PL195813B1

PL195813B1 - Sposób modyfikacji cząsteczki chemicznej

Info

Publication number: PL195813B1
Application number: PL357664A
Authority: PL
Inventors: Janusz Boratyński; Renata Budzyńska; Andrzej Górski; Monika Jagiełło; Urszula Kańska; Anna Nasulewicz; Mohamed Omar Salah Megahed; Adam Opolski; Joanna Wietrzyk
Original assignee: Inst Immunologii I Terapii Dos
Priority date: 2002-12-10
Filing date: 2002-12-10
Publication date: 2007-10-31
Also published as: PL357664A1

Abstract

Sposób modyfikacji cząsteczki chemicznej posiadającej co najmniej jedną dostępną grupę aminową, znamienny tym, że do sprzęgania z grupami aminowymi wykorzystuje się związek dikarboksylowy, który w pierwszym etapie przeprowadza się w formę bezwodnika, a następnie w reakcji z alkoholem przeprowadza się w formę aktywnego estru, po czym zapewniając pH od 4,5 do 9 i temperaturę od 0 do 40°C miesza się z roztworem poddawanych modyfikacji cząsteczek, przy czym tylko jedna grupa karboksylowa sprzęganego związku dikarboksylowego jest zdolna do efektywnej reakcji.

Description

Wynalazek dotyczy sposobu modyfikacji cząsteczki chemicznej posiadającej co najmniej jedną dostępną grupę aminową, który polega na przyłączaniu cząsteczki dikarboksylowej do cząsteczki modyfikowanej. Sposób znajduje zastosowanie w otrzymywaniu koniugatów nośnik-hapten, zwłaszcza w sprzęganiu leków z białkami nośnikowymi.

Modyfikowane makrocząsteczki tworzą ważne narzędzia badawcze w medycynie i biotechnologii oraz mogą być wykorzystane w tworzeniu nowych kierunków terapii różnych schorzeń. Leki związane lub kompleksowane z nośnikami charakteryzują się wieloma korzystnymi cechami. Lek sprzężony z nośnikiem ma inny okres półtrwania, wywołuje inne objawy uboczne. Zmienia się jego toksyczność, sposób wnikania do komórek. Komórki, które wykształciły cechy lekooporności na wolny lek, mogą być jednak wrażliwe na działanie koniugatów. Nośnik może mieć właściwość kumulowania się w określonych komórkach lub tkankach i sprzężony z lekiem wybiórczo uczestniczyć w leczeniu choroby. Dlatego chemiczne modyfikacje nośników jak i leków, a następnie tworzenie koniugatów, otwierają nowe możliwości terapeutyczne.

Koniugaty mogą być otrzymywane na szereg sposobów. Ważny jest nie tylko wybór leku i nośnika, ale także rodzaj przeprowadzonych modyfikacji chemicznych. Warunki reakcji sprzęgania powinny zachować aktywność biologiczną leku i nośnika. Osiąga się to między innymi regulując stopień podstawienia koniugatu. W niektórych sytuacjach ważne jest stworzenie labilnych łączników leknośnik. Ważne jest, aby koniugat lek-makrocząsteczka wybiórczo modulował funkcje tkanek i komórek. Dla przeprowadzenia reakcji sprzęgania wykorzystuje się głównie obecność w białkach grup aminowych i sulfhydrylowych. W przypadku leku grupami wykorzystywanymi w reakcji z białkiem są grupy karboksylowe, grupy aminowe, reszty tyrozyny i ugrupowania cukrowe.

Opublikowano wiele prac wskazujących na przewagę koniugatów nad wolnymi lekami. Koniugaty makrocząsteczek z haptenami są obecnie przedmiotem wstępnych badań klinicznych. W terapii i diagnostyce klinicznej chorób nowotworowych (głównie hematologicznych) znajdują zastosowanie 131 90 koniugaty przeciwciał lub ich fragmentów z izotopami np.: ¹³¹I lub ⁹⁰Y (Matthay i współpr. 2001, Weiden i Breitz 2001).

Leki sprzęgane są zarówno z nośnikami naturalnymi jak i syntetycznymi. Koniugat ludzkiej albuminy z metotreksatem jest w I fazie prób klinicznych u chorych z różnymi nowotworami (Hartung i współpr. 1999). W II fazie badań klinicznych znajduje się koniugat monoklonalnego przeciwciała z doksorubicyną (BR96-DOK) (Smith 2001). Wykorzystywane są również koniugaty leków z polimerami np. pochodne metaakrylamidowe z doksorubicyną (Duncan i współpr. 2001, Meerum Terwogt i współpr. 2001).

Patent PL 130458 opisuje koniugaty metotreksatu z fibrynogenem. Przedmiotem zgłoszenia P 352435 jest sposób otrzymywania koniugatów leków z białkami w środowisku bezwodnym.

Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu pozwalającego na uzyskanie koniugatów leków z białkami, które posiadałyby poprawione właściwości farmakologiczne, a w szczególności lepszą biodostępność, poprawioną aktywność, obniżony poziom toksyczności i niższy stopień wewnątrz i międzycząsteczkowego posieciowania koniugatu.

Nieoczekiwanie niniejszy wynalazek rozwiązuje opisane powyżej problemy.

Przedmiotem wynalazku jest sposób modyfikacji cząsteczki chemicznej posiadającej co najmniej jedną dostępną grupę aminową, charakteryzujący się tym, że do sprzęgania z grupami aminowymi wykorzystuje się związek dikarboksylowy, który w pierwszym etapie przeprowadza się w formę bezwodnika, a następnie w reakcji z alkoholem przeprowadza się w formę aktywnego estru, po czym zapewniając pH od 4,5 do 9 i temperaturę od 0do 40°C miesza się z roztworem poddawanych modyfikacji cząsteczek, przy czym tylko jedna grupa karboksylowa sprzęganego związku dikarboksylowego jest zdolna do efektywnej reakcji.

Korzystnie, związkiem dikarboksylowym jest metotreksat albo tomudeks, a modyfikowana makrocząsteczka zawiera polipeptyd, albo jest białkiem, zwłaszcza przeciwciałem albo fibrynogenem. W korzystnej realizacji wynalazku otrzymany w reakcji czysty, nieposieciowany koniugat haptenu z nośnikiem białkowym, następnie rozpuszcza się lub zawiesza się w środowisku wodnym.

Zgodnie z istniejącymi w stanie techniki dokumentami, można było oczekiwać, że podwyższenie stopienia podstawienia nośnika takiego jak białko, np. fibrynogenu będzie powodowało podwyższenie toksyczności koniugatu. Nieoczekiwanie, zastosowanie sposobu modyfikowania cząsteczki chemicznej będącego przedmiotem wynalazku, do otrzymywania koniugatów lek-białko, zapewniając wiązanie

PL 195 813 B1 leku poprzez tylko jedną z dostępnych dwóch grup karboksylowych, powoduje, że koniugaty są bardziej polarne. Dzięki temu w miejscu wiązania leku z białkiem pozostaje jedna wolna grupa karboksylowa leku. Przyczynia się ona do nieznacznego obniżenia punktu izoelektrycznego białka. Pośrednio, przyczynia się to również do obniżenia liczby I rzędowych grup aminowych białka, które są angażowane w reakcję otrzymania koniugatów o tym samym stopniu podstawienia. Nie występuje zjawisko wiązania jednej cząsteczki leku z dwoma grupami aminowymi. W koniugatach otrzymanych zgodnie z wynalazkiem, uwypukleniu ulegają cechy wybiórczości nośnika dzięki słabszym nieswoistym oddziaływaniom koniugatów z hydrofobowymi składowymi organizmu (lipidy, lipoproteidy, błony komórkowe, tłuszcze), natomiast cząsteczki haptenów np. leków, zawarte w otrzymywanych koniugatach są korzystnie stosunkowo łatwo uwalniane z koniugatów w warunkach in-vivo.

Przykład 1. Aktywacja metotreksatu

Do 45,5 mg metotreksatu w 0,5 ml dimetyloformamidu dodaje się 18,5 mg dicykloheksylokarbodiimidu. Po 24 godzinnej reakcji w temperaturze +4°C do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 30 mg N-hydroksysukcynimidu. Po 2 godzinach mieszaninę reakcyjną wiruje się w chłodzonej wirówce. Zawarty w supernatancie aktywny ester wykorzystuje się do reakcji koniugowania metotreksatu z nośnikiem.

Przykład 2. Otrzymywania koniugatów metotreksatu z białkami

Białko o stężeniu 3-20 mg/ml w 0,1 M roztworze kwaśnego węglanu sodu miesza się w różnych proporcjach z roztworem aktywnego estru. Stopień podstawienia lekiem zależy od proporcji dodanych reagentów, od pH środowiska reakcji, od rodzaju białka. Najlepsze wyniki uzyskuje się prowadząc reakcję w pH od 4,5 do 9 i temperaturze od 0do 40°C. Po kilkuminutowej reakcji aktywnego estru leku z białkiem koniugat poddaje się oczyszczaniu tradycyjnymi metodami.

Przykład 3. Aktywacja tomudeksu (Raltitrexed)

Do 4 mg tomudeksu w 0,1 ml dimetyloformamidu dodaje się 1,4 mg dicykloheksylokarbodiimidu. Po 40 godzinnej reakcji w temperaturze +4°C do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 3 mg N-hydroksysukcynimidu. Po 2 godzinach mieszaninę reakcyjną wymraża się w -6°C. Roztwór znad osadu zawierający aktywny ester wykorzystuje się do reakcji koniugowania tomudeksu z białkiem.

Przykład 4. Otrzymywanie koniugatów tumodeksu z białkami, w tym immunoglobulinami i przeciwciałami

Białko o stężeniu 3-20 mg/ml w 0,1 M roztworze kwaśnego węglanu sodu miesza się w różnych proporcjach z roztworem aktywnego estru. Stopień podstawienia lekiem zależy od proporcji dodanych reagentów, od pH środowiska reakcji, od rodzaju białka. Najlepsze wyniki uzyskuje się prowadząc reakcję w pH od 4,5 do 9 i temperaturze od 0do 40°C. Po kilkuminutowej reakcji aktywnego estru leku z białkiem koniugat poddaje się oczyszczaniu tradycyjnymi metodami. Wydajność reakcji zależy od pH środowiska reakcji i jest wyższa w pH 7 w porównaniu z pH 8,3. Prowadzenie reakcji w wyższym pH niweluje wewnątrz i międzycząsteczkowe sieciowania koniugatów.

Zakładany stopień podstawienia białka lekiem osiąga się dobierając odpowiednie proporcje molowe aktywowanego leku do białka i pH środowiska reakcji.

Przykład 5. Stabilność koniugatów

Koniugaty, otrzymane tak jak opisano powyżej, są stabilne w stanie zamrożenia -20°C w pH 4,7 oraz 10 pH, z koniugatów przechowywanych w temperaturze 37°C w pH 4, 7 i 10 w pierwszej dobie uwalnia się do 20% związanego leku. Dalsze przechowywanie koniugatów nie wpływa istotnie na uwalnianie leku. Koniugaty przechowywane w pH 10 charakteryzowały się wyższą stabilnością. Po 23 dniach uwalniało się tylko 2% leku. Najbardziej stabilne były koniugaty przechowywane w pH 4i17. Po23 dniach uwalniało się 12 i 10% związanego leku.

Przykład 6. Testy aktywności koniugatów

Aktywność przeciwnowotworową koniugatów fibrynogenu z metotreksatem, otrzymanych jak opisano powyżej, testowano na modelu białaczki mysiej P388. Terapia koniugatami istotnie statystycznie przedłużała czas przeżycia myszy (czas przeżycia zwierząt w grupie leczonej koniugatem 23,2 dnia) względem grupy kontrolnej (czas przeżycia zwierząt w grupie kontrolnej 12,4 dnia) (P<0,05) i względem grupy leczonej analogiczną dawką metotreksatu (P<0,05) (czas przeżycia zwierząt w grupie leczonej metotreksatem 15,8 dnia). Jedna cząsteczka fibrynogenu zawierała 11,2 moli leku. Wcześniejsze opracowanie (Boratyński 2000) wskazywało, że tak wysoki stopień podstawienia fibrynogenu będzie powodował toksyczne działanie preparatu. Jednak wiązanie leku poprzez tylko jedną z dwóch grup karboksylowych spowodowało, iż koniugaty są bardziej polarne. Przemawiają za tym następujące dane:

PL 195 813 B1

W miejscu wiązania leku z białkiem pozostaje jedna wolna grupa karboksylowa leku. Przyczynia się ona do nieznacznego obniżenia punktu izoelektrycznego białka.

Niezależnie mniejsza liczba I rzędowych grup aminowych białka jest angażowana w reakcję otrzymania koniugatów o tym samym stopniu podstawienia. Nie występuje zjawisko wiązania jednej cząsteczki leku z dwoma grupami aminowymi. W koniugatach otrzymanych według nowej procedury uwypukleniu ulegają cechy wybiórczości nośnika dzięki słabszym nieswoistym oddziaływaniom koniugatów z hydrofobowymi składowymi organizmu (lipidy, lipoproteidy, błony komórkowe, tłuszcze). Obok grup aminowych również inne grupy funkcyjne białek (na przykład grupy hydroksylowe) reagują z aktywnymi formami leków. Jednak to wiązanie jest niestabilne.

Na aktywność biologiczną koniugatów ma wpływ stabilność wiązania lek-nośnik. W przypadku opisywanych koniugatów wiązanie lek nośnik jest stabilne w temperaturze -20°C natomiast w temperaturze +37°C następuje uwalnianie leku z nośnika.

Literatura:

Boratyński J., Opolski A., Wietrzyk J., Górski A., Radzikowski C.: „Cytotoxic and antitumor effect of fibrinogen-methotrexate conjugate”. Cancer Letters 2000, 148: 189-195.

Boratyński J., Myc A.: „Nowa metoda otrzymywania koniugatów z lekami przeciwnowotworowymi”. Patent PRL 130458.

Boratyński J.: „Sposób otrzymywania koniugatu hapten-nośnik”. Patent 352435.

Duncan R., Gac-Breton S., Keane R., Musila R., Sat Y.N., Satchi R., Searle F.: “Polymer-drug conjugates, PDEPT and PELT: basic principles for design and transfer from the laboratory to clinic”. J. Control. Release. 2001, 74(1-3): 135-46.

Hartung G., Stehle G., Sinn H., Wunder A., Schrenk H. H., Heeger S., Kranzle M., Edler L., Frei E., Fiebig H.H., Heene D.L., Maier-Borst W., Quiesser W.: „Phase I trial of methotreksate-albumin in weekly intervenous bolus regimen in cancer patients. Phase I Study Group of the Association for Medical Onkology of the German Cancer Society”. Clin. Cancer Res. 1999, 5: 753-759.

Matthay K.K., Panina C., Huberty J., Price D., Glidden D.V., Tang H.R., Hawkins R.A., Veatch J., Hasegawa B.: „Correlation of tumor and whole-body dosimetry with tumor response and toxicity in refractory neuroblastoma treated with (131)I-MIBG”. J. Nucl. Med. 2001, 42(11): 1713-21.

Meerum Terwogt J.M., ten Bokkel Huinink W.W., Schellens J.H., Schot M., Mandjes I.A., Zurlo M.G., Rocchetti M., Rosing H., Koopman F.J., Beijnen J.H.: „Phase I clinical and pharmacokinetic study of PNU166945, a novel water-soluble polymer-conjugated prodrug of paclitaxel”. Anticancer Drugs. 2001, 12(4): 315-23.

Smith S.: „Technology evaluation: SGN-15, Seattle Genetics Inc”. Curr. Opin. Mol. Ther. 2001, 3(3): 295-302.

Weiden P.L., i Breitz H.B.: „Pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) for treatment of nonHodgkin's lymphoma (NHL)”. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001, 40(1): 37-51.

Claims

1. Sposób modyfikacji cząsteczki chemicznej posiadającej co najmniej jedną dostępną grupę aminową, znamienny tym, że do sprzęgania z grupami aminowymi wykorzystuje się związek dikarboksylowy, który w pierwszym etapie przeprowadza się w formę bezwodnika, a następnie w reakcji z alkoholem przeprowadza się w formę aktywnego estru, po czym zapewniając pH od 4,5 do 9 i temperaturę od 0 do 40°C miesza się z roztworem poddawanych modyfikacji cząsteczek, przy czym tylko jedna grupa karboksylowa sprzęganego związku dikarboksylowego jest zdolna do efektywnej reakcji.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związkiem dikarboksylowym jest metotreksat albo tomudeks, a modyfikowana makrocząsteczka zawiera polipeptyd.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikowana makrocząsteczka jest białkiem.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że białkiem jest przeciwciało albo fibrynogen.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymany w reakcji czysty, nieposieciowany koniugat haptenu z nośnikiem białkowym, następnie rozpuszcza się lub zawiesza się w środowisku wodnym.