PL195457B1

PL195457B1 - Kaseta ekspresyjna, dwucistronowy wektor plazmidowy, środek farmaceutyczny oraz ich zastosowanie

Info

Publication number: PL195457B1
Application number: PL355354A
Authority: PL
Inventors: Maciej Małecki; Przemysław Janik; Małgorzata Przybyszewska; Irena Mostowska-Waś
Original assignee: Zaklady Farm Polpharma Sa
Priority date: 2002-08-05
Filing date: 2002-08-05
Publication date: 2007-09-28
Also published as: DE60315330D1; DK1556494T3; EP1556494B1; EP1556494A2; AU2003272159A1; PL355354A1; WO2004012775A2; ATE368745T1; WO2004012775A3; AU2003272159A8; DE60315330T2

Abstract

1. Kaseta ekspresyjna skladajaca sie z promotora CMV oraz sekwencji sygnalu poliadenylacji SV40 polaczonych operacyjnie z kompleksem genowym zawierajacym: a) sekwencje kodujaca bialko hybrydowe zawierajace sekwencje sekrecyjna pochodzaca z immu- noglobuliny polaczona z sekwencja VEGF 165 z której usunieto natywna sekwencje sekrecyjna, b) sekwencje kodujaca bialko hybrydowe zawierajace sekwencje sekrecyjna pochodzaca z immu- noglobuliny polaczona z sekwencja bFGF, c) sekwencje IRES znajdujaca sie pomiedzy wymienionymi sekwencjami kodujacymi bialka hybry- dowe. 5. Dwucistronowy wektor plazmidowy, znamienny tym, ze zawiera kasete ekspresyjna skladajaca sie z promotora CMV oraz sekwencji sygnalu poliadenylacji SV40 polaczonych operacyjnie z komplek- sem genowym zawierajacym: a) sekwencje kodujaca bialko hybrydowe zawierajace sekwencje sekrecyjna pochodzaca z immu- noglobuliny polaczona z sekwencja VEGF 165 z której usunieto natywna sekwencje sekrecyjna, przy czym korzystnie sekwencja kodujaca bialko hybrydowe jest sekwencja kodujaca przedstawiona na fig. 5, b) sekwencje kodujaca bialko hybrydowe zawierajace sekwencje sekrecyjna pochodzaca z immunoglobuliny polaczona z sekwencja bFGF, przy czym korzystnie sekwencja kodujaca bialko hy- brydowe jest sekwencja kodujaca przedstawiona na fig. 2, c) sekwencje IRES znajdujaca sie pomiedzy wymienionymi sekwencjami kodujacymi bialka hybry- dowe, przy czym korzystnie sekwencja IRES jest sekwencja przedstawiona na fig. 4. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kaseta ekspresyjna, dwucistronowy wektor plazmidowy, środek farmaceutyczny oraz ich zastosowanie do angiogennej terapii genowej.

Lecznicze wykorzystanie angiogennych czynników wzrostu zostało po raz pierwszy opisane przez Folkman i wsp. (Folkman, N Engl J Med, 285:1182-1186 (1971)). Późniejsze badania potwierdziły przydatność rekombinowanych angiogennych czynników wzrostu, takich jak rodzina czynników wzrostu fibroblastów (FGF) (Yanagisawa-Miwa, et al., Science, 257:1401-1403 (1992) i Baffour, et al., J Vasc Surg, 16:181-91 (1992)), czynnik wzrostu komórek śródbłonka (ECGF)(Pu, et al., J Surg Res, 54:575-83 (1993)), oraz naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF) w stymulowaniu rozwoju i dojrzewania nowych naczyń krwionośnych w zwierzęcym modelu stanów niedokrwiennych, szczególnie mięśnia sercowego (Takeshita, et al., Circulation, 90:228-234 (1994) i Takeshita, et al., J Clin Invest, 93:662-70 (1994)). W opisanych badaniach rekombinowane białka podawano domięśniowo. Istotnym ograniczeniem tego typu terapii są trudności w zachowaniu odpowiedniego stężenia czynników wzrostu w miejscu leczenia.

Alternatywną metodą do leczenia białkami rekombinowanymi jest wykorzystywanie terapii genowej polegającej na wprowadzaniu, w miejsce dotknięte schorzeniem, DNA kodującego wymienione czynniki. Podjęto liczne próby wykorzystania w terapii sekwencji kodujących angiogenne czynniki wzrostu.

