PL197647B1

PL197647B1 - Sposób wytwarzania mewinoliny

Info

Publication number: PL197647B1
Application number: PL336934A
Authority: PL
Inventors: Péter Seress; Gabor Balogh; Antal Olah; Laszló Cséke
Original assignee: Teva Gyogyszergyar Zartkoruen
Priority date: 1998-03-20
Filing date: 1999-03-19
Publication date: 2008-04-30
Also published as: US6197560B1; SI20079A; HU9800619D0; HU226966B1; WO1999049072A1; HRP990361A2; PL336934A1; HUP9800619A1; HRP990361B1; EP0983373A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania mewinoliny w procesie fermentacji obejmuj acym etap hodowli zarodo- wej i etap fermentacji zasadniczej szczepu z rodzaju Aspergillus, znamienny tym, ze szczep Aspergillus poddaje si e kontrolowanej metabolicznie hodowli wg lebnej, przy pH od 5,2 do 7,0, w tem- peraturze od 24 do 30°C, w pod lo zu zawieraj acym przyswajalne zród la w egla i azotu oraz sole mine- ralne, przy czym podczas przebiegu fazy fermentacji zasadniczej kontroluje si e ca lkowit a zawartosc substancji redukuj acych, wprowadza si e zród lo azotu organicznego i azotu nieorganicznego a tak ze kontroluje si e poziom piany w fermentorze oraz przeprowadza si e czesciowe zbieranie brzeczki. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania mewinoliny. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy biosyntezy czynnika obniżającego poziom cholesterolu, mewinoliny, przez pewne mikroorganizmy.

Mewinolina (lowastatyna; monakolina K; δ-lakton kwasu β,5-dihydroksy-7-[1,2,6,7,8,8a-heksahydro-2,6-dimetylo-8-(2-metylo-butyryloksy)-naftalen-1-ylo]-heptanowego) jest jednym z najważniejszych znanych czynników obniżających poziom cholesterolu. Mewinolina w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, obejmuje zarówno postać laktonu, jak i wolnego hydroksykwasu.

Jej otwarta postać hydroksykwasu jest silnym inhibitorem enzymu reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylokoenzymu A, który katalizuje tworzenie kwasu mewalonowego, wczesnego półproduktu biosyntezy cholesterolu. Mewinolina jest szczególnie korzystna, ponieważ w wyniku jej stosowania, nie ulegają akumulacji półprodukty biosyntezy o toksycznym szkielecie steroidowym, tworzone na późniejszym etapie biosyntezy. Mewinolina zwiększa liczbę receptorów LDL na powierzchni błony komórkowej, co usuwa cholesterol LDL krążący we krwi, w ten sposób indukując obniżanie poziomu cholesterolu w osoczu krwi.

Powszechnie składnik aktywny wytwarza się poprzez fermentację. Brytyjski opis patentowy numer 2046737 ujawnia, że składnik aktywny może być wytwarzany przez niektóre szczepy należące do rodzaju Monascus, np. M. ruber 1005 hodowany w temperaturze pomiędzy 7 a 40°C. Jako podłoże hodowlane stosowano wodny roztwór glukozy, peptonu, namoku kukurydzianego i chlorku amonowego. Fermentację prowadzono w ciągu 10 dni w warunkach tlenowych i uzyskiwano 87 mg mewinoliny z przesączu brzeczki o objętości 5 litrów.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 294 926 ujawnia biosyntezę mewinoliny korzystnie przez stosowanie mikroorganizmów zdeponowanych pod numerami ATCC 20541 lub 20542, należących do rodzaju Aspergillus terreus, w podłożu hodowlanym zawierającym jako źródło węgla węglowodany, np. glukozę, fruktozę, maltozę, źródła azotu, np. drożdże, hydrolizowane drożdże, hydrolizowaną kazeinę, namok kukurydziany; oraz sole mineralne, np. węglan wapnia, siarczan magnezu, kobalt, żelazo, sole manganowe, w temperaturze 20-37°C. Podobne procedury opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 420 491,4 342 767, 4 319 039 oraz 4 294 846, gdzie fermentacje prowadzi się w ciągu 3-5 dni w podłożach zawierających 1-6% węglowodanów i 0,2-6% źródła azotu.

