PL191861B1 - Sposób długoterminowej konserwacji cząsteczek DNA i opakowanie konserwujące - Google Patents

Abstract

1. Sposób dlugoterminowej konserwacji czasteczek DNA, znamienny tym, ze obejmuje etapy ekstrakcji i oczyszczenia DNA; i zakap- sulkowania czasteczki DNA w szczelnej metalo- wej kapsulce odpornej na korozje, przy czym zakapsulkowanie prowadzi sie w warunkach nieobecnosci tlenu, w atmosferze zlozonej z jednego lub kilku obojetnych gazów majacych stopien wilgotnosci mniejszy lub równy 1 ppm wody. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób długoterminowej konserwacji cząsteczek DNA i opakowanie konserwujące.

Niniejszy wynalazek dotyczy konserwacji cząsteczki DNA w szczególności pochodzenia ludzkiego, która niesie geny charakterystyczne dla każdego osobnika, to znaczy jego dziedzictwo genetyczne.

Celem wynalazku jest ochrona informacji genetycznej przez konserwację cząsteczki DNA w możliwie długim czasie i w warunkach zachowania integralności informacji genetycznej. Ten wynalazek jest interesujący w szczególności dla medycyny zapobiegawczej, dla genealogii genetycznej i identyfikacji.

Jeżeli cząsteczka DNA jest stosunkowo stabilna, badania archeogenetyczne wykazały, że może być ona zachowana przez miliony lat w korzystnym otoczeniu, może jednak ulegać degradacji przy braku konserwacji w takim środowisku.

Wśród przyczyn zmian DNA można wymienić działanie promieniowania jonizującego takiego jak promieniowanie rentgenowskie i gamma, działanie promieni ultrafioletowych, utlenianie i hydrolizę enzymatyczną lub chemiczną.

Niniejszy wynalazek ma na celu dostarczenie techniki konserwacji DNA w środowisku chroniącym go od efektów powyższych działań.

Sposób długoterminowej konserwacji cząsteczek DNA według wynalazku, obejmuje etapy ekstrakcji i oczyszczenia DNA; i zakapsułkowania cząsteczki DNA w szczelnej metalowej kapsułce odpornej na korozję, przy czym zakapsułkowanie prowadzi się w warunkach nieobecności tlenu, w atmosferze złożonej z jednego lub kilku obojętnych gazów mających stopień wilgotności mniejszy lub równy 1 ppm wody.

Korzystnie przed kapsułkowaniem fizycznym, DNA poddaje się kapsułkowaniu chemicznemu przez otoczenie odpowiednim (ko)polimerem.

Bardziej korzystnie kapsułkowanie chemiczne przeprowadza się stosując hybrydę złożoną z tego (ko)polimeru, i z organicznych cząsteczek i/lub nieorganicznych soli, w celu wzmożonej ochrony DNA przed promieniowaniem ultrafioletowym lub jonizującym. Jeszcze bardziej korzystnie hybryda jest złożona z (ko)polimeru i jonów metali ciężkich.

Korzystnie (ko)polimer i jego ewentualne dodatki organiczne lub nieorganiczne są rozpuszczone w rozpuszczalniku, który następnie odparowuje się do uzyskania lepkiego żelu, po czym wcześniej określoną próbkę DNA w zawiesinie w roztworze alkoholowym umieszcza się w żelu i całość suszy się w odpowiedniej temperaturze w celu uzyskania stałej bryły zawierającej DNA. Bardziej korzystnie po kapsułkowaniu chemicznym następuje kapsułkowanie w zapieczętowanej, metalowej odpornej na korozję kapsułce 1, w atmosferze złożonej z jednego lub kilku obojętnych gazów.

Korzystnie i niezależnie od tego czy przeprowadza się kapsułkowanie chemiczne, czy nie, kapsułkowanie fizyczne jest uzupełniane przez umieszczenie tej metalowej kapsułki 1 w szczelnym pojemniku 2 odpornym na wstrząsy i zgniecenie.

Korzystnie DNA przed jego kapsułkowaniem w kapsułce metalowej 1 umieszcza się w naczynku szklanym.

Tak kapsułkowany DNA może być teoretycznie zachowany przez wiele dziesiątków tysięcy lat, chroniony przed promieniowaniem jonizującym, ultrafioletowym, agresją chemiczną i naprężeniami mechanicznymi.

