PL191777B1 - Izolowany kwas nukleinowy, rekombinowany konstrukt DNA, wektor, plazmid, komórka bakterii, rekombinowany genom rośliny, komórki roślinne, roślina, nasiona transgeniczne, sposób otrzymywania roślin, sposób zabezpieczania roślin, sposób izolowania kwasu nukleinowego, sposób identyfikacji kwasu nukleinowego, kombinacja primerów, zestaw diagnostyczny, sposób detekcji, polipeptyd i RNA - Google Patents

Abstract

1. Izolowany kwas nukleinowy, którego sekwencja jest sekwencja DNA przedstawiona na fig. 5 lub jego czesc albo sekwencja DNA homologiczna do sekwencji DNA z fig. 5, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest zdolny, po przeniesieniu do rosliny gospodarza podatnej na patogen roslinny do uczynienia tej rosliny gospodarza odporna na patogen rosliny. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowany kwas nukleinowy, rekombinowany konstrukt DNA, wektor, plazmid, komórka bakterii, rekombinowany genom rośliny, komórki roślinne, roślina, nasiona transgeniczne, sposób otrzymywania roślin, sposób zabezpieczania roślin, sposób izolowania kwasu nukleinowego, sposób identyfikacji kwasu nukleinowego, kombinacja primerów, zestaw diagnostyczny, sposób detekcji, polipeptyd i RNA.

W szczegółach, niniejszy wynalazek dotyczy genów odpornościowych, konstrukcji DNA, drobnoustrojów, komórek roślinnych i roślin, zawierających wymienione geny odporności.

Ponadto, wynalazek dotyczy genetycznie transformowanych roślin, które są odporne na nicienie i/lub mszyce.

Oprócz tego, wynalazek dotyczy sond i primerów do identyfikacji genów odporności oraz zestawów diagnostycznych, obejmujących wymienione geny odporności.

Wreszcie, wynalazek dotyczy polipeptydów, kodowanych przez wymienione geny oraz zastosowanie wymienionych polipeptydów.

Patogeny roślinne są odpowiedzialne za znaczne straty roślin i produktów roślinnych w związku z zakażeniem rośliny. Choroby roślin, jako wynik zakażenia przez patogeny lub szkodniki, powodują zniszczenie roślin i/lub produktów roślinnych, zmniejszają produkcję i wydajność, ograniczają rodzaj roślin, jakie można hodować w pewnych obszarach geograficznych oraz w rezultacie powodują poważne (finansowe) straty dla hodowców.

Pasożyty roślinne nicienie, występują na całym świecie, a większość z nich przebywa przez większość swego życia w wierzchniej warstwie gleby. Mimo, że straty powodowane przez bezpośrednie żerowanie nicieni na korzeniach roślin wydają się mniej ważne, kilka gatunków, a wśród nich nicienie węzłów korzeniowych, należące do rodzaju Meloidogyne, nicienie cystowe, należące do rodzaju Heterodera i rodzaju Globodera oraz inne nicienie, takie jak rodzaj Nacobbus, powodują poważne zniszczenia i ekonomiczne straty w plonach. Nicienie węzłów korzeniowych występują także na całym świecie lecz znajduje się je częściej i w większych ilościach na obszarach o cieplejszym klimacie oraz w szklarniach. Najważniejszymi gatunkami Meloidogyne są M . incognita, M . arenaria, M . hapla i M . javanica, z których M. hapla występuje także w bardziej umiarkowanych strefach klimatycznych.

Istnieją różne sposoby kontrolowania patogenów roślinnych, takie jak mechaniczna uprawa gleby, traktowanie chemiczne pestycydami, łącznie ze środkami nicieniobójczymi oraz insektycydami. Jednakże dla pewnych patogenów roślinnych, te sposoby kontroli są niewystarczające aby zabezpieczyć rośliny przed zakażeniem i wynikłymi chorobami. Jedynie skutecznym sposobem kontroli jest odporność gospodarza roślinnego (Russell, 1978, Plant Breeding for pests and disease resistance, Butterworths wydawca, strona 485). Wykorzystanie odmian odpornych na powszechne patogeny roślinne jest jednym z głównych celów dzisiejszych hodowców roślin, w celu zmniejszenia lub całkowitej eliminacji potrzeby szerokiego stosowania pestycydów. Zbyt poważne staje się zanieczyszczenie środowiska wielkimi ilościami pestycydów wprowadzonych do gleby lub rozpryskanych na roślinach, drzewach itd. na całym świecie, każdego roku. Poza tym ustawy rządowe w krajach zachodnich ograniczają stosowanie lub nawet zabraniają stosowania pewnych pestycydów. Zatem coraz bardziej pilna staje się potrzeba uzyskania roślin, które są odporne na jeden lub więcej swych patogenów lub które posiadają zmniejszoną podatność na czynniki atakujące. Wykorzystanie roślin odpornych jest jednym z ważnych celów obecnych programów hodowli roślin. Genotypy roślin wrażliwych na poszczególne patogeny krzyżuje się z genotypami roślin odpornych, w celu wprowadzenia fenotypu odpornego do linii hodowlanej.

Zniszczenie przez nicienie węzłów korzeniowych wynika przede wszystkim z inwazji do korzeni rośliny larw, które w zgodnej zależności z rośliną rozwijają się w rozmnażające się samice. Po inwazji, larwa powoduje rozrost komórki korzenia w komórkę olbrzymią, na której się żywi. Po zakażeniu na korzeniach tworzą się uszkodzenia lub zgrubienia i przeciwnie korzenie roślin stają się uszkodzone, zgrubiałe i skarłowaciałe. System korzeniowy działa więc nieprawidłowo pod względem wychwytu wody i składników odżywczych, co upośledza wzrost i rozwój rośliny. Często zniszczenie zainfekowanych roślin zwiększa się przez grzyby pasożytnicze, atakujące osłabioną tkankę korzenia. Zainfekowane rośliny wykazują mniejszy wzrost i mniejsze, blado zabarwione liście, karłowate, złej jakości owoce lub nawet brak owoców oraz w cieplejszym klimacie mają tendencję do więdnięcia (Agrios, 1988 w: Plant Pathology, Academic Press, Inc.). Zniszczenie i/lub zmniejszenie wydajności powodoPL 191 777 B1 wane przez nicienie węzłów korzeniowych jest znaczne w całej światowej produkcji rolnej. W poszczególnych miejscach straty wydajności dochodzą do 25-50% lub nawet plon może ulec zniszczeniu.

W szklarniach, nicienie węzłów korzeniowych można kontrolować przez wyjaławianie gleby parą lub odymianie gleby środkami nicieniobójczymi. W warunkach pola kontrolę można uzyskać przez stosowanie środków nicieniobójczych. Jednak stosowanie takich, w pewnych przypadkach bardzo trwałych środków chemicznych jest coraz bardziej dyskutowane, a w pewnych krajach nawet zabrania się pewnych środków nicieniobójczych.

Hodowla genotypów genetycznie odpornych jest najbardziej pewną i skuteczną drogą kontrolowania chorób węzłów korzeniowych. Donoszono, że wiele gatunków uprawnych posiada zdolność odporności wewnątrz pokrewnej plazmy zarodkowej, np. ziemniaka, bawełny, tytoniu, pszenicy, soi, pomidora, oberżyny, fasoli zwyczajnej i lucerny. Odporność hodowlaną zakłóca po pierwsze ograniczone występowanie (znanych) genów odpornościowych w dostępnej plazmie zarodkowej, po drugie, u pewnych gatunków roślin istnienie barier krzyżowania między odmianami gatunków uprawnych a gatunkami pokrewnymi niosącymi odporność, a po trzecie, testy przesiewowe pod względem odporności przeciw wrażliwości na nicienie są pracochłonne lub nie do uzyskania albo, jeśli możliwe, czasochłonne.

Zadowalające wprowadzenie genów odporności zrealizowano u pomidora. Gen odporności Mi (Meloidogyne incognita) wprowadzono do odmiany pomidora, Lycopersicon esculentum, po przekrzyżowaniu z pokrewnym dzikim gatunkiem L. peruvianum (PI 128657), przy użyciu hodowli zarodków. Gen Mi nadaje odporność wobec różnych gatunków Meloidogyne (Fassuliotis, 1991 w: Genetic Improvement of Tomato, Springer Verlag wydawca). Gen odporności Mi opisuje się jako monogeniczny gen dominujący (Gilbert i McGuire, 1956, Proc. Am. Soc. Hortic. Sci. 68, 437-442) i położony jest na chromosomie pomidora 6. Postuluje się także, aby introgresja regionu, obejmującego locus Mi wiązała się z odpornością na mszyce ziemniaczane (Macrosiphum euphorbia) (Kalshian i in., 1995, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 92, 622-625).

Rośliny wykorzystują kompleksowy mechanizm obronny przed atakiem i infekcją patogenami. Do dzisiaj nie wyjaśniono jeszcze dokładnego mechanizmu ich systemu obronnego.

Odporność na nicienie u pomidora podlega ekspresji po jego wniknięciu. Po wejściu młodej larwy do korzenia i ustalenia się jej w miejscu pokarmowym, uwalnia się reakcja hiperczuła (HR) przy głowie nicienia, która powoduje miejscową śmierć komórek gospodarza. Nicień ulega także niekorzystnemu wpływowi tej HR i obumiera (Fassuliotis, 1991, w: Genetic Improvement of Tomato, Springer Verlag wydawca). Tak czy nie, istnieje zależność genu wobec genu zwana Flor (1956, Adv. Gen. 8, 29-54) ponieważ często występuje w wypadku innych zależności roślina-patogen, gdzie odporność oparta o niezgodność HR jest nieznana.

Wyizolowanie genów roślinnych nie znając ich produktów genowych jest bardzo pracochłonne i trudne, z powodu ogromnych rozmiarów genomów gatunków roślinnych, np. wielkość genomu pomidora wynosi 1000 Mb (10⁹ par zasad jądrowego DNA), wielkość genomu kukurydzy wynosi 3000 Mb, a pszenica posiada nawet więcej niż 16 x 10⁹ par zasad. Poszukiwanie konkretnego genu wśród miliardów par zasad jest możliwe jedynie gdy (i) istnieje wystarczająca ilość markerów cząsteczkowych ściśle związanych z interesującym genem oraz (ii) dostępny jest dobry materiał genetyczny (Tanksley iin., 1995, Trends in Genetics, 11 strona 63-68).

Mimo że, donoszono o wyizolowaniu kilku genów odporności, żaden z tych genów odporności nie był zdolny do nadania roślinie gospodarza odporności na nicienie lub mszyce. Przykładami takich wyizolowanych genów odporności są: RPS2 z Arabidopsis (odporność na Pseudomonas syringae avrRpt2), N z tytoniu (odporność na wirus mozaiki tytoniowej), Cf-9 z pomidora (odporność na grzybowy patogen liści Cladosporum fulvum avr9) i L⁶ z lnu (odporność na odpowiadający rodzaj grzybowej rdzy liści) (Dang, 1995, Cell 80, 363-366).

Niniejszy wynalazek opisuje pierwszy wyizolowany gen odporności na nicienie, a ponadto także definiuje pierwszy wyizolowany gen odporności na mszyce. Dalej, niniejszy wynalazek odnosi się do podwójnej funkcji genu odporności, nadającej zmniejszoną podatność na nicienie jak również mszyce, a szczególnie, odpowiednio na Meloidogyne incognita i Macrosiphum euphorbiae.

Szczegółowo, niniejszy wynalazek dotyczy izolowanego kwasu nukleinowego, którego sekwencję stanowi sekwencję DNA przedstawioną na fig. 5 lub jego część albo sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA z fig. 5, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest zdolny do uczynienia tej rośli4

PL 191 777 B1 ny gospodarza odporną na patogen rośliny, po przeniesieniu do rośliny gospodarza podatnej na patogen roślinny.

Korzystnie cDNA odpowiada kwasowi nukleinowemu, którego sekwencja DNA jest co najmniej w części sekwencją DNA przedstawioną na fig. 5. W następnym korzystnym rozwiązaniu kwas nukleinowy według wynalazku po przeniesieniu do rośliny gospodarza jest zdolny do uczynienia tej rośliny odporną na nicienie lub ewentualnie na mszyce, lub też na nicienie i mszyce.

Korzystnie, kwas nukleinowy według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja DNA odpowiada sekwencji rozpoczynającej się przy nukleotydzie 3263 i kończącej się przy nukleotydzie 7111 sekwencji z fig. 5 lub jakiejkolwiek sekwencji DNAdo niej homologicznej.

W niniejszym wynalazku sekwencja DNA odpowiada sekwencji promotorowej leżącej w kierunku 5' przed nukleotydem 3263 lub jakiejkolwiek sekwencji homologicznej do niej.

Korzystnie wymieniona sekwencja DNA odpowiada co najmniej części genomowego insertu obecnego w kosmidzie Mi-11 lub jakiejkolwiek sekwencji DNA do niej homologicznej.

Także korzystnie, kwas nukleinowy, ma wielkość wystarczającą do selektywnej hybrydyzacji surowych w warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA według wynalazku.

W jeszcze bardziej korzystnym rozwiązaniu sekwencja DNA, z którą hybrydyzuje kwas nukleinowy według wynalazku odpowiada sekwencji, która rozpoczyna się przy nukleotydzie 6921 i kończy się przy nukleotydzie 7034.

Korzystnie, wymieniona sekwencja DNA leży przy końcu 3' sekwencji hybrydyzacji i korzystnie odpowiada sekwencji 5'-TAATCT-3', która może inicjować syntezę DNA lub ewentualnie wymieniona sekwencja DNA leży przy końcu 3' sekwencji hybrydyzacji i korzystnie odpowiada sekwencji 5'-TGCAGGA-3', która może inicjować syntezę DNA.

Przedmiotem wynalazku jest także rekombinowany konstrukt DNA, obejmujący kwas nukleinowy według wynalazku zdefiniowany powyżej.

W korzystnym rozwiązaniu wynalazku, rekombinowany konstrukt DNA znajduje się pod kontrolą promotora, który funkcjonuje w komórce roślinnej, przy czym wymieniony promotor jest albo endogenny, albo egzogenny wobec wymienionej komórki roślinnej i skutecznie kontroluje transkrypcję tej sekwencji DNAw takiej komórce roślinnej.

Bardziej korzystnie, promotor odpowiada sekwencji promotorowej leżącej w kierunku 5' przed nukleotydem 3263 jak opisano w fig. 5 lub jakiejkolwiek sekwencji DNA do niej homologicznej.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor odpowiedni do transformowania komórek roślinnych, obejmujący konstrukt DNA zawierający izolowany kwas nukleinowy, którego sekwencję stanowi sekwencja DNA przedstawiona na fig. 5lub jego część albo sekwencja DNA homologiczna do sekwencji DNA z fig. 5, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest zdolny do uczynienia tej rośliny gospodarza odporną na patogen rośliny, po przeniesieniu do rośliny gospodarza podatnej na patogen roślinny.

Przedmiotem wynalazku jest także plazmid opatrzony numerem depozytowym CBS 822.96., zawierający kwas nukleinowy, którego sekwencję stanowi sekwencja DNA przedstawiona na fig.5 lub jego część albo sekwencja DNA homologiczna do sekwencji DNA z fig. 5, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest zdolny do uczynienia tej rośliny gospodarza odporną na patogen rośliny, po przeniesieniu do rośliny gospodarza podatnej na patogen roślinny.

Przedmiotem wynalazku jest także plazmid pKGMi-18 opatrzony numerem depozytowym CBS 821.96., zawierający kwas nukleinowy którego sekwencję stanowi sekwencja DNA przedstawiona na fig. 5 lub jego część albo sekwencja DNA homologiczna do sekwencji DNA z fig. 5, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest zdolny do uczynienia tej rośliny gospodarza odporną na patogen rośliny, po przeniesieniu do rośliny gospodarza podatnej na patogen roślinny.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka bakterii, zawierająca wektor odpowiedni do transformowania komórek roślinnych, odejmujący rekombinowany konstrukt DNA obejmujący sekwencję DNA przedstawioną na fig. 5 lub jego część albo sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA zfig. 5, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest zdolny do uczynienia tej rośliny gospodarza odporną na patogen rośliny, po przeniesieniu do rośliny gospodarza podatnej na patogen roślinny.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka bakterii, zawierająca plazmid opatrzony numerem depozytowym CBS 822.96., zawierający kwas nukleinowy którego sekwencję stanowi sekwencja DNA przedstawiona na fig.5 lub jego część albo sekwencja DNA homologiczna do sekwencji DNA z fig. 5, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest zdolny do uczynienia tej rośliny gospodarza odporną na patogen rośliny, po przeniesieniu do rośliny gospodarza podatnej na patogen roślinny.

PL 191 777 B1

Przedmiotem wynalazku jest także komórka bakterii, zawierająca plazmid pKGMi-18 opatrzony numerem depozytowym CBS 821.96., zawierający kwas nukleinowy którego sekwencję stanowi sekwencja DNA przedstawiona na fig. 5 lub jego część albo sekwencja DNA homologiczna do sekwencji DNA z fig. 5, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest zdolny do uczynienia tej rośliny gospodarza odporną na patogen rośliny, po przeniesieniu do rośliny gospodarza podatnej na patogen roślinny

Przedmiotem wynalazku jest także rekombinowany genom rośliny, obejmujący włączony do niej konstrukt DNA obejmujący izolowany kwas nukleinowy, którego sekwencję stanowi sekwencja DNA przedstawiona na fig. 5 lub jego część albo sekwencja DNA homologiczna do sekwencji DNA z fig. 5, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest zdolny do uczynienia tej rośliny gospodarza odporną na patogen rośliny, po przeniesieniu do rośliny gospodarza podatnej na patogen roślinny.