Niemiecki opis patentowy numer 4 402 591 ujawnia biosyntezę mewinoliny przez mikroorganizmy należące do rodzaju Pleurotus, np. Pleurotus ostreatus, P. sapidus, P. saca, w temperaturze 25-35°C podczas hodowli w ciągu 7-14 dni w hodowlach powierzchniowych lub wgłębnych.

Kanadyjski opis patentowy numer 2 129 416 ujawnia przygotowywania mewinoliny lub, w szczególnym przypadku, mewastatyny, za pomocą mikroorganizmu należącego do rodzaju Coniothyrium, np. Coniothyrium fuckelii zdeponowanego pod numerem ATCC 74227 w podłożu hodowlanym zawierającym 3-15% glukozę, 0,5-4% pepton, 0,5-5% amylazę, 0,2-1% siarczan amonu, 0,010,1% siarczan magnezu, 0,05-0,2% czynnik przeciwpieniący, 0,2-1,5% L-izoleucynę, 0,2-1,5% kwas L-asparaginowy, w zakresie pH 5-6. Według przykładów, stężenie składnika aktywnego w brzeczce pozostawało w zakresie 19-430 mg/litr.

Węgierski opis patentowy numer 208 997 ujawnia stosowanie holotypu szczepu Aspergillus obsucurus oznaczonego numerem MV-1, zdeponowanego pod numerem NCAIM(P)F 001189. Fermentację korzystnie prowadzi się w podłożu zawierającym ekstrakt drożdżowy i/lub pepton i/lub kazeinę jako źródło(a) azotu, oraz glukozę i/lub maltozę lub sacharozę jako źródło(a) węgla. Aktywność brzeczki pod koniec hodowli na skalę laboratoryjną wynosi pomiędzy 400 a 850 mg/ml.

Powyższa dyskusja pozwala stwierdzić, że prace nad rozwojem biosyntezy mewinoliny skupiały się raczej na odkrywaniu nowych mikroorganizmów wytwarzających mewinolinę, niż na opracowywaniu samego procesu fermentacji. W kilku odnośnikach literaturowych ujawniono, że fermentacje można prowadzić w konwencjonalnych i znanych podłożach stosując namnażanie zarówno w hodowlach powierzchniowych, jak i na podłożach stałych. Stosowano procedury szarżowe, których przebieg zależał od warunków początkowych. Jednakże, ograniczenia techniczne, np. utrzymywanie najbardziej dogodnych poziomów składników, optymalnego dostarczania rozpuszczonego tlenu oraz pH itd., czyni trudnym stałe, właściwe utrzymywanie procesu dla zapewniania bardziej korzystnych warunków. Dany mikroorganizm podczas etapu fermentacji zasadniczej, zależnie od swojego metabolizmu, wymaga różnych warunków/składu podłoża dla uzyskania optymalnego wzrostu i wytwarzania składnika aktywnego. Autorzy niniejszego wynalazku wyciągnęli ze swoich doświadczeń wniosek, że w hodowli

197 647 B1 zarodowej oraz na początku fermentacji zasadniczej ilość aktywnej biomasy jest bardzo mała i zmienna. A zatem, wydajności fermentacji są stosunkowo niskie i zmienne. Wydajności osiągane pod koniec fermentacji, które zależą oczywiście od szczepu, nie przekraczają stężenia mewinoliny wynoszącego 850 mg/litr. Autorzy niniejszego wynalazku przeprowadzili szczegółową analizę całego procesu fermentacji od etapu hodowli zarodowej do zakończenia fermentacji. Stwierdzono, że na etapie przygotowywania hodowli zarodowej, zarówno w przypadku znanych podłóż, jak i sposobów wykonywania, ilość biomasy jest zbyt niska. Dlatego też, podczas fermentacji zasadniczej, metabolizm mikroorganizmu i hodowla nie są odpowiednie.