W zakres wynalazku wchodzi też opakowanie konserwujące do długotrwałej konserwacji cząsteczek DNA, które składa się z kapsułki 1 z ciągliwego metalu lub stopu metalicznego odpornego na korozję i niezanieczyszczającego DNA, zamkniętej szczelnie wieczkiem dowolnym odpowiednim sposobem, szczególnie przez obciskanie przez rolowanie. W korzystnym opakowaniu kapsułka 1 jest zamknięta w pojemniku 2 z materiału wybranego z grupy obejmującej ceramikę, kompozyty, metale, polimery. Korzystnie opakowanie zawiera wewnątrz metalowej kapsułki 1 naczynko ze szkła 3, w którym jest umieszczony DNA. Korzystnie naczynko 3 jest wykonane ze szkła sodowo-wapniowego.

Wewnątrz kapsułki przechowywana jest ilość DNA na przykład 30 mg, wystarczająca do pobrania znacznej ilości próbek w dowolnym momencie.

DNA jest osadzony bezpośrednio na kapsułce lub na naczynku ze szkła wprowadzonym do kapsułki.

PL 191 861 B1

Przy każdym pobraniu próbki kapsułkę otwiera się i pobiera się pożądaną ilość DNA, a resztę pozostawia się w kapsułce, przywracając szczelne warunki. Pobrany DNA następnie uwadnia się w celu analizy.

Takie opakowanie jest w stanie zapewnić wieczną konserwację dziedzictwa genetycznego, które jest chronione szczególnie przed utlenieniem i promieniowaniem jonizującym lub ultrafioletowym jak i innymi atakami chemicznymi i mechanicznymi.

Inne właściwości i korzyści wynikają z następującego opisu wykonania wynalazku, który jest przedstawiony tylko jako przykład i w odniesieniu do załączonego rysunku, na którym schematycznie pokazano strukturę opakowania według wynalazku.

Ekstrakcję i oczyszczenie DNA można przeprowadzić dowolną konwencjonalną metodą. DNA można wyekstrahować z dowolnych komórek organizmu.

Przykładowo DNA ekstrahuje się z krwi lub cebulek włosowych, komórek pochodzących ze śliny, śluzówki lub komórek skóry. Następnie przeprowadza się proces oczyszczania w kilku etapach, to znaczy: dezagregacji komórek, eliminacji białek przez trawienie enzymatyczne, izolacji/ekstrakcji DNA, amplifikacji przez polimeryzację, i przechowywania z ochroną przed czynnikami zmieniającymi.

Tak przygotowany DNA jest w postaci osadu w alkoholu.

Protokół powyższy jest dobrze znany i może być zastąpiony dowolnym innym sposobem, znanym lub nowym.

DNA po ekstrakcji i oczyszczeniu zgodnie z wynalazkiem umieszcza się w kapsułce metalowej, szczelnej i odpornej na korozję. Takie kapsułkowanie, określane jako fizyczne, jest przeprowadzane w atmosferze złożonej z jednego lub kilku gazów obojętnych, takich jak gazy szlachetne i mających bardzo niski stopień wilgotności, korzystnie poniżej 1 ppm wody.

Pożądany stopień wilgotności uzyskuje się za pomocą konwencjonalnej suszarki.

Kapsułka przedstawiona schematycznie jako 1 na figurze 1 załączonego rysunku jest na przykład kapsułką ze złota uformowaną jako mała kolista miseczka zamknięta na prasie wieczkiem obciśniętym dookoła obwodu miseczki.

Średnica złotej kapsułki jest na przykład rzędu 5 mm i jej grubość wynosi 2 do 3 mm.

Szczelne połączenie miseczki i jej wieczka można wykonać w dowolny odpowiedni sposób.

Złoto jest korzystne ze względu na jego kowalność i właściwość nie podlegania utlenianiu i nie zanieczyszczania DNA. Jako modyfikację można stosować stop na bazie złota lub platyny.

Atmosferę podczas kapsułkowania suszy się, aby uniknąć hydrolizy i utleniania DNA po jego szczelnym zamknięciu.

Ilość DNA umieszczana w kapsułce, na przykład około trzydzieści mikrogramów jest z nadwyżką wystarczającą, aby można było przeprowadzić znaczną liczbę odrębnych pobrań DNA z kapsułki w czasie jego przechowywania.

Takie opakowania mogą zapewnić wieczną konserwację dziedzictwa genetycznego w ciągu dziesiątków, a nawet setek tysięcy lat, o ile oczywiście kapsułka pozostanie nienaruszona.

To opakowanie chroni DNA w szczególności przed:

- reakcjami hydrolizy chemicznej lub enzymatycznej;

- cięciami powodowanymi przez promieniowanie ultrafioletowe lub dowolne promieniowanie jonizujące takie jak promienie rentgenowskie lub promieniowanie gamma;

- utlenianiem przez tlen z powietrza.

Korzystnie, aby wzmocnić konserwację DNA, kapsułkę 1, to znaczy wymienioną kapsułkę ze złota, samą zamyka się w szczelnym pojemniku 2 z materiału mającego dobre właściwości mechaniczne, aby lepiej chronić kapsułkę 1 przed mechanicznymi agresjami, w szczególności wibracjami, wstrząsami i zgnieceniem, lub dowolną inną agresją, na przykład poprzez zwiększenie temperatury i w sposób ogólny chroni tę kapsułkę przed środowiskiem, normalnym lub nienormalnym.

Pojemnik 2 może być rodzajem małego pudełka z dwóch części 2a, 2b, połączonych szczelnie lub scalonych w dowolny sposób by zapewnić integralność i szczelność całości.

Przykładowo pojemnik 2 może być z odpowiedniego materiału na przykład ceramicznego, kompozytu, metalu lub polimeru.

Według innego wykonania sposobu według wynalazku odpowiednio przygotowany DNA przed umieszczeniem w kapsułce 1 jest poddany kapsułkowaniu zwanemu chemicznym.

W tym celu DNA otacza się polimerem lub kopolimerem obojętnym w stosunku do DNA, w celu wzmocnienia ochrony w stosunku do czynników zmieniających DNA, a cząsteczki DNA są chronione w porach (ko)polimeru.

PL 191 861 B1

Materiał otaczający jest tak dobrany, że może być w końcu rozpuszczony, aby można było odzyskać cząsteczki DNA.

Można stosować dowolny (ko)polimer, poza tymi, które mogą reagować z cząsteczką DNA, tymi, które będą zapobiegać rozpuszczaniu DNA i tymi, które wymagają do takiego rozpuszczenia rozpuszczalnika kwaśnego, to znaczy mającego pH mniejsze lub równe około 4.

Można przeprowadzić takie chemiczne kapsułkowanie umieszczając odpowiednio przygotowany DNA, na przykład osad DNA uzyskany przez strącenie, w roztworze kwasu akrylowego lub poliakrylowego w alkoholu metylowym.

₃

Na przykład umieszcza się 1 g kwasu akrylowego lub poliakrylowego w roztworze 50 cm³ alkoholu metylowego. Alkohol odparowuje się powoli do uzyskania lepkiego żelu. Około 1 mm³ osadu DNA zawiesza się w roztworze alkoholowym i umieszcza się w środku tego żelu.

Całość suszy się w 50°C aż do uzyskania stałego bloku zawierającego DNA, który następnie umieszcza się w kapsułce 1 według sposobu opisanego powyżej, z tą różnicą, że nie jest już potrzebna suszarka, przy utrzymaniu obojętnej atmosfery.

Ostatecznie i w dowolnym momencie po otwarciu otoczek 1 i 2, DNA może być odkapsułkowany przez zanurzenie przez 1 godzinę w alkoholu etylowym. Uzyskuje się ponownie próbkę cząsteczek identycznych z tymi otrzymanymi w sposobie oczyszczania.

Według innego przykładu, w którym stosuje się inny (ko)polimer przygotowuje się roztwór 1 g metakrylanu lub polimetakrylanu metylu rozpuszczonego w 50 cm³ dichlorometanu. Rozpuszczalnik ₃ odparowuje się aż do uzyskania lepkiego żelu. Próbkę około 1 mm³ DNA w zawiesinie w roztworze alkoholowym umieszcza się w środku żelu. Całość suszy się w 50°C aż do uzyskania stałego bloku zawierającego DNA, który następnie umieszcza się w kapsułce 1 w tych samych warunkach jak w poprzednim przykładzie.

Następnie i w dowolnym momencie po otwarciu otoczki 1 i 2, wyjściowy DNA może być regenerowany przez rozpuszczenie (ko)polimeru dichlorometanem.

Według wariantu kapsułkowania chemicznego, (ko)polimer jest zasocjowany z cząsteczkami organicznymi i/lub solami nieorganicznymi w celu lepszej ochrony przed promieniowaniem ultrafioletowym i promieniowaniem jonizującym. Do (ko)polimeru można dodać jony metali ciężkich o ile nie ma ryzyka uszkodzenia DNA.

₃

Według jednego przykładu rozpuszczono 1 g akryloamidu lub poliakryloamidu w 25 cm³ wody destylowanej. Do roztworu dodano 50 mg octanu miedzi i 50 mg octanu cynku. Wodę odparowano ₃ powoli aż do uzyskania lepkiego żelu. Próbkę około 1 mm³ DNA w zawiesinie w roztworze alkoholowym wprowadzono do żelu. Całość suszono w 50°C aż do uzyskania stałego bloku zawierającego DNA, który następnie umieszczano w kapsułce 1 w tych samych warunkach jakw poprzednich przykładach.

Należy zauważyć, że kapsułkowanie chemiczne w (ko)polimerze ma zaletę, że podczas polimeryzacji powstają pojedyncze kulki, co czyni bardziej praktycznym dalsze pobieranie DNA, ponieważ wystarczy pobrać z kapsułki jedną kulkę bez dotykania pozostałych.

Jako przydatny polimer do stosowania według wynalazku można też wymienić agarozę.

Wynalazek oczywiście nie jest ograniczony do sposobów wykonania przedstawionych powyżej ale wręcz przeciwnie, obejmuje wszystkie modyfikacje, w szczególności odnoszące się do natury materiałów, z których składają się kapsułki 1 lub pojemniki 2, warunków kapsułkowania fizycznego i chemicznego, natury (ko)polimeru do kapsułkowania chemicznego i jego ewentualnych dodatków, jak i kształtu i wymiarów tych kapsułek 1 lub pojemników 2.

Zatem jako modyfikację DNA można umieścić na naczynku szklanym, szczególnie ze szkła sodowo-wapniowego 3 jak pokazano schematycznie na figurze 2 załączonego rysunku.

DNA przylega do szklanego naczynka 3, które przykładowo może mieć średnicę 7 mmi wysokość 1,2 mm, a naczynko jest zamknięte w sposób szczelny w kapsułce 1.

Claims (12)

1. Sposób długoterminowej konserwacji cząsteczek DNA, znamienny tym, że obejmuje etapy ekstrakcji i oczyszczenia DNA; i zakapsułkowania cząsteczki DNA w szczelnej metalowej kapsułce odpornej na korozję, przy czym zakapsułkowanie prowadzi się w warunkach nieobecności tlenu, w atmosferze złożonej z jednego lub kilku obojętnych gazów mających stopień wilgotności mniejszy lub równy 1 ppm wody.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed kapsułkowaniem fizycznym, DNA poddaje się kapsułkowaniu chemicznemu przez otoczenie odpowiednim (ko)polimerem.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że kapsułkowanie chemiczne przeprowadza się stosując hybrydę złożoną z (ko)polimeru i z organicznych cząsteczek i/lub nieorganicznych soli, w celu wzmożonej ochrony DNA przed promieniowaniem ultrafioletowym lub jonizującym.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że hybryda jest złożona z (ko)polimeru i jonów metali ciężkich.

5. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że (ko)polimer i jego ewentualne dodatki organiczne lub nieorganiczne rozpuszcza się w rozpuszczalniku, który następnie odparowuje się do uzyskania lepkiego żelu, po czym wcześniej określoną próbkę DNA w zawiesinie w roztworze alkoholowym umieszcza się w żelu i całość suszy się w odpowiedniej temperaturze w celu uzyskania stałej bryły zawierającej DNA.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że po kapsułkowaniu chemicznym następuje kapsułkowanie w zapieczętowanej, metalowej odpornej na korozję kapsułce (1), w atmosferze złożonej z jednego lub kilku obojętnych gazów.

7. Sposób według zastrz. 1 albo 6, znamienny tym, że kapsułkę (1) umieszcza się w szczelnym pojemniku (2) opornym na wstrząsy i zgniecenie.

8. Sposób według zastrz. 1 albo 6, znamienny tym, że DNA przed jego kapsułkowaniem w kapsułce metalowej (1) umieszcza się w naczynku szklanym.

9. Opakowanie konserwujące do długotrwałej konserwacji cząsteczek DNA, znamienne tym, że składa się z kapsułki (1) z ciągliwego metalu lub stopu metalicznego odpornego na korozję i niezanieczyszczającego DNA, zamkniętej szczelnie wieczkiem dowolnym odpowiednim sposobem, szczególnie przez obciskanie przez rolowanie.

10. Opakowanie według zastrz. 9, przystosowane do przeprowadzenia sposobu określonego w zastrz. 7, znamienne tym, że kapsułka (1) jest zamknięta w pojemniku (2) z materiału wybranego z grupy obejmującej ceramikę, kompozyty, metale, polimery.

11. Opakowanie według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że zawiera wewnątrz metalowej kapsułki (1) naczynko szklane (3), w którym jest umieszczony DNA.

12. Opakowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że naczynko (3) jest wykonane ze szkła sodowo-wapniowego.