PL195495B1 - Sposób i zestaw testowy do wykrywania antybiotyków beta-laktamowych w płynach biologicznych - Google Patents
Sposób i zestaw testowy do wykrywania antybiotyków beta-laktamowych w płynach biologicznychInfo
- Publication number
- PL195495B1 PL195495B1 PL99345396A PL34539699A PL195495B1 PL 195495 B1 PL195495 B1 PL 195495B1 PL 99345396 A PL99345396 A PL 99345396A PL 34539699 A PL34539699 A PL 34539699A PL 195495 B1 PL195495 B1 PL 195495B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- blar
- ctd
- antibiotics
- ppb
- test
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 title claims abstract description 41
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 title abstract 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 75
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 44
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 29
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims abstract description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 91
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 61
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 61
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 61
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 33
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 32
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 24
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 claims description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 claims description 18
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 claims description 18
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 8
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 7
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 3
- 229910052714 tellurium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N tellurium atom Chemical compound [Te] PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 claims description 3
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 62
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 41
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 31
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 18
- 229960005229 ceftiofur Drugs 0.000 description 17
- ZBHXIWJRIFEVQY-IHMPYVIRSA-N ceftiofur Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC(=O)C1=CC=CO1 ZBHXIWJRIFEVQY-IHMPYVIRSA-N 0.000 description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N cloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1Cl LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N 0.000 description 16
- 229960003326 cloxacillin Drugs 0.000 description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- UQLLWWBDSUHNEB-CZUORRHYSA-N Cefaprin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CSC1=CC=NC=C1 UQLLWWBDSUHNEB-CZUORRHYSA-N 0.000 description 13
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 13
- 229960004350 cefapirin Drugs 0.000 description 13
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 13
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 12
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 10
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 10
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- -1 urine Substances 0.000 description 8
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 7
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 7
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 5
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 5
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 4
- YFAGHNZHGGCZAX-JKIFEVAISA-N dicloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=C(Cl)C=CC=C1Cl YFAGHNZHGGCZAX-JKIFEVAISA-N 0.000 description 4
- 229960001585 dicloxacillin Drugs 0.000 description 4
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 4
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- LHNIIDJCEODSHA-OQRUQETBSA-N (6r,7r)-3-[(e)-2-(2,4-dinitrophenyl)ethenyl]-8-oxo-7-[(2-thiophen-2-ylacetyl)amino]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SCC(=C(N2C1=O)C(=O)O)\C=C\C=1C(=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)C(=O)CC1=CC=CS1 LHNIIDJCEODSHA-OQRUQETBSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 description 3
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N nafcillin Chemical compound C1=CC=CC2=C(C(=O)N[C@@H]3C(N4[C@H](C(C)(C)S[C@@H]43)C(O)=O)=O)C(OCC)=CC=C21 GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N 0.000 description 3
- 229960000515 nafcillin Drugs 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 2
- 102100036129 Tumor suppressor candidate 2 Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 2
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N Antibiotic SQ 26917 Natural products O=C1N(S(O)(=O)=O)C(C)C1NC(=O)C(=NOC(C)(C)C(O)=O)C1=CSC(N)=N1 WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100064718 Borrelia bavariensis (strain ATCC BAA-2496 / DSM 23469 / PBi) fusA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100209555 Caenorhabditis elegans vha-17 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N D-alanyl-D-alanine Chemical group C[C@@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C)C([O-])=O DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101001061518 Homo sapiens RNA-binding protein FUS Proteins 0.000 description 1
- 101000659267 Homo sapiens Tumor suppressor candidate 2 Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 102000030899 Serine-Type D-Ala-D-Ala Carboxypeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010004832 Serine-Type D-Ala-D-Ala Carboxypeptidase Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 101710150339 Tumor suppressor candidate 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 229940024554 amdinocillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N aztreonam Chemical compound O=C1N(S([O-])(=O)=O)[C@@H](C)[C@@H]1NC(=O)C(=N/OC(C)(C)C(O)=O)\C1=CSC([NH3+])=N1 WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N 0.000 description 1
- 229960003644 aztreonam Drugs 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- XFLVBMBRLSCJAI-ZKWXMUAHSA-N biotin amide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)N)SC[C@@H]21 XFLVBMBRLSCJAI-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- XFLVBMBRLSCJAI-UHFFFAOYSA-N biotin amide Natural products N1C(=O)NC2C(CCCCC(=O)N)SCC21 XFLVBMBRLSCJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 108010059877 carboxy-terminal domain phosphatase Proteins 0.000 description 1
- JFPVXVDWJQMJEE-IZRZKJBUSA-N cefuroxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(N)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CC=CO1 JFPVXVDWJQMJEE-IZRZKJBUSA-N 0.000 description 1
- 229960001668 cefuroxime Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- BWWVAEOLVKTZFQ-ISVUSNJMSA-N chembl530 Chemical compound N(/[C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)=C\N1CCCCCC1 BWWVAEOLVKTZFQ-ISVUSNJMSA-N 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000576 food coloring agent Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-ylideneazanium;chloride Chemical compound Cl.N=C1CCCS1 ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/11—Automated chemical analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
1. Sposób wykrywania antybiotyków ß-laktamowych w plynach biologicznych, a zwlaszcza w mleku, obejmujacy nastepujace etapy: a) kontaktowanie okreslonej objetosci tego plynu biologicznego z pewna iloscia srodka rozpo- znajacego i inkubowanie tak otrzymanej mieszaniny w warunkach umozliwiajacych kompleksowanie antybiotyków, które moga byc obecne w tym plynie biologicznym, srodkiem rozpoznajacym, b) kontaktowanie mieszaniny otrzymanej w etapie a) z co najmniej jednym ß-laktamowym anty- biotykiem wzorcowym unieruchomionym na podlozu w warunkach umozliwiajacych kompleksowanie tego antybiotyku wzorcowego srodkiem rozpoznajacym w ilosci, która nie ulegla reakcji w etapie a), oraz c) oznaczanie ilosci srodka rozpoznajacego zwiazanego z podlozem, znamienny tym, ze jako srodek rozpoznajacy stosuje sie receptor BlaR lub BlaR-CTD, otrzy- many ze szczepu Bacillus licheniformis. 12. Zestaw testowy do wykrywania antybiotyków ß-laktamowych w plynach biologicznych, a zwlaszcza w mleku, sposobem okreslonym w zastrz. 1, zawierajacy co najmniej jeden srodek roz- poznajacy wrazliwy na antybiotyki ß-laktamowe i co najmniej jeden ß-laktamowy antybiotyk wzorcowy unieruchomiony na podlozu, znamienny tym, ze jako srodek rozpoznajacy zawiera receptor BlaR lub BlaR-CTD, otrzymany ze szczepu Bacillus licheniformis. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sposób i zestaw testowy do wykrywania antybiotyków b-laktamowych w płynach biologicznych, a zwłaszcza w mleku.
Obecnie antybiotyki są bardzo szeroko stosowane nie tylko jako środki lecznicze w zwalczaniu chorób zakaźnych wywoływanych przez bakterie, ale również jako środki pomocne w przechowywaniu żywności i dodatki do pokarmów zwierzęcych, stosowanych wcelu stymulacji wzrostu. W związku z tym istnieje coraz większa potrzeba wykrywania obecności antybiotyków, nawet w bardzo niskich stężeniach, w złożonych płynach biologicznych, takich jak mleko, mocz, krew, surowica, ślina, ekstrakty mięsne, płyny fermentacyjne, lub w buforowanych ośrodkach wodnych.
Przykładowo, jest to istotne w procesie produkcji mleka, gdyż dobrze wiadomo, że antybiotyki są stosowane w leczeniu pewnych chorób zakaźnych u bydła mlecznego.
Jednak z oczywistych względów medycznych mleko, które ma być stosowane jako produkt spożywczy przeznaczony dla ludzi, zasadniczo nie może zawierać nawet śladowych ilości antybiotyków. Poza tym, penicylina w stężeniu 0,005 I.U./ml lub niższym może wywierać szkodliwe działanie w procesie wytwarzania produktów mlekopochodnych, takich jak sery, jogurt itp.
Rozważyć można kilka sytuacji. W pierwszym przypadku, np. wcelu wykrycia obecności antybiotyków u producenta mleka przed transportem, pierwszeństwo będą miały testy niezmiernie szybkie (trwające krócej niż 5 minut) i proste. Możliwe jest również rozważenie użycia takiego testu wówczas, gdy np. znany jest antybiotyk, który został zastosowany w leczeniu, a ponadto gdy test ten umożliwia wykrycie danego antybiotyku zgodnie z obowiązującą normą. W drugim przypadku, gdy podstawowym problemem nie jest szybkość reakcji, znaczenia nabiera możliwość wykrycia większości, jeżeli nie wszystkich, antybiotyków zgodnie z obowiązującą normą.
Przyczyną tego jest to, że prawo w niektórych państwach nakłada bardzo szczegółowe normy jakościowe. Przykładowo, władze amerykańskie wymagają, aby stężenia w mleku następujących sześciu antybiotyków nie przekraczały ściśle określonych wartości: penicylina 5 ppb (części na miliard); ampicylina, 10 ppb; amoksycylina, 10 ppb; kloksacylina, 10 ppb; cefapiryna, 20 ppb; ceftiofur, 50 ppb. Unia Europejska nakłada następujące normy jakości: penicylina, 4 ppb; amoksycylina, 4 ppb; ampicylina, 4 ppb; kloksacylina, 30 ppb; dikloksacylina, 30 ppb; oksacylina, 30 ppb; cefapiryna, 10 ppb; ceftiofur, 100 ppb; cefochinon, 20 ppb; nafcylina, 30 ppb; cefazolina, 50 ppb.
Korzystne może być zatem dysponowanie takimi testami, które umożliwiałyby wykrywanie większości antybiotyków. Ponadto w przemyśle mleczarskim, gdy nie jest dostępny test charakteryzujący się zarówno odpowiednią szybkością, czułością jaki łatwością wykonania, korzystny może okazać się test zapewniający najlepsze możliwe połączenie tych trzech cech, nawet wówczas gdy żadna z nich nie byłaby całkowicie spełniona.
