PL193897B1 - Zastosowanie estrogenu i zestaw do ogólnoustrojowego podawania leku - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie estrogenu do wytwarzania leku do leczenia stanów chorobowych u osoby po menopauzie, które to stany chorobowe s a wybrane z grupy obejmuj acej pomenopauzalny spadek poziomu estrogenu, zwi ekszone ryzyko osteoporotycznych z lama n ko sci spowodowanych osteopo- roz a pomenopauzaln a i ubytek g esto sci mineralnej ko sci, do przezskórnego podawania tej osobie, przy czym ilo sc podawanego estrogenu wynosi 10 - 25 µg/dzie n. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są zastosowanie estrogenu i zestaw do ogólnoustrojowego podawania leku.

Po naturalnej lub wywołanej zabiegiem chirurgicznym menopauzie obserwuje się zdecydowany spadek poziomu endogennych estrogenów, który powoduje wzmożony ubytek tkanki kostnej i, na skutek tego, prowadzi do złamań. Wiadomo, że endogenne estrogeny odgrywają dużą rolę w utrzymaniu prawidłowego stanu szkieletu kostnego u młodszych kobiet. Znaczenie endogennych estrogenów u kobiet w starszym wieku jest jednak mniej jasne.

Uprzednio wykazano, że poziomy endogennego estronu u kobiet powyżej 65 roku życia nie są związane z późniejszymi złamaniami biodra ani kręgów. S.R. Cummings i inni, J. Bone Min. Res. 10 (Suppl I): S174 (1995). Estradiol jest jednakże silniej działającym estrogenem od estronu, a badania mające na celu ustalenie jego roli w złamaniach kości dały niejednoznaczne wyniki. Średnie poziomy estradiolu w surowicy kobiet przed menopauzą wynoszą powyżej 100 pg/ml. Poziom estradiolu w surowicy kobiet w okresie pomenopauzalnym, nie otrzymujących hormonalnej terapii zastępczej, spadają poniżej 20 pg/ml, a aż u 30 - 50% kobiet poziom estradiolu jest tak niski, że związek ten jest niewykrywalny zwykłymi, czułymi metodami pomiarowymi (np. poniżej 5 pg/ml). Znany sposób leczenia kobiet w okresie pomenopauzalnym polega na stosowaniu hormonalnej terapii zastępczej w dawkach wystarczających do utrzymania poziomu estradiolu w surowicy powyżej 40 - 60 pg/ml.

Udowodniono, że zwykła hormonalna terapia zastępcza jest użyteczna w leczeniu stanów wynikających z pomenopauzalnego spadku poziomu estrogenów i powoduje ona zmniejszenie ubytku, a nawet wzrost gęstości tkanki kostnej, oraz spadek zagrożenia złamaniami kości. Badania wykazały jednakże, że ze stosowaniem hormonalnej terapii zastępczej może wiązać się zwiększone zagrożenie rakiem sutka i trzonu macicy; terapia ta może również podwyższać krzepliwość krwi oraz powodować krwawienia z macicy. Zatem istnieje zapotrzebowanie na opracowanie sposobów leczenia stanów wynikających z pomenopauzalnego spadku poziomu estrogenów lub ich niedoboru. Istnieje również potrzeba takiego leczenia takich stanów chorobowych, z ograniczeniem skutków ubocznych hormonalnej terapii zastępczej.

Wynalazek dotyczy zastosowania estrogenu do wytwarzania leku do leczenia stanów chorobowych u osoby po menopauzie, które to stany chorobowe są wybrane z grupy obejmującej pomenopauzalny spadek poziomu estrogenu, zwiększone ryzyko osteoporotycznych złamań kości spowodowanych osteoporozą pomenopauzalną i ubytek gęstości mineralnej kości, do przezskórnego podawania tej osobie, przy czym ilość podawanego estrogenu wynosi 10 - 25 μg/dzień.

W tym zastosowaniu korzystnie ilość podawanego estrogenu skutecznie zapewnia osiągnięcie poziomu estrogenu w surowicy równoważnego poziomowi estradiolu w surowicy w zakresie około 5-10 pg/ml.

Korzystnie jako estrogen stosuje się estradiol.

Wynalazek dotyczy również zestawu do ogólnoustrojowego podawania leku osobie dotkniętej lub podatnej na ogólnoustrojowe stany chorobowe wynikające z pomenopauzalnego spadku poziomu estrogenu, takie jak osteoporoza, ból głowy, mdłości, depresja, uderzenia krwi do głowy, spadek gęstości minerałów w kości lub zwiększone ryzyko złamania kości, przy czym ten zestaw zawiera:

a) plaster przezskórny, przeznaczony do przezskórnego podawania estrogenu w ilości odpowiadającej 10 - 25 μg estradiolu dziennie; oraz

b) instrukcje dotyczące sposobu stosowania plastra przezskórnego, dla zmniejszenia ryzyka wywołanych osteoporozą złamań kości u tej osoby.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania estrogenu do wytwarzania leku do leczenia stanów chorobowych u osoby po menopauzie, do przezskórnego podawania tej osobie estrogenu w ilości odpowiadającej 10 - 25 μg estradiolu dziennie, pod nieobecność egzogennych substancji o działaniu progesteronu, które to stany chorobowe są wybrane z grupy obejmującej pomenopauzalny spadek poziomu estrogenu, zwiększone ryzyko osteoporotycznych złamań kości spowodowanych osteoporozą pomenopauzalną i ubytek gęstości mineralnej kości.

W szczególnym przypadku podawanie odbywa się przed wykonaniem zabiegu usunięcia macicy u tej osoby.

Korzystnie jako estrogen stosuje się estradiol.

W tym przypadku wskazany jest ponadto etap badania poziomu estradiolu w surowicy tej osoby oraz ustalenie, że poziom estradiolu w surowicy osoby, która ma być leczona, jest prawidłowy dla kobiet po menopauzie w tej samej grupie wiekowej jak dana osoba.

PL 193 897 B1

O ile nie okreś lono inaczej, wszystkie zastosowane w opisie określenia techniczne i naukowe mają zwykłe znaczenia.

Te określenia objaśniono poniżej.

„Stany chorobowe wynikające z pomenopauzalnego spadku poziomu estrogenu oznaczają stany chorobowe, które występują często wśród kobiet po menopauzie, oraz które są wywoływane, przynajmniej częściowo, poprzez spadek poziomu estrogenu w organizmie. Do stanów tych należą, ale nie wyłącznie, osteoporoza, bóle głowy, nudności, depresja, uderzenia gorąca, spadek gęstości mineralnej kości oraz podwyższone ryzyko lub częstość występowania złamań kostnych, w tym złamania kręgów i/lub złamania szyjki kości udowej.

„Osoba w okresie pomenopauzalnym” oznacza kobietę w okresie po menopauzie. Do osób dotkniętych objawami pomenopauzalnymi należą kobiety po menopauzie, u których występuje którykolwiek z wymienionych stanów chorobowych, a zwłaszcza kobiety, u których po menopauzie występuje zmniejszenie gęstości mineralnej kości w kręgach, biodrze lub w innym miejscu, lub u których miało miejsce złamanie kręgów lub złamanie szyjki kości udowej. Do osób podatnych na stany chorobowe wynikające z pomenopauzalnego spadku poziomu estrogenu należą kobiety, u których zbliża się początek menopauzy, u których występuje spadek poziomu estradiolu w surowicy w porównaniu z wartościami charakterystycznymi dla kobiet przed menopauzą, oraz kobiety po menopauzie, u których występuje spadek poziomu estradiolu w surowicy, a u których nie rozwinął się jeszcze stan chorobowy wywołany pomenopauzalnym spadkiem poziomu estrogenu. Do osób, u których obserwuje się spadek poziomu estradiolu w surowicy, należą osoby z poziomem estradiolu 20 pg/ml lub niższym, w tym osoby, u których poziom estradiolu w surowicy jest niewykrywalny. W przypadku rozwiązań według wynalazku poziomy hormonów płciowych, w tym poziomy estradiolu w surowicy, mierzono metodą radioimmunologiczną po ekstrakcji i rozdziale w kolumnie. Dolną granicę wykrywalności stanowi poziom estradiolu 5 pg/ml.

„Spowodowane osteoporozą złamania kości” oznacza złamania kości, zwykle kręgów lub szyjki kości udowej, do których przyczyniła się osteoporoza.

Leki zawierające estrogeny są przydatne w leczeniu kobiet po menopauzie, zwłaszcza dotkniętych lub podatnych na stany chorobowe w rodzaju omówionych powyżej. Wskazane jest podawanie estrogenu w ilości skutecznej do osiągnięcia wymaganego poziomu estradiolu w surowicy leczonej osoby. Stosowane tutaj wyrażenie „leczenie stanów chorobowych oznacza wyeliminowanie lub zmniejszenie nasilenia lub częstości występowania takich stanów chorobowych u osoby dotkniętej takimi stanami, a także zapobiegania występowaniu stanów chorobowych u osoby podatnej na wystąpienie takich stanów na skutek spadku poziomu estrogenu po menopauzie. Chociaż leczenie takich stanów chorobowych po menopauzie może obejmować całkowitą eliminację takiego stanu u osoby nim dotkniętej, jednakże całkowita eliminacja takiego stanu nie jest konieczna, aby spełnić definicję tego pojęcia w opisie. Zatem zgodnie z wynalazkiem stosuje się bardzo niskie dawki estrogenu w leczeniu stanów chorobowych wynikają cych ze spadku poziomu estrogenu oraz w celu zmniejszania ryzyka powodowanych osteoporozą złamań kości u osoby dotkniętej lub podatnej na osteoporozę pomenopauzalną.

Leczenie może również obejmować dodatkowy etap, jakim jest badanie poziomu estradiolu w surowicy kobiety po menopauzie, która ma być leczona, oraz ustalenie, czy poziom ten znajduje się w zakresie normy dla kobiet po menopauzie w tej samej grupie wiekowej. Innymi słowy, stosowanie leku z estrogenem ogranicza się do leczenia kobiet, u których poziom estradiolu w surowicy jest niższy niż prawidłowy średni poziom estradiolu w surowicy kobiet w okresie pomenopauzalnym w tej samej grupie wiekowej. Taki lek można stosować w celu leczenia kobiet po menopauzie, u których poziom estradiolu w surowicy znajduje się w zakresie normy dla kobiet po menopauzie w tej samej grupie wiekowej. Określenie „prawidłowy poziom estradiolu w surowicy oznacza tu poziom estradiolu w surowicy, który jest stosunkowo zbliż ony do ś redniego poziomu estradiolu w surowicy kobiet w tej samej grupie wiekowej.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że spadek gęstości mineralnej kości nie jest jedynym czynnikiem przyczyniającym się do zwiększonego zagrożenia złamaniami kości na skutek osteoporozy u osób dotkniętych osteoporozą pomenopauzalną. Niski poziom estradiolu w surowicy, to znaczy poziom poniżej 5 pg/ml, zwłaszcza w połączeniu z poziomem globuliny wiążącej hormony płciowe (SHBG, ang. sex hormone binding globulin) 1 μg/dl lub wyższym, w istotny sposób podwyższa ryzyko złamań szyjki kości udowej i kręgów. Ponadto, niski poziom 1,25(OH)2-witaminy D w surowicy również prowadzi do podwyższenia ryzyka złamań szyjki kości udowej. Sposób oceny ryzyka spowodowanych oste4

PL 193 897 B1 oporozą złamań kości obejmuje zastosowanie modeli logistycznych opracowanych przez SAS Institute, Cary, North Carolina, celem analizy związku pomiędzy czynnikami prognostycznymi a złamaniami kręgów, oraz proporcjonalne modele ryzyka, uwzględniające model odnajdowania przypadków chorobowych z losowo wybranej populacji w analizie związku pomiędzy czynnikami prognostycznymi a złamaniami szyjki kości udowej. Analizy prowadzi się w odniesieniu do wyjściowego wieku i masy ciał a, a wyniki przedstawia się jako ryzyko wzglę dne, z 95% przedział ami ufnoś ci. Odsetek złamań, którym tło można przypisać do różnych poziomów hormonów, szacuje się metodą opisaną przez W.S. Brownera w American Journal of Epidemiology 123:143 (1986). Pojęcie „zmniejszanie ryzyka wywołanych osteoporozą złamań kości oznacza, że ryzyko mierzone wymienionymi powyżej metodami jest niższe u danej osoby, leczonej z użyciem leku z estrogenem, niż ryzyko występujące u tej samej osoby przed leczeniem takim lekiem. Zatem ryzyko wywołanych osteoporozą złamań koś ci zmniejsza się u tak leczonej osoby w porównaniu z osobą nieleczoną w okresie pomenopauzalnym, dotkniętą lub podatną na wystąpienie wywołanych osteoporozą złamań kości.

Nieoczekiwanie stwierdzono również, że na leczenie stanów chorobowych wynikających ze spadku poziomu estrogenu może mieć wpływ podawanie bardzo niskich dawek estrogenu, bez konieczności podawania hormonów o działaniu progesteronu. Stwierdzono, że podawanie estrogenu z wyłączeniem podawania hormonów o dział aniu progesteronu, jest skutecznym sposobem leczenia kobiet w okresie pomenopauzalnym, mających macicę i jajniki. Uprzednio stosowane hormonalne terapie zastępcze polegały na łącznym podawaniu hormonów o działaniu progesteronu, dla osiągnięcia skutecznego działania terapeutycznego, szczególnie u kobiet, które nie zostały poddane operacji wycięcia macicy lub jajników.

Źródłem egzogennego estrogenu stosowanego zgodnie z wynalazkiem może być dowolna odpowiednia postać, przeznaczona do podawania estrogenu pacjentowi. Do odpowiednich postaci egzogennego estrogenu należą zarówno naturalne, jak i syntetyczne związki, wykazujące działanie estrogenowe. Na rynku dostępnych jest szereg postaci egzogennego estrogenu. Tak np. do odpowiednich postaci egzogennego estrogenu należą, ale nie wyłącznie, estradiole, w tym α-estradiol, 17e-estradiol, etynyloestradiol, benzoesan estradiolu i cypionian 17e-estradiolu, estron, estriol, sprzężone estrogeny końskie oraz sole wymienionych związków. Wszystkie wymienione substancje stanowią przykłady steroidów wykazujących działanie estrogenowe. Do przykładów niesteroidowych związków wykazujących działanie estrogenowe należą, ale nie wyłącznie, difosforan dietylostilbestrolu, dipropionian dietylostilbestrolu i heksestrol. Obecnie korzystną postacią egzogennego estrogenu, mającą zastosowanie zgodnie z wynalazkiem, jest estradiol.

Ilość egzogennego estrogenu, jaką należy podać leczonej osobie, jest wystarczająca do osiągnięcia poziomu estradiolu w surowicy co najmniej około 5 pg/ml, ale nie wyższego niż około 20 pg/ml, a korzystnie nie wyższego niż 15 pg/ml. Innymi słowy, podaje się ilość egzogennego estrogenu wystarczającą do osiągnięcia całkowitego poziomu estradiolu w surowicy od co najmniej około 5 pg/ml do około 20 pg/ml. Z uwagi na to, że poziom estradiolu w surowicy nieleczonych osób jest różny u różnych osób, różne osoby mogą wymagać podawania różnych dawek estrogenu dla osiągnięcia żądanego poziomu estradiolu w surowicy. Nie jest konieczne podwyższenie poziomu estradiolu w surowicy każdej z leczonych osób o około 5-20 pg/ml, natomiast całkowity poziom estradiolu w surowicy każdej z leczonych osób musi wynosić co najmniej około 5 pg/ml i nie więcej niż około 20 pg/ml. Często ilość egzogennego estrogenu, jaką należy podać, wystarcza do osiągnięcia poziomu estradiolu w surowicy w zakresie około 5-10 pg/ml. W przeciwieństwie do obowiązującego uprzednio rozumowania stwierdzono, że poziom estradiolu w surowicy w zakresie 5-15 pg/ml powoduje korzystnie spadek ryzyka złamań kręgów i szyjki kości udowej. Podawanie tych niższych niż zazwyczaj ilości egzogennego estrogenu wiąże się z dalszymi korzyściami, jakimi jest zmniejszenie ryzyka niepożądanych skutków ubocznych, związanych ze stosowaniem hormonalnej terapii zastępczej.

Egzogenny estrogen można podawać dowolną odpowiednią drogą. Tak np. znane są preparaty służące do podawania egzogennych estrogenów drogą doustną lub pozajelitową, które można zastosować zgodnie z wynalazkiem. Preparaty odpowiednie do podawania leków drogą doustną mogą być w postaci odrębnych jednostek, jak kapsułki, opłatki, pastylki do ssania lub tabletki, z których każda zawiera ustaloną ilość substancji czynnej; w postaci proszku, granulatu, roztworu, dyspersji lub zawiesiny w ośrodku wodnym lub niewodnym. Takie preparaty można wytworzyć dowolnymi odpowiednimi sposobami farmaceutycznymi, obejmującymi etap połączenia substancji czynnej z odpowiednim nośnikiem (który może zawierać jeden lub większą liczbę składników dodatkowych). Zazwyczaj preparaty wytwarza się przez jednorodne i dokładne zmieszanie substancji czynnej z ciekłym i/lub silnie rozPL 193 897 B1 drobnionym stałym nośnikiem, a następnie, w razie potrzeby, nadanie uzyskanej mieszaninie pożądanego kształtu. Tak np. tabletki można wytworzyć przez sprasowanie lub formowanie proszku lub granulek zawierających substancję czynną, ewentualnie wraz z jednym lub większą liczbą składników dodatkowych. Tabletki sprasowane można wytworzyć przez sprasowanie, w odpowiednim urządzeniu, związku w sypkiej postaci, takiej jak proszek lub granulki, ewentualnie zmieszanego ze środkiem wiążącym, poślizgowym, obojętnym rozcieńczalnikiem i/lub z jednym lub większą liczbą środków powierzchniowo czynnych/dyspergujących. Tabletki formowane można wytworzyć przez formowanie, w odpowiedniej tabletkarce, sproszkowanego związku zwilżonego obojętnym ciekłym środkiem wiążącym.

Ilość egzogennego estrogenu w preparacie do podawania doustnego stanowi bardzo niską dawkę estrogenu, która zależy od konkretnej postaci estrogenu, jaka ma zostać podana, ale zazwyczaj wynosi mniej niż 0,5 mg dziennie. Korzystnie podaje się doustnie około 0,1 - 0,25 mg estrogenu dziennie. Tak np. estradiol podaje się doustnie w dawce około 0,1 - 0,25 mg dziennie. Równoważne dawki innych postaci estrogenu mogą być łatwo ustalone przez fachowców.

Estrogen korzystnie podaje się raczej pozajelitowo lub przezskórnie, niż doustnie. Te dwie pierwsze drogi podawania są korzystniejsze niż droga doustna, ponieważ doustne stosowanie estrogenu może prowadzić do podwyższenia poziomu globuliny wiążącej hormony płciowe. Globulina wiążąca hormony płciowe może zmniejszyć korzyści wynikające z podawania estrogenu osobom po menopauzie, zwłaszcza u osób z objawami osteoporozy lub spadku gęstości mineralnej kości. Chociaż droga doustna nie jest korzystną drogą podawania estrogenów, można jednak stosować preparaty doustne.

Preparaty odpowiednie do podawania pozajelitowego stanowią dogodnie sterylne wodne preparaty substancji czynnej, które to preparaty są korzystnie izotoniczne wobec krwi osoby otrzymującej dany preparat. Preparaty te mogą być stosowane przez wstrzyknięcie podskórnie, dożylnie, domięśniowo, śródskórnie, lub też w postaci pierścienia dopochwowego. Takie preparaty można dogodnie wytworzyć przez zmieszanie substancji czynnej, estrogenu, z wodą lub buforem glicynowym, oraz zapewnienie sterylności otrzymanego roztworu i jego izotoniczności z krwią.

Ilość egzogennego estrogenu, zawarta w preparacie do podawania pozajelitowego, jest bardzo niską dawką, która zależy od konkretnej postaci estrogenu, jaka ma być podawana, ale zazwyczaj wynosi nie więcej niż 20 μg dziennie. Korzystnie ilość stosowanego pozajelitowo estrogenu wynosi około 5-15 μg dziennie, a korzystniej około 10 μg dziennie. Tak np. ilość podawanego pozajelitowo estradiolu wynosi około 5-15 μg dziennie. Równoważne dawki innych postaci estrogenu mogą być łatwo ustalone przez fachowców.

Korzystniej, egzogenny estrogen podaje się przezskórnie. Odpowiednie preparaty do przezskórnego podawania estrogenu są znane fachowcom. Tak np. odpowiednie preparaty w postaci plastrów do przezskórnego podawania egzogennego estrogenu opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4460372, 4573996, 4624665, 4722941 i 5223261.

Jeden odpowiedni rodzaj plastra przezskórnego przedstawia fig. 1. Ogólnie, w skład odpowiedniego przezskórnego plastra 10 wchodzi nieprzepuszczalna podłożowa warstwa 12, przepuszczalna powierzchniowa warstwa 13 oraz warstwa klejowa (nie pokazana), która zasadniczo w sposób ciągły pokrywa przepuszczalną powierzchniową warstwę 13, oraz zbiornik 16 umieszczony lub wstawiony między podłożową warstwą 12 i przepuszczalną powierzchniową warstwę 13, tak że podłożowa warstwa 12 rozciąga się wokół brzegów zbiornika 16 i jest połączona z przepuszczalną powierzchniową warstwą 13 na krawędziach tej przepuszczalnej powierzchniowej warstwy 13. Zbiornik 16 zawiera estrogen w płynie, stykający się z przepuszczalną powierzchniową warstwą 13. Plaster 10 jest przyklejany do skóry za pomocą warstwy klejowej na przepuszczalnej powierzchniowej warstwie 13 w taki sposób, że gdy plaster 10 zostaje nałożony na skórę, przepuszczalna powierzchniowa warstwa 13 znajduje się zasadniczo w stałym kontakcie ze skórą. Gdy plaster 10 zostaje nałożony na skórę, estrogen zawarty w zbiorniku 16 plastra 10 przenika przez przepuszczalną powierzchniową warstwę 13, poprzez warstwę klejową na skórę, a następnie przez skórę. Plaster 10 może ewentualnie zawierać w zbiorniku 16 również jeden lub większą liczbę składników zwiększających penetrację, zwiększających przenikanie estrogenu przez skórę.

Przykłady odpowiednich materiałów, z jakich może być wykonana warstwa podłożowa plastra służącego do podawania leków drogą przezskórną, są dobrze znane fachowcom, i do wytwarzania plastra można zastosować dowolny znany materiał warstwy podłożowej. Konkretne przykłady odpowiednich materiałów warstwy podłożowej stanowią, ale nie wyłącznie, folia poliestrowa, z polietylenu

PL 193 897 B1 o dużej gę stości, z polietylenu o małej gęstości lub z kompozytów polietylenu, polipropylen, polichlorek winylu, polichlorek winylidenu, kopolimery etylen-octan winylu itp.

Przykłady odpowiednich materiałów, z jakich może być zbudowana przepuszczalna warstwa powierzchniowa plastra służącego do podawania leków drogą przezskórną, są również dobrze znane fachowcom, i w plastrach można stosować dowolny materiał, przepuszczalny dla podawanej substancji czynnej, czyli estrogenu. Konkretne przykłady odpowiednich materiałów przepuszczalnej warstwy powierzchniowej stanowią, ale nie wyłącznie, gęste lub mikroporowate folie z polimerów, np. z poliwęglanów, polichlorków winylu, poliamidów, kopolimerów modakrylowych, polisulfonów, polimerów chlorowcowanych, polichloroeterów, polimerów acetalowych, żywic akrylowych itp. Konkretne przykłady znanych materiałów odpowiednich do zastosowania w przepuszczalnych błonach zostały opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3797494.

Do przykładowych odpowiednich klejów, którymi może być powleczona warstwa podłożowa, dla zapewnienia warstwy klejowej, również znanych fachowcom, należą kleje przylepcowe, takie jak kleje zawierające polimery akrylowe i/lub metakrylowe. Do konkretnych przykładów odpowiednich klejów należą polimery estrów kwasu akrylowego lub metakrylowego (np. ich estrów z n-butanolem, n-pentanolem, izopentanolem, 2-metylobutanolem, 1-metylobutanolem, 1-metylopentanolem, 3-metylo-pentanolem, 3-etylobutanolem, izooktanolem, n-dekanolem lub n-dodekanolem), samych lub w postaci kopolimerów z etylenowo nienasyconymi monomerami, takimi jak kwas akrylowy, kwas metakrylowy, akryloamid, metakryloamid, N-alkoksymetyloakryloamidy, N-alkoksymetylometakryloamidy, N-t-butyloakryloamid, kwas itakonowy, octan winylu, N-rozgałęzione kwasy maleamido-C10-24 alkilowe, diakrylan glikolu lub ich mieszaniny; naturalne lub syntetyczne kauczuki, jak kauczuk silikonowy, kauczuk butadienowo-styrenowy, kauczuk eterobutylowy, kauczuk neoprenowy, kauczuk nitrylowy, poliizobutylen, polibutadien oraz poliizopren, elastomery poliuretanowe, polimery winylowe, jak polialkohol winylowy, polietery winylowe, poliwinylopirolidon i polioctan winylu, żywice mocznikowo-formaldehydowe, żywice fenolowo-formaldehydowe, żywice rezorcynowo-formaldehydowe, pochodne celulozy, takie jak etyloceluloza, metyloceluloza, nitroceluloza, octanomaślan celuloza i karboksymetyloceluloza, jak również naturalne żywice, jak guma guar, guma arabska, pektyna, skrobia, destria, żelatyna, kazeina itp. Fachowcom wiadomo, że warstwa klejowa powinna być obojętna dla substancji czynnej, estrogenu, i nie powinna wpływać na przezskórne podawanie estrogenu przez przepuszczalną warstwę powierzchniową. Warstwę klejową plastra korzystnie stanowi klej przylepcowy, dla ułatwienia nakładania plastra na skórze leczonej osoby.

Fachowcom znane są również odpowiednie środki zwiększające przenikanie. Do przykładowych znanych środków zwiększających przenikanie należą alkanole, takie jak etanol, heksanol, cykloheksanol itp.; węglowodory, takie jak heksan, cykloheksan, izopropylobenzen; aldehydy i ketony, takie jak cykloheksanon; acetamid; N,N-di(niższo-alkilo)acetamidy, takie jak N,N-dietyloacetamid, N,N-dimetyloacetamid; N-(2-hydroksyetylo)acetamid; estry, takie jak N,N-di-niższo-alkilosulfotlenki; olejki eteryczne, glikol propylenowy, gliceryna, monolaurynian glicerylu, mirystynian izopropylu oraz oleinian etylu; salicylany; oraz mieszaniny wymienionych powyżej substancji.

Figura 2 przedstawia przykład drugiego rodzaju plastra przezskórnego, odpowiedniego do przezskórnego podawania estrogenu. W tym przykładzie substancja czynna jest umieszczona w warstwie klejowej, a nie w zbiorniku. Przykłady plastrów tego typu są powszechnie znane, i należy do nich np. plaster CLIMERA®, dostępny z Berlex. Przezskórny plaster 20 zawiera podłożową warstwę 22 oraz warstwę 24 kleju zawierającą lek. Warstwa 24 kleju zawierająca lek spełnia podwójną rolę - zapewnia przyleganie plastra 20 do skóry oraz zawiera substancję czynną, estrogen, który ma zostać dostarczony do organizmu. Substancja czynna przedostaje się z warstwy 24 kleju zawierającej lek i przenika przez skórę leczonej osoby wówczas, gdy plaster przylega do skóry.

W tej postaci moż na stosować dowolną z opisanych powyż ej warstw podł oż owych. Ponadto można stosować dowolne opisane powyżej kleje. Warstwę kleju zawierającą lek stanowi stosunkowo jednorodna mieszanina wybranego kleju i substancji czynnej. Zazwyczaj warstwa kleju zawierająca lek ma powłokę, która pokrywa zasadniczo jedną powierzchnię warstwy podłożowej. Warstwa kleju zawierająca lek może również zawierać środek zwiększający penetrację skórną, np. dowolny z opisanych powyżej środków. W takim przypadku środek zwiększający penetrację skórną wchodzi w skład zasadniczo jednorodnej mieszaniny kleju i substancji czynnej.

Dla fachowców będzie jasne, że plastry przezskórne mogą zawierać szereg dodatkowych zaróbek, stosowanych powszechnie dla ułatwienia przezskórnego podawania substancji czynnej, zwłaszcza środka z grupy steroidów. Do przykładów takich zaróbek należą między innymi nośniki, środki

PL 193 897 B1 zagęszczające, środki dyspergujące, środki rozpraszające, konserwanty, stabilizatory, środki zwilżające, emulgatory itp. Konkretne przykłady każdego z tych rodzajów zaróbek są dobrze znane fachowcom i w plastrach przezskórnych może być stosowana każda znana zaróbka. Należy jednakże zauważyć, że plastry przezskórne w zestawach według wynalazku nie zawierają substancji o działaniu progesteronu. W związku z tym substancje o działaniu progesteronu nie są odpowiednimi zaróbkami do stosowania w plastrach przezskórnych w zestawach według wynalazku.

Ilość egzogennego estrogenu w plastrach przezskórnych stanowi bardzo niską dawkę estrogenu, która zależeć będzie od konkretnej postaci estrogenu, jaka ma być podawana, ale wystarczającą dawką jest dawka poniżej 20 μg, a zwykle nie więcej niż 15 μq dziennie. Korzystnie ilość estrogenu dostarczanego przez plaster przezskórny wynosi około 5 - 15 μg dziennie. Korzystniej ilość dostarczanego estrogenu wynosi około 10 μg dziennie. Chociaż dzienna dawka estrogenu stosowanego zgodnie z wynalazkiem wynosi zazwyczaj mniej niż 20 μg, można stosować dawki nawet 25 μg dziennie. Tak np. ilość stosowanego pozajelitowo estradiolu wynosi około 5 - 15 μg dziennie. Równoważne dawki innych postaci estrogenu mogą być łatwo ustalone przez fachowców. Nieoczekiwanie stwierdzono, że bardzo niskie dawki estrogenu, stosowane zgodnie z wynalazkiem, zasadniczo zmniejszają ryzyko powodowanych osteoporozą złamań kości u kobiet po menopauzie.

Zazwyczaj plastry przezskórne są tak wykonane, aby można je było nosić przez kilka dni i zmieniać dopiero po tym czasie. W związku z tym ilość estrogenu zawartego w zbiorniku musi być wystarczająca do zapewnienia podawania mniej niż 20 μg leku dziennie przez okres kilku dni. Tak np. plaster przezskórny w zestawach według wynalazku, przeznaczony do podawania 10 μg estrogenu dziennie przez siedem (7) dni, powinien zawierać około 1 mg estrogenu. Plaster przeznaczony do podawania 15 μg dziennie przez siedem (7) dni, powinien zawierać około 1,4 mg estrogenu. Na podstawie tych konkretnych przykładów fachowcy będą mogli ustalić odpowiednią ilość estrogenu, jaka ma być zawarta w plastrze przezskórnym, aby osiągnąć podawanie właściwej dziennej dawki estrogenu.

Zestaw przeznaczony do stosowania przez osobę z objawami pomenopauzalnej osteoporozy lub narażonego na jej wystąpienie, składa się z plastra przezskórnego oraz instrukcji opisującej sposób stosowania plastra przezskórnego w celu leczenia objawów występujących po menopauzie i/lub zmniejszania ryzyka powodowanych osteoporozą złamań kości u tej osoby. Te instrukcje poinformują osobę przyjmującą, aby za pomocą warstwy klejowej nałożyła plaster bezpośrednio na skórę, np. na ramieniu, w celu uzyskania przezskórnego podawania bardzo niskich dawek estrogenu z plastra, a tym samym podwyższenia poziomu estradiolu w surowicy do poziomu około 5-20 pg/ml. Te instrukcje poinformują również osobę przyjmującą o konieczności zmiany plastra, tak aby uzyskać ciągłe podawanie estrogenu, konieczne do utrzymania odpowiedniego poziomu estradiolu w surowicy. W szczególności te instrukcje mogą informować osobę przyjmującą o konieczności zmiany plastra co siedem (7) dni, tak aby zapewnić podawanie mniej niż 20 μg, a korzystnie mniej niż 10 μg estrogenu dziennie, gdy w zestawie stosowany jest plaster siedmiodniowy. Takie zestawy mogą korzystnie być pakowane i sprzedawane w jednostkach zawierających jeden lub kilka plastrów.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

P r z y k ł a d 1

Poniższy przykład i przedstawione dane wykazują istnienie korelacji pomiędzy poziomem estradiolu w surowicy a ryzykiem powodowanych osteoporozą złamań kości, a także wykazują skuteczność stosowania bardzo małych dawek egzogennego estrogenu w zmniejszaniu ryzyka powodowanych osteoporozą złamań kości oraz skuteczności w leczeniu objawów występujących po menopauzie.

1. Badana populacja

The Study of Osteoporotic Fractures jest badaniem prospektywnym, obejmującym grupę 9704 kobiet, wybranych do badania na podstawie spisów populacji w czterech społecznościach w Stanach Zjednoczonych Ameryki: Baltimore, Minneapolis, Pittsburgh i Portland. Patrz: Cummings i inni, N. Engl. J. Med. 332:767-773 (1995). Kobiety w wieku 65 lat lub starsze były listownie proszone o wzięcie udziału w badaniu. Wśród badanej populacji nie było czarnych kobiet, ze względu na fakt, że ryzyko złamań szyjki kości udowej jest w tej populacji niskie, oraz kobiety, u których wykonano obustronną protezę stawów biodrowych lub te, które przy chodzeniu wymagały pomocy osób trzecich. Uczestniczki badania pytano o obecne lub uprzednie stosowanie estrogenu, suplementacji wapnia oraz stosowanie multiwitamin, zawierających witaminę D.

PL 193 897 B1

2. Pomiary kliniczne

Gęstość mineralną kości (czyli masę kostną kości piętowej) mierzono metodą absorpcjometrii pojedynczego fotonu, z użyciem aparatu OsteoAnalyzer, Siemens-Osteon, Wahiawa, Hawaje. Średni współczynnik wariancji dla tego pomiaru pomiędzy ośrodkami wynosił 1,2%. Patrz Steiger i inni,

J. Bone Miner. Res., 7:625 (1992).

3. Próbki surowicy

Wszystkie uczestniczki badania proszono o przestrzeganie diety beztłuszczowej przez noc oraz rano przed badaniem, w celu obniżenia lipemii, która mogłaby wpłynąć na oznaczenia. Krew pobierano pomiędzy godziną 8 rano a 2 po południu, a surowicę natychmiast mrożono w temperaturze -20°C. Wszystkie próbki dostarczano w ciągu dwóch tygodni do Biomedical Research Institute w Rockville, Maryland, gdzie przechowywano je w ciekłym azocie, w temperaturze -190°C.

4. Stwierdzanie złamań

Z kobietami utrzymywano kontakt raz na cztery miesiące poprzez wysyłanie kart pocztowych lub widywano je na okresowych wizytach lekarskich; obserwacja stanu życiowego oraz ocena złamań szyjki kości udowej była kompletna w ponad 99,7%. Złamania szyjki kości udowej potwierdzano oglądaniem zdjęć rentgenowskich wykonanych przed operacją. Średnio w 3,3 roku po wykonaniu wyjściowego badania radiologicznego 7299 kobiet (79% tych, które przeżyły) powróciło w celu wykonania ponownego bocznego zdjęcia kręgosłupa; stwierdzono, że liczba 7238 par radiogramów wystarczała do oceny występowania złamań kręgów. Radiologiczną ocenę złamań prowadzono metodą ilościowej morfometrii, którą opisali Black i inni, J. Bone Miner. Res. 10:890 (1995). Uznawano, że dana kobieta przebyła złamanie kręgu, gdy wysokość któregokolwiek z kręgów zmniejszyła się o > 20% i > 4 mm w porównaniu z badaniem wyjściowym. Patrz: National Osteoporosis Foundation Working Group on Vertebral Fractures, J. Bone Miner. Res. 10:518 (1995). Oceniający radiogramy nie znali wyników oceny surowicy osób biorących udział w badaniu.

5. Wybór przypadków i prób populacyjnych

Stosując model odnajdowania przypadków chorobowych w losowo wybranej populacji, opisany przez Prentice R.L. w Biometrika 73:1 (1986), z wyłączeniem kobiet, które stosowały wyjściowo hormonalną terapię zastępczą, w losowy sposób wybrano próbki surowicy pochodzące od 133 uczestniczek badania, u których wystąpiło później pierwsze złamanie szyjki kości udowej, oraz od 138 uczestniczek, u których miało miejsce złamanie kręgu. Wybrano także losowe próbki pochodzące od 359 kobiet z grupy, w tym 12 kobiet, u których wystąpiło później złamanie szyjki kości udowej oraz 14, u których wystąpiło później złamanie kręgu. Z analizy złamań szyjki kości udowej, wyłączono osoby z grupy kontrolnej (n = 4), u których miały miejsce złamania szyjki kości udowej przed wizytą wyjściową; z analizy złamań kręgów wyłączono osoby z grupy kontrolnej (n =8), u których nie wykonano badania radiologicznego w okresie obserwacji po badaniu lub te, u których wykonany w okresie obserwacji radiogram nie nadawał się do oceny morfometrycznej z przyczyn technicznych.

6. Analizy biochemiczne

Stabilność wybranych rodzajów pomiarów hormonów u 51 kobiet po menopauzie ustalano poprzez ocenę poziomów hormonów wyjściowo oraz ponownie po 3,5 roku przechowywania w temperaturze -190°C. Korelacje (wszystkie istotne przy poziomie p < 0,001) między tymi dwoma pomiarami były następujące: hormon przytarczyczny z obszaru środkowego (r = 0,99); 25(OH)-witamina D (r = 0,88); testosteron (r = 0,99); oraz estron (r = 0,98). Spadki średnich wartości dla tych substancji, o ile w ogóle występowały, były bardzo nieznaczne. Metoda immunoradiometryczna (IRMA) badania hormonu przytarczycznego nie była dostępna w momencie wykonywania pomiarów wyjściowych; korelacja pomiędzy poziomami mierzonymi metodą IRMA oraz metodą środkowego regionu wynosiła 0,78.

Wszystkie oznaczenia wykonywano w mieszanych partiach przypadków chorobowych i kontrolnych, z utajnieniem informacji na temat złamań występujących u danej uczestniczki badania. Próbki wysyłano bezpośrednio z magazynu do laboratorium analitycznego, bez ich odmrażania. Pierwotnie zaplanowano wykonanie analizy poziomu estronu, ale nie estradiolu. Po zakończeniu pierwszej serii oznaczeń, przeprowadzono dodatkowo pomiary estradiolu i wykonano te oznaczenia w 89 przypadkach złamań szyjki kości udowej, 96 przypadkach złamań kręgów oraz u 204 kobiet, u których nie wystąpiło żadne z tych złamań.

Hormony płciowe oraz globulinę wiążącą hormony płciowe oznaczano w Endocrine Sciences of Calabasas Hills w Kalifornii. Poziom estradiolu i estronu mierzono metodą radioimmunologiczną po ekstrakcji oraz rozdziale w kolumnie 1H2O. Zmienność pomiędzy oznaczeniami dla estradiolu wynosiła od 8% do 12,5%, a dla estronu od 6,2% do 7%. Dolny próg wykrywalności wynosił dla estradiolu 5 pg/ml. Poziom całkowitego testosteronu mierzono metodą radioimmunologiczną po ekstrakcji i chromatograficznym rozdziale w kolumnie z Al2O3, a zmienność pomiędzy oznaczeniami wynosiła od

PL 193 897 B1

6,1% do 13,4%. Zdolność wiązania SHBG mierzono bezpośrednio w surowicy z zastosowaniem metody podstawiania, a zmienność pomiędzy oznaczeniami wynosiła od 4,1% do 14,4%. Stężenie wolnego testosteronu określano po procedurze strącania siarczanem amonu, jak opisali Furuyama i inni, Steroids 16:415 (1970); oraz Mayes, J. Clin. Endocrinol. Metab. 26:1169 (1968). Zmienność pomiędzy oznaczeniami wynosiła od 10,7% do 15,5%.

Hormony kalcytropowe oznaczano w UCSF Calciotropic Hormone Reference Laboratory of San Francisco, w Kalifornii. Poziom hormonu przytarczycznego mierzono metodą radioimmunologiczną, a zmienność jednego oznaczenia wynosiła 5,2%, natomiast zmienność pomiędzy oznaczeniami wynosiła 8,5%. 25(OH)-witaminę D oraz 1,25(OH)2-witaminę D mierzono z zastosowaniem metod radioimmunologicznych, a zmienność jednego oznaczenia wynosiła w obu przypadkach 6,6%, natomiast zmienność pomiędzy oznaczeniami wynosiła odpowiednio 15% i 24,4%. Poziom kreatyniny mierzono z użyciem automatycznego analizatora chemicznego.

7. Analiza danych

Poziomy hormonów i witamin analizowano jako zmienne ciągłe, przez przybliżone kwintyle oraz, gdzie było to odpowiednie, jako zmienne dychotomiczne (powyżej lub poniżej progu wykrywalności). Zastosowano modele logistyczne opracowane przez SAS Institute of Cary, North Carolina, w celu analizy związku pomiędzy czynnikami prognostycznymi a złamaniami kręgów, oraz modele proporcjonalnego ryzyka, uwzględniające model odnajdowania przypadków chorobowych z losowo wybranej populacji (Epicure, Hirosoft International, Seattle, WA) w celu analizy związku pomiędzy czynnikami prognostycznymi a złamaniami szyjki kości udowej. Wszystkie analizy były odnoszone do wyjściowego wieku i masy ciała, a przedstawione zostały jako wartości ryzyka względnego (przybliżone jako ilorazy szans lub ilorazy ryzyka) z 95% przedziałami ufności. Odsetek złamań, którym można przypisać różne poziomy hormonów, oszacowano znanymi metodami opisanymi przez Brownera w Am. J. Epidemiol. 123:143 (1986). Dopasowaną do wieku masę tkanki kostnej porównywano w różnych grupach z zastosowaniem ogólnych modeli liniowych.

8. Wyniki

Przedstawiona poniżej tabela 1 zawiera zebrane dane charakteryzujące uczestniczki badania, u których wystąpiły złamania szyjki kości udowej lub kręgów.

T a b e l a 1

Charakterystyka uczestniczek badania, u których wystąpiły złamania szyjki kości udowej, złamania kręgów oraz osób kontrolnych, bez złamań

	Złamania kręgów	Złamania szyjki
Złamania	Populacja*	Złamania	Populacja
	przypadki	próba	przypadki	próba
Cecha	(n =138)	(n = 264)	(n =133)	(n =343)
Średni wiek (lata)	73,2 f	71,6	75,3Ϊ	72,1
Średnia masa ciała (kg)	63,5Ϊ	68,6	61,9Ϊ	68,2
Obecne palenie papierosów	12%	8,8%	17%ί	9,1%
Obecne stosowanie suplementacji wapnia	53Ϊ	42%	51%	42%
Obecne stosowanie suplementacji witaminy D	43%	42%	43%	48%
Średnie spożycie wapnia z dietą (mg dziennie)	695	693	659	689
Średnia masa kości piętowej (g/cm2)	0,3δΐ	0,41	0,34Ϊ	0,41

* Liczba kontroli dla analizy złamań szyjki koś ci udowej wynosiła od 240 do 343 z uwagi na brakujące dane z oznaczeń estradiolu. Liczba kontroli dla złamań kręgów wynosiła od 193 do 264; jest ona mniejsza z uwagi na wyłączenie osób bez poprawnych technicznie par zdjęć (wyjściowych i w okresie obserwacji) radiologicznych kręgosłupa. Przypadki złamań wyciągano z próby populacji i włączano do grupy przypadków, t p < 0,01 w porównaniu z kontrolą ί p < 0,05 w porównaniu z kontrolą

PL 193 897 B1

Dane te wskazują, że uczestniczki badania, u których wystąpiło załamanie szyjki kości udowej lub kręgu, były starsze, ważyły mniej oraz częściej paliły papierosy, miały niższą masę kostną w porównaniu z osobami kontrolnymi.

U około jednej trzeciej kobiet (81 z 247) w losowej próbce pochodzącej z badanej populacji, poziom estradiolu był poniżej progu wykrywalności (< 5 pg/ml). Dane dotyczące ryzyka względnego, dopasowanego do masy ciała i wieku, przedstawia tabela 2.

T a b e l a 2

Odniesione do wieku i masy ciała związki pomiędzy poziomami hormonów i witamin a ryzykiem złamania szyjki kości udowej i kręgu

		Ryzyko względne (95% C.I.)*
Zmienna	Chorobowość (%)1*	Złamanie szyjki	Złamanie kręgu
Estradiol całkowity < 5 pg/ml	32,8	2,48 (1,35-4,55)	2,46 (1,43-4,22)
Globulina wiążąca hormony płciowe > 0,9 pg/dl	76,4	2,04 (1,06-3,85)	2,27 (1,19-4,35)
Globulina wiążąca hormony płciowe (na 1,0 pg/dl)		1,25 (0,97-1,60)	1,49 (1,15-1,95)
Estron > 1,5 ng/dl	77,4	1,30 (0,76-2,17)	1,72 (1,01-2,94)
Wolny testosteron < 0,7 pg/ml	19,4	1,63 (1,00-2,66)	1,40 (0,83-2,35)
25(OH)-witamina D < 19 ng/ml t	21,5	1,16 (0,70-1,92)	1,08 (0,64-1,80)
1,25(OH)2-witamina D < 23 pg/ml§	15,4	2,05 (1,21-3,46)	1,60 (0,92-2,79)
Nienaruszony PTH > 50 pg/ml	11,2	1,05 (0,52-2,12)	0,49 (0,20-1,17)

* Ryzyko względne oszacowano jako ilorazy szans dla zł amań kręgów oraz ilorazy ryzyka dla złamań szyjki kości udowej.

C.I. = przedział ufności.

' Chorobowość w losowej próbce populacji.

ί Aby przeliczyć wartości dla 25-hydroksywitaminy D na nanomole na litr, należy przemnożyć przez 2,496.

§ Aby przeliczyć wartości dla 1,25-dihydroksywitaminy D na pikomole na litr, należy przemnożyć przez 2,4.

Powyższe dane wskazują, że u kobiet z niewykrywalnym poziomem estradiolu występuje 2,5 razy wyższe ryzyko złamania szyjki kości udowej i złamania kręgu, niż u kobiet z oznaczalnym poziomem tego hormonu. Ocenia się, że 33% złamań szyjki kości udowej i 32% złamań kręgów w tej populacji było związanych z niewykrywalnym poziomem estradiolu. Dane te wydają się odzwierciedlać progowy spadek ryzyka związany ze stężeniami estradiolu > 5 pg/ml. Kobiety, u których poziom całkowitego estradiolu znajdował się w zakresie od 5 do 10 pg/ml, miały o 62% niższe ryzyko złamań szyjki kości udowej (iloraz ryzyka = 0,38; 0,20 do 0,72) oraz o 57% niższe ryzyko złamań kręgów (iloraz szans = 0,43; 95% przedział ufności od 0,25 do 0,76) w porównaniu z kobietami, u których poziom ten jest niższy niż 5 pg/ml.

Wyższe poziomy SHBG były związane z podwyższonym ryzykiem złamań szyjki kości udowej i kręgów. Po dopasowaniu do wieku, każdy wzrost poziomu SHBG o 1,0 pg/dl był związany z 1,44-krotnym (1,16 do 1,80) wzrostem ryzyka złamania szyjki kości udowej oraz 1,65-krotnym (1,30 do 2,10) wzrostem ryzyka złamań kręgów. Dla złamań szyjki kości udowej, ten efekt wydaje się częściowo zależny od masy ciała.

W losowo wybranej próbce populacji, 26% (63 z 244) kobiet miało zarówno niewykrywalny poziom estradiolu oraz poziom SHBG > 1 pg/dl; u tych kobiet ryzyko złamania szyjki kości udowej było 14-krotnie wyższe (95% przedział ufności; 3,0 do 62) a ryzyko złamania kręgów 12-krotnie wyższe (3,3 do 41) niż u innych kobiet. Dopasowanie do masy ciała w pewnym stopniu osłabiło te związki zarówno dla złamań szyjki kości udowej (iloraz ryzyka = 6,9; 1,5 do 32), jak i dla złamań kręgów (iloraz szans = 7,9; 2,2 do 28). Związki pomiędzy estradiolem, SHBG oraz złamaniami kręgów były podobne w podgrupach kobiet, u których wyjściowo występowały złamania kręgów, jak i u tych, u których nie występowały. Ryzyko dla 26% kobiet z tym połączeniem wynosiło 60% dla złamań szyjki kości udowej i 64% dla złamań kręgów.

PL 193 897 B1

Dane z tabeli 2 dotyczące złamań kręgów zostały rozszerzone przez zestaw danych przedstawionych w tabeli 3.

T a b e l a 3

Czynniki prognostyczne złamań kręgów: modele wielozmienne*

	Iloraz szans (95% przedział ufności)
Zmienna (jednostka)	Dopasowany do wielu zmiennych	Dopasowany również do masy kości
Estradiol < 5 pg/ml	2,65 (1,50-4,68)	2,34 (1,30-4,22)
SHBG (na 1 pg/dl wzrostu)	1,62 (1,16-2,26)	1,51 (1,07-2,12)
Estron > 1,5 ng/dl	2,04 (1,03-4,17)	2,33 (1,12-4,76)
Wiek (na 5-letni wzrost)	1,17 (0,89-1,54)	1,09 (0,82-1,44)
Masa ciała (na 10 kg wzrost)	0,71 (0,53-0,94)	0,86 (0,64-1,16)
Masa kości piętowej (na spadek SD) t		2,27 (1,52-3,33)

* Wszystkie wyniki są dopasowane do innych zmiennych w tabeli.

SD - (odchylenie standardowe) kości piętowej wynosi 0,098 g/cm².

' Masa kości piętowej mierzona wyjściowo.

Dane w tabeli 2 pokazują, że kobiety, których poziom estronu znajduje się w najniższym kwintylu (< 1,4 ng/dl) miały wyższe ryzyko złamań kręgów niż kobiety z wyższymi poziomami. Chociaż wśród kobiet z niższym poziomem estronu występowała tendencja do współwystępowania niższego poziomu estradiolu, korelacja pomiędzy poziomami estronu i estradiolu była umiarkowana (r = 0,57), a niski poziom estronu pozostawał związany ze zmniejszonym ryzykiem złamań kręgów po dopasowaniu do poziomów estradiolu, jak pokazano w tabeli 3.

Kobiety, których poziom 1,25(OH)2-witaminy D znajdował się w najniższym kwintylu (< 23 pg/ml [< 55,2 pm/l]) miały istotnie podwyższone ryzyko złamań szyjki kości udowej (iloraz ryzyka = 2,1; 1,2 do 3,5), jak pokazano w tabeli 4.

T a b e l a 4

Czynniki prognostyczne złamań szyjki kości udowej: modele wielozmienne*

	Iloraz ryzyka (95% przedział ufności)
Zmienna (jednostka)	Dopasowany do wielu zmiennych	Dopasowany również do masy kości
Estradiol < 5 pg/ml	2,37 (1,27-1,45)	1,92 (1,01-3,64)
SHBG (na 1 pg/dl wzrostu)	1,34 (0,92-1,95)	1,25 (0,85-1,84)
1,25(OH)2-witamina D < 23 pg/ml§	2,20 (1,00-4,80)	2,16 (0,93-5,00)
Wiek (na 5-letni wzrost)	2,22 (1,50-3,28)	2,09 (1,49-3,10)
Masa ciała (na 10 kg wzrostu)	0,56 (0,39-0,79)	0,67 (0,46-0,98)
Masa kości piętowej (na spadek SD) t		1,61 (1,03-2,56)

* Wszystkie wyniki są dopasowane do innych zmiennych w tabeli.

SD - (odchylenie standardowe) kości piętowej wynosi 0,098 g/cm².

§ Aby przeliczyć wartości dla 1,25-dihydroksywitaminy D na pikomole należy przemnożyć przez 2,4.

Związek ten pozostał istotny po dopasowaniu do poziomów estradiolu i SHBG (iloraz ryzyka = 2,2; 1,0 do 4,8). Dalsze dopasowanie do poziomu kreatyniny w surowicy nie spowodowało żadnej różnicy (iloraz ryzyka = 2,3; 1,0 do 5,2).

Po wykluczeniu kobiet przyjmujących suplementację witaminy D, poziomy 25(OH)-witaminy D (średnia ± SD) były istotnie wyższe w próbkach pobranych od stycznia do czerwca (28,4 ± 10,2 ng/ml [83,6 ± 25,5 nm/litr]) od tych z lipca do grudnia (25,5 ± 10,4 ng/ml [63,6 ± 25,9 nm/litr], p < 0,01). Nie

PL 193 897 B1 było istotnych różnic, gdy poziom witaminy D z kwietnia-września porównano z poziomem w próbkach pobranych od października do marca.

Nie było statystycznie istotnego związku pomiędzy niskim poziomem 25(OH)-witaminy D w surowicy a ryzykiem złamań kręgów (patrz tabela 2), nawet po dopasowaniu do miesiąca, pory roku, kliniki, lub tego, czy w analizie uwzględniono kobiety przyjmujące witaminę D, czy nie.

Dodanie masy kości do wielozmiennych modeli hormonów i ryzyka złamania jedynie w niewielkim stopniu obniżyło znaczenie związku pomiędzy estradiolem, SHBG a ryzykiem złamań szyjki kości udowej lub kręgów, patrz tabele 3 i 4. Dopasowanie do masy kości nie miało zasadniczo żadnego wpływu na poziom zależności pomiędzy 1,25(OH)2-witaminą D a złamaniami szyjki kości udowej lub pomiędzy estronem a złamaniami kręgów.

Połączone dane wskazują, że ryzyko złamań szyjki kości udowej i kręgów u kobiet powyżej 65 roku życia zasadniczo wzrasta, gdy stężenie estradiolu w surowicy wynosi poniżej 5 pg/dl, czyli poniżej progu wykrywalności w oznaczeniu. Około jedną trzecią złamań szyjki kości udowej i kręgów można przypisać tym bardzo niskim poziomom estradiolu. Kobiety, u których poziom estradiolu jest nieco wyższy, w zakresie od 5 do 10 pg/ml, są znacznie mniej narażone na te złamania.

Kobiety, u których poziom estradiolu jest niewykrywalny, mają również niższą masę kostną. Jednakże dopasowanie masy kości piętowej jedynie w umiarkowanym stopniu zmniejszyło podwyższone ryzyko złamań. Sugeruje to, że związek pomiędzy bardzo niskim poziomem estradiolu a ryzykiem złamań jest przynajmniej częściowo niezależny od masy kostnej.

Poziom SHBG wywierał również silny i niezależny wpływ na ryzyko złamań szyjki kości udowej i kręgów. Kobiety, u których stężenia SHBG wynosiły > 1,0 μg/dl, a poziom estradiolu był niewykrywalny, miały ponad siedmiokrotnie wyższe ryzyko złamania szyjki kości udowej lub kręgów, niż kobiety z niższymi poziomami SHBG i wyższymi poziomami estradiolu. SHBG silnie wiąże krążący estradiol, co powoduje, że podwyższony poziom SHBG wiąże się z obniżeniem biodostępności estradiolu. Zatem stężenia dostępnego biologicznie estradiolu mogą być jeszcze silniej związane ze złamaniami niż poziomy estradiolu całkowitego, mierzonego w tym badaniu.

P r z y k ł a d 2

Przykład ten przedstawia porównanie wpływu podawania różnych ilości estrogenu z użyciem siedmiodniowego plastra przezskórnego, na zapobieganie utracie kości u kobiet po menopauzie.

1. Metody

W badaniu udział wzięły zdrowe kobiety po operacji usunięcia macicy, w wieku od 45 do 65 lat, 1-5 lat po menopauzie, z wyjściową mineralną gęstością kości (BDM) mierzoną metodą absorpcjometrii rentgenowskiej podwójnej energii (DEXA) w odcinku L2-L4 z 2,5 SD średniej dla zdrowych kobiet poniżej 45 roku życia. Badane osoby losowo przydzielano do grup otrzymujących od 1 do 4 dawek estradiolu w TTS (plastry o powierzchni 6,5; 12,5; 15 i 25 cm², dostarczające odpowiednio 0,025; 0,05; 0,06 i 0,1 mg estradiolu dziennie) lub do grupy otrzymującej placebo. Jeden plaster był przyczepiany na skórze brzucha raz na tydzień przez cały czas trwania tego dwuletniego badania. BMD w odcinku L2-L4, szyjce kości udowej i przedramieniu, poziom osteokalcyny (OST) w surowicy, oraz stosunek usieciowań deoksypirydynolinowych w moczu do kreatyniny (DPD) mierzono co 6 miesięcy. Przedstawiono wyniki uzyskane po 18 miesiącach leczenia.

2. Wyniki

W badaniu udział wzięło 176 kobiet w średnim wieku 51,2 lat. Łącznie 103 osoby ukończyły 18 miesięczny okres leczenia. Utracie BMD zapobiegały wszystkie dawki we wszystkich punktach czasowych. Po 18 miesiącach, u pacjentek otrzymujących placebo, średni procentowy spadek BMD w odcinku lędźwiowym kręgosłupa wynosił -0,7 ± 4,1 w porównaniu odpowiednio z 3,6 ± 4,7; 3,2 ± 3,1; 3,0 ± 3,6 i 4,8 ± 5,5 dla grup otrzymujących dawki 0,025; 0,05; 0,06 i 0,1 mg dziennie (dla wszystkich różnic p < 0,05 w stosunku do placebo). Po 12 miesiącach, poziom OST spadł w porównaniu z wartością wyjściową we wszystkich grupach poddanych aktywnemu leczeniu (procentowe zmiany wynosiły odpowiednio -30,4 ± 42,9; -17,9 ± 50,7; -13,0 ± 37,6 oraz -26,9 ± 29,8; dla wszystkich różnic p < 0,05 w porównaniu z placebo, + 27,6 ± 60,4). DPD również spadł w porównaniu z wartością wyjściową po 12 miesiącach we wszystkich aktywnie leczonych grupach (zmiany odpowiednio -5,8 ± 3,4; -6,0 ± 8,5; -5,1 ± 7,4 i -1,8 ± 10,8 nmol/mmol). Trzy z czterech grup poddanych aktywnemu leczeniu wykazywały istotne różnice w porównaniu z placebo. DPD spadł jednakże również wśród pacjentek otrzymujących placebo.

PL 193 897 B1

3. Wnioski

Estradiol podawany przezskórnie z użyciem obu obecnie dostępnych dawek CLIMARA® TTS (0,05 i 0,1 mg dziennie), jak również z plastra CLIMARA® TTS o powierzchni 6,5 cm², dostarczającego

0,025 mg estradiolu dziennie, zapobiega pomenopauzalnej utracie tkanki kostnej. Należy oczekiwać, że plaster CLIMARA® TTS, dostarczający 10 - 15 μq dziennie, wpłynąłby na ubytek tkanki kostnej.

P r z y k ł a d 3

Poniższy przykład i przedstawione dane wykazują korelację poziomu estradiolu w surowicy z ubytkiem gęstości mineralnej kości. Przykład ten wykazuje również skuteczność stosowania egzogennego estrogenu w bardzo niskich dawkach w zmniejszaniu spadku gęstości mineralnej kości.

1. Badana populacja

Badane osoby były uczestniczkami Study of Osteoporotic Fractures (SOF), którego szczegóły opisano w przykładzie 1. Niniejsze badanie wykonano na losowo wybranej grupie 261 pacjentek z badania SOF, którym pobrano krew, oraz które miały odpowiednio zmierzoną BMD kości piętowej zarówno w badaniu wyjściowym, jak i w okresie obserwacji w latach 1993-94. Wśród tych kobiet, 241 miało odpowiednio zmierzoną gęstość mineralną kości biodrowej zarówno w drugim roku badania w roku 1990, jak i w okresie obserwacji w latach 1993-94. Ostateczne wyniki badania oparte są na podgrupach 231 i 218 kobiet z kompletnymi parami pomiarów BMD odpowiednio kości piętowej i biodrowej, które nie zgłaszały obecnego stosowania estrogenowej terapii zastępczej podczas badania wyjściowego. Wielkości prób dla poszczególnych oznaczeń nie są identyczne z uwagi na brakujące wartości. Wielkości prób są również niższe dla estradiolu niż dla innych oznaczeń, ponieważ pomiary estradiolu dodano do zestawu oznaczeń po pewnym czasie od rozpoczęcia badania.

2. Pomiary

Podczas wizyty wyjściowej w latach 1986-1988, każdej z badanych kobiet dawano kwestionariusz, w którym pytano o obecne lub uprzednie stosowanie estrogenów, wapnia oraz multiwitamin zawierających witaminę D. Kobiety badano i zapisywano wzrost i masę ciała.

Masę kości piętowej mierzono metodą absorpcjometrii pojedynczego fotonu wyjściowo, oraz podczas wizyty w okresie obserwacji w latach 1993-1994, średnio po 5,9 roku. Gęstość kostną kości biodrowej oraz jej poszczególnych okolic mierzono metodą absorpcjometrii rentgenowskiej o podwójnej energii podczas drugiej wizyty w latach 1988-1990, wśród 82% wyjściowej populacji, która przeżyła. Powtórny pomiar gęstości kości biodrowej wykonano w okresie obserwacji w latach 1993-1994, średnio po 3,5 roku. Średnie współczynniki wariacji (CV), wynoszące 1,2% pomiędzy ośrodkami, zarówno dla kości piętowej, jak i szyjki kości udowej, oszacowano poprzez wykonanie wielu pomiarów wśród tych osób spośród personelu, które odwiedzały inne ośrodki. Pomiaru gęstości kręgosłupa nie wykonano u wystarczająco licznej grupy pacjentów, aby uzyskane wyniki można było uwzględnić w tym badaniu.

3. Próbki surowicy

Podczas badania wyjściowego pobierano krew w godzinach 8:00-14:00, a surowice przechowywano w temperaturze -20°C. W ciągu dwóch tygodni próbki transportowano do Biomedical Research Institute (Rockville, MD) i przechowywano w ciekłym azocie, w temperaturze -190°C. W 1994 roku surowice pochodzące od wybranych uczestniczek badania rozmrożono i oznaczono poziomy krążących hormonów, oraz wykonano inne pomiary biochemiczne. Laboratoria wykonujące oznaczenia nie wiedziały nic o złamaniach występujących u osób, których surowice były oznaczane.

Stabilność wybranych rodzajów pomiarów hormonów w czasie ustalono u 51 kobiet na podstawie oceny poziomów hormonów wyjściowo oraz ponownie, po 3,5 roku przechowywania w temperaturze -190°C. Korelacje między parami pomiarów były następujące: estron (r = 0,98), testosteron całkowity (r = 0,99), hormon przytarczyczny z obszaru środkowego (r = 0,99) oraz 25(OH)-witamina D (r = 0,88). Wszystkie korelacje były istotne na poziomie p < 0,001. Metoda radioimmunometryczna badania hormonu przytarczycznego nie była dostępna w momencie wykonywania pomiarów wyjściowych. Korelacje pomiędzy poziomami PTH mierzonymi metodą IRMA oraz metodą badania hormonu przytarczycznego z regionu środkowego w próbkach mierzona po 3,5 roku przechowywania wynosiła 0,78. Średnie poziomy hormonów nie różniły się zasadniczo pomiędzy tymi dwiema próbkami.

4. Oznaczenia biochemiczne

Stężenia estradiolu, estronu i testosteronu całkowitego w surowicy oznaczano metodą radioimmunologiczną. Zdolność wiązania globuliny wiążącej hormony płciowe mierzono metodą podstawiania. Poziom wolnego testosteronu obliczono mnożąc poziom całkowitego testosteronu przez odsetek steroidu nie związanego z SHBG, ustalony przez strącanie siarczanem amonu. Poziom hormonu przytarczycznego, 25(OH)D oraz 1,25(OH)2D mierzono metodą radioimmunologiczną. Dokładność

PL 193 897 B1 wszystkich pomiarów przedstawiono w tabeli 5, wraz z danymi na temat wartości średnich i odchyleń standardowych, jak również zakresy kwartyli dla każdego hormonu.

T a b e l a 5

Dane uzyskane w oznaczeniach biochemicznych

Czynnik	Korelacja w oznaczeniach	Zmienność między oznaczeniami (%)	N*	Średnia (SD)	Najniższy kwartylt	Q2f	Q3f	Najwyż- szy kwartylt
Steroidy płciowe i SHBG
Estron (ng/ml)	0,97	8-12,5	230	2,3(1,2)	< 1,6	1,6 - <2,3	2,3 - <3,0	> 3,0
Estradiol (pg/ml)	0,96	6,2-7,0	168	6(5)	< 5	5-<7	7-<10	> 10
Wolny testosteron (pg/ml)	0,79	10,7-15,5	230	2,2(1,9)	<0,9	0,9 -<1,5	1,5 - < 2,7	> 2,7
Całkowity testosteron (ng/dl)	0,97	6,1-13,4	230	20,2(15,7)	9,7	9,7-<17,0	17,0 - <6,0	> 26,0
SHBG (pg/dl)	0,95	4,1-14,4	230	1,5(0,8)	<1,1	1,1 - <1,5	1,5 - < 2,4	> 2,4
Hormony kalcytropowe i wapń
PTH (pg/ml)	-	8,5	231	34,3 (23,7)	<23	23 -<31	31 -< 41	> 41
25(OH)D (pg/ml)	-	15,0	231	26,2 (9,8)	<21	21-<25	25 -< 32	> 32
1,25(OH)2D (pg/ml)	-	12,4	229	32,9 (9,7)	<26	26 - <32	32 - < 40	> 40
Wapń (mg/dl)	-	-	231	9,7 (0,5)	<9,5	9,5 - <9,8	9,8 -<10,0	> 10,0

* N, średnia (SD) oraz granice kwartyli obliczono dla utraty tkanki kostnej w kości piętowej.

Liczby dla całkowitej utraty tkanki kostnej w biodrze przedstawia tabela 4. t Zakres wartości dla wskazanego kwartylu.

5. Analizy statystyczne

Wszystkie zmienne biochemiczne, z wyjątkiem estradiolu, analizowano w kwartylach oraz jako zmienne ciągłe. Ponieważ 36% poziomów estradiolu było niższych niż minimalny próg wykrywalności (5 pg/ml), wartości dla estradiolu podzielono na cztery grupy, umieszczając poziomy niewykrywalne w najniższej kategorii, a pozostałe wykrywalne poziomy podzielono na tertyle. Kategorie estradiolu przedstawiono w tabelach w uproszczeniu jako kwartyle. Dla modeli ciągłych, niewykrywalnym poziomom estradiolu przypisywano wartość zero.

W celu analizy związku pomiędzy poziomami hormonów a roczną procentową zmianą BMD, dopasowaną do wieku i masy ciała, stosowano analizę regresji liniowej. Wyniki rocznej bezwzględnej zmiany BMD, włączając klinikę jako współzmienną, były zbliżone i nie zostały przedstawione. Związki pomiędzy poziomami hormonów a ubytkiem kości były słabsze dla szyjki kości udowej, oraz podobne dla okolicy krętarzowej w porównaniu z całym biodrem, w związku z czym przedstawiono jedynie wyniki ubytku kości dla całego biodra. Dopasowaną do wieku i masy ciała średnią procentową zmianę BMD oraz 95% przedziały ufności obliczono w kwartylach dla każdego hormonu stosując metodę najmniejszych kwadratów średnich, a badanie trendu w kwartylach (dopasowanego do wieku i masy ciała) wykorzystywano do oceny istotności statystycznej. Związek pomiędzy ciągłymi poziomami hormonów a roczną procentową zmianą BMD przedstawiono jako standaryzowane współczynniki β, odzwierciedlające różnicę w procentowej rocznej zmianie BMD na wzrost odchylenia standardowego poziomu każdego hormonu.

W celu ustalenia, które zmienne biochemiczne były niezależnymi czynnikami prognostycznymi ubytku kości, opracowano modele wielozmienne, po zbadaniu poziomów innych hormonów.

Ponieważ poziomy estradiolu i estronu były umiarkowanie skorelowane w tej populacji (r = 0,64), tylko te zmienne analizowano w oddzielnych modelach.

6. Wyniki

Charakterystykę wybranej losowo podgrupy ocenianej w tym badaniu przedstawia tabela 2. Charakterystyka ta nie różni się zasadniczo od charakterystyki całej populacji, z której wybrano tę

PL 193 897 B1 grupę. Średni wiek kobiet w tej podgrupie wynosił 71,3 roku. Średnia roczna ubytku kości wynosiła około 1,5% w kości piętowej, oraz 0,5% zarówno dla biodra jako całości, jak i szyjki kości udowej.

T a b e l a 6

Charakterystyka uczestniczek Calcaneal Bone Loss Cohort

Cecha	Populacja badania Calcaneal Bone Loss Cohort, próbka biochemiczna
Liczba	231
Wiek, lata, średnia (SD)	71,3 (4,8)
Masa ciała, kg, średnia (SD)	68,1 (11,7)
Obecna suplementacja wapnia, n (%)	102 (44,2)
Obecna suplementacja witaminy D, n (%)	100 (44,1)
Spożycie wapnia w diecie, mg/dzień, średnia (SD)	687 (390)
Aktywność fizyczna, kJ/tydzień, średnia (SD)	7108 (7497)
BMD kości piętowej, g/cm2, średnia (SD)	0,409 (0,088)
BMD biodra jako całości, g/cm2, średnia (SD)	0,765 (0,124)
BMD szyjki kości udowej, g/cm2, średnia (SD)	0,658 (0,108)
BMD kręgosłupa, g/cm2, średnia (SD)	0,850 (0,154)
Utrata kości piętowej, % rocznie, średnia (SD)	1,48 (1,80)
Utrata kości całego biodra, % rocznie, średnia (SD)	0,49 (1,49)
Utrata szyjki kości udowej, % rocznie, średnia (SD)	0,50 (1,70)

Związki pomiędzy hormonami a zmianą BMD kości piętowej przedstawia tabela 7. Dla modeli regresji liniowej dopasowanych do wieku i masy ciała, jedynie SHBG była istotnym czynnikiem prognostycznym ubytku tkanki kostnej kości piętowej.

T a b e l a 7

Związki pomiędzy hormonami a zmianą BMD kości piętowej. Dostosowana * roczna średnia procentowa zmiana BMD (95% CI)

Czynnik	Różnica na wzrost SD Y	Najniższy kwartyl	Q2	Q3	Najwyższy kwartyl
1	2	3	4	5	6
Steroidy płciowe i SHBG
Estron (ng/ml)	0,2 (0,0;0,5)f	-1,7 (-2,1; -1,2)	-1,5 (-1,9; -1,0)	-1,6 (-2,0; -1,1)	-1,0 (-1,5; -0,6)
Estradiol (ng/ml)	0,2 (-0,1; 0,5)	-1,6 (-2,0; -1,1)	-1,3 (-1,9; -0,6)	-1,3 (-1,9; -0,8)	-1,0 (-1,7; -0,3)
Wolny testosteron (pg/ml)	0,1 (-0,1; 0,4)	-1,9 (-2,4; -1,3)	-1,4 (-1,9; -1,0)	-1,6 (-2,1; -1,2)	-1,2 (-1,6; -0,7)
Całkowity testosteron (ng/dl)	0,0 (-0,2; 0,2)	-1,5 (-1,9; -1,0)	-1,8 (-2,3; -1,4)	-1,2 (-1,7; -0,8)	-1,3 (-1,8; -0,9)
SHBG pg/dl)	-0,6 (-0,8; -0,3) t	-1,2 (-1,6; -0,7)	-1,2 (-1,6; -0,7)	-1,7 (-2,2; -1,3)	-2,2 (-2,9; -1,6) ί
Hormony kalcytropowe i wapń
PTH (pg/ml)	0,0 (-0,2; 0,2)	-1,3 (-1,7; -0,8)	-1,5 (-1,9; -1,0)	-1,6 (-2,0; -1,1)	-1,6 (-2,1; -1,2)
25(OH)D (pg/ml)	-0,1 (-0,3; 0,1)	-1,2 (-1,7; -0,8)	-1,8 (-2,3; -1,4)	-1,3 (-1,8; -0,8)	-1,5 (-2,0; -1,0)

PL 193 897 B1 cd. tabeli 7

1	2	3	4	5	6
1,25(OH)2D (pg/ml)	0,0 (-0,2; 0,2)	-1,3 (-1,8; -0,8)	-1,6 (-2,0; -1,2)	-1,7 (-2,1; -1,2)	-1,3 (-1,8; -0,8)
Wapń (mg/dl)	0,1 (-0,2; 0,3)	-1,4 (-1,8; -0,9)	-1,6 (-2,1; -1,2)	-1,4 (-2,0; -0,9)	-1,5 (-1,9; -1,1)

* Dostosowane do wieku i masy ciała, z wyłączeniem osób stosujących estrogenową terapię zastępczą Y różnica w rocznej procentowej zmianie BMD na wzrost SD dla poziomu hormonu/czynnika fp<0,10 § p < 0,05 + < 0,01

Testy istotności statystycznej dla różnic na SD oparte są na teście H0: β=0 dla szacunkowego parametru liniowego każdego hormonu. Testy istotności w kwartylach oparte są na badaniach trendu.

U kobiet, u których poziomy SHBG znajdują się w najwyższym kwartylu (> 2,4 pg/dl), wystąpił dwukrotnie większy roczny ubytek tkanki kostnej z kości piętowej (średnia zmiana = -2,2%; 95% CI = -2,9%; -1,6%) niż u kobiet, u których poziom tego białka znajdował się w najniższym kwartylu (< 1,1 pg/dl; średnia zmiana = -1,2%; -1,6%; -0,7). Związek pozostawał wysoce istotny nawet po dopasowaniu do poziomów estradiolu, estronu i testosteronu w surowicy (p < 0,002). Tendencje w kierunku zwiększonego ubytku tkanki kostnej w kości piętowej wraz ze zmniejszającym się poziomem hormonu były widoczne w przypadku wszystkich hormonów płciowych (patrz tabela 7), ale żaden nie osiągnął poziomu istotności statystycznej. Związek pomiędzy stężeniami estronu w surowicy, modelowanymi jako zmienna ciągła, a ubytkiem tkanki kostnej z kości piętowej, był na granicy znamienności statystycznej (p < 0,1).

Dane dotyczące związków hormonów ze zmianą BMD biodra jako całości (patrz tabela 8) wykazują, że niższe poziomy zarówno estronu, jak i estradiolu, były w statystycznie istotny sposób związane z większym ubytkiem tkanki kostnej z biodra.

T a b e l a 8

Związki pomiędzy hormonami a zmianą BMD biodra jako całości. Dostosowana * roczna średnia procentowa zmiana BMD (95% CI)

Czynnik	n	Różnica na wzrost SD Y	Najniższy Q2 kwartyl	Q3	Najwyższy kwartyl
Steroidy płciowe i SHBG
Estron (pg/ml)	217	0,2(0,0;0,4)f	-0,8 (-1,2; -0,4)	-0,7 (-1,1; -0,3)	-0,3 (-0,7; 0,2)	-0,1 (-0,5; 0,3)ί
Estradiol (pg/ml)	160	0,2 (0,0; 0,5)	-0,8 (-1,2; -0,3)	-0,8 (-1,2; -0,2)	-0,3 (-0,7; 0,2)	0,1 (-0,5; 0,7)§
Wolny testosteron (pg/ml)	217	0,3 (0,0; 0,5)§	-0,6 (-1,0; -0,1)	-0,5 (-0,9; -0,1)	-0,7 (-1,1;- 0,3)	-0,3 (-0,6; 0,1)
Całkowity testosteron (ng/dl)	217	0,1 (-0,1; 0,3)	-0,6 (-0,9; -0,2)	-0,6 (-1,0; -0,3)	-0,6 (-1,0; -0,2)	-0,1 (-0,5; 0,3)
SHBG (pg/dl)	217	0,1 (-0,4; 0,1)	-0,4 (-0,7; -0,1)	-0,4 (-0,7; 0,0)	-0,7 (-1,7; -0,3)	-0,1 (-1,2; -0,1)
Hormony kalcytropowe i wapń
PTH (pg/ml)	218	0,2 (0,0; 0,4)§	-0,4 (-0,8; 0,0)	-0,6 (-1,0; -0,2)	-0,6 (-1,0; -0,2)	-0,3 (-0,7; 0,1)
25(OH)D (pg/ml)	218	0,2 (0,0; 0,4)§	-0,7 (-1,1; -0,4)	-0,6 (-0,9; -0,2)	-0,5 (-0,9; -0,1)	-0,1 (-0,5; 0,3)§
1,25(OH)2D (pg/ml)	216	0,0 (-0,2; 0,2)	-0,5 (-1,0; -0,1)	-0,6 (-0,9; -0,2)	-0,5 (-0,9; -0,1)	-0,4 (-0,7; 0,0)
Wapń (mg/dl)	218	0,2 (0,0; 0,3)	-0,4 (-0,7; 0,0)	-0,7 (-1,1; -0,4)	-0,5 (-1,0; -0,1)	-0,3 (-0,7; 0,0)

* Dostosowane do wieku i masy ciała, z wyłączeniem osób stosujących estrogenową terapię zastępczą Y Różnica w rocznej procentowej zmianie BMD na wzrost SD dla poziomu hormonu/czynnika t p < 0,10 § p < 0,05 ί p < 0,01

PL 193 897 B1

Testy istotności statystycznej dla różnic na SD oparte są na teście H0: β=0 dla szacunkowego parametru liniowego każdego hormonu. Testy istotności w kwartylach oparte są na badaniach trendu.

Tak np. po dopasowaniu do wieku i masy ciała, u kobiet, u których poziom estradiolu wynosił 10 pg/ml lub więcej, wystąpił niewielki wzrost masy kostnej w okresie obserwacji (średnia roczna zmiana = 0,1%; -0,5; -0,7), podczas gdy u kobiet, u których poziom estradiolu był poniżej 5 pg/ml, następował wyższy ubytek tkanki kostnej biodra (średnia roczna zmiana = -0,8%; -1,2, -0,3).

Wyniki badania średniej procentowej rocznej zmiany gęstości kości w kwartylach testosteronu sugerują istnienie progu: u kobiet, u których poziom testosteronu całkowitego wynosi 26 ng/ml lub więcej (najwyższy kwartyl) roczna procentowa zmiana wynosi jedynie -0,1% (-0,5%; 0,3%), w porównaniu z -0,6% (-0,8%; -0,4%) wśród kobiet, u których poziom ten jest mniejszy niż 26 ng/ml (zsumowane kwartyle 1-3). Różnica była statystycznie istotna (p < 0,05). Obserwowano zwiększony ubytek tkanki kostnej biodra pomiędzy kwartylami SHBG, chociaż ta tendencja nie osiągnęła poziomu istotności statystycznej w dopasowanych do wieku i masy ciała modelach regresji (p = 0,27).

W modelu wielozmiennym, uwzględniającym poziomy SHBG, estradiolu i testosteronu wraz z wiekiem i masą ciała, niższe stężenia testosteronu całkowitego i wyższe stężenia SHBG były niezależnie związane ze zmianą BMD biodra. Dane przedstawia tabela 9.

T a b e l a 9

Model wielozmienny: hormony płciowe, SHBG oraz ubytek masy kostnej całego biodra. Różnica w procentowej zmianie BMD biodra*

Czynnik	Dopasowanie tylko do wieku i masy ciała Y	Model wielozmiennyt
SHBG (na wzrost SD)	-0,3 (-0,6; 0,0)t	-0,3 (-0,6; 0,0)t
Estradiol (na wzrost SD)	0,2 (0,0; 0,5)	0,1 (-0,1; 0,4)
Testosteron całkowity (> 25 ng/dl w stosunku do innych)	0,6 (0,0; 1,2)t	0,6 (0,0; 1,3)t

* Wszystkie analizy uwzględniają jedynie kobiety, u których dla porównania zmierzono poziom estradiolu.

Y Pierwsza kolumna przedstawia wyniki oddzielnych modeli regresji dla każdego hormonu, dopasowane do wieku i masy ciała.

' Druga kolumna przedstawia wyniki modeli regresji pojedynczej, uwzględniające SHBG, estradiol, testosteron całkowity, wiek i masę ciała. ί p < 0,05.

Ponieważ u dużej części kobiet nie wykonano pomiaru estradiolu, nie było jasne, czy istotny związek pomiędzy SHBG a ubytkiem tkanki kostnej biodra w modelu wielozmiennym wynikał z dopasowania do poziomów innych hormonów, czy też silniejszego związku pomiędzy SHBG a ubytkiem tkanki kostnej, występującego w tej podgrupie kobiet. W związku z tym zbadano ponownie dopasowany do wieku i masy ciała związek pomiędzy SHBG a ubytkiem tkanki kostnej biodra wśród kobiet, u których zmierzono poziom estradiolu i stwierdzono, że był on statystycznie istotny, patrz tabela 9.

Gdy estradiol wyrażono jako zmienną ciągłą, nie był w statystycznie istotny sposób związany ze zmianą BMD biodra ani przed, ani po dopasowaniu do testosteronu i SHBG. Jednakże badanie trendu między kwartylami estradiolu wykazało istotność statystyczną po skontrolowaniu dla poziomu SHBG i testosteronu, podczas gdy trend między kwartylami estronu był na granicy istotności statystycznej (p < 0,06).

Jedynie poziomy 25(OH)D były istotnie różne zimą (styczeń-czerwiec) w porównaniu z resztą roku (lipiec-grudzień), a średnie wartości wynosiły 24,0 zimą i 26,9 w innych porach (p = 0,01). Nie było istotnych statystycznie różnic w poziomach hormonów kalcytropowych w pomiarach wykonanych od maja do października w porównaniu z pomiarami wykonanymi od listopada do kwietnia.

Żaden z poziomów hormonów kalcytropowych ani wapnia nie był w istotny sposób związany ze zmianą BMD kości piętowej po skontrolowaniu względem wieku i masy ciała, patrz tabela 7. Było to prawdą nawet po dopasowaniu do pory roku (lipiec-grudzień w stosunku do styczeń-czerwiec) oraz kliniki, a nawet po dopasowaniu lub wyłączeniu obecnego stosowania wapnia lub multiwitamin zawierających witaminę D.

PL 193 897 B1

Niższe poziomy 25(OH)D były w istotny sposób związane z większym ubytkiem tkanki kostnej biodra, patrz tabela 9. U kobiet, u których poziom 25(OH)D znajdował się w najwyższym kwartylu (> 32 pg/ml), występowała średnia roczna zmiana BMD -0,1% (-0,5; 0,3) w porównaniu z -0,7 (-1,1; -0,4) wśród kobiet, u których poziom 25(OH)D był w najniższym kwartylu (< 21 pg/ml). Tendencja ta pozostała statystycznie istotna po dopasowaniu do kliniki, pory roku oraz stosowania wapnia i multiwitamin zawierających witaminę D.

Związek pomiędzy poziomem hormonu przytarczycznego (PTH) a ubytkiem tkanki kostnej z któregokolwiek miejsca nie był stały, patrz tabela 7 i 8. Badanie trendu pomiędzy kwartylami PTH wykazało niezwykły wzór, z większym ubytkiem tkanki kostnej z biodra dla poziomu PTH w środku normy (drugi i trzeci kwartyl), oraz mniejszy ubytek tkanki kostnej u kobiet, u których te wartości bardziej odbiegały od normy (najniższy i najwyższy kwartyl).

7. Wniosek

Uzyskane dane wskazują, że niższy poziom estrogenów w surowicy jest w istotny sposób związany ze zwiększonym ubytkiem tkanki kostnej biodra u kobiet w starszym wieku, nawet po skontrolowaniu dla wieku, masy ciała i poziomów SHBG i testosteronu. W istocie u kobiet, u których poziom estradiolu wynosi 10 pg/ml lub jest wyższy, występował średnio niewielki wzrost masy tkanki kostnej w okresie obserwacji (średnia zmiana roczna = 0,1%; 95% CI = -0,5; 0,7), podczas gdy kobiety, u których poziom estradiolu był niewykrywalny (< 5 pg/ml), traciły tkankę kostną z biodra w tempie niemal 1% rocznie (-0,8%; -1,2; -0,3). Ponieważ ubytek tkanki kostnej może być ważnym czynnikiem ryzyka złamań biodra u kobiet w starszym wieku, odkrycia te sugerują, że nawet umiarkowany wzrost krążących hormonów może skutecznie zmniejszać szybkość ubytku tkanki kostnej oraz częstość złamań.

Stężenia SHBG były silnie związane z ubytkiem tkanki kostnej zarówno z kości piętowej, jak i biodra, niezależnie od wieku, masy ciała i poziomów hormonów płciowych. SHBG wiąże estradiol i testosteron w surowicy z dużym powinowactwem, a związek ten może odzwierciedlać zwiększone zagrożenie ubytku tkanki kostnej, wraz z malejącym poziomem dostępnych biologicznie hormonów płciowych. Jednakże siła tego związku, nawet po dopasowaniu do poziomu estradiolu i testosteronu w surowicy sugeruje, że SHBG może wywierać inny wpływ na kości.

Niższe poziomy 25(OH)D wiążą się z szybszym ubytkiem tkanki kostnej z biodra, ale nie z kości piętowej. Uzyskane uprzednio wyniki badania przekrojowego były mieszane: w dwóch badaniach stwierdzono, że u kobiet po menopauzie z niższymi poziomami 25(OH)D, gęstość mineralna kości jest mniejsza (patrz Villareal, J. Clin. Endocrin. Metab. 72(3):628-634 (1991); Martinez i inni, Calcified Tissue International 55(4):253-256 (1994)), ale przynajmniej w jednym badaniu przekrojowym nie wykazano statystycznego związku pomiędzy 25(OH)D a gęstością mineralną kości w dystalnym odcinku kości promieniowej, środkowym odcinku kości promieniowej, ani lędźwiowym odcinku kręgosłupa (patrz Tsai i inni, Calcified Tissue International 40(5):241-243 (1987)). Jednakże badanie przeprowadzone przez Tsai i innych uwzględniało osoby w szerokim zakresie wieku (33-94), a autorzy nie informują o związkach mierzonych osobno dla kobiet w starszym wieku.

W badaniu tym poziomy PTH nie były związane z ubytkiem tkanki kostnej z kości piętowej ani biodra. Było to prawdą nawet po dopasowaniu do pory roku oraz po wyłączeniu kobiet przyjmujących wapń lub witaminę D.

Badanie to jest badaniem prospektywnym, mierzącym szybkość zmian masy tkanki kostnej, a nie przekrojowym pomiarem masy tkanki kostnej. Próbki surowicy pobierano przed pomiarem zmiany masy tkanki kostnej. Liczebność próby była znacznie większa niż w większości podobnych badań, a osoby wybrane zostały z populacji kobiet w starszym wieku, mieszkających w oddzielnych społecznościach w Stanach Zjednoczonych Ameryki.

W podsumowaniu, uzyskane wyniki wykazują, że SHBG oraz endogenne estrogeny są ważnymi czynnikami, określającymi ubytek tkanki kostnej u kobiet w starszym wieku. Niższe poziomy 25(OH)D związane są z szybszym ubytkiem tkanki kostnej z biodra, ale nie z kości piętowej. Poziomy PTH oraz innych hormonów kalcytropowych nie wpływają w istotny sposób na ubytek tkanki kostnej u kobiet w starszym wieku.

P r z y k ł a d 4

Poniższy przykład i uzyskane dane wykazują korelację pomiędzy poziomem estradiolu w surowicy a gęstością kości.

PL 193 897 B1

1. Badana populacja

Osoby objęte tą analizą były uczestniczkami Study of Osteoporotic Fractures (SOF), opisanego w przykładzie 1.

Z wszystkimi 9704 uczestniczkami SOF przeprowadzono wywiad i zbadano w jednym z ośrodków prowadzących badanie w okresie wizyty wyjściowej w latach 1986-1988. Podczas tej wizyty zebrano szczegółowe dane na temat rozpoznanych przez lekarza stanów medycznych oraz stosowanych uprzednio leków. Wykonano standaryzowane pomiary wzrostu, masy ciała i siły. Zmierzyliśmy BMD kości piętowej oraz proksymalnej jednej trzeciej części kości promieniowej, stosując absorpcjometrię pojedynczego fotonu. Wykonano radiologiczne zdjęcia boczne odcinka piersiowego i lędźwiowego kręgosłupa. Od każdej uczestniczek badania pobrano próbki surowicy.

Uczestniczki badania wypełniały roczne kwestionariusze i 3 razy co dwa lata zgłaszały się na obserwację do kliniki. Podczas pierwszej wizyty w okresie obserwacji (przeprowadzonej w latach 1988-1990), zmierzono BMD proksymalnego odcinka kości udowej, metodą absorpcjometrii rentgenowskiej o podwójnej energii (DXA). Szczegóły dotyczące metod tych pomiarów oraz procedur sprawdzających jakość densytometrii opisane zostały w pracy Steiger i inni, J. Bone Miner. Res. 7:625-632 (1992).

2. Próbki surowicy i badania biochemiczne

Wszystkie uczestniczki badania poinstruowano, aby od wieczora poprzedzającego oznaczenia stosowały dietę beztłuszczową dla zminimalizowania porannej lipemii, która mogłaby wpłynąć na wynik oznaczenia. Krew pobierano w godzinach 8:00-14:00, a surowice przechowywano w temperaturze -20°C. W ciągu dwóch tygodni próbki transportowano do Biomedical Research Institute (Rockville, MD) i przechowywano w ciekłym azocie (w temperaturze około -190°C). Stabilność tych pomiarów w czasie ustalono poprzez porównanie wyników uzyskanych dla stężenia estradiolu po dwóch tygodniach przechowywania w temperaturze -20°C z wynikami uzyskanymi po 3,5 roku przechowywania w temperaturze -190°C; dla 51 próbek, współczynnik korelacji wynosił 0,94, a wartości średnie (±SD) wynosiły 11,8 (9,0) po 2 tygodniach oraz 10,9 (9,0) po 3,5 roku.

W pierwszej badanej populacji, badania biochemiczne, prowadzone na surowicach pobranych wyjściowo, były dostępne od 400 losowo wybranych uczestniczek. W tej analizie wykluczono kobiety, u których nie wykonano pomiarów estradiolu w surowicy (n = 134) oraz te, które zgłaszały bieżące stosowanie układowej terapii estrogenowej (n = 39); analiza ta objęła ostatecznie 247 kobiet.

U każdej z badanych osób wykonano następujące oznaczenia biochemiczne: do czynników kalcytropowych należały wapń, 25-hydroksywitamina D, 1,25-dihydroksywitamina D oraz hormon przytarczyczny; do czynników wzrostu należały insulinopodobny czynnik wzrostu-1 oraz białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu-3; do markerów tworzenia kości należały swoista kostna fosfataza alkaliczna oraz osteokalcyna; do hormonów płciowych i nadnerczowych należały estradiol, estron, testosteron (całkowity i wolny), SHBG, siarczan dehydroepiandrosteronu (DHEAS); do innych badań endokrynologicznych należało badanie hormonu tyreotropowego (TSH). Sposoby prowadzenia tych oznaczeń biochemicznych opisane zostały w pracy Reginster i innych, Calcif. Tissue Intl. 51:340-343 (1992). Oznaczenia immunologiczne estradiolu wykonywano w Endocrine Sciences Laboratory (Tarzana, CA), w którym stosowano oznaczenie o wysokiej czułości, w którym dolny próg wykrywalności wynosił 5 pg/ml.

Dla uwiarygodnienia wyników w niezależnej populacji, zmierzono poziom estradiolu w surowicy w drugiej losowo wybranej próbie 222 uczestniczek badania SOF, które spełniały te same kryteria włączania i wyłączania z badania, co próba analizowana. Pomiar poziomu estradiolu w surowicy w drugiej próbie wykonano w Corning Nichols Institute (San Juan Capistrano, CA), w którym stosowano bardzo czułą metodę, w której dolny próg wykrywalności wynosił 2 pg/ml. Wyniki 22 pomiarów podzielonych próbek surowicy w dwóch referencyjnych laboratoriach były podobne (współczynnik korelacji = 0,9; nachylenie 1,3).

3. Ustalanie odkształcenia kręgów

Do rozpoznania wyjściowych odkształceń kręgów stosowano radiologiczne badanie morfometryczne; kryteriami rozpoznania odkształceń było > 3 SD zmniejszenie albo przedniej, środkowej albo tylnej wysokości co najmniej jednego kręgu. Patrz Black i inni, J. Bone Miner. Res. 10:890-902 (1995).

4. Analizy statystyczne

Analizy wykonywano w Ośrodku Koordynacyjnym SOF w University of California, San Fransisco.

W pierwszej próbie (n = 247), kobiety podzielono na cztery grupy w oparciu o poziom estradiolu: w 1 grupie znalazły się kobiety z niewykrywalnym poziomem estradiolu (n = 81, 32,8%); pozostałe kobiety

PL 193 897 B1 podzielono na 3 w przybliżeniu równe grupy, w oparciu o poziom estradiolu 5-6 pg/ml, 7-9 pg/ml i 10-25 pg/ml; liczba pacjentek w każdej z grup wynosiła 55 (22,3%), 63 (25,5%) i 48 (19,4%). W drugiej próbie (uwiarygodniającej, n = 222) stosowano te same podziały w zależności od poziomu estradiolu; odsetki osób w tych grupach wynosiły 25,2%; 27,5%; 24,8% i 22,5%.

Uzyskane wyniki analizowano, dopasowując do masy ciała i wieku osoby badanej. Ponieważ masa ciała i BMI są silnie skorelowane i ponieważ masa ciała wykazuje silniejszą korelację z BMD, patrz Bauer i inni, Ann. Intern. Med. 118:657-665 (1993), w następnych modelach włączono masę ciała. Następnie oceniono możliwy udział współzmiennych poprzez, po pierwsze, zbadanie zmiennych, które uznano za potencjalne czynniki prognostyczne gęstości kości lub wywołanych osteoporozą złamań. Jeżeli jakikolwiek czynnik wykazywał zgodny trend (analiza wariancji z testem dla trendu liniowego) między warstwami estradiolu, oceniano dalej jego wpływ w modelach wielozmiennych, których wynikami były gęstość kości oraz cztery interesujące nas miejsca w układzie szkieletowym. W skład tych modeli wchodził wiek, klinika, oraz poziom estradiolu, jak również badana zmienna prognostyczna. Jeżeli badana zmienna utrzymywała się w większości tych modeli, była uważana za czynnik przyczynowy. Do modelu dodano również siłę uścisku i obecne palenie papierosów, gdyż we wcześniejszych badaniach wykazano, że te zmienne są czynnikami prognostycznymi BMD (patrz Bauer i inni, Ann. Intern. Med. 118:657-665 (1993)) oraz złamań (patrz Cummings i inni, N. Engl. J. Med. 332:767-773 (1995)).

Z zastosowaniem analizy wariancji obliczono dopasowaną średnią BMD dla każdego przedziału estradiolu. Test Dunetta stosowano dla ustalenia istotności statystycznej pomiędzy dopasowanymi wartościami BMD najniższego przedziału (niewykrywalny poziom estradiolu), i każdego z trzech wyższych przedziałów. Model regresji logistycznej stosowano dla obliczenia wielokrotnie-dopasowanych ilorazów szans (OF) i 95% przedziałów ufności dla ryzyka odkształceń kręgów dla każdej z trzech wyższych warstw estradiolu względem warstwy najniższej. Analizy wykonano z zastosowaniem SAS (SAS Institute, Cary, NC).

5. Cechy badanych osób w zależności od poziomu estradiolu

Wartości kliniczne pomiarów dla kobiet biorących udział w tym badaniu przedstawia tabela 10.

T a b e l a 10

Wartości kliniczne i laboratoryjne zmierzone u 247 kobiet w starszym wieku, pogrupowanych w zależności od poziomu estradiolu w surowicy

POZIOM ESTRADIOLU W SUROWICY
Dla zmiennej	niewykrywalny (n = 81)	5-6 pg/ml (n = 55)	7-9 pg/ml (n = 63)	10-25 pg/ml (n = 48)	wartość P Trend liniowy
1	2	3	4	5	6
Średnia (SD)
Wiek, lata	71,8 (4,8)	72,9 (4,8)	71,1 (4,8)	71,8 (5,7)	0,57
Wzrost, cm	158,9 (6,1)	159,9 (6,1)	158,1 (5,4)	159,1 (6,3)	0,84
Masa ciała, kg	65,2 (10,3)	65,0 (11,3)	69,9 (11,3)	77,3 (15,4)	< 0,001
Stosunek obwodu talia : biodra	0,81 (0,08)	0,82 (0,06)	0,81 (0,06)	0,83 (0,08)	0,08
Siła uścisku, kg	21,6 (4,5)	20,5 (4,6)	22,8 (4,7)	21,5 (5,3)	0,48
Poziom estronu, pg/ml	16,8 (8,7)	18,3 (8,6)	25,3 (7,4)	38,4 (13,6)	< 0,001
Poziom testosteronu, ng/ml	13,9 (11,1)	16,7 (9,6)	20,5 (15,5)	27,0 (15,3)	< 0,001
Poziom osteokalcyny, ng/ml	25,8 (10,5)	25,2 (9,1)	24,9 (9,8)	23,0 (12,7)	0,17
Poziom SHBG, pg/dl	1,7 (1,0)	1,6 (0,9)	1,4 (0,7)	1,4 (0,6)	0,01
Odsetek
Zły stan zdrowia	21	11	11	15	0,22
>1 upadek w zeszłym roku	33	20	26	29	0,59
Palenie, obecnie	7	9	5	9	0,11

PL 193 897 B1 cd. tabeli 10

1	2	3	4	5	6
Spożycie wapnia < 400 mg	11	20	14	4	0,32
Cukrzyca	9	9	10	13	0,52
Stosowanie tiazydów, obecnie	23%	15%	27%	36%	0,07
Stosowanie hormonów tarczycy, obecnie	7	17	11	15	0,28
> 10-letnie stosowanie estrogenu przed badaniem	8	11	10	11	0,69

Średni wiek kobiet biorących udział w tym badaniu wynosił około 72 lata (tabela 10). Średni poziom estradiolu zmieniał się w zależności od wieku; u osób w wieku 65-74 lat, średni (SD) poziom estradiolu wynosił 5,8 (5,1) pg/ml, w porównaniu z poziomem 6,3 (4,9) pg/ml u osób w wieku > 80 lat. Wzrost nie różnił się w różnych warstwach estradiolu. Masa ciała była w statystycznie istotny sposób wyższa u kobiet w najwyższej warstwie estradiolu. Wyniki badań biochemicznych nie wykazały dużych ani stałych różnic w różnych warstwach estradiolu, włączając czynniki kalcytropowe, czynniki wzrostowe, swoistą dla kości fosfatazę alkaliczną oraz DHEAS (wyników nie przedstawiono). Poziomy estronu i całkowitego testosteronu były około dwukrotnie wyższe u kobiet z najwyższym poziomem estradiolu w porównaniu z tymi, u których poziom estradiolu był niewykrywalny. Kilka zmiennych, włączając te związane z masą ciała, wykazywało stałe i wyraźne różnice w różnych warstwach estradiolu. Poziom osteokalcyny był niższy przy wyższych poziomach estradiolu; w warstwie najwyższej był o 10,9% niższy niż w najniższej warstwie (niewykrywalny poziom estradiolu). Ponieważ masa ciała i SHBG również wykazywały różnice w różnych warstwach estradiolu, a wyniki były zbliżone do 4 wyników BMD, zmienne te zostały włączone, wraz z wiekiem, siłą uścisku oraz obecnym paleniem papierosów, do modelu.

Dopasowana do wieku i masy ciała wyjściowa BMD we wszystkich czterech miejscach w układzie szkieletowym wykazywała podobną tendencję - była wyższa przy wyższym poziomie estradiolu. W porównaniu z kobietami, których poziom estradiolu w surowicy wynosi < 5 pg/ml, kobiety, u których poziom ten wynosił 10-25 pg/ml, miały statystycznie wyższą średnią BMD we wszystkich miejscach w układzie szkieletowym; różnica wynosiła 4,6%; 6,1%, 5,8% i 7,1% dla całego biodra, kości piętowej, proksymalnego odcinka kości promieniowej oraz kręgosłupa (p < 0,05 dla każdego porównania). Po wielokrotnym dopasowaniu, różnica pozostała statystycznie istotna: 5,7%; 6,3%; 6,5% i 6,9% dla całego biodra, kości piętowej, proksymalnego odcinka kości promieniowej oraz kręgosłupa.

Kobiety w badaniu uwiarygodniającym wykazywały podobne cechy, jak kobiety w naszym początkowym badaniu, włączając poziomy estradiolu w surowicy. W populacji badania uwiarygodniającego występowały podobne związki pomiędzy poziomem estradiolu w surowicy a BMD. Dopasowane do wieku i masy ciała BMD we wszystkich czterech miejscach w układzie szkieletowym wykazywały podobną tendencję, jak w populacji pierwszego badania. W porównaniu z kobietami, u których poziom estradiolu w surowicy wynosi < 5 pg/ml, u kobiet, u których poziom ten wynosił 10-25 pg/ml, BMD wynosiła 4,9%; 9,6%, 7,3% i 6,8% dla całego biodra, kości piętowej, proksymalnego odcinka kości promieniowej oraz kręgosłupa. Po wielokrotnym dopasowaniu, różnica pozostała statystycznie istotna: 3,8%; 7,0%; 5,4% i 6,9% dla całego biodra, kości piętowej, proksymalnego odcinka kości promieniowej oraz kręgosłupa.

Spośród kobiet w warstwie o najniższym poziomie estradiolu w surowicy (< 5 pg/ml), 30% miało > 1 zniekształcenie kręgu, natomiast występowanie odkształceń kręgów w innych warstwach pozostawało w zakresie 7-19%. Po dopasowaniu do wieku i masy ciała, zniekształcenia kręgów były o 60% rzadsze wśród kobiet z poziomem estradiolu w granicach 5-25 pg/ml, w porównaniu z tymi, u których poziom estradiolu był niewykrywalny (OR = 0,4; 95% przedział ufności (CI) 0,2-0,8); wielokrotne dopasowanie wywarło minimalny wpływ na ten stosunek (OR = 0,4; CI 0,2-0,7). W populacji badania uwiarygodniającego nie stwierdzono tendencji w kierunku związku pomiędzy poziomem estradiolu a występowaniem zniekształceń kręgów; występowanie zniekształceń kręgów było podobne we wszystkich warstwach i znajdowało się w zakresie od 15% do 19%.

PL 193 897 B1

6. Wnioski

Dane te wskazują, że poziomy estradiolu w surowicy poniżej 5 pg/ml są szkodliwe dla stanu zdrowia układu kostnego u kobiet w starszym wieku. Po dopasowaniu do wieku i masy ciała, dane wskazują, że kobiety, u których poziom estradiolu wynosi < 5 pg/ml, miały znacznie mniejszą BMD we wszystkich mierzonych miejscach w układzie kostnym. Ponadto dane te wskazują, że osteokalcyna, wskaźnik obrotu tkanki kostnej, wykazuje tendencję do wyższych wartości u kobiet z niższymi poziomami estradiolu w surowicy. W związku z tym niskie poziomy estradiolu wywierają istotny klinicznie wpływ na układ kostny u kobiet w starszym wieku. Prawdopodobnym tego wytłumaczeniem jest fakt, że estradiol, gdy znajduje się w niskich stężeniach, zmniejsza przebudowę tkanki kostnej, zapewniając zarówno wyższą jakość, jak i większą masę kości, zmniejszając tym samym częstość złamań.

Obserwowana różnica w BMD była wyraźna i odpowiadała około 0,4 odchylenia standardowego (SD), nawet po dopasowaniu do wielu czynników. Oczekuje się, że różnica ta zmniejszy o 30% ryzyko złamań szyjki kości udowej (przy założeniu 1,0 SD = 0,11 g/cm² oraz różnica SD 1,0 = RR 2,8). Na podstawie podobnych obliczeń szacuje się, że wzrost gęstości tkanki kostnej kręgosłupa, związany z poziomem estradiolu w surowicy 10 - 25 pg/ml, równoważny około 0,4 SD, zmniejszy ryzyko złamań kręgosłupa o 23% (przy założeniu 1,0 SD = 0,17 g/cm² oraz różnica SD 1,0 = RR 2,1).

Estron był hormonem szeroko badanym jako czynnik prognostyczny stanu zdrowia układu kostnego u kobiet po menopauzie.

Odkryto, że BMD była związana z poziomami estronu w surowicy zarówno u białych, jak i u czarnych kobiet (patrz Cauley i inni, Am. J. Epid. 139:1035-1046 (1994)). Ograniczeniem tego badania był jednakże poziom estradiolu poniżej progu wykrywalności u ponad połowy kobiet. Estron nie pozwalał na przewidzenie złamań szyjki kości udowej. U kobiet po menopauzie, estron jest pod względem ilościowym dominującym estrogenem i jest wytwarzany głównie w wyniku przemiany androstenodionu nadnerczowego. Estradiol jest wytwarzany przez redukcję estronu oraz przez aromatyzację testosteronu pochodzenia jajnikowego i nadnerczowego, który z kolei pochodzi z przemiany androstenodionu i DHEA (patrz Cauley i inni, Am. J. Epid. 139:1035-1046 (1994)). Dane wykazują stosunkowo silną korelację z poziomami estronu i estradiolu w surowicy, zarówno w próbie wyjściowej (r = 0,65), jak i w próbie z badania uwiarygodniającego (r = 0,78). Uważa się, że estradiol, ale nie estron, jest hormonem efektorowym w receptorze jądrowym (patrz Grodin i inni, J. Clin. Endo. Metab. 36:207-214 (1973)). Estradiol jest również 4 do 10 razy silniejszym hormonem niż estron. Można zatem spodziewać się, że estradiol jest głównym steroidowym hormonem płciowym, wykazującym silną, stałą i dodatnią korelację ze stanem układu kostnego.

Estradiol może wywoływać korzystne działania na układ kostny w kilku możliwych mechanizmach: hormon ten zmniejsza aktywację jednostek metabolicznych kości; ma działanie przeciwstawne w stosunku do wywieranej przez hormon przytarczyczny resorpcji kości; może zwiększać przeżywalność osteoblastów poprzez uwalniane lokalnie cytokiny lub inne czynniki wzrostowe; poprawia zarówno skuteczność wchłaniania wapnia w przewodzie pokarmowym, jak i zatrzymywanie wapnia w nerkach. Niektóre, lub wszystkie z wymienionych powyżej działań, mogą odpowiadać na bardzo niskie poziomy estradiolu. Obecne dane również potwierdzają wpływ estradiolu na zmniejszenie obrotu tkanki kostnej. W pośredni sposób, estradiol mógłby mieć wpływ na tkankę kostną poprzez wpływ na masę ciała, ale dane dopasowane do masy ciała wciąż wykazywały silny związek.

W przeszłości badania nad działaniem estradiolu były ograniczone z uwagi na mało czułe metody pomiaru. Jedynie bardzo czułe i precyzyjne metody pozwalają na odróżnienie pomiędzy niskim (< 30 pg/ml) a bardzo niskim (< 5 pg/ml) poziomem estradiolu. Niewiele komercyjnych laboratoriów oferuje oznaczenia estradiolu, których dolny próg wykrywalności wynosi poniżej 20 pg/ml. Niedostępność takich czułych metod oznaczeń mogła utrudnić innym badaczom wykrycie tych związków. Różnica wpływu niskiego a bardzo niskiego wytwarzania estradiolu jest subtelna, a różnice w BMD mogą pojawić się dopiero po wielu latach. Dane przekrojowe sugerują, że poziomy estradiolu nie spadają po przekroczeniu wieku 65 lat.

Uzyskane wyniki wskazują na ochronne działanie niskich poziomów estradiolu na niską masę kostną i złamania; to działanie jest stałe, ponieważ obserwuje się je dla gęstości kostnej w różnych miejscach szkieletu, dla ubytku tkanki kostnej z biodra i kości piętowej, a także dla ryzyka złamań kręgosłupa. Wyniki zostały odtworzone z zastosowaniem wysoce czułej metody wykrywania estradiolu w innym laboratorium. Korzystne działania estradiolu u osób w starszym wieku występują przy poziomach, o których sądzono poprzednio, że nie wywołują działania biologicznego.

Claims (8)

1. Zastosowanie estrogenu do wytwarzania leku do leczenia stanów chorobowych u osoby po menopauzie, które to stany chorobowe są wybrane z grupy obejmującej pomenopauzalny spadek poziomu estrogenu, zwiększone ryzyko osteoporotycznych złamań kości spowodowanych osteoporozą pomenopauzalną i ubytek gęstości mineralnej kości, do przezskórnego podawania tej osobie, przy czym ilość podawanego estrogenu wynosi 10 - 25 pg/dzień.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym ilość podawanego estrogenu skutecznie zapewnia osiągnięcie poziomu estrogenu w surowicy równoważnego poziomowi estradiolu w surowicy w zakresie około 5-10 pg/ml.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym jako estrogen stosuje się estradiol.

4. Zestaw do ogólnoustrojowego podawania leku osobie dotkniętej lub podatnej na ogólnoustrojowe stany chorobowe wynikające z pomenopauzalnego spadku poziomu estrogenu, takie jak osteoporoza, ból głowy, mdłości, depresja, uderzenia krwi do głowy, spadek gęstości minerałów w kości lub zwiększone ryzyko złamania kości, znamienny tym, że zawiera:

a) plaster przezskórny, przeznaczony do przezskórnego podawania estrogenu w ilości odpowiadającej 10 - 25 pg estradiolu dziennie; oraz

b) instrukcje dotyczące sposobu stosowania plastra przezskórnego, dla zmniejszenia ryzyka wywołanych osteoporozą złamań kości u tej osoby.

5. Zastosowanie estrogenu do wytwarzania leku do leczenia stanów chorobowych u osoby po menopauzie, do przezskórnego podawania tej osobie estrogenu w ilości odpowiadającej 10 - 25 pg estradiolu dziennie, pod nieobecność egzogennych substancji o działaniu progesteronu, które to stany chorobowe są wybrane z grupy obejmującej pomenopauzalny spadek poziomu estrogenu, zwiększone ryzyko osteoporotycznych złamań kości spowodowanych osteoporozą pomenopauzalną i ubytek gęstości mineralnej kości.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, w którym podawanie odbywa się przed wykonaniem zabiegu usunięcia macicy u tej osoby.

7. Zastosowanie według zastrz. 5, w którym jako estrogen stosuje się estradiol.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, obejmujące ponadto etap badania poziomu estradiolu w surowicy tej osoby oraz ustalenie, że poziom estradiolu w surowicy osoby, która ma być leczona, jest prawidłowy dla kobiet po menopauzie w tej samej grupie wiekowej jak dana osoba.