Dlatego też, celem wynalazku jest poprawa wydajności procesu fermentacji w wyniku którego wytwarza się mewinolinę przez wzmocnienie zdolności wytwarzania mikroorganizmu poprzez zmianę warunków i sposób prowadzenia fermentacji.

Innym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie, na jednym z lub na obu etapach hodowli zarodowej i fermentacji zasadniczej, warunków chemicznych i fizjologicznych najbardziej dogodnych dla metabolizmu mikroorganizmu.

Dalszym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie, na jednym z lub na obu etapach hodowli zarodowej i fermentacji zasadniczej, warunków chemicznych i fizjologicznych najbardziej dogodnych dla metabolizmu mikroorganizmu przez utrzymywanie stanu stabilnych warunków, szybkości wzrostu, a następnie, w ciągu wydłużonego czasu, maksymalnej szybkości tworzenia produktu.

Te i inne cele wynalazku uzyskuje się w niniejszym rozwiązaniu przez zapewnienie sposobu wytwarzania mewinoliny przez mikroorganizm w procesie fermentacji obejmującym etap hodowli zarodowej i etap fermentacji zasadniczej.

Niniejszy wynalazek dotyczy procesu fermentacji obejmującym etap hodowli zarodowej i etap fermentacji zasadniczej szczepu z rodzaju Aspergillus charakteryzujący się tym, że szczep Aspergillus poddaje się hodowli wgłębnej w pH pomiędzy 5,2 a 7,0, w temperaturze pomiędzy 24 a 30°C, w podłożu zawierającym przyswajalne źródła węgla i azotu oraz sole mineralne, przy czym w fazie fermentacji zasadniczej kontroluje się całkowitą zawartość substancji redukujących, wprowadza się źródła węgla organicznego i azotu nieorganicznego a także kontroluje się poziom piany w fermentorze oraz wprowadza się częściowe zbieranie brzeczki.

Korzystnie jako źródło węgla stosuje się w sposobie według wynalazku glukozę, hydrolizowaną skrobię i olej roślinny. Korzystnie, poziom stężenia glukozy utrzymuje się poniżej 0,2% od 60-tej godziny fermentacji. Podczas przebiegu procesu, wprowadza się źródła azotu, takie jak namok kukurydziany i roztwór wodorotlenku amonowego. pH korzystnie utrzymuje się w zakresie od około 5,2 do 6,2 przez wprowadzanie źródła węgla i/lub zasady, np. wodorotlenku amonowego i/lub wodorotlenku sodowego. Poziom piany w fermentorze można również kontrolować przez wprowadzanie do brzeczki oleju roślinnego, np. oleju słonecznikowego i/lub oleju sojowego, i/lub syntetycznego czynnika przeciwpieniący. Poziom rozpuszczonego tlenu korzystnie kontroluje się zmieniając szybkość mieszania i/lub szybkość napowietrzania. Podczas przebiegu fermentacji przeprowadza się jedno lub więcej usunięć części brzeczki.

W korzystnym rozwiązaniu, inokuluje się hodowlą zarodową podłoże do hodowli zasadniczej posiadające następujący skład:

Składnik	Ilość (% w/v)
glukoza	2-6
kwas fosforowy	0,002-0,006
kazeina kwaśna	0,2-0,8
namok kukurydziany	1,5-5
olej słonecznikowy	0,05-0,18
glikol polipropylenowy	0,05-0,18
pankreatyna*	0,002-0,008

* 4 razy aktywniejsza niż według Farmakopei Węgierskiej VII.

