który może być stosowany do izolacji odpowiedniego promotora stosując standardowe techniki. Podobnie, Firek i Warner i wsp. opisali indukowany przez zranienie gen z jednoliściennego Asparagus officinalis, który jest wyrażany w lokalnych miejscach inwazji przez zranienie i patogeny. Stosując techniki klonowania dobrze znane w dziedzinie, te promotory można przenieść do odpowiednich wektorów, połączyć z genami dotyczącymi niniejszego wynalazku i zastosować do ekspresji tych genów w miejscach zranienia roślin.

g. Preferowana ekspresja w rdzeniu

Zgłoszenie patentowe WO 93/07278, które jest tu włączone w postaci odniesienia, opisuje izolację genu trpA kukurydzy, który jest preferencyjnie eksprymowany w komórkach rdzenia. Zaprezentowano sekwencję genu i promotora sięgającą do -1726 bp od startu transkrypcji. Stosując standardowe techniki biologii molekularnej ten promotor lub jego części może być przeniesiony do wektora takiego jak pCGN1761, gdzie może zastąpić promotor 35S i może być stosowany do sterowania ekspresją obcego genu w sposób preferowany w rdzeniu. Faktycznie, fragmenty zawierające promotor preferowany w rdzeniu lub jego części może być transferowany do dowolnego wektora i zmodyfikowany do wykorzystania w roślinach transgenicznych.

h. Ekspresja specyficzna w stosunku do liści

Gen kukurydzy kodujący karboksylazę fosfoenolową (PEPC) opisali Hudspeth i Grula (Plant Molec. Biol 12:579-589 (1989)). Stosując standardowe techniki biologii molekularnej promotor tego genu może być stosowany do sterowania ekspresją w sposób specyficzny w stosunku do liści w roślinach transgenicznych.

2.Terminatory transkrypcji

Dostępne są różnorodne terminatory transkrypcji do stosowania w kasetach ekspresyjnych. Są one odpowiedzialne za terminację transkrypcji za transgenem i jego prawidłową poliadenylację. Odpowiednie terminatory transkrypcji to te, o których wiadomo, że działają w roślinach i obejmują terminator 35S CaMV, terminator tml, terminator syntazy nopaliny i terminator rbcS E9 grochu. Mogą one być stosowane zarówno wjednoliściennych i dwuliściennych.

3.Sekwencje do wzmagania lub regulacji ekspresji

Znaleziono liczne sekwencje, które wzmagają ekspresję genówz obrębu jednostki transkrypcyjnej i te sekwencje mogą być użyte wrazz genami niniejszego wynalazku do zwiększenia ich ekspresji w roślinach transgenicznych.

Stwierdzono, że różne sekwencje intronów wzmagają ekspresję wszczególności w komórkach jednoliściennych. Na przykład stwierdzono, że introny genu Adh1 kukurydzy znacząco wzmagają ekspresję genu typu dzikiego pod jego odpowiednim promotorem gdy są wprowadzone do komórek kukurydzy. Stwierdzono, że intron 1 jest szczególnie skuteczny i wzmaga ekspresję w konstruktach fuzyjnych z genem acetylotransferazy chloramfenikolu (Callis i wsp., Genes Develop. 1:1183-1200 (1997)). W tym samym układzie eksperymentalnym intron z genu kukurydzy bronze1 miał podobny efekt na wzmaganie ekspresji. Sekwencje intronów rutynowo włączano do wektorów do transformacji roślin, typowo w obrębie nie ulegającego translacji lidera.

Wiadomo też, że pewna ilość nie ulegających translacji sekwencji liderów pochodzących z wirusów też wzmaga ekspresję,i są one szczególnie skuteczne w komórkach dwuliściennych. Specyficznie, pokazano, że sekwencje liderowe z wirusa mozaiki tytoniu (TMV, sekwencja „W”), wirusa chlorotycznej plamistości kukurydzy (MCMV) i wirusa mozaiki lucerny (AMV) są skuteczne we wzmaganiu ekspresji (np. Gallie i wsp. Nucleic Acids Res. 15:8693-8711 (1987); Skuzeski i wsp. Plant Molec. Biol.15:65-79(1990)).

4. Adresowanie produktu genu w obrębie komórki

Wiadomo, że istnieją różne mechanizmy adresowania produktów genów u roślin i sekwencje kontrolujące działanie tych mechanizmów zostały dość szczegółowo scharakteryzowane. Na przykładadresowanie produktów genów do chloroplastów jest kontrolowane przez sekwencje sygnałową znajdowaną na

PL 191 355 B1

N-końcu różnych białek, która jest odcinana w czasie importu do chloroplastów dając dojrzałe białko (np. Cornai i wsp. J. Biol. Chem. 263:15104-15109 (1988)). Te sekwencje sygnałowe mogą być połączone w postaci fuzji do heterologicznych produktów genów aby uskutecznić import heterologicznych produktów genów do chloroplastu (van den Broeck i wsp. Nature 313:358-363 (1985)). DNA kodujący odpowiednie sekwencje sygnałowe może być wyizolowany z 5' końców cDNA kodujących białko RUBISCO, białko CAB, enzym syntazy EPSP, białko GS2 i wiele innych białek, o których wiadomo, że są zlokalizowane w chloroplastach. Patrz też część pt. „Ekspresja z adresowaniem do chloroplastów” w przykładzie 37 Patentu US Nr 5,639,949.

Inne produkty genów zlokalizowane są do innych organelli takich jak mitochondrium i peroksysom (np. Unger i wsp. Plant Molec. Biol. 13:411-418 (1989)). cDNA kodujące te produkty mogą być manipulowane aby zapewnić adresowanie heterologicznych produktów genów do tych organelli. Przykłady takich sekwencji to kodowane w jądrze ATPazy i specyficzne dla mitochondriów izoformy aminotransferazy asparaginianowej. Adresowanie do ciał białkowych komórek opisali Rogers i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6512-6516 (1985)).

W dodatku scharakteryzowano sekwencje, które powodują adresowanie produktów genów do innych kompartymentów komórek. N-końcowe sekwencje są odpowiedzialne za adresowanie do ER, apoplastu, i zewnątrzkomórkowej sekrecji z komórek aleuronu (Koehler i Ho, Plant Cell 2:769-783 (1990)). Dodatkowo, sekwencje N-końcowe wraz z sekwencjami C-końcowe są odpowiedzialne za adresowanie produktów genów (Shinsh i wsp. Plant Molec. Biol. 14:357-368 (1990)).

Poprzez fuzję odpowiednich sekwencji adresujących opisanych powyżej do interesujących sekwencji transgenu jest możliwe nakierowanie produktu transgenu do dowolnego narządu lub kompartymentu komórki. Na przykład do adresowania do chloroplastów sekwencja sygnałowa chloroplastów z genu RUBISCO, genu CAB, genu syntazy ESPS, lub genu GS2 jest łączona w postaci fuzji w zgodnej fazie do N-końcowej ATG transgenu. Wybrana sekwencja sygnałowa powinna objąć znane miejsce cięcia i skonstruowana fuzja powinna uwzględnić ewentualne aminokwasy po miejscu cięcia, które są wymagane do cięcia. W niektórych przypadkach to wymaganie może być spełnione przez dodanie niewielkiej liczby aminokwasów pomiędzy miejscem cięcia i ATG transgenu lub alternatywnie zastąpienie pewnych aminokwasów w obrębie sekwencji transgenu. Fuzje skonstruowane dla importu do chloroplastów mogą być badane pod kątem skuteczności pobierania przez chloroplasty przez translację in vitro transkrybowanych in vitro konstruktów, a następnie pobieranie przez chloroplasty in vitro stosując techniki opisane przez Bartlett i wsp. w: Edelmann i wsp. (red) i Wasmann i wsp. Mol. Gen. Genet. 205:446-453 (1986). Te techniki konstrukcji są dobrze znane w dziedzinie i są równie dobrze stosowane do mitochondriów i peroksysomów.

Opisane powyżej mechanizmy do adresowania komórkowego mogą być stosowane nie tylko ze swoimi odpowiednimi promotorami ale też wraz z heterologicznymi promotorami tak, by uzyskać specyficzny cel adresowania w komórkach pod transkrypcyjną regulacją promotora, który ma wzór ekspresji inny niż promotora, z którego pochodzi sygnał adresujący.

B. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin

Liczne wektory do transformacji dostępne do transformacji roślin są znane osobom o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie transformacji roślin, a geny istotne dla wynalazku mogą być stosowane wraz z dowolnymi takimi wektorami. Selekcja wektora będzie zależała od preferowanej techniki transformacji i docelowego gatunku do transformacji. Dla pewnych docelowych gatunków mogą być korzystne różne markery selekcyjne na antybiotyki lub herbicydy. Markery selekcyjne rutynowo stosowane w transformacji obejmują gen nptll, który nadaje oporność na kanamycynę i pokrewne antybiotyki (Messing i Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan i wsp., Nature 304:184-187 (1983)), gen bar, który nadaje oporność na herbicyd fosfinotricyną (White i wsp., Nucl. Acids. Res. 18:1062 (1990), Spencer i wsp. Theor. Appl.Genet. 79:625-631 (1990)), gen hph, który nadaje oporność na antybiotyk hygromycynę (Blochinger i Diggelman, Mol. Cell Biol 4:2929-2931), i gen dhfr, który nadaje oporność na metotreksat (Bourouis i wsp., EMBO J. 2(7) 1099-1104 (1983)) i gen EPSPS, który nadaje oporność na glifosan (Patenty USA Nr 4,940,935 i 5,186,642).

1. Wektory odpowiednie do transformacji Agrobacterium

Dostępnych jest wiele wektorów do transformacji stosując Agrobacterium tumefaciens. Typowo zawierają one wektory takie jak pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984). Poniżej opisano konstrukcje dwóch wektorów odpowiednich do transformacji Agrobacterium.

PL 191 355 B1

a. pCIB200 i pCIB2001

Wektory binarne pCIB200 i pCIB2001 są stosowane do konstrukcji zrekombinowanych wektorów do stosowania z Agrobacterium i mogą być skonstruowane w następujący sposób. pTJS75kan stworzono przez trawienie pTJS75 Narl (Schmidhauser i Helinski, J. Bacteriol. 164:446-455 (1985)) pozwalając na wycięcie genu oporności na tetracyklinę, a następnie insercję fragmentu Accl z pUC4K niosącego NPTIl (Messing i Vierra, Gene 19:259-268 (1982), Bevan i wsp., Nature 304:184-187 (1983); McBride i wsp., Plant Molecular Biology 14:266-276 (1990)). Linkery Xhol wligowano do fragmentu EcoRV pCIB7, który zawiera lewe i prawe sekwencje graniczneTDNA, selekcyjny marker roślinny gen hybrydowy nos/nptll i polilinker pUC (Rothstein i wsp., Gene 53:151-161 (1987)) i fragment strawiony Xhol wklonowano do strawionego Sall pTJS75kan aby stworzyć pCIB2000 (patrz też EP-A-332 104, przykład 19). pCIB2000 zawiera następujące unikalne miejsca restrykcyjne w polilinkerze: EcoRI, Sstl, Kpnl, Bglll, Xbal i SalI. pCIB2001 jest pochodną pCIB2000, która jest stworzona przez insercję dodatkowych miejsc restrykcyjnych do polilinkera. Unikalne miejsca restrykcyjne w polilinkerze pCIB2001 to EcoRI, Sstl, Kpnl, Bglll, Xbal, SalI, Mlul, Bcll, Avrll, Apal, Hpal i Stul. pCIB2001 oprócz posiadania tych unikalnych miejsc restrykcyjnych także ma selekcję na kanamycynę u bakterii i roślin, prawe i lewe sekwencje graniczne T-DNAdla transformacji z udziałem Agrobacterium, pochodzącą od RK2 funkcję trfA do mobilizacji między E. coli i innymi gospodarzami i funkcje OriT i OriV także z RK2. Polilinker pCIB2001 jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zwierających swoje własne sygnały regulacyjne.

b. pCIB10i jego pochodne do selekcji na hygromycynie

Binarny wektor pCIB10 zawiera gen kodujący oporność na kanamycynę dla selekcji u roślin, prawe i lewe sekwencje graniczne T-DNA i ma sekwencje z plazmidu pRK252 o szerokim zakresie gospodarza, co pozwala mu na replikację zarówno w E. coli i Agrobacterium. Jego konstrukcja jest opisana w Rothstein i wsp., Gene 53:153-161 (1987). Różne pochodne pCIB zostały skonstruowane, które włączają gen dla fosfotransferazy hygromycyny B opisany przez Gritz i wsp., Gene 25:179-188 (1983). Te pochodne pozwalają na selekcję transgenicznych komórek roślinnych tylko na hygromycynie (pCIB743) lub hygromycynie i kanamy-cynie (pCIB715, pCIB717).

2. Wektory odpowiednie do transformacji bez Agrobacterium

Transformacja bez zastosowania Agrobacterium obchodzi wymaganie sekwencji T-DNA w wybranym wektorze do transformacji i w efekcie wektory pozbawione tych sekwencji mogą być stosowane oprócz wektorów takich jak opisane powyżej, które zawierają sekwencje T-DNA. Techniki transformacji, które nie opierają się na Agrobacterium obejmują transformację za pomocą bombardowania cząsteczkami, pobieranie przez protoplast (np. PEG i elektroporację) i mikroiniekcję. Wybór wektora zależy w dużym stopniu od preferowanej selekcji dla transformowanego gatunku. Poniżej opisano typowe wektory odpowiednie do transformacji bez udziału Agrobacterium.

a. pCIB3064 pCIB3064 jest wektorem pochodzącym od pUC odpowiednim do bezpośrednich technik przenoszenia genów w połączeniu z herbicydem basta (lub fosfinotricyną). Plazmid pCIB246 zawiera promotor 35S CaMV w funkcjonalnej fuzji z genem GUS E. coli i terminatorem transkrypcji 35S CaMV i jest opisany w opublikowanym zgłoszeniu PCT WO 93/07278. Promotor 35S tego wektora zawiera dwie sekwencje ATG 5' od miejsca startu. Te miejsca są mutowane stosując standardowe techniki PCR tak by usunąć ATG i wygenerować miejsca restrykcyjne Sspl i Pvull. Nowe miejsca restrykcyjne są odległe o 96 i 37 bp od unikalnego miejsca Sqll i 101 i 42 bp odległe od aktualnego miejsca startu. Powstała pochodna pCIB246 jest określana jako pCIB3025. Gen GUS jest następnie wycinany z pCIB3025 przez trawienie SalI i Sacl, końce tępi się i religuje aby uzyskać plazmid pCIB3060. Plazmid pJIT82 uzyskuje się z John Innes Centre, Norwich, i 400 bp fragment Smal zawierający gen bar ze Streptomyces viridiochormogenes wycina się i wstawia do miejsca Hpal pCIB3060 (Thompson i wsp., EMBO J. 6:2519-2523 (1987)). To daje pCIB3064, który zawiera gen bar pod kontrolą promotora i terminatora 35S CaMV dla selekcji na herbicyd, gen oporności na ampicylinę (dla selekcji w E. coli) i polilinker z unikalnymi miejscami Sphl, Pstl, Hindlll i BamHI. Ten wektor jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swe własne sygnały regulatorowe.

b. pSOG19i pSOG35 pSOG35 jest wektorem do transformacji, który wykorzystuje gen reduktazy dihydrofolianowej E. coli jako marker selekcyjny nadający oporność na metotreksat. PCR użyto do amplifikacji promotora 35S (ok. 800 bp), intronu 6 z genu Adh1 kukurydzy (ok. 550 bp) i 18 bp sekwencji nie ulegającej translacji lidera GUS z pSOG10. Fragment 250 bp kodujący gen typu II reduktazy dihydrofolianu E. coli

PL 191 355 B1 także zamplifikowano za pomocą PCR i te dwa fragmenty PCR połączono z fragmentem Sacl-Pstl z pB1221 (Clontech), który obejmuje szkielet wektora pUC19 i terminator syntazy nopaliny. Połączenie tych fragmentów wygenerowało pSOG19, który zawiera promotor 35S w fuzji z sekwencją intronu 6, liderem GUS, genem DHFR i terminatorem syntazy nopaliny. Zastąpienie lidera GUS w pSOG19 sekwencją liderowąz wirusa chlorotycznej plamistości kukurydzy (MCMV) wygenerowało wektorpSOG35. pSOG19 i pSOG35 mają gen pUC dla oporności na ampicylinę i mają miejsca Hindlll, Sphl i EcoRI dostępne dla klonowania obcych sekwencji.

C. Transformacja

Po sklonowaniu interesującej sekwencji w układzie ekspresyjnym, jest ona wtransformowywana do komórki rośliny. Sposoby transformacji i regeneracji roślin są dobrze znane w dziedzinie. Stosowano wektory plazmidowe Ti do wprowadzania obcego DNA jak i bezpośrednie pobieranie DNA, liposomy, elektroporację, mikroiniekcję, i mikropociski. Dodatkowo, bakterie z rodzaju Agrobacterium mogą być stosowane do transformacji komórek roślinnych. Poniżej opisano reprezentatywne techniki transformacji roślin zarówno dwuliściennych i jednoliściennych.

1. Transformacja dwuliściennych

Techniki transformacji dwuliściennych są dobrze znane w dziedzinie i obejmują techniki oparte na Agrobacterium i techniki, które nie wymagają Agrobacterium. Techniki bez Agrobacterium obejmują pobieranie egzogennego materiału genetycznego bezpośrednio przez protoplasty lub komórki. Może to być uzyskane przez pobieranie z udziałem PEG lub elekroporację, dostarczanie za pomocą bombardowania mikropociskami lub mikroiniekcje. Przykłady tych technik opisali Paszkowski i wsp., EMBO J. 3:2717-2222 (1984), Potrykus i wsp., Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1987), Reich i wsp., Biotechnology 4:1001-1004 (1986) i Klein i wsp. Nature 327:70-73 (1987). W każdym przypadku stransformowane komórki są regenerowane do całych roślin stosując standardowe techniki znane w dziedzinie.

Technika z udziałem Agrobacterium jest preferowaną techniką transformacji dwuliściennych ze względu na jej wysoką wydajność transformacji i szerokie zastosowanie u wielu różnych gatunków. Transformacja Agrobacterium typowo obejmuje przeniesienie binarnego wektora niosącego obcy interesujący DNA (np. pCIB200 lub pCIB2001) do odpowiedniego szczepu Agrobacterium, co może zależeć od zestawu genów vir niesionych przez szczep gospodarza Agrobacterium albo na współrezydującym plazmidzie Ti, albo na chromosomie (np. szczep CIB542 dla pCIB200 i pCIB2001 (Uknes i wsp. Plant Cell5: 159-169 (1993)). Przeniesienie zrekombinowanego wektora binarnego do Agrobacterium uzyskuje się przez trójrodzicielską procedurę krzyżowania stosując E. coli niosącą zrekombinowany wektor binarny, szczep pomocniczy E. coli niosący plazmid taki jak pRK2013, który jest zdolny do mobilizacji zrekombinowanego binarnego wektora do Agrobacterium poprzez transformację DNA (Hoefgen i Willmizer, Nucl. Acids Res. 16:9877(1988)).

Transformacja docelowego gatunku roślin przez zrekombinowany Agrobacterium na ogół obejmuje kokultywację Agrobacterium z eksplantami z roślin i zachodzi według protokołów dobrze znanych w dziedzinie. Transformowana tkanka jest regenerowana na pożywce selekcyjnej zawierającej marker oporności na antybiotyk lub herbicyd obecny między granicami T-DNA plazmidu binarnego.

Inne podejście do transformacji komórek roślin genem obejmuje strzelanie nieczynnymi lub biologicznie aktywnymi cząsteczkami do tkanek i komórek roślinnych. Ta technika jest ujawniona w Patentach US 4,945,050, 5,036,006 i 5,100,792 dla Sanford i wsp. Na ogół ta procedura obejmuje strzelanie nieczynnymi lub biologicznie czynnymi cząsteczkami do komórek w warunkach skutecznych do penetracji zewnętrznej powierzchni komórki i dających inkorporację do jej wnętrza. Gdy stosowane są bierne cząsteczki, wektor może być wprowadzony do komórki przez powleczenie cząsteczek wektorem zawierającym pożądany gen. Alternatywnie, komórka docelowa może być otoczona przez wektor tak, że wektor jest wnoszony do komórki w ślad za cząsteczką. Biologicznie czynne cząsteczki (np. suszone komórki drożdży, suszone bakterie lub bakteriofag, każdy niosący DNA, który ma być wprowadzony) mogą też być wstrzeliwane do tkanki roślinnej.

2. Transformacja jednoliściennych

Transformacja większości gatunków jednoliściennych też obecnie stała się rutynowa. Korzystne techniki obejmują bezpośrednie przeniesienie genów do protoplastów z zastosowaniem PEG lub technik elektroporacji, i bombardowanie cząsteczkami tkanek kalusa. Transformacje mogą być podjęte z pojedynczym rodzajem DNA lub wieloma rodzajami DNA (tzn. kotransformacja) i obie te techniki są odpowiednie do stosowania z niniejszym wynalazkiem. Kotransformacja może mieć zaletę unikania konstrukcji kompletnego wektora i generowania transgenicznych roślin z niesprzężonymi loci dla interesującego genu i selekcyjnego markera, co pozwala na usunięcie markera selekcyjnego w kolejnych

PL 191 355 B1 generacjach, o ile to by było uważane za pożądane. Jednak wadą stosowania kotransformacji jest mniejsza niż 100% częstość, z którą oddzielne rodzaje DNA są wintergrowane do genomu (Schocher i wsp. Biotechnology 4:1093-1096 (1986)).

Zgłoszenia patentowe europejskie EP 0 292 435, EP 0 392 225 i WO 93/07278 opisują techniki do przygotowania kalusu i protoplastów z wsobnej linii elitę kukurydzy, transformację protoplastów z zastosowaniem PEG lub elektroporacji, i regenerację roślin kukurydzy z transformowanych protoplastów. Gordon-Kamm i wsp. (Plant Cell 2:603-618 (1990)) i Fromm i wsp. (Biotechnology 8:833-839 (1990)) opisują techniki dla transformacji linii kukurydzy pochodzącej od A188 za pomocą bombardowania cząsteczkami. Co więcej, WO 93/07278 i Koziel i wsp.(Biotechnology 11:194-200 (1993)) opisują techniki transformacji wsobnych linii elite kukurydzy za pomocą bombardowania cząsteczkami. Technika ta stosuje niedojrzałe zarodki kukurydzy o długości 1,5 - 2,5 mm długości wycięte z kolby kukurydzy 14-15 dni po zapyleniu i urządzenie PDS-1000He Biolistics do bombardowania.

Transformacja ryżu może być także podjęta za pomocą technik bezpośredniego przenoszenia genów stosując protoplasty lub bombardowanie cząsteczkami. Transformacja z udziałem protoplastów była opisana dla typów Japonica i typów Indica (Zhang i wsp. Plant Cell Rep. 7:379-384 (1988); Shimamoto i wsp. Nature 338:274-277 (1989); Datta i wsp. Biotechnology 8:736-740 (1990)). Oba typy są też rutynowo transformowane stosując bombardowanie cząsteczkami (Christou i wsp. Biotechnology 8:957-962 (1991)).

Zgłoszenie patentowe EP 0 332 581 opisuje techniki transformacji i regeneracji protoplastów Pooidae. Te techniki pozwalają na transformację Dactylis i pszenicy. Co więcej transformację pszenicy opisali Vasil i wsp. (Biotechnology 10:667-674 (1992) stosując bombardowanie cząsteczkami do komórek typu C długotrwałego kalusu zdolnego do regeneracji, a także Vasil i wsp. (Biotechnology 11:1553-1558 (1993)) i Weeks i wsp. (Plant Physiol. 102:667-674 (1992) stosując bombardowanie cząsteczkami niedojrzałych zarodków lub kalusa pochodzącego od niedojrzałych zarodków. Jednak korzystna technika transformacji pszenicy obejmuje transformację pszenicy przez bombardowanie cząsteczkami niedojrzałych zarodków i obejmuje etap wysokiej sacharozy lub wysokiej maltozy przed dostarczeniem genu. Przed bombardowaniem dowolną ilość zarodków (o długości 0,75 - 1 mm) wysiewa się na pożywkę MS z 3% sacharozą (Murashige i Skoog, Physiologia Plantarum 15:474-497 (1962)) i 3 mg/ml 2,4-D dla indukcji somatycznych zarodków, która zachodzi w ciemności. W wybrany dzień bombardowania zarodki usuwa się z pożywki indukcyjnej i umieszcza w osmoticum (tzn. pożywce indukcyjnej z dodaną do pożądanego stężenia sacharozą lub maltozą, typowo 15%). Zarodkom pozwala się na plazmolizę przez 2-3 godziny i następnie bombarduje. Typowe jest 20 zarodków na docelowej płytce, choć nie jest to krytyczne. Odpowiedni plazmid niosący gen (taki jak pCIB3064 lub pSG35) strąca się na cząsteczki złota wielkości mikrometra stosując standardowe procedury. Do każdej płytki strzela się urządzeniem helowym DuPont Biolistics^® stosując ciśnienie przerywające około 1000 psi i stosując standardową siatkę o wielkości oczek 80. Po bombardowaniu zarodki umieszcza się z powrotem w ciemności w celu zregenerowania przez około 24 godziny (nadal na osmoticum). Po 24 godzinach zarodki usuwa się z osmoticum i umieszcza z powrotem na pożywce regeneracyjnej (MS + 1 mg/litr NAA, 5 mg/litr GA), zawierającej także odpowiedni czynnik selekcyjny (10 mg/l basta dla pCIB3064 i 2 mg/l metotreksatu dla pSOG35). Po około 1 miesiącu, rozwinięte pędy przenosi się do większych sterylnych pojemników znanych jako „GA7”, które zawierają MS o połowie stężenia, 2% sacharozę i to samo stężenie czynnika selekcyjnego.

Niedawno opisano transformację jednoliściennych z zastosowaniem Agrobacterium. Patrz WO 94/00977 i Patent US 5,591,616, oba są tu włączone w postaci odniesienia.

Hodowla

Immunomodulowane rośliny uzyskane poprzez transformację genem SAR takie jak postać genu NIM1 mogą być dowolne z szerokiego zakresu gatunków roślin, obejmując jednoliścienne i dwuliścienne, jednak immunomodulowane rośliny stosowane w sposobie wynalazku są korzystnie wybrane z listy rolniczo ważnych roślin docelowych podanych powyżej. Ekspresja wybranej postaci genu NIM1 w kombinacji z innymi cechami ważnymi dla produkcji i jakości może być włączona do linii roślin poprzez hodowlę. Podejścia hodowlane i techniki są znane w dziedzinie. Patrz na przykład Welsh J.R. Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981); Crop Breeding, Wood

D.R. (red) American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1983); Mayo O. The Theory of Plant Breeding wydanie 2. Clarendon Press, Oxford (1987); Singh, D.P., Breeding for Resistance toDiseases and Insect Pests, Springer Verlag NY (1986) i Wricke i Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co, Berlin (1986).

PL 191 355 B1

Genetyczne właściwości wprowadzone do transgenicznych nasion i roślin wymienionych powyżej są przekazywane przez rozmnażanie płciowe lub wzrost wegetatywny, i mogą więc być utrzymane i namnażane u roślin potomnych. Ogólnie, rzeczone utrzymywanie i namnażanie stosują znane metody rolnicze opracowane, aby pasowały do specyficznych celów takich jak uprawa, wysiewanie i zbieranie. Ponieważ rosnący plon jest wrażliwy na atak i zniszczenia tworzone przez owady lub infekcje podejmuje się kroki aby kontrolować choroby roślin, owady, nicienie i inne niesprzyjające stany aby poprawić wydajność. Te obejmują takie mechaniczne kroki jak uprawa gleby lub usuwanie zakażonych roślin jak i stosowanie agrochemikaliów takich jak fungicydy, gametocydy, nematocydy, regulatory wzrostu, środki promujące dojrzewanie i insektycydy.

Wykorzystanie korzystnych właściwości genetycznych roślin transgenicznych i nasion może być także przeprowadzane przez hodowlę roślin, która ma na celu opracowanie roślin o polepszonych właściwościach takich jak tolerancja szkodników, herbicydów lub stresu, poprawiona wartość odżywcza, poprawiona wydajność, lub lepsza budowa powodująca mniejsze straty z pokładania lub rozpadania. Różne etapy hodowlane są określane przez dobrze zdefiniowaną interwencję taką jak wybór linii do krzyżowania, sterowanie zapylaniem linii rodzicielskich, lub wybór odpowiednich roślin potomnych. W zależności od pożądanych właściwości stosuje sią różne kroki hodowlane. Odpowiednie techniki są dobrze znane w dziedzinie i obejmują, ale nie ograniczają się do, hybrydyzacji, chowu wsobnego, krzyżowania wstecznego, krzyżowania wieloliniowego, mieszania odmian, hybrydyzacji międzygatunkowej, techniki aneuploidów itp. Krzyżowe zapylenie rośliny męskosterylnej pyłkiem innej linii zapewnia, że genom męskosterylnej ale żeńskopłodnej rośliny uzyska jednorodne właściwości obu linii rodzicielskich Tak więc transgeniczne nasiona i rośliny mogą być stosowane do wyhodowania ulepszonych linii roślin, które na przykład zwiększają skuteczność konwencjonalnych metod takich jak traktowanie herbicydami lub pestycydami lub pozwalają na nie stosowanie takich metod ze względu na ich zmodyfikowane właściwości genetyczne. Odmiennie można uzyskać nowe rośliny uprawne z polepszoną tolerancją stresu, które ze wzglądu na swoje zoptymalizowane genetyczne „wyposażenie” dają zebrane produkty o lepszej jakości niż produkty, które nie były zdolne do tolerancji porównywalnych niesprzyjających warunków rozwojowych.

W produkcji nasion niezbędnymi cechami są jakość i jednorodność nasion, podczas gdy jakość i jednorodność nasion zebranych przez rolnika nie jest ważna. Jako że jest trudno utrzymywać roślinę uprawną wolną od innej rośliny uprawnej i chwastów aby kontrolować choroby przenoszone przez nasiona i aby uzyskać nasiona z dobrym kiełkowaniem, producenci nasion opracowali dość rozległe i dobrze opracowane praktyki produkcji nasion, są oni doświadczeni w sztuce hodowania, kondycjonowania, i sprzedawania czystych nasion. Tak więc jest powszechną praktyką, że rolnik kupuje nasiona z certyfikatem spełniające specyficzne standardy jakości zamiast stosowania nasion zebranych z własnych plonów. Materiał do namnażania do stosowania jako nasiona jest zwyczajowo traktowany ochronną powłoką zawierającą herbicydy, insektycydy, fungicydy, środki bakteriobójcze, nematocydy, środki mięczakobójcze i ich mieszaniny. Zwyczajowo stosowane powłoki ochronne zawierają takie związki jak kaptan, karboksyna, tiram (TMTD®), metalaksyl (Apron®) i pirimpos-metyl (Actellic®). Jeśli jest pożądane te związki są w jednej formule wraz z przyszłymi nośnikami, związkami powierzchniowo czynnymi lub adiuwantami sprzyjającymi nakładaniu zwyczajowo stosowanymi w sztuce formułowania aby dostarczyć ochronę przeciw uszkodzeniom powodowanym przez bakterie, grzyby lub szkodniki zwierzęce. Powłoki ochronne mogą być stosowane przez impregnowanie materiału do namnażania za pomocą płynnej formuły lub przez powleczenie kombinowaną mokrą lub suchą formułą. Inne metody nakładania są także możliwe takie jak traktowanie skierowane na pąki lub owoce.

Nasiona mogą być dostarczone w worku, pojemniku lub naczyniu złożonym z odpowiedniego materiału do pakowania, worek lub opakowanie, które może być zamykane aby zawierało nasiona. Worek, pojemnik lub naczynie może być określone dla przechowywania krótkoterminowego lub długoterminowego, lub obu, nasion. Przykłady odpowiedniego materiału do pakowania obejmują papier takie jak gruby papier, sztywny lub giętki plastyk lub inny materiał polimeryczny, szkło lub metal. Korzystnie worek, pojemnik lub naczynie składa się z szeregu warstw materiałów do pakowania, tego samego lub różnych typów. W jednej postaci worek, pojemnik lub naczynie jest dostarczone tak aby wykluczać lub ograniczać dostęp wilgoci do naczynia. W jednym przykładzie worek, pojemnik lub naczynie jest szczelnie zamknięte, na przykład za pomocą ciepła, aby zapobiec dostępowi wody lub wilgoci. W innej postaci materiały absorbujące wodę są umieszczane między lub obok warstw materiałów pakujących. W jeszcze innej postaci worek, pojemnik lub naczynie, lub materiał pakujący, z którego jest złożony jest traktowany by ograniczyć, suprymować lub zapobiegać chorobom, zanieczyszczeniu

PL 191 355 B1 lub innym niekorzystnym efektom przechowywania lub transportu nasion. Przykładem takiego traktowania jest sterylizacja na przykład za pomocą środków chemicznych lub ekspozycji na promieniowanie. Objęty przez niniejszy wynalazek jest worek handlowy zawierający nasiona transgenicznej rośliny zawierającej postać genu NIM1 lub białko NIM1 które ulega ekspresji w rzeczonej transformowanej roślinie na wyższych poziomach niż w roślinie typu dzikiego, wraz z odpowiednim nośnikiem, wraz z instrukcjami na etykiecie jak je stosować w nadawaniu oporności o szerokim zakresie roślinom.

Zastosowanie mikrobicydu na immunomodulowane rośliny

Jak tu opisano, sposób według wynalazku ochrony roślin obejmuje dwa etapy: po pierwsze aktywację szlaku SAR aby dostarczyć immunomodulowaną roślinę i po drugie dostarczanie mikrobicydu takim immunomodulowanymroślinomabyuzyskaćsynergistyczniezwiększoną oporność na choroby.

A. Konwencjonalne mikrobicydy

Według sposobu niniejszego wynalazku dowolny handlowy lub konwencjonalny mikrobicyd może być stosowany do immunodulowanych roślin uzyskanych za pomocą dowolnej z trzech dróg opisanych powyżej. Przykłady odpowiednich mikrobicydów obejmują, ale nie ograniczają sią do, następujących środków grzybobójczych: 4-[3-(4-chlorofenylo)-3-(3,4-dimetoksyfenylo)akroilo]morfolina („dimetomorf”) (odnośnik: C. Tomlin (redaktor): The Pesticide Manual, 10 wydanie, Farnhan, UK, 1994, 351-352);

5-metylo-1,2,4-triazolo[3,4-b][1,3]benzotiazol („tricyklazol”), (odnośnik: C. Tomlin (redaktor): The Pesticide Manual, 10 wydanie, Farnhan, UK, 1994, 1017-1018); 3-allyloksy-1,2-benzotiazolo-1,1-dioksyd („probonazol”) (odnośnik: C. Tomlin (redaktor): The Pesticide Manual, 10 wydanie, Farnhan, UK, 1994, 831-832); α-[2-(4-chlorofenylo)etylo]-α(1,1-dimetyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („tebukonazol”), (odnośnik: EP-A-40 345); 1[-[3-(2-chlorofenylo)-2-(4-fluorofenylo)oksyran-2-yl)metylo]1H-1,2,4-triazol (epoksykonazol), (odnośnik: EP-A-196 038); μ-(4-chlorofenylo)-μ-(1 -cyklopropyloetylo-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („cyklopronazol”) (odnośnik: US-4 664 696); 5-(4-chlorobenzylo)-2-2-dimetylo-1-(1H-1,2,4-triazolo-1-ylmetylo)cyklopentanol, („metkonazol”) (odnośnik EP-A-267 778); 2-(2,4-dichlorofenylo)-3(1H-1,2,4-triazol-1-yl)propylo-1,1,2,2-tetrafluoroetyloeter, („tetrakonazol”) (odnośnik: EP-A 234 242); metylo-(E)-2-[2-[6-(2-cyjanofenoksy)pirymidyno-4-yloksy]fenylo]-3-metoksyakrylan, („ICI 5504” „azoksystrobina”) (odnośnik EP-A-382 375); metylo^E^-metoksyimino^-fa^o-tolyloksy^o-tolylo^ctan („BAS 490 F” „metyl krezoksymu”) (odnośnik: EPA 400 417); 2-(2-fenoksyfenylo)-(E)-2-metoksymino-N-metyloacetamid (odnośnik EP-A-398 692); [2-(2,5-dimetylofenoksymetylo)-fenylo]-(E)-2-metoksymino-N-metyloacetamid, (odnośnik: EP-A-398 692); (1R,3S/1S,3R)2,2-dichloro-N-[(R)-1(4-chlorofenylo)etylo]-1-etylo-3-metylocyklopropanokarboksyamid, („KTU3616”) (odnośnik: EP-A-341 475); kompleks polimeru cynkowego manganu etylenobis(ditiokarbaminian) („mankozeb”) (odnośnik US 2 974 156); 1-[2-(2,4-dichlorofenylo)-4-propylo-1,3-dioksolano-2-yl[metylo]-1H-1,2,4-triazol („propikonazol”), (odnośnik GB-1522657); 1-[2-[2-chloro-4-(4-chlorofenoksy)fenylo]-4-metylo-1,3-dioksolan-2-yl-metyl)-1H-1,2,4-triazol („difenokonazol”), (odnośnik: GB-209860); 1-[2-(2,4-dichlorofenylo)pentylo-1H-1,2,4-triazol („penkonazol”) (odnośnik GB-1589852); cis-4-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo]-2,6-dimetylomorfolina („fenpropimorf”) (odnośnik: DE 275212\35); 1-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo-piperydyna („fenpropidyna”) (odnośnik DE: 2752135); 4-cyklopropylo-6-metylo-N-fenylo-2-pirymidynamina („cyprodinil”) (odnośnik: EP-A-310550); ester metylowy (RS)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („metalaksyl”) (odnośnik: GB-1500581); ester metylowy (R)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo) alaniny („R-metalaksyl”), (odnośnik:GB-1500581); 1,2,5,6-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2,1,1]chinolino-4-on („pyrochilon”) (odnośnik GB-1394373); fosfonian wodorku etylu („fosetyl”) (odnośnik: C. Tomlin (redaktor): The Pesticide Manual, 10 wydanie, Farnhan, UK, 1994, 530-532); i wodorotlenek miedzi (odnośnik: C. Tomlin (redaktor): The Pesticide Manual, 10 wydanie, Farnhan,UK, 1994, 229-230).