Korzystnie, taki rekombinowany genom roślinny, znajduje się w środowisku komórkowym rośliny.

Przedmiotem wynalazku są także komórki roślinne, zawierające konstrukt DNA według wynalazku jak już zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również roślina, zawierająca komórki roślinne zawierające konstrukt DNA jak już zdefiniowano powyżej.

Korzystnie roślina według wynalazku posiada zmniejszoną podatność na nicienie. W bardziej korzystnym rozwiązaniu roślina uzyskuje zmniejszoną podatność na nicienie węzłów korzeniowych, zwłaszcza Meloidogyne incognita.

Również korzystnie roślina według wynalazku posiada zmniejszoną podatność na mszyce, zwłaszcza na Macrosiphum euphorbiae.

Przedmiotem wynalazku są także nasiona transgeniczne, zawierające rekombinowany konstrukt DNA według wynalazku zdefiniowany powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania roślin, mających zmniejszoną podatność na patogen, polegający tym, że:

i) wprowadza się do genomu komórki roślinnej konstrukt DNA zdefiniowanego powyżej, ii) uzyskuje się transformowane komórki roślinne, iii) regeneruje się z wymienionych komórek roślinnych genetycznie transformowane rośliny, i iv) ewentualnie, rozmnaża się wymienione rośliny.

W korzystnym wykonaniu wymieniony patogen jest nicieniem, korzystnie nicieniem węzłów korzeniowych, zwłaszcza Meloidogyne incognita.

W innym korzystnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku wymieniony patogen jest mszycą, a korzystnie Macrosiphum euphorbiae.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób zabezpieczania roślin uprawnych przed zakażeniem patogenem, który to sposób obejmuje:

i) wprowadzenie do genomu komórki roślinnej konstruktu DNA jak zdefiniowano powyżej, ii) otrzymanie transformowanych roślin; i iii) hodowlę transformowanych roślin.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób izolowania kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej, obejmujący następujące etapy:

i) skrining biblioteki genomowej lub cDNA rośliny za pomocą sekwencji DNA jak zdefiniowano powyżej, ii) identyfikację klonów pozytywnych, które hybrydyzują z wymienioną sekwencją DNA, iii) izolację wymienionych klonów pozytywnych.

Korzystnie, w sposobie tym wymieniona biblioteka pochodzi z pierwszej rośliny, a sekwencja DNA należy do drugiej rośliny.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób identyfikacji kwasu nukleinowego według wynalazku zdefiniowanego powyżej, polegający na tym, że używa się kombinacji primerów, identyfikujących co najmniej jeden z markerów AFLP PM02 do PM29, jak opisano w tabeli 3.

Korzystnie w sposobie tym, wymieniona kombinacja primerów identyfikuje marker AFLP PM14.

Przedmiotem wynalazku jest także kombinacja primerów, obejmująca pierwszy izolowany kwas nukleinowy według wynalazku zdefiniowany powyżej, w którym sekwencja DNA leży przy końcu 3' sekwencji hybrydyzacji i korzystnie odpowiada sekwencji 5'-TAATCT-3', która może inicjować syntezę DNA.

W korzystnej wersji wynalazku, kombinacja primerów zawiera drugi izolowany kwas nukleinowy, w którym wymieniona sekwencja DNA leży przy końcu 3' sekwencji hybrydyzacji i korzystnie odpowiada sekwencji 5'-TGCAGGA-3', która może inicjować syntezę DNA.

PL 191 777 B1

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw diagnostyczny obejmujący co najmniej jeden izolowany kwas nukleinowy, o wielkości wystarczającej do selektywnej hybrydyzacji z sekwencją DNA w surowych warunkach hybrydyzacji i którego sekwencją jest sekwencja DNA przedstawiona na fig. 5 lub jego część albo sekwencja DNA homologiczna do sekwencji DNA z fig. 5, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest zdolny, po przeniesieniu do rośliny gospodarza podatnej na patogen roślinny do uczynienia tej rośliny gospodarza odporną na patogen rośliny.

Korzystnie zestaw diagnostyczny zawiera kombinację primerów obejmującą izolowany kwas nukleinowy, w którym sekwencja DNA leży przy końcu 3' sekwencji hybrydyzacji i korzystnie odpowiada sekwencji 5'-TAATCT-3', która może inicjować syntezę DNA.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób detekcji obecności lub nieobecności sekwencji DNA, szczególnie w DNA rośliny przy użyciu zestawu diagnostycznego zdefiniowanego powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd, który jest produktem ekspresji kwasu nukleinowego rekombinowanego DNA jak zdefiniowano w zastrz. 1.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd, mający sekwencję aminokwasową o sekwencji przedstawionej w fig. 7A lub kodowany przez odpowiadającą homologiczną sekwencję.

Przedmiotem wynalazku jest także RNA, mający sekwencję kwasu rybonukleinowego transkryptu części lub całości sekwencji DNA izolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku.

Opis rysunków

Figura 1 ukazuje mapę fizyczną YAC 1/1172, YAC 2/1256 i YAC 1/1084, o wielkości odpowiednio 570, 500 i 470 kb. Zaznaczono pozycje miejsc restrykcji Sfil i BssHII oraz wielkość fragmentów restrykcyjnych. Zaznaczono różne markery AFLP na fragmentach restrykcyjnych.

Figura 2 ukazuje schematyczny rysunek binarnego wektora kosmidowego pJJ04541, który stosuje się do konstrukcji biblioteki kosmidowej YAC 1/546. Plazmid pRK290 (20 kb wielkości) (Ditta i in., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7247-7351) użyto jako wektor początkowy. „Tet” odnosi się do genu, nadającego odporność na tetracyklinę. „LB” oznacza lewy brzeg powtórzonej sekwencji T-DNA, a „RB” oznacza prawy brzeg powtórzenia. Sekwencję promotorową wirusa 35S mozaiki kalafiora oznaczono przez „p35S”, a „ocs3” oznacza koniec 3' syntazy oktopinowej. „NPT” oznacza fosfotransferazę neomycynową, a „cos” odnosi się do miejsca cos bakteriofaga lambda, umożliwiającego upakowanie in vitro. „pDBS oznacza polilinker pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA, USA).

Figura 3 ukazuje schematyczne przedstawienie szczegółowej pozycji markerów AFLP na YAC 1/172, YAC 2/1256 i YAC 1/1084. Określenie pozycji opiera się o przyleganie kosmidów zbudowanych dla różnych określonych regionów.

Figura 3B ukazuje schematyczne przedstawienie przylegania kosmidu do regionu, obejmującego gen odporności Mi. Kosmidy Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 i Mi-14 reprezentują linie poziome. Zaznaczono położenie markerów AFLP PM14 i PM25.

Figura 4 ukazuje fizyczną mapę kosmidów Mi-32, Mi-30, Mili, Mi-18 i Mi-14 dla enzymu restrykcyjnego Pstl. Zaznaczono wielkość fragmentów Pstl (w kb). Fenotyp Mi, jako określony w teście choroby in vitro roślin R0, zawierających różne kosmidy, zaznaczono w prawej końcowej części rysunku. Segment DNA, którego określono sekwencję nukleotydową, zaznaczono przez podwójną linię ze strzałką w dwóch kierunkach.

Figura 5 ukazuje sekwencję nukleotydową segmentu DNA, w przybliżeniu 9,9 kb obok markera AFLP PM14, oraz wnioskowaną sekwencję aminokwasową genu odporności Mi. Kodon inicjujący ATG pozycja 3263-6265) podkreślono, a kodon terminacji (TAG pozycja 7109-7111) podkreślono podwójnie, ukazując otwartą ramkę odczytu (ORF1), kodującą polipeptyd o 1257 aminokwasach (fig. 7A). Gen odporności Mi obejmuje dwie sekwencje intronowe (ukazane drukiem pochyłym): jeden intron o1306 nukleotydach od pozycji 1936 do pozycji 3241 i jeden intron o 75 nukleotydach od pozycji 3305 do pozycji 3379. Drugi kodon inicjujący (ATG pozycja 3491-3493), który jest w ramce z pierwszym kodonem inicjującym, daje drugą otwartą ramkę odczytu (ORF2), kodującą skrócony polipeptyd o1206 aminokwasach (fig. 7B). Pozycja markera AFLP PM14 znajduje się od pozycji nukleotydu 6921 (5'-TGCAGGA-3') do pozycji nukleotydu 7034 (5'-AGATTA-3').

Figura 6 ukazuje mapę fizyczną kosmidów Mi-11 i Mi-18 oraz określoną sekwencję nukleotydową kosmidu Mi-11. Sekwencję podzielono na cztery części przylegania: con25 (5618 bp), con10 (898 kb), con62 (2495 bp) i Mi (9870 bp). Niższa część rysunku opisuje obecność („+”) lub brak („-”) kilku fragmentów PGR, odpowiadających częściom segmentu DNA z fig. 5, który przedstawiono jako linie poziome o różnej długości po prawej stronie tabeli, w różnych tłach genetycznych (klon YAC 2/1256, kosmidu Mi-11, zawierającego E. coli, kosmidu Mi11, zawierającego A. tumefaciens, kosmidu Mi-18,

PL 191 777 B1 zawierającego E. coli, kosmidu Mi-18, zawierającego A. tumefaciens, odporną linię pomidora E22, podatną linię pomidora 52201, rośliny R0 transformowane kosmidem Mi-11 i rośliny R0 transformowane kosmidem Mi-18).

Sekwencja nukleotydowa kosmidu Mi-11 i kosmidu Mi-18

Analiza różnych części przylegania

Figura 7A ukazuje wnioskowaną sekwencję aminokwasową polipeptydu kodowanego przez ORF1.

Figura 7B ukazuje wnioskowaną sekwencję aminokwasową skróconego polipeptydu kodowanego przez ORF2.

Figura 8 opisuje schemat struktury genu odporności Mi.

Figura 9 opisuje schemat rodziny genu odporności Mi.

Definicje

- kwas nukleinowy: cząsteczka DNA o podwójnej nici. Kwas nukleinowy może być genomowym DNA, cDNA, syntetycznym DNA lub każdym innym DNA.

- oligonukleotyd: krótka cząsteczka DNA o pojedynczej nici;

- primery: ogólnie, określenie primer odnosi się do cząsteczki DNA o pojedynczej nici, która może początkować syntezę DNA;

- hybrydyzacja kwasu nukleinowego: metoda detekcji spokrewnionych sekwencji DNA przez hybrydyzację DNA o pojedynczej nici na podłożach, takich jak błona nylonowa lub nitrocelulozowy papier filtrowy. Cząsteczki kwasu nukleinowego, które posiadają komplementarną sekwencję zasad, będą tworzyć strukturę o podwójnej nici jeśli zmiesza się je w roztworze w odpowiednich warunkach. Struktura o podwójnej nici utworzy się między dwoma komplementarnymi pojedynczymi łańcuchami kwasu nukleinowego, nawet jeśli jeden unieruchomi się na podłożu. W procedurze hybrydyzacji Southern ma miejsce ta ostatnia sytuacja;

- sonda hybrydyzacji: aby wykryć poszczególną sekwencję DNA w procedurze hybrydyzacji Southern, znakowaną cząsteczkę DNA lub sondę hybrydyzacji poddaje się reakcji z frakcjonowanym DNA związanym z podłożem, takim jak błona nylonowa lub nitrocelulozowy papier filtrowy. Obszary na filtrze, które niosą sekwencje DNA komplementarne do znakowanej sondy DNA stają się same oznakowane w konsekwencji reakcji ponownego annealingu. Obszary filtra, które wykazują takie znakowanie można następnie wykrywać zgodnie z rodzajem użytego znacznika. Sondę hybrydyzacji wytwarza się generalnie przez kloning molekularny specyficznej sekwencji DNA lub przez syntezę syntetycznego oligonukleotydu;

- sekwencja homologiczna: sekwencja, która posiada co najmniej 50%, korzystnie 60%, korzystniej 70%, najkorzystniej 80% lub nawet 90% identyczności sekwencji z poszczególną sekwencją, przez co długość sekwencji dla kwasów nukleinowych, którą można porównać, wynosi generalnie co najmniej 120 nukleotydów, korzystnie 200 nukleotydów, a najkorzystniej 300 nukleotydów, a długość sekwencji porównywanych dla polipeptydów wynosi generalnie co najmniej 40 reszt aminokwasowych, korzystnie 65 reszt aminokwasowych i najkorzystniej 100 reszt aminokwasowych. Alternatywnie, sekwencja homologiczna odnosi się do sekwencji, która może hybrydyzować w surowych warunkach z poszczególną sekwencją i/lub sekwencji DNA, kodującej polipeptyd, który posiada zasadniczo takie same właściwości jak polipeptyd kodowany przez poszczególną sekwencję DNA, i/lub sekwencji aminokwasowej, w której niektóre reszty aminokwasowe zamieniono ze względu na sekwencję aminokwasową poszczególnego polipeptydu, bez zasadniczego wpływu na główne właściwości wymienionego polipeptydu;

- surowe warunki odnoszą się do warunków hybrydyzacji, które pozwalają na hybrydyzację sekwencji kwasu nukleinowego z poszczególną sekwencją. Ogólnie, warunki wysokiej surowości odnoszą się do warunków hybrydyzacji, które pozwalają na hybrydyzację sekwencji kwasu nukleinowego o co najmniej 50 nukleotydach, a korzystnie około 200 lub więcej nukleotydach, z poszczególną sekwencją, w temperaturze około 65°C w roztworze, zawierającym około 1M sól, korzystnie 6 x SSC lub każdy inny roztwór, posiadający porównywalną siłę jonową oraz przemycia w temperaturze 65°C w roztworze, zawierającym około 0,1M sól lub mniej, korzystnie 0,2 x SSC lub każdy inny roztwór, posiadający porównywalną siłę jonową. Warunki te pozwalają na detekcję sekwencji, posiadających około 90% lub więcej identyczności sekwencji. Ogólnie, warunki mniej surowe odnoszą się do warunków hybrydyzacji, które pozwalają na hybrydyzację sekwencji kwasu nukleinowego o co najmniej 50 nukleotydach, a korzystnie około 200 lub więcej nukleotydach, z poszczególną sekwencją, w temperaturze około 45°C w roztworze, zawierającym około 1M sól, korzystnie 6 x SSC lub każdy inny

PL 191 777 B1 roztwór, posiadający porównywalną siłę jonową oraz przemycia w temperaturze pokojowej w roztworze, zawierającym około 1M sól, korzystnie 6 x SSC lub każdy inny roztwór, posiadający porównywalną siłę jonową. Warunki te pozwalają na detekcję sekwencji, mających do 50% identyczności sekwencji. Fachowiec będzie w stanie modyfikować te warunki hybrydyzacji w celu identyfikacji sekwencji o identyczności zmieniającej się między 50% i 90%;

- promotor: region regulacji transkrypcji w górę od sekwencji kodującej, zawierający sekwencje regulatorowe wymagane do transkrypcji sąsiedniej sekwencji kodującej i obejmuje region 5' nie podlegający translacji lub tak zwaną sekwencję liderową mRNA;

- terminator: region w dół od sekwencji kodującej, który kieruje terminacją transkrypcji, także zwany regionem 3' nie podlegającym translacji, który obejmuje sygnał poliadenylacji;

-gen odporności: kwas nukleinowy, zawierający sekwencję kodującą jak opisano na fig. 5lub jej część albo każdą sekwencję odpowiadającą lub homologiczną;

- nicień(nie): rodzaj Meloidogyne, taki jak Meloidogyne incognita, M. arenaria lub M. javanica albo każdy inny genotyp, który nie jest zdolny do zakażenia gospodarza, mającego gen odporności według wynalazku, tak jak, bez ograniczenia, inne nicienie węzłów korzeniowych, tak jak M. hapla, nicienie cystowe, tak jak rodzaj Heterodera lub rodzaj Globodera, albo inne nicienie, takie jak rodzaj Nacobbus, owady, takie jak mszyce ziemniaczane lub inne patogeny lub szkodniki roślinne;

- produkt genu odporności: polipeptyd, mający sekwencję aminokwasową jaka opisano na fig. 5 lub jej część albo każda homologiczna sekwencja aminokwasowa;

- roślina R0: pierwotna roślina regenerowana z doświadczenia transformacji, oznaczana także jako roślina transformowana lub roślina transgeniczna;

- linia R1: potomstwo samopowielonej rośliny R0;

- linia R2: potomstwo samopowielonej rośliny R1;

- linia R1BC: potomstwo krzyżówki wstecznej między rośliną R1 i rośliną o genotypie, który użyto początkowo do doświadczenia transformacji.

W niniejszym wynalazku zdołaliśmy zidentyfikować i wyizolować gen odporności Meloidogyne incognita (Mi). Gen klonowano z genotypu pomidora, który jest odporny na Meloidogyne incognita. Wyizolowany gen odporności Mi według wynalazku można przenieść do podatnej rośliny gospodarza, przy użyciu transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium lub każdą inną znaną metodą transformacji i wiąże się on z nadaniem roślinie gospodarzowi odporności przeciw patogenom roślinnym, zwłaszcza nicieniom. Rośliną gospodarzem może być pomidor lub każdy inny genotyp, zakażony wymienionym patogenem roślinnym.

