PL195510B1 - Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 i kompozycja farmaceutyczna zawierająca nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 - Google Patents

Abstract

1. Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 zdeponowany pod numerem B/00005. 2. Kompozycja farmaceutyczna składająca się z nowego szczepu bakteryjnego i nośnika, znamienna tym, że jako szczep bakteryjny zawiera szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 zdeponowany pod numerem B/00005.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 i kompozycja farmaceutyczna zawierająca nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/2.

Znany jest z polskiego opisu patentowego 175 639 szczep bakterii kwasu mlekowego wybrany z grupy skł adają cej się ze szczepów Bifidobacterium breve CNCM I - 1226, Bifidobacterium infantis CNCM I- 1227, Bifidobacterium longum CNCM I - 1228 posiadający zdolność eliminowania z komórek jelitowych bakterii chorobotwórczych wywołujących biegunkę.

Przewód pokarmowy stanowi złożony ekosystem, którego składniki pozostają między sobą w stanie dynamicznej równowagi. U czł owieka w 1 gramie treś ci jelitowej zawarte jest ponad 10¹¹ komórek drobnoustrojów reprezentujących ponad 500 gatunków bakterii. Wraz z treścią pokarmową, codziennie do naszego organizmu wnikają znaczne liczby drobnoustrojów, z czego zdecydowana większość wydalana jest na zewnątrz w wyniku naturalnego pasażu jelitowego. Tylko niewielka część mikroorganizmów, jako tzw. lokalna flora, na stałe kolonizuje nabłonek przewodu pokarmowego.

Większość bakterii bytujących w jelicie grubym człowieka to niesporujące beztlenowce należące do rodzajów Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium. Występują tu także, w mniejszych ilościach, laseczki Clostridium oraz beztlenowe i tlenowe paciorkowce, głównie z grupy D (Enterococcus) oraz pałeczki Enterobacteriaceae. Tak więc laseczki z rodzaju Lactobacillus w przewodzie pokarmowym zdrowego człowieka nie stanowią dominującej grupy bakterii. Ich obecność jednak zarówno w górnym jak i dolnym odcinku przewodu pokarmowego, nie wyłączając śluzówki żołądka, jest uważana za szczególnie pożądaną.

Liczba doniesień naukowych mówiących o nowych możliwościach wykorzystania bakterii z rodzaju Lactobacillus do celów medycznych, szczególnie w ostatnich latach, jest imponująca. Przeprowadzone badania kliniczne wykazały, że bakterie kwasu mlekowego odbudowują, a następnie utrzymują prawidłowy skład mikroflory człowieka, po zadziałaniu na niego wielu wewnętrznych i zewnętrznych czynników, do których zaliczyć możemy przede wszystkim, za Fullerem i Gibsonem.

- ostre (bakteryjne, lub wirusowe) zakaż enia jelitowe,

- ś rodki farmakologiczne, w szczególności antybiotyki,

- róż ne postacie stresu,

- dietę .

Ze względu na zdolność do produkowania aktywnych substancji (kwasy organiczne, substancje hamujące podobne do bakteriocyn, lantybiotyki, nadtlenek wodoru), działających antagonistycznie na większość bakterii chorobotwórczych, uważa się, że w niedalekiej przyszłości bakterie kwasu mlekowego mogą stać się naturalną, biologiczną alternatywą dla powszechnego i zbyt szerokiego stosowania antybiotyków, tym bardziej, że preparaty zawierające żywe bakterie kwasu mlekowego, mogą być przyjmowane bez obawy ich przedawkowania i niepożądanego, ubocznego działania, w szczególności zaś bakterie kwasu mlekowego o własnościach probiotycznych.

Wymagania stawiane szczepom probiotycznym są bardzo wysokie; a mianowicie powinny one:

1. pochodzić ze zdrowej mikroflory ludzkiego organizmu,

2. posiadać precyzyjnie określony rodzaj i gatunek, potwierdzony najnowszymi badaniami molekularnymi,

3. wykazywać wyjątkową, antagonistyczną aktywność wobec typowych patogenów przewodu pokarmowego,

4. posiadać zdefiniowane właściwości powierzchniowe i adherencyjne, potwierdzone za pomocą hodowli tkankowej,

5. wykazywać oporność na sok żołądkowy i sole żółci,

6. potwierdzać swoje probiotyczne działanie w prawidłowo przeprowadzonych badaniach klinicznych.

Istotą wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/2 i kompozycja farmaceutyczna zawierająca nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/2 i nośnik. Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/2 został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doś wiadczalnej PAN we Wrocł awiu, gdzie nadano mu numer B/00005.

Cechy charakterystyczne szczepu Lactobacillus rhamnosus 573L/2.

Szczep 573L/2 został zidentyfikowany za pomocą metod fenotypowych (zestaw API 50 CHL) i genotypowych (reakcja PCR z starterami swoistymi dla gatunku Lactobacillus rhamnosus) jako Lactobacillus rhamnosus.

PL 195 510 B1

1. Morfologia: drobnoustrój gramdodatni, nieruchomy, niezarodnikujący.

2. Fermentacja cukru: ribose (+), galactse (+), d-glucose (+), d-fructose (+), d-mannose (+), 1- sorbose (+), rhamnose (+), dulcitol (+), mannitol (+), sorbitol (+), α methyl-d-glucoside (+), n ecetyl glucosamine (+), amygdaline (+), arbutine (+), esculine (+), salicine (+), cellobiose (+), maltose (+), lactose (+), trehalose (+), d-tagatose (+).

3. Właściwości szczepu.

Szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/2 wykazuje wybitne powinowactwo do komórek ustroju ludzkiego dzięki unikalnym właściwościom powierzchniowym:

Cechy określające	Stopień aktywności
aktywność powierzchniową
Produkcja śluzu zewnątrzkomórkowego	++
Hydrofobowość powierzchni	+++
Adherencja do linii komórkowej CaCo 2	++
Adherencja do linii komórkowej HT-29	++

4. Określanie właściwości powierzchniowych.

Badanie hydrofobowości powierzchni.

W celu określenia hydrofobowych właściwości powierzchni szczepu Lactobacillus rhamnosus 573L/2 posłużono się dwoma odczynami: pierwszym z nich był test agregacji w soli (SAT = salt-aggregation test) według Jonssona i wsp. zaś drugim - odczyn bakteryjnej interakcji z ksylenem według Rosenberga.

Test agregacji w soli (SAT).

Test agregacji w soli (SAT) - wykonano w następujący sposób: 18 godzinną, płynną hodowlę badanego szczepu Lactobacillus rhamnosus 573 L/2 przemywano 0,02 mol/1 buforem fosforanowym o pH 6,8, a otrzymaną zawiesinę ponownie rozcieńczono tym samym buforem do gęstości 5x10⁹ j.t.k./ml. Na szkiełkach podstawowych mieszano następnie powyższą zawiesinę bakterii ze wzrastającymi stężeniami siarczanu amonu (0,02, 0,05, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 mol/l). Końcowe, najniższe stężenie siarczanu amonu powodujące agregację bakterii kwasu mlekowego 573L/2 podawano jako wartość SAT. Uważa się, że szczepy wykazujące wartość SAT < 0,9 mol/l posiadają najwyższą hydrofobowość, podczas gdy szczepy o wartości SAT > 1,5 mol/l najniższą.

Test bakteryjnego powinowactwa do ksylenu.

Test powinowactwa szczepu Lactobacillus rhamnosus 573L/2 do ksylenu wykonano według metody Rosenberga. W tym celu 18-godzinną, płynną hodowlę bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 odwirowywano (1500 obrotów na minutę przez 15 minut), a następnie przemywano dwukrotnie w PBS. Tak przygotowane komórki bakteryjne zawieszano w 1,2 ml buforu o następującym składzie: 22.2 g K2HPO4 x 3 H2O, 7,26 g K2HPO4, 1,8 g mocznika, 0,2 g MgSO4 w 1000 ml H2O, o pH 7.1. Zawiesinie tej mierzono absorbancję za pomocą densytometru przy długości fali 540 nm. Następnie dodawano 0,2 ml ksylenu i tak otrzymaną mieszaninę energicznie wytrząsano przez 30 sekund i odstawiano. Po upływie 30 min, gdy mieszanina ponownie rozdzielała się na dwie fazy dokonywano końcowego pomiaru absorpcji fazy wodnej za pomocą densytometru przy tej samej długości fali. Uzyskane wyniki dla każdego porównano wykazując różnice w absorbancji przed i po dodaniu ksylenu. Spadek absorpcji fazy wodnej był miarą hydrofobowości powierzchni bakterii.

Test na produkcję śluzu.

Do określenia jakościowej produkcji śluzu posłużono się metodą Christensena i współpracowników. W tym celu szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 hodowano w szklanych probówkach zawierających 10 ml płynnego podłoża MRS przez 18 godzin w warunkach ściśle beztlenowych. Po zakończonej inkubacji, jałową pipetą, bez dotknięcia ścian probówki, odciągano MRS, a następnie, po ściankach probówki, wlewano pipetą 1 ml - 0,1% roztworu safraniny. Przez 60 sekund delikatnie obracano probówką, a następnie odwracano ją do góry dnem, pozostawiając ją przez kilka minut w temperaturze pokojowej. Na ściankach probówki uwidaczniał się, lub też nie, różowy biofilm w zależności od zdolności badanego szczepu do tworzenia śluzu, którego natężenie oceniano w skali od 0 do ++++.

5. Badanie siły przylegania (adherencji) do komórek ustroju ludzkiego.

W celu oznaczenia siły przylegania bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 do komórek ustroju ludzkiego posłużono się ludzkimi liniami komórkowymi Caco2 i HT 29 pochodzenia jelitowego. Hodowlę

PL 195 510 B1 prowadzono przez wielokrotne pasaże, przy zastosowaniu podłoża RPMI - 1640 z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej. Ponadto, podłoże to zawierało 3 mM/ml L-glutaminy oraz antybiotyki: 100 μg/ml^-1 streptomycyny i 100 U/ml^-1 penicyliny. Hodowle prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze o zwiększonej wilgotności zawierającej 10% CO2, zmieniając podłoże odżywcze 2 razy w tygodniu. W celu przeprowadzenia testu adherencji wysiewano komórki linii tkankowych o gęstości 10⁴/ml do 6-dołkowych plastikowych płytek. Używano 14-dniowej hodowli komórkowej tworzącej jednolitą warstwę (monolayer). Tak wyrośnięte komórki przemywano dwukrotnie PBS. Badane bakterie Lactobacillus rhamnosus 573L/2 inkubowano w standardowych warunkach przez 18 godzin, po czym hodowlę płukano dwukrotnie roztworem fizjologicznym NaCl. Do testu adherencji bakterie doprowadzano do gęstości 10⁹/ml, a następnie bakterie zawieszone w podłożu: bulion MRS i MEM lub RPMI w stosunku 1:1 dodawano do dołków zawierających komórki Caco2 lub HT-29. Komórki linii tkankowych wraz z badanym szczepem inkubowano w temperaturze 37° C, w atmosferze wzbogaconej 10% CO2 przez 30 minut. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nie przyczepionych bakterii, a następnie utrwalano 3,7% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po utrwaleniu komórki ponownie przemywano PBS i barwiono fioletem krystalicznym przez 3 minuty. Preparat oceniano mikroskopowo przy powiększeniu 1000 x. W każdym preparacie oglądano 20 pól widzenia. Adherencję określano półilościowo, według skali:

- brak przylegania, + pojedyncze komórki bakterii w całym preparacie, ++ pojedyncze komórki bakterii w poszczególnych polach widzenia, liczne w preparacie, +++ liczne komórki bakterii w poszczególnych polach widzenia.

6. Oporność na antybiotyki

Antybiotyk	Wartości najmniejszego stężenia hamującego (MIC) w mg/l
Gentamycyna	1.0
Wankomycyna	256.0
Erytromycyna	0.047
Klindamycyna	0.064
Metronidazol	256.0
Cyprofloksacyna	0.38
Doksycyklina	0.5
Penicylina G	0.5
Ampicylina	1.0
Metycylina	6.0
Kotrymoksazol	32.0
Cefaklor	24.0
Mupirocyna	3.0

Szczep wykazuje zatem zakres oporności na leki odpowiadający gatunkowi Lactobacillus rhamnosus: wrażliwość na penicylinę, erytromycynę i klindamycynę oraz gatunkowo-swoistą oporność na aminoglikozydy, kotrymoksazol, metronidazol i wankomycynę.

7. Określanie wrażliwości na leki przeciwbakteryjne

Zastosowano najnowocześniejszą, ilościową metodę E-testu, umożliwiającą badanie bakterii kwasu mlekowego na korzystnym dla nich podłożu. Polega ona na umieszczaniu na podłożu Brucella Agar z dodatkiem krwi, posianym badanym szczepem bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 o stężeniu 0,5 w skali Mc Farlanda specjalnych pasków nasyconych gradientem badanego leku i inkubacji w warunkach beztlenowych przez 24 godziny. Wynik badania odpowiadający wartości najniższego stężenia hamującego (MIC) w mg/l odczytuje się bezpośrednio ze skali umieszczonej na pasku.

8. Określenie oporności na sole żółci i sok żołądkowy.

Oporność na sole żółci: znaczna

Oporność na sok żołądkowy: średnia

PL 195 510 B1

Tempo namnażania: wysokie

Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że badany szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/2 wykazał dużą oporność zarówno na sole żółci, jak i na niskie pH sztucznego soku żołądkowego, co może świadczyć o jego doskonałym przystosowaniu się do niesprzyjających warunków panujących w ludzkim przewodzie pokarmowym. Badanie oporności bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 na sok żołądkowy.

Aby oznaczyć stopień oporności szczepu bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 na pH soku żołądkowego posłużono się metodą Clarka, którą zmodyfikowano w ten sposób, że zamiast stężonego kwasu solnego zastosowano sztuczny sok żołądkowy o stałym pH wynoszącym 2.5 według następującego przepisu: 2.0 g NaCl, 3,2 g pepsyny w 7 ml 36% HCl o pH 1,2 rozpuszczono w 1000 ml wody destylowanej. Tak przygotowany, jałowy, sztuczny sok żołądkowy rozlewano po 10 ml do jałowych probówek, a następnie do każdej kolejno dolewano po 100 μΐ wcześniej wyhodowanego szczepów bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 o znanej gęstości. Mieszaninę inkubowano przez 20 minut w 37°C w warunkach ściśle beztlenowych i kolejno rozcieńczano w soli fizjologicznej w celu określenia otrzymanej gęstości końcowej. Spadek gęstości badanego szczepu po inkubacji z sztucznym sokiem żołądkowym był miarą wrażliwości na niskie pH soku żołądkowego i trawienie przez pepsynę. Badanie oporności bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 na sole żółci.

W celu oznaczenia oporności szczepu bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 na sole żółci posłużono się metodą Dashkevicz i Feighner, która polegała na tym, że do agaru MRS dodawano wskaźnika - purpury bromokrezolowej w ilości 0,17 g /l oraz soli żółci w pięciu kolejnych stężeniach tj: 1g/l, 2g/l, 5g/l, 10g/l i 20g/l. Na tak przygotowane, stałe podłoże MRS posiewano hodowlę szczepu bakterii kwasu mlekowego, które następnie inkubowano w standardowych warunkach przez 24 godziny. Po zakończonej inkubacji kolonie bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 oporne na dane stężenie soli nabierały koloru jasno żółtego.

P r z y k ł a d I.

Własności antagonistyczne szczepu bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2.

Szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 posiada wybitne właściwości antagonistyczne. Szczep działa hamująco na wzrost następujących bakterii wykorzystując metodę słupkową.

Szczep Lactobacillus rhamnosus 573 L/2 Bakterie wskaźnikowe:

Staphylococcus aureus Salmonella enteritidis Shigella sonnei

E. coli, szczepy enteropatogenne Helicobacter pylori Campylobacter coli Campylobacter jejuni Clostridium difficile

Strefa zahamowania wzrostu (w mm)/stopnień 18/ ++

20/ +++

20/+++

19/++

25/+++

35/ +++

35/ +++

30/+++

Legenda: średnica stref zahamowania wzrostu wg. metody słupkowej: +++ => 20 mm, ++ = 16-19 mm,+ = 12-15 mm

Zastosowana metoda określenia właściwości antagonistycznych

Zastosowano własną metodę badania. Szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 hodowano w temperaturze 37° C, w warunkach beztlenowych na płytkach z podłożem stałym MRS (OXOID) o objętości 40 ml. Po upływie 18 godzin inkubacji, w płytkach agarowych wycinano korkoborem okrągłe słupki o średnicy 9 mm, które po 3 nakładano na płytki z naniesionymi, za pomocą wymazu, bakteriami wskaźnikowymi, po czym umieszczano je na 4 godziny w lodówce w temperaturze 4°C (za wyjątkiem bakterii beztlenowych).

Grupę drobnoustrojów wskaźnikowych stanowiły tlenowe i beztlenowe czynniki patogenne ludzkiego przewodu pokarmowego. Do tlenowych bakterii wskaźnikowych, zaliczono Gram-ujemne pałeczki: Salmonella enteritidis, Shigella sonnei i enteropatogenny szczep Escherichia coli, wywołujące ostre biegunki i inne dolegliwości ze strony przewodu pokarmowego. Pałeczki pochodziły z kolekcji zebranej w latach 1995/96 w Państwowym Zakładzie Higieny. Ponadto do tlenowych bakterii wskaźnikowych zaliczono również Gram-dodatnie ziarenkowce: Staphylococcus aureus, pochodzące z materiału ludzkiego.

Beztlenową grupę bakterii wskaźnikowych stanowiły: Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Helicobacter pylori i Clostridium difficile, pochodzące z materiałów klinicznych badanych w trakcie bieżącej

PL 195 510 B1 diagnostyki Zakładu Mikrobiologii Centrum Zdrowia Dziecka oraz Katedry Mikrobiologii Lekarskiej Akademii Medycznej we Wrocławiu i Katedry Mikrobiologii Klinicznej Akademii Medycznej w Warszawie.

Tlenowe bakterie wskaźnikowe hodowano w optymalnych warunkach to znaczy na bulionowym podłożu Mueller-Hintona (MH) przez 24 godziny, w temperaturze 37°C. Po inkubacji, 1 oczko ezy przenoszono do 5 ml czystego bulionu MH i ponownie inkubowano przez 4-8 godzin w temperaturze 37°C w łaźni wodnej. Stężenie wskaźnikowych bakterii tlenowych doprowadzano do gęstości 0.5 według skali Mc Farland'a, rozcieńczając hodowlę solą fizjologiczną. Następnie 0.1 ml takiego inokulum przenoszono na podłoże stałe MH i rozprowadzano je po powierzchni płytki wacikiem.

Beztlenowe bakterie wskaźnikowe hodowano na odpowiednich podłożach wzrostowych. Dla Helicobacter i Campylobacter był to agar Brucella z dodatkiem krwi ludzkiej (lub końskiej), heminy oraz witaminy K1, a dla Clostridium difficile - Columbia Agar z dodatkiem 5% krwi baraniej firmy bio-Merieux. Inkubowano je w warunkach beztlenowych (Clostridium difficile) lub mikroaerofilnych (Helicobacter i Campylobacter) stosując odpowiednie generatory atmosfery firmy bio-Merieux przez 48-72 godziny, a następnie bakterie zawieszano w soli fizjologicznej, starając się doprowadzić gęstość zawiesiny do 3.0 w skali Mc Farland'a. Objętość 0.1 ml tej zawiesiny rozprowadzano na powierzchni płytek z odpowiednimi, powyżej opisanymi agarowymi podłożami wzrostowymi. Dalszą inkubację przeprowadzano w temperaturze 37°C przez 24-72 godziny w warunkach tlenowych, mikroaerofilnych, lub też beztlenowych w zależności od wymagań bakterii wskaźnikowych. Po inkubacji wokół słupka powstawała strefa zahamowania wzrostu bakterii wskaźnikowych, której średnicę w mm przyjmowano, jako miarę antagonizmu.

Szczep bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus rhamnosus 573L/2 wykazuje silną aktywność hamującą wzrost podstawowych tlenowych czynników etiologicznych zakażeń przewodu pokarmowego: Salmonella, Shigella i Escherichia coli. Ponadto jest aktywny wobec bakterii beztlenowych powodujących przewlekłe stany zapalne żołądka i jelit. Działa także na ziarenkowce Gram-dodatnie.

Nowy szczep kwasu mlekowego Lactobacillus rhamnosus 573L/2 posiada wybitne działanie hamujące w szczególności w stosunku do bakterii Clostridium oraz własności lecznicze w przypadkach biegunek poantybiotykowych, posiada dobre własności probiotyczne.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 zdeponowany pod numerem B/00005.
2. 2. Kompozycja farmaceutyczna składająca się z nowego szczepu bakteryjnego i nośnika, znamienna tym, że jako szczep bakteryjny zawiera szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/2 zdeponowany pod numerem B/00005.