Wybrany mikrobicyd jest korzystnie nakładany na immunomodulowane rośliny, które mają być chronione w postaci kompozycji z dalszymi nośnikami, środkami powierzchniowo czynnymi lub innymi adjuwantami sprzyjającymi aplikacji zwyczajowo stosowanymi w technologii przygotowywania formuł. Odpowiednie nośniki i adiuwanty mogą być stałe lub płynne i są substancjami zwyczajowo stosowanymi w technologii formulacji; np. naturalne lub regenerowane substancje mineralne, rozpuszczalniki, związki dyspergujące, zwilżacze, lepiszcza, zagęszczacze, związki wiążące lub nawozy.

Korzystny sposób nanoszenia kompozycji mikrobicydu to aplikacja na części rośliny które są nad ziemią, szczególnie na liście (nanoszenie nalistne). Częstość i dawka stosowania zależą od biologicznych i klimatycznych warunków życia patogenu. Mikrobicyd może jednak także penetrować rośliny poprzez korzenie przez ziemię lub przez wodę (działanie ogólnoustrojowe) jeśli miejsce, w którym jest roślina jest impregnowane płynną formułą (np. w hodowli ryżu) lub jeśli mikrobicyd jest wprowadzany w postaci stałej do gleby na przykład w postaci granulek (nanoszenie glebowe). Aby traktować

PL 191 355 B1 nasiona mikrobicyd może być też stosowany do nasion (powlekanie) albo przez impregnację kłączy lub ziaren z płynną formułą mikrobicydu, lub przez powleczenie ich już połączoną mokrą lub suchą formułą. Dodatkowo, w specjalnych przypadkach inne metody aplikacji do roślin są możliwe na przykład traktowanie skierowane na pączki lub owoce.

Mikrobicyd może być stosowany w formie niezmodyfikowanej lub korzystnie wraz z adiuwantami konwencjonalnie stosowanymi w technologii formulacji i jest więc formułowany w znany sposób np. w emulgowalne koncentraty, powlekalne pasty, roztwory do sprejowania lub rozcieńczania, rozcieńczone emulsje, zwilżalne proszki, rozpuszczalne proszki, pyły, granulki, lub przez enkapsulację w np. substancje polimeryczne. Jak z naturą kompozycji, sposoby aplikacji, jak sprejowanie, atomizacja, pylenie, rozproszenie, powlekanie, lub wylewanie, są wybrane w zgodzie z celami i panującymi warunkami. Korzystne stężenia aplikacji mikrobicydu normalnie są od 50 g do 2 kg a.i./ha, korzystnie od100 g do 1000 g a.i./ha, szczególnie od 150 g do 700 g a.i./ha. W razie traktowania nasion stężenia aplikacji są od 0,5 g do 1000 g, korzystnie od 5 g do 100 g a.i. na 100 kg nasion.

Formulacje są przygotowywane w znany sposób, np. przez homogenne zmieszanie i/lub mielenie mikrobicydu z wypełniaczami, np. rozpuszczalnikami, stałymi nośnikami i gdzie odpowiednie, związkami powierzchniowo czynnymi.

Odpowiednie rozpuszczalniki to: aromatyczne węglowodory, korzystnie frakcje zawierające 8 do 12 atomów węgla, np. mieszaniny ksylenu i podstawione naftaleny, ftalany, takie jak ftalan dibutylu lub ftalan dioktylu, alifatyczne węglowodory, jak cykloheksan lub parafiny, alkohole i glikole i ich etery iestry, takie jak etanol, glikol etylenowy, monometyl glikolu etylenowego lub eter monometylu, ketony, takie jak cykloheksanon, silnie polarne rozpuszczalniki takie jak N-metylo-2-pyrrolidon, sulfotlenek dimetylu, lub dimetyloformamid, jak i oleje roślinne lub epoksydowane oleje roślinne, takie jak epoksydowany olej kokosowy lub olej sojowy,lub woda.

Stałe nośniki stosowane np. do pyłów lub dyspergowalnych proszków są normalnie naturalnymi wypełniaczami mineralnymi takimi jak kalcyt, talk, kaolin, motmorylonit lub atapulgit. Aby polepszyć właściwości fizyczne jest też możliwe dodanie wysoce zdyspergowanego kwasu krzemowego lub wysoce zdyspergowanych absorbujących polimerów. Odpowiednie granulowane adsorpcyjne nośniki są typami porowatymi, na przykład kalcyt lub piasek. Dodatkowo wielka liczba pregranulowanych materiałów nieorganicznych lub organicznych może być stosowanych np. w szczególności dolomit lub sproszkowane resztki roślin.

W zależności od natury mikrobicydu odpowiednie związki powierzchniowo czynne to niejonowe, kationowe i/lub anionowe związki powierzchniowo czynne mające dobre właściwości emulgujące, dyspergujące i zwilżające. Określenie „związki powierzchniowo czynne” będzie też zrozumiane jako mieszaniny związków powierzchniowo czynnych.

Szczególnie korzystne adiuwanty promujące aplikację są także naturalnymi lub syntetycznymi fosfolipidami z serii kefalin i lecytyn, np. fosfatydyloetanolamina, fosfatydyloseryna, fosfatydyloglicerol i lizolecytyna.

Kompozycje agrochemiczne na ogół obejmują 0,1 do 99%, korzystnie 0,1 do 95%, aktywnego czynnika mikrobicydalnego 99,9 do 1%, korzystnie 99,9 do 5%, stałego lub płynnego adiuwantu i 0do 25%, korzystnie 0,1 do 25% związku powierzchniowo czynnego.

Podczas gdy produkty komercyjne będą korzystnie formułowane jako koncentraty, końcowy użytkownik będzie na ogół stosował rozcieńczone formuły.

B. Mikrobicydy aktywujące rośliny

Jeśli jest stosowany do immunomodulowanych roślin uzyskanych poprzez drugą lub trzecią powyżej opisaną drogę (wybiórcza hodowla lub inżynieria genetyczna), mikrobicyd może alternatywnie być chemicznym induktorem SAR (mikrobicyd aktywujący rośliny) takim jak związek benzotiadiazolowy, związek kwasu izonikotynowego, lub związek kwasu salicylowego, które są opisane w Patencie US Nr 5,523,311 i 5,614,395. Tak więc dwie metody immunomodulacji są stosowane łącznie. Przez stosowanie mikrobicydów aktywujących rośliny uzyskane poprzez selektywną hodowlę, albo inżynierię genetyczną powstaje w wyniku „ekstraimmunomodulacja” i uzyskana jest synergistyczna wzmożona oporność na choroby.

Jak opisano poniżej immunomodulowane rośliny transgeniczne nadeksprymujące NIM1 reagowały o wiele szybciej i na znacznie niższe dawki BTH, jak wykazała ekspresja genu zPR-1 i oporność na P. parasitica, niż rośliny typu dzikiego. Patrz przykład 35 i analiza typu Northern na figurze 3. Synergistycznie wzmożona oporność na choroby w roślinach nadeksprymujących NIM1 może być uzyskana przy zastosowaniu zaledwie 10 μΜ BTH, stężenia normalnie niewystarczającego dla jakiejkolwiek

PL 191 355 B1 skuteczności. Można uniknąć normalnie fitotoksycznych lub w inny sposób niepożądanych stężeń związków chemicznych indukujących SAR przez wykorzystanie synergii. Dodatkowo można wykorzystać zmianę przebiegu w czasie aktywacji SAR, która zachodzi gdy związki chemiczne indukujące SAR są stosowane do już immunomodulowanych roślin takich jak rośliny nadeksprymujące NIM1. Co więcej, zyski ekonomiczne mogą być uzyskane w wyniku zmiejszonej ilości związków chemicznych wymaganych do dostarczania danego poziomu ochrony roślin.

C. Konwencjonalne mikrobicydy w połączeniu z mikrobicydami aktywującymi rośliny

Dla jeszcze większej oporności na choroby, zarówno konwencjonalny mikrobicyd i mikrobicyd aktywujący roślinę może być stosowany do immunomodulowanych roślin uzyskanych albo poprzez selekcyjną drogę hodowli albo drogę inżynierii genetycznej. To daje jeszcze wyższy poziom synergistycznej oporności na choroby w porównaniu z poziomem oporności na choroby uzyskanym poprzez samą immunomodulację, poprzez immunomodulację plus tylko jeden typ mikrobicydu, lub poprzez równoczesne stosowanie obu typów mikrobicydów (konwencjonalnych i aktywujących rośliny). Patrz na przykład tabela 35 w przykładzie 19.

Ocena oporności na choroby

Ocena oporności na choroby przeprowadzana jest za pomocą sposobów znanych w dziedzinie. Patrz Uknes i wsp. (1993) Molecular Plant Microbe Interactions 6:680-685; Gorlach i wsp., (1996) Plant Cell8:629-643; Alexander i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7327-7331 (1993). Na przykład poniżej opisano kilka reprezentatywnych oznaczeń oporności na choroby.

A. Oznaczenie oporności na Phythophthora parasitica

Oznaczenie oporności na Phytophthora parasitica, organizm powodujący czarne szypułki, jest przeprowadzane na sześciotygodniowych roślinach hodowanych jak opisano w Alexander i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7327-7331 (1990). Rośliny podlewa się, daje się im dobrze odsączyć, i następnie zaszczepia przez podanie 10 ml zawiesiny sporangiów (300 sporangia/ml) do gleby. Zaszczepione rośliny trzyma się w szklarni utrzymywanej w temperaturze 23-25°C w dzień i 20-22°C w nocy. Do oznaczenia używa się indeksu więdnięcia jak następuje: 0=brak objawów; 1=brak objawów; 1=pewna ilość więdnięcia ze zmniejszonym turgorem; 2=wyraźne objawy więdnięcia ale brak gnicia czy karłowacenia; 3=wyraźne objawy więdnięcia z karłowaceniem, ale bez widocznego gnicia łodyg; 4=silne więdnięcie, z wyraźnym gniciem łodygi pewnymi uszkodzeniami układu korzeni; 5=jak 4, ale rośliny bliskie śmierci lub martwe, i z poważnym zmniejszeniem układu korzeni. Wszystkie oznaczenia robi się w sposób ślepy na roślinach ułożonych w sposób losowy.

B. Oznaczenie oporności na Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae pv. tabaci szczep #551 wstrzykuje się dodwóch niższych liści kilku 6-7 tygodniowych roślin w stężeniach 10⁶ lub 3x10⁶ na ml H2O. W każdym punkcie czasowym ocenia się sześć roślin. Rośliny zainfekowane Pseudomonas tabaci ocenia się na 5 punktowej skali ostrości choroby. 5=100% martwej tkanki, 0=brak objawów. Test T (LSD) przeprowadza się na ocenach każdego dnia i grupowania są podane po średniej ocenie choroby. Wartości, po których następuje ta sama litera w dany dzień oceny nie są różne w sposób znaczący statystycznie.

C. Oznaczenie oporności na Cercospora nicotiana

Zawiesinę spor Cercospora nicotiana (ATCC#18366) rozpyla się nieomal aż do spływania na powierzchnię liści. Rośliny utrzymuje się w 100% wilgotności przez 5 dni. Potem rośliny napyla się wodą 5-10 razy dziennie. W każdym punkcie czasowym ocenia się sześć roślin. Cercospora nicotiana ocenia się na podstawie % powierzchni liści wykazujących objawy. Test T (LSD) przeprowadza się na ocenach każdego dnia i grupowania są podane po średniej ocenie choroby. Wartości, po których następuje ta sama litera w ten dzień oceny nie są różne w sposób znaczący statystycznie.

D. Oznaczenie oporności na Peronospora parasitica

Oznaczenie oporności na Peronospora parasitica przeprowadza się na roślinach jak opisano w Uknes i wsp. (1993). Rośliny są szczepione kompatybilnym izolatem P. parasitica przez rozpylanie zawiesiny spor (około 5x10⁴ spor na mililitr). Zaszczepione rośliny inkubuje się w warunkach wilgotnych przy 17°C w komorze do wzrostu z cyklem 14 godz.dzień/10 godz. noc. Rośliny ocenia się po 3-14 dniach, korzystnie 7-12 dniach, po zaszczepieniu, na obecność konidioforów. Dodatkowo kilka roślin z każdego traktowania wybiera się losowo i barwi błękitem laktofenolowym (Keogh i wsp., Trans. Br. Mycol. Soc. 74:329-333 (1980)) dla badań mikroskopowych.

Krótki opis rysunków

Figura 1 jest porównaniem sekwencji białka NIM1 z ΙκΒα z myszy, szczura i świni. Pionowe linie powyżej sekwencji (l) wskazują na identyczność aminokwasów między sekwencją NIM1 i ΙκΒα (wartość

PL 191 355 B1 macierzy wynosi 1,5); dwukropki (:) powyżej sekwencji wykazują wartość podobieństwa >0,5; pojedyncze kropki (.) powyżej sekwencji wskazują na wartość podobieństwa między <0,5 ale >0,0, a wartość <0,0 wskazuje na brak podobieństwa i nie ma wskaźnika powyżej sekwencji (Patrz przykłady). Położenia ssaczych domen ankyrynowych ΙκΒα zidentyfikowano według de Martin i wsp., Gene 152, 252-255 (1995). Kropki w obrębie sekwencji wskazują luki między białkami NIM1 i ΙκΒα. Pięć powtórek ankyryny w ΙκΒα pokazanych jest przez linie przerywane pod sekwencją. Aminokwasy są numerowane względem białka NIM1 z lukami wprowadzanymi gdzie to jest odpowiednie. Znaki plus (+) są umieszczane powyżej sekwencji co 10 aminokwasów.

Figura 2 jest sekwencją aminokwasów złożoną z regionów białka NIM1 (cyfry odpowiadają pozycjom aminokwasów w SEQ ID NO:2) i produktów białkowych EST ryżu (SEQ ID NO:17-24).

Figura 3 przedstawia wyniki analizy Northern przedstawiające krzywą czasową ekspresji genu PR-1 w dzikim typie i liniach nadeksprymujących po traktowaniu wodą lub BTH. RNA przygotowywano z traktowanych roślin i analizowano jak opisano w przykładach. „Ws” to ekotyp Ws Arabidopsis typu dzikiego. „3A”, „5B”, „6E”i „7C”to pojedyncze linie roślin nadeksprymujące NIM1 wyprodukowane według przykładu 21. „ BTH” to traktowanie wodą, „10 BTH” to traktowanie 10 μΜ BTH, „100 BTH” to traktowanie 100 μΜ BTH, „0” to kontrola dnia zero, „1”, „3” i „5” to próbki w dniach 1,3 i 5.

Krótki opis sekwencji z listy sekwencji SEQ ID NO:1 to sekwencja genomowa obejmująca obszar kodującygenu typu dzikiego N I M 1 Arabidopsis .

SEQ ID NO:2 to sekwencja aminokwasów białka typu dzikiego NIM1 Arabidopsis thaliana kodowanego przez region kodujący SEQ IDNO:1.

SEQ ID NO:3 to sekwencja aminokwasów iKBa myszy z figury 1.

SEQ ID NO:4 to sekwencja aminokwasów IKBa szczura z figury 1.

SEQ ID NO:5 to sekwencja aminokwasów IKBa świni z figury 1.

SEQ ID NO:6 to sekwencja cDNA genu N I M 1 Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO:7 i 8 to odpowiednio sekwencja kodująca cDNA i kodowana sekwencja aminokwasów dominującej negatywnej formy białka NIM1mającego reszty alaniny zamiast reszt seryny w pozycjach 55 i 59.

SEQ ID NO:9 i 10 to odpowiednio sekwencja kodująca cDNA i kodowana sekwencja aminokwasów dominującej negatywnej formy białka NIM1mającej N-końcową delecję.

SEQ ID NO:11 i 12 to odpowiednio sekwencja kodująca cDNA i kodowana sekwencja aminokwasów dominującej negatywnej formy białka NIM1mającej C-końcową delecję.

SEQ ID NO:13 i 14 to odpowiednio sekwencja kodująca cDNA i kodowana sekwencja aminokwasów dominującej negatywnej formy białka NIM1mającej zarówno N-końcową i C-końcową delecję.

SEQ ID NO:15 i 16 to odpowiednio sekwencja kodująca cDNA i kodowana sekwencja aminokwasów domeny ankyryny NIM1.

SEQ ID NO:17 to sekwencja aminokwasów 33-155 Rice-1 z figury 2.

SEQ ID NO:18 to sekwencja aminokwasów 215-328 Rice-1 z figury 2.

SEQ ID NO:19 to sekwencja aminokwasów 33-155 Rice-2 z figury 2.

SEQ ID NO:20 to sekwencja aminokwasów 208-288 Rice-2 z figury 2.

SEQ ID NO:21 to sekwencja aminokwasów 33-155 Rice-3 z figury 2.

SEQ ID NO:22 to sekwencja aminokwasów 208-288 Rice-3 z figury 2.

SEQ ID NO:23 to sekwencja aminokwasów 33-155 Rice-4 z figury 2.

SEQ ID NO:24 to sekwencja aminokwasów 215-271 Rice-4 z figury 2.

SEQ ID NO:25 do 32 to primery oligonukleotydowe.

DEFINICJE

Następujące definicje pomogą w zrozumieniu niniejszego wynalazku

Komórka roślinna: jednostka strukturalna i fizjologiczna roślin, złożona z protoplastu i ściany komórkowej. Określenie „komórka roślinna” dotyczy każdej komórki, która jest albo częścią rośliny, albo od niej pochodzi. Niektóre przykłady komórek roślinnych obejmują zróżnicowane komórki, które stanowią część żywej rośliny; zróżnicowane komórki w hodowli; niezróżnicowane komórki w hodowli; komórki niezróżnicowanej tkanki takiej jak kalus lub guzy; zróżnicowane komórki nasion, zarodków, propagul i pyłku.

Tkanka roślinna: grupa komórek roślinnych zorganizowana w jednostkę strukturalną i funkcjonalną. Włączona jest każda tkanka rośliny w roślinie lub hodowli. Określenie obejmuje, choć nie ogranicza się do, całe rośliny, narządy roślin, nasiona roślin, hodowle tkankowe, i każde grupy komórek roślinnych zorganizowane w jednostki strukturalne i/lub funkcjonalne. Zastosowanie tego określenia

PL 191 355 B1 wraz z lub bez specyficznego typu tkanki jak wyliczono powyżej lub w inny sposób objęte przez niniejszą definicjęnie ma na celu wykluczanie dowolnego innego typu tkanki roślinnej.

Protoplast: komórka roślinna bez ściany komórkowej

Roślina potomna: roślina przyszłej generacji wywiedziona na drodze płciowej lub bezpłciowej, która obejmuje, ale nie ogranicza się do, roślin potomnych.

Roślina transgeniczna: roślina mająca stabilnie wbudowany zrekombinowany DNA w swoim genomie.

Zrekombinowany DNA: Dowolna cząsteczka DNA powstała przez łączenie segmentów DNA z różnych źródeł i wyprodukowana z zastosowaniem technologii zrekombinowanego DNA.

Technologia zrekombinowanego DNA. Technologia, która produkuje zrekombinowany DNA in vitro i przenosi zrekombinowany DNA do komórek, w których może on ulegać ekspresji lub namnożeniu (p. Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, red. Juo, CRC Press, Boca Raton(1996)), na przykład przeniesienie DNA do protoplastu (ów) lub komórki (komórek) w różnych postaciach, obejmujące między innymi (1) nagi DNA w postaci kolistej, liniowej lub superhelikalnej; (2) DNA zawarty w nukleosomach lub chromosomach lub jądra lub ich części; (3) DNA skompleksowany lub połączony z innymi cząsteczkami, (4) DNA zamknięty w liposomach, sferoplastach, komórkach lub protoplastach lub (5) DNA przeniesionyz organizmów innych niż organizm gospodarza (np. Agrobacterium tumefaciens). Te i różne inne metody wprowadzania zrekombinowanego DNA do komórek są znane w dziedzinie i mogą być użyte do produkcji transgenicznych komórek lub transgenicznych roślin niniejszego wynalazku.

Technologia zrekombinowanego DNA także obejmuje metody rekombinacji homologicznej opisane w Treco i wsp., WO 94/12650 i Treco i wsp., WO 95/31560, które mogą być zastosowane do zwiększenia aktywności peroksydazy u rośliny jednoliściennej. Specyficznie obszary regulatorowe (np. promotory) mogą być wprowadzone do genomu rośliny w celu zwiększenia ekspresji endogennej peroksydazy.

Także włączone do technologii zrekombinowanego DNA jest wstawienie sekwencji kodującej peroksydazę pozbawionej wybranych sygnałów ekspresji do rośliny jednoliściennej i oznaczenie transgenicznej rośliny jednoliściennej pod kątem wzmożonej ekspresji peroksydazy ze względu na endogenne sekwencje kontrolne u rośliny jednoliściennej. To by spowodowało zwiększenie liczby kopii sekwencji kodujących peroksydazę w obrębie rośliny.

Oryginalna insercja zrekombinowanego DNA do genomu rośliny R⁰ nie jest definiowana jako osiągana za pomocą tradycyjnych metod hodowli roślin ale za pomocą metod technicznych jak tu opisano. Po oryginalnej insercji, transgeniczni potomkowie mogą być namnażani stosując zasadniczo tradycyjne metody hodowli.

Gen hybrydowy: Cząsteczka DNA zawierająca przynajmniej dwie części heterologiczne np. części pochodzące z uprzednio istniejących sekwencji DNA, które nie są połączone w swych uprzednio istniejących stanach, jako że te sekwencje zostały korzystnie wygenerowane stosując technologię zrekombinowanego DNA.

Kaseta ekspresyjna: cząsteczka DNA obejmująca promotor i terminator między którymi może być wstawiona sekwencja kodująca.

Sekwencja kodująca: cząsteczka DNA, która gdy ulegnie transkrypcji i translacji daje powstanie polipeptydu lub białka.

Gen: odrębny obszar chromosomu obejmujący regulacyjną sekwencję DNA odpowiedzialną za kontrolę ekspresji, tzn. transkrypcję i translację, i sekwencję kodującą, która ulega transkrypcji i translacji dając odrębny polipeptyd lub białko.

acd:roślina o przyspieszonej śmierci komórek

AFLP: polimorfizm długości zamplifikowanych fragmentów avrRpt2:gen awirulencji Rpt2, wyizolowany z Pseudomonas syringae BAC: sztuczny chromosom bakterii

BTH: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiadiazolo-7-karbotiowego

CIM: fenotyp odporności konstytutywnej (SAR jest konstytutywnie zaktywowany) cim:roślina zmutowana o konstytutywnej odporności cM:centimorgany cprl: roślina zmutowana konstytutywnie eksprymująca geny PR

Col-O:Arabidopsisekotyp Columbia

Ecs:kombinacje enzymów

PL 191 355 B1

Emwa: Izolat Peronospora parasitica kompatybiliny w ekotypie Ws-O Arabidopsis

EMS: etylo metylo siarczan

INA: kwas 2,6 dichloroizonikotynowy

Ler: Arabidopsis ekotyp Landsberg erecta

Isd: roślina zmutowana o uszkodzeniach symulujących chorobę nahG:hydroksylaza salicylanowa Pseudomonas putida, która przekształca kwas salicylowy do katecholu

NahG: linia Arabisopsis transformowana genem nahG ndr: roślina mutanta o oporności na chorobę niespecyficznym w stosunku do rasy nim: roślina zmutowana o nieindukowalnej odporności

NIM1: gen dzikiego typu biorący udział w kaskadzie transdukcji sygnału SAR

Nim1: zmutowany allel NIM1, nadający roślinie oporność na choroby, także dotyczy zmutowanych roślin Arabidopsis thaliana mających zmutowany allel nim1 NIM1

Noco: izolat Peronospora parasitica kompatybilny na ekotypie Col-O Arabidopsis

ORF: - otwarta ramka odczytu

PCs: kombinacje primerów

PR: związane z patogenezą

SA: kwas salicylowy

SAR: nabyta oporność ogólnoustrojowa

SAR-on: immunomodulowane rośliny, w których SAR jest zaktywowany, typowo wykazujące większą niż dzika ekspresja genu SAR i mające fenotyp oporny na chorobę

SSLP: prosty polimorfizm długości sekwencji

UDS: uniwersalny fenotyp wrażliwości na chorobę

Wela: Izolat Peronospora parasitica kompatybilny z ekotypem Weiningen Arabidopsis

Ws-O: ekotyp Issilewskija Arabidopsis

WT: dziki typ

YAC: sztuczny chromosom drożdży

Przykłady

Wynalazek jest ilustrowany bardziej szczegółowo przez następujące szczegółowe procedury, preparaty i przykłady. Przykłady są tylko dla celów ilustracji i nie mają być uważane za ograniczające zakres niniejszego wynalazku.

Standardowe techniki rekombinowanego DNA i klonowania molekularnego są dobrze znane w dziedzinie i są opisane przez Sambrook i wsp., Molecular Cloning, red. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) i T.J. Silhavy M.L. Bernam i L.W. Enquist Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) i Ausubel F.M. i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, wydane przez Greene Publishing Associates i WileyInterscience (1987).

1. Synergistyczne efekty oporności na chorobę uzyskiwane przez skoordynowane nakładanie na rośliny chemicznego induktora nabytej oporności ogólnoustrojowej z konwencjonalnym mikrobicydem

W tym zestawie przykładów indukowano SAR u roślin przez nałożenie chemicznego induktora SAR takiego jak benzotiodiazol. Dodatkowo aplikowano konwencjonalne mikrobicydy. Rośliny następnie poddawano atakowi różnych chorobotwórczych patogenów. Kombinacja obu metod zwalczania patogenów (w tym chemiczne + mikrobicyd) dawała większą niż addytywna, tzn. synergistyczną oporność na chorobę. Było to określone jako czynnik synergii (SF), tzn. stosunek obserwowanego (O) efektu do oczekiwanego (E).

Oczekiwany efekt (E) podany dla kombinacji aktywnych składników może być opisany przez tak zwany wzór Colby'ego i może być wyliczony jak następuje (Colby, S.R. „Calculating synergistic and antagonistic responses of herbicide combinations”. Weeds15, strony 20-22 (1967)).

ppm = miligramy czynnego składnika (=a.i.) na litr mieszaniny spraju

X = % działania powodowany przez czynny składnik l przy stężeniu aplikacji p ppm aktywnego składnika

Y = % działania powodowany przez czynny składnik II przy stężeniu aplikacji q ppm aktywnego składnika

E = oczekiwany efekt aktywnych składników l + II przy stężeniu aplikacji p + q ppm aktywnego składnika (działanie addytywne)

X+Y

Wzór Colby' ego to : E = X + Y - '

100

PL 191 355 B1

Przykład 1: Działanie przeciwko Erysiphe graminis na jęczmieniu

Resztkowe działanie ochronne: Rośliny jęczmienia o wysokości około 8 cm zostały opryskane aż do momentu wytworzenia kropel wodną mieszaniną (maksymalnie 0,02% czynnika aktywnego) i oprószone 3 do 4 dni później konidiami grzyba. Zainfekowane rośliny hodowano w szklarni w temperaturze 22°. Stopień zakażenia grzybem określano ogólnie po 10 dniach od infekcji.

Tabel a 1

Działanie przeciwko Erysiphe graminis na jęczmieniu składnik l: kwas benzotiodiazolo-7-karboksylowy składnik II: metoconazol

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
skł. l	skł. II	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
1	0,6			0
2	2			40
3	6			89
4		0,6		10
5		2		40
6		6		51
7		20		65
8	0,6	0,6	1:1	37	10	3,7
9	0,6	2	1:3	59	40	1,5
10	0,6	6	1:10	81	51	1,6
11	0,6	20	1:30	78	65	1,2
12	2	6	1:3	78	71	1,1
13	2	20	1:10	98	79	1,2

Tabel a 2

Działanie przeciwko Erysiphe graminis na jęczmieniu składnik l: kwas benzotiodiazolo-7-karboksylowy składnik II: tetraconazol

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1	0,6			14
2	2			27
3		0,6		45
4		2		63
5	0,6	0,6	1:1	70	53	1,3
6	0,6	2	1:3	82	68	1,2
7	2	0,6	3:1	79	60	1,3

PL 191 355 B1

Tabela 3

Działanie przeciwko Erysiphe graminis na jęczmieniu składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: metoconazol

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	Skł. II
1	0,6			0
2	2			33
3		6		17
4		20		33
5		60		50
6	0,6	6	1:10	33	17	1,9
7	0,6	0,6	1:10	50	33	1,5
8	0,6	60	1:100	83	50	1,7

Przykład 2: Działanie przeciwko Colleotrichium lagenarium na Cucumis sativus L.

Po okresie uprawy od 10 do 14 dni rośliny ogórka opryskano mieszaniną przygotowaną ze zwilżalnego sproszkowanego preparatu testowanego związku. Po 3 do 4 dniach rośliny zainfekowano ₅ zawiesiną spor (1,0 x 10⁵ spor/ml) grzyba i inkubowano przez 30 godzin przy wysokiej wilgotności w temperaturze 23°C. Inkubacjękontynuowano następnie przy normalnej wilgotności w 22°C do 23°C. Działanie ochronne oszacowano 7 do 10 dni po infekcji na podstawie stopnia zakażenia grzybem.

Po okresie hodowli 10 do 14 dni rośliny ogórka traktowano przez podanie do gleby mieszaniny opryskowej przygotowanej ze zwilżalnego sproszkowanego preparatu testowanego związku. Po 3 do4 dniach rośliny zainfekowano zawiesiną spor (1,0 x 10⁵ spor/ml) grzyba i inkubowano przez 30 godzin przy wysokiej wilgotności w temperaturze 23°C. Inkubację kontynuowano następnie przy normalnej wilgotności w 22°C. Działanie ochronne oszacowano 7 do 10 dni po infekcji na podstawie stopnia zakażenia grzybem.

Tabela 4

Działanie przeciwko Colleotrichium lagenarium na Cucumis sativa L./podanie na liście składnik I: kwas benzotiodiazolo-7-karboksylowy składnik II: azoksystrobina

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E(oczekiwany)
skł. l	skł. II
1	0,06			0
2	0,2			5
3	2			22
4		0,06		5
5		0,2		9
6		0,6		12
7		6		17
8	0,06	0,06	1:1	16	5	3,2
9	2	0,2	10:1	65	29	2,2
10	2	0,6	3:1	49	31	1,6
11	2	6	1:3	44	35	1,3

PL 191 355 B1

Tabel a 5

Działanie przeciwko Colleotrichium lagenarium na Cucumis sativa L./podanie do gleby składnik l: kwas benzotiodiazolo-7-karboksylowy składnik II: azoksystrobina

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1	0,006			0
2	0,02			40
3	0,06			49
4	0,2			91
5		0,2		0
6		0,6		9
7		2		28
8		6		66
9	0,006	0,2	1:30	11	0	_*
10		0,6	1:100	30	9	3,3
11		2	1:300	83	28	3,0
12	0,02	6	1:300	97	80	1,2
13	0,06	6	1:100	100	82	1,2

* współczynnik synergii SF nie może być obliczony

Tabel a 6

Działanie przeciwko Colleotrichium lagenarium na Cucumis sativa L./podanie na liście składnik l: kwas benzotiodiazolo-7-karboksylowy składnik II: krezoksym metylowy

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1	0,2			3
2	0,6			51
3		2		0
4		20		41
5	0,2	2	1:10	15	3	5
6	0,2	20	1:100	61	43	1,45

PL 191 355 B1

T ab el a 7

Działanie przeciwko Colleotrichium lagenarium na Cucumis sativa L./podanie na liście składnik I: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: azoksystrobina

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1	0,06			16
2	0,2			22
3	6			60
4		2		18
5		6		75
6	0,06	2	1:30	43	31	1,4
7	0,2	2	1:10	57	36	1,6

T ab el a 8

Działanie przeciwko Colleotrichium lagenarium na Cucumis sativa L./podanie do gleby składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: azoksystrobina

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1	0,006			0
2	0,02			6
3	0,06			23
4	0,2			36
5		0,02		1
6		0,06		5
7		0,6		27
8		2		61
9		6		93
10	0,006	0,02	1:3	26	1	26
11	0,006	0,6	1:100	44	27	1,6
12	0,006	2	1:300	84	61	1,4
13	0,02	0,02	1:1	23	7	3,3
14	0,02	2	1:100	77	64	1,2
15	0,06	0,02	3:1	42	24	1,8
16	0,06	2	1:30	92	70	1,3
17	0,2	2	1:10	93	75	1,2

PL 191 355 B1

Przykład 3: Działanie przeciwko Cercospora nicotianae na roślinach tytoniu

Rośliny tytoniu (w wieku 6 tygodni) spryskano roztworem preparatu testowanego związku (stężenie maksymalnie 0,02% czynnika aktywnego). Cztery dni po spryskaniu rośliny zaszczepiono zawiesiną sporangiów Cercospora nicotianae (1 50 000 spor/ml) i trzymano w wysokiej wilgotności przez4 do 5 dni a następnie inkubowano przy normalnej sekwencji dnia i nocy. Oszacowanie objawów w teście oparto na powierzchni liści zarażonych grzybem.

Tabela 9

Działanie przeciwko Cercospora nicotianae na roślinach tytoniu składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: tebukonazol

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1	0,2			0
2	2			17
3	6			55
4	20			78
5		2		0
6		6		0
7	0,2	2	1:10	87	0	_*
8	0,2	6	1:30	97	0	_*
9	2	2	1:1	87	17	5,1
10	2	6	1:3	94	17	5,5
11	6	2	3:1	87	55	1,6
12	6	6	1:1	90	55	1,6
13	20	2	10:1	97	78	1,2
14	20	6	3:1	97	78	1,2

Tabela 10

Działanie przeciwko Cercospora nicotianae na roślinach tytoniu składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: cyprokonazol

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1	2	3	4	5	6	7
1	0,2			0
2	2			17
3	6			55
4	20			78
5		2		0

PL 191 355 B1 ciąg dalszy tabeli 10

1	2	3	4	5	6	7
6		6		0
7	0,2	2	1:10	78	0	_*
8	0,2	6	1:30	84	0	_*
9	2	2	1:1	90	17	5,3
10	2	6	1:3	94	17	5,5
11	6	2	3:1	87	55	1,6
12	6	6	1:1	93	55	1,7
13	20	2	10:1	100	78	1,3
14	20	6	3:1	100	78	1,3

Tabela 11

Działanie przeciwko Cercospora nicotianae na roślinach tytoniu składnik l: kwas benzotiodiazolo-7-karboksylowy składnik II: fenpropimorph

Test nr	mg czynnika aktywnego na hektar	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
skł. l	skł. II	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
0	--	--		0 (kontrolny)
1	0,2			0
2	0,6			3
3	2			69
4	6			79
5		2		13
6		6		23
7		10		42
8	0,2	2	1:10	52	13	4
9	0,2	6	1:30	61	23	2,7
10	0,6	2	1:3	71	16	4,4
11	6	6	1:1	100	83	1,2

PL 191 355 B1

Tabela 12

Działanie przeciwko Cercospora nicotianae na roślinach tytoniu składnik l: kwas benzotiodiazolo-7-karboksylowy składnik II: difenoconazol

Test nr	mg czynnika aktywnego na hektar	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
skł. l	skł. II	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
0	--	--		0 (kontrolny)
1	2			69
2	6			79
3	20			100
4		0,6		3
5		2		23
6		6		32
7	2	0,6	3:1	90	70	1,3
8	6	0,6	10:1	100	80	1,3

Przykład 4: Działanie przeciwko Pyricularia orizae na roślinach ryżu

Rośliny ryżu w wieku około 2 tygodni umieszczono razem z glebą przy korzeniach w pojemniku wypełnionym mieszaniną opryskową (maksymalnie 0,006% czynnika aktywnego). 96 godzin później rośliny ryżu zainfekowano zawiesiną konidiów grzyba. Stopień zakażenia grzybem szacowano poinkubacji zainfekowanych roślin przez 5 dni przy wilgotności względnej 95-100% w temperaturze około 24°C. Tabela 13

Działanie przeciwko Pyricularia orizae na roślinach ryżu składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: KTU 3616

Test nr	mg cz aktywne (pp skł. l	ynnika go na litr m) skł. II	l:ll	% akty O (obserwowany)	wności E (oczekiwany)	SF (współczynnik synergii) O/E
1	6			16
2		0,02		0
3		0,06		28
4		0,2		47
5		0,6		79
6		2		83
7		6		91
8	6	0,02	300:1	42	15	2,8
9	6	0,06	100:1	76	39	1,9
10	6	0,2	30:1	98	55	1,8
11	6	0,6	10:1	98	82	1,2
12	6	2	3:1	100	86	1,2
13	6	6	1:1	98	92	1,1

PL 191 355 B1 ₂

Na poletku o powierzchni 12 m² rośliny ryżu opryskano mieszaniną przygotowaną ze zwilżalnego proszku czynnika aktywnego. Infekcja odbywała się naturalnie. Dla oszacowania wyników mierzono powierzchnię liści zakażonych grzybem 44 dni po oprysku. Uzyskano następujące wyniki:

Tabel a 14

Działanie przeciwko Pyricularia orizae na roślinach ryżu na otwartej przestrzeni składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: pyrokwilon

Test nr	mg czynnika aktywnego na hektar	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
skł. l	skł. II	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
-	--	--		0 (kontrolny)
1	0,25			22
2	0,5			50
3		0,75		46
4		0,5		82
5	0,25	0,75	1:3	80	58	1,4
6	0,5	0,75	1:1,5	85	73	1,2

Rośliny ryżu w wieku około 2 tygodni umieszczono razem z ziemia przy korzeniach w pojemniku wypełnionym mieszaniną opryskową. Stopień zakażenia grzybem szacowano 36 dni później. Stopień zakażenia roślin nie traktowanych odpowiadał 0% aktywności.

Tabel a 15

Działanie przeciwko Pyricularia orizae na roślinach ryżu składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: tricyklazol

Test nr	mg cz aktywne (pp skł. l	ynnika go na litr m) skł. II	l:ll	% akty O (obserwowany)	wności E (oczekiwany)	SF (współczynnik synergii) O/E
1	0,5			65
2	0,25			39
3	0,1			18
4	0,05			5
5		1		74
6		0,5		71
7		0,25		48
8		0,1		32
9	0,25	0,25	1:1	75	68	1,1
10	0,1	0,25	1:2,5	69	57	1,2
11	0,1	0,1	1:1	61	44	1,4
12	0,05	1	1:20	80	75	1,1
13	0,05	0,25	1:5	58	50	1,2

PL 191 355 B1

P r z y k ł a d 5: Działanie przeciwko Colleotrichium sp. (antraknoza) i Cercospora sp. (plamistość liści) na papryce chili.

₂

Wpływ na plon uprawy: Na obszarze około 10 m² (miejsce testu: Cikampek, Jawa, Indonezja) rośliny papryki chili spryskano w sumie siedmiokrotnie w odstępie około 7 dni 500-700 litrami mieszaniny opryskowej na hektar. Trzy dni po pierwszym oprysku rośliny zainfekowano sztucznie grzybem.

Tabela 16

Działanie przeciwko Colleotrichium: oznaczono na podstawie oceny zakażenia na owocach papryki chili po piątym oprysku składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: mancozeb

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1 2	5	100		55 12
3	5	100	1:20	77	59	1,3

Tabela 17

Działanie przeciwko Cercospora: oznaczono na podstawie oceny zakażenia na liściach po szóstym oprysku składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: mancozeb

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1 2	5	100		76 8
3	5	100	1:20	87	78	1,1

Tabela 18

Wpływ na plon uprawy: owoce chili zebrano po szóstym oprysku składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: mancozeb

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	plon w kg na hektar	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1 2	5	100		459 8
3	5	100	1:20	1400	ca 460	ca 3

P r zyk ł a d 6: działanie przeciwko Puccinia recondita na pszenicy

Siedmiodniowe rośliny kukurydzy zostały opryskane aż do momentu wytworzenia kropel mieszaniną przygotowaną z preparatu czynnika aktywnego lub kombinacji czynników aktywnych. Po 4 dniach opryskane rośliny zainfekowano zawiesiną konidiów grzyba, opryskane rośliny inkubowano następnie przez 2 dni przy względnej wilgotności atmosfery 90-100% i 20°C. 10 dni po infekcji oceniono zakażenie grzybem.

PL 191 355 B1

Tabel a 19

Działanie przeciwko Puccinia recondita na pszenicy składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: propioconazol

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1	100	--		0 (kontrolny) 51
2		5		10
3	100	5	20:1	79	56	1,4

Tabel a 20

Działanie przeciwko Puccinia recondita na pszenicy składnik I: kwas benzotiodiazolo-7-karboksylowy składnik II: fenpropidyna

Test nr	kg czynnika aktywnego na hektar	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
skł. l	skł. II	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
-	--	--		0 (kontrolny)
1	6			20
2	20			40
3		20		40
4		60		60
5	6	20	1:3	73	52	1,4
6	6	20	1:10	75	68	1,1

Przykła d 7: Działanie przeciwko Erysiphe graminis na pszenicy ₂

W próbach na polu (10 m²), pszenicę ozimą w fazie wzrostu spryskano mieszaniną opryskową przygotowaną ze zwilżalnego proszku czynnika aktywnego. Infekcja odbywała się naturalnie. 10 dni po infekcji oceniono stopień zakażenia grzybem. Uzyskano następujące wyniki:

Tabela 21

Działanie przeciwko Erysiphe graminis na pszenicy składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: propioconazol

Test nr	g czynnika aktywnego na hektar	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
-	--	--		0 (kontrolny)
1	5			29
2		50		2
3		100		31
4	5	50	1:10	49	32	1,5
5	5	100	1:20	59	51	1,2

PL 191 355 B1

Tabela 22

Działanie przeciwko Erysiphe graminis na pszenicy składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: cyprodinil

P r zyk ł a d 8: Działanie przeciwko Mycosphaerella fijiensis na bananowcach roślin bananowca na poletku 300 m² opryskano z przerwami 17-19 dni mieszaniną opryskową przygotowaną ze zwilżalnego proszku czynnika aktywnego w sumie sześciokrotnie. Infekcja odbywała się naturalnie. Dla oceny wyników zmierzono powierzchnię liści zakażoną grzybem. Uzyskano następujące wyniki:

Tabela 23

Działanie przeciwko Mycosphaerella fijiensis na bananowcach składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: propioconazol

Test nr	g czynnika aktywnego na hektar	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
skł. l	skł. II	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
1	50	--		0 (kontrolny) 19
2		50		26
3	50	50	1:1	46	40	1,15

P r zyk ł a d 9: Działanie przeciwko Alternaria solani na pomidorach

Rośliny pomidora na poletku 7 m² opryskano z przerwami 7 dni mieszaniną opryskową przygotowaną ze zwilżalnego proszku czynnika aktywnego w sumie dziewięciokrotnie. Infekcja odbywała się naturalnie.Dla oceny wyników zmierzono powierzchnie Kinga zakażoną grzybem. Uzyskano następujące wyniki:

PL 191 355 B1

Tabela 24

Działanie przeciwko Alternaria soleni na pomidorach na otwartej przestrzeni składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: cyprodynil

Test nr	g czynnika aktywnego na hektar	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
skł. l	skł. II	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
-	--	--		0 (kontrolny)
1	2,5			32
2		12,5		30
3		25		51
4	2,5	12,5	1:5	79	53	1,5
5	2,5	25	1:10	80	67	1,2

Przykład 10: działanie przeciwko Phytophora infestans na pomidorach

Rośliny pomidora odmiany „Roter Gnom”zostały opryskane aż do momentu wytworzenia kropel mieszaniną przygotowaną z preparatu czynnika aktywnego lub kombinacji czynników aktywnych. Po 4 dniach opryskane rośliny zainfekowano zawiesiną sporangiów grzyba, a następnie inkubowane wszafce przez 2 dni w 18-20°C i przy wilgotności względnej atmosfery 90-100%. 5 dni po infekcji oceniono zakażenie grzybem. Uzyskano następujące wyniki:

Tabela 25

Działanie przeciwko Phytophora infestans na pomidorach składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: metalaksyl

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
skł. l	skł. II	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
-	--	--		0 (kontrolny)
1	5			14
2	25			36
3	100			61
4	500			72
5		0,1		13
6		1		23
7		10		35
8		50		68
9	5	0,1	50:1	50	25	2,0
10	5	1	5:1	62	34	1,8
11	5	10	1:2	87	44	2,0
12	5	50	1:10	84	73	1,2
13	25	50	1:2	92	80	1,2
14	100	10	10:1	85	75	1,1
15	100	50	2:1	95	88	1,1
16	500	10	50:1	97	82	1,2

PL 191 355 B1

Tabel a 26

Działanie przeciwko Phytophora infestans na pomidorach składnik l: kwas benzotiodiazolo-7-karboksylowy składnik II: metalaksyl

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
skł. l	skł. II	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
-	--	--		0 (kontrolny)
1	0,1			0
2	0,5			9
3	1			22
4	5			45
5		1		13
6		10		33
7		50		63
8		100		83
9	0,1	1	1:10	36	13	2,8
10	0,5	1	1:2	29	21	1,4
11	1	1	1:1	57	32	1,8
12	1	10	1:10	79	48	1,6
13	5	1	5:1	61	52	1,2

Przykład 11: Działanie przeciwko Pseudoperonospora cubensis na ogórkach

16-19 dniowe rośliny ogórka („Wisconsin”) zostały opryskane aż do momentu wytworzenia kropel mieszaniną przygotowaną z preparatu czynnika aktywnego lub kombinacji czynników aktywnych. Po 4 dniach opryskane rośliny zainfekowano zawiesiną sporangiów Pseudoperonospora cubensis (szczep 365, Ciba; maksymalnie 5000 na ml), opryskane rośliny inkubowano następnie przez 1-2 dni w 18-20°C i przy wilgotności względnej atmosfery 70-190%. 10 dni po infekcji oceniono stopień zakażenia grzybem i porównano z zakażeniem roślin niepryskanych. Uzyskano następujące wyniki:

Tabel a 27

Działanie przeciwko Pseudoperonospora cubensis na ogórkach składnik I: kwas benzotiodiazolo-7-karboksylowy składnik II: metalaksyl

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1	2	3	4	5	6	7
-	--	--		0 (kontrolny)
1	0,05			0
2	0,5			6
3	5			66
4		0,5		31

PL 191 355 B1 ciąg dalszy tabeli 27

1	2	3	4	5	6	7
5		5		66
6		50		91
7	0,05	0,5	1:10	66	31	2,1
8	0,05	5	1:100	83	66	1,3
9	0,5	0,5	1:1	83	35	2,4
10	0,5	5	1:10	83	68	1,2

Przykład 12: Działanie przeciwko Peronospora tabacina na roślinach tytoniu

Rośliny tytoniu (w wieku 6 tygodni) spryskano roztworem preparatu testowanego związku. Cztery dni po spryskaniu rośliny zaszczepiono zawiesiną sporangiów grzyba i trzymano w wysokiej wilgotności przez 4 do 5 dni a następnie inkubowano przy normalnej sekwencji dnia i nocy. Oszacowanie objawów w teście oparto na powierzchni liści zarażonych grzybem. Stopień zakażenia nieopryskanych roślin odpowiada 0% aktywności.

Tabela 28

Działanie przeciwko Peronospora tabacina na roślinach tytoniu składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: dimethomorph

Test nr	mg czynnika aktywnego na litr (ppm)	l:ll	% aktywności	SF (współczynnik synergii) O/E
O (obserwowany)	E (oczekiwany)
skł. l	skł. II
1	0,03			14
2	0,1			34
3	0,3			88
4		0,3		52
5		1		52
6	0,03	1	1:33	74	59	1,3
7	0,1	0,3	1:3	92	68	1,4
8	0,1	1	1:10	95	68	1,4

Przykład 13: Działanie przeciwko Peronospora parasitica na Arabidopsis thaliana

Czynniki grzybobójcze metalaksyl, fosetyl i wodorotlenek miedzi oraz aktywator SAR ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego (BTH), przygotowane w stężeniu czynnika aktywnego (ai) odpowiednio 25%, 80%, 70% i 25% z nośnikiem w postaci zwilżalnego proszku, naniesiono w postaci rzadkiej mgły na liście trzytygodniowych roślin. Sam proszek zwilżalny zastosowano jako kontrolę. Trzy dni później rośliny zaszczepiono zawiesiną konidiów Peronospora parasitica tak, jak opisali to Delaney i wsp. (1995). Rośliny Ws zaszczepiono odpowiednim izolatem P. parasitica Emwa (1-2 x 10⁵spor/ml); rośliny Col zaszczepiono odpowiednim izolatem P. parasitica Noco2 (0,5-1x 10⁵ spor/ml). Po inkubacji rośliny przykryto dla zachowania wysokiej wilgotności i umieszczono w komorze hodowlanej Percival w 17°C z cyklem 14 godzin dzień/10 godzin noc (Uknes i wsp., 1993). Tkankę zebrano 8 dni po zaszczepieniu.

Postąp infekcji grzybem śledzono przez 12 dni przez oglądanie pod mikroskopem dysekcyjnym dla obserwacji rozwoju konidioforów (Delaney i wsp. (1994); Dietrich i wsp. (1994)). Wcelu obserwacji wzrostu grzyba w tkance liścia zastosowano barwienie błękitem laktofenylotrypanowym pojedynczych liści. Wzrost grzyba oznaczono ilościowo przy użyciu sondy rRNA grzybowego uzyskanej przez PCR według White i wsp. (1990; PCR Protocols: A guide to methods and Application, 315-322) przy użyciu

PL 191 355 B1 starterów NS1 i NS2 oraz DNA P. parasitica EmWa jako matrycy. RNA oczyszczano z zamrożonej tkanki metodą ekstrakcji fenolem/chloroformem po wytrącaniu chlorkiem litu (Lagrimini i wsp.: PNAS, 84: 7542-7546). Próbki (7,5 μg) rozdzielano przez elektroforezę w żelu agarozowym z formaldehydem i przenoszono na filtr nylonowy (Hybond N+, Amersham) tak, jak opisali to Ausbel i wsp. (1987). Hybrydyzację i płukanie prowadzono według Church i Gilbert (1984, PNAS, 81:1991-1995). Względne ilości transkryptu wyznaczano przy użyciu Phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) zgodnie z instrukcjami producenta, nanoszenie próbek normalizowano przez hybrydyzację zdehybrydyzowanego filtru z podlegającym konstytutywnej ekspresji cDNA b-tubuliny Arabidopsis. Stopień zakażenia nieopryskanych roślin odpowiadał 0% zahamowania wzrostu grzyba, uzyskano następujące wyniki:

Tabela 29

Działanie przeciwko Peronospora parasilicaNoCo2 na Arabidopsis thaliana (Col-0) składnik I: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: metalaksyl

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
BTH	metalaksyl	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	--	--	0
1	0,01 mM	--	0
2	--	0,1 mg/l	0
3	0,01 mM	0,1 mg/l	40,7	0

Tabela 30

Działanie przeciwko Peronospora parasitica Emwa na Arabidopsis thaliana(Ws) składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: metalaksyl

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
BTH	metalaksyl	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	--	--	0
1	0,01 mM		20
2	0,003 mM		0
3		2,5 mg/l	74
4		0,5 mg/l	50
5		0,1 mg/l	50
6	0,01 mM	2,5 mg/l	100	90	1,1
7	0,01 mM	0,5 mg/l	95	70	1,4
8	0,01 mM	0,1 mg/l	88	70	1,3
9	0,003 mM	2,5 mg/l	100	75	1,3

PL 191 355 B1

T a b el a 31

Działanie przeciwko Peronospora parasitica Emwa na Arabidopsis thaliana (Ws) składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: fosetyl

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
BTH	fosetyl	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	--	--	0
1	0,01 mM		30
2		1,0 g/l	40
3		0,2 g/l	10
4		0,04 g/l	0
5	0,01 mM	0,1 g/l	100	70	1,4
6	0,01 mM	0,2 g/l	100	40	2,5
7	0,01 mM	0,04 g/l	95	30	3,2

T a b el a 32

Działanie przeciwko Peronospora parasitica Emwa na Arabidopsis thaliana (Ws) składnik l: ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]tiodiazolo-7-karbotiowego składnik II: wodorotlenek miedzi

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
BTH	Cu(OH)2	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	--	--	0
1	0,01 mM	--	30
2		0,01 g/l	0
3	0,01 mM	0,01 g/l	85	30	2,8

Jak widać w tabeli 29 synergistyczne efekty oporności na choroby zostały wykazane w dzikich roślinach Arabidopsis Col-0. Nie zaobserwowano zahamowania wzrostu grzyba przy oddzielnym podziałaniu na rośliny zarówno 0,01 mM BTH jak i 0,0001 g/l metalaksylem, ponieważ stężenia te są normalnie niewystarczające dla uzyskania efektu. Jednakże przy podziałaniu na rośliny obydwoma tymi związkami przy tych, normalnie niewystarczających stężeniach zaobserwowano 40,7% zahamowanie wzrostu grzyba, co jest ewidentnie efektem synergistycznym. Tabele 30-32 ukazują synergistyczne efekty oporności na choroby u dzikich roślin Arabidopsis Ws. Zaledwie 20-30% zahamowanie wzrostu grzyba zaobserwowano przy podziałaniu na rośliny Ws 0,01 mM BTH. Jednakże przy jednoczesnym podziałaniu BTH i metalaksylem, fosetylem lub wodorotlenkiem miedzi na rośliny zaobserwowano synergistyczną oporność na choroby. Te połączone efekty przeciwgrzybowe powodujące zmniejszenie efektywnych stężeń środka grzybobójczego i BTH wymaganych dla zwalczania patogenu pozwalają na zmniejszenie dawki chemicznej wymaganej dla zatrzymania wzrostu grzyba i tym samym redukują częstość uszkodzenia liści związanego z tolerancją chemiczną.

II. Synergistyczne efekty oporności na choroby uzyskane przez zastosowanie konwencjonalnych środków zwalczających mikroorganizmy i/lub chemicznych induktorów nabytej oporności ogólnoustrojowej w roślinach mutantów konstytutywnej odporności (CIM)

W tej grupie przykładów wysokowydajny test hybrydyzacyjny Northern został opracowany dla zidentyfikowania mutantów roślin wykazujących wysoki poziom mRNA PR-1 podczas normalnego wzrostu, z myślą o tym, że mutanty te wykazują również nabytą oporność ogólnoustrojową. Wyizolowano przy użyciu tego testu pewną liczbę mutantów i wykazano, że nie tylko akumulują mRNA PR-1 lecz także PR-2 i PR-5 (Lawton i wsp. (1993); Dietrich i wsp. (1994); i Weyman i wsp. (1995)).

PL 191 355 B1

Mutanty te wykazują również podwyższony poziom SA i są oporne na zakażenie patogenem, co potwierdza użyteczność tej strategii do izolacji mutantów szlaku przekazywania sygnału SAR.

Wyizolowano przy użyciu tego testu dwie klasy mutantów szlaku przekazywania sygnału SAR. Jedną klasę określono jako mutanty Isd (Isd = lesion simulating disease - choroby symulującej uszkodzenia). Ta klasa mutantów, określana jest również jako „cim Klasy l” jak opisano to w WO 94/16077, którego opis jest niniejszym włączony przez referencję w całości. Ta klasa Isd (znana również pod nazwą cim Klasy l) tworzyła na liściach spontaniczne uszkodzenia, akumulowała w podwyższonym stężeniu SA, wykazywała wysoki poziom mRNA PR-1, PR-2 i PR-5 i była oporna na patogeny grzybowe i bakteryjne 9Dietrich i wsp. 1994; Weymann i wsp., 1995).

Druga klasa, zwana cim (cim = constitutive jmmunity - konstytutywna odporność) opisana jest poniżej i wykazuje wszystkie cechy mutantów Isd z wyjątkiem spontanicznych uszkodzeń. Ta druga klasa (cim) odpowiada mutantom „cim Klasy II” omawianym w WO 94/16077. Linia mutantów roślinnych cim3 opisana poniżej zalicza się do tej klasy cim (cim Klasy II) i odpowiada dominującej mutacji o dzikim wyglądzie i wyrażającej stabilne, podwyższone poziomy SA i mRNA genów SAR oraz posiadającej szerokie spektrum oporności na choroby.

Przykład 14: Izolacja i charakteryzacja mutantów cim wykazujących konstytutywną ekspresję genów SAR

1100 pojedynczych mutagenizowanych (EMS) roślin Arabidopsis M2 hodowano w tackach Aracon (Lehie Seeds, Round Rock, TX) w grupach po około 100. Rośliny hodowano tak, jak opisano to w Uknes i wsp., 1993 supra, szczególną uwagę zwracając na uniknięcie nadmiernego nawodnienia i infekcji patogenami. W skrócie, Metro Mix 360 nasycono wodą i autoklawowano trzykrotnie przez 70 minut w porcjach po 10 litrów. Mieszankę dokładnie wymieszano pomiędzy każdym autoklawowaniem. Nasiona wysterylizowano na powierzchni w 20% Clorox przez 5 minut i wypłukano siedmioma zmianami sterylnej wody przed wysianiem. Zasiane nasiona jarowizowano przez 3-4 dni po czym hodowano w komorach przy 9 godzinnym dniu i 15 godzinnej nocy w 22°C. Gdy rośliny osiągnęły wiek trzech do czterech tygodni, jeden lub dwa liście ważące 50 do 100 mg zbierano i izolowano całkowity RNA przy zastosowaniu szybkiej metody minipreparacji RNA (Verwoerd i wsp. (1989) Nuc. Acid Res., 17, 2362). Ekspresję genu PR-1 analizowano przez hybrydyzację Northern (Lagrimini i wsp. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7542-7546; Watd i wsp., 1991). Każda grupa roślin zawierała również kontrole w postaci nie traktowanych roślin A. thaliana Col-0 i oraz traktowanych przez dwa dni INA (0,25 mg/ml). Wszystkie rośliny hodowano jak opisali to Weymann i wsp. (1995).

Zidentyfikowano 80 potencjalnych mutantów wykazujących podwyższone poziomy mRNA PR-1. Po zbadaniu potomstwa wybrano pięć do dalszej charakteryzacji. Potencjalne mutanty cim wykazywały podwyższoną ekspresję genów SAR w nieobecności patogenu lub działania indukującego. Badanie potomstwa potencjalnych mutantów cim potwierdziło, że konstytutywna ekspresja PR-1 jest dziedziczna. Spośród mutantów cim dalej scharakteryzowano dwa: cim2 i cim3 wykazujące najwyższą i najbardziej stabilną ekspresję PR-1.

W krzyżówkach testowych z roślinami Columbia wykorzystano jako marker recesywną cechę braku włosków. Pąki kwiatowe Col-g1 pozbawiono pręcików przed wyrzutem pyłku po czym zaraz, a także następnego dnia podano pyłek mutantów. Rośliny F1 hodowano w glebie, odkrzyżowane potomstwo zidentyfikowano po obecności włosków.

Po krzyżówce cim2i cim3 z ekotypem Col-0 lub La-er zidentyfikowano znaczną część roślin F1 wykazujących wysoką ekspresję genów SAR, co sugeruje, że cechy te są dominujące. W przypadku cim2 niektóre, lecz nie wszystkie rośliny F1 wykazywały konstytutywną ekspresję genów SAR. Takiego wyniku można by oczekiwać gdyby mutacja cim2 była dominująca i występowała u rodzica w układzie heterozygotycznym. Dalsze badania genetyczne mutacji cim2 wykazały ciągłą zmienną segregację w pokoleniu F2, zgodną z hipotezą niepełnej penetracji.

Mutacja cim3 wykazywała w pokoleniu F1 rozkład 1:1, po czym dwa osobniki F1 wykazujące wysoki poziom mRNA PR-1 skrzyżowano wsobnie tworząc populację F2. Rozkład w F2 zbadany przez określenie akumulacji mRNA PR-1 dał 93 rośliny F2 o wysokim poziomie mRNA PR-1 i 25 roślin F2 bez znaczącej akumulacji mRNA R-1, co daje stosunek 3,7:1 (c²=1,77; 0,5>P>0,1), co zgodne jest z hipotezą, że cim3 jest mutacją dominującą w jednym genie. Dalsze krzyżówki potwierdziły, że cim3 dziedziczy się jako mutacja dominująca.

W przypadku cim3 wyjściowa roślina M2 zidentyfikowana w teście i populacja M3 miały normalny wygląd. Jednakże, po krzyżówce wsobnej roślin cim3, niektóre z najlepiej eksprymujących linii

PL 191 355 B1 wykazywały niską płodność. Po krzyżówce testowej z Col-g1 uzyskano rośliny o normalnym wyglądzie i płodności oraz wysokiej ekspresji PR-1.

Wstępnie zidentyfikowane rośliny cim3 miały karłowaty wygląd z cienkimi zniekształconymi liśćmi. Jednakże, rośliny F2 uzyskane w krzyżówce z ekotypem Col-g1 zachowały wysoki poziom ekspresji genów SAR i nie były odróżnialne od roślin dzikich. Sugerowało to, że fenotyp karłowatości i zniekształconych liści spowodowany był przez niezależną mutację niezwiązaną z konstytutywną ekspresją genów SAR. Fenotyp mutanta cim3 zaobserwowano również gdy rośliny hodowano w warunkach sterylnych, co potwierdza, że akumulacja mRNA PR-1 nie była spowodowana przez patogen.

Przykła d 15: Ekspresja genów SAR

Poza PR-1 w mutantach cim3 silnej ekspresji podlegają również dwa inne geny SAR, PR-2 i PR-5. Poziomy ekspresji genów SAR były zmienne wśród potomstwa lecz zawsze ponad 10-krotnie przewyższały nietraktowaną kontrolę i były zbliżone do poziomów uzyskanych po indukującym oporność traktowaniu INA (0,25 mg/ml) roślin dzikich.

Przykła d 16: Analiza kwasu salicylowego

Wykazano wzrost endogennego stężenia SA przy zaindukowanej przez patogen nekrozie u Arabidopsis (Uknes i wsp., 1993 supra). Kwas salicylowy i jego koniugat glukozowy analizowano tak, jak opisali to Uknes i wsp., 1993, tkankę liściową zebrano z 10 roślin cim3 i 10 kontrolnych w wieku 4 tygodni. Zebrano liście z indywidualnych roślin i oznaczono poziom genu PR-1. Poziom SA zmierzono u roślin eksprymujących PR-1. Stężenie wolnego SA u mutanta cim3 było 3 do 4 razy wyższe niż w niezainfekowanych dzikich roślinach Arabidopsis (odpowiednio 233±35 i 69±8 ng/g świeżej masy). Poziom koniugatu glukozowego SA (SAG) był 13,1 raza wyższy u cim3 niż w niezainfekowanych dzikich Arabidopsis (odpowiednio 4519±473 i 344±58 ng/g świeżej masy). Te podwyższone stężenia SA i SAG są porównywalne z poziomami uzyskanymi w tkankach zainfekowanych przez patogeny lub w mutantach cpr.

Przykła d 17: Oporność na choroby

Zbadano mutanta cim3 pod kątem oporności na Peronospora parasitica, czynnik wywołujący u Arabidopsis chorobę mączniaka rzekomego. Trzydzieści roślin cim3 (potwierdzonych przez badanie ekspresji PR-1) i trzydzieści kontrolnych (ekotyp Columbia), każda w wieku około 4 tygodni, zaszczepiono P. parasitica tak, jak opisali to Uknes i wsp., 1992 supra. Siedem dni później zbadano w roślinach sporulację i wybarwiono błękitem trypanowym w celu uwidocznienia struktur grzybowych tak, jak opisali to Keogh i wsp. (1980) Trans. Br. Mycol. Soc. 74, 329-333 oraz Koch i Slusarenko (1990) Plant Cell 2, 437-445. W dzikich roślinach (Col-0) zachodzi wzrost strzępek, konidiów i oospor, podczas gdy dzikie rośliny traktowane INA (0,25 mg/ml) i rośliny cim3 nie wykazują wzrostu grzyba. Odporność nadawana przez mutację cim3 ujawnia się przeważnie w postaci małej grupy martwych komórek w miejscu infekcji patogenem. Ten typ oporności przypomina obserwowany w mutantach Isd (Dietrich i wsp., 1984, supra; Weymann i wsp., 1995, supra) lub roślinach dzikich, w których zaindukowano SAR (Uknes i wsp., 1992, supra). Niekiedy obserwowano pośrednie fenotypy odporności, w tym nekrozę postępująca w ślad za końcówką strzępki w roślinach cim3. Taka nekroza przypomina obserwowaną w dzikich roślinach traktowanych małymi dawkami SA lub INA (Uknes i wsp., 1992, supra, Uknes i wsp., 1993, supra). Nigdy jednak nie zaobserwowano w roślinach cim3 sporulacji, podczas gdy zachodziła ona we wszystkich roślinach kontrolnych. Na niezainfekowanych liściach cim3 nie obserwowano po wybarwieniu błękitem trypanowym spontanicznych uszkodzeń.

Poza opornością na patogen grzybowy P. parasitica rośliny cim3 były również oporne na infekcję bakteryjnym patogenem Pseudomonas syringae DC3000. Sześciotygodniowe rośliny dzikie (± traktowanie INA) i cim3 zaszczepiono zawiesiną P. syringae DC3000 i obserwowano postępy choroby przez oznaczanie wzrostu bakterii ekstrahowanych z zainfekowanych liści z postępem czasu. Różnica miana bakterii pomiędzy Col-0, Col-0 + INA i cim3 w dniu 0 lub dniu 2 nie była statystycznie znacząca. Jednakże przed upływem czwartego dnia w roślinach cim3 zaobserwowano w porównaniu z dzikimi 31-krotne zmniejszenie wzrostu bakterii (P<0,003; Sokal i Rohlf, 1981). Rośliny zbadano również wzrokowo pod kątem objawów choroby. Liście z roślin dzikich wykazywały silną chlorozę, przy czym objawy choroby rozprzestrzeniały się wyraźnie poza wstępną strefę wstrzyknięcia. W przeciwieństwie do nich rośliny dzikie traktowane INA lub rośliny cim3 były praktycznie pozbawione objawów choroby.

W tym przykładzie hodowle Pseudomonas syringae pochodzące z pomidorów DC3000 hodowano na podłożu B Kinga (szalki agarowe lub płynne) z rifampicyną (50 μg/ml) w 28°C (Walen i wsp. (1991) Plant Cell 3, 49-59). Nocną hodowlę rozcieńczano i zawieszano w 10 mM MgCI2 do gęstości 2-5 x 10⁵komórek na ml i wstrzykiwano do liści Arabidopsis. Wstrzyknięcia dokonywano przez utworzenie małej

PL 191 355 B1 dziurki przy użyciu igły nr 28 w połowie liścia i wstrzyknięcie około 250 μl rozcieńczonej zawiesiny bakterii strzykawką 1 cm³. W różnych punktach czasowych pobierano 10 losowych próbek zawierających po 3 losowe wycinki liści pobrane korkoborem nr 1 z 10 roślin z każdej grupy. 3 wycinki liści umieszczano w probówce Eppendorfa z 300 μl 10 mM MgCI₂ i homogenizowano tłuczkiem. Uzyskaną zawiesinę bakterii rozcieńczano odpowiednio i wysiewano na podłoże B Kinga z rifampicyną (50 μg/ml) i hodowano przez 4 dni w 28°C. Kolonie bakterii zliczano i poddawano dane obróbce statystycznej testem t studenta (Sokal i Rohlf (1981), Biometry, 2^nd ed. New York: W.H.Freeman and Company).

Również w tym przykładzie kwas 2,6-dichloroizonikotynowy (INA) zawieszano w sterylnej destylowanej wodzie w stężeniu 25% czynnika aktywnego preparowanego jako zwilżalny proszek (0,25 mg/ml, 325 μΜ Kessmann i wsp. (1994) Annu. Rev. Phytopatol. 32, 439-59). Wszystkie rośliny opryskiwano wodą lub roztworem INA aż do momentu utworzenia kropli.

Przykład 18: Rola SA w ekspresji genów SAR i oporności na choroby

W celu zbadania zależności między SA, ekspresją genów SAR i opornością u mutanta cim3 przeprowadzono krzyżówki z roślinami Arabidopsis eksprymującymi gen hydroksylazy salicylanowej (nahG) (Delaney i wsp., 1994). Te „rośliny NahG” uzyskano przez transformację genu nahG pod kontrolą promotora 35S do Arabidopsis przy użyciu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium. Patrz: Huang, H., Ma, H. (1992) Plant Mol. Biol. Rep. 10, 372-383, włączony tu przez referencję; oraz Delaney i wsp. (1994) Science 266, 1247-1250, włączony tu przez referencję. ArabidopsisCol-nahG niesie dominujący gen oporności na kanamycynę obok dominującego genu nahG, tak więc jako dawcy pyłku użyto Col-nahG. Nasiona f1 nawodniono w wodzie przez 30 minut po czym wysterylizowano powierzchniowo w 10% Clorox, 0,05% Tween 20 przez pięć minut i wypłukano dokładnie w sterylnej wodzie. Nasiona wysiano na podłoże do kiełkowania (GM, podłoże Murashige i Skoog zawierające 10 g/l sacharozy buforowane 0,5 g/l kwasu 2(N-morfolino)etanosulfonowego, pH 5,7 z KOH) zawierające 25 mg/ml kanamycyny dla wyselekcjonowania roślin F1. Patrz: Valvekens i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536-5540. Rośliny F1 oporne na kanamycynę przeniesiono do gleby po 18 dniach. Obecność genu nahG i ekspresja PR-1 zostały we wszystkich doświadczeniach potwierdzone przez analizę hybrydyzacją Northern. Ponieważ zarówno fenotyp cim3, jak i nahG są dominujące, epistaza pomiędzy tymi dwoma genami mogła być analizowana u roślin F1. Siedemdziesiąt roślin F1 z krzyżówki cim3 X nahG analizowano pod kątem ekspresji genów PR-1 i nahG. W analizach ekspresji mRNA hybrydyzacją Northern obecność genu nahG korelowała z supresją ekspresji genów SAR. Obecność mutacji cim3 w każdym osobniku F1 potwierdzono oznaczając poziom mRNA PR-1 w uzyskanych segregantach F2.

W celu stwierdzenia, czy mutacja cim3 jest epistatyczna względem nahG pod względem oporności na chorobę 5 roślin 51 z krzyżówki cim3 X nahG, u których potwierdzono obecność nahG i bark mRNA PR-1 skrzyżowano wsobnie i wysiano 20-30 nasion F2. Ekspresja mRNA nahG i PR-1 była analizowana u osobników z tej populacji F2, które następnie wystawiono na działanie P. parasitica (NoCo2) dla zbadania ich podatności na chorobę. Oporność na chorobę niesiona przez mutację cim3 była eliminowana przez obecność genu nahG, wykazując że nahG jest epistatyczna względem cim3 pod względem fenotypów ekspresji genów SAR i oporności na choroby.

Przykład 19: Synergistyczna oporność na choroby uzyskana przez podawanie mikrobiocydu i/lub BTH mutantom cim

Trzy dni przed zaszczepieniem patogenem podano w postaci mgły na liście czterotygodniowych roślin chemiczny induktor ogólnoustrojowej nabytej oporności BTH (ester S-metylowy kwasu benzo[1,2,3]-tiodiazolo-7-karbotiowego) preparowany jako 25% czynnik aktywny (ai) z nośnikiem w postaci zwilżalnego proszku (Metraux i wsp., 1991) i/lub mikrobiocyd metalaksyl (CGA 48988) preparowany jako 25% ai, lub też sam zwilżalny nośnik. Rośliny zaszczepiono zawiesiną konidiów (1,8 x 10⁵ spor/ml) odpowiedniego patogenu Peronospora parasitica NoCo2. Po infekcji rośliny przykryto w celu utrzymania wysokiej wilgotności oraz umieszczono w komorze hodowlanej Percival w 17°C z cyklem 14 godz. dzień/10 godz. noc (Uknes i wsp., 1993). Tkankę zebrano 8 dni po infekcji.

Wzrost grzyba oznaczono przy użyciu sondy rRNA grzybowego uzyskanej przez PCR według White i wsp. (1990; PCR Protocols: A guide to methods and Application, 315-322) przy użyciu starterów NS1 i NS2 oraz DNA P. parasitica EmWa jako matrycy. RNA oczyszczano z zamrożonej tkanki metodą ekstrakcji fenolem/chloroformem po wytrącaniu chlorkiem litu (Lagrimini i wsp.: PNAS, 84: 7542-7546). Próbki (7,5 μg) rozdzielano przez elektroforezę w żelu agarozowym z formaldehydem i przenoszono na filtr nylonowy (Hybond N+, Amersham) tak, jak opisali to Ausbel i wsp. (1987). Hybrydyzację i płukanie prowadzono według Church i Gilbert (1984, PNAS, 81:1991-1995). Względne

PL 191 355 B1 ilości transkryptu wyznaczano przy użyciu Phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) zgodnie z instrukcjami producenta, nanoszenie próbek normalizowano przez hybrydyzację zdehybrydyzowanego filtru z podlegającym konstytutywnej ekspresji cDNA b-tubuliny Arabidopsis. Stopień zakażenia nieopryskanych roślin odpowiadał 0% zahamowania wzrostu grzyba.

Podanie samego metalaksylu, samego „aktywatora roślin” BTH lub zarówno metalaksylu i BTH mutantom cim3 opisanym powyżej wywoływało efekt oporności na chorobę przewyższający addytywny, czyli synergistyczny. Efekt ten oznaczano jako współczynnik synergii (SF), który jest stosunkiem efektu obserwowanego (O) do oczekiwanego (E). Uzyskano następujące wyniki:

Tabela 33

Działanie przeciwko Peronospora parasitica na Arabidopsis składnik l: mutacja cim3 składnik II: metalaksyl

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
cim3	metalaksyl	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	wt	--	0
1	cim3	--	12,5
2	wt	12,5 mg/l	52,7
3	wt	2,5 mg/l	0
4	wt	0,1 mg/l	0
5	wt	0,02 mg/l	ND
6	cim3	12,5 mg/l	ND	ND	ND
7	cim3	2,5 mg/l	82,2	12,5	6,6
8	cim3	0,1 mg/l	57,8	12,5	4,6
9	cim3	0,02 mg/l	55,6	ND	ND

wt = dziki Col-0 ND= nie oznaczony

Tabela 34

Działanie przeciwko Peronospora parasitica na Arabidopsis składnik l: mutacja cim3 składnik II: BTH

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
cim3	BTH	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	wt	--	0
1	cim3	--	12,5
2	wt	0,1 mM	85,7
3	wt	0,03 mM	20,8
4	wt	0,01 mM	0
5	cim3	0,1 mM	ND	98,2	ND
6	cim3	0,03 mM	73,1	33,3	2,2
7	cim3	0,01 mM	16,6	12,5	1,3

wt = dziki Col-0 ND= nie oznaczony

PL 191 355 B1

Tabel a 35

Działanie przeciwko Peronospora parasitica na Arabidopsis składnik l: mutacja cim3 składnik II: BTHi metalaksyl (M)

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
cim3	BTH+M	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	wt	--	0
1	cim3	--	12,5
2	wt	BTH 0,01 mM + M 0,5 mg/l	100
3	wt	BTH 0,01 mM + M 0,1 mg/l	40,7
4	wt	BTH 0,01 mM + M 0,2 mg/l	ND
5	cim3	BTH 0,01 mM + M 0,5 mg/l	ND	100	ND
6	cim3	BTH 0,01 mM + M 0,1 mg/l	100	53,2	1,9
7	cim3	BTH 0,01 mM + M 0,02 mg/l	77,7	ND	ND

wt = dziki Col-0 ND= nie oznaczony

Jak widać w powyższych tabelach synergistyczne efekty oporności na choroby wykazano w roślinach cim3 przy zastosowaniu samego metalaksylu, zastosowanie samego BTH i zastosowanie kombinacji BTH i metalaksylu. Na przykład, w nietraktowanych roślinach cim3 zaobserwowano 12,5% zahamowanie wzrostu grzyba w porównaniu z nietraktowaną rośliną dziką, wskazuje to, że konstytutywna ekspresja genów SAR w mutancie cim3 koreluje z opornością na chorobę. Jak wykazano jednak w tabeli 30, zastosowanie metalaksylu w stężeniu 0,0001 g/l (stężenie normalnie niewystarczające dla efektywnego działania) w immunomodulowanej (SAR-konstytutywnej) roślinie cim3 powoduje wzrost zahamowania wzrostu grzyba do 57,8%. Współczynnik synergii 4,6 obliczony na podstawie tych danych jasno wykazuje synergistyczny efekt uzyskany przez potraktowanie mikrobiocydem rośliny immunomodulowanej.

Dane przedstawione w tabeli 31 wykazują, że synergia jest również uzyskiwana przez podanie chemicznego induktora ogólnoustrojowej nabytej oporności takiego, jak BTH immunomodulowanej (SAR-konstytutywnej) roślinie cim3. Na przykład, w dzikich roślinach stężenie 0,03 mM BTH jest normalnie niewystarczające do uzyskania efektywnej oporności na chorobę, dając zaledwie 20,8% zahamowania wzrostu grzyba. Jednakże w roślinach cim3 to normalnie niewystarczające stężenie BTH dało 73,1% zahamowania wzrostu grzyba, prawie tak wiele, jak hamowanie uzyskane przy zastosowaniu 0,1 mM BTH, zalecanego wydajnego stężenia. Współczynnik synergii 2,2 obliczony na podstawie danych z tabeli 31 jasno wykazuje synergistyczny efekt uzyskany przez zastosowanie BTH na roślinie immunomodulowanej innymi środkami.

Efekty oporności na chorobę były jeszcze bardziej jaskrawe przy zastosowaniu zarówno BTH, jak i metalaksylu na roślinie cim3. Jak wykazano w przykładzie 13 (tabela 29), w dzikich roślinach nie obserwuje się zahamowania wzrostu grzyba przy oddzielnym podaniu 0,01 mM BTH lub 0,0001 g/l metalaksylu, ponieważ stężenia te są normalnie niewystarczające dla wydajnego działania. Jednakże zastosowanie na roślinie obu tych związków w tych normalnie niewystarczających stężeniach daje obserwowane zahamowanie wzrostu grzyba 40,7%, co jest efektem synergistycznym na dzikich roślinach. Na roślinach cim3 jednoczesne podanie 0,01 mM BTH i 0,0001 g/l metalaksylu dało w rezultacie 100% zahamowanie wzrostu grzyba, jasno wykazując dalej jeszcze posuniętą aktywność synergistyczną.

Tak zatem połączone użycie immunomodulowanych roślin cim i niskich, normalnie nieskutecznych stężeń chemikaliów dla uzyskania oporności na chorobę dostarcza korzyści, które powinny być oczywiste dla specjalistów w naukach rolniczych. Można uniknąć stosowania normalnie toksycznych lub z innych powodów niepożądanych stężeń chemikaliów przez wykorzystanie wykazanych tu synergii. Dodatkowo uzyskać można korzyści ekonomiczne w wyniku zmniejszonych ilości chemikaliów wymaganych dla zapewnienia danego poziomu ochrony roślin.

PL 191 355 B1

III. Synergistyczne efekty oporności na choroby uzyskane przez zastosowanie konwencjonalnych mikrobiocydów i/lub chemicznych induktorów ogólnoustrojowej nabytej oporności na roślinach transgenicznych zawierających formy genu NIM1

Gen NIM1 jest kluczowym składnikiem szlaku ogólnoustrojowej nabytej oporności (SAR) u roślin (Ryals i wsp. 1996). Gen NIM1powiązany jest z aktywacją SAR przez induktory chemiczne i biologiczne oraz, w połączeniu z takimi induktorami, wymagany jest dla uzyskania SAR i ekspresji genów SAR. Lokalizację genu NIM1wyznaczono przy pomocy analizy metodami biologii molekularnej genomu zmutowanych roślin niosących mutację nim1 nadającą roślinom wyjątkową wrażliwość na różnorodne patogeny i uniemożliwiającą im odpowiedź na patogeny i chemiczne induktory SAR. Dziki gen NIM1 Arabidopsis zmapowano i zsekwencjonowano (SEKW. Nr ID:1). Produkt dzikiego genu NIM1 (SEKW. NR ID:2) zaangażowany jest w kaskadę transdukcji sygnału prowadząca do SAR oraz oporności na choroby typu gen-za-gen (Ryals i wsp., 1997). Nadekspresja zrekombinowanej dzikiej formy NIM1daje w efekcie immunomodulowane rośliny o fenotypie konstytutywnej odporności (CIM) i nadaje tym samym oporność na chorobyroślinom transgenicznym. Podwyższony poziom aktywnego białka NIM1 wytwarza ten sam efekt oporności na choroby co indukcja chemiczna z zastosowaniem induktorów chemicznych takich, jak BTH, INA i SA. Patrz: złożony jednocześnie wniosek patentowy USA nr08/880,179, włączony tu przez referencję.

Ponadto, wykazano, że produkt genu NIM1 jest homologiem strukturalnym ssaczego czynnika transdukcji sygnału IkB podklasy a (Ryals i wsp., 1997). Opisano mutacje IkB działające jako superrepresory, lub dominujące mutacje negatywne szlaku regulacji NFkB/IkB. Pewne zmienione formy NIM1 są dominującymi negatywnymi regulatorami szlaku transdukcji SAR. Te zmienione formy NIM1nadają transformowanym nimi roślinom fenotyp odwrotny do fenotypu mutanta nim1, to znaczy że immunomodulowane rośliny transformowane zmienionymi formami NIM1 wykazują konstytutywną ekspresję genów SAR i fenotyp CIM. Patrz: złożony jednocześnie wniosek PCT „Metody użycia genu NIM1 dla nadania oporności na choroby u roślin”włączony tu przez referencję.

Przykład 20: Transformacja roślin klonami kosmidowymi zawierającymi dziki allel genuNIM1

Kosmid D7 (złożony w kolekcji ATCC 25 września 1996 jako ATCC 97736) uzyskano z klonu obejmującego obszar genu NIM1, zawiera zatem dziki allel genu NIM1 (SEKW. NR ID:1). Kosmid E1 również uzyskano z klonu obejmującego obszar genu NIM1, zawiera on zatem również dziki allel genu NIM1(SEKW. NR ID:1). Kosmidy D7 i E1 wprowadzono do Agrobacterium tumefaciensAGL-1 przez transfer koniugacyjny w trójrodzicielskiej krzyżówce ze szczepem pomocniczym HB101 (pRH2.013) tak, jak opisano to we wniosku patentowym USA nr 08/880,179. Kosmidy te wykorzystano do transformacji wrażliwej na kanamycynę linii Arabidopsis mutanta nim1 przy użyciu infiltracji próżniowej (Mindrinos i wsp., 1994, Cell78, 1089-1099). Nasiona z infiltrowanych roślin zebrano i wykiełkowano na szalkach GM agar zawierających 50 mg/ml kanamycyny w roli czynnika selekcyjnego. Siewki, które przeżyły selekcję przeniesiono do gleby około dwa tygodnie po wysianiu.

Rośliny przeniesione do gleby hodowano w fitotronie około tygodnia od przeniesienia. Przy użyciu chromistera rośliny pokryto całkowicie mgłą 300 mM INA. Po dwóch dniach zebrano liście do ekstrakcji RNA i analizy ekspresji PR-1. Rośliny spryskano następnie Peronospora parasitica (izolat EmWa) i hodowano w warunkach wysokiej wilgotności w komorze hodowlanej w temperaturze 19°C za dnia i17°C nocą przy cyklu 8 godz. światła/16 godz. ciemności. Osiem do dziesięciu dni po infekcji grzybem rośliny zbadano i zliczono jako pozytywne lub negatywne pod kątem wzrostu grzyba. W ten sam sposób potraktowano rośliny Ws i nim1jako kontrole w każdym doświadczeniu.

Całkowity RNA ekstrahowano z zebranej tkanki przy użyciu buforu LiCI/fenol (Verwoerd i wsp.,1989, Nucl. Acids Res. 2362). Próbki RNA rozdzielano na żelu agarozowym z formaldehydem i przenoszono na filtry GeneScreen Plus (DuPont). Filtry hybrydyzowano z sondą cDNA PR-1 znakowaną ³²P. Uzyskane filtry eksponowano na kliszy w celu stwierdzenia, które z transformantów były zdolne do zaindukowania ekspresji PR-1 po traktowaniu INA.

W celu stwierdzenia czy którekolwiek z transformantów D7 i E1 nadeksprymowały NIM1na skutek efektu miejsca insercji (pozycyjnego), transformanty pierwotne zawierające kosmidy D7 lub E1 skrzyżowano wsobnie i zebrano nasiona T2. Nasiona z jednej linii E1 i 95 linii D7 wysiano na glebę i hodowano tak, jak opisano powyżej. Gdy rośliny T2 wytworzyły przynajmniej 4 właściwe liście zebrano po jednym liściu z każdej rośliny. RNA wyizolowano z tej tkanki i zbadano pod kątem ekspresji PR-1 i NIM1. Rośliny zaszczepiono następnie P. parasitica(EmWa) i analizowano pod kątem wzrostu grzyba przez 10 dni od infekcji, pewna liczba transformantów wykazała obniżony w porównaniu z normalnym wzrost grzyba, cztery z nic, konkretnie linie D7-2, D7-4, D7-89 i E1-1 wykazały brak widocznego wzrostu

PL 191 355 B1 grzyba. Rośliny wykazujące wyższą od normalnej ekspresję NIM1 i PR-1 i wykazujące oporność na grzyba świadczą o tym, że nadekspresja NIM1 niesie oporność na chorobę.

Przykład 21: Nadprodukcja NIM1 pod kontrolą natywnego promotora

Wytworzono rośliny wyrażające konstytutywnie gen NIM1 poprzez transformacjęroślin Ws typu dzikiego genomowym fragmentem BamHI-Hindlll (SEK NR ID: 1 - zasady 1249-5655) zawierającym sekwencję promotorowąo długości 1,4 kb. Fragment ten sklonowano w pSGCG01 i transformowano do szczepu GV3101 Agrobacterium (pMP90), Koncz i Schell (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396). Rośliny Ws infiltrowano tak, jak opisano poprzednio. Otrzymane w rezultacie nasiona zbierano i wysiewano na agar GM zawierający 50 mg/ml kanamycyny. Siewki, które przeżyły przenoszono do gleby i testowano tak, jak opisano poprzednio dla oporności na izolat Emwa Peronospora parasitica. Wyselekcjonowane rośliny krzyżowano wsobnie i selekcjonowano przez dwa kolejne pokolenia w celu wytworzenia linii homozygotycznych. Nasiona z kilku z tych linii wysiano do gleby i 15-18 roślin z każdej linii hodowano przez trzy tygodnie i testowano ponownie pod kątem oporności na Emwa bez uprzedniego działania indukującymi związkami chemicznymi. Po około 24 godzinach, 48 godzinach i pięciu dniach po zadziałaniu grzybami, tkankę dla każdej linii zbierano, łączono razem i zamrażano. Rośliny pozostawały w pomieszczeniu hodowlanym do pięciu dni po rozpoczęciu hodowli, kiedy testowano je pod kątem oporności na Emwa.

RNA otrzymywano ze wszystkich zebranych próbek i analizowano tak, jak opisano poprzednio (Delaney i wsp., 1995). Filtr hybrydyzowano z sondą dla genu PR-1 Arabidposis(Uknes i wsp., 1992). Pięć z 13 analizowanych transgenicznych linii wykazywało wczesną indukcję ekspresji genu PR-1. Dla tych linii, mRNA PR-1 był widoczny po 24 lub 48 godzinach po zadziałaniu grzybem. Tych pięć linii nie wykazywało również widocznego wzrostu grzybów. Liście barwiono błękitem laktofenolowym tak, jak odpisano (Dietrich i wsp. 1994) w celu potwierdzenia braku grzybni w liściach. Ekspresję genu PR-1 nie była indukowana w innych ośmiu liniach przez 48 godzin i rośliny te nie wykazywały oporności naEmwa.

Zestaw linii opornych testowano również pod kątem zwiększonej oporności na patogen bakteryjny Pseudomonas syringae DC3000 w celu ustalenia spektrum widocznej oporności, jak opisano uprzednio przez Uknes i wsp. (1993). Doświadczenia wykonano zasadniczo tak, jak opisano przez Lawton i wsp. (1996). Wzrost bakteryjny był wolniejszy w tych liniach, które wykazywały również konstytutywną oporność na Emwa. Pokazuje to, że rośliny nadprodukujące gen NIM1 pod swoim natywnym promotorem mają konstytutywną oporność na patogeny.

W celu przeprowadzenia dodatkowej charakterystyki fenotypu CIM w tych liniach, w niezainfekowanych roślinach mierzono wolny i połączony z glukozą kwas salicylowy i barwiono liście błękitem laktofenolowym w celu zbadania obecności mikroskopijnych ubytków. Rośliny oporne krzyżowano na drodze płciowej z mutantami SAR, takimi jak NahG i ndr1w celu ustalenia, w jaki sposób te dominujące negatywne mutacje NIM1 mogą wpływać na zależne od kwasu salicylowego sprzężenie zwrotne.

Przykład 22: Nadprodukcja NIM1 pod kontrolą 35S cDNA NIM1 pełnej długości (SEK NR ID:6) sklonowano w miejscu EcoRI pGCN1761 ENX (Comai i wsp. (1990) Plant. Mol. Biol. 15, 373-381). Z otrzymanego w rezultacie plazmidu otrzymano fragment Xbal zawierający wzmocniony promotor 35S CaMV, cDNA NIM1 w orientacji odpowiedniej dla transkrypcji oraz terminator 3' tml. Fragment ten sklonowano w binarnym wektorze pCIB200 i transformowano do GV3101. Rośliny Ws infiltrowano tak, jak opisano poprzednio. Otrzymane w rezultacie nasiona zbierano i wysiewano na agar GM zawierający 50 mg/ml kanamycyny. Siewki, które przeżyły przenoszono do gleby i testowano tak, jak opisano poprzednio. Wyselekcjonowane rośliny krzyżowano wsobnie i selekcjonowano przez dwa kolejne pokolenia w celu wytworzenia linii homozygotycznych. Dla dziewięciu spośród 58 testowanych linii wykazano oporność przy traktowaniu Emwa bez uprzedniego działania związkami chemicznymi. A zatem nadprodukcja cDNA NIM1 prowadziła również w rezultacie do powstania roślin opornych na chorobę.

Przykład 23: NIM1 jest homologiem iKBa

Przeprowadzono uliniowanie dla wielu sekwencji biorąc pod uwagę białkowe produkty NIM1 i IkB, dzięki czemu stwierdzono, że produkt genu NIM1 pasuje jako homolog iKBa (fig. 1). Poszukiwania homologii sekwencji przeprowadzono przy zastosowaniu BLAST (Altschul i wsp., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990). Uliniowanie dla wielu sekwencji przeprowadzono przy zastosowaniu Clustal V (Higgins i wsp., CABIOS 5,151-153 (1989)) stanowiącego część oprogramowania Lasergene Biocomputing Software z DNASTAR (Madison, Wl). Sekwencjami poddanymi uliniowaniu były NIM1 (SEK NR ID:2), iKBa myszy (SEK NR ID:3, Nr dostępu w GenBanku: 1022734), iKBa szczura (SEK NR ID:4, Nr dostępu w GenBanku: 57674 i Χ63594; Tewari i wsp., Nucleic Acids Res. 20, 607 (1992)) oraz iKBa świni (SEK

PL 191 355 B1

NR ID:5, Nr dostępu w GenBanku: 221968; de Martin i wsp., EMBO J. 12, 2773-2779 (1993); Nr dostępu w GenBanku: 517193, de Martin i wsp., Gene 152, 253-255 (1995)). Wobec sekwencji poddawanych uliniowaniu zastosowano parametry używane w analizie Clustal, z karą 10 za utworzenie przerwy i karą 10 za wydłużanie przerwy. Odległość ewolucyjną obliczono przy zastosowaniu macierzy PAM250 (Dayhoff i wsp., „A model of evolutionary change in proteins. Matrices for detecting distant relationships.” In Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Suppl. 3, M.O., Dayhoff, wyd. (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.), str. 345-358 (1978)). Podobieństwo reszt obliczano przy zastosowaniu zmodyfikowanej macierzy Dayhoff (Schwartz i Dayhoff, „A model of evolutionary change in proteins.” In Atlas of Protein Sequence i Structure, M.O. Dayhoff, wyd. (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) pp. 353-358 (1979); Gribskov i Burgess, Nucleic Acids Res. 14, 6745-6763(1986)).

Poszukiwania homologii wskazują na podobieństwo NIM1do domen ankyrynowych kilku białek włączając w to: ankyrynę, NF-κΒ i IkB. Największa całkowita homologia jest do IkB i pokrewnych cząsteczek (fig. 1). NIM1 zawiera 2 seryny w pozycjach aminokwasowych 55 i 59; seryna w pozycji 59 jest w kontekście (D/ExxxxS), a pozycja (N-końcowa) odpowiada jej roli w zależnej od fosforylacji, indukowalnej degradacji z udziałem ubikwityny. Wszystkie te IKBa, mają takie N-końcowe seryny i są one wymagane do inaktywacji IkB i następującego po tym uwolnienia NF-kB. NIM1 ma domeny ankyrynowe (aminokwasy 262-290 i 323-371). Uważa się, że domeny ankyrynowe są zaangażowane w oddziaływania białko-białko i są wspólną cechą cząsteczek IkB i NF-kB. Końce C IkB mogą być niepodobne. NIM1 wykazuje pewną homologię do regionu bogatego w QL (aminokwasy 491-499) znajdywanego na końcu C niektórych IkB.

P r z y k ł a d 24: Wytwarzanie zmienionych postaci NIM1 - zamiana reszt serynowych 55 i 59 na reszty alaninowe

Fosforylacja reszt serynowych w ludzkiej IKBa jest wymagana dla aktywowanej przez bodziec degradacji IKBa, aktywując w ten sposób NF-kB. Mutageneza reszt serynowych (S32-S36) w ludzkiej IKBa do reszt alaninowych hamuje indukowaną przez bodziec fosforylację, a zatem blokuje degradację za pośrednictwem proteosomu IKBa (E. Britta-Mareen Traenckner i wsp., EMBO J. 14: 2876-2883 (1995); Brown i wsp., Science 267:1485-1488 (1996); Brockman i wsp., Molecular and Cellular Biology 15:2809-2818 (1995); Wang i wsp., Science 274:784-787(1996)).

Ta zmieniona postać IKBa działa jako forma dominująca negatywna poprzez zatrzymywanie NF-KB w cytoplazmie, blokując w ten sposób dalsze przekazywanie sygnałów. Na podstawie porównania sekwencji pomiędzy NIM1 i IKB, seryny 55 (S55) i 59 (S59) w NIM1 są homologiczne do S32 i S36 w ludzkiej IKBa. W celu skonstruowania dominujących negatywnych postaci NIM1, seryny w pozycji aminokwasowej 55 i 59 zmutagenizowano do reszt alaninowych. Można to wykonać dowolną metodą znaną biegłym w tej dziedzinie, taką jak przykładowo, przy zastosowaniu zestawu do QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit (#200518:Strategene).

Stosując cDNA NIM1 pełnej długości (SEK NR ID:6), łącznie z sekwencją 5' nie podlegającą translacji (UTR) o długości 42 bp i 3'UTR o długości 187 bp, można wytworzyć zmutagenizowany konstrukt zgodnie z instrukcjami producenta przy zastosowaniu następujących starterów (SEK NR ID:6, pozycje 192-226): 5'CAA CAG CTT CGA AGC CGT CTT TGA CGC GCC GGA TG-3' (SEK NR ID:25) i 5'CAT CCG GCG CGT CAA AGA CGG CTT CGA AGC TGT TG-3' (SEK NR ID:26), gdzie podkreślone zasady oznaczają mutacje. Strategia jest następująca: cDNA NIM1, sklonowany w wektorze pSE936 (Elledge i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:1731-1735 (1991)) denaturuje się i przyłącza startery zawierające zmienione zasady. Polimeraza DNA (Pfu) wydłuża startery poprzez wymianę brakującej nici, prowadząc w rezultacie do kolistych nici z nacięciem. DNA poddaje się trawieniu endonukleazą restrykcyjną DpnI, która przecina jedynie miejsca zmetylowane (niezmutagenizowaną nić matrycową). Pozostałe koliste DNA transformuje się do szczepu XL1-Blue E.coli. Z otrzymanych w rezultacie kolonii ekstrahuje się plazmidy i poddaje sekwencjonowaniu w celu potwierdzenia obecności zmutowanych zasad i sprawdzenia, czy nie zaszły żadne inne mutacje.

Zmutagenizowany cDNA NIM1 trawi się endonukleazą restrykcyjną EcoRI i klonuje w pCGN1761 pod kontrolą transkrypcyjną podwójnego promotora 35S z wirusa mozaiki kalafiora. Kasetę do transformacji zawierającą promotor 35S, cDNA NIM1 i terminator tml uwalnia się z plazmidu pCGN1761 poprzez częściowe strawienie enzymem restrykcyjnym Xbal i wstawia się poprzez ligację w miejscu Xbal defosforylowanego pCIB200. SEK NR ID:7 i 8 pokazują, odpowiednio, kodującą sekwencję DNA i zakodowaną sekwencję aminokwasową takiej zmienionej postaci genu NIM1.

PL 191 355 B1

Przykła d 25: Wytwarzanie zmienionych postaci NIM1 - N-końcowa delecja

Delecja aminokwasów 1-36 (Brockman i wsp.; Sun i wsp.) lub 1-72 (Sun i wsp.) w ludzkiej IKBa, która obejmuje K21, K22, S32 i S36, prowadzi w rezultacie do dominującego negatywnego fenotypu IKBa w hodowli transfekowanych komórek ludzkich. N-końcowa delecja pierwszych około 125 aminokwasów zakodowanego produktu cDNA NIM1 usuwa osiem reszt lizynowych, które mogą służyć jako potencjalne miejsca ubikwitynylacji i usuwa również przypuszczalne miejsca fosforylacji S55 i S59 (patrz przykład 2). Taki zmieniony konstrukt genowy można wytworzyć dowolnymi sposobami znanymi biegłym w tej dziedzinie. Przykładowo, przy zastosowaniu metody Ho i wsp., Gene 77:51-59 (1989), można wytworzyć postać NIM1, w której usunięty jest DNA kodujący około 125 pierwszych aminokwasów. Produkt PCR o wielkości 1612 bp jest wytwarzany z użyciem następujących starterów (SEK NR ID:6: 418 do 2011): 5'-gg aat tca-ATG GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG-3' (SEK NR ID:27) i 5'-gga att cTA CAA ATC TGT ATA CCA TTG G-3' (SEK NR ID:28), w których syntetyczny kodon startowy jest podkreślony (ATG), a sekwencja linkera EcoRI linker jest zapisana małymi literami. Przy powielaniu fragmentów stosuje się mieszaninę reakcyjną zawierającą 0,1 do 100 ng matrycowego DNA, 10 mM Tris pH 8,3/50 mM KCI/2 mM MgCI2/0,001% żelatynę/0,25 mM każdego dNTP/0,2 mM każdego startera i 1 jednostkę polimerazy DNA rTth w końcowej objętości 50 ml i maszynę Perkin Elmer Cetus 9600 PCR. Warunki PCR są następujące: 94°C 3 min: 35 x (94°C 30 sek.: 52°C 1 min.: 72°C 2 min.): 72°C 10 min. Produkt PCR klonuje się bezpośrednio w wektorze pCR2.1 (lnvitrogen). Wytworzoną poprzez PCR wstawkę w wektorze do PCR uwalnia się poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym EcoRI i wstawia poprzez ligację w miejscu EcoRI defosforylowanego pCGN1761, pod kontrolą transkrypcyjną podwójnego promotora 35S. Konstrukt sekwencjonuje się w celu potwierdzenia obecności syntetycznego kodonu startowego ATG i sprawdzenia, czy nie zaszły żadne inne mutacje. Kasetę do transformacji zawierającą promotor 35S, zmodyfikowany cDNA NIM1 i terminator tml uwalnia się z plazmidu pCGN1761 poprzez częściowe strawienie enzymem restrykcyjnym Xbal i wstawia się poprzez ligację w miejscu Xbal defosforylowanego pCIB200. SEK NR ID:9 i 10 pokazują, odpowiednio, kodującą sekwencję DNA i zakodowaną sekwencję aminokwasową zmienionej postaci genu NIM1, mającej N-końcową delecję aminokwasową.

P r z y k ł a d 26: Wytwarzanie zmienionych postaci NIM1 - C-końcowa delecja

Uważa się, że delecja aminokwasów 261-317 w ludzkiej IKBa prowadzi w rezultacie do zwiększonej wewnętrznej stabilności poprzez blokowanie konstytutywnej fosforylacji reszt serynowych i treoninowych na końcu C. Region bogaty w serynę i treoninę jest obecny na obszarze aminokwasów 522-593 na końcu C NIM1. C-końcowy region kodujący genu NIM1 można zmodyfikować poprzez usunięcie sekwencji nukleotydowych, które kodują aminokwasy 522-593. Stosując metodę Ho i wsp., (1989), poprzez PCR usuwa się C-końcowy region kodujący i 3'UTR cDNA NIM1 (SEK NR ID:6: 1606-2011) wytwarzając fragment o wielkości 1623 bp przy użyciu następujących starterów: 5'-cggaattcGATCTCTTTAATTTGTGAATTT C-3' (SEK NR ID:29) oraz 5'-ggaattcTCAACAGTT CATAATCTGGTCG-3' (SEK NR ID:30), w których syntetyczny kodon stop jest podkreślony (TGA na nici komplementarnej), a sekwencja linkera EcoRI jest zapisana małymi literami. Składniki reakcji PCR są takie, jak opisano poprzednio, a parametry cykli są następujące: 94°C 3 min: 35 x (94°C 30 sek.: 52°C 30 sek.: 72°C 2 min.): 72°C 10 min. Produkt PCR klonuje się bezpośrednio w wektorze pCR2.1 (lnvitrogen). Wytworzoną poprzez PCR wstawkę w wektorze do PCR uwalnia się poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym EcoRI i wstawia się poprzez ligację w miejscu EcoRI defosforylowanego pCGN1761, pod kontrolą transkrypcyjną podwójnego promotora 35S. Konstrukt sekwencjonuje się w celu potwierdzenia obecności syntetycznego kodonu stop w ramce i sprawdzenia, czy w czasie reakcji PCR nie zaszły żadne inne mutacje. Kasetę do transformacji zawierającą promotor 35S, zmodyfikowany cDNA NIM1 i terminator tml uwalnia się z plazmidu pCGN1761 poprzez częściowe strawienie enzymem restrykcyjnym Xbal i wstawia się poprzez ligację w miejscu Xbal defosforylowanego DCIB200. SEK NR ID:11 i 12 pokazują, odpowiednio, kodującą sekwencję DNA i zakodowaną sekwencją aminokwasową zmienionej postaci genu NIM1, mającej C-końcową delecją aminokwasową.

Przyk ład 27: Wytwarzanie zmienionych postaci NIM1 - hybryda z delecją N-końcową/C-końcową

Postać z delecją N-końcową i C-końcową NIM1 wytwarza się przy zastosowaniu pojedynczego miejsca restrykcyjnego Kpnl w pozycji 819 (SEK NR ID:6). Postać z delecją N-końcową (przykład 25) trawi się enzymami restrykcyjnymi EcoRI/Kpnl i fragment o wielkości 415 bp odpowiadający zmodyfikowanemu końcowi N otrzymuje się poprzez elektroforezę w żelu. Analogicznie, postać z delecją C-końcową (przykład 26) trawi się enzymami restrykcyjnymi EcoRI/Kpnl i fragment o wielkości 790 bp odpowiadający zmodyfikowanemu końcowi N otrzymuje się poprzez elektroforezę w żelu. Fragmenty

PL 191 355 B1 poddaje się ligacji w 15°C, trawi EcoRI w celu wyeliminowania konkatamerów EcoRI i klonuje w miejscu EcoRI defosforylowanego pCGN1761. Postać z delecją N/C końcową NIM1 znajduje się pod kontrolą transkrypcyjną podwójnego promotora 35S. Podobnie, wytwarza się hybrydową postać NIM1, która zawiera zmutagenizowane przypuszczalne miejsca fosforylacji (przykład 24) przyłączone do C-końcowej delecji (przykład 26). Konstrukty sekwencjonuje się w celu potwierdzenia prawidłowych kodonów startowego i stop w ramce oraz sprawdzenia, czy nie zaszły żadne inne mutacje. Odpowiednie kasety do transformacji zawierające promotor 35S, hybrydy NIM1 i terminator tml uwalnia się z plazmidu pCGN1761 poprzez częściowe strawienie enzymem restrykcyjnym Xbal i wstawia się poprzez ligację w miejscu Xbal defosforylowanego pCIB200. SEK NR ID:13 i 14 pokazują, odpowiednio, kodującą sekwencję DNA i zakodowaną sekwencję aminokwasową zmienionej postaci genu NIM1, mającej N-końcową i C-końcową delecję aminokwasową.

P r z y k ł a d 28: Wytwarzanie zmienionych postaci NIM1 - domeny ankyrynowe

NIM1 wykazuje homologię do motywów ankyrynowych w okolicy aminokwasów 103-362. Stosując metodę Ho i wsp., (1989), powiela się sekwencję DNA kodującą przypuszczalne domeny ankyrynowe (SEK NR ID:1: 3093-3951) poprzez PCR (warunki: 94°C 3 min.: 35 x (94°C 30 sek.: 62°C 30 sek.: 72°C 2 min.): 72°C 10 min.) z cDNA NIM1 (SEK NR ID:6: 349-1128), przy użyciu następujących starterów 5'-ggaattcaATGGACTCCAACAACACCGCCGC-3' (SEK NR ID:31) oraz 5'-ggaattcTCAACCTTCCAA-AGTTGCTTCTGATG-3' (SEK NR ID:32). Otrzymany w rezultacie produkt trawi się enzymem restrykcyjnym EcoRI i wstawia w miejscu EcoRI defosforylowanego pCGN1761, pod kontrolą transkrypcyjną podwójnego promotora 35S. Konstrukt sekwencjonuje się w celu potwierdzenia obecności syntetycznego kodonu startowego (ATG), kodonu stop (TGA) w ramce i sprawdzenia, czy w czasie reakcji PCR nie zaszły żadne inne mutacje. Kasetę do transformacji zawierającą promotor 35S, domeny ankyrynowe i terminator tml uwalnia się z plazmidu pCGN1761 poprzez częściowe strawienie enzymem restrykcyjnym Xbal i wstawia się poprzez ligację w miejscu Xbal defosforylowanego pCIB200. SEK NR ID:15 i 16 pokazują, odpowiednio, kodującą sekwencję DNA i zakodowaną sekwencję aminokwasową domeny ankyrynowej NIM1.

P r z y k ł a d 29: Konstrukcja genów hybrydowych

W celu zwiększenia prawdopodobieństwa odpowiedniej przestrzennej i czasowej ekspresji zmienionych postaci NIM1, fragment Hindlll/BamHI o wielkości 4407 bp (SEK NR ID:1: zasady 1249-5655) i/lub fragment EcoRV/BamHI o wielkości 5655 bp (SEK NR ID:1: zasady 1-5655) zawierający promotor i gen NIM1 używa się do wytworzenia zmienionych postaci NIM1 z przykładów 24-28 powyżej. Jakkolwiek etapy konstrukcji mogą się różnić, koncepcja jest porównywalna z przykładami opisanymi tu poprzednio. Silna nadprodukcja zmienionych postaci może być potencjalnie letalna. A zatem, zmienione postaci genu NIM1 opisane w przykładach 24-28 umieszcza się pod kontrolą promotorów innych niż endogenny promotor NIM1, obejmujących między innymi promotor nos lub promotor małej podjednostki Rubisco. Analogicznie, zmienione postaci genu NIM1 wyraża się pod kontrolą odpowiadającego na patogen promotora PR-1 (Patent USA Nr 5,614,395). Taka ekspresja umożliwia silną ekspresję zmienionych postaci genu NIM1 jedynie w czasie ataku patogenu lub innych warunkach indukcji SAR. Ponadto, oporność na chorobę może być widoczna w transformantach wyrażających zmienione postaci genu NIM1 pod kontrolą promotora PR-1 w czasie działania takich stężeń związków aktywujących SAR (tj., BTH lub INA), które normalnie nie aktywują SAR, aktywując w ten sposób sprzężenie zwrotne (Weymann i wsp., (1995) Plant Cell 7: 2013.

P r z y k ł a d 30: Transformacja zmienionych postaci genu NIM1 do Arabidopsis thaliana

Wytworzone konstrukty (przykłady 24-29) wprowadza się do Agrobacterium tumefaciens poprzez elektroporację do szczepu GV3101. Konstrukty te używa się do transformacji ekotypów Col-0 i Ws-0 Arabidopsis poprzez infiltrację pod próżnią (Mindrinos i wsp., Cell 78, 1089-1099 (1994)) lub standardową transformację korzeni. Nasiona z tych roślin zbiera się i umożliwia się ich kiełkowanie na płytkach agarowych z kanamycyną (lub innym odpowiednim antybiotykiem) jako czynnikiem selekcyjnym. Jedynie siewki, które są transformowane mogą zneutralizować czynnik selekcyjny i przeżyć. Siewki, które przeżywają selekcję przenosi się do gleby i testuje pod kątem fenotypu CIM (konstytutywna oporność). Rośliny ocenia się pod względem dających się zaobserwować różnic w porównaniu z roślinami typu dzikiego.

P r z y k ł a d 31: Testowanie fenotypu CIM w roślinach transformowanych genem NIM1 lub zmienionymi postaciami genu NIM1

Z każdego pierwotnego transformanta pobiera się liść, izoluje RNA (Verwoerd i wsp., 1989, Nuc Acid Res, 2362) i testuje pod kątem konstytutywnej ekspresji PR-1 poprzez analizę filtrów z RNA

PL 191 355 B1 (Uknes i wsp., 1992). Przygotowuje sią zawiesinę konidiów 5-10 x 10⁴ spor/ml z dwóch odpowiadających sobie izolatów P. parasitica, Emwa i Noco (tj. te szczepy grzybów powodują chorobę roślin typu dzikiego, odpowiednio, Ws-0i Col-0) i transformanty opryskuje się odpowiednim izolatem, zależnie od ekotypu transformanta. Zaszczepione rośliny inkubuje się w warunkach dużej wilgotności przez 7 dni. Rośliny sprawdza się pod kątem wystąpienia choroby 7 dnia i zbiera się pojedyncze liście do analizy filtrów RNA stosując sondę, która umożliwia pomiar infekcji grzybowej.

Transformanty, które wykazują fenotyp CIM bierze się w celu wytworzenia pokolenia T1 i identyfikuje się rośliny homozygotyczne. Transformanty poddaje się opisanej poniżej baterii testów na oporność na chorobę. Infekcję grzybową Noco i Emwa powtarza się i liście barwi błękitem laktofenolowym w celu zidentyfikowania obecności strzępek grzybni tak, jak opisano w Dietrich i wsp., (1994). Transformanty infekuje się patogenem bakteryjnym Pseudomonas syringae DC3000 w celu ustalenia spektrum widocznej oporności, jak opisano uprzednio przez Uknes i wsp. (1993). W niezainfekowanych roślinach mierzy się zarówno wolny, jak i połączony z glukozą kwas salicylowy, i barwi liście błękitem laktofenolowym w celu zbadania obecności mikroskopijnych ubytków. Rośliny oporne krzyżuje się na drodze płciowej z mutantami SAR, takimi jak NahG (Patent USA Nr 5,614,395) i ndr1w celu ustalenia, w jaki sposób te dominujące negatywne mutacje NIM1 mogą wpływać na SA-zależne sprzężenie zwrotne.

Przykład 32: Izolacja homologów NIM1

Można otrzymać homologi NIM1, które hybrydyzują w średnio ostrych warunkach bądź z całym genem NIM1z Arabidopsis, bądź, korzystniej, z sondą oligonukleotydową pochodzącą z Arabidopsis, która zawiera ciągłą część jego sekwencji kodującej o długości co najmniej 10 nukleotydów. Czynniki, które wpływają na stabilność hybryd określają ostrość hybrydyzacji. Jednym z tych czynników jest temperatura topnienia Tm, którą można łatwo obliczyć według wzoru dostarczonego w DNA PROBES, George H. Keller i Mark M. Manak, Macmillan Publishers Ltd, 1993,Część pierwsza: Molecular Hybridization Technology; strona 8 ff. Korzystna temperatura hybrydyzacji mieści się w zakresie około 25°C poniżej obliczonej temperatury topnienia Tm, korzystnie w zakresie 12-15°C poniżej obliczonej temperatury topnienia Tm, a w przypadku oligonukleotydów, około 5-10°C poniżej obliczonej temperatury topnienia Tm.

Stosując jako sondę cDNA NIM1 (SEK NR ID:6), identyfikuje się homologi NIM1 Arabidopsis poprzez przeszukiwanie bibliotek genomowych lub cDNA z różnych roślin uprawnych, takich jak, między innymi te wymienione poniżej w przykładzie 33. Stosowane w tym celu standardowe techniki obejmują przeszukiwanie wysianych bibliotek DNA (łysinki lub kolonie, patrz, np. Sambrook i wsp., Molecular Cloning, wyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) powielanie poprzez PCR przy zastosowaniu starterów oligonukleotydowych (patrz, np. Innis i wsp., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications eds., Academic Press (1990)). Zidentyfikowane homologi wstawia się stosując zabiegi inżynierii genetycznej do omawianych tu wektorów ekspresyjnych i retransformuje do wymienionych poniżej roślin uprawnych. Transformanty ocenia się pod kątem zwiększonej oporności na chorobę przy zastosowaniu odpowiednich patogenów wobec poddawanych testom roślin uprawnych.

Homologi NIM1z genomów ogórka, pomidora, tytoniu, kukurydzy i jęczmienia wykryto poprzez analizę filtrów z DNA. Genomowy DNA izolowano z ogórka, pomidora, tytoniu, kukurydzy i jęczmienia, trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI, Hindlll, Xbal lub Sall, rozdzielano elektroforetycznie na 0,8% żelach agarozowych i przenoszono kapilarnie na filtry nylonowe. Po związaniu DNA do nośnika poprzez UV, filtr hybrydyzowano w łagodnych warunkach [(1% BSA; 520 mM NaPO4) pH 7,2; 7% siarczan laurynowy, sól sodowa; 1 mM EDTA; 250 mM chlorek sodu) w 55°C przez 18-24 godz.] z wyznakowanym radioaktywnie ³²P cDNA NIM1 z Arabidopsis thaliana. Po hybrydyzacji filtry płukano w łagodnych warunkach [6XSSC przez 15 min. (X3) 3XSSC przez 15 min. (X1) w 55°C; 1XSSC jest to 0,15 M NaCI, 15 mM cytrynian-Na (pH 7,0)] i eksponowano na błonę rentgenowską w celu uwidocznienia prążków, które odpowiadają NIM1.

Ponadto, do izolowania homologów można użyć zidentyfikowanych podlegających ekspresji etykietek sekwencji (EST) wykazujących podobieństwo do genu NIM1. Przykładowo, zidentyfikowano kilka podlegających ekspresji etykietek sekwencji (EST) z ryżu wykazujących podobieństwo do genu NIM1. Uliniowanie dla wielu sekwencji skonstruowano przy zastosowaniu Clustal V (Higgins, Desmond G. i Paul M. Sharp (1989), Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer, CABIOS 5:151-153) jako część oprogramowania DNA* (1228 South Park Street, Madison Wisconsin, 53715) Lasergene Biocomputing Software dla Macintosh (1994). Niektóre regiony białka NIM1 wykazują homologię sekwencji aminokwasowej do 4 różnych produktów białkowych cDNA

PL 191 355 B1 z ryżu. Homologię zidentyfikowano przy zastosowaniu sekwencji NIM1w przeszukiwaniach GenBanku. Porównanie regionów homologii NIM1i produktów cDNA z ryżu są pokazane na fig. 2 (Patrz również, SEK NR ID:2 i SEK NR ID:17-24). Fragmenty białka NIM1 wykazują 36 to 48% identyczności sekwencji aminokwasowej z 4 produktami z ryżu. Te EST z ryżu mogą być szczególnie przydatne do izolowania homologów NIM1z innych roślin jednoliściennych.

Homologi można również otrzymać poprzez PCR. W tej metodzie robi się porównania pomiędzy znanymi homologami (np. z ryżu i Arabidopsis). Regiony o dużym podobieństwie lub identyczności aminokwasów i DNA są następnie stosowane do zrobienia starterów PCR. Najlepiej, jeżeli po regionach bogatych w reszty M i W występują regiony bogate w reszty aminokwasowe F, Y, C, H, Q, K i E, ponieważ te aminokwasy są kodowane przez ograniczoną liczbę kodonów. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego regionu, tworzy się startery dla tego regionu z różnymi podstawieniami w trzeciej pozycji kodonu. Te różnorodne podstawienia w trzeciej pozycji mogą być zawężone, zależnie od gatunku docelowego. Przykładowo, ponieważ kukurydza jest bogata w GC, projektuje się startery, które wykorzystują G lub C w trzeciej pozycji, jeżeli to możliwe. Reakcję PCR przeprowadza się z cDNA lub DNA genomowego w różnorodnych standardowych warunkach. Jeżeli widoczny jest prążek, jest on klonowany i/lub sekwencjonowany w celu określenia, czy jest to homolog NIM1.

Przykład 33: Ekspresja postaci NIM1w roślinach uprawnych

Konstrukty, które nadawały fenotyp CIM w Col-0 lub Ws-0, transformuje się do roślin uprawnych w celu ich przetestowania. Alternatywnie, zmienione natywne geny NIM1, izolowane z roślin uprawnych w poprzednim przykładzie, wstawia się z powrotem do odpowiednich roślin uprawnych. Jakkolwiek gen NIM1 można wstawić do dowolnej komórki roślinnej należącej do tych rozległych klas, jest on szczególnie użyteczny w komórkach roślin uprawnych, takich jak ryż, pszenica, jęczmień, żyto, kukurydza, ziemniak, marchew, słodki ziemniak, burak cukrowy, fasola, groch, cykoria, sałata, kapusta, kalafior, brokuły, rzepa,rzodkiewka, szpinak, szparagi, cebula, czosnek, oberżyna, papryka, seler, marchew, dynia (ang. squash), dynia (ang. pumpkin), cukinia, ogórek, jabłko, gruszka, pigwa, melon, śliwka, wiśnia, brzoskwinia, nektarynka, morela, truskawka, winogrono, malina, czarna porzeczka, ananas, awokado, papaja, mango, banan, soja, tytoń, pomidor, sorgo i trzcina cukrowa. Transformanty ocenia się pod kątem zwiększonej oporności na chorobę. W korzystnym wykonaniu, ekspresja genu NIM1jest na poziomie, który przewyższa co najmniej dwukrotnie poziom ekspresji natywnego genu NIM1 w roślinach typu dzikiego, a korzystnie przewyższa dziesięciokrotnie poziom ekspresji typu dzikiego.

P r z y k ł a d 34: Synergistyczna oporność na choroby uzyskiwana poprzez zastosowanie konwencjonalnego środka grzybobójczego wobec transgenicznych roślin nadprodukujących NIM1

Linie roślinne zastosowane w tym przykładzie (6E i 7C) wytworzono poprzez transformację Arabidopsis thaliana typu dzikiego (ekotypu Ws) genomowym fragmentem NIM1 BamHI-Hindlll (SEK NR ID:1 - zasady 1249-5655) tak, jak opisano powyżej w przykładzie 21. Fungicydy metalaksyl, fosetyl i wodorotlenek miedzi, jako składniki aktywne kompozycji ze zwilżalnym proszkiem nośnikowym, w której stanowią, odpowiednio, 25%, 80% i 70%, zostały zastosowane w postaci delikatnej mgiełki wobec liści trzytygodniowych transgenicznych roślin Ws konstytutywnie wyrażających gen NIM1. Sam zwilżalny proszek został zastosowany jako kontrola. Trzy dni później, rośliny zaszczepiano zawiesiną konidiów izolatu Emwa Peronospora parasitica (1-2 x 10⁵ spor/ml) tak, jak opisano w Delaney i wsp. (1995). Po zaszczepieniu, rośliny okrywano, aby utrzymać wilgotność i umieszczano w pomieszczeniu hodowlanym w 17°C w cyklu 14 godz. dzień/10 godz. noc (Uknes i wsp., 1993). Tkanki zbierano 8 dni po zaszczepieniu.

Rozwój grzyba śledzono przez 12 dni poprzez obserwację pod mikroskopem preparatywnym w celu stwierdzenia rozwoju konidioforów (Delaney i wsp. (1995), Dietrich i wsp. (1994)). Przeprowadzono barwienie poszczególnych liści błękitem laktofenolotrypanowym w celu zaobserwowania wzrostu grzyba wewnątrz tkanki liściowej. Wzrost grzyba oznaczano ilościowo przy zastosowaniu grzybowej sondy rRNA otrzymanej poprzez PCR według White i wsp. (1990; PCR Protokols: A guide to Methods and Application, 315-322) przy zastosowaniu starterow NS1 i NS2 oraz DNA P. parasitica Emwa jako matryc. RNA oczyszczono z zamrożonej tkanki poprzez ekstrakcje fenolem/chloroformem, a następnie wytrącanie chlorkiem litu (Lagrimini i wsp. 1987: PNAS, 84:7542-7546). Próbki (7,5 μg) rozdzielano elektroforetycznie w żelach agarozowych z formaldehydem i przenoszono na filtry nylonowe (Hybond-N+, Amersham) tak, jak opisano przez Ausubel i wsp. (1987). Hybrydyzacje i płukania były według Church i Gilbert (1984, PNAS, 81:1991-1995). Względne ilości transkryptu określano przy zastosowaniu Phosphor Imager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Nałożenie próbek normalizowano poprzez ponowną hybrydyzację filtrów, po uprzednim usunięciu

PL 191 355 B1 wyznakowanego DNA, z cDNA konstytutywnie wyrażanej b-tubuliny Arabidopsis. Zakażenie roślin nie poddanych działaniu odpowiada 0% hamowania wzrostu grzybów.

Zastosowanie metalaksylu, fosetylu lub wodorotlenku miedzi wobec linii roślin nadprodukujących NIM1miało więcej niż addytywny, tj. synergistyczny, wpływ na oporność na chorobę. Efekt ten został określony jako wspóczynnik synergizmu (SF), który jest stosunkiem wpływu obserwowanego(O) wobec spodziewanego (E). Otrzymano następujące wyniki:

Tabela 36

Działanie przeciw Peronospora parasitica u Arabidopsis składnik l: nadprodukcja NIM1 (linia 6E) składnik II: metalaksyl

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
NIM1	metalaksyl	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	wt	--	0
1	NIM1	--	10
2	wt	0,0125 g/l	59
3	wt	0,0012 g/l	27
4	NIM1	0,0125 g/l	76	69	1,1
5	NIM1	0,0012 g/l	56	37	1,5

wt = dziki typ WS

Tabela 37

Działanie przeciw Peronospora parasitica u Arabidopsis składnik l: nadprodukcja NIM1 (linia 6E) składnik II: fosetyl

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
NIM1	fosetyl	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	wt	--	0
1	NIM1	--	10
2	wt	5,0 g/l	7
3	wt	0,5 g/l	2
4	wt	0,05 g/l	0
5	NIM1	5,0 g/l	93	17	5,5
6	NIM1	0,5 g/l	83	12	6,9
7	NIM1	0,05 g/l	42	10	4,2

wt = dziki typWS

PL 191 355 B1

T abel a 38

Działanie przeciw Peronospora parasitica u Arabidopsis składnik l: nadprodukcja NIM1(linia 7C) składnik II: fosetyl

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
NIM1	fosetyl	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	wt	--	0
1	NIM1	--	14
2	wt	5,0 g/l	7
3	wt	0,5 g/l	2
4	NIM1	5,0 g/l	80	21	3,8
5	NIM1	0,5 g/l	56	16	3,5

wt = dziki typ WS

Tabel a 39

Działanie przeciw Peronospora parasitica u Arabidopsis składnik l: nadprodukcja NIM1(linia 6E) składnik II: wodorotlenek miedzi

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
NIM1	Cu(OH)2	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	wt	--	0
1	NIM1	--	10
2	wt	2,0 g/l	0
3	wt	0,2 g/l	0
4	wt	0,02 g/l	0
5	NIM1	2,0 g/l	66	10	6,6
6	NIM1	0,2 g/l	14	10	1,4
7	NIM1	0,02 g/l	20	10	2,0

wt = dziki typ WS

Tabel a 40

Test nr	Składniki	% hamowania wzrostu grzyba	współczynnik synergii O/E
NIM1	Cu(OH)2	O (obserwowany)	E (oczekiwany)
kontrolny	wt	--	0
1	NIM1	--	14
2	wt	2,0 g/l	0
3	wt	0,2 g/l	0
4	wt	0,02 g/l	0
5	NIM1	2,0 g/l	77	14	5,5
6	NIM1	0,2 g/l	51	14	3,6
7	NIM1	0,02 g/l	55	14	3,9

wt = dziki typ WS

PL 191 355 B1

Jak można zobaczyć w powyższych tabelach, synergistyczny wpływ na oporność na chorobę pokazano w roślinach nadprodukujących NIM1 poprzez zastosowanie metalaksylu, fosetylu lub wodorotlenku miedzi. Przykładowo, dla nie traktowanej rośliny NIM1 (linia 6E) widoczne jest 10% zahamowanie wzrostu grzybów w stosunku do nie traktowanej rośliny typu dzikiego; to pokazuje, że konstytutywna ekspresja genu SAR w tym nadproducencie NIM1 koreluje z opornością na chorobę. Jednakże, jak pokazano powyżej w tabeli 37, przy zastosowaniu fosetylu w dawce 5,0 g/l (stężenie zazwyczaj niewystarczające dla skuteczności) wobec immunomodulowanej rośliny nadprodukującej NIM1 (SARwłączony), obserwowany poziom hamowana wzrostu grzybów wzrastał do 93%. Współczynnik synergizmu wynoszący 5,5 obliczony z tych danych wyraźnie pokazuje wpływ synergistyczny uzyskany poprzez zastosowanie czynnika grzybobójczego zastosowanego wobec immunomodulowanej rośliny (SAR-włączony). W innym przykładzie, dla nie poddawanej działaniu rośliny NIM1 (linia 7C) obserwowano 14% hamowanie wzrostu grzybów w stosunku do nie traktowanej rośliny typu dzikiego, co pokazuje, że konstytutywna ekspresja genu SAR w tym nadproducencie NIM1 koreluje z opornością na chorobę. Jednakże, jak pokazano powyżej w tabeli 40, przy zastosowaniu wodorotlenku miedzi w stężeniu 2,0 g/l (stężenie zazwyczaj niewystarczające dla skuteczności) wobec immunomodulowanej rośliny nadprodukującej NIM1 (SAR-włączony), obserwowany poziom hamowania wzrostu grzybów wzrastał do 77%. Współczynnik synergizmu wynoszący 5,5 obliczony z tych danych wyraźnie pokazuje wpływ synergistyczny uzyskany poprzez użycie czynnika grzybobójczego zastosowanego wobec immunomodulowanej rośliny (SAR-włączony).

A zatem zastosowanie kombinacji immunomodulowanej rośliny nadprodukującej NIM1 z niskimi, normalnie nieskutecznymi stężeniami środka grzybobójczego, w celu osiągnięcia oporności na chorobę, dostarcza korzyści, które będą oczywiste dla biegłych w dziedzinie rolnictwa. Można uniknąć stosowania normalnie toksycznego lub z innych powodów niepożądanego stężenia środka grzybobójczego korzystając z zademonstrowanego tu synergizmu. Ponadto, można uzyskać oszczędności w rezultacie zmniejszonej ilości wymaganych środków grzybobójczych wymaganych dla uzyskania danego poziomu ochrony roślin.

P r z y k ł a d 35: Synergistyczna oporność na chorobę uzyskiwana poprzez zastosowanie induktora chemicznego SAR wobec roślin transgenicznych nadprodukujących NIM1

Transgeniczne rośliny zawierające genomowy fragment DNA NIM1 pod własnym promotorem (przykład 21) analizowano również pod kątem odpowiedzi na różne stężenia BTH w stosunku do linii Wstypu dzikiego. Nasiona z każdej linii wysiewano i hodowano tak, jak opisano poprzednio. Po około trzech tygodniach po podsadzeniu, próbki liścia zbierano z każdej linii (kontrola-dzień 0), a pozostałe liście traktowano H₂O, 10 μM BTH lub 100 μM BTH. Dodatkowe próbki zbierano w dniu 1, 3 i 5 po działaniu. Po zebraniu próbek 3 dnia, pobierano grupę roślin z każdej linii i traktowano izolatem Emwa Peronospora parasitica tak, jak opisano powyżej. Z zebranej tkanki otrzymano RNA i przeprowadzono analizę Northern przy zastosowaniu sondy dla genu PR-1 z Arabidopsis. Rośliny badano pod kątem oporności na grzyby po 8 dniach od infekcji.

Wyniki analizy Northern dla Ws i czterech linii nadprodukujących NIM1 (3A, 5B, 6E i 7C) są pokazane na fig. 3. Ekspresja genu PR-1 w linii Ws typu dzikiego jest ledwie wykrywalna po zadziałaniu BHT w niskiej dawce 10 μl (stężenie BHT 100-300 μM jest normalnie wymagane dla skuteczności). Rośliny Ws z takiego działania są nadal podatne na patogen grzybowy P. parasitica (Emwa). Jednakże, we wszystkich liniach nadprodukujących NIM1 odpowiedź na ekspresję genu PR-1 była znacznie mocniejsza po zadziałaniu BHT na niskim poziomie. Ponadto, wszystkie linie nadprodukujące NIM-1 traktowane 10 μI BTH wykazywały prawie całkowitą oporność na P. parasitica. Liście barwione błękitem laktofenolowym w celu zidentyfikowania obecności strzępek grzybni ((Dietrich i wsp. (1994) potwierdziły brak wzrostu grzyba w liniach nadprodukujących NIM1 w stosunku do typu dzikiego. A zatem rośliny immunomodulowane mają zdolność do szybszej odpowiedzi i na znacznie niższe dawki BTH, jak pokazano poprzez ekspresję genu PR-1 i oporność na P. parasitica, niż rośliny typu dzikiego. Te dane pokazują, że synergistyczną oporność na chorobę można uzyskać poprzez zastosowanie induktora chemicznego systemowej nabytej oporności, takiego jak BTH, wobec immunomodulowanej rośliny (SAR-włączony), takiej jak roślina nadprodukująca NIM1.

A zatem zastosowanie kombinacji immunomodulowanej rośliny nadprodukującej NIM1 z niskimi, normalnie nieskutecznymi stężeniami związków chemicznych indukujących SAR, takich jak BTH, w celu osiągnięcia oporności na chorobę, dostarcza korzyści, które będą oczywiste dla biegłych w dziedzinie rolnictwa. Można uniknąć stosowania normalnie toksycznego lub z innych powodów niepożądanego stężenia związków chemicznych indukujących SAR, korzystając z zademonstrowanego

PL 191 355 B1 tu synergizmu. Ponadto, można uzyskać oszczędności w rezultacie zmniejszonej ilości wymaganych związków chemicznych indukujących SAR, wymaganych dla uzyskania danego poziomu ochrony roślin.

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Novartis AG (B) ULICA: Schwarzwaldallee 215 (C) MIASTO: Bazyleja (E) PAŃSTWO: Szwajcaria (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 4002 (G) TELEFON: +41 61 69 11 11 (H) TELEFAX: +41 61 696 79 76 (v) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Sposób ochrony roślin (iii) LICZBA SEKWENCJI: 32 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5655 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: ekson (B) POZYCJA: 2787..3347 (D) INNE INFORMACJE: /produkt= „1-szy ekson NIM1

PL 191 355 B1 (ix> CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: ekson (B) POZYCJA: 3427..4162 (D) INNE INFORMACJE: /produkt= „2-gi ekson NIM1” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: ekson (B) POZYCJA: 4271..4474 (D) INNE INFORMACJE: /produkt= „3-gi ekson NIM1” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: ekson (B) POZYCJA: 4586..4866 (D) INNE INFORMACJE: /produkt= „4-ty ekson NIM1” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: łączy(2787,.3347, 3427..4162, 4271..4474, 4586..4866) (xi)OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 1:

TGTGATGCAA	GTCATGGGAT	ATTGCTTTGT	GTTAAGTATA	CAAAACCATC	ACGTGGATAC	60
ATAGTCTTCA	AACCAACCAC	TAAACAGTAT	CAGGTCATAC	CAAAGCCAGA	AGTGAAGGGT	120
TGGGATATGT	CATTGGGTTT	AGCGGTAATC	GGATTGAACC	CTTTCCGGTA	TAAAATACAA	180
AGGCTTTCGC	AGTCTCGGCG	TATGTGTATG	TCTCGGGGTA	TCTACCATTT	GAATCACAGA	240
ACTTTTATGT	GCGAAGTTTT	CGATTCTGAT	TCGTTTACCT	GGAAGAGATT	AGAAAATTTG	300
CGTCTACCAA	AAACAGACAG	ATTAATTTTT	TCCAACCCGA	TACAAGTTTC	GGGGTTCTTG	360
CATTGGATAT	CACGGAACAA	CAATGTGATC	CGGTTTTGTC	TCAAAACCGA	AACTTGGTCC	420

PL 191 355 B1

TTCTTCCATA	CTCCGAACTC	TGATGTTTTC	TCAGGATTAG	TCAGATACGA	AGGGAAGCTA	480
GGTGCTATTC	GTCAGTGGAC	AAACAAAGAT	CAAGAAGATG	TTCACGAGTT	ATGGGTTTTA	540
AAGAGCAGTT	TTGAAAAGTC	GTGGGTTAAA	GTGAAAGATA	TTAAAAGCAT	TGGAGTAGAT	600
TTGATTACGT	GGACTCCAAG	CAACGACGTT	GTATTGTTTC	GTAGTAGTGA	TCGTGGTTGC	660
CTCTACAACA	TAAACGCAGA	GAAGTTGAAT	TTAGTTTATG	CAAAAAAAGA	GGGATCTGAT	720
TGTTCTTTCG	TTTGTTTTCC	GTTTTGTTCT	GATTACGAGA	GGGTTGATCT	GAACGGAAGA	780
AGCAACGGGC	CGACACTTTA	AAAAAAAAAT	AAAAAAAATG	GGCCGACAAA	TGCAAACGTA	840
GTTGACAAGG	ATCTCAAGTC	TCAAGTCTCA	ATTGGCTCGC	TCATTGTGGG	GCATAAATAT	900
ATCTAGTGAT	GTTTAATTGT	TTTTTATAAG	GTAAAAAGGA	ATATTGAATT	TTGTTTCTTA	960
GGTTTATGTA	ATAATACCAA	ACATTGTTTT	ATGAATATTT	AATCTGATTT	TTTGGCTAGT	1020
tattttatta	TATCAAGGGT	TCCTGTTTAT	AGTTGAAAAC	AGTTACTGTA	TAGAAAATAG	1080
TGTCCCAATT	TTCTCTCTTA	AATAATATAT	TAGTTAATAA	AAGATATTTT	AATATATTAG	1140
ATATACATAA	TATCTAAAGC	AACACATATT	TAGACACAAC	ACGTAATATC	TTACTATTGT	1200
TTACATATAT	TTATAGCTTA	CCAATATAAC	CCGTATCTAT	GTTTTATAAG	CTTTTATACA	1260
ATATATGTAC	GGTATGCTGT	CCACGTATAT	ATATTCTCCA	AAAAAAACGC	ATGGTACACA	1320
AAATTTATTA	aatatttggc	AATTGGGTGT	TTATCTAAAG	TTTATCACAA	TATTTATCAA	1380
CTATAATAGA	TGGTAGAAGA	TAAAAAAATT	ATATCAGATT	GATTCAATTA	AATTTTATAA	1440
TATATCATTT	TAAAAAATTA	ATTAAAAGAA	AACTATTTCA	TAAAATTGTT	CAAAAGATAA	1500
TTAGTAAAAT	TAATTAAATA	TGTGATGCTA	TTGAGTTATA	GAGAGTTATT	GTAAATTTAC	1560
TTAAAATCAT	ACAAATCTTA	TCCTAATTTA	ACTTATCATT	TAAGAAATAC	AAAAGTAAAA	1620
AACGCGGAAA	GCAATAATTT	ATTTACCTTA	TTATAACTCC	TATATAAAGT	ACTCTGTTTA	1680

PL 191 355 B1

TTCAACATAA TCTTACGTTG TTGTATTCAT AGGCATCTTT AACCTATCTT TTCATTTTCT 1740

GATCTCGATC GTTTTCGATC CAACAAAATG AGTCTACCGG TGAGGAACCA AGAGGTGATT 1800

ATGCAGATTC CTTCTTCTTC TCAGTTTCCA GCAACATCGA GTCCGGAAAA CACCAATCAA 1860

GTGAAGGATG AGCCAAATTT GTTTAGACGT GTTATGAATT TGCTTTTACG TCGTAGTTAT 1920

TGAAAAAGCT GATTTATCGC ATGATTCAGA ACGAGAAGTT GAAGGCAAAT AACTAAAGAA 1980

GTCTTTTATA TGTATACAAT aattgttttt AAATCAAATC CTAATTAAAA AAATATATTC 2040

ATTATGACTT TCATGTTTTT AATGTAATTT ATTCCTATAT CTATAATGAT TTTGTTGTGA 2100

AGAGCGTTTT CATTTGCTAT AGAACAAGGA GAATAGTTCC AGGAAATATT CGACTTGATT 2160

TAATTATAGT GTAAACATGC TGAACACTGA AAATTACTTT TTCAATAAAC GAAAAATATA 2220

ATATACATTA CAAAACTTAT GTGAATAAAG CATGAAACTT AATATACGTT CCCTTTATCA 2280

TTTTACTTCA AAGAAAATAA ACAGAAATGT AACTTTCACA TGTAAATCTA ATTCTTAAAT 2340

TTAAAAAATA ATATTTATAT ATTTATATGA AAATAACGAA CCGGATGAAA AATAAATTTT 2400

ATATATTTAT ATCATCTCCA AATCTAGTTT GGTTCAGGGG CTTACCGAAC CGGATTGAAC 2460

TTCTCATATA CAAAAATTAG CAACACAAAA TGTCTCCGGT ATAAATACTA ACATTTATAA 2520

CCCGAACCGG TTTAGCTTCC TGTTATATCT TTTTAAAAAA GATCTCTGAC AAAGATTCCT 2580

TTCCTGGAAA TTTACCGGTT TTGGTGAAAT GTAAACCGTG GGACGAGGAT GCTTCTTCAT 2640

ATCTCACCAC CACTCTCGTT GACTTGACTT GGCTCTGCTC GTCAATGGTT ATCTTCGATC 2700

TTTAACCAAA TCCAGTTGAT AAGGTCTCTT CGTTGATTAG CAGAGATCTC TTTAATTTGT 2760

GAATTTCAAT TCATCGGAAC CTGTTG ATG GAC ACC ACC ATT GAT GGA TTC GCC 2813

Met Asp Thr Thr Ile Asp Gly Phe Ala

GAT TCT TAT GAA ATC AGC AGC ACT AGT TTC GTC GCT ACC GAT AAC ACC Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser Thr Ser Phe Val Ala Thr Asp Asn Thr

2861

PL 191 355 B1

GAC TCC

TCT Ser

ATT GTT

TAT Tyr

CTG GCC GCC GAA CAA GTA CTC ACC GGA CCT

2909

Asp

Ser

Ile

Val 30

Leu Ala Ala

Glu 35

Gin Val

Leu

Thr

Gly 40

Pro

GAT

GTA

TCT

GCT

CTG

CAA

TTG

CTC

TCC

AAC

AGC

TTC

GAA

TCC

GTC

TTT

2957

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

Gin

Leu

Ser

Asn

Ser

Phe

Glu

Ser

Val

Phe

45

50

55

GAC

TCG

CCG

GAT

TTC

TAC

AGC

GAC

GCT

AAG

CTT

GTT

CTC

TCC

GAC

3005

Asp

Ser

Pro

Asp

Phe

Tyr

Ser

Asp

Ala

Lys

Leu

Val

Leu

Ser

Asp

SO

65

70

GGC

CGG

GAA

GTT

TCT

TTC

CAC

CGG

TGC

GTT

TTG

TCA

GCG

AGA

AGC

TCT

3053

Gly

Arg

Glu

Val

Ser

Phe

His

Arg

Cys

Val

Leu

Ser

Ala

Arg

Ser

75

80

85

TTC

AAG

AGC

GCT

TTA

GCC

GCT

AAG

GAG

AAA

GAC

TCC

AAC

3101

Phe

Lys

Ser

Ala

Leu

Ala

Lys

Glu

Lys

Asp

Ser

Asn

90

95

100

105

AAC

ACC

GCC

GTG

AAG

CTC

GAG

CTT

AAG

GAG

ATT

GCC

AAG

GAT

TAC

3149

Asn

Thr

Ala

Val

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile

Ala

Lys

Asp

Tyr

110

115

120

GAA

GTC

GGT

TTC

GAT

TCG

GTT

GTG

ACT

GTT

TTG

GCT

TAT

GTT

TAC

AGC

3197

Glu

Val

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

Thr

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Tyr

Ser

125

130

135

AGC

AGA

GTG

AGA

CCG

CCT

AAA

GGA

GTT

TCT

GAA

TGC

GCA

GAC

GAG

3245

Ser

Arg

Val

Arg

Pro

Lys

Gly

Val

Ser

Glu

Cys

Ala

Asp

Glu

140

145

150

AAT

TGC

CAC

GTG

GCT

TGC

CGG

CCG

GCG

GTG

GAT

TTC

ATG

TTG

GAG

3293

Asn

Cys

His

Val

Ala

Cys

Arg

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Met

Leu

Glu

155

160

165

GTT

CTC

TAT

TTG

GCT

TTC

ATC

TTC

AAG

ATC

CCT

GAA

TTA

ATT

ACT

CTC

3341

Val

Leu

Tyr

Leu

Ala

Phe

Ile

Phe

Lys

Ile

Pro

Glu

Leu

Ile

Thr

Leu

170

175

180

185

TAT CAG GTAAAACACC ATCTGCATTA AGCTATGGTT ACACATTCAT GAATATGTTC 3397

Tyr Gin

PL 191 355 B1

TTACTTGAGT ACTTGTATTT GTATTTCAG AGG CAC TTA TTG GAC GTT GTA GAC	3450
	Arg His Leu 190	Leu	Asp Val Val	Asp 195
AAA GTT	GTT ATA GAG GAC ACA TTG GTT ATA CTC	AAG	CTT GCT AAT	ATA	3498
Lys Val	Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu 200 205	Lys	Leu Ala Asn 210	Ile
TGT GGT	AAA GCT TGT ATG AAG CTA TTG GAT AGA	TGT	AAA GAG ATT	ATT	3546
Cys Gly	Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg 215 220	Cys	Lys Glu Ile 225	Ile
GTC AAG	TCT AAT GTA GAT ATG GTT AGT CTT GAA	AAG	TCA TTG CCG	GAA	3594
val Lys	Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu 230 235	Lys	Ser Leu Pro 240	Glu
GAG CTT	GTT AAA GAG ATA ATT GAT AGA CGT AAA	GAG	CTT GGT TTG	GAG	3642
Glu Leu 245	Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys 250	Glu 255	Leu Gly Leu	Glu
GTA CCT	AAA GTA AAG AAA CAT GTC TCG AAT GTA	CAT	AAG GCA CTT	GAC	3690
Val Pro 260	Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val 265 270	His	Lys Ala Leu	ASp 275
TCG GAT	GAT ATT GAG TTA GTC AAG TTG CTT TTG	AAA	GAG GAT CAC	ACC	3738
Ser Asp	Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu 280 285	Lys	Glu Asp His 290	Thr
AAT CTA	GAT GAT GCG TGT GCT CTT CAT TTC GCT	GTT	GCA TAT TGC	AAT	3786
Asn Leu	Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala 295 300	Val	Ala Tyr Cys 305	Asn
GTG AAG	ACC GCA ACA GAT CTT TTA AAA CTT GAT	CTT	GCC GAT GTC	AAC	3034
Val Lys	Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp 310 315	Leu	Ala Asp Val 320	Asn
CAT AGG	AAT CCG AGG GGA TAT ACG GTG CTT CAT	GTT	GCT GCG ATG	CGG	3882
His Arg 325	Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His 330	Val 335	Ala Ala Met	Arg
AAG GAG	CCA CAA TTG ATA CTA TCT CTA TTG GAA	AAA	GGT GCA AGT	GCA	3930

PL 191 355 B1

Lys 340

Glu

Pro

Gin

Leu

Ile 345

Leu

Ser

Leu

Leu Glu 350

Lys Gly

Ala

Ser

Ala 355

TCA

GAA

GCA

ACT

TTG

GAA

GGT

AGA

ACC

GCA

CTC

ATG

ATC

GCA

AAA

CAA

3978

Ser

Glu

Ala

Thr

Leu

Glu

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Met

Ile

Ala

Lys

Gin

360

365

370

GCC

ACT

ATG

GCG

GTT

GAA

TGT

AAT

ATC

CCG

GAG

CAA

TGC

AAG

CAT

4026

Ala

Thr

Met

Ala

Val

Glu

Cys

Asn

Ile

Pro

Glu

Gin

Cys

Lys

His

375

380

385

TCT

CTC

AAA

GGC

CGA

CTA

TGT

GTA

GAA

ATA

CTA

GAG

CAA

GAA

GAC

AAA

4074

Ser

Leu

Lys

Gly

Arg

Leu

Cys

Val

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

Glu

Asp

Lys

390

395

400

CGA

GAA

CAA

ATT

CCT

AGA

GAT

GTT

CCT

CCC

TCT

TTT

GCA

GTG

GCG

GCC

4122

Arg

Glu

Gin

Ile

Pro

Arg

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ala

Val

Ala

405

410

415

GAT

GAA

TTG

AAG

ATG

ACG

CTG

CTC

GAT

CTT

GAA

AAT

AGA

G

4162

Asp

Glu

Leu

Lys

Met

Thr

Leu

Asp

Leu

Glu

Asn

Arg

420

425

430

GTATCTATCA AGTCTTATTT CTTATATGTT TGAATTAAAT

TTATGTCCTC TCTA'

TTAGGA

4222

AACTGAGTGA ACTAATGATA ACTATTCTTT GTGTCGTCCA

CTGTTTAG TT GCA CTT

4278

Val Ala Leu

435

GCT

CAA

CGT

CTT

TTT

CCA

ACG

GAA

GCA

CAA

GCT

GCA

ATG

GAG

ATC

GCC

4326

Ala

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Ala

Gin

Ala

Met

Glu

Ile

Ala

440

445

450

GAA

ATG

AAG

GGA

ACA

TGT

GAG

TTC

ATA

GTG

ACT

AGC

CTC

GAG

CCT

GAC

4374

Glu

Met

Lys

Gly

Thr

Cys

Glu

Phe

Ile

Val

Thr

Ser

Leu

Glu

Pro

Asp

455

460

465

CGT

CTC

ACT

GGT

ACG

AAG

AGA

ACA

TCA

CCG

GGT

GTA

AAG

ATA

GCA

CCT

4422

Arg

Leu

Thr

Gly

Thr

Lys

Arg

Thr

Ser

Pro

Gly

Val

Lys

Ile

Ala

Pro

470

475

480

TTC

AGA

ATC

CTA

GAA

GAG

CAT

CAA

AGT

AGA

CTA

AAA

GCG

CTT

TCT

AAA

4470

Phe

Arg

ile

Leu

Glu

His

Gin

Ser

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

Lys

485 490 495

PL 191 355 B1

ACC G GTATGGATTC TCACCCACTT CATCGGACTC CTTATCACAA AAAACAAAAC 4524

Thr

500

TAAATGATCT TTAAACATGG TTTTGTTACT TGCTGTCTGA CCTTGTTTTT TTTATCATCA

4584

G TG GAA CTC GGG AAA CGA TTC TTC CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC 4629

Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu

505 510 515

GAC Asp

CAG ATT ATG AAC

TGT Cys

GAG Glu

GAC Asp

TTG Leu

ACT CAA

CTG GCT

TGC Cys

GGA Gly 530

GAA Glu

4677

Gin

Ile Met

Asn 520

Thr 525

Gin

Leu

Ala

GAC

ACT

GCT

GAG

AAA

CGA

CTA

CAA

AAG

CAA

AGG

TAC

ATG

GAA

4725

Asp

Thr

Ala

Glu

Lys

Arg

Leu

Gin

Lys

Gin

Arg

Tyr

Met

Glu

535

540

545

ATA

CAA

GAG

ACA

CTA

AAG

GCC

TTT

AGT

GAG

GAC

AAT

TTG

GAA

TTA

4773

Ile

Gin

Glu

Thr

Leu

Lys

Ala

Phe

Ser

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Leu

550

555

560

GGA Gly

AAT TCG

TCC Ser

CTG Leu

ACA GAT

TCG Ser

ACT TCT TCC ACA

TCG Ser

AAA Lys

TCA Ser

ACC Thr

4821

Asn 565

Ser

Thr

Asp 570

Thr

Ser Ser Thr 575

GGT

GGA

AAG

AGG

TCT

AAC

CGT

AAA

CTC

TCT

CAT

CGT

CGG

TGA

4866

Gly

Lys

Arg

Ser

Asn

Arg

Lys

Leu

Ser

His

Arg

★

580

585

590

GACTCTTGCC	TCTTAGTGTA	ATTTTTGCTG	TACCATATAA	TTCTGTTTTC	ATGATGACTG	4926
TAACTGTTTA	TGTCTATCGT	TGGCGTCATA	TAGTTTCGCT	CTTCGTTTTG	CATCCTGTGT	4986
ATTATTGCTG	CAGGTGTGCT	TCAAACAAAT	GTTGTAACAA	TTTGAACCAA	TGGTATACAG	5046
ATTTGTAATA	TATATTTATG	TACATCAACA	ATAACCCATG	ATGGTGTTAC	AGAGTTGCTA	5106
GAATCAAAGT	GTGAAATAAT	GTCAAATTGT	TCATCTGTTG	GATATTTTCC	ACCAAGAACC	5166
AAAAGAATAT	TCAAGTTCCC	TGAACTTCTG	GCAACATTCA	TGTTATATGT	ATCTTCCTAA	5226

PL 191 355 B1

ttcttccttt	AACCTTTTGT	AACTCGAATT	ACACAGCAAG	TTAGTTTCAG	GTCTAGAGAT	5286
AAGAGAACAC	TGAGTGGGCG	TGTAAGGTGC	ATTCTCCTAG	TCAGCTCCAT	TGCATCCAAC	5346
ATTTGTGAAT	GACACAAGTT	AACAATCCTT	TGCACCATTT	CTGGGTGCAT	ACATGGAAAC	5406
TTCTTCGATT	GAAACTTCCC	ACATGTGCAG	GTGGGTTCGC	TGTCACTGAT	AGACCAAGAG	5466
ACTGAAAGCT	TTCACAAATT	GCCCTCAAAT	CTTCTGTTTC	TATCGTCATG	ACTCCATATC	5526
TCCGACCACT	GGTCATGAGC	CAGAGCCCAC	TGATTTTGAG	GGAATTGGGC	TAACCATTTC	5586
CGAGCTTCTG	AGTCCTTCTT	TTTGATGTCC	TTTATGTAGG	AATCAAATTC	TTCCTTCTGA	5646

CTTGTGGAT 5655 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 594 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 2

Met 1

Asp

Thr

Ile 5

Asp

Gly

Phe

Ala

Asp 10

Ser

Tyr

Glu

Ile

Ser 15

Ser

Thr

Ser

Phe

Val 20

Ala

Thr

Asp

Asn

Thr 25

Asp

Ser

Ile

Val 30

Tyr

Leu

Ala

Glu 35

Gin

Val

Leu

Thr

Gly 40

Pro

Asp

Val

Ser

Ala 45

Leu

Gin

Leu

Ser 50

Asn

Ser

Phe

Glu

Ser 55

Val

Phe

Asp

Ser

Pro 60

Asp

Phe

Tyr

Ser

Asp

Ala

Lys

Leu

Val

Leu

Ser

Asp

Gly

Arg

Glu

Val

Ser

Phe

His

PL 191 355 B1

Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser 85

Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser 100

Glu Leu Lys Glu Ile Ala Lys Asp 115 120

Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr 130 135

Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp 145 150

Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu 165

Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr 180

Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu 195 200

Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys 210 215

Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val 225 230

Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu 245

Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys 260

Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu 275 280

Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala 290 295

Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala 90 95

Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu 105 110

Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val 125

Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro 140

Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys 155 160

Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile 170 175

Leu Tyr Gin Arg His Leu Leu Asp 185 190

Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu 205

Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys 220

Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser 235 240

Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu 250 255

Lys His Val Ser Asn Val His Lys 265 270

Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu 285

Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala 300

PL 191 355 B1

Tyr Cys Asn Val 305

Lys

Thr 310

Ala Thr

Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala

315

320

Asp

Val

Asn

His

Arg

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

325

330

335

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Gin

Leu

Ile

Leu

Ser

Leu

Glu

Lys

Gly

340

345

350

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Ala

Thr

Leu

Glu

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Met

Ile

355

360

365

Ala

Lys

Gin

Ala

Thr

Met

Ala

Val

Glu

Cys

Asn

Ile

Pro

Glu

Gin

370

375

380

Cys

Lys

His

Ser

Leu

Lys

dy

Arg

Leu

Cys

Val

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

385

390

395

400

Glu

Asp

Lys

Arg

Glu

Gin

Ile

Pro

Arg

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ala

405

410

415

Val

Ala

Asp

Glu

Leu

Lys

Met

Thr

Leu

Asp

Leu

Glu

Asn

Arg

420

425

430

Val

Ala

Leu

Ala

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Ala

Gin

Ala

Met

435

440

445

Glu

Ile

Ala

Glu

Met

Lys

Gly

Thr

Cys

Glu

Phe

Ile

Val

Thr

Ser

Leu

450

455

460

Glu

Pro

Asp

Arg

Leu

Thr

Gly

Thr

Lys

Arg

Thr

Ser

Pro

Gly

Val

Lys

465

470

475

480

Ile

Ala

Pro

Phe

Arg

Ile

Leu

Glu

His

Gin

Ser

Arg

Leu

Lys

Ala

485

490

495

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

Pro

Arg

Cys

Ser

500

505

510

Ala

Val

Leu

Asp

Gin

Ile

Met

Asn

Cys

Glu

Asp

Leu

Thr

Gin

Leu

Ala

515

520

525

Cys

Gly

Glu

Asp

Thr

Ala

Glu

Lys

Arg

Leu

Gin

Lys

Gin

Arg

530

535

540

PL 191 355 B1

Tyr 545

Met

Glu

Ile

Gin

Glu 550

Thr

Leu

Lys

Ala 555

Phe

Ser

Glu

Asp

Asn 560

Leu

Glu

Leu

Gly

Asn 565

Ser

Leu

Thr

Asp 570

Ser

Thr

Ser

Thr 575

Ser

Lys

Ser

Thr

Gly 560

Gly

Lys

Arg

Ser

Asn 585

Arg

Lys

Leu

Ser

His 590

Arg

Arg * (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 314 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związana (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 3

Met 1

Phe

Gin

Pro

Ala 5

Gly

His

Gly

Gin

Asp 10

Trp

Ala

Met

Glu

Gly 15

Pro

Arg

Asp

Gly

Leu 20

Lys

Glu

Arg

Leu 2S

Val

Asp

Arg

His 30

Asp

Ser

Gly

Leu

Asp 35

Ser

Met

Lys

Asp

Glu 40

Glu

Tyr

Glu

Gin

Met 45

Val

Lys

Glu

Leu

Arg 50

Glu

Ile

Arg

Leu

Gin 55

Pro

Gin

Glu

Ala

Pro 60

Leu

Ala

Glu

Pro

Trp

Lys

Gin

Leu

Thr

Glu

Asp

Gly

Asp

Ser

Phe

Leu

His

Leu

70 75 80

PL 191 355 B1

Cys Val Phe Gly Gly Gin Arg Leu Thr Leu 305 310 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 314 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związana (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 4

Met 1

Phe

Gin Pro Ala 5

Gly His Gly Gin Asp Trp Ala Met Glu Gly Pro

10

15

Arg

Asp

Gly

Leu

Lys

Glu

Arg

Leu

Val

Asp

Arg

His

Asp

Ser

20

25

30

Gly

Leu

Asp

Ser

Met

Lys

Asp

Glu

Asp

Tyr

Glu

Gin

Met

Val

Lys

Glu

35

40

45

Leu

Arg

Glu

Ile

Arg

Leu

Gin

Pro

Gin

Glu

Ala

Pro

Leu

Ala

Glu

50

55

60

Pro

Trp

Lys

Gin

Leu

Thr

Glu

Asp

Gly

Asp

Ser

Phe

Leu

His

Leu

65

70

75

80

Ala

Ile

His

Glu

Lys

Thr

Leu

Thr

Met

Glu

Val

Ile

Gly

Gin

85

90

95

Val

Lys

Gly

Asp

Leu

Ala

Phe

Leu

Asn

Phe

Gin

Asn

Leu

Gin

100

105

110

Thr

Pro

Leu

His

Leu

Ala

Val

Ile

Thr

Asn

Gin

Pro

Gly

Ile

Ala

Glu

115

120

125

PL 191 355 B1

Ala

Leu 130

Leu

Lys

Ala

Gly Cys Asp 135

Pro

Glu Leu

Arg 140

Asp

Phe

Arg

Gly

Asn

Thr

Pro

Leu

His

Leu

Ala

Cys

Glu

Gin

Gly

Cys

Leu

Ala

Ser

Val

145

150

155

160

Ala

Val

Leu

Thr

Gin

Thr

Cys

Thr

Pro

Gin

His

Leu

His

Ser

Val

Leu

165

170

175

Gin

Ala

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

His

Thr

Cys

Leu

His

Leu

Ala

Ser

Ile

180

185

190

His

Gly

Tyr

Leu

Gly

Ile

val

Glu

His

Leu

Val

Thr

Leu

Gly

Ala

Asp

195

200

205

Val

Asn

Ala

Gin

Glu

Pro

Cys

Asn

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

His

Leu

Ala

210

215

220

Val

Asp

Leu

Gin

Asn

Pro

Asp

Leu

Val

Ser

Leu

Lys

Cys

Gly

225

230

235

240

Ala

Asp

Val

Asn

Arg

Val

Thr

Tyr

Gin

Gly

Tyr

Ser

Pro

Tyr

Gin

Leu

245

250

255

Thr

Trp

Gly

Arg

Pro

Ser

Thr

Arg

Ile

Gin

Leu

Gly

Gin

Leu

260

265

270

Thr

Leu

Glu

Asn

Leu

Gin

Thr

Leu

Pro

Glu

Ser

Glu

Asp

Glu

Ser

275

280

285

Tyr

Asp

Thr

Glu

Ser

Glu

Phe

Thr

Glu

Asp

Glu

Leu

Pro

Tyr

Asp

290

295

300

Cys

Val

Phe

Gly

Gin

Arg

Leu

Thr

Leu

305 310 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 314 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas

PL 191 355 B1 (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związana (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi)OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 5

Met 1

Phe Gin

Pro Ala Glu 5

Pro

Gly

Gin

Glu Trp Ala 10

Met

Glu

Gly 15

Pro

Arg

Asp

Ala

Leu

Lys

Glu

Arg

Leu

Asp

Arg

His

Asp

Ser

20

25

30

Gly

Leu

Asp

Ser

Met

Lys

Asp

Glu

Tyr

Glu

Gin

Met

Val

Lys

Glu

35

40

45

Leu

Arg

Glu

Ile

Arg

Leu

Glu

Pro

Gin

Glu

Ala

Pro

Arg

Gly

Ala

Glu

50

55

60

Pro

Trp

Lys

Gin

Leu

Thr

Glu

Asp

Gly

Asp

Ser

Phe

Leu

His

Leu

65

70

75

80

Ala

Ile

His

Glu

Lys

Ala

Leu

Thr

Met

Glu

Val

Arg

Gin

85

90

95

Val

Lys

Gly

Asp

Leu

Ala

Phe

Leu

Asn

Phe

Gin

Asn

Leu

Gin

100

105

110

Thr

Pro

Leu

His

Leu

Ala

Val

Ile

Thr

Asn

Gin

Pro

Glu

Ile

Ala

Glu

115

120

125

Ala

Leu

Glu

Ala

Gly

Cys

ASp

Pro

Glu

Leu

Arg

Asp

Phe

Arg

Gly

130

135

140

Asn

Thr

Pro

Leu

His

Leu

Ala

Cys

Glu

Gin

Gly

Cys

Leu

Ala

Ser

Val

145

150

155

160

Gly

Val

Leu

Thr

Gin

Pro

Arg

Gly

Thr

Gin

His

Leu

His

Ser

Ile

Leu

165 170 175

PL 191 355 B1

Gin

Ala Thr

Asn 180

Tyr Asn Gly

His

Thr 185

Cys

Leu

His

Leu

Ala 190

Ser

Ile

His

Gly

Tzr

Leu

Gly

Ile

Val

Glu

Leu

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Asp

195

200

205

Val

Asn

Ala

Gin

Glu

Pro

Cys

Asn

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

His

Leu

Ala

210

215

220

Val

Asp

Leu

Gin

Asn

Pro

Asp

Leu

Val

Ser

Leu

Lys

Cys

Gly

225

230

235

240

Ala

Asp

Val

Asn

Arg

Val

Thr

Tyr

Gin

Gly

Tyr

Ser

Pro

Tyr

Gin

Leu

245

250

255

Thr

Trp

Gly

Arg

Pro

Ser

Thr

Arg

Ile

Gin

Leu

Gly

Gin

Leu

260

265

270

Thr

Leu

Glu

Asn

Leu

Gin

Met

Leu

Pro

Glu

Ser

Glu

Asp

Glu

Ser

275

280

285

Tyr

Asp

Thr

Glu

Ser

Glu

Phe

Thr

Glu

Asp

Glu

Leu

Pro

Tyr

Asp

290

295

300

Cys

Val

Leu

Gly

Gin

Arg

Leu

Thr

Leu

305 310 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2011 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (vi) ŹRÓDŁO PIERWOTNE:

(A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: różne cechy

PL 191 355 B1 (B) POZYCJA: 1..2011 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „sekwencja cDNA NIM1” (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 43..1824 (D) INNE INFORMACJE: /produkt= „białko NIM1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 6:

GATCTCTTTA ATTTGTGAAT TTCAATTCAT CGGAACCTGT TG ATG GAC ACC ACC 54

Met Asp Thr Thr

ATT Ile 5

GAT GGA

TTC GCC Phe Ala

GAT Asp 10

TCT TAT GAA

ATC AGC AGC

ACT Thr

AGT Ser

TTC Phe

GTC Val 20

102

Asp

Gly

Ser

Tyr Glu

Ile

Ser 15

Ser

GCT

ACC

GAT

AAC

ACC

GAC

TCC

TCT

ATT

GTT

TAT

CTG

GCC

GAA

CAA

150

Ala

Thr

Asp

Asn

Thr

Asp

Ser

Ile

Val

Tyr

Leu

Ala

Glu

Gin

25

30

35

GTA

CTC

ACC

GGA

CCT

GAT

GTA

TCT

GCT

CTG

CAA

TTG

CTC

TCC

AAC

AGC

198

Val

Leu

Thr

Gly

Pro

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

Gin

Leu

Ser

Asn

Ser

40

45

50

TTC

GAA

TCC

GTC

TTT

GAC

TCG

CCG

GAT

TTC

TAC

AGC

GAC

GCT

AAG

246

Phe

Glu

Ser

Val

Phe

Asp

Ser

Pro

Asp

Phe

Tyr

Ser

Asp

Ala

Lys

55

60

65

CTT

GTT

CTC

TCC

GAC

GGC

CGG

GAA

GTT

TCT

TTC

CAC

CGG

TGC

GTT

TTG

294

Leu

Val

Leu

Ser

Asp

Gly

Arg

Glu

Val

Ser

Phe

His

Arg

Cys

Val

Leu

70

75

80

TCA

GCG

AGA

AGC

TCT

TTC

AAG

AGC

GCT

TTA

GCC

GCT

AAG

342

Ser

Ala

Arg

Ser

Phe

Lys

Ser

Ala

Leu

Ala

Lys

85

90

95

100

GAG

AAA

GAC

TCC

AAC

ACC

GCC

GTG

AAG

CTC

GAG

CTT

AAG

GAG

390

Glu

Lys

Asp

Ser

Asn

Thr

Ala

Val

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

Glu

105

110

115

PL 191 355 B1

ATT GCC AAG GAT

TAC GAA GTC

GGT TTC GAT TCG GTT GTG ACT GTT TTG

438

Ile

Ala

Lys Asp 120

Tyr Glu

Val

Gly

Phe 125

Asp

Ser

Val

Thr 130

Val

Leu

GCT

TAT

GTT

TAC

AGC

AGA

GTG

AGA

CCG

CCT

AAA

GGA

GTT

TCT

486

Ala

Tyr

Val

Tyr

Ser

Arg

Val

Arg

Pro

Lys

Gly

Val

Ser

135

140

145

GAA

TGC

GCA

GAC

GAG

AAT

TGC

CAC

GTG

GCT

TGC

CGG

CCG

GCG

GTG

534

Glu

Cys

Ala

Asp

Glu

Asn

Cys

His

Val

Ala

Cys

Arg

Pro

Ala

Val

150

155

160

GAT

TTC

ATG

TTG

GAG

GTT

CTC

TAT

TTG

GCT

TTC

ATC

TTC

AAG

ATC

CCT

582

Asp

Phe

Met

Leu

Glu

Val

Leu

Tyr

Leu

Ala

Phe

Ile

Phe

Lys

ile

Pro

165

170

175

180

GAA

TTA

ATT

ACT

CTC

TAT

CAG

AGG

CAC

TTA

TTG

GAC

GTT

GTA

GAC

AAA

630

Glu

Leu

Ile

Thr

Leu

Tyr

Gin

Arg

His

Leu

Asp

Val

val

Asp

Lys

185

190

195

GTT

ATA

GAG

GAC

ACA

TTG

GTT

ATA

CTC

AAG

CTT

GCT

AAT

ATA

TGT

678

Val

Ile

Glu

Asp

Thr

Leu

Val

Ile

Leu

Lys

Leu

Ala

Asn

Ile

Cys

200

205

210

GGT

AAA

GCT

TGT

ATG

AAG

CTA

TTG

GAT

AGA

TGT

AAA

GAG

ATT

GTC

726

Gly

Lys

Ala

Cys

Met

Lys

Leu

Asp

Arg

Cys

Lys

Glu

Ile

Val

215

220

225

AAG

TCT

AAT

GTA

GAT

ATG

GTT

AGT

CTT

GAA

AAG

TCA

TTG

CCG

GAA

GAG

774

Lys

Ser

Asn

Val

Asp

Met

Val

Ser

Leu

Glu

Lys

Ser

Leu

Pro

Glu

230

235

240

CTT

GTT

AAA

GAG

ATA

ATT

GAT

AGA

CGT

AAA

GAG

CTT

GGT

TTG

GAG

GTA

822

Leu

Val

Lys

Glu

ile

Asp

Arg

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Glu

Val

245

250

255

260

CCT

AAA

GTA

AAG

AAA

CAT

GTC

TCG

AAT

GTA

CAT

AAG

GCA

CTT

GAC

TCG

870

Pro

Lys

Val

Lys

His

Val

Ser

Asn

Val

His

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

265

270

275

GAT

ATT

GAG

TTA

GTC

AAG

TTG

CTT

TTG

AAA

GAG

GAT

CAC

ACC

AAT

918

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Lys

Glu

Asp

His

Thr

Asn

280 285 290

PL 191 355 B1

CTA

GAT

GCG

TGT

GCT

CTT

CAT

TTC

GCT

GTT

GCA

TAT

TGC

AAT

GTG

966

Leu

Asp

Ala

Cys

Ala

Leu

His

Phe

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asn

Val

295

300

305

AAG Lys

ACC Thr 310

GCA Ala

ACA GAT Thr Asp

CTT TTA AAA CTT GAT CTT

GCC Ala 320

GAT Asp

GTC AAC

CAT His

1014

Leu

Leu 315

Lys

Leu

Asp

Leu

Val

Asn

AGG

AAT

CCG

AGG

GGA

TAT

ACG

GTG

CTT

CAT

GTT

GCT

GCG

ATG

CGG

AAG

1062

Arg

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

Met

Arg

Lys

325

330

335

340

GAG

CCA

CAA

TTG

ATA

CTA

TCT

CTA

TTG

GAA

AAA

GGT

GCA

AGT

GCA

TCA

1110

Glu

Pro

Gin

Leu

Ile

Leu

Ser

Leu

Glu

Lys

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

345

350

355

GAA

GCA

ACT

TTG

GAA

GGT

AGA

ACC

GCA

CTC

ATG

ATC

GCA

AAA

CAA

GCC

1158

Glu

Ala

Thr

Leu

Glu

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Met

Ile

Ala

Lys

Gin

Ala

360

365

370

ACT

ATG

GCG

GTT

GAA

TGT

AAT

ATC

CCG

GAG

CAA

TGC

AAG

CAT

TCT

1206

Thr

Met

Ala

Val

Glu

Cys

Asn

Ile

Pro

Glu

Gin

Cys

Lys

His

Ser

375

380

385

CTC

AAA

GGC

CGA

CTA

TGT

GTA

GAA

ATA

CTA

GAG

CAA

GAA

GAC

AAA

CGA

1254

Leu

Lys

Gly

Arg

Leu

Cys

Val

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

Glu

Asp

Lys

Arg

390

395

400

GAA

CAA

ATT

CCT

AGA

GAT

GTT

CCT

CCC

TCT

TTT

GCA

GTG

GCG

GCC

GAT

1302

Glu

Gin

Ile

Pro

Arg

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ala

Val

Ala

Asp

405

410

415

420

GAA

TTG

AAG

ATG

ACG

CTG

CTC

GAT

CTT

GAA

AAT

AGA

GTT

GCA

CTT

GCT

1350

Glu

Leu

Lys

Met

Thr

Leu

Asp

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Ala

Leu

Ala

425

430

435

CAA

CGT

CTT

TTT

CCA

ACG

GAA

GCA

CAA

GCT

GCA

ATG

GAG

ATC

GCC

GAA

1398

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Ala

Gin

Ala

Met

Glu

Ile

Ala

Glu

440

445

450

ATG

AAG

GGA

ACA

TGT

GAG

TTC

ATA

GTG

ACT

AGC

CTC

GAG

CCT

GAC

CGT

1446

Met

Lys

Gly

Thr

Cys

Glu

Phe

Ile

val

Thr

Ser

Leu

Glu

Pro

Asp

Arg

455 460 465

PL 191 355 B1

CTC Leu

ACT Thr 470

GGT ACG AAG

AGA Arg

ACA Thr 475

TCA Ser

CCG GGT GTA AAG

ATA GCA

CCT Pro

TTC Phe

1494

Gly

Thr Lys

Pro

Gly

Val

Lys 480

Ile

Ala

AGA

ATC

CTA

GAA

GAG

CAT

CAA

AGT

AGA

CTA

AAA

GCG

CTT

TCT

AAA

ACC

1542

Arg

Ile

Leu

Glu

His

Gin

Ser

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

Lys

Thr

485

490

495

500

GTG

GAA

CTC

GGG

AAA

CGA

TTC

ttc

CCG

CGC

TGT

TCG

GCA

GTG

CTC

GAC

1590

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

Pro

Arg

Cys

Ser

Ala

Val

Leu

Asp

505

510

515

CAG

ATT

ATG

AAC

TGT

GAG

GAC

TTG

ACT

CAA

CTG

GCT

TGC

GGA

GAA

GAC

1638

Gin

Ile

Met

Asn

Cys

Glu

Asp

Leu

Thr

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Glu

Asp

520

525

530

GAC

ACT

GCT

GAG

AAA

CGA

CTA

CAA

AAG

CAA

AGG

TAC

ATG

GAA

ATA

1686

Asp

Thr

Ala

Glu

Lys

Arg

Leu

Gin

Lys

Gin

Arg

Tyr

Met

Glu

Ile

535

540

545

CAA

GAG

ACA

CTA

AAG

GCC

TTT

AGT

GAG

GAC

AAT

TTG

GAA

TTA

GGA

1734

Gin

Glu

Thr

Leu

Lys

Ala

Phe

Ser

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Leu

Gly

550

555

560

AAT

TTG

TCC

CTG

ACA

GAT

TCG

ACT

TCT

TCC

ACA

TCG

AAA

TCA

ACC

GGT

1782

Asn

Leu

Ser

Leu

Thr

Asp

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

Lys

Ser

Thr

Gly

565

570

575

580

GGA

AAG

AGG

TCT

AAC

CGT

AAA

CTC

TCT

CAT

CGT

CGG

TGA

1824

Gly

Lys

Arg

Ser

Asn

Arg

Lys

Leu

Ser

His

Arg

★

585 590

GACTCTTGCC TCTTAGTGTA ATTTTTGCTG TACCATATAA TTCTGTTTTC ATGATGACTG 1884

TAACTGTTTA TGTCTATCGT TGGCGTCATA TAGTTTCGCT CTTCGTTTTG CATCCTGTGT

ATTATTGCTG CAGGTGTGCT TCAAACAAAT GTTGTAACAA TTTGAACCAA TGGTATACAG

ATTTGTA

1944

2004

2011

PL 191 355 B1 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2011 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: różne cechy (B) POZYCJA: 43..1824 (D) INNE INFORMACJE: /produkt= „zmieniona forma NIM1 /uwaga= „reszty seryny w pozycjach aminokwasów 55 i 59 w dzikim produkcie genu NIMI zostały zmienione na reszty alaniny (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: różne cechy (B) POZYCJA: 205..217 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= „nukleotydy 205 i 217 zmienione z T na G w porównaniu z sekwencją dziką” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 7:

GATCTCTTTA ATTTGTGAAT TTCAATTCAT CGGAACCTGT TG ATG GAC ACC ACC 54

Met Asp Thr Thr

ATT GAT

GGA Gly

TTC Phe

GCC GAT

TCT Ser

TAT GAA Tyr Glu

ATC AGC

AGC Ser

ACT AGT

TTC Phe

GTC Val 20

102

Ile 5

Asp

Ala

Asp 10

Ile

Ser 15

Thr

Ser

GCT

ACC

GAT

AAC

ACC

GAC

TCC

TCT

ATT

GTT

TAT

CTG

GCC

GAA

CAA

150

Ala

Thr

Asp

Asn

Thr

Asp

Ser

ile

Val

Tyr

Leu

Ala

Glu

Gin

25

30

35

GTA

CTC

ACC

GGA

CCT

GAT

GTA

TCT

GCT

CTG

CAA

TTG

CTC

TCC

AAC

AGC

198

Val

Leu

Thr

Gly

Pro

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

Gin

Leu

Ser

Asn

Ser

40

45

50

PL 191 355 B1

TTC Phe

GAA Glu

GCC GTC

TTT GAC

GCG CCG GAT GAT

TTC TAC AGC GAC GCT AAG

246

Ala 55

Val

Phe

Asp

Ala

Pro Asp 50

Asp

Phe

Tyr

Ser 65

Asp

Ala

Lys

CTT

GTT

CTC

TCC

GAC

GGC

CGG

GAA

GTT

TCT

TTC

CAC

CGG

TGC

GTT

TTG

294

Leu

Val

Leu

Ser

Asp

Gly

Arg

Glu

Val

Ser

Phe

His

Arg

Cys

Val

Leu

70

75

80

TCA

GCG

AGA

AGC

TCT

TTC

AAG

AGC

GCT

TTA

GCC

GCT

AAG

342

Ser

Ala

Arg

Ser

Phe

Lys

Ser

Ala

Leu

Ala

Lys

85

90

95

100

GAG

AAA

GAC

TCC

AAC

ACC

GCC

GTG

AAG

CTC

GAG

CTT

AAG

GAG

390

Glu

Lys

Asp

Ser

Asn

Thr

Ala

Val

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

Glu

105

110

115

ATT

GCC

AAG

GAT

TAC

GAA

GTC

GGT

TTC

GAT

TCG

GTT

GTG

ACT

GTT

TTG

438

Ile

Ala

Lys

Asp

Tyr

Glu

Val

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

Thr

Val

Leu

120

125

130

GCT

TAT

GTT

TAC

AGC

AGA

GTG

AGA

CCG

CCT

AAA

GGA

GTT

TCT

486

Ala

Tyr

Val

Tyr

Ser

Arg

Val

Arg

Pro

Lys

Gly

val

Ser

135

140

145

GAA

TGC

GCA

GAC

GAG

AAT

TGC

CAC

GTG

GCT

TGC

CGG

CCG

GCG

GTG

534

Glu

Cys

Ala

Asp

Glu

Asn

Cys

His

Val

Ala

Cys

Arg

Pro

Ala

Val

150

155

160

GAT

TTC

ATG

TTG

GAG

GTT

CTC

TAT

TTG

GCT

TTC

ATC

TTC

AAG

ATC

CCT

582

Asp

Phe

Met

Leu

Glu

Val

Leu

Tyr

Leu

Ala

Phe

Ile

Phe

Lys

Ile

Pro

165

170

175

180

GAA

TTA

ATT

ACT

CTC

TAT

CAG

AGG

CAC

TTA

TTG

GAC

GTT

GTA

GAC

AAA

630

Glu

Leu

Ile

Thr

Leu

Tyr

Gin

Arg

His

Leu

Asp

Val

Asp

Lys

185

190

195

GTT

ATA

GAG

GAC

ACA

TTG

GTT

ATA

CTC

AAG

CTT

GCT

AAT

ATA

TGT

678

Val

Ile

Glu

Asp

Thr

Leu

Val

Ile

Leu

Lys

Leu

Ala

Asn

Ile

Cys

200

205

210

GGT

AAA

GCT

TGT

ATG

AAG

CTA

TTG

GAT

AGA

TGT

AAA

GAG

ATT

GTC

726

Gly

Lys

Ala

Cys

Met

Lys

Leu

Asp

Arg

Cys

Lys

Glu

Ile

Val

215 220 225

PL 191 355 B1

AAG TCT AAT

GTA GAT

ATG Met

GTT AGT CTT GAA AAG TCA TTG CCG GAA GAG

774

Lys

Ser Asn 230

Val

Asp

Val 235

Ser

Leu

Glu

Lys

Ser 240

Leu

Pro

Glu

CTT

GTT

AAA

GAG

ATA

ATT

GAT

AGA

CGT

AAA

GAG

CTT

GGT

TTG

GAG

GTA

822

Leu

Val

Lys

Glu

Ile

Asp

Arg

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Glu

Val

245

250

255

260

CCT

AAA

GTA

AAG

AAA

CAT

GTC

TCG

AAT

GTA

CAT

AAG

GCA

CTT

GAC

TCG

870

Pro

Lys

Val

Lys

His

Val

Ser

Asn

Val

His

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

265

270

275

GAT

ATT

GAG

TTA

GTC

AAG

TTG

CTT

TTG

AAA

GAG

GAT

CAC

ACC

AAT

918

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Lys

Glu

Asp

His

Thr

Asn

280

285

290

CTA

GAT

GCG

TGT

GCT

CTT

CAT

TTC

GCT

GTT

GCA

TAT

TGC

AAT

GTG

966

Leu

Asp

Ala

Cys

Ala

Leu

His

Phe

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asn

Val

295

300

305

AAG

ACC

GCA

ACA

GAT

CTT

TTA

AAA

CTT

GAT

CTT

GCC

GAT

GTC

AAC

CAT

1014

Lys

Thr

Ala

Thr

Asp

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Ala

Asp

Val

Asn

His

310

315

320

AGG

AAT

CCG

AGG

GGA

TAT

ACG

GTG

CTT

CAT

GTT

GCT

GCG

ATG

CGG

AAG

1062

Arg

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

Met

Arg

Lys

325

330

335

340

GAG

CCA

CAA

TTG

ATA

CTA

TCT

CTA

TTG

GAA

AAA

GGT

GCA

AGT

GCA

TCA

1110

Glu

Pro

Gin

Leu

Ile

Leu

Ser

Leu

Glu

Lys

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

345

350

355

GAA

GCA

ACT

TTG

GAA

GGT

AGA

ACC

GCA

CTC

ATG

ATC

GCA

AAA

CAA

GCC

1158

Glu

Ala

Thr

Leu

Glu

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Met

Ile

Ala

Lys

Gin

Ala

360

365

370

ACT

ATG

GCG

GTT

GAA

TGT

AAT

ATC

CCG

GAG

CAA

TGC

AAG

CAT

TCT

1206

Thr

Met

Ala

Val

Glu

Cys

Asn

Ile

Pro

Glu

Gin

Cys

Lys

His

Ser

375

380

385

CTC

AAA

GGC

CGA

CTA

TGT

GTA

GAA

ATA

CTA

GAG

CAA

GAA

GAC

AAA

CGA

1254

PL 191 355 B1

Leu Lys Gly

Arg

Leu

Cys

Val 395

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin 400

Glu Asp

Lys

Arg

390

GAA

CAA

ATT

CCT

AGA

GAT

GTT

CCT

CCC

TCT

TTT

GCA

GTG

GCG

GCC

GAT

1302

Glu

Gin

Ile

Pro

Arg

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ala

Val

Ala

Asp

405

410

415

420

GAA

TTG

AAG

ATG

ACG

CTG

CTC

GAT

CTT

GAA

AAT

AGA

GTT

GCA

CTT

GCT

1350

Glu

Leu

Lys

Met

Thr

Leu

Asp

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Ala

Leu

Ala

425

430

435

CAA

CGT

CTT

TTT

CCA

ACG

GAA

GCA

CAA

GCT

GCA

ATG

GAG

ATC

GCC

GAA

1398

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Ala

Gin

Ala

Met

Glu

Ile

Ala

Glu

440

445

450

ATG

AAG

GGA

ACA

TGT

GAG

TTC

ATA

GTG

ACT

AGC

CTC

GAG

CCT

GAC

CGT

1446

Met

Lys

Gly

Thr

Cys

Glu

Phe

Ile

Val

Thr

Ser

Leu

Glu

Pro

Asp

Arg

455

460

465

CTC

ACT

GGT

ACG

AAG

AGA

ACA

TCA

CCG

GGT

GTA

AAG

ATA

GCA

CCT

TTC

1494

Leu

Thr

Gly

Thr

Lys

Arg

Thr

Ser

Pro

Gly

Val

Lys

Ile

Ala

Pro

Phe

470

475

480

AGA

ATC

CTA

GAA

GAG

CAT

CAA

AGT

AGA

CTA

AAA

GCG

CTT

TCT

AAA

ACC

1542

Arg

Ile

Leu

Glu

His

Gin

Ser

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

Lys

Thr

485

490

495

500

GTG

GAA

CTC

GGG

AAA

CGA

TTC

CCG

CGC

TGT

TCG

GCA

GTG

CTC

GAC

1590

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

Pro

Arg

Cys

Ser

Ala

Val

Leu

Asp

505

510

515

CAG

ATT

ATG

AAC

TGT

GAG

GAC

TTG

ACT

CAA

CTG

GCT

TGC

GGA

GAA

GAC

1638

Gin

Ile

Met

Asn

Cys

Glu

Asp

Leu

Thr

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Glu

Asp

520

525

530

GAC

ACT

GCT

GAG

AAA

CGA

CTA

CAA

AAG

CAA

AGG

TAC

ATG

GAA

ATA

1686

Asp

Thr

Ala

Glu

Lys

Arg

Leu

Gin

Lys

Gin

Arg

Tyr

Met

Glu

ile

535

540

545

CAA

GAG

ACA

CTA

AAG

GCC

TTT

AGT

GAG

GAC

AAT

TTG

GAA

TTA

GGA

1734

Gin

Glu

Thr

Leu

Lys

Ala

Phe

Ser

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Leu

Gly

550 555 560

PL 191 355 B1

AAT Asn 565

TTG TCC

CTG Leu

ACA Thr

GAT Asp 570

TCG Ser

ACT Thr

TCT Ser

TCC Ser

ACA Thr 575

TCG AAA TCA

ACC Thr

GGT Gly 5Θ0

1782

Leu

Ser

Lys

Ser

GGA

AAG

AGG

TCT

AAC

CGT

AAA

CTC

tct

CAT

CGT

CGG

TGA

1824

dy

Lys

Arg

Ser

Asn

Arg

Lys

Leu

Ser

His

Arg

	585		590
GACTCTTGCC	TCTTAGTGTA	ATTTTTGCTG	TACCATATAA	TTCTGTTTTC	ATGATGACTG	1884
TAACTGTTTA	TGTCTATCGT	TGGCGTCATA	TAGTTTCGCT	CTTCGTTTTG	CATCCTGTGT	1944
ATTATTGCTG	CAGGTGTGCT	TCAAACAAAT	GTTGTAACAA	TTTGAACCAA	TGGTATACAG	2004

ATTTGTA 2011 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 594 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 8

Met 1

Asp

Thr

Ile 5

Asp

Gly

Phe

Ala

Asp 10

Ser

Tyr

Glu

Ile

Ser 15

Ser

Thr

Ser

Phe

Val 20

Ala

Thr

Asp

Asn

Thr 25

Asp

Ser

Ile

Val 30

Tyr

Leu

Ala

Glu 35

Gin

Val

Leu

Thr

Gly 40

Pro

Asp

Val

Ser

Ala 45

Leu

Gin

Leu

Ser 50

Asn

Ser

Phe

Glu

Ala 55

Val

Phe

Asp

Ala

Pro 60

Asp

Phe

Tyr

Ser 65

Asp

Ala

Lys

Leu

Val 70

Leu

Ser

Asp

Gly

Arg 75

Glu

Val

Ser

Phe

His 80

PL 191 355 B1

Arg Cys

Val

Leu Ser 35

Ala

Arg Ser

Ser Phe 90

Phe

Lys

Ser

Ala

Leu 95

Ala

Lys

Glu

Lys

Asp

Ser

Asn

Thr

Ala

Val

Lys

Leu

100

105

110

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile

Ala

Lys

Asp

Tyr

Glu

Val

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

115

120

125

Val

Thr

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Tyr

Ser

Arg

Val

Arg

Pro

130

135

140

Lys

Gly

Val

Ser

Glu

Cys

Ala

Asp

Glu

Asn

Cys

His

Val

Ala

Cys

145

150

155

160

Arg

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Met

Leu

Glu

Val

Leu

Tyr

Leu

Ala

Phe

Ile

165

170

175

Phe

Lys

Ile

Pro

Glu

Leu

Ile

Thr

Leu

Tyr

Gin

Arg

His

Leu

Asp

180

185

190

Val

Asp

Lys

Val

Ile

Glu

Asp

Thr

Leu

Val

Ile

Leu

Lys

Leu

195

200

205

Ala

Asn

Ile

Cys

Gly

Lys

Ala

Cys

Met

Lys

Leu

Asp

Arg

Cys

Lys

210

215

220

Glu

Ile

Val

Lys

Ser

Asn

Val

Asp

Met

Val

Ser

Leu

Glu

Lys

Ser

225

230

235

240

Leu

Pro

Glu

Leu

Val

Lys

Glu

Ile

ASp

Arg

Lys

Glu

Leu

245

250

255

Gly

Leu

Glu

Val

Pro

Lys

Val

Lys

His

Val

Ser

Asn

Val

His

Lys

260

265

270

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Lys

Glu

275

280

285

Asp

His

Thr

Asn

Leu

Asp

Ala

Cys

Ala

Leu

His

Phe

Ala

Val

Ala

290

295

300

Tyr

Cys

Asn

Val

Lys

Thr

Ala

Thr

Asp

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Ala

305 310 315 320

PL 191 355 B1

Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala 325 330 335

Ala Met Arg Lys

Glu

Pro Gin Leu

Ile Leu 345

Ser

Leu Leu Glu 350

Lys

Gly

340

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Ala

Thr

Leu

Glu

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Met

Ile

355

360

365

Ala

Lys

Gin

Ala

Thr

Met

Ala

Val

Glu

Cys

Asn

Ile

Pro

Glu

Gin

370

375

380

Cys

Lys

His

Ser

Leu

Lys

Gly

Arg

Leu

Cys

Val

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

385

390

395

400

Glu

Asp

Lys

Arg

Glu

Gin

Ile

Pro

Arg

Asp

Val

Pro

Ser

Phe

Ala

405

410

415

Val

Ala

Asp

Glu

Leu

Lys

Met

Thr

Leu

Asp

Leu

Glu

Asn

Arg

420

425

430

Val

Ala

Leu

Ala

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Ala

Gin

Ala

Met

435

440

445

Glu

Ile

Ala

Glu

Met

Lys

Gly

Thr

Cys

Glu

Phe

Ile

Val

Thr

Ser

Leu

450

455

460

Glu

Pro

Asp

Arg

Leu

Thr

Gly

Thr

Lys

Arg

Thr

Ser

Pro

Gly

val

Lys

465

470

475

480

Ile

Ala

Pro

Phe

Arg

Ile

Leu

Glu

His

Gin

Ser

Arg

Leu

Lys

Ala

485

490

495

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

Pro

Arg

Cys

Ser

500

505

510

Ala

Val

Leu

Asp

Gin

Ile

Met

Asn

Cys

Glu

Asp

Leu

Thr

Gin

Leu

Ala

515

520

525

Cys

Gly

Glu

Asp

Thr

Ala

Glu

Lys

Arg

Leu

Gin

Lys

Gin

Arg

530

535

540

PL 191 355 B1

Tyr 545

Met

Glu

Ile Gin Glu 550

Thr Leu Lys

Lys

Ais 555

Phe

Ser

Glu

Asp

Asn 560

Leu

Glu

Leu

Gly

Asn

Leu

Ser

Leu

Thr

Asp

Ser

Thr

Ser

Thr

Ser

565

570

575

Lys

Ser

Thr

Gly

Lys

Arg

Ser

Asn

Arg

Lys

Leu

Ser

His

Arg

580 535 590

Arg (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1597 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1..1410 (D) INNE INFORMACJE: /produkt= „zmieniona forma NIM1” /uwaga= „N-końcowa delecja w porównaniu z dziką sekwencją NIM 1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 9

ATG GAT TCG

GTT GTG ACT GTT TTG GCT

TAT GTT TAC

AGC Ser

AGA Arg 15

GTG Val

48

Met 1

Asp

Ser

Val

Val 5

Thr

Val

Leu

Ala

Tyr 10

Val

Tyr

AGA

CCG

CCT

AAA

GGA

GTT

TCT

GAA

TGC

GCA

GAC

GAG

AAT

TGC

96

Arg

Pro

Lys

Gly

Val

Ser

Glu

Cys

Ala

Asp

Glu

Asn

Cys

20

25

30

CAC

GTG

GCT

TGC

CGG

CCG

GCG

GTG

GAT

TTC

ATG

TTG

GAG

GTT

CTC

TAT

144

PL 191 355 B1

His

Val

Ala 35

Cys

Arg

Pro

Ala

Val 40

Asp

Phe

Met

Leu

Glu 45

Val

Leu

Tyr

TTG

GCT

TTC

ATC

TTC

AAG

ATC

CCT

GAA

TTA

ATT

ACT

CTC

TAT

CAG

AGG

192

Leu

Ala 50

Phe

Ile

Phe

Lys

Ile 55

Pro

Glu

Leu

Ile

Thr 60

Leu

Tyr

Gin

Arg

CAC

TTA

TTG

GAC

GTT

GTA

GAC

AAA

GTT

ATA

GAG

GAC

ACA

TTG

GTT

240

His 65

Leu

Asp

Val

Val 70

Asp

Lys

Val

Ile 75

Glu

Asp

Thr

Leu

Val 80

ATA

CTC

AAG

CTT

GCT

AAT

ATA

TGT

GGT

AAA

GCT

TGT

ATG

AAG

CTA

TTG

288

Ile

Leu

Lys

Leu

Ala 85

Asn

Ile

Cys

Gly

Lys 90

Ala

Cys

Met

Lys

Leu 95

Leu

GAT

AGA

TGT

AAA

GAG

ATT

GTC

AAG

TCT

AAT

GTA

GAT

ATG

GTT

AGT

336

Asp

Arg

Cys

Lys 100

Glu

Ile

Val

Lys 105

Ser

Asn

Val

Asp

Met 110

Val

Ser

CTT

GAA

AAG

TCA

TTG

CCG

GAA

GAG

CTT

GTT

AAA

GAG

ATA

ATT

GAT

AGA

384

Leu

Glu

Lys 115

Ser

Leu

Pro

Glu

Glu 120

Leu

Val

Lys

Glu

Ile 125

Ile

Asp

Arg

CGT

AAA

GAG

CTT

GGT

TTG

GAG

GTA

CCT

AAA

GTA

AAG

AAA

CAT

GTC

TCG

432

Arg

Lys 130

Glu

Leu

Gly

Leu

Glu 135

Val

Pro

Lys

Val

Lys 140

Lys

His

Val

Ser

AAT

GTA

CAT

AAG

GCA

CTT

GAC

TCG

GAT

ATT

GAG

TTA

GTC

AAG

TTG

480

Asn 145

Val

His

Lys

Ala

Leu 150

Asp

Ser

Asp

Ile 155

Glu

Leu

Val

Lys

Leu 160

CTT

TTG

AAA

GAG

GAT

CAC

ACC

AAT

CTA

GAT

GCG

TGT

GCT

CTT

CAT

528

Leu

Lys

Glu

Asp 165

His

Thr

Asn

Leu

Asp 170

Asp

Ala

Cys

Ala

Leu 175

His

TTC

GCT

GTT

GCA

TAT

TGC

AAT

GTG

AAG

ACC

GCA

ACA

GAT

CTT

TTA

AAA

576

Phe

Ala

Val

Ala 180

Tyr

Cys

Asn

Val

Lys 185

Thr

Ala

Thr

Asp

Leu 190

Leu

Lys

CTT

GAT

CTT

GCC

GAT

GTC

AAC

CAT

AGG

AAT

CCG

AGG

GGA

TAT

ACG

GTG

624

Leu

Asp

Leu 195

Ala

Asp

Val

Asn

His 200

Arg

Asn

Pro

Arg

Gly 205

Tyr

Thr

Val

PL 191 355 B1

CTT Leu

CAT His 210

GTT Val

GCT Ala

GCG Ala

ATG Met

CGG Arg 215

AAG Lys

GAG Glu

CCA CAA TTG ATA CTA

TCT Ser

CTA Leu

672

Pro

Gin

Leu 220

Ile

Leu

TTG

GAA

AAA

GGT

GCA

AGT

GCA

TCA

GAA

GCA

ACT

TTG

GAA

GGT

AGA

ACC

720

Leu

Glu

Lys

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Ala

Thr

Leu

Glu

Gly

Arg

Thr

225

230

235

240

GCA

CTC

ATG

ATC

GCA

AAA

CAA

GCC

ACT

ATG

GCG

GTT

GAA

TGT

AAT

763

Ala

Leu

Met

Ile

Ala

Lys

Gin

Ala

Thr

Met

Ala

Val

Glu

Cys

Asn

245

250

255

ATC

CCG

GAG

CAA

TGC

AAG

CAT

TCT

CTC

AAA

GGC

CGA

CTA

TGT

GTA

GAA

816

Ile

Pro

Glu

Gin

Cys

Lys

His

Ser

Leu

Lys

Gly

Arg

Leu

Cys

Val

Glu

260

265

270

ATA

CTA

GAG

CAA

GAA

GAC

AAA

CGA

GAA

CAA

ATT

CCT

AGA

GAT

GTT

CCT

864

Ile

Leu

Glu

Gin

Glu

Asp

Lys

Arg

Glu

Gin

Ile

Pro

Arg

Asp

Val

Pro

275

260

285

CCC

TCT

TTT

GCA

GTG

GCG

GCC

GAT

GAA

TTG

AAG

ATG

ACG

CTG

CTC

GAT

912

Pro

Ser

Phe

Ala

Val

Ala

Asp

Glu

Leu

Lys

Met

Thr

Leu

Asp

290

295

300

CTT

GAA

AAT

AGA

GTT

GCA

CTT

GCT

CAA

CGT

CTT

TTT

CCA

ACG

GAA

GCA

960

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Ala

Leu

Ala

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Ala

305

310

315

320

CAA

GCT

GCA

ATG

GAG

ATC

GCC

GAA

ATG

AAG

GGA

ACA

TGT

GAG

TTC

ATA

1008

Gin

Ala

Met

Glu

Ile

Ala

Glu

Met

Lys

Gly

Thr

Cys

Glu

Phe

Ile

325

330

335

GTG

ACT

AGC

CTC

GAG

CCT

GAC

CGT

CTC

ACT

GGT

ACG

AAG

AGA

ACA

TCA

1056

Val

Thr

Ser

Leu

Glu

Pro

Asp

Arg

Leu

Thr

Gly

Thr

Lys

Arg

Thr

Ser

340

345

350

CCG

GGT

GTA

AAG

ATA

GCA

CCT

TTC

AGA

ATC

CTA

GAA

GAG

CAT

CAA

AGT

1104

Pro

Gly

Val

Lys

Ile

Ala

Pro

Phe

Arg

Ile

Leu

Glu

His

Gin

Ser

355

360

365

AGA

CTA

AAA

GCG

CTT

TCT

AAA

ACC

GTG

GAA

CTC

GGG

AAA

CGA

TTC

1152

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

370

375

380

PL 191 355 B1

CCG Pro 385

CGC TGT Arg Cys

TCG GCA Ser Ala

GTG CTC GAC CAG ATT ATG AAC TGT GAG GAC TTG

1200

Val 390

Leu

Asp

Gin

Ile

Met 395

Asn

Cys

Glu

Asp

Leu 400

ACT

CAA

CTG

GCT

TGC

GGA

GAA

GAC

ACT

GCT

GAG

AAA

CGA

CTA

CAA

1248

Thr

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Glu

Asp

Thr

Ala

Glu

Lys

Arg

Leu

Gin

405

410

415

AAG

CAA

AGG

TAC

ATG

GAA

ATA

CAA

GAG

ACA

CTA

AAG

GCC

TTT

1296

Lys

Gin

Arg

Tyr

Met

Glu

Ile

Gin

Glu

Thr

Leu

Lys

Ala

Phe

420

425

430

AGT

GAG

GAC

AAT

TTG

GAA

TTA

GGA

AAT

TTG

TCC

CTG

ACA

GAT

TCG

ACT

1344

Ser

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Leu

Gly

Asn

Leu

Ser

Leu

Thr

Asp

Ser

Thr

435

440

445

TCT

TCC

ACA

TCG

AAA

TCA

ACC

GGT

GGA

AAG

AGG

TCT

AAC

CGT

AAA

CTC

1392

Ser

Thr

Ser

Lys

Ser

Thr

Gly

Lys

Arg

Ser

Asn

Arg

Lys

Leu

450 455 460

TCT CAT CGT CGT CGG TGA GACTCTTGCC TCTTAGTGTA ATTTTTGCTG 1440

Ser His Arg Arg Arg *

465 470

TACCATATAA	TTCTGTTTTC	ATGATGACTG	TAACTGTTTA	TGTCTATCGT	TGGCGTCATA	1500
TAGTTTCGCT	CTTCGTTTTG	CATCCTGTGT	ATTATTGCTG	CAGGTGTGCT	TCAAACAAAT	1560
GTTGTAACAA	TTTGAACCAA	TGGTATACAG	ATTTGTA			1597

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 470 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 10

PL 191 355 B1

Met Asp Ser Val Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val 15 10 15

Arg Pro Pro Pro Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys 20 25 30

His Val Ala Cys Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr 35 40 45

Leu Ala Phe Ile Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gin Arg 50 55 60

His Leu Leu Asp Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val 65 70 75 80

Ile Leu Lys Leu Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu 85 90 95

Asp Arg Cys Lys Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser 100 105 110

Leu Glu Lys Ser Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg 115 120 125

Arg Lys Glu Leu Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser 130 135 140

Asn Val His Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Lys Glu Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His

165 170 175

Phe Ala Val Ala Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys 180 185 190

Leu Asp Leu Ala Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val 195 200 205

Leu His Val Ala Ala Met Arg Lys Glu Pro Gin Leu Ile Leu Ser Leu 210 215 220

Leu Glu Lys Gly Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr

PL 191 355 B1

225

230

235

240

Ala

Leu

Met

Ile

Ala

Lys

Gin

Ala

Thr

Met

Ala

Val

Glu

cys

Asn

245

250

255

Ile

Pro

Glu

Gin

Cys

Lys

His

Ser

Leu

Lys

Gly

Arg

Leu

Cys

Val

Glu

260

265

270

Ile

Leu

Glu

Gin

Glu

Asp

Lys

Arg

Glu

Gin

Ile

Pro

Arg

Asp

Val

p

275

280

285

Pro

Ser

Phe

Ala

Val

Ala

Asp

Glu

Leu

Lys

Met

Thr

Leu

Asp

290

295

300

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Ala

Leu

Ala

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Ala

305

310

315

320

Gin

Ala

Met

Glu

Ile

Ala

Glu

Met

Lys

Gly

Thr

Cys

Glu

Phe

Ile

325

330

335

Val

Thr

Ser

Leu

Glu

Pro

Asp

Arg

Leu

Thr

Gly

Thr

Lys

Arg

Thr

Ser

340

345

350

Pro

Gly

Val

Lys

Ile

Ala

Pro

Phe

Arg

Ile

Leu

Glu

His

Gin

Ser

355

360

365

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

370

375

380

Pro

Arg

Cys

Ser

Ala

Val

Leu

Asp

Gin

Ile

Met

Asn

Cys

Glu

Asp

Leu

385

3 90

395

400

Thr

Gin

Leu

Ala

Cys

Gly

Glu

Asp

Thr

Ala

Glu

Lys

Arg

Leu

Gin

405

410

415

Lys

Gin

Arg

Tyr

Met

Glu

Ile

Gin

Glu

Thr

Leu

Lys

Ala

Phe

420

425

430

Ser

Glu

Asp

Asn

Leu

Glu

Leu

Gly

Asn

Leu

Ser

Leu

Thr

Asp

Ser

Thr

435

440

445

Ser

Thr

Ser

Lys

Ser

Thr

Gly

Lys

Arg

Ser

Asn

Arg

Lys

Leu

450 455 460

PL 191 355 B1

Ser His Arg Arg Arg *

465 470 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 11:

(Ϊ) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1608 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 43..1608 (D) INNE INFORMACJE: /produkt= „zmieniona forma NIM1” /uwaga= „C-końcowa delecja w porównaniu z dziką sekwencją NIM1 (xi)OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 11:

GATCTCTTTA ATTTGTGAAT TTCAATTCAT CGGAACCTGT TG ATG GAC ACC ACC 54

Mec Asp Thr Thr

ATT GAT GGA TTC GCC GAT

TCT TAT GAA ATC AGC AGC ACT

AGT TTC Ser Phe

GTC Val 20

102

Ile Asp 5

Gly

Phe Ala

Asp 10

Ser

Tyr Glu

Ile

Ser 15

Ser

Thr

GCT

ACC

GAT

AAC

ACC

GAC

TCC

TCT

ATT

GTT

TAT

CTG

GCC

GAA

CAA

150

Ala

Thr

Asp

Asn

Thr

Asp

Ser

Ile

Val

Tyr

Leu

Ala

Glu

Gin

25

30

35

GTA

CTC

ACC

GGA

CCT

GAT

GTA

TCT

GCT

CTG

CAA

TTG

CTC

TCC

AAC

AGC

198

Val

Leu

Thr

Gly

Pro

Asp

val

Ser

Ala

Leu

Gin

Leu

Ser

ASn

Ser

40

4S

50

TTC

GAA

TCC

GTC

TTT

GAC

TCG

CCG

GAT

TTC

TAC

AGC

GAC

GCT

AAG

246

Phe

Glu

Ser

Val

Phe

Asp

Ser

Pro

Asp

Phe

Tyr

Ser

Asp

Ala

Lys

55

60

65

PL 191 355 B1

CTT Leu

GTT CTC TCC GAC GGC CGG

GAA GTT TCT

TTC CAC CGG TGC GTT

TTG Leu

294

Val 70

Leu

Ser Asp Gly

Arg 75

Glu

Val

Ser

Phe

His 80

Arg

Cys

Val

TCA

GCG

AGA

AGC

TCT

TTC

AAG

AGC

GCT

TTA

GCC

GCT

AAG

342

Ser

Ala

Arg

Ser

Phe

Lys

Ser

Ala

Leu

Ala

Lys

85

90

95

100

GAG

AAA

GAC

TCC

AAC

ACC

GCC

GTG

AAG

CTC

GAG

CTT

AAG

GAG

390

Glu

Lys

Asp

Ser

Asn

Thr

Ala

Val

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

Glu

105

110

115

ATT

GCC

AAG

GAT

TAC

GAA

GTC

GGT

TTC

GAT

TCG

GTT

GTG

ACT

GTT

TTG

438

Ile

Ala

Lys

Asp

Tyr

Glu

Val

Gly

Phe

Asp

Ser

val

Val

Thr

Val

Leu

120

125

130

GCT

TAT

GTT

TAC

AGC

AGA

GTG

AGA

CCG

CCT

AAA

GGA

GTT

TCT

486

Ala

Tyr

Val

Tyr

Ser

Arg

Val

Arg

Pro

Lys

Gly

Val

Ser

135

140

145

GAA

TGC

GCA

GAC

GAG

AAT

TGC

CAC

GTG

GCT

TGC

CGG

CCG

GCG

GTG

534

Glu

Cys

Ala

Asp

Glu

Asn

Cys

His

Val

Ala

Cys

Arg

Pro

Ala

Val

150

155

160

GAT

TTC

ATG

TTG

GAG

GTT

CTC

TAT

TTG

GCT

TTC

ATC

TTC

AAG

ATC

CCT

582

Asp

Phe

Met

Leu

Glu

val

Leu

Tyr

Leu

Ala

Phe

Ile

Phe

Lys

Ile

Pro

165

170

175

180

GAA

TTA

ATT

ACT

CTC

TAT

CAG

AGG

CAC

TTA

TTG

GAC

GTT

GTA

GAC

AAA

630

Glu

Leu

Ile

Thr

Leu

Tyr

Gin

Arg

His

Leu

Asp

Val

Asp

Lys

185

190

195

GTT

ATA

GAG

GAC

ACA

TTG

GTT

ATA

CTC

AAG

CTT

GCT

AAT

ATA

TGT

678

Val

Ile

Glu

Asp

Thr

Leu

Val

Ile

Leu

Lys

Leu

Ala

Asn

Ile

Cys

200

205

210

GGT

AAA

GCT

TGT

ATG

AAG

CTA

TTG

GAT

AGA

TGT

AAA

GAG

ATT

GTC

726

Gly

Lys

Ala

Cys

Met

Lys

Leu

Asp

Arg

Cys

Lys

Glu

Ile

Val

215

220

225

AAG

TCT

AAT

GTA

GAT

ATG

GTT

AGT

CTT

GAA

AAG

TCA

TTG

CCG

GAA

GAG

774

Lys

Ser

Asn

Val

Asp

Met

Val

Ser

Leu

Glu

Lys

Ser

Leu

Pro

Glu

230 235 240

PL 191 355 B1

CTT Leu 245

GTT AAA GAG ATA ATT GAT

AGA CGT AAA GAG CTT GGT TTG

GAG Glu

GTA Val 260

822

Val

Lys

Glu

Ile

Ile Asp 250

Arg

Lys

Glu 255

Leu

Gly

Leu

CCT

AAA

GTA

AAG

AAA

CAT

GTC

TCG

AAT

GTA

CAT

AAG

GCA

CTT

GAC

TCG

870

Pro

Lys

Val

Lys

His

Val

Ser

Asn

Val

His

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

265

270

275

GAT

ATT

GAG

TTA

GTC

AAG

TTG

CTT

TTG

AAA

GAG

GAT

CAC

ACC

AAT

918

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Lys

Glu

Asp

His

Thr

Asn

280

285

290

CTA

GAT

GCG

TGT

GCT

CTT

CAT

TTC

GCT

GTT

GCA

TAT

TGC

AAT

GTG

966

Leu

Asp

Ala

Cys

Ala

Leu

His

Phe

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asn

Val

295

300

305

AAG

ACC

GCA

ACA

GAT

CTT

TTA

AAA

CTT

GAT

CTT

GCC

GAT

GTC

AAC

CAT

1014

Lys

Thr

Ala

Thr

Asp

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Ala

Asp

Val

Asn

His

310

315

320

AGG

AAT

CCG

AGG

GGA

TAT

ACG

GTG

CTT

CAT

GTT

GCT

GCG

ATG

CGG

AAG

1062

Arg

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

Met

Arg

Lys

325

330

335

340

GAG

CCA

CAA

TTG

ATA

CTA

TCT

CTA

TTG

GAA

AAA

GGT

GCA

AGT

GCA

TCA

1110

Glu

Pro

Gin

Leu

Ile

Leu

Ser

Leu

Glu

Lys

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

345

350

355

GAA

GCA

ACT

TTG

GAA

GGT

AGA

ACC

GCA

CTC

ATG

ATC

GCA

AAA

CAA

GCC

1158

Glu

Ala

Thr

Leu

Glu

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Met

Ile

Ala

Lys

Gin

Ala

360

365

370

ACT

ATG

GCG

GTT

GAA

TGT

AAT

ATC

CCG

GAG

CAA

TGC

AAG

CAT

TCT

1206

Thr

Met

Ala

Val

Glu

Cys

Asn

Ile

Pro

Glu

Gin

Cys

Lys

His

Ser

375

380

385

CTC

AAA

GGC

CGA

CTA

TGT

GTA

GAA

ATA

CTA

GAG

CAA

GAA

GAC

AAA

CGA

1254

Leu

Lys

Gly

Arg

Leu

Cys

Val

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

Glu

Asp

Lys

Arg

390

395

400

GAA

CAA

ATT

CCT

AGA

GAT

GTT

CCT

CCC

TCT

TTT

GCA

GTG

GCG

GCC

GAT

1302

PL 191 355 B1

Glu 405

Gin

Ile

Pro Arg Asp 410

Val

Pro

Ser

Phe Ala Val Ala Ala Asp

415

420

GAA

TTG

AAG

ATG

ACG

CTG

CTC

GAT

CTT

GAA

AAT

AGA

GTT

GCA

CTT

GCT

1350

Glu

Leu

Lys

Met

Thr

Leu

Asp

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Ala

Leu

Ala

425

430

435

CAA

CGT

CTT

TTT

CCA

ACG

GAA

GCA

CAA

GCT

GCA

ATG

GAG

ATC

GCC

GAA

1398

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Ala

Gin

Ala

Met

Glu

Ile

Ala

Glu

440

445

450

ATG

AAG

GGA

ACA

TGT

GAG

TTC

ATA

GTG

ACT

AGC

CTC

GAG

CCT

GAC

CGT

1446

Met

Lys

Gly

Thr

Cys

Glu

Phe

Ile

Val

Thr

Ser

Leu

Glu

Pro

Asp

Arg

455

460

465

CTC

ACT

GGT

ACG

AAG

AGA

ACA

TCA

CCG

GGT

GTA

AAG

ATA

GCA

CCT

TTC

1494

Leu

Thr

Gly

Thr

Lys

Arg

Thr

Ser

Pro

Gly

Val

Lys

Ile

Ala

Pro

Phe

470

475

480

AGA

ATC

CTA

GAA

GAG

CAT

CAA

AGT

AGA

CTA

AAA

GCG

CTT

TCT

AAA

ACC

1542

Arg

Ile

Leu

Glu

His

Gin

Ser

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

Lys

Thr

485

490

495

500

GTG

GAA

CTC

GGG

AAA

CGA

TTC

CCG

CGC

TGT

TCG

GCA

GTG

CTC

GAC

1590

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

Pro

Arg

Cys

Ser

Ala

Val

Leu

Asp

505

510

515

CAG

ATT

ATG

AAC

TGT

TGA

1608

Gin

Ile

Met

Asn

Cys

*

520

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 522 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 12

PL 191 355 B1

Met Asp Thr Thr Ile Asp Gly Phe 1 5

Thr Ser Phe Val Ala Thr Asp Asn 20

Ala Ala Glu Gin Val Leu Thr Gly 35 40

Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ser Val 50 55

Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser 65 70

Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser 85

Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser 100

Glu Leu Lys Glu Ile Ala Lys Asp 115 120

Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr 130 135

Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp 145 150

Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu 165

Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr 180

Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu 195 200

Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys 210 215

Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val 225 230

Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser 10 15

Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu 25 30

Pro Asp Val Ser Ala Leu Gin Leu 45

Phe Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr 60

Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His 75 80

Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala 90 95

Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu

105 110

Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val 125

Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro 140

Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys 155 160

Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile 170 175

Leu Tyr Gin Arg His Leu Leu Asp

185 190

Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu 205

Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys 220

Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser 235 240

PL 191 355 B1

Leu

Pro

Glu

Leu 245

Val

Lys

Glu

Ile

Ile 250

Asp

Arg

Lys

Glu 255

Leu

Gly

Leu

Glu

Val 260

Pro

Lys

Val

Lys

Lys 265

His

Val

Ser

Asn

Val 270

His

Lys

Ala

Leu

Asp 275

Ser

Asp

Ile

Glu 280

Leu

Val

Lys

Leu

Leu 285

Leu

Lys

Glu

Asp

His 290

Thr

Asn

Leu

Asp

Asp 295

Ala

Cys

Ala

Leu

His 300

Phe

Ala

Val

Ala

Tyr 305

Cys

Asn

Val

Lys

Thr 310

Ala

Thr

Asp

Leu

Leu 315

Lys

Leu

ASp

Leu

Ala 320

Asp

Val

Asn

His

Arg 325

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr 330

Thr

Val

Leu

His

Val 335

Ala

Met

Arg

Lys 340

Glu

Pro

Gin

Leu

Ile 345

Leu

Ser

Leu

Glu 350

Lys

Gly

Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile 355 360 365

Ala Lys Gin Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gin 370 375 380

Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gin

385 390 395 400

Glu Asp Lys Arg Glu Gin Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala

405 410 415

Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg 420 425 430

Val Ala Leu Ala Gin Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gin Ala Ala Met 435 440 445

Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu 450 455 460

PL 191 355 B1

Glu 465

Pro

Asp

Arg

Leu

Thr 470

Gly

Thr

Lys

Arg

Thr 475

Ser

Pro

Gly

Val

Lys 480

Ile

Ala

Pro

Phe

Arg 485

Ile

Leu

Glu

His 490

Gin

Ser

Arg

Leu

Lys 495

Ala

Leu

Ser

Lys

Thr 500

Val

Glu

Leu

Gly

Lys 505

Arg

Phe

Pro

Arg 510

Cys

Ser

Ala

Val

Leu

Asp

Gin

Ile

Met

Asn

Cys

♦

515 520 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1194 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1..1194 (D) INNE INFORMACJE: /produkt= „zmieniona forma NIM1 Zuwaga= „hybryda N-końcowa/C-końcowa (xi)OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 13

ATG GAT TCG GTT

GTG Val 5

ACT GTT

TTG GCT TAT GTT

TAC AGC

AGC Ser

AGA Arg 15

GTG Val

48

Met 1

Asp

Ser

Val

Thr

Val

Leu Ala

Tyr 10

Val

Tyr

Ser

AGA

CCG

CCT

AAA

GGA

GTT

TCT

GAA

TGC

GCA

GAC

GAG

AAT

TGC

96

Arg

Pro

Lys

Gly

Val

Ser

Glu

Cys

Ala

Asp

Glu

Asn

Cys

20

25

30

CAC

GTG

GCT

TGC

CGG

CCG

GCG

GTG

GAT

TTC

ATG

TTG

GAG

GTT

CTC

TAT

144

His

Val

Ala

Cys

Arg

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Met

Leu

Glu

Val

Leu

Tyr

35

40

45

PL 191 355 B1

TTG Leu

GCT TTC ATC

TTC AAG

ATC CCT GAA

TTA ATT ACT CTC TAT CAG

AGG Arg

192

Ala 50

Phe

Ile

Phe

Lys

Ile 55

Pro Glu

Leu

Ile

Thr 60

Leu

Tyr

Gin

CAC

TTA

TTG

GAC

GTT

GTA

GAC

AAA

GTT

ATA

GAG

GAC

ACA

TTG

GTT

240

His

Leu

Asp

Val

Asp

Lys

Val

Ile

Glu

Asp

Thr

Leu

Val

65

70

75

80

ATA

CTC

AAG

CTT

GCT

AAT

ATA

TGT

GGT

AAA

GCT

TGT

ATG

AAG

CTA

TTG

288

Ile

Leu

Lys

Leu

Ala

Asn

Ile

cys

Gly

Lys

Ala

Cys

Met

Lys

Leu

85

90

95

GAT

AGA

TGT

AAA

GAG

ATT

GTC

AAG

TCT

AAT

GTA

GAT

ATG

GTT

AGT

336

Asp

Arg

Cys

Lys

Glu

Ile

Val

Lys

Ser

Asn

Val

Asp

Met

Val

Ser

100

105

110

CTT

GAA

AAG

TCA

TTG

CCG

GAA

GAG

CTT

GTT

AAA

GAG

ATA

ATT

GAT

AGA

384

Leu

Glu

Lys

Ser

Leu

Pro

Glu

Leu

val

Lys

Glu

Ile

Asp

Arg

115

120

125

CGT

AAA

GAG

CTT

GGT

TTG

GAG

GTA

CCT

AAA

GTA

AAG

AAA

CAT

GTC

TCG

432

Arg

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Glu

Val

Pro

Lys

Val

Lys

His

Val

Ser

130

135

140

AAT

GTA

CAT

AAG

GCA

CTT

GAC

TCG

GAT

ATT

GAG

TTA

GTC

AAG

TTG

480

Asn

Val

His

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

145

150

155

160

CTT

TTG

AAA

GAG

GAT

CAC

ACC

AAT

CTA

GAT

GCG

TGT

GCT

CTT

CAT

528

Leu

Lys

Glu

Asp

His

Thr

Asn

Leu

Asp

Ala

Cys

Ala

Leu

His

165

170

175

TTC

GCT

GTT

GCA

TAT

TGC

AAT

GTG

AAG

ACC

GCA

ACA

GAT

CTT

TTA

AAA

576

Phe

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asn

Val

Lys

Thr

Ala

Thr

Asp

Leu

Lys

180

185

190

CTT

GAT

CTT

GCC

GAT

GTC

AAC

CAT

AGG

AAT

CCG

AGG

GGA

TAT

ACG

GTG

624

Leu

Asp

Leu

Ala

Asp

Val

Asn

His

Arg

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

195

200

205

CTT

CAT

GTT

GCT

GCG

ATG

CGG

AAG

GAG

CCA

CAA

TTG

ATA

CTA

TCT

CTA

672

PL 191 355 B1

Leu His Val Ala Ala Met Arg

Lys

Glu

Pro

Gin

Leu 220

Ile

Leu

Ser

Leu

210

215

TTG

GAA

AAA

GGT

GCA

AGT

GCA

TCA

GAA

GCA

ACT

TTG

GAA

GGT

AGA

ACC

720

Leu

Glu

Lys

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Ala

Thr

Leu

Glu

Gly

Arg

Thr

225

230

235

240

GCA

CTC

ATG

ATC

GCA

AAA

CAA

GCC

ACT

ATG

GCG

GTT

GAA

TGT

AAT

768

Ala

Leu

Met

Ile

Ala

Lys

Gin

Ala

Thr

Met

Ala

Val

Glu

Cys

Asn

245

250

255

ATC

CCG

GAG

CAA

TGC

AAG

CAT

TCT

CTC

AAA

GGC

CGA

CTA

TGT

GTA

GAA

816

Ile

Pro

Glu

Gin

Cys

Lys

His

Ser

Leu

Lys

Gly

Arg

Leu

Cys

Val

Glu

260

265

270

ATA

CTA

GAG

CAA

GAA

GAC

AAA

CGA

GAA

CAA

ATT

CCT

AGA

GAT

GTT

CCT

864

Ile

Leu

Glu

Gin

Glu

Asp

Lys

Arg

Glu

Gin

Ile

Pro

Arg

Asp

Val

Pro

275

280

285

CCC

TCT

TTT

GCA

GTG

GCG

GCC

GAT

GAA

TTG

AAG

ATG

ACG

CTG

CTC

GAT

912

Pro

Ser

Phe

Ala

Val

Ala

Asp

Glu

Leu

Lys

Met

Thr

Leu

Asp

290

295

300

CTT

GAA

AAT

AGA

GTT

GCA

CTT

GCT

CAA

CGT

CTT

TTT

CCA

ACG

GAA

GCA

960

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Ala

Leu

Ala

Gin

Arg

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Ala

305

310

315

320

CAA

GCT

GCA

ATG

GAG

ATC

GCC

GAA

ATG

AAG

GGA

ACA

TGT

GAG

TTC

ATA

1008

Gin

Ala

Met

Glu

Ile

Ala

Glu

Met

Lys

Gly

Thr

Cys

Glu

Phe

Ile

325

330

335

GTG

ACT

AGC

CTC

GAG

CCT

GAC

CGT

CTC

ACT

GGT

ACG

AAG

AGA

ACA

TCA

1056

Val

Thr

Ser

Leu

Glu

Pro

Asp

Arg

Leu

Thr

Gly

Thr

Lys

Arg

Thr

Ser

340

345

350

CCG

GGT

GTA

AAG

ATA

GCA

CCT

TTC

AGA

ATC

CTA

GAA

GAG

CAT

CAA

AGT

1104

Pro

Gly

Val

Lys

Ile

Ala

Pro

Phe

Arg

Ile

Leu

Glu

His

Gin

Ser

355

360

365

AGA

CTA

AAA

GCG

CTT

TCT

AAA

ACC

GTG

GAA

CTC

GGG

AAA

CGA

TTC

1152

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

370

375

380

PL 191 355 B1

CCG CGC TGT TCG GCA GTG CTC GAC CAG ATT ATG AAC TGT TGA 1194

Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp Gin Ile Met Asn Cys *

385 390 395 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 398 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi)OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 14

Met 1

Asp

Ser

Val

Val 5

Thr

Val

Leu

Ala

Tyr 10

Val

Tyr

Ser

Arg 15

Val

Arg

Pro

Pro 20

Lys

Gly

Val

Ser

Glu 25

Cys

Ala

Asp

Glu

Asn 30

Cys

His

Val

Ala 35

Cys

Arg

Pro

Ala

Val 40

Asp

Phe

Met

Leu

Glu 45

Val

Leu

Tyr

Leu

Ala 50

Phe

Ile

Phe

Lys

Ile 55

Pro

Glu

Leu

Ile

Thr 60

Leu

Tyr

Gin

Arg

His 65

Leu

Asp

Val

Val 70

Asp

Lys

Val

Ile 75

Glu

Asp

Thr

Leu

Val 80

Ile

Leu

Lys

Leu

Ala 85

Asn

Ile

Cys

Gly

Lys 90

Ala

Cys

Met

Lys

Leu 95

Leu

Asp

Arg

Cys

Lys 100

Glu

Ile

Val

Lys 105

Ser

Asn

Val

Asp

Met 110

Val

Ser

Leu

Glu

Lys 115

Ser

Leu

Pro

Glu

Glu 120

Leu

Val

Lys

Glu

Ile 125

Ile

Asp

Arg

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Glu

Val

Pro

Lys

Val

Lys

His

Val

Ser

130 135 140

100

PL 191 355 B1

101

Pro Arg Cys Ser Ala Val Leu Asp Gin Ile Met Asn Cys * 385 390 395 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 786 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (ix> CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1..786 (D) INNE INFORMACJE: /produkt= „zmieniona forma NIM1 /uwaga= „domeny ankyryny NIM1” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 15:

ATG GAC

TCC AAC

AAC ACC

GCC GCC GTG AAG

CTC GAG CTT

AAG Lys

GAG Glu 15

ATT Ile

48

Met 1

Asp

Ser

Asn

Asn 5

Thr

Ala

Val

Lys 10

Leu

Glu

Leu

GCC

AAG

GAT

TAC

GAA

GTC

GGT

TTC

GAT

TCG

GTT

GTG

ACT

GTT

TTG

GCT

96

Ala

Lys

Asp

Tyr 20

Glu

Val

Gly

Phe

Asp 25

Ser

Val

Thr

Val 30

Leu

Ala

TAT

GTT

TAC

AGC

AGA

GTG

AGA

CCG

CCT

AAA

GGA

GTT

TCT

GAA

144

Tyr

Val

Tyr 35

Ser

Arg

Val

Arg 40

Pro

Lys

Gly 45

Val

Ser

Glu

TGC

GCA

GAC

GAG

AAT

TGC

CAC

GTG

GCT

TGC

CGG

CCG

GCG

GTG

GAT

192

Cys

Ala 50

Asp

Glu

Asn

Cys

Cys 55

His

Val

Ala

Cys

Arg 60

Pro

Ala

Val

Asp

TTC

ATG

TTG

GAG

GTT

CTC

TAT

TTG

GCT

TTC

ATC

TTC

AAG

ATC

CCT

GAA

240

Phe 65

Met

Leu

Glu

Val

Leu 70

Tyr

Leu

Ala

Phe

Ile 75

Phe

Lys

Ile

Pro

Glu 80

102

PL 191 355 B1

TTA Leu

ATT ACT CTC

TAT Tyr 85

CAG AGG Gin Arg

CAC His

TTA TTG GAC

GTT GTA GAC AAA GTT

288

Ile

Thr

Leu

Leu 90

Asp

Val

Asp

Lys 95

Val

GTT

ATA

GAG

GAC

ACA

TTG

GTT

ATA

CTC

AAG

CTT

GCT

AAT

ATA

TGT

GGT

336

Val

Ile

Glu

Asp

Thr

Leu

Val

Ile

Leu

Lys

Leu

Ala

Asn

Ile

Cys

Gly

100

105

110

AAA

GCT

TGT

ATG

AAG

CTA

TTG

GAT

AGA

TGT

AAA

GAG

ATT

GTC

AAG

384

Lys

Ala

cys

Met

Lys

Leu

Asp

Arg

Cys

Lys

Glu

Ile

Val

Lys

115

120

125

TCT

AAT

GTA

GAT

ATG

GTT

AGT

CTT

GAA

AAG

TCA

TTG

CCG

GAA

GAG

CTT

432

Ser

Asn

Val

Asp

Met

Val

Ser

Leu

Glu

Lys

Ser

Leu

Pro

Glu

Leu

130

135

140

GTT

AAA

GAG

ATA

ATT

GAT

AGA

CGT

AAA

GAG

CTT

GGT

TTG

GAG

GTA

CCT

480

val

Lys

Glu

Ile

Asp

Arg

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Glu

Val

Pro

145

150

155

160

AAA

GTA

AAG

AAA

CAT

GTC

TCG

AAT

GTA

CAT

AAG

GCA

CTT

GAC

TCG

GAT

528

Lys

Val

Lys

His

Val

Ser

Asn

Val

His

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

165

170

175

GAT

ATT

GAG

TTA

GTC

AAG

TTG

CTT

TTG

AAA

GAG

GAT

CAC

ACC

AAT

CTA

576

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Lys

Glu

Asp

His

Thr

Asn

Leu

180

185

190

GAT

GCG

TGT

GCT

CTT

CAT

TTC

GCT

GTT

GCA

TAT

TGC

AAT

GTG

AAG

624

Asp

Ala

Cys

Ala

Leu

His

Phe

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asn

Val

Lys

195

200

205

ACC

GCA

ACA

GAT

CTT

TTA

AAA

CTT

GAT

CTT

GCC

GAT

GTC

AAC

CAT

AGG

672

Thr

Ala

Thr

Asp

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Ala

Asp

Val

Asn

His

Arg

210

215

220

AAT

CCG

AGG

GGA

TAT

ACG

GTG

CTT

CAT

GTT

GCT

GCG

ATG

CGG

AAG

GAG

720

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

225

230

235

240

CCA

CAA

TTG

ATA

CTA

TCT

CTA

TTG

GAA

AAA

GGT

GCA

AGT

GCA

TCA

GAA

768

PL 191 355 B1

103

Pro	Gin	Leu	Ile	Leu	Ser Leu	Leu Glu Lys Gly Ala	Ser Ala Ser Glu
				245		250	255
GCA	ACT	TTG	GAA	GGT	TGA
Ala	Thr	Leu	Glu	Gly	★
			260

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 262 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 16

Met Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu Glu Leu Lys Glu Ile

1

5

10

15

Ala

Lys

Asp

Tyr 20

Glu

Val

Gly

Phe

Asp 25

Ser

Val

val

Thr

Val 30

Leu

Ala

Tyr

Val

Tyr 35

Ser

Arg

Val

Arg 40

Pro

Lys

Gly 45

Val

Ser

Glu

Cys

Ala 50

Asp

Glu

Asn

Cys

Cys 55

His

Val

Ala

Cys

Arg 60

Pro

Ala

Val

Asp

Phe 65

Met

Leu

Glu

Val

Leu 70

Tyr

Leu

Ala

Phe

Ile 75

Phe

Lys

Ile

Pro

Glu 80

Leu

Ile

Thr

Leu

Tyr Θ5

Gin

Arg

His

Leu

Leu 90

Asp

Val

Asp

Lys 95

Val

Ile

Glu

Asp 100

Thr

Leu

Val

Ile

Leu 105

Lys

Leu

Ala

Asn

Ile 110

Cys

Gly

Lys

Ala

Cys

Met

Lys

Leu

Asp

Arg

Cys

Lys

Glu

Ile

Val

Lys

115 120 125

104

PL 191 355 B1

Ser

Asn 130

Val

Asp Met

Val

Ser Leu Glu Lys Ser Leu

Pro

Glu

Leu

135

140

Val

Lys

Glu

Ile

Asp

Arg

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Glu

Val

Pro

145

150

155

160

Lys

Val

Lys

His

Val

Ser

Asn

Vał

His

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

165

170

175

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Lys

Glu

Asp

His

Thr

Asn

Leu

180

185

190

Asp

Ala

Cys

Ala

Leu

His

Phe

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asn

Val

Lys

195

200

205

Thr

Ala

Thr

Asp

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Ala

Asp

Val

Asn

His

Arg

210

215

220

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

225

230

235

240

Pro

Gin

Leu

Ile

Leu

Ser

Leu

Glu

Lys

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

245

250

255

Ala

Thr

Leu

Glu

Gly

*

260 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 41 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związana (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 17

PL 191 355 B1

105

Ile 1

Arg

Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val

5

10

15

Lys

Leu

Met

Val

Met

Gly

Glu

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Ala

Leu

Ala

20

25

30

Val

His

Tyr

Ala

Val

Gin

His

Cys

Asn

35

40

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związana (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 18

Pro 1

Thr Gly Lys

Thr 5

Ala Leu His

Leu

Ala 10

Ala

Glu

Met

Val

Ser 15

Pro

Asp

Met

Val

Ser

Val

Leu

Asp

His

Ala

Asp

Xaa

Asn

Phe

Arg

20

25

30

Thr Xaa Asp Gly Val Thr 35 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 19 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 41 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związana (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa

106

PL 191 355 B1 <xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 19:

Ile 1

Arg

Met Arg Arg Ala Leu Asp Ala Ala Asp Ile Glu Leu Val

5

10

15

Lys

Leu

Met

Val

Met

Gly

Glu

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Ala

Leu

Ala

20

25

30

Val

His

Tyr

Ala

Val

Gin

His

Cys

Asn

35

40

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związana (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 20:

Arg Arg Pro Asp Ser Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val 15 10 15

Ser Pro Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp Gin 20 25 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 21 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 41 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związana

PL 191 355 B1

107 (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 21

Ile

Arg

Met

Arg

Ala

Leu

Asp

Ala

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

1

5

10

15

Lys

Leu

Met

Val

Met

Gly

Glu

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Ala

Leu

Ala

20

25

30

Val

His

Tyr

Ala

Val

Gin

His

Cys

Asn

35

40

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związana (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 22:

Arg Arg Pro Asp Ser Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val 1 5 10 15

Ser Pro Asp Met Val Ser Val Leu Leu Asp Gin 20 25 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 23 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 41 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany

108

PL 191 355 B1 (D) TOPOLOGIA: nie związana (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 23

Ile

Arg

Met

Arg

Ala

Leu

Asp

Ala

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

1

5

10

15

Lys

Leu

Met

Val

Met

Gly

Glu

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

ASp

Ala

Leu

Ala

20

25

30

Vał

His

Tyr

Ala

Val

Gin

His

Cys

Asn

35

40

(2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związana (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białkowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 24:

Pro Thr Gly Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Glu Met Val Ser Pro 15 10 15

Asp Met Val (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 25 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasadowych

PL 191 355 B1

109 (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 25:

CAACAGCTTC GAAGCCGTCT TTGACGCGCC GGATG 35 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (xi)OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 26:

CATCCGGCGC GTCAAAGACG GCTTCGAAGC TGTTG 35 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd”

110

PL 191 355 B1 (xi> OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 27

GGAATTCAAT GGATTCGGTT GTGACTGTTT TG (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis ~ „oligonukleotyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 28:

GGAATTCTAC AAATCTGTAT ACCATTGG (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 29:

CGGAATTCGA TCTCTTTAAT TTGTGAATTT C (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 30 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 191 355 B1

111 (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd (xi)OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 30:

GGAATTCTCA ACAGTTCATA ATCTGGTCG 29 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 31:

GGAATTCAAT GGACTCCAAC AACACCGCCG C 31 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasadowych (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = „oligonukleotyd” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 32:

GGAATTCTCA ACCTTCCAAA GTTGCTTCTG ATG 33

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób ochrony rośliny przed atakiem patogenu, przez nadanie tej roślinie synergistycznej oporności na choroby, polegający na dostarczeniu immunomodulowanej rośliny mającej pierwszy poziom oporności na chorobę i naniesieniu na tę immunomodulowaną roślinę co najmniej jednego mikrobicydu, który nadaje jej drugi poziom oporności na chorobę, przy czym naniesienie środka mikrobójczego na już immunomodulowaną roślinę nadaje jej synergistycznie wzmożony trzeci poziom oporności na chorobę, który jest większy niż suma pierwszego i drugiego poziomu oporności na chorobę, znamienny tym, że jako immunomodulowaną roślinę stosuje się:

(i) roślinę mutanta (cim) o konstytutywnej odporności, (ii) roślinę mutanta imitującego uszkodzenia lub (iii) roślinę uzyskaną przez rekombinowaną ekspresję genu SAR.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że z populacji roślin wybiera się mutanta cim rośliny i następnie (a) ocenia się ekspresję genów SAR w niezakażonych roślinach, które są fenotypowo normalne przez to, że nie mają fenotypu imitującego uszkodzenie i kolejno (b) wybiera się niezakażone rośliny, które konstytutywnie wyrażają geny SAR pod nieobecność infekcji wirusowej, bakteryjnej lub grzybowej.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że z populacji roślin wybiera się roślinę będącą mutantem imitującym uszkodzenia i następnie (a) ocenia się ekspresję genów SAR w niezakażonych roślinach, które mają fenotyp imitujący uszkodzenie i kolejno (b) wybiera się niezakażone rośliny, które konstytutywnie wyrażają geny SAR pod nieobecność infekcji wirusowej, bakteryjnej lub grzybowej.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen SAR, który jest funkcjonalną formą genu NIM1 kodującego białko NIM1, związane z kaskadą transdukcji sygnału prowadzącej do nabytej ogólnoustrojowej oporności u roślin.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wytwarza się białko NIM1, o sekwencji aminokwasów przedstawionej jako SEQ ID NO:2.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wytwarza się białko NIM1, które jest kodowane przez cząsteczkę DNA zawierającą sekwencję kodującą przedstawioną jako SEQ ID NO:1.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen SAR, który koduje zmienioną formę białka NIM1, która wykazuje konstytutywną ekspresję genu SAR w roślinie transgenicznej.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która ma alaniny zamiast seryn w pozycjach aminokwasów odpowiadających pozycjom 55 i 59 w SEQID NO:2.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która obejmuje sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO:8.
10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która jest kodowana przez cząsteczkę DNA, która obejmuje sekwencję nukleotydów przedstawioną jako SEQID NO:7.
11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która ma przy N-końcu odcięte aminokwasy, odpowiadające w przybliżeniu pozycjom aminokwasów 1-125 wSEQ ID NO:2.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która obejmuje sekwencję aminokwasów przedstawioną jako SEQ ID NO:10.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która jest kodowana przez cząsteczkę DNA, która obejmuje sekwencję nukleotydów przedstawioną jako SEQ ID NO:9.
14. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która przy C-końcu ma odcięte aminokwasy odpowiadające w przybliżeniu pozycjom aminokwasów 522-593 wSEQ ID NO:2.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która obejmuje sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO:12.
16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która jest kodowana przez cząsteczkę DNA, która obejmuje sekwencję nukleotydów przedstawioną jako SEQ ID NO:11.

PL 191 355 B1

113
17. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, które przy N-końcu ma odcięte aminokwasy odpowiadające w przybliżeniu pozycjom aminokwasów 1-125 w SEQ ID NO:2, a przy C-końcu ma odcięte aminokwasy odpowiadające w przybliżeniu pozycjom aminokwasów 522-593 w SEQ ID NO:2.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, które obejmuje sekwencję aminokwasów przedstawioną jako SEQ ID NO:14.
19. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która jest kodowana przez cząsteczkę DNA, która obejmuje sekwencję nukleotydów przedstawioną jako SEQ ID NO:13.
20. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która składa się zasadniczo z motywów ankyrynowych odpowiadających w przybliżeniu pozycjom aminokwasów 103-362 w SEQ ID NO:2.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która obejmuje sekwencję aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO:16.
22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że wytwarza się zmienioną formę białka NIM1, która jest kodowana przez cząsteczkę DNA, obejmującą sekwencję nukleotydów przedstawioną jako SEQ ID NO:15.
23. Sposób według zastrz. 6 albo 10, albo 13, albo 16, albo 19, albo 22, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydów przedstawionej jako SEQ ID NO 1, 7, 9, 11, 13 lub 15 w następujących warunkach: 1% BSA; 520 mM NaPO4, pH 7,2; 7% siarczan laurylu, sól sodowa; 1 mM EDTA; 250 mM NaCI w 55°C przez 18-24 godz. i płukanie w 6xSSC przez 15 min (X3) 3xSSC przez 15 min (X1) w 55°C.
24. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, albo 19, albo 20, albo 21, albo 22, znamienny tym, że jako mikrobicyd stosuje się fungicyd wybrany z grupy obejmującej:

4-[3-(4-chlorofenylo)-3-(3,4-dimetoksyfenylo)akryloilo]morfolinę („dimetomorf”);

5-metylo-1,2,4-triazolo[3,4-b][1,3]benzotiazol („tricyklazol”);

3-alliloksy-1,2-benzotiazolo-1,1-dioksyd („probonazol”);

a-[2-(4-chlorofenylo)etylo]-a(1,1-dimetyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („tebukonazol”);

1- {[3-(2-chlorofenylo)-2-(4-fluorofenylo)oksyran-2-yl]metylo}1H-1,2,4-triazol („epoksykonazol”); a-(4-chlorofenylo)-a-(1 -cyklopropyloetylo-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („cyprokonazol”); 5-(4-chlorobenzylo)-2-2-dimetylo-1-(1H-1,2,4-triazolo-1-ylmetylo)cyklopentanol („metkonazol”);

2- (2,4-dichlorofenylo)-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylo)propylo-1,1,2,2-tetrafluoroetyloeter („tetrakonazol”); metylo-(E)-2-{2-[6-(2-cyjanofenoksy)pirymidyn-4-yloksy]fenylo}-3-metoksyakrylan („ICI A 5504”, „azoksystrobina”);

metylo-(E)-2-metoksyimino-2-[a-(o-toliloksy)-o-tolilo]octan („BAS 490 F”, „metyl krezoksymu”);

2-(2-fenoksyfenylo)-(E)-2-metoksyimino-N-metyloacetamid;

[2-(2,5-dimetylofenoksymetylo)-fenylo]-(E)-2-metoksyimino-N-metylo-acetamid;

(1R,3S/1S,3R)-2,2-dichloro-N-[(R)-1-(4-chlorofenylo)etylo]-1-etylo-3-metylocyklopropano-karboksamid („KTU 3616”);

kompleks polimerycznego etylenobis(ditiokarbaminianu) manganawego z solami cynku („mankozeb”);

1-[2-(2,4-dichlorofenylo)-4-propylo-1,3-dioksolan-2-ylmetylo]-1H-1,2,4-triazol („propikonazol”);

1-[2-[2-chloro-4-(4-chlorofenoksy)fenylo]-4-metylo-1,3-dioksolan-2-yl-metyl]-1H-1,2,4-triazol („difenokonazol”);

1-[2-(2,4-dichlorofenylo]pentylo-1H-1,2,4-triazol („penkonazol”); cis-4-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo]-2,6-dimetylomorfolinę(„fenpropimorf”); 1-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo]-piperydynę („fenpropidyna”);

4-cyklopropylo-6-metylo-N-fenylo-2-pirymidynaminę („cyprodynyl”);

ester metylowy (RS)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny(„metalaksyl”); ester metylowy (R)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny(„R-metalaksyl”);

1,2,5,6-tetrahydro-4H-pirolo[3,2,1,ij]chinolino-4-on („pirochilon”) oraz fosfonian wodorku etylu („fosetyl”).
25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że jako fungicyd stosuje się metalaksyl.
26. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że jako jeden z mikrobicydów stosuje się fungicyd wybrany z grupy obejmującej:

4-[3-(4-chlorofenylo)-3-(3,4-dimetoksyfenylo)akryloilomorfolinę(„dimetomorf”);

114

PL 191 355 B1

5-metylo-1,2,4-triazolo[3,4-b][1,3]benzotiazol („tricyklazol”);

3-alliloksy-1,2-benzotiazolo-1,1-dioksyd („probonazol”);

a-[2-(4-chlorofenylo)etylo]-a(1,1-dimetyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („tebukanozol”);

1- {[3-(2-chlorofenylo)-2-(4-fluorofenylo)oksyran-2-yl]metylo}-1H-1,2,4-triazol („epoksykonazol”); a-(4-chlorofenylo)-a-(1-cyklopropyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („cyprokonazol”); 5-(4-chlorobenzylo)-2-2-dimetylo-1-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmetylo)cyklopentanol, („metkonazol”);

2- (2,4-dichlorofenylo)-3-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)-propylo-1,1,2,2-tetrafluoroetylo-eter, („tetrakonazol”); metylo-(E)-2-{2-[6-(2-cyjanofenoksy)pirymidyn-4-yloksy]fenylo}-3-metoksyakrylan, („ICI A 5504”, „azoksystrobina”);

metylo-(E)-2-metoksyimino-2-[a-(o-toliloksy)-o-tolilo]octan („BAS 490 F”, „metyl krezoksymu”);

2- (2-fenoksyfenylo)-(E)-2-metoksyimino-N-metyloacetamid;

[2-(2,5-dimetylofenoksymetylo)-fenylo]-(E)-2-metoksymino-N-metyloacetamid;

(1R,3S/1S,3R)2,2-dichloro-N-[(R)-1-(4-chlorofenylo)etylo]-1-etylo-3-metylocyklopropanokarboksamid („KTU 361 6”);

kompleks polimerycznego etylenobis(ditiokarbaminianu) manganawegoz solami cynku („mankozeb”);

1-[2-(2,4-dichlorofenylo)-4-propylo-1,3-dioksolan-2-ylometylo]-1H-1,2,4-triazol („propikonazol”);

1-{2-[2-chloro-4-(4-chlorofenoksy)fenylo]-4-metylo-1,3-dioksolan-2-yl-metyl}-1H-1,2,4-triazol („difenokonazol”);

1-[2-(2,4-dichlorofenylo}pentylo-1H-1,2,4-triazol („penkonazol”); cis-4-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo]-2,6-dimetylomorfolina(„fenpropimorf”); 1-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylopiperydyna („fenpropidyna”);

4-cyklopropylo-6-metylo-N-fenylo-2-pirymidynamina („cyprodynyl”); ester metylowy (RS)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („metalaksyl”); ester metylowy (R)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („R-metalaksyl”);

1,2,5,6-tetrahydro-4H-pirolo[3,2,1,ij]chinolino-4-on („pirochilon”) oraz fosfonian wodorku etylu („fosetyl”).
27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że jako fungicyd stosuje się metalaksyl.
28. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, albo 19, albo 20, albo 21 albo 22, znamienny tym, że jako mikrobicyd stosuje się albo związek benzotiadiazolu, związek kwasu izonikotynowego, albo związek kwasu salicylowego.
29. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że jako mikrobicyd stosuje się albo związek benzotiadiazolu, albo związek kwasu izonikotynowego, albo związek kwasu salicylowego.
30. Sposób według zastrz 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, albo 19, albo 20, albo 21 albo 22, znamienny tym, że na immunomodulowaną roślinę nakłada się równocześnie dwa mikrobicydy.
31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że jako jeden z mikrobicydów stosuje się fungicyd wybrany z grupy obejmującej:

4- [3-(4-chlorofenylo)-3-(3,4-dimetoksyfenylo)akryloilomorfolinę („dimetomorf”);

5- metylo-1,2,4-triazolo[3,4-b][1,3]benzotiazol („tricyklazol”);

3- alliloksy-1,2-benzotiazolo-1,1-dioksyd („probonazol”);

α-[2-(4-chlorofenylo)etylo]-α(1,1-dimetyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („tebukanozol”);

1- {[3-(2-chlorofenylo)-2-(4-fluorofenylo)oksyran-2-yl]metylo}-1H-1,2,4-triazol („epoksykonazol”); α-(4-chlorofenylo)-α-(1-cyklopropyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („cyprokonazol”); 5-(4-chlorobenzylo)-2-2-dimetylo-1-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmetylo)cyklopentanol, („metkonazol”);

2- (2,4-dichlorofenylo)-3-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)-propylo-1,1,2,2-tetrafluoroetylo-eter, („tetrakonazol”); metylo-(E)-2-{2-[6-(2-cyjanofenoksy)pirymidyn-4-yloksy]fenylo}-3-metoksyakrylan, („ICI A 5504”, „azoksystrobina”);

metylo-(E)-2-metoksyimino-2-[α-(o-toliloksy)-o-tolilo]octan („BAS 490 F”, „metyl krezoksymu”);

2-(2-fenoksyfenylo)-(E)-2-metoksyimino-N-metyloacetamid;

[2-(2,5-dimetylofenoksymetylo)-fenylo]-(E)-2-metoksymino-N-metyloacetamid;

(1 R,3S/1 S,3R)2,2-dichloro-N-[(R)-1 -(4-chlorofenylo)etylo]-1 -etylo-3-metylocyklopropanokarboksamid („KTU 3616”);

kompleks polimerycznego etylenobis(ditiokarbaminianu) manganawego z solami cynku („mankozeb”);

1-[2-(2,4-dichlorofenylo)-4-propylo-1,3-dioksolan-2-ylometylo]-1H-1,2,4-triazol („propikonazol”);

PL 191 355 B1

115

1-{2-[2-chloro-4-(4-chlorofenoksy)fenylo]-4-metylo-1,3-dioksolan-2-yl-metyl}-1H-1,2,4-triazol („difenokonazol”);

1-[2-(2,4-dichlorofenylo}pentylo-1H-1,2,4-triazol („penkonazol”); cis-4-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo]-2,6-dimetylomorfolina („fenpropimorf”);

1 -[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo-piperydyna („fenpropidyna”);

4-cyklopropylo-6-metylo-N-fenylo-2-pirymidynamina („cyprodynyl”); ester metylowy (RS)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („metalaksyl”); ester metylowy (R)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („R-metalaksyl”);

1,2,5,6-tetrahydro-4H-pirolo[3,2,1,ij]chinolino-4-on („pirochilon”) oraz fosfonian wodorku etylu („fosetyl”).
32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że wymieniony fungicyd jest metalaksylem, adrugi mikrobicyd jest związkiem benzotiadiazolu,
33. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że na immodulowaną roślinę nakładane sąrównocześnie dwa mikrocybidy.
34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że jako jeden z mikrobicydów stosuje się fungicyd wybrany z grupy obejmującej:

4- [3-(4-chlorofenylo)-3-(3,4-dimetoksyfenylo)akryloilomorfolinę („dimetomorf”);

5- metylo-1,2,4-triazolo[3,4-b][1,3]benzotiazol („tricyklazol”);

3- alliloksy-1,2-benzotiazolo-1,1-dioksyd („probonazol”);

a-[2-(4-chlorofenylo)etylo]-a(1,1-dimetyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („tebukanozol”);

1- {[3-(2-chlorofenylo)-2-(4-fluorofenylo)oksyran-2-yl]metylo}-1H-1,2,4-triazol („epoksykonazol”); a-(4-chlorofenylo)-a-(1-cyklopropyloetylo)-1H-1,2,4-triazolo-1-etanol („cyprokonazol”); 5-(4-chlorobenzylo)-2-2-dimetylo-1-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmetylo)cyklopentanol, („metkonazol”);

2- (2,4-dichlorofenylo)-3-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)-propylo-1,1,2,2-tetrafluoroetylo-eter, („tetrakonazol”); metylo-(E)-2-{2-[6-(2-cyjanofenoksy)pirymidyn-4-yloksy]fenylo}-3-metoksyakrylan, („ICI A 5504”, „azoksystrobina”);

metylo-(E)-2-metoksyimino-2-[a-(o-toliloksy)-o-tolilo]octan („BAS 490 F”, „metyl krezoksymu”);

2-(2-fenoksyfenylo)-(E)-2-metoksyimino-N-metyloacetamid;

[2-(2,5-dimetylofenoksymetylo)-fenylo]-(E)-2-metoksymino-N-metyloacetamid;

(1R,3S/1S,3R)2,2-dichloro-N-[(R)-1-(4-chlorofenylo)etylo]-1-etylo-3-metylocyklopropanokarboksamid („KTU 3616”);

kompleks polimerycznego etylenobis(ditiokarbaminianu) manganawego z solami cynku („mankozeb”); 1-[2-(2,4-dichlorofenylo)-4-propylo-1,3-dioksolan-2-ylometylo]-1H-1,2,4-triazol („propikonazol”); 1-{2-[2-chloro-4-(4-chlorofenoksy)fenylo]-4-metylo-1,3-dioksolan-2-yl-metyl}-1H-1,2,4-triazol („difenokonazol”);

1-[2-(2,4-dichlorofenylo}pentylo-1H-1,2,4-triazol („penkonazol”); cis-4-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo]-2,6-dimetylomorfolina („fenpropimorf”); 1-[3-(4-tert-butylofenylo)-2-metylopropylo-piperydyna(„fenpropidyna”);

4- cyklopropylo-6-metylo-N-fenylo-2-pirymidynamina („cyprodynyl”);

ester metylowy (RS)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („metalaksyl”); ester metylowy (R)-N-(2,6-dimetylofenylo-N-(metoksyacetylo)-alaniny („R-metalaksyl”);

1,2,5,6-tetrahydro-4H-pirolo[3,2,1,ij]chinolino-4-on („pirochilon”) oraz fosfonian wodorku etylu („fosetyl”) a drugi mikrobicyd jest albo związkiem benzotiadiazolu, albo związkiem kwasu izonikotynowego, albo związkiem kwasu salicylowego.
35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że wymieniony fungicyd jest metalaksylem, a drugi mikrobicyd jest związkiem benzotiadiazolu.