Niniejszy wynalazek przewiduje także sekwencje kwasu nukleinowego, obejmującą gen odporności Mi, który opisano na fig. 5.

Gen odporności Mi według wynalazku daje skuteczny środek do kontroli patogenów roślinnych i/lub szkodników, ponieważ gen można stosować do transformowania podatnych genotypów roślin, wytwarzając przez to genetycznie transformowane rośliny, mające mniejszą podatność lub będące korzystnie odporne na patogeny roślinne lub szkodniki. W szczególności, roślina, którą genetycznie transformowano genem odporności Mi według wynalazku, posiada zmniejszoną podatność na nicienie węzłów korzeniowych.

W zalecanej postaci realizacji gen odporności Mi obejmuje sekwencję kodującą przedstawioną na fig. 5 lub każdą odpowiadającą lub homologiczną sekwencję lub sekwencję cDNA, poprzedzoną przez region promotora i zakończoną regionem terminatora. Region promotora powinien funkcjonować w komórkach roślinnych i korzystnie odpowiadać natywnemu regionowi promotora genu odporności Mi. Jednak powinno się poznać, że można stosować każdy heterologiczny region promotorowy w połączeniu z sekwencjami kodującymi tak długo, jak funkcjonuje on w komórkach roślinnych.

Korzystnie, stosuje się promotor konstytucyjny, taki jak promotor CaMV 35 S lub promotory T-DNA, wszystkie dobrze znane fachowcom. Ponadto, odpowiedni region terminatorowy powinien działać w komórkach roślinnych, wszystkie dobrze znane fachowcom.

Oprócz tego, wynalazek odnosi się do produktu genu odporności Mi, kodowanego przez gen odporności Mi według wynalazku i który posiada wnioskowaną sekwencję aminokwasową przedstawioną ma fig. 5 i fig. 7Alub która jest homologiczna do wnioskowanej sekwencji aminokwasowej lub jej części. Ponadto, produkt genu odporności Mi lub skrócony polipeptyd jaki przedstawiono na fig. 7B, można stosować do wzbudzania przeciwciał przeciw niemu, które to przeciwciała można stosować do detekcji obecności produktu genu odporności Mi.

PL 191 777 B1

W innym aspekcie wynalazku gen odporności Mi można stosować do planowania oligonukleotydów, które są komplementarne z jednym łańcuchem sekwencji DNA, jaką opisano na fig. 5 lub jej częścią, które można stosować jako sondy hybrydyzacji, odpowiednio oznakowane, aby pozwolić na detekcję, w celu skriningu bibliotek DNA genomowego lub cDNA pod względem genów homologicznych. Sekwencje homologiczne, które mogą hybrydyzować z sondą w surowych warunkach hybrydyzacji i które kodują produkt genowy, związany z nadawaniem mniejszej podatności lub odporności roślinie wobec patogenów roślinnych, które normalnie zakażają wymienione rośliny, wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.

W innym aspekcie wynalazku planuje się oligonukleotydy na podstawie sekwencji genu odporności Mi, tak, że można je stosować jako sondy hybrydyzacji w analizie Southern. Sondy te można stosować jako markery molekularne do odróżniania genotypów roślin, posiadających gen odporności i genotypów roślin bez genu odporności. Taką sondę można stosować jako dodatkowe narzędzie w selekcji. W zalecanej postaci realizacji wynalazku, planuje się oligonukleotydy na podstawie sekwencji genu odporności Mi, tak, że można je stosować jako primery w reakcji powielenia, takiej jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PGR), przez którą tworzenie się produktu powielenia wskazuje na obecność genu odporności Mi w pewnym genotypie roślinnym. W szczególnej postaci realizacji wynalazku, wymienione primery kierują powieleniem fragmentów polimorficznych, tak zwanych markerów molekularnych, które są ściśle połączone z genem odporności Mi. W zalecanej postaci realizacji, wymienione primery stosuje się w selektywnym powieleniu fragmentu restrykcyjnego w celu identyfikacji markerów AFLP, które są ściśle połączone z genem odporności Mi. Wynalazek odnosi się także do zestawów diagnostycznych, obejmujących oligonukleotydy według wynalazku, do detekcji obecności lub braku obecności genu odporności Mi w badanym genotypie. Taki zestaw diagnostyczny zastąpić może stosowanie pracochłonnego testu chorobowego do skriningu pod względem genotypów, mających gen odporności lub nie.

Ponadto wynalazek dotyczy konstrukcji DNA, zawierających sekwencję DNA, kodującą gen odporności Mi i sekwencje regulatorowe funkcjonalne w komórkach roślinnych, przy czym wymieniona sekwencja DNA może być DNA genomowym, cDNA, syntetycznym DNA lub DNA każdego innego pochodzenia. Wymienione sekwencje regulatorowe są albo homologiczne, albo heterologiczne z sekwencjami kodującymi gen odporności Mi. Korzystnie wymieniona konstrukcja DNA obejmuje kwas nukleinowy, którego sekwencję przedstawiono w fig. 5 lub jego część.

Wynalazek dotyczy także konstrukcji DNA, zawierających sekwencje regulatorowe, a korzystnie region promotora genu odporności Mi w połączeniu ze strukturalną sekwencją genu heterologiczną z wymienionymi sekwencjami regulatorowymi.

Wynalazek dotyczy także wektora DNA, zawierającego konstrukcje DNA według wynalazku. Odpowiednimi wektorami mogą być wektory kloningowe, wektory transformacji, wektory ekspresji, itd., które są dobrze znane fachowcom.

Ponadto, komórki obejmujące wektor, zawierający sekwencję DNA, odpowiadającą sekwencji, jaką opisano w fig. 5 lub jej części albo homologiczną do niej, wchodzą w zakres wynalazku.

W jednej zalecanej postaci realizacji wynalazku, genetycznie transformowaną roślinę otrzymuje się przez wprowadzenie genu odporności Mi do genomu wymienionej rośliny, będącej podatną na nicienie, przy użyciu standardowych technik transformacji, gdzie wymieniona genetycznie transformowana roślina jest odporna na nicienie.

W innej postaci realizacji wynalazku gen odporności Mi można przenosić, przy użyciu ogólnie znanych technik transformacji, do układów heterologicznych, takich jak nie ograniczając, melon, tytoń, Arabidopsis thaliana, ziemniak, burak cukrowy, rzepa, ogórek, pieprz, oberżyna. Układ heterologiczny odnosi się do gatunku rośliny, który jest inny niż gatunek rośliny, z którego wyizolowano gen odporności.

W jeszcze innej postaci realizacji wynalazku, gen odporności Mi odpowiada genowi odporności Macrosiphum euphorbiae (Meu-1) i wiąże się z nadawaniem roślinom transformowanym genem według wynalazku odporności na owady, a zwłaszcza mszyce.

Sekwencja DNA, zawierająca gen odporności Mi, jaką przedstawiono w niniejszym wynalazku, posiada liczne zastosowania, z których niektóre opisano w niniejszym, lecz które nie ograniczają zakresu wynalazku.

Niniejszy wynalazek zostanie dalej opisany szczegółowo pod względem izolacji genu odporności Mi obecnego w liniach pomidora, które są odporne na nicienie węzłów korzeniowych. W celu izolacji genu odporności Mi, użyliśmy strategii kloningu na podstawie mapy (kloning pozycyjny), obejmującej następujące etapy:

PL 191 777 B1 (1) identyfikacja markerów molekularnych połączonych z genem odporności Mi, (2) konstrukcja genomowej biblioteki YAC o wysokim ciężarze cząsteczkowym, (3) fizyczne mapowanie markerów molekularnych na klonach YAC oraz budowanie części przylegania YAC, (4) konstrukcja biblioteki kosmidowej klonów YAC, obejmujących przyłączone markery molekularne, (5) dokładne mapowanie fizyczne i budowanie kosmidowych części przylegania, (6) transformacja podatnych roślin kosmidami, tworzącymi części przylegania, (7) analiza komplementacji.

W celu identyfikacji markerów molekularnych, użyliśmy technologii selektywnego powielenia _™ fragmentu restrykcji, oznaczanej także w niniejszym jako technologia AFLP^™, która w sposób losowy powiela podzbiór fragmentów DNA na zewnątrz kompleksowej mieszaniny wielu fragmentów DNA i wymienione powielone fragmenty tworzą linie papilarne, które można analizować. Ogólnie, całość DNA różnych genotypów tego samego gatunku rośliny poddaje się technologii AFLP i porównuje się różne linie papilarne AFLP uzyskane od różnych genotypów. Fragmenty, które są obecne w jednym genotypie i nieobecne w innym genotypie są fragmentami polimorficznymi i oznacza się je jako markery AFLP. Selektywność reakcji AFLP uzyskuje się przez użycie losowo wybranych selektywnych nukleotydów przy końcu 3' primerów PGR bezpośrednio sąsiadujących z nukleotydami miejsca enzymu restrykcyjnego. W skriningu AFLP badany DNA poddaje się różnym kombinacjom primerów. Całkowitą ilość różnych primerów, które można stosować, można określić przez liczbę selektywnych nukleotydów, które dodano do końca 3' (4 primery z 1 nukleotydem selektywnym, 16 primerów z 2 nukleotydami selektywnymi, 64 primery z 3 nukleotydami selektywnymi). Jeśli stosuje się dwa różne enzymy restrykcyjne, wtedy jest dwukrotna ilość primerów. Primery te można stosować w różnych kombinacjach. Jeśli stosuje się wszystkie możliwe kombinacje, wtedy wszystkie obecne fragmenty powinny zostać powielone za pomocą jednej z kombinacji primerów (Zabeau i Vos, EP 0534858).

W celu identyfikacji markerów AFLP przyłączonych do genu odporności Mi, różne linie pomidora poddano skriningowi AFLP. W pierwszym etapie analizowano dwa zbiory prawie izogenicznych linii pod względem odporności na nicienie, przeciw podatności, przez linie papilarne AFLP, przy użyciu następujących primerów:

Primery Pstl: 5'-GACTGCGTACATGCAGNN-3'

Primery Msel: 5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3'

N wskazują zmienne selektywne nukleotydy. W skriningu AFLP wszystkie 16 primerów możliwych dla primera Pstl i wszystkie 64 primery możliwe dla primera Msel użyto do dwóch zbiorów prawie izogenicznych linii, dając całość 16 x 641024 testowanych kombinacji primerów. Po analizie wszystkich linii papilarnych AFLP zidentyfikowano całość 30 prawdopodobnych markerów AFLP przyłączonych do genu odporności Mi. Te prawdopodobne markery testowano później na zespole linii pomidora odpornych na nicienie oraz podatnych na nicienie, w celu potwierdzenia i odległości przyłączenia do locus Mi. Gen odporności Mi wprowadzono do odmiany pomidora w 1944 z Lycopersicon peruvianum. Nowoczesne linie pomidorów odpornych na nicienie poddano licznym cyklom krzyżowania dającym jak się spodziewano wprowadzenie małego regionu z Lycopersicum peruvianum z genem odporności Mi. Testowanie kandydatów na markery AFLP na tych nowoczesnych genotypach pomidora będzie dobrym testem, jak się oczekuje, do szacowania ścisłego połączenia z locus Mi. Zbiór 7 odpornych i 11 podatnych genotypów pomidora testowano z kandydatami na markery AFLP. Wszystkie 20 markery AFLP okazały się obecne we wszystkich liniach odpornych i nieobecne we wszystkich liniach podatnych i przytacza się je jako markery AFLP połączone z Mi.

Następnie, cztery markery AFLP poddano skriningowi na bibliotece genomowej o wysokim ciężarze cząsteczkowym. Kloning bardzo dużych segmentów DNA jako wielkich sztucznych chromosomów w drożdżach stał się zasadniczym etapem w izolacji genów poprzez kloning pozycyjny. Zdolność kloningowa wektora YAC pozwala na izolację fragmentów DNA do jednego miliona par zasad długości. Jako źródła DNA do konstrukcji biblioteki YAC użyto linii pomidora Lycopersicum esculentum E22, homozygotycznej pod względem locus Mi. Otrzymaliśmy bibliotekę YAC, zawierającą 3840 klonów o średniej wielkości insertów wynoszącej 520 kb, reprezentującą w przybliżeniu 2,2 równoważniki genomowe genomu pomidora. Trzy dodatnie klony YAC uzyskano po skriningu AFLP za pomocą markerów AFLP przyłączonych do Mi: 1/1084, 1/1172 i 2/1256. Następnie, określono obecność wszystkich markerów AFLP przyłączonych do Mi w klonach 3 YAC. Jak się okazało, wszystkie markery były obecne w jednym lub więcej klonach 3 YAC, co pozwoliło na pierwsze pozycjonowanie różnych marPL 191 777 B1 kerów AFLP przyłączonych do Mi. Dane AFLP pokazały, że klony 3 YAC stanowiły nakładającą się część przylegania o około 1,4 Mb (patrz fig. 1).

Aby określić fizyczną wielkość locus Mi, obejmującego markery AFLP połączone z Mi i zawartego w klonach YAC 1/1084, 1/1172 i 2/1256, skonstruowano mapę restrykcyjną o długim zakresie części przylegania YAC. Określało to segment DNA, obejmujący locus Mi o około 700 kb, na którym leżały wszystkie markery AFLP połączone z Mi (patrz fig. 1).

Wielkość 700 kb jest wciąż zbyt duża do bezpośredniej lokalizacji genu odporności Mi. Takich wielkich insertów nie można transformować bezpośrednio do komórek roślinnych. Dlatego skonstruowano bibliotekę kosmidową szczepu drożdży, zawierającą YAC 1/1172 oraz skonstruowano bibliotekę kosmidową szczepu drożdży, zawierającą YAC 2/1256, przy użyciu wektorów kosmidowych, odpowiednich do transformacji za pośrednictwem Agrobacterium. Wielkość tego binarnego wektora kosmidowego wynosi 29 kb i ukazano go schematycznie na fig. 2. Zdolność kloningowa tego binarnego wektora kosmidowego, przy użyciu ekstraktu pakującego faga lambda, wynosi 9 do 24 kb. Otrzymano dwa banki o około 250000 klonów kosmidowych z drożdżowego DNA frakcjonowanego pod względem wielkości. Banki kosmidowe poddano skriningowi przez hybrydyzację kolonii przy użyciu znakowanych fragmentów restrykcyjnych YAC, jako sond. Zidentyfikowano dodatnie klony kosmidowe i dodatkowo zgrupowano kosmidy w siedem określonych regionów, pokrywających region Mi.

W następnym etapie określono linie papilarne zbioru kosmidów z siedmiu określonych regionów, przy użyciu powielenia fragmentów restrykcyjnych, w celu determinacji ich wzajemnego uporządkowania. Można było skonstruować część przylegania kosmidu, pokrywającą segment DNA o około 700 kb. Następnie określono obecność markerów AFLP połączonych z Mi w tej części przylegania kosmidu. Uzyskano mapę fizyczną segmentu DNA, obejmującego gen odporności Mi z pozycjami różnych markerów AFLP połączonych z Mi (patrz fig. 3).

Wszystkie 96 nakładających się kosmidów razem stanowiło segment DNA, obejmujący gen odporności Mi. Analiza komplementacji w celu identyfikacji genu odporności Mi za pomocą tak dużego zbioru kosmidów jest zadaniem bardzo pracochłonnym. Dlatego, pozycję genu odporności Mi na części przylegania kosmidu określono przy użyciu zmutowanej linii pomidora. Te zmutowane linie są członkami rodziny, pochodzącej od zwyczajnego przodka i zawierają genotyp Mi dzikiego typu (odporny na nicienie), lecz zmutowany fenotyp podatny na nicienie. Po analizie zbiorem markerów AFLP połączonych z Mi na wielkiej liczbie tych zmutowanych linii, trzy markery AFLP połączone z Mi okazały się być nieobecne w większości mutantów. Te markery AFLP wykazały zatem dobrą korelację między genotypem AFLP Mi i genotypem Mi, w przeciwieństwie do wszystkich innych 17 markerów AFLP. Dwa z tych markerów AFLP, PM14 i PM25 były sąsiadujące, a region wokół tych markerów przypuszczalnie był najbardziej prawdopodobna pozycją dla genu odporności Mi. Wybrano zbiór 6 nakładających się kosmidów, określających segment DNA o około 50 kb wokół markerów AFLP PM14 i PM25, do analizy komplementacji (patrz fig. 4).

Ostatnim etapem identyfikacji genu odporności Mi poprzez kloning pozycyjny jest komplementacja odpowiadającego genotypu podatności. 6 kosmidów z kandydującego regionu Mi wprowadzono do Agrobacterium tumefaciens przez transfer sprzęgający w kojarzeniu trójrodzicielskim. Określono obecność kosmidu w szczepie A. tumefaciens, porównując szczepy ze szczepami E. coli, zawierającymi kosmid. Tylko te hodowle A. tumefaciens, które obejmowały kosmid z takim samym wzorem DNA jak odpowiadająca hodowla E. coli, użyto do transformacji podatnej linii pomidora. Podatną linię pomidora transformowano kosmidami Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 i Mi-14 przy użyciu standardowych metod transformacji.