Podłoże hodowlane o powyższej kompozycji uzupełnia się regularnie stosując sole mikroi makroelementów, np. nieorganiczne sole sodu, potasu, magnezu i żelaza. Podłoże do hodowli za4

197 647 B1 sadniczej inokuluje się hodowlą zarodową, przy czym czas prowadzenia hodowli zarodowej wydłuża się o 10-25%. Na etapie przenoszenia hodowli zarodowej, pH jest w fazie zwiększania się po osiągnięciu wartości minimalnej.

Do fermentacji korzystnie stosuje się szczep Aspergillus obscurus, jego wariant lub jego mutanta, a korzystniej holotyp szczepu Aspergillus obscurus n. sp. MV-1 zdeponowany pod numerem kodowym NCAIM(P)F 001189.

Hodowlą zarodową, prowadzoną przez wydłużony czas, można inokulować jałowe podłoże do fermentacji zasadniczej w fazie zwiększania się pH po osiągnięciu wartości minimalnej. Na etapie fermentacji zasadniczej warunki „stanu stabilizacji zapewniające maksymalną szybkość wytwarzania składnika aktywnego można utrzymywać w ciągu długiego czasu przez wprowadzanie źródeł węgla i azotu w celu zaspokojenia potrzeb pokarmowych; kontrolowanie stężenia glukozy dla unikania niepożądanego gęstnienia hodowli i nadmiernego wzrostu biomasy; kontrolowanie szybkości mieszania i szybkości napowietrzania, zgodnie z zapotrzebowaniem na tlen; połączenie kontroli poziomu piany z zapotrzebowaniem na źródło węgla przez stosowanie substancji odpowiedniej do obu celów, np. mieszaniny oleju roślinnego i czynnika syntetycznego; utrzymywanie pH w zakresie od około 5,2 do 6,2 przez wprowadzanie źródła węgla, np. syropu glukozowego, bądź zasady oraz przeprowadzenie jednego lub więcej usunięć części brzeczki, gdy uzyskuje się maksymalną objętość roboczą fermentora, lub gdy osiąga się stężenie mewinoliny wystarczające z ekonomicznego punktu widzenia do przeprowadzenia dalszej obróbki.

Stosując te elementy, można prowadzić proces fermentacji, który można wszechstronnie kontrolować, i który opierając się na cyklu życiowym może zapewnić dobrze dobrane stałe środowisko dla mikroorganizmu.

Zgodnie z opisanym powyżej rozwiązaniem, sposób według niniejszego wynalazku posiada przewagę w stosunku do znanych procesów, zużywając znacząco mniej surowców i energii oraz obniżając ilość zanieczyszczających środowisko ścieków w stosunku do jednostki masy materiału aktywnego oraz zapewniając lepsze wykorzystanie fermentora.

W poniższych przykładach porównuje się biosyntezę mewinoliny według sposobu ujawnionego w węgierskim opisie patentowym numer 208997 (Porównawczy przykład 1) ze sposobem według korzystnego rozwiązania według niniejszego wynalazku (przykład 2).

Twórcy wynalazku stwierdzili, że optymalną biosyntezę mewinoliny można przeprowadzić dzięki doprowadzeniu do określonej wartości jednego lub więcej z pewnych parametrów, etapów i/lub zmiennych procesu, na jednym z lub na obu etapach, hodowli zarodowej i fermentacji zasadniczej, procesu biosyntezy.

Twórcy wynalazku stwierdzili, że podczas fazy hodowli zarodowej te parametry, etapy i/lub zmienne procesu obejmują dostarczanie mikroorganizmowi koniecznych składników podłoża w łatwo przyswajalnej postaci i w najbardziej odpowiednim stężeniu oraz wydłużenie czasu hodowli o około 10 do około 25%.

Twórcy wynalazku stwierdzili, że w celu uzyskania stanu stabilnych warunków podczas etapu fermentacji zasadniczej, te parametry, etapy i/lub zmienne procesu obejmują kontrolowanie zawartości glukozy i/lub całkowitej zawartości cukrów redukujących, utrzymywanie źródeł węgla na odpowiednim poziomie minimalnym, wprowadzanie źródeł azotu organicznego i/lub nieorganicznego, kontrolowanie pH, kontrolowanie poziomu piany, kontrolowanie masy brzeczki przez usuwanie części i wprowadzanie oraz kontrolowanie poziomu rozpuszczalnego tlenu przez zmianę szybkości mieszania i/lub szybkości napowietrzania.