Do wykrywania antybiotyków b-laktamowych w płynach biologicznych proponowano stosowanie różnych rodzajów testów.
Testy te są zazwyczaj oparte na metodach wykrywania, w których stosuje się środek rozpoznający (receptor lub przeciwciało), który w swoisty sposób rozpoznaje ten antybiotyk lub jego analog, oraz środek znakujący (pierwiastek radioaktywny, enzym, środek fluorescencyjny itp.), które to substancje będą w dalszej części opisu nazywane środkami wykrywającymi. W zależności od wybranych składników, stosuje się metodę radioimmunoenzymatyczną (RIA), test z użyciem radioreceptora (RRA), metodę immunoenzymatyczną (EIA) itp. Zgodnie z ogólną zasadą, wtych testach stosuje się co najmniej dwa z wymienionych powyżej składników (środków wykrywających) w połączeniu, dzięki czemu można wtych testach uzyskać wyniki, których wartości będą stanowiły wskaźnik ilości analitu znajdującego się w badanej próbce.
Należy zauważyć, że w zależności od wybranej metody wykrywania, środek znakujący może być ewentualnie sprzężony albo ze środkiem rozpoznającym, alboz antybiotykiem lub jego analogiem rozpoznawanym przez środek rozpoznający. Znane są również sposoby, w których środek rozpoznający, antybiotyk lub jego analog zawiera środek znakujący (np. analit znakowany promieniotwórczo).
W przypadku przetworów mlecznych, testy służące do wykrywania analitów są najdokładniej opisane pod kątem wykrywania antybiotyków.
W opisie patentowym US 4239852 opisano mikrobiologiczny sposób wykrywania w mleku antybiotyków b-laktamowych. Zgodnie z tym sposobem, próbkę mleka inkubuje się najpierw
PL 195 495 B1 w obecności fragmentów komórek mikroorganizmów, które są wysoce wrażliwe na te antybiotyki, zwłaszcza Bacillus stearothermophilus, a następnie w obecności antybiotyku, który jest znakowany („znaczony”) pierwiastkiem radioaktywnym lub enzymem. Inkubację prowadzi się w warunkach umożliwiających wiązanie się antybiotyków, jeżeli znajdują się w próbce, oraz znakowanego antybiotyku, z fragmentami komórek.
Po inkubacji fragmenty komórek oddziela się od mieszaniny, a następnie przemywa. Następnie oznacza się ilość znakowanego antybiotyku związanego z fragmentami komórek i porównuje z wzorcem. Ilość znakowanego antybiotyku związanego z fragmentami komórek jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia antybiotyku w analizowanej próbce mleka.
Sposób ten wymaga ostrożnego obchodzenia się z materiałem, zwłaszcza w stadium wydzielania fragmentów komórek z mieszaniny. Ponadto, w najczulszej postaci tego sposobu, umożliwiającej wykrycie penicyliny G w mleku w stężeniu do 0,01 I.U./ml, a nawet do 0,001 I.U./ml, stosuje się antybiotyk znakowany pierwiastkiem promieniotwórczym (14C lub 125I). W tym przypadku do oznaczenia ilości antybiotyku znajdującego się w mleku konieczne jest użycie specjalnego przyrządu, takiego jak np. licznik scyntylacyjny. Ponadto praca z produktami radioaktywnymi, nawet w bardzo niewielkich ilościach, jest związana z pewnymi zagrożeniami dla osoby przeprowadzającej analizę.
W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 593112 opisano inny sposób umożliwiający wykrywanie antybiotyków zawartych w mleku. Wtym sposobie stosuje się białko wyizolowane z mikroorganizmu wrażliwego na antybiotyk, takiego jak Bacillus stearothermophilus. Białko to jest ponadto znakowane enzymem, takim jak peroksydaza.
Test wykonuje się w następujący sposób: próbkę mleka inkubuje się w probówce w obecności znakowanego białka; po inkubacji mleko przenosi się do drugiej probówki, na której ściankach znajdujesię immobilizowany antybiotyk wzorcowy; przeprowadza się drugą inkubację, a następnie usuwa zawartość probówki; ścianki tej drugiej probówki spłukuje się trzykrotnie roztworem płuczącym, który następnie usuwa się, a pozostałości obecne w drugiej probówce przenosi się na kawałek bibuły; do drugiej probówki dodaje się substratu reakcji barwnej, probówkę inkubuje się ponownie, a następnie dodaje się roztwór, który hamuje powstawanie barwy; zabarwienie probówki porównuje się z zabarwieniem innej probówki, dla której równolegle przeprowadzono identyczny test z użyciem wzorcowej próbki antybiotyku. Ilość znakowanego białka, immobilizowanego na ściankach probówki, a zatem intensywność zabarwienia, jest odwrotnie proporcjonalna do ilości antybiotyku w analizowanej próbce mleka.
Zgodnie z przykładem 1 wspomnianego zgłoszenia patentowego, test umożliwia wykrycie penicyliny G w stężeniu rzędu 5 ppb; wykrycie amoksycyliny w stężeniu 5 ppb; wykrycie ampicyliny w stężeniu 10 ppb; wykrycie cefapiryny w stężeniu 5 ppb i wykrycie ceftiofuru w stężeniu 5 ppb. Test ten nie umożliwia wykrywania penicyliny, amoksycylinyiampicyliny na poziomie wymaganym przez przepisy europejskie. Poza tym test ten jest stosunkowo złożony i nie spełnia całkowicie wymogów czułości i prostoty wykonania, cech istotnych z punktu widzenia jego przydatności.
Test ten jest jednak trudny w wykonaniu, zwłaszcza przez personel bez odpowiednich kwalifikacji. W istocie na test ten składa się szereg etapów, w tym etapy przenoszenia płynu i pozostałości z jednego naczynia do drugiego, oraz szereg etapów przemywania. Z uwagi na liczbę i rodzaj etapów wtym teście, uzyskanie wiarygodnego wyniku zależy w znacznym stopniu od doświadczenia osoby wykonującej test.
Ponadto interpretacja wyników wymaga równoległego prowadzenia dwóch testów, co przyczynia się do zwielokrotnienia i dalszej komplikacji procedur koniecznych do wykonania.
Ujawniono również inne rodzaje sposobów enzymatycznych, umożliwiających oznaczanie antybiotyków obecnych w mleku w niskich stężeniach (J.M. Frere i inni, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510 (1980), oraz opisy patentowe EP 85667 i EP 486946), oparte na zastosowaniu swoistego enzymu, a mianowicie rozpuszczalnej zewnątrzkomórkowej karboksypeptydazy D-alanylo-D-alaninowej, wytwarzanej przez Actinomadura R39 (w dalszej części opisu enzym ten jest określany jako „enzym R39”). Enzym R39 wykazuje specyficzną zdolność hydrolizowania grup D-alanylo-D-alaninowych w różnych peptydach i może również hydrolizować niektóre tioestry.
Ponadto enzym R39 reaguje z antybiotykami b-laktamowymi, w wyniku czego bardzo szybko powstaje równomolowy kompleks enzym-antybiotyk, który to kompleks jest nieaktywny i zasadniczo nieodwracalny.
PL 195 495B1
W najnowszej wersji tego testu (EP 468946), próbkę badanego płynu o ustalonej objętości inkubuje się z ustaloną ilością enzymu R39 w warunkach umożliwiających reakcję antybiotyku b-laktamowego, który może znajdować się w próbce, z enzymem, w wyniku czego powstaje równomolowy kompleks enzym-antybiotyk, który to kompleks jest nieaktywny i zasadniczo nieodwracalny.
Następnie inkubuje się substrat tiostrowy w ustalonej ilości z produktem uzyskanym w pierwszym etapie, w warunkach umożliwiających hydrolizę substratu przez pozostały enzym R39, który nie został związany w kompleks z antybiotykiem podczas pierwszej inkubacji. Następnie określa się ilość powstałego kwasu merkaptoalkanowego metodą kolorymetryczną z dodatkiem odczynnika, który reagując z wolną grupą SH kwasu merkaptoalkanowego wywołuje zabarwienie. Intensywność zabarwienia porównuje się z ustanowionym wzorcem, otrzymanym z próbek zawierających znane ilości antybiotyków. Oznaczenie ilościowe antybiotyków można wykonać przez pomiar w spektrofotometrze; w przypadku mleka konieczne może być uprzednie sklarowanie próbki.
Według opisu patentowego EP 468946, sposób ten umożliwia oznaczenie w mleku penicyliny G w stężeniu 10 ppb przy całkowitym czasie inkubacji 5 minut, oraz penicyliny G w stężeniu około 2,5 ppb przy całkowitym czasie inkubacji 15 minut.
Istniała potrzeba opracowania nowego, skuteczniejszego sposobu wykrywania antybiotyków w płynach biologicznych z uwzględnieniem omawianych kryteriów szybkości, łatwości wykonania i czułości, jakimi muszą oznaczać się sposoby wykrywania antybiotyków w produktach spożywczych. W szczególności istniała potrzeba opracowania sposobu umożliwiającego, w pojedynczym teście, wykrywanie większości antybiotyków, których dopuszczalna zawartość jest określona przepisami wydanymi przez władze europejskie i amerykańskie. Ponadto metody wykrywania powinny umożliwiać osiągnięcie tego w niewielkiej liczbie etapów, wykonywanych nawet przez niewykwalifikowany personel. Taki sposób powinien być realizowany przy czasie inkubacji krótszym niż w przypadku obecnie dostępnych sposobów.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że sposób według wynalazku spełnia żądane wymagania dzięki zastosowaniu odpowiednich środków, a zwłaszcza środka rozpoznającego tworzącego kompleks z antybiotykiem b -laktamowym.
Wynalazek dotyczy sposobu wykrywania antybiotyków b-laktamowych w płynach biologicznych, a zwłaszcza w mleku, obejmującego następujące etapy:
a) kontaktowanie określonej objętości tego płynu biologicznego z pewną ilością środka rozpoznającego i inkubowanie tak otrzymanej mieszaniny w warunkach umożliwiających kompleksowanie antybiotyków, które mogą być obecne w tym płynie biologicznym, środkiem rozpoznającym,
b) kontaktowanie mieszaniny otrzymanej w etapie a) z co najmniej jednym b-laktamowym antybiotykiem wzorcowym unieruchomionym na podłożu w warunkach umożliwiających kompleksowanie tego antybiotyku wzorcowego środkiem rozpoznającym w ilości, która nie uległa reakcji w etapie a), oraz
c) oznaczanie ilości środka rozpoznającego związanego z podłożem, przy czym ten sposób charakteryzuje się tym, że jako środek rozpoznający stosuje się receptor
BlaR lub BlaR-CTD, otrzymany ze szczepu Bacillus licheniformis.
Korzystnie stosuje się receptor BlaR lub BlaR-CTD sprzężony ze środkiem znakującym, wybranym spośród koloidalnych cząstek metali, koloidalnych cząstek selenu, węgla, siarki lub telluru oraz koloidalnych cząstek barwionych syntetycznych lateksów.
Korzystnie stosuje się receptor BlaR lub BlaR-CTD sprzężony ze środkiem znakującym wybranym spośród substancji fluorescencyjnych.
Korzystnie stosuje się receptor BlaR lub BlaR-CTD sprzężony ze środkiem znakującym, wybranym spośród enzymów, takich jak fosfataza alkaliczna, peroksydazy lub b-laktamazy.
W szczególności stosuje się receptor BlaR lub BlaR-CTD sprzężony chemicznie lub genetycznie z enzymatycznym środkiem znakującym.
Korzystnie receptor BlaR lub BlaR-CTD sprzęga się ze środkiem znakującym przed przeprowadzeniem etapu a), podczas lub po przeprowadzeniu etapu a).
Korzystnie etapy a) i b) prowadzi się równocześnie.
Korzystnie w etapie b) stosuje się podłoże w postaci probówki, płytki lub pręta powleczonych antybiotykiem wzorcowym.
PL 195 495 B1
Korzystnie w etapie b) jako podłoże stosuje się urządzenie testowe mające stałą podstawę 1, mającą koniec pierwszy i drugi, przy czym na tej podstawie są zamocowane kolejno, od pierwszego końca: membrana 2 do oczyszczania analizowanego płynu; membrana 3 do unieruchomiania co najmniej jednej substancji wychwytującej; oraz absorpcyjna membrana 4.
Korzystnie w etapie b) jako podłoże stosuje się kulki magnetyczne lub niemagnetyczne.
Wynalazek dotyczy również zestawu testowego do wykrywania antybiotyków b-laktamowych w płynach biologicznych, a zwłaszcza w mleku, sposobem określonym powyżej, zawierającego co najmniej jeden środek rozpoznający wrażliwy na antybiotyki b-laktamowe ico najmniej jeden b-laktamowy antybiotyk wzorcowy unieruchomiony na podłożu, przy czym ten zestaw charakteryzuje się tym, że jako środek rozpoznający zawiera receptor BlaR lub BlaR-CTD, otrzymany ze szczepu Bacillus licheniformis.
Sposób według wynalazku jest wyjątkowo użyteczny ze względu na stosowanie określonego środka rozpoznającego, który zawiera receptor wrażliwy na antybiotyki b-laktamowe, który to receptor otrzymany z Bacillus licheniformis, to znaczy białko, którego izolację i sekwencję aminokwasów opisali Y. Zhu i inni, J. Bacteriol., 1137-1141 (1990); lub polipeptyd BlaR-CTD stanowiący karboksy-końcowy region białka BlaR, którego izolację i sekwencję aminokwasów opisali B. Joris i inni, FEMS Microbiology Letters, 107-114 (1990).
Zastosowanie receptorów BlaR lub BlaR-CTD w wykrywaniu antybiotyków b-laktamowych sposobem według wynalazku przynosi znaczące korzyści w porównaniu z dotychczas stosowanymi środkami rozpoznającymi. Jest to związane ztym, że receptory BlaR i BlaR-CTD są zdolne do bardzo szybkiego tworzenia kompleksów ze znaczną liczbą antybiotyków, przy czym zachodzi to przy krótszym czasie inkubacji niż w przypadku znanych środków rozpoznających, takich jak np. receptory otrzymane z Bacillus stearothermophilus.
Do przykładowych antybiotyków, które można wykrywać sposobem według wynalazku, należą następujące antybiotyki: benzylopenicylina (czyli penicylina G), ampicylina, amoksycylina, karbenicylina, metycylina, kloksacylina, 6-APA, monolaktam, aztreonam, mecylinam, cefaleksyna, cefaloglicyna, cefalorydyna, nitrocefina, cefatoksym, cefuroksym, ceftiofur, cefapiryna, 7-ACA. W szczególności sposób według wynalazku umożliwia wykrywanie wszystkich antybiotyków, określanych w przepisach wydanych przez władze amerykańskie i europejskie, w ilościach w zakresie dolnej dopuszczalnej granicy.
Sposób według wynalazku umożliwia wykrywanie antybiotyków b-laktamowych w płynach biologicznych, takich jak mleko, mocz, krew, surowica, ślina, ekstrakty mięsne, płyny fermentacyjne, lub w buforowanych ośrodkach wodnych.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się środek rozpoznający sprzężony ze środkiem znakującym. Środek znakujący może mieć różnorodny charakter. Środek znakujący może mieć postać cząstek, takich jak koloidalne cząstki metali (platyny, złota, srebra itp.), koloidalne cząstki selenu, węgla, siarki lub telluru, bądź też barwione, syntetyczne, koloidalne cząstki lateksu. Środek znakujący, który można stosować w sposobie według wynalazku, może mieć postać substancji fluorescencyjnej, takiej jak zaktywowana fluoresceina (dostępna z Boeringher-Mannheim Biochemica), izocyjanian fluoresceiny, tetrametyloizocyjanian rodaminy lub inna substancja fluorescencyjna znana fachowcom. Środek znakujący może również stanowić enzym, np. b-laktamaza, peroksydaza, fosfataza itp. W tym przypadku receptory BlaR lub BlaR-CTD są chemicznie lub genetycznie sprzężone z tym enzymatycznym środkiem znakującym i mają postać białek fuzyjnych.
Środek rozpoznający można sprzęgać ze środkiem znakującym sposobami znanymi fachowcom. Środek rozpoznający może być związany ze środkiem znakującym bezpośrednio, lub też poprzez utworzenie kompleksu pośredniego. Sprzęganie środka rozpoznającego ze środkiem znakującym może zachodzić w różnych etapach sposobu według wynalazku. W jednym przypadku sprzęganie środka rozpoznającego ze środkiem znakującym zachodzi przed kontaktowaniem środka rozpoznającego z analizowanym płynem biologicznym. W innych przypadkach sprzęganie środka rozpoznającego ze środkiem znakującym zachodzi w momencie, gdy środek rozpoznający umieszcza się w próbce analizowanego płynu biologicznego, lub później. Korzystnie znakowanie środka rozpoznającego zachodzi przed jego kontaktowaniem z analizowaną próbką.
PL 195 495B1
Pierwszy etap, etap a), sposobu według wynalazku polega na połączeniu określonej objętości płynu biologicznego z pewną ilością środka rozpoznającego, a następnie inkubacji uzyskanej mieszaniny w warunkach umożliwiających kompleksowanie antybiotyków, które mogą znajdować się w płynie biologicznym, ze środkiem rozpoznającym.
Płyn biologiczny można inkubować z receptorem BlaR lub BlaR-CTD w temperaturze 4 - 60°C. Korzystnie inkubację prowadzi się w temperaturze około 47°C. Podwyższenie temperatury inkubacji spowoduje skrócenie czasu inkubacji, a obniżenie temperatury spowoduje jego wydłużenie. Tak więc możliwe jest skrócenie czasu inkubacji przez podwyższenie temperatury.
W drugim etapie, etapie b) sposobu według wynalazku, do mieszaniny uzyskanej w etapie a) dodaje się co najmniej jeden antybiotyk wzorcowy, unieruchomiony na podłożu.
Podłoża stosowane w sposobie według wynalazku mogą być bardzo różnego rodzaju. Mogą to być stałe podłoża, takie jak probówki, płytki lub pręty, pokryte preparatem antybiotyku wzorcowego. Może to być urządzenie testowe mające stałą podstawę, na której są zamocowane membrany, przy czym w ustalonej strefie detekcji jest umieszczona co najmniej jedna substancja wychwytująca. Podłoża mogą mieć postać kulek magnetycznych lub niemagnetycznych (z agarozy, polistyrenu itp.), mogące tworzyć żel, na których jest unieruchomiony antybiotyk wzorcowy.
Antybiotyk wzorcowy może być unieruchomiony na podłożu sposobami znanymi fachowcom, np. przez kowalencyjną lub niekowalencyjną absorpcję na podłożu, ewentualnie poprzez łącznik.
W szczególności etapy a) i b) prowadzi się równocześnie.
Etap c) sposobu według wynalazku polega na oznaczaniu receptorów przyłączonych do podłoża, na którym unieruchomiony jest antybiotyk wzorcowy. Stosowana metoda oznaczania tych receptorów zależy bezpośrednio od rodzaju stosowanego środka znakującego. Jeżeli środkiem znakującym jest enzym, etap oznaczania będzie polegał na przeprowadzeniu reakcji specyficznej dla tego enzymu, wywołującej np. zabarwienie. Jeżeli środkiem znakującym jest substancja fluorescencyjna, oznaczanie będzie polegać po prostu na pomiarze fluorescencji podłoża. W przypadku cząstek metali lub barwnych lateksów, obecność receptorów przyłączonych do podłoża jest odzwierciedlana zabarwieniem, którego intensywność jest wprost proporcjonalna do liczby receptorów przyłączonych do podłoża. Niezależnie od rodzaju użytego środka znakującego, intensywność uzyskanego sygnału jest odwrotnie proporcjonalna do ilości antybiotyku w analizowanej próbce.
W sposobie według wynalazku korzystnie jako podłoże stosuje się urządzenie testowe przedstawione na fig. 1, mające stałą podstawę 1, na której są zamocowane membrany 2, 3 i4. Fig. 1a przedstawia urządzenie w widoku z przodu, a fig. 1b przedstawia urządzenie w przekroju podłużnym.
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.
Przykład 1.
Wykrywanie antybiotyków b-laktamowych w mleku
Przykład ten ilustruje sposób wykrywania w mleku antybiotyków b -laktamowych, kontrolowanych przez władze odpowiedzialne za ochronę zdrowia. W teście opisanym wtym przykładzie stosuje się receptor BlaR-CTD sprzężony z cząstkami złota, stanowiącymi środek znakujący, oraz podłoże w postaci urządzenia testowego mającego stałą podstawę, na której są zamocowane membrany.
1.1. Sprzęganie BlaR-CTD z cząstkami złota
1.1.1. Biotynylacja BlaR-CTD
W 20 mM buforze z fosforanu sodu o pH 7 umieszczono 3,79 ml roztworu środka rozpoznającego BlaR-CTD o stężeniu 6,6 mg/ml. Do tego roztworu BlaR-CTD następnie dodano 41,71 ml buforu wodorowęglanowego (0,1 M wodorowęglan sodu, pH 9) i2 ml roztworu estru N-hydroksysukcynoimidowego kwasu 6-(biotynamido)kapronowego, zawierającego 2,23 mg/ml tego samego buforu wodorowęglanowego. Roztwór ostrożnie mieszano w mieszalniku LABINCO do probówek na osi obrotowej (firmy VEL, Belgia) z szybkością 2 obrotów na minutę przez 2 godziny w temperaturze otoczenia bez dostępu światła. W takich samych warunkach przez 30 minut inkubowano 2,5 ml roztworu buforu Tris, 1 M, pH 8, z mieszaniną reakcyjną. Tak uzyskany roztwór dializowano względem buforu HNM (Hepes 100 mM, pH 8, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM) przez 24 godziny. W ten sposób otrzymano biotynylowany roztwór BlaR-CTD, który następnie rozcieńczono buforem HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml) do uzyskania stężenia 250 mg biotynylowanego BlaR-CTD na ml buforu. Roztwór ten przechowywano w temperaturze -20°C.
PL 195 495 B1
1.1.2. Środek znakujący
Jako środek znakujący stosowano cząstki złota o średnicy 40 nm, na których osadzono kozie przeciwciało antybiotynowe w postaci zawiesiny w2 mM wodnym roztworze tetraboranu sodu, opH
7,2, stabilizowanym z użyciem 0,1% azydku sodu (dostępne z firmy British Biocell, pozycja GAB40). Gęstość optyczna tej zawiesiny przy 520 nm wynosi około 10, a stężenie białka wynosi około 24 mg/ml.
1.1.3. Sprzęganie biotynylowanego BlaR-CTD z cząstkami złota
Roztwór biotynylowanego BlaR-CTD przygotowany w przykładzie 3.1.1. rozcieńczono 114,7 -krotnie buforem HNM-BSA (Hepes 500 mM; pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml). W temperaturze pokojowej mieszano 22,5 części objętościowych tego rozcieńczonego roztworu biotynylowanego BlaR-CTD, 7,5 części objętościowych buforu HNM-BSA, 9,27 części objętościowych zawiesiny cząstek złota stosowanych do znakowania biotynylowanego BlaR-CTD oraz 6 części objętościowych wzorcowej zawiesiny cząstek złota (patrz poniższy przykład 3.1.4).
1.1.4. Niezależny wzorzec
W tym teście stosowano również substancję wzorcową dająca prążek, którego intensywność umożliwia szybkie ilościowe oznaczenie antybiotyku zawartego w próbce.
W tym celu zastosowano 40 nm cząstki złota, na których osadzono kozią immunoglobulinę anty-króliczą. Takie cząstki złota są dostępne z firmy British Biocell (pozycja GAR40) w postaci zawiesinyw2 mM wodnym roztworze tetraboranu sodu, o pH 7,2, stabilizowanym 0,1% azydkiem sodu. Gęstość optyczna tej zawiesiny przy 520 nm wynosi około 3, a stężenie białka wynosi około 6 mg/ml.
1.2. Urządzenie testowe
Stosowane urządzenie testowe miało stałą podstawę 1, mającą koniec pierwszy i drugi, na której to podstawie były zamocowane kolejno, od pierwszego końca:
- membrana 2 do oczyszczenia analizowanego płynu;
- membrana 3, na której zostały unieruchomione dwie substancje wychwytujące (antybiotyk wzorcowy i substancja, która może wiązać niezależny wzorzec); oraz
- absorpcyjna membrana 4.
1.2.1. Montowanie urządzeń testowych
Na początku zmontowano karty o wymiarach 300 x 76,2 mm za pomocą laminatora typu Clamshell (dostępnego z firmy BioDot, Inc.) według następującej metody.
Wycięto tworzywową prostokątną podstawę typu ArCare 8565 (dostępną z firmy Adhesive Research) o wymiarach 300 x 76,2 mm (stała podstawa 1). Następnie wycięto: prostokąt z membrany Leukosorb LK4 (dostępnej z firmy Pali Gelman Sciences) o wymiarach 300 x 20 mm (membrana 2), prostokąt z membrany Hi-Flow SX (dostępnej z firmy Millipore) o wymiarach 300 x 25 mm (membrana3), prostokąt 3 mm z membrany celulozowej (dostępnej z firmy Whatman) o wymiarach 300 x 40mm (membrana 4).
Następnie membrany 2 i 4, później 3, umieszczono w odpowiednich miejscach na dolnej formie laminatora. Stała podstawa 1, pokryta klejem, była w tym etapie utrzymywana w pokrywie urządzenia, stroną pokrytą klejem na zewnątrz. Membrany umieszczone na dolnej formie laminatora złączono z podstawą pokrytą klejem przez zamknięcie laminatora; membrany utrzymywano ściśle na swoich miejscach przez zasysanie powietrza za pomocą pompy próżniowej. Gdy następował spadek próżni, wyjmowano kartę, która składała się ze stałej podstawy 1, na której znajdowały się membrany 2,3i4.
Następnie na membranę 3 naniesiono następujące roztwory: strona proksymalna: pierwsza substancja wychwytująca, prążek nr 1; strona dystalna: druga substancja wychwytująca, prążek nr 2. Te substancje wychwytujące umieszczono na membranie za pomocą dozownika BioJet X-Y Platform Quanti-3000 Dispenser, dostępnego z firmy BioDot, Inc.
Naniesione na membranę roztwory natychmiast odparowano przez umieszczenie całej karty w wymuszonym strumieniu gorącego powietrza o temperaturze 60°C na okres jednej minuty.
Karty uzyskane po montażu pocięto na paski za pomocą urządzenia typu gilotyny lub urządzenia obrotowego (dostępnego z firmy BioDot, Kinematic lub Akzo). Brzegowe paski usuwano, a pozostałe paski były gotowe do użycia.
Figura 1 przedstawia takie urządzenie testowe.
W celu przechowywania urządzenia testowe umieszczono w nieprzezroczystych, hermetycznie szczelnych pojemnikach zawierających również środki suszące (Silgelac, Francja).
PL 195 495B1
1.2.2. Pierwsza substancja wychwytująca. Antybiotyk wzorcowy ml roztworu zawierającego 213 mg ludzkiej g-globuliny (G4386, Sigma) i 8,6 mg chlorowodorku 2-iminotiolanu (Aldrich, 33056-6) w buforze z węglanu sodu (100 mM, pH 9) inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 25°C.
Ponadto 20 ml roztworu zawierającego 119,8 mg cefalosporyny C i 54 mg 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu sulfosukcynimidylu (sSMCC, 22322 Pierce) w buforze z węglanu sodu (100 mM, pH 9) inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 25°C.
Następnie zmieszano te dwa roztwory przygotowane jak opisano powyżej. Odczyn uzyskanego roztworu doprowadzono do pH 7,1 przez dodanie 3 ml 500 mM NaH2PO4 i roztwór inkubowano w temperaturze 25°C przez 2 godziny. Mieszaninę uzyskaną po inkubacji trzykrotnie dializowano względem 1 litra buforu z fosforanu sodu (10 mM, pH 7,5). Otrzymany roztwór przesączono przez 0,22 mm filtr, po czym podzielono na równe objętości i przechowywano w postaci zamrożonej w temperaturze -20°C aż do momentu użycia.
Przed użyciem odmierzone objętości roztworu rozmrożono i dodano barwnik spożywczy przed naniesieniem roztworu na membranę, tak aby umożliwić precyzyjne wskazanie miejsca naniesienia roztworu oraz jakości śladu.
Pierwsza substancja wychwytująca umożliwia wychwycenie BlaR-CTD sprzężonego z cząstkami złota, znajdującego się w nadmiarze względem ilości antybiotyku zawartego w próbce.
1.2.3. Druga substancja wychwytująca. Substancja wiążąca niezależny wzorzec
Jako drugą substancję wychwytującą stosowano roztwór immunoglobuliny króliczej (SigmaI 5006), o stężeniu immunoglobuliny 0,5 mg/ml w 10 mM fosforanie sodu, pH 7,5, i ludzkiej g-globuliny o stężeniu 5 mg/ml buforu. Ta druga substancja wychwytująca zatrzymuje substancję wzorcową podczas migracji płynu przez urządzenie testowe.
1.3. Wykrywanie antybiotyków w mleku
1.3.1. Test 3-minutowy - test szybki
Przygotowano siedem próbek świeżego mleka, zawierających odpowiednio 0; 1; 2; 3; 4; 5 i 6 ppb penicyliny G. Każdy z tych roztworów następnie analizowano w poniższy sposób.
Pobrano próbkę 200 ml mleka oraz 45,27 ml roztworu przygotowanego w przykładzie 1.1.3. i umieszczono w szklanej kolbie. Tę mieszaninę inkubowano w temperaturze 47°C przez 1 minutę. Następnie w kolbie umieszczono pionowo urządzenie testowe tak, aby pierwszy koniec tego urządzenia testowego stykał się z mieszaniną, a drugi koniec opierał się o ścianę szklanej kolby. Mieszaninę pozostawiono dla umożliwienia migracji przez urządzenie testowe, inkubując w tym czasie urządzenie w temperaturze 47°C przez 2 minuty.
W poniższej tabeli 1 podano wyniki uzyskane dla siedmiu badanych próbek. Wykrytym prążkom przypisano wartość intensywności od 0 do 10, przy czym wartość 10 odpowiada najintensywniejszemu prążkowi, a wartość 0 odpowiada najmniej intensywnemu prążkowi. Według tej skali, prążkowi wzorcowemu przypisano wartość 6. Intensywność sygnału obserwowanego na pierwszym prążku jest odwrotnie proporcjonalna do ilości penicyliny G znajdującej się w próbce.
T ab el a 1
| Penicylina G (PPb) | Intensywność | |
| pierwszy prążek | drugi prążek | |
| 0 | 10 | 6 |
| 1 | 9 | 6 |
| 2 | 9 | 6 |
| 3 | 4 | 6 |
| 4 | 0 | 6 |
| 5 | 0 | 6 |
| 6 | 0 | 6 |
PL 195 495 B1
W tym przykładzie wynik testu uważa sięza dodatni, gdy pierwszy prążek ma intensywność niższą niż drugi prążek. Wyniki podane w tabeli 1 wskazują, że ten test umożliwia wykrycie w ciągu 3 minut mniej niż 4 ppb penicyliny G w próbce mleka.
W takich samych warunkach przeprowadzono również testy z innymi antybiotykami b -laktamowymi. Test ten, prowadzony w ciągu 3 minut, umożliwia wykrycie amoksycyliny do 5 ppb, ampicyliny do 5 ppb, kloksacyliny do mniej niż 10 ppb, dikloksacyliny do mniej niż 20 ppb, oksacyliny do mniej niż 20 ppb i cefapiryny do 20 ppb w próbce mleka.
1.3.2. Test 5-minutowy
Przygotowano sześć próbek świeżego mleka, zawierających odpowiednio 0; 2; 4; 6; 8 i 10 ppb kloksacyliny. Każdy z tych roztworów analizowano następnie w poniższy sposób.
Pobrano próbkę 200 ml mleka oraz 45,27 ml roztworu przygotowanego w przykładzie 1.1.3. i umieszczono w szklanej kolbie. Tę mieszaninę inkubowano w temperaturze 47°C przez 3 minuty. Następnie w kolbie umieszczono pionowo urządzenie testowe tak, aby pierwszy koniec tego urządzenia testowego stykał się z mieszaniną, a drugi koniec opierał się o ścianę szklanej kolby. Mieszaninę pozostawiono dla umożliwienia migracji przez urządzenie testowe, inkubując w tym czasie urządzenie w temperaturze 47°C przez 2 minuty.
W poniższej tabeli 2 podano wyniki uzyskane dla sześciu badanych próbek. Wykrytym prążkom przypisano wartość intensywności od 0 do 10, przy czym wartość 10 odpowiada najintensywniejszemu prążkowi, a wartość 0 odpowiada najmniej intensywnemu prążkowi. Według tej skali, prążkowi wzorcowemu przypisano wartość 6. Intensywność sygnału obserwowanego na pierwszym prążku jest odwrotnie proporcjonalna do ilości kloksacyliny znajdującej się w próbce.
Tabela 2
| Kloksacylina (PPb) | Intensywność | |
| pierwszy prążek | drugi prążek | |
| 0 | 10 | 6 |
| 2 | 6 | 6 |
| 4 | 5 | 6 |
| 6 | 3 | 6 |
| 8 | 3 | 6 |
| 10 | 3 | 6 |
W tym przykładzie wynik testu uważa sięza dodatni, gdy pierwszy prążek ma intensywność niższą niż drugi prążek. Wyniki podane w tabeli 2 wskazują, że ten test umożliwia wykrycie w ciągu 5 minut mniej niż 4 ppb kloksacyliny w próbce mleka.
W takich samych warunkach przeprowadzono również testy z innymi antybiotykami b -laktamowymi. Test ten, prowadzony w ciągu 5 minut, umożliwia wykrycie penicyliny G w stężeniu do 3ppb, amoksycyliny do 4 ppb, ampicyliny do 4 ppb, dikloksacyliny do 8 ppb, oksacyliny do 8 ppb, cefapiryny do 16 ppb, ceftiofuru do 100 ppb, cefochinonu do mniej niż 20 ppb, nafcyliny do 20 ppb i cefazoliny do 60 ppb w próbce mleka.
Test ten jest szczególnie odpowiedni jako test sortujący przed opróżnieniem cystern z mlekiem do silosów.
1.3.3. Test 9-minutowy
Przygotowano sześć próbek świeżego mleka, zawierających odpowiednio 0; 4; 6; 8; 10 i 12 ppb cefapiryny. Każdy z tych roztworów analizowano następnie w poniższy sposób.
Pobrano próbkę 200 ml mleka oraz 45,27 ml roztworu przygotowanego w przykładzie 1.1.3. i umieszczono w szklanej kolbie. Tę mieszaninę inkubowano w temperaturze 47°C przez 7 minut. Następnie w kolbie umieszczono pionowo urządzenie testowe tak, aby pierwszy koniec tego urządzenia testowego stykał się z mieszaniną, a drugi koniec opierał się o ścianę szklanej kolby. Mieszaninę pozostawiono dla umożliwienia migracji przez urządzenie testowe, inkubując w tym czasie urządzenie w temperaturze 47°C przez 2 minuty.
PL 195 495B1
W poniższej tabeli 3 podano wyniki uzyskane dla sześciu badanych próbek. Wykrytym prążkom przypisano wartość intensywności od 0 do 10, przy czym wartość 10 odpowiada najintensywniejszemu prążkowi, a wartość 0 odpowiada najmniej intensywnemu prążkowi. Według tej skali, prążkowi wzorcowemu przypisano wartość 6. Intensywność sygnału obserwowanego na pierwszym prążku jest odwrotnie proporcjonalna do ilości cefapiryny znajdującej się w próbce.
Tabel a 3
| Cefapiryna (PPb) | Intensywność | |
| pierwszy prążek | drugi prążek | |
| 0 | 10 | 6 |
| 4 | 6 | 6 |
| 6 | 5 | 6 |
| 8 | 4 | 6 |
| 10 | 3 | 6 |
| 12 | 3 | 6 |
W tym przykładzie wynik testu uważa się za dodatni, gdy pierwszy prążek ma intensywność niższą niż drugi prążek. Wyniki podane w tabeli 3 wskazują, że ten test umożliwia wykrycie w ciągu 9 minut do 6 ppb cefapiryny w próbce mleka.
W takich samych warunkach przeprowadzono również testy z innymi antybiotykami b -laktamowymi. Test ten, prowadzony w ciągu 9 minut, umożliwia wykrycie penicyliny G do 3 ppb, amoksycyliny do 4 części ppb, ampicyliny do 4 ppb, kloksacyliny do 4 ppb, dikloksacyliny do mniej niż 8 ppb, oksacyliny do mniej niż 8 ppb, ceftiofuru do 80 ppb, cefochinonu do mniej niż 20 ppb, nafcyliny do mniej niż 20 ppbi cefazoliny do 45 ppb w próbce mleka.
Test ten, wykonywany w ciągu 9 minut, umożliwia zatem wykrycie wszystkich antybiotyków, których zawartość regulowana jest obecnie przez przepisy europejskie, w ilościach poniżej dolnej granicy normy określonej w tych przepisach.
1.3.4. Test 20-minutowy
Przygotowano sześć próbek świeżego mleka, zawierających odpowiednio 0; 20; 30; 40; 50 i 60 ppb ceftiofuru. Każdy z tych roztworów analizowano następnie w poniższy sposób.
Pobrano próbkę 200 ml mleka oraz 45,27 ml roztworu przygotowanego w przykładzie 1.1.3. i umieszczono w szklanej kolbie. Tę mieszaninę inkubowano w temperaturze 47°C przez 18 minut. Następnie w kolbie umieszczono pionowo urządzenie testowe tak, aby pierwszy koniec tego urządzenia testowego stykał się z mieszaniną, a drugi koniec opierał się o ścianę szklanej kolby. Mieszaninę pozostawiono dla umożliwienia migracji przez urządzenie testowe, inkubując w tym czasie urządzenie w temperaturze 47°C przez 2 minuty.
W poniższej tabeli 4 podano wyniki uzyskane dla sześciu badanych próbek. Wykrytym prążkom przypisano wartość intensywności od 0 do 10, przy czym wartość 10 odpowiada najintensywniejszemu prążkowi, a wartość 0 odpowiada najmniej intensywnemu prążkowi. Według tej skali, prążkowi wzorcowemu przypisano wartość 6. Intensywność sygnału obserwowanego na pierwszym prążku jest odwrotnie proporcjonalna do ilości ceftiofuru obecnego w próbce.
Tabel a 4
| Ceftiofur (ppb) | Intensywność | |
| pierwszy prążek | drugi prążek | |
| 1 | 2 | 3 |
| 0 | 10 | 6 |
| 20 | 6 | 6 |
PL 195 495 B1 ciąg dalszy tabeli 4
| 1 | 2 | 3 |
| 30 | 5 | 6 |
| 40 | 4 | 6 |
| 50 | 3 | 6 |
| 60 | 3 | 6 |
W tym przykładzie wynik testu uważa się za dodatni, gdy pierwszy prążek ma intensywność niższą niż drugi prążek. Wyniki podane w tabeli 4 wskazują, że ten test umożliwia wykrycie w ciągu 20 minut do 30 ppb ceftiofuru w próbce mleka.
Test ten umożliwia wykrycie w ciągu 20 minut, w pojedynczym teście, wszystkich antybiotyków, których zawartość regulowana jest obecnie przepisami europejskimi i amerykańskimi, w ilościach poniżej dolnej granicy normy określonej wtych przepisach.
P r zyk ł a d 2.
Wykrywanie sześciu antybiotyków w mleku
Przykład ten ilustruje sposób wykrywania w mleku 6 antybiotyków b-laktamowych, których zawartość regulowana jest przepisami amerykańskimi. W teście opisanym wtym przykładzie zastosowano receptor BlaR-CTD w postaci białka fuzyjnego z b-laktamazą oraz podłoże w postaci kulek magnetycznych.
2.1. Białko fuzyjne BlaR-CTD-b-laktamaza
Białko fuzyjne BlaR-CTD-b-laktamaza uzyskano przez genetyczne sprzężenie receptora BlaR-CTD (B. Joris i inni, FEMS Microbiology Letters, 107-114, 1990) i b-laktamazy Zn pochodzącej ze szczepu Bacillus cereus (M. Hussain i inni, 1985, J. Bact., 164:1, 223-229, 1985).
Proces sprzęgania prowadzono w następujący sposób.
2.1.1. Tworzenie plazmidu
Przeprowadzono sprzęganie 1/1 genów polipeptydu BlaR-CTD i b-laktamazy; gen kodujący b-laktamazę wprowadzono w fazie i za genem BlaR-CTD. Plazmid przenoszący tę fuzję genową wykazuje oporność na kanamycynę. Białko fuzyjne jest określane w dalszej części opisu jako Fus 1.
2.1.2. Wytwarzanie
- Szczep: plazmid przenoszący fuzję genów wprowadzono do E. coli. Klony zawierające rekombinowany plazmid wyselekcjonowano na pożywce LB + Km (50 mg/ml).
- Selekcja: znakowanie ekstraktu komórkowego radioaktywnym antybiotykiem, a następnie elektroforeza na denaturującym żelu poliakrylamidowym wykazały, że większość białka jest wytwarzana w postaci białka fuzyjnego o masie cząsteczkowej około 50000. Jednak wydaje się, że proces posttranslacyjnej proteolizy powoduje dysocjację jedynie bardzo niewielkiego odsetka (2%) tych cząsteczek na dwie oddzielne aktywne cząsteczki.
- Hodowla: za pomocą rekombinowanych komórek przechowywanych w temperaturze -70°C zaszczepiono pożywkę zawierającą 500 ml LB + Km (50 mg/ml). Wstępną hodowlę inkubowano w temperaturze 37°C i mieszano przez noc przy 225 obrotach na minutę. Z użyciem 500 ml tej wstępnej hodowli zaszczepiono 18 litrów pożywki LB + Km (50 mg/ml), której gęstość optyczna przy 600 nm wynosiła 4. 18-litrową hodowlę zatrzymano w momencie, gdy gęstość optyczna osiągnęła wartość 6.
2.1.3. Ekstrakcja
Bezpośrednio po zatrzymaniu hodowli komórki przefiltrowano, a następnie odwirowano. Zachowano supernatant zebrany znad osadu komórkowego, po lizie w dezintegratorze. Supernatant ten zawiera białko fuzyjne FUS1.
2.1.4. Oczyszczanie stosowane bufory:
- bufor A: 20 mM Tris, pH 8,0, 10% glikolu etylenowego, 50 mm DTT;
- bufor B: buforA+ 1M NaCl.
Białko fuzyjne oczyszczono częściowo metodą chromatografii jonowej i na sitach molekularnych. Po naniesieniu ekstraktu i przemyciu w kolumnie QSFF (Pharmacia, Upsala) w buforze A, białko FUS1 wyeluowano z liniowym gradientem buforu B. Aktywne frakcje (± 0,25 M NaCl) następnie połączono i naniesiono na sita molekularne G-100 (Pharmacia, Upsala); wyeluowano je buforem A. Średnią aktywność właściwą odzyskanej partii oszacowano na 30%.
PL 195 495B1
2.1.5. Hamowanie b-laktamazy
Białko fuzyjne (9/10 objętości) inkubowano z 50 mM EDTA (1/10 objętości) przez 45 minut w temperaturze 37°C. Hamowanie sprawdzono za pomocą nitrocefiny w 10 mM buforze kakodylanowym o pH 6,0. W obecności lub bez Zn sygnał powinien być odpowiednio dodatni lub ujemny. Po zahamowaniu efektywne stężenie, mierzone na podstawie aktywności b-laktamazy, wynosiło 7,74 pmol/ml.
2.2. Stałe podłoże: kulki magnetyczne - cefalosporyna C (antybiotyk wzorcowy)
Stosowano cząstki BioMag 4100 (wytwarzane przez DRG Instrument GmbH, Marburg, Niemcy, dostępne jako AM 4100 B), których NH2-końce zaktywowano glutaraldehydem w następujący sposób:
- jedną objętość wyjściowego roztworu cząstek Biomag 4100 czterokrotnie przemyto 5 objętościami 0,01 M buforu pirydynowego, pH 6,0. Cząstki rozprowadzono w 2,5 objętości glutaraldehydu w stężeniu 5% w buforze pirydynowym i mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przemyto je dziesięciokrotnie w 2 objętościach 0,01 M buforu Kpi, pH 7,0. Następnie cząstki ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 1 objętości 0,1 M cefalosporyny C w buforze Kpi i mieszano przez noc w temperaturze +4°C. Końcowe przemywanie prowadzono do całkowitego usunięcia cefalosporyny Cz0,1 M buforu Kpi, pH 7,0.
2.3. Wykrywanie sześciu antybiotyków: penicyliny G, ampicyliny, amoksycyliny, kloksacyliny, cefapiryny i ceftiofuru w mleku
2.3.1. Stosowane roztwory
- roztwór 1: 700 pikomoli białka fuzyjnego liofilizowanego w 100 mM Tris, pH 8, 1 mg/ml BSA, 50 mM EDTA, 50 mm DTT z dodatkiem 5 ml wody Milli-Q; do przeprowadzenia testu potrzeba 50 ml tego roztworu;
- roztwór 2: 2 ml cząstek BioMag-cefalosporyny C przygotowanych w przykładzie 1.2. w 100% izopropanolu; do przeprowadzenia testu potrzeba 20 ml tego roztworu.
- roztwór 3: 10 ml buforu kakodylanowego, pH 6, 1 M NaCl, zliofilizowano i dodano 500 ml wody Milli-Q.
- roztwór 4: 400 ml 10 mM nitrocefiny w DMF rozcieńczono do 40 ml roztworem 3; do przeprowadzenia testu potrzeba 400 ml tego roztworu.
2.3.2. Wykrywanie ml roztworu 1 dodano do 500 ml próbek domieszkowanego mleka i inkubowano wtemperaturze 47 °C przez 2 minuty. 20 ml roztworu 2 przeprowadzono w zawiesinę w mleku, które następnie ponownie inkubowano w temperaturze 47°C przez 2 minuty.
Cząstki przyciągnięto do ściany pojemnika za pomocą magnesu paramagnetycznego, podczas gdy z probówki odciągano supernatant. Cząstki dwukrotnie przemyto roztworem 3, ponownie wykorzystując magnes. Na koniec 400 ml roztworu 4 inkubowano w obecności cząstek przez 3 minuty w temperaturze 47°C. Następnie mierzono absorbancję pozostałego roztworu przy długości fali 482nm względem roztworu nitrocefiny.
Sposób ten umożliwia wykrycie 6 antybiotyków wymienionych w przepisach amerykańskich, w stężeniach poniżej dolnej granicy normy określonej wtych przepisach, czyli 5 ppb penicyliny, 10ppb ampicyliny, 10 ppb amoksycyliny, 10 ppb kloksacyliny, 20 ppb cefapiryny i 50 ppb ceftiofuru.
Przykład 3.
Wykrywanie trzech antybiotyków (penicyliny G, kloksacyliny, ceftiofuru) w mleku
Przykład ten ilustruje sposób wykrywania w mleku 3 antybiotyków b-laktamowych, których zawartość regulowana jest przepisami wydanymi przez władze odpowiedzialne za ochronę zdrowia. W teście opisanym w tym przykładzie zastosowano receptor BlaR-CTD w postaci dwóch białek fuzyjnych, odpowiednio z fosfatazą alkaliczną i peroksydazą, oraz podłoże w postaci mikropłytki.
3.1. Białko fuzyjne BlaR-CTD-fosfataza alkaliczna
Białko fuzyjne BlaR-CTD-fosfataza alkaliczna uzyskano przez chemiczne sprzężenie receptora BlaR-CTD (B. Joris i inni, FEMS Microbiology Letters, 107-114, 1990) i aktywowanej fosfatazy alkalicznej, dostępnej z Boehringer-Mannheim Bio-chemica (pozycja nr 1464752).
Proces sprzęgania prowadzono w następujący sposób.
3.1.1. Sprzęganie: BlaR-CTD i fosfatazę alkaliczną dializowano w 100 mM buforze węglan sodu/wodorowęglan sodu o pH 9,8. 15 nonomoli BlaR-CTD inkubowano w obecności 100 ml aktywowanej fosfatazy alkalicznej (20 mg/ml) przez 2 godziny w temperaturze 25°C.
3.1.2. Zatrzymywanie reakcji: dodano 40 ml 2 mM roztworu trietanoloaminy opH 8, a następnie 50 ml 200 mM roztworu borowodorku sodu. Mieszaninę inkubowano przez 30 minut w temperaturze +4°C.
PL 195 495 B1
Następnie dodano 25 ml 2 mM roztworu trietanoloaminy o pH 8, po czym mieszaninę inkubowano ponownie przez 2 godziny w temperaturze +4°C.
3.1.3. Stabilizacja sprzężenia: dodano 10 ml1 M roztworu glicyny o pH 7,0.
3.1.4. Przeniesienie do buforu do przechowywania: mieszaninę reakcyjną (około 300 ml) trzykrotnie dializowano przez 8 godzin względem 0,5 litra 50 mM buforu z trietanoloaminy, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,5 mM ZnCl2, 10 mM glicyna, w temperaturze +4°C.
3.1.5. Końcowe miano: końcowe miano sprzężenia wynosiło około 50 pmoli aktywnego BlaR-CTDna1 ml roztworu.
3.2. Białko fuzyjne BlaR-CTD-peroksydaza
Białko fuzyjne BlaR-CTD-peroksydaza uzyskano przez chemiczne sprzężenie receptora BlaR-CTD (B. Joris i inni, FEMS Microbiology Letters, 107-114, 1990) i aktywowanej peroksydazy, dostępnej z Boehringer-Mannheim Biochemica (pozycja nr 1428861).
Proces sprzęgania prowadzono w następujący sposób.
3.2.1. Sprzęganie: BlaR-CTD i peroksydazę dializowano w100 mM buforze węglan sodu/wodorowęglan sodu o pH 9,8. 40 nanomoli BlaR-CTD inkubowano w obecności 100 ml aktywowanej peroksydazy (16 mg/ml) przez 2 godziny w temperaturze 25°C.
3.2.2. Zatrzymywanie reakcji: dodano 40 ml 2 mM roztworu trietanoloaminy o pH 8, a następnie 50 ml 200 mM roztworu borowodorku sodu. Mieszaninę inkubowano przez 30 minut wtemperaturze +4°C. Następnie dodano 25 ml2 mM roztworu trietanoloaminy o pH 8, po czym mieszaninę inkubowano ponownie przez 2 godziny w temperaturze +4°C.
3.2.3. Stabilizacja sprzężenia: dodano 10 ml1 M roztworu glicyny o pH 7,0.
3.2.4. Przeniesienie do buforu do przechowywania: mieszaninę reakcyjną (około 400 ml) trzykrotnie dializowano przez 8 godzin względem 0,5 litra 10 mM buforu z fosforanu potasu, pH 7,5, 200 mM NaCl, 10 mM glicyny, w temperaturze +4°C.
3.2.5. Końcowe miano: końcowe miano sprzężenia wynosiło około 100 pmol aktywnego BlaR-CTDna1 ml roztworu.
3.3. Stałe podłoże: mikropłytka-cefalosporyna C.
3.3.1. Przygotowanie roztworu antybiotyku wzorcowego ml roztworu zawierającego 213 mg ludzkiej g-globuliny (G4386, Sigma) i 8,6 mg chlorowodorku 2-iminotiolanu (Aldrich, 33056-6) w buforze z węglanu sodu (100 mM, pH 9), inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 25°C.
Oddzielnie inkubowano 20 ml roztworu zawierającego 119,8 mg cefalosporyny-C i 54 mg 4-(N-meleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu sulfosukcynimidylu (sSMCC, 22322 Pierce) w buforze z węglanu sodu (100 mM, pH 9) przez 1 godzinę w temperaturze 25°C.
Następnie zmieszano dwa roztwory wytworzone jak opisano powyżej. Odczyn uzyskanego roztworu doprowadzono do pH 7,1 przez dodanie 3 ml 500 mM NaH2PO4 i mieszaninę inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 25°C. Mieszaninę po inkubacji trzykrotnie dializowano względem 1 litra buforu z fosforanu sodu (10 mM, pH 7,5). Otrzymany roztwór następnie przesączono przez 0,22 mm fitr.
3.3.2. Pokrywanie mikropłytek antybiotykiem wzorcowym
Stosowano mikropłytki polistyrenowe o wysokiej zdolności absorpcji białka, o nazwie handlowej NUNK (Immuno Plate: typ Maxisorp) lub o nazwie handlowej GREINER (microlon 600, pozycja 705071). Kuwety z mikropłytkami przemyto 150 mM buforem PBS, pH 7,2. Następnie próbkę roztworu przygotowanego w przykładzie 3.3.1. inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 4°C w kuwetach. Po inkubacji kuwety trzykrotnie przemyto 150 mM buforem PBS, pH 7,2, 0,1% Tween-20. Probówkę następnie wysycano przez 2 godziny w temperaturze 20°C 150 mM buforem nasycającym PBS, pH 7,2, 5% BSA. Po trzykrotnym przemyciu buforem przemywającym probówki suszono i przechowywano w temperaturze 4°C bez dostępu wilgoci.
W przypadku kuwet przeznaczonych dla środka rozpoznającego BlaR-CTD-fosfataza alkaliczna stosowano bufor przemywający opH 9,8, zawierający 1 M dietanoloaminę, 0,5 mM MgCl2; w przypadku kuwet przeznaczonych dla środka rozpoznającego BlaR-CTD-peroksydaza jako bufor przemywający stosowano 50 mM fosforan potasu o pH 5.
3.4. Wykrywanie trzech antybiotyków w mleku
1,4 pmola znakowanego środka rozpoznającego inkubowano w obecności 100 ml domieszkowanego mleka w temperaturze 47°C przez 5 minut. Mleko przeniesiono za pomocą pipety do kuwety, którą wstępnie potraktowano w sposób opisany w przykładzie 2.3. Mleko następnie inkubowano
PL 195 495B1 w temperaturze 47°C przez 2 minuty. Po usunięciu mleka i dwukrotnym przemyciu buforem przemywającym (patrz przykład 2.3.2.), 300 ml buforu zawierającego substrat inkubowano przez 2 minuty w kuwecie (substrat dla środka rozpoznającego BlaR-CTD-peroksydaza: 50 mM fosforan potasu, pH 5, 9,1 ml ABTS, 0,002% H2O2; substrat dla środka rozpoznającego BlaR-CTD-fosfataza alkaliczna: 1M dietanoloamina, pH 9,8, 0,5 mM MgCl2, 10 mM 4-NPP). Płytkę następnie umieszczono w automatycznym spektrofotometrze do płytek ELISA, przy długości fali 405 nm.
Test ten umożliwia wykrycie trzech antybiotyków: penicyliny G, kloksacyliny i ceftiofuru w ilościach około dolnej granicy normy określonej w przepisach nakładanych przez władze amerykańskie (penicylina G - 5 ppb, kloksacylina - 10 ppb; ceftiofur - 50 ppb).
Przykład 4.
Wykrywanie sześciu antybiotyków: penicyliny G,ampicyliny,amoksycyliny,kloksacyliny,cefapiryny i ceftiofuru w mleku
Przykład ten ilustruje sposób wykrywania w mleku 6 antybiotyków b-laktamowych, których zawartość regulowana jest przepisami amerykańskimi, w ilościach około dolnej granicy normy określonej wtych przepisach. W teście opisanym w tym przykładzie zastosowano receptor BlaR-CTD w postaci białka fuzyjnego z fosfatazą alkaliczną lub peroksydazą oraz podłoże w postaci pokrytej probówki.
4.1. Białko fuzyjne BlaR-CTD-fosfataza alkaliczna
Patrz przykład 3.1.
4.2. Stałe podłoże: probówka pokryta antybiotykiem wzorcowym
W tym przykładzie stosowano probówki polistyrenowe o wysokiej zdolności absorpcji białka, o nazwie handlowej NUNK (typ Maxisorp), potraktowane roztworem antybiotyku wzorcowego, jak podano w przykładzie 3.3.2.
4.3. Wykrywanie sześciu antybiotyków w mleku pmoli środka rozpoznającego inkubowano w probówce Eppendorfa w obecności 500 m l mleka w temperaturze 47°C przez 5 minut. Mleko następnie przeniesiono za pomocą pipety do probówki, którą wstępnie potraktowano w sposób opisany w przykładzie 3.2. Mleko następnie inkubowano w temperaturze 47°C przez 2 minuty. Po usunięciu mleka probówkę dwukrotnie przemyto 1 ml buforu zawierającego 1 M dietanoloaminę, pH 9,8 i 0,5 mM MgCl2. Następnie dodano 500 ml buforu zawierającego 1 M dietanoloaminę, pH 9,8, 0,5 mM MgCl2, 10 mM substratu, 4-NPP, i substrat inkubowano przez 2 minuty w temperaturze 47°C. Następnie zmierzono absorbancję supernatantu w spektrofotometrze, przy długości fali 405 nm.
Test ten umożliwia wykrycie sześciu antybiotyków w ilościach poniżej dolnej granicy normy określonej w przepisach amerykańskich: penicyliny G do poniżej 5 ppb, ampicyliny do poniżej 10 ppb, amoksycyliny do poniżej 10 ppb, kloksacyliny do poniżej 10 ppb, cefapiryny do poniżej 20 ppb i ceftiofuru do poniżej 50 ppb.
Claims (12)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wykrywania antybiotyków b-laktamowych w płynach biologicznych, a zwłaszcza w mleku, obejmujący następujące etapy:a) kontaktowanie określonej objętości tego płynu biologicznego z pewną ilością środka rozpoznającego i inkubowanie tak otrzymanej mieszaniny w warunkach umożliwiających kompleksowanie antybiotyków, które mogą być obecne w tym płynie biologicznym, środkiem rozpoznającym,b) kontaktowanie mieszaniny otrzymanej w etapie a) z co najmniej jednym b-laktamowym antybiotykiem wzorcowym unieruchomionym na podłożu w warunkach umożliwiających kompleksowanie tego antybiotyku wzorcowego środkiem rozpoznającym w ilości, która nie uległa reakcji w etapie a), orazc) oznaczanie ilości środka rozpoznającego związanego z podłożem, znamienny tym, że jako środek rozpoznający stosuje się receptor BlaR lub BlaR-CTD, otrzymany ze szczepu Bacillus licheniformis.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się receptor BlaR lub BlaR-CTD sprzężony ze środkiem znakującym, wybranym spośród koloidalnych cząstek metali, koloidalnych cząstek selenu, węgla, siarki lub telluru oraz koloidalnych cząstek barwionych syntetycznych lateksów.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się receptor BlaR lub BlaR-CTD sprzężony ze środkiem znakującym wybranym spośród substancji fluorescencyjnych.PL 195 495 B1
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się receptor BlaR lub BlaR-CTD sprzężony ze środkiem znakującym, wybranym spośród enzymów, takich jak fosfataza alkaliczna, peroksydazy lub b-laktamazy.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się receptor BlaR lub BlaR-CTD sprzężony chemicznie lub genetycznie z enzymatycznym środkiem znakującym.
- 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że receptor BlaR lub BlaR-CTD sprzęga się ze środkiem znakującym przed przeprowadzeniem etapu a).
- 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że receptor BlaR lub BlaR-CTD sprzęga się ze środkiem znakującym podczas lub po przeprowadzeniu etapu a).
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etapy a) i b) prowadzi się równocześnie.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) stosuje się podłoże w postaci probówki, płytki lub pręta powleczonych antybiotykiem wzorcowym.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) jako podłoże stosuje się urządzenie testowe mające stałą podstawę (1) mającą koniec pierwszy i drugi, przy czym na tej podstawie są zamocowane kolejno, od pierwszego końca: membrana (2) do oczyszczania analizowanego płynu; membrana (3) do unieruchomiania co najmniej jednej substancji wychwytującej; oraz absorpcyjna membrana (4).
- 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) jako podłoże stosuje się kulki magnetyczne lub niemagnetyczne.
- 12. Zestaw testowy do wykrywania antybiotyków b-laktamowych w płynach biologicznych, a zwłaszcza w mleku, sposobem określonym w zastrz. 1, zawierający co najmniej jeden środek rozpoznający wrażliwy na antybiotyki b-laktamowe ico najmniej jeden b-laktamowy antybiotyk wzorcowy unieruchomiony na podłożu, znamienny tym, że jako środek rozpoznający zawiera receptor BlaR lub BlaR-CTD, otrzymany ze szczepu Bacillus licheniformis.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE9800485A BE1012049A6 (fr) | 1998-06-25 | 1998-06-25 | Procede pour la determination d'antibiotique a noyau beta-lactame dans un liquide biologique. |
| PCT/EP1999/002166 WO1999067416A2 (fr) | 1998-06-25 | 1999-03-30 | Procede pour la determination d'antibiotiques a noyau beta-lactame |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL345396A1 PL345396A1 (en) | 2001-12-17 |
| PL195495B1 true PL195495B1 (pl) | 2007-09-28 |
Family
ID=3891319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL99345396A PL195495B1 (pl) | 1998-06-25 | 1999-03-30 | Sposób i zestaw testowy do wykrywania antybiotyków beta-laktamowych w płynach biologicznych |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6524804B2 (pl) |
| EP (1) | EP1082451B1 (pl) |
| JP (1) | JP4426103B2 (pl) |
| KR (1) | KR100577700B1 (pl) |
| CN (1) | CN1145029C (pl) |
| AR (1) | AR018821A1 (pl) |
| AT (1) | ATE331808T1 (pl) |
| AU (1) | AU737906B2 (pl) |
| BE (1) | BE1012049A6 (pl) |
| BR (1) | BR9911500B1 (pl) |
| CA (1) | CA2335734C (pl) |
| CZ (1) | CZ298192B6 (pl) |
| DE (1) | DE69932161T2 (pl) |
| DK (1) | DK1082451T3 (pl) |
| ES (1) | ES2268860T3 (pl) |
| IL (1) | IL140258A (pl) |
| NO (1) | NO20006574L (pl) |
| NZ (1) | NZ508965A (pl) |
| PL (1) | PL195495B1 (pl) |
| PT (1) | PT1082451E (pl) |
| RU (1) | RU2213973C2 (pl) |
| TR (1) | TR200003833T2 (pl) |
| WO (1) | WO1999067416A2 (pl) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8481334B1 (en) | 2001-11-06 | 2013-07-09 | Charm Sciences, Inc. | Method of attaching a ligand to a solid support |
| EP1712914A1 (fr) * | 2005-04-14 | 2006-10-18 | Unisensor S.A. | Procédé in vitro pour la detection et l'identification simultanées d'antibiotiques de classes differentes et trousse de diagnostic correspondante |
| RU2379686C2 (ru) * | 2007-12-17 | 2010-01-20 | Федеральное агентство по высокотехнологичной медицинской помощи Федеральное государственное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии" (ФГУ УрНИИДВиИ Росмедтехнологий) | Способ определения концентрации препаратов бензилпенициллина в биологических жидкостях |
| PL385415A1 (pl) * | 2008-06-11 | 2009-12-21 | Marek Ciesielski | Sposób wykrywania bakteriooporności, zestaw diagnostyczny oraz zastosowanie oznaczania obecności leku i/lub produktów jego rozpadu |
| RU2406086C2 (ru) * | 2008-06-30 | 2010-12-10 | Михаил Тимофеевич Александров | Способ выбора предпочтительного антимикробного препарата |
| CN104250661A (zh) * | 2008-07-10 | 2014-12-31 | 塔康特精确有限公司 | 可培养的微生物细胞的数目的测定方法 |
| GB0914001D0 (en) * | 2009-08-11 | 2009-09-16 | Benson Jennifer M | Biodegradable pregnancy test |
| RU2524624C2 (ru) * | 2010-01-29 | 2014-07-27 | Тарту Юликоол (Юниверсити Оф Тарту) | Система реального времени, способ калибровки системы и одновременное обнаружение остатков антибиотиков и их концентраций в молоке |
| CN102192980B (zh) * | 2010-03-08 | 2014-04-09 | 苏州浩欧博生物医药有限公司 | 非金属胶体粒子免疫分析方法 |
| WO2013037886A1 (en) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Immunoassay for detecting antibiotics |
| DK2756306T3 (da) | 2011-09-16 | 2019-11-11 | Dsm Ip Assets Bv | Immunassay til påvisning af antibiotika |
| WO2013037888A1 (en) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Immunoassay for detecting antibiotics |
| WO2013053953A1 (en) * | 2011-10-14 | 2013-04-18 | Université de Liège | Method for measuring beta-lactam antibiotics |
| MY186524A (en) * | 2015-11-20 | 2021-07-24 | Centrient Pharmaceuticals Netherlands B V | Assay for determining antibiotics in waste |
| CN108431603B (zh) | 2016-12-28 | 2020-04-21 | 纽勤有限公司 | 流体限位器筒式组件及其使用方法 |
| USD834721S1 (en) | 2017-03-03 | 2018-11-27 | Neogen Corporation | Assay cartridge |
| JP6987593B2 (ja) * | 2017-10-16 | 2022-01-05 | 株式会社ニップン | 変異体受容体タンパク質 |
| JP7206645B2 (ja) * | 2018-06-08 | 2023-01-18 | 株式会社島津製作所 | 流体デバイスの製造方法および流体デバイス |
| CN111830015B (zh) * | 2019-04-18 | 2022-12-09 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种定量检测抗生素的方法 |
| CN110241056A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-09-17 | 石河子大学 | 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4239852A (en) * | 1978-06-12 | 1980-12-16 | Penicillin Assays, Inc. | Antibiotic detection method |
| US4762782A (en) | 1985-05-16 | 1988-08-09 | Micromol Corporation | Assay for Beta-lactam antibiotics |
| US5028535A (en) * | 1989-01-10 | 1991-07-02 | Biosite Diagnostics, Inc. | Threshold ligand-receptor assay |
| US5434053A (en) * | 1992-10-06 | 1995-07-18 | Gist-Brocades N.V. | Detection of antibiotics |
| DE69840657D1 (de) * | 1997-07-16 | 2009-04-23 | Charm Sciences Inc | Verfahren zum Nachweis eines Restanalyts in einer Probe |
| US5985675A (en) * | 1997-12-31 | 1999-11-16 | Charm Sciences, Inc. | Test device for detection of an analyte |
| CZ301093B6 (cs) * | 1997-10-07 | 2009-11-04 | Neogen Corporation (Michigan Corporation) | Zpusob detekce analytu v tekutém mlécném produktu a testovací zarízení k provádení zpusobu |
-
1998
- 1998-06-25 BE BE9800485A patent/BE1012049A6/fr not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-26 US US09/276,923 patent/US6524804B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 IL IL14025899A patent/IL140258A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 EP EP99919158A patent/EP1082451B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 KR KR1020007014639A patent/KR100577700B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-30 DE DE69932161T patent/DE69932161T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 TR TR2000/03833T patent/TR200003833T2/xx unknown
- 1999-03-30 CN CNB998094056A patent/CN1145029C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-30 PT PT99919158T patent/PT1082451E/pt unknown
- 1999-03-30 AT AT99919158T patent/ATE331808T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 NZ NZ508965A patent/NZ508965A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 PL PL99345396A patent/PL195495B1/pl unknown
- 1999-03-30 BR BRPI9911500-0A patent/BR9911500B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 CA CA002335734A patent/CA2335734C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 RU RU2001102261/13A patent/RU2213973C2/ru active
- 1999-03-30 CZ CZ20004790A patent/CZ298192B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 WO PCT/EP1999/002166 patent/WO1999067416A2/fr not_active Ceased
- 1999-03-30 AU AU37032/99A patent/AU737906B2/en not_active Ceased
- 1999-03-30 DK DK99919158T patent/DK1082451T3/da active
- 1999-03-30 JP JP2000556056A patent/JP4426103B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-30 ES ES99919158T patent/ES2268860T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-31 AR ARP990101468A patent/AR018821A1/es active IP Right Grant
-
2000
- 2000-12-21 NO NO20006574A patent/NO20006574L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-06-14 US US10/170,343 patent/US8106155B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8106155B2 (en) | Test kit for determining process for determining antibiotics containing a beta-lactam ring in a biological fluid | |
| AU738143B2 (en) | Assay device for determining analytes in a liquid dairy product | |
| JP3457324B2 (ja) | 同時でのサンプル抽出及び免疫原性反応を含む抗体又は抗原の検査のための迅速イムノアッセイ | |
| CA1231049A (en) | Protected binding assay | |
| EP1824991B1 (en) | Device and method for detection of analytes | |
| JPH08501145A (ja) | 固相免疫学的検定法 | |
| EP0711414B1 (fr) | Procede de dosage d'une substance immunologique au moyen de particules de latex magnetiques et de particules non-magnetiques | |
| CN202916286U (zh) | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
| US4963478A (en) | Article for preforming immunological assays utilizing organic dyes and method for producing and utilizing same | |
| EP1450160A1 (en) | Surface plasmon resonance sensor for endotoxin | |
| MXPA00012583A (en) | METHOD FOR DETERMINING ANTIBIOTICS WITH&bgr;-LACTAM CORE IN A BIOLOGICAL FLUID | |
| EP1382966A1 (en) | Microvolume detecting method and device | |
| MXPA00003325A (en) | Testing device for determining analytes in a liquid dairy product | |
| CA2392681A1 (en) | Microvolume detecting method and device |