Zgłoszenie WO 97/14307 dotyczy sposobu leczenia niedokrwienia tkanki ssaka, który polega na wstrzykiwaniu do tej tkanki skutecznej ilości kwasu nukleinowego zdolnego do ekspresji białka angiogennego. Sposób według wynalazku może być zastosowany do leczenia dowolnej tkanki niedokrwionej, tj. tkanki upośledzonej w dopływie krwi w wyniku choroby niedokrwiennej. Takie tkanki obejmują przykładowo mięśnie (w tym serce), mózg, nerki i płuca. Opisano plazmid zawierający cDNA ludzkiego VEGF-165 pod kontrolą promotora CMV. Na stronie 9, akapit 3, stwierdzono, że „korzystnie białko angiogenne zawiera sygnałową sekwencję sekrecyjną ułatwiającą wydzielanie białka. Korzystne są białka angiogenne posiadające natywne sekwencje sygnałowe, np. VEGF. Białka angiogenne nie posiadające natywnej sekwencji sygnałowej, np. bFGF, mogą być zmodyfikowane znanymi metodami, tak aby posiadały takie sekwencje (...). Takie zaprezentowanie problemu nie uwzględnia możliwości zastąpienia natywnej sekwencji sekrecyjnej obecnej w VEGF-165 inną znaną sekwencją, np. wcelu poprawienia sekrecji, i sugeruje raczej, że najbardziej odpowiednie są sekwencje sekrecyjne natywnie występujące w sekwencji danego białka.

Opisano testy badań prowadzonych na zwierzętach (króliki i cielaki), ujawniając jakościowe i ilościowe dowody świadczące o uzyskaniu pożądanego efektu fizjologicznego. Brak danych opisujących terapię u ludzi.

Zgłoszenie WO 97/12519 dotyczy sposobu służącego do powtórnej entotelizacji uszkodzonych naczyń krwionośnych techniką terapii genowej. Zastosowano plazmid zawierający cDNA ludzkiego VEGF-165 pod kontrolą promotora CMV. Kaseta ekspresyjna pochodziła z phVEGF-165 opisanego już w WO 97/14307. W opisie zawarto również te same stwierdzenia dotyczące sekwencji sekrecyjnej.

Zgłoszenie WO 00/24412 dotyczy produktów i sposobów do zapobiegania zwężeniu lub powtórnemu zwężeniu naczyń za pomocą genów i białek VEGF-C i/lub VEGF-D.

Na stronie 7 opisu (linie 8-19) ujawniono możliwe zmiany stosowanej sekwencji VEGF-C i podkreślono jednocześnie rolę sekwencji sekrecyjnej dla prawidłowego wydzielania projektowanych białek. Zasugerowano stosowanie sekwencji sekrecyjnej z VEGF-C wraz z opisywanymi pochodnymi tego białka. Zasugerowano również możliwość zmiany natywnej sekwencji sekrecyjnej VEGF-C na inną sekwencję sekrecyjną.

Zgłoszenie WO 01/34208 dotyczy leczenia pacjentów ze schorzeniami sercowo-naczyniowymi, obejmującymi choroby serca i choroby obwodowego układu naczyniowego. Sposoby według wynalazku obejmują podawanie in vivo genów, kodujących białka lub peptydy angiogenne, do mięśnia sercowego lub obwodowej tkanki dotkniętej niedokrwieniem, poprzez wprowadzenie wektora zawierającego gen do naczyń krwionośnych zasilających serce lub do niedokrwionej tkanki. W przykładzie 7 ujawniono wyniki eksperymentu, którego celem było podniesienie poziomu sekrecji angiogennego białka FGF-2 nie posiadającego natywnej sekwencji ekspresyjnej. Pożądany efekt (poprawiona stymulacja

PL 195 457 B1 angiogenezy w modelu zwierzęcym) osiągnięto poprzez przyłączenie sekwencji sekrecyjnej z FGF-4. Zasugerowano, że dodawana sekwencja sekrecyjna powinna pochodzić z białka ulegającego sekrecji z komórek mięśnia sercowego. Zasugerowano również, że korzystne może być jednoczesne wykorzystanie genu FGF-4 i VEGF-145, co zdaniem autorów może prowadzić do efektu synergistycznego. Nie przedstawiono jednak żadnych dowodów potwierdzających takie przypuszczenia. Opisano jedynie badania prowadzonych na zwierzętach. Brak danych opisujących terapię u ludzi.