W celu optymalizacji biosyntezy mewinoliny nie jest konieczne, aby wszystkie z wymienionych powyżej parametrów, etapów i/lub zmiennych procesu dla albo fazy hodowli zarodowej, albo etapu fermentacji zasadniczej, były jednocześnie doprowadzane do określonej wartości. Jednakże, w korzystnym rozwiązaniu niniejszego wynalazku, biosynteza mewinoliny obejmuje każdy z wymienionych powyżej parametrów, etapów i/lub zmiennych procesu. W takim korzystnym rozwiązaniu, można prowadzić korzystny proces metabolicznie kontrolowanej fermentacji mewinoliny, w którym można szybko osiągnąć stan stabilnych warunków, tj. stałe pH, stężenie glukozy, stężenie rozpuszczonego tlenu, lepkość, objętość itp., oraz który można utrzymywać w ciągu długiego czasu, zapewniając wydajność znacznie przekraczającą wyniki znanych procesów.

Pewne korzyści można osiągnąć na etapie hodowli zarodowej przez doprowadzenie do określonej wartości na tym etapie jednego lub więcej z wymienionych powyżej parametrów, etapów lub zmiennych. Korzyści te obejmują np. zmniejszenie czasu wymaganego do osiągnięcia „stanu stabil197 647 B1 nych warunków o około 20-30% poprzez zwiększenie liczby ośrodków wzrostu oraz wzrost aktywnej biomasy w korzystniejszej postaci morfologicznej, czego wynikiem stają się bardziej sprzyjające warunki hodowli mikroorganizmu. W wyniku osiągnięcia tych korzyści i wydłużonego czasu hodowli, stężenie aktywnej biomasy ulega prawie podwojeniu.

Pewne korzyści można osiągnąć na etapie fermentacji zasadniczej przez doprowadzenie do określonej wartości na tym etapie jednego lub więcej z wymienionych powyżej parametrów, etapów lub zmiennych. Korzyści te obejmują np. szybszą i z mniejszymi wahaniami fazę wzrostu oraz szybkie osiągnięcie etapu stanu stabilizacji, który można utrzymywać w ciągu długiego czasu. Wynikiem osiągnięcia tych korzyści jest znacząco zwiększona aktywność fermentacji.

Porównawczy przykład 1

Biosynteza mewinoliny zgodnie z węgierskim opisem patentowym numer 208997

W naczyniu o pojemności 600 litrów przygotowano podłoże do hodowli zarodowej o następującym składzie:

Składnik	Ilość (%)
glukoza	4,0
pepton kazeinowy	0,5
NaNO3	0,3
KH2PO4	0,2
KCl	0,05
MgSO4 -7H2O	0,05
FeSO4 ·7H2O	0,001

Inokulum przygotowano przez zaszczepienie zawiesiną zarodników szczepu Aspergillus obscurus, zawierającą 6,5 x 10⁹ zarodników. Parametry procesu hodowli zarodowej były następujące:

Parametr	Wartość
Objętość	400 litrów
Temperatura	27°C
Szybkość napowietrzania	20 normalnych m³/h
Ciśnienie wewnętrzne	0,5 bara
Szybkość mieszania	320 obrotów na minutę

Przeniesienie hodowli zarodowej do podłoża do fermentacji zasadniczej przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami po 36 godzinach, kiedy pH obniżyło się do poziomu 5,6. Objętość biomasy w postaci odwirowanego osadu komórek (PCV) wynosiła 14%.