Korzenie roślin R0 transformowanych in vitro testowano pod względem objawów choroby, w celu identyfikacji kosmidów z genem odporności. Korzenie roślin przeniesiono na ustaloną pożywkę w płytkach Petriego i zaszczepiono za pomocą dziesięciu zgrubień z jałowej hodowli nicieni węzłów korzeniowych Meloidogyne incognita. Objawy choroby ocenia się sześć tygodni po zaszczepieniu. Roślinę transgeniczną uważa się za odporną, gdy na hodowli jej korzeni nie są widoczne lub widoczne jest jedno zgrubienie. Roślinę transgeniczną uważa się za podatną, gdy na hodowli jej korzeni indukowano co najmniej dwa zgrubienia. Obserwacje testu choroby in vitro ujawniły, że 2 kosmidy były zdolne do komplementacji genotypu podatnego. Obecność markera AFLP PM14 w odpornych roślinach R0 wskazywały, że insert genomowy obecny w kosmidach Mi-11 i Mi-18 jest obecny także wroślinach R0 i wiąże się z nadawaniem roślinom R0 odporności na nicienie Meloidogyne incognita.

Pierwotne rośliny regenerowane (rośliny R0) doświadczeń transformacyjnych hodowano w szklarniach na zbiór nasion, z których otrzymano linie R1, które testowano pod względem objawów

PL 191 777 B1 chorobowych. Test choroby przeprowadza się na siewkach. W tym celu, posiewa się nasiona lub małe ukorzenione roślinki przenosi się do gleby zakażonej Meloidogyne incognita i ocenia objawy choroby po 4 do 8 tygodniach po zaszczepieniu. Rośliny uważa się za odporne, gdy na korzeniach widać trzy lub mniej zgrubień. Rośliny uważa się za podatne, gdy na korzeniach tworzy się więcej niż trzy zgrubienia. Obserwacje testu choroby in vivo ujawniły, że odporne rośliny R0 odpowiadają transformatom kosmidu Mi-11.

W celu potwierdzenia stabilnej integracji genu odporności Mi z genomem roślin transgenicznych R0, odporne rośliny linii R2 poddano samopowieleniu i hodowano w szklarni na nasiona, z których otrzymano linie R2. Siewki linii R2 poddano testowi choroby nicieniowej in vivo. Otrzymane wyniki wskazywały na stabilne odziedziczenie genu odporności Mi.

Wreszcie, scharakteryzowano dodatkowo inserty w kosmidach Mi-11 i Mi-18. Analiza sekwencji ujawniła wielką otwartą ramkę odczytu (ORF2) o 3621 nukleotydach. Sekwencje DNA wymieniono na fig. 5.

Sekwencję DNA, zawierającą gen odporności Mi poddano dalej badaniom mapowania transkryptowego w celu określenia istnienia sekwencji intronowych. Te badania mapowania transkryptowego przeprowadzono zgodnie z ogólnie znanymi metodami, dzięki którym sekwencje genomowego DNA porównuje się z sekwencjami cDNA. Porównanie sekwencji DNA i sekwencji genomowych ujawniło istnienie dwóch sekwencji intronowych w genie odporności Mi.

Jeden intron o 1306 nukleotydach leży od pozycji nukleotydu 1936 do 3241, a drugi intron o 75 nukleotydach leży od pozycji nukleotydu 3305 do 3379 jak opisano na fig. 5. Pozycję miejsca inicjacji transkrypcji uważa się za leżącą przy lub w górę od nukleotydu 1880. Pierwszy kodon inicjacyjny ATG leży przy pozycji nukleotydu 3263, która znajduje się 52 nukleotydy w górę od drugiego introny, dając wielką otwartą ramkę odczytu (ORF1), kodującą polipeptyd o 1257 aminokwasach (fig. 7A).

Poszukiwania homologii ukazały, że polipeptydy według wynalazku należą do klasy LRR roślinnych białek odporności (Staskawicz i in., 1995, Science, 268, 661-667). Poza tym, białka można podzielić na cztery regiony oznaczone A do D: region A obejmuje dużą ilość reszt leucynowych, region B obejmuje motyw miejsca wiązania nukleotydu, region C jest regionem LRR, zawierającym 13 powtórzeń z następującymi sekwencjami konsensusowymi a--a-NL--L-a-----a--a/S-- (Jones i Jones, 1997,

Advances in Botanical Research, 24, 89-167), a region D ujawnia brak homologii z żadnym innym znanym białkiem.

W celu identyfikacji i izolacji sekwencji homologicznych, wchodzących w zakres niniejszego wynalazku, biblioteki genomowe i cDNA poddano skriningowi z sekwencją kodującą genu odporności Mi jako sondą, w surowych warunkach hybrydyzacji. Klony dodatnie wyizolowano i użyto do analizy komplementacji.

Przeprowadzono hybrydyzację Southern blot na części przylegania YAC, za pomocą wewnętrznego fragmentu Pstl sekwencji kodującej genu odporności Mi. Można było zidentyfikować trzy dodatkowe regiony homologiczne: dwa w YAC 1/1172 i jeden w YAC 1/1084. Każdy region obejmuje 2 do 3 homologów Mi, wskazujące fakt, że rodzina genu Mi składa się z około 10 do 12 członków.

Niespodziewanie, testy chorobowe mszyc ujawniły, że rośliny R0, transformowane kosmidem Mi-11 są odporne na Meloidogyne incognita, a także odporne na Macrosiphum euphorbiae, wskazując, że insert genomowy obecny w kosmidzie Mi-11 wiąże się z nadawaniem roślinom R0 odporności na nicienie, jak również wiąże się z nadawaniem odporności na mszyce. W szczególności, roślina, którą transformuje się genem odporności według wynalazku posiada co najmniej zmniejszoną podatność na jeden lub więcej patogenów, zwłaszcza nicienie węzłów korzeniowych i/lub mszyce.

W celu potwierdzenia odziedziczenia odporności na mszyce (i) wcześniej otrzymane linie pomidora R1, które pochodziły od transformantów kosmidem Mi-11 odpornych na nicienie, (ii) linie R2 pochodzące od samopowielonych odpornych na nicienie roślin R1 oraz (iii) linie R1BC otrzymane z odpornych na nicienie roślin R1 krzyżowano wstecznie z podatną linią pomidora 52201, testowano pod względem odporności przeciw M. euphorbiae. Otrzymane wyniki wskazywały na odziedziczenie odporności na mszyce.

Kosmid Mi-11 użyto do transformacji genotypów podatnych na nicienie tytoniu i ziemniaka, zgodnie z ogólnymi znanymi metodami transformacji. Korzenie hodowanych in vitro transformowanych roślin R0 tytoniu i ziemniaka testowano pod względem objawów chorobowych, jak wcześniej opisano w niniejszym.

Obserwacje testu chorobowego na hodowlach korzeni transformowanych roślin wskazywały, że kosmid wiąże się z nadawaniem roślinom transformowanym zmniejszonej podatności na nicienie.

PL 191 777 B1

Gen odporności według wynalazku ma wpływ na zmniejszanie podatności heterologicznych gatunków roślin na nicienie, korzystnie na rodzaj Meloidogyne, zwłaszcza Meloidogyne incognita. Ponadto transformanty tytoniu testowano także pod względem odporności na mszyce i zidentyfikowano rośliny odporne R0. Gen odporności według wynalazku posiada podwójną funkcję i ma wpływ na układy heterologiczne.

Kosmid Mi-11 złożono 5 sierpnia 1996 jako plazmid pKGMi-11 w Centraalbureau voor Schimmelcultures w Baarn, Holandia, pod numerem depozytowym CBS 822.96.

Kosmid Mi-18 złożono 5 sierpnia 1996 jako plazmid pKGMi-18 w Centraalbureau voor Schimmelcultures w Baarn, Holandia, pod numerem depozytowym CBS 821.96.

Następujące przykłady dostarczą ilustracji niniejszego wynalazku, który niemniej nie ogranicza się do tych przykładów.

Przykład 1. Test choroby

Jałową kulturę nicienia powodującego zgrubienia na korzeniach Meloidogyne incognita utrzymuje się na jałowych korzeniach odmiany pomidora Moneymaker. Kultury hoduje się na zestalonej pożywce B5 (Gamborg i in., 1968, Experimental Celi Research 50: 151-158) z 2% sacharozą i bez hormonów.

Przeszczepy korzeniowe (1-5 cm), pochodzące od hodowanych in vitro roślin pomidora przenosi się na zestaloną pożywkę B5 wspomnianą powyżej, aby zapoczątkować kulturę korzeniową. W tym samym czasie każdy przeszczep korzeniowy inokuluje się dziesięcioma zgrubieniami z jałowej kultury nicienia.

Zgrubienia umieszcza się kilka centymetrów od przeszczepu korzeniowego. Płytki Petriego z korzeniami i zgrubieniami inkubuje się w ciemności w temperaturze 25°C. Po czterech do sześciu tygodni określa się poziom zakażenia przez liczenie zgrubień utworzonych na kulturach korzeniowych.

Ocenę pod względem odporności/podatności na M. incognita przeprowadza się następująco.

Roślinę transgeniczną uważa się za odporną, jeśli widać brak lub mniej niż dwa zgrubienia na kulturze korzeniowej. Roślinę transgeniczną uważa się na podatną, jeśli na kulturze korzeniowej utworzyły się co najmniej dwa zgrubienia.

Przykład 2. Identyfikacja markerów AFLP połączonych z segmentem DNA, zawierającym gen odporności Mi

Linie pomidora (Lycopersicon esculentum)

Wszystkie z 9 linii pomidora odpornych wobec Meloidogyne incognita oraz 13 linii pomidora podatnych na M. incognita użyto do identyfikacji markerów AFLP. Początkowo skrining AFLP przeprowadzono na dwóch zbiorach prawie izogenicznych linii 83M-R (odpornych) i 83M-S (podatnych) oraz Motelle (odpornych) i Mobox (podatnych). Kandydujące markery uzyskane z pierwszego skriningu potwierdzono przez drugi skrining na 7 liniach M. incognita odpornych i 11 M. incognita podatnych.

	Dwa zbiory linii prawie izogenicznych:
1.	83M-R	odporna	De Ruiter Zonen C.V. Bergschenhoek, Holandia (potem w niniej-
			szym „De Ruiter”)
2.	83M-S	podatna	De Ruiter
3.	Motelle	odporna	INRA, Montfavet, Francja
4.	Mobox	podatna	De Ruiter
	7 odpornych linii odpornych M. incognita i 11 linii podatnych M. incognita do potwierdzenia:
5.	DR30	odporna	De Ruiter
6.	DR17	odporna	De Ruiter
7.	E22	odporna	Enza Zaden, de Enkhuizer Zaadhandel B.V., Enkhuizen, Holandia
			(potem w niniejszym „Enza Zaden”)
8.	E1	odporna	Enza Zaden
9.	DR6	odporna	De Ruiter
10.	DR10	odporna	De Ruiter
11.	1872	odporna	Royal Sluis B.V., Enkhuizen, Holandia (potem w niniejszym „Roy-
			al Sluis”)
12.	Moneymaker	podatna	Agricultural University Wageningen
13.	DR12	podatna	De Ruiter
14.	DR23	podatna	De Ruiter
15.	GT	podatna	De Ruiter

PL 191 777 B1

16.	RZ3	podatna	De Ruiter
17.	RZ5	podatny	Rijk Zwaan
18.	E3	podatna	Enza Zaden
19.	E7	podatna	Enza Zaden
20.	E16	podatna	Enza Zaden
21.	RS1	podatna	Royal Sluis
22.	R2S	podatna	Royal Sluis

Wyizolowanie i modyfikacja DNA

Całość DNA z 22 linii opisanych powyżej, wyizolowano z młodych liści, jak opisano u Bernatzki'ego i Tanksleya (Theor. Appl. Genet. 72, 314-321). Typowa wydajność wynosiła 50-100 μg DNA na gram świeżego materiału liściowego. Matrycowy DNA do analizy AFLP za pomocą kombinacji enzymów Pstl-Msel wytworzono jak opisano u Zabeau i Vosa (europejskie zgłoszenie patentowe, EP0534858) i jak opisano w skrócie poniżej.

0,5 μg DNA pomidora inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C z 5 jednostkami Pstl i 5 jednostkami Msel w 40 μl 10 mM Tris · HAc pH 7.5, 10 mM MgAc, 50 mM Kac, 5 mM DTT, 50 ng/nl BSA. Następnie dodano 10 Ul roztworu, zawierającego 5 pMoli adapterów Pstl, 50 pMoli adapterów Msel, 1 jednostkę ligazy DNA T4, 1 mM ATP w 10 mM Tris · HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM Kac, 5 mM DTT, 50 ng^l BSA i kontynuowano inkubację przez 3 godziny w temperaturze 37°C.

Adaptery opisano poniżej.

St ru ktu ra adaptera Pstl była następująca:

5'-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3

3'-CATCTGACGCATGT-5'

Struktura adaptera Msel była następująca:

5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'

3'-TCTCAGGACTCAT-5'

Adaptery wytworzono przez dodanie równomolowych ilości obu nici; adapterów nie ufosforylowano. Po ligacji, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono do 500 μl za pomocą 10 mM Tris · HCl, 0,1 mM EDTA pH 8,0 i przechowywano w temperaturze -20°C. Rozcieńczoną mieszaninę reakcyjną przytaczano dalej jako matrycowy DNA.

Reakcje AFLP

Primery użyte do skriningu AFLP opisano poniżej:

Primery Pstl: 5'-GACTGCGTACATGCAGNN-3'

Primery Msel: 5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3'

N w primerach wskazuje, że ta część primerów była zmienna. W skriningu AFLP użyto wszystkie możliwe 16 primerydla primera Pstl i użyto wszystkie możliwe 64 primery dla primerów Msel. Dało to całość 16 x 64 kombinacji primerów Pstl i Msel, czyli 1024 kombinacje. Wszystkie 1024 kombinacje primerów użyto w skriningu AFLP dla markerów AFLP połączonych z Mi. Reakcje AFLP przeprowadzono w następujący sposób.

W reakcjach AFLP wykorzystano radioaktywnie znacznikowany primer Pstl i nie znacznikowany primer Msel. Primery Pst znacznikowano na końcu przy użyciu (γ- P)ATP i kinazy polinukleotydowej

T4. Reakcje znacznikowania przeprowadzono w 50 μl 25 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM

DTT, 0,5 mM spermidyny. 3HCl, przy użyciu 500 ng primera oligonukleotydowego, 100 μφ (γ- P)ATP oraz 10 jednostek kinazy polinukleotydowej T4. Do analizy AFLP sporządzono 20 μl mieszaniny reakcyjnej, zawierającej 5 ng znakowanego primera Pstl (0,5 μl z mieszaniny reakcji znacznikowania), 30 ng primera Msel, 5 μl matrycowego DNA, 0,4 jednostki polimerazy Taq, 10 mM Tris · HCl pH 8,3,

1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,2 mM wszystkich 4 dNTP. Reakcje AFLP przeprowadzono stosując następujący profil cyklu: 30 sekund etapu denaturacji w temperaturze 94°C, 30 sekund etapu annealingu (patrz poniżej) i jedna minuta etapu wydłużania w temperaturze 72°C. Temperaturę annealingu w pierwszym cykli wynoszącą 65°C, stopniowo zmniejszano w każdym cyklu o 0,7°C przez następnych 12 cykli i kontynuowano w temperaturze 56°C przez pozostałe 23 cykle. Wszystkie reakcje powielenia przeprowadzono w cyklerze cieplnym PE-9600 (Perkin Elmer Corp. Norwalk, CT, USA).

Analiza żelowa produktów reakcji AFLP

Po powieleniu, produkty reakcji zmieszano z równą objętością (20 μΓ> barwnika formamidowego (98% formamid, 10 mM EDTA pH 8,0 i błękit bromofenolowy oraz cyjanol ksylenowy jako barwniki odwzorowujące). Uzyskane mieszaniny ogrzewano przez 3 minuty w temperaturze 90°C, a potem

PL 191 777 B1 szybko ochłodzono na lodzie. 2 μΐ każdej próbki załadowano na 5% denaturujący (sekwencjonujący) żel poliakrylamidowy (Maxam i Gilbert, Methods in Enzymology 65, 499-560). Macierz żelową sporządzono przy użyciu 5% akrylamidu, 0,25% bisakrylu metylenowego, 7,5 M mocznika w 50 Tris/50 mM kwasu borowego/1 mM EDTA. Do 100 ml roztworu żelowego dodano 500 μl 10% APS i 100 μl TEMED i żele odlano przy użyciu aparatu 38 x 50 cm SequiGen (Biorad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Użyto grzebieni o kształcie zębów rekina, aby uzyskać 97torów na przyrządach z żelem SequiGen. Jako buforu do przebiegów użyto 100 mM Tris/100 mMkwas borowy/2 mM EDTA. Elektroforezę przeprowadzono przy stałej mocy, 110 Watów, przez około 2 godziny. Po elektroforezie, żele utrwalono przez 30 minut w 10% kwasie octowym, wysuszono na płytkach szklanych i poddano ekspozycji na fosforowe ekrany obrazujące Fuji na 16 godzin.Wzory linii papilarnych uwidoczniono przy użyciu układu do analizy obrazu fosforowego Fuji BAS-2000 (Fuji Photo Film Company Ltd, Japonia).