W świetle aktualnego stanu wiedzy istnieje nadal zapotrzebowanie na środki, które mogłyby być wykorzystane w terapii genowej niedokrwistości tkanek występującej u ludzi. Problemami, które wymagają rozwiązania jest poprawa skuteczności dostarczanych preparatów, na przykład poprzez zwiększenie poziomu sekrecji ekspresjonowanych czynników angiogennych. Problemami wymagającymi rozwiązania są też poprawa jakości i trwałości indukowanych naczyń, które dla osiągnięcia lepszego efektu terapeutycznego powinny osiągać pełną dojrzałość. Korzystne byłoby również ograniczenie potencjalnej toksyczności preparatów iniekcyjnych zawierających lecznicze DNA oraz obniżenie ich kosztów wytwarzania.

Wskazane problemy zostały rozwiązane w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest kaseta ekspresyjna składająca się z promotora CMV oraz sekwencji sygnału poliadenylacji SV40 połączonych operacyjnie z kompleksem genowym zawierającym:

a) sekwencję kodującą białko hybrydowe zawierające sekwencję sekrecyjną pochodzącą z immunoglobuliny połączoną z sekwencją VEGF165 pozbawioną natywnej sekwencji sekrecyjnej,

b) sekwencję kodującą białko hybrydowe zawierające sekwencję sekrecyjną pochodzącą z immunoglobuliny połączoną z sekwencją bFGF,

c) sekwencję IRES znajdującą się pomiędzy wymienionymi sekwencjami kodującymi białka hybrydowe.

Korzystnie sekwencją kodującą białko hybrydowe wymienioną w (a) jest sekwencja kodująca przedstawiona na fig. 5, sekwencją kodującą białko hybrydowe wymienioną w (b) jest sekwencja kodująca przedstawiona na fig. 2, natomiast sekwencją IRES wymienioną w (c) jest sekwencja przedstawiona na fig. 4.

Przedmiotem wynalazku jest także dwucistronowy wektor plazmidowy, charakteryzujący się tym, zawiera kasetę ekspresyjną według wynalazku. Korzystnie, wektorem plazmidowym jest pVIF.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kasety ekspresyjnej według wynalazku do produkcji wektora ekspresyjnego do terapii genowej stanów niedokrwiennych u ludzi. W szczególności, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie plazmidu pVIF do wytwarzania leku do leczenia stanów niedokrwiennych u ludzi. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny do leczenia stanów niedokrwiennych u ludzi zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera dwucistronowy wektor plazmidowy zawierający kasetę ekspresyjną według wynalazku. Korzystnie czynnikiem aktywnym jest plazmid pVIF.

Niniejszy wynalazek nieoczekiwanie pozwala osiągnąć istotną poprawę efektywności angiogennej terapii genowej. Nieoczekiwanie stosując obce gatunkowo sekwencje sekrecyjne uzyskano zwiększenie poziomu sekrecji ekspresjonowanych czynników angiogennych. Nieoczekiwanie, prezentowany wektor indukuje w warunkach in vivo powstawanie bardziej dojrzałych i ustabilizowanych naczyń krwionośnych w porównaniu z wektorem kodującym pojedynczy czynnik, np. tylko VEGF, a prowadzona za jego pomocą terapia genowa (próby na pacjentach) przynosi efektywniejszą i szybszą poprawę stanu klinicznego pacjenta. Iniekcja wektora dwucistronowego wiąże się bezpośrednio z wprowadzeniem mniejszej dawki obcego DNA oraz endotoksyn, które mogą stanowić zanieczyszczenia preparatów DNA, niż w sytuacji podania dwóch jednogenowych wektorów, niweluje się tym samym niebezpieczeństwo wystąpienia toksyczności preparatu lub innych poważnych powikłań (stany gorączkowe, wstrząsy, zapaści). Nie bez znaczenia są też niższe koszty materiałowe potrzebne dla uzyskania jednego wektora dwucistronowego. Oczywiste jest, że izolacja, oczyszczanie, badanie poziomu endotoksyn jest mniejszy niż dwóch wektorów jednogenowych. Dzięki temu proces produkcji, przy zaangażowaniu takich samych środków może być bardziej wydajny. Zwiększa to w istotny sposób dostępność preparatu.

Opis wynalazku uzupełniono następującymi figurami:

Figura 1 przedstawia schemat kasety ekspresyjnej w wektorze pVIF. Zastosowano następujące oznaczenia: CMV- promotor pochodzący z wirusa cytomegalii, ATG - kodon startu, TGA - kodon sto4

PL 195 457 B1 pu, Igk - sekwencja sygnałowa pochodząca z mysiej immunoglobuliny, VEGF - gen kodujący naczyniowo śródbłonkowy czynnik wzrostu, bFGF - gen kodujący zasadowy fibroblastyczny czynnik wzrostu, IRES - sekwencja wiązania do rybosomów (ang. internal ribosome entry site).

Figura 2 przedstawia sekwencję ATG-Igk-bFGF wklonowaną do wektora pSEC/VEGF/IRES (NotI-ATG-Igk-bFGF-XhoI), podkreślono fragmenty sekwencji odpowiadające użytym starterom, a zacieniowano fragmenty sekwencji kodujące wykorzystane miejsca restrykcyjne.

Figura 3 przedstawia sekwencję bFGF wklonowaną do wektora pSEC (EcoRI-bFGF-XhoI), podkreślono fragmenty sekwencji odpowiadające użytym starterom, a zacieniowano fragmenty sekwencji kodujące wykorzystane miejsca restrykcyjne.

Figura 4 przedstawia sekwencję IRES wklonowaną do wektora pSEC/VEGF (EcoRI-IRES-NotI). Podkreślono fragmenty sekwencji odpowiadające starterom RBS-1, RBS-2, a zacieniowano fragmenty sekwencji kodujące wykorzystane miejsca restrykcyjne (EcoRI, NotI).

Figura 5 przedstawia sekwencję ATG-Igk-VEGF wklonowaną do wektora pSEC/VEGF, wytłuszczono kodony startu i stopu, zacieniowano fragmenty sekwencji kodujące wykorzystane miejsca restrykcyjne.

Przykład 1. Plazmid pVIF.

Konstrukt pVIF jest plazmidowym wektorem ekspresyjnym kodującym czynniki o charakterze angiogennym. Wklonowana kaseta jest dwucistronowa. Zawiera ona: gen kodujący VEGF165 (pubmed X62568), sekwencję IRES (na podstawie matrycy wklonowanej do wektora pIRES-EGFP, clontech, cat. #6064-1) oraz sekwencję kodującą bFGF (pubmed E02544). Sekwencja IRES pochodzi z wirusa encephalomyocarditis (ECMV) i zapewnia translację dwóch wklonowanych genów na bazie jednej bicistronowej sekwencji mRNA. W kasecie sekwencje VEGF, jak i FGF poprzedzane są przez sekwencje sygnałowe umożliwiające sekrecję powstałych białek VEGF i FGF. Schemat kasety ekspresyjnej w wektorze pVIF przedstawiono na figurze 1.

Przykład 2. Otrzymywanie wektora pVIF.

Klonowanie przeprowadzono wykorzystując lepkie końce, zgodnie z ramką odczytu od trójki ATG, wykorzystano odczynniki firmy Amersham, wektor amplifikowano w bakteriach E.coli szczepu DH5a, izolację przeprowadzono zestawem EndoFree Plasmid Mega Kit firmy Qiagen.

Do uzyskania wektora pVIF wykorzystano dwa wektory posiłkowe: pSEC/VEGF oraz pusty wektor pSEC. Wektor pSEC/VEGF sklonowano wcześniej zgodnie z opisem zawartym w polskim zgłoszeniu patentowym P.339326, i jest to ekspresyjny wektor plazmidowy kodujący izoformę VEGF165. Zawiera on sekwencję sygnałową umożliwiającą sekrecję białka VEGF poza komórkę. Procedura obejmowała trzy etapy: (a) subklonowanie sekwencji IRES z wektora pMIG/IRES do wektora pSEC/VEGF, (b) wklonowanie sekwencji bFGF do wektora pSEC, (c) subklonowanie kasety ATG-Igk-bFGF z wektora pSEC/bFGF do wektora pSEC/VEGF/IRES

A. Subklonowanie sekwencji IRES z wektora pMIG/IRES do wektora pSEC/VEGF. Sekwencję IRES amplifikowano reakcją PCR na matrycy sekwencji wklonowanej do wektora pMIG. Startery do PCR zaprojektowano tak, aby wnosiły miejsca rozpoznawalne przez restryktazy EcoRI i Notl:

RBS-1: 5' - AAGAATTCCAATTCCGCCCCTCTCCCT - 3'

RBS-2: 5' - AAGCGGCCGCTTGTGGCAAGCTTATCATC -3'

Produkt PCR oczyszczano zestawem clean-up (DNA-Gdańsk), trawiono EcoRI i Notl przez 1 h w temp. 37°C i izolowano z żelu agarozowego zestawem QIAquick Gel Extraction Kit firmy Qiagen. Wektor pSEC/VEGF również trawiono EcoRI i Notl, rozdzielano elektroforetycznie i izolowano z żelu. Ligowano przez 16 h w16°C wykorzystując aktywność ligazy T4 (Amersham). Liganty transformowano do bakterii E.coli, przeprowadzono selekcję klonów na płytkach agarowych z ampicyliną. Wyrosłe klony przepasażowano do płynnej pożywki LB z ampicyliną. Hodowano przez noc w 37°C. Z klonów izolowano plazmidy, które poddano następnie analizie restrykcyjnej.

Otrzymano w ten sposób wektor pSEC/VEGF/IRES.

B. Wklonowanie sekwencji bFGF do wektora pSEC

Sekwencję kodującą bFGF amplifikowano na bazie cDNA z komórek linii HUVEC (ang. human urolimbical vein endothelial cell). Startery zaprojektowano z miejscami restrykcyjnymi dla EcoRI i Xhol:

HbF-1: 5' - ATGAATTCGCCAGCATTGCCCGAGGAT -3'

HbF-2: 5' - TTCTCGAGATTCAGCTCTTAGCAGACAT -3'

Produkt PCR oczyszczano zestawem clean-up (DNA-Gdańsk), trawiono EcoRI i XHol przez 1h w temp. 37°C i izolowano z żelu agarozowego zestawem QIAquick Gel Extraction Kit firmy Qiagen.

PL 195 457 B1

Wektor pSEC również trawiono EcoRI i Xhol, rozdzielano elektroforetycznie i izolowano z żelu. Ligowano przez 16 h w 16°C wykorzystując aktywność ligazy T4 (Amersham). Liganty transformowano do bakterii E.coli, przeprowadzono selekcję klonów na płytkach agarowych z ampicyliną. Wyrosłe klony przesiewano do płynnej pożywki LB z ampicyliną. Hodowano przez noc w 37°C. Z klonów izolowano plazmidy, które poddano następnie analizie restrykcyjnej. Otrzymano w ten sposób wektor pSEC/FGF.

C. Subklonowanie kasety ATG-Igk-bFGF z wektora pSEC/bFGF do wektora pSEC/VEGF/IRES

Z wektora pSEC/FGF przeklonowano kasetę ATG-Igk -FGF do wektora pSEC/VEGF/IRES. Fragment ten amplifikowano reakcją PCR. Zaprojektowano nowy starter - wprowadzający miejsce dla Notl oraz wykorzystano starter HbF-2. Sekwencja startera sens:

Not_JgK: 5' - AAGCGGCCGCACCATGGAGACAGACACA - 3'

Dalej postępowano podobnie jak wcześniej: produkt PCR oczyszczano zestawem clean-up (DNA-Gdańsk), trawiono Notl i Xhol przez 1 h w temp. 37°C i izolowano z żelu agarozowego zestawem QIAquick Gel Extraction Kit firmy Qiagen. Wektor pSEC/VEGF/IRES również trawiono enzymami Notl i Xhol, rozdzielano elektroforetycznie i izolowano z żelu. Ligowano przez 16 h w 16°C wykorzystując aktywność ligazy T4 (Amersham). Liganty transformowano do bakterii E.coli, przeprowadzono selekcję klonów na płytkach agarowych z ampicyliną. Wyrosłe klony przepasażowano do płynnej pożywki LB z ampicyliną. Hodowano przez noc w 37°C. Z klonów izolowano plazmidy, które poddano następnie analizie restrykcyjnej. Otrzymano wten sposób wektor pSEC/VEGF/IRES/FGF (pVIF).

Powstały konstrukt został poddany szczegółowej analizie restrykcyjnej - stosowano różne kombinacje restryktaz; przeprowadzono również kilka reakcji PCR w oparciu o różne zestawy starterów, jak również sekwencjonowano konstrukt. Wszystkie analizy potwierdziły prawidłowe klonowanie - otrzymano wektor z bicistronową kasetą ekspresyjną VEGF/IRES/FGF:

Przykład 3. Badania in vitro

Skonstruowany wektor pVIF został wprowadzony do komórek nowotworowych (linia LI -mysi mięsak) i nienowotworowych (linia HCV-29 - ludzki nabłonek przejściowy pęcherza moczowego) o niskiej ekspresji czynników wzrostowych VEGF i FGF. Metodą Western blotting, w oparciu o swoiste monoklonalne przeciwciała antyVEGF i antyFGF, badano występowanie tych białek w medium znad transfekowanych komórek. Analiza potwierdziła, iż w transfekowanych komórkach dochodzi do ekspresji genów niesionych przez wektor pVIF oraz że powstałe białka VEGF i FGF są wydzielane poza komórkę.

Przykład 4. Badania in vivo

Badania zostały przeprowadzone na myszach szczepu BALB/c (samce). Wykonano test skórnej angiogenezy. Myszy otrzymywały śródskórnie wektor w dawce 10 mg na punkt. Po 3, 13 dniach od iniekcji liczono nowe naczynia krwionośne. Stwierdzono, iż wektor pVIF wyraźnie indukuje powstawanie naczyń krwionośnych. Wyniki zebrano w tabeli 1.

Tabela 1. Porównanie efektów

Angiogeneza in vivo (myszy) - liczba nowych naczyń po śródskórnym wprowadzeniu wektorów
	pVIF	pVEGF	pFGF
3 dni	21,33 +/-3,77 n = 15	14,50 +/-2,26 n = 14	12,13 +/-1,96 n = 15
13 dni	26,10 +/-8,60 n = 17	18,20+/-4,5 n = 15	-

Przykład 5. Badania histochemiczne

Do badań wykorzystano myszy poddane testowi skórnej angiogenezy. Pobierano wycinki tkanki śródskórnej z nowymi naczyniami krwionośnymi. Celem badań była ocena i porównanie charakteru histologicznego naczyń powstałych po śródskórnej iniekcji wektorów pVIF i pSEC/VEGF. Uzyskane wyniki dowodzą, iż wektor pVIF indukuje powstanie bardziej dojrzałych, większych naczyń niż wektor pSEC/VEGF.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kaseta ekspresyjna składająca się z promotora CMV oraz sekwencji sygnału poliadenylacji SV40 połączonych operacyjnie z kompleksem genowym zawierającym:

a) sekwencję kodującą białko hybrydowe zawierające sekwencję sekrecyjną pochodzącą z immunoglobuliny połączoną z sekwencją VEGF165 z której usunięto natywną sekwencję sekrecyjną,

b) sekwencję kodującą białko hybrydowe zawierające sekwencję sekrecyjną pochodzącą z immunoglobuliny połączoną z sekwencją bFGF,

c) sekwencję IRES znajdującą się pomiędzy wymienionymi sekwencjami kodującymi białka hybrydowe.
2. Kaseta ekspresyjna według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencją kodującą białko hybrydowe wymienioną w (a) jest sekwencja kodująca przedstawiona na fig. 5.
3. Kaseta ekspresyjna według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencją kodującą białko hybrydowe wymienioną w (b) jest sekwencja kodująca przedstawiona na fig. 2.
4. Kaseta ekspresyjna według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencją IRES wymienioną w (c) jest sekwencja przedstawiona na fig. 4.
5. Dwucistronowy wektor plazmidowy, znamienny tym, że zawiera kasetę ekspresyjną składającą się z promotora CMV oraz sekwencji sygnału poliadenylacji SV40 połączonych operacyjnie z kompleksem genowym zawierającym:

a) sekwencję kodującą białko hybrydowe zawierające sekwencję sekrecyjną pochodzącą z immunoglobuliny połączoną z sekwencją VEGF165 z której usunięto natywną sekwencję sekrecyjną, przy czym korzystnie sekwencją kodującą białko hybrydowe jest sekwencja kodująca przedstawiona na fig. 5,

b) sekwencję kodującą białko hybrydowe zawierające sekwencję sekrecyjną pochodzącą z immunoglobuliny połączoną z sekwencją bFGF, przy czym korzystnie sekwencją kodującą białko hybrydowe jest sekwencja kodująca przedstawiona na fig. 2,

c) sekwencję IRES znajdującą się pomiędzy wymienionymi sekwencjami kodującymi białka hybrydowe, przy czym korzystnie sekwencją IRES jest sekwencja przedstawiona na fig. 4.
6. Wektor plazmidowy według zastrz. 5, znamienny tym, że jest plazmidem pVIF zawierającym kasetę ekspresyjną przedstawioną na fig. 1.
7. Zastosowanie kasety ekspresyjnej składającej się z promotora CMV oraz sekwencji sygnału poliadenylacji SV40 połączonych operacyjnie z kompleksem genowym zawierającym:

a) sekwencję kodującą białko hybrydowe zawierające sekwencję sekrecyjną pochodzącą z immunoglobuliny połączoną z sekwencją VEGF165 z której usunięto natywną sekwencję sekrecyjną,

b) sekwencję kodującą białko hybrydowe zawierające sekwencję sekrecyjną pochodzącą z immunoglobuliny połączoną z sekwencją bFGF,

c) sekwencję IRES znajdującą się pomiędzy wymienionymi sekwencjami kodującymi białka hybrydowe, do produkcji wektora ekspresyjnego do terapii genowej stanów niedokrwiennych u ludzi.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że jako sekwencję kodującą białko hybrydowe wymienioną w (a) stosuje się sekwencję kodującą przedstawioną na fig. 5.
9. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że jako sekwencję kodującą białko hybrydowe wymienioną w (b) stosuje się sekwencję kodującą przedstawioną na fig. 2.
10. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że jako sekwencję IRES wymienioną w (c) stosuje się sekwencję przedstawioną na fig. 4.
11. Zastosowanie plazmidu pVIF zawierającego kasetę ekspresyjną przedstawioną na fig. 1do wytwarzania leku do leczenia stanów niedokrwiennych u ludzi.
12. Środek farmaceutyczny do leczenia stanów niedokrwiennych u ludzi zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera dwucistronowy wektor plazmidowy zawierający kasetę ekspresyjną składającą się z promotora CMV oraz sekwencji sygnału poliadenylacji SV40 połączonych operacyjnie z kompleksem genowym zawierającym:

a) sekwencję kodującą białko hybrydowe zawierające sekwencję sekrecyjną pochodzącą z immunoglobuliny połączoną z sekwencją VEGF165 z której usunięto natywną sekwencję sekrecyjną,

b) sekwencję kodującą białko hybrydowe zawierające sekwencję sekrecyjną pochodzącą z immunoglobuliny połączoną z sekwencją bFGF,

PL 195 457 B1

c) sekwencję IRES znajdującą się pomiędzy wymienionymi sekwencjami kodującymi białka hybrydowe.
13. Środek farmaceutyczny według zastrz. 12, znamienny tym, że sekwencją kodującą białko hybrydowe wymienioną w (a) jest sekwencja kodująca przedstawiona na fig. 5.
14. Środek farmaceutyczny według zastrz. 12, znamienny tym, że sekwencją kodującą białko hybrydowe wymienioną w (b) jest sekwencja kodująca przedstawiona na fig. 2.
15. Środek farmaceutyczny według zastrz. 12, znamienny tym, że sekwencją IRES wymienioną w (c) jest sekwencja przedstawiona na fig. 4.
16. Środek farmaceutyczny według zastrz. 12, znamienny tym, że sekwencją kodującą białko hybrydowe jest kaseta ekspresyjna przedstawiona na fig. 1.
17. Środek farmaceutyczny według zastrz. 12, znamienny tym, że czynnikiem aktywnym jest plazmid pVIF zawierający kasetę ekspresyjną przedstawioną na fig. 1.