PL192924B1

PL192924B1 - Szczep z rodzaju Lactobacillus i produkt zawierający ten szczep

Info

Publication number: PL192924B1
Application number: PL341010A
Authority: PL
Inventors: Torkel Wadström; Per Aleljung; Ulla Svensson; Rangne Fonden
Original assignee: Arlafoods Amba
Priority date: 1997-12-08
Filing date: 1998-12-08
Publication date: 2006-12-29
Also published as: JP4247458B2; SE9704577D0; SE9704577L; DK1036160T3; RU2205871C2; ATE318889T1; HUP0100428A2; PT1036160E; WO1999029833A1; HU228050B1; NO326833B1; EP1036160A1; EE04724B1; ES2255195T3; HUP0100428A3; NO20002919D0; EE200000339A; CZ300143B6; DE69833691D1; US6599504B1

Abstract

1. Szczep z rodzaju Lactobacillus uzyteczny jako probiotyczny skladnik produktów spozyw- czych i leków naturopatycznych, in vitro oporny na kwas solny i sok zoladkowy, tolerujacy sole kwasów zólciowych bez ich dekoniugowania, z silna ich asymilacja, o wielkiej zdolnosci asymilo- wania cholesterolu, wykazujacy dobra przezywalnosc przy przemieszczaniu sie przez zoladek i przewód zoladkowo-jelitowy, o optymalnej temperaturze rozwoju wynoszacej 37°C, znamienny tym, ze stanowi Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, LMG P-17806, zdeponowany w Belgian Coordinated Collections zgodnie z postanowieniami Ukladu Budapesztenskiego, bedacy bakteria Gram-dodatnia, homofermentatywna, o ksztalcie paleczek, zdolna do wytwarzania kwasu L-mleko- wego, oraz tym, ze zawiera trzy plazmidy o wielkosci wynoszacej, odpowiednio, 2,2, 4,36 i 9,1 kz. 2. Szczep wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jego zawartosc GC wynosi 44%. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek niniejszy dotyczy szczepu z rodzaju Lactobacillus i produktu zawierającego ten szczep. Produkt zawierający szczep Lactobacillus jest przeznaczony do stosowania w składzie produktów spożywczych.

Nowy szczep, który w poniższym tekście oznaczany będzie dla uproszczenia skrótem LMG-P-17806, jest wariantem gatunku Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Wykazuje on cechy charakterystyczne dla gatunku o zawartości GC wynoszącej 44%. LMG P-17806 wyizolowano z próbki ludzkiej mikroflory żołądkowo-jelitowej. LMG-P-17806 jest to Gram-dodatnia, homofermentatywna bakteria o kształcie pałeczek. Wytwarza ona kwas L-mlekowy (lewoskrętny izomer kwasu mlekowego), a jej optymalna temperatura rozwoju wynosi 37°C. Szczep ten charakteryzuje się in vitro tolerowaniem kwasu solnego i soku żołądkowego, tolerowaniem soli kwasów żółciowych bez ich dekoniugacji, oraz dużą zdolnością asymilowania cholesterolu. Szczep ten charakteryzuje się także posiadaniem trzech plazmidów o wielkości wynoszącej, odpowiednio, 2,2, 4,36 i 9,1 kz. Do innych jego cech charakterystycznych należy to, że szczep ten fermentuje rybozę, adonitol, galaktozę, glikozę, fruktozę, mannozę, sorbozę, mannitol, sorbitol, N-acetyloglukozaminę, eskulinę, celobiozę, maltozę, laktozę, sacharozę, trehalozę, inulinę, melezytozę, D-turanozę i D-tagatozę. Z drugiej strony, nie fermentuje on glicerolu, erytrytolu, D- i L-arabinozy, D- i L-ksylozy, b-metylo-D-ksylozydu, ramnozy, dulcytolu, inozytolu, a-metylo-D-mannozydu, a-metylo-D-glukozydu, amygdaliny, arbutyny, salicyny, melibiozy, rafinozy, skrobi, glikogenu, ksylitolu, gencjobiozy, D-liksozy, D-i L-fukozy, D-i L-arabitolu i 2-i 5-ketoglukonianu.

Charakterystykę tego szczepu przeprowadza się z zastosowaniem metody elektroforezy w żelu z siarczanem dodecylo-sodowym, w której szczep ten porównuje się z sześcioma innymi szczepami Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (patrz załączona figura). W porównaniu takim wykazano, że różni się on od innych opisanych szczepów, a zarazem, przy porównywaniu z innymi laktobakteriami, że przynależny do wyszczególnionego gatunku. Został on scharakteryzowany także pod względem rybosomalnego RNA w aparacie o nazwie Riboprinter^®. Metodą tą wykazano, że szczep ten wykazuje 76% podobieństwo z typowym szczepem Lactobacillus paracasei subsp. paracasei i 72% podobieństwo z typowym szczepem Lactobacillus casei, analizowanym dla porównania.

Przedmiotem wynalazku jest szczep z rodzaju Lactobacillus użyteczny jako probiotyczny składnik produktów spożywczych i leków naturopatycznych, in vitro oporny na kwas solny i sok żołądkowy, tolerujący sole kwasów żółciowych bez ich dekoniugowania, z silną ich asymilacją, o wielkiej zdolności asymilowania cholesterolu, wykazujący dobrą przeżywalność przy przemieszczaniu się przez żołądek i przewód żołądkowo-jelitowy, o optymalnej temperaturze rozwoju wynoszącej 37°C, charakteryzujący się tym, że stanowi Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, LMG P-17806, zdeponowany w Belgian Coordinated Collections zgodnie z postanowieniami Układu Budapeszteńskiego, będący bakterią Gram-dodatnią, homofermentatywną, o kształcie pałeczek, zdolną do wytwarzania kwasu L-mlekowego, oraz tym, że zawiera trzy plazmidy o wielkości wynoszącej, odpowiednio, 2,2, 4,36 i 9,1 kz.

Korzystnie szczep charakteryzuje się tym, że jego zawartość GC wynosi 44%.

Szczep korzystnie może być wyodrębniany z próbek ludzkiej mikroflory żołądkowo-jelitowej.

Korzystnie, szczep fermentuje rybozę, adonitol, galaktozę, glukozę, fruktozę, mannozę, sorbozę, mannitol, sorbitol, N-acetyloglukozaminę, eskulinę, celobiozę, maltozę, laktozę, sacharozę, trehalozę, inulinę, melezytozę, D-turanozę i D-tagatozę.

Szczep według wynalazku ma postać koncentratu w formie proszku zamrożonego lub zliofilizowanego.

Korzystnie szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei dodaje się do produktu mlecznego, sfermentowanego produktu mlecznego, napoju owocowego lub warzywnego takiego jak sok warzywny, sok z owoców cytrusowych lub sok z innych owoców lub warzyw, w ilości mieszczącej się w zakresie od 0,001% do 5%, korzystnie w zakresie od 0,01% do 1%.

Korzystnie można prowadzić wspólną hodowlę szczepu Lactobacillus paracasei subsp. paracasei według wynalazku z kulturami jogurtowymi i kulturami kwaśnego mleka z laktokokami lub innymi gatunkami rodzaju Lactobacillus, takimi jak L. acidophilus, L. fermentum lub L. rhamnosus.

Szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei według wynalazku, korzystnie obecny jest w ilości mieszczącej się w zakresie od 1 miliona do 10000 milionów żywych bakterii/g złożonego produktu.

Przedmiotem wynalazku jest także produkt zawierający szczep z rodzaju Lactobacillus jako szczep zawierający Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, LMG P-17806 zdeponowany w Belgian

Coordinated Collections zgodnie z postanowieniami Układu Budapeszteńskiego, stanowiący produkt

PL 192 924 B1 mleczny, sfermentowany produkt mleczny, napój warzywny lub owocowy lub proszek kleikowy, przy czym wszystkie one zawierają szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei w ilości mieszczącej się w zakresie od 5 x 10⁵ do 5 x 10⁹, zazwyczaj w zakresie od 1x 10⁵ do 10⁹ żywych bakterii, co odpowiada od 0,0005 do 0,5% produktu, albo stanowi skoncentrowany lek naturopatyczny (leczniczy produkt spożywczy), w którym szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei obecny jest w ilości mieszczącej się w zakresie od 1000 do 100000 milionów żywych bakterii, co odpowiada 0,001 -100% produktu.

Produkt według wynalazku w przypadku produktów spożywczych zawiera ponadto od 0,001 do 0,1%, ekstraktu drożdżowego lub innej substancji przyczyniającej się do rozwoju lub przeżycia Lactobacillus paracasei subsp. paracasei w produkcie, a w przypadku leków naturopatycznych zawiera dodatkowo substancje ważne pod względem przeżycia bakterii i/lub pozostałości podłoża hodowlanego.

Korzystnie w produkcie według wynalazku szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ma postać koncentratu w formie zamrożonej lub zliofilizowanej, przeznaczonego do zmieszania z produktem mlecznym, sfermentowanym produktem mlecznym, napojem warzywnym lub owocowym do bezpośredniego spożycia, proszkiem kleikowym lub skoncentrowanym lekiem naturopatycznym (tak zwanym leczniczym produktem spożywczym).

Produkt zawierający szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, według wynalazku stosuje się dla dzieci w celu złagodzenia problemów atopowych, dla osób starszych w celu skorygowania zmian mikroflory spowodowanych normalnymi zmianami związanymi z wiekiem lub zmienionym wydzielaniem kwasu solnego, oraz dla wszystkich w celu znormalizowania flory jelitowej, przy czym udział klostrydiów zostaje zmniejszony, udział bifidobakterii zostaje zwiększony, a wysoki poziom bakterii podobnych do pałeczek okrężnicy zostaje obniżony.

Zalety szczepu.

LMG P-17806 w porównaniu ze znanymi szczepami z rodzaju Lactobacillus, w zdecydowany sposób góruje nad nimi pod względem użytkowości jako probiotyk w składzie produktów spożywczych i leków naturopatycznych, a to dzięki unikalnej kombinacji dobrych właściwości:

- szczep wykazuje dobrą oporność na działanie soku żołądkowego i soli kwasów żółciowych, ale inaczej niż ma to miejsce w przypadku innych szczepów, nie dekoniuguje tych soli;

- szczep wykazuje dużą zdolność asymilowania cholesterolu;

- szczep dobrze znosi warunki przemieszczania się przez żołądek;

- szczep wywiera wpływ na warunki istniejące w modelu jelita grubego przez zwiększenie w nim produkcji kwasu L-mlekowego;

- szczep nie jest bardziej pro-zapalny od zwykłych bakterii jogurtowych;

- szczep zapobiega zaatakowaniu komórek jelita przez drobnoustroje chorobotwórcze, takie jak Salmonella typhimurium;

- szczep wywiera działanie antagonistyczne w stosunku do bakterii Helicobacter pylori będącej czynnikiem przyczynowym choroby wrzodowej żołądka;

- szczep wytwarza bakteriocyny, aktywne wobec klostrydiom;

- szczep wykazuje dobrą przeżywalność w mleku, czy to w stanie zamrożonym, czy też wysuszonym;

- szczep, inaczej niż ma to miejsce w przypadku innych laktobakterii, odznacza się wywieraniem korzystnego wpływu na smak sfermentowanych produktów mlecznych (nie nadając im jakiegokolwiek bądź posmaku).

Omawiany szczep Lactobacillus parcasei subsp. paracasei można stosować jako dodatek do produktu spożywczego lub jako lek naturopatyczny, tak zwany leczniczy produkt spożywczy (Medical food), albo jako dodatek do leku naturopatycznego.

Leki takie można stosować dla dzieci w celu złagodzenia problemów atopowych; dla osób starszych w celu skorygowania zmian mikroflory zmienionej w wyniku normalnych zmian związanych z wiekiem lub zmian związanych z wydzielaniem kwasu solnego; oraz dla wszystkich, w celu unormowania składu flory jelitowej, w wyniku czego następuje zmniejszenie się zawartości bakterii z rodzaju Clostridium, wzrost udziału laktobakterii i bifidobakterii oraz obniżenie wysokiego poziomu bakterii podobnych do pałeczek okrężnicy.

Właściwościami tymi szczep LMG P-17806 różni się od szczepów dotychczas znanych, co zostanie przedstawione w poniższych przykładach.

Otrzymywanie szczepu.

Szczep przygotowuje się w sposób zwykle stosowany w przypadku laktobakterii. Stosuje się podłoże odpowiednie dla laktobakterii. Podłoże to powinno zawierać, na przykład, co najmniej jeden węglowodan, który jest fermentowany przez omawiany szczep (zgodnie z tym, co powiedziano w powyż4

PL 192 924 B1 szej części niniejszego opisu) łącznie z białkami, witaminami, solami mineralnymi i innymi środkami odżywczymi, których normalnie potrzebują laktobakterie. Przykładowymi odpowiednimi podłożami handlowymi są takie podłoża jak bulion z ekstraktem drożdżowym i glukozą, podłoże MRS (bulion De Mana-Rogosy-Sharpa), podłoże Rogosy, mleko z dodaną niewielką ilością ekstraktu drożdżowego itd. Hodowlę szczepu prowadzi się w warunkach względnie beztlenowych lub beztlenowych, stosownie w temperaturze mieszczącej się w zakresie od 15 do 42°C. W przypadku, gdy podłoże zaszczepia się inokulum w ilości mieszczącej się w zakresie od 0,1 do 1%, stosowny czas hodowli mieści się w zakresie od 10 do 40 godzin. Jeżeli jest to pożądane, hodowlę szczepu można zagęścić, na przykład przez wirowanie lub sączenie, i po przeprowadzeniu tej operacji otrzymany koncentrat przemywa się w celu usunięcia podłoża hodowlanego. Następnie, koncentrat ten zamraża się lub liofilizuje w zwykły sposób. W taki sposób można otrzymać preparaty zawierające od 100 milionów do 100000 milionów żywych bakterii LMG P-17806/gram. Preparat ten można następnie stosować jako taki, albo jako dodatek do produktów spożywczych, na przykład do mleka lub innego artykułu spożywczego, zapewniającego przeżywalność LMG P-17806, a jeżeli jest to pożądane, także i rozwój tych bakterii.

Opis badań.

A. Badanie dotyczące przejścia szczepu przez przewód żołądkowo-jelitowy.

Przeprowadzono hodowlę LMG P-17806 sposobem powyżej opisanym, po czym wprowadzono wraz z kulturą jogurtową do mleka. Przefermentowany produkt wytworzono za pomocą inkubacji mleka przeprowadzonej w ciągu 5 godzin w temperaturze 42°C. Otrzymano smakowity produkt, zawierający pełne 100 milionów żywych LMG P-17806/gram.

Zdrowym osobom podawano w ciągu tygodnia 3 razy dziennie po 200 g tego produktu. Całkowita ilość przyjętych LMG P-17806 mieściła się w zakresie od 40 do 200 miliardów.

Próbki kału poddano badaniu przed rozpoczęciem przyjmowania produktu, po upływie tygodnia od rozpoczęcia konsumpcji i po upływie tygodnia od zaprzestania jego spożywania. Jak to uwidoczniono w poniższych tabelach 1i 2, u osób poddanych testowi uzyskano silny wzrost liczby laktobakterii. Klasyfikacji pod względem przynależności gatunkowej poddano w każdym przypadku dwa izolaty pobrane od każdej testowanej osoby, to znaczy ogółem 20 izolatów. Stwierdzono, że 18 izolatów dla okresu konsumpcji składało się z LMG P-17806 zgodnych z klasyfikacją fenotypową. W próbkach pobranych przed i po przyjęciu LMG P-17806 nie odkryto tego szczepu bakteryjnego.

Średnio, zawartość bakterii w próbkach kału w trakcie podawania była bardzo wysoka i zmieniała się w umiarkowanym tylko zakresie, od 63 milionów do 320 milionów/gram, to znaczy ze współczynnikiem 5. Godnym zauważenia było to, że ilość ta była w dużej mierze jednakowa, niezależnie od tego, jaką ilość oznaczono przez rozpoczęciem eksperymentu. Po zaprzestaniu podawania, zawartość bakterii w próbkach powróciła do poziomu naturalnego dla danej osoby poddawanej badaniu.

W poniższych tabelach 1 i 2 podano wyniki oznaczenia zawartości laktobakterii w kale. Pomiarów dokonano przez wysiew na płytki z użyciem podłoża Rogosy. Wyniki podano w milionach/g.

Tabela 1

Test 5-osobowy przy pierwotnie niskiej zawartości laktobakterii w kale.

Osoba badana nr	Przed eksperymentem	W trakcie eksperymentu	Po eksperymencie
1	0,05	120	0,07
2	0,15	320	0,12
3	0,08	97	0,14
4	0,009	63	0,02
5	< 0,001	278	0,002

Tabela 2

Test 5-osobowy przy wysokiej zawartości laktobakterii w kale

Osoba badana nr	Przed eksperymentem	W trakcie eksperymentu	Po eksperymencie
6	1,2	297	1,3
7	0,7	83	0,6
8	0,2	136	0,18
9	4,3	74	3,5
10	0,6	212	0,8

PL 192 924 B1

Wyniki badania pokazują, że szczep odznacza się dobrą przeżywalnością przy przemieszczaniu się przez przewód żołądkowo-jelitowy.

B. Badanie dotyczące wytwarzania kwasu L-mlekowego przez szczep w modelu jelita grubego.

Przefermentowany produkt, wytworzony sposobem opisanym w pkt. A, wprowadzono do reaktora o nazwie SHIME, będącego in vitro modelem jelita. Próbki pobierano z tej części reaktora, która odpowiada najważniejszym częściom jelita grubego. Podobne testy przeprowadzano z udziałem niektórych innych szczepów z rodzaju Laktobacillus, między innymi szczepów blisko spokrewnionych z L. paracasei subsp. paracasei. Jak to wyraźnie uwidoczniono w poniższej tabeli 3, LMG P-17806 wykazywał silny wzrost poziomu wytwarzania kwasu L-mlekowego, będącego tym właśnie izomerem kwasu mlekowego, który produkowany jest przez LMG P-17806. Wytwarzanie kwasu mlekowego uważa się za bardzo korzystne z wielu powodów, między innymi biorąc pod uwagę jego działanie antybakteryjne, jak również ten fakt, że (jak się przypuszcza) niższe pH zmniejsza dostępność i tworzenie związków azotowych.

Tabela 3

Wytwarzanie kwasu L-i D-mlekowego w reaktorze SHIME po wprowadzeniu do niego różnych bakterii kwasu mlekowego w mg/litr zawartości reaktora

Bakterie kwasu mlekowego	Reaktor 4	Reaktor 5	Reaktor 6
L	D	L	D	L	D
LMG P-17806	300	80	500	100	280	90
L. paracasei	40	80	200	70	130	40
L. rhamnosus	90	10	10	70	80	10
L. plantarum	60	50	60	70	40	50

W powyższej tabeli 3 oznaczenie L odnosi się do lewoskrętnego izomeru kwasu mlekowego, aD do izomeru prawoskrętnego.

Reaktor 4 odpowiada górnej części jelita grubego, reaktor 5 środkowej części jelita grubego i reaktor 6 dolnej części jelita grubego. Wyniki badania pokazują, że szczep w modelu jelita grubego wytwarza kwas L-mlekowy.

C. Badanie stopnia zabezpieczenia przez LMG P-17806 komórek nabłonkowych jelita przed inwazją bakterii Salmonella typhimurium.

Prowadzono hodowlę in vitro komórek nabłonkowych jelita typu CaCo-2. Komórki te wprowadzono łącznie z laktobakteriami i bakteriami Salmonella typhimurium we wzajemnym stosunku ilościowym wynoszącym 100 : 1, przy użyciu 1 miliona komórek Salmonella/ml. Efekt takiego postępowania badano po upływie 120 minut inkubacji w temperaturze 37°C. Ilość atakujących bakterii Salmonella oznaczano przez trzykrotne przemycie płytek z przylegającymi komórkami CaCo-2, po czym przylegające komórki poddano w ciągu godziny działaniu antybiotyku gentamycyny użytym w stężeniu wynoszącym 100 mg/litr, w celu zabicia wszystkich bakterii, które nie zaatakowały komórek. Następnie płytki przemyto PBS w celu usunięcia całej ilości gentamycyny i w końcu wychwycone bakterie uwolniono za pomocą potraktowania komórek CaCo-2 0,1% Triton-X, przy wstrząsaniu. Następnie, oznaczono liczbę komórek Salmonella zwykłą metodą płytkową. LMG P-17806 wywierał wyraźne działanie polegające na redukowaniu liczby zaatakowanych komórek. Z drugiej strony, ściśle spokrewniony wariant L. paracasei, K 506, wydawał się raczej stymulować inwazję bakterii z rodzaju Salmonella. Także pod względem tej właściwości, LMG P-17806 wykazywał pozytywne działanie. Otrzymane wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 4.

Tabela 4

Inwazja bakterii z rodzaju Salmonella

Bakterie kwasu mlekowego	Atakujące bakterie z rodzaju Salmonella (w %)
bez bakterii kwasu mlekowego	z bakteriami kwasu mlekowego
LMG P-17806	2,5	0,75
L. paracasei, K 506	2,5	7
L. plantarium	2	2
L. rhamnosus	2,5	0,75

PL 192 924 B1

Dane zamieszczone w powyższej tabeli pokazują, że szczep LMG P-17806 zapewnia wyraźną ochronę przed wtargnięciem bakterii z rodzaju Salmonella.

D. Badanie zabezpieczania przed Helicobacter pylori.

Wpływ podawania sfermentowanego produktu mlecznego ze szczepem LMG P-17806 i bez tego szczepu na zawartość H. pylori w kale mierzono w modelu mysim, w którym użyto myszy zarażonych Helicobacter pylori.

Myszy zarażano 100 milionami komórek szczepu H. pylori 17874 w formie spiralnej, trzykrotnie, z przerwami jednodniowymi. Następnie myszom podawano produkty przewidziane do przetestowania w tym eksperymencie i mierzono ilość H. pylori w kale, przy użyciu heparynizowanych kulek magnetycznych i z zastosowaniem testu immunoenzymatycznego. Badaniu poddano trzy produkty. Wszystkie przefermentowane produkty mleczne przejawiły działanie zmniejszające udział H. pylorii, ale działanie to, w przypadku produktu zawierającego LMG P-17806, odbywało się znacznie szybciej w porównaniu, odpowiednio, ze zwykłym jogurtem i szczepem L. fermentum KLD.

Tabela 5

Zawartość H. pylori w kale zmierzona przy użyciu heparynizowanych kulek magnetycznych i z zastosowaniem testu immunoenzymatycznego

Produkt	Przed przyjmowaniem	Po przyjmowaniu w ciągu 2 dni	Po przyjmowaniu w ciągu 7 dni	Po upływie 7 dni od zakończenia przyjmowania
Zwykły jogurt	1,48	1,86	0, 63	2,25
Jogurt z L. fermentum	1, 65	1,62	0,94	1,61
Jogurt z LMG P-17806	1,80	0,68	0, 61	1,71

Dane zamieszczone w powyższej tabeli 5 stanowią wartości absorbancji przy 405 nm i oznaczają względne zawartości.

E. Badanie działania szczepu LMG P-17806 jako immunologicznej bariery ochronnej. Immunologiczny system ochronny regulowany jest przez szereg substancji sygnałowych, tak zwanych cytokin. Niektóre z nich mogą przejawiać aktywność prozapalną. Wpływ LMG P-17806 na wytwarzanie cytokin TNF-alfa i IL-6 porównano z wpływem wywieranym przez dwa gatunki występujące w kulturze jogurtowej, a mianowicie L. delbrueckii subsp. bulgaricus i Streptococcus thermophilus. Z krwi ludzkiej wyizolowano leukocyty i dodano je, w ilości 10 milionów, do bakterii żywych i do bakterii zabitych przy użyciu aldehydu glutarowego. Jako kontroli użyto lipopolisacharydów (LPS) z E. coli. Otrzymane wyniki zamieszczono w poniższej tabeli 6. Wyniki te pokazują, że w przyjętym modelu LMG P-17806 ma te same właściwości przeciwzapalne, jakie wykazuje kultura jogurtowa.

Tabela 6

Działanie szczepu LMG P-17806 jako immunologicznej bariery ochronnej

Bakterie kwasu mlekowego	TNF-alfa mg/litr	IL-6 mg/litr
żywe	zabite	żywe	zabite
S. thermophilus, E584	12	1	0,4	< 0,1
L. bulgaricus, E585	2	3	0,5	0,1
LMG P-17806	4	1	0,7	< 0,1

F. Badanie oporności szczepu LMG P-17806 na antybiotyki.

Probiotyki mogą okazać się skuteczne, jeśli chodzi o przywracanie stanu równowagi flory jelitowej zakłóconego w trakcie kuracji antybiotykowej. Jednocześnie, jest rzeczą ważną, że probiotyki nie przyczyniają się do rozprzestrzeniania się oporności na antybiotyki, co jest szczególnie istotne w przypadku równoczesnego podawania probiotyków i antybiotyków. Z tego powodu przetestowano oporność szczepu LMG P-17806 na rozmaite antybiotyki. Wrażliwość szczepu LMG P-17806 na różne antybiotyki oznaczono za pomocą ustalenia takiego ich stężenia, przy którym uzyskiwano 50% redukcję rozwoju szczepu, mierzonego jako gęstość optyczna.

Okazało się, że szczep LMG P-17806 był oporny na wankomycynę i jego rozwój nie był zahamowany nawet przy stężeniu wynoszącym 256 mg/litr. Szczep wykazał pewien stopień oporności na

PL 192 924 B1 trymetoprym i na cefotaksym, dla których otrzymano 50% wartości gęstości optycznej (OD) przy stężeniu wynoszącym, odpowiednio, 12 i 4 mg/litr. Z drugiej strony, szczep LMG P-17806 okazał się wrażliwy na chloramfenikol, erytromycynę, ryfampicynę i tetracyklinę, w przypadku których 50% zahamowanie wzrostu następowało już przy stężeniu wynoszącym 1 mg/litr.

Wpływ antybiotyków przebadano także w formie skriningu przy użyciu tak zwanych Sensi discs z firmy Oxoid. Zgodnie z otrzymanymi w ten sposób wynikami, szczep LMG P-17806 okazał się oporny na aztreonam, ceftaksymid, cefoksytynę, siarczan kolistyny, kanamycynę, polimiksynę B, streptomycynę i wankomycynę.

Tak więc, zgodnie z tymi wynikami, szczep LMG P-17806 mógł się okazać szczególnie interesujący w równoczesnym stosowaniu z antybiotykami takimi jak wankomycyna, trymetoprym, jak również szeregiem cefloksacyn, które to antybiotyki są znane z działań ubocznych wywieranych na florę jelitową i czynność jelit. Zastosowanie szczepu LMG P-17806.

P r z y k ł a d 1

Otrzymywanie koncentratu bakteryjnego

Sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu wytworzono zamrożony koncentrat bakteryjny zawierający 10 miliardów komórek LMG P-17806/gram.

Hodowlę laktobakterii prowadzono na podłożu serwatkowym z dodatkiem 1 g ekstraktu drożdżowego/litr, przy stałym pH 5,5, w ciągu 14 godzin, w temperaturze 36°C. Bakterie wydzielono przez wirowanie przy stałym przemywaniu gęstego odwirowywanego materiału. Następnie otrzymany tak koncentrat zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C do dalszego użycia.

Przykład 2

Otrzymywanie sfermentowanego produktu mlecznego

Z mleka, za pomocą homogenizacji, obróbki termicznej w temperaturze 95°C w ciągu 5 minut i obniżenia temperatury do 37°C, otrzymano produkt mleczny, który zaszczepiono 0,01% handlowej, zamrożonej kultury jogurtowej i 0,5% koncentratu LMG P-17806. Następnie, pozwolono kulturom rozwijać się w ciągu 6 godzin we wspomnianej temperaturze i w tych warunkach nastąpiła koagulacja mleka, a wartość jego pH obniżyła się do poziomu 4,55. Koagulat rozbito i produkt schłodzono do temperatury 12°C, po czym zapakowano w zwykłe kubki z tworzywa sztucznego, stosowane powszechnie do pakowania jogurtu, i w dalszym ciągu schładzano w komorze chłodniczej o temperaturze 5°C, w ciągu jednego dnia i nocy. Następnie obniżono pH do wartości 4,4, po czym produkt przechowywano w temperaturze 8°C w ciągu 3 tygodni.

Śledzono i kontrolowano ilość szczepu LMG P-17806 i jak to pokazują wyniki przedstawione w poniższej tabeli 7, nastąpił ograniczony wzrost bakterii szczepu LMG P-17806 w trakcie hodowli, przy czym LMG P-17806 bardzo dobrze przeżył przechowywanie w ciągu 3 tygodni przy pH poniżej 4,4.

Tabela 7

Przechowalność szczepu LMG P-17806 w produkcie mlecznym

Inokulum	Zawartość w produkcie mlecznym	Zawartość po hodowli	Po przechowywaniu w ciągu 1 tygodnia	Po przechowywaniu w ciągu 2 tygodni	Po przechowywaniu w ciągu 3 tygodni
9900	49	97	132	118	121

Zawartości podane są w milionach/g.

Produkt miał normalny wygląd, z wydzieleniem się serwatki wynoszącym zaledwie 1% po przechowywaniu w ciągu 14 dni. Produkt smakował wyśmienicie, posiadał jednolitą konsystencję i świeży, łagodny zapach. W niezależnej degustacji przeprowadzonej w instytucie badawczym, produkt testowany uzyskał wynik oceny lepszy od wyniku dla jogurtu normalnego. Produkt testowany porównywano z odpowiednim produktem nie zawierającym szczepu LMG P-17806, w degustacji przeprowadzanej z udziałem konsumentów zaproszonych do dokonania oceny, którzy nie wiedzieli, który wyrób aktualnie kosztują. W zespole oceniającym, 74% osób wypowiedziało się za produktem z LMG P-17806 jako korzystniejszym i uzyskał on średnią wartość 7,6 na 9-punktowej skali, co jest wynikiem wyraźnie lepszym od wyników uzyskiwanych dla zwykłego jogurtu. Ocena była o nieco ponad 1 punkt lepsza od oceny dla poprzednio znanej probiotycznej kultury zawierającej Lactobacillus acidophilus. Wyniki te różnią się także od wyników uzyskiwanych dotychczas przy porównywaniu czystego jogurtu i produktów mieszanych, złożonych z jogurtu i probiotycznych bakterii, odpowiednio, Lactobacillus acidophilus

PL 192 924 B1 i Bifidobacterium longum. Nie można było stwierdzić wyraźniejszych różnic między czystym jogurtem a odpowiednimi produktami mieszanymi.

Przykład 3

Określenie stosownego zakresu ilości wprowadzanego szczepu LMG P-17806

Przeprowadzono także eksperymenty prowadzące do określenia stosownego zakresu ilości wprowadzanego szczepu LMG P-17806.

Mleko poddawano obróbce, a następnie wprowadzano do niego kulturę jogurtową, zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w powyższej części niniejszego opisu. Ilość dodawanego koncentratu szczepu LMG P-17806 wahała się w zakresie od 5% do 0,01%.

Przy wsadzie wynoszącym 5% stwierdzono występowanie posmaku, wynikającego przypuszczalnie z obecności samego inokulum. Zmiany pH były jednak normalne, a i wygląd produktu także był normalny. Zawartość LMG P-17806 w świeżym produkcie wynosiła 504 miliony/g i utrzymywała się na tym poziomie podczas przechowywania.

Przy dodaniu 0,01% koncentratu LMG P-17806 produkt nie był sensorycznie do odróżnienia od zwykłego jogurtu, a zawartość LMG P-17806 już po upływie tygodnia wynosiła mniej niż 1 milion/ml, co stanowi najniższą zawartość w produkcie, jaką musi on wykazywać aby mógł zostać uznany za produkt zawierający specyficzny probiotyk według propozycji zmierzającej do uzyskania legalizacji międzynarodowej.

P r z y k ł a d 4

Otrzymywanie sfermentowanego produktu specjalnego

Eksperyment przeprowadzono sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu, z tą różnicą, że do mleka dodano także ekstrakt drożdżowy w ilości wynoszącej 0,4 g/litr. Inokulum złożone było z 0,01% takiej samej kultury jogurtowej, jaką stosowano w sposobie opisanym w powyższej części niniejszego opisu, ale wprowadzano tylko 0,1 LMG P-17806. Inkubację, w temperaturze 34°C prowadzono w ciągu 8 godzin, po czym proces przerwano i produkt schłodzono, zapakowano i przechowywano w sposób opisany w powyższym przykładzie 3. W tych warunkach, LMG P-17806 wykazał 10-krotnie większy wzrost i podobnie do sytuacji opisanej w powyższej części niniejszego opisu bakterie przeżywały dobrze okres przechowywania. Otrzymane wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 8.

Tabela 8

Przechowalność specjalnego produktu mlecznego zawierającego szczep LMG P-17806

Inokulum	Zawartość w produkcie mlecznym	Zawartość po hodowli	Po przechowywaniu w ciągu 1 tygodnia	Po przechowywaniu w ciągu 2 tygodni	Po przechowywaniu w ciągu 3 tygodni
9900	10	103	114	109	107

Zawartości zamieszczone w tabeli podane są w milionach/g produktu.

Produkt miał normalny wygląd, z 1,5%-owym wydzieleniem się serwatki po przechowywaniu w ciągu 14 dni. Produkt odznaczał się dobrą smakowitością i jednolitą konsystencją.

Przykład 5

Otrzymywanie soku warzywnego zawierającego szczep LMG P-17806

Wytworzono sok warzywny za pomocą zmieszania ze sobą równych ilości koncentratu soku z marchwi i koncentratu soku pomarańczowego tak, że wartość pH końcowego produktu wynosiła 3,9. Tak utworzony napój mieszany poddano obróbce termicznej, po czym wprowadzono do niego, odpowiednio, 1% i 0,1% koncentratu LMG P-17806. Zawartość LMG P-17806 wynosiła, odpowiednio, 100 i10 milionów komórek/ml. Napoje te przechowywano w temperaturze 7°C w ciągu 4 tygodni. Smakowitość produktu nie pogorszyła się i nie stwierdzono żadnych zmian wynikających z przechowywania lub wprowadzenia LMG P-17806. Jednakże, dodawanie LMG P-17806 do poziomu powyżej 50 milionów, wydawało się zmniejszać ubytek witaminy C. W produkcie nie zawierającym LMG P-17806, jak również w produkcie zawierającym 10 milionów bakterii/ml, zawartość witaminy C obniżała się od 25 mg/100 g przed przechowywaniem do 18 mg/100 g po upływie 4 tygodni. Przy dodaniu LMG P-17806 w ilości wynoszącej 100 milionów/ml zawartość witaminy C obniżyła się tylko do 22 mg/100 g, to znaczy o ponad 50% mniej od obniżenia się zawartości witaminy C. LMG P-17806 przeżywał dobrze i zawartość jego po upływie 4 tygodni była o tylko około 40% mniejsza od zawartości w świeżym produkcie, niezależnie od tego, w jakiej ilości został dodany.

PL 192 924 B1

W innym eksperymencie, do takiego samego napoju owocowego dodano 5% LMG P-17806.

Powodowało to powstawanie posmaku, a szczep rozwijał się gorzej podczas przechowywania.

P r z y k ł a d 6

Otrzymywanie proszku kleikowego

Proszek kleikowy wytwarza się w zwykły sposób. Koncentrat LMG P-17806 zdefiniowany w powyższej części niniejszego opisu liofilizuje się po zmieszaniu ze skrobią kukurydzianą i po zapakowaniu w opakowanie tlenoszczelne przechowuje w temperaturze -20°C. Zliofilizowany preparat zawierał 61 miliardów bakterii LMG P-17806/g. Proszek kleikowy zmieszano na sucho z 0,03% LMG P-17806 i zapakowano, w atmosferze azotu, w opakowanie tlenoszczelne. Następnie, proszek przechowywano wpierw w ciągu 3 miesięcy w temperaturze 12°C, a następnie jeszcze w ciągu 4 miesięcy w temperaturze pokojowej. Zawartość LMG P-17806 uwidoczniono w poniższej tabeli 9. Proszek kleikowy stwarzał dobre możliwości dla przeżywania LMG P-17806 i dlatego możliwe jest wytwarzanie, na przykład, pożywek dla dzieci o wysokiej zawartości LMG P-17806.

Tabela 9

Preparat zliofilizowany	Proszek przed dodaniem	Proszek po dodaniu	Po upływie 3 miesięcy	Po upływie 7 miesięcy
61000	< 0,0001	20	18	6,5

Zawartości podane w tabeli podane są w milionach/g proszku.

Proszek kleikowy rozpuszczono w 9 częściach wody o temperaturze 50°C i oznaczano w nim zawartość LMG P-17806. Ilość ta wynosiła 1 milion LMG P-17806/ml napoju w przypadku użycia do oznaczenia proszku sześciomiesięcznego. Kleiku nie można było odróżnić od produktu zwykłego. Jednakże, po przechowywaniu przez nocw temperaturze pokojowej, kleik z dodanym LMG P-17806 miał smak nieco kwaskowaty i wykazywał pH 5,7.

W drugim eksperymencie, badaniu poddano wpływ dodania, odpowiednio, 1% i 0,001% zliofilizowanego preparatu LMG P-17806. Zawartość bakterii w proszku kleikowym po dodaniu wynosiła odpowiednio, 570 i 0,8 milionów/g.

Proszki przechowywano w sposób jak wyżej opisano i badano po upływie 5 miesięcy przechowywania. Po rozpuszczeniu jak wyżej opisano, zawartość w sporządzonym kleiku wynosiła 800 milionów, a w odniesieniu do niskiego poziomu dodania mniej niż 10000/ml. Przy wysokim poziomie dodania wyczuwało się lekki smak kwaśny już po przechowaniu kleiku w ciągu 4 godzin w temperaturze ciała.

Przykład 7

Otrzymywanie suchego proszku przeznaczonego do stosowania jako leczniczy produkt spożywczy

Zliofolizowany koncentrat LMG P-17806 zmieszano z użytą w różnych ilościach skrobią kukurydzianą w stosunku, odpowiednio, 1:1, 1:9, 1:99 i 1:999. Tak zmieszane proszki przechowywano w małych saszetkach o zawartości od1 do 100 g/saszetkę. Tworzywo, z jakiego wykonane były te saszetki, było nieprzepuszczalne dla tlenu i pary wodnej. Saszetki przechowywano w, odpowiednio, zamrażarce, lodówce i w temperaturze pokojowej. Zawartości saszetek użyto następnie jako dodatku do napoju przez zmieszanie proszku z napojem przed jego spożyciem. Uzyskano poziom przeżywalności odpowiadający poziomowi stwierdzonemu w powyższym przykładzie 6. Proszek sporządzony w stosunku 1:1 zapakowano także w kapsułki żelatynowe w ilości 0,4 g/kapsułkę. Ilość bakterii w jednej kapsułce wynosiła 10 miliardów. Kapsułki zapakowano w listki (opakowania typu blister) z tworzywa o dobrych właściwościach barierowych w stosunku do tlenu i pary wodnej. Kapsułki przechowywano w taki sam sposób, jaki opisano powyżej i uzyskano odpowiednio dobre wyniki odnośnie do przeżywalności.

Przykład 8

Otrzymywanie i stosowanie mieszanin bakteryjnych

LMG P-17806 można zmieszać z innymi laktobakteriami, bez powodowania zahamowania ich aktywności. Jak się wydaje, LMG P-17806 nie wytwarza jakichkolwiek substancji wpływających hamująco na inne laktobakterie lub laktokoki w warunkach wspólnej hodowli z kulturami jogurtowymi, kulturami kwaśnego mleka z laktokokami lub innymi laktobakteriami innych gatunków, takimi jak L. acidophilus, L. fermentum lub L. rhamnosus. Eksperymenty przeprowadzone z mieszaninami zliofilizowanych preparatów zawierających wszystkie te bakterie wykazały niezmienność właściwości odnoszących się do przechowywania, niezależnie od tego, czy mieszania dokonano z udziałem skrobi kukurydzianej, czy proszku kleikowego. Po rozpuszczeniu proszku kleikowego i przechowywaniu w ciągu 12

PL 192 924 B1 godzin w temperaturze ciała, oraz 12 godzin w temperaturze pokojowej, nie wyśledzono żadnego ujemnego wpływu LMG P-17806 ani na całkowitą ilość laktobakterii, ani na zawartość którejś z tych bakterii.

W eksperymencie polegającym na wytwarzaniu probiotycznego kwaśnego mleka, do poddanego normalnej obróbce mleka spożywczego wprowadzono 0,5% kultury mleka kwaśnego i 0,6 % zliofilizowanego koncentratu szczepów L. acidophilus NCFB 1748, L. fermentum KLD i LMG P-17806. Jednakże, dodano tylko 0,1% KLD, ponieważ większe ilości stwarzały ryzyko wystąpienia posmaku i złego skrzepu. Mleko przetrzymywano w temperaturze pokojowej w ciągu 19 godzin, po czym jego pH wynosiło 4,50. Mleko schłodzono do temperatury 10°C, zapakowano i przechowywano w temperaturze 6°C w ciągu 14 dni. Otrzymane wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 10.

T ab el a 10

Bakterie kwasu mlekowego	Przed schłodzeniem	Po upływie 5 dni	Po upływie 14 dni
Laktokoki	730	810	580
L. acidophilus	135	142	131
L. fermentum	12	14	9
LMG P-17806	112	126	109

Ilości podane są w milionach różnych bakterii/ml.

Produkty te podawano do spożycia 80 zdrowym uczestnikom podróży na zjazd do Stambułu w Turcji. Grupę podzielono na dwie podgrupy, z których jedna otrzymywało kwaśne mleko sporządzone zgodnie z powyższym sposobem tylko z LMG P-17806, podczas gdy drugiej grupie podawano mleko kwaśne probiotyczne, zawierające trzy różne szczepy probiotyczne. Osoby uczestniczące w teście przebywały na miejscu zjazdu w ciągu 8 dni. Rozpoczynały one konsumpcję omawianych produktów na dwa dni przed opuszczeniem miejsca zjazdu i kontynuowały spożywanie jeszcze w ciągu 4 dni po powrocie do domu. Produkty te spożywano jako 3 przekąski równomiernie rozmieszczone w ciągu dnia, w ilości 150 g/posiłek. Wszyscy uczestnicy testu, z wyjątkiem 2 osób z grupy kwaśnego mleka, deklarowali, że spożywali produkty zgodnie z wyznaczonym schematem. W ankiecie, proszono ich o podanie na skali 3-stopniowej ewentualnego dyskomfortu ze strony przewodu żołądkowo-jelitowego postaci bólu żołądka, napięcia, biegunki lub zatwardzenia. Co do biegunki, wystąpiła ta różnica, że 5% uczestników testu spożywających produkt tylko z LMG P-17806 stwierdziło, iż wystąpiła u nich poważna, albo bardzo poważna biegunka w ciągu ostatnich dwóch dni, podczas gdy częstość tego wynosiła tylko 22% w grupie spożywającej probiotyczne mleko kwaśne.

Stąd też, wydaje się, że mieszanina kilku różnych laktobakterii może okazać się jeszcze skuteczniejsza od tylko pojedynczego szczepu bakterii. Może to wynikać z faktu, że zastosowane laktobakterie mają różne właściwości.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczep z rodzaju Lactobacillus użyteczny jako probiotyczny składnik produktów spożywczych i leków naturopatycznych, in vitro oporny na kwas solny i sok żołądkowy, tolerujący sole kwasów żółciowych bez ich dekoniugowania, z silną ich asymilacją, o wielkiej zdolności asymilowania cholesterolu, wykazujący dobrą przeżywalność przy przemieszczaniu się przez żołądek i przewód żołądkowo-jelitowy, o optymalnej temperaturze rozwoju wynoszącej 37°C, znamienny tym, że stanowi Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, LMG P-17806, zdeponowany w Belgian Coordinated Collections zgodnie z postanowieniami Układu Budapeszteńskiego, będący bakterią Gram-dodatnią, homofermentatywną, o kształcie pałeczek, zdolną do wytwarzania kwasu L-mlekowego, oraz tym, że zawiera trzy plazmidy o wielkości wynoszącej, odpowiednio, 2,2, 4,36 i 9,1 kz.
2. Szczep według zastrz. 1, znamienny tym, że jego zawartość GC wynosi 44%.
3. Szczep według zastrz. 1, znamienny tym, że został wyodrębniony z próbek ludzkiej mikroflory żołądkowo-jelitowej.
4. Szczep według zastrz. 1, znamienny tym, że fermentuje rybozę, adonitol, galaktozę, glukozę, fruktozę, mannozę, sorbozę, mannitol, sorbitol, N-acetyloglukozaminę, eskulinę, celobiozę, maltozę, laktozę, sacharozę, trehalozę, inulinę, melezytozę, D-turanozę i D-tagatozę.

PL 192 924 B1
5. Szczep według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że ma postać koncentratu w formie proszku zamrożonego lub zliofilizowanego.
6. Szczep według zastrz. 1, znamienny tym, że dodaje się szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei do produktu mlecznego, sfermentowanego produktu mlecznego, napoju owocowego lub warzywnego takiego jak sok warzywny, sok z owoców cytrusowych lub sok z innych owoców lub warzyw, w ilości mieszczącej się w zakresie od 0,001% do 5%, korzystnie w zakresie od 0,01% do 1%.
7. Szczep według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się wspólną hodowlę szczepu Lactobacillus paracasei subsp. paracasei według wynalazku z kulturami jogurtowymi i kulturami kwaśnego mleka z laktokokami lub innymi gatunkami rodzaju Lactobacillus, takimi jak L. acidophilus, L. fermentum lub L. rhamnosus.
8. Szczep według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei według wynalazku obecny jest w ilości mieszczącej się w zakresie od 1 miliona do 10000 milionów żywych bakterii/g złożonego produktu.
9. Produkt zawierający szczep z rodzaju Lactobacillus, znamienny tym, że jako szczep zawiera Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, LMG P-17806 zdeponowany w Belgian Coordinated Collections zgodnie z postanowieniami Układu Budapeszteńskiego, stanowiący produkt mleczny, sfermentowany produkt mleczny, napój warzywny lub owocowy lub proszek kleikowy, przy czym wszystkie one zawierają szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei w ilości mieszczącej się

5 9 5 9 w zakresie od 5 x 10⁵ do 5 x 10⁹, zazwyczaj w zakresie od 1x 10⁵ do 10⁹ żywych bakterii, co odpowiada od 0,0005 do 0,5% produktu, albo stanowi skoncentrowany lek naturopatyczny (leczniczy produkt spożywczy), w którym szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei obecny jest w ilości mieszczącej się w zakresie od 1000 do 100000 milionów żywych bakterii, co odpowiada 0,001-100% produktu.
10. Produkt według zastrz. 9, znamienny tym, że w przypadku produktów spożywczych zawiera ponadto od 0,001 do 0,1%, ekstraktu drożdżowego lub innej substancji przyczyniającej się do rozwoju lub przeżycia Lactobacillus paracasei subsp. paracasei w produkcie, a w przypadku leków naturopatycznych zawiera dodatkowo substancje ważne pod względem przeżycia bakterii i/lub pozostałości podłoża hodowlanego.
11. Produkt według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ma postać koncentratu w formie zamrożonej lub zliofilizowanej, przeznaczonego do zmieszania z produktem mlecznym, sfermentowanym produktem mlecznym, napojem warzywnym lub owocowym do bezpośredniego spożycia, proszkiem kleikowym lub skoncentrowanym lekiem naturopatycznym (tak zwanym leczniczym produktem spożywczym).
12. Produkt zawierający szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei jak zdefiniowano w zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się go dla dzieci w celu złagodzenia problemów atopowych, dla osób starszych w celu skorygowania zmian mikroflory spowodowanych normalnymi zmianami związanymi z wiekiem lub zmienionym wydzielaniem kwasu solnego, oraz dla wszystkich w celu znormalizowania flory jelitowej, przy czym udział klostrydiów zostaje zmniejszony, udział bifidobakterii zostaje zwiększony, a wysoki poziom bakterii podobnych do pałeczek okrężnicy zostaje obniżony.