Powyższą hodowlą zarodową zaszczepiono podłoże do fermentacji zasadniczej oznaczone MEF-03, przy czym inokulum stanowiło 10% objętości. Skład podłoża do fermentacji zasadniczej był następujący:

197 647 B1

Składnik	Ilość (%)
Monowodzian dekstrozy	1,0
Kazeina kwaśna	0,2
Skrobia kukurydziana	8
Mączka sojowa	1,5
Namok kukurydziany (50%)	1
Chlorek sodowy	1
Fosforan jednopotasowy	0,2
Glutaminian sodowy	1,2
Olej słonecznikowy	0,16
Glikol polipropylenowy	0,16
Pankreatyna*	0,002
Enzym BAN 240	0,007
CaCl2	0,02
Wodorotlenek potasowy	do ustawienia pH

* 4 razy silniejsza niż według Farmakopei Węgierskiej VII Objętość w czasie 0:500 litrów.

Fermentację prowadzi się w ciągu 7 dni. Szybkości napowietrzania i mieszania są następujące:

Napowietrzanie*	Szybkość mieszania*
18-25 normalnych rrP/h	180-320 obrotów na minutę

* Rozpuszczony tlen utrzymuje się na poziomie powyżej 40% wartości nasycenia.

Podczas przebiegu fermentacji, dodaje się 4 porcje, o masie 50 kg, enzymatycznie upłynnionej skrobi kukurydzianej zgodnie ze schematem: w 50, 73, 90 i 108 godzinie.

Dane dotyczące wytwarzania składnika aktywnego:

Czas fermentacji: 164 godziny. Aktywność mierzona HPLC: 927 mg/kg. Ilość brzeczki: 580 kg. W konsekwencji powyższego, ilość uzyskanego w wyniku fermentacji składnika aktywnego wynosi ^{0,58 t}on^y x ^{927 g/t}on^ę/1000/1 m³ = ^{0,54 kg/}m³ o^bj^ęto^śc cafcowrtej.

P r z y k ł a d 2

Biosynteza mewinoliny z dodatkiem syropu glukozowego i źródła azotu i kontrolowaniem pH wodorotlenkiem sodowym lub wodorotlenkiem amonowym

Składnik	(%)
glukoza	4,0
pepton kazeinowy	0,5
namok kukurydziany (50%)	3,0
NaNO3	0,3
KH2PO4	0,2
KCl	0,05
MgSO4 ·7H2O	0,05
FeSO4 ·7H2O	0,001
pankreatyna*	0,005
glikol polipropylenowy	0,1
olej słonecznikowy	0,1

* 4 razy silniejsza niż według Farmakopei Węgierskiej VII

197 647 B1

Zaszczepienie przeprowadzono stosując zawiesinę zarodników szczepu Aspergillus obscurus zawierającą 6,5 x 10⁹ zarodników. Parametry procesu hodowli zarodowej były takie same jak przedstawiono w Porównawczym przykładzie 1.

Jednakże, przeniesienie hodowli zarodowej przeprowadzono inaczej niż przeniesienie opisane w Porównawczym przykładzie 1. Przeniesienie przeprowadzono po 40 godzinach. pH osiągnęło minimalną wartość (pH 4,9), a przeniesienie odbyło się na etapie kiedy pH zaczęło rosnąć i osiągnęło wartość około 5,0. A zatem, pH wzrosło około 0,1 w stosunku do swojej wartości minimalnej. Objętość biomasy w postaci odwirowanego osadu komórek (PCV) wynosiła 24%.

Powyższą hodowlą zarodową zaszczepiono podłoże do fermentacji zasadniczej, przy czym inokulum stanowiło 10% objętości. Skład podłoża do fermentacji głównej był następujący:

Składnik	Ilość (%)
skrobia kukurydziana	8
syrop glukozowy*	1,0
kazeina kwaśna	0,2
mączka sojowa	1,5
namok kukurydziany (50%)	1
chlorek sodowy	1
fosforan jednopotasowy	0,2
glutaminian sodowy	1,2
olej słonecznikowy	0,16
glikol polipropylenowy	0,16
pankreatyna*	0,002
Wodorotlenek potasowy	do ustawienia pH