Skrining AFLP dla przyłączonych markerów

Przeprowadzono skrining AFLP przy użyciu wszystkich możliwych 1024 kombinacji primerów Pstl-Msel na dwóch zbiorach prawie izogenicznych linii. Celem była identyfikacja markerów AFLP obecnych w oby liniach odpornych i nieobecnych w oby liniach podatnych. Żel AFLP zawierał linie papilarne AFLP 24 kombinacji primerów 4 linii izogenicznych, dając wszystkie 43 żele. Zidentyfikowano wszystkie 30 markerów AFLP obecnych w oby liniach odpornych i nieobecnych woby liniach podatnych. Markery te przytoczono jako kandydujące markery AFLP połączone z Mi.

Następnie przeprowadzono reakcje AFLP w celu określenia obecności 30 kandydujących markerów na 7 odpornych i 11 podatnych liniach pomidora. Jak się okazało, z 30 kandydujących markerów 20 było obecnych w 7 liniach odpornych i nieobecnych w 11 liniach podatnych. Te 20 markerów użyto do dalszych badań w celu zmapowania genu odporności Mi. Kombinacje primerów wymagane do identyfikacji 20 markerów Pstl-Msel opisano w tabeli 1. W kolumnie z kombinacjami primerów, „Pst-” odnosi się do sekwencji 5'-GACTGCGTACATGCAG-3', a „Msel-” odnosi się do sekwencji 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'. Przykładowo, marker PM14 można identyfikować przy użyciu primera Pstl, mającego następującą sekwencję: 5'-GACTGCGTACATGCAGGA-3' i primera Msel, mającego następującą sekwencję: 5'-GATGAGTCCTGAGTAATCT-3'.

T a b e l a 1

Marker	Kombinacja primerów z selektywnym przedłużeniem (NN/NNN)
1	2
PM02	Pstl-AT/Msel-AAA
PM07	Pstl-AA/Msel-TAC
PM08	Pstl-CT/Msel-ACT
PM10	Pstl-CA/Msel-TCT
PM11	Pstl-TA/Msel-TGA
PM13	Pstl-GA/Msel-ATC
PM14	Pstl-GA/Msel-TCT
PM15	Pstl-GT/Msel-GAC
PM16	Pstl-GT/Msel-TCT
PM17	Pstl-AT/Msel-AAG
PM18	Pstl-AT/Msel/TAG
PM19	Pstl-GG/Msel-ATT
PM20	Pstl-TG/Msel-AAT
PM21	Pstl-TG/Msel-TTT
PM22	Pstl-TG/Msel-GCT

PL 191 777 B1 ciąg dalszy tabeli 1

1	2
PM23	Pstl-GT/Msel-GAA
PM24	Pstl-AA/Msel-CTG
PM25	Pstl-AC/Msel-GTG
PM27	Pstl-TA/Msel-CTA
PM29	Pstl-TA/Msel-GGA

Pr zy kł a d 3. Konstrukcja i skrining biblioteki YAC pomidora

Materiał

Jako źródła DNA do konstrukcji biblioteki YAC użyto linii pomidora Lycopersicon esculentum E22 (Enza Zaden) homozygotyczną pod względem locus Mi. Wyizolowano protoplasty z liści kiełków in vitro, które miały dwa do trzech tygodni, jak opisano u Van Daelena i in., (Plant Mol. Biol. 12, 341-352).

Żywe protoplasty (stężenie 50 milionów protoplastów na ml) zebrano i zmieszano z równą objętością agarozy (1% Seaplaque, FMC Bioproducts, Rockland, Maine, USA), aby utworzyć czop. Protoplasty osadzone na czopach poddano lizie mieszaniną do lizy (0,5 M EDTA, 1% N-laurylosarkozynian i 1 mg/ml proteinazy K, pH = 8,0). Po lizie, czopy przechowywano w temperaturze 4°C w buforze do przechowywania (świeża mieszanina do lizy), aż do użycia. Do dalszych badań użyto około 3 milionów protoplastów na czop, aby uzyskać około 4,5 μg chromosomowego DNA. Jako wektor kloningowy użyto plazmid pYAC4, zawierający unikalne miejsce kloningowe EcoRI i jako gospodarza użyto szczep drożdżowy AB1380 (Burke i in., Science 236, 806-812).

Konstrukcja biblioteki YAC

Izolację DNA o wysokim ciężarze cząsteczkowym, częściowe trawienie EcoRI w obecności metylazy EcoRI, ligację ramion wektora z genomowym DNA, selekcję pod względem wielkości przez elektroforezę żelową z pulsującym polem oraz transformację gospodarza drożdżowego, przeprowadzono zgodnie z opisem Burke'a i in., (Science 236, 806-812) oraz Larina i in., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4123-4127).

Wszystkie standardowe manipulacje przeprowadzono zgodnie z opisem w Molecular Cloning: a laboratory manual Sambrook i in., (Cold Spring Harbor Laboratory Press). Na koniec otrzymano 3840 klonów o przeciętnej wielkości 520 kb, która odpowiada 2,2 równoważnikom genomu i poszczególne klony przechowywano w 40 96-studzienkowych płytkach do mikromianowania, zawierających 75 μl roztworu YPD (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton i 2% dekstroza).

Skrining biblioteki YAC

Aby zmniejszyć liczbę obrabianych próbek, komórki jednej z płytek o 96 studzienkach zlano (zlanie płytek) i użyto do izolacji DNA jak opisano u Rossa i in., (Nucleic Acids Res. 19, 6053). 2,2 równoważnika genomu biblioteki YAC pomidora składa się z 40 96-studzienkowych studzienek do mikromianowania i jako DNA uzyskane z 40 zlań płytek, poddano skriningowi za pomocą markerów AFLP PM10, PM13, PM21 i PM25, przy użyciu protokołu zgodnie z opisem w przykładzie 2. PM10, PM13, PM21 i PM25 wybrano do skriningu zlań płytek YAC, ponieważ te markery nie zakłócają wstęg tła szczepu drożdży AB1380. Za pomocą czterech markerów AFLP zidentyfikowano trzy dodatnie zlania płytek z 40, jak ukazano w tabeli 2. Następnie, wykorzystano wtórny skrining czterema markerami AFLP (PM10, PM13, PM21 i PM25) 96 poszczególnych klonów YAC z każdej płytki, aby znaleźć prawidłowe położenie klonów YAC. Zidentyfikowano trzy poszczególne klony YAC, oznaczone 1/1084, 1/1172 i 2/1256 (tabela 2). Potem analizowano trzy poszczególne klony YAC pozostałymi markerami AFLP. Wszystkie zidentyfikowane markery PM02 do PM29 były obecne na jednym lub więcej tych trzech klonów YAC (tabela 3). Wielkość klonu YAC określono przez analizę elektroforezy z pulsującym polem elektromagnetycznym (PFGE) przy użyciu jednorodnego pola elektrycznego z zamkniętym obwodem (CHEF; Chu i in., Science, 235, 1582-1585) i wynosił on jak się okazało 470 kb (1/1084), 570 kb (1/1172) i 500 kb (2/1256), odpowiednio.

PL 191 777 B1

T a b e l a 2

Zlanie nr	PM10	PM13	PM21	PM25	Wykryty YAC (wielkość w kb)
2	-	-	+	-	YAC 1/1172 (570 kb)
16	+	-	-	-	YAC 2/1256 (500kb)
4	-	+	-	-	YAC 1/1084 (470kb)

T a b e l a 3

Marker	1/1172	2/1256	1/1084
PM02	-	-	+
PM07	-	+	-
PM08	-	+	+
PM10	-	+	-
PM11	-	+	-
PM13	-	+	+
PM14	+	+	-
PM15	-	+	-
PM16	+	-	-
PM17	-	+	-
PM18	-	+	+
PM19	-	+	-
PM20	-	+	-
PM21	+	-	-
PM22	-	+	+
PM23	-	+	-
PM24	-	+	-
PM25	-	+	-
PM27	-	+	-
PM29	-	+	-

P r z y k ł a d 4. Konstrukcja mapy fizycznej o długim zasięgu części przylegania YAC Mi i położenie markerów AFLP klony YAC 1/1172, 2/1256 i 1/1084 poddano częściowemu trawieniu wzrastającym stężeniem enzymów restrykcyjnych Sfil i BssHII. Próbki frakcjonowano przez PFGE, przeniesiono na błonę Gene Screen plus (DuPont NEN, Boston, MA, USA) i testowano przez hybrydyzację przy użyciu sond sekwencyjnych sąsiadujących z końcem zgodnie z protokołem dla pośredniego mapowania ze znaczeniem końca, zgodnie z opisem Burke'go i in., (Science 236, 806-812). Można było skonstruować mapę fizyczną YAC 1/1172, 2/1256 i 1/1084 dla enzymów Sfil i BssHII jak ukazano w fig. 1. W celu wyizolowania fragmentów YAC uruchomiono trawienie na PFGE. Trawienie YAC 1/1172 za pomocą Sfil dało dwa fragmenty (200 kb i 370 kb). Trawienie YAC 2/1256 za pomocą BssHII dało cztery fragmenty (40 kb, 90 kb, 110 kb i 260 kb), podczas gdy trawienie YAC 1/1084 za pomocą BssHII dało dwa fragmenty o wielkości 70 i 400 kb. W wyniku tego, część przylegania YAC o wielkości 1,4 Mb można było

PL 191 777 B1 podzielić na 8 regionów, odpowiadających 8 fragmentom restrykcyjnym z trzech klonów YAC, pokrywających pełny region Mi i sekwencje sąsiadujące.

Aby umiejscowić różne markery AFLP w tych 8 regionach na mapie fizycznej, użyto markery AFLP jako sond hybrydyzacji na częściowych i pełnych produktach trawienia Sfil i BssHII klonów YAC 1/1172, 2/1256 i 1/1084. Dlatego każdy fragment markera AFLP odcięto od wysuszonego żelu i wymywano za pomocą dyfuzji w buforze, zawierającym 0,5 M octan amonowy, 10 mM octan magnezu, 1mM EDTA (pH = 8,0), 0,1% SDS, ponownie powielony odpowiadającymi nie znakowanymi primerami AFLP oraz znakowanymi później ³²P zgodnie z metodą losowego primera Feinberga i Vogelsteina (Anal. Biochem. 132, 6-10). Każdy marker AFLP można przypisać jednemu lub więcej z ośmiu regionów, jak przedstawiono w tabeli 4 i na fig. 1.

T a b e l a 4

Fragment YAC	Markery AFLP połączone z Mi wykryte przez hybrydyzację
Fragment Sfil 1/1172 o 200 kb	-
Fragment Sfil 1/1172 o 370 kb	PM14, PM16, PM21
Fragment 2/1256 BssHII o 260 kb	PM10, PM11, PM17, PM19, PM23, PM24, PM29
Fragment 2/1256 BssHII o 90 kb	PM07, PM27
Fragment 2/1256 BssHII o 110 kb	PM08, PM13, PM14, PM15, PM20, PM 22, PM25
Fragment 2/1256 BssHII o 40 kb	PM18
Fragment 1/108 BssHII o 70 kb	PM08, PM13, PM22
Fragment 1/108 BssHII o 400 kb	PM02, PM18

Przykład 5. Konstrukcja biblioteki kosmidowej klonów YAC 1/1172 i 2/1256

Materiał

Binarny wektor kosmidowy pJJ04541 jest pochodną pJJ1881 (Jones i in., Transgenic Research 1, 285-297) i opiera się o plazmid pRK290, zawierający gen odporności na tetracyklinę do selekcji w Escherichia coli i Agrobacterium tumefaciens. W unikatowym miejscu Eco RI pRK290 sekwencje niosące T-DNA (LB; powtórzenie zlewego brzegu, RB oznacza powtórzenie prawego brzegi), które oskrzydlają

- miejsce cos bakteriofaga lambda;

-gen fosfotransferazy neomycynowej (Beck i in., Gene 19, 327-336), którego ekspresję napędza sekwencja promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S (Odell i in., Mol. Gen. Genet. 223, 369-378) oraz

- sekwencję polilinkera pBluescript (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA).

Wielkość pJJ04541 wynosi 29 kb i ukazano ją schematycznie na fig. 2. Zdolność kloningowa tego binarnego wektora kosmidowego przy użyciu ekstraktów upakowujących faga lambda wynosi 9do 24 kb.

Konstrukcja biblioteki

Wyizolowano cały DNA ze szczepu AC1380 Saccharomyces cerevisiae, zawierającego YAC 2/1256, przy użyciu zymoliazy, do wykonywania protoplastów zgodnie z Greenem i Olsenem (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1213-1217).

Równe ilości oby DNA analizowano na PFGE. Oba izolaty DNA, jak się okazało, miały wielkość >100 kb.

Około 15 μg każdego DNA trawiono częściowo za pomocą Sau3A, tworząc cząsteczki ośredniej wielkości 15-25 kb. Następnie próbki wirowano z 10-35% gradientem sacharozy przez 22godziny, 22000 obrotów na minutę w temperaturze 20°C w rotorze Beckman SW41. Frakcje zawierające cząsteczki DNA analizowano na 0,7% żelu agarozowym. Frakcje zawierające cząsteczki DNA o wielkości = 20 kb zlano i zatężono przez precypitację etanolem.

PL 191 777 B1

Następnie, lepkie końce wypełniono częściowo dATP i dGTP przy użyciu strategii częściowego wypełniania przedłużeń 5' DNA wytworzonego przez endonukleazę restrykcyjną typu II, jak opisano u Korcha (Nucleic Acids Res. 15, 3199-3220) i Loftusa i in., (Biotechniques 12, 172-176).

Binarny wektor kosmidowy pJJ04541 trawiono w całości za pomocą Xhol i fragment liniowy częściowo wypełniono dDTP i dCTP jak opisano u Korcha (Nucleic Acids Res. 15, 3199-3220).

Fragmenty o 20 kb poddano ligacji do wektora kosmidowego i transdukowano do szczepu E. coli XLl-Blue MR (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA) przy użyciu ekstraktów upakowujących faga lambda Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA) zgodnie zaleceniami producentów. Przeprowadzono selekcję na płytkach agarowych LB (1% baktotrypton, 0,5% ekstrakt baktodrożdżowy i 1% NaCl, pH 7,5), zawierających 10 mg/1 tetracykliny. Wykonano dwa banki o około

250000 klonach kosmidowych na bank, z 2-3 μg DNA drożdży frakcjonowanego pod względem wielkości klonów YAC 1/1172 i 2/1256 odpowiednio.

Następnie te transformanty przechowywano w studzienkach płytek do mikromianowania (96-studzienkowe, 100 μl pożywki LB, zawierającej 10 mg/l tetracykliny). Powtórzenia sieci 96 studzienek klonów kosmidowych w płytkach do mikromianowania odciśnięto na filtrach błonowych Gene Screen Plus (NEN Dupont) i pozostawiono do wyrośnięcia w kolonie na pożywce. Hybrydyzacja kolonii, zgodnie z opisem Sambrooka i in., (w: Molecular Cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), przy użyciu klonów YAC znakowanych ³²P 1/1172 i 2/1256 ujawniła kosmidy dodatnie. Z około 10000 kolonii YAC 1/1172, zidentyfikowano około 200 dodatnich klonów kosmidowych. Z około 20000 kolonii YAC 2/1256 zidentyfikowano około 300 dodatnich klonów kosmidowych.

P r z y k ł a d 6. Dokładne mapowanie segmentu genu odporności Mi i pozycjonowanie markerów AFLP

Dzielenie kosmidów w określonych regionach

W celu podziału kosmidów na siedem określonych regionów, 200 dodatnich klonów kosmidowych YAC 1/1172 i 300 dodatnich klonów kosmidowych YAC 2/1256 hybrydyzowano 7 z 8 fragmentów restrykcyjnych (fragmenty YAC) jak przedstawiono w przykładzie 4 (patrz tabela 4 i fig. 1). Określono kosmidy dodatnie dla każdego z 7 fragmentów YAC. Poza tym, można było zidentyfikować kosmidy, które reagowały dodatnio z nakładającymi się fragmentami restrykcyjnymi dwóch różnych klonów YAC.

Konstrukcja części przylegania kosmidu segmentu genu odporności Mi

W celu skonstruowania części przylegania kosmidu we wszystkich dodatnich zidentyfikowanych kosmidach w różnych określonych regionach, zastosowano powielenie fragmentu restrykcyjnego. Do wytworzenia matrycy użyto około 200 ng każdego kosmidu i primerami w powieleniu fragmentów restrykcyjnych były primer EcoRI 5'-GACTGCGTACCAATTC-3', nie mający nukleotydów selektywnych oraz primer Msel 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3', nie mający nukleotydów selektywnych, zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 2. Primer EcoRI oznakowano na końcu 5' i wszystkie 500 kosmidów powielono przy użyciu zbioru primerów EcoRI/Msel. Odciski palców DNA zawierały około 8 do 20 powielonych fragmentów. Z każdego regionu wybrano zbiory kosmidów, zawierające powielone fragmenty o identycznej wielkości i ponownie uruchomiono na żelach poliakrylamidowych, jak opisano w przykładzie 2 aż do skonstruowania przylegających szeregów wszystkich powielonych fragmentów poprzez określone regiony. Poza tym, część przylegania kosmidu jednego regionu uszeregowano z sąsiadującymi regionami w celu skonstruowania części przylegania kosmidu locus Mi. W ten sposób skonstruowano część przylegania 96 kosmidów, obejmujących locus Mi o około 800 kb.

Szczegółowe pozycjonowanie markerów AFLP połączonych z częścią przylegania kosmidu

W celu pozycjonowania 20 markerów AFLP połączonych z Mi na części przylegania kosmidu, trawiono 96 kosmidów Pst, po czym poddano analizie Southern zgodnie z Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-515.

Jako sondy hybrydyzacji użyto markery AFLP, zgodnie z opisem w przykładzie 4 na Southern blot 96 produktów trawienia Pstl kosmidów. Dokładną pozycję markerów AFLP połączonych z Mi, z wyjątkiem markera PM02, przedstawiono na fig. 3A.

P r z y k ł a d 7. Analiza genetyczna mutantów Mi

Rodzinę zmutowanych linii pomidora uczyniono dostępną przez Enza Zaden. Linie te pochodzą od hybrydy F1 heterozygotycznej pod względem genu odporności Mi i heterozygotycznej pod względem genu Aps-1 (kodującego kwaśną fosfatazę-1), który jest bardzo ściśle związany z Mi (Stevens i Rick, 1986, w: The Tomato Crop, Atherton & Rudich wydawca., Chapman i Hall, strony 35-109). Różne allele genu Aps-1 można określić przez analizę izozymu (Vallejos, 1983 w: Isozymes in plant gene20

PL 191 777 B1 tics and breeding, Tanksley and Orton wydawcy, część A Elsevier, Amsterdam, 469-515). Allele Aps-1' pochodzą od L. peruvianum i wprowadzono je do kilku genotypów pomidora odpornych na nicienie przez kosegregację z genem odporności Mi. Schemat tych zmutowanych linii opisuje się poniżej:

Hybryda F1 (heterozygota Aps-1, fenotyp odporności Mi) | samopowielona

Linie F2 (segregacja Aps-1 1:2:1, segregacja odporności Mi 3:1) | samopowielenie heterozygotycznych roślin F₂(Aps-1)

Linie F3 (segregacja Aps-1 1:2:1, segregacja odporności Mi 3:1) | samopowielenie heterozygotycznych roślin F₃(Aps-1)

Linie F4 (segregacja Aps-1 1:2:1, segregacja odporności Mi 3:1) | samopowielenie heterozygotycznych roślin F₄(Aps-1)

Linie F5 (segregacja Aps-1 1:2:1, podatność Mi) | samopowielenie heterozygotycznych roślin F₅(Aps-1)

Linie F6 (segregacja Aps-1 1:2:1, podatność Mi) | samopowielenie heterozygotycznych roślin F₆(Aps-1')

Linie F7 (wszystkie Aps-1', podatne Mi) | samopowielenie homozygotycznych roślin F₇ (Aps-1')

Linie F8 (wszystkie Aps-1', podatne Mi)

W liniach F1, F2, F3 i F4 tej rodziny obecność allelu Aps-1' koreluje z fenotypem odporności Mi, podczas gdy nieobecność allelu Aps-1' koreluje z fenotypem odporności Mi. W F5 i następnych pokoleniach ta korelacja zanika: wszystkie rośliny są podatne na nicienie bez względu na allele Aps-1.

Dwadzieścia osobników z każdego pokolenia F2, F3, F4, F5, F6, F7 i F8 testowano pod względem odporności na nicienie, pod względem obecności allelu Aps-1 i obecności markerów AFLP połączonych z Mi. Testowanie siewek wobec nicieni przeprowadzono w glebie zanieczyszczonej zgrubieniami korzeniowymi M. incognita. Wyniki odporności na nicienie były takie jak zaznaczono w powyższym schemacie: segregacja 3:1 w roślinach F2, F3 i F4 oraz podatność w F5 i populacjach potomnych. Większość markerów AFLP połączonych z Mi wskazywała na identyczny genotyp jak marker izozymowy Aps-1. Jednak 3 z markerów AFLP PM14, PM16 i PM25 jak się okazało, segregują z fenotypem Mi: u większości roślin F5, F6, F7 i F8 podatność Mi zaznaczała się przez nieobecność tych markerów. Markery AFLP PM14, PM16 i PM25 wykazały korelację między genotypem AFLP Mi i fenotypem Mi u mutantów. Markery PM14 i PM25 sąsiadują na mapie fizycznej, jak ukazano na fig. 3B i dlatego uznano, że region otaczający markery AFLP prawdopodobnie obejmujegen odporności Mi.

Pr zy kł a d 8. Mapa fizyczna nakładających się klonów kosmidowych, zawierających gen odporności Mi

Identyfikację kosmidów, hybrydyzujących z markerami AFLP połączonymi z Mi PM14 i PM25 przeprowadzono w przykładzie 6. PM14 identyfikuje kosmidy Mi-11, Mi-18 i Mi-01, podczas gdy PM25 identyfikuje kosmidy Mi-18 i Mi-01.

Następnie, z części przylegania kosmidu opisanej w przykładzie 6 wybrano mały szereg kosmidowy wokół kosmidów Mi-11, Mi-18 i Mi-01. Wybrano część przylegania 6 kosmidów, obejmujących 3 zidentyfikowane kosmidy i kosmidy sąsiednie. Te 6 kosmidów to Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 i Mi-14. W celu wykonania dokładnej mapy fizycznej tych 6 kosmidów, próbki DNA części przylegania kosmidu trawiono Pstl, po czym poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym. Można było określić fizyczne nałożenie między różnymi kosmidami. Łącząc te dane z uzyskanymi danymi o szczegółowym położeniu markerów AFLP połączonych z Mi na części przylegania kosmidu (patrz przykład 6) można było skonstruować dokładną mapę fizyczną położenia PM14 i PM25, jak ukazano na fig. 4. Część przylegania wokół markerów AFLP PM14 i PM25 jak obliczono, wynosi około 50 kb.

Pr zy kł a d 9. Transformacja

Przeniesienie kosmidów do Agrobacterium tumefaciens

Klony kosmidowe Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01, Mi-14 oraz kosmid kontrolny pJJ04541 wprowadzono do Agrobacterium tumefaciens poprzez łączny transfer w kojarzeniu trójrodzicielskim z szczepem pomocniczym (pRK2013) zasadniczo zgodnie z Deblaere i in., (Methods in Enzymology, 153, 277-292). E. coli hodowano w pożywce LB (1% bakto-trypton, 0,5% ekstrakt bakto-drożdżowy i 1% NaCl, pH 7,5) uzupełnionej 5 mg/l tetracykliną w temperaturze 37°C. Szczep pomocniczy HB101 (pRK2013) hodowano w identycznych warunkach w pożywce LB uzupełnionej 100 mg/l siarczanem kanamycyny.

PL 191 777 B1

Szczep Agrobacterium tumefaciens AGL1 (Lazo i in., Bio/Technology, 9, 963-971, 1991) hodowano w pożywce LB uzupełnionej 100 mg/l karbenicyliny w temperaturze 28°C. Całonocne hodowle rozcieńczono 1:100 w pożywce LB bez żadnych antybiotyków i po 6 godzinach wzrostu, 0,1 każdej hodowli Agrobacterium z m i e s z a n o z hodowlą szczepu pomocniczego i hodowlą szczepu kosmidowego i powleczono na płytkach agarowych z LB bez antybiotyków. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 28°C, mieszaninę powleczono na płytkach agarowych z pożywką LB, zawierających 100 mg/l karbenicyliny i 10 mg/l tetracykliny do przesiewu pod względem transkoniugantów. Płytki inkubowano przez 3-4 dni w temperaturze 28°C. Przeprowadzono dwa seryjne pasaże przez płytki z agarem selektywnym, w celu selekcji pod względem pojedynczych transkoniugantów kolonii Agrobacterium.

Charakteryzacja transkoniugantów A. tumefaciens

Kultury na małą skalę hodowano z wybranych kolonii i hodowano na pożywce LB, zawierającej 10 mg/l tetracykliny. DNA plazmidu wyizolowano przez lizę alkaliczną przy użyciu metody opisanej przez Ish-Horowicza i in., Nucl. Acids Res. 9, 2989-2997, 1981) i trawiono Bglll przy użyciu standardowych technik. Poza tym, przeprowadzono powielenie fragmentu restrykcyjnego na DNA miniprep A. tumefaciens, przy użyciu kombinacji enzymów EcoRI/Msel i primerów, nie mających nukleotydów selektywnych jak opisano w przykładzie 6. Następnie, wzórenzymu restrykcyjnego Bglll,jak również linie papilarne DNAtranskoniuganta A. tumefaciens porównano z DNAminiprep szczepu E. coli, zawierającym kosmid. Tylko te transkoniuganty A. tumefaciens, które zawierały kosmid z takim samym wzorem DNA jak odpowiadająca hodowla E. coli, użyto do transformacji podatnej linii pomidora.

Transformacja podatnej linii pomidora

Nasiona podatnej linii pomidora 52201 (Rijk Zwaan, De Lier, Holandia) wyjałowiono powierzchniowo w 2% podchlorynie sodowym przez 10 minut, przepłukano trzykrotnie w jałowej wodzie destylowanej i umieszczono na pożywce do kiełkowania (składającej się z pożywki MS o połowie mocy zgodnie z Murashige iSkoog, Physiol. Plant. 15, 473-497, z 1% (ciężar/objętość) sacharozą i 0,8% agarem) w szklanych słojach lub polipropylenowych naczyniach do hodowli. Pozostawiono je do skiełkowania na 8 dni. Warunkami hodowli była temperatura 25°C, gęstość strumienia fotonów 30 μmli · m^-2 · s^-1 oraz okres naświetlania 16/24 godziny.

Transformację pomidora przeprowadzono zgodnie z Koorneefem i in., (19986) w: Tomato Biotechnology, 169-178, Alan R. Liss, Inc. i opisano ją w skrócie poniżej. Ośmiodniowe przeszczepy liścieni hodowano wstępnie przez 24 godziny w płytkach Petriego, zawierających warstwę odżywczą zzawiesiny komórkowej Petunia hybrida powleczonej na pożywce MS20 (pożywka hodowlana według Murashige i Skooga, (1962) Physiol. Plant. 15, 473-497 z 2% (ciężar/objętość) sacharozą oraz 0,8% agarem) uzupełnionej 10,7 μM kwasem α-naftalenooctowym i 4,4 μM 6-benzyloaminopuryną. Przeszczepy zakażono następnie rozcieńczoną całonocną hodowlą Agrobacterium tumefaciens, zawierającą klony kosmidów Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 i Mi-14 lub wektor kosmidowy pJJ04541 przez 5-10 minut, odciśnięto na sucho na jałowym papierze filtrowym i wspólnie hodowano przez 48 godzin na oryginalnych płytkach z warstwą odżywczą. Warunki hodowli były takie jak opisano powyżej. Całonocne hodowle Agrobacterium tumefaciens rozcieńczono w ciekłej pożywce MS20 (pożywka hodowlana według Murashige i Skooga, (1962) z 2% (ciężar/objętość) sacharozą, pH 5,7) do O.D600 wynoszącej 0,8.

Po wspólnej hodowli, przeszczepy liścieni przeniesiono na płytki Petriego z pożywką selektywną, zawierającą MS20 uzupełnioną 4,56 μM zeatyną, 67,3 μM wankomycyną, 418,9 μm cefotaksymem i 171,6 μM siarczanem kanamycyny i hodowano w warunkach hodowlanych opisanych powyżej. Przeszczepy przenoszono co 3 tygodnie do świeżej pożywki. Ukazujące się kiełki odcinano od leżącej niżej tkanki kallusowej i przenoszono do szklanych słoi z selektywną pożywką bez zeatyny, w celu utworzenia korzeni. Tworzenie się korzeni w pożywce, zawierającej siarczan kanamycyny uznano za wskaźnik transgenicznej natury rozpatrywanego korzenia. Prawdziwie transgeniczne regeneranty rozmnażano in vitroprzez subkulturę merystemu wierzchołkowego oraz pączki pomocnicze do szklanych słoi z świeżą pożywką selektywną bez zeatyny.

Przykład 10. Analiza komplementacji

Identyfikacja kosmidów z genem odporności przez skrining pod względem odporności w korzeniach roślin transformowanych

Korzenie transformowanych roślin R0 hodowanych in vitropoddano testowi chorobowemu opisanemu w przykładzie 1. Z każdego transformanta testowano dwa przeszczepy korzeniowe. We wszystkich 72 roślinach R0 testowano 7 różnych transformacji kosmidowych; 6 kosmidów, niosących

PL 191 777 B1

DNA insertu pomidora i jeden kosmid, pJJ04541 było bez DNA insertu pomidora. Wyniki ukazano w tabeli 4. Sześćdziesiąt trzy transgeniczne rośliny R0 okazały się podatne, ponieważ utworzyły się zgrubienia na co najmniej jednej z dwóch kultur korzeniowych. Dziewięć roślin R0 oceniono jako odporne, ponieważ nie znaleziono zgrubień na kulturach korzeniowych. Siedem odpornych roślin uzyskano z transformacji kosmidem Mi-11, podczas gdy dwie rośliny odporne uzyskano za pomocą kosmidu Mi-18, to jest nakładającego się w większej części z kosmidem Mi-11. Kosmidy Mi-11 i Mi-18 użyto do dalszej analizy cząsteczkowej.

T a b e l a 5

Kosmid	Rośliny R0
Odporne	Podatne
Mi-32	0	8
Mi-30	0	11
Mi-11	7	4
Mi-18	2	8
Mi-01	0	10
Mi-14	0	15
pJJ04541	0	7

Analiza cząsteczkowa transformowanych roślin z fenotypem odpornym

Aby pokazać, że fenotyp odporny transgenicznych roślin R0, który uzyskano za pomocą nakładających się kosmidów Mi-11 i Mi-18, określa się przez insert genomowy obecny w różnych kosmidach, przeprowadzono analizę AFLP z markerem AFLP PM14. Przeprowadzono selektywne powielenie fragmentu restrykcyjnego z kombinacją primerów, identyfikującą marker PM14 dla roślin R0 transformowanych kosmidami Mi-11 i Mi-18. Otrzymane odciski palca DNA ukazały obecność markera PM14 w roślinach odpornych, wskazując, że insert genomowy obecny w kosmidach Mi-11 i Mi-18 jest także obecny jest w roślinach R0 i że dwa zidentyfikowane nakładające się kosmidy Mi-11 i Mi-18 zawierają gen odporności Mi.

Scharakteryzowano dodatkowo inserty w kosmidach Mi-11 i Mi-18 oraz inserty w sąsiednich kosmidach Mi-32, Mi-30 z jednej strony i kosmidach Mi-01 i Mi-14 z drugiej strony. Region DNA, obejmujący gen odporności Mi na podstawie nałożenia się między kosmidami Mi-11 i Mi-18, oszacowano na około 16-18 kb. Na podstawie podatności roślin R0, mających insert obecny w kosmidzie Mi-30, region można było zmniejszyć do około 12 kb. Sekwencjonowano segment DNA, zawierający gen odporności Mi, odpowiadający regionowi oskrzydlonemuprzez prawe końce kosmidów Mi-30 i Mi-11 (patrz fig. 4).

Pr zy kł a d 11. Sekwencja nukleotydowa i wnioskowana sekwencja aminokwasowa genu odporności Mi z pomidora

Subkloning nakładającego się segmentu DNA

Aby określić sekwencję nakładającego się segmentu DNA w kosmidach Mi-11 i Mi-18, zawierających gen odporności Mi, utworzono zbiór losowych subklonów o wielkości insertów, wynoszących około 2 kb. 7,5 μg DNA kosmidów oczyszczonych CsCl Mi-11 i Mi-18 ścięto przez 10 sekund w temperaturze 4°C przy 15% mocy sondy (w 40 μl 10 mM octanu Tris, 10 mM octanu Mg i 50 mM octanu K) przy użyciu urządzenia dźwiękowego Misonix (Misonix Inc., Farmingdale, NY, USA) (typ XL2020) z wypełnionym wodą głośnikiem miseczkowym (typ 431A). Następnie, DNA ogrzewano przez 10 minut w temperaturze 60°C i ochłodzono do temperatury pokojowej. Końce fragmentów DNA naprawiono przez dodanie 10 μl mieszaniny naprawiającej (10 mM octanu Tris, 10 mM octanu Mg, 50 mM octanu K, 10 jednostek polimerazy Klenowa DNA, 10 jednostek polimerazy T4 DNAi 2 mM wszystkich 4 dNTP) i następnie inkubowano przez 30 minut w temperaturze 20°C. Ścięty DNA rozdzielono przez elektroforezę na 1% żelu agarozowym Seakem GTG (FMC Bio Products, Rockland, ME, USA). Frakcję o wielkości 1,8-2,2 kb odcięto od żelu i następnie płatki żelowe trawiono β-agarazą I według protokołu producenta (New England Biolabs Inc., Beverly, MA, USA) i wytrącono DNA.

PL 191 777 B1

Do klonowania frakcji 1,8-2,2 kb użyto modyfikowanego wektora pUC19 (oznaczonego pStuc). W tym wektorze zamieniono fragment BamHI/Sall z pUC19 na fragment DNA, zawierający miejsce restrykcyjne Stul i SalI przy użyciu dwóch primerów oligonukleotydowych i standardowych technik kloningowych jak opisano u Sambrooka i in., (w: Molecular Cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Frakcję o 1,8-2,2 kb poddano ligacji w temperaturze 16°C w trawionym Stul i defosforylowanym wektorze pStuc. Mieszaninę ligacyjną transformowano potem do ultrakompetentnych komórek Epicurian Coli XL2-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Hodowano poszczególne kolonie i przechowywano w płytkach do mikromianowania o 384 studzienkach (100 μΐ pożywki LB, zawierającej 100 mg/lkarbenicyliny).

Aby wyizolować klony reprezentujące nakładający się region DNA w kosmidach Mi-11 i Mi-18, zawierających gen odporności Mi, fragment Pstl klonu kosmidowego Mi-18 o 8,6 i 4,5 kb (patrz fig. 4)jak również marker AFLP PM14 użyto jako sondy hybrydyzacji w hybrydyzacji kolonii. Zatem, powtórzenia 384-studzienkowej sieci klonów w płytkach do mikromianowania, odciśnięto na filtry błonowe Gene Screen Plus (DuPont NEN, Boston, MA, USA) i pozostawiono do hodowli na kolonie na pożywce. Osiemdziesiąt cztery dodatnie klony użyto do izolacji DNA plazmidu przy użyciu metody lizy alkalicznej opisanej przez Ish-Horowicza i in., 1981, Nucl. Acids Res. 9, 2989-2997.

Analiza sekwencji

Do przeprowadzenia reakcji sekwencjonowania użyto zestaw ABI PRISM dye terminator cycle sequencing ready reaction w systemie Gene-Amp PCR Model 9600 (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA). Użyto standardowe primery M13 o kierunku zgodnym i odwrotnym. Produkty reakcji analizowano na 48 cm żelach ABI Prism 377. Określono sekwencję DNA 84 wybranych klonów przy użyciu standardowych primerów sekwencjonujących o kierunku zgodnym i odwrotnym. Montowanie i analizę sekwencji wykonano za pomocą wersji 1994 programu analizy sekwencji STADEN (Dear i Staden, 1991, Nucl. Acids Res. 19, 3907-3911). Można było utworzyć przylegającą sekwencję DNA o około 9,9 kb nukleotydów i ukazano ją na fig. 5. Można było wywnioskować wielką otwartą ramkę odczytu o3621 nukleotydach (ORF2), kodującą skrócony polipeptyd o 1206 aminokwasach (fig. 7B).

Przykład 12. Zakażenie nicieniem węzłów korzeniowych: zaszczepienie gleby

Glebę zakażoną nicieniem węzłów korzeniowych Meloidogyne incognita p rzy g oto w a n o następująco: systemy korzeniowe ciężko zakażonych roślin pomidora z wielką liczbą zgrubień (lub węzłów korzeniowych) pocięto na kawałki i wymieszano ze świeżą glebą.

Wysiano nasiona lub małe ukorzenione roślinki przeniesiono do zakażonej gleby. Rośliny hodowano w szklarni w temperaturze 25°C. Po 4 do 8 tygodniach, rośliny ostrożnie wyciągnięto zgleby iprzepłukano korzenie w wodzie w celu usunięcia przylegającej gleby. Określono poziom zakażenia przez liczenie utworzonych zgrubień.

Rośliny uznano za odporne, gdy na korzeniach widać było trzy lub mniej zgrubień. Rośliny uznano za podatne, gdy na systemie korzeniowym utworzyło się więcej niż trzy zgrubienia.

Przykład 13. Analiza komplementacji

Identyfikacja kosmidów genu odporności Mi przez skrining pod względem odporności u samopowielonego potomstwa transformowanych roślin

Pierwotne regeneraty (pokolenie R0) z doświadczeń transformacji hodowano w szklarni na nasiona. Dla każdego kosmidu hodowano dziesięć do piętnastu regenerantów i zebrano nasiona R1. Linie R1 co najmniej siedmiu roślin R0 dla każdego kosmidu testowano pod względem odporności przeciw Meloidogyne incognita w celu identyfikacji kosmidów z genem odporności. Zaszczepiono ioceniono dwadzieścia do 30 siewek lub roślinek z każdej linii R1, jak opisano w przykładzie 12.

We wszystkich 63 liniach R1 testowano różne transformacje kosmidów; 6 kosmidów, niosących DNA insertu pomidora i jeden kosmid pJJ04541, bez DNA insertu pomidora. Wyniki ukazano w tabeli 5. Jak się okazało, pięćdziesiąt cztery transgeniczne rośliny R0 były podatne, ponieważ na systemach korzeniowych wszystkich testowanych roślin R1 utworzyły się zgrubienia. Dziewięć roślin uznano za odporne, ponieważ co najmniej połowa roślin z każdej linii R1 posiada trzy lub mniej zgrubień. Jedna linia R1 była całkowicie odporna, sześć linii R1 segregowało w stosunku około 3:1 (roślinki odporne do podatnych), a potomstwo dwóch roślin R0 segregowało 1:1. Wszystkie dziewięć odpornych roślin R0 pochodziło z transformacji kosmidem Mi-11.

Dodatkowy dowód genetyczny na obecność genu odporności Mi na kosmidzie Mi-11 uzyskano w następnym pokoleniu. Odporne rośliny R1 poddano samopowieleniu. Czternaście uzyskanych linii R2, które pochodziły od czterech różnych roślin R0 testowano pod względem odporności przeciw M. incognita. Dwadzieścia do trzydzieści siewek z każdej linii R2 zaszczepiono i oceniono zgodnie

PL 191 777 B1 z opisem w przykładzie 12. Wyniki ukazano w tabeli 6. Pięć linii R2 było całkowicie odpornych, wskazując, że rodzicielskie rośliny R1 były homozygotyczne pod względem genu odporności Mi. Osiem linii R2 segregowało w stosunku 3:1, wskazując, że ich rodzicielskie rośliny R1 były heterozygotyczne pod względem genu odporności Mi. Jedna linia R2 segregowała w stosunku około 1:1 i okazało się, że żadna z testowanych linii nie była w pełni podatna. Wyniki te dowodzą, że wybrane rośliny R1, które pochodzą od kilku roślintransformowanych kosmidem Mi-11, zawierają funkcjonalny gen odporności Mi.

T a b e l a 6

Kosmid	Liczba linii R1 niezależnych testowanych roślin R0
Całość	Stosunek segregacji R : S (odporne do podatnych)
		1:0	3:1	1:1	0:1
Mi-32	7	0	0	0	7
Mi-30	9	0	0	0	9
Mi-11	9	1	6	2	0
Mi-18	8	0	0	0	8
Mi-01	10	0	0	0	10
Mi-14	9	0	0	0	9
pKK04541	11	0	0	0	11

T a b e l a 7

Kosmid	Liczba linii R2 niezależnych testowanych roślin R1
Całość	Stosunek segregacji R: S (odporne do podatnych)
		1:0	3:1	1:1	0:1
Mi-11	14	5	8	1	0

Pr zy kł a d 14. Test zakażenia mszycą ziemniaczaną

Małe rośliny pomidora (4-tygodniowe) zaszczepiono mszycą ziemniaczaną (Macrosiphum euphorbiae) przez umieszczenie pięciu do ośmiu samic mszycy na liściach. Rośliny hodowano w szklarni w temperaturze 18° do 20°C. Po jednym do dwóch tygodni określono poziom odporności przez zliczenie liczby nowo urodzonych mszyc.

Rośliny uznano za odporne, gdy nie było żadnych żywych mszyc na łodydze i liściach. Rośliny były podatne, gdy obecne były nowo urodzone mszyce.

Pr zy kł a d 15. Identyfikacja kosmidów z genem odporności Meu-1 przez skrining pod względem odporności u samopowielonego potomstwa roślin transformowanych

Podzbiór linii R1 uzyskanych w przykładzie 13 testowano pod względem odporności przeciw Macrosiphum euphorbiae w celu identyfikacji kosmidów z genem odporności Meu-1. Dziesięć do piętnastu roślinek z każdej linii R1 zaszczepiono i oceniono jak opisano w przykładzie 14. Testowano wszystkie 41 linii R1 o 7 różnych transformacjach kosmidowych; 6 kosmidów niosących DNA insertu pomidora i jeden kosmid pJJ04541, bez DNA insertu pomidora. Wyniki ukazano w tabeli 7.

Trzydzieści sześć transgenicznych roślin R0 uważa się za podatne, ponieważ tuziny mszyc mnożyły się na wszystkich lub większości roślin z każdej linii R1.

Pięć roślin R0 jest odpornych, ponieważ co najmniej połowa roślin z każdej linii R1 nie posiadała żywych mszyc.

Wszystkie te pięć odpornych roślin R0transformowano kosmidem Mi-11.

Uzyskane wyniki dobitnie wskazują, że rośliny R0, które pochodziły od transformacji kosmidem Mi-11, zawierają funkcjonalny gen odporności Meu-1.

PL 191 777 B1

T a b e l a 8

Kosmid	Liczba linii R1 niezależnych testowanych roślin R0
Całość	Stosunek segregacji R: S (odporne do podatnych)
		1:0	3:1	1:1	0:1
Mi-32	4	0	0	0	4
Mi-30	7	0	0	0	7
Mi-11	7	1	2	2	2
Mi-18	7	0	0	0	7
Mi-01	6	0	0	0	6
Mi-14	5	0	0	0	5
pJJ04541	5	0	0	0	5

Dodatkowy dowód genetyczny na obecność genu odporności Meu-1 na kosmidzie Mi-11 otrzymano w następnym pokoleniu.

Dwadzieścia cztery linie R2, które otrzymano z samopowieleń roślin R1 odpornych na nicienie (patrz przykład 13), które pochodziły od dziewięciu różnych roślin R0, testowano pod względem odporności przeciw M.euphorbiae.

Jedenaście do piętnastu siewek z każdej linii R2 zaszczepiono i oceniono zgodnie z opisem wprzykładzie 14. Wyniki ukazano w tabeli8. Jedna linia R2 segregowała w stosunku 3:1, a osiem linii R2 segregowało w stosunku 1:1. W tych dziewięciu liniach fenotyp odporności na mszyce ziemniaczana był jasno widoczny.

Pięć linii R2 okazało się całkowicie podatnych.

Pozostałe dziesięć linii R2 oceniono jako pośrednie: segregowały one w stosunku około 1:3. Wyniki te wskazują, że kilka roślin R1, które są odporne na Meloidogyne incognita i które pochodzą od roślin R0 transformowanych kosmidem Mi-11 posiada funkcjonalny gen odporności Meu-1.

Poza tym, osiem linii R1BC, które otrzymano od roślin R1 odpornych na nicienie, skrzyżowanych wstecznie z podatną linią pomidora 52201, testowano pod względem odporności przeciw M. euphorbiaew celupotwierdzenia odziedziczenia wprowadzonego genu odporności Meu-1.

Dwanaście do piętnastu siewek każdej linii R1BC zaszczepiono i oceniano zgodnie z opisem wprzykładzie 14. Wyniki ukazano w tabeli9.

Stosunki segregacji ukazane w tabeli8i tabeli9służąjedynie do ilustracji odziedziczalności fenotypu odporności.

T a b e l a 9

Kosmid	Liczba linii R2 niezależnych testowanych roślin R1
Całość	Stosunek segregacji R	: S (odporne do podatnych)
		1:0	3:1	1:1	0:1
Mi-11	0	1	8	10	5

T a b e l a 10

Kosmid	Liczba linii R1BC niezależnych testowanych roślin R1
Całość	Stosunek segregacji R	: S (odporne do podatnych)
		1:0	3:1	1:1	0:1
Mi-11	8	0	1	5	0

PL 191 777 B1

Przykład 16. Mapowanie transkryptów

Przeprowadzono badania mapowania transkryptów, w celu zmapowania końca 5' i 3' genu odporności Mi oraz w celu określenia, czy gen odporności Mi zawiera jakieś introny. W tym celu wykorzystano reakcję łańcuchową polimerazy do powielenia części transkryptów z genu odporności Mi.

Cały RNA z tkanki liścia odpornej odmianypomidora E22 wyizolowano zgodnie z metodą gorącego fenolu, jak opisano u Sambrooka i in. (w: Molecular Cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Poli A+ RNA wyizolowano przy użyciu biotynylowanego oligo(dT) związanego z Dynabeads M-280 Streptavidin (DYNALA. S., Oslo, Norwegia) zgodnie z instrukcjami producenta. Skonstruowano bibliotekę cDNAprzy użyciu zestawu Superscript RnaeH Reverse Transcriptase cDNA od Life technologies, Inc., Gaithersburg, MD, USA i protokołu dostarczonego przez producenta.

Produkty 5' i 3' RACE otrzymano przy użyciu zestawu do powielania Marathon cDNA od Clontech (Pało Alto, CA, USA). Stosowane primery zaplanowano na podstawie genomowej sekwencji Mi, azwłaszcza na końcu 5' sekwencji kodującej ORF2. Następnie klonowano różne fragmenty 5' i 3'-RACE do wektora kloningowego TA pCRII (Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USA) i sekwencjonowano przy użyciu standardowych protokołów. Uzyskane sekwencje nukleotydowe uszeregowano z genomową sekwencją o 9,9 kb i można było wywnioskować dwie sekwencje intronowe dla końca 5' genu odporności Mi. Jeden intron o 1306 nukleotydach leżał od pozycji nukleotydowej 1936 do 3241, adrugi intron od pozycji nukleotydowej 3305 do 3379 (fig. 5). Największy transkrypt Mi wykryty za pomocą zestawu do powielania Marathon cDNA mapuje na pozycji nukleotydowej 1880. Stąd wnioskujemy, że miejsce inicjacji transkrypcji Mi leży przy lub w górę od nukleotydu 1880. Pierwszy kodon ATG, który można wykryć w 5' cDNA leżał przy pozycji nukleotydowej 3263, 52 nukleotydy w górę od drugiego intronu i można było wielką otwartą ramkę odczytu (ORF1), kodującą polipeptydy o 1257 aminokwasach i ukazano ją nafig. 7A. Jako wynik, ten drugi intron leży między aminokwasami 14 i 15 produktu genu odporności mi.

Przykład 17. Analiza PCR roślin transformowanych Mi-11 iMi-18

Dane otrzymane dla analizy komplementacji w korzeniach transformowanych roślin (przykład 10) wskazują, że gen odporności Mi leżał na segmencie DNA, nakładającym się między kosmidami Mi-11 iMi-18, wyłączając segment DNA, odpowiadający kosmidowi Mi-30, którego wszystkie transformanty były podatne. Region ten oszacowano jako mający około 12 kb. Jednakże w analizie komplementacji na samopowielonym potomstwie transformowanych roślin, jedynie rośliny transformowane kosmidem Mi-11 oceniono jako odporne (przykłady 13 i 15). Aby odpowiedzieć na pytanie dlaczego rośliny transformowane Mi-18 oceniono jako podatne, przeprowadzono analizę PCR na obecność lub nieobecność przypuszczalnej Mi-ORF w roślinach transformowanych Mi-11 iMi-18.

Analizowano następujące próbki DNA:

1. Klon YAC 2/1256.

2-3. Kosmid Mi-11odpowiednio w E. coli i w A.tumefaciens.

4-5. Kosmid Mi-18 odpowiednio w E. coli i w A.tumefaciens.

6. Linię pomidora E22 (odporną).

7. Linię pomidora 52201 (podatną).

8-12. Pięć roślin transformowanych kosmidem Mi-11.

13-17. Pięć roślin transformowanych kosmidem Mi-18.

DNA trawiono Pstl i Pstl-adaptory poddano ligacji. Następnie przeprowadzono analizę PCR za pomocą primera, identyfikującego miejsce Pstl i trzy dodatkowe nukleotydy selektywne lub marker PM14 oraz różnych primerów PCR położonych w górę od PM14 przy użyciu enzymu polimerazy rTh (zestaw Gene Amp XL PCR; Perkin Elmer). Utworzone produkty posiadały wielkość, zmieniającą się od443 do 6110 bp i obejmują pełny region w górę od PM14 przypuszczalnej Mi-ORF (patrz fig. 6).

Okazało się, że wszystkie matryce wytworzyły produkty PGR o oczekiwanej wielkości, z wyjątkiem pięciu roślin transformowanych kosmidem Mi-18. Utworzył się tylko najmniejszy produkt PGR (443 bp). Dane te wskazują, że prawie pełny region w górę od PM14 nie był obecny w roślinach transformowanych kosmidem Mi-18. Delecje te nie występują przy kosmidzie Mi-18 obecnym w E. coli lub A.tumefacienslecz występują tylko w transformowanych roślinach. Skutkiem tego, wnioskujemy, że te delecje są odpowiedzialne za fenotyp podatności na Meloidogyne incognita i/lub Macrosiphum euphorbiae roślin transformowanych Mi-18.

PL 191 777 B1

P r z y k ł a d 18. Sekwencja nukleotydowa kosmidu Mi11

Obserwacja, że tylko rośliny transformowane kosmidem Mi-11 wykazywały fenotyp odporności, mogła wskazywać, że dodatkowe otwarte ramki odczytu obecne na Mi-11 mogły prawdopodobnie kodować odporność przeciw nicieniom i/lub mszycom. Dlatego określono sekwencję nukleotydową regionu w górę od postulowanej ORF1, w celu identyfikacji dodatkowych otwartych ramek odczytu.

Wyizlowano zbiór losowych subklonów o wielkości insertu 2 kb, przy użyciu fragmentu Pstl o 2,1, 4,7 i 2,9 kb klonu kosmidu Mi-11 jako sondy hybrydyzacji w hybrydyzacji kolonii, zasadniczo jak opisano w przykładzie 11. Do określenia sekwencji DNA użyto czterdzieści dziewięć dodatnich klonów, stosując standardowe primery sekwencjonujące o kierunku zgodnym i odwrotnym. Montowanie i analizę sekwencji przeprowadzono zasadniczo jak opisano w przykładzie 11. Można było wywnioskować trzy przylegające odcinki DNA o wielkości 5618 bp (con25), 898 bp (con10) i 2495 bp (con62). Przerwy między tymi odcinkami DNA oraz sekwencje DNA o 9870 bp, zawierającą przypuszczalną Mi-ORF (fig. 6), obliczono przy użyciu PGR i zmieniała się w zakresie 50-200 bp. Trzy określone części przylegania (con25, con10 i con62) analizowano pod względem rozmieszczenia kodonów przestankowych we wszystkich sześciu możliwych ramkach. Nie można było założyć żadnej istotnej ramki ORF o wielkości 120 lub więcej aminokwasów. Poza tym nie wykryto żadnej homologii DNA z przypuszczalną ORF1. Skutkiem tego, jedyną znaczącą ORF obecną na kosmidzie Mi-11 była ORF1, jak opisano na fig. 5. Na podstawie tych wyników, można wnioskować, że polinukleotyd kodowany przez ORF1 nadaje odporność na nicienie jak również na mszyce i stąd, że gen odporności Mi oraz gen odporności Meu-1 odnoszą się do tej samej sekwencji kodującej, jaką opisano na fig. 5.

P r z y k ł a d 19. Transformacja tytoniu i analizy komplementacji

Transformacja tytoniu

Odmianę tytoniu Petit Havana typu SR1 transformowano kosmidem Mi-11 lub wektorem kosmidowym pJJ04541, przy użyciu protokołu opisanego u Horscha i in., (Science 227, 1229-1231, 1985).

Analiza komplementacji: skrining pod względem odporności na nicienie w kulturach korzeniowych transformowanych roślin tytoniu. Korzenie hodowanych in vitro transformowanych roślin R0 poddano testowi chorobowemu jak opisano w przykładzie 1. Z każdego z 31 transformantów przetestowano dwa lub więcej przeszczepy korzeniowe. Oprócz tego analizowano wszystkie 17 transformantów Mi-11 przez PGR pod względem obecności przypuszczalnej ORF1 Mi przez skrining pod względem integralnego fragmentu o wielkości 823 par zasad (w zakresie pozycji nukleotydowej 4824 do 5646, patrz fig. 5). Pojedyncze primery PGR dla fragmentu wnioskowano z sekwencji, jak ukazano na fig. 5. Użyte primery miały następujące sekwencje:

primer S21 5'-CCAAGGACAGAGGTCTAATCG-3' primer S22: 5'-TTGAGGTGATGTGGTAAATGG-3'

Primer S21 celuje w sekwencję od pozycji nukleotydu 4824 do 4844, a primer S22 celuje w sekwencję od pozycji nukleotydu 5626 do 5646 (patrz fig. 5).

Wyniki testu chorobowego in vitro oraz analiza PGR (obecność „+” lub nieobecność „-” wewnętrznego fragmentu PCR) ukazano w tabeli 10. „Mi-11” reprezentuje rośliny transformowane, zawierające przypuszczalną Mi ORF1, a „Mi-11A” reprezentuje te transformowane rośliny, które posiadają delecję w przypuszczalnej Mi ORF1, jak określono przez analizę PCR (opisaną powyżej). Dwadzieścia dziewięć transformantów R0 było podatnych, ponieważ zgrubienia utworzyły się na co najmniej jednej z testowanych kultur korzeniowych. Ogólnie, tempo tworzenia zgrubień na korzeniach tytoniu jest nieco niższe niż na korzeniach podatnych pomidorów. Dwie rośliny R0 oceniono jako odporne na Meloidogyne incognita, ponieważ nie znaleziono zgrubień na kulturach korzeniowych. Obie odporne rośliny transformowano kosmidem Mi-11, zawierającym wewnętrzny fragment PGR, wskazujący na obecność genu odporności Mi.

T a b e l a 11

Genotyp	Fragment PGR	Rośliny Rq
Odporne	Podatne
Mi-11	+	2	7
ΜΪ-11Δ	-	0	8
pJJ04541	-	0	14

PL 191 777 B1

Analiza komplementacji: skrining pod względem odporności na mszyce w odcinkach transformowanych roślin tytoniu.

Ukorzenione odcinki transformowanych roślin R0 zaszczepiono i oceniono zgodnie z opisem w przykładzie 14. Z każdego z 23 transformantów, dwa lub trzy odcinki testowano pod względem odporności przeciw Macrosiphum euphorbiae. Wyniki testu chorobowego i analizy PGR (jak opisano powyżej) ukazano w tabeli 11. Dwadzieścia jeden roślin R0 uznano na podatne, ponieważ zliczono kilka żywych mszyc na co najmniej jednym testowanym odcinku. Ogólnie, poziom namnażania mszyc na tytoniu jest niski w porównaniu z namnażaniem na podatnych roślinach pomidora. Dwie rośliny R0 oceniono jako odporne, ponieważ na żadnym odcinku z tych roślin nie było żywych mszyc. Rośliny odporne na mszyce transformowano kosmidem Mi-11, zawierającym gen odporności Mi, jak zaznaczono przez obecność wewnętrznego fragmentu PGR.

T a b e l a 12

Genotyp	Fragment PGR	Rośliny R0
Odporne	Podatne
Mi-11	+	2	3
Mi-1^	-	0	6
pJJ04541	-	0	12

Pr zy kł a d 20. Transformacja ziemniaka i analizy komplementacji

Transformacja ziemniaka

Do transformacji użyto ziemniaka odmiany Diamant (Cebecco Zaden B. V., Vlijmen, Holandia). Przeszczepy międzywęźli roślin hodowanych in vitro transformowano kosmidem Mi-11 lub wektorem kosmidowym pJJ04541 stosując protokół opisany przez Oomsa i in., (Theor. Appl. Genet. 73, 744-750).

Analiza komplementacji: skrining pod względem odporności na nicienie w kulturach korzeniowych transformowanych roślin.

Korzenie hodowanych in vitro transformowanych roślin R0 poddano testowi chorobowemu zgodnie z opisem w przykładzie 1. Z każdego z 31 transformantów testowano co najmniej dwa przeszczepy korzeniowe.

Oprócz tego, analizowano wszystkie 26 transformantów Mi-11 przez PGR stosując primery S21 i S22 jak opisano w przykładzie 19. Wyniki testu chorobowego in vitro oraz analiza PGR (obecność „+” lub nieobecność „-” wewnętrznego fragmentu PGR) ukazano w tabeli 12. „Mi-11” reprezentuje rośliny transformowane, zawierające przypuszczalną Mi ORF1, a „Mi-11A” reprezentuje te transformowane rośliny, które posiadają delecję w przypuszczalnej Mi ORF1, jak określono przez analizę PGR (opisaną powyżej). Dwadzieścia osiem transformantów R0 było podatnych, ponieważ zgrubienia utworzyły się na co najmniej jednej z testowanych kultur korzeniowych. Ogólnie, tempo tworzenia zgrubień na korzeniach ziemniaka jest nieco niższe niż na korzeniach podatnych pomidorów. Trzy rośliny R0 oceniono jako odporne na Meloidogyne incognita, ponieważ nie znaleziono zgrubień na kulturach korzeniowych. Wszystkie odporne rośliny transformowano kosmidem Mi-11, zawierającym wewnętrzny fragment PGR, wskazującego na obecność genu odporności Mi.

T a b e l a 13

Genotyp	Fragment PGR	Rośliny R0
Odporne	Podatne
Mi-11	+	3	17
Mi-1^	-	0	6
pJJ04541	-	0	5

PL 191 777 B1

Analiza komplementacji: skrining pod względem odporności na nicienie w odcinkach transformowanych roślin.

Ukorzenione odcinki roślin R0 transformowanych Mi-11 ziemniaka poddano testowi chorobowemu zgodnie z opisem w przykładzie 12. Z każdego z 19 transformantów testowano jeden do trzech odcinków pod względem odporności przeciw Meloidogyne incognita. Wyniki ukazano w tabeli 13. Oprócz tego, testowano 36 ukorzenionych odcinków nie transformowanych roślin ziemniaka (odmiana Diamant) (jako kontrole podatne) i wszystkie były podatne. Jedną roślinę R0 oceniono jako odporną na Meloidogyne incognita, ponieważ nie znaleziono zgrubień na systemie korzeniowym.

T a b e l a 14

Genotyp	Fragment PGR	Rośliny Rq
Odporne	Podatne
Mi-11	+	1	12
Mi-1^	-	0	6
pJJ04541	-	0	1

Zastrzeżenia patentowe

Claims (45)

1 . Izolowany kwas nukleinowy, którego sekwencją jest sekwencja DNA przedstawiona na fig. 5 lub jego część albo sekwencja DNA homologiczna do sekwencji DNA z fig. 5, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest zdolny, po przeniesieniu do rośliny gospodarza podatnej na patogen roślinny do uczynienia tej rośliny gospodarza odporną na patogen rośliny.

2. Kwas nukleinowy, według zastrz. 1, znamienny tym, że cDNA odpowiada kwasowi nukleinowemu, którego sekwencja DNA jest co najmniej w części sekwencją DNA przedstawioną na fig. 5.

3. Kwas nukleinowy według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że po przeniesieniu do rośliny gospodarza, jest zdolny do uczynienia tej rośliny odporną na nicienie.

4. Kwas nukleinowy według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że po przeniesieniu do rośliny gospodarza, jest zdolny douczynienia tej rośliny odporną na mszyce.

5. Kwas nukleinowy według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że po przeniesieniu do rośliny gospodarza, jest zdolny do uczynienia tej rośliny odporną na nicienie i mszyce.

6. Kwas nukleinowy, według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja DNA odpowiada sekwencji rozpoczynającej się przy nukleotydzie 3263 i kończącej się przy nukleotydzie 7111 sekwencji z fig. 5lub jakiejkolwiek sekwencji DNA do niej homologicznej.

7. Kwas nukleinowy, według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja DNA odpowiada sekwencji promotorowej leżącej w kierunku 5' przed nukleotydem 3263 lub jakiejkolwiek sekwencji homologicznej do niej.

8. Kwas nukleinowy według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że wymieniona sekwencja DNA odpowiada co najmniej części genomowego insertu obecnego w kosmidzie Mi-11 lub jakiejkolwiek sekwencji DNA do niej homologicznej.

9. Kwas nukleinowy, znamienny tym, że ma wielkość wystarczającą do selektywnej hybrydyzacji z sekwencją DNA jak zdefiniowano w zastrz. 1, w surowych warunkach hybrydyzacji.

10. Kwas nukleinowy według zastrz. 9, znamienny tym, że sekwencja DNA,z którą hybrydyzuje wspomniany kwas nukleinowy odpowiada sekwencji, która rozpoczyna się przy nukleotydzie 6921 i kończy się przy nukleotydzie 7034.

11. Kwas nukleinowy według zastrz. 10, znamienny tym, że wymieniona sekwencja DNA leży przy końcu 3' sekwencji hybrydyzacji i korzystnie odpowiada sekwencji 5'-TAATCT-3', która może inicjować syntezę DNA.

12. Kwas nukleinowy według zastrz. 10, znamienny tym, że wymieniona sekwencja DNA leży przy końcu 3' sekwencji hybrydyzacji i korzystnie odpowiada sekwencji 5'-TGCAGGA-3', która może inicjować syntezę DNA.

13. Rekombinowany konstrukt DNA, obejmujący kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 1.

PL 191 777 B1

14. Rekombinowany konstrukt DNA według zastrz. 13, znamienny tym, że kwas nukleinowy znajduje się pod kontrolą promotora, który funkcjonuje w komórce roślinnej, przy czym wymieniony promotor jest albo endogenny, albo egzogenny wobec wymienionej komórki roślinnej i skutecznie kontroluje transkrypcję tej sekwencji DNAw takiej komórce roślinnej.

15. Rekombinowy konstrukt DNA według zastrz. 14, znamienny tym, że promotor odpowiada sekwencji promotorowej leżącej w kierunku 5' przed nukleotydem 3263, jak opisano na fig. 5 lub jakiejkolwiek sekwencji DNAdo niej homologicznej.

16. Wektor odpowiedni do transformowania komórek roślinnych, obejmujący rekombinowany konstrukt DNA jak zdefiniowano w zastrz. 13.

17. Plazmid pKGMi-11 opatrzony numerem depozytowym CBS 822.96., zawierający kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 13.

18. Plazmid pKGMi-18 opatrzony numerem depozytowym CBS 821.96., zawierający rekombinowany kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 13.

19. Komórka bakterii, zawierająca wektor jak zdefiniowano w zastrz. 16.

20. Komórka bakterii, zawierająca plazmid jak zdefiniowano w zastrz. 17.

21. Komórka bakterii, zawierająca plazmid jak zdefiniowano w zastrz. 18.

22. Rekombinowany genom rośliny, obejmujący włączony do niej konstrukt DNA jak zdefiniowano w zastrz. 13.

23. Rekombinowany genom roślinny według zastrz. 22, znamienny tym, że jest w środowisku komórkowym rośliny.

24. Komórki roślinne, zawierające konstrukt DNA jak zdefiniowano w zastrz 13.

25. Roślina, zawierająca komórki roślinne jak zdefiniowano w zastrz. 24.

26. Roślina według zastrz. 25, znamienna tym, że posiada zmniejszoną podatność na nicienie.

27. Roślina według zastrz. 26, znamienna tym, że wymieniony nicień jest nicieniem węzłów korzeniowych, zwłaszcza Meloidogyne incognita.

28. Roślina według zastrz 25, znamienna tym, że posiada zmniejszoną podatność na mszyce, zwłaszcza na Macrosiphum euphorbiae.

29. Nasiona transgeniczne, zawierające rekombinowany konstrukt DNA jak zdefiniowano w zastrz. 13.

30. Sposób otrzymywania roślin, mających zmniejszoną podatność na patogen, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

i) wprowadzenie do genomu komórki roślinnej konstruktu DNA jak zdefiniowano w zastrz. 13, ii) uzyskanie transformowanych komórek roślinnych, iii) regenerowanie z wymienionych komórek roślinnych genetycznie transformowanych roślin, iv) i ewentualnie, rozmnożenie wymienionych roślin.

31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że wymieniony patogen jest nicieniem, korzystnie nicieniem węzłów korzeniowych, zwłaszcza Meloidogyne incognita.

32. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że wymieniony patogen jest mszycą, a korzystnie Macrosiphum euphorbiae.

33. Sposób zabezpieczania roślin uprawnych przed zakażeniem patogenem, który obejmuje:

i) wprowadzenie do genomu komórki roślinnej konstruktu DNA jak zdefiniowano w zastrz. 13, ii) otrzymanie transformowanych roślin; i iii) hodowlę transformowanych roślin.

34. Sposób izolowania kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

i) skrining biblioteki genomowej lub cDNA rośliny za pomocą sekwencji DNA jak zdefiniowano w zastrz. 1, ii) identyfikację klonów pozytywnych, które hybrydyzują z wymienioną sekwencją DNA, iii) izolację wymienionych klonów pozytywnych.

35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że wymieniona biblioteka pochodzi z pierwszej rośliny, a sekwencja DNA należy do drugiej rośliny.

36. Sposób identyfikacji kwasu nukleinowego zdefiniowanego w zastrz. 1, znamienny tym, że używa się kombinacji primerów identyfikujących co najmniej jeden z markerów AFLP PM02 do PM29, jak opisano w tabeli 3.

37. Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że wymieniona kombinacja primerów identyfikuje marker AFLP PM14.

PL 191 777 B1

38. Kombinacja primerów, obejmująca pierwszy izolowany kwas nukleinowy jak zdefiniowano wzastrz. 11.

39. Kombinacja primerówwedług zastrz. 38, znamienna tym, że zawiera drugi izolowany kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 12.

40. Zestaw diagnostyczny obejmujący co najmniej jeden izolowany kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 9.

41. Zestaw diagnostyczny obejmujący kombinacje primerów jak zdefiniowano w zastrz. 38.

42.Sposób detekcji obecności lub nieobecności sekwencji DNA jak zdefiniowano w zastrz. 1, szczególnie w DNA rośliny przy użyciu zestawu diagnostycznego jak zdefiniowano w zastrz. 40.

43. Polipeptyd, który jest produktem ekspresji kwasu nukleinowego rekombinowanego DNA jak zdefiniowano w zastrz. 1.

44. Polipeptyd, mający sekwencję aminokwasową o sekwencji przedstawionej w fig. 7A lub kodowany przez odpowiadającą homologiczną sekwencję jak zdefiniowano w zastrz. 1.

45. RNA, mający sekwencję kwasu rybonukleinowego transkryptu części lub całości sekwencji DNA jak zdefiniowano w zastrz. 1.