PL194141B1 - Plazmidowy wektor ekspresyjny, plazmidy pPTAI, pHIS, pLMT8.5 sposób ekstrahowania zrekombinowanego białka, sposoby wytwarzania zrekombinowanej ludzkiej insuliny lub peptydu-C proinsuliny lub proinsuliny - Google Patents

Abstract

1. Plazmidowy wektor ekspresyjny do ekspresji co najmniej jednego bialka heterologicznego, znamienny tym, ze zawiera nastepujace elementy polaczone w sposób funkcjonalny, od 5' do 3': (i) sekwencje kodujaca poczatek regionu replikacji z pUC8; (ii) sekwencje kodujaca promotor PL z faga Lambda; (iii) sekwencje kodujaca region Shine -Dalgarno; (iv) sekwencje kodujaca co najmniej jedno miejsce restrykcyjne do wstawienia heterologicznego DNA ko- dujacego co najmniej jedno bialko heterologiczne, oraz (v) sekwencje kodujaca terminator transkrypcji Rho-niezalezny. 21. Sposób wytwarzania zrekombinowanej ludzkiej insuliny, znamienny tym, ze ze zrekombinowanej bak- terii Gram-ujemnej posiadajacej blone komórkowa, bez lizy bakterii, ekstrahuje sie rekombinowane bialko, którym jest rekombinowana ludzka proinsulina znakowana HIS przez (a) doprowadzenie do kontaktu bakterii z detergentem w celu uzyskania przepuszczal rekombinowanego bialka z blony komórkowej; (b) solubilizacje rekombinowanego bialka i blony komórkowej, oraz (c) oddzielenie rekombinowanego bialka od blony komórkowej po czym oddzielone bialko z etapu (c) poddaje sie sulfitolizie, oddziela sie ciekly produkt, który nastepnie umieszcza sie na kolumnie z chelatujacym-Ni, odzyskuje sie i renaturuje eluat, renaturowany produkt przeksztal- ca sie trypsyna i karboksypeptydaza B i w celu oczyszczenia izolowanej zrekombinowanej ludzkiej insuliny pod- daje sie go chromatografii. PL PL PL

Description

(21) Numer zgłoszenia: 348669 ⁽¹³⁾

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 02.07.1998 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

02.07.1998, PCT/IB98/01023 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

14.01.1999, WO99/01548 PCT Gazette nr 02/99 (51) Int.Cl.

C12N 15/73 (2006.01) C07K 14/62 (2006.01) C07K 1/36 (2006.01) C12P 21/02 (2006.01)

Plazmidowy wektor ekspresyjny, plazmidy pPTAI, pHIS, pLMT8.5 (54) sposób ekstrahowania zrekombinowanego białka, sposoby wytwarzania zrekombinowanej ludzkiej insuliny lub peptydu-C proinsuliny lub proinsuliny (30) Pierwszeństwo:

02.07.1997,US,08/886,967 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

03.06.2002 BUP 12/02 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.04.2007 WUP 04/07 (73) Uprawniony z patentu:

UNIVERSIDADE DE BRASILIA,Brasilia,BR BIOBRAS S.A.,Montes Claros,BR (72) Twórca(y) wynalazku:

Spartaco Astolfi-Filho,Brasilia,BR Beatriz Dolabela De Lima,Brasilia,BR Josef Ernst Thiemann,Montes Claros,BR Heloisa Ribeiro Tunes De Sousa,

Montes Claros,BR

Luciano Vilela,Montes Claros,BR (74) Pełnomocnik:

Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o.

(57) 1. Plazmidowy wektor ekspresyjny do ekspresji co najmniej jednego białka heterologicznego, znamienny tym, że zawiera następujące elementy połączone w sposób funkcjonalny, od 5' do 3':

(i) sekwencję kodującą początek regionu replikacji z pUC8;

(ii) sekwencję kodującą promotor PL z faga Lambda;

(iii) sekwencję kodującą region Shine -Dalgarno;

(iv) sekwencję kodującą co najmniej jedno miejsce restrykcyjne do wstawienia heterologicznego DNA kodującego co najmniej jedno białko heterologiczne, oraz (v) sekwencję kodującą terminator transkrypcji Rho-niezależny.

21. Sposób wytwarzania zrekombinowanej ludzkiej insuliny, znamienny tym, że ze zrekombinowanej bakterii Gram-ujemnej posiadającej błonę komórkową, bez lizy bakterii, ekstrahuje się rekombinowane białko, którym jest rekombinowana ludzka proinsulina znakowana HIS przez (a) doprowadzenie do kontaktu bakterii z detergentem w celu uzyskania przepuszczal rekombinowanego białka z błony komórkowej;

(b) solubilizację rekombinowanego białka i błony komórkowej, oraz (c) oddzielenie rekombinowanego białka od błony komórkowej po czym oddzielone białko z etapu (c) poddaje się sulfitolizie, oddziela się ciekły produkt, który następnie umieszcza się na kolumnie z chelatującym-Ni, odzyskuje się i renaturuje eluat, renaturowany produkt przekształca się trypsyną i karboksypeptydazą B i w celu oczyszczenia izolowanej zrekombinowanej ludzkiej insuliny poddaje się go chromatografii.

PL 194 141 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są plazmidowy wektor ekspresyjny, plazmidy pPTAI, pHIS, pLMT8.5, sposób ekstrahowania rekombinowanego białka, sposoby wytwarzania ludzkiej insuliny lub peptydu-c proinsuliny lub proinsuliny.

Technika rekombinowania DNA umożliwia ekspresję obcych (heterologicznych) białek w komórkach mikroorganizmów lub innych gospodarzy. Wektor zawierający materiał genetyczny, kierujący komórką gospodarza tak by wytwarzała białko kodowane przez część sekwencji heterologicznego DNA, wprowadzany jest do gospodarza, a stransformowane komórki gospodarza można hodować w fermentorach i poddawać działaniu warunków ułatwiających ekspresję heterologicznego DNA, prowadzącą do tworzenia dużej ilości żądanego białka.

Do korzyści wynikających z użycia białka wytworzonego na drodze rekombinacji, zamiast izolowania z naturalnego źródła, należą: łatwa dostępność surowego materiału; wysokie poziomy ekspresji, co jest szczególnie przydatne w przypadku białek, które naturalnie występują w niskiej ilości; łatwość z jaką normalnie wewnątrzkomórkowe białko może być wydzielone do podłoża, co ułatwia proces oczyszczania oraz względna łatwość z jaką mogą być tworzone zmodyfikowane (fuzje) białka, dla dalszego ułatwienia oczyszczania powstałego białka.

Jednakże wspomnianym wyżej korzyściom, wynikającym z użycia technologii rekombinowania DNA, towarzyszą także pewne niedogodności, a mianowicie: elementy wymagane dla aktywności białka, wytwarzane w wyniku posttranslacyjnych modyfikacji (np. glikozylacja) mogą nie powstać w środowisku ekspresyjnym; może dojść do proteolitycznej degradacji nowo utworzonego białka w wyniku ekspresji w komórkach gospodarza oraz mogą tworzyć się agregaty o dużej masie cząsteczkowej, często określane jako „ciała inkluzyjne” lub „ciała refrakcyjne” („refractile bodies) w wyniku niezdolności wytworzonych białek do prawidłowego fałdowania się w nienaturalnym środowisku komórkowym. Zrekombinowane białko nie może być wydzielane do podłoża hodowlanego po wytworzeniu ciał inkluzyjnych.

Ciała inkluzyjne zawierają białka o stabilnej, nie natywnej konformacji lub agregaty białkowe, które mogą być amorficzne, obejmujące częściowo lub całkowicie zdenaturowane białka, dodatkowo do nieprawidłowych białek powstałych w wyniku zaburzonej syntezy wynikającej z niedokładnej translacji. Takie ciała inkluzyjne stanowią dużą część całkowitego białka komórkowego.

Ciała inkluzyjne stanowią istotne problemy podczas oczyszczania zrekombinowanych białek ze względu na to, że są one stosunkowo nierozpuszczalne w wodnych buforach. Przy izolowaniu białek z ciał inkluzyjnych mogą być konieczne denaturanty i detergenty np. chlorowodorek guanidyny, mocznik, dodecylosiarczan sodu (SDS) i Triton X-100 co często dzieje się kosztem aktywności biologicznej samego białka, na skutek nieprawidłowego fałdowania i modyfikowania reszt aminokwasowych w sekwencji.

Dodatkowo wynikiem ekspresji zrekombinowanego DNA w E. coli jest gromadzenie wysokiego stężenia octanu w podłożu, głównie podczas fazy indukcji. W literaturze dobrze jest udokumentowany szkodliwy wpływ gromadzenia octanu (większy od 5g/l) na wzrost komórki i wytwarzanie zrekombinowanego białka.

Dalej, odzyskanie żądanego białka z ciał inkluzyjnych jest często komplikowane przez konieczność oddzielenia żądanego białka od innych materiałów komórkowych gospodarza i ponadto oddzielenia żądanego białka od zanieczyszczeń heterologicznym białkiem, występującym w ciele inkluzyjnym. Ten drugi problem wynika z silnego przyciągania przez białka ciał inkluzyjnych innych białek z powodu silnych oddziaływań jonowych i hydrofobowych.

W konsekwencji, w wyniku przeprowadzenia większości przedstawianych procedur izolowania zrekombinowanych białek z ciał inkluzyjnych, powstaje duża ilość nieaktywnego biologicznie materiału i bardzo niewiele białka aktywnego, które nie jest zanieczyszczone obcym heterologicznycm białkiem.

Badacze skupili się na manipulowaniu fagiem w celu stymulowania syntezy białka różnymi sposobami.

Promotory faga Lambda (PL i PR) są silnymi promotorami negatywnie kontrolowanymi przez represor kodowany przez gen c1. Mutacja c1⁸⁵⁷ czyni represor nieaktywnym w temperaturze powyżej

37°C. Zatem ekspresję sekwencji znajdującej się pod kontrolą tych promotorów i represora c1⁸⁵⁷ można aktywować przez prostą zmianę temperatury. Promotory takie są często stosowane w wektorach ekspresyjnych dla E. coli, ponieważ są silnie i skutecznie tłumione (Denhardt i Colasanti, 1987).

PL 194 141 B1

Remaut i wsp. (1981) skonstruował zestaw plazmidów zawierających promotor PL. Promotor i region trp genu wzięto z rodziny fagów (trp44) i wprowadzono do plazmidu pBR322 tworząc pierwszy plazmid z serii, plazmid pPLa2. Po kilku manipulacjach otrzymano inne plazmidy. Plazmidy pPLa2 i pPLaS zawierają fragment promotora PL, miejsce startu replikacji, gen oporności na ampicylinę z plazmidu pBR322 i gen oporności na kanamycynę z plazmidu pMK20. Obszar promotorowy zawiera promotor/operator i miejsce nutL (antyterminacji) lecz nie posiada początku genu N.

Plazmidy pPLc236, pPLc28 i pPLc24 różnią się od wcześniej zidentyfikowanych plazmidów pod względem kierunku transkrypcji z promotora PL, w stosunku do orientacji miejsca startu replikacji jak w pBR322 (a = w kierunku przeciwnym do wskazówek zegara, c = w kierunku zgodnym ze wskazówkami zegara). Gen oporności na kanamycynę jest nieobecny w tych trzech wektorach. Różnicą pomiędzy pPLc236 i pPLcsS jest obecność lub brak obszaru (obecnego w pierwszym i nieobecnego w drugim) dotyczącego regionu unikatowych miejsc do klonowania. pPLc24 powstał z pPLc28 dzięki wstawieniu obszaru zawierającego miejsce wiązania rybosomu z genu dla replikazy z faga MS2, umożliwiającego ekspresję genów eukariotycznych.

Plazmidy te testowano pod względem ekspresji różnych genów, np. genu trpA z Salmonella typhimurium, sklonowanego w plazmidzie pPLc23 (poprzednik pPLc236) wykazującego 40% indukcję produktu w stosunku do całkowitego białka komórkowego. pPLc236 działający w E. coli daje ekspresję genu ROP na poziomie 20% całkowitego białka (Muesing i wsp., 1984). Białka p4 i p3 faga 29 z Bacillus subtilis były także wytwarzane z plazmidu pPLci i osiągały odpowiednio 30% i 6% całkowitego białka komórkowego zaindukowanego w E. coli po indukcji termicznej (Hellado i Salas, 1982).

W 1983 roku Remault i wsp. (1983a) skonstruował plazmid pPlc245, pochodny pPLc24, z którego usunięto inicjacyjny obszar kodujący replikazy, a dodano obszar z kilkoma unikatowymi miejscami do klonowania, pozwalający na bezpośrednią ekspresję. W plazmidzie tym sklonowano gen dla ludzkiego a-interferonu i uzyskano indukcję białka w przybliżeniu 2% do 4% całkowitego białka komórkowego. Poziomy wytwarzania a-interferonu różnią się od 3% do 25% białka komórkowego i zależą od użytego plazmidu np. pPLc245, pPLc28 i pCP40 oraz obecności terminatora transkrypcji z faga T4 (Simons i wsp., 1984). Plazmid pCP40, pochodny pPL, został skonstruowany przez Remaut i wsp. (1983b). Obszar promotorowy przeniesiono do plazmidu pochodzącego z pKN402, z zależną od temperatury „uciekającą replikacją. Kiedy hodowle podgrzewa się do 42°C, represor c1⁸⁵⁷ jest inaktywowany, a promotor PL uwalniany, co prowadzi do podniesienia liczby kopii plazmidu pCP40 w przybliżeniu dziesięć razy.

Publikacja Crowla i wsp. (1985) odnosi się do czterech plazmidów zawierających promotor PL. Skonstruowano plazmid pRC23 zawierający promotor PL i syntetyczny obszar Shine-Dalgarno bez kodonu ATG, sklonowany w plazmidzie pRC2 (pochodny pBR322). Dla skonstruowania trzech innych plazmidów, pEV-vrf1, pEV-vrf2 i pEV-vrf3, wprowadzono obszar z unikatowymi miejscami do klonowania, dodano kodon inicjacyjny ATG, tak aby w każdym z nich otwarte ramki odczytu były w fazie. Plazmid pRC23 zastosowano do wyrażania interleukiny-2, oraz a-interferonu na poziomie 10% do 20% całkowitego białka komórkowego.

Lautenberg i wsp. (1983) skonstruowali plazmid pJL6, zawierający promotor PL, odpowiedzialny za inicjację translacji genu cII faga, z unikatowymi miejscami do klonowania ClaIi Hindlll, położonymi 50 bp od miejsca inicjacji ATG. Geny, właściwie sklonowane w tych miejscach są indukowane i wytwarzają fuzje białkowe z białkiem CII. Seth i wsp. (1986) zmodyfikował ten wektor w taki sposób, aby indukcja białek mogła zajść bez fuzji. Skonstruowano trzy plazmidy: pANK-12 zawierający miejsce KpnI, pANH-1 zawierający miejsce Hpal oraz pPL2 zawierający miejsce Ndel w kodonie inicjacji ATG genu CII z pJL6. W pANH-1 aminokwas „walina pojawia się częściej na końcu aminowym indukowanego białka. Z użyciem tych wektorów uzyskano onkogeny.

Chang i Peterson (1992) zmodyfikowali także plazmid pJL6 i skonstruowali linie plazmidów pXC, w których obszar inicjacji translacji genu CII podstawiono syntetycznym. Dodatkowo, wprowadzono obszar zawierający kilka unikatowych miejsc do klonowania. Obszar CII wpływa na wydajność translacji wówczas, gdy wymagana jest ekspresja bez fuzji. Z regionem syntetycznym wydajność wzrosła pomiędzy 10 a 20 razy, w zależności od obszaru dzielącego SD i ATG. Ekspresja osiągnęła 48% całkowitego białka komórkowego dla białka 14-3-3 z mózgu krowy, którego DNA powielono techniką PCR.

Schauder i wsp. (1987) skonstruował linię plazmidów pochodzących z pJL6, zawierających promotory PR i PL w tandemie, obszar SD genu atpE (dla podjednostki ATPazy), z terminatorem transkrypcyjnym bakteriofaga fd i genem represora c1⁸⁵⁷. Plazmidy te, nazwne pJLA501 do 05, różnią się

PL 194 141 B1 między sobą obszarami zgrupowanych miejsc do klonowania. Przy testowaniu ekspresji genu atpA (dla podjednostki ATPazy) osiągnięto indukcję sięgającą 50% całkowitego białka komórkowego. Geny sucC i sucD wykazywały, odpowiednio, 30% i 15% indukcję białka w stosunku do całkowitego białka komórkowego.

Rosenberg i wsp. (1983) skonstruowali plazmid pKC30 i jego pochodne. Wektor pKC30 jest stosowany do ekspresji genów bakteryjnych zawierających prawidłowe obszary regulacji translacji. Wektor ten zawiera unikatowe miejsce Hpal do klonowania, położone 321 bp poniżej promotora PL, w obszarze kodującym gen N. Wytwarzanie aktywatora CII i ośmiu mutantów, w tylko jednym aminokwasie, osiągnięto dla wektora pKC30. Ponieważ CII podlega szybkiej recyrkulacji w E. colii jest szkodliwy dla wzrostu komórki, osiągnięto poziomy ekspresji genu wprowadzonego do pKC30 w wysokości 3% do 5% całkowitego białka komórkowego. Wytwarzanie białka CII wzrosło, gdy przez komórkę gospodarza dostarczone było białko N (antyterminator), ze względu na obecność sekwencji położonych „powyżej” genu CIIz sekwencjami nutL, nutR (dla antyterminatora) i tr1 (dla terminatora). Wyrażano również inne białka z wektora pKC30 takie jak białko B z faga Mu (Chaconas i wsp., 1985) i białko UvrA z E. coli wytwarzane na poziomach odpowiednio, 15% i 7% całkowitego białka komórkowego.

Do ekspresji genów eukariotycznych skonstruowano plazmid pAS1, pochodny pKC30, ze sklonowanym genem CII. Usunięto pełny obszar kodujący CII i dodano miejsce BamHI bezpośrednio „poniżej kodonu inicjacyjnego ATG. W ten sposób zachowano w wektorze obszary regulacyjne dla translacji, a eukariotyczne lub syntetyczne geny można wyrażać jeśli są prawidłowo sklonowane w miejscu BamHI. Ekspresja genu dla antygenu t z wirusa SV40 wynosiła, dla tego wektora, 10% całkowitych białek komórkowych, po jednej godzinie indukcji termicznej (Rosenberg i wsp., 1983).

Lowman i wsp. (1988) zmodyfikowali plazmid pAS1, wprowadzając miejsce Ncol w kodon inicjacyjny ATG, tworząc plazmid nazwany pAS1-N. Otrzymano ekspresję genu CAT i fuzję z białkami wirusa SV40. Później, Lowman i Bina (1990) zastosowali te produkty do badania wpływu temperatury podczas indukcji termicznej.

Mott i wsp. (1985) zastosowali pKC30 i pAS1 do ekspresji bakteryjnego genu rho i potwierdzili, że w wyniku indukcji termicznej nie powstają wysokie poziomy ekspresji białka Rho. Zbadano indukcję kwasem nalidiksowym i mitomycyną C w gospodarzu cI, które wywoływały indukcję syntezy Rec a, w wyniku czego nastąpiła inaktywacja represora cI. W ten sposób osiągnięto poziomy ekspresji w granicach od 5% do 40% białka komórkowego.

Zatem, manipulowanie plazmidami do ekspresji interesujących białek lub peptydów jest rozwijającą się dziedziną, ale sposoby indukcji złożonych białek, jak proinsulina, poprzez manipulację plazmidami oraz plazmidami pochodzącymi z nich, nie zostały dotychczas rozwinięte ani zaproponowane.

Patent USA nr 4734362, Hung i wsp., odnosi się do sposobu izolacji polipeptydów wytwarzanych na drodze rekombinacji w ciałach inkluzyjnych. Ujawniony sposób obejmuje liżę komórki oraz odzyskanie ciał inkluzyjnych obejmujących żądane, zrekombinowane białko, solubilizację przy użyciu denaturantu, ochronę grup sulfhydrylowych zrekombinowanego białka, derywatyzację kationowych grup aminowych i odzyskanie pochodnego, zrekombinowanego białka.

Olson w patencie USA nr 4518526 odnosi się do sposobu uwalniania aktywnych białek z ciał inkluzyjnych poprzez lizę komórki, wirowanie, denaturację i renaturację. W patencie mówi się o konieczności zniszczenia komórki dla rozdzielenia białek rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych, a następnie działaniu na frakcję nierozpuszczalną silnym denaturantem i odzyskiwaniu zrenaturowanego, heterologicznego białka.

Rausch, w patencie USA nr 4766224 odnosi się do sposobu oczyszczania i solubilizacji białek, wytwarzanych w stransformowanych mikroorganizmach w postaci ciał inkluzyjnych. Oczyszczanie przeprowadza się przez solubilizację ciał inkluzyjnych w detergencie, działanie silnym denaturantem, a następnie rozdział chromatograficzny dla odzyskania zrenaturowanego, aktywnego białka.

Builder i wsp. w patencie USA nr 4620948 koncentruje się na procesie izolacji i oczyszczania ciał inkluzyjnych poprzez lizę hodowli komórek, wytrącanie białka, denaturację nierozpuszczalnej frakcji i renaturację w celu wyizolowania białka „refrakcyjnego”.

Podobnie każdy z patentów USA nr, nr, 4734368, 4659568, 4902783, 5215896 oraz EP 337243 i WO 87/02673 odnosi się do sposobów oczyszczania białek zamkniętych w ciałach inkluzyjnych.

Sposoby te wykorzystują następujące techniki (pojedynczo lub w kombinacji); liza komórki, denaturacja, rozdział chromatograficzny, wirowanie, manipulacja denaturacją/renaturacją białka, przyłączenie peptydów liderowych dla ułatwienia wydzielenia białek z ciał inkluzyjnych.

PL 194 141 B1

Wszystkie wyżej wspomniane procesy znane są specjalistom i wykorzystują sposoby niszczenia komórki dla uwolnienia ciał inkluzyjnych z materiału komórkowego. Nie istnieje wiedza ani sugestie o sposobie izolacji ciał inkluzyjnych z materiału komórkowego bez niszczenia komórki i na podstawie znanego stanu techniki nie ma motywacji do tworzenia takich sposobów. Jednakże, liza czy niszczenie komórek są niekorzystne ponieważ prowadzą do zanieczyszczeń żądanego białka, takich jak lipopolisacharydy, których oddzielenie od żądanego białka jest bardzo trudne.

Patenty USA nr, nr, 4877830, 5115102, 5310663 oraz EP 656419, WO 91/11454, WO 91/16912, WO 94/07912, Proc. Natl. Acad. Sci. (1991), 88 (20) oraz Mol. Biol. Rep (1993) 18: 223-230 dotyczą, oczyszczania białek przez powinowactwo. Dokumenty te odnoszą się do zastosowania (pojedynczo lub w kombinacji): chromatografii powinowactwa z metalem chelatującym dla chromatograficznego rozdzielenia białek zawierających sąsiadujące reszty histydynowe, chromatografii immunopowinowactwa oraz zastosowania związków naśladujących aminokwasy jako eluentów w oczyszczaniu białek przez powinowactwo.

Patenty USA nr, nr, 4766205 i 4599197, 4923967 oraz EP 312358, EP 302469, Biochemistry (1968), 7 (12), 4247 oraz J. Biological Chemistry (1959), 234 (7), 1733 dotyczą, sposobów lizy siarczynowej, tj. traktowania białka, solubilizowanego w silnie denaturującym roztworze, łagodnym utleniaczem w obecności jonów siarczynowych, przekształcających reszty cysteinowe i cystynowe do S-sulfonianów białka. Silnie denaturujący roztwór jest osłabiany, co pozwala na ponowne fałdowanie i odtwarzanie mostków disiarczkowych przy użyciu związku sulfhydrylowego, w obecności odpowiedniej formy (utlenionej) disiarczku. Podobnie EP 208539 i WO 87/02985 odnoszą się do sposobów ułatwiających ponowne fałdowanie białka in vitro.

EP 264250, GB 2067574, EP 055945, MMW (1983), 125 (52), 14, J. Biol. Chem. (1971), 246 (22), 6786-91, J. Chrom (1989), 461: 45-61 dotyczą, insuliny, jej wytwarzania z proinsuliny oraz oczyszczania insuliny i proinsuliny.

Patent USA nr 4578355, Rosenberg'a, odnosi się do pochodnej jednostki transkrypcyjnej P_L i jej zastosowania. EP 363896 odnosi się do zastosowania ultrafiltracji przy oczyszczaniu białka.

Insulina ludzka, produkt proteolitycznego trawienia proinsuliny, jest hormonem peptydowym wytwarzanym przez komórki beta w wysepkach Langerhansa w trzustce. Jej zadaniem jest obniżanie ilości glukozy we krwi, poprzez pobudzenie pobierania glukozy przez komórki i podniesienie wydajności wątroby do syntezy glikogenu. Działanie insuliny jest antagonistyczne do glukagonu, glukokortykoidów nadnerczy i adrenaliny, a jej niedobór lub obniżona aktywność wywołują cukrzycę z podniesieniem poziomu cukru we krwi.

Insulinę ludzką pozyskuje się z wielu źródeł, w tym przez: izolację z ludzkiej trzustki, syntezę peptydu, półsyntetyczne przekształcenie świńskiej insuliny i hodowlę w fermentorach bakterii E. coli lub drożdży Saccharomyces cerevisiae, odpowiednio zmienionych metodami rekombinacji DNA. Sposoby te charakteryzuje niska wydajność i wysokie koszty, dlatego rozwój wydajnych i tanich sposobów wytwarzania ludzkiej insuliny do leczenia cukrzycy był w ostatnich latach przedmiotem wielu wysiłków naukowych.

Dotychczas nie został zatem opracowany sposób indukcji ludzkiej proinsuliny technikami rekombinacji, gdzie białko można by izolować w pokaźnych ilościach z ciał inkluzyjnych, szczególnie przy użyciu sposobów unikających lizy lub niszczenia komórki.

Niniejszy wynalazek dotyczy plazmidowego wektora ekspresyjnego do ekspresji co najmniej jednego białka heterologicznego, który zawiera następujące elementy połączone w sposób funkcjonalny, od 5¢ do 33 (i) sekwencję kodującą początek regionu replikacji z pUC8 ;

(ii) sekwencję kodującą promotor PL z faga Lambda;

(iii) sekwencję kodującą region Shine -Dalgarno;

(iv) sekwencję kodującą co najmniej jedno miejsce restrykcyjne do wstawienia heterologicznego DNA kodującego co najmniej jedno białko heterologiczne, oraz (v) sekwencję kodującą terminator transkrypcji Rho-niezależny.

Korzystnie plazmidowy wektor ekspresyjny obejmuje co najmniej jeden heterologiczny DNA kodujący co najmniej jedno heterologiczne białko.

Korzystnie plazmidowy wektor ekspresyjny zawiera ponadto sekwencję dla markera selekcyjnego pomiędzy (i) i (v).

Korzystnie co najmniej jedno heterologiczne białko jest wybrane z grupy składającej się z insuliny, proinsuliny, insuliny ze znacznikiem His i proinsuliny ze znacznikiem His.

PL 194 141 B1

Korzystnie białkiem heterologicznym jest proinsulina albo proinsulina zawierająca znacznik.

Korzystnie plazmidowy wektor ekspresyjny służy do transformacji bakterii Gram-ujemnych, bardziej korzystnie zawierających gen represorowy c1⁸⁵⁷.

Bardziej korzystnie bakterią Gram ujemną jest E. coli, region Shine -Dalgarno jest syntetycznym regionem Shine -Dalgarno z genu 10 faga T7, marker selekcyjny koduje oporność na tetracyklinę, a sekwencja kodująca co najmniej jedno miejsce restrykcyjne jest zawarta w sekwencji polilinkera, który korzystnie obejmuje miejsca restrykcyjne Ncol, EcoRI, Stul, PstI, BamHI i BspEI.

Jeszcze korzystniej E. coli zawiera gen represorowy c1⁸⁵⁷.

Bardziej korzystnie bakterią Gram-ujemną jest E. coli szczep N4830-1 (c1⁸⁵⁷).

Wektor według wynalazku jest wektorem uniwersalnym i może być użyty do ekspresji co najmniej jednego białka heterologicznego, w stosownej komórce, jak E. coli, lub w innej bakterii Gram ujemnej.

W zakres wynalazku wchodzi też plazmid pPTAI (ATCC 98476) lub plazmid, który ma wszystkie jego cechy identyfikacyjne.

Ponadto wynalazek dotyczy również plazmidu pHIS (ATCC 98473) lub plazmidu, który ma wszystkie jego cechy identyfikacyjne.

Wynalazek dotyczy również plazmidu pLMTS.5 (ATCC 98474) lub plazmidu, który ma wszystkie jego cechy identyfikacyjne.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób ekstrahowania rekombinowanego białka zawierającego proinsulinę ze zrekombinowanej bakterii Gram-ujemnej posiadającej błonę komórkową, bez lizy bakterii, obejmujący etapy:

(a) doprowadzenia do kontaktu bakterii z detergentem w celu uzyskania przepuszczalności błony komórkowej, co umożliwia wydzielenie natywnych białek komórkowych z błony komórkowej bez wydzielania rekombinowanego białka z błony komórkowej;

(b) solubilizacji rekombinowanego białka i błony komórkowej, oraz (c) oddzielenia rekombinowanego białka od błony komórkowej.

Korzystnie jako detergent w etapie (a) stosuje się polioksyetylenowany oktylofenol (Triton X-100).

Korzystnie sposób w etapie (a) obejmuje oddzielenie natywnych białek komórkowych od błony komórkowej przez wirowanie, w wyniku czego uzyskuje się osad zawierający rekombinowane białko w błonie komórkowej.

Korzystnie w etapie (b) solubilizację przeprowadza się przez doprowadzenie do kontaktu rekombinowanego białka w błonie komórkowej z etapu (a) z mocznikiem.

Korzystnie w etapie (c) oddzielenie przeprowadza się przez wirowanie, w wyniku czego uzyskuje się supernatant zawierający rekombinowane białko.

Korzystnie rekombinowane białko jest rekombinowaną ludzką proinsuliną znakowaną HIS.

Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania zrekombinowanej ludzkiej insuliny, w którym ze zrekombinowanej bakterii Gram-ujemnej posiadającej błonę komórkową, bez lizy bakterii, ekstrahuje się rekombinowane białko, którym jest rekombinowaną ludzka proinsuliną znakowana HIS przez (a) doprowadzenie do kontaktu bakterii z detergentem w celu uzyskania przepuszczalności błony komórkowej, co umożliwia wydzielenie natywnych białek komórkowych z błony komórkowej bez wydzielania rekombinowanego białka z błony komórkowej;

(b) solubilizację rekombinowanego białka i błony komórkowej, oraz (c) oddzielenie rekombinowanego białka od błony komórkowej po czym oddzielone białko z etapu c) poddaje się sulfitolizie, oddziela się ciekły produkt, który następnie umieszcza się na kolumnie z chelatującym-Ni, odzyskuje się i renaturuje eluat, renaturowany produkt przekształca się trypsyną i karboksypeptydazą B i w celu oczyszczenia izolowanej zrekombinowanej ludzkiej insuliny poddaje się go chromatografii.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób wytwarzania insuliny lub peptydu-c proinsuliny lub proinsuliny, obejmujący transformowanie E. coli wektorem zawierającym pPTAI (ATCC 98476) lub pHIS (ATCC 98473) lub plazmidem, który ma co najmniej jedną cechę identyfikacyjną pPTAI lub pHIS i uzyskanie ekspresji w wyniku której, ewentualnie stosując cięcia proinsuliny.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania proinsuliny lub insuliny, obejmującego transformowanie E. coli wektorem według wynalazku i uzykiwanie z niego ekspresji, w wyniku której wytwarzana jest proinsulina lub insulina.

PL 194 141 B1

Krótki opis figur

W następującym Szczegółowym opisie pojawią się odniesienia do towarzyszących rysunków włączone tu jako odnośniki:

Na fig. 1 przedstawiono konstruowanie plazmidu pUTc6 zawierającego gen oporności na tetracyklinę z plazmidu pRP4 i miejsce startu replikacji z pUC8 z jednym tylko miejscem EcoRI do klonowania;

Na fig. 2 przedstawiono konstruowanie plazmidu pULTDK 7.1 zawierającego promotor PL f aga Lambda i obszar Shine-Dalgarno z genu 10 faga T7;

Na fig. 3 przedstawiono dodanie polilinkera do pUTC6, a następnie klonowanie fragmentu zawierającego promotor P1i obszaru Shine-Dalgarno z plazmidu pULDK 7.1 oraz konstruowanie pLM 8.1;

Na fig. 4 przedstawiono ostateczne skonstruowanie nadekspresyjnego wektora pLMT8.5 poprzez dodanie syntetycznego terminatora transkrypcji do pLMC8.1;

Na fig. 5 i 5A przedstawiono mapy wektora pLM8.5;

Na fig. 6 przedstawiono wyniki bezpośredniej solubilizacji ciała inkluzyjnego z komórek, poddanych wstępnie działaniu 8M mocznika względem czasu (ścieżki 1-2 reprezentują 6 godz. solubilizacji; ścieżki 3-4 reprezentują 8 godz. solubilizacji; ścieżki 5-6 reprezentują 24 godz. solubilizacji, M oznacza marker masy cząsteczkowej, S oznacza supernatant, a P oznacza szczątkowy osad);

Na fig. 7 przedstawiono oczyszczanie fuzji białkowej proinsuliny przez wytrącanie za pomocą pH, gdzie porcje solubilizowanej (8M mocznik) i dializowanej fuzji białkowej wytrącano przy różnych wartościach pH (przy pH 4,5, w wytrąconym osadzie można odzyskać całość zrekombinowanego białka (ścieżka 5); ścieżki 1 do 7 przedstawiają wartości pH 5,5, 5,5, 5,0, 5,0, 4,5, 4,5, 4,0 oraz marker masy cząsteczkowej, odpowiednio, z P odnoszącym się do osadu oraz S odnoszącym się supernatantu);

Na fig. 8 przedstawiono schemat procesu według wynalazku izolacji zrekombinowanej, ludzkiej insuliny;

Na fig. 9 przedstawiono analizę, w 15% żelu denaturującym, całkowitego białka komórkowego z hodowli stransformowanych pLMT8.5, pPTA1 lub pPLT4.1 dla różnych czasów indukcji w 40°C (strzałki wskazują zaindukowane białko zrekombinowanej proinsuliny);

Na fig. 10A-M przedstawiono sekwencję nukleotydową pLMT8.5 oraz położenie miejsc dla endonukleaz restrykcyjnych;

Na fig. 11A-F przedstawiono zestawienie miejsc restrykcyjnych w sekwencji z pLMT8.5 oraz długości wytwarzanych fragmentów restrykcyjnych;

Na fig. 12 i 13 przedstawiono strategię wytworzenia fragmentu z pLA7 zawierającego sekwencję proinsuliny i znacznika His oraz wprowadzenia ich w miejsce restrykcyjne w miejscu wielokrotnego klonowania w plazmidowym wektorze pLMT8.5 dla wytworzenia plazmidowego wektora pHIS; oraz

Na fig. 14 i 15 przedstawiono konstruowanie pPLT4 i sekwencję zawierającą lider z T7.

Niniejszy wynalazek dotyczy różnych wykonań, obejmujących co najmniej jedno z następujących: wektor obejmujący co najmniej jeden kwas nukleinowy, jak DNA, do klonowania kwasu nukleinowego lub ekspresji co najmniej jednego białka heterologicznego przez komórkę taką jak bakteria Gram ujemna (wektor może obejmować cząsteczkę kwasu nukleinowego, np. DNA, kodującą: obszar startu replikacji, ewentualnie i korzystnie marker selekcyjny (który może być kodującym kwasem nukleinowym w miejscu restrykcyjnym), promotor, obszar inicjacji, np. obszar inicjacji translacji i/lub miejsce wiązania rybosomu, co najmniej jedno miejsce restrykcyjne do wprowadzania heterologicznego kwasu nukleinowego, np. DNA kodującego heterologiczne białko oraz terminator transkrypcji); sposób ekstrakcji zrekombinowanego białka z komórki takiej jak zrekombinowana bakteria Gram ujemna, która ma błonę komórkową oraz sposób oczyszczania wyizolowanej zrekombinowanej ludzkiej insuliny. Bez ograniczania ogólnego charakteru powyższego, poniżej przedstawione są następujące szczegółowe omówienia różnych wykonań.

W jednym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu uzyskania przepuszczalności błony komórkowej komórki, takiej jak zrekombinowana bakteria Gram ujemna dla ekstrakcji białka, takiego jak zrekombinowane białko, z błony komórkowej.

Heterologiczne białka to takie, które normalnie nie są wytwarzane przez komórkę gospodarza lub takie, które normalnie są wytwarzane jedynie w ograniczonej ilości. Techniki rekombinowania DNA i inne standardowe manipulacje genetyczne, takie jak punktowa mutageneza, umożliwiły wytwarzanie heterologicznych białek w obfitej ilości z hodowli stransformowanych komórek gospodarza.

PL 194 141 B1

W praktyce te heterologiczne białka są często wytwarzane na drodze genetycznej ekspresji, w ilościach potęgujących wytrącenie ich, w warunkach, w których białka komórkowe gospodarza utrzymują się w postaci rozpuszczonej.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobów wytwarzania heterologicznych białek i sposobów izolowania i oczyszczania heterologicznych białek, minimalnie zanieczyszczonych endotoksynami. Technologia rekombinacji DNA umożliwia wyrażanie obcych (heterologicznych) białek w mikroorganizmach lub innych komórkach gospodarza. W procesie tym wektor, zawierający materiał genetyczny, ukierunkowujący komórkę gospodarza do wytwarzania białka kodowanego przez część sekwencji heterologicznego DNA, jest wprowadzany do gospodarza, a stransformowane komórki gospodarza można hodować w fermentorze i poddawać działaniu warunków ułatwiających ekspresję heterologicznego DNA, co prowadzi do wytworzenia dużej ilości żądanego białka.

Jako wektory do klonowania cząsteczek DNA szeroko stosowane są plazmidy. Większość wektorów plazmidowych powstaje z DNA pochodzących z różnych replikonów (plazmidy, chromosomy bakteriofagów i chromosomy bakteryjne) połączonych ze sobą (przy użyciu enzymów restrykcyjnych i ligazy DNA) dla utworzenia plazmidu zawierającego miejsce startu replikacji, marker selekcyjny (zazwyczaj gen oporności na antybiotyk) oraz promotor dla wyrażania interesujących genów w wymaganej komórce gospodarza.

W niniejszym wynalazku DNA kodujący białko, takie jak białko prekursorowe, wprowadzany jest do wektora. Sekwencja kodująca, która ulega ekspresji, wprowadzana jest w prawidłowym położeniu względem promotora, specyficznego dla gospodarza, i innych sekwencji regulacyjnych dla transkrypcji oraz w prawidłowej ramce odczytu tak, że jest wytwarzane heterologiczne białko. Wektor zawiera także sekwencje wydajnej translacji (np. obszar Shine-Dalgarno do ekspresji w komórkach bakteryjnych). Wektory ekspresyjne zazwyczaj zawierają miejsce terminacji transkrypcji na końcu 3' wprowadzonego genu dla uniemożliwienia wytwarzania mRNA na pełnej długości plazmidu.

W korzystnym wykonaniu, plazmidowy wektor ekspresyjny według niniejszego wynalazku, oznaczony jako pLMT8.5,zawiera:

i. miejsce startu replikacji, korzystnie z pUC8 (zapewniające wysoką liczbę kopii plazmidu w komórkach E. colijako biorcy);

ii. marker, korzystnie marker oporności na tetracyklinę zplazmidu pRP4;

iii. promotor, korzystnie promotor PL wyizolowany z bakteriofaga Lambda;

iv. obszary Sine -Dalgarno, korzystnie syntetyczne obszarySine -Dalgarno oraz korzystnie takie syntetyczne obszary genu10 z faga T7;

v. terminator transkrypcji, taki jak syntetyczny, wydajnyterminator transkrypcji, będący terminatorem Rho-niezależnym;

oraz vi. co najmniej jedno miejsce restrykcyjne, a korzystnie obszar zgrupowania miejsc restrykcyjnych, dla ułatwienia klonowania genów, które mają ulec ekspresji.

Konstruowanie plazmidu pLMT8.5 jest zilustrowane na fig. 1-5, ana fig. 10A-M oraz 11A-F przedstawiono sekwencję nukleotydową i miejsca restrykcyjne w pLMT8.5.

W co najmniej jednym miejscu restrykcyjnym można klonować co najmniej jedną sekwencję nukleotydową, która może być egzogenna, np. kodująca epitop będący przedmiotem zainteresowania, modulator odpowiedzi biologicznej, czynnik wzrostu, sekwencję rozpoznawaną, gen leczniczy, fuzję białkową lub inne interesujące białko (np. proinsulinę) lub ich kombinację. W dalszej dyskusji wprowadzono odniesienia dotyczące tych terminów, a ogólnym odnośnikiem jest Kendrew, The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., 1995) i Sambrook, Fritsch i Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.

Epitop, będący przedmiotem zainteresowania, jest istotnym immunologicznie obszarem antygenu lub immunogenu lub ich aktywnym immunologicznie fragmentem, np. z patogenu lub toksyny zwierzęcej lub ludzkiej.

Epitop będący przedmiotem zainteresowania można wytworzyć z antygenu patogenu lub toksyny, np. antygenu z ludzkiego patogenu lub toksyny lub innego antygenu lub toksyny, które wywołują odpowiedź w stosunku do patogenu lub z innego antygenu lub toksyny, które wywołują odpowiedź w stosunku do patogenu, takiego jak przykładowo: antygen Morbiliwirusa, np. wirusa nosówki psiej lub antygen odry lub zarazy bydlęcej takie jak HA czy F; glikoproteina wścieklizny, np. glikoproteina G wścieklizny; antygen grypy, np. wirus grypy HA czy N lub antygen grypy ptasiej, np. grypy indyczej HA, antygen grypy Chicken/Pennsylvania/1/83 taki jak nudeoproteina (NP); antygen wirusa białaczki

PL 194 141 B1 bydlęcej, np. otoczka 30 gp51 płaszcza; antygen wirusa choroby z Newcastle (NDV), np. HN czy F; antygen wirusa białaczki kociej (FeLV), np. białko otoczki FeLV; RAV-1 env, macierz i/lub preplomer wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli; glikoproteina wirusa opryszczki, np. glikoproteina wirusa opryszczki kociej, wirusa opryszczki końskiej, wirusa opryszczki bydlęcej, wirusa choroby Aujeszkyego, wirusa opryszczki psiej, HSV, wirusa choroby Mareka, wirusa Epsteina-Barr lub cytomegalowirusa; antygen flaviwirusa, np. antygen wirusa japońskiego zapalenia mózgu (JEV), antygen żółtej febry czy antygen wirusa Dengi, antygen malarii (Plasmodium), antygen wirusa niedoboru odporności, np. antygen wirusa kociego niedoboru odporności (FIV) lub antygen wirusa małpiego niedoboru odporności (SIV) lub antygen wirusa ludzkiego niedoboru odporności (HIV); antygen parvowirusa, np. parvowirusa psiego; antygen grypy końskiej; antygen wirusa ospy, np. antygen ektromeli, antygen wirusa wirus ospy kanarka, antygen wirusa ospy drobiu, antygen zakaźnej choroby kaletki np. VP2, VP3, VP4; antygen wirusa zapalenia wątroby, np. HBsAg; antygen wirusa Hantaan; antygen C. tetani; antygen świnki; antygen pneumokokowy, np. PspA; antygen Borrelia, np. OspA, OspB, OspC z Borrelia związanymi z chorobą z Lyme, jak Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelli i Borrelia garinii lub antygen kurzej ospy (wirusa varizella zoster).

Oczywiście powyższa lista jest przykładowa, jako że epitop będący przedmiotem zainteresowania może pochodzić z dowolnego antygenu od dowolnego zwierzęcego czy ludzkiego patogenu, a dla wytworzenia epitopu będącego przedmiotem zainteresowania można wytworzyć antygen z patogenu zwierzęcego czy ludzkiego. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące epitopy będące przedmiotem zainteresowania, jak te i wymienione, można znaleźć w literaturze patentowej i naukowej, tak że nie jest wymagane nadmierne eksperymentowanie dla zastosowania niniejszego wynalazku w odniesieniu do dowolnego egzogennego DNA, kodującego co najmniej jeden epitop będący przedmiotem zainteresowania.

Ponieważ heterologiczny DNA może być genem czynnika wzrostowego czy genem terapeutycznym zrobione jest odniesienie do patentu USA nr 5252479, włączonego tu drogą odniesienia wraz z dokumentem cytowanym w nim i na jego pierwszej stronie i do WO 94/16716, z których każdy jest także włączany jako odnośnik wraz z dokumentami tam cytowanymi (patrz Kendrew, powyżej, szczególnie na stronie 455 i sekw.). Gen czynnika wzrostowego lub gen terapeutyczny, przykładowo może kodować białko zwalczające chorobę, cząsteczkę leczącą raka, supresor nowotworowy, cytokinę, antygen towarzyszący nowotworowi, interferon, a gen czynnika wzrostowego lub gen terapeutyczny można, przykładowo, wybrać z grupy składającej się z genu kodującego: alfa-globinę, beta-globinę, gamma-globinę, czynnik stymulujący powstawanie kolonii granulocytów i makrofagów, czynnik martwicy nowotworów, interleukinę, czynnik stymulujący powstawanie kolonii makrofagów, czynnik stymulujący powstawanie kolonii granulocytów, erytropoetynę, czynnik wzrostowy komórek tucznych, supresor nowotworowy p53, retinoblastomę, interferon, antygen towarzyszący czerniakowi lub B7. Patent USA nr-5252479 dostarcza listę białek, które można wytwarzać na drodze ekspresji w systemie adenowirusa dla terapii genowej, a specjalistów kieruje się do tych ujawnień. WO 94/16716 dostarcza genów dla cytokin i antygenów towarzyszących nowotworowi, a specjalistów kieruje się do tych ujawnień.

Jeśli chodzi o epitopy będące przedmiotem zainteresowania, specjalista w tej dziedzinie może określić epitop lub dominujący region immunologiczny peptydu lub polipeptydu, a co za tym idzie kodujący go DNA, na podstawie wiedzy o sekwencji aminokwasowej peptydu lub polipeptydu i odpowiadającej jej sekwencji DNA, jak również natury poszczególnych aminokwasów (np. wielkości, ładunku, itd.) oraz znając znaczenie kodonów, bez wykonywania zbyt wielu doświadczeń. Patrz również Ivan Roitt, Essential Immunology, 1988; Kendrew, jak wyiej; Janis Kuby, Immunology (1992), str. 79-80; Bocchia, M. i wsp., Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Peptides to HLA Class I Molecules, Blood 85:2680-2684; Englehard, VH, Structure of peptides associated with class I and class IIMHC molecules. Ann. Rev. Immunol. 12:181 (1994); Gefter i wsp., Patent USA Nr 5019384, wydany 28 maja 1991 oraz dokumenty tam zacytowane, włączone tu jako odniesienie (Warto zwrócić szczególną uwagę na część „Odnośniki Literaturowe” tego patentu i wiersz 13 tego patentu, który mówi, że „Określono dużą liczbę epitopów dla szerokiej gamy organizmów będących przedmiotem zainteresowania. Warte szczególnego zainteresowania są te epitopy, wobec których są skierowane neutralizujące przeciwciała. Ujawnienie takich epitopów znajduje się w wielu odnośnikach zacytowanych w części Odnośniki Literaturowe.”)

Jeśli chodzi o ekspresję modulatora odpowiedzi biologicznej, odniesieniem jest Wohlstadter, „Selection Methods, WO 93/19170, opublikowane 30 września 1993, oraz zacytowane tam dokumenty, włączone tu jako odniesienie.

PL 194 141 B1

Jeśli chodzi o ekspresję fuzji białkowych za pośrednictwem plazmidowych wektorów według wynalazku, odniesieniem jest Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Wydanie 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) (w szczególności Tom 3) oraz Kendrew, jak wyżej, włączone tu jako odniesienie. Wskazówki z Sambrook i wsp. mogą być odpowiednio modyfikowane przez specjalistę w tej dziedzinie na podstawie tego ujawnienia bez wykonywania zbyt wielu doświadczeń, w celu wytworzenia rekombinantów lub wektorów do ekspresji fuzji białkowych.

A zatem specjalista w tej dziedzinie może wytworzyć rekombinanty lub wektory do ekspresji czynnika wzrostu lub do ekspresji genów leczniczych oraz zastosować zrekombinowane wektory na podstawie tego ujawnienia oraz wiedzy w tej dziedzinie, bez wykonywania zbyt wielu doświadczeń.

Ponadto, na podstawie powyższego i wiedzy w tej dziedzinie, nie jest wymagane wykonywanie zbyt wielu doświadczeń przez specjalistę w tej dziedzinie dla skonstruowania plazmidowego wektora według wynalazku do ekspresji epitopu będącego przedmiotem zainteresowania, modulatora odpowiedzi biologicznej, czynnika wzrostu, rozpoznawanej sekwencji, genu leczniczego lub fuzji białkowej albo dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania, takiego jak proinsulina; albo dla zastosowania przez specjalistę w tej dziedzinie produktu ekspresji z wektora według wynalazku.

Dalsze korzystne wykonania wynalazku obejmują wektory plazmidowe zawierające cząsteczkę kwasu nukleinowego (wstawioną w miejsce restrykcyjne) kodujące proinsulinę i proinsulinę ze znacznikiem His, np. plazmidy pPTA1 i pHis (które są pokrewne wobec pLMT8.5, ale zawierają w miejscu restrykcyjnym DNA kodujący proinsulinę i proinsulinę ze znacznikiem His; patrz fig. 12 i 13). Proinsulina ze znacznikiem His jest przydatna do izolacji proinsuliny (patrz przykład 7).

Stabilność białka może być czynnikiem limitującym przy ekspresji jego genu w E. coli, która podlega wpływom wielu czynników, między innymi obecności lub nieobecności enzymów proteolitycznych w pożywce, jak również samej sekwencji białka.

Tworzenie się ciał inkluzyjnych z wytwarzanego zrekombinowanego białka może ułatwić ochronę przed proteolizą. Ciała inkluzyjne tworzą się w zależności od białka i mają pewne zalety, jeżeli chce się indukować białka, które są nierozpuszczalne lub które są toksyczne dla E. coli (Schein, 1989; Kane i Hartley, 1988; Hellebust i wsp., 1989). Zasadniczo, tworzą się one jako agregaty cytoplazmatyczne, które można oczyszczać po uszkodzeniu komórek, a następnie odwirowaniu i zmieszaniu białek z silnymi związkami denaturującymi np. mocznikiem lub guanidyną.

Jeśli chodzi o stabilność zaindukowanego białka, ponieważ jest ona zależna od sekwencji białkowej, czas półtrwania białka należy rozpatrywać w odniesieniu do jego reszty amino-końcowej, podlegającej tak zwanej regule końca N. Tobias i wsp. (1991) potwierdzili istnienie takiej reguły u E. coli. Reszty: arginina, lizyna, leucyna, fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan na końcu aminowym powodują tendencję do zmniejszania okresu półtrwania białka tj. okres półtrwania może być rzędu dwóch minut, podczas gdy inne reszty dają białko o okresie półtrwania do ponad dziesięciu godzin w przypadku tego samego białka. Aminokwasy arginina i leucyna działają jako drugorzędowe reszty destabilizujące, ponieważ ich aktywność zależy od sprzężenia z pierwszorzędowymi resztami destabilizującymi, leucyna i fenyloalanina, poprzez białko przenośnikowe -tRNA-fenyloalanina/leucyna (transferaza L/F). Enzym ten, który jest obecny u bakterii Gram-ujemnych, a brak go u eukariontów, katalizuje połączenie leucyny i fenyloalaniny na N-końcach z argininą i lizyną sterycznie dostępną w białkach lub peptydach. Proteaza Clp(Ti), jedna z dwóch znanych zależnych od ATP proteaz w E. coli (drugą jest La), jest wymagana do degradacji in vivo substratów podlegających zasadzie końca N. Clp (750 Kda) jest białkiem zawierającym dwie podjednostki, ClpA (21 Kda) i ClpP (21 Kda), porównywalnym z proteasomem 20S u eukariontów. Jakkolwiek mutacje clpA^- E. coli nie podlegają więcej regule N-końca, rosną w tempie E. coli typu dzikiego, wykazując prawidłowe fenotypy, i nie stabilizują różnych białek E. coli o krótkim okresie trwania (Varshavsky, 1992).

Innym sposobem wytwarzania bardziej stabilnego heterologicznego białka w E. coli jest wytwarzanie go jako białko, które stanowi fuzję z częścią natywnego/naturalnego białka bakterii. Niektóre białka heterologiczne są szybko degenerowane przez proteazy gospodarza i fuzje genetyczne stabilizują wytwarzanie białek w komórce, dostarczając również strategii do dalszego ich oczyszczania (Sherwood, 1991). Jednym z przykładów tej metody jest dodanie bogatego w argininę regionu z końca karboksylowego urogastronu, który pomaga w ochronie przed proteolizą i w oczyszczaniu białka na kolumnie jonowymiennej (Smitch i wsp., 1994).

Sposób regulowanego termicznie wytwarzania białek heterologicznych w E. colii innych bakteriach Gram ujemnych obejmuje indukcję termiczną hodowli bakteryjnej zawierającej plazmid pLMT8.5

PL 194 141 B1 i gen do klonowania, przy czym plazmid pLMT8.5 jest wytworzony według opisanego tu sposobu, a klonowanie przeprowadza się bez dokonywania fuzji genetycznej. W korzystnym wykonaniu białkiem heterologicznym jest ludzka proinsulina z syntetycznego genu dla proinsuliny.

W zrekombinowanych komórkach E. coli białka heterologiczne są prawie zawsze wyrażane w postaci nierozpuszczalnych cytoplazmatycznych ciał inkluzyjnych. Innymi słowy, zrekombinowane białko nie jest wydzielanie do podłoża hodowlanego. Dodatkową cechą charakterystyczną zrekombinowanych bakterii E. coli jest akumulacja wysokich poziomów octanu w pożywce, głównie w fazie indukcji. Szkodliwy wpływ akumulacji octanu (>5g/l) na wzrost komórek i ekspresję białek heterologicznych jest dobrze udokumentowany w literaturze.

Dodatkowo, jeśli chodzi o akumulację wysokiego stężenia octanu w pożywce, które jest głównym następstwem pracy z E. coli, niniejszy wynalazek ułatwia opracowanie warunków fermentacji, w których uzyskuje się zarówno wysoką akumulację biomasy (>70 g/sucha masa/l), jak i utrzymanie niskiego stężenia octanu (<2,0 g/l), a jednocześnie osiąga się wytwarzanie zwiększonego stężenia zrekombinowanego białka powstającego w wyniku ekspresji.

Odnośnie przedstawionego tutaj sposobu oczyszczania białka wyizolowanego z ciał inkluzyjnych, należy rozumieć, że można dokonać niewielkich modyfikacji w protokole oczyszczania nie odbiegając od ducha i zakresu wynalazku tj. w szczególności w odniesieniu do wyboru rozpuszczalników, buforów, detergentów, środków denaturujących, enzymów proteolitycznych, metod rozdziału i podłoży chromatograficznych. Zrozumiałe jest w świetle ujawnienia, że jakkolwiek korzystnym detergentem do zastosowania w sposobie według niniejszego wynalazku jest Triton X-100, specjalista w tej dziedzinie może zastosować dowolny niejonowy detergent przy wykonywaniu niniejszego wynalazku. Podobnie, jeśli chodzi o wybór enzymów proteolitycznych, jakkolwiek korzystne są trypsyna i karboksypeptydaza B, można zastosować dowolny odpowiedni enzym proteolityczny, np. można zastąpić trypsynę endoproteinazą Lys-C przy zamianie proinsuliny w insulinę, a takie zastąpienia mieszczą się w zakresie wiedzy specjalisty w tej dziedzinie zorientowanego co do dostępności preparatów enzymów proteolitycznych i ich odpowiednich specyficzności.

Lepsze zrozumienie niniejszego wynalazku i jego licznych zalet umożliwią następujące, niestanowiące ograniczenia przykłady, podane w celu ilustracji.

Przykłady

P r zyk ł a d 1 - Przygotowanie wektora

Sposób konstruowania wektora do zastosowania przy regulowanym termicznie wytwarzaniu białek heterologicznych w E. coli oraz konstruowanie wektora według wynalazku składa się z następujących etapów:

i. Konstruowanie plazmidu pULTDK7.1 (fig.1)

Wytwarzanie pULTDK7.1 rozpoczęto od izolacji fragmentu zawierającego promotor PL faga lambda. Fragment ten rozciąga się od miejsca Hindlll do miejsca Hpal faga i został sklonowany w miejscach HindIII i SmaI polilinkera pUC19, z wytworzeniem zrekombinowanego plazmidu pUCPL2.7. Oligonukleotydy 011929 i 011930, które zawierają region Shine-Dalgarno genu 10 faga T7, zostały połączone i poddane ligacji w miejscu EcoRI pUCPL2.7, z wytworzeniem zrekombinowanego plazmidu pULT7.2.4. Plazmid pULT7.2.4 przecięto w miejscach BspEI i Xbal, traktowano fragmentem Klenowa polimerazy I DNA i ponownie poddawano ligacji, otrzymując delecję regionu kodującego genu N faga lambda i wytworzenie plazmidu pULTDK7.1.

oligo 011929

EcoRI

NcoI

5' AATTTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGGTG 3'

3' AGATCTTTATTAAAACAAATTGAAATTCTTCCTCTATATAGGTACCACTTAA 5' oligo 011930 ii. Konstruowanie plazmidu pUTC6 (fig. 2)

Konstrukcję pUTC6 rozpoczęto od izolacji genu oporności na tetracyklinę (Tc) poprzez trawienie plazmidu pRP4 BglII i Stul co uwolniło fragment 1,4 kb, który sklonowano w miejscach BamHI i SmaI plazmidu pUC8, z wytworzeniem plazmidu pUTl. Fragment pUC8 o wielkości 0,9 kb uwolniono poprzez trawienie Dral i PvuII i poddano ligacji z pUT1 po trawieniu Pst1, działaniu nukleazą S1, trawieniu EcoRI i traktowaniu fragmentem Klanowa w celu otrzymania plazmidu pUTC6, który zachowuje miejsce EcoRI i zawiera początek replikacji i gen oporności na Tc.

PL 194 141 B1 iii. Konstruowanie plazmidu pLMC8.1 (fig. 3)

Połączone ze sobą oligonukleotydy 1 i 2 poddano ligacji w miejscu EcoRI pUTC6 w celu wytworzenia plazmidu pMC8, zawierającego region miejsc restrykcyjnych do klonowania molekularnego. Następnie pULTDK7.1 uwolniono poprzez trawienie HindIII i EcoRI i poddano ligacji z pMC8, również strawionym Hindlll i EcoRI, uzyskując zrekombinowany plazmid pLMC8.1, zawierający gen oporności na Tc, początek replikacji, promotor PL, region Shine-Dalgarno i polilinker do klonowania molekularnego.

iv. Konstruowanie plazmidu pLMT8.5 (fig. 4)

Wydajny terminator transkrypcji został wstawiony za pośrednictwem olignukleotydów 12 i 13, które połączono ze sobą i poddano ligacji w miejscu BamHI plazmidu pLMC8.1, zachowując miejsce na końcu 5' oligonukleotydów i wytwarzając miejsce HindIII na końcu 3', co dało wektor ekspresyjny pLMT8.5 dla E. colii innych baterii Gram-ujemnych.

oligo 01

HindIII EcoRI

Stul BamHI

5' AATTAAGCTTTTCGCGAATTCTGAGGCCTGCAGGATCC 3'

3' TTCGAAAAGCGCTTAAGACTCCGGACGTCCTAGGTTAA 5'

PstI Nrul oligo 02 oligo 12

BamHI Hindlll

5'GATCCGGAAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTAAGCTT 3'

3' GCCTTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAATTCGAACTAG 5'

BspEI oligo 13

A zatem, pLMT8.5, wytworzony według metody opisanej powyżej zawiera: (1) początek replikacji pUC8; (2) gen oporności na tetracyklinę z pRP4; (3) promotor P1 faga lambda; (4) region SD-genu 10 faga T7; (5) zgrupowanie miejsc do klonowania do przeprowadzenia klonowania bez fuzji; oraz (6) terminator Rho-niezależny do transkrypcji (patrz fig.11-5, 10A-M, 11A-F).

W celu otrzymania wektora do ekspresji proinsuliny, kodującą ją sekwencję DNA wstawiono do miejsca restrykcyjnego w zgrupowaniu miejsc do klonowania wektora plazmidowego pLMT8.5. Konkretnie, syntetyczny gen dla proinsuliny sklonowano w polilinkerze, uzyskując wektor plazmidowy pPTA1 (pLMT8.5 + proinsulina). Wektor wprowadzono następnie do E. coli i bakterie hodowano w celu uzyskania ekspresji proinsuliny (np. szczep N4830-1 (c1⁸⁵⁷), patrz przykłady poniżej).

v. Konstruowanie plazmidów pLA7 i pHIS Fragment z pLA7 zawierający sekwencję proinsuliny i znacznik histydynowy wstawiono do miejsca restrykcyjnego w zgrupowaniu miejsc do klonowania wektora plazmidowego pLMT8.5., uzyskując wektor plazmidowy pHIS. Strategia klonowania jest przedstawiona na fig. 12 i 13. Wektor wprowadzono następnie do E. coli i bakterie hodowano w celu uzyskania ekspresji proinsuliny (np. szczep N4830-1 (c1⁸⁵⁷), patrz przykłady poniżej). pHIS zawiera gen dla proinsuliny z wstawioną za pośrednictwem oligonukleotydu sekwencją kodującą (HIS)6 (MetAla-His-His-His-His-His-His-Met-Gly-Arg).

(Syntetyczny gen dla proinsuliny, skonstruowany przez wynalazców przy zastosowaniu oligonukleotydów został sklonowany w miejscach NcoI i BamHI regionu polilinkera wektora pLMT8.5 w celu utworzenia wektorów do ekspresji proinsuliny pPTA1 i pHIS, patrz przykład 8).

Przykła d 2

Wytwarzanie dużej biomasy przy niskiej akumulacji octanu

Wyniki doświadczalne pokazały, że programowane dodawanie ekstraktu drożdżowego było niezbędne dla wytwarzania dużej biomasy. Dla utrzymania stężenia octanu na niskim poziomie, pH hodowli kontrolowano w fermentorze automatycznie poprzez pętlę glukozową. W tych warunkach można było kontrolować nie tylko pH, utrzymując jego wartość na dowolnym pożądanym poziomie (np. 6,8 lub niższym), ale również poziom glukozy w bulionie w fermentorze może być utrzymywana na bardzo niskim poziomie (<0,10 g/l) w czasie hodowli, zapobiegając akumulacji octanu.

W tych warunkach można było otrzymać do 95 g/l suchej masy komórkowej i ekspresję na poziomie 194 mg fuzji białkowej na gram suchej masy komórkowej.

PL 194 141 B1

P r zyk ł a d 3

Przepuszczalność i solubilizacja ciał inkluzyjnych zawierających proinsulinę.

Z reguły ciała inkluzyjne otrzymywano z komórek gospodarza przy zastosowaniu dwóch procedur: (a) Mechaniczne lub fizyczne rozerwanie osłony komórkowej poprzez przepuszczanie pasty komórkowej przez prasę Manton-Gaulin lub przez mielenie zawiesiny komórkowej w młynie koloidalnym, takim jak Dyno-Moll; oraz (b) Strawienie błony komórkowej poprzez traktowanie lizozymem. Jednakże obydwie wymienione powyżej techniki są kosztowne i potencjalnie szkodliwe z punktu widzenia całkowitej wydajności pożądanego białka. A zatem sposób według niniejszego wynalazku wykorzystuje alternatywne sposoby oczyszczania i bezpośredniej solubilizacji ciał inkluzyjnych.

Komórki E. coli (szczep K12 N 4830-1 zawierający gen dla proinsuliny pod kontrolą promotora PL; plazmidy pPTA1 i HIS, patrz Przykład 1) hodowano w 10 litrach pożywki zawierającej ekstrakt drożdżowy (20 g/l), pepton (6,0 g/l), NaCl (5,0 g/l), glukozę (10,0 g/l), Antifoam A (2,0 g/l) oraz ampicylinę (100 mg/ml) , pH 6,8 (po sterylizacji)). Pożywkę zaszczepiano w proporcji 10% objętości hodowlą wstępną, przygotowaną z pojedynczej kolonii hodowanej przez noc w tej samej pożywce. Przy gęstości optycznej około 6,0 przy 540 nm, syntezę proinsuliny indukowano poprzez podwyższenie temperatury z 30 do 38°C. Indukcję można było również zapoczątkować w temperaturach od 40 do 42°C. Komórki zbierano po 2 do 5 godzinach indukcji. Tworzenie ciał inkluzyjnych śledzono w mikroskopie z kontrastem fazowym.

Komórki zbierano poprzez odwirowanie, zawieszano dwukrotnie w wodzie dejonizowanej i odzyskiwano poprzez wirowanie. Znane ilości mokrego ciasta komórkowego zawieszano w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 i dodawano odpowiedniej ilości związków wpływających na przepuszczalność błony komórkowej, samych albo w kombinacji, do stężenia do dziesięciu objętości masy mokrego ciasta komórkowego, jak pokazano w tabeli 1. Po wytrząsaniu przez noc w temperaturze pokojowej, komórki odzyskiwano poprzez wirowanie, wilgotne ciasto komórkowe i wilgotny osad homogenizowano w 10-krotnej objętości w stosunku do masy 0,1 Tris-HCl, pH 8,5 zawierającego 8M mocznik i wytrząsanie kontynuowano w temperaturze pokojowej przez okres do 24 godzin. Supernatanty odzyskiwano poprzez odwirowanie, a osady komórkowe przemywano przez wirowanie. Stężenie fuzji białkowej określano poprzez analizę SDS-PAGE, przy zastosowaniu zarówno supernatantów, jak i osadów po etapie przemywania. Określenie masy dokonane dla mokrych osadów przed etapem wstępnym, po etapie wstępnym i po działaniu 8M mocznikiem wykazało, że nastąpiła zasadnicza utrata masy, jak pokazano w tabeli 1.

T a b e l a 1

Wpływ niektórych sposobów wstępnego traktowania na utratę masy osadów komórkowych

Próbka nr	Bufory	Mokra masa komórkowa	% utraty masy
		Początkowa	Po wstępnym traktowaniu	Po wstępnym traktowaniu	Po wstępnym traktowaniu + 8M mocznik
1	Tris 0,1 M pH 8,5	6,43	4,94	23,2	42,3
2	Tris 0,1 M pH 8,5/Toluen	6,49	4,57	29,6	52,2
3	Tris 0,1 M pH 8,5/EDTA	6,38	4,28	33,0	71,0
4	Tris 0,1 M pH 8,5/Triton X-100	6,41	3,47	45,8	58,7
5	Tris 0,1 M pH 8,5/Toluen/Triton	6,26	3,73	40,4	58,5
6	Tris 0,1 M pH 8,5 /Toluen/ EDTA	6,38	3,81	40,3	84,6
7	Tris 0,1 M pH 8,5 /EDTA/treeton	6,47	2,21	65,8	86,3
8	Tris 0,1 M pH 8,5/Toluen/EDTA/Triton	6,38	3,58	43,9	81,7

PL 194 141 B1

Przykład 4

Jednoczesne uzyskanie przepuszczalności i solubilizacja ciał inkluzyjnych zawierających proinsulinę

W doświadczeniach wstępnych, komórki po wstępnym traktowaniu odczyszczano od białek cytoplazmatycznych i innego zanieczyszczającego materiału ekstrabowanego z komórek (hodowanych tak, jak w przykładzie 3) poprzez odwirowanie, a następnie ponowne zawieszenie komórek i przemywanie w buforze zawierającym 8M mocznik.

Jednolitrowe porcje bulionu z fermentora, otrzymane tak, jak w przykładzie 3, zagęszczano do 100 ml przy zastosowaniu filtracji w przeciwprądzie. Porcje zawiesiny zagęszczonych komórek dializowano na filtrach wobec 10 objętości buforu 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 zawierającego 5 mM EDTA, 1% toluen albo wody dejonizowanej. Stały mocznik dodawano do stężenia końcowego 8M, a objętość doprowadzano buforem do 200 ml. Próbki pobierane w różnych odstępach czasu, do 24 godzin, analizowano poprzez SDS-PAGE. Uzyskano wysoce wydajne oczyszczanie i solubilizację ciał inkluzyjnych działając mocznikiem jedynie przez 6 godzin, jak pokazano na fig. 6.

P r z y k ł a d 5

Procedura uzyskiwania przepuszczalności błon przy zastosowaniu Tritonu X-100

Hodowle komórkowe hodowane tak, jak w przykładzie 4 zbierano poprzez wirowanie, zawieszano dwukrotnie w wodzie dejonizowanej i odzyskiwano poprzez wirowanie. Znane ilości mokrego ciasta komórkowego zawieszano w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 zawierającym 20% Triton X-100 i roztwory wytrząsano przez noc w temperaturze pokojowej. Stężenie białka fuzyjnego określano poprzez analizę SDS-PAGE i stwierdzono, że w tych warunkach istotna ilość materiału cytoplazmatycznego dyfunduje z komórki, pozostawiając pustą osłonkę zawierającą zasadniczo ciała inkluzyjne z nielicznymi białkami komórkowymi stanowiącymi zanieczyszczenie.

P r z y k ł a d 6

Oczyszczanie i zatężanie upłynnionych ciał inkluzyjnych przez wytrącenie w zależności od pH.

Hodowle komórkowe hodowano, traktowano wstępnie i ciała inkluzyjne solubilizowano tak, jak w przykładach 3 lub 4. Roztwór solubilizowanych ciał inkluzyjnych dializowano albo poddawano ultrawirowaniu w celu wyeliminowania mocznika. Etap frakcjonowania przez wytrącanie w pH dał w rezultacie zwiększoną czystość rozpuszczonego białka. pH roztworubiałkaobniżano, bądź poprzez dodanie kwasów mineralnych tj. kwasu solnego lub siarkowego, bądź kwasów organicznych tj. kwasu octowego. Stosując tę metodę pH obniżano do 6,0, a osad usuwano poprzez wirowanie. Białko fuzyjne wytrącano z roztworu poprzez obniżenie pH do 5,0 tą samą metodą. Osiągnięto całkowite odzyskanie białka fuzyjnego. Wytracone białko fuzyjne rozpuszczano w buforze alkalicznym przy pH 8,5. Oczyszczanie białka przez strącanie w zależności od pH jest pokazane na fig. 7.

Przykład 7

Oczyszczanie i izolacja insuliny

Ciała inkluzyjne wyizolowane z komórek zawierających i wyrażających plazmid pHIS lub całe traktowane wstępnie komórki przemywano dwukrotnie 50 mM buforem z octanem amonu, pH 9,0 i wirowano. Osad rozpuszczano w 50 mM buforze z octanem amonu, pH 9,0 zawierającym 8M mocznik i dodawano siarczyn sodu (1,25 g/g próbki) oraz tetrationian sodu (0,55 g/g próbki). Próbki mieszano w temperaturze pokojowej. Reakcję lizy siarczynowej śledzono poprzez analizę próbek na kolumnie Mono-Q. Po 24 do 48 godzin, próbkę rozcieńczano 3 razy wodą dejonizowaną, wirowano i supernatant filtrowano aby otrzymać przejrzysty roztwór. Filtrowany supernatant nakładano na kolumnę z chelatującym Ni złożem -sepharose FF (Pharmacia Biotech, Upsala, Szwecja), zrównoważoną 0,1 M buforem do równoważenia zawierającym 8 M mocznik i 0,08 M imidazol, a następnie płukano buforem do równoważenia zawierającym 8 M mocznik i 0,3 M imidazol. Rozdział chromatograficzny śledzono poprzez pomiar absorbancji przy 280 mm. Bufor z roztworu zawierającego czyste S-sulfonowane białko, izolowane przy zastosowaniu chromatografii powinowactwa do metalu, zmieniano na 10 mM glicynę, pH 10,0poprzez sączenie molekularne na złożu Sephadex G-25.

Czyste sulfonowane białko renaturowano (0,5 mg białka/ ml) poprzez dodanie 0,5 mM cystyny i 0,05 mM beta-merkaptoetanolu, z wytrząsaniem przez 18 do 24 godzin w temp. 4 do 8°C i reakcję śledzono poprzez wstrzyknięcie próbek mieszaniny reakcyjnej na HPLC wyposażoną w kolumnę Aquapore RP-300. Próbki zatężano i wymieniano bufor przez diafiltrację.

Do 1,0 ml próbki (8mg/ml) w 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5 zawierającym 0,01 EDTA dodano 35 mg trypsyny i 0,6 mg karboksypeptydazy B. Reakcję śledzono przez analizę HPLC na kolumnie Aquapore

PL 194 141 B1

RP-300 i reakcję kończono po 1 godzinie w 37°C. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczano trzykrotnie wodą i oczyszczano przez chromatografię jonowymienną i HPLC z odwróconymi fazami.

Przykład 8

Testowanie wydajności wektora ekspresyjnego

Syntetyczny gen dla proinsuliny, skonstruowany przez wynalazców przy zastosowaniu oligonukleotydów został sklonowany w miejscach Ncol i BamHI w regionie polilinkera wektora pLMT8.5 w celu wytworzenia wektorów ekspresyjnych pPTA1 i pHIS dla proinsuliny (patrz przykład 1). W testach stwierdzono, że po indukcji termicznej hodowli szczepu E. coli N4830-1 (c1⁸⁵⁷), zawierającego plazmid pPTA1 (pLMT8.5 + proinsulina) następowała indukcja zrekombinowanego białka o wielkości około 10 kDa, stanowiąc 20% frakcję wszystkich białek bakteryjnych po upływie 90 minut i że w czasie szoku cieplnego następowała utrata zdolności do namnażania się, z zachowaniem jedynie zdolności do wytwarzania zrekombinowanego białka, jak pokazano na fig. 4. W teście tym zastosowano również plazmid pPLT4. Plazmid ten jest pochodną plazmidu pPLc28 (Remaut i wsp., 1981), zmodyfikowanym przez wynalazców, w którym sklonowano to samo syntetyczne miejsce Shine Dalgarno i gen proinsuliny z plazmidów pLMT8.5 i pPTA1. Poprzez porównanie z tym plazmidem, wykazującym indukcję białka na poziomie 11% i wzrost komórek w czasie szoku termicznego, stwierdzono, że w okresie 90 minut pLMT8.5 był o 100% bardziej wydajny (Patrz fig. 9).

W ten sposób otrzymano hiperekspresyjny wektor dla E. coli, oznaczony pLMT8.5. Kiedy testowano go pod kątem wytwarzania ludzkiej proinsuliny z genu syntetycznego, stwierdzano, że z tego genu indukowane są wysokie poziomy ekspresji białka.

Plazmidy pLMT8.5, pPLT4, pHIS, i pPTA1 zostały zdeponowane 24 czerwca, 1997 w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 USA pod numerem dostępu 98474, 98475, 98476 i 98473.

P r z y k ł a d 9

Dodatkowe wektory ekspresyjne

Gen dla dowolnego spośród: epitopu będącego przedmiotem zainteresowania, modulatora odpowiedzi biologicznej, czynnika wzrostu, sekwencji rozpoznawanej, genu leczniczego lub białka fuzyjnego lub dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania albo ich kombinacji (jak dyskutowano w Szczegółowym Opisie) sklonowano w polilinkerze i wstawiono do plazmidu z przykładu 1, np. pLMT8.5, pHIS i pPTA1, a otrzymane w ten sposób plazmidy wprowadzono do E. coli, np. szczep N4830-1 (c1⁸⁵⁷) (zawierający plazmid pLMT8.5 + gen). Po indukcji termicznej następowała indukcja zrekombinowanego białka, podobna do obserwowanej w przykładzie 8 pokazując, że pLMT8.5 jest nadzwyczaj wydajny.

W ten sposób otrzymano hiperekspresyjny wektor dla E. coli, oznaczony pLMT8.5. Kiedy testowano pod kątem wytwarzania ludzkiej proinsuliny z genu syntetycznego, stwierdzano, że z tego genu indukowane są wysokie poziomy ekspresji białka. Wysokie poziomy ekspresji można było otrzymać po zastosowaniu wektora plazmidowego pLMT8.5 i innych genów egzogennych. Jak tu dyskutowano, pLMT8.5 lub jego pochodne np. pHIS i pPTA1 mogą być pozbawione markera selekcyjnego, a selekcja może się opierać na ekspresji produktu genowego np. insuliny lub proinsuliny ze znacznikiem histydynowym. Sposoby selekcji oparte o ekspresję egzogennie kodowanych sekwencji są znane w tej dziedzinie i mogą obejmować immunoprecypitację lub inne metody przeszukiwania, wykorzystujące przeciwciała, które wiążą się z produktem ekspresji lub pożywki selektywne (patrz np. Patent USA Nr 4769330, 4603112, 5110587 odnośnie selekcji z zastosowaniem pożywki selekcyjnej wobec produktu ekspresji; Patent USA Nr 5494807 odnośnie metod przeszukiwania opartych o przeciwciała).

Przykła d 10.

Manipulacja warunkami hodowli w fermentorze dla zwiększenia ekspresji białek

Produktywność fermentora można istotnie zwiększyć (<40%) poprzez odrzucenie około 70% objętości bulionu po okresie indukcji w 42°C przez 5 godzin, dodanie świeżej pożywki, powrót temperatury do 30°C na następne 5 godzin, a następnie dodatkowych 5 godzin indukcji w 42°C. W ten sposób bez zwiększania całkowitego czasu hodowli w fermentorze (20-22 godz.), otrzymuje się zwiększoną objętość biomasy i z rekombinowanego białka.

A zatem zmiana 5 godzin hodowli w fermentorze w 30°C na5 godzin indukcji w 42°C doprowadziła do wyższej wartości procentowej ekspresji zrekombinowanego białka, niż kiedy rozpoczyna się indukcję po dłuższej hodowli w fermentorze (około 17 godzin) w 30°C.

PL 194 141 B1

Stwierdzono, że inaktywacja cieplna ma negatywny wpływ na etapy oczyszczania ciał inkluzyjnych na skutek znacznej koagulacji białek cytoplazmatycznych w temperaturze inaktywacji cieplnej (80°C).

Inaktywacja komórek i uzyskanie przepuszczalności błon przeprowadzono jednocześnie poprzez traktowanie zebranych komórek przez noc 1% Toluenem i 50 mM EDTA. Dalsze oczyszczanie uzyskano poprzez ponowne zawieszenie odzyskanej biomasy w buforze 0,1 M Tris, pH 8,5 zawierającym 1,0% Triton X-100 i wytrząsanie przez pięć godzin lub przez noc. Komórki traktowane wstępnie w ten sposób, po wirowaniu można zastosować bezpośrednio w dalszych etapach oczyszczania.

Dodatkowo, poprzez dalsze traktowanie lizozymem, można otrzymać zawiesinę wyizolowanych ciał inkluzyjnych, które dają się oddzielić od resztek komórek poprzez wirowanie, w stanie wysoce oczyszczonym.

Mając zatem opisane szczegółowo korzystne wykonania niniejszego wynalazku, będzie zrozumiałe, że wynalazek zdefiniowany poprzez dołączone zastrzeżenia nie ma być ograniczony do konkretnych szczegółów przedstawionych w powyższym opisie, jako że możliwych jest wiele oczywistych jego odmian bez odbiegania od ducha i zakresu niniejszego wynalazku.

Claims (23)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Plazmidowy wektor ekspresyjny do ekspresji co najmniej jednego białka heterologicznego, znamienny tym, że zawiera następujące elementy połączone w sposób funkcjonalny, od 5' do 3':

   (i) sekwencję kodującą początek regionu replikacji z pUC8;

   (ii) sekwencję kodującą promotor PL z faga Lambda;

   (iii) sekwencję kodującą region Shine -Dalgarno;

   (iv) sekwencję kodującą co najmniej jedno miejsce restrykcyjne do wstawienia heterologicznego DNA kodującego co najmniej jedno białko heterologiczne, oraz (v) sekwencję kodującą terminator transkrypcji Rho-niezależny.
2. 2. Plazmidowy wektor ekspresyjny według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje co najmniej jeden heterologiczny DNA kodujący co najmniej jedno heterologiczne białko.
3. 3. Plazmidowy wektor ekspresyjny według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto zawiera sekwencję dla markera selekcyjnego pomiędzy (i) i (v).
4. 4. Plazmidowy wektor ekspresyjny według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jedno heterologiczne białko jest wybrane z grupy składającej się z insuliny, proinsuliny, insuliny ze znacznikiem His i proinsuliny ze znacznikiem His.
5. 5. Plazmidowy wektor ekspresyjny według zastrz. 1, znamienny tym, że białkiem heterologicznym jest proinsulina albo proinsulina zawierająca znacznik.
6. 6. Plazmidowy wektor ekspresyjny według zastrz. 1, do transformacji bakterii Gram-ujemnych.
7. 7. Plazmidowy wektor ekspresyjny według zastrz. 6, znamienny tym, że bakteria Gram-ujemna zawiera gen represorowy c1⁸⁵⁷.
8. 8. Plazmidowy wektor ekspresyjny według zastrz. 6, znamienny tym, że bakterią Gram ujemną jest E. coli, region Shine -Dalgarno jest syntetycznym regionem Shine -Dalgarno z genu 10 faga T7, marker selekcyjny koduje oporność na tetracyklinę, a sekwencja kodująca co najmniej jedno miejsce restrykcyjne jest zawartaw sekwencji polilinkera.
9. 9. Plazmidowy wektor ekspresyjny według zastrz. 8, znamienny tym, że E. coli zawiera gen represorowy c1⁸⁵⁷.
10. 10. Plazmidowy wektor ekspresyjny według zastrz. 9, znamienny tym, że bakterią Gram-ujemną jest E. coliszczep N4830-1 (c1⁸⁵⁷).
11. 11. Plazmidowy wektor ekspresyjny według zastrz. 8, znamienny tym, że polilinker obejmuje miejsca restrykcyjne Ncol, EcoRI, Stul, Pstl, BamHIi BspEI.
12. 12. Plazmid pPTAI(ATCC 98476) lub plazmid, który ma wszystkie jego cechy identyfikacyjne.
13. 13. Plazmid pHIS (ATCC 98473) lub plazmid, który ma wszystkie jego cechy identyfikacyjne.
14. 14. Plazmid pLMT8.5 (ATCC 98474) lub plazmid, który ma wszystkie jego cechy identyfikacyjne.
15. 15. Sposób ekstrahowania rekombinowanego białka zawierającego proinsulinę ze zrekombinowanej bakterii Gram-ujemnej posiadającej błonę komórkową, bez lizy bakterii, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    PL 194 141 B1 (a) doprowadzenia do kontaktu bakterii z detergentem w celu uzyskania przepuszczalności błony komórkowej, co umożliwia wydzielenie natywnych białek komórkowych z błony komórkowej bez wydzielania rekombinowanego białka z błony komórkowej;

    (b) solubilizacji rekombinowanego białka i błony komórkowej, oraz (c) oddzielenia rekombinowanego białka od błony komórkowej.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako detergent w etapie (a) stosuje się polioksyetylenowany oktylofenol (Triton X-100).
17. 17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że w etapie (a) obejmuje oddzielenie natywnych białek komórkowych od błony komórkowej przez wirowanie, w wyniku czego uzyskuje się osad zawierający rekombinowane białko w błonie komórkowej.
18. 18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że w etapie (b) solubilizację przeprowadza się przez doprowadzenie do kontaktu rekombinowanego białka w błonie komórkowej z etapu (a) z mocznikiem.
19. 19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że w etapie (c) oddzielenie przeprowadza się przez wirowanie, w wyniku czego uzyskuje się supernatant zawierający rekombinowane białko.
20. 20. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że rekombinowane białko jest rekombinowaną ludzką proinsuliną znakowaną HIS.
21. 21. Sposób wytwarzania zrekombinowanej ludzkiej insuliny, znamienny tym, że ze zrekombinowanej bakterii Gram-ujemnej posiadającej błonę komórkową, bez lizy bakterii, ekstrahuje się rekombinowane białko, którym jest rekombinowana ludzka proinsulina znakowana HIS przez (a) doprowadzenie do kontaktu bakterii z detergentem w celu uzyskania przepuszczalności błony komórkowej, co umożliwia wydzielenie natywnych białek komórkowych z błony komórkowej bez wydzielania rekombinowanego białka z błony komórkowej;

    (b) solubilizację rekombinowanego białka i błony komórkowej, oraz (c) oddzielenie rekombinowanego białka od błony komórkowej po czym oddzielone białko z etapu (c) poddaje się sulfitolizie, oddziela się ciekły produkt, który następnie umieszcza się na kolumnie z chelatującym-Ni, odzyskuje się i renaturuje eluat, renaturowany produkt przekształca się trypsyną i karboksypeptydazą B i w celu oczyszczenia izolowanej zrekombinowanej ludzkiej insuliny poddaje się go chromatografii.
22. 22. Sposób wytwarzania insuliny lub peptydu-c proinsuliny lub proinsuliny, znamienny tym, że obejmuje transformowanie E. coli wektorem zawierającym pPTAI (ATCC 98476) lub pHIS (ATCC 98473) lub plazmidem, który ma co najmniej jedną cechę identyfikacyjną pPTAI lub pHIS i uzyskanie ekspresji, ewentualnie stosując enzym do cięcia proinsuliny.
23. 23. Sposób wytwarzania proinsuliny lub insuliny, znamienny tym, że obejmuje transformowanie E. coli wektorem określonym w zastrz. 1 i uzykiwanie z niego ekspresji, w wyniku której wytwarzana jest proinsulina lub insulina.