* dodano 25 kg w postaci 25% syropu glukozowego razy silniejsza niż według Farmakopei Węgierskiej VII

Fermentację prowadzono w ciągu 13 dni. Szybkości napowietrzania i mieszania są następujące:

Napowietrzanie*	Szybkość mieszania*
minimalnie 12, maksymalnie 32 normalnych rrP/h	minimalnie 220, maksymalnie 400 obrotów na minutę

* Rozpuszczony tlen utrzymywano na poziomie powyżej 40% wartości nasycenia przede wszystkim metodą napowietrzania.

Podczas przebiegu fermentacji, utrzymywanie poziomu rozpuszczonego tlenu jest bardzo ważne. W najintensywniejszym etapie, można to osiągnąć przez stosowanie szybkości napowietrzania wynoszącej około 25-32 normalnych m³/h i szybkości mieszania wynoszącej 300-400 obrotów na minutę.

Podczas etapu fermentacji zasadniczej, temperatura wynosiła 27±2°C, ciśnienie wewnętrzne wynosiło 0,4 bara, a czas hodowli 309 godzin.

W czasie przebiegu fermentacji wprowadzano następujące składniki odżywcze:

1. Hydrollzowaną skrobię kukurydzianą (syrop glukozowy) przygotowuje się przez traktowanie enzymatyczne i kwasem solnym, a następnie wprowadza się. Surowce stosowane do przygotowania syropu glukozowego były następujące: 25% skrobia kukurydziana, 0,3-0,4% CaCl₂, 0,1-0,2% enzym amylaza (BAN) i 1% stężony kwas solny. Wprowadzanie syropu glukozowego rozpoczynano na etapie wzrostu pH, po osiągnięciu jego minimalnej wartości (5,0), w 45 godzinie i przy pH o wartości 5,6. Wprowadzanie prowadzano w sposób ciągły, utrzymując pH w zakresie od 5,4 do 5,8. Minimalna szybkość wprowadzania wynosiła 0,5 litra/godzinę, a maksymalna szybkość wprowadzania wynosiła 5 litrów/godzinę.

2. Roztwór NaOH lub NH..OHwprowadzanow ce^lLukt^rni^c^lc^tw^rnEa pH, kiedy pH spadałoponiżej 5,5 w dodatku do wprowadzania z minimalną szybkością syropu glukozowego.

3. N^rm^l^ kukur/dziany(1 %) wprowadzanopo100 godzinachfefmentacjj (w ordi^i^^i^r^iLudool^^ jętości w godzinie 0).

197 647 B1

Dane dotyczące wytwarzania składnika aktywnego:

Czas fermentacji: 309 godzin. Aktywność mierzona HPLC: 2868 mg/kg. Ilość brzeczki: 680 kg. W konsekwencji powyższego, ilość uzyskanego w wyniku fermentacji składnika aktywnego wynosi ^0,68 ton^y x ^{2868 g/}ton^ę/1^000/1 m³ = 1^,95 ^kg/m³ o^ętoto cafcowrtej.

P r z y k ł a d 3

Biosynteza mewinoliny z wprowadzaniem, kontrolowaniem i usuwaniem

Holotyp szczepu Aspergillus obscurus n. sp. MV-1 hodowano w jałowym podłożu inokulacyjnym o następującym składzie :

Składnik	(%)
glukoza	4,0
kwas fosforowy	0,0035
kwaśna kazeina	0,5
namok kukurydziany (50%)	3,0
NaNO3	0,3
KH2PO4	0,2
KCl	0,05
MgSO4 ·7H2O	0,05
FeSO4 ·7H2O	0,001
olej słonecznikowy	0,1
glikol polipropylenowy	0,1
pankreatyna*	0,005
wodorotlenek potasowy	do ustawienia pH
kwas solny	do ustawienia pH

* 4 razy silniejsza niż według Farmakopei Węgierskiej VII

Podczas etapu przygotowywania inokulum stosowano następujące parametry procesu:

Parametr	Wartość
Objętość	8 ^m3
Szybkość mieszania	120 obrotów na minutę
Napowietrzanie	⁴⁰⁰±⁵⁰ norma^ln^yc^h m^3/h
Ciśnienie wewnętrzne	0,410,1 bara
Temperatura	27±2°C

Inokulum przeniesiono po tym, jak pH osiągnęło minimalną wartość (pH 4,8), a następnie jego wartość wynosiła 0,1 jednostki powyżej minimum, to jest kiedy pH osiągnęło wartość 4,9. Objętość biomasy w postaci odwirowanego osadu komórek (PCV) wynosiła 24%. Przy 8% szybkości przenoszenia, inokulum przeniesiono do podłoża do fermentacji zasadniczej o następującym składzie:

197 647 B1

Składnik	Ilość (%)
mączka sojowa	1,28-1,57
suma skrobi kukurydzianej lub pszennej	9
kazeina kwaśna	0,20
namok kukurydziany (50%)	0,857-1,10
chlorek sodowy	1,0
fosforan jennoHotasowy	0,2
glutaminian sodowy	1,10-1,20
chlorek wapniowy	3^,8x10^-3
enzym BAN	2^,2x10^-3
olej słonecznikowy	0,10
glikol polipropylenowy	0,10
pankreatyna*	2^,0^χ10^-3
Wodorotlenek potasowy lub kwas solny	do ustawienia pH

* 4 razy silniejsza niż według Farmakopei Węgierskiej VII

Parametry procesu podczas etapu fermentacji zasadniczej były następujące:

Parametr	Wartość
Ciśnienie wewnętrzne	0,2±0,05 bara
Temperatura	27±2°C
Szybkość mieszania	60-85 obrotów na minutę
Napowietrzanie	1000^-0000 ^m3/y

Materiał zasilający

1. Źródło węęla: Wprowaadz się w sppoód ciąąły oOoło 40 ton hydrolizzwanej ssroOi, zzderadowanej w znacznym stopniu do uzyskania glukozy (syropu glukozowego) w postaci 25%. Surowce do przygotowania syropu glukozowego są następujące: 25% skrobia kukurydziana lub pszenna, 0,3% chlorku wapniowego, 0,3% enzymu BAN 200 i około 2% kwasu solnego.

2. Źródło aazou: Stonujesię nemon kukuryydiane t55%)dd prozygłowania t% jakło^weg tootwaru, w stosunku do objętości w 0 godzinie fermentacji, w objętości 5 m3

3. Zansaaddkontroloo/aniapH. to kontrolowania ftH stonujasię nieja-owa22-33% rootwabwał dorotlenku sodowego lub amoniaku.

Zasilanie

1. Ssroo glukoozo/a: waroo/aadznie roozpoczde sięnn ejoaie warontu ρΠ, ppooiągnięęiu jjeg minimalnej wartości. Syrop glukozowy wprowadza się w celu kontrolowania pH, tak aby pozostawało w zakresie od 5,0 do 5,8. Wprowadzanie glukozy przeprowadza się w postaci dawki lub w sposdb ciągły. Syrop glukozowy wprowadza się z szybkością pozostającą w zakresie od 0 do 1000 kg/godzinę, korzystnie w zakresie od 150 do 500 kg/godzinę. Kiedy nie można utrzymać minimalnego pH, mimo minimalnej szybkości podawania syropu glukozowego, konieczne jest wprowadzenie zasady w celu skorygowania pH.

2. Namc>o kukur'oydięr^e: Namok kukuróydięne wprowaadz sśę; w ppntoai j jen^ d^a^^i w okoto 100 godzinie. Dalsze dawki wprowadza się jeżeli istnieje taka potrzeba.

3. NaOH I ub NNHOH: Wproo/aadznie aznaad i kołóygo/anie pH prozeroo/aadz się, kóeed mimc> minimalnej szybkości wprowadzania syