PL191687B1

PL191687B1 - Urządzenie testowe do oznaczania zawartości analitów w płynnych produktach nabiałowych

Info

Publication number: PL191687B1
Application number: PL339901A
Authority: PL
Inventors: Jacques Degelaen; Jean-Marie Frere; Benoit Granier; Bernard Joris
Original assignee: Ucb Sa
Priority date: 1997-10-07
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2006-06-30
Also published as: SI1023603T1; DE69830416D1; US20040096356A1; CZ301093B6; US20020127737A1; TR200000921T2; BR9812876A; JP2009133877A; KR100614632B1; CN1274423A; EP1023603A1; DK1023603T3; EP1023603B1; AR013671A1; PL339901A1; CA2305774A1; ES2244083T3; WO1999018439A1; PT1023603E; NO20001817L

Abstract

1. Urzadzenie testowe do oznaczania zawar- tosci analitów w plynnych produktach nabialo- wych, majace stala podstawe (1) majaca koniec pierwszy i drugi, przy czym na tej podstawie sa zamocowane nastepujace membrany, poczawszy od pierwszego konca, membrana (2) do oczysz- czania analizowanego plynu, membrana (3) do unieruchomiania co najmniej jednej substancji wychwytujacej, wykonana z nitrocelulozy, oraz membrana absorpcyjna (4) wykonana z celulozy, znamienne tym, ze membrana (2) jest wykonana z nietkanych wlókien poliestrowych. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest urządzenie testowe do oznaczania zawartości analitów w płynnych produktach nabiałowych, a zwłaszcza w mleku.

Obecnie wymogi higieniczne obowiązujące w wielu krajach stwarzają konieczność regularnego kontrolowania produktów nabiałowych pod względem zawartości różnych substancji, takich jak leki weterynaryjne i hormony, często stosowane w hodowli bydła. Z oczywistych względów medycznych konieczne jest unikanie obecności tych substancji w produktach nabiałowych przeznaczonych do spożywania przez ludzi.

W innych przypadkach pożądane jest dysponowanie testami, umożliwiającymi wykrywanie obecności endogennych substancji w mleku dla zoptymalizowania praktyk stosowanych podczas hodowli bydła. W szczególności metody szybkiego określania poziomu hormonów w mleku umożliwiają łatwą identyfikację faz korzystnych dla reprodukcji.

W jeszcze innych przypadkach potrzebne są wiarygodne i praktyczne metody i urządzenia służące do monitorowania pochodzenia produktów nabiałowych uzyskanych z mleka pochodzącego od różnych gatunków zwierząt. W związku z tym prowadzone są badania mające na celu opracowanie metod i urządzeń umożliwiających wykrycie obecności białek charakterystycznych dla mleka pochodzącego od pewnych gatunków, nie występujących w mleku innych gatunków zwierząt.

W literaturze opisano różne testy przeznaczone do wykrywania analitów w płynach biologicznych. W tych testach zazwyczaj wykorzystywane są metody wykrywania z użyciem środka wykrywającego (receptora lub przeciwciała), który w wybiórczy sposób rozpoznaje analit lub analog tego analitu, oraz środka znakującego (pierwiastek promieniotwórczy, enzym, środek fluorescencyjny itp.). Środki te nazywane są w dalszej części opisu odczynnikami wykrywającymi. W zależności od wybranych środków, w wykrywaniu stosuje się metodę radioimmunoenzymatyczną (RIA), metodę z zastosowaniem znakowanych radioaktywnie receptorów (RRA), metodę enzymoimmunologiczną (EIA) itp. Zgodnie z ogólną zasadą tych testów, stosuje się w nich połączenie co najmniej dwóch wymienionych powyżej środków (odczynników wykrywających), co umożliwia uzyskanie wyniku, którego wartość stanowi miarę ilości obecnego analitu.

Należy wziąć pod uwagę, że w zależności od wybranej metody wykrywania, środek znakujący może ulegać sprzężeniu alternatywnie albo ze środkiem rozpoznającym, albo z analitem lub analogiem analitu, co umożliwia jego wykrycie przez odczynnik wykrywający. Istnieją również procesy, w których środek rozpoznający, analit lub analog tego analitu w naturalny sposób zawierają środek znakujący (np. analit znakowany promieniotwórcze).

W przypadku produktów nabiałowych testy służące do wykrywania analitów są opisywane przede wszystkim pod kątem wykrywania antybiotyków. W istocie wiadomo, że antybiotyki stosowane są w leczeniu pewnych chorób zakaźnych występujących u bydła mlecznego.

Jednak z oczywistych względów medycznych mleko przeznaczone do spożycia przez ludzi musi przede wszystkim być wolne od nawet śladowych ilości antybiotyków. Ponadto, stężenie penicyliny wynoszące 0,005 I.U./ml (jednostek międzynarodowych na ml) może wywierać szkodliwe działania podczas wytwarzania produktów mleko-pochodnych, takich jak ser, jogurt itp.

Można wyobrazić sobie szereg sytuacji. W pierwszym przypadku, np. w celu wykrycia obecności antybiotyków na farmie przed umieszczeniem zwierząt w ciężarówce, pierwszeństwo będą miały testy, które można bardzo szybko wykonać (w czasie poniżej 5 minut) i które są proste. Można również wyobrazić sobie zastosowanie szybkich testów tego rodzaju w sytuacjach, gdy np. znany jest antybiotyk stosowany podczas leczenia zwierząt, a ponadto taki test umożliwia wykrycie tego antybiotyku zgodnie ze wzorcem urzędowym. W drugim przypadku, gdy nie ma konieczności tak szybkiego przeprowadzenia testu, istotne jest wykrycie większości, o ile nie wszystkich antybiotyków, zgodnie ze wzorcami urzędowymi.

Wynika to z tego, że prawodawstwo w niektórych krajach ustanawia określone normy jakości. Przykładowo władze amerykańskie wymagają, aby stężenia następujących sześciu antybiotyków w mleku nie przekraczały określonych wartości: penicylina, 5 części na miliard; ampicylina, 10 części na miliard; amoksycylina, 10 części na miliard; kloksacylina, 10 części na miliard; cefapiryna, 20 części na miliard; ceftiofur, 50 części na miliard. Unia Europejska ze swojej strony również ustanawia własne normy jakości: penicylina, 4 części na miliard; amoksycylina, 4 części na miliard; ampicylina, 4 części na miliard; kloksacylina, 30 części na miliard; dikloksacylina, 30 części na miliard; oksacylina,

PL 191 687 B1 części na miliard; cefapiryna, 10 części na miliard; ceftiofur, 100 części na miliard; cefochinon, 20 części na miliard; nafcylina, 30 części na miliard; cefazolina, 50 części na miliard.

Korzystne może być zatem dysponowanie testami, które umożliwiałyby wykrycie większości antybiotyków. Ponadto można uważać, że w przemyśle mleczarskim, w przypadku niedostępności testu mającego wszystkie wymienione właściwości, to znaczy testu o odpowiedniej czułości, szybkiego i łatwego w wykonaniu, korzystny byłby test, który łączyłby w sobie najlepsze połączenie tych trzech parametrów, nawet gdyby wszystkie z nich nie były w pełni realizowane,

W opisie patentowym US 4239852 opisano mikrobiologiczny sposób wykrywania w mleku antybiotyków z pierścieniem b-laktamowym. Zgodnie z tym sposobem, próbkę mleka inkubuje się początkowo w obecności fragmentów komórek mikroorganizmów, które są wysoce wrażliwe na ten antybiotyk, zwłaszcza Bacillus stearothermophilus, a następnie w obecności antybiotyku, który jest znakowany pierwiastkiem radioaktywnym lub enzymem. Inkubację prowadzi się w warunkach pozwalających na wiązanie się antybiotyków, jeżeli znajdują się w próbce, z fragmentami komórek.

Po inkubacji fragmenty komórek oddziela się od mieszaniny, a następnie przemywa. Następnie ustala się ilość znakowanego antybiotyku związanego z fragmentami komórek i porównuje ze standardem. Ilość znakowanego antybiotyku związanego z fragmentami komórek jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia antybiotyku występującego w analizowanej próbce mleka.

Sposób ten wymaga delikatnego obchodzenia się z materiałem, zwłaszcza w etapie wyodrębniania fragmentów komórek z mieszaniny. Ponadto w najczulszej wersji tego sposobu wykorzystuje się antybiotyk znakowany pierwiastkiem promieniotwórczym (¹⁴C lub 125I). W tym przypadku, dla ustalenia ilości antybiotyku znajdującego się w mleku, konieczne jest zastosowanie specjalnego przyrządu, takiego jak licznik scyntylacyjny. Ponadto praca z produktami radioaktywnymi, nawet w bardzo niewielkich ilościach, wiąże się z pewnymi zagrożeniami dla osoby przeprowadzającej analizę.

W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 593112 opisano inny sposób umożliwiający wykrywanie antybiotyków zawartych w mleku. Wtym sposobie wykorzystuje się białko wyizolowane z mikroorganizmu wrażliwego na antybiotyk, jak np. Bacillus stearothermophilus. Białko to jest ponadto wyznakowane enzymem, np. peroksydazą.

Oznaczenie prowadzi się w następujący sposób: próbkę mleka inkubuje się w probówce w obecności znakowanego białka; po inkubacji, mleko przenosi się do drugiej probówki, na której ściankach znajduje się immobilizowany antybiotyk wzorcowy; przeprowadza się drugą inkubację, a następnie usuwa zawartość probówki; ścianki tej drugiej probówki spłukuje się trzykrotnie roztworem płuczącym, który następnie usuwa się, a pozostałości obecne w drugiej probówce przenosi się na kawałek papieru chłonnego; do drugiej probówki dodaje się substrat reakcji barwnej, inkubuje ponownie, a następnie dodaje się roztwór, który hamuje powstawanie substancji barwnej; zabarwienie probówki porównuje się z zabarwieniem drugiej probówki, w której równolegle prowadzono identyczny test z użyciem standardowej próbki antybiotyku. Ilość znakowanego białka, immobilizowanego na ściankach probówki, a zatem intensywność zabarwienia, jest odwrotnie proporcjonalna do ilości antybiotyku obecnego w analizowanej próbce mleka.

Zgodnie z przykładem 1 tego zgłoszenia patentowego test umożliwia wykrycie penicyliny G w stężeniu rzędu 5 części na miliard; wykrycie amoksycyliny w stężeniu 5 części na miliard; wykrycie ampicyliny w stężeniu 10 części na miliard; wykrycie cefapiryny w stężeniu 5 części na miliard i wykrycie ceftiofuru w stężeniu 5 części na miliard.

Ten test jest jednak trudny w wykonaniu, zwłaszcza przez personel bez odpowiednich kwalifikacji. W istocie na test ten składa się szereg etapów, w tym etapy przenoszenia płynu i pozostałości z jednego naczynia do drugiego, oraz szereg etapów przemywania. Mając na uwadze liczbę i rodzaj etapów stosowanych w tym teście, uzyskanie wiarygodnego wyniku zależy w znacznym stopniu od kompetencji osoby prowadzącej doświadczenie.

Ponadto interpretacja wyników wymaga równoległego prowadzenia dwóch testów, co przyczynia się do zwielokrotnienia i dalszej komplikacji koniecznych do wykonania procedur.

Ujawniono również inne rodzaje procesów enzymatycznych, umożliwiających wykrycie antybiotyków obecnych w mleku w niskich stężeniach (J.M. Frere i inni, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18 (4), 506-510 (1980), oraz opisy patentowe EP 85667 i EP 468946), oparte na zastosowaniu swoistego enzymu, a konkretnie rozpuszczalnej zewnątrzkomórkowej karboksypeptydazy D-alanylo-D-alaninowej wytwarzanej przez Actinomadura R39 (w dalszej części opisu ten enzym zwany jest „enzymem R39). Enzym R39 wykazuje zdolność do hydrolizy grup D-alanylo-D-alaninowych różnych peptydów i może również hydrolizować niektóre tioestry.

PL 191 687 B1

Ponadto enzym R39 reaguje z antybiotykami z pierścieniem b-laktamowym, bardzo szybko prowadząc do powstania równomolowego kompleksu enzym-antybiotyk, który to kompleks jest nieaktywny i zasadniczo nieodwracalny.

W najnowszej wersji tego testu (EP 468 946), ustaloną uprzednio objętość próbki badanego płynu inkubuje się z ustaloną uprzednio ilością enzymu R39 w warunkach umożliwiających reakcję antybiotyku b-laktamowego, który może znajdować się w próbce, z enzymem, prowadząc do powstania równomolowego kompleksu enzym-antybiotyk, który to kompleks jest nieaktywny i zasadniczo nieodwracalny.

Następnie inkubuje się ustaloną uprzednio ilość substratu tioestrowego z produktem uzyskanym w pierwszym etapie w warunkach umożliwiających hydrolizę substratu przez pozostały enzym R39, który nie został związany w kompleks z antybiotykiem podczas pierwszej inkubacji. Następnie określa się ilość utworzonego w ten sposób kwasu merkaptoalkanowego metodą kolorymetryczną z dodatkiem odczynnika, który reagując z wolną grupą SH kwasu merkaptoalkanowego tworzy barwny produkt. Intensywność zabarwienia porównuje się z ustanowionym wcześniej standardem, otrzymanym z próbek zawierających znane ilości antybiotyków. Zawartość antybiotyków można również oznaczyć ilościowo przez pomiar w spektrofotometrze; w przypadku mleka konieczne może być wówczas uprzednie sklarowanie próbki.

Oczywiście sposób ten składa się z mniejszej liczby etapów i jest łatwiejszy w wykonaniu niż test opisany w EP nr 593112. Jego zastosowanie ograniczone jest jednak do wykrywania antybiotyków z pierścieniem b-laktamowym, a próg wykrywalności ogranicza zastosowany enzym R39. W związku z tym owego testu nie można stosować z innymi receptorami dla antybiotyków i nie można go bezpośrednio wykorzystywać jako podstawy do wykrywania innych analitów w mleku.

Wziąwszy pod uwagę, iż stosowane obecnie testy nadal mają pewne niekorzystne cechy, istniała potrzeba opracowania nowych testów do wykrywania analitów w płynnych produktach nabiałowych, które to testy umożliwiałyby wiarygodne oznaczanie obecności różnego rodzaju analitów, korzystnie w chwili pozyskiwania tych produktów na farmie. Dążono do opracowania urządzenia umożliwiającego uzyskanie w bardzo krótkim czasie wiarygodnego i czułego wyniku oznaczenia, w niewielkiej liczbie prostych do wykonania czynności, które nie wymagałoby od osoby prowadzącej oznaczenie specjalnych umiejętności laboratoryjnych. Ponadto potrzebny byłby test, którego wynik mógłby być w łatwo odczytany wizualnie i umożliwiałby oznaczanie ilościowe przez pomiar metodą instrumentalną.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że nowe urządzenie testowe spełnia żądane wymagania i umożliwia łatwe wykrycie obecności analitów w płynnych produktach nabiałowych, a zwłaszcza w mleku.

Zgodne z wynalazkiem urządzenie testowe do wykrywania obecności analitów w płynnych produktach nabiałowych, ma stałą podstawę mającą koniec pierwszy i drugi, przy czym na tej podstawie są zamocowane następujące membrany, począwszy od pierwszego końca, membrana do oczyszczania analizowanego płynu, membrana do unieruchomiania co najmniej jednej substancji wychwytującej, wykonana z nitrocelulozy, oraz membrana absorpcyjna wykonana z celulozy, a cechą tego urządzenia jest to, że membrana do oczyszczania analizowanego płynu jest wykonana z nietkanych włókien poliestrowych.

Korzystnie urządzenie testowe zawiera dodatkowo membranę, na której jest umieszczony co najmniej jeden odczynnik wykrywający, przy czym ta membrana jest usytuowana przed membraną do unieruchomiania substancji wychwytującej.

Korzystnie w urządzeniu testowym membrany są całkowicie lub częściowo pokryte adhezyjną folią tworzywową.

W szczególności ta folia tworzywowa nie pokrywa pierwszych kilku milimetrów urządzenia testowego.

Korzystnie urządzenie testowe jest umieszczone w tworzywowym pudełku, mającym otwór w kształcie wanienki powyżej membrany do oczyszczania, oraz otwór stanowiący okienko powyżej membrany do unieruchomiania substancji wychwytującej.

W urządzeniu według wynalazku membrana do oczyszczania analizowanego płynu ma zdolność zatrzymywania substancji znajdujących się w tym produkcie nabiałowym uniemożliwiających analitom, które mogą znajdować się w tym produkcie nabiałowym, i odczynnikom wykrywającym stosowanym zgodnie z zastosowaną metodą, migrowanie przez urządzenie testowe podczas stycznej kapilarnej migracji próbki po zanurzeniu pierwszego końca urządzenia testowego w analizowanym produkcie nabiałowym.

PL 191 687 B1

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania jest przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 - 3 pokazują urządzenie testowe według wynalazku, przy czym fig. 1a, 2 i 3 pokazują je w widoku z przodu, a fig. 1b w przekroju wzdłużnym.

W jednej z postaci wynalazku, urządzenie testowe według wynalazku ma dodatkowo membranę 5, na której jest umieszczony co najmniej jeden odczynnik wykrywający, który to odczynnik ma zdolność szybkiego rozpuszczania się w obecności produktu nabiałowego. W tej szczególnej postaci wynalazku, membrana 5 musi być umieszczona przed membraną 3. Może ona znajdować się np. albo przed membraną 2 na pierwszym końcu urządzenia, albo pomiędzy membraną 2 a membraną 3, albo jeszcze w innym miejscu powyżej lub poniżej membrany 2.

Różne membrany obecne w urządzeniu testowym według wynalazku są ułożone jedna na drugiej swymi końcami, co umożliwia ciągłą migrację produktu nabiałowego z jednej strefy do drugiej. Korzystnie membrana 3 ułożona jest tak, że jej koniec bliższy jest umieszczony poniżej membrany 2, a jej koniec dalszy poniżej membrany 4. Membrany mogą ewentualnie być utrzymywane w kontakcie ze sobą przez adhezyjną tworzywową folię 6. W tym przypadku wybiera się taką adhezyjną tworzywową folię, aby nie wpływała ona na sposób migracji płynu przez urządzenie testowe.

Urządzenie testowe z adhezyjną folią tworzywową ma dwie zalety: zapewnia doskonały kontakt w miejscu nałożenia jednej membrany na drugą oraz istnienie cienkiej warstwy ochronnej. Adhezyjna tworzywowa folia 6 może pokrywać membrany 2, 3, 4 i 5 całkowicie, lub też częściowo przykrywać poszczególne membrany. Korzystnie adhezyjna tworzywowa folia 6 nie przykrywa pierwszych kilku milimetrów pierwszego końca urządzenia, dla umożliwienia szybszej migracji płynu przez membranę 2 urządzenia testowego.

Stała podstawa 1 znajdująca się w urządzeniu testowym według wynalazku jest wykonana ze szkła lub tworzywa sztucznego, korzystnie z tworzywa sztucznego. W przypadku, gdy podstawa wykonana jest z tworzywa sztucznego, jej grubość wynosi zazwyczaj 0,05 - 1 mm, a korzystnie 0,1 - 0,6 mm. Membrany są przytwierdzone do stałej podstawy 1 za pomocą kleju.

Można stosować membrany 2 różnych typów. Ta membrana musi mieć zdolność zatrzymywania substancji znajdujących się w produkcie nabiałowym zapobiegających migracji przez urządzenie testowe ewentualnie obecnych w produkcie nabiałowym analitów i odczynników wykrywających stosowanych zgodnie z praktykowanym sposobem. Ponadto ta membrana musi umożliwiać szybką migrację analitów i odczynników wykrywających przez urządzenie testowe, z zachowaniem aktywności tych analitów i odczynników wykrywających podczas tej migracji. Do przykładowych membran, które umożliwiają osiągnięcie tych celów, należą Cytosep 1663 i Leukosorb LK4 (wytwarzane przez firmę Pall Gelman Sciences). Poza tym można też stosować membrany GF/D, GF/DVA, 17 CHR (wytwarzane przez firmę Whatmann oraz włókno szklane typu GF141 (wytwarzane przez firmę Alstrom).

Korzystna membrana, membrana Leukosorb, jest membraną wytworzoną z włókien poliestrowych i jest przeznaczona do zatrzymywania leukocytów z próbek klinicznych uzyskanych z krwi, moczu, śliny i płynu mózgowo-rdzeniowego. Zatrzymywanie leukocytów odbywa się na drodze filtracji płynu przez tę membranę w trakcie przepływu poprzecznego.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że tego rodzaju membrany mogą również spełniać bardzo ważną funkcję przy wykrywaniu analitów w produkcie nabiałowym z użyciem urządzeń testowych według wynalazku, a mianowicie przez zatrzymywanie obecnych w produktach nabiałowych substancji, które uniemożliwiają prawidłowy przebieg testu polegającego na wykrywaniu substancji drogą stycznej kapilarnej migracji produktu nabiałowego w tym urządzeniu testowym, umożliwiając równocześnie szybką migrację analitów i odczynników wykrywających.

Dla jak najlepszego zrealizowania tych funkcji, membrana 2 musi mieć długość wystarczającą do usunięcia wszystkich obecnych w produkcie nabiałowym substancji, które uniemożliwiają migrację analitów i odczynników wykrywających przez urządzenie testowe.

Membrana 3 musi umożliwiać immobilizację jednej lub kilku substancji wychwytujących i musi umożliwiać szybką migrację próbki produktu nabiałowego po przejściu przez membranę 2. Korzystnie membrana 3 jest trwale umocowana na nieporowatej podstawie z poliestru. Do przykładowych membran należą membrany nitrocelulozowe o wysokiej szybkości kapilarnej, jak np. membrany Hi-Flow (wytwarzane przez firmę Millipore), korzystnie membrany Hi-Flow typu SX lub ST. Te membrany zapewniają uzyskanie optymalnego wyniku w połączeniu z membraną 2, opisaną powyżej.

Na membranie 3 unieruchamiana jest jedna lub większa liczba substancji wychwytujących. Rodzaj unieruchomionej na membranie substancji wychwytującej zależy oczywiście od stosowanej metody wykrywania analitów; substancje wychwytujące mają zdolność wybiórczego wychwytywania co

PL 191 687 B1 najmniej jednego ze składników znajdujących się w płynie migrującym przez urządzenie testowe, będącego np. odczynnikiem wykrywającym lub produktem powstałym na skutek powstania kompleksu pomiędzy analitem lub analogiem analitu, a co najmniej jednym odczynnikiem wykrywającym lub, alternatywnie, produktem powstającym na skutek wytworzenia kompleksu dwóch lub większej liczby odczynników wykrywających. Substancja wychwytująca może być również jednym z odczynników wykrywających. Substancje wykrywające umieszczone są w stężonej postaci w kilku ściśle określonych miejscach na membranie 3, np. w postaci krążków lub cienkich pasków, lub w innej odpowiedniej postaci, nadającej się do zastosowania. Niezależnie od wybranej postaci, musi ona umożliwiać wyraźny odczyt wyniku.

Jeżeli chodzi o wymiary, membrana 3 musi mieć długość wystarczającą do pomieszczenia wszystkich kolejno stosowanych substancji wychwytujących, w ilościach wymaganych przez stosowaną metodę wykrywania.

Rodzaj membrany stosowanej jako membrana 4 ma mniejsze znaczenie, pod warunkiem, że ta membrana ma zdolność absorpcji i przechowywania płynu po jego przejściu przez poprzednie membrany. Wielkość membrany 4 jest tak dobrana, aby w wystarczający sposób absorbowała ona płyn po przejściu przez membranę 3, ale zarazem, z praktycznego punktu widzenia, aby umożliwić jak najwygodniejszą obsługę urządzenia testowego.

Urządzenie według wynalazku może zawierać membranę 5, na której znajduje się co najmniej jeden odczynnik wykrywający. Membrana 5 musi umożliwiać migrację produktu nabiałowego, umożliwiając zarazem rozpuszczanie i uwalnianie odczynnika wykrywającego (lub odczynników wykrywających) podczas migracji płynnego produktu nabiałowego. Do przykładowych membran, jakie mogą być odpowiednie w tym celu, należą: membrany na bazie żywic z włóknami szklanymi, jak membrany T5NM (wytwarzane przez firmę Millipore), membrany F075-14, F075-17 lub GF/C (wytwarzane przez firmę Whatman), membrana Cytosep 1663 (wytwarzana przez firmę Pall Gelman Sciences), membrany na bazie żywic z włóknami poliestrowymi, jak membrany Accuwick (wytwarzane przez firmę Pall Gelman Sciences), papier celulozowy 3 mm (wytwarzany przez firmę Whatman) lub inne rodzaje membran typu Release Matrix PT-R2 (wytwarzane przez firmę Advances Micro Devices). Korzystne jest zastosowanie membran na bazie żywic z włóknami poliestrowymi, np. membran Accuwick. Membrana 5 ma długość odpowiednią do pomieszczenia pożądanej ilości odczynnika wykrywającego.

Urządzenia testowe według wynalazku są wytwarzane metodami znanymi fachowcom. Karty można wytworzyć np. z zastosowaniem dostępnych na rynku laminatorów. Stosowane substancje wychwytujące są umieszczane na membranie 3 w postaci roztworów, przed zmontowaniem lub po zmontowaniu kart. Roztwory te mogą być bardzo precyzyjnie nanoszone na membrany za pomocą dostępnych na rynku przyrządów, np. dozownika platformowego BioJet Quanti-3000 X-Y, wytwarzanego przez firmę BioDot, Inc. Naniesione na membranę roztwory natychmiast odparowuje się, np. przez umieszczenie karty w strumieniu gorącego powietrza. W przypadku produkcji na większą skalę, możliwe jest również wytworzenie rolek. Następnie rolki lub karty, zawierające pożądane substancje wytwarzające, tnie się na paski, a każdy z tych pasków stanowi urządzenie testowe według wynalazku.

W przypadku, gdy w skład urządzania do wykrywania wchodzi membrana 5, odczynnik lub odczynniki wykrywające mogą zostać na niej umieszczone przed zmontowaniem kart lub rolek, po prostu przez zanurzenie membrany 5 w roztworze zawierającym odczynnik(-i) wykrywający(-e). Alternatywnie odczynnik(i) można umieścić po zmontowaniu kart lub rolek, z zastosowaniem techniki zbliżonej do techniki stosowanej podczas umieszczania substancji wychwytujących na membranie 3.

W jednej z postaci wynalazku urządzenie jest umieszczone w tworzywowym pudełku, mającym dwa otwory: otwór pierwszy, w kształcie wanienki, umieszczony jest tuż nad membraną 2 i przeznaczony jest do wpuszczania płynu, który ma być analizowany; otwór drugi jest okienkiem, które umożliwia obserwację wyniku pojawiającego się na membranie 3. W tym przypadku urządzenie testowe nie zawiera adhezyjnej tworzywowej membrany 6.

Urządzenie testowe według wynalazku umożliwia wykrywanie obecności analitów w płynnych produktach nabiałowych, a zwłaszcza w mleku.

Tak więc urządzenie testowe według wynalazku stosuje się w sposobie wykrywania analitów w płynnych produktach nabiałowych z użyciem odczynników wykrywających, który to sposób obejmuje następujące etapy:

a) kontaktowanie określonej objętości produktu nabiałowego z urządzeniem testowym, przy czym ten kontakt zachodzi na pierwszym końcu urządzenia testowego,

PL 191 687 B1

b) styczną kapilarną migrację produktu nabiałowego przez urządzenie testowe tak, że anality i odczynniki wykrywające, które mogą znajdować się w produkcie nabiałowym, przemieszczają się stopniowo przez membranę 2, a następnie membranę 3, przy czym składniki produktu nabiałowego niezatrzymane przez membrany 2 i 3 zostają zatrzymane na membranie 4, i

c) określanie związania z membraną 3.

Sposób ten umożliwia wykrywanie analitów znajdujących się w płynnym produkcie nabiałowym, np. w mleku, serwatce, maślance itp. W szczególności możliwe jest wykrywanie analitów, takich jak stosowane w weterynarii leki, hormony lub białka, które mogą znajdować się w mleku.

Ilość i charakter odczynników wykrywających może zmieniać się w zależności od zastosowania wynalazku, z uwzględnieniem stosowanej w praktyce metody wykrywania. Stosuje się co najmniej dwa odczynniki wykrywające. Pierwszy odczynnik wykrywający jest środkiem rozpoznającym, mającym właściwości swoistego rozpoznawania analitu; będzie on w dalszej części opisu nazywany „substancją identyfikującą. Drugi odczynnik wykrywający jest środkiem znakującym; będzie on w dalszej części opisu nazywany „markerem. Należy wziąć pod uwagę, że w zależności od wybranego zastosowania wynalazku, pewne odczynniki wykrywające mogą znajdować się na membranie 3 lub na membranie 5. W zależności od rodzaju analitu, jaki ma być wykrywany, oraz od zastosowanych odczynników wykrywających, konieczne może być dodanie jednego lub kilku odczynników wykrywających przed naniesieniem produktu nabiałowego na urządzenie testowe według wynalazku oraz utrzymywanie tej mieszaniny w warunkach inkubacji, które pozwalają na utworzenie kompleksów pomiędzy odczynnikami do wykrywania a analitem lub jego analogiem. W zależności od wybranej metody, substancja identyfikująca oraz marker mogą zostać ze sobą połączone, lub mogą występować jako pojedyncze substancje. Można też zastosować wiele substancji identyfikujących i/lub markerów.

Substancja identyfikująca umożliwia wykrycie obecności poszukiwanego analitu określonego rodzaju, na podstawie zdolności tej substancji do swoistego rozpoznawania tego analitu lub jego analogu. Substancją tą może być receptor zdolny do wybiórczego tworzenia trwałych i zasadniczo nieodwracalnych kompleksów z analitem lub jego analogiem, bądź też monoklonalne lub poliklonalne przeciwciało swoiste dla analitu lub jego analogu. W przypadku wykrywania obecności antybiotyków, substancjami identyfikującymi mogą być stosowane swoiste poliklonalne lub monoklonalne przeciwciała lub receptory pozyskane od mikroorganizmów wrażliwych na te antybiotyki, np. receptory pozyskane od gatunku Bacillus (Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis itp.), gatunku Streptococcus (Streptococcus thermophilus itp.) lub gatunku Actinomyces (Actinomadura R39 itp.).

Korzystnie stosuje się substancję identyfikującą, którą stanowi receptor wrażliwy na antybiotyki z pierścieniem b -laktamowym, który to receptor jest pozyskany z Bacillus licheniformis, np. receptor BlaR lub receptor BlaR-CTD. Sposób izolacji i sekwencję aminokwasową białka BlaR opisali Y. Zhu i inni, w J. Bacteriol., 1137-1141 (1990); receptor BlaR-CTD jest regionem karboksy-końcowym białka BlaR, którego sposób izolacji i sekwencję aminokwasową opisali B. Joris i inni, w FEMS Microbiology Letters, 107-114 (1990).

Zastosowanie receptorów BlaR lub BlaR-CTD w wykrywaniu antybiotyków z pierścieniem b-laktamowym ma znaczne zalety w porównaniu z dotychczas stosowanymi środkami rozpoznającymi. W istocie, receptory BlaR i BlaR-CTD zdolne są do bardzo szybkiego tworzenia kompleksów ze znaczną liczbą antybiotyków, przy czym to wiązanie zachodzi w temperaturze inkubacji, która jest niższa od temperatury stosowanej w przypadku znanych substancji rozpoznających, jak np. receptorów pozyskanych z Bacillus stearothermophilus.

Drugim rodzajem odczynnika wykrywającego jest marker, który umożliwia wizualizację oraz bezpośrednie lub pośrednie ilościowe oznaczenie analitów znajdujących się w danym produkcie nabiałowym. Markery mogą mieć postać cząstek, substancji fluorescencyjnych, substancji radioaktywnych, luminescencyjnych lub enzymów. Korzystne jest zastosowanie markera w postaci cząstek, który umożliwia uzyskanie łatwego do odczytu sygnału wizualnego, nawet wówczas, gdy marker obecny jest w małej ilości. Do przykładowych takich markerów można zaliczyć koloidalne cząstki metali (platyny, złota, srebra itp.}, koloidalne cząsteczki selenu, węgla, siarki, telluru, bądź też barwione, syntetyczne, koloidalne cząstki lateksu. Szczególnie korzystne jest zastosowanie koloidalnych cząsteczek złota o średnicy 1-60 nm; umożliwiają one uzyskanie łatwego do odczytania, intensywnego różowoczerwonego zabarwienia.

Marker umożliwia wykrycie obecności analitu w próbce produktu nabiałowego poprzez wiązanie się z jednym lub większą liczbą odczynników, z analitem lub jego analogiem.

PL 191 687 B1

Marker można wiązać z odczynnikiem do wykrywania sposobami znanymi fachowcom. W przypadku, gdy stosowany jest marker cząsteczkowy, znakowanie może zachodzić przez bezpośrednią absorpcję na cząsteczkach albo pośrednio za pomocą środka wiążącego, np. kompleksu biotyna/antybiotyna. Takie wiązanie może nastąpić przed naniesieniem produktu nabiałowego na urządzenie testowe według wynalazku albo podczas migracji produktu nabiałowego przez urządzenie według wynalazku.

W pewnych przypadkach można stosować odczynnik wykrywający trzeciego rodzaju, zwany w dalszej części opisu „substancją wzorcową. Jest to substancja, dodawana w znanej ilości do analizowanej próbki, która wiąże się ze swoistą substancją wychwytującą, unieruchomioną na membranie 3. Substancja wzorcowa powoduje uzyskanie prążka, którego intensywność służy jako wzorzec w sposobie ilościowego oznaczania analitu.

Produkt nabiałowy nanosi się na urządzenie testowe według wynalazku (etap a) procesu) przez umieszczenie urządzenia testowego według wynalazku w naczyniu, na którego dnie znajduje się próbka, która ma być poddana analizie. Urządzenie testowe umieszcza się zasadniczo pionowo w naczyniu, tak że pierwszy koniec urządzenia styka się z mieszaniną.

W przypadku zastosowania urządzenia testowego umieszczonego w tworzywowym pudełku, pudełko ustawia się poziomo, a kontakt analizowanej substancji z urządzeniem odbywa się przez umieszczenie pewnej objętości analizowanej próbki w otworze o kształcie wanienki, znajdującym się powyżej membrany 2.

W etapie migracji, etapie b), płyn migruje przez kapilary urządzenia testowego według wynalazku. Płyn migrujący dzięki oddziaływaniom kapilarnym przez urządzenie według wynalazku napotyka najpierw na membranę 2, która umożliwia zatrzymywanie substancji znajdujących się w produkcie nabiałowym, które zapobiegają migracji analitów, które mogą być obecne w tym produkcie nabiałowym, oraz odczynników wykrywających, przez urządzenie testowe. Anality i odczynniki wykrywające migrują następnie przez membranę 3, na której została(y) unieruchomiona(e) jedna lub większa liczba substancji wychwytujących. Substancje wychwytujące w wybiórczy sposób unieruchamiają co najmniej jeden ze składników obecnych w analizowanym płynie. W szczególności stosuje się substancję wychwytującą, umieszczoną na końcu ścieżki migracji płynu przez membranę 3, która ma zdolność wychwytywania wszystkich markerów, które nie zostały zatrzymane przez wcześniejsze substancje wychwytujące. Ta substancja wychwytująca umożliwia uzyskanie w pełni ilościowych informacji dostarczanych przez poprzedzające substancje wychwytujące.

Określanie związania z membraną 3 (etap c) procesu) odbywa się po prostu na drodze ustalenia obecności markerów w tej strefie. Można to najprościej osiągnąć stosując metody wizualne. Jednak, jeżeli pożądane jest dysponowanie precyzyjnym pomiarem intensywności obserwowanych sygnałów, możliwe jest zastosowanie przyrządu umożliwiającego pomiar intensywności obserwowanego sygnału. Gdy stosowana jest substancja wzorcowa, jest ona wiązana przez swoistą substancję wychwytującą, która dostarcza wewnętrznego wzorca, służącego do oceny pomiaru intensywności obserwowanego sygnału.

Interpretacja uzyskanego wyniku zależy od stosowanej metody wykrywania, to znaczy od zastosowanych odczynników wykrywających oraz substancji wychwytujących.

W odniesieniu do sposobu wykrywania analitów w mleku, które zostały uprzednio opisane w piśmiennictwie, sposób z użyciem urządzenia testowego według wynalazku ma następujące zalety. Po pierwsze, sposób ten przebiega bardzo szybko i jest niezmiernie łatwy w zastosowaniu; składa się zasadniczo z dwóch łatwych do przeprowadzenia etapów, nie wymagających od osoby wykonującej oznaczenie specjalnego doświadczenia eksperymentalnego. Następnie, jakościowa i ilościowa ocena wyniku jest natychmiastowa i nie wymaga przeprowadzenia dodatkowych operacji, jak te wymagane wówczas, gdy oznaczenie prowadzi się z zastosowaniem markerów barwiących i/lub enzymatycznych. Ponadto sposób ten można bezpośrednio zastosować podczas wykrywania różnych rodzajów analitów. Na koniec, w zastosowaniu z wykorzystaniem substancji wzorcowej, wynik może być bezpośrednio zinterpretowany w sposób ilościowy, bez konieczności przeprowadzania jednego lub kilku testów odniesienia.

Urządzenie według wynalazku może być dostarczane w zestawie do oznaczeń, przeznaczonym do wykrywania analitów w produktach nabiałowych. Jeżeli jest to właściwe, ten zestaw może również zawierać odczynniki wykrywające, które są dodawane do próbki przed naniesieniem produktu nabiałowego na urządzenie testowe.

Przedstawione poniżej przykłady ilustrują urządzenie według wynalazku i jego zastosowanie.

PL 191 687 B1

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie urządzeń testowych. Procedury ogólne.

1.1. Montowanie kart z membranami

Na początku montowane są karty o wymiarach 300 x 76,2 mm za pomocą laminatora typu Clamshell (wytwarzanego przez firmę BioDot, Inc.) według następującej metody.

Wycina się tworzywową prostokątną podstawę typu ArCare 8565 (wytwarzaną przez firmę Adhesive Research) o wymiarach 300 x 76,2 mm (stała podstawa 1). Następnie wycina się: prostokąty z membrany Leukosorb LK4 (wytwarzanej przez firmę Pall Gelman Sciences) o wymiarach 300 x 20mm (membrana 2), prostokąt z membrany Hi-Flow SX (wytwarzanej przez firmę Millipore) o wymiarach 300 x 25 mm (membrana 3), prostokąt 3 mm z membrany celulozowej (wytwarzanej przez firmę Whatman) o wymiarach 300 x 40 mm (membrana 4), oraz prostokąt z membrany Accuwick (wytwarzanej przez firmę Pall Gelman Sciences) o wymiarach 300 x 0,8 mm (membrana 5).

Następnie membrany 2 i 4, później 5, później 3, umieszcza się w odpowiednich miejscach na dolnej formie laminatora. Stała podstawa 1, pokryta klejem, jest w tym etapie utrzymywana w pokrywie urządzenia, stroną pokrytą klejem na zewnątrz. Membrany umieszczone na dolnej formie laminatora są stykane z podstawą pokrytą klejem przez zamknięcie laminatora; membrany są utrzymywane ściśle na swoich miejscach przez zasysanie powietrza, odbywającego się za pomocą pompy próżniowej. Gdy następuje spadek próżni, otrzymuje się kartę, która składa się ze stałej podstawy 1, na której są umieszczone membrany 2, 3, 4 i 5.

1.2. Umieszczanie substancji wychwytujących na membranie 3

Umieszczanie substancji wychwytujących na membranie 3 odbywa się przed wytworzeniem lub po wytworzeniu urządzenia, jak opisano w przykładzie 1.1.

Przygotowuje się roztwór wodny, zawierający substancję wychwytującą. Nanosi się go na membranę 3 karty przygotowanej w przykładzie 1.1 za pomocą dozownika BioJet X-Y Platform Quatni-3000 Dispenser, wytwarzanego przez firmę BioDot, Inc.

Naniesione na membranę roztwory odparowuje się natychmiast przez umieszczenie całej karty w strumieniu gorącego pulsującego powietrza o temperaturze 60°C na okres jednej minuty.

1.3. Umieszczanie substancji znakującej na membranie 5 a) przed zmontowaniem urządzenia, opisanym w przykładzie 1.1.

Przygotowuje się roztwór wodny, zawierający substancję znakującą. W tym roztworze zanurza się membranę 5. Membranę odsącza się, a następnie suszy przez noc w temperaturze otoczenia, pod podciśnieniem 0,05 MPa.

b) po zmontowaniu urządzenia, opisanym w przykładzie 1.1.

Postępuje się zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1.2. dla umieszczania substancji wychwytujących.

1.4. Umieszczanie adhezyjnej tworzywowej błony 6

Wycina się prostokątny fragment adhezyjnej folii typu ArCare 7759 (wytwarzanej przez firmę Adhesive Research) o wymiarach 300 x 20 mm, jeżeli ma ona pokrywać tylko część urządzenia, lub o wymiarach 300 x 71,2 mm, w przypadku, gdy folia ma pokrywać wszystkie membrany.

Kartę otrzymaną jak w przykładzie 1.1. umieszcza się na dolnej formie laminatora, adhezyjną folię umieszcza się w pokrywie laminatora, stroną adhezyjną skierowaną na zewnątrz. Następnie styka się folię adhezyjną z pokrytą membranami kartą przez zamknięcie urządzenia.

1.5. Cięcie na paski

Karty uzyskane po montażu tnie się na paski za pomocą urządzenia typu gilotyny lub za pomocą urządzenia obrotowego (wytwarzanego przez firmę BioDot, Kinematic lub Akzo). Końcowe paski są usuwane, a pozostałe paski są gotowe do użycia.

W celu konserwacji urządzenia testowe umieszcza się w nieprzezroczystych, hermetycznych pojemnikach, zawierających również środki suszące (Silgelac, Francja).

1.6. Umieszczanie w tworzywowej skrzynce

Urządzenie testowe umieszcza się w tworzywowym pudełku, mającym dwa otwory: pierwszy otwór, o kształcie wanienki, jest umieszczony bezpośrednio nad membraną 2 i umożliwia wprowadzenie płynu, który ma być analizowany; drugi otwór jest okienkiem, który umożliwia wizualizację wyniku powstającego na membranie 3.

P r z y k ł a d 2. Wykrywanie antybiotyków z pierścieniem b -laktamowym w mleku za pomocą enzymu R39

2.1. Substancja identyfikująca

PL 191 687 B1

Stosowaną substancją identyfikującą jest w tym przykładzie rozpuszczalna zewnątrzkomórkowa karboksypeptydaza D-alanylo-D-alaninowa, wytwarzana przez Actinomadura R39, uzyskana w sposób opisany przez J.-M. Frere i innych, w Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510 (1980).

2.2. Sprzęganie substancji identyfikującej z markerem

2.2.1. Biotynylacja substancji identyfikującej

250 ml wodnego roztworu enzymu R39 o stężeniu 1 mg/ml poddaje się dializie przez 24 godziny względem 500 ml buforu HNM (Hepes 10 mM, pH 8, NaCl 10 mM, MgCl2 5 mM). Do zdializowanego roztworu enzymu R39 dodaje się następnie 2 ml buforu wodorowęglanowego (0,1 M wodorowęglan sodu, pH 9) oraz 250 ml roztworu estru N-hydroksysukcynoimidowego kwasu 6-(biotyn-amido)kapronowego o stężeniu 5 mg/ml w bezwodnym DMF. Roztwór ten łagodnie miesza się w mieszadle LABINCO dla probówek na osi obrotowej (wytwarzane przez VEL, Belgia) z prędkością 2 obrotów na minutę przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Tak uzyskany roztwór dializuje się względem buforu HNM (Hepes 100 mM; pH 8, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM) przez 24 godziny. W ten sposób uzyskuje się roztwór biotynylowanego enzymu R39, który rozcieńcza się buforem HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml) do osiągnięcia stężenia 100 mg enzymu R39 na mililitr buforu. Roztwór ten przechowuje się w temperaturze -20°C.

2.2.2. Marker

Jako marker stosuje się cząstki złota o średnicy 40 nm, na których umieszczono kozie przeciwciało anty-biotynowe w postaci zawiesin w 2 mM wodnym roztworze tetraboranu sodu, o pH równym

7,2, stabilizowanym za pomocą 0,1% azydku sodu (wytwarzany przez firmę British Biocell, pozycja GAB40). Gęstość optyczna tych zawiesin przy 520 nm wynosi około 10, a stężenie białka wynosi około 24 mg/ml.

2.2.3. Sprzęganie biotynylowanej substancji identyfikującej z markerem

Roztwór A, do szybkiego testu.

Roztwór biotynylowanego enzymu R39 przygotowany w przykładzie 2.2.1. rozcieńcza się 25-krotnie buforem HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml). W temperaturze pokojowej miesza się 17,5 części objętościowych tego rozcieńczonego roztworu biotynylowanego enzymu R39, 9,27 części objętościowych zawiesiny cząstek złota stosowanych do znakowania enzymu R39 oraz 6 części objętościowych wzorcowej zawiesiny cząstek złota (patrz przykład 2.3).

Roztwór B, do czułego testu.

Roztwór biotynylowanego enzymu R39 przygotowany w przykładzie 2.2.1. rozcieńcza się 50-krotnie buforem HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml). W temperaturze pokojowej miesza się 17,5 części objętościowych tego rozcieńczonego roztworu biotynylowanego enzymu R39, 9,27 części objętościowych zawiesiny cząstek złota stosowanych do znakowania enzymu R39 oraz 6 części objętościowych wzorcowej zawiesiny cząstek złota (patrz przykład 2.3.).

2.3. Substancja wzorcowa

Jako substancję wzorcową stosuje się 40 nm cząstki złota, na których umieszczono kozią immunoglobulinę anty-króliczą. Takie cząstki złota wytwarzane są przez firmę British Biocell (pozycja GAR40) w postaci zawiesin w 2 mM wodnym roztworze tetraboranu sodu, o pH 7,2, stabilizowanym 0,1% azydkiem sodu. Gęstość optyczna tych zawiesin przy 520 nm wynosi około 3, a stężenie białka wynosi około 6 mg/ml.

2.4. Substancje wychwytujące

2.4.1. Pierwsza substancja wychwytująca ml roztworu zawierającego 213 mg ludzkiej g -globuliny (G4386, Sigma) i 8,6 mg chlorowodorku 2-iminotiolanu (Aldrich, 33056-6) w buforze węglanie sodu (100 mM, pH 9) inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 25°C.

Ponadto 20 ml roztworu zawierającego 119,8 mg cefalosporyny C i 54 mg 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu sulfosukcynyloimidylu (sSMCC, 22322 Pierce) w buforze węglanie sodu (100 mM, pH 9) inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 25°C.

Te dwa roztwory przygotowane jak opisano powyżej następnie miesza się. Odczyn uzyskanego roztworu doprowadza się do pH 7,1 przez dodanie 3 ml 500 mM NaH2PO4, a roztwór inkubuje się w temperaturze 25°C przez 2 godziny. Mieszaninę uzyskaną po inkubacji trzykrotnie dializuje się względem 1 litra buforu fosforanu sodu (10 mM, pH 7,5). Uzyskany roztwór filtruje się przez filtr

PL 191 687 B1

0,22 mm, po czym dzieli na równe objętości i przechowuje w postaci zamrożonej w temperaturze -20°C, aż do momentu użycia.

Przed użyciem odmierzone uprzednio objętości roztworu rozmraża się i dodaje barwnik spożywczy przed umieszczeniem roztworu na membranie, tak aby umożliwić precyzyjne wskazanie miejsca umieszczenia roztworu oraz jakości śladu.

Pierwsza substancja wychwytująca umożliwia wychwycenie substancji identyfikujących sprzężonych z trzema markerami znajdującymi się w nadmiarze względem ilości antybiotyku zawartego w próbce.

2.4.2. Druga substancja wychwytująca

Jako drugą substancję wychwytującą stosuje się roztwór immunoglobuliny króliczej (Sigma I 5006), o stężeniu immuno-globuliny wynoszącym 0,5 mg/ml w 10 mM fosforanie sodu, pH 7,5, i zawartości ludzkiej g-globuliny wynoszącej 5 mg/ml buforu. Druga substancja wychwytująca zatrzymuje substancję wzorcową podczas migracji płynu przez urządzenie testowe.

2.5. Urządzenie testowe

Stosowane są urządzenia testowe zawierające membrany 2, 3 i 4, zmontowane zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1.1. Membrana 3 tych urządzeń zawiera substancję wychwytującą opisaną w przykładzie 2.4.1. na końcu proksymalnym, a na końcu dystalnym zawiera substancję wychwytującą opisaną w przykładzie 2.4.2. Substancje wychwytujące zostały umieszczone na membranie według procedur opisanych w przykładzie 1.2.

2.5.1. Test 1 - szybki test

Przygotowuje się siedem próbek mleka, zawierających odpowiednio 0; 2; 4; 5; 6; 8 i 10 części na miliard penicyliny G. Każdy z tych roztworów jest następnie analizowany w następujący sposób.

Pobiera się próbkę 250 ml mleka oraz 32,8 ml roztworu A przygotowanego w przykładzie 2.2.3 i umieszcza się w probówce Eppendorfa. Tę mieszaninę inkubuje się w temperaturze 47°C przez 3 minuty. Następnie w probówce Eppendorfa umieszcza się pionowo urządzenie testowe tak, aby pierwszy koniec tego urządzenia testowego stykał się z mieszaniną. Pozwala się na migrację mieszaniny przez urządzenie testowe, inkubując w tym czasie urządzenie w temperaturze 47°C przez 2 minuty.

W poniższej tabeli 1 podano wyniki uzyskane dla siedmiu badanych próbek. Wykrytym prążkom przypisano wartość intensywności od 0 do 10, przy czym wartość 10 odpowiada najintensywniejszemu prążkowi, a wartość 0 odpowiada najmniej intensywnemu prążkowi. Według tej skali, prążkowi wzorcowemu przypisano wartość 6. Intensywność sygnału obserwowanego na pierwszym prążku jest odwrotnie proporcjonalna do ilości penicyliny G znajdującej się w próbce.

	T ab el a 1
Penicylina G	Intensywność
(części/mld.)	pierwszy prążek	drugi prążek
0	10	6
2	8	6
4	5	5
5	3	6
6	2	6
8	1	6
10	0	6

W tym przykładzie wynik testu uważa się za dodatni, gdy pierwszy prążek ma intensywność niższą niż prążek wzorcowy. Wyniki podane w tabeli 1 wskazują, że ten test umożliwia wykrycie w ciągu 5 minut nawet do 4 części na miliard penicyliny G w próbce.

2.5.2. Test 2 - czuły test

Przygotowuje się sześć próbek mleka, zawierających odpowiednio 0; 2; 2,5; 3; 4 i 5 części na miliard penicyliny G. Każdy z tych roztworów jest następnie analizowany w następujący sposób.

Pobiera się próbkę 250 ml mleka oraz 32,8 ml roztworu B przygotowanego w przykładzie 2.2.3 i umieszcza się w probówce Eppendorfa. Tę mieszaninę inkubuje się w temperaturze 47°C przez 5 minut. Następnie w probówce Eppendorfa umieszcza się pionowo urządzenie testowe tak, aby pierwszy

PL 191 687 B1 koniec tego urządzenia testowego stykał się z mieszaniną. Pozwala się na migrację mieszaniny przez urządzenie testowe, inkubując w tym czasie urządzenie w temperaturze 47°C przez 2 minuty.

W poniższej tabeli 2 podano wyniki uzyskane dla siedmiu badanych próbek. Wykrytym prążkom przypisano wartość intensywności od 0 do 10, przy czym wartość 10 odpowiada najintensywniejszemu prążkowi, a wartość 0 odpowiada najmniej intensywnemu prążkowi. Według tej skali, prążkowi wzorcowemu przypisano wartość 6. Intensywność sygnału obserwowanego na pierwszym prążku jest odwrotnie proporcjonalna do ilości penicyliny G znajdującej się w próbce.

Tabel a 2

Penicylina G (części/mld.) 0

2,5

Intensywność pierwszy prążek drugi prążek 6 6 6 6 6 6

W tym przykładzie wynik testu uważa się za dodatni, gdy pierwszy prążek ma intensywność niższą niż prążek wzorcowy. Wyniki podane w tabeli 2 wskazują, że ten test umożliwia wykrycie w ciągu 7 minut nawet do 2,5 części na miliard penicyliny G w próbce.

P r z y k ł a d 3. Ustalanie obecności w mleku antybiotyków z pierścieniem b -laktamowym za pomocą BlaR

Przykład ten ilustruje sposób wykrywania w mleku antybiotyków z pierścieniem b-laktamowym, monitorowanych przez organizacje odpowiedzialne za ochronę zdrowia. W teście opisanym w tym przykładzie stosuje się receptor BlaR sprzężony z drobinami złota, służącymi jako środek znakujący, oraz wykorzystuje się urządzenie, mające postać urządzenia testowego ze stałą podstawą, na której umieszczone są membrany.

3.1. Sprzęganie BlaR-CTD (substancja identyfikująca) z drobinami złota (marker)

3.1.1. Biotynylacja BlaR-CTD

3,79 ml roztworu środka rozpoznającego BlaR-CTD o stężeniu 6,6 mg/ml umieszcza się w buforze fosforanie sodu, 20 mM, pH 7. Do tego roztworu BlaR-CTD dodaje się następnie 41,71 ml buforu wodorowęglanowego (0,1 M wodorowęglan sodu, pH 9) oraz 2 ml roztworu estru N-hydroksysukcynoimidowego kwasu 6-(biotynamido)kapronowego, zawierającego 2,23 mg/ml buforu wodorowęglanowego. Roztwór ten łagodnie miesza się w mieszadle LABINCO dla probówek na osi obrotowej (wytwarzane przez VEL, Belgia) z prędkością 2 obrotów na minutę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Wraz z mieszaniną reakcyjną w tych samych warunkach przez 30 minut inkubuje się 2,5 ml roztworu buforu Tris, 1M, pH 8. Tak uzyskany roztwór dializuje się względem buforu HNM (Hepes 100 mM; pH 8, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM) przez 24 godziny. W ten sposób uzyskuje się roztwór biotynylowanego BlaR-CTD, który rozcieńcza się buforem HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml) do osiągnięcia stężenia 250 mg biotynylowanego BlaR-CTD na mililitr buforu. Roztwór ten przechowuje się w temperaturze -20°C.

3.1.2. Środek znakujący

Jako środek znakujący stosuje się cząstki złota o średnicy 40 nm, na których umieszczono kozie przeciwciało antybiotynowe w postaci zawiesin w 2 mM wodnym roztworze tetraboranu sodu, o pH 7,2, stabilizowanym za pomocą 0,1% azydku sodu (wytwarzany przez firmę British Biocell, pozycja GAB40). Gęstość optyczna tych zawiesin przy 520 nm wynosi około 10, a stężenie białka wynosi około 24 mg/ml.

3.1.3. Sprzęganie biotynylowanego BlaR z drobinami złota

Roztwór biotynylowanego BlaR-CTD przygotowany w przykładzie 3.1.1. rozcieńcza się 114,7-krotnie buforem HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml). W temperaturze pokojowej miesza się 22,5 części objętościowych tego rozcieńczonego roztworu biotynylowanego BlaR-CTD, 7,5 części objętościowych buforu HNM-BSA, 9,27 części objętościowych zawiesiny cząstek złota stosowanych do znakowania biotynylowanego BlaR-CTD oraz 6 części objętościowych wzorcowej zawiesiny cząstek złota (patrz poniższy przykład 3.1.4).

PL 191 687 B1

3.1.4. Niezależna substancja wzorcowa

W tym teście wykorzystuje się również substancję wzorcową, która powoduje powstanie prążka, którego intensywność umożliwia szybką ilościową ocenę antybiotyku zawartego w próbce.

W tym celu stosuje się 40 nm cząstki złota, na których umieszczono kozie przeciwciało immunoglobuliny anty-króliczej. Takie cząstki złota wytwarzane są przez firmę British Biocell (pozycja GAR40) w postaci zawiesin w 2 mM wodnym roztworze tetraboranu sodu, o pH 7,2, stabilizowanym 0,1% azydkiem sodu. Gęstość optyczna tych zawiesin przy 520 nm wynosi około 3, a stężenie białka wynosi około 6 mg/ml.

3.2. Substancje wychwytujące

3.2.1. Pierwsza substancja wychwytująca - antybiotyk wzorcowy ml roztworu zawierającego 213 mg ludzkiej g-globuliny (G4386, Sigma) i 8,6 mg chlorowodorku 2-iminotiolanu (Aldrich, 33056-6) w buforze węglanie sodu (100 mM, pH 9) inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 25°C.

Te dwa roztwory przygotowane jak opisano powyżej następnie miesza się. Odczyn uzyskanego roztworu doprowadza się do pH 7,1 przez dodanie 3 ml 500 mM NaH2PO4, a roztwór inkubuje się w temperaturze 25°C przez dwie godziny. Mieszaninę uzyskaną po inkubacji trzykrotnie dializuje się względem 1 litra buforu fosforanu sodu (10 mM, pH 7,5). Uzyskany roztwór filtruje się przez filtr 0,22 mm, po czym dzieli na równe objętości i przechowuje w postaci zamrożonej w temperaturze -20°C aż do momentu użycia.

Pierwsza substancja wychwytująca umożliwia wychwycenie substancji BlaR-CTD sprzężonego z drobinami złota znajdującymi się w nadmiarze względem ilości antybiotyku zawartego w próbce.

3.2.2. Druga substancja wychwytująca - substancja umożliwiająca związanie niezależnej substancji wzorcowej

Jako drugą substancję wychwytującą stosuje się roztwór immunoglobuliny króliczej (Sigma I 5006), o stężeniu immunoglobuliny wynoszącym 0,5 mg/ml w 10 mM fosforanu sodu, pH 7,5, i zawartości ludzkiej g-globuliny wynoszącej 5 mg/ml buforu. Ta druga substancja wychwytująca zatrzymuje niezależną substancję wzorcową podczas migracji płynu przez urządzenie testowe.

3.3. Urządzenie testowe

Stosowane są urządzenia testowe zawierające membrany 2, 3 i 4, zmontowane zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1.1. Membrana 3 tych urządzeń zawiera substancję wychwytującą opisaną w przykładzie 3.2.1. na końcu proksymalnym, a na końcu dystalnym zawiera substancję wychwytującą opisaną w przykładzie 3.2.2. Substancje wychwytujące zostały umieszczone na membranie według procedur opisanych w przykładzie 1.2.

3.4. Oznaczanie zawartości antybiotyków w mleku

3.4.1. Test 3-minutowy - szybki test

Przygotowuje się siedem próbek mleka, zawierających odpowiednio 0; 1; 2; 3; 4; 5 i 6 części na miliard penicyliny G. Każdy z tych roztworów jest następnie analizowany w następujący sposób.

Pobiera się próbkę 200 ml mleka oraz 45,27 ml roztworu przygotowanego w przykładzie 3.1.3 i umieszcza się w szklanej kolbie. Tę mieszaninę inkubuje się w temperaturze 47°C przez 1 minutę. Następnie w szklanej kolbie umieszcza się pionowo urządzenie testowe tak, aby pierwszy koniec tego urządzenia testowego stykał się z mieszaniną, a drugi koniec opierał się o ścianę szklanej kolby. Pozwala się na migrację mieszaniny przez urządzenie testowe, inkubując w tym czasie urządzenie w temperaturze 47°C przez 2 minuty.

W poniższej tabeli 3 podano wyniki uzyskane dla siedmiu badanych próbek. Wykrytym prążkom przypisano wartość intensywności od 0 do 10, przy czym wartość 10 odpowiada najintensywniejszemu prążkowi, a wartość 0 odpowiada najmniej intensywnemu prążkowi. Według tej skali, prążkowi wzorcowemu przypisano wartość 6. Intensywność sygnału obserwowanego na pierwszym prążku jest odwrotnie proporcjonalna do ilości penicyliny G znajdującej się w próbce.

PL 191 687 B1

T ab el a 3

Penicylina G (części/mld.) 0

Intensywność pierwszy prążek drugi prążek 6 6 6 6 6 6 6

W tym przykładzie wynik testu uważa się za dodatni, gdy pierwszy prążek ma intensywność niższą niż drugi prążek. Wyniki podane w tabeli 3 wskazują, że ten test umożliwia wykrycie w ciągu 3 minut obecności penicyliny G w próbce w ilości mniejszej niż 4 części na miliard.

W tych samych warunkach prowadzono również oznaczenia obecności innych antybiotyków z pierścieniem b -laktamowym. Ten test, wykonywany w ciągu 3 minut, umożliwia wykrycie w próbce mleka zawartości amoksycyliny w ilości do 5 części na miliard, ampicyliny w ilości do 5 części na miliard, kloksacyliny w ilości mniejszej niż 10 części na miliard, dikloksacyliny w ilości mniejszej niż 20 części na miliard, oksacyliny w ilości mniejszej niż 20 części na miliard i cefapiryny w ilości do 20 części na miliard.

1.3.2. Test pięciominutowy

Przygotowuje się sześć próbek mleka, zawierających odpowiednio 0; 2; 4; 6; 8 i 10 części na miliard kloksacyliny. Każdy z tych roztworów jest następnie analizowany w następujący sposób.

Pobiera się próbkę 200 ml mleka oraz 45,27 ml roztworu przygotowanego w przykładzie 3.1.3 i umieszcza się w szklanej kolbie. Tę mieszaninę inkubuje się w temperaturze 47°C przez 3 minuty. Następnie w szklanej kolbie umieszcza się pionowo urządzenie testowe tak, aby pierwszy koniec tego urządzenia testowego stykał się z mieszaniną, a drugi koniec urządzenia opierał się o ściankę szklanej kolby. Pozwala się na migrację mieszaniny przez urządzenie testowe, inkubując w tym czasie urządzenie w temperaturze 47°C przez 2 minuty.

W poniższej tabeli 4 podano wyniki uzyskane dla sześciu badanych próbek. Wykrytym prążkom przypisano wartość intensywności od 0 do 10, przy czym wartość 10 odpowiada najintensywniejszemu prążkowi, a wartość 0 odpowiada najmniej intensywnemu prążkowi. Według tej skali, prążkowi wzorcowemu przypisano wartość 6. Intensywność sygnału obserwowanego na pierwszym prążku jest odwrotnie proporcjonalna do ilości kloksacyliny znajdującej się w próbce.

T ab el a 4

Kloksacylina	Intensywność
(części/mld.)	pierwszy prążek	drugi prążek
0	10	6
2	6	6
4	5	6
6	3	6
8	3	6
10	3	6

W tym przykładzie wynik testu uważa się za dodatni, gdy pierwszy prążek ma intensywność niższą niż drugi prążek. Wyniki podane w tabeli 4 wskazują, że ten test umożliwia wykrycie w ciągu 5 minut nawet do 4 części na miliard kloksacyliny w próbce mleka.

W tych samych warunkach prowadzono również oznaczenia obecności innych antybiotyków z pierścieniem b -laktamowym. Ten test, wykonywany w ciągu 5 minut, umożliwia wykrycie w próbce mleka zawartości penicyliny G w ilości do 3 części na miliard, amoksycyliny w ilości do 4 części na miliard, ampicyliny w ilości do 4 części na miliard, dikloksacyliny w ilości do 8 części na miliard, oksacyliny w ilości do 8 części na miliard, cefapiryny w ilości do 16 części na miliard, ceftiofuru w ilości do

PL 191 687 B1

100 części na miliard, cefochinonu w ilości mniej niż 20 części na miliard, nafcyliny w ilości do 20 części na miliard i cefazoliny w ilości do 60 części na miliard.

Ten test jest szczególnie użyteczny jako test sortujący, wykonywany przed momentem, w którym mleko przywożone na ciężarówkach wprowadzone zostanie do silosów.

1.3.3. Test dziewięciominutowy

Przygotowuje się sześć próbek świeżego mleka, zawierających odpowiednio 0; 4; 6; 8; 10 i 12 części na miliard cefapiryny. Każdy z tych roztworów jest następnie analizowany w następujący sposób.

Pobiera się próbkę 200 ml mleka oraz 45,27 ml roztworu przygotowanego w przykładzie 3.1.3 i umieszcza się w szklanej kolbie. Tę mieszaninę inkubuje się w temperaturze 47°C przez 7 minut. Następnie w szklanej kolbie umieszcza się pionowo urządzenie testowe tak, aby pierwszy koniec tego urządzenia testowego stykał się z mieszaniną, a drugi koniec urządzenia opierał się o ściankę szklanej kolby. Pozwala się na migrację mieszaniny przez urządzenie testowe, inkubując w tym czasie urządzenie w temperaturze 47°C przez 2 minuty.

W poniższej tabeli 5 podano wyniki uzyskane dla sześciu badanych próbek. Wykrytym prążkom przypisano wartość intensywności od 0 do 10, przy czym wartość 10 odpowiada najintensywniejszemu prążkowi, a wartość 0 odpowiada najmniej intensywnemu prążkowi. Według tej skali, prążkowi wzorcowemu przypisano wartość 6. Intensywność sygnału obserwowanego na pierwszym prążku jest odwrotnie proporcjonalna do ilości cefapiryny znajdującej się w próbce.

T ab el a 5

Cefapiryna	Intensywność
(części/mld.)	pierwszy prążek	drugi prążek
0	10	6
4	6	6
6	5	6
8	4	6
10	3	6
12	3	6

W tym przykładzie wynik testu uważa się za dodatni, gdy pierwszy prążek ma intensywność niższą niż drugi prążek. Wyniki podane w tabeli 5 wskazują, że ten test umożliwia wykrycie w ciągu 9 minut nawet do 6 części na miliard cefapiryny w próbce mleka.

W tych samych warunkach prowadzono również oznaczenia obecności innych antybiotyków z pierścieniem b -laktamowym. Ten test, wykonywany w ciągu 9 minut, umożliwia wykrycie w próbce mleka zawartości penicyliny G w ilości do 3 części na miliard, amoksycyliny w ilości do 4 części na miliard, ampicyliny w ilości do 4 części na miliard, kloksacyliny w ilości do 4 części na miliard, dikloksacyliny w ilości do 8 części na miliard, oksacyliny w ilości do 8 części na miliard, ceftiofuru w ilości do 80 części na miliard, cefochinonu w ilości mniej niż 20 części na miliard, nafcyliny w ilości do 20 części na miliard i cefazoliny w ilości do 45 części na miliard.

Ten test, wykonywany w ciągu 9 minut, umożliwia zatem wykrycie wszystkich antybiotyków, jakie są obecnie monitorowane przez europejskie organizacje rządowe, w tak niewielkich ilościach, aby sprostać normom prawnym nakładanym przez te instytucje.

1.3.4. Test dwudziestominutowy

Przygotowuje się sześć próbek świeżego mleka, zawierających odpowiednio 0; 20; 30; 40; 50 i 60 części na miliard ceftiofuru. Każdy z tych roztworów jest następnie analizowany w następujący sposób.

Pobiera się próbkę 200 ml mleka oraz 45,27 ml roztworu przygotowanego w przykładzie 3.1.3. i umieszcza się w szklanej kolbie. Tę mieszaninę inkubuje się w temperaturze 47°C przez 18 minut. Następnie w szklanej kolbie umieszcza się pionowo urządzenie testowe tak, aby pierwszy koniec tego urządzenia testowego stykał się z mieszaniną, a drugi koniec urządzenia opierał się o ściankę szklanej kolby. Pozwala się na migrację mieszaniny przez urządzenie testowe, inkubując w tym czasie urządzenie w temperaturze 47°C przez 2 minuty.

W poniższej tabeli 6 podano wyniki uzyskane dla sześciu badanych próbek. Wykrytym prążkom przypisano wartość intensywności od 0 do 10, przy czym wartość 10 odpowiada najintensywniejszemu

PL 191 687 B1 prążkowi, a wartość 0 odpowiada najmniej intensywnemu prążkowi. Według tej skali, prążkowi wzorcowemu przypisano wartość 6. Intensywność sygnału obserwowanego na pierwszym prążku jest odwrotnie proporcjonalna do ilości ceftiofuru znajdującego się w próbce.

Tabel a 6

Ceftiofur	Intensywność
(części/mld.)	pierwszy prążek	drugi prążek
0	10	6
20	6	6
30	5	6
40	4	6
50	3	6
60	3	6

W tym przykładzie wynik testu uważa się za dodatni, gdy pierwszy prążek ma intensywność niższą niż drugi prążek. Wyniki podane w tabeli 6 wskazują, że ten test umożliwia wykrycie w ciągu 20 minut nawet do 30 części na miliard ceftiofuru w próbce mleka.

Ten dwudziestominutowy test umożliwia zatem wykrycie podczas jednego oznaczenia wszystkich antybiotyków, jakie są obecnie monitorowane przez europejskie i amerykańskie organizacje rządowe, w tak niewielkich ilościach, aby sprostać normom prawnym nakładanym przez te instytucje.

P r z y k ł a d 4. Zastosowanie urządzenia testowego umieszczonego w tworzywowym pudełku.

Stosowane jest urządzenie testowe, opisane w przykładzie 1.6. W tym przypadku, kontakt próbki z urządzeniem następuje w wyniku umieszczenia inkubowanej mieszaniny w otworze o kształcie wanienki, specjalnie w tym celu zaprojektowanym.

Claims

1. Urządzenie testowe do oznaczania zawartości analitów w płynnych produktach nabiałowych, mające stałą podstawę (1) mającą koniec pierwszy i drugi, przy czym na tej podstawie są zamocowane następujące membrany, począwszy od pierwszego końca, membrana (2) do oczyszczania analizowanego płynu, membrana (3) do unieruchomiania co najmniej jednej substancji wychwytującej, wykonana z nitrocelulozy, oraz membrana absorpcyjna (4) wykonana z celulozy, znamienne tym, że membrana (2) jest wykonana z nietkanych włókien poliestrowych.

2. Urządzenie testowe według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera dodatkowo membranę (5), na której jest umieszczony co najmniej jeden odczynnik wykrywający, przy czym ta membrana (5) jest usytuowana przed membraną (3).

3. Urządzenie testowe według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że membrany są całkowicie lub częściowo pokryte adhezyjną tworzywową folią (6).

4. Urządzenie testowe według zastrz. 3, znamienne tym, że tworzywowa folia (6) nie pokrywa pierwszych kilku milimetrów urządzenia testowego.

5. Urządzenie testowe według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że jest umieszczone w tworzywowym pudełku, mającym otwór w kształcie wanienki powyżej membrany (2), oraz otwór stanowiący okienko powyżej membrany (3).