PL193662B1

PL193662B1 - Sekwencja nukleotydowa kodująca agonistę ApoA-I, agonista ApoA-I, sekwencja nukleotydowa kodująca multimerycznego agonistę ApoA-I, komórka gospodarza, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie sekwencji nukleotydowej

Info

Publication number: PL193662B1
Application number: PL98358529A
Authority: PL
Inventors: Jean-Louis Dasseux; Renate Sekul; Klaus Buttner; Isabelle Cornut; Gunther Metz; Jean Dufourcq
Original assignee: Klaus Buttner; Isabelle Cornut; Dasseux Jean Louis; Jean Dufourcq; Gunther Metz; Renate Sekul
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2007-03-30
Also published as: AU9671498A; HUP0003924A3; AU758307B2; CA2304814A1; US6844327B2; RU2222545C2; DE69834267T2; KR20010030806A; NZ503720A; IL135324A0; ES2263221T3; EP1039934B1; CN1303298A; EP1039934A4; JP2003525565A; PL358529A1; US6518412B1; US20030208059A1; WO1999016409A2; HUP0003924A2

Abstract

1. Sekwencja nukleotydowa kodujaca agoniste ApoA-I wykazujacego co najmniej 38% aktywacje acylotransferazy lecyty- nowo-cholesterolowej (LCAT) w stosunku do ludzkiej ApoA-I, zawierajacego (i) 15-29 reszt peptydu lub analogu peptydu, który tworzy amfipatyczne a-helisy w obecnosci lipidów i który posiada wzór strukturalny (I): X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8-X 9-X 10-X 11-X 12-X 13-X 14-X 15-X 16-X 17-X 18-X 19-X 20-X 21-X 22-X 23 lub jego ich farmaceutycznie dopuszczalna sól, gdzie: X 1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asp (D) lub Asn (N); X 2 oznacza reszte alifatyczna; X 3 oznacza Leu (L) lub Phe (F); X 4 oznacza reszte kwasowa; X 5 oznacza Leu (L) lub Phe (F); X 6 oznacza Leu (L) lub Phe (F); X 7 oznacza reszte hydrofilowa; X 8 oznacza aminokwasowa reszte kwasowa lub zasadowa; X 9 oznacza Leu (L) lub Gly (G); X 10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G); X 11 oznacza aminokwasowa reszte hydrofilowa; X 12 oznacza aminokwasowa reszte hydrofilowa; X 13 oznacza Gly (G) lub aminokwasowa reszte alifatyczna; X 14 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G); X 15 oznacza aminokwasowa reszte hydrofilowa; X 16 oznacza aminokwasowa reszte hydrofobowa; X 17 oznacza aminokwasowa reszte hydrofobowa; X 18 oznacza aminokwas zasadowy, GLN (Q) lub ACN (N); X 19 oznacza aminokwas zasadowy, GLN (Q) lub ACN (N);…………………………………………………………………………… PL PL PL

Description

1. Dziedzina techniki

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa kodująca agonistę ApoA-I, agonista ApoA-I, sekwencja nukleotydowa kodująca multimerycznego agonistę ApoA-I, komórka gospodarza, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie sekwencji nukleotydowej. Wynalazek dotyczy sposobów terapii genowej dostarczających sekwencji nukleotydowych kodujących zmodyfikowane formy natywnych form apolipoproteiny A-I (ApoA-I) tj. dojrzałej ApoA-I, preproApoA-I i proApoA-I; peptydów ApoA-I; agonistów i nadagonistów ApoA-I, peptydów, które naśladują lub przewyższają aktywnością natywną ApoA-I; oraz natywnego genu ApoA-I w celu leczenia chorób związanych z dyslipoproteinemią, w tym choroby sercowo-naczyniowej, miażdżycy naczyń, arteriosklerozy, restenozy, hiperlipidemii oraz innych zaburzeń, takich jak wstrząs septyczny.

2. Tło wynalazku

Krążący cholesterol jest przenoszony przez lipoproteiny osocza - cząsteczki złożone z lipidów i białek, które transportują lipidy we krwi. Lipoproteiny o małej gęstości (LDL) i lipidy o dużej gęstości (HDL) są najważniejszymi nośnikami cholesterolu. Uważa się, że LDL są odpowiedzialne za przenoszenie cholesterolu z wątroby (gdzie jest syntetyzowany lub uzyskiwany z diety) do pozawątrobowych tkanek organizmu. Termin „odwrócony transport cholesterolu” opisuje transport cholesterolu z tkanek pozawątrobowych do wątroby, gdzie jest katabolizowany i eliminowany. Uważa się, że cząstki HDL osocza odgrywają główną rolę w procesie odwrotnego transportu, działając jako wychwytywacze tkankowego cholesterolu.

Dowody łączące podwyższony poziom cholesterolu w surowicy z chorobą naczyń wieńcowych są przytłaczające. Na przykład, miażdżyca jest wolno postępującą chorobą charakteryzującą się nagromadzeniem cholesterolu na wewnętrznej ścianie tętnicy. Dowody nie do odparcia potwierdzają koncepcję, że lipidy odłożone w lezjach miażdżycowych pochodzą głównie z LDL osocza, a zatem LDL jest popularnie zwany jako „zły” cholesterol. Dla kontrastu, poziomy HDL w surowicy korelują odwrotnie do choroby wieńcowej - wysoki poziom HDL w surowicy jest uważany jako negatywny czynnik ryzyka. Istnieje hipoteza, że wysoki poziom HDL w surowicy nie tylko chroni przed chorobą naczyń wieńcowych, ale może w istocie powodować ustępowanie płytek miażdżycowych, (np. patrz Badimon i wsp., 1992, Circulation 86 (Suppl. III): 86-94). A zatem, HDL są popularnie znane jako „dobry” cholesterol.

2.1 Transport cholesterolu.

System transportu tłuszczów można podzielić na dwa szlaki: egzogenny dla cholesterolu i trójglicerydów wchłanianych z jelita, endogenny dla cholesterolu i trójglicerydów dostających się do strumienia krwi z wątroby i innych tkanek niewątrobowych.

W szlaku egzogennym, tłuszcze z diety tworzą cząsteczki lipoprotein zwane chylomikronami, które dostają się do krwi i dostarczają swoje trójglicerydy do tkanki tłuszczowej (przechowywanie) oraz do mięśni (utlenianie w celu dostarczenia energii). Reszta chylomikronu, zawierająca estry cholesterylu jest usuwana z krwiobiegu przez specyficzny receptor znajdujący się jedynie na komórkach wątroby. Ten cholesterol staje się następnie dostępny dla metabolizmu komórkowego lub recyklizacji do komórek pozawątrobowych jako lipoproteiny osocza.

W szlaku endogennym, wątroba wydziela do krwiobiegu dużą cząsteczkę lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL). Rdzeń VLDL składa się głównie z trójglicerydów syntetyzowanych w wątrobie, z mniejszą ilością estrów cholesterylu (syntetyzowanych albo w wątrobie albo odzyskiwanych z chylomikronów). Na powierzchni VLDL eksponowane są dwa dominujące białka, apoproteina B-100 i apoproteina E. Gdy VLDL osiąga naczynia włosowate tkanki tłuszczowej lub mięśni, jego trójglicerydy są ekstrahowane prowadząc do nowego rodzaju cząsteczki, mniejszej i wzbogaconej w estry cholesterylu ale zachowującej swoje dwa apolipoproteiny zwane lipoproteinami o pośredniej gęstości (IDL).

W ludzkich organizmach około połowy cząsteczek IDL jest szybko usuwane z krążenia (w ciągu dwóch do sześciu godzin od wytworzenia), ponieważ wiążą się ściśle do komórek wątroby, które ekstrahują ich cholesterol, aby zrobić nowe VLDL i kwasy żółciowe. Cząstki IDL nie pobrane przez wątrobę pozostają w krążeniu dłużej. Z czasem, apoproteina E oddysocjowuje od krążących cząsteczek przekształcając je do LDL mających apoproteinę B-100 jako ich jedyne białko.

W pierwszym rzędzie, wątroba pobiera większość cholesterolu i degraduje do kwasów żółciowych, będących końcowym produktem metabolizmu cholesterolu. W pobieraniu cząsteczek zawierających cholesterol pośredniczą receptory LDL, które są obecne w wysokich stężeniach na hepatocytach.

PL 193 662 B1

Receptor LDL wiąże zarówno apoproteinę E, jak i apoproteinę B-100 oraz jest odpowiedzialny za wiązanie i usuwanie z krążenia zarówno IDL jak i LDL. Jednakże, powinowactwo apoproteiny E dla receptora LDL jest większe niż apoproteiny B-100. W efekcie tego cząsteczki LDL mają dużo dłuższy okres życia w krążeniu niż cząstki IDL-LDL krążą przeciętnie dwa i pół dnia przed związaniem do receptorów LDL w wątrobie i innych tkankach. Wysokie poziomy LDL w surowicy („złego” cholesterolu) są pozytywnie skorelowane z chorobą wieńcową serca. Na przykład w miażdżycy tętnic, cholesterol pochodzący z krążących LDL kumuluje się w ścianach arterii prowadząc do tworzenia rozległych złogów, hamujących przepływ krwi, aż ostatecznie tworzy skrzep powodujący obstrukcję tętnicy i powodujący atak serca lub zawał.

Ostatecznie, ilość wewnątrzkomórkowego cholesterolu pochodzącego z LDL kontroluje komórkowy metabolizm cholesterolu. Nagromadzenie komórkowego cholesterolu pochodzącego z VLDL i LDL kontroluje trzy procesy: po pierwsze redukuje możliwość syntezy cholesterolu w komórce poprzez wyłączenie syntezy reduktazy HMGCoA - kluczowego enzymu w szlaku biosyntezy cholesterolu. Po drugie, napływający cholesterol pochodzący z LDL sprzyja gromadzeniu cholesterolu poprzez aktywacje ACAT - enzymu komórkowego, który przekształca cholesterol w estry cholesterylu, które są gromadzone w kropelkach do przechowywania tłuszczu. Po trzecie, gromadzenie cholesterolu wewnątrz komórek napędza mechanizm zwrotny, który hamuje komórkową syntezę nowych receptorów LDL. Komórki zatem dopasowują swój zestaw receptorów LDL w taki sposób, aby wystarczająca ilość cholesterolu była dostarczana do zaspokojenia ich potrzeb metabolicznych. (Przegląd, patrz Brown i Goldstein, w: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8^th Ed., Goodeman&Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, Ch. 36, s. 874-896).

2.2 Odwrócony transport cholesterolu.

Podsumowując, obwodowe (niewątrobowe) komórki otrzymują swój cholesterol z połączenia lokalnej syntezy i pobierania uprzednio wytworzonego cholesterolu z VLDL i LDL. Dla odmiany, odwrócony transport cholesterolu (RCT) jest szlakiem, dzięki któremu cholesterol komórek obwodowych może powrócić do wątroby do recyrkularyzacji do tkanek pozawątrobowych lub wydzielenia do jelita w żółci. Szlak RCT stanowi jedyny sposób eliminacji cholesterolu z większości tkanek pozawątrobowych i jest istotny dla utrzymania struktury i funkcji większości komórek w ciele.

RCT składa się głównie z trzech etapów: (a) wypływu cholesterolu, wstępnego usunięcia cholesterolu z puli komórek obwodowych; (b) estryfikacji cholesterolu poprzez działanie acylotransferazy lecytyna:cholesterol (LCAT), zapobiegającej powtórnemu wejściu wypłyniętego cholesterolu do komórek; (c) poboru/dostarczenia estrów cholesterylu HDL do komórek wątroby. W szlaku RCT biorą udział HDL. HDL jest ogólną nazwą dla cząsteczek lipoprotein, charakteryzujących się wysoką gęstością. Głównymi składnikami lipidowymi kompleksów HDL są różne fosfolipidy, cholesterol (estry) i trójglicerydy. Najbardziej widocznymi komponentami apolipoproteinowymi są: A-I i A-II, które determinują funkcjonalne cechy HDL; co więcej, obserwowano niewielkie ilości apolipoprotein C-I, C-II, C-III, D, E, J, itp. HDL może istnieć w szerokim zakresie różnych wielkości i różnych mieszanin wyżej wspomnianych składników w zależności od stanu remodelowania podczas kaskady metabolicznej RCT.

Kluczowym enzymem związanym z RCT jest acylotransferaza lecytynowo-cholesterolowa (LCAT). LCAT jest produkowana głównie w wątrobie i krąży w osoczu związanym z frakcją HDL. Białko transportujące estry cholesterylu (CETP) i kolejne białko przenoszące fosfolipidy (PLTP) przyczyniają się do dalszego przekształcania krążącej populacji HDL. CETP może przemieszczać estry cholesterylu wyprodukowane przez LCAT do innych lipoprotein, w szczególności lipoprotein zawierających ApoB, takich jak VLDL i LDL. Trójglicerydy HDL mogą być katabolizowane przez zewnątrzkomórkową wątrobową lipazę trójglicerydów a cholesterol z lipoprotein jest usuwany przez wątrobę poprzez kilka mechanizmów.

Każda z cząsteczek HDL zawiera co najmniej jedną kopię (zazwyczaj dwie do czterech) ApoA-I. ApoA-I jest syntetyzowana w wątrobie i jelicie cienkim jako preproapolipoproteina, wydzielana jako probiałko, które jest szybko cięte, aby wytworzyć dojrzały peptyd mający 243 reszty aminokwasowe. ApoA-I składa się głównie z od 6 do 8 różnych 22-aminokwasowych powtórzeń przedzielonych łącznikiem, którym często jest prolina. Iw niektórych przypadkach składa się z odcinka zbudowanego z kilku reszt. ApoA-I tworzy z lipidami trzy typy stabilnych kompleksów: małe ubogie w lipidy kompleksy określane jako pre-β-Ι HDL; spłaszczone, dyskowe cząsteczki zawierające jedynie polarne lipidy (fosfolipidy i cholesterol) określone jako pre^-2 HDL; kuliste cząstki zawierające lipidy zarówno polarne jak i niepolarne, nazwane sferycznymi lub dojrzałymi HDL (HDL3 i HDL2). Większość HDL w populacji krążącej zawiera zarówno ApoA-Ii ApoA-II (drugie główne białko HDL) i jest tutaj nazywane jako frakcja

PL 193 662 B1

ApoA-I i ApoA-II. Jednakże, frakcja HDL zawierająca jedynie ApoA-I (nazwana tutaj jako frakcja AI-HDL) wydaje się być bardziej efektywna w RCT. Niektóre badania epidemiologicze potwierdzają hipotezę, że frakcja AI-HDL jest miażdżycogenna. (Parra i wsp. 1992, Arterioscler. Thromb. 12: 701-707; Decossin i wsp. 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27: 299-307).

Chociaż nieznany jest mechanizm transportu cholesterolu z powierzchni komórki uważa się, że ubogi w lipidy kompleks, pre-β-Ι HDL jest korzystnym akceptorem cholesterolu przenoszonego z tkanek peryferyjnych biorących udział w RCT. Cholesterol świeżo przeniesiony z powierzchni komórki do pre^-1 HDL szybko pojawia się w dyskoidalnym pre^-2 HDL. PLTP może zwiększać szybkość tworzenia się dysku, jednak brakuje danych wskazujących na rolę PLTP w RCT. LCAT korzystnie reaguje z dyskowymi i kulistymi HDL, przenosząc grupę 2-acylo z lecytyny lub innych fosfolipidów na wolną resztę hydroksylową steroidów, w szczególności cholesterolu, tworząc estry cholesterylu (zatrzymywane w HDL) i lizolecytynę. Reakcja LCAT wymaga ApoA-I jako aktywatora; tj. ApoA-Ijest naturalnym kofaktorem LCAT. Konwersja cholesterolu do estrów zatrzymywanych w HDL zapobiega powtórnemu wnikaniu cholesterolu do komórki, w rezultacie powodując usunięcie estrów cholesterolu. Estry cholesterylu w dojrzałych cząsteczkach HDL we frakcji AI-DHL (tj.ApoA-I i nie ApoA-II) są usuwane przez wątrobę w przekształcane w żółć bardziej skutecznie, niż te pochodzące z HDL zawierającego zarówno ApoA-I jak i ApoA-II (frakcja AI/AII-HDL). Może to częściowo wynikać, z bardziej skutecznego wiązania AI-HDL do błon hepatocytów. Postulowano istnienie receptora HDL i ostatnio receptor wymiataczy, SR-BI został zidentyfikowany jako receptor HDL. (Acton i wsp. 1996, Science 271:518-520). SR-BI jest produkowany obficie w tkankach steroidogennych (np. nadnerczach) oraz w wątrobie. (Landshulz i wsp. 1996, J. Clin. Invest. 98: 984-995; Rigotti i wsp. 1996, J. Biol. Chem. 271:33545-33549).

CEPT nie wydaje się odgrywać znaczącej roli w RCT, zamiast tego jest uwikłany w metabolizm lipidów pochodzących od VLDL i LDL. Jednakże, zmiany w aktywności CETP lub jego akceptorów, VLDL i LDL odgrywają role w remodelowaniu populacji HDL. Na przykład w nieobecności CETP, HDL stają się powiększonymi, nieusuwalnymi cząsteczkami. (Przeglądy RCT i HDL, patrz Fielding & Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36: 211-228; Barrans i wsp. 1996, Biochem. Biophys. Acta. 1300: 73-85; Hirano i wsp. 1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17(b):1053-1059).

2.3.Aktualneterapieobniżającecholesterolwsurowicy

Obecnie dostępnych jest szereg terapii obniżających cholesterol i trójglicerydy w surowicy, (patrz, np. Brown & Goldstein, powyżej).Jednakże, każda z nich ma swoje wady i ograniczenia wzakresie skuteczności, efektów ubocznych i wyboru populacji pacjentów.

Żywice wiążące kwasy żółciowe są klasą leków zaburzających recyrkulację kwasów żółciowych pomiędzy jelitem a wątrobą; np. cholestyramina (Questran Light®, Bristol-Myers Squibb) i chlorowodorek kolestypolu (Colestid®, The Upjohn Company). Pobierane doustnie te dodatnio naładowane nośniki wiążą negatywnie naładowane kwasy żółciowe w jelicie. Ponieważ żywice nie mogą być wchłonięte z jelita, są one wydalane unosząc ze sobą kwasy żółciowe. Stosowanie takich żywic jednakże, w najlepszym wypadku obniża poziom cholesterolu jedynie o około 20% i jest związane z efektami ubocznymi ze strony przewodu pokarmowego, w tym zaparciem i niedoborem pewnych witamin. Co więcej, ponieważ żywice wiążą inne leki, pozostałe leki doustne musząbyć podawane najmniej jedną godzinę przed lub cztery do sześciu godzin po spożyciu żywicy; w ten sposób komplikując rygory pobierania lekarstw pacjentów z chorym sercem.

Statyny są czynnikami obniżającymi poziom cholesterolu, które blokują syntezę cholesterolu poprzez hamowanie reduktazy AMGCoA - kluczowego enzymu związanego ze ścieżką biosyntezy cholesterolu. Statyny, np. Lowastatyna (Mevacor®, Merck & Co., Inc.) i prawastatyna (Pravachol®, Bristol-Myers Squibb Co.) są czasami stosowane w powiązaniu z żywicami wiążącymi kwasy żółciowe. Statyny znacząco redukują poziomy cholesterolu i LDL w surowicy. Jednakże, poziom cholesterolu HDL w surowicy wzrasta tylko umiarkowanie. Mechanizm efektu obniżania cholesterolu może dotyczyć zarówno obniżenia stężenia VLDL i indukcji komórkowej ekspresji receptora LDL, prowadząc do obniżonej produkcji i/lub zwiększonego katabolizmu LDL. Efekty uboczne, w tym dysfunkcje wątroby i nerek są związane ze stosowaniem tych leków (Physicians Desk Reference, Medical Economics Co., Inc., Montvale, N.J. 1997). Ostatnio, FDA dopuściła atorwastatynę (inhibitor reduktazy HMGroA opracowany przez Parke-Davis (Warner Lambert) do leczenia rzadkich ale naglących przypadków rodzinnej hipercholesterolemii (1995, Scrip 20 (19):10).

Niacyna, lub inaczej kwas nikotynowy, jest rozpuszczalnym w wodzie kompleksem witaminy B stosowanym jako uzupełnienie diety i czynnik przeciwhiperlipidowy. Niacyna obniża produkcję VLDL i skutecznie obniża LDL. Stosowana jest w powiązaniu z żywicami wiążącymi kwasy żółciowe. Niacyna

PL 193 662 B1 może zwiększyć HDL, gdy jest stosowana w odpowiednich dawkach, jednakże jej użyteczność jest ograniczona przez poważne efekty uboczne jeśli zostanie zastosowana w takich dawkach.

Fibraty są klasą leków obniżających poziom lipidów stosowanych do leczenia różnych form hiperlipidemii (tj. podwyższonego poziomu trójglicerydów w surowicy), które mogą być również związane z hipercholesterolemią. Fibraty wydają się obniżać frakcje VLDL i nieznacznie podnosić HDL -jednakże wpływ tych środków na poziom cholesterolu w surowicy jest zmienny. W Stanach Zjednoczonych fibraty zostały zaaprobowane do użytku jako środki przeciwlipideniczne, ale nie uzyskały pozwolenia jako środki przeciwko hipercholesterolemii. Na przykład klofibrat (Atromid-S®, Wyeth-Ayerest Laboratories) jest środkiem przeciwlipidenicznym, który działa aby obniżyć (poprzez nieznany mechanizm) trójglicerydy poprzez redukcje frakcji VLDL. Chociaż cholesterol może być obniżony w niektórych subpopulacjach pacjentów, odpowiedź biochemiczna na lekarstwo jest zróżnicowana, i nie zawsze możliwe jest przewidzenie u którego z pacjentów wystąpią pozytywne efekty. Atromid-S® nie okazał się efektywny dla zapobiegania chorobie wieńcowej serca. Chemicznie i farmakologicznie pokrewne lekarstwo, gemfibrozyl (Lopid®, Parke-Davis) jest czynnikiem regulującym lipidy, który w sposób umiarkowany zmniejsza trójglicerydy i cholesterol VLDL w surowicy oraz cholesterol HDL - zarówno subfrakcje HDL2 i HDL3, jak i ApoA-I oraz A-II (tzn. frakcję AI/AII-HDL). Jednakże, odpowiedź lipidowa jest heterogenna, zwłaszcza wśród różnych populacji pacjentów. Co więcej, podczas gdy u mężczyzn pomiędzy 40-55 rokiem życia, bez historii lub symptomów istniejącej choroby wieńcowej, obserwowano zapobieganie chorobie wieńcowej serca, nie jest pewne w jakim stopniu te wyniki mogą być ekstrapolowane na inne populacje pacjentów (np. kobiet, starszych bądź młodszych mężczyzn). Nie obserwowano wręcz żadnej skuteczności u pacjentów z rozwiniętą chorobą wieńcową serca. Z użyciem fibratów wiążą się poważne efekty uboczne w tym toksyczność taka jak złośliwe nowotwory (zwłaszcza nowotwory przewodu pokarmowego), choroby woreczka żółciowego i zwiększona śmiertelność niezwiązana z chorobą wieńcową. Leki te nie są przeznaczone do leczenia pacjentów z wysokim, LDL lub niskim HDL jako jedynym zaburzeniem lipidowym (Physicians Desk Reference, 1997, Medical Economics Co., Inc., Montvale, N.J.).

Doustna estrogenowa terapia zastępcza może być brana pod uwagę przy umiarkowanej hipercholesterolemii u kobiet po menopauzie. Jednak wzrostowi HDL może towarzyszyć wzrost trójglicerydów. Terapia estrogenowa jest oczywiście ograniczona do specyficznej populacji pacjentów (kobiet po menopauzie) i jest związana z poważnymi efektami ubocznymi w tym indukcją złośliwych nowotworów, choroby woreczka żółciowego, choroby zakrzepowej gruczolaka wątroby, zwiększonego ciśnienia krwi, nietolerancji glukozy, i hiperkalcemii.

A zatem istnieje potrzeba rozwinięcia bezpieczniejszych leków, które są skuteczne w obniżaniu cholesterolu w surowicy, zwiększają poziom HDL w surowicy, zapobiegają chorobie wieńcowej serca i/lub leczeniu istniejącej choroby.

2.4. ApoA-I jako cel.

Żaden z obecnie dostępnych środków do bezpiecznego obniżenia cholesterolu nie podnosi w sposób bezpieczny poziomu HDL i nie stymuluje RCT - większość wydaje się działać na szlak transportu cholesterolu, modulując pobór pokarmu, recyrkulację, syntezę cholesterolu i populację VLDL.

Podczas gdy potrzebne jest znalezienie środków, które stymulują wypływ i usuwanie cholesterolu, istnieje kilka potencjalnych celów w RCT - np. LCAT, HDL i różne składniki (ApoA-I, ApoA-II i fosfolipidy), PLTP i CETP -i nie wiadomo, który cel mógłby być najbardziej efektywny w osiąganiu pożądanych profili lipoprotein i efektów ochronnych. Zaburzenie jakiegokolwiek pojedynczego składnika szlaku RCT ostatecznie wpływa na skład populacji krążących lipoprotein i skuteczność RCT.

Kilka linii dowodów opartych na danych otrzymanych in vivo wskazuje na udział HDL i jego głównego składnika białkowego, ApoA-I, w zapobieganiu lezjom miażdżycowym, i potencjalnie, regresji złogów -co czyni je atrakcyjnymi celami dla interwencji terapeutycznej. Po pierwsze, istnieje odwrócona korelacja pomiędzy stężeniem ApoA-I w surowicy (HDL) i rozwojem miażdżycy u człowieka (Gordon & Rifkind, 1989, N. Eng. J. Mod. 321: 1311-1316; Gordon i wsp. 1989, Circulation 79: 8-15). W istocie, specyficzne subpopulacje HDL zostały powiązane ze zmniejszonym ryzykiem arteriosklerozy u ludzi (Miller, 1987, Amer. Heart 113: 589-597; Cheung i wsp. 1991, Lipid Res. 32: 383-394).

Po drugie, badania na zwierzętach potwierdzają ochronną rolę ApoA-I (HDL). Podawanie karmionym cholesterolem królikom ApoA-I lub HDL zmniejsza rozwój i postęp złogów (złogi tłuszczu) u karmionych cholesterolem królików. (Koizumii wsp. i 1988, J. Lipid Res. 29: 1405-1415; Badimon i wsp. 1989, Lab. Invest. 60: 455-461; Badimon i wsp.1990, J. Clin. Invest. 85: 1234-1241). Jednak skuteczność różniła się w zależności od źródła HDL (Beitz i wsp. 1992, 30 Prostaglandins, Leukotrienes

PL 193 662 B1 and Essential Fatty Acids 47: 149-152; Mezdour i wsp. 1995, Atherosclerosis 113: 237-246). Po trzecie, bezpośrednie dowody na rolę ApoA-I zostały otrzymane z eksperymentów na transgenicznych zwierzętach. Ekspresja ludzkiego genu ApoA-I przeniesionego do myszy genetycznie predysponowanych do indukowanej dietą miażdżycy chroniła przed rozwojem lezji aort (Rubin i wsp. 1991, Nature 353: 265-267). Wykazano, że ApoA-I transgen powodował supresję miażdżycy tętnic u myszy pozbawionych ApoE i myszy transgenicznych Apo(a) (Paszty i wsp. 1994, J. Clin. Invest. 94: 899-903; Plump i wsp. 1994, Proc. Natl. Acad. 5 Sci. USA 91: 9607-9611, Lin i wsp. 1994, J. Lipid Res. 35: 2263-2266). Podobne wyniki zaobserwowano u transgenicznych królików produkujących ludzką ApoA-I (Duverger, 1996, Circulation 94: 713-717; Duverger i wsp. 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16: 1424-1429; Emmanuel i wsp. 1997, 10 Artheriosclerosis 1035: 144), i u transgenicznych szczurów gdzie podniesione poziomy ludzkiej ApoA-I chroniły przed miażdżycą tętnic i hamowały restenozę po angioplastyce balonowej (Burkey i wsp. 1992, Circulation, Supplement I, 86: 1-472, Abstract No. 1876; Burkey i wsp. 1995, J. Lipid 15 Res. 36: 1463-1473).

AI-HDL wydają się być bardziej wydajne w RCT niż frakcja AI/AII-HDL. Badania z myszami transgenicznymi dla ludzkiej ApoA-I lub ApoA-I oraz ApoA-II (AI/AII) wykazały, że skład białkowy HDL w sposób znaczący wpływa na jego rolę - Al-HDL, jest bardziej przeciwmiażdżycowy niż AI/AII-HDL (Schultz i wsp. 1993, Nature 365: 762-764). Równolegle badania dotyczące myszy transgenicznych produkujących ludzki gen LCAT pokazują, że umiarkowany wzrost aktywności LCAT znacząco zmienia poziomy lipoprotein cholesterolu i że LCAT ma znaczącą preferencję dla HDL zawierającego ApoA-I (Francone i wsp. 1995, J. Clinic. Invest. 96: 1440-1448; Beard i wsp. 1997, Nature Medicine 3,7: 744-749). Podczas gdy te wyniki potwierdzają znaczącą rolę ApoA-I w aktywowaniu LCAT i stymulacji RCT, dodatkowe badania pokazują bardziej skomplikowany scenariusz: główny komponent HDL, który moduluje wpływ komórkowego cholesterolu jest fosfolipidem (Fournier i wsp. 1996, J. Lipid Res. 37: 1704-1711).

W obliczu potencjalnej roli HDL, tj. zarówno ApoA-I i związanych z nim fosfolipidów, w ochronie przeciwko chorobie miażdżycowej, rozpoczęte zostały ludzkie badania kliniczne stosujące rekombinowaną ApoA-I, przerwane i najwyraźniej powtórnie rozpoczęte przez UCB Belgium (Pharma Projects, 27 październik, 1995; IMS R&D Focus, June 30, 1997; Drug Status Update, 1997, Atherosclerosis 2(6): 261-265); patrz również M. Eriksson at Congress, „The Role of HDL in Disease Prevention,” Nov. 7-9, 1996, Fort Worth; Lacko & 5 Miller, 1997, J. Lipid Res. 38: 1267-1273; and W094/13819) oraz rozpoczęte i przerwane przez Bio-Tech (Pharmaprojects, April 7, 1989). Podjęte zostały również próby zastosowania ApoA-I i związanych z nim fosfolipidów w leczeniu szoku septycznego (Opal, „Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis,” IBCs 7th Annual International 10 Conference on Sepsis, April 28-30, 1997, Washington, D.C.; Gouni i wsp. 1993, J. Lipid Res. 94: 139-146; Levine W096/04916). Jednakże, istnieje wiele pułapek związanych z produkcją i zastosowaniem ApoA-I czyniących ją mniej niż idealnym środkiem; np. ApoA-I jest dużym białkiem, trudnym i kosztownym w produkcji; znaczące problemy wytworzenia i powielania muszą zostać pokonane z uwzględnieniem stabilności w trakcie transportu, dostarczania aktywnego produktu i czasu półtrwania in vivo.

W obliczu tych pułapek, podjęto próby przygotowania peptydów naśladujących ApoA-I. Ponieważ kluczowa aktywność ApoA-I została przypisana obecności licznych powtórzeń unikalnej cechy struktury drugorzędowej - amfipatycznej α-helisy klasy A (Segrest, 1974, FEBS Lett. 38: 247-253), większość wysiłków zaprojektowania peptydów, które naśladują aktywność ApoA-I skupiło się na zaprojektowaniu peptydów formujących amfipatyczną α-helisę klasy A.

Amfipatyczne α-helisy klasy A są unikalne w tym, że reszty aminokwasowe o pozytywnym ładunku są zgromadzone na powierzchniach hydrofobowo-hydrofilowych, a reszty aminokwasowe o negatywnychładunkach są zgromadzone w centrum powierzchni hydrofilowej. Negatywnie, co więcej, Klasa A β-helikalnych peptydów posiada kąt hydrofobowy mniej niż 180° (Segrest i wsp. PROTEINS, 1990; Structure, Function and Genetics 8: 103-117). Początkowe strategie projektowania de novo naśladujących ApoA-I peptydów nie były oparte na pierwszorzędowych sekwencjach naturalnie występujących apolipoprotein ale raczej na włączeniu zarówno tych unikalnych cech helisy Klasy A do sekwencji analogów peptydowych jak i niektórych własności domen ApoA-I (patrz np. Davidson i wsp. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13605-13610; Rogers i wsp.1997, Biochemistry 36: 288-300; Lins i wsp. 1993, Biochim. Biophys. Acta 5 biomembranes 1151:137-142; Ji and Jonas, 1995, J. Biol. Chem. 270: 11290-11297; Collet i wsp. 1997, Journal of Lipid Research, 38:634-644; Sparrow and Gotto, 1980, Ann. N.Y. Acad. Sci. 348:187-211; Sparrow and Gotto, 1982, CRC Crit. Rev. Biochem. 13:87-107; Sorci-Thomas i wsp. 1993, J. Biol. 10 Chem. 268: 21403-21409; Wang i wsp. 1996, Biochim. Biophys. Acta 174-184;

PL 193 662 B1

Minnich i wsp. 1992, J. Biol. Chem. 267: 16553-16560; Holvoet i wsp. 1995, Biochemistry 34: 13334-13342;

Sorci-Thomas i wsp. 1997, J. Biol. Chem. 272 (11): 7278-7284; and Frank i wsp. 1997, Biochemistry

36: 1798-1806).

W jednym z badań, Fukushima i wsp., zsyntetyzowali 22-aminokwasowy peptyd złożony całkowicie z reszt Glu, Lys i Leu ułożonych periodycznie tworzących amfipatyczną α-helisę z jednakowymi powierzchniami hydrofilowymi i hydrofobowymi („peptyd ELK”) (Fukushima i wsp. 1960, J. Biol. Chem. 255: 10651-10657; Fukushima i wsp.1979, J. Amer. Chem. Soc. 101(13): 3703-3704). ELK peptyd posiada41% homologii sekwencji z 198-219 fragmentem ApoA-I. Jak badano jakościową ultrafiltracją, chromatografie przepuszczalności żelowej i ciągłym dichroizmem, peptyd ELK efektywnie wiąże się fosfolipidami i naśladuje niektóre z fizycznych i chemicznych właściwości ApoA-I (Kaiser i wsp. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1137-1140; Kaiser i wsp. 1984, Science 223: 249-255; Fukushiroa i wsp. 1980, powyżej; Nakagawa i wsp. 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 7087-7092). Yokoyama i wsp. wywnioskowali z takich badań że istotnym czynnikiem dla aktywacji LCAT jest jedynie obecność wystarczająco dużych struktur amfipatycznych (Yokoyama i wsp. 1980, J. Biol. Chem. 255(15): 7333-7339). Dimer tych 22-aminokwasowego peptydu okazał się później, bardziej dokładnie naśladować ApoA-I niż monomer. Opierając się na tych wynikach założono, że 44-mer, który jest przerwany w połowie przez przełamujące helisę Gly lub Pro, stanowi minimalną domenę funkcjonalną ApoA-I (Nakagawa i wsp. 1985, powyżej).

Inne badania dotyczyły modelu amfipatycznych peptydów zwanych „peptydami LAP” (Pownall i wsp., 1980, Proc. Natl. 5 Acad. Sci. USA 77(b): 3154-3158; Sparrow i wsp. 1981, In. Peptides:SynthesisStructure-Function, Roch and Gross, Eds., Pierce Chem. Co., Rockford, II, 253-256). Opierającsięna badaniach wiązania lipidów z fragmentami natywnych apolipoprotein, zaprojektowano kilka peptydów LAP, oznaczonych LAP-16, LAP-20 i LAP-24 (zawierających odpowiednio, 16, 20 i 24 reszt aminokwasowych). Te modelowe peptydy amfipatyczne nie posiadają homologii z apolipoproteinami i były zaprojektowane tak aby mieć polarne powierzchnie zorganizowane w sposób nie podobny do domen helis amfipatycznych typu klasy A, związanych z apolipoproteinami. Z tych badań, autorzy wywnioskowali, że minimalna długość 20 reszt jest konieczna do przekazania zdolności do wiązania lipidów modelowym peptydom amfipatycznym.

Badania nad mutantami LAP20 zawierającymi resztę proliny w różnych miejscach sekwencji wskazały na istnienie bezpośredniego związku pomiędzy wiązaniem lipidów i aktywacja LCAT, jednak potencjał helikalny samego peptydu nie prowadzi do aktywacji LCAT (Ponsin i wsp. 1986 J. Biol. Chem. 261(20): 9202-9205). Co więcej, obecność łamiącej helisę Pro blisko środka peptydu redukowała jego powinowactwo do powierzchni fosfolipidów jak również jego zdolność do aktywacji LCAT. Podczas gdy pewne peptydy LAP miały zdolność do wiązania fosfolipidów (Sparrow i wsp. powyżej), istnieje kontrowersja co do stopnia w jakim peptydy LAP są helikalne w obecności lipidów (Buchko i wsp.1996, J. 30 Biol. Chem. 271(6): 3039-3045; Zhong i wsp.1994, Peptide Research 7(2): 99-106).

Segrest i wsp., zsyntetyzowali peptydy złożone z od 18 do 24 reszt aminokwasowych, które niemają homologii sekwencji z helisami ApoA-I (Kannelis i wsp. 1980, 35 J. Biol. Chem. 255(3): 11464-11472; Segrest i wsp. 1983, J. Biol. Chem. 258: 2290-2295). Sekwencje były specyficznie zaprojektowane aby naśladować amfipatyczne domeny helikalne klasy A wymiennych apolipoprotein w zakresie momentu hydrofobowego (Eisenberg i wsp. 1982, Nature 299: 371-374) i rozmieszczenia ładunku (Segrest i wsp. 1990, Proteins 8: 103-117; U.S. Patent No. 4,643,988).

Jeden 18-resztowy peptyd, „18A” został zaprojektowany aby stanowić model klasy A α-helisy (Segrest i wsp. 1990, powyżej). Badania z tymi peptydami i innymi peptydami posiadającymi odwrócone rozmieszczenie ładunku, jak peptyd „18A”, stale wykazywały, że rozmieszczenie ładunku jest krytyczne dla aktywności; peptydy z odwróconym rozmieszczeniem ładunków wykazują zmniejszone powinowactwo do lipidów relatywne do 18A peptydów naśladujących klasę A i mniejszą zawartość helisy w obecności lipidów (Kanellis i wsp. 1980, J. Biol. Chem. 255: 11464-11472; Anantharamaiah i wsp.1985, J. Biol. Chem. 260:10248-10255; Chung i wsp.1985, J. Biol. 15 Chem. 260: 10256-10262; Epand i wsp.1987, J. Biol. Chem. 262: 9389-9396; Anantharamaiah i wsp.1991, Adv. Exp. Med. Biol. 285: 131-140).

Inne syntetyczne peptydy nie osiadające homologii sekwencji z apolipoproteinami, które zaproponowano z mniejszym powodzeniem dotyczą dimerów i trimerów peptydu 18A (Anatharamaiah i wsp. 1986, Proteins of Biological Fluids 34: 63-66), peptydów GALA i EALA (Subbarao i wsp. 1988, Proteins: Structure, Function and Genetics 3: 187-198), peptydów ID (Labour i wsp. 1997, Arteriosclerosis,

PL 193 662 B1

Thrombosis, and Vascular Biology 17: 580-588) oraz peptydów 18AM4 (Brasseur i wsp. 1993, Biochem.

Biophys. Acta 1170: 1-7).

Zaprojektowany został również peptyd konsensusowy zawierający 22 reszty aminokwasowe oparte na sekwencjach ludzkiej ApoA-I (Venkatachalapathi i wsp. 1991, Mol. Conformation and Bio. Interactions B: 585-596). Sekwencja została skonstruowana przez identyfikację najbardziej dominującej reszty w każdej pozycji helis ApoA-I. Podobnie jak opisane powyżej peptydy, helisa tworzona przez ten peptyd ma reszty aminokwasowe o pozytywnym ładunku zebrane na powierzchni hydrofilowo:hydrofobowej, reszty aminokwasowe o negatywnym ładunku zebrane w centrum powierzchni hydrofilowej i kąt hydrofobowy mniejszy niż 180°. Podczas gdy dimer tego peptydu jest w jakiś sposób efektywny w aktywowaniu LCAT, monomer wykazywał słabe własności wiązania lipidów (Vekatachalapathi i wsp. 1991, powyżej).

W oparciu głównie o badania in vitro z opisanymi powyżej peptydami, pojawił się zestaw zasad do projektowania peptydów naśladujących funkcje ApoA-I. Uważa się, że amfipatyczna α-helisa posiadająca reszty o pozytywnych ładunkach zebranych na powierzchni hydrofilowo-hydrofobowej i reszty o negatywnym ładunku zebrane w centrum powierzchni polarnej jest znacząco wymagana do powinowactwa do lipidów i aktywacji LCAT (Venkatachalapathi i wsp. 1991, powyżej). Anantharamaiah i wsp. również wykazali, że reszta Glu o negatywnym ładunku w pozycji 13 koncensusowego 22-merowego peptydu, umiejscowionego wewnątrz hydrofobowej powierzchni α-helisy, odgrywa istotną rolę w aktywacji LCAT (Anantharamaiah i wsp. 1991, powyżej). Co więcej, Brasseur wskazał, że kąt hydrofobowy (kąt pho) mniejszy niż 180° jest wymagany dla optymalnej stabilności kompleksu lipidowo-apolipoproteinowego, i również odpowiada za formowanie dyskoidalnych cząstek posiadających peptydy wokół krawędzi dwuwarstwy lipidowej (Brasseur, 1991, J. Biol. Chem. 66(24): 16120-16127). Rosseneu i wsp., wskazywali również, że kąt hydrofobowy mniejszy niż 180° jest wymagany dla aktywności LCAT (W093/25581).

Jednakże, pomimo tych zasad do chwili obecnej nikt nie zaprojektował lub wyprodukował peptydu tak aktywnego jak ApoA-I, najlepszy miał mniej niż 40% aktywności ApoA-I mierzonej opisanym tutaj testem aktywacji LCAT. Żaden z „mimetyków” opisanych w literaturze nie okazał się skutecznym lekarstwem.

W związku z tym, istnieje potrzeba rozwoju stabilnego agonisty ApoA-I, który naśladuje aktywność ApoA-I i jest relatywnie prosty i efektywny w kosztach produkcji. Jednakże, „zasady” projektowania skutecznych naśladowców ApoA-I nie były rozwikłane a zasady wynalezienia molekuł organicznych o funkcji ApoA-I są nieznane.

Przedmiotem wynalazku jest więc sekwencja nukleotydowa kodująca agonistę ApoA-I wykazującego co najmniej 38% aktywację acylotransferazy lecytynowo-cholesterolowej (LCAT) w stosunku do ludzkiej ApoA-I, zawierającego (i) 15-29 reszt peptydu lub analogu peptydu, który tworzy amfipatyczne α-helisy w obecności lipidówi który posiada wzór strukturalny (I):

^X1^-X2^-X3^-X4^-X5^-X6^-X7^-X8^-X9^-X10^-X11^-X12^-X13^-X14^-X15^-X16^-X17^-X18^-X19^-X20^-X21^-X22^-X23 lubjego ich farmaceutycznie dopuszczalna sól, gdzie:

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G),Gln (Q), Asp (D)lub Asn (N); X2 oznacza resztę alifatyczną;

X3 oznacza Leu (L) lub Phe(F);

X4 oznacza resztę kwasową;

X5 oznacza Leu (L) lub Phe(F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe(F);

X7 oznacza resztę hydrofilową;

X8 oznacza aminokwasową resztę kwasową lub zasadową;

X9 oznacza Leu (L) lubGly (G);

X10 oznacza Leu (L), Trp(W)lub Gly (G);

XII oznacza aminokwasową resztę hydrofilową;

X12 oznacza aminokwasową resztę hydrofilową;

X13 oznacza Gly(G)lub aminokwasową resztę alifatyczną;

X14 oznacza Leu (L), Trp(W)lub Gly (G);

X15 oznacza aminokwasową resztę hydrofilową;

X16 oznacza aminokwasową resztę hydrofobową;

X17 oznacza aminokwasową resztę hydrofobową;

PL 193 662 B1

X18 oznacza aminokwas zasadowy, GLN (Q) lub ACN (N);

X19 oznacza aminokwas zasadowy, GLN (Q) lub ACN (N);

X20 oznacza aminokwas zasadowy;

X21 oznacza aminokwas alifatyczny;

X22 oznacza aminokwas zasadowy;

X23 oznacza brak lub reszę zasadową; lub (ii) wydeletowaną postać wzoru strukturalnego (I) w którym co najmniej jedna do ośmiu reszt uległa delecji X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16, X17, X18, X19, X20, X21i X22; lub (iii) zmienioną postać wzoru strukturalnego (I) w którym co najmniej jedna z reszt X1, X2, X3, X4, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂ lub X₂₃ jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

Sekwencja nukleotydowa według wynalazku korzystnie koduje agonistę ApoA-I posiadającego sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:

peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd

GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK

PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFKELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELGNELLEALKQKLK

PVLDLFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK

GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELWNELLEALKQKLK

PVLDLLRELLNELLEALKQKLK

PVLELFKELLQELLEALKQKLK

GVLDLFRELLNELLEALKQKLK 20 PVLDLFREGLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK

PLLELFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALQKKLK 26 PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

PVLDLFRELLNELWEALKQKLK

AVLDLFRELLNELLEALKQKLK 123 QVLDLFRELLNELLEALKQKLK

125 NVLDLFRELLNELLEALKQKLK

126 PVLDLFRELLNELGEALKQKLK

127 PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

128 PVLDLFRELLNELLEFLKQKLK

129 PVLELFNDLLRELLEALQKKLK

130 PVLELFNDLLRELLEALKQKLK

131 PVLELFKELLNELLDALRQKLK

132 PVLDLFRELLENLLEALQKKLK

133 PVLELFERLLEDLLQALNKKLK

134 PVLELFERLLEDLLKALNQKLK

135 DVLDLFRELLNELLEALKQKLK

136 PALELFKDLLQELLEALKQKLK

138 PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK

139 PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK

141 PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK

142 PVLELFRELLNEGLEALKQKLK

(SEQ	ID	NO	2) ;
(SEQ	ID	NO	3) ;
(SEQ	ID	NO	4) ;
(SEQ	ID	NO	7) ;
(SEQ	ID	NO	8) ;
(SEQ	ID	NO	9) ;
(SEQ	ID	NO	11) ;
(SEQ	ID	NO	12) ;
(SEQ	ID	NO	13) ;
(SEQ	ID	NO	15) ;
(SEQ	ID	NO	16) ;
(SEQ	ID	NO	17) ;
(SEQ	ID	NO	18) ;
(SEQ	ID	NO	20) ;
(SEQ	ID	NO	22) ;
(SEQ	ID	NO	23) ;
(SEQ	ID	NO	24) ;
(SEQ	ID	NO	26) ;
(SEQ	ID	NO	28) ;
(SEQ	ID	NO	29) ;
(SEQ	ID	NO	123)
(SEQ	ID	NO	125)
(SEQ	ID	NO	126)
(SEQ	ID	NO	127)

(SEQ	ID	NO:128)
(SEQ	ID	NO:129)
(SEQ	ID	NO:130)
(SEQ	ID	NO:131)
(SEQ	ID	NO:132)
(SEQ	ID	NO:133)
(SEQ	ID	NO:134)
(SEQ	ID	NO:135)
(SEQ	ID	NO:136)
(SEQ	ID	NO:138)
(SEQ	ID	NO:139)
(SEQ	ID	NO:141)
(SEQ	ID	NO:142)

PL 193 662 B1

Przedmiotem wynalazku jest także agonista ApoA-I kodowany przez sekwencję nukleotydową jak zdefiniowano powyżej, wykazujący co najmniej około 38% aktywację LCAT w porównaniu z ludzką

ApoA-I.

Przedmiotem wynalazku jest również agonista ApoA-I kodowany przez sekwencję nukleotydową jak zdefiniowano powyżej charakteryzujący się tym, że stanowi go zmieniona postać wzoru strukturalnego (I). Przedmiotem wynalazku jest też agonista ApoA-I kodowany przez taką sekwencję nukleotydową o zmienionym wzorze strukturalnym (I), w którym reszty hydrofobowe są przyłączone według wzoru strukturalnego (I) i co najmniej jedna nieprzyłączona reszta jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

W korzystnej realizacji wynalazku w agoniście ApoA-I

XI oznaczaPro(P),Gly(G)lubAla(A);

X2 oznacza Ala (A), Leu (L) lub Val (V);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X13 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X16oznacza Ala(A),Trp(W),lub Gly(G);Leu(L)lubPhe(F);

X17 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X22 oznacza Leu (L); i conajmniejjednazX4,X7,X8, X11,X12, X14, X15,X18, X19,X20, X22 i X23 jestkonserwatywniepodstawionainnąresztą.

W innej korzystnej postaci wynalazku w agoniście ApoA-I reszty hydrofilowe są przyłączone zgodnie ze wzorem strukturalnym (I) i co najmniej jedna nieprzyłączona reszta jest konserwatywnie podstawiona inną resztą. Jeszcze bardziej korzystną postacią w takim przypadku realizacji jest agonita ApoA-I w którym:

X4 oznacza Asp (D) lub Glu;

X7 oznacza Lys (K), Arg (R);

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

XII oznaczaAsn(N)lubGlu(E);

X12 oznacza Glu (E) lub Asp (D);

X15 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub Lys (K);

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub Lys (K);

X20 oznaczaLys(K);

X22 oznaczaLys(K);

X23 brakujealbooznaczaLys(K);i co najmniej jedna z X1, X2, X3, X5, X6, X9, X10, X13, X14, X16, X17 i X21 jest konserwatywnie podstawiona innąresztą.

Wjeszcze bardziej korzystnej postaci w agoniście ApoA-I:

X3oznacza Leu (L) lub Phe (F), X6oznacza Phe (F), X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G), X10oznacza Leu (L) lub Trp (W),lub Gly (G) i co najmniej jedna z X1, X2, X5, X13, X14, X16, X17 i X21 jest konserwatywnie podstawiona innąresztą.

W innej korzystnej postaci, w agoniście ApoA-I reszta którą się podstawia jest zaklasyfikowana do tej samej subkategorii co reszta podstawiana.

Przedmiotem wynalazku jest także agonista ApoA-I kodowany przez sekwencję nukleotydową według wynalazku zdefiniowaną powyżej, który stanowi wydeletowaną postać wzoru strukturalnego (I). W innej korzystnej postaci agonisty ApoA-I jeden helikalny skręt peptydu lub analogu peptydowego może być wydeletowany.

Przedmiotem wynalazku jest również agonista ApoA-I kodowany przez sekwencję nukleotydową według wynalazku, będący 22-23-resztowym peptydem lub analogiem peptydowym wzoru strukturalnego (I).

PL 193 662 B1

Przedmiotem wynalazku jest również agonista ApoA-I kodowany przez sekwencję nukleotydową według wynalazku, w którym

X1oznaczaPro(P),Ala(A),Gly(G),Gln(Q)lubAsp(D);

X2 oznaczaAla(A),Val(V) lubLeu(L);

X3 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X4 oznaczaAsp(D)lubGlu(E);

X5 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X6 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X7 oznacza Lys (R) lub Arg (R);

X8 oznaczaAsp(D)lubGlu(E);

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznaczaAsn(N)lubGlu(E);

X12 oznaczaGlu(E)lubAsp(D);

X13 oznacza Gly (G) lub Leu (L);

X14 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X15 oznaczaAsp(D)lubGlu(E);

X16oznaczaAla(A),Trp(W),Leu(L),Phe(F)lubGly(G);

X17 oznacza Gly (G) lub Leu (L);

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub Lys (K);

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K); i

X23 brakuje lub oznacza Lys (K).

W korzystnej postaci we wzorze agonisty ApoA-I według wynalazku, X23 może być nieobecny, lub także korzystnie jeden z X18 lubX19 może oznaczać Gln (Q) lub Asn, a inny X18 lubX19 oznacza Lys(K). Również korzystnie, każdy X9, X10, X13, X14, X15 iX17 oznacza inny niż Gly (G); lub też jeden zX9,X10,X13, X14, X15 iX17 oznaczaGly(G)ipozostałesąinneniżGly(G).

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa kodująca multimerycznego agonistę ApoA-I, który wykazuje co najmniej 38% aktywację LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i który ma wzór strukturalny (IV) (IV) HH[LLm-HH]nLLm-HH lubjegofarmaceutyczniedopuszczalnesole,wktórymtowzorze każdemjestniezależnieliczbąnaturalnąod0do1;njest liczbąnaturalnąod0do10;

każde„HH”jestniezależniepeptydemlubanalogiempeptydukodowanymprzezsekwencjęnukleotydową według wynalazku o wzorze strukturalnym(I);i każde„LL”jestniezależniebifunkcjonalnymlinkerem.

Przedmiotem wynalazku jest też komórka gospodarza z ekspresją peptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową kodującą agonistę ApoA-Io wzorze strukturalnym (I), lub sekwencję nukleotydową kodującą multimerycznego agonistę ApoA-Io wzorze strukturalnym (IV).

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencje kodujące agonistę ApoA-Ii dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, wypełniacz lub rozpuszczalnik, przy czym agonista ApoA-I jest kodowany przez sekwencję nukleotydową kodującą agonistę ApoA-I o wzorze strukturalnym (I) lub sekwencję nukleotydową kodującą multimerycznego agonistę ApoA-I o wzorze strukturalnym (IV).

Korzystnie, sekwencja nukleotydowamoże mieć postać kompleksu nukleotydowo-lipidowego, przy czym wspomniany kompleks składa się z sekwencji nukleotydowych kodujących agonistę ApoA-I i lipidu.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie sekwencji nukleotydowej lub komórek gospodarza z ekspresją sekwencji nukleotydowej kodującej agonistę ApoA-Io wzorze strukturalnym (I) lub sekwencji nukleotydowej kodującej multimerycznego agonistę ApoA-Io wzorze strukturalnym (IV) do leczenia pacjentów cierpiących na schorzenia związane z dyslipidemią.

W zastosowaniu według wynalazku agonista ApoA-I występuje w postaci kompleksu agonista ApoA-I-lipid, przy czym kompleks ten zawiera agonistów ApoA-Ii lipid.

PL 193 662 B1

Choroba może być związana z dyslipidemią co oznacza hipercholesterolemię, ewentualnie oznacza chorobę naczyniową, ewentualnie oznacza miażdżycę, ewentualnie oznacza restenozę, ewentualnie oznacza niedobór HDL lub ApoA-I, ewentualnie oznacza hipertriglicerydemię, ewentualnie oznacza syndrom metaboliczny.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie sekwencji nukleotydowej lub komórki gospodarza z ekspresją peptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową kodującą agonistę ApoA-I o wzorze strukturalnym (I) lub sekwencję kodującą multimerycznego agonistę ApoA-I o wzorze strukturalnym (IV) do wytwarzania leku do leczenia osobnika cierpiącego z powodu choroby związanej z endotoksemią/szokiem septycznym.

3. Podsumowania wynalazku

Wynalazek mieści się w dziedzinie genetycznych sposobów dostarczenia sekwencji nukleotydowych kodujących zmodyfikowane formy natywnej apolipoproteiny A-I (ApoA-I) do leczenia chorób związanych z dyslipoproteinemią w tym choroby naczyniowej, miażdżycy, restenozy, hiperlipidemii i innych chorób takich jak szok septyczny. Dotyczy to form ApoA-I takich jak: dojrzałej ApoA-I, preproApoA-I i proApoA-I, w tym natywnej ApoA-I zmodyfikowanej tak, żeby zawierała agonistów ApoA-I, peptydów, które naśladują działanie ApoA-I; superagonistów ApoA-I, peptydów, których aktywność przewyższa aktywność natywnej ApoA-I, zmodyfikowanej natywnej ApoA-I mającej jedną lub więcej helis amfipatycznych zastąpionych przez sekwencje nukleotydowej jednego lub więcej agonistów apolipoproteiny.

W szczególności wynalazek nawiązuje do genetycznych sposobów dostarczenia sekwencji nukleotydowych kodujących zmodyfikowane natywne formy białek ApoA-I i peptydów, które działają jako agoniści ApoA-I zdolne do tworzenia amfipatycznych α-helis (w obecności lipidów), które przybliżają się lub przekraczają aktywność natywnej ApoA-I, np. formacji kompleksów przypominających pre-β lub HDL, sprzyjaniu wypływowi cholesterolu, wiązaniu lipidów, zwiększaniu aktywności LCAT i zwiększaniu poziomu HDL w surowicy.

Niniejszy wynalazek nawiązuje również do sekwencji nukleotydowych kodujących zmodyfikowaną ApoA-I mającą jedną lub więcej helis amfipatycznych zastąpionych przez sekwencje nukleotydowe jednego lub więcej agonistów ApoA-I.

Niniejszy wynalazek nawiązuje do wektorów DNA lub kaset zawierających sekwencje nukleotydowe kodujące zmodyfikowaną ApoA-I lub peptydy, które działają jako agoniści lub superagoniści ApoA-I. W dalszej kolejności wynalazek nawiązuje do wektorów DNA lub kaset zawierających sekwencje nukleotydowe kodujące zmodyfikowane formy natywnego genu ApoA-I. Wektory DNA lub kasety mogą kodować zmodyfikowane formy natywnej ApoA-I lub antagonistów ApoA-I pod kontrolą silnych elementów regulatorowych, które prowadzą do wysokich poziomów ekspresji ApoA-I. Aby zwiększyć skuteczność produkcji, wektory ekspresji DNA lub kasety mogą być zaprojektowane tak aby kodowały liczne jednostki peptydowe, np. kasety mogą zawierać sekwencje nukleotydowe kodujące kilka peptydów ApoA-I w tandemie, rozdzielone przez wewnętrzne miejsce wiązania rybozymu w taki sposób, że kilka peptydów może być kodowanych przez tę samą kasetę. Wektory lub kasety mogą również dawać ekspresję peptydów ApoA-I jako monopolimery (powtarzające się jednostki peptydowe) lub heteropolimerów (różne jednostki peptydowe). Kasety niniejszego wynalazku mogą również dodatkowo kodować sekwencje prepropeptydu lub propeptydu ApoA-I w taki sposób, że peptydy niniejszego wynalazku są modyfikowane w ten sam sposób jak natywne białko ApoA-I.

Niniejszy wynalazek w dalszej kolejności nawiązuje do genetycznie zmodyfikowanych komórek gospodarza, które produkują zmodyfikowane natywne formy ApoA-I: preproforma lub profoma-dojrzałej ApoA-I, peptydy naśladujące aktywność ApoA-I lub natywnego produktu genu ApoA-I. Komórki gospodarza mogą być genetycznie zmodyfikowane in vitro lub in vivo. Niniejszy wynalazek nawiązuje również do zwierząt transgenicznych zmodyfikowanych tak aby produkować peptydy ApoA-I niniejszego wynalazku.

Wynalazek nawiązuje również do dostarczenia in vivo zastosowań terapii genowej, w tym podawania zmodyfikowanych wektorów wirusowych lub liposomów, które zawierają sekwencje DNA kodujące ApoA-I lub peptydy agonistów ApoA-I w postaci monomerycznej lub heteromerycznej. Wynalazek nawiązuje do zastosowania terapii genowej ex vivo w celu dostarczenia zmodyfikowanych komórek otrzymanych od pacjenta, lub kompatybilnego gospodarza w celu ekspresji modyfikowanych form natywnego genu ApoA-I, agonistów ApoA-I w postaci monomerycznej lub heteromerycznej. Sposoby terapii genowej ex vivo mogą również obejmować dostarczenie „pęcherzyków z komórkami”, które zostały genetycznie zmodyfikowane do ekspresji genu ApoA-I niniejszego wynalazku, w tym

PL 193 662 B1 agonistów ApoA-I w postaci monomerycznej lub heteromerycznej dodatkowych prosekwencji ApoA-I.

W korzystnym wykonaniu, ludzkie hepatocyty mogą być zmodyfikowane do produkcji agonistów ApoA-I.

Wynalazek jest częściowo oparty na odkryciu peptydów, które naśladują strukturę helikalną i amfipatyczne właściwości helikalnych amfipatycznych domen ApoA-I. Niespodziewanie okazało się, że peptydy wynalazku posiadają aktywność ApoA-I, tj. tworzenia kompleksów przypominających HDL i sprzyjania wypływowi cholesterolu, znacznie powyżej tego opisywanego w literaturze dla otrzymanych z ApoA-I peptydów. Faktycznie, niektóre przykłady wynalazku zbliżają się do 100% aktywności natywnej ApoA-I, podczas gdy opisani tutaj superantagoniści przekraczają specyficzną aktywność ApoA-I.

Wynalazek jest zilustrowany w przykładach, które opisują aktywność i skuteczność in vitro oraz in vivo peptydów i agonistów ApoA-I kodowanych przez sekwencje nukleotydowe według niniejszego wynalazku. Zgłaszający obmyślili zestaw „zasad”, które mogą być zastosowane do projektowania zmienionych lub zmutowanych form, również znajdujących się w zakresie wynalazku.

Wynalazek nawiązuje również do kompozycji farmaceutycznych zawierających linie komórkowe i wektory kodujące zmodyfikowane formy natywnej ApoA-I, tj. dojrzałej ApoA-I, preproformy ApoA-I lub proformy ApoA-I oraz agonistów ApoA-I (zarówno jako peptydy lub kompleksy białkowo-lipidowe), będących aktywnymi składnikami, metod przygotowania takich kompozycji oraz ich zastosowania do leczenia chorób związanych z dyslipoproteinemią (np. chorób naczyniowych, miażdżycy), restenozy, hiperlipidemii, hipertrójglicerydemii, i/lub endotoksynemii (np. szoku septycznego).

3.1. Skróty

Zastosowano następujące skróty dla genetycznie kodowanych aminokwasów:

Aminokwas	Symbol jednoliterowy	Popularny skrót
Alanina	A	Ala
Arginina	R	Arg
Asparagina	N	Asn
Asparaginian	D	Asp
Cysteina	C	Cys
Glutamina	Q	Gln
Glutaminian	E	Glu
Glicyna	G	Gly
Histydyna	H	His
Isoleucyna	I	He
Leucyna	L	Leu
Lizyna	K	Lys
Metionina	M	Met
Fenyloalanina	F	Phe
Proilina	P	Pro
Seryna	S	Ser
Treonina	T	Thr
Tryptofan	W	Trp
Tyrozyna	Y	Tyr
Valina	V	Val

PL 193 662 B1

3.2.Definicje

Jak użyto tutaj następujące terminy będą miały następujące znaczenie:

„Aminokwas hydrofilowy” odnosi się do aminokwasu mającego łańcuch boczny, który wykazuje tendencję do łączenia się z fazą wodną lub polarnymi końcami fosfolipidów w obecności lipidów. Genetycznie kodowane aminokwasy hydrofilowe dotyczą: Asp (D), Glu (E), His (H), Lys (K), Arg (R), Asn (N), Gln (Q), Ser (S) i Thr (T).

„Kwaśny aminokwas”odnosi się do aminokwasu mającego łańcuch boczny o pK mniejszej niż 7. Kwaśne aminokwasy majązazwyczaj łańcuchy boczne o negatywnym ładunku w fizjologicznym pH ze względu na utratę protonu. Genetycznie kodowane kwaśne aminokwasy dotyczą: Glu (E) i Asp (D).

„Zasadowy aminokwas” odnosi się do aminokwasu mającego łańcuch boczny o pK większej niż7. Kwaśne aminokwasy mają zazwyczaj łańcuchy boczne o pozytywnym ładunku w fizjologicznym pHze względu na asocjację z jonem hydroksylowym. Genetycznie kodowane zasadowe aminokwasy dotyczą:Arg(R)iLys10(K).

„Polarny aminokwas” odnosi się do aminokwasu mającego łańcuch boczny pozbawiony ładunku w fizjologicznym pH ale posiadającego co najmniej jedno wiązanie, w którym wspólna para elektronowa dwóch atomów znajduje się bliżej jednego z atomów. Genetycznie kodowane zasadowe aminokwasy dotyczą: Asn (N) i Gln(Q).

„Hydrofobowy aminokwas” odnosi się do aminokwasu mającego łańcuch boczny wykazujący tendencję do wiązania się z acylowymi łańcuchami fosfolipidów w obecności lipidów. Genetycznie kodowane zasadowe aminokwasy dotyczą: Phe (F), Tyr (Y),Trp (W),Leu(L),Val(V), He(I),Met(M), Gly(G),Ala.(A)iPro(P).

„Aromatyczny aminokwas” odnosi się do hydrofobowego aminokwasu mającego w łańcuchu bocznymconajmniejjedenpierścieńaromatycznylubheteroaromatyczny.Pierścieńaromatycznylub heteroaromatyczny może zawierać jeden lub więcej podstawników. Genetycznie kodowane zasadowe aminokwasy dotyczą: Phe (F), Tyr(Y)iTrp(W).

„Niepolarny aminokwas” odnosi się do hydrofobowego aminokwasu mającego łańcuch boczny, który jest pozbawiony ładunku w fizjologicznym pH i który posiada wiązania w których wspólna para elektronowa dwóch atomów jest dokładnie pośrodku pomiędzy dwoma atomami (tj. łańcuch boczny niejestpolarny).

„Alifatyczny aminokwas” odnosi się do hydrofobowego aminokwasu mającego alifatyczny wodorowęglowy łańcuch boczny. Genetycznie kodowane zasadowe aminokwasy dotyczą: Ala (A), Val (V), Leu(L)iIle(I).

4. Krótkiopisrysunków

Rysunek 1. Sekwencja nukleotydowa (SEQ. ID NO.: )i sekwencja aminokwasowa (SEQ. IDNO.: ) ludzkiejApoAI.

Rysunek 2. Sekwencja nukleotydowa, kodująca peptydy rdzeniowe struktury I (SEQ. ID NOS.: ).

Rysunek 3. Sekwencja nukleotydowa, kodująca peptydy rdzeniowe struktury II(SEQ. ID NOS.:).

Rysunek 4. Sekwencja nukleotydowa, kodująca peptydyrdzeniowe struktury III(SEQ. ID NOS.:).

5. Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy sekwencji nukleotydowych kodujących zmodyfikowane formy natywnych form genu ApoA-I, sekwencji nukleotydowych kodujących agonistów ApoA-I, peptydów, które naśladują funkcję i aktywność lub przewyższają funkcję i aktywność natywnej ApoA-I, w celu leczenia chorób związanych z hipercholesterolemią.

Sekwencje nukleotydowe według niniejszego wynalazku kodują peptydy, które tworzą amfipatyczne helisy (w obecności lipidów), wiążą lipidy, tworzą kompleksy przypominające pre-β i HDL, aktywują LCAT, zwiększają stężenie HDL w surowicy i sprzyjają wypływowi cholesterolu.

Biologiczna funkcja kodowanych peptydów wydaje się korelować z ich strukturą helikalną lub konwersją do struktur helikalnych w obecności lipidów.

Co najmniej trzy typy wektorów DNA lub kaset mogą być zaprojektowane i skonstruowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem zawierające sekwencje nukleotydowe natywnego ludzkiego genu ApoA-I, zmodyfikowane formy natywnej lub proformy ApoA-I, sekwencje nukleotydowe kodujące agonistów ApoA-I w pre- lub pro-formie, oraz sekwencje nukleotydowe kodujące agonistów lub superagonistów ApoA-I. Wektory DNA lub kasety mogą również produkować peptydy ApoA-I jako monopolimery (powtarzające się jednostki peptydowe) lub heteropolimery (różne jednostki peptydowe).

PL 193 662 B1

Wynalazek w dalszej kolejności dotyczy genetycznie modyfikowanych komórek gospodarza, które produkują peptydy agonistów ApoA-Iwedług niniejszego wynalazku. Komórki gospodarza mogą być modyfikowane in vivo lub in vitro.

Sekwencje nukleotydowe kodujące agonistów ApoA-I mogą być dostarczane jako gołe sekwencje RNA lub DNA, w wektorach takich jak wektory wirusowe lub poprzez stransfekowane komórki. Wynalazek dotyczy też kompozycji farmaceutycznych i zastosowania ich w leczeniu dyslipoproteinemii, hiperlipidemii, hipercholesterolemii, choroby wieńcowej serca, miażdżycy i innych warunków takich jak endotoksynemia/szok septyczny.

Wynalazek jest częściowo oparty na odkryciu Zgłaszających, że agoniści ApoA-I wiążą się z HDL zawartym w surowicy i mogą zwiększać koncentrację cząstek HDL i pre-β. Agoniści ApoA-I wynalazku zwiększają wypływ cholesterolu z tkanek pozawątrobowych. Agoniści są również wysoce efektywni w aktywacji LCAT i tym samym sprzyjają RCT. Zastosowanie agonistów ApoA-I wynalazku in vivonamodelachzwierzęcychprowadzidowzrostustężeniaHDLwsurowicy.

5.1 . Sekwencje nukleotydowe kodujące ApoA-I i agonistów ApoA-I

Sekwencje nukleotydowe według niniejszego wynalazku kodują peptydy ApoA-I, lub agonistów ApoA-I zdolnych do tworzenia amfipatycznych helis w obecności lipidów i które mogę naśladować aktywność ApoA-I. Sekwencje nukleotydowe kodujące agonistów ApoA-I i peptydy ApoA-Isą opisane poniżej.

Niniejszy wynalazek obejmuje również sekwencje nukleotydowe kodujące pełnej długości gen ApoA-I(SEQ. ID: (fig.1),które zostały zmodyfikowane tak aby wzmacniać lub zwiększać aktywność przypominającą ApoA-I produktu ulegającego ekspresji tj. tworzenia amfipatycznych helis (w obecności lipidów), wiązania lipidów, tworzenia kompleksów przypominających pre-β i HDL, aktywacji LCAT, zwiększania stężenia HDL w surowicy i sprzyjają wypływowi cholesterolu. Niniejszy wynalazek obejmuje również sekwencje nukleotydowe kodujące zmodyfikowane formy natywnej ApoA-I, tj.sekwencji nukleotydowych kodujących zmodyfikowaną ApoA-I mającą jedną, dwie lub więcej helis amfipatycznych zastąpionych przez przynajmniej dwóch agonistów ApoA-I.

Niniejszy wynalazek dotyczy również sekwencji nukleotydowych kodujących zmodyfikowane formy ApoA-II, ApoA-III, ApoA-IV,ApoB, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD i ApoE, które zostały zmodyfikowane w taki sposób aby kodować jeden, dwa lub więcej agonistów ApoA-I niniejszego wynalazku (patrz np. Lusis, 1988, J of Lipid Res. 29: 397-428, zacytowane tutaj w całości).

Sekwencje nukleotydowe niniejszego wynalazku obejmują również sekwencje nukleotydowe kodujące peptydy rdzenia Struktury I (np. SEQ: (fig.2)), peptydy rdzeniowe StrukturyII (np. SEQ: (fig.3)), lubpeptydyrdzenioweStrukturyIII(np.SEQ:(fig.4)).

Wynalazek można zastosować do tworzenia wektorów. Wektory DNA mogą zawierać którąkolwiek z powyższych sekwencji kodujących ApoA-I oraz ich nici komplementarne (tj. antysensowne).

Wektory ekspresyjne DNA mogą zawierać którąkolwiek z powyższych sekwencji kodujących ApoA-I operacyjnie powiązaną z elementem regulatorowym kierującym ekspresją kodowanej sekwencji; wektory ekspresyjne DNA lub kasety kodujące agonistów ApoA-I w tandemach przedzielonych wewnętrznym miejscem wiązania rybosomu w taki sposób, że kilka kodujących to samo sekwencji może ulegać ekspresji z tej samej kasety lub kilka różnych sekwencji kodujących różnych agonistów ApoA-I może ulegać ekspresji z tej samej kasety.

Genetycznie zmodyfikowane komórki gospodarza mogą zawierać którąkolwiek z powyższych sekwencji kodujących ApoA-I operacyjnie powiązanych z elementem regulatorowym, kierującym ekspresją kodowanych sekwencji w komórce gospodarza.

Elementy regulatorowe dotyczą, ale nie są ograniczone do indukowalnych lub nieindukowalnych promotorów, wzmacniaczy, operatorów i innych elementów regulujących ekspresję znanych fachowcom. Takie elementy dotyczą, ale nie są ograniczone do wczesnego genu hCMV cytomegalovirusa, wczesnych lub późnych promotorów adenowirusa SV40, systemu lac, systemu trp,systemu TRC, głównego operatora i regionów promotorowych faga A, regionów kontrolnych białek otoczki fd, promotora 3-fosfatydylokinazy, promotorów kwaśnej fosfatazy, promotora drożdżowego czynnika α.

5.1.1.NatywnygenApoA-I.

Gen ApoA-Ikoduje główny składnik białkowy HDL i jest związany z regulacjąuwalniania cholesterolu i stężeniem cholesterolu w osoczu. Opisane w tym wniosku kwasy nukleinowe kodujące gen ApoA-I są przeznaczone do terapii genowej chorób związanych z dyslipidemią. Używany tu termin gen ApoA-I obejmuje:

PL 193 662 B1 (a) cząsteczkę cDNA kodującą ludzki ApoA-I, sekwencja cDNA pełnej długości dla ludzkiego ApoA-I obejmuje 842 nukleotydy (SEQ (fig. 1)) (patrz Shoulders i współ., 1983, Nucleic Acids Research 11: 2827-2837, jako referencja włączone tu w całości), w której zmieniono co najmniej jeden z fragmentów 22-aminokwasowego powtórzenia na sekwencje kodującą agonistę ApoA-I przedstawianego w tym wniosku;

(b) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą genomową kopię ludzkiego ApoA-I, która zawiera co najmniej dwa introny o długości 185i588nukleotydów;

(c) cząsteczkę DNA kodującą 1 do 8 rożnych 22 aminokwasowych powtórzeń znalezionych w natywnej ludzkiej ApoA-I i może ponadto zawierać sekwencje kodujące reszty rozdzielające znajdowane pomiędzyjednym bądź wieloma powtórzeniami;

(d) cząsteczkę DNA kodującą zmodyfikowaną ApoA-I w, wktórej co najmniej jeden amfipatyczny helisęjest zamieniony przez sekwencje co najmniej jednego agonisty;

(e) cząsteczkę DNA zawierającą całe bądź częściowe (a), (b), (c) lub (d) oraz dodatkowo sekwencję DNA kodującą prepropetyd albo peptyd liderowy, który obejmuje pierwsze 18 aminokwasów N-terminalnej części ApoA-I. Peptyd liderowy ludzkiej ApoA-I, 5'MKAAVLTLAVLFLTGSQA3' (SEQ.: fig. 1) jest trawiony w czasie sekrecji ApoA-I z komórek gospodarza;

(f) cząsteczkę DNA zawierającą całość lub część (a),(b), (c), (d)lub(e)i dodatkowo sekwencje kodującą 6 aminokwasowy propeptyd 5'RHFWQQ3', któryjestodtrawianyprzezspecyficznąproteazę, co prowadzi do powstania dojrzałej ApoA-I; oraz (g) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającąsekwencjegenu, któregoproduktjest funkcjonalnie równoważny z peptydem ApoA-I.

Używany tutaj termin „funkcjonalnie równoważny z peptydem ApoA-I” odpowiada produktowi genu, który wykazuje jedną z aktywności biologicznych ApoA-I w tym tworzenie amfipatycznych helis (w obecności lipidów), wiązanie do lipidów, tworzenie pre-β i HDL-podobnych kompleksów, aktywacja LCAT, wzrost stężenia HDL w osoczu i wzmaganie uwalniania cholesterolu. W tym aspekcie wynalazek dotyczy również formy ApoA-II, ApoA-III, ApoA-IV, ApoB, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD i ApoE, które zostały zmodyfikowane tak, że kodują jeden dwa lub więcej agonistów ApoA-I prezentowanych tutaj.

Wynalazek zawiera również cząsteczki kwasów nukleinowych, zwłaszcza DNA, które hybrydyzują do natywnej cząsteczki ApoA-I. Warunki hybrydyzacji mogą być mniej lub bardziej specyficzne jak to opisano wyżej. W przypadku kiedy cząsteczkami tymi są deoksyoligonukleotydy („oliogosy”), można mieć do czynienia z warunkami bardzo specyficznymi na przykład: płukanie w 6xSSC/0,05% pirofosforan sodu przy 37C (dla „oliogosa” o długości 14 par zasad), przy 48C (dla „oligosa” o długości 17 par zasad), 55C (dla „oligosa” o długości 20 par zasad), 60C (dla „oligosa” o długości 23 par zasad). Te cząsteczki kwasów nukleinowych mogą działać jako cząsteczki antysensowne, użyteczne na przykład w regulacji genu ApoA-I lub startery do amplifikacji sekwencji ApoA-I. Jeśli chodzi o regulację genu ApoA-I, takie techniki mogą być użyte do leczenia hipercholesterolemii. Co więcej, takie sekwencje mogą być użyte jako fragmenty rybozymów lub potrójnej helisy, również użytecznych dla regulacji ekspresji zmutowanych form ApoA-I, które mogą wykazywać działanie antagonistyczne do ApoA-I. Dalej takie cząsteczki mogą być użytew technikach diagnostycznych do wykrywania na przykład określonych zmutowanych alleli ApoA-I, które powodują hipercholesterolemię. Oprócz sekwencji ludzkich, opisanych tutaj, przy pomocy technik biologii molekularnej, mogą zostać wkrótce zidentyfikowane i klonowane dalsze sekwencje genów ApoA-I.

5.1.2 Peptydy i agoniści ApoA-I.

Sekwencje nukleotydowe mogą kodować peptydy ApoA-Ilub agonistów ApoA-I, których główną cechą jest peptyd „rdzeniowy” złożony z 15 do 23 reszt aminokwasowych. Sekwencja aminokwasowa peptydu „rdzeniowego” jest oparta o sekwencje rodziny peptydów, które jak odkryli zgłaszający są podobne do struktury i właściwości amfipatycznych helis ApoA-I i wykazują specyficzne aktywności, charakterystyczne dla ApoA-I, a w niektórych wykonaniach je przewyższają.

Sekwencje nukleotydowe zawarte w tym zgłoszeniu patentowym, kodujące peptydy ApoA-I lub jego agonistów mogą być eksprymowane samodzielnie w formie multimerycznej lub jako fuzje z sekwencjami DNA kodującymi natywną formę ApoA-Ilub jego pro-peptyd.

Agoniści ApoA-I według wynalazku oparci są, po części na niespodziewanym odkryciu zgłaszających, że zmiana określonych reszt aminokwasowych w 22 aminokwasowej sekwencji zgodności (Vkatachalapathi i współ., 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions B: 585-596 35 (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO: 75; dalej zwanej „sekwencją wysokiej zgodności Segrasta” lub „22-merem wysokiej zgodności”), które były uważane za niezbędne do aktywności, dała peptydy, wykazujące

PL 193 662 B1 aktywności zbliżone bądź w niektórych wykonaniach większe od aktywności natywnego ApoA-I.

W szczególności zgłaszający odkryli, że zamiana trzech naładowanych reszt aminokwasowych z 22 aminokwasowych sekwencji wysokiej zgodności Segresta (Glu-5, Lys-9 and Glu-13) na hydrofobowe reszty Leu daje peptydy naśladujące strukturalne i funkcjonalne właściwości ApoA-I w stopniu do tej pory nie osiągniętym.

Uważa się, że helisy tworzone przez agonistów ApoA-I według wynalazku, lepiej naśladują strukturalne i funkcjonalne właściwości helikalnych amfipatycznych regionów natywnej ApoA-I, które są istotne dla wiązania lipidów, uwalniania cholesterolu i aktywacji LCAT, niż helisy tworzone przez peptydy naśladujące ApoA-I opisane w literaturze, i co za tym idzie wykazują wyższe aktywności ApoA-I-podobne. Rzeczywiście, podczas gdy aktywności agonistów ApoA-I przedstawianych tutaj są zbliżone lub w niektórych przypadkach nawet większe, niż aktywność ApoA-I, najlepiej naśladujący ApoA-I peptyd opisany w literaturze, peptyd 18AM4 (SEQ ID. 246); (Corinjn i współ., 1993, Bio-chim. Biophys. Ada 1170: 8-16; Labour i wsp., Oct. 1994, Arteriosclerosis: Abstract Nos. 186 and 187); i N-acetylowany, C-amidowany peptyd 1 8AM4 (SEQ ID 25 NO: 239) (Brasseur, 1993, Bio-chim. Biophys. Acta 1170: 1-7) wykazuje mniej niż 4% i 11%, odpowiednio aktywności ApoA-I mierzonej opisanym tutaj testem aktywacji LCAT.

W ilustracyjnym wykonaniu wynalazku, sekwencje nukleotydowe kodują peptydy rdzeniowe (lub ich analogi), które budują agonistów ApoA-I mają następujący wzór strukturalny:

(I) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22 gdzie:

X1oznaczaPro(P), Ala(A), Gly(G),Gln(Q), Asp(D)lub Asn (N);

X2 oznaczaaminokwasalifatyczny;

X3 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X4 oznacza kwaśny aminokwas;

X5 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X6 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X7 oznaczaaminokwashydrofilowy;

X8 oznacza kwaśny lub zasadowy aminokwas;

X9 oznaczaLeu(L)lubGly(G);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznaczaaminokwashydrofilowy;

X12 oznaczaaminokwashydrofilowy;

X13 oznaczaGly(G)lubaminokwasalifatyczny;

X14 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X15 oznaczaaminokwashydrofilowy;

X16 oznacza aminokwas hydrofobowy;

X17 oznacza aminokwas hydrofobowy;

X18 oznaczaaminokwaszasadowy,Gln(Q)lubAsn (N);

X19 oznaczaaminokwaszasadowy,Gln(Q)lubAsn(N);

X20 oznacza aminokwas zasadowy;

X21 oznaczaaminokwasalifatyczny;

X22 oznacza aminokwas zasadowy.

W peptydach „rdzeniowych” o strukturze (I) symbol „-”między resztami aminokwasowymi oznacza trwałe wiązanie funkcyjne.Tak więc symbol „-”oznacza zwykle wiązanie peptydowe lub amidowe.

Wynalazek ten dotyczy sekwencji nukleotydowych, które są funkcjonalnie równoważne peptydom o strukturze (I), dla bardziej dokładnego opisu patrz zgłoszenie patentowe U.S.A. nr 5580859, str.25, wers 6 do strony 58, wers 21, włączone tutaj w całości.

W kolejnym ilustracyjnym wykonaniu wynalazku sekwencje nukleotydowe, kodują peptyd „rdzeniowy” (i jego analogi), które tworzą agonistów ApoA-I, mających następujący wzór strukturalny:

(II)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22 gdzie:

X1oznacza Pro (P), Ala (A),Gly (G),Gln (Q),Asn (N) lub Asp (D); X2 oznaczaaminokwasalifatyczny;

X3 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X4 oznaczaGlu(E);

X5 oznaczaaminokwasalifatyczny;

PL 193 662 B1

X6 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X7 oznaczaGlu(E)lubLeu(L);

X8 oznaczaAsn(N)lubGln(Q);

X9 oznaczaLeu(L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X11 oznaczakwaśnyaminokwas;

X12 oznaczaArg (R);

X13 oznaczaLeu(L) lubGly (G);

X14 oznaczaLeu(L),Phe(F)lubGly (G);

X15 oznaczaAsp(D);

X16 oznaczaAla(A);

X17 oznaczaLeu(L);

X18 oznaczaAcn(N)lubGln(Q);

X19 oznacza aminokwas zasadowy;

X20 oznacza aminokwas zasadowy;

X21 oznaczaLeu(L);

X22 jest aminokwaszasadowy.

Symbol „-” oznacza niezależnie wiązanie peptydowe lub amidowe.

Ten wynalazek obejmuje sekwencje nukleotydowe, które kodują peptydy, które są funkcjonalnie równoważne peptydom o strukturze (II), dokładniejszy opis jest dostępny we Wniosku Patentowym U.S.A. n r 5580859, strona 25, wiersz 6 do strony 58, wiersz 21, w całości włączony tu jako odniesienie.

Dalszym ilustracyjnym wykonaniem wynalazku są sekwencje nukleotydowe kodujące peptyd „rdzeniowy” (i jego analogi), które tworzą agonistów ApoA-I, mających następujący wzór:

(III)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N) lub Gln (Q);

X2 oznaczaaminokwasalifatyczny;

X3 oznaczaLeu(L);

X4 oznacza kwaśny aminokwas (E);

X5 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X6 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X7 oznacza aminokwas zasadowy;

X8 oznaczakwaśnyaminokwas;

X9 oznaczaLeu(L)lubTrp(W);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W);

XII oznaczakwaśnyaminokwaslubAsn(N);

X12 oznaczakwaśnyaminokwas;

X13 oznaczaLeu(L),Trp(W)lubPhe (F);

X14 oznacza aminokwas zasadowy lub Leu (L);

X15 oznaczaGln (Q) lub Asn (N);

X16 oznacza aminokwas zasadowy;

X17 oznaczaLeu(L);

X18 oznacza aminokwas zasadowy.

Symbol „-” oznacza niezależnie wiązanie peptydowe lub amidowe.

Wynalazek obejmuje sekwencje nukleotydowe, które kodują peptydy, które są funkcjonalnie równoważne peptydom o strukturze (III), dokładniejszy opis jest dostępny we Wniosku patentowym U.S.A. n r 5580859, strona24, wiersz 31 do strony 58, wiersz 3, w całości włączony tu jako odniesienie.

Peptydy „rdzeniowe” o strukturze (I), (II), (III) są po części zdefiniowane przez wyszczególnione klasy aminokwasów. Definicje rożnych wyszczególnionych klas są dostępne poniżej z opisem zmutowanych lub zmienionych struktur (I), (II) i(III).

Wszystkie inne litery w strukturach (I), (II) i (III) odpowiadają kodowi jednoliterowemu aminokwasów, który jest powszechnie używany. Sekwencja nukleotydowa kodująca peptydy może być odczytana z tabeli I.

PL 193 662 B1

T a b el a I

	Druga zasada
	U	c	A	G
	UUU		ucu		UAU L	UGU	-
u	UUC	” Phe	ucc	_k Ser	UAC ^J Tyr	UGC^J	Cys
	UUA-		UCA		UAA J-	UGA	Stop
	UUG	Leu	UCG j		UAG Stop	UGG	Trp
	cuu?		CCU Ί		CAU -i	CGUq
c	cuc	Leu	CCC	Pro	CAC J His	CGC	„ Arg
	CUA		CCA		CAA T_	CGA
	cugJ		CCG J		CAG J Gin	cggJ
	AUU1	k	ACU		AAU T	AGUl	L
A	AUC^J	” Ile	ACC	Thr	AAC 7 A_sn	AGC^J	Ser
	AUA	-	ACA		AAA ~L	AGAl	k
	AUG ^J	Met	ACG ^J		AAG ^J Lys	AGG^J	Arg
G	GUU-.		GCU η		GAU k	GGU^
	GUC	Val	GCC	Ala	GAC ^J Asp	GGC	μ Gly
	GUA		GCA	I	GAA }-	GGA
	gugJ		GCG J		GAG Glu	GGG

Nie chcąc się wiązać z żadną szczególną teorią, uważa się, że sekwencje nukleotydowe zawarte w niniejszym wniosku kodują peptydy, które tworzą w obecności lipidów amfipatyczne helisy, które lepiej naśladują strukturalne i amfipatyczne właściwości helikalnych regionów natywnej ApoA-I, ważnych dla wiązania lipidów, uwalniania cholesterolu i aktywacji LCAT niż robią to helisy tworzone przez peptydy opisane w literaturzei tym samym wykazują wyższe aktywności ApoA-I niż te peptydy.

Rzeczywiście podczas gdy wiele z peptydów „rdzeniowych” o strukturach (I), (II), (III) wykazuje w niektórych wykonaniach aktywności zbliżone do ApoA-I, najlepszy do chwili obecnej peptyd naśladujący ApoA-I opisany w literaturze ma mniej niż 40% aktywności ApoA-I mierzonej w teście aktywacji LCAT opisanym tutaj.

Nie chcąc wiązać się z żadną szczególną teorią, uważa się, że pewne strukturalne i fizyczne właściwości peptydów o strukturach (I), (II), (III) są ważne dla aktywności. Właściwości te to: stopień amfipatyczności, ogólna hydrofobowość, średnia hydrofobowość, kąty hydrofobowości i hydrofilowości, moment hydrofobowości, średni moment hydrofobowości, wypadkowy ładunek i moment dipolowy. Podsumowanie fizycznych i strukturalnych właściwości peptydów o strukturach (I), (II), (III) jest przedstawione w tabelach II, III, IV poniżej:

T a b el a II

Fizyczne właściwości korzystnych agonistówApoA-I o wzorze (I)

Właściwość	Zakres	Korzystny zakres
1	2	3
% hydrofobowych aminokwasów	40-70	50-60
<H0>	-0,050 do -0,070	-0,030 do -0,055
<H0^pho>	0,90 do 1,2	0,94 do 1,1
<mH>	0,45 do 0,65	0,50 do 0,60
Kąt pho	160° -220°	180° -200°
Ilość dodatnio naładowanych aminokwasów	3-5	4

PL 193 662 B1 ciąg dalszy tabeli II

1	2	3
Ilość ujemnie naładowanych aminokwasów	3-5	4
Ładunek netto	-1 do +1	0
Skupienie hydrofobowe	pozycje 3, 6, 9, 10 są hydrofobowymi aminokwasami
Skupienie kwaśne	przynajmniej 1 kwaśny aminokwas na skręt z wyjątkiem ostatnich 5 aminokwasów C-końcowych
Skupienie zasadowe	przynajmniej 3 aminokwasy zasadowe wśród 5 aminokwasów C-końcowych

T ab el a III

Fizyczne właściwości korzystnych agonistów ApoA-I o wzorze (II)

Właściwość	Zakres	Korzystny zakres
% hydrofobowych aminokwasów	40-70	50-60
<H0>	-0,050 do -0,070	-0,030 do -0,055
<Hc^pho>	0,90 do 1,2	0,94 do 1,1
<mH>	0,45 do 0,65	0,50 do 0,60
Kąt pho	160° -220°	180° -200°
Ilość dodatnio naładowanych aminokwasów	3-5	4
Ilość ujemnie naładowanych aminokwasów	3-5	4
Ładunek netto	-1 do +1	0
Skupienie hydrofobowe	pozycje 3, 6, 9, 10 są hydrofobowymi aminokwasami
Skupienie kwaśne	przynajmniej 1 kwaśny aminokwas na skręt z wyjątkiem ostatnich 5 aminokwasów C-końcowych
Skupienie zasadowe	przynajmniej 3 aminokwasy zasadowe wśród 5 aminokwasów C-końcowych

T ab el a IV

Fizyczne właściwości korzystnych agonistów ApoA-I o wzorze (III)

Właściwość	Zakres	Korzystny zakres
1	2	3
% hydrofobowych aminokwasów	40-70	50-60
<H0>	-0,150 do -0,070	-0,130 do -0,050
<Hc^pho>	0,90 do 1,2	0,95 do 1,10
<mH>	0,55 do 0,65	0,58 do 0,62
Kąt pho	120° -260°	130° - 150°
# dodatnio naładowanych aminokwasów	3-5	4
# ujemnie naładowanych aminokwasów	3-5	4

PL 193 662 B1 ciąg dalszy tabeli IV

1	2	3
Ładunek netto	-1 do +1	0
Skupienie hydrofobowe	pozycje 3, 6, 9, 10 są hydrofobowymi aminokwasami
Skupienie kwaśne	przynajmniej 1 kwaśny aminokwas na skręt z wyjątkiem ostatnich 5 aminokwasów C-końcowych
Skupienie zasadowe	przynajmniej 3 aminokwasy zasadowe wśród 5 aminokwasów C-końcowych

Właściwości amfipatycznych helis tworzonych przez peptydy „rdzeniowe”różnią się znacznie od właściwości amfipatycznych helisów klasy A, w szczególności od helisów Sagresta I8A klasy A i 22-u aminokwasowych peptydów sekwencji wysokiej zgodności. Te różnice są zilustrowane przykładowym peptydem „rdzeniowym” 210 (SEQ ID NO: 210). Porównanie fizycznych i strukturalnych właściwości peptydu 210 (SEQ ID NO: 210), peptydu Sagresta 18A SEQ ID NO: 244 i 22-u aminokwasowego peptydu sekwencji wysokiej zgodności (SEQ ID NO: 75) przedstawione jest w tabeli V poniżej.

Tabel a V

Porównanie właściwości przykładowego peptydu rdzeniowego 210 (SEQ ID NO: 210) z peptydem Sagresta 18A SEQID NO: 244 i 22-u aminokwasowym peptydem sekwencji wysokiej zgodności (SEQ ID NO: 75)

Właściwość	18A	Koncensusowy 22-mer	Peptyd 210
Ilość aminokwasów	18	22	18
Ilość aminokwasów hydrofitowych	9	13	9
Ilość aminokwasów hydrofobowych	9	9	9
% aminokwasów hydrofobowych	50	41	50
<Ho>	-0,43	0,0293	-0,125
<Ho^pho>	0,778	0,960	1,081
<μΗ>	0,485	0,425	0,597
Kąt pho	100°	100°	140°
Ilość pozytywnie naładowanych aminokwasów	4	5	4
Ilość negatywnie naładowanych aminokwasów	4	6	4
Ładunek całościowy	0	-1	0

Te różnice we własnościach prowadzą do znaczących różnic w aktywności. Podczas gdy peptyd Sagresta 18A SEQ ID NO: 244 i 22 aminokwasowy peptyd wysokiej zgodności (SEQ ID NO: 75) wykazują tylko odpowiednio 5% i 10% aktywacji LCAT, peptyd 210 (SEQ ID NO: 210) wykazuje 46% aktywacji w tym samym teście.

Pewne reszty aminokwasowe w peptydzie „rdzeniowym” o strukturze (I), (II), (III) mogą być zamienione z innymi resztami aminokwasowymi bez zmniejszenia a w wielu przypadkach ze zwiększeniem aktywności peptydów. W tym wynalazku rozważane są również zmutowane formy peptydu „rdzeniowego” o strukturze (I), (II), (III), w których przynajmniej jedna zdefiniowana reszta aminokwasowa jest zastępowana przez inną. Jedną z kluczowych cech wpływających na aktywność peptydu „rdzeniowego” jest zdolność do tworzenia helis w obecności lipidów, które to helis wykazują właściwości amfipatyczne i inne opisane powyżej. Zauważono, że w niektórych peptydach substytucje aminokwasowe są konserwatywne tj. zastępujący aminokwas ma właściwości fizyczne i chemiczne podobne do zastępowanego. W celu określania substytucji konserwatywnych, aminokwasy mogą być podzielone na dwie główne grupy: hydrofiłowe i hydrofobowe, w zależności od fizykochemicznej charakterystyki reszty aminokwasowej. Te grupy mogą być dalej podzielone na kategorie, które dokładniej definiują

PL 193 662 B1 właściwości reszty aminokwasowej. Przykładowo aminokwasy hydrofilowe mogą być podzielone na:

kwaśne, zasadowe i polarne a hydrofobowe na: polarne i aromatyczne. Definicje rożnych grup aminokwasów, które wchodzą w skład struktury (I), (II), (III) są następujące:

„Aminokwas hydrofilowy” odpowiada aminokwasowi wykazującemu hydrofobowość mniejszą niż 0w skali Eisenberga, (1984, Ann. Rev. Biochem. 53: 595-623). Aminokwasy hydrofilowe kodowane genetycznie to:Pro (P), Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (M), Gln (Q), Asp (D), Lys (K) iArg(R).

„Aminokwas kwaśny” odpowiada aminokwasowi hydrofilowemu o wartości pK łańcucha bocznego mniejszej niż 7. Aminokwasy kwaśne posiadają zwykle ujemny ładunek łańcucha bocznego w pH fizjologicznym z powodu oddysocjowania protonu. Genetycznie kodowane aminokwasy kwaśne to: Glu (E) i Asp (D).

„Aminokwas zasadowy” odpowiada aminokwasowi hydrofilowemu o wartości pK łańcucha bocznego większej niż 7. Aminokwasy zasadowe posiadają zwykle dodatni ładunek łańcucha bocznego w pH fizjologicznym z powodu asocjacji z jonem hydroniowym, genetycznie kodowane aminokwasy zasadowe to: His (H), Arg (R) iLys (K).

„Aminokwaspolarny”odpowiadaaminokwasowihydrofilowemu, którego łańcuch bocznyjest nie naładowany w fizjologicznym pH ale posiadający wiązania spolaryzowane. Genetycznie kodowane aminokwasypolarneto:Cys(C),Asn(N),Gln(Q),Ser(S)iThr(T).

„Aminokwas hydrofobowy” odpowiada aminokwasowi wykazującemu hydrofobowość większą od 0 w skali Eisenberga, (1984, Ann.Rev.Biochem.53:595-62).Genetyczniekodowaneaminokwasy hydrofobowe to: He (I),Phe(F),Val(V), Leu(L),Trp(W), Met (M), Ala (A), Gly (G) i Tyr (Y).

„Aminokwas aromatyczny” odpowiada aminokwasowi hydrofobowemu posiadającemu co najmniej 1 pierścień aromatyczny lub heteroaromatyczny. Pierścień aromatyczny lub heteroaromatyczny może zawierać następujące grupy -OH, -SH, -CN, -Cl, -Br, -I, -NO, -NO, -NH, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR i tym podobne gdzie R oznacza niezależnie (C1-C6) alkil, podstawiony (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, podstawiony (C1-C6) alkenyl, (C5-C20) aryl, podstawiony (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkiloaryl, (C6-C26) alkiloaryl.

Genetycznie kodowane aminokwasy aromatyczne to: Phe (F), Tyr (Y) i Trp (W).

„Aminokwas niepolarny” odpowiada aminokwasowi hydrofobowemu, którego łańcuch boczny jest nie naładowany przy fizjologicznym pH i nie zawiera wiązań spolaryzowanych. Genetycznie kodowaneaminokwasyniepolarneto:Leu(L),Val(V), Ile(I), Met(M),Gly(G)iAla(A).

„Aminokwas alifatyczny” odpowiada aminokwasowi hydrofobowemu, który posiada boczny łańcuch alifatyczny. Genetycznie kodowane aminokwasy alifatyczne to: Ala (A), Val (V), Leu (L) i Ile(I). Aminokwas Cys (C) jest nietypowy ze względu na to, że może tworzyć mostki dwusiarczkowe z innymi Cys (C) lub innymi aminokwasami zawierającymi grupy sulfalynowe. Zdolność Cys (C) i innych aminokwasów zawierających grupy -SH do występowania w białku w formie zredukowanej -SH lub utlenionej, jako mostek dwusiarczkowy, wpływa na to, czy Cys (C) przyczynia się do wzrostu hydrofilowości czy hydrofobowości białka. Ponieważ Cys (C) wykazuje hydrofobowość 0,04 w skali Eisenberga (Eisenberg, 1984, powyżej), jest zrozumiałe, że dla celów tego wynalazku Cys (C) jest sklasyfikowana jako aminokwas polarny, pomimo klasyfikacji zdefiniowanej powyżej.

Jak wiadomo fachowcom, powyżej zaprezentowane kategorie nie są rozłączne. I tak aminokwasy zawierające łańcuchy boczne o dwóch lub więcej własnościach fizykochemicznych mogą być zaklasyfikowane do wielu kategorii.Na przykład aminokwasy zawierające reszty aromatyczne z podstawnikamipolarnymi,jakTyr(Y),mogąwykazywaćzarównoaromatyczne,hydrofobowejaki polarne czy hydrofilowe właściwości i mogą być włączone zarówno do kategorii aminokwasów aromatycznych jak i polarnych. Odpowiednie zaklasyfikowanie aminokwasów, powinno być łatwe dla specjalistów, zwłaszcza,dziękidanymtuwyjaśnieniom.

Niektóre aminokwasy, zwane „łamiącymi helisę” mają zdolność do przerywania struktur α-helikalnych jeśli znajdą się na pozycjach wewnętrznych helisu. Takie aminokwasy są znane fachowcom (patrz Chou i Fasman, Ann. Rev. Biochem. 4_7.: 251-276) i obejmują Pro (P), D-Pro (p) i Gly (G). Aminokwasy te z wyjątkiem Gly (G) nie powinny być używane do substytucji w środku helisy - ewentualnie powinny być używane do substytucji 1-3 aminokwasów na N-lub C- końcu.

Natywna struktura ApoA-I zawiera 8jednostek helikalnych, które prawdopodobnie współdziałają w wiązaniu się do lipidów (Nakagawa i współ., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 7087-7092; Anantharamaiah i współ., 1985, J. Biol. Chem. 260:10248-10262; Vanloo i współ., 1991, J. Lipid Res. 32: 1253-1264; Mendez i współ., 1994, J. Clin. Invest. 94: 1698-1705; Palgunari i współ., 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16: 328-338; Demoor i współ., 1996, Eur. J. Biochem. 239: 74-84). Tak więc również w skład

PL 193 662 B1 tego wynalazku wchodzą cząsteczki agonistów ApoA-I złożone z dimerów, trimerów, tetramerów a nawet multimerów większego rzędu peptydów rdzeniowych opisanych tutaj. Takie multimery mogą być w formie powtórzeń liniowych, rozgałęzionych sieci lub ich kombinacji.

Peptydy „rdzeniowe” mogą być przyłączone bezpośrednio jeden do drugiego lub rozdzielone jednym lub dwoma łącznikami. Peptydy „rdzeniowe”, które tworzą multimery mogą mieć strukturę (I), (II), (III),mogą być analogami struktury (I), (II), (III), zmutowanymi formami struktury (I), (II), (III), skróconymi lub wydłużonymi formami struktury (I), (II), (III) oraz kombinacjami powyższych. Peptydy „rdzeniowe” mogą być połączone głową do ogona (tj. N-koniec do C-końca), „głową do głowy” (tj. N-koniec do N-końca) i „ogon do ogona” (tj. C-koniec do C-końca) lub kombinacje powyższych. Multimery mogą być powtórzeniami tandemowymi 2,3,4 do 10 peptydów „rdzeniowych”.

Korzystnie, multimery są tandemowymi powtórzeniami od 2 do 8 peptydów. W jednym wykonaniu wynalazku agoniśći ApoA-I składają się z multimerów mających następujący wzór strukturalny:

(IV) HH-[LLm-HH]-nLLm-HH gdzie:

każde m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0do 1,korzystnie 1; n jest liczbą całkowitą od 0 do 10, korzystnie od 0 do 8;

każde „HH” oznacza niezależnie peptyd „rdzeniowy” analog peptydu o strukturze (I), jego wersje zmutowaną, skróconą lub wydłużoną, jak to opisano;

każde„LL”oznaczaniezależniełączniknp.Pro (P), D-Pro (p) iGly (G).

W korzystnym wykonaniu wynalazku powtórzenia tandemowe są przerywane pojedynczymi resztamiproliny.

W sytuacji, gdy peptydy rdzeniowe zawierają na ich C- lub N-końcu prolinę, np., gdzie X1 w strukturze (I) oznacza Pro (P). W tych przypadkach,gdzie peptyd „rdzeniowy”nie zawiera proliny na N-lub C-końcu, „LL”jest korzystnie proliną.

W pewnych wykonaniach wynalazku może być właściwe użycie sekwencji łączących podatnych na cięcie, co pozwoli uwolnić w pewnych warunkach jeden lub więcej segmentów helikalnych (HH). Użyteczne łączniki podatne na cięcie obejmują peptydy mające sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez proteazy i oligonukleotydy, które są trawione przez endonukleazy. Warunki trawienia powinny być relatywnie łagodne, ażeby nie zdenaturować lubzdegradować segmentów helikalnych i/lub nieciętych łączników, które wchodzą w skład agonistów ApoA-I. Peptydy i łączniki oligonukleotydowe, które mogą być selektywnie trawione, a także sposoby trawienia łączników są dobrze znane specjalistom.

W korzystnym wykonaniu, używane łączniki są peptydami, które stanowią substraty dla endogennie występujących enzymów cyrkularnych, przez co umożliwiają trawienie agonistów ApoA-I in vivo. Endogennie występujące enzymy użyteczne do trawienia łączników obejmują na przykład peptydazę proapolipoproteiny A-I.

Odpowiednie enzymy, jak również fragmenty peptydowe, które są substratami dla danych enzymów są dobrze znane specjalistom (Edelstein i współ., 1983, J. Biol. Chem. 258: 1 1 430-1 1 433; Zanis, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2574-2578).

Jak wcześniej omawialiśmy, kluczową cechą peptydów „rdzeniowych” tego wynalazku jest ich zdolność do tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych lub mostków solnych, kiedy są ułożone antyrównolegle. W korzystnym wykonaniu naszego wynalazku łączniki o odpowiedniej długości i ruchliwości są używane po to, ażeby pozwolić segmentom helikalnym (HH) struktury (II) ułożyć się w sposób antyrównoległy i utworzyć wiązania wodorowe lub mostki solne w obecności lipidów. Łączniki odpowiedniej długości obejmują, ale nie są ograniczone do Pro (P), Gly (G), Cys-Cys.

Alternatywnie mogą być używane łączniki peptydowe, które odpowiadają w pierwotnej sekwencji segmentom peptydowym łączącym przyległe heliksy w natywnych apolipoproteinach w tym ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE i ApoJ, w celu łączenia peptydów „rdzeniowych”. Sekwencje te są dobrze znane specjalistom (Rosseneu i współ., „Analysis of the Primary andof the Secondary Structureof the Apolipoproteins”, W: Structure and Function of Lipoproteins, Ch. 6, 159-183, CRC Press, Inc., 1992).

Inne łączniki, które umożliwiają tworzenie międzycząsteczkowych wiązań wodorowych lub mostków solnych między powtórzeniami tandemowymi antyrównoległych segmentów helikalnych, obejmują białkowe skręty „odwracające” takie, jak skręty β i skręty α. Ogólnie skręty „odwracające” są segmentami białkowymi, które odwracają kierunek łańcucha polipeptydowego tak, że pojedynczy polipeptyd może utworzyć strukturę antyrownoleglej β-kartki lub α-helisy. Skręty β są złożone z 4 reszt

PL 193 662 B1 aminokwasowych, a skręty α są złożone z 3 reszt aminokwasowych. Konformacja i sekwencja wielu białkowych skrętów β jest dobrze opisana i obejmuje przykładowo typ-I, typ-I', typ-II, typ-II', typ-III, typ-III', typ-IV, typ-V, typ-V, typ-Vla, typ-Vlb, typ-VIIi typ-VIII (Richardson, 1981, Adv. Protein Chem. 34: 167-339; Rosei współ., 1985, Adv. Protein Chem. 37: 1-109; Wilmot i współ., 1988, J. Mol. Biol. 20 203:221-232; Sibanda i współ., 1989, J. Mol. Biol. 206: 759-777; Tramontane i współ., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6: 382-394).

Specyficzna konformacja krótkich skrętów białkowych, takich jak skręty β zależy przede wszystkim od pozycji pewnych aminokwasów w skręcie, zwykle Gly, Asn lub Pro. Ogólnie typ-I skrętu β może składać się z jakiegokolwiek aminokwasu w pozycjach 1-4 z wyjątkiem, że prolina nie może występować w pozycji 3. Gly występuje w pozycji 4, a Pro występuje głównie w pozycji 2 w typie-I i typie-II skrętów. Asp, Asn,Ser, Cys występują najczęściej w pozycji 1, gdzie ich łańcuchy boczne tworzą często wiązania wodorowe z grupąNH reszty w pozycji 3. W typie-II skrętów Gly i Asn występują najczęściej w pozycji 3, ponieważ najłatwiej mogą przyjąć wymagane kąty wiązań. Idealnie typ-I' skrętów ma Gly w pozycji 2 i 3, a typ-II' skrętów ma Gly w pozycji 2. Typ-III skrętów może zawierać większość aminokwasów, typ-III' skrętów wymaga zwykle Gly w pozycji 2i 3. Typ-VIa i typ-VIb skrętów zawiera wiązanie peptydowe typu Cis i Pro, jako wewnętrzną resztę. Przegląd rożnych typów β skrętów został opublikowany przez Wilmot i współ., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232.

Konformacja i sekwencja wielu y skrętów została również dobrze opisana przez specjalistów (Rosei współ., 1985, Adv. Protein Chem. 37: 1 -109; Wilmer-White 10 i współ., 1987, Trends Biochem. Sci. 12:189-192; Wilmot i współ., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda i współ., 1989, J. Mol. Biol. 206: 759-777; Tramontane i współ., 1989, Proteins:Struct. Funct. Genet. 6: 382-394). Wszystkie typy β skrętów i γ skrętów oraz odpowiadające im sekwencje i struktury, jak również ostatnio odkryte β skręty i γ skręty zostały szczegółowo rozważone w wynalazku.

Podczas, gdy struktury (I), (II), (III) zawierają 22 reszty aminokwasowe, jest oczywiste, że peptyd „rdzeniowy” wynalazku może ich zawierać mniej. Rzeczywiście skrócone od końca lub wewnętrznie formy struktury (I), (II), (III) zawierające tak mało, jak 18 a nawet 15 aminokwasów, które zachowują ogólną charakterystykę i właściwości amfipatycznej helisy tworzonej przez peptyd „rdzeniowy” o strukturze (I), (II), (III) są uważane za leżące w ramach tego wynalazku.

Skrócone formy peptydów o strukturze (I) są uzyskiwane przez delecje jednego lub więcej aminokwasów z N-lub C-końca wzoru (I), (II), (III). Wewnętrzne delecje struktur (I), (II), (III) są uzyskiwane przez delecje jednego lub więcej aminokwasów z pozycji wewnętrznych peptydu struktury (I), (II), (III), przy czym mogąto być ale mogą nie być również aminokwasy kolejne.

Specjaliści z dziedziny zauważą, że delecja wewnętrznych aminokwasów z peptydu „rdzeniowego” struktury (I), (II), (III) może spowodować skręcenie płaszczyzny hydrofilowo-hydrofobowej helisy o 100° w punkcie delecji. Ponieważ takie skręcenie może znacznie zmienić własności amfipatyczne powstałej helisy, w wynalazku aminokwasy są usuwane tak, żeby nie zmieniać uliniowania płaszczyzny hydrofilowo-hydrofobowej, wzdłuż podłużnej osi helisy.

To może być łatwo osiągnięte przez usuwanie, dostatecznej liczby następujących bądź nie następujących po sobie aminokwasów, w ten sposób całkowity skręt helisy zostaje usunięty. Wyidealizowany skręt helisy zawiera 3,6 reszty aminokwasowej na skręt. Tak więc w wynalazku usuwane są grupy kolejnych lub nie następujących po sobie 3-4 aminokwasów. Czy są to 3 czy 4 aminokwasy zależy od pozycji w helisie pierwszego aminokwasu, który ma zostać usunięty. Specjaliści mogą ustalić dokładną liczbę aminokwasów, które tworzą kompletny skręt helisy począwszy od danego punktu amfipatycznego helisy.

Z powodu przypuszczalnej roli fragmentu zawierającego ugrupowania aminokwasów zasadowych na C-końcu peptydu rdzeniowego o strukturze (I), (II) i (III) w stabilizacji helisy oraz roli fragmentu zawierającego zgrupowania aminokwasów hydrofobowych w wiązaniu lipidów i aktywacji LCAT, w wynalazku fragmenty zawierające takie zgrupowania nie są usuwane. Tak więc w wynalazku reszty 19, 20 i 22 (zgrupowanie reszt zasadowych) i reszty 3,6,9 i10 (zgrupowanie reszt hydrofobowych) nie są usuwane.

Peptydy „rdzeniowe” o strukturze (I), (II), (III) mogąbyć wydłużone z jednego, z dwóch końców lub wewnętrznie przez addycję aminokwasów, które nie zaburzają, a w niektórych przypadkach poprawiają strukturalne i funkcjonalne własności peptydów. Rzeczywiście, wydłużone peptydy „rdzeniowe” zawierające 23,25,26,29 lub nawet więcej aminokwasów obejmują zakres tego wynalazku. Najlepiej, gdy wydłużone peptydy zachowują amfipatyczność i inne własności peptydów o strukturze (I), (II) i (III). Oczywiście wewnętrzne insercje spowodują skręt płaszczyzny hydrofobowo-hydrofilowej

PL 193 662 B1 w punkcie insercji w sposób podobny do opisanych wcześniej wewnętrznych delecji. Tak więc, zastrzeżenia dyskutowane dla wewnętrznych delecji odnoszą się również do wewnętrznych insercji.

W jednym wykonaniu, peptydy „rdzeniowe” są wydłużone na N-lub\i C-końcu przez co najmniej jeden skręt helisy. Takie wydłużenia raczej stabilizują w obecności lipidów drugorzędową strukturę helisalną, podobnie jak aminokwasy „czapeczki” i segment opisane wcześniej.

W szczególnie wybranym wykonaniu peptyd „rdzeniowy”o strukturze (I), (II), (III) jest wydłużony na C-końcu przez jedną zasadową resztę, najlepiej Lys (K).

5.1.3 Korzystne wykonania wynalazku.

Cząsteczki agonistów ApoA-I kodowane przez sekwencje nukleotydowe według tego wynalazku mogą być dalej zdefiniowane przez wybrane wykonania.

W jednym wybranym wykonaniu, sekwencja nukleotydowa wynalazku koduje cząsteczkę agonisty ApoA-I złożoną z peptydu „rdzeniowego” o strukturze (I) zawierającego 22 aminokwasy gdzie:

XI oznaczaPro(P),Gly(G)lubAla(A);

X2 oznaczaVal(V),Leu(L);

X3 oznacza Leu (L);

X4 oznaczaAsp(D)lubGlu(E);

X5 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X6 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X7 oznaczaLys(K)lubArg(R);

X8 oznaczaGlu(E);

X9 oznacza Leu (L);

X10oznacza Leu (L), Trp (W);

XII oznaczaAsn(N)lubGln(Q);

X12 oznaczaGlu(E);

X13 oznacza Leu (L);

X14 oznacza Leu (L), Trp(W);

X15 oznaczaGlu(E);

X16 oznaczaAla(A) lubTrp(W);

X17 oznacza Leu (L);

jednymzX18lubX19oznaczaGln(Q)ainnymLys(K);

X20 oznaczaLys(K);

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznaczaLys(K).

W innym wykonaniu, sekwencja nukleotydowa tego wynalazku koduje cząsteczkę agonisty ApoA-I złożoną z peptydu „rdzeniowego” o strukturze (I) zawierającego 22 aminokwasy gdzie:

XI oznaczaPro(P),Gly(G)lubAla(A);

X2 oznaczaVal(V);

X3 oznacza Leu (L);

X4 oznaczaAsp(D)lubGlu(E);

X5 oznaczaLeu(L)lubPhe(F);

X6 oznaczaPhe(F);

X7 oznaczaArg(R);

X8 oznaczaGlu(E);

X9 oznacza Leu (L);

X10oznacza Leu (L), Trp (W);

XII oznaczaAsn(N);

X12 oznaczaGlu(E);

X13 oznaczaGly(G);

X14 oznacza Leu (L);

X15 oznaczaGlu(E);

X16 oznaczaAla(A) lubTrp(W);

X17 oznacza Leu (L);

X18oznaczaLys(K);

X19 oznaczaGln(Q);

X20 oznaczaLys(K);

X21 oznacza Leu (L);

PL 193 662 B1

X22 oznacza Lys (K).

Szczególnie wybranymi sekwencjami nukleotydowymi, jeśli chodzi o ten aspekt wynalazku są te które kodują peptydy „rdzeniowe” wybrane z grupy złożonej z:

peptyd	3	PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ	ID	NO	3) ;
peptyd	13	GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ	ID	NO	13) ;
peptyd	138	PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK	(SEQ	ID	NO	138) ;
peptyd	139	PVLDLFRELWNEGLEALKQKLK	(SEQ	ID	NO	139) ;
peptyd	141	PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ	ID	NO	141) ;
peptyd	142	PVLELFRELLNEGLEALKQKLK	(SEQ	ID	NO	142) .

W następnym wykonaniu sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów ApoA-I, które są 22 aminokwasowym peptydami o strukturze (I), gdzie: X9 oznacza Gly (G), a X10, X13, X14, X16 iX17 są różne od Gly (G).

Szczególnie wybranym agonistą ApoA-I zgodnie z tym aspektem wynalazku jest peptyd 20: PVLDLFREGLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 20).

W następnym wykonaniu sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów ApoA-I, które są 22 aminokwasowymi peptydami o strukturze (I), gdzie, gdzie: X10 jest Gly (G), a X9, X13, X14, X16 i X17 są różne od Gly (G). Szczególnie wybranym agonistą ApoA-I zgodnie z tym aspektem wynalazku jest peptyd 9: PVLDLFRELGNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 9).

W następnym przykładzie sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów ApoA-I, które są 22 aminokwasowymi peptydami o strukturze (I), gdzie: X14 oznacza Gly (G), a X9, X10, X13, X16 i X17 są różne od Gly (G). Szczególnie wybranym agonistą ApoA-I zgodnie z tym aspektem wynalazku jest peptyd 126: PVLDLFRELLNELGEALKQKLK (SEQ ID NO: 126).

W następnym wykonaniu sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów ApoA-I, które są 22 aminokwasowymi peptydami o strukturze (I), gdzie X16 oznacza Gly (G), a X9, X10, X13, X14, X16 i X17 są różne od Gly (G). Szczególnie wybranym agonistą ApoA-I zgodnie z tym aspektem wynalazku jest peptyd 22: PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK (SEQ ID NO: 22).

W następnym przykładzie sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów ApoA-I, które są 22 aminokwasowymi peptydami o strukturze (I), gdzie X17 oznacza Gly (G), a X9, X10, X13, X14 iX16 są różne od Gly (G). Szczególnie wybranym agonistą ApoA-I zgodnie z tym aspektem wynalazku jest peptyd 12: PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK (SEQ ID NO: 12).

W kolejnym wykonaniu sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów ApoA-I, które są22 aminokwasowymi peptydami o strukturze (I), gdzie X9, X10, X13, X14, X16 i X17 są różne od Gly (G).

Agonistami są 22 aminokwasowe peptydy o strukturze (I), gdzie:

XI oznacza Pro (P), Gly (G) lub Ala (A);

X2 oznacza Val (V), Leu (L);

X3 oznacza Leu (L);

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Arg (R) lub Lys (K);

X8 oznacza Glu (E);

X9 oznacza Leu (L);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W);

XII oznacza Asn (N) lub Gln (Q);

X12 oznacza Glu (E);

X13 oznacza Leu (L);

X14 oznacza Leu (L), Trp (W);

X15 oznacza Glu (E);

X16 oznacza Ala (A), Leu (L) lub Trp (W);

X17 oznacza Leu (L).

W jednym z wykonań X18 lub X19 oznacza Gln (Q) a innym Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X21 oznacza Leu (L);

PL 193 662 B1

X22 oznaczaLys(K).

W szczególnie wybranym wykonaniu tego aspektu wynalazku: X2 oznacza Val (V); X4 oznacza

Asp (D); X5 oznacza Leu (L); X6 oznacza Phe (F); X7 oznaczaArg (R); X10 oznacza Leu (L); X11 oznacza Asn (N); X13 oznacza Leu (L); X14 oznacza Leu (L); X16 oznacza Ala (A); X17 oznacza Leu (L); X18 oznacza Lys (K); X19 oznacza Gln (Q); X20 oznacza Lys (K) i/lub X22 oznacza Lys (K).

W jeszcze innym wykonaniu sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów ApoA-I, które są zmienionymi lub zmutowanymi formami peptydów o strukturze (I), gdzie:

XI oznaczainnyniżVal(V) lubLeu(L);

X5 oznaczainnyniżLys(K),Glu(E)lubTrp(W);

X6 oznaczainnyniżTrp(W);

X7 oznaczainnyniżTrp(W)lubLeu(L);

X8 oznaczainnyniżTrp(W);

X9 oznaczainnyniżLys(K)lubTrp(W);

XII oznaczainnyniżTrp(W);

X12 oznaczainnyniżTrp(W)lubLeu(L);

X13 oznaczainnyniżGlu(E)lubTrp(W);

X15 oznaczainnyniżTrp(W);i/lub

X21 oznaczainnyniżLys(K).

W jeszcze innym wybranym wykonaniu, sekwencje nukleotydowe wynalazku kodują cząsteczki agonistów ApoA-I, które są wybrane z grupy peptydów podanych niżej:

GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK

PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALKQKLK

PVLDLFKELLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELGNELLEALKQKLK

PVLDLFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK

GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

PVLDLFRELWNELLEALKQKLK

PVLDLLRELLNELLEALKQKLK

PVLELFKELLQELLEALKQKLK

GVLDLFRELLNELLEALKQKLK 20 PVLDLFREGLNELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK

PLLELFKELLQELLEALKQKLK

PVLDLFRELLNELLEALQKKLK 26 PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

PVLDLFRELLNELWEALKQKLK

AVLDLFRELLNELLEALKQKLK 123 QVLDLFRELLNELLEALKQKLK

125 NVLDLFRELLNELLEALKQKLK

126 PVLDLFRELLNELGEALKQKLK

127 PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

128 PVLDLFRELLNELLEFLKQKLK

129 PVLELFNDLLRELLEALQKKLK

130 PVLELFNDLLRELLEALKQKLK

131 PVLELFKELLNELLDALRQKLK

132 PVLDLFRELLENLLEALQKKLK

133 PVLELFERLLEDLLQALNKKLK

134 PVLELFERLLEDLLKALNQKLK

135 DVLDLFRELLNELLEALKQKLK

136 PALELFKDLLQELLEALKQKLK

138 PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK

139 PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK

141 PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK

142 PVLELFRELLNEGLEALKQKLK

(SEQ	ID	NO:2);
(SEQ	ID	NO:3);
(SEQ	ID	NO:4);
(SEQ	ID	NO:7);
(SEQ	ID	NO:8);
(SEQ	ID	NO:9);
(SEQ	ID	NO:11);
(SEQ	ID	NO:12);
(SEQ	ID	NO:13);
(SEQ	ID	NO:15);
(SEQ	ID	NO:16);
(SEQ	ID	NO:17);
(SEQ	ID	NO:18);
(SEQ	ID	NO:20);
(SEQ	ID	NO:22);
(SEQ	ID	NO:23);
(SEQ	ID	NO:24);
(SEQ	ID	NO:2 6);
(SEQ	ID	NO:28);
(SEQ	ID	NO:29);
(SEQ	ID	NO:123);
(SEQ	ID	NO:125);
(SEQ	ID	NO:126);
(SEQ	ID	NO:127);
(SEQ	ID	NO:128);
(SEQ	ID	NO:129);
(SEQ	ID	NO:130);
(SEQ	ID	NO:131);
(SEQ	ID	NO:132);
(SEQ	ID	NO:133);
(SEQ	ID	NO:134);
(SEQ	ID	NO:135);
(SEQ	ID	NO:136);
(SEQ	ID	NO:138);
(SEQ	ID	NO:139);
(SEQ	ID	NO:141);
(SEQ	ID	NO:142);

PL 193 662 B1

W innym wykonaniu, sekwencje nukleotydowe tego wynalazku kodują cząsteczki agonistów

ApoA-I złożone z peptydu „rdzeniowego” o strukturze (II) zawierającego 22 aminokwasy gdzie:

XI oznacza Pro (P), Gly (G), Ala (A) lub Asn (N);

X2 oznaczaAla(A),Val(V) lubLeu(L);

X5 oznaczaLeu(L);

X6 oznacza Phe (F);

XII oznacza Glu (E);

X19 oznacza Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X21 oznaczaLeu(L); i/lub

X22 oznacza Lys (K), a X3, X4, X7, X8, X9, X10, X12, X13, X14, X15, X16, X17, X18 i X21 byłypoprzednio zdefiniowanedlastruktury (II).

Szczególnym przypadkiem agonistów ApoA-I w stosunku do tego aspektu wynalazku są struktury w których X2 oznacza Val (V),i/lub X16 oznacza Gln (Q).

W innym wykonaniu, sekwencje nukleotydowe tego wynalazku kodują cząsteczki agonistów ApoA-I złożone z peptydu „rdzeniowego” o strukturze (II) zawierającego 22 aminokwasy gdzie: X10, X13, X14 są Gly (G) i inny gdzie: X10, X13, X14 są inne niż Gly (G). Gdy X14 oznacza Gly (G), to X7 oznacza korzystnie Glu (E).

Szczególnie korzystne sekwencje nukleotydowe zgodnie z tym aspektem wynalazku kodują cząsteczki agonistów ApoA-I, które są peptydami z grupy peptydów:

peptyd 148: peptyd 151: peptyd 154:

PVLELFENLLERLGDALQKKLK

PVLELFENLGERLLDALQKKLK

PVLELFENLLERGLDALQKKLK (SEQ ID NO:148); (SEQ ID NO:151); (SEQ ID NO:154).

W jeszcze innym wybranym wykonaniu sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów ApoA-I złożone z peptydu „rdzeniowego” o zmienionej lub zmutowanej strukturze (II), gdzie:

X4 oznaczainnyniżAsp(D);

X5 oznaczainnyniżPhe(F);

X6 oznacza inny niż Trp (W);

X7 oznaczainnyniżLeu(L)lubAsp(D);

X9 oznacza inny niż Gly (G)lubTrp(W);

X12 oznacza inny niż Lys (K);

X13 oznacza inny niż Trp (W);

X14 oznacza inny niż Trp (W);

X15 oznacza inny niżGlu (E);

X16 oznacza inny niż Trp (W)lubLeu(L);i

X17 oznacza inny niż Trp (W).

W następnym wybranym przykładzie sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów ApoA-I, które są 22 aminokwasowymi peptydami o strukturze (II), gdzie: X7 oznacza Leu (L), X10 oznacza Trp (W), X1 oznacza inny niż Gly (G) i/lub X14 oznacza inny niż Gly (G). Szczególnie wybrany agonista ApoA-I zgodnie z tym aspektem wynalazku oznacza peptyd 155 (PVLELFLNLWERLLDALQKKLK; SEQ ID NO: 155).

PL 193 662 B1

W następnym wybranym przykładzie, sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów

ApoA-I, które są wybrane z zestawu peptydów podanego poniżej:

peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd peptyd

145 GVLELFENLLERLLDALQKKLK

146 PVLELFENLLERLLDALQKKLK

147 PVLELFENLLERLFDALQKKLK

148 PVLELFENLLERLGDALQKKLK

149 PVLELFENLWERLLDALQKKLK

150 PLLELFENLLERLLDALQKKLK

151 PVLELFENLGERLLDALQKKLK

152 PVFELFENLLERLLDALQKKLK

153 AVLELFENLLERLLDALQKKLK

154 PVLELFENLLERGLDALQKKLK

155 PVLELFLNLWERLLDALQKKLK

186 PVLELFEQLLERLLDALQKKLK

187 PVLELFENLLERLLDALNKKLK

188 PVLELFENLLDRLLDALQKKLK

189 DVLELFENLLERLLDALQKKLK (SEQ ID NO:145); (SEQ ID NO:146); (SEQ ID NO:147); (SEQ ID NO:148); (SEQ ID NO:149); (SEQ ID NO:150); (SEQ ID NO:151); (SEQ ID NO:152); (SEQ ID NO:153); (SEQ ID NO:154); (SEQ ID NO:155); (SEQ ID NO:186); (SEQ ID NO:187); (SEQ ID NO:128); (SEQ ID NO:189);

W jeszcze innym wybranym wykonaniu cząsteczkami agonistów ApoA-I są 18 aminokwasowe peptydy o strukturze(III).

W jeszcze innym wybranym wykonaniu sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów ApoA-I złożoną z 18 aminokwasowego peptydu o strukturze(III), gdzie:

X2 oznaczaAla(A),Val(V) lubLeu(L);

X4 oznaczaAsp(D)lubGlu(E);

X7 oznacza Arg (R) lub Lys (K);

X8 oznaczaAsp(D)lubGlu(E);

X11 oznaczaGlu(E)lubAsn(N);

X12 oznacza Glu (E);

X14 oznacza Arg (R), Lys (K) lub Leu (L);

X16 oznacza Arg (R), Lys (K); i/lub X18 oznaczaArg(R), Lys(K)i

X1, X3, X4, X6, X9, X10,X13, X15 i X17 są zdefiniowane tak jak dla struktury (III), wcześniej.

W innym wybranym wykonaniu sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczkę agonisty ApoA-I złożoną z 18 aminokwasowego peptydu o strukturze (III), gdzie: X11 oznacza Asn (N), X14 oznacza Leu(L)igdzieX11 oznaczainneniżAsn(N)iX14 oznaczainne niż Leu (L). Szczególnie wybrany agonista ApoA-I zgodnie z tym aspektem wynalazku oznacza peptyd 209 (PVLDLFRELLNELLQKLK; SEQIDNO:209).

W jeszcze innym wykonaniu, cząsteczki agonistów ApoA-I są zmienionymi lub zmutowanymi peptydami o strukturze (III), gdzie:

X1 oznacza inny niż Asp (D);

X9 oznacza inny niż Gly (G);

X10oznacza inny niż Gly (G);

X12 oznacza inny niż Leu (L); i X13 oznaczainnyniżGly(G).

PL 193 662 B1

W następnym wybranym wykonaniu, sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów

ApoA-I, które są wybrane z zestawu peptydów podanych poniżej:

peptyd	191	PVLDLLRELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	191) ;
peptyd	192	PVLDLFKELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	192) ;
peptyd	193	PVLDLFRELLEELKNKLK*	(SEQ	ID	NO	193) ;
peptyd	194	PVLELFRELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	194) ;
peptyd	195	PVLELFKELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	195) ;
peptyd	196	PLLDLFRELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	196) ;
peptyd	197	GVLDLFRELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	197) ;
peptyd	198	PVLDLFRELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	198) ;
peptyd	199	NVLDLFRELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	199) ;
peptyd	200	PLLDLFKELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	202) ;
peptyd	201	PVLDLFRELWEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	201) ;
peptyd	202	PALELFKDLLEELRQKLR*	(SEQ	ID	NO	202) ;
peptyd	203	AVLDLFRELLEELKQKLK *	(SEQ	ID	NO	203) ;
peptyd	204	PVLDFFRELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	204) ;
peptyd	205	PVLDLFREWLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	205) ;
peptyd	206	PLLELLKELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	206) ;
peptyd	207	PVLELLKELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	207) ;
peptyd	208	PALELFKDLLEELRQRLK*	(SEQ	ID	NO	208) ;
peptyd	209	PVLDLFRELLNELLQKLK	(SEQ	ID	NO	209) ;
peptyd	210	PVLDLFRELLEELKQKLK	(SEQ	ID	NO	210) ;
peptyd	213	PALELFKDLLEEFRQRLK*	(SEQ	ID	NO	213) ;
peptyd	215	PVLDLFRELLEEWKQKLK*	(SEQ	ID	NO	215) ;
peptyd	229	PVLELFERLLEDLQKKLK	(SEQ	ID	NO	229) ;
peptyd	230	PVLDLFRELLEKLEQKLK	(SEQ	ID	NO	230) ;
\ peptyd	231	PLLELFKELLEELKQKLK*	(SEQ	ID	NO	231) .

W jeszcze innym wybranym wykonaniu sekwencje nukleotydowe kodują cząsteczki agonistów ApoA-I, które są multimerycznymi formami zgodnie ze strukturą IV, w której ΗΗ oznacza niezależny peptyd o strukturze (I), (II) lub (III), lub jakimkolwiek wybranym peptydem zgodnym ze strukturą(I), (II) lub (III) opisana tutaj.

W ostatnim wybranym wykonaniu cząsteczkami agonistów ApoA-I nie są peptydy wymienione w tabeli VIII, które są złożone z aminokwasów nie kodowanych genetycznie lub takie które wykazują aktywacje LCAT mniejsza niż 38% w porównaniu z natywną ludzką ApoA-I.

5.1.4 Analiza struktury i funkcji.

Struktura i funkcja peptydów „rdzeniowych” lub analogów peptydów złożonych z takich peptydów „rdzeniowych”, w tym form multimerycznych opisanych wyżej, może być testowana w celu selekcji aktywnych agonistów lub mimetyków ApoA-I. Na przykład peptydy „rdzeniowe” lub analogi peptydów mogą być testowane pod względem ich zdolności do tworzenia form α-helikalnych w obecności lipidów, do wiązania lipidów, do tworzenia kompleksów z lipidami, do aktywacji LCAT, do uwalniania cholesterolu itd.

Metody i testy służące do analizy struktury są znane specjalistom. Wybrane metody są podane w roboczych przykładach, poniżej. Na przykład, testy dichroizmu kołowego (CD) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), opisane w Rozdziale 7, poniżej, mogą być użyte do analizy struktury peptydów i ich analogów, w szczególności stopnia helikalności w obecności lipidów. Zdolność do wiązania lipidów może być mierzona przy pomocy spektroskopii fluorescencyjnej opisanej w Rozdziale 7, poniżej. Zdolność peptydów lub ich analogów do aktywacji LCAT może być łatwo zmierzona przez zmierzenie aktywacji LCAT opisanej w Rozdziale 8, poniżej. Testy in vitro i in vivoopisane w Rozdziale 9 i 10 mogą być użyte do zbadania czasu półtrwania, dystrybucji, wypływu cholesterolu i efektów na RCT. Ogólnie, peptydy „rdzeniowe” i ich analogi są uważane w wynalazku za aktywne, jeśli wykazują własności wyliczone w tabeli VI.

PL 193 662 B1

T a b el a VI

Właściwości aktywnych peptydów

Właściwości	Zakres	Korzystny zakres
% helikalności w obecności lipidów (Ri=30) (niezablokowane 22-aminokwasowe reszty peptydowe)	> 60%	> 80%
% helikalności w obecności lipidów (Ri=30) (niezablokowane 18-aminokwasowe reszty peptydowe)	> 40%	> 60%
% helikalności w obecności lipidów (Ri=30) (niezablokowane 18-aminokwasowe reszty peptydowe i krótsze peptydowe)	> 60%	> 80%
wiązanie lipidów (w obecności SUV)	0,5-10 μΜ peptyd Ri=1-50
aktywacja LCAT	> 38%	> 80%

Jak pokazano w przykładach, peptydy „rdzeniowe”, które wykazują wysoki stopień aktywacji LCAT (38%) posiadają znaczący udział struktury α-helikalnej w obecności „małych jednobło nowych pęcherzyków” (SUV) (60% struktury helikalnej w przypadku nieblokowanych peptydów zawierających 22 lub więcej aminokwasów i blokowanych peptydów zawierających 18 i mniej aminokwasów; (40% struktury helikalnej w przypadku nie blokowanych peptydów zawierających 18 i mniej aminokwasów), a peptydy które wykazują mały albo żaden stopień aktywacji LCAT wykazują niewielki udział struktury α-helikalnej. Aczkolwiek, w niektórych przypadkach, peptydy które wykazują znaczący udział struktury α-helikalnej w obecności lipidów, nie aktywują LCAT w znaczący sposób.

Podobnie, podczas gdy peptydy „rdzeniowe”, które aktywują znacznie LCAT, wiążą lipidy, to w niektórych przypadkach peptydy wykazujące wiązanie lipidów nie wpływają na aktywacje LCAT.

W konsekwencji, zdolność do tworzenia przez peptydy „rdzeniowe” struktury α-helikalnej (w obecności lipidów) i wiązanie do lipidów, są istotne, ale nie wystarczające do aktywności.

Tak więc wybrane wynalazki zostały poddane selekcji w celu wybrania peptydów „rdzeniowych” wykazujących aktywność farmakologiczną.

W pierwszym etapie peptyd „rdzeniowy” jest badany pod względem zdolności do tworzenia struktury α-helikalnej (w obecności lipidów) przy użyciu dichroizmu kołowego (CD) jak opisano w Rozdziale 7, poniżej. Te peptydy, które wykazywały przynajmniej 40% lub 60% helikalności w obecności lipidów (w stężeniu około 5 μΜ i stosunku molowym lipid:peptyd około 30), bada się dalej pod względem zdolności do wiązania lipidów przy użyciu testu fluorescencyjnego jak opisano w Rozdziale 7, poniżej. Oczywiście tylko te peptydy „rdzeniowe”, które posiadają resztę Trp (W) mogą być badane z zastosowaniem fluorescencji pod względem wiązania lipidów. Jednakże, dla peptydów nie posiadających reszty fluoryzującej, wiązanie do lipidów jest oczywiste, jeśli wzrasta helikalność w obecności lipidów.

Peptydy „rdzeniowe”, które wykazują wiązanie do lipidów w obecności SUV (0,5-10 μΜ peptydu; stosunek molarny lipid :peptyd w zakresie 1 do 50) są następnie badane pod względem aktywności farmakologicznej. Oczywiście badana aktywność farmakologiczna będzie zależała od prawidłowego użycia agonisty ApoA-I. W wybranym wykonaniu, peptydy „rdzeniowe” są badane pod względem zdolności do aktywacji LCAT, ponieważ peptydy aktywujące LCAT są szczególnie użyteczne w metodach tu opisywanych. Peptydy „rdzeniowe”, które wykazują około 38% aktywacji LCAT (mierzonej w teście aktywacji LCAT opisanym w rozdziale 8, poniżej), są tutaj preferowane, w tym szczególnie peptydy „rdzeniowe”, które wykazują 50%, 60%, 70%, 80%, lub nawet 90% aktywacji.

5.2Wektory DNAi kasety kodujące ApoA-I

Zgodnie z tym wynalazkiem sekwencje nukleotydowe kodujące, natywną ApoA-I, jej zmodyfikowane formy lub peptydy o aktywnościach ApoA-I, w tym agonistów i superagonistów ApoA-I są wklonowane w kasety lub wektory ekspresyjne tj. posiadające sekwencje niezbędne do transkrypcji i translacji wklonowanej sekwencji kodującej lub w przypadku wektorów opartych na wirusach RNA, elementy niezbędne do replikacji i translacji. Sekwencja nukleotydowa wynalazku może być podana w czasie terapii genowej ex vivo i in vivo jako „nagie” DNA. „Nagie” plazmidy kodujące cząsteczki peptydów i agonistów ApoA-I mogą być z powodzeniem pobrane przez komórki, które następnie wyprodukują peptydy. (Felgner i współ. Patent U.S.A. nr. 5,580,859, dołączone jako odniesienie w całości).

PL 193 662 B1

DNA może być również podawane w kompleksach z nielipidowymi polimerami kationowymi lub w kompleksach z liposomami, ażeby wzmóc jego pobieranie przez komórki.

W innym przykładzie wynalazku wektor ekspresyjny jest wprowadzany do odpowiednich komórek, które będą eksprymować peptyd. W zależności od używanego systemu, eksprymowany peptyd jest następnie izolowany przez standardowe metody. Metody produkcji rekombinowanych białek i peptydów są znane specjalistom (Maniatis i współ., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; and Ausubel i współ., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).

W wynalazku, kasety DNA zawierają sekwencje nukleotydowe kodujące prepropeptyd i propeptyd ApoA-I, ażeby zapewnić prawidłowe procesowanie i sekrecję peptydów ApoA-I z komórek gospodarza. Prepro-ApoA-I zawiera 18 aminokwasowy peptyd liderowy lub inaczej sekwencję sygnałową na N-końcu, odcinany w czasie sekrecji proApoA-I z komórek gospodarza. Sekwencja liderowa jest typowej długości i hydrofobowości (Davis i współ. 1980 Nature 283: 433-438) i kończy się aminokwasem o małym łańcuchu bocznym np. alaniną. Oto przykładowe sekwencje liderowe które mogą być użyte w wynalazku 5'MKAAVLTLAVLFLTGSQA3' (SEQ ID NO: 131) lub 5'MKAAVLAVALVFLTGCQA3' (SEQ ID NO: 133). Jakakolwiek sekwencja, która powoduje sekrecję peptydu z komórki może być używana z wynalazkiem.

ProApoA-I zawiera dodatkowe 6 aminokwasów na N-końcu sekwencji: R-H-F-W-Q-Q (SEQ ID NO: 120) lub X-E-F-X-Q-Q (SEQ ID NO: 140). Zewnątrzkomórkowe trawienie tej sekwencji przez specyficzną proteazę daje formę ApoA-I obecną w osoczu. Zgodnie z wynalazkiem sekwencja kodująca dodatkowe 6 aminokwasów może być dołączona do kaset i wektorów wynalazku, ażeby zapewnić to prawidłowe procesowanie peptydów ApoA-I kiedy już znajdą się poza komórką.

W celu zwiększenia wydajności produkcji, polinukleotyd może być skonstruowany w ten sposób, że zawiera wielokrotne powtórzenia peptydu przedzielone miejscami trawienia enzymatycznego. W ten sposób skonstruowane mogą być homopolimery (taki sam peptyd) lub heteropolimery (rożne peptydy połączone ze sobą). Powstały polipeptyd może być trawiony (przez traktowanie odpowiednim enzymem) w celu uzyskania monomerów. To może pozwolić na zwiększenie wydajności peptydów uzyskiwanych z jednego promotora. W wybranym przykładzie, z policistronowego nukleotydu powstaje pojedyncza cząsteczka mRNA, która koduje wiele peptydów, mogących ulegać niezależnej od „czapeczki” sekwencji kontroli translacji takiej jak „internal ribosome entry site (IRES)” opisanej przez Pelletier i współ. 1988 Nature 334: 320-325. W wybranym przykładzie IRES jest uzyskany z niekodującego 5' fragmentu sekwencji mRNA kodującego białko wiążące łańcuch ciężki immunoglobulin (BiP) (Macejak i współ. 1991 Nature 353: 90-94). Lepiej, gdy IRES pochodzi picornawirusów: wybrana z sekwencji IRES enterowirusów, rhinowirusów, cardiowirusów, aphtowirusów; wirusa żółtaczki typu A, B lub C. Używając odpowiedniego wirusowego systemu ekspresyjnego, translacja każdego peptydu kodowanego przez mRNA jest kierowana od środka cząsteczki przez IRES. Tak więc policistronowy konstrukt jest transkrybowany do pojedynczego policistronowego mRNA które następnie ulega translacji do pojedynczych peptydów. To podejście eliminuje produkcję i enzymatyczne procesowanie poliprotein i może znacznie podnieść wydajność produkcji z jednego promotora. W celu ekspresji peptydów opisanych tutaj można użyć wieluwektorów ekspresyjnych. Jakikolwiek system ekspresyjny może zostać użyty zgodnie z tym wynalazkiem pod warunkiem, że (1) eksprymuje peptydy ApoA-I wynalazku; (2) używa elementów kontrolnych (np. promotorów i wzmacniaczy (ang. enhanser), które są używane w komórkach ssaczych; (3) utrzymuje nukleotydową sekwencje ApoA-I w wielu kopiach. W wybranym przykładzie, może to być dowolny system ekspresyjny, który powoduje wzrost kopii sekwencji nukleotydowej kodującej peptydy lub cząsteczki agonistów ApoA-I, wprowadzony w czasie terapii genowej ex vivo lub in vivo. Obejmuje to, choć nie tylko: mikroorganizmy takie jak bakterie transformowane rekombinowanym DNA fagowym lub plazmidowym DNA zawierającym odpowiednie sekwencje kodujące; drożdże lub grzyby nitkowate transformowane rekombinowanymi wektoramiekspresyjnymi zawierającymi odpowiednie sekwencje kodujące, komórki owadzie infekowane rekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (tj. bakulowirusem) zawierającymi odpowiednie sekwencje kodujące; komórki roślinne infekowane rekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. wirusem mozaiki kalafiora lub wirusem mozaiki tytoniu) lub transformowane rekombinowanymi plazmidami ekspresyjnymi (np. plazmidy Ti) zawierającym odpowiednie sekwencje kodujące; lub komórki zwierzęce.

PL 193 662 B1

Elementy sterujące ekspresją systemów ekspresyjnych różnią się siłą i specyficznością. Zależnie od używanego systemy gospodarz/wektor, mogą być używane rożne elementy sterujące transkrypcja i translacja u ssaków, korzystnie u człowieka, wliczając w tym promotory konstytutywne i indukowane. W wybranym przykładzie, elementy sterujące ekspresją włączone w wektory i kasety ekspresyjne wynalazku są elementami cis- i trans-regulującymi ekspresję natywnego genu ApoA-I. W szczególności, elementy regulacji transkrypcji i „wzmacniacze” są znajdowane w rejonie -222 do -110 powyżej miejsca startu transkrypcji genu ApoA-I. Na przykład miejsce wiązania białka ARP-1, członka nadrodziny białek receptorów hormonów steroidowych leży w obrębie „wzmacniacza” specyficznego dla wątroby, zlokalizowanego w rejonie -222 do -110 powyżej genu ApoA-I. Sekwencja zgodności dla wiązania białka ARP-1 jest: 5'TGAACCCTTGACCCCT3' (SEQ ID NO: 197) (Ladias i współ. 1991 Science 251: 561-565). Sekwencje innych regulatorowych elementów transkrypcyjnych i „wzmacniaczy” podane są w Sorci-Thomas i współ. 1991 Journal of 5 Biol. Chem. 266: 18045-18050, Dai i współ. 1990 Eur. J. Biochem. 190: 305-310, Rottman i współ. 1991 Molecular and Cell Biology 11: 3814-3820.

Jeśli chodzi o klonowanie w komórkach bakteryjnych, roślinnych, owadzich, czy ssaczych można używać promotorów pochodzących z genomu komórek ssaczych (np. promotor matalotioneiny) lub ssaczych wirusów (np. późny promotor adenowirusów, promotor 7.5 K wirusa ospy). Jeśli chodzi o tworzenie linii komórkowych zawierających wiele kopii konstruktu ekspresyjnego mogą być używane wektory oparte o wirusy SV40, BPV, EBV odpowiednim markerem selekcyjnym.

W komórkach ssaczych, można używać wielu systemów ekpresyjnych opartych o wirusy. W przypadku kiedy jako wektor ekspresyjny używany jest adenowirus, sekwencja kodująca ApoA-I może być połączona z fragmentem kontrolującym trankrypcję/translację np. późnym promotorem i trzyczęściową sekwencją liderową. Taki gen hybrydowy może być włączony do genomu adenowirusa przez rekombinacje in vitro lub in vivo. Włączenie w nieistotne miejsce genomu wirusa (np. rejon E1 lub E3) dla rekombinowanego wirusa, który jest żywy i zdolny do ekspresji peptydu ApoA-I w zainfekowanym gospodarzu (Logan i Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3655-3659). W celu wydajnej translacji włączonej sekwencji kodującej peptyd ApoA-I może być potrzebny specyficzny sygnał inicjacyjny. Te sygnały obejmują startowy kodon ATG i przyległe sekwencje. W przypadku, gdy cały gen ApoA-I zawierający kodon ATG i przyległe sekwencje jest sklonowany do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, inne sygnały kontrolujące translacje mogą być nie potrzebne. Jeśli natomiast, tylko fragment sekwencji kodującej peptyd ApoA-I jest wklonowany, muszą być wkonstruowane egzogenne sygnały translacji, w tym może być kodon ATG. Ponadto kodon startu translacji musi być w fazie z ramką odczytu zadanej sekwencji, aby zapewnić translacje całości. Te egzogenne sygnały kontroli translacji i kodony inicjujące mogą być zarówno naturalne jak i sztuczne. Wydajność ekspresji może być wzmożona przez użycie odpowiednich sekwencji wzmacniaczy, terminatorów, itd. (Bittner, i współ., 1987, Methods in Enzymol. 153, 516-544).

5.2.1Wirusowe wektory kodujące ApoA-I.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, sekwencja nukleotydowa i kasety DNA opisane powyżej kodujące cząsteczki agonistów ApoA-I lub peptydy o aktywności ApoA-I mogą być wklonowane w wektory wirusowe. Opisane tutaj wektory wirusowe, są w szczególności użyteczne do wprowadzania sekwencji nukleotydowych wynalazku in vivo. Zgodnie z wynalazkiem, wektory wirusowe skonstruowane w celu ekspresji natywnej formy ApoA-I nie są objęte tym wynalazkiem.

W praktycznym aspekcie wynalazku wirusy wykazujące tropizm do komórek w których wywołują chorobę, np. komórek wątroby, komórek jelita cienkiego i grubego, komórek nabłonkowych itd., są tak genetycznie zmienione, że taką samą preferencję wykazują wklonowane sekwencje kodujące peptydy agonistów ApoA-I. W praktycznym aspekcie wynalazku, wirusy wykazujące tropizm do komórek wątroby, jelita cienkiego i grubego są szczególnie korzystnymi wykonaniami wynalazku. Wektory wirusowe, które mogą być użyte zgodnie z wynalazkiem obejmują m.in. hepadnawirusy, adenowirusy, wirusy związane z adenowirusami, herpeswirusy, retrowirusy, parvowirusy, wirus vaccinii itd.

W specyficznym wykonaniu, atenuowane hepadnawirusy, które posiadają naturalną preferencję do komórek wątroby, mogą być przekonstruowane i użyte w celu terapii genowej zgodnej z tym wynalazkiem. Hepadnawirusy mogą być przekonstruowane tak, że dostarczają sekwencji natywnej ApoA-I do komórek i organów w których jest naturalnie eksprymowana. W sekwencji genomu hepadnawirusów są miejsca, które służą do włączania obcych sekwencji DNA. W szczególności sekwencje kodujące antygen powierzchniowy wirusa żółtaczki typu B (HBV), pre-S1 i pre-S2, mogą być użyte jako miejsca wstawienia sekwencji DNA kodujących cząsteczki agonistów i peptydów ApoA-I. Na przykład sekwencje DNA kodujących cząsteczki peptydów ApoA-I mogą być wklonowane poniżej sekwencji TATA-podobnej

PL 193 662 B1 (pozycja 278), która jest promotorem dla pre-S-1 mRNA lub mogą być wklonowane poniżej promotora typu SV40 (pozycja 3166), który jest promotorem dla pre-S-2 mRNA. Wklonowanie obcych sekwencji kodujących poniżej tych regionów, powoduje ekspresje tych sekwencji pod ich kontrolą bez zaburzenia funkcji życiowych wirusa.

Adenowirusy są innymi wirusami, które mogą być wykorzystane do celów terapii genowej. Adenowirusy są szczególnie dobrym środkiem do dostarczenia genów do wątroby i nabłonków oddechowych. Adenowirusy naturalnie zakażają nabłonki oddechowe powodując lekkie stany chorobowe. Innymi celami mogą być: wątroba, centralny układ nerwowy, nabłonki, mięśnie. Adenowirusy mają tą zaletę, że mogą infekować komórki nie dzielące się. Kozarsky i Wilson, 1993, Current Opinion in 30 Genetics and Development 3: 499-503 praca przeglądowa prezentująca terapię genową opartą na adenowirusach. Gerard i współ., 1996, Current Opin. in Lipidology 7:105-111 opisują transfer genów przy pomocy adenowirusów, na przykładzie ApoA-I. Bout i inni, 1994, Human Gene Therapy 5: 3-10 35 pokazuje użycie wektorów opartych na adenowirusach w celu transferu genów do nabłonków oddechowych rezusa. Inne przykłady zastosowania adenowirusów w terapii genowej można znaleźć w Rosenfeld i współ., 1991, Science 252: 431-434, Rosenfeld i inni, 1992, Cell 68: 143-155; i Mastrangeli i inni, 1993, J. Clin. Invest, 91: 225-234. Zaproponowano również użycie do terapii genowej wirusów związanych z adenowirusami (AAV) (Walsh i inni, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300) .

Na przykład, kasety kodujące heteropolimery peptydów ApoA-I (tj. heteropolimery agonistów i superagonistów ApoA-I oddzielone miejscami trawienia przez enzymy lub sekwencjami IRES) mogą być łatwo wklonowane do adenowirusów. Sekwencje genów, które mogą być zmieniane zgodnie z wynalazkiem obejmują region E1, E3 i między prawym ITR i regionem 4. Te regiony mogą być zastąpione przez odpowiednie TRE i rekonstytuowane do cząsteczek wirusowych przez pakowanie rekombinowanego genomu wirusa.

Są trzy regiony adenowirusa, które mogą być wykorzystane do insercji obcego DNA w celu stworzenia rekombinowanych wirusów. Regiony te obejmują: (1) region EIA i główny późny promotor (MLP); (2) MLP razem z trzyczęściowym liderem; (3) zastąpienie regionu E3. Zostało pokazane, że region E3 jest zbędny do pakowania wirusa w kulturach tkankowych. Wektory hybrydowe powstałe przez insercje obcego DNA do EIA i MLP mogą być propagowane przez wzrost w komórkach 293 lub przez kotransfekcję z wirusem helperowym dającym brakującąfunkcję in trans.

Wirus opryszczki (herpes simplex, HSV), który wykazuje naturalne powinowactwo do komórek sytemu nerwowego, może być tak zmodyfikowany, że infekuje komórki wątroby i nabłonkowe oraz zawiera sekwencje kodujące ApoA-I. Na przykład kasety kodujące hetero polimery peptydów ApoA-I mogą być wklonowane poniżej regiony wczesnego promotora takich genów jak ICP4 lub VP16 w celu wzmocnienia ich ekspresji. Aby skonstruować rekombinowane wirusy obce DNA może być wklonowane w niektóre geny strukturalne. Mogą to być na przykład sekwencje kodujące strukturalne glikoproteiny takie jak: gB, gD i gH. Aczkolwiek, produkty tych genów, które zostały zastąpione lub przerwane, powinny być dostarczone in trans, eksprymowane przez wektor i/lub komórki gospodarza, w celu umożliwiania namnażania się rekombinowanych wirusów.

Mogą zostać również użyte ludzkie retrowirusy, np. HTLV-1, HTLV-2 lub zwierzęce retrowirusy wykazujące powinowactwo do ludzkich limfocytów, np. wirus białaczki bydlęcej, wirus białaczki małpiej Maloneya, wirusy Rous'a, wirus białaczki kociej, które mogą być użyte do infekowania komórek wątroby. Sekwencje niezbędne do replikacji retrowirusów są zlokalizowane w ITR, więc obce DNA tj. sekwencje kodujące peptyd ApoA-I powinny znaleźć się poniżej. W komórkach zainfekowanych retrowirusem, transkrypcja wirusowa następuje z integrowanej sekwencji DNA wirusa, tzw. prowirusa, który jest jednostką transkrypcyjną posiadającą własne sekwencje regulatorowe. Ekspresja prowirusa zależy od: (1) miejsca integracji prowirusa; (2) stanu fizjologicznego komórki; (3) wirusowego ITR. Ekspresja prowirusa zależy prawie całkowicie od enzymów kodowanych przez gospodarza.

Wirusowy ITR pochodzi z 3 segmentów wirusowego RNA; R, U5, i U3. Sekwencja R jest krótkim fragmentem (30 do 60 nukleotydów), który występuje 2 razy w wirusowym RNA na 5' i 3' końcu. Sekwencja U5 jest obecna na 5' końcu wirusowego RNA. Sekwencja U3 leży powyżej sekwencji R i manajbardziej zmienną długość (200 do 1200 par zasad) i sekwencje.

Regulacja ekspresji specyficzna dla wirusa zależy przede wszystkim od sekwencji ITR, które zawierają sygnały wzmacniające, sygnały promotorowe i sygnały poliadenylacji RNA. Transkrypcja rozpoczynana jest polewej stroniesekwencji R wlewymLTR. Transkrypcja wirusowa jest katalizowana przez polimerazę typu II, a transkrypt jest poliadenylowany posttranskrypcyjnie blisko prawego końca prawego LTR.

PL 193 662 B1

Region U3 wszystkich LTR posiada sekwencje CCAAT i TATAA. Funkcje wzmacniacza przypisuje się sekwencji powtarzającej się o zmiennej długości (od 72 do 101 nukleotydów) lokującej się w U3, powyżej promotora. Odkryto, że sekwencje U3 LTR wirusa białaczki mysiej Maloney'a (MMTV) są odpowiedzialne za wzmożoną ekspresję wirusa w odpowiedzi na traktowanie komórek zakażonych

MMTV glukokortykoidem.

Mysie parwowirusy (MVM), które wykazują naturalne powinowactwo do ludzkich komórek T mogą być zmodyfikowane tak, że infekują komórki wątroby i nabłonek jelita. W przypadku MVM, najważniejsze czynniki działające in cis, które są niezbędne do pierwszych kroków replikacji wirusowego DNA znaleziono powyżej wczesnego promotora P4 (Cotmore i inni, 1992, Virology 15 190: 365-377). Wczesny promotor jest promotorem zaczynającym wirusową transkrypcję, i jego sekwencja TTATAA lokalizuje się 4 jednostki od lewego końca genomu MVM, około 150 nukleotydu. Znaleziono również funkcje cis dla początku replikacji MVM. Wstawienie obcych sekwencji DNA, takich jak kodujących peptydy ApoA-I, tuż poniżej tego regionu, poddaje je regulacji ekspresji genów wirusowych, bez zaburzania istotnych funkcji życiowych wirusa, tj. replikacji DNA.

Wirus VSV (vesicular stomatitis virus), prototypowy rhabdowirus, jest wirusem który może być użyty w terapii genowej przy użyciu peptydów ApoA-I wynalazku w komórkach ssaczych. VSV jest najprostszym wirusem zwierzęcym posiadającym otoczkę, rośnie do wysokich gęstości i może być uzyskany w dużych ilościach. Obce glikoproteiny mogą być włączone do otoczki G VSV w celu skierowania wirusa do komórek wątroby lub cienkiego i grubego jelita. Gen G wirusa VSV jest wystarczająco duży żeby pomieścić sekwencje nukleotydowe kodujące peptydy ApoA-I wynalazku (Schnell i inni, 1996, 35 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11359-11365).

Wektory oparte o alphawirusy, prototypowe (+)RNA wirusy posiadające otoczkę, mogą również być tak zmodyfikowane, że powodują wydajną ekspresję sekwencji kodujących peptydy ApoA-I wynalazku. Chociaż alphawirusy są normalnie cytotoksyczne dla komórek kręgowców, to istnieją warianty z mutacjami adaptacyjnymi pozwalającymi na replikację wektorów alphawirusowych. Sekwencje nukleotydowe kodujące peptydy ApoA-I mogą być wklonowane do genów strukturalnych wirusów defektywnych w replikacji. Znane są RNA helperowe zawierające sekwencje działające in cis wymagane do replikacji jak również promotory RNA potrzebne do pakowania alfawirusów defektywnych w replikacji (Frolovi i inni, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11371-11377). W ten sposób, prócz VSV i alfawirusów, mogą być zmienione przy użyciu podobnych technik takie wirusy jak wirus grypy, rhababwirusy w celu dostarczenia i ekspresji sekwencji nukleotydowych kodujących peptydy ApoA-I wynalazku.

Wyżej wymienione wektory wirusowe są jedynie przykładowe. Jakikolwiek wektor wirusowy może być genetycznie zmieniony tak, żeby bezpiecznie dostarczył sekwencje nukleotydową kodującą cząsteczki peptydówi agonistów ApoA-I do wybranych komórek wzgodzie z niniejszym wynalazkiem.

5.2.2. Komórki gospodarza eksprymujące ApoA-I.

Przedstawiany wynalazek obejmuje ekspresję ApoA-I i peptydów wykazujących aktywność ApoA-I jak opisano to wyżej, w komórkach zwierzęcych i liniach komórkowych, w szczególności komórkach ludzkich i liniach komórkowych, które mogą być potem podane in vivo. Komórki, które mogą być użyte zgodnie z wynalazkiem w celu ekspresji ApoA-I i peptydów wykazujących aktywność ApoA-I obejmują m.in. fibroblasty, komórki Caco-2, epitelialne, endotelialne, mięśniowe, hepatocyty, komórki izolowane z nabłonka jelita cienkiego i grubego itd.W wybranym przykładzie wynalazku, jako komórki eksprymujące ApoA-I i peptydy wykazujące aktywność ApoA-I użyte są komórki wątroby i komórki wyizolowane z jelitacienkiego.

Komórki takie mają również zastosowanie jako system modelowy do badania roli ApoA-I w metabolizmie lipidów.

W wybranym wykonaniu wynalazku komórki są pobierane od dawcy lub biorcy, który ma następnie przyjąć transdukowane komórki. Przykładami komórek, które mogą być genetycznie zmodyfikowane zgodnie z wynalazkiem są m.in. hepatocyty, komórki pęcherzyka żółciowego, jelita cienkiego, komórki nabłonkowe i endotelium w tym izolowane z żył. Wyizolowane komórki mogą być transfekowane lub transdukowane DNA i wektorami wirusowymi opisanymi tutaj. Transdukowane komórki mogą być następnie przeszczepione i transplantowane do biorcy.

W innym wykonaniu wynalazku, zarówno przejściowo jak i permanentnie rekombinowane linie komórkowe mogą zawierać sekwencje w których sekwencja kodująca natywną apolipoproteinę A lub inną apolipoproteinę jest zamieniona na sekwencje zmodyfikowanej preproapolipoproteiny A-l, zmodyfikowanej proapolipoproteiny A-I, zmodyfikowanej ApoA-I lub agonisty ApoA-I.

PL 193 662 B1

Szczep komórki gospodarza może być wybrany tak, żeby modulował ekspresję wprowadzonej sekwencji lub modyfikował i procesował produkt genu w specyficzny, pożądany sposób. Takie modyfikacje (np. glikozylacja) i procesowanie (np. trawienie) produktu białkowego mogą być istotne dla funkcji białka. Rożne komórki mają charakterystyczne i specyficzne mechanizmy posttranslacyjnego procesowania i modyfikacji białek. Odpowiednie linie komórkowe powinny zostać wybrane, ażeby zapewnić prawidłową modyfikację eksprymowanych białek. Wśród linii komórkowych, które zapewniają prawidłowe procesowanie pierwotnego transkryptu, glikozylację, fosforylację są m.in. linie komórkowe CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38.

W celu długoterminowej ekspresji natywnej ApoA-I lub peptydów posiadających aktywność agonisty ApoA-I mogą zostać skonstruowane linie stabilnie eksprymujące te peptydy. W tym celu komórki powinny być transfekowane przy użyciu DNA zawierającego elementy kontrolujące ekspresje (np. promotory, wzmacniacze, terminatory transkrypcji, miejsca poliadenylacji, itd.) i marker selekcyjny, zamiast transformować je przy użyciu wektorów zawierających wirusowe miejsca startu replikacji. Po wprowadzeniu obcego DNA, komórki powinny rosnąć na pełnym podłożu przez 1-2 dni, a następnie powinny być przeniesione na podłoże selekcyjne. Marker selekcyjny w rekombinowanym plazmidzie nadaje oporność na selekcję i komórki które integrowały go do swoich chromosomów tworzą kolonie które mogą być wyprowadzone do linii komórkowych. Ta metoda może być z powodzeniem stosowana do konstrukcji linii komórkowych, w tym do tworzenia linii eksprymujących ApoA-I i jej peptydy. Takie linie będą szczególnie przydatne w poszukiwaniuzwiązków, które wpływająna endogenną aktywność ApoA-I i peptydów ApoA-I.

Można używać wielu systemów selekcyjnych w tym opartych o kinazę tymidylanową wirusa opryszczki (Wigier i współ., 1977, Cell 11: 223), fosforybozylotransferazę hypoksantynowo-guaninową (Szybalska i Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026), fosforybozylotransferazę adeninową (Lowy i współ.,1980, Cell 22: 817), tj. komórek tk^-, hgprt^- i aprt^-. Jako podstawę selekcji może służyć również oporność na antymetabolity nadawaną przez następujące geny: dhfr- nadaje oporność na metotreksan (Wigier i współ., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare i współ., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt warunkuje oporność na kwas mykofenolowy (Mulligan i Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo-nadajeoporność na aminoglikozyd G418 (Colberre-Garapin i współ., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1) i hygro-nadaje oporność nahigromycynę (Santerrei współ., 1984, Gene30: 147).

Na przykład można sklonować do adenowirusów kasety kodujące heteropolimery peptydówApoA-I jakto opisano wyżej.

5.2.3ZwierzętatransgeniczneeksprymująceApoA-I.

Wynalazek obejmuje ekspresję sekwencji nukleotydowych kodujących ApoA-I wynalazku wzwierzętach transgenicznych, jako modelu do badania roli ApoA-I w metabolizmie lipidów, poza zastosowaniem w terapii genowej. W celu stworzenia zwierząt transgenicznych pod względem ApoA-I, można użyć wielu gatunków zwierząt w tym m.in. myszy, szczurów, królików, świnek morskich, kóz, i naczelnych poza człowiekiem, np. pawianów, małp, szympansów.

W celu stworzenia transgenicznych pod względem ApoA-I linii zarodkowych mogą być użyte różne techniki. Są to m.in. mikroiniekcja jądrowa (Hoppe, P.C. i Wagner, T.E., 1989, U.S. Pat. No. 25 4,873,191); transfer genów do komórek zarodkowych ptzy użyciu retrowirusów (Van der Putten i współ. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148-6152); elektroporacja embrionów (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3: 1803-1814) i przenoszenie genów przy użyciu plemników (Lavitrano i współ. 1989, Cell 57: 717-723). Przegląd technik daje Gordon, 1989, w Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229, tu załączone jako referencja w całości.

Niniejszy wynalazek przewiduje stworzenie zwierząt, które niosą transgen we wszystkich swoich komórkach, jak również takich, które niosą transgen tylko w ich części tzw. zwierząt mozaikowych. Transgen może być wprowadzony jako pojedynczy lub w postaci konkatamerów np. „głową do głowy” lub „głową do ogona”. Transgen może być również wprowadzony selektywnie i aktywowany tylko w określonym typie komórek (Lasko, M. i współ., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236). Sekwencje regulatorowe potrzebne do aktywacji zależnej od typu komórek będą zależały od używanego typu komórek, co jest znane specjalistom. Jeśli będzie potrzebna integracja transgenicznej formy ApoA-I w locus chromosomalny natywnej ApoA-I, należy użyć techniki „gene targeting” (dosł. celowniawgen).

Pokrótce, aby zrealizować powyższą technikę, konstruowane są wektory zawierające sekwencję homologiczną do endogennego genu ApoA-I i w procesie homologicznej rekombinacji z sekwencjami

PL 193 662 B1 chromosomalnymi następuje integracja i dysrupcja funkcji sekwencji nukleotydowej endogennego genu ApoA-I. Transgen może być również wybiórczo wprowadzony do określonych typów komórek i przez to inaktywujący endogenny gen ApoA-I tylko w tych komórkach. Sekwencje regulatorowe wymagane dla tego typu komórkowo specyficznej inaktywacji zależą od typu komórek i są znane specjalistom.

5.3. Terapia genowa dostarczająca peptydów ApoA-I.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem może być podejmowana terapia genowa polegająca na dostarczeniu sekwencji nukleotydowych kodujących natywną ApoA-I i peptydy ApoA-I.

Terapia genowa z użyciem tego wynalazku może być stosowana u zwierząt szczególnie ssaków, w tym człowieka, w celu zwiększenia stężenia HDL w osoczu, aktywacji LCAT wspomagania uwalniania cholesterolu i RCT. Takie warunki obejmują między innymi hiperlipidemię w tym szczególnie hipercholesterolemię, choroby tętnic wieńcowych takie jak: miażdżyca (w tym zapobieganie i leczenie rozwiniętej choroby); restenoza (np. zapobieganie płytkom miażdżycowym, które rozwijają się, jako wynik zabiegów medycznych takich, jak angioplastyka balonikowa) i inne choroby, jak endotoksemia, która często prowadzi do wstrząsu septycznego (np. Gouni i współ., 1993, J. Lipid Research 94: 139-146; Levine WO96/04914).

Terapia genowa z użyciem wynalazku może być używana samodzielnie lub w kombinacji z innymi lekami i może obejmować równoczesne lub następujące po sobie podawanie leków.

5.3.1 Terapia typu „Gene replacement”

W odniesieniu do zwiększonego poziomu ekspresji natywnego peptydu ApoA-I i jego aktywności, w celu np. leczenia chorób typu dyslipidemii lub hiperlipidemii mogą być użyte sekwencje kwasów nukleinowych opisane powyżej. Używając wektorów takich między innymi, jak adenowirusy, retrowirusy i innych cząsteczek, które wprowadzają DNA do komórek może zostać wprowadzona do komórek pacjenta jedna lub więcej kopii natywnego peptydu ApoA-I lub fragment peptydu ApoA-I, który powoduje produkcję ApoA-I, wykazującą normalną funkcję. Ponieważ białko ApoA-I ulega ekspresji w wątrobie terapia powinna być zdolna do dostarczenia sekwencji ApoA-I do tych komórek w pacjencie. W innym wykonaniu mogą zostać wykorzystane techniki, które umożliwiają bezpośrednie dostarczenie sekwencji ApoA-I do miejsca, w którym znajdują się komórki mające prowadzić ekspresje ApoA-I. Dodatkowymi metodami, które mogą być użyte do zwiększenia ogólnego poziomu ekspresji peptydu ApoA-I może być wprowadzenie odpowiednich komórek, w których ApoA-I ulega ekspresji najlepiej autologicznych do miejsca i w ilości, która będzie wystarczającą do zniesienia symptomów hiperlipidemii. Takimi komórkami, które mogą być podane w celu zwiększenia ogólnej ekspresji peptydu ApoA-Iu pacjenta są normalne komórki najlepiej hepatocyty, w których peptyd ApoA-I ulega ekspresji. W innym przypadku komórki, najlepiej pochodzenia autologicznego, mogą zostać tak skonstruowane, że eksprymują sekwencje peptydów ApoA-I i wprowadzone w odpowiednie miejsca zniosą objawy dyslipidemii. Ekspresja sekwencji peptydów ApoA-I może być kontrolowana przez odpowiednie sekwencje regulatorowe adekwatne do ekspresji w odpowiednich typach komórek. Takie sekwencje regulatorowe są dobrze znane specjalistom. Techniki terapii genowej oparte na komórkach są również znane specjalistom (np. Anderson, Patent U.S.A. nr. 5,399,349, włączone tu jako odniesienie w całości).

W przypadku, gdy komórki, które majązostać podane nie są pochodzenia autologicznego mogą być użyte techniki, które zabezpieczają przed rozwinięciem się reakcji immunologicznej gospodarza np. komórki mogą zostać podane w zamkniętych kapsułkach, które umożliwiają wymianę ze środowiskiem wewnątrzkomórkowych a zabezpieczają wprowadzone komórki przed rozpoznaniem przez system immunologiczny gospodarza.

5.3.2. Wprowadzanie kwasów nukleinowych in vivo

Kwasy nukleinowe mogą być wprowadzone do pacjenta albo bezpośrednio gdy pacjent otrzymuje bezpośrednio kwas nukleinowy lub wektor niosący kwas nukleinowy, albo pośrednio, gdy komórki są najpierw transformowane kwasem nukleinowym in vitro a następnie transplantowane do pacjenta. Te dwie metody są znane, jako terapia genowa in vivo i ex vivo. Metoda in vivo może być zrealizowana na wiele sposobów. Przez konstrukcje odpowiedniego wektora i podanie go tak, że staniesię wewnątrzkomórkowy np. przez infekcje z użyciem defektywnych lub osłabionych wektorów retrowirusowych lub wirusowych (patrz Patent U.S.A. nr 4, 980,286) przez bezpośrednie wstrzyknięcie „nagiego DNA” albo przez użycie „strzelby genowej” albo przez pokrycie lipidami, receptorami zewnątrzkomórkowymi, czynnikami transfekującymi, zamknięcie w liposomach, mikrokapsułkach lub podanie razem z peptydem, który wejdzie do komórki lub jądra np. ligandem endocytozy przy pomocy receptorów (Wu i Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Kwas nukleinowy może być skierowany in vivo do specyficznych komórek przez specyficzny receptor (np. PCT Publications WO 92/06180, April 16,

PL 193 662 B1

1992 (Wu i współ.); WO 92/22635, Grudzień 23, 1992 (Wilson i współ); WO 93/14188 July 22, 1993 (Clarke i współ.); WO 93/20221 14 październik, 1993 (Young)). W innym wykonaniu może zostać stworzony kompleks kwas nukleinowy: ligand, w którym ligand jest wirusowym peptydem fuzjogennym, który zaburza funkcje endosomów i zapobiega lizosomalnej degradacji kwasów nukleinowych. Innym sposobem jest wykorzystanie rekombinacji homolgicznej w celu włączenia DNA do genomu gospodarza (Koller i Smithes, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 8932-8935; Zijstra i współ., 1989, Nature 342: 435-438).

W jeszcze innym wykonaniu kwas nukleinowy może być podawany in vivo przez urządzenie dozujące. Kwas nukleinowy może być również podawany in vivo przez urządzenie, które zawiera komórki, w których peptydy i agoniśći wynalazku ulegają ekspresji, zabezpieczając tym samym przed odrzuceniem przez biorcę lub gospodarza. Zgodne z tym urządzeniem białka i peptydy mogą przenikać przez przepuszczalne membrany mające zakres przepuszczania ok. 3500 do 50000 tys. daltonów.

Jedną ze strategii kierowania DNA i wektorów wirusowych do hepatocytów jest obecność na powierzchni tych komórek receptora dla asjalglikoproptein (ASPG). Receptor ten ulega specyficznej ekspresji na powierzchni hepatocytów. Pęcherzyki pokryte asjaloglikopeptydami były używane in vivo do specyficznego dostarczania wielu bioaktywnych czynników do wątroby (Aite i współ., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci USA 27: 5923-5927; Hildebrandt i współ, 1980, BBA631: 499-502).

Innym sposobem dostarczania sekwencji nukleotydowych do hepatocytów jest genetyczna modyfikacja wektorów wirusowych tj. adenowirusów i retrowirusów tak, żeby wyrażały na swojej powierzchni ligandy dla receptorów ASPG. Przez specyficzne oddziaływanie otoczki wirusa z receptorami powierzchni komórki następuje endocytoza i internalizacja wirusa. Wektory wirusowe, które mogą być użyte zgodnie z tym wynalazkiem są dyskutowane powyżej w rozdziale 5.2.2.

5.3.3. Dostarczanie kwasów nukleinowych ex vivo

Innym podejściem do terapii genowej jest wprowadzanie genu do komórek w kulturze tkankowej takimi metodami, jak: elektroporacja, lipofekcja, transfekcja przy pomocy fosforanu wapnia lub zakażanie wirusami. Zwykle wprowadzany jest do komórek również marker selekcyjny. Komórki są następnie hodowane w warunkach selekcyjnych w celu wyodrębnienia takich komórek, które pobrały i wyraziły wprowadzony gen. Komórki są następnie wprowadzane do pacjenta. W tym przykładzie kwas nukleinowy jest wprowadzany do komórek, które stają się rekombinowane przed wprowadzeniem ich in vivo. Taki transfer może być przeprowadzany przez powszechnie znane metody w tym między innymi transfekcję, elektroporację, mikroiniekcję, zakażanie wektorami wirusowymi zawierającymi daną sekwencję, fuzję komórkową, wprowadzanie genów na chromosomach, fuzję sferoplastów itd. Jest znanych wiele metod wprowadzania obcych genów do komórki i które mogą być użyte zgodnie z wynalazkiem pod warunkiem, że w komórkach biorcy nie zostaną zaburzone podstawowe funkcje rozwojowe i fizjologiczne. Używane techniki powinny doprowadzić do stabilnego transferu genu, który jest wyrażany i dziedziczony przez komórki potomne. Powstające zrekombinowane komórki mogą być wprowadzane do pacjenta przez znane metody specjalistyczne. W 4 wybranym przykładzie komórki epitelialne są wstrzykiwane np. podskórnie. W innym przykładzie rekombinowane komórki skóry (np. keranocyty) mogą być przeszczepiane do skóry. Zrekombinowane komórki krwi (np. hematopoetyczne komórki pnia) są dostarczane do żył. Przewidywana ilość komórek zależy od pożądanego efektu, stanu pacjenta itd. Powinno to być ustalone przez specjalistów. W wykonaniu, w którym zrekombinowane komórki są używane do terapii genowej, sekwencje nukleotydowe, które kodują gen są wprowadzane do komórek w ten sposób, że gen jest wyrażany przez te komórki lub ich potomków, tak zrekombinowane komórki są następnie w celu leczniczym podawane in vivo. W szczególnym przypadku są używane komórki pnia lub zarodkowe. Zgodnie z tym wykonaniem wynalazku mogą być używane jakiekolwiek komórki zarodkowe lub komórki pnia, które da się wyizolować i hodować in vitro. Dla celów terapii genowej ex vivo mogą być użyte podane niżej sposoby izolacji hepatocytów, które zostaną genetycznie zmodyfikowane przez użycie wynalazku oraz ich pasażowanie i transplantacja do biorcy. W tym wykonaniu hepatocyty są uzyskiwane od dawcy lub biorcy - osoby, która przyjmie następnie zmodyfikowane hepatocyty. Ta procedura wymaga usunięcia części wątroby, z której usuwane są hepatocyty przez perfuzję in situ roztworem kalogenazy. Jeśli hepatocyty mają być wyizolowane z nienaruszonej wątroby do żyły, która albo opuszcza albo wchodzi do wątroby, jest wprowadzany cewnik i przez cewnikowane naczynia przepuszczany jest roztwór kalogenazy co powoduje uwolnienie hepatocytow. Wyizolowane hepatocyty są wysiewane i przetrzymywane w warunkach odpowiednich do transfekcji.

PL 193 662 B1

Znanych jest kilka metod izolacji wzbogaconych hepatocytów i utrzymywania tych komórek w kulturze przez dłuższe okresy czasu. Koch, K.S. i H.L. Leffert, Annals N.Y. Academy of Sciencies, 349: 111-127 (1980); McGovan, J.A. i współ. Journal of Cellular Physiology, 108: 353-363 (1981); Bissell, D.M. i P.S. Guzelian, Annals of the New York Academy of Sciencies, 349: 85-98 (1981); Enat, R. i współ., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81: 1411-1415 (1984). Wyżej wymienione w odnośnikach metody mogą być użyte do izolacji i utrzymania hepatocytów w celu ich transdukcji wynalazkiem. Hepatocyty mogą być również uzyskane przez modyfikacje procedury opracowanej Barry i Friend opisanej poniżej i w przykładzie 1, z użyciem mieszaniny perfuzyjnej opisanej przez Lefferta, którego wykłady są włączone tu, jako referencje. Materiał genetyczny włączony do hepatocytów może ewentualnie zawierać marker selekcyjny, który umożliwia identyfikację i selekcję, komórek, które wyrażają podany materiał genetyczny. DNA lub RNA wprowadzone do hodowanych hepatocytów zawiera materiał genetyczny, który jest obiektem naszego zainteresowania i ewentualnie materiał genetyczny kodujący marker selekcyjny. Taki materiał genetyczny nazywany jest inkorporowanym. Hepatocyty zawierające inkorporowany materiał genetyczny nazywane są hepatocytami transdukowanymi. DNA lub RNA, który nas interesuje ulega wnich ekspresji.

EgzogennyDNAkodującypolipeptydlubbiałkonasinteresującei ewentualniemarkerselekcyjnyjestwprowadzane in vitro do hepatocytów, jakopisanoniżeji w przykładach 1.3. Hepatocyty wyizolowane, jak zostało opisane powyżej są wysiewane i hodowanenahormonalniezdefiniowanej pożywce, tak jak zostało to opisane przez Enat i współ., któregowykłady są tuwcałości włączone jako referencja, (Enat, R. i współ., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81: 1411-1415 (1984). W razie potrzeby pożywka jest zmieniana. Komórki są następnie infekowane retrowirusem , który zawiera DNA nas interesuje ewentualnie DNA kodującemarkerselekcyjny. Hepatocyty są zarażane rekombinowanym adenowirusem lub retrowirusem przez wystawienie ich na działanie wirusa, który ma zrekombinowany genom. Możliwa jest optymalizacja warunków zakażania hepatocytów przezzwiększenie mianawirusaamfotropowego.

Zawiesiny wirusów, stosowanych do przenoszenia materiału genetycznego do hepatocytów, są zbierane, jak to opisano wyżej, uzupełnione przy pomocy Polybren (Aldrich) i dodawane do hodowli hepatocytów. Jeśli miano wirusa jest wysokie (np. około 10⁶ cfu na ml), to wszystkie hepatocyty powinny być zakażone, tak więc selekcja nie jest potrzebna. Jeśli miano wirusa jest niskie,to wymagane jest użycie wektora retrowirusowego posiadającego marker selekcyjny, taki jak neo lub his. Jeśli używany jest marker selekcyjny, to po ekspozycji na wirus, komórki są hodowane do zmętnienia hodowli, a następnie przeszczepiane na pożywkę selekcyjną (np. zawierającą G418 jeśli markerem selekcyjnym jest neo lub zawierającą histydynol a bez histydyny jeśli markerem jest his).

Hepatocyty eksprymujące włączony materiał genetyczny hoduje się do zmętniania hodowli w naczyniach do kultur tkankowych, następniepobiera z naczyń i wprowadza do organizmu. Można to wykonać poprzez zabieg chirurgiczny. W tym przypadku tkanka, złożona z transdukowanych hepatocytów zdolnych do ekspresji wprowadzonej sekwencji jest wszczepiana lub przeszczepiana do organizmu. Na przykład, może być umieszczona w jamie brzusznej w kontakcie z wątrobą, wszczepiona w wątrobę lub blisko niej. Inaczej, komórki transdukowanych hepatocytów mogą być przyczepione do nośnika w postaci mikrokulek, które są wprowadzone (np. wstrzyknięte do otrzewnej pacjenta). To podejście było z sukcesem wykorzystane do transplantacji normalnych hepatocytów do szczepu szczurów (ang. Nagase analbuminemic rats, który wykazuje brak syntezy albuminy, gdzie pokazano średni poziom albuminy w osoczu. Możliwe jest również bezpośrednie wstrzyknięcie albuminy do wątroby. Wszczepione, transdukowane hepatocyty, są ciągłym źródłem hormonów, enzymów lub leków, kodowanych przez wprowadzony materiał genetyczny. Ilość hormonów, enzymów lub leków podawanych w ten sposób może być regulowana w razie potrzeby (np. przez sygnały zewnętrzne lub czynniki, które kontrolują lub wpływają na ich produkcję, przez kontrolowanie wielkości przeszczepu ilości hepatocytów wprowadzonych do organizmu, lub przez usuwania przeszczepu.

5.4Preparatyleczniczeisposobyichstosowania.

Niniejszy wynalazek obejmuje przepisy farmaceutyczne, dotyczące dostarczania wektorów wirusowych kodujących ApoA-I lub peptydy ApoA-I w celu transformacji komórek in vivo lub dostarczania komórek-gospodarzy transformowanych DNA lub wektorami wirusowymi w celu terapii genowej in vivo lub ex vivo.

Agoniści ApoA-I wynalazku mogą być używani do leczenia chorób wśród zwierząt, szczególnie ssaków w tym człowieka, dla których korzystne jest podwyższenie stężenia HDL w surowicy, aktywacja LCAT, wzmaganie wypływu cholesterolu i RCT. Takie warunki obejmują, ale nie są ograniczone do

PL 193 662 B1 innych hiperlipidemii w tym szczególnie hipercholesterolemii, chorób naczyń wieńcowych takich, jak miażdżyca (w tym zapobieganie i leczenie rozwiniętej choroby); restenoza (np. zapobieganie płytkom miażdżycowym, które rozwijają się, jako wynik zabiegów medycznych takich, jak angioplastyka balonikowa) i innych chorób, jak wstrząs spowodowany endotoksyną, który często prowadzi do zwiększenia stężenia trójglicerydów(Guoni i współ., 193, J. Lipid Research 94: 139-146; Levine, WO/04914).

Na przykład, w leczenia hipercholesterolemii lub miażdżycy preparaty zawierające komórki ssacze produkujące agonistów ApoA-I, mogą być podawane wspólnie ze stosowanymi obecnie lekami obniżającymi poziom cholesterolu, np. żywic wiążących kwasy żółciowe, niacyną i/lub statyną. Takie wiązane terapie mogą powodować szczególnie korzystne efekty ponieważ, każdy z leków działa w innym miejscu szlaku syntezy cholesterolu lub jego transportu, tj. żywice wiążące kwasy żółciowe, wpływają na odzyskiwanie cholesterolu, populacje LDL i chylomikronów; niacyna wpływa na populacje VLDL i LDL; statyny hamują syntezę cholesterolu, obniżając populacje LDL (i prawdopodobnie podwyższają ekspresje receptorów LDL; podczas gdy agoniści ApoA-I wpływają na RCT, podwyższają HDL, podwyższają aktywność LCAT i wzmagają wypływ cholesterolu).

W innym wykonaniu wynalazku, komórki ssacze eksprymujące agonistów ApoA-I mogą być użyte wspólnie z fibratem w celu leczenia hiperlipidemii, hipercholesterolemii i/lub chorób naczyń wieńcowych takich jak miażdżyca. Takie postępowanie może okazać się bardzo korzystne ponieważ fibrat, nie wykazuje sprawdzonego wyraźnego efektu na choroby naczyń wieńcowych.

W jeszcze innym wykonaniu, agoniści ApoA-I wynalazku, mogą być stosowani razem ze środkami antybakteryjnymi, lub przeciwzapalnymi używanymi obecnie w leczeniu wstrząsu septycznego spowodowanego endotoksyną.

Agoniści ApoA-I kodowani przez sekwencje nukleotydowe wynalazku, mogą być używani w postaci peptydów lub kompleksów lipidowo-peptydowych podawanych na różne sposoby, tak aby dostały się do krwioobiegu. Przykładowe preparaty i kuracje są opisane niżej.

Komórki-gospodarze wyrażające peptydy agonistów ApoA-I wynalazku, kompleksy lipidy-DNA, bądź „nagie” DNA zawierające plazmidowe DNA, które koduje peptydy agonistów ApoA-I wynalazku, mogą być podawane w odpowiedni sposób, który zapewni dostępność w krwiobiegu. Może to być osiągnięte z użyciem starych metod takich jak wstrzykiwanie: dożylne (IV), domięśniowe (IM), doskórne, podskórne (SC), dootrzewnowe (IP). Można użyć również innych sposobów. Na przykład, można uzyskać absorpcje przez układ trawienny, podając doustnie pod warunkiem, że preparaty stosowane są w odpowiedniej formie (np. tabletki powlekane), aby zminimalizować lub uniknąć degradacji aktywnego składnika w drastycznych warunkach panujących w jamie ustnej, żołądku lub jelicie cienkim. Co więcej można podać środek wynalazku w postaci np. liposomów o powinowactwie do wątroby, które zostaną selektywnie pobrane przez wątrobę. Alternatywnie, można stosować podanie dopochwowe lub doodbytowe w celu uniknięcia degradacji w układzie pokarmowym. Jeszcze inaczej preparaty wynalazku mogą być podawane przez skórę lub przez inhalacje. Wybrany sposób podawania zależy od stanu, wieku i dolegliwości pacjenta.

Dawka agonisty ApoA-I lub jego kompleksów lipidowych zmienia się w zależności od drogi podania i powinna być ustalona w celu osiągnięcia stężenia w osoczu od 100 mg do 2 g/l. Wyniki uzyskane na modelach zwierzęcych, opisane tutaj, pokazują, że agoniści ApoA-I wynalazku są związani z HDL i mają u człowieka okres półtrwania około 5 dni. Tak więc w realizacji, agoniści ApoA-I mogą być podawani przez iniekcję w dawce 0,5 do 100 mg/kg jeden raz w tygodniu. Można też utrzymywać pożądany poziom przez ciągłąinfuzję w ilości 0,5-100 mg/kg lub infuzję przerywaną w ilości 0,5-100 mg/kg.

Toksyczność i skuteczność terapeutyczna różnych agonistów ApoA-I może być ustalona przez zastosowanie standardowych procedur farmaceutycznych z użyciem kultur tkankowych lub zwierząt eksperymentalnych, przez pomiar LD50 (dawka śmiertelna dla 50% populacji) i ED50 (dawka terapeutyczna dla 50% populacji). Stosunek między dawką toksyczną a leczniczą jest indeksem terapeutycznym i jest wyrażony jako LD50/ED50. Korzystni są agoniści ApoA-I wykazujący duże indeksy terapeutyczne.

5.4.1 Preparatylecznicze

Preparaty lecznicze obejmują ssacze komórki eksprymujące agonistów peptydowych ApoA-I, DNA kodujący peptydy ApoA-I albo w formie „nagiej” albo w kompleksach z lipidami, liposomami lub nielipidowymi polimerami kationowymi jako aktywny czynnik wraz z odpowiednim nośnikiem do stosowania i podawania in vivo.

PL 193 662 B1

Preparaty wstrzykiwane obejmują, sterylne zawiesiny, roztwory, lub emulsje aktywnego czynnika w wodzie lub nośniku oleistym. Skład może obejmować również takie czynniki jak czynnikistabilizujące,rozpuszczające, zawieszające. Preparaty do wstrzykiwania mogą być w formie dawek jednorazowychnp.ampułek lubwielorazowychimogązawieraćkonserwanty.

Inaczej, preparaty do iniekcji mogą być w formie proszku do zawieszenia przed użyciem w odpowiednim nośniku m.in. wodzie niepirogennej, buforze, roztworze glukozy. Peptydy lub kompleksy lipidowo-petydowe agonistów ApoA-Imogą by liofilizowane. Preparaty takie mogą być przechowywane w dawkach jednorazowych i zawieszone przed podaniem.

W celu przedłużonego dawkowania aktywny składnik może być użyty w formie implantu umieszczanego podskórnie, doskórnie lub domięśniowo. Może być użyta wraz z odpowiednim polimerem, substancją hydrofobową (np. emulsją w tolerowanym oleju), złożem jonowymiennym lub jako słabo rozpuszczalne pochodne (np. słabo rozpuszczalne sole agonistów ApoA-I).

Alternatywnie, można użyć plaster lub przyklejany krążek, który będzie wolno wydzielał aktywny czynnik absorbowany następnie przezskórę. Można również użyć substancji wzmagających absorpcje przez skórę. Szczególnie korzystne wydaje się użycie agonistów ApoA-I wynalazku w kompleksach z lipidami w plastrach z nitrogliceryną przez pacjentów z chorobą niedokrwienną serca i hipercholesterolemią.

Dla celów podawania doustnego, preparat, leczniczy może przybrać formę tabletek lub kapsułek przygotowanych w konwencjonalny sposób z tolerowanymi farmaceutycznie dodatkami: wiążącymi (np. skrobia kukurydziana, poliwinylopirolidon, hydroksypropylem metyloceluloza); wypełniaczami (np. laktozą, celulozą mikrokrystaliczną, fosforanem wapnia); substancjami powlekającymi (stearynian magnezu, talk, krzemiany); substancjami nawilżającymi (siarczan dodecylu). Tabletki mogą być pokrywane znanymi fachowcom metodami. Preparaty płynne do zażywania doustnego mogą przybierać formę np. roztworów, syropów, zawiesin lub jako proszek do rozpuszczenia w nośniku przed zażyciem. Płynne preparaty mogą być przygotowane w sposób konwencjonalny przez użycie farmaceutycznie tolerowanych dodatków takich jak; środki zawieszające (np. syrop sorbitolowy, pochodne celulozy, nasycone jadalne kwasy tłuszczowe); środki emulgujące (np. lecytyna); nośniki niewodne (np. olej migdałowy, alkohol etylowy, rafinowane oleje roślinne) i konserwanty (np. metylo- lub propylo-p-hydroksybenzoesan, sorbinian). Preparat może zawierać również w miarę potrzeby sole buforu, środki zapachowe, barwiące i smakowe. Preparaty do zażywania doustnego mogą być przygotowane tak, że zapewniają kontrolowane uwalnianie czynnika aktywnego.

Jeśli chodzi o podawanie podjęzykowe, preparat może przyjąć formę tabletek lub pastylek przygotowanych w sposób konwencjonalny. Dla celów podawania dopochwowego lub doodbytowego, czynnik aktywny może wchodzić w skład roztworów(do lewatyw), czopków lub maści.

W celu podawania w formie inhalacji, składnik aktywny możebyć zawieszony w odpowiednim nośniku (np. dichlorodifluorometan, trichlorodifluorometan, dichlorotetrafluorometan) dostarczony w postaci aerozolu w pojemnikach pod ciśnieniem lub jako nebulizatory. W przypadku aerozoli pod ciśnieniemdoza może byćustalona przez odpowiedni zawór mierzący. Kapsułki (np. z żelatyny) używane w inhalatorach mogą być tak wykonane, że zawierają składnik aktywny i nośnik (laktozę lub skrobie)w formie stałej.

Preparat może być dostępny w formie opakowania lub dozownika, który może zawierać jedną lub więcej porcji zawierających aktywny składnik. Opakowania mogą być np. listków, opakowanie lub dozownik zaopatrzony może być w instrukcje.

5.5 Inne zastosowania.

Peptydy ApoA-I i jej agoniści kodowane przez sekwencje według wynalazku, mogą być użyte do celów mierzenia HDL w osoczu in vitro np. w diagnostyce. Ponieważ agoniści ApoA-I łączą się z osoczową HDL, mogą służyć jako znaczniki populacji HDL.

Co więcej agoniści, mogą służyć jako znaczniki subpopulacji HDL aktywnej w RCT. Agoniści mogą być dodani i zmieszani z próbką osocza pacjenta, po odpowiednim czasie inkubacji, populacja HDL morze być mierzona przez detekcję włączonego agonisty ApoA-I. Może to być osiągnięte przez użycie znakowanego agonisty (np. znakowanie radioaktywne, fluorescencyjne, enzymatyczne, z zastosowaniem barwników itp.) lub testy immunologiczne z użyciem przeciwciał lub ich fragmentów specyficznych do agonisty.

Wyznakowany agonista może być użyty w badaniach wizualizacyjnych (np. tomografia komputerowa (CAT), rezonans magnetyczny (MRI)) w celu wizualizacji krwiobiegu, monitorowania RCT, akumulacji HDLwtkance tłuszczowej lub złogach miażdżycowych itd. (gdzieHDLpowinnabyćaktywnawuwalnianiucholesterolu).

PL 193 662 B1

6. Przykła d:test aktywacji LCAT.

Przykłady nukleotydów, które mogą być kodowane przez sekwencje nukleotydowe wynalazku są podane wtabeli VIII, która również obejmuje peptydy zsyntetyzowane chemicznie. Wynalazek obejuje tylko peptydy złożone z aminokwasów kodowanych genetycznie i mającychzdolnośćdoaktywacji LCAT mniejszą niż 38% w porównaniu z natywną ApoA-I. Wszystkie wymienione peptydy zostały przeanalizowane in vitro pod względem ich zdolności do aktywacji LCAT. W teście aktywacji LCAT pęcherzyki (SUV) zbudowane z fosfatydylocholiny z jajka lub 1-palmitylo-2-oleilofosfatydylocholiny i znakowanego izotopowo cholesterolu są preinkubowane z równą ilością peptydu lub ApoA-I (izolowaną z osocza ludzkiego). Reakcja jest rozpoczynana przez dodanie LCAT (izolowanej z osocza ludzkiego). Natywną ApoA-I, która została użyta jako kontrola pozytywna stanowi 100% zdolności aktywacyjnej. „Aktywność specyficzna” (tj. jednostki aktywności (aktywacji LCAT)/jednostki masy) peptydów mogą być wyliczone jako stężenie, które powoduje maksymalną aktywację LCAT. Na przykład w celu zmierzenia „aktywności specyficznej” stężenia przy którym osiągnięta jest maksymalna aktywacja LCAT (tj. procent przemiany cholesterolu w ester cholesterolu) wokreślonym czasie (np. 1 h)- pomiary można przeprowadzić na serii stężeń peptydu (np. kolejnych rozcieńczeniach). Kiedy określa się to procent przemiany cholesterolu w czasie np. 1 h, wobec stężenia użytego peptydu, „aktywność specyficzna”może być zidentyfikowana jako stężenie w którym wykres osiąga na wykreślanej krzywej plateau.

6.1Przygotowanie pęcherzyków substratu.

W teście aktywacji LCAT używane są pęcherzyki (SUV) zbudowane z fosfatydylocholiny z jajka lub 1-palmitylo-2-oleilofosfatydylocholiny i cholesterolu w stosunku molowym 20:1. W celu przygotowania pęcherzyków wystarczających na 40 testów należy rozpuścić 7,7 mg EPC (lub 7,6 mg POPC;

(moli), 78 μg (0,2 μmoli) 4- C-cholesterolu, 116 μg cholesterolu (0,3 μmoli) w 5 ml ksylenu, a następnie liofilizować. Do liofilizatu należy dodać 4 ml buforu reakcyjnego i sonikować pod azotem w 4°C. Warunki sonikacji: sonikator Branson 250, końcówka 10 mm, 6,5 min. Skład buforu reakcyjnego:100 mM Tris, 0,14 M NaCl, 1mM EDTA, pH 7,4. Sonikat jest następnie wirowany 6 razy po 5 min. przy 14000rpm (16000 x g) w celu usunięcia cząsteczek tytanu. Powstały przeźroczysty roztwór jest używany w reakcji enzymatycznej.

6.2 Oczyszczanie LCAT

Do oczyszczania LCAT, używa się ludzkiego osocza traktowanego siarczanem dekstranu/Mg²⁺w celu uzyskania surowicy bez lipoproteiny (LPDS), którą następnie poddaje się chromatografii na złożach Phenylsepharose, Affigelblue, ConcanavalinA sepharose i chromatografii powinowactwa wobec anty-ApoA-I, co zestawiono w tabeli IX, poniżej, przedstawiającej reprezentatywny przykład oczyszczania, wobec anty-ApoA-I, co zestawiono w tabeli VII, poniżej, przedstawiającej reprezentatywny przykład oczyszczania.

T ab el a VII Oczyszczanie LCAT

Frakcja	Objętość całkowita (mL)	Białko całkowite (mg)	Aktywność całkowita (nmol CE/mg*h)	Wydajność (%)	Stopień oczyszczenia (rząd)
Osocze	550	44550	63706
LPDS	500	31000	62620	98	1,4
Phenyl eepharose	210	363	51909	82	100
Affigel blue	95	153	25092	39	115
ConAsepha- rose	43	36	11245	18	220
Powinowactwo Anty-A-I	120	3,5	5500	9	1109

6.2.1. Przygotownie LPDS

Aby przygotować LPDS, 500 ml surowicy jest dodawane do 50 ml roztworu siarczanu dekstranu (MW=500000), mieszane przez 20 minut, wirowane przez 30 minut w 3000 rpm (16,000 x g) w 4°C. Do dalszego oczyszczania stosowany jest supernatant (LPDS) (ok. 500 ml).

PL 193 662 B1

6.2.2.Chromatografianafenylosefarozie

Następujące materiały i warunki są stosowane do chromatografii fenylosefarozy: faza stała: fenylosefaroza z szybkim przepływem, o wysokiej czystości, Pharmacia kolumna: XK26/40, wysokość złoża: 33 cm, V=około 175 ml szybkośćprzepływu:200ml/godz.(próbka) przemywanie: 200 ml/ godz. (bufor) wymywanie: 80 ml/godz. (woda destylowana) bufor: 10 mM Tris, 140 mM NaCl, 1mM EDTA pH 7,4, 0,01% azydek sodu.

Zrównoważyć kolumnę buforem Tris, dodać 29 g NaCl do 500 ml LPDS i nałożyć na kolumnę. Przemyć kilkoma objętościami buforu Tris do osiągnięcia dolnego poziomu absorpcji przy długości fali 280 nm, a następnie rozpocząć wymywanie wodą destylowaną. Frakcje zawierające białko są łączone (wielkość puli 180 ml) i użyte w chromatografii na Affigelblue.

6.2.3ChromatografianaAffigelblue

Pulę frakcji z kolumny z fenylosefarozą dializuje się przez noc w 4°C wobec 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,01% azydku sodu. Objętość puli zmniejsza się poprzez ultrawirowanie (Amicon YM30) do 50-60 ml i nakłada ma kolumnę Affigelblue.

faza stała: Affigelblue, Biorad, kolumna 153-7301, XK26/20, wysokość złoża: około 13 cm;

objętośćkolumny:około70ml szybkość przepływu: nakładanie: 15 ml/godz.

przemywanie:50ml/godz.

Zrównoważyć kolumnę buforem Tris. Nałożyć pulę frakcji z kolumny z fenylosefarozą. Równocześnie rozpocząć zbieranie frakcji. Przemyć buforem Tris. Zebrane frakcje (170 ml) użyto do chromatografii na ConA.

6.2.4.ChromatografianaConA.

Frakcja z Affigelblue jest redukowana na Amiconie (YM30) do 30-40 ml i dializowana wobec początkowego buforu ConA (1 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM CaCl2, 0,01% azydek sodu) przez nocw 4°C.

faza stała: sefaroza ConA (Pharmacia) kolumna: XK26/20, wysokość złoża: 14 cm (75 ml) szybkośćprzepływu:nakładanie40ml/godz.

Przemywanie (wyjściowym buforem):90mlgodz.

Wymywanie: 50 ml/godz 0,2 M metylo^-D- mannozydem w 1 mM Tris, pH 7,4.

Frakcje białkowe wymywane mannozydem zbierano (110 ml) i objętość zmniejszano poprzez ultrafiltrację(YM30)do44ml. PuleConAdzielononaporcje2ml,któreprzechowywanow-20°C.

8.2.5 Chromatografia powinowactwa na anty-ApoA-I

Chromatografię powinowactwa na anty-ApoA-I przeprowadzono na złożu Affigel-Hz (Biorad), do którego kowalencyjnie skoniugowano przeciwciała anty-ApoA-I.

kolumna: XK16/20, V=16 ml. Kolumna była zrównoważona PBS pH 7,4. Dwa ml puli ConA dializowano przez 2 godz. wobec PBS przed nałożeniem na kolumnę.

Szybkość przepływu: nakładanie: 15 ml/godz., przemywanie: (PBS) 40 ml/godz.

Zebrane frakcje białkowe (V=14 ml) użyto w testach LCAT.

Kolumnę regeneruje się 0,1 M buforem cytrynianowym (pH 4,5) w celu wymycia związanej A-I (100 ml) i natychmiast po tej procedurze równoważy się ponownie PBS.

6.3.Wyniki

Wyniki testu aktywności LCAT są przedstawione w tabeli VIII, poniżej.

PL 193 662 B1

AKTYWACJA LCAT WYKAZYWANA PRZEZ PRZYKŁADOWE PEPTYDY RDZENIOWE

B Q3 K

en lo

in cn

’ϊΓ en

en OY

O o

o en

rd r-

CD LO

m

.—_r

rd

o

θ'

o

m

t—l

o

CD

00

en

Γ*

CD

LD

i>

CD

LD

c cn

dP m — u

DD

LD

LTi

n

en

O

r-

LO

O

—H

α

en

CD

en

CD

en

W

c e

ÓP Φ — Φ

r-

o

r*

o

O

52

M

Γ

0*

CD

Lf)

Γ-

CM

LD

2

OJ 2 X

Ό H μλ <

0 U

«Λ»

oP

G 4

o'r°

o\s

Ol°

ę\Q

<*>

oV5

pP

p*P

«Vs

e>

o'p

cip

£

en

m

O

m

n

en

OM

O

H

O

en

Η

ι—1

en

co

ω

O

UD

LO

LD

m

LTi

£7 #>

<

rO

Cd

s

Cd

2

Ł4

2

4

o

4

0

4

W

Cd

B

CZ

4

Cd

4

O

td

Cd

di

ο

O

o

O

o

O

o

c>

s 44 O

2

Cd

2

id

4

id

4

Cd

4

O

4

id

4

N

4

O

4

2

4

Μ

<

z

<

rf

<

et

ω

2

B

Cd

2

w

2

4

2

4

2

4

U

2

4

id

2

•H

4

kd

4

X

4

U

4

23

4

o

4

(-4

J

jjl

£

ω

Cd

ω

Cd

4

Cd

B

2

ft

κ

2

o

2

fY

fti

4

2

4

ot

4

2

4

bd

2

4

T~1

β

Cd

W

Cd

B

Cd

2

B

υ

Ci

ci

ed

ci

K

Cd

B

. 2

Cd

2

e

B

id

α

Β

u.

4

2

4

B

2

Cu

2

B

2

4

2

α)

»Α3

4

£

Β

α

0

Q

O

B

D

B

D

O

B

4

j

4-!

4

<υ

>

ω

2

ο

CU

Cu

a,

Cu

CU

Cu

2

O

2

B

OM

n

in

LD

o

co

en

O

ϊΗ

OM

n

ΤΓ

in

U3

t>

r*4

r~'5

rd

2

rd

t-4

r-l

ο 2

O 2

o 2

ó 2

o 2

O 2

o 2

O 2

Q Μ

Β 2

Q H

Q M

Q

Q w

Q H

Q

B

Q

D

Q

O

Q

M

n

M

K

M

H

M

σ ω ω

O K co

O w cn

O ω cc

σ H OT

O Cd CO

O Cd 2

O Cd cn

σ B W

o w w

o B OT

σ B OT

o B OT

O 2 en

cx 2 en

σ w en

cx B OT

ptyd

γΗ

OJ

m

in

lo

r-

co

en

o tH

Γ-ί H

CJ H

m H

•φ r4

m H

LD rH

Γ—ł

ω

β

PL 193 662 B1 cd. Tabeli VIII

* e tu 0) ffi

rn Cl

81

o fc

62

vn

fc

·“- £

PJ

O

m

CD

tH

kD

P

CD

fc

uo

kO

r*

o co K

dP co — o

Pl

Cl

□0

o

co

r-

en

o

m

-H UJ β

co

fc

\0

in

rd

Γ'

K

c*° D

a

0)

tO

PJ

Pi

in

fc

ao

fc

J-f

rr

Γ-

CO

co

TT

m

σ\

ko

0) kU *T-

O\

'T

>O -

-w 2 c 3

_ov>

+³

<ΛΡ

oV

o\°

ώΡ

•V*

oV>

rfp

•V»

♦V»

oV»

o¥·

o*·

S ^u

co

CD

P'

r*·

SJ

rn

fH

o

fc

co

«T

m

Pi

r-l

t—1

ΟΊ

tn

in

tn

m

tn

fc

+

n·

fc

m

n

m

rn

PJ

-l^J df X —

ίΰ

2

E

hi

E

X

fc

E

hi

o

2

CI

Cl

d

2

e!

2

fc

2

hi

E

hi

E

fc

hi

fc

E

fc

E

hi

rO •X O

o

O

a

O

σ

E

σ

o

σ

o

c*

a

o

O

σ

o

χ

hi

fc

σ

E

fc

E

fc

E

hi

2

id

fc

2

<

<c

<

o

*£

<

fC

2

<

fi

f£

fi

<

ω

w

ca

fc

E

fc

. fc

fc

β

2

łd

d

2

fc

2

£S3

2

-H

o

Cl

fc

2

X

2

d

X

2

6

e

ω

ca

fc

E

ω

e

fc

Ε

ω

E

fO

2

o

2

z

Z

2

Z

z

2

O

2

Cl

2

Cl

2

«3

2

U

d

fc

Cl

2

E.

2

Ti

ω

w

fc]

fc

ω

E

H

E

W

ω

fc

E

fc

E

a

E

et

ci

E

2

E

hi

E

c

E

Lii

fc

' E

E

fc

E

fc

E

fc

2

E

ω

Cl

d

2

fc

2

N

s

2

Q

CS

D

o

fc

Cl

D

E

O

a

Cl

a

Q

O

o

Q

E

a

Cl

Ci

k-3

d

fc

2

<u w

>

fc

>

2

>

O

(E

CU

tx

fc

CU

fc

<

CU

fc

X

E

CU

E

Cu

„

CD

cn

o

T^-1

CN

m

’Τ

fc

kD

r

CD

fc

o

rH

Pi

m

fc

to

P*

rH

CN

PI

Pi

n

I*)

m

n

fc

rn

O

o

2

55

2

a

Q

a

Q

Cl

Q

a

O

a

CS

□

D

Q

Cl

Q

o

O

Ht

M

H

M

Ht

H

M

Hi

H

M

Hł

H

W

Hi

M

Cf

o

σ

o

CX

o

c*

o

Cr

o

Cf

o

ω

u

w

td

fc

B

E

w

B

E

e

w

Cd

ω

fc

E

co

«

w

co

CO

co

w

CO

w

co

CO

co

w

CO

W

TJ

>Ί

4J

o?

cn

O

rd

Pi

m

rf*

fc

ko

r*

CD

fc

O

r-t

Pi

m

rr

tn

U)

r-

Q-i

T”ł

r-1

Pi

CN

Pi

CN

PJ

oi

CN

ci

Pi

ci

m

(0

n

m

n

fc

η

0

Λ

PL 193 662 B1 cd. Tabeli VIII

Ew X 41 ^BK

σ\

OJ θ’

ο- ο-

Ch uo

ud Γ

UD CO

m CD

Γ- m

UD Γ*

n r*

co r-»

in o·

05

·— £>

rd

00

cn

in

o-

ΜΊ

CD

OJ

σ\

rH

a

*·

CO

P

03

VD

θ'

CD

OJ

in

tn

CD

W

co

θ'

Φ CO W

dt⁵ nj ~ O

0Ί

σι

V

n

n*

UD

in

-r

OJ

a

iH

OJ

•H

rr

KD

co

r-

o-

aj

co

UD

co

CO

ω

0-

o

o έ

a

dP Φ — Φ

in

UD

m

tn

O

σ'

o

«0

n

a

UD

<E

u

OJ

UD

un

rd

Oł

OJ

co

in

UD

W

θ’

m

Φ Ud X

E- ^νω π Π £ d >

«V»

o*

oV>

e*>

o\°

o\®

«A°

<A°

«A°

aVs

ώ»

eAo

*Va

«*»

«Λ³

ch

m

in

m

tn

in

τΓ

n

ΓΊ

OJ

i—1

O

ou

CJT

en

CD

>1 _Λ

OJ

03

OJ

Ol

OJ

1—|

rd

i—i

i—ί

d. dp

X -

fti

X

o

d

dl

d

dl

d

i—i

d

X

d

U) d >

X

Si

X

σ

X

a

o

σ

ck

o

σ

cx

a

CU

o

σ

o

x

X

σ

X

kl

X

kl

2

dl

d

dl

d

r~t

d

<

rt

<ϋ

<

rt

<

o

Cd

taU

Cd

X

w

W

<υ

Cd

w

Cd

kl

w

kl

X

£

d

dl

d

dl

2

d

r-f

d

.J

d

•H

X

dl

d

X

n

d

X

d

2

d

β

Cd

W

£1

w

Φ

Cd

SD

Cd

kl

W

w

kl

rd

z

w

X

2

c

2

kl

2

W

dl

d

dl

d

dl

d

r~f

d

dl

d

td

X

Si

X

d

Sć

d

*Γ“1

w

W

w

Cd

ω

Cd

Φ

Cd

W

2

Cd

kl

w

[4

kl

w

W

2

o

Pi

2

X

cd

X

M

cd

Pi

pi

OŚ

X

2

pi

ci

Pi

Oi

Pi

Di

£

x

Cl

X

2

tu

X

4—F

X

Cu

X

Cl

X

Cl

X

Cl

X

<U

dl

d

w

tl

ω

d

w

d

1

d

1 <0 CD

c

D

Q

o

O

Ό

o

Q

D

a

O

G

o

Q

D

0

o

Q

dl

d

rU

d

2

d

1

d

>

1

>

CU

id

Gi

CU

P.

CU

X

J

a

CU

Cu

X

>

CU

cp

o\

o

rd

05

o

ΤΓ

tn

uo

r-

CD

m

o

rU

OJ

m

-T¹

m

UD

ΓΟ

m

•sj*

ς*

TT

U*1

in

Ln

LO

in

ω

un

tn

o

O

o

2

Z

2

z

2

Q

O

Q

a

Q

O

a

Q

O

Ω

a

Q

C

Q

C

Q

W

ł-l

W

M

ł-t

W

t—t

n

W

ł—f

M

H

I-i

ł-t

ł-s

M

H

hd

H

a

CX

σ

o

ck

r>

ck

a

σ

a

Cx

CK

σ

CK

UJ

w

Cd

w

Cd

ω

kl

w

ω

w

kl

Cd

kl

X

ω

w

ω

«

w

W

w

co

ω

w

CO

ω

Cfl

ω

CO

w

nj

>1

4J

CD

cn

o

T“ł

OJ

m

Ln

UD

Γ-

CD

σ\

o

H

OJ

m

un

UD

Pi

tn

m

•4*

*s*

Φ

’Τ¹

LO

tn

LTł

un

LD

tn

LO

ω

X

PL 193 662 B1 cd. Tabeli VIII

He (%} TFE

TT CD

o o

<Tk

ko kD

m LTI

03

— S

kp

n

kO

m

Cb

m

5

kO

·ό*

kD

CO

m

w

Cd

ω co

& *— υ

ΓΊ

LO

Cl

o

CD

2

co

-H

CO

CD

CO

Oi

l>

ω

<d

o 6

33

D — φ

σ\

to

V

rd

Γ-

ft

00

n

ł—1

kD

cD

<N

w

H

OJ «-i

Ό H -W <

_ev=

ο·Ρ

«V

pY»

»v»

oYa

o\°

<Λ°

P*>

od

«V»

eV>

oY³

eJp

ΟΫ*

eks

4^1°

co

r*

kD

ko

kD

in

un

tn

•tr

n

<N

rd

H

o

O

rd

H

r—ί

T—1

rd

r-l

r-ł

rd

r-*

r-l

ed

H

r-1

rd

+J dP <

It·

3

ί

X

1

ht

X

o

2

1

2

X

2

ω

hi

1

X

fd

o

σ

o

X

O

o

O

Cf

O

£

hi

X

hi

X

o

X

bć

hi

2

o

<

CJ

£d

ω

Ul

ω

2

X

2

Cd

2

Cd

£

2

t-4

fj{

2

X

2

J

2

s w

X

2

j

X

2

X

2

X

Ul

2

Cd

ω

Cd

to

Cd

ω

X

2

U

2

£

2

X

2

>-

2

s

rt

i-d

2

X

2

X

2

X

2

X

2

X

2

X

-n

ω

Cd

w

£

ω

2

H

X

2

X

2

id

Cd

2

Cd

u

Pi

P-

et

X

2

X

s

K

X

c

x

X

2

X

s

X

U,

X

2

Lu

X

2

X

OJ

ω

2

ω

X

Ul

ω

2

ω

X

2

ω

2

Cd

X

2

3

Q

c

o

O

Q

o

□

c

α

Q

Cl

Q

c

Q

□

44

X

I-I

2

X

2

u

2

0)

>

X

>

w

X

2

(X

X

ł

X

J

X

Ł

2

X

2

X

00

c\

σ

rd

Cd

n

ŁO

ko

r-

CD

σ·,

O

i-d

cd

n

'T

tn

Lfl

Lii

\n

vn

kD

. ko

kD

kO

kD

r*

O

r-

o

2

Cl

C

Q

D

Q

C

O

Q

Ω

O

2

O

Q

O

l-t

bd

hd

I-I

ł-d

M

ł-d

H

W

hd

H

M

H

n

H

K

M

o

σ

o

Cf

σ

ot

o

(7

o

ω

Cd

ui

Cd

w

X

2

ω

X

2

w

CO

to

ω

to

co

to

CO

to

co

W

to

tl >1 4J

CD

cn

o

X

CJ

m

in

ko

Γ-

CD

o

ł-d

Cd

r>

-Φ

fł

in

LO

kD

ko

vo

uo

kO

<n

kD

ko

r-

r«

t·

r-

t

•Φ

(Łi

--

1/ 22-j laerowy peptyd Segresta (Anantharamaiałi i wsp., 1990, Arteriosclerosis 10(1):95-105

PL 193 662 B1 cd- Tabeli VIII

X Φ s

<0 W

O W

100

dP o

—· >

CD

o ω

K

dP to — u

CO

r-1

o o

o

tH m e

CD

rd

X

d? o

r-t

CD

O

n

k

in

5T

0) MU W

Ό , 'tn Ej

£ -F³ 44 D

eM>

»v>

0^

dA

fiV·

eA®

oV>

dP

di°

«Α»

dl°

rfp

Op

Λ»

CD

cn

en

co

Γ*

Γ-

Γ~

r*

UD

ω

UD

m

c

rtf £ O ω fti

X

UJ

X

UJ

X

UJ

fi

fil

fi)

»4

u

UJ

fi)

fil

fi)

fi

t—1

fi

X

UJ

X

UJ

Ud

X

UJ

ŁtfJ

O

a

σ

CU

tz

o

cji

o

σ

fil

o

O

X

ić

UJ

S4

o

X

UJ

2

Ui

X

o

X

UJ

X

UJ

δ

fi)

fil

fi)

fil

fi)

fil

fi

f—1

fi

j

J

<

fi)

<

id

<

O

Ul

w

Ul

w

Ul

ui

w

Ul

z

0)

w

2

Ul

G

fil

J

fil

*4

fil

fi!

fil

fi

t—1

fi

j

fi

j

u

H

X

►4

fi)

X

fi

j

hH

X

g

ui

X

UJ

Ul

2

Ul

W

Ul

ω

OJ

Ul

ω

BS

u.

z

Z

2

2.

2

fi

CP

2,

2

a

1

fil

fi

fil

fi

fil

fi

fil

J

j

r—(

fi

fil

fi

<d

fi)

X

fil

*21

X

UJ

X

fil

j

|H

fi

X

UJ

►4

fi

Ul

ui

Q

w

fi

Ul

fi

W

Ul

Oi

01

Ul

tu

bl

n

Cd

pj

fi

Ul

OJ

fi

Od

OJ

Ul

X

UJ

Di

Pi

a

X

fi OJ 1

U-

X

Uh

ω

Uh

r-4

Uh

fc

u.

Uh

b,

Ul

UJ

Ul

fi)

Ul

fi

r—i

X

Ul

bl

o

α

o

Q

D

O

fi

w

Φ

o

fi

Q

fil

fi

fil

fi

i-i

fi

i

fil

fi

>

i

>

1

>

i—1

>

Ϊ

>

ω

IX

£X

tx

cx

Ph

f

Uh

Pj

Ph

P-

tu

Pj

l

Ph

CU

M3

c-

CD

en

o

rU

Oi

m

'

in

V0

r-

ω

en

o

H

Ol

r-

r·

P*

r*

co

CO

. ^m

03

co

03

CD

en

o

z

2

z

2

a

2

a

2

a

fi

O

fi

O

fi

Q

fi

□

fi

O

H

M

H

W

M

H

IH

W

H

K

H

σ

o

σ

o

cif

o

W

Ul

b)

Ul

ω

w

Ul

w

Ul

UJ

b)

bl

Ul

M

en

fi

tn

fi

tn

w

tn

Oj

en

tn

en

'

TJ >1 •μ

vo

r-

CO

0Ί

o

rH

Oi

n

«φ

m

to

Γ*

CD

en

o

rd

oi

Di

r-

r*

r

Γ

03

CO

03

m

CD

03

00

m

®

<D

σι

en

<h

dl

CM

PL 193 662 B1

Tabeli VIII

*W w w ^H w

n V£ł

BI

09

co CD

55

65

77

<#> m

“ >

Γ*

a

n

O

CL

OS

CH

P

ch

ω

CD

ω

CH

m

<D ŁO

X

<*° en o

o

CL

in

CO

CH

CL

OS

o

CU

*H

r*

03

CD

CO

cs

<n

•'T

CH

w

a> £

X

— flj

ω

CH

• PS

CL

<—1

OS

a

k

r-1

in

C'

CD

W

CH

to

<U H-1

***

'tn g °s

£ «4

enA

«>

«V»

ώ³

oV»

eV>

cY

oV>

oY»

oY>

cY=

ώ³

in

m

in

U)

V

ΓΗ

CH

rd

r-i

w

O

o

•P t*·

crS

5

X

ii

f

X

CU

X

CU

o

P

i—l

[

P

>

Γ~t

P

>

IG

X

i

X

P

X

n3

o

Cf

σ

1

o

Q

σ*

o

u

c*

Of

o

κ·

X

x

!

P

U

X

X¹

P

r—1

1

P

Ul

i—(

P

0-1

c

<

ίϋ

I

<

z

(G

<

Cr

£

X

u

w

ω

UJ

ω

tu

w

UJ

ω

UJ

ω

Cd

Φ

P

r—4

P

1—i

P

<

P

X

<

X

P

UJ

i—1

X

UJ

P

w

cd

ω

P

OL)

ω

u

z

CJ

2

P

ω

Cd

c

2

Z

2

c

z

Z

Cd

C

Z

2

(D

P

p

P

r—ł

P

r-A

P

«Η

X

P

i—1

P

i-H

P

X

u

W

OJ

ω

Cd

UJ

QJ

UJ

ω

Cd

Ϊ

ω

Cd

4)

X

U

ci

Cr

z

Z

<

Kr

U

cd

J

cd

ci

ej

z

w

U

Cu

Mu

w

P

Uu

Cu

W

Cu

i

Cu

u

ω

P

i—1

P

X

i—1

P

. P

Cd

2

<=r

p

λ;

£

O

Q

a

Ό

a

o

c*

Ό

o

Q

o

ί

Q

ΰ

σ

Λί

P

p

*—t

P

X

r—1

P

ł

P

u

Φ

>

' >

>

P

>

l

3

>

ω

CU

Cu

CU

CL

CU

X

CL

CU

cu

X

₄___

n

·<

LD

UD

r-

CD

Ci

o

t—(

CH

m

LC

to

!>

OS

os

Ci

Os

cs

o

O

o

O

o

O

»—1

rH

r—1

rH

«—i

T~ί

rH

O Z

O z

O Z

O z

O iz

o

O

o

O

o

2

z

2

Q I—t

ID

Q H

a M

Q łH

Q

O

Cl

Q

o

Q

□

n

H

W

n

O u

O ω

σ ca

O Cd

o

σ

o

co

CO

Cd

tu

ω

Cd

ω

Ul

w

CO

w

CC

K

w

CC

V.

w

—

τί >1 P CL

m

Γ4

tf)

to

C'

CD

o

i-i

CS

σ'

TT

LO

to

cn

cs

os

θ'

os

a

O

o

c

O

c

o

H

P

r^-

H

r-

0)

CL

Ł

1

22-Merowy (Anantharamaiah i wsp., 1990, Arteriosclerosis 10(1):95-105).

>ι <0

-u O ω

Φ

M cn en C tu CU ζΛ [fi

I -P CL « a)

PL 193 662 B1 cd. Tabeli VIII

w Cu w

<* Lf)

OT ΙΛ

óP ra

OT

P

n

o ω W

jp cn U

ŁD

LT3

CN

ΙΠ

tr

<N

® g

w

<jP Φ — Φ

OT

uo

CJ

<N

I—I

G> Ud

¹⁽³ X O « 2 o

Fl *_3

«>

cV>

«V⁵

«V

«V»

«V⁵

«V»

oV»

eP

<Λ°

«Μ

«V»

«VI

2

O

o

O

o

O

o

4J o*“ X —

<

.¾

X

bi

X

PI

Pl

P

ω

ΪΖ

Ł4

X

bi

X

o

σ

«

o

c<

o

Cf

a

o

a

o

nl

X

bii

b£

X

bd

X

2

bi

£

p

PI

P

X

P

At’

<

rf

<

d

X

<

2

O

ω

Cd

ω

X

ω

Cd

X

c

P

X

2

co

P

2

P

•rd

X

Ci

X

OU

X

g

ω

W

ω

w

ω

X

td

X

łti

2

s

Z

s

2

z

2

P

kJ

P

fd

P

X

bC

X

2

w

X

Cd

ω

w

X

w

X

a

X

Ci

X

κ

X

fu

Cu

u

X

Cu

u<

Cu

Lu

X

Cu

Φ

p

X

w

ω

Η

ω

X

o

O

Q

o

Q

c

o

Q

δ

Pl

P

U

P

Ρ

P

>

X

>

Φ

cu

Cu

cu

CU

Cu

CU

P

cu

ω

„

___„

m rd

OT O

o rd

r~1 rd

CN rd

OT H

’Τ rd

. 'u? rd

o rd

co rd

OT rd

o Cd

K (N

CN CN

«—i

rd

o

O

o

ó

o

z

2

Q

D

Q

D

Ci

Q

Q M

O

a

Q

Cl

Q

K

H

K

H

hd

W

M

Ud

H

I-d

H

W

σ

o

σ

o

Ot

o

o ω co

o

a

σ

o

ω

w

X

Cd

X

co

ω

co

w

co

CO

w

co

ω

co

CO

ω

****

'~^l*

P

>1

OT

o

rd

CN

OT

'Φ

in

UD

>

aa

OT

O

rd

<N

-P

O

rd

P

rd

CN

fi

rd

P

rd

P

rd

tu

Ch

peptyd

PL 193 662 B1 cd. Tabeli VIII

Ew (U 0) K

de tn

~£

CD CO X

de c — u

•Η

OJ £

ffi

de o — Φ

u

ω m X

Ό eh 'ui χ

o u G d

ώ® [—

2 >, — +J <)P X —

O'

π3

&

X

o

X

Si

X

Si

X

Si

X

o

X

o

d

01

Si

o

Si

si

Si

X

Si

X

o

X

fti

σ

o

c*

o

Si

a

o

X

Si

CK

o

CK

o

O

CK

£

X

o

Si

σ

X

CK

z

X

n

X

d

>0

d

u

d

tso

d

S3

d

o

<

ri

<

J

Cl

ri

<

ri

<

ri

z

ri

U3

ω

tl

Cd

ω

X

Q

X

CK

Su

X

CU

X

ω

X

ω

r*l

U

d

o

d

ι-d

X

d

e r0

d

u

d

o

u

ts3

X

w

Cd

X

Cd

z

o

a

CU

ω

X

Cd

ω

X

z

2:

z

Di

id

z

X

z

CK

z

ni

d

►0

d

2

d

J

d

m

ω

X

Q

X

a

X

υ

ci

o

X

Z

X

Si

X

Di

oi

CU

DŚ

ci

G

X

Lu

X

Cl

X

Cl

El

Cl

X

φ

d

>-3

d

X

d

&

o

c

o

X

w

X

Q

X

o

X

o

D

Q

o

X

X,

d

►0

kO

►d

►Ί

d

Φ

>

ri

>

co

o

Cu

z

CU

PU

CU

a

PU

CU

,_,

_

__

ΡΊ

rr

LO

UD

Γ*

co

ΟΊ

o

- rb

01

ΓΊ

N*

in

UO

t-

CJ

o

Ϊ—ł

<N

CN

d

cn

CN

<N

Cl

(N

co

Γ0

fi

m

n

m

TT

N*

Ν'

rd

r-l

<—i

i—ł

r~i

rU

rd

i—t

I-I

<—1

1—1

rd

1“ł

rd

e-t

rb

i—t

O

o

O

o

O

o

O

o

z

C

Cl

c

Q

o

Q

o

Q

a

Q

a

Q

I-d

Hi

HI

Hł

Ht

K

Ht

Hł

H

HI

H

HI

H

HI

Hł

Hi

H

o

σ

o

CX

o

cx

CK

c*

σ

CK

o

CK

o

σ

CK

w

X

ω

Cd

X

ω

X

ω

X

ω

X

ω

w

CO

w

co

X

CO

w

to

w

ω

co

CO

co

ω

co

w

-“,

'·*

—*

*—'

>1 41

m

T

uo

UD

Γ*

CD

o%

o

rd

M

m

in

CD

r*

CD

cn

o

r-l

CN

(N

d

CN

d

CN

d

CN

f>

n

m

Γ0

n

m

Γ0

n

V⁴

N*

Oj <D a

r4

Η

«—ί

rd

H

rd

I-{

d

rd

H

rd

d

rd

d

r-l

H

PL 193 662 B1 cd. Tabeli VIII

He (%) TFE

95

58 1

95

80

47

⁸⁰

61

dP tn

o

A

in

tn

A

b

CM

A

r-

CO

<u to as

dp ©

o

— U

CD

A

o

LO

A

LD

A

CO

Lf)

f*

in

ot

OT

CD

ν ε

as

&> 0) — 0)

<n

tn

r*

O

00

a

tn

CD

co

tn

cn

A

LD

φ A W

'U r 'to

o

o\°

dP

oV>

dP

«V»

©V»

dP

2

LD

tn

A

r*

in

O

cn

CD

tn

O

o

CD

A

r-

C-

>!„

co

r*

r-

LD

tn

a

A

a

A

CM

A

+J ĆP

a: l<

te

*

&

B

td

B

0

4

A

4

to

B

fti

o

B

J5;

2

a

O

θ'

O

a

O

θ'

O

O<

o

O

Of

O

Of

O<

λ:

4

A

4

c

<

·<

<

2

<

3-

<

c

Cd

Ω

O

o

Ω

D

Ω

. Ω

Ω

Cd

Ω

4

A

2

U

4

s fti

O

4

A

4

O

4

ω

Cd

cd

Cd

2

Cd

2

cd

Cd

2

cc

Cd

CC

Cd

cd

2

cd

2

Cd

ω

W

Cd

ω

Cd

4

Cd

fti

4

2

4

CO

4

2

4

2

•m

Cd

2

U

a-

Cd

W

Cd

4

Cd

4

ω

Cd

G

u

Cd

2

Cd

2

Cd

2

Cd

2

Cd

2

Cd

OJ

4

2

4

&

α

Cd

ω

W

ω

W

Ω

ω

Cd

Χ

4

Cd

4

• 4

A

4

tu

>

4

>

cn

2

a

U

2

CM

<

CM

_r_.

„__.

____

__

_____

a

m

LO

Γ*

CO

cn

O

A

tn

LD

tx

CO

cn

O

A

’Τ*

A

a

A

a

in

tn

in

tn

in

tn

LD

r-ł

A

r-ł

A

f—1

A

O

o

O

o

O

o

O

♦P*

2

Ω

O

Q

Ω

Q

O

Ω

A

W

A

o

σ

o

Of

o

a

o

σ

Of

o

Of

ω

Cd

w

Cd

w

CO

co

CO

co

CO

co

CO

***

**—'

T3

>1

a

tn

LD

OT

CO

cn

o

A

a

A

tn

LO

CD

cn

o

A

CN

Ch <D

XJ<

rr

A

tn

in

tn

in

cn

in

tn

in

tn

u>

co

CO

A

H

A

CM

PL 193 662 B1 cd. Tabeli VIII

Ew U Φ K

LP in

61

dr» ω

«—

rd

tn

□ w

t*³ ® — U

m

uo

Ή

in

UD

0) £

X

dP Φ — OJ

r·

l>

k

OJ

m

Φ MU X

Ό νλ H

⁰ 3

£ j

«*1°

dP

od*~

dp

oV>

dP

£»V>

ΟΫ»

«Α»

o**

s

UD

ΓΊ

CN

ro

r-

o

UD

LP

Γ9

cn

O

eV>

«Ao

>d

CN

Ol

Γ4

rd

h

rd

co

03

Γ'

£ 5

<

«3

&

a

X

.X

X

o

X

o

fil

a

J

fi

fil

fi

f—l

fi

• ω

X

a

X

Ω

a

X

Ui

X

a

X

a

X

a

u?

a

X

a

O

X

Λ!

X

Ui

X

£

o

σ

o

σ

o

O

o

X

σ

X

Cf

CK

Ci

o

Ω

X

Ś

♦4

X

fi

fil

>—1

fi

<

U

<

fil

<

fi

ίθ

fi

<

Q

o

O

Cl

Ω

Q

o

-α

ω

o

Ω

u

Ω

a

Ω

Ul

s

fil

J

fi

fil

fi

X

fi

1—I

fi

fil

fi

j

fi

I-I

fil

X

fi

fil

<—t

fi

j

X

fi

B

X

Pi

a

X

O

a

pi

X

k

ci

X

Ci

ui

X

ui

Pi

X

n3

Cd

K

ω

ui

fi

Cd

ω

fi

ω

o

01

fi

Ω

fi

rtf

fil

fi

j

fi

J

fi

rd

fi

fil

fi

h4

o

J

fi

fil

fi

i—1

fi

i~ i

z

%

X

o

X

a

X

c

X

υ

ω

fi

a

fil

ω

fi

Q

OJ

fi

Q

fi

Ul

c

fi

£-i

U

tu.

fi

Cu

fi

Pu

Uh

Md

Ul

X

fi

U

fi

U

u

fi

GJ

fil

a

fil

►4

fil

fi

*4

fil

j

fi

t—f

fi

fi-

fi

S

fi

ω

Cd

fi

w

Ω

0)

w

fi

Ul

u

Cd

fi

fi!

fil

fi

j

fi

j

fi

1—1

fi

<y

>

ω

EU

CU

PU

CU

Dh

Oh

CM

Oh

CU

Ω

CM

fi

u

X

fi

___

{*»

in

UD

r-

CD

cn

o

rd

CN

ΓΡ

*r

LP

UD

r-

03

cn

σ

rd

CN

MJ

L£5

u?

UD

W

. ud

r~

Γ-

r-

r~

r-

r*

C3

CO

00

rl

rd

O

o

O

Ω

o

X

z

X

a

X

Ω

o

Ω

D

□

α

Ω

O

α

O

Q

Ω

H

ł-d

w

h-f

K

H

ł-d

M

kd

H

kd

K

kd

M

kd

σ

CK

o<

o

σ

o

ω

CK

o

σ

O

o

CK

σ

o

CK

£3

w

fi

w

fi

w

fi

ω

fi

w

fi

fi.

ω

fi

w

fi

W

w

ω

co

w

co

co.

CO

co

fi

co

w

co

CO

***

—*“

—'

Tl

>1

m

Ό*

tn

UD

r*

¢0

<n

o

rd

CN

n

in

UD

Γ*

co

cn

o

rd

CN

Pd α)

k>

UD

ud

UD

uo

X

x

F*

r»

CD

CO

H

T—i

i—i

rd

łH

H

rd

T-i

H

rd

H

rd

PM

PL 193 662 B1 cd. Tabeli VIII

He (%) TFE

UD m

co

fc cn

cn co

cn P*

dP w

“ fe

Γ-

O

o

5

uj

co

dp m υ

OD

co

fc

o

r-

rd

•Λ

CD

cn

p*

i>

<u S

W

d? Φ — Φ

W

TT

ao

fc

Jd

fc

xp

n

D iw W

'Uh

‘CO <

OD C2 ?

ΟΫ» UD

oV* N*

eV fc

ώ° O O

o\A O o

MD cn

oU> co co

o¥> r- co

e\p rd CO

eA° rd OD

er> O CO

«Λ° UD r·

eV» fc

Γ*

O P-

X?dP

χ-'

2

X

o

X

hC

X

0

2

3

co

X

O

. X

hi

X

h£

hi

-d

X

o

X

h£

3

-*

*

+

*

+

*

o

O

θ'

Cf

2

Cf

θ'

Qf

X

2

s

2

w

2

<

O.

<

n:

X

hi

β

Q

a

El

Q

O

Q

a

O

θ'

CX

Cf

O

Z

O

CX

2

X

-rd

2

. 2

2

fc

2

£

Xj

Ci

X

a

X

M

E

W

fc

E

fc

ω

E

iti

td'

E

Q

W

o

fc

E

fc

E

w

fc

,<ć

2

U

2

fc

2

TO

2

Z

Cf

2

J2

ω

E

fc

E

fc

E

O

u

fc

2

E

W

E

M

X

d

X

d

β

fc

E

fcj

fc

E

s

2

fc

E

fc

E

fc

E

<ϋ

2

fcl

2

Cd

E

W

Q

O'

O

E

O

D

O

Q

O

E

di

2

»-3

łd

2

-1

2

Φ cn

2

F>

>

2

>

2

<

PM

E

fc

E

0

E

Oi

fc

E

O

CU

2

fc

___

___k

H-w

- .

fc

«Τ

in

MD

r-

ao

0\

o

• rd

CN.

fc

tn

to

r~

GO

tn

O

rd

PJ

CD

co

OD

ao

co

CD

cn

o

O

o

i—i

r-ł

ł—t

rd

i-d

rd

2

rd

Pl

PJ

P?

o

. o

o

O

a

O

Ci:

o

O

o,

o

s

2

• 2

2

Q

□ Q

Q

O

Q

O

Q

D

Q

O

Cl

Q

O

Q

O

Hł

-1 H

ł-d

Hł

Hi

ł-i

M

H

W

H

M

Hi

W

H

ł-d

Hł

o

σ

O

o

σ

Cf

rv

Cf

ΓΧ

a

Cf

o

Cf

o

w

ω

E

ω

B

W

B

E

fc

E

B

E

fc

E

co

V)

cn

U)

CO

Ώ

cn

W

cn

w

cn

tO

W

ω

co

W

.

”

'—'

****

~·

fc

tn

MD

o

cb

cn

a

rd

PJ

fc

tn

MD

t-

GD

cn

o

rd

CN

>1

co

OD

GD

CD

co

W

co

cn

<n

cn

o

O

2

w

r*ł

rd

H

i-d

rd

H

rd

2

rd

N

Pi

PJ

&

<D

PM

PL 193 662 B1 cd. Tabeli VIII

dP ω w

W 2 H

cd kO

m tn

' 68

70

kT ta

4

*

ĆP

tn

i>

c~

r*

ΓΠ

kD

5

kO

rn

tn

c·

m

0

ω

K

ca

□

rd

n

ΓΊ

co

d*

—M

r

kO

kD

r-

kD

<D

6

K

ĆP

ω

Φ

k*

o

03

π

Γ'

H

in

Cd

m

cd

Φ

Md

2

Ό

'tO

o

CJ 2

od

Jp

od

ep

ok³

©\^a

Λ*

oV

aY³

_ov*

oY>

eY>

Λ*

oY

ώ°

e?P

©V⁵

«+

o'r

oY¹ CO

*>

k£>

m

o

r-

o

co

r

kO

tn

CO

Cd

cr\

cc

m

o

en

ki

Cd

cd

£

kD

w

kO

tn

d¹

sr

m

ΓΊ

rO

m

Cd

cd

rd

+J

X

-¹

<

rt

> o·

ω

rt

*

+

*

+

*

+

*

+

* '

£

X

o

X

2

2.

2

hi

o

hi

X

Γ)

O

X

hi

ν'

X

hi

X

2

c

c*

o

O

o

σ

O

o

d

O

o

d

X

2

X

n

O

2

X

hi

2

£

r>

X

2

g rt

2

X

J

2

X

2

£

2

ω

2

X

2

X

2

X

ω

2

rt

X

2

X

ω

X

2

X

2

X

2

X

2

X

2

rt

łrt

2

rt3

2

£

2

ΓΊ

ω

Ed

X

ω

2

Q

X

2

ω

2

X

2

X

2

G

X

K

o

X

ci

X

hi

K

X

rt

X

2

X

2

X

2

X

tu

2

rt

£

n

a

O

t3

2

X

O

a

O

X

a

2

X

D

Q

O

Q

o

X

2

2-J

2

, η

2

rt]

2

W

>

2

>

rt

>

rt

>

ω

rt

X

2

X

12

X

a

2

__

J__

___

_____

___

ΓΟ

m

kD

r-

co

X

o

’ rd

CJ

m

Lfi

kD

c-

CD

en

o

rd

Cd

o

a

o

O

o

rd

H

rd

cd

Cd

cd

es

cd

<d

rd

Cd

cd

Cd

<d

Cd

rd

ci

Cd

o

X

2

z

s

2

D

O

a

O

Q

D

Q

O

G

Q

a

Q

D

Q

a

Q

O

Cl

hd

ł-d

hi

H

hd

H

hd

ł-d

hd

H

hd

a

o

d

o

d

σ

d

θ'

d

o

d

σ

o

d

o

d

X

ω

bJ

2

X

2

X

2

ω

co

CO

co

EO

W

w

W

CO

co

en

CO

W

co

CO

W

' '

·—·

•s—'

‘

'

Ό

m

·«+

m

ko

r-

co

Oi

o

rd

Cd

m

+

in

kO

t-

co

ΟΊ

o

rd

Cd

>1

o

O

o

O

H

2

rd

2

rd

cd

Cl

Cd

+J

cd

rd

cd

Cd

<N

Ci

Cd

CJ

Ci

td

cd

Ci

cd

<d

cd

d

O

ft

PL 193 662 B1

Tabeli VIII

-18AM4-C(O)NH₂ peptyd {Brasseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:1-7).

PL 193 662 B1 cd. Tabeli VIII

He (%) TFE			48	a co
<*= U) Φ w X		O in	OT rd	o Γ-	Γ* N*		OT rd
jp o u -Η Φ fi *n		Φ w	O Tl*	Γ- r*	s N*		in TT
d? 4) — ® ® P X		o i—1	OT	CD OT	OD rd		CD rd
ijg * s 5	«V· t>	<a° m	in	oV* Φ	o>® N*	Pp OT	<Λ° OT
<
Iti 2 O U3 2 X o fi •rd e ttj (U •m o fi a) 2 X 3) ω	o > X g P X X 2 P ω u P X X p P o	Ł < X X X X X < > X o 2 X X 2 o	X < X X P X X < > X a X s P 2 D	X X X X X X X X > X Q X 3 P 2 Q	X P X X P X X P > X X X X P 2 X	X X X X X X X X X X Q :» X X 2 a	X P X X P X X P > X X X s P 2 X	* X P X X P X X X > X X X 5 P 2 X	+ X P X X P X X P > X X ►*. X 5 P 2 X	+ X P X X P X X P > X X -> X B P 2 X
	ΪΝ Φ CN	OT N* <N	N- Tf CN	iri •Φ CN	UD N* CN	r- N* CN	co N* (N	OT CN	. o lg CN	rd in CN
	o 2	o 2	o 2	o 2	o 2	o 2	o z	o 2	o 2	o 2
	a K	G H	G H	G H	G M	G M	Q K	G M	G H	a ud
	σ ω w	o X w	a X X	O Cd co	o X X	a X X	a X X	o X X	o w X	o X X
τ> >1 +> a a) &	r· CN TT CN	OT CN	N* Φ CN	tn j CN	VD •Φ CN	r- -φ CN	o «Μ CD *Φ CN	OT CN	Pł rł O m CN	Pł rH rd Lfl CN

PL 193 662 B1

ΐω w w
o ω υι X
ro u -fi Φ £ K
ćfi 4) *- 4) h 4) Ή W
Ό X O < °p > ^M>1 ~ -P dP X — rf!
Sekwencja.aminokwasowa	+ X P X o ω P P ω X x P o P > X	* X Ol X P w a P P a X X P O P > X	+ X c X P X a P P a X X P o P > X	+ X O P X a P P a X X P o P > X	* X o X P < a P P a X X P a P > X	ł X σ X P X a P P z a X P O P > X	* X o X P a z p P a X X P Q P > X
	CH in CH o z Q H O w a	n tn CH o z Q M O W W	rr tn CH o z Q H o a M	Ul Ul CH o z o H o a M	W m CH o z o M o a a	r- in CH o z Cl w O a w	OT Ul CH o z Q H O a a
Ό >1 +J Pr <D Pi.	CH 1T> CH	m Ul CH	LD CH	tri in CH	to ui CH	C' m CH	OT Ul CH

PL 193 662 B1

W tabeli X * oznacza peptydy, które są N-końcowo acetylowane i C-końcowo amidowane;

^t oznacza peptydy N-końcowo dansylowane; sp oznacza peptydy wykazujące problemy z rozpuszczalnością w warunkach eksperymentalnych; X jest Aib; Z jest Nal; O jest Orn; He (%) oznacza stopień helikalności; micsoznacza micelle; i -oznacza wydeletowane aminokwasy.

7.Przykład:Analizastrukturalnai wiązanialipidówprzezpeptydyApoA-I.

Charakterystyka strukturalna i wiązania oczyszczonych peptydów zsyntetyzowanych jak opisano w Rozdziale 6, powyżej, były określone poprzez dichroizm kołowy (CD), spektroskopię fluorescencyjną i magnetyczny rezonans jądrowy (NMR).

7.1. Dichroizmkołowy(CD)

Ten przykład opisuje korzystny sposób określenia procentowości drugorzędowej struktury α-helikalnej samych peptydów, bądź w obecności lipidów.

7.1.1. Metodaeksperymentalna

Widma dichroizmu kołowego w dalekim UV mierzono pomiędzy 190 a 260 nm (co 0,5 nm lub 0,2 nm) przy zastosowaniu spektrometru AVIV62DS (AVIV Associates, Lakewood, NJ, USA) wyposażonego w termoelektryczny statyw do kuwet i zmiennik próbek. Urządzenie było kalibrowane (+)-10-kwasem kamforowym. Dla każdej próbki wykonywano od jednego do trzech skanów przy zastosowaniu kwarcowych kuwet. Powyżej sil o długości toru 10 cm, 5 cm, 1 cm i 0,1 cm dla stężeń peptydów, odpowiednio, od 10^-7 do 10^-4M. Szerokość pasma była ustalona na 1,5 nm,a szybkość skanowania 1 sek. na skok długości fali. Przedstawione dane stanowią średnią co najmniej 2 lub 3 niezależnych pomiarów.

Po odjęciu tła, widma przekształcano na eliptyczność molową (θ) na resztę w stopniach cm^-2 dmol^-1. Stężenie peptydu oznaczano poprzez analizę aminokwasów, a także poprzez spektrometrię absorpcyjną w spektrofotometrze UV/Światło widzialne Perkin Elmer Lambda 17 wówczas, gdy peptyd zawierał chromofor (tryptofan, dansyl, naftyloalaninę).

Widma CD otrzymywano dla wolnego, niezwiązanego peptydu (5 μΜ w 5 mM buforze fosforanowym, pH 7,4); dla kompleksów peptyd-SUV (20:1 EPC:Chol., Ri=30 oraz Ri=50); dla kompleksów peptyd-micella (1-mirystoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fostatydylocholina, Ri=100); oraz dla wolnego, niezwiązanego peptydu w obecności 2,2,2-trifluoroetenolu (TFE) (5 μΜ peptyd, 90% obj. TFE).

SUV otrzymywano poprzez rozproszenie lipidów (10 mM, 20:1 EPC:Chol., Avanti Polar Lipids, AL) w buforze fosforanowym (5 mM, pH 7,4) przy zastosowaniu strumienia N2 przez 5 min., a następnie sonikację (1,5 godz.) w sonikatorze wannowym. Homogenność preparatu sprawdzano poprzez FPLC.

Micelle otrzymywano poprzez rozproszenie lipidu (6 mM 1-mirystoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fostatydylocholina, Avanti Polar Lipids, AL.) w buforze fosforanowym (5 mM, pH 7,4) przy zastosowaniu strumienia N2 przez 5 min., a następnie mieszanienaworteksie.

W celu otrzymania kompleksów peptyd-SUV, SUV dodawano do peptydu (5 μΜ w 5 mM buforze fosforanowym pH 7,4) przy stosunku molowym fosfolipid-peptyd (Ri) wynoszącym od 30 do 50.

W celu otrzymania kompleksów peptyd-micella, micelle dodawano do peptydu (5 μΜ w 5 mM buforze fosforanowym pH 7,4) przy Ri wynoszącym 100. Wszystkie widma mierzono w 37°C. Stabilność peptydu 210 (SEQ ID NO:210) jako funkcja temperatury (zarówno w buforze jak i micellach) była określana poprzez zbieranie widm w seriach różnych temperatur. Określono również stopień helikalności peptydu 210 (SEQ ID NO:210) w funkcji stężenia.

7.1.2.Określaniehelikalności

Stopień helikalnośći peptydów w różnych warunkach był określany ze średniej eliptyczności przy 222 nm (Chen i wsp., 1974, Biochemistry 13: 3350-3359) lub przez porównywanie otrzymanych widm CD do widm referencyjnych (16 referencyjnych widm helikalnych otrzymanych z Provencher & Glockner, 1981, Biochemistry 20: 33-37; widmo referencyjne zdenaturowanego białka z Venyaminov i wsp., 1993, Anal. Biochem. 214:17-24), stosując algorytm dopasowania do krzywej CONTLN wersja 2DP, zestaw CD-1 (Aug. 1982) (Provencher, 1982, Comput. Phys. Commun. 27: 213-227, 229-242). Dopuszczalne dopasowanie było określane przy zastosowaniu metod statystycznych dostarczonych w algorytmie CONTIN. Błąd wszystkich metod wynosił 5% helikalności.

7.1.3.Wyniki

Stopień helikalnośći (%) wolnych, niezwiązanych peptydów (wolne), kompleksów peptydy-SUV (SUV), kompleksówpeptydowo-micellowych(mics)i roztworówpeptydy-TFE(TFE)jestprzedstawionywtabeli X, Sekcja8.3,poniżej.

Peptyd 210 (SEQ ID NO: 210) zawiera znaczącą strukturę α-helikalną (63% helikalności) w micellach. Co więcej, struktura α-helikalna jest całkowicie stabilna w zakresie temperatur 5°-45°C (wyniki

PL 193 662 B1 nie pokazane). Helikalność peptydu 210 (SEQ ID NO: 210) również wzrasta w obecności TFE, będącego rozpuszczalnikiem o znacząco mniejszej stałej dielektrycznej (ε=26,7) niż woda (ε=78,4), stabilizuje on α-helisy i wewnątrzpeptydowe wiązania wodorowe przy stężeniach pomiędzy 5-90% (v/v).

Odnosząc się do tabeli VIII, infra, widocznym jest,że to peptydy wykazujące się wysokim stopniem aktywacji LCAT (>38%) generalnie posiadją znaczącą strukturę α-helikalną w obecności lipidów (>60% struktury helikalnej w przypadku niezablokowanych peptydów zawierających 22 lub więcej aminokwasów lub zablokowanych peptydów zawierających 18 lub mniej aminokwasów; >40% struktury helikalnej w przypadku niezablokowanych peptydów zawierających 18 lub mniej aminokwasów), podczas gdy peptydy wykazujące niewielką lub brak zdolności do aktywacji LCAT posiadają niewielką strukturę α-helikalną. Jednak w niektórych przypadkach peptydy, które zawierają znaczącą strukturę α-helikalną w obecności lipidów nie wykazują znaczącej zdolności do aktywacji LCAT. W konsekwencji, zdolność peptydów rdzeniowych wynalazku do przyjmowania struktury α-helikalnej w obecności lipidów jest uznawana za krytyczną cechę peptydów rdzeniowych wynalazku, a jako zdolność do formowania α-helisy w obecności lipidów wydaje się warunkiem wstępnym do aktywacji LCAT.

7.2.Spektroskopiafluorescencyjna.

Właściwości wiązania lipidów dla peptydów syntetyzowanych w Rozdziale 6, powyżej, testowano poprzez pomiary fluorescencji przy użyciu wyznakowanych peptydów, w tym przypadku tryptofanu (Trp lub W) albo naftyloalaniny (Nal). Widma fluorescencji mierzono we Fluoromax ze Spex (JobinYvon) wyposażonym w lampę Xenon 150 W, dwa monochtromatory (wzbudzenia i emisji), fotopowielacz R-928 do wykrywania czułego na czerwień do 850 mm i termoelektryczny statyw do kuwet z mieszadłem magnetycznym. Do pomiarów w mikromolarnym zakresie stężeń stosowano kwarcowe kuwety Suprasil. Przystawka ze zmiennymi szczelinami (od 0,4 do 5 nm) pozwala na modulowanie przypadkowych i emitowanych intensywności w zależności od stężenia zastosowanego peptydu. Przedstawione wartości są na ogół średnią z 2 do 4 widm. Stężenie peptydu określa się poprzez spektrometrię absorpcyjną przy użyciu Philips PU 8800 stosując pasmo absorpcji Trp (ε_{280 nm}=5,550 M^-1cm^-1

-1 -1 w buforze Tris) lub Nal (ε_{280 nm}=5,550 M^- cm^- w metanolu).

Widma fluorescencyjne peptydów mierzono w zakresie od 290 nm do 450 nm w buforze TrisHCl (20 mM, pH=7,5) w obecności lub nieobecności pęcherzyków lipidowych. Małe jednowarstwowe pęcherzyki wytwarzano po rehydratacji zliofilizowanych fosfolipidów w buforze, rozproszeniu i sonikacji z użyciem końcówki w strumieniu N2. Stosowanymi lipidami były PC/Chol. z jaja (20:1) bądź POPC/Chol. (20:1). Widma mierzono przy stężeniu peptydów 2 μM w temperaturze 37°C. Standardem fluorescencyjnym w przypadku Trp był N-acetylotryptofanyloamid (NATA).

Badania wiązania lipidów przeprowadzono dodając stopniowo pęcherzyki lipidowe do roztworu peptydu o stężeniu 2 μM (szczeliny: 5 nm dla wzbudzenia i 1,5 nm dla emisji). Efekty rozcieńczenia brano pod uwagę przy określaniu intensywności fluorescencji. Stężenia lipidów wahały się od 10 do 600 μM, a stosunek molowy lipidu do peptydu (Ri) zmieniał się w zakresie od 5 do 300. Długość fali wzbudzenia ustawiano na 280 nm zarówno dla Trp, jak i Nal.

7.2.1. Analizywidmfluorescencyjnych

Wyniki zostały bezpośrednio zarejestrowane i obrabiane przez IBM-PC połączony z spektrofluorometrem, przy użyciu oprogramowania DM3000F ze Spex. Widma były korygowane poprzez odjęcie udziału rozpuszczalnika i poprzez zastosowanie współczynnika podanego przez konstruktora, uwzględniającego zróżnicowanie w odpowiedzi fotopowielacza w zależności do długości fali.

Widma fluorescencyjne peptydów charakteryzowano poprzez długość fali przy maksimum emisji fluorescencji i ich wydajność kwantową w porównaniu do NATA w przypadku peptydów wyznakowanych tryptofanem. Proces wiązania się do lipidów analizowano poprzez obliczenie przesunięcia długości fali przy maksimum emisji fluorescencji, (A_max), oraz różnic względnej intensywności emisji fluorescencji w zależności od stężenia lipidu. Względna intensywność fluorescencji jest zdefiniowana jako stosuneki (I-I₀)_Ama_X/I_0Ama_X. Zarówno I jak i I₀są mierzone w przy (A_max), co odpowiada wyjściowemu wolnemu stanowi peptydu, tj. bez lipidów. I odpowiada intensywności dla określonego stosunku lipidu do peptydu, a I0 jest tym samym parametrem mierzonym w nieobecności lipidów. Brak tych różnic oznacza brak oddziaływań peptydów z lipidami.

7.2.2. Wynikii dyskusja

Własności wiązania lipidów peptydu 199 (SEQ ID NO:199), którego sekwencja pierwszorzędowa przypomina sekwencję peptydu 210 (SEQ ID NO: 210), poza tym, że zawiera resztę W (Trp) w pozycji 10 są przedstawionewtabeliIX.

PL 193 662 B1

Zdolności wiązania peptydu 199 (SEQ IDNO: 199) do pęcherzyków lipidowych mierzone drogąfluorescencji

Tabela IX

Stosunek molowy (Ri) Lipid:Peptyd	I/I0	^Amax (^nm)
0	0	348
5	8	344
10	8	339
30	18	328
60	22
100	27	326
200	41	325

W buforze przy stężeniu 2 μm, maksimum emisji fluorescencji (A_max) dla tryptofanu w przypadku peptydu 199 (SEQ ID NO: 149) wynosi 348 nm. Odpowiada to tryptofanowi, który jest względnie wystawiony na działanie środowiska wodnego w porównaniu do NATA (Amax=350 nm). Peptyd 199 (SEQ ID NO: 199) wiąże się bardzo wydajnie z małymi jednowarstwowymi pęcherzykami EPC/Chol (20:1) jak wykazano przez chowanie tryptofanu (długość fali dla maksimum emisji fluorescencji przesuwa się z 348 nm do 325 nm) i wysoką egzaltację intensywności fluorescencji (patrz tabela IX). Chowanie reszty tryptofanowej jest maksymalne przy stosunku molowym lipidu do peptydu wynoszącym około 100. Inne peptydy, które wykazywały wysoki poziom helikalności w obecności lipidów (>60% dla peptydów niezablokowanych o długości >22 aminokwasów lub peptydów zablokowanych o długości <18 aminokwasów; >40% dla peptydów niezablokowanych o długości <18 aminokwasów), co zmierzono poprzez dichroizm kołowy, jak ujawniono w Rozdziale 7.1. powyżej, również wykazywały dobre wiązanie lipidów. Oczywiście, wśród wszystkich peptydów wybranych na podstawie dichroizmu kołowego, jedynie te, dla których można było obserwować fluorescencję, były testowane pod kątem właściwości wiązania lipidów.

7.3.Magnetycznyrezonansjądrowy(NMR)

TenprzykładopisujemetodęNMRdoanalizowaniastruktury rdzeniapeptydowegowynalazku.

7.3.1.PrzygotowaniepróbekdoNMR.

Próbki były przygotowane poprzez rozpuszczenie 5 mg peptydu w 90% H2O/10% D2O zawierającym śladowe ilości sulfonianu 2,2-dimetylo-2-sila-5-pentanowego (DSS) będącego wewnętrznym odnośnikiem. Niektóre próbki zawierały trifluoroetanol (TFE) (wyrażony jako % obj.). Całkowita objętość próbki wynosiła 500 μ( a stężenie peptydu wynosiło około 5 mM. Niektóre z próbek zawierały trifluoroetanol (TFE) (wyrażany w % v). Całkowita objętość próbki wynosiła 500 μL stężenie peptydów wynosiło około 5 mM.

7.3.2.SpektroskopiaNMR

Widma protonu wjądrowym rezonansie magnetycznym zostały osiągnięte przy 550 MHZ spektrometrem Bruker DRX500 wyposażonym w urządzenie do kontroli temperatury B-VT2000. Jedno i dwuwymiarowe pomiary zostały zapisane z użyciem standardowej sekwencji pulsów. (Two Dimensional NMR Spectroscopy, Eds. W.R. Croasmun and RMK Carlson, 1994 VCH Publishers, New York,USA).

Maskowanie wody zostało uzyskane przez 2s przy niedosycie niskiej mocy. Eksperymenty dwuwymiarowe przeprowadzono w trybie fazoczułym, stosując inkrementacje fazy proporcjonalną do czasu (TPPI) oraz szerokość widmową 6000 Hz w obydwu wymiarach. Zazwyczaj sumowano 40 skanów dla każdego z 400 inkrementów t1, zawierających po 2048 punktów danych. Dane zostały obrobione przy pomocy oprogramowania FELIX95 (Molecular Simulations) nastacji roboczej INDIGO2 (Silikon graphics). Dane zostały wyzerowane aby otrzymać macierz 2Kx2K, a następnie apodyzowane przez przesuniętąo45°kwadratowąfunkcjęsinus-dzwonowy.

7.3.3.OznaczeniaNMR

Pełne przypisanie rezonansu protonowego zostało dokonane przez zastosowanie techniki przypisania sekwencyjnego przy użyciu widm DQFCOSY, TOCSY i NOESY opisanych w literaturze fachowej (Wuthrich, NMR of proteins and Nucleic Acids,1986, John Wiley & Sons, New York, USA). Drugorzędowe przesunięcia chemiczne zostały obliczone dla protonów HN oraz Ηα przez odjęcie przesunięć losowych spiral (Wishart and Sykes,1994, Method. Enz. 239: 363-392) od odpowiednich wartości doświadczalnych.

PL 193 662 B1

7.3.4.Wynikiiidyskusja

Ogólne rozważania. Amfipatyczne peptydy helikalne zmierzają do gromadzenia się w roztworach wodnych w wysokich stężeniach koniecznych dla spektroskopi magnetycznego rezonansu jądrowego, powodując trudności w otrzymaniu widma o wysokiej rozdzielczości. TFE jest znany ze zdolności rozpuszczania peptydów oraz dodatkowo ze stabilizacji helikalnej konformacji peptydów posiadających skłonności do helikalizacji. Wyniki uzyskano przy pomocy spektroskopimagnetycznego rezonansu jądrowego dla peptydu 210 (SEQ ID NO: 210) jako charakterystycznego przykładu i 22-meru o największej zgodności Segrest (SEQ ID NO:75) był analizowany dla porównania.

Drugorzędoweprzesunięciachemiczne.

Przesunięciachemiczneprotonóww aminokwasachzależązarówno od typu reszty, jak i lokalnej struktury drugorzędowej w obrębie peptydu lub białka (Szlagyi, 1995, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 27: 325-443). A zatem możliwa jest identyfikacja regularnej struktury drugorzędowej poprzez porównanie przesunięć eksperymentalnych ze stabularyzowanymi wartościami dla konformacji kłębka statystycznego. Tworzenie α-heliksy zwykle powoduje ujemne przesunięcie dla rezonansu Hα.

Obserwacja przesunięcia Hα dla sekwencji reszt zwykle świadczy o strukturze helikalnej.

Drugorzędowe przesunięcie Hα dla peptydu 210 (SEQ ID NO: 210) przy 25% TFE w 294 K wykazujeznacząceprzesunięciedla resztod4do15,wskazującnawysocehelikalnąkonformację.

Małe różnice są obserwowane w chemicznym przesunięciu Hα wysoce zgodnego 22-meru (SEQ ID NO:75)w porównaniu do peptydu 210 (SEQ ID NO:210).

Przesunięcia chemiczne wodorów amidowych reszt aminokwasowych występują w regionach α-helikalnych, są także przesunięte zgodnie z przesunięciami chemicznymi obserwowanymi dla spirali losowej. Dodatkowo obserwowana jest okresowość przesunięć HN co odzwierciedla okres skrętu helikalnego. Amplituda zmian przesunięć wzdłuż sekwencji jest związana z amfipatycznością helikalnego peptydu. Wyższy moment hydrofobowy prowadzi do bardziej wyraźnych oscylacji (Zhou iwsp.,1992, J. Am. Chem. Soc. 1 14: 4320-4326). Przesunięcie drugorzędowe HN peptydu 210 (SEQ ID NO: 210) w 25% TFE przy 295 K ukazuje zachowanie oscylacyjne zgodne z amfipatyczną naturą helisy.

Przemieszczenia aminokwasów prowadzą do uwypuklonej okresowości wzdłuż całej sekwencji. Ten obraz jaśniej odzwierciedla silniejsząnaturęamfipatycznąpeptydu210(SEQID NO: 210) wporównaniu do 22-merowego peptydu o wysokiej zgodności Segresta (SEQ ID NO: 75). Można wyodrębnićobecność4-5obrotów helikalnych.Drugorzędoweprzesunięcieprotonuamidowegojest powodowanedługościąwiązaniawodorowegozwiązanegoztlenem węglajedenobrótpozaheliksem.Dlatego okresowość obserwowanego przesunięcia chemicznego odzwierciedla różnice długości wiązań wodorowych.Taróżnicazwiązanajestcałkowiciezakrzywionymhelikalnymkształtemszkieletuhelisy. Reszty hydrofobowe umieszczone są po stronie wypukłej. Drugorzędowe przesunięcia peptydu 210 (SEQ ID NO: 210) wskazują na ułożenie α-helikalne.

8. P r z y kł a d: farmakokinetyka agonistów ApoA-I

Można zastosować następujące przykłady do pokazania, że agoniści ApoA-I są stabilni wkrążeniu i wiążą się ze składnikami surowicy.

8.1.Syntezaznakowanychradioaktywniepeptydów.

Wyznakowane radioaktywnie peptydy syntetyzuje się poprzez przyłączenie wyznakowanego ¹⁴C-aminokwasu jako aminokwasu N-końcowego. Syntezę przeprowadza się według Lapatsanis, Synthesis, 1983, 671-173. Pokrótce, 250 μΜ niewyznakowanego N-końcowego aminokwasu rozpuszcza się w 225 μl roztworu 9% Na₂CO₃ i dodaje się do roztworu (9% Na₂CO₃) z 9,25 mBq (250 μΜ) wyznako14 wanego C N-końcowego aminokwasu. Mieszanina jest chłodzona do 0°C, mieszana z 600 μl (202 mg) 9-fluoroenylometylo-N-sukcynimidylowęglanu (Fmoc-OSu) w 0,75 ml DMF i wytrącana wtemperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę ekstrahuje się dietyloeterem (2x 5 ml)i chloroformem (1x 5 ml), a pozostałą fazę wodną zakwasza się 30% HCl i ekstrahuje chloroformem (5x 8 ml). Fazę organiczną suszy się nad Na2SO4, odfiltrowuje i objętość zmniejsza pod strumieniem azotu do 5 ml. Czystość określa się poprzez TLC (CHCL3:MeOH:Hac, 9:1:0,1 v/v/v. stacjonarna faza RPTLC żelu krzemionkowego 60, Merck, Niemcy).

8.2. Farmakokinetyka u myszy

W każdym eksperymencie, 2,5 mg/kg znakowanego radioaktywnie peptydu jest wstrzykiwane dootrzewnowo myszom, które są karmione normalnym mysim pokarmem lub miażdżycogenną zmodyfikowaną karmą Thomas-Harcrofta (prowadzącą w rezultacie do poważnie zwiększonego poziomu

PL 193 662 B1 cholesterolu VLVL i IDL). Próbki krwi pobiera się w punktach czasowych celem oznaczenia radioaktywności w osoczu.

8.3. Stabilność w ludzkiej surowicy

Stabilność agonistów ApoA-I wynalazku w surowicy przedstawiono jak poniżej.

8.3.1. Metodyeksperymentalne

100 μl peptydu wyznakowanego C (otrzymanego jak opisano w Rozdziale 9.1, powyżej) miesza się z 2 ml świeżego osocza ludzkiego (w 37°C) i odtłuszcza bądź bezpośrednio (próbka kontrolna), bądź po 8 dniach inkubacji w 37°C (próbka testowa). Odtłuszczanie przeprowadza się poprzez ekstrakcję tłuszczów równą objętością mieszaniny chloroform:metanol 2:1 (v/v).

Próbki nakłada się na kolumnę HPLC C18 z odwróconymi fazami i wymywa liniowym gradientem (25-58% przez 33 min.) acetonitrylu (zawierającego 0,1% TFA). Profile elucji śledzi się poprzez pomiar absorpcji (220 nm) i radioaktywności.

8.4. Tworzenie się cząstek typu pre-β.

Zdolność agonistów ApoA-I według wynalazku do tworzenia cząstek pre-β określa się tak, jak opisano poniżej.

8.4.1. Metodaeksperymentalna

Ludzki HLD izoluje się poprzez ultrawirowanie w gradiencie gęstości KBr przy gęstości d= 1,21g/ml w celu otrzymania górnej frakcji, a następnie sączenie molekularne na Superose 6 w celu oddzielenia HLD od innych lipoprotein. Izolowany HLD doprowadza się do końcowego stężenia 1,0 mg/ml roztworem soli fizjologicznej w oparciu o zawartość białek oznaczoną metodą Bradforda. Z preparatu wyizo14 lowanego HDL pobiera się próbkę 300 μl i inkubuje ze 100 μl wyznakowanego C peptydu przez 2 godziny w 37°C. Analizuje się pięć odrębnych inkubacji, włączając w to ślepą próbę zawierającą 100 μl soli fizjologicznej i cztery rozcieńczenia peptydu wyznakowanego C: (i) 0,20 μg/μl peptyd:HDL, stosunek 1:15; (ii) 0,30 μg/μl peptyd:HDL, stosunek 1:10; (iii) 0,60 μg/μl peptyd:HDL, stosunek 1:5; oraz (iv) 1,00 μg/μl peptyd:HDL, stosunek 1:3. Po dwóch godzinach inkubacji 200 μl porcje próbek (całkowita objętość=400 μθ nakłada się na kolumnę do sączenia molekularnego Superose 6 w celu oddzielenia i analizy lipoproteiny, a 100 μl używa się do określenia całkowitej radioaktywności nałożonej na kolumnę.

8.5PołączenieagonistówApoA-Izludzkimilipoproteidami

8.5.1. Metodyeksperymentalne

Zdolność agonistów ApoA-I według wynalazku do łączenia się z frakcją ludzkich lipoprotein określa się poprzez inkubację peptydu wyznakowanego ¹⁴C z każdą klasą lipoproteiny (HDL, LDL i VLDL) i mieszaniną rożnych klas lipoprotein.

HDL, LDL i VLDL izoluje się poprzez ultrawirowanie w gradiencie gęstości KBr przy gęstości d=1,21 g/ml i oczyszcza poprzez FPLC na kolumnie ze złożem do sączenia molekularnego Superose 6 (chromatografię przeprowadza się przy szybkości przepływu 0,7 ml/min, w buforze 10 mM Tris (pH 8), 115 mM NaCl, 2 mM EDTA i 0,01% NaN3). Peptyd wyznakowany ¹⁴C inkubuje się z HDL:LDL:VLDL przy stosunku peptyd:fosfolipid 1:5 (stosunek mas) przez dwie godz. w 37°C. Wymagana ilość lipoprotein (objętości oparte o ilość niezbędną dla uzyskania wydajności 1000 μg) miesza się z 0,32 ml wyjściowego roztworu peptydu (1 mg/ml) i roztwór doprowadza się do 2,2 ml przy zastosowaniu 0,9%NaCl.

Po inkubacji przez 2 godziny w 37°C, próbki (0,1 ml) mierzy się w ciekłym scyntylatorze w celu określenia całkowitej radioaktywności, gęstość pozostałej mieszaniny inkubacyjnej doprowadza się do 1,21 g/ml KBr i próbki zwirowywuje się przy 100000 rpm (300000 g) przez 24 godziny w 4°C w rotorze TLA 100.3 przy zastosowaniu ultrawirówki stołowej Beckman. Otrzymany supernatant frakcjonuje się, pobierając 5 frakcji po 0,3 ml próbki od góry każdej próbki i 0,05 ml każdej frakcji używa się do zliczeń w płynnym scyntylatorze. Górne dwie frakcje zawierają unoszące się lipoproteiny, inne frakcje (3-5) odpowiadają białkom/peptydom w roztworze.

8.6AgoniściApoA-IwedługwynalazkuselektywniewiążąlipidyHDLwludzkimosoczu

8.6.1. Metodyeksperymentalne.

W celu wykazania, że agoniści ApoA-I według wynalazku selektywnie wiążą białka HDL w ludz14 kim osoczu, 2 ml ludzkiego osocza inkubuje się z 20, 40, 60, 80 i 100 μg wyznakowanego C peptydu przez 2 godz. w 37°C. Lipoproteiny wydziela się poprzez doprowadzenie do gęstości 1,21 g/ml i wirowanie w rotorze TLA 100.3 C przy 100000 rpm (300000 g) przez 36 godz. w 4°. Górne 900 μl (jako frakcje po 300 μθ pobiera się do analizy. W 50 μl z każdej 300 μl frakcji zlicza się radioaktywność i 200 μl z każdej frakcji analizuje się poprzez FPLC (kombinacja kolumn Superose 6/Superose 12).

PL 193 662 B1

9. P r z y k ł a d. Agoniści ApoA-I sprzyjają wypływowi cholesterolu

Aby pokazać, że agoniści ApoA-I wynalazku sprzyjają wypływowi cholesterolu komórki hepatomy HepG są nanoszone na 6-dołkowe płytki do hodowli i hodowane do osiągnięcia konfluencji. Komórki znakuje się ³H-cholesterolem poprzez wysuszenie cholesterolu, a następnie dodanie 1% albuminy z surowicy wołu (BSA) w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS), sonikowanie roztworu i dodanie 0,2 ml takiego wyznakowanego roztworu i 1,8 ml pożywki hodowlanej do komórek tak, że każda studzienka zawiera 2 μφ radioaktywności. Komórki inkubuje się przez 24 godziny z pożywką do znakowania. Peptyd (lub białko):kompleksy DMPC są przygotowywane w stosunku peptyd (lub białko):DMPC 1:2 (w:w). Aby przygotować kompleksy, peptyd lub natywne ludzkie białko ApoA-I jest dodawane do roztworu DMPC w PBS i inkubowane w temperaturze pokojowej przez noc, po tym czasie roztwór staje się przejrzysty. Stężenie białka lub peptydu w roztworze końcowym wynosi około 1 mg/ml.

Przed dodaniem kompleksów podłoże znakujące jest usuwane znad komórek i i komórki przemywa się PBS przed dodaniem kompleksów. Do każdej studzienki dodaje się 1,6 ml pożywki wzrostowej, a następnie kompleks peptyd (lub białko):DMPC i odpowiednią ilość PBS, aby doprowadzić do końcowej objętości 2 ml na studzienkę. Końcowe stężenie peptydu lub ApoA-I wynosi około 1, 2,5, 5, 7,5 i 25 μg/ml pożywki. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C, pożywkę usuwa się, komórki przemywa 2 ml 1% BSA/PBS, a następnie dwukrotnie przemywa się 2 ml PBS. Ilość ³H-cholesterolu wypływającego do pożywki określa się poprzez zliczenia w liczniku scyntylacyjnym.

0. P r z y k ł a d: Zastosowanie agonistów ApoA-I w zwierzęcych systemach modelowych.

Skuteczność agonistów ApoA-I wynalazku została zademonstrowana na królikach. Wyniki pokazują, że podawanie agonistów ApoA-I zwiększa stężenie cząsteczek przypominających HDL w surowicy.

10.1. Przygotowanie kompleksów fosfolipid/peptyd

Małe diskoidalne cząstki składające sięz fosfolipidów (DPPC)i peptydu 146 (SEQ ID NO: 146) zostały przygotowane według następującej metody dializy cholanowej. Fosfolipid rozpuszczano w chloroformie i suszono w strumieniu azotu. Peptyd rozpuszczano w buforze (roztwór soli) w stężeniu 1-2 mg/ml. Film lipidowy rozpuszczano ponownie w buforze zawierającym cholan (43°C) i dodawano roztwór peptydu w stosunku fosfolipid/peptyd 1-3. Mieszaninę inkubowano przez noc w 43°C, a następnie dializowano w 43°C (24 godz.), temperaturze pokojowej (24 godz.) i 4°C (24 godz.) z trzema zmianami buforu (duże objętości) w temperaturze pokojowej. Kompleksy do zastrzyków sterylizowano poprzez filtrowanie (0,22 μ) i przechowywano w 4°C.

10.2.Izolacjai charakteryzacja cząsteczek peptydowo/fosfolipidowych.

Cząstki były rozdzielane na kolumnie do sączenia molekularnego, (Superose 6 HR). Pozycja piku zawierającego cząstki była identyfikowana poprzez pomiar stężenia fosfolipidów w każdej frakcji. Na podstawie objętości po elucji, można określić promień Stokesa. Stężenie peptydu w kompleksie określono poprzez oznaczenie zawartości fenyloalaniny (poprzez HPLC), a następnie przeprowadzono16godz.kwaśnąhydrolizę.

10.3. Zastrzykinakrólikach

Samcom królików New Zealand (2,5-3 kg) wstrzykiwano dożylnie dawkę kompleksu fosfolipidowo/białkowego (8 mg/kg masy ciała peptydu 146 (SEQ ID NO: 146) lub 10 mg/kg masy ciała ApoA-I (wyrażanych jako zawartość peptydu lub białka) w pojedynczym, jednorazowym zastrzyku nie przekraczającym 10-15 ml. Przed zabiegami zwierzęta były lekko uspokajane. Próbki krwi (zebrane na EDTA) były pobierane przed i 5, 15, 30, 60, 240 oraz 1440 minut po zastrzyku. Hematokryt (Hct) był określonydlakażdejpróbki.Próbkibyłyporcjowanei przechowywane w -20°C przed analizą.

10.4. Analizasurowicykrólika

Lipidy surowicy. Całkowity cholesterol i trójglicerydy surowicy były oznaczane enzymatycznie stosując komercyjnie dostępne testy zgodnie z protokółami producenta (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany and Biomerieux, 69280, Marcy-l'Etoile, France).

Profile lipoproteinowe. Profile lipoproteiny osocza dla frakcji otrzymanych po rozdzieleniu osocza na frakcje lipoproteinowe określano poprzez odwirowanie w gradiencie sacharozy. Frakcje zbierano i w każdej z frakcji zmierzono enzymatycznie zawartość fosfolipidu i cholesterolu.

10.5. Wyniki

Profil lipoproteinowy dla królików, którym wstrzykiwano 8 mg/kg peptydu 146 (SEQIDNO: 146) (w postaci kompleksów peptyd/DPPC) wykazano jako funkcję czasu. Znaczący wzrost cholesterolu we frakcjach cholesterolu HLD (frakcje >1,06 mg/ml) jest widoczny po 5 minutach po wstrzyknięciu i trwa przez około 24 godziny. Cholesterol z połączonych frakcji HDL otrzymanych przez ultrawirowanie

PL 193 662 B1 w gradiencie gęstości jest przedstawiony w tabeli X, poniżej. Największy wzrost cholesterolu HDL (90%) następowało 240 min po podaniu. W 24 h po podaniu, wzrost wciąż wynosił 71,2%. Te wyniki wskazują, że podanie kompleksów peptydu 146/DPPC (8 mg/kg) indukuje szybką i skuteczną mobilizację peryferyjnego peptydu.

Tabel a X

Cholesterol HDL w królikach po podaniu 8 mg/kg 146 (SEQ ID NO: 146) lub 10 mg/kg natywnej ApoA-I

Czas (min.)	Wzrost cholesterolu HDL (%) Natywny ApoAI	Wzrost cholesterolu HDL (%) Peptyd 146
5	19,3	31,3
15	16,0	60,4
60	15,8	42,9
240	-24,1	90,2
1440	_*	71,2

^* zwierzę zmarło przed osiągnięciem punktu

1 . P r z y k ł a d: Przygotowanie kompleksów peptydo-lipidowych drogą koliofilizacji.

Zastosowano następujący protokół do przygotowania kompleksów peptydowo-lipidowych. Jeden mg peptydu 149 (PVLELFENLWERLLDALQKKLK; SEQ ID NO: 149) był rozpuszczany w 250 pi metanolu czystości HPLC (Perkin Elmer) w jednomililitrowej przezroczystej probówce szkalnej z nakrętką (Waters #WAT025054). Rozpuszczanie peptydu było ułatwione poprzez okresowe wytrząsanie przez okres 10 minut w temperaturze pokojowej. Do tej mieszaniny dodawano 3 mg dipalmitoilo-fosfatidylocholiny (DPPC; Avanti Polar Lipids, 99% czystości, produkt numer 850355) z 100 mg/ml wyjściowego roztworu w metanolu. Objętość mieszaniny była doprowadzana do 400 μl poprzez dodanie metanolu, mieszanina była dalej wytrząsana sporadycznie przez okres 10 minut w temperaturze pokojowej. Do probówki dodawano 200 μl ksylenu (Sigma-Aldrich 99% czystości, do HPLC) i probówki wytrząsano na worteksie przez 10 sekund. W wieczku probówki wykonano dwa małe dziurki igłą do strzykawki kaliber 20, probówkę zamrażano przez 15 sekund w ciekłym azocie i liofilizowano przez noc pod próżnią. Do probówki dodawano 200 ml 0,9% roztworu NaCl. Probówka była wytrząsana przez 20 sekund. Po tym czasie roztwór w probówce miał mleczne zabarwienie. Probówka była następnie inkubowana w łaźni wodnej przez 30 minut w 41°C. Roztwór stawał się przezroczysty (tj. przypominający w wyglądzie wodę) po kilku minutach inkubacji w 41°C.

11.1.CharakteryzacjakompleksówprzezsączeniemolekularnenaSuperose6.

Kompleksy peptydowo-fosfolipidowe zawierające peptyd 149 (SEQ ID NO: 149) były przygotowywane przez koliofilizację jak opisano powyżej. Preparat zawierał wagowo 1 mg peptydu i 3 mg DPPC. Po zawieszeniu kompleksów w 200 μl 0,9% NaCl, 20 μl (zawierających 100 μg peptydu 149) kompleksów nakładano na kolumnę Pharmacia Superose 6 przy zastosowaniu 0,9% NaCl jako fazy ciekłej przy szybkości przepływu 0,5 ml/min. Chromatografię śledzono poprzez pomiar absorpcji lub rozpraszania światła o długości fali 280 nm. Zbierano 1 ml porcje. Porcje zawierające 20 μl były testowane na zawartość fosfolipidów stosując zestaw bioMerieux Phospholipides Enzymatique PAP 150 (#61491) według instrukcji dostarczonych przez wytwórcę. Większość zarówno fosfolipidów, jak i absorpcji UV, odzyskiwano razem w kilku frakcjach z pikami przy około 15,8 ml. Ta objętość przesączu opowiadaśrednicyStokesa87angstremów.

Dla porównania, oddzielny chromatogram 20 μl ludzkiego HDL₂, był rozwijany w tych samych warunkach i stosując tę samą kolumnę jak dla kompleksów peptydu 149. HDL2 przygotowano jak następuje: 300 ml zamrożonego ludzkiego osocza (Mannheim Blutspendzentrale #1185190) rozmrożono, doprowadzono do gęstości 1,25 stałym bromkiem potasowym i wirowano przez 45 godzin przy 40000 rpm używając rotora Ti45 (Beckman) w 20°C. Unoszącą się warstwę zebrano, dializowano wobec wody destylowanej, doprowadzano do gęstości 1,07 stałym bromkiem potasu i wirowano tak, jak opisano powyżej przez 70 godzin. Spodnią warstwę (na poziomie około 1 cm powyżej dna probówki) zbierano, doprowadzono do stężenia 1,01% azydku sodu i przechowywano w 4°C przez 4 dni do czasu wykonania chromatografii. Wypływ z kolumny śledzono poprzez pomiar absorpcji lub rozpraszanie światła o długości fali 254 nm. Serie białek o znanych ciężarach cząsteczkowych i średnicy Stokesa zastosowano jako standardy do kalibracji kolumny w celu obliczenia średnicy Stokesa cząstek (Pharmacia Gel Filtration Calibration Kit Instruction Manual, Pharmacia Laboratory Separation, Piscataway,

PL 193 662 B1

NJ, skorygowano kwiecień, 1985). HDL2 wymywany przy objętości retencji 14,8 ml odpowiada średnicy Stokesa 108 nm.

Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony zakresem specyficznych, opisanych tutaj przykładów. W rzeczywistości, różne modyfikacje wynalazku w dodatku do tych opisywanych tutaj staną się widocznymi dla fachowców w powyższych opisach i towarzyszących rysunkach. Takie modyfikacje mają na celu znajdować się w obrębie załączonych zastrzeżeń.

Wszystkie cytowane tu odnośniki literaturowe są dołączone jako odniesienie dla wszelkich celów.

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY: Dasseux, Jean-Louis Sekul, Renate Buttner, Klaus Cornut, Isabelle Metz, Gunther Dufourcq, Jean (ii) TYTUŁ: TERAPIA GENOWA DOSTARCZAJĄCA AGONISTÓW

APOLIPOPROTEINY A-l ORAZ ICH ZASTOSOWANIE W LECZENIU CHORÓB DYSLIPIDEMICZNYCH.

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 270 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Pennie & Edmonds LLP (B) ULICA: 1155 Avenue of the Americas (C) MIASTO: New York (D) STAN: NY (E) KRAJ: USA (F) KOD: 10036-2811 (v) FORMA ODCZYTU W KOMPUTERZE:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: DOS (D) OPROGRAMOWANIE: FastSEQ Version 2.0 (vi) DANE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/940,136
(B) (C)	DATA WYPEŁNIENIA: KLASYFIKACJA:	29-SEP-1997
(vii)	DANE POPRZEDNIEGO	ZGŁOSZENIA:
(A)	NUMER ZGŁOSZENIA:
(B)	DATA WYPEŁNIENIA:

(vi i i)INFORMACJE PEŁNOMOCNIKA/AGENTA:

(A) NAZWISKO: Coruzzi, Laura A (B) NUMER REJESTRACJI :30,742 (C) REFERENCJE/DOCKET NUMBER: 009196-0007-999 (XX) TELEFONICZNA INFORMACJA:

(A) TELEFON:650-493-4935 (B) TELEFAX:650-493-5556 (C) TELEX: 66141 PENNIE (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:l (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

PL 193 662 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: inna

CB) UMIEJSCOWIENIE: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina

		(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ	ID N0:l:
Pro	Val	Leu	Asp	Leu Phe Arg	Glu	Leu Leu Asn Glu Leu	Leu Glu Xaa
1				5		10	15
Leu	Lys	Gin	Lys	Leu Lys

(2) INFORMACJE O SEQ ID NO: 2:

[i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:2:

Glu Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

		(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	brak
		(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID NO 3:
Pro 1	Val	Leu	Asp	Leu Phe Arg 5	Glu Leu Leu Asn Glu 10	Leu Leu Glu Trp 15
Leu	Lys	Gin	Lys 20	Leu Lys
			(2)	INFORMACJA O	SEKWENCJI ID NO:4 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: S£Q ID NO:4:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

PL 193 662 B1 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:5:

Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Aib (xi) OPIS SEKWENCJI ID NO:6:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 ¹⁵

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI	ID NO:7
Pro	Val Leu	Asp Leu Phe Lys	Glu Leu	Leu Asn Glu Leu Leu	Glu Ala
1		5		10	15
Leu	Lys Gin	Lys Leu Lys

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:8 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 193 662 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:8:

Pro Vai Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala

10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak .

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:9:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Asn Glu Leu Leu Glu Ala

10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 17 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: ID NO:10:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:ll:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

		(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	brak
		(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID N0:ll:
Pro 1	Val	Leu	Asp	Leu Phe Lys 5	Glu Leu Leu Gin 10	Glu Leu Leu Glu Ala 15
Leu	Lys	Gin	Lys 20	Leu Lys
			(2)	INFORMACJA 0	SEKWENCJI ID NO	:12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI

PL 193 662 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:12:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Gly Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:13:

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 18 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn

	(xi) OPIS SEKWENCJI:	SEQ	ID N0:14:
Pro	val	Leu	Asp Leu Phe Arg	Glu	Leu Leu Asn Glu	Leu Leu Glu Ala
1			5		10	15
Leu	Xaa	Gin	Xaa Leu Xaa

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:15 (i)CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 193 662 B1 (B) TYP: aminokwasowy

CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

		(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	brak
		(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID N0:15:
Pro	Val	Leu	Asp	Leu Phe Arg	Glu Leu Trp Asn Glu Leu	Leu Glu Ala
1				5	10	15
Leu	Lys	Gin	Lys	Leu Lys
			20
			(2)	INFORMACJA 0	SEKWENCJI ID NO:16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

		(ii)	TYP	CZĄSTECZKI: brak
		(xi)	OPIS	SEKWENCJI: SEQ ID	N0:16:
Pro 1	Val	Leu	Asp	Leu Leu Arg Glu Leu 5	Leu Asn Glu 10	Leu Leu Glu Ala 15
Leu	Lys	Gin	Lys 20	Leu Lys

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:17 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

		(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	brak
		(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID NO:17:
Pro	Val	Leu	Glu	Leu Phe Lys	Glu Leu Leu Gin Glu	Leu Leu Glu Ala
1				5	10	15
Leu	Lys	Gin	Lys	Leu Lys
			20
			(2)	INFORMACJA O	SEKWENCJI ID NO:18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:18:

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Giu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 193 662 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:19:

Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:20:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 <D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (xx) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:21:

Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:22 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

PL 193 662 B1

			(C)	NICIOWOŚĆ:	pojedyncza
			(D)	TOPOLOGIA:	liniowa
		(ii)	TYP	CZĄSTECZKI	: brak
		(xi)	OPIS SEKWENCJI	: SEQ ID NO:22:
Pro	Val	Leu	Asp	Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn	Glu Leu Leu Glu Gly
1				5	10	15
Leu	Lys	Gin	Lys	Leu Lys

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

. (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:23:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala

I	5	10	15
Leu Lys Gin Lys	Leu Lys
20

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

			(A)	DŁUGOŚĆ: 22	aminokwasy
			(B)	TYP: aminokwasowy
			(C)	NICIOWOŚĆ:	pojedyncza
			(D)	TOPOLOGIA:	liniowa
		(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	: brak
		(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO:24:
Pro	Val	Leu	Asp	Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu	Glu Ala
1				5	10	15
Leu	Gin	Lys	Lys	Leu Lys
			20
				(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:25:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20

PL 193 662 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:26:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Naftyloalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:27:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:28:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJĄ O SEKWENCJI ID NO:29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak

PL 193 662 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:29:

Ala Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala

10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo dansylowany peptyd (i) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:30:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:31:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Leu Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1

CD) INNE INFORMACJE: Xaa - Aib

PL 193 662 B1

	<xi)	opi:	3 SEKWENCJI: SEQ	ID NO:32:
Xaa	Val	Leu	Asp	Leu Phe Arg Glu	Leu Leu Asn Glu	Leu Leu Glu Ala
1				5	10	15
Leu	Lys	Gin	Lys	Leu Lys
			20
			(2)	INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:33:

	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	brak
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID NO:33:
Pro	Val Leu	Asp Leu Phe Arg	Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala
1		5	10 15
Leu	Lys Gin	Lys Leu Lys

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

[ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 5 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina

	(xi) OPIS	3 SEKWENCJI: SEQ ID NO:34:
Pro 1	Val	Leu	Asp	Xaa Phe Arg Glu Leu Leu Asn 5 10	Glu Leu Leu Glu Ala 15
Leu	Lys	Gin	Lys 20	Leu Lys
			(2)	INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO	: 35 :

		(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	brak
		(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID NO:35:
Pro 1	Val	Leu	Asp	Trp Phe Arg 5	Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu 10	Glu Ala 15
Leu	Lys	Gin	Lys 20	Leu Lys
			(2)	INFORMACJA 0	SEKWENCJI ID NO:36:
		(i)	CHARAKTERYSTYKA	SEKWENCJI:

PL 193 662 B1

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy
	(C) NICIOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA:	pojedyncza liniowa
(ii) (ix)	TYP CZĄSTECZKI: CECHY:	; brak
(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID NO: 36

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala

1	5	10
Leu Lys Gin Lys	Leu Lys
20
(2)	INFORMACJA O	SEKWENCJI ID NO:37

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:37:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:38:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy .

(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:38:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Trp Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:39:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:39:

PL 193 662 B1

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Lys Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:40:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa {ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:40:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Asn Glu Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:41:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa =Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:41

Pro 1	Val	Leu	Asp Leu Trp Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa	Leu Glu Ala 15
5	10
Leu	Lys	Gin	Lys	Leu	Lys
			20

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:42:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:42:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Trp Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20

PL 193 662 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI 10 NO:43:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:43:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:44:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: wszystkie genetycznie odkodowane aminokwasy są w konfiguracji D (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:44:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) <B) (D)	NAZWA/KLUCZ: inna UMIEJSCOWIENIE: 13
INNE INFORMACJE	: Xaa = Aib
(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID N0:45

PL 193 662 B1

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:46:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (XX) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:46:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:47:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:47:

Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala Leu 1 5 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:48:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 2 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Val (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:48:

Xaa Xaa Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

PL 193 662 B1

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:49:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:49:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:50:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna ' (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:50:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:51:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (iii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:51:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Trp Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala

10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

PL 193 662 B1 {2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:52:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:52:

Pro Val Trp Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:53:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:53:

Val Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:54:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:54:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Trp Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:55:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:55:

PL 193 662 B1

Pro Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin 15 10 15

Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:56:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:56:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Lys Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:57:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa .

(ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:57:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:58:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:58:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:59:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

PL 193 662 B1

CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:59:

Leu Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala ¹ 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:60:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:60:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:61:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:61:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Trp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:62:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:62:

PL 193 662 B1

Pro Val Leu Asp Glu Trp Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:63:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:63:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:64:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:64:

Pro Trp Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:65:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 12 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib

PL 193 662 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:65:

Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:66:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

- (D) TOPOLOGIA: liniowa . (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:66:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:67:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:67:

Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:68:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:68

Pro	Val	Leu	Asp	Glu	Phe Arg Glu	Leu Leu Lys	Glu Xaa Leu Glu Ala
1 Leu	Lys	Gin	Lys 20	5 Leu	Lys	10	15

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:69 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 193 662 B1 (B) TYP: aminokwasowy {C} NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:69:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Lys Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:70:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:70:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Tyr Glu Xaa Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:71:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:72:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 193 662 B1 (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak , (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:72:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:73:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza <D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:73:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Trp Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:74:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:74:

Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:75:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 193 662 B1 (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:75:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:76:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:76:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Phe Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:77:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:77:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Lys Xaa Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:78:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 193 662 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:78:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Asp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:79:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:79:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:80:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:80:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:81:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:81:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20

PL 193 662 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:82:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 11 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:82:

Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:83:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa ' (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:83:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Trp Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:84:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:84:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:85:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

PL 193 662 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:85

Pro Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu	Leu Leu Glu Ala Leu 15
1	5	10
Lys Gin Lys Leu	Lys
20

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:86:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:86:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asp Glu Leu Leu Asn Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:87:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ; 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: Wszystkie aminokwasy są w konfiguracji D (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:87:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:88:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib

PL 193 662 B1 <xi> OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:88:

Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:89:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:89:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:90:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 10 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:90:

Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys Gin 15 10 15

Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:91:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

CC) NICIOWOŚĆ: poj edyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib

PL 193 662 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:91:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:92:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak {ix} CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:92:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Tyr Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:93:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:93:

Pro Val· Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:94:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:94:

PL 193 662 B1

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Ala Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:95:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:95:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:96: ' (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: wszystkie genetycznie kodowane aminokwasy są w konfiguracji D (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:96:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:97:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa · (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:97:

PL 193 662 B1

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu 1 5 10 15 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:98:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:98:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:99:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:99:

Lys Leu Lys Gin Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg 1 5 10 15

Phe Leu Asp Leu Val Pro 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:100:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: wszystkie aminokwasy są w konfiguracji D (XX) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:100:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:101:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

PL 193 662 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:101:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:102:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:102:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Glu Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:103:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:103:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:104:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:104:

PL 193 662 B1

Pro Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin Lys Leu Lys 1 5 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:105:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ IU NO:105:

Pro Ala Ala Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Glu Ala 15 10 15

Ala Lys Gin Lys Ala Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:106:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:106:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:107:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: wszystkie aminokwasy są w konfiguracji D (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:107:

Lys Leu Lys Gin Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg 15 10 15

Phe Leu Asp Leu Val Pro 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:108:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

PL 193 662 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii} TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:108:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Trp Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:109:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:109:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:110:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Aib (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI; SEQ ID NO:110:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Xaa Glu Ala

5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:111:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

100

PL 193 662 B1 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:111:

Pro Val· Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Trp Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:112:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

JA) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza iD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:112:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Ser Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:113:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:113:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys	Leu Asn Glu Pro Leu Glu Ala
1				5		10	15
Leu	Lys	Gin	Lys	Leu	Lys
			20

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:114 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13

PL 193 662 B1

101

CD) INNE INFORMACJE: Xaa - Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:114:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Met Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:115:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:115:

Pro Lys Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:116:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:116:

Pro His Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:117:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

102

PL 193 662 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:117:

Pro Glu Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:118:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza .

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:118: '

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:119:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 17

CD) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:119:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:120:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 193 662 B1

103 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:120:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Xaa 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:121:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:121:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Trp Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA ENCJI ID N0:122:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:122:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:123:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:123:

Gin Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20

104

PL 193 662 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:124:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (□) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 18 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:124: ·

Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:125:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:125:

Asn Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:126:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:126:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Gly Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20

PL 193 662 B1

105 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:127:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:127:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:128:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:128:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Phe 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:129:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B> TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:129:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:130:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:130:

106

PL 193 662 B1

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:131:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:131:

Pro Vai Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Arg Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:132:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:132:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:133:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:133:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Gin Ala 1 5 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:134:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

PL 193 662 B1

107 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:134:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Asn Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:135:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:135:

Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Giu Leu Leu Glu Ala

5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:136:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:136:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala
1	5	10	15
Leu Lys Gin	Lys Leu	Lys
	20

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:137:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza {□) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 17 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina

108

PL 193 662 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:137:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:138:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (XX) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 138:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:139 (ii CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:139:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Gly Leu Glu Ala 1-5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:140:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 18 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna

PL 193 662 B1

109 (B) UMIEJSCOWIENIE: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:140

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:141 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 141:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:142:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

CCI NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:142:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala ! 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:143:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana

110

PL 193 662 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID N0:143

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:144:

[i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:144:

Xaa Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:145:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak ' (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:145:

Gly Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:146:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID N0:146:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

PL 193 662 B1

111 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:147:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:147:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Phe Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJE O SEKWENCJI ID NO:148:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:148:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20

INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:149:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:149:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20

INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:150:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:150:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

112

PL 193 662 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:151:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:151:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Gly Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

LeuGln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:152:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:152:

Pro Val Phe Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:153:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:153:

Ala Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:154:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:154:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Gly Leu Asp Ala

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

PL 193 662 B1

113 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:155:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:155:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:156:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA; liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak .

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:156:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 · 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:157:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:157:

Pro Val Leu Glu Phe Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:158:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:158:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys

114

PL 193 662 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:159:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:159:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 S 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:160:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:160:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:161:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy CB) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:161:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:162:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:162:

PL 193 662 B1

115

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Trp Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:163:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xij OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:163:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Trp Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:164:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:164:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Trp Gin Lys Lys Leu Lys ' (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:165:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:165:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:166:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

116

PL 193 662 B1 (χί) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:166:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:167:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:167:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Gly Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:168:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:168:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Gin Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:169:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:169:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:170:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

PL 193 662 B1

117 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 12 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 19 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:170:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Xaa Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:171:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:171:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:172:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:172:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:173:

118

PL 193 662 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:173:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:174:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1,..22 (D) INNE INFORMACJE: Wszystkie aminokwasy są w konfiguracji D (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:174:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:175:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:175:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Leu 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:176:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 193 662 B1

119 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:176:

Pro Val Leu Glu Leu Trp Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:177:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:177:

Gly Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:178:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:178:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:179:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:179:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Aso Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala

5 ' 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O-SEKWENCJI ID NO:180:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

120

PL 193 662 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:180:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:181:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:180:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Trp Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:181:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:181:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Trp Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:182:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:182:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:183:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 193 662 B1

121 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:183:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:184:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:184:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Trp Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:185:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 19 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:185:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Xaa Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:186:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

122

PL 193 662 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa [ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:186:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Gin Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO: 187:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ; 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:187:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 ¹⁵

Leu Asn Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:188:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:188:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:189:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:189:

Asp Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:190:

PL 193 662 B1

123 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:190:

Pro Val Leu Glu Phe Trp Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:191:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:191:

Pro Val Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:192:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1..,18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:192:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:193:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

124

PL 193 662 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:193:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys. 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:194:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:194:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:195:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ixj CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:195:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:196:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 193 662 B1

125 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna

CB) UMIEJSCOWIENIE: 1..,18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:196:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:197:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (XX) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:197:

Pro Leu Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO: 198:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NQ:199:

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:199:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

CD) TOPOLOGIA: liniowa

126

PL 193 662 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo antidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:199:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:200:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:200:

Asn Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:201:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:201:

Pro Leu Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:202:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 193 662 B1

127 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:202:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Lys 15 10 15

Leu Arg (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:203:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:203:

Ala Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:204:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:204:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:205:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CD) TOPOLOGIA: liniowa

128

PL 193 662 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:205:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:206:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:206:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:207:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:207:

Pro Val Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:208:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 193 662 B1

129 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:208:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lya Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Arg ¹ 5 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:209:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:209:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:210:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:210:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:211:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Orn

130

PL 193 662 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 18 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:211:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gin Xaa

5 10 15

Leu Xaa (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:212:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...1Θ (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 7 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:212:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gin Xaa 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:213:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...1B (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana

PL 193 662 B1

131 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:213:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Phe Arg Gin Arg 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:214:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(AJ NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (Dl INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (D) INNE INFORMACJE: D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:214:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:215:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:215:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Trp Lys Gin Lys

10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:216:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:1S aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

132

PL 193 662 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:216:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:217:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:217:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Leu Leu Lys Gin Lys 1 5 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:218:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: c (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:218:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:219:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:219:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Gin Lys 1 5 ' 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:220:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: IB aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

PL 193 662 B1

133 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:220:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Gin Lys Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:221:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:221:

Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 1 5 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:222:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:222:

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Leu Gin Leu 15 10 15

Lys Lys (2 INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:223:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:223:

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Ala Gin Leu 15 10 15

Lys Lys

134

PL 193 662 B1 (2: INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO) :224 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:224:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Giy Trp Glu Glu Leu Lys Gin Lys

10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:225:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:225:

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Gin Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:226:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:226:

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Gly Glu Ala Leu Leu Gin Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:227:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana

PL 193 662 B1

135 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:227:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Glu Glu Leu Lys Gin Lys 1 5 10 '15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:228:

{i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D> INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:228:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:229:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:229:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Gly Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:230:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:230:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Gin Lys Lys 15 10 15

Leu Lys

136

PL 193 662 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:231 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:231:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Glu Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:232:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:232:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 1 5 10 '15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:233:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) TYP:

(C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:233:

Sekwencja ta została celowo pominięta (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:234:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) TYP:

(0) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO :234:

PL 193 662 B1

137

Sekwencja ta została celowo pominięta (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:235 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) TYP:

(C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:235: Sekwencja ta została celowo pominięta (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:236:

fi) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) TYP:

(C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:236:

Sekwencja ta została celowo pominięta (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:237;

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:237:

Leu Asp Asp Leu Leu Gin Lys Trp Ala Glu Ala Phe Asn Gin Leu Leu ¹ 5 10 15

Lys Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:238:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: ifg aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO :238:

138

PL 193 662 B1

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:239:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:239:

Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:240:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: ' (A) DŁUGOŚĆ: ¢3 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO :240:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Ala Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:241:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:48 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:241:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Phe Phe

PL 193 662 B1

139 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:242 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO :242:

Gly Ile Lys Lys Phe Leu Gly Ser Ile Trp Lys Phe Ile Lys Ala Phe 15 10 15

Val Gly (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:243:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO :243:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Ala Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:244:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:12 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:244:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Ala Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:245:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:245:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Phe Phe

140

PL 193 662 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:246:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:246:

Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:247:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (8) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:247:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Phe Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 15

Phe Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:248:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:248:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val· Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:249:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI;

(A) NAZWA/KLUCZ: inna

CB) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:249:

PL 193 662 B1

141

Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Glu Glu Lys Leu Lys Glu 15 io 15

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:250:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(B) TYP: aminokwasowy (A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:250:

Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:251:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:251:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:252:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xx) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...15 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana

142

PL 193 662 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:252:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Gin Lys Leu Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:253:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:253:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:254:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 £ aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 16 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:254:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:255:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

PL 193 662 B1

143 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:255:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:256:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza ID) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:256:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:257:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...16 ' (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana 1 C-końcowo amidowana (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:257:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:258:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: N-końcowo acetylowana i C-końcowo amidowana

144

PL 193 662 B1 (χί) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:258:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) : INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0(2_59 ;

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: 259:

(A) DŁUGOŚĆ: 842 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) UMIEJSCOWIENIE:1...801 (D) INNE INFORMACJE:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:259:

ATG AAA GCT GCG GTG CTG ACC

TTG GCC GTG CTC

TTC Phe

CTG ACG GGG

AGC Ser

48

Met 1

Lys Ala

Ala

Val 5

Leu

Thr

Leu

Ala

Val 10

Leu

Leu Thr

Gly 15

CAG

GCT

CGG

CAT

TTC

TGG

CAG

CAA

GAT

GAA

CCC

CAG

AGC

CCC

TGG

96

Gin

Ala

Arg

His

Phe

Trp

Gin

Asp

Glu

Pro

Gin

Ser

Pro

Trp

20

25

30

GAT

CGA

GTG

AAG

GAC

CTG

GCC

ACT

GTG

TAC

GTG

GAT

GTG

CTC

AAA

GAC

144

Asp

Arg

Val

Lys

Asp

Leu

Ala

Thr

Val

Tyr

Val

Asp

Val

Leu

Lys

ASp

35

40

45

AGC

GGC

AGA

GAC

TAT

GTG

TCC

CAG

TTT

GAA

GGC

TCC

GCC

TTG

GGA

AAA

192

Ser

Gly

Arg

Asp

Tyr

Val

Ser

Gin

Phe

Glu

Gly

Ser

Ala

Leu

Gly

Lys

50

55

60

CAG

CTA

AAC

CTA

AAG

CTC

CTT

GAC

AAC

TGG

GAC

AGC

GTG

ACC

TCC

ACC

240

Gin

Leu

Asn

Leu

Lys

Leu

Asp

Asn

Trp

Asp

Ser

Val

Thr

Ser

Thr

65

70

75

80

TTC

AGC

AAG

CTG

CGC

GAA

CAG

CTC

GGC

CCT

GTG

ACC

CAG

GAG

TTC

TGG

288

Phe

Ser

Lys

Leu

Arg

Glu

Gin

Leu

Gly

Pro

Val

Thr

Gin

Glu

Phe

Trp

85

90

95

GAT

AAC

CTG

GAA

AAG

GAG

ACA

GAG

GGC

CTG

AGG

CAG

GAG

ATG

AGC

AAG

336

Asp

Asn

Leu

Glu

Lys

Glu

Thr

Glu

Gly

Leu

Arg

Gin

Glu

Met

Ser

Lys

100

105

110

GAT

CTG

GAG

GTG

AAG

GCC

AAG

GTG

CAG

CCC

TAC

CTG

GAC

TTC

384

Asp

Leu

Glu

Val

Lys

Ala

Lys

Val

Gin

Pro

Tyr

Leu

Asp

Phe

115

120

125

CAG

AAG

TGG

CAG

GAG

ATG

GAG

CTC

TAC

CGC

CAG

AAG

GTG

GAG

432

Gin

Lys

Trp

Gin

Glu

Met

Glu

Leu

Tyr

Arg

Gin

Lys

Val

Glu

130

135

140

CCG

CTG

CGC

GCA

GAG

CTC

CAA

GAG

GGC

GCG

CGC

CAG

AAG

CTG

CAC

GAG

480

Pro

Leu

Arg

Ala

Glu

Leu

Gin

Glu

Gly

Ala

Arg

Gin

Lys

Leu

His

Glu

145

150

155

160

CTG

CAA

GAG

AAG

CTG

AGC

CCA

CTG

GGC

GAG

ATG

CGC

GAC

CGC

GCG

528

Leu

Gin

Glu

Lys

Leu

Ser

Pro

Leu

Gly

Glu

Met

Arg

Asp

Arg

Ala

165

170

175

CGC

GCC

CAT

GTG

GAC

GCG

CTG

CGC

ACG

CAT

CTG

GCC

CCC

TAC

AGC

GAC

576

PL 193 662 B1

145

Arg

Ala

His

Vał 180

Asp

Ala

Leu

Arg

Thr 185

His

Leu

Ala

Pro

Tyr 190

Ser

Asp

GAG

CTG

CGC

CAG

CGC

TTG

GCC

GCG

CGC

CTT

GAG

GCT

CTC

AAG

GAG

AAC

624

Glu

Leu

Arg 195

Gin

Arg

Leu

Ala

Ala 200

Arg

Leu

Glu

Ala

Leu 205

Lys

Glu

Asn

GGC Gly AGC Ser 225

GGC GCC AGA CTG GCC Gly Ala Arg Leu Ala

GAG Glu .215 GCC Ala

TAC CAC

GCC AAG GCC ACC

GAG CAT CTG

672 720

Tyr AAG Lys

His CCC Pro

Ala GCG Ala

Lys Ala 220

Thr GAC Asp

Glu CTC Leu

His CGC Arg

Leu CAA Gin 240

210 ACG Thr

CTC Leu

AGC GAG

AAG Lys 230

CTC Leu 235

GAG Glu

Ser

Glu

GGC

CTG

CCC

GTG

CTG

GAG

AGC

TTC

AAG

GTC

AGC

TTC

CTG

AGC

GCT

768

Gly

Leu

Pro

Val

Leu

Glu

Ser

Phe

Lys

Val

Ser

Phe

Leu

Ser

Ala

245

250

255

CTC

GAG

TAC

ACT

AAG

CTC

AAC

ACC

CAG

TGAGGCGCCC GCCGCCGCCC

821

Leu

Glu

Tyr

Thr

Lys

Leu

Asn

Thr

Gin

260

265

CCCTTCCCGG TGCTCAGAAT A 842 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:260:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 267 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (ii) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:260

Met 1

Lys

Ala Ala Val 5

Leu Thr

Leu Ala Val Leu 10

Phe

Leu

Thr

Gly 15

Ser

Gin

Ala

Arg

His

Phe

Trp

Gin

Asp

Glu

Pro

Gin

Ser

Pro

Trp

20

25

30

Asp

Arg

Val

Lys

Asp

Leu

Ala

Thr

Val

Tyr

Val

Asp

Val

Leu

Lys

Asp

35

40

45

Ser

Gly

Arg

Asp

Tyr

Val

Ser

Gin

Phe

Glu

Gly

Ser

Ala

Leu

Gly

Lys

50

55

60

Gin

Leu

Asn

Leu

Lys

Leu

Asp

Asn

Trp

Asp

Ser

Val

Thr

Ser

Thr

65

70

75

80

Phe

Ser

Lys

Leu

Arg

Glu

Gin

Leu

Gly

Pro

Val

Thr

Gin

Glu

Phe

Trp

85

90

95

Asp

Asn

Leu

Glu

Lys

Glu

Thr

Glu

Gly

Leu

Arg

Gin

Glu

Met

Ser

Lys

100

105

110

Asp

Leu

Glu

Val

Lys

Ala

Lys

Val

Gin

Pro

Tyr

Leu

Asp

Phe

115

120

125

Gin

Lys

Trp

Gin

Glu

Met

Glu

Leu

Tyr

Arg

Gin

Lys

Val

Glu

130

135

140

Pro

Leu

Arg

Ala

Glu

Leu

Gin

Glu

Gly

Ala

Arg

Gin

Lys

Leu

His

Glu

145

150

155

160

Leu

Gin

Glu

Lys

Leu

Ser

Pro

Leu

Gly

Glu

Met

Arg

Asp

Arg

Ala

165

170

175

146

PL 193 662 B1

Arg

Ala His Vai 180

Asp

Ala Leu

Arg

Thr His 185

Leu

Ala

Pro

Tyr 190

Ser

Asp

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Leu

Ala

Arg

Leu

Glu

Ala

Leu

Lys

Glu

Asn

195

200

205

Gly

Ala

Arg

Leu

Ala

Glu

Tyr

His

Ala

Lys

Ala

Thr

Glu

His

Leu

210

215

220

Ser

Thr

Leu

Ser

Glu

Lys

Ala

Lys

Pro

Ala

Leu

Glu

Asp

Leu

Arg

Gin

225

230

235

240

Gly

Leu

Pro

Val

Leu

Glu

Ser

Phe

Lys

Val

Ser

Phe

Leu

Ser

Ala

245

250

255

Leu

Glu

Tyr

Thr

Lys

Leu

Asn

Thr

Gin

260

265

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:261:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 66 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa {xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:261:

CCTGTTCTTG ACCTCTTCCG TGAACTTCTT AACGAAGGCC TCGAGGCACT GAAACAGAAA 60

CTAAAA 66 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:262:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 63 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (0) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:262:

GGTGTTCTGG ACCTCTTCCG TGAACTTCTT AACGAAGGCC TAGCGCTAAA ACAAAAACTA 60

AAA 63 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:263:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 66 par 2asad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CE) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:26

CCCGTGTTGG ACTTGTTCCG AGAACTACTA AACGAAGGAC TAGAATGGTT GAAACTAAAA 60

CTAAAA 66 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:264:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 66 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (C) TOPOLOGIA: liniowa

PL 193 662 B1

147 (D) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:264:

GGTGTTTTGG AACTTTTCGA AAACTTATTG GAAAGATTGT TGGACGCACT GCAAAAAAAA 60 TTGAAA 66 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:265:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 66 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:265:

CCAGTCTTGG AACTTTTCGA GAACTTGTGG GAGCGATTGT TGGATGCTTT GCAAAAAAAA 60 TTGAAA 66 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:266:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 66 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:266:

GCCGTGTTGG AGCTGTTCGA AAACTTATTA GAGCGATTAT TAGACGCATT ACAGAAAAAA 60 TTGAAA £6 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:267:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 54 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:267:

CCTGTGTTGG ACTTGTTCCG CGAGTTATTA AACGAGTTAT TACAGAAATT AAAA 54 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:260 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 54 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:268:

CCTGTGTTGG ACTTGTTGCG AGAATTATTA GAGGAATTAA AACAAAAACT AAAA 54 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:269:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

148

PL 193 662 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 54 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:269:

CCATTATTAG AATTATTTAA GGAATTATTG GAGGAGCTGG AACAGGAACT AGAA 54 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:270:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:270:

Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 15 10 15

Gin Ala (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:271:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: .

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa . (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:271:

Met Lys Ala Ala Val Leu Ala Val Ala Leu Val Phe Leu Thr Gly Cys 15 10 15

Gin Ala (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:272 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:272

Arg His Phe Trp Gin Gin 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:273 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

PL 193 662 B1

149 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:273:

Xaa Glu Phe Xaa Gin Gin 1 5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:274:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:274: TGAACCCTTG ACCCCT

Claims

1. Sekwencja nukleotydowa kodująca agonistę ApoA-I wykazującego co najmniej 38% aktywację acylotransferazy lecytynowo-cholesterolowej (LCAT) w stosunku do ludzkiej ApoA-I, zawierającego (i) 15-29 reszt peptydu lub analogu peptydu, który tworzy amfipatyczne α-helisy w obecności lipidów i który posiada wzór strukturalny (I):

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23 lub jego ich farmaceutycznie dopuszczalna sól, gdzie:

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asp (D) lub Asn (N);

X2 oznacza resztę alifatyczną;

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza resztę kwasową;

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza resztę hydrofilową;

X8 oznacza aminokwasową resztę kwasową lub zasadową;

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

XII oznacza aminokwasową resztę hydrofilową;

X12 oznacza aminokwasową resztę hydrofilową;

X13 oznacza Gly (G) lub aminokwasową resztę alifatyczną;

X14 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X15 oznacza aminokwasową resztę hydrofilową;

X16 oznacza aminokwasową resztę hydrofobową;

X17 oznacza aminokwasową resztę hydrofobową;

X18 oznacza aminokwas zasadowy, GLN (Q) lub ACN (N);

X19 oznacza aminokwas zasadowy, GLN (Q) lub ACN (N);

X20 oznacza aminokwas zasadowy;

X21 oznacza aminokwas alifatyczny;

X22 oznacza aminokwas zasadowy;

X23 oznacza brak lub reszę zasadową; lub (ii) wydeletowaną postać wzoru strukturalnego (I) w którym co najmniej jedna do ośmiu reszt uległa delecji X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10,X11, X12, X13, X14, X15, X16, X17, X18,X19, X20, X21 i X22; lub (iii) zmienioną postać wzoru strukturalnego (I) w którym co najmniej jedna z reszt X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16, X17, X18, X19, X20, X21, X22 lubX23 jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

150

PL 193 662 B1

2. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje agonistę ApoA-I posiadającego sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z :

2 GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK

3 PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK

4 PVLDLFRELLNELLEALKQKLK

7 PVLDLFKELLNELLEALKQKLK

8 PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

9 PVLDLFRELGNELLEALKQKLK

11 PVLDLFKELLQELLEALKQKLK

12 PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK

13 GVLDLFRELLNEGLEALKQKLK

15 PVLDLFRELWNELLEALKQKLK

16 PVLDLLRELLNELLEALKQKLK

17 PVLELFKELLQELLEALKQKLK

18 GVLDLFRELLNELLEALKQKLK 20 PVLDLFREGLNELLEALKQKLK

22 PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK

23 PLLELFKELLQELLEALKQKLK

24 PVLDLFRELLNELLEALQKKLK 26 PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

28 PVLDLFRELLNELWEALKQKLK

29 AVLDLFRELLNELLEALKQKLK 123 QVLDLFRELLNELLEALKQKLK

125 NVLDLFRELLNELLEALKQKLK

126 PVLDLFRELLNELGEALKQKLK

127 PVLDLFRELLNELLELLKQKLK

128 PVLDLFRELLNELLEFLKQKLK

129 PVLELFNDLLRELLEALQKKLK

130 PVLELFNDLLRELLEALKQKLK

131 PVLELFKELLNELLDALRQKLK

132 PVLDLFRELLENLLEALQKKLK

133 PVLELFERLLEDLLQALNKKLK

134 PVLELFERLLEDLLKALNQKLK

135 DVLDLFRELLNELLEALKQKLK

136 PALELFKDLLQELLEALKQKLK

138 PVLDLFRELLNEGLEWLKQKLK

139 PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK

141 PVLDFFRELLNEGLEALKQKLK

142 PVLELFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO 2) ;

(SEQ ID NO 3) ;

(SEQ ID NO 4) ;

(SEQ ID NO 7) ;

(SEQ ID NO 8) ;

(SEQ ID NO 9) ;

(SEQ ID NO 11) ;

(SEQ ID NO 12) ;

(SEQ ID NO 13) ;

(SEQ ID NO 15) ;

(SEQ ID NO 16) ;

(SEQ ID NO 17) ;

(SEQ ID NO 18) ;

(SEQ ID NO 20) ;

(SEQ ID NO 22) ;

(SEQ ID NO 23) ;

(SEQ ID NO 24) ;

(SEQ ID NO 26) ;

(SEQ ID NO 28) ;

(SEQ ID NO 29) ;

(SEQ ID NO 123) (SEQ ID NO 125) (SEQ ID NO 126) (SEQ ID NO 127) (SEQ ID NO:128) (SEQ ID NO:129) (SEQ ID NO:130) (SEQ ID NO:131) (SEQ ID NO:132) (SEQ ID NO:133) (SEQ ID NO:134) (SEQ ID NO:135) (SEQ ID NO:136) (SEQ ID NO:138) (SEQ ID NO:139) (SEQ ID NO:141) (SEQ ID NO:142)

3. Agonista ApoA-I kodowany przez sekwencję nukleotydową jak zdefiniowano w zastrz. 1, znamienny tym, że wykazuje co najmniej około 38% aktywację LCAT wporównaniu z ludzką ApoA-I.

4. Agonista ApoA-I kodowany przez sekwencję nukleotydową jak zdefiniowano w zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi go zmieniona postać wzoru strukturalnego (I).

5. Agonista ApoA-I kodowany przez sekwencję nukleotydową jak zdefiniowano w zastrz. 4, w którym reszty hydrofobowe są przyłączone według wzoru strukturalnego (I) i co najmniej jedna nieprzyłączona reszta jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

PL 193 662 B1

151

6. Agonista ApoA-I według zastrz. 5, w którym:

XI oznacza Pro (P), Gly (G) lub Ala (A);

X2 oznacza Ala (A), Leu (L) lub Val (V);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X13 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X14 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X16 oznacza Ala (A), Trp (W) lub Gly (G); Leu (L) lub Phe (F);

X17 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X22 oznacza Leu (L);i co najmniej jedna z X4, X7, X8, X11, X12, X14, X15, X18, X19, X20, X22 i X23 jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

7. Agonista ApoA-I według zastrz. 4, w którym reszty hydrofilowe są przyłączone zgodnie ze wzorem strukturalnym (I) i co najmniej jedna nieprzyłączona reszta jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

8. Agonista ApoA-I według zastrz. 7, w którym:

X4 oznacza Asp (D) lub Glu;

X7 oznacza Lys (K), Arg (R);

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

XII oznacza Asn (N) lub Glu (E);

X12 oznacza Glu (E) lub Asp (D);

X15 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub Lys (K);

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X22 oznacza Lys (K);

X23 brakuje albo oznacza Lys (K); i co najmniej jedna z X1, X2, X3, X5, X6, X9, X10, X13, X14, X16, X17 i X21 jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

9. Agonista ApoA-I według zastrz. 8, w którym X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F), X6 oznacza Phe (F), X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G), X10 oznacza Leu (L) lub Trp (W), lub Gly (G) i co najmniej jedna z X1, X2, X5, X13, X14, X16, X17 i X21 jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

10. Agonista ApoA-I według zastrz. 6 lub 8, w którym reszta która jest podstawiana jest zaklasyfikowana do tej samej subkategorii co reszta podstawiona.

11. Agonista ApoA-I kodowany przez sekwencję nukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 1, który stanowi wydeletowaną postać wzoru strukturalnego (I).

12. Agonista ApoA-I według zastrz. 11, w którym jeden helikalny skręt peptydu lub analogu peptydowego jest wydeletowany.

13. Agonista ApoA-I kodowany przez sekwencję nukleotydową jak zdefiniowano w zastrz. 1, będący 22-23-resztowym peptydem lub analogiem peptydowym wzoru strukturalnego (I).

14. Agonista ApoA-I kodowany przez sekwencję nukleotydową jak zdefiniowano w zastrz. 1, w którym:

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q) lub Asp (D);

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Lys (R) lub Arg (R);

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X9 oznacza Leu (L) lub Gly (G);

X10 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

XII oznacza Asn (N) lub Glu (E);

152

PL 193 662 B1

X12 oznacza Glu (E) lub Asp (D);

X13 oznacza Gly (G) lub Leu (L);

X14 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Gly (G);

X15 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X16 oznacza Ala (A), Trp (W), Leu (L), Phe (F) lub Gly (G);

X17 oznacza Gly (G) lub Leu (L);

X18 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub Lys (K);

X19 oznacza Gln (Q), Asn (N) lub Lys (K);

X20 oznacza Lys (K);

X21 oznacza Leu (L);

X22 oznacza Lys (K); i

X23 brakuje lub oznacza Lys (K).

15. Agonista ApoA-I według zastrz. 14, w którym: X23 jest nieobecny.

16. Agonista ApoA-I według zastrz. 14, w którym jeden z X18 lub X19 oznacza Gln (Q) lub Asn, a inny X18 lub X19 oznacza Lys (K).

17. Agonista ApoA-I według zastrz. 14, w którym każdy X9, X10, X13, X14, X15 i X17 oznacza inny niż Gly (G).

18. Agonista ApoA-I według zastrz. 14, w którym jeden z X9, X10, X13, X14, X15 i X17 oznacza Gly (G)i pozostałe są inne niż Gly (G).

19. Sekwencja nukleotydowa kodująca multimetrycznego agonistę ApoA-I który wykazuje co najmniej 38% aktywację LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I i który ma wzór strukturalny (IV) (IV) HH[LLm-HH]nLLm-HH lub jego farmaceutycznie dopuszczalne sole, w którym to wzorze każde m jest niezależnie liczbą naturalną od 0 do 1; n jest liczbą naturalną od 0 do 10; każde „HH” jest niezależnie peptydem lub analogiem peptydu kodowanym przez sekwencję nukleotydową jak zdefiniowo w zastrz. 1; i każde „LL” jest niezależnie bifunkcjonalnym linkerem.

20. Komórka gospodarza z ekspresją peptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową jak zdefiniowano w zastrz. 1 lub 19.

21. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera sekwencje kodujące agonistę ApoA-I i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, wypełniacz lub rozpuszczalnik, przy czym agonista ApoA-I jest kodowany przez sekwencje nukleotydowe jak zdefiniowano w zastrz. 1 lub 19.

22. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 21, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa ma postać kompleksu nukleotydowo-lipidowego, przy czym wspomniany kompleks, znamienny tym, że składa się z sekwencji nukleotydowych kodujących agonistę ApoA-I i lipidu.

23. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej lub komórek gospodarza produkujących sekwencję nukleotydową jak zdefiniowano w zastrz. 1 lub 19 do leczenia pacjentów cierpiących na schorzenia związane z dyslipidemią.

24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że agonista ApoA-I występuje w postaci kompleksu agonista ApoA-I-lipid, przy czym kompleks ten zawiera agonistów ApoA-I i lipid.

25. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza hipercholesterolemię.

26. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że choroba związaną z dyslipidemią oznacza chorobę naczyniową.

27. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza miażdżycę.

28. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza restenozę.

29. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza niedobór HDL lubApoA-I.

30. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza hipertriglicerydemię.

31. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza syndrom metaboliczny.

PL 193 662 B1

153

32. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej lub komórki gospodarza z ekspresją peptydu kodowanego przez sekwencję jak zdefiniowano w zastrz. 1 lub 19 do wytwarzania leku do leczenia osobnika cierpiącego z powodu choroby związanej z endotoksemią/szokiem septycznym.

Rysunki ATG AAA GCT GCG GTG CTG ACC TTG GCC GTG CTC TTC CTG ACG GGG AGC Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 CAG GCT CGG CAT TTC TGG CAG CAA GAT GAA CCC CCC CAG AGC CCC TGG Gin Ala Arg His Phe Trp Gin Gin Asp Glu Pro Pro Gin Ser Pro Trp 20 25 30 GAT CGA GTG AAG GAC CTG GCC ACT GTG TAC GTG GAT GTG CTC AAA GAC Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 35 40 45 AGC GGC AGA GAC TAT GTG TCC CAG TTT GAA GGC TCC GCC TTG GGA AAA Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gin Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 CAG CTA AAC CTA AAG CTC CH GAC AAC TGG GAC AGC GTG ACC TCC ACC Gin Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 TTC AGC AAG CIG CGC GAA CAG CTC GGC CCT GTG ACC CAG GAG TTC TGG Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gin Leu Gly Pro Val Thr Gin Glu Phe Trp 85 90 95 GAT AAC CTG GAA AAG GAG ACA GAG GGC CTG AGG CAG GAG ATG AGC AAG Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gin Glu Met Ser Lys 100 105 110 GAT CTG GAG GAG GTG AAG GCC AAG GTG CAG CCC TAC CTG GAC GAC TTC Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gin Pro Tyr Leu Asp • Asp Phe 115 120 125 CAG AAG AAG TGG CAG GAG GAG ATG GAG CTC TAC CGC CAG AAG 1 GTG GAG Gin Lys Lys Trp Gin Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gin Lys , Val Glu

130 135 140

FIG.1 A

154

PL 193 662 B1 CCG Pro 145 CTG CGC GCA GAG CTC CAA GAG GGC GCG CGC CAG AAG CTG CAC GAG Leu Arg Ala Glu Leu 150 Gin Glu Gly Ala Arg 155 Gin Lys Leu His Glu 160 CTG CAA GAG AAG CTG AGC CCA CTG GGC GAG GAG ATG CGC GAC CGC GCG Leu Gin Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 165 170 175 CGC GCC CAT GTG GAC GCG CTG CGC ACG CAT CTG GCC CCC TAC AGC GAC Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 GAG CTG CGC CAG CGC TTG GCC GCG CGC Cn GAG GCT CTC AAG GAG AAC Glu Leu Arg Gin Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 205 GGC GGC GCC AGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC AAG GCC ACC GAG CAT CTG Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 210 215 220 AGC ACG CTC AGC GAG AAG GCC AAG CCC GCG CTC GAG GAC CTC CGC CAA Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gin 225 230 235 240 GGC CTG CTG CCC GTG CTG GAG AGC TTC AAG GTC AGC TTC CTG AGC GCT Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 245 250 255 CTC GAG GAG TAC ACT AAG AAG CTC AAC ACC CAG TGA GGCGCCCGCC Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gin ★

260 265

GCCGCCCCCC TTCCCGGTGC TCAGAATA

FIG.1B

PL 193 662 B1

155

5’ CCT GH CH GAC CTC HC CGT GAA CH CH AAC GAA GGC CTC GAG GCA CTG AAA CAG AAA CTA AAA 3’

5* GGT GH CTG GAC CTC HC CGT GAA CH CH AAC GAA GGC CTA GCG CTA AAA CAA AAA CTA AAA 3'

5’ CCC GTG HG GAC HG HC CGA GAA CTA CTA AAC GAA GGA CTA GAA TGG HG AAA CTA AAA CTA AAA 3'

FIG.2

5’ GGT GH HG GAA CH HC GAA AAC HA HG GAA AGA HG HG GAC GCA CTG CAA AAA AAA HG AAA 3'

5’ CCA GTC HG GAA CH HC GAG AAC HG TGG GAG CGA HG HG GAT GCT HG CAA AAA AAA HG AAA 3'

5* GCC GTG HG GAG CTG HC GAA AAC HA HA GAG CGA HA HA GAC GCA HA CAG AAA AAA HG AAA 3'

FIG.3

156

PL 193 662 B1

5’ CCT GTG KG GAC KG TTC CGC GAG KA KA AAC GAG KA KA

CAG AAA KA AAA 3'

5' CCT GTG KG GAC KG KG CGA GAA KA KA GAG GAA KA AAA CAA AAA CTA AAA 3'

5' CCA KA KA GAA KA TK AAG GAA KA KG GAG GAG CTG GAA CAG GAA CTA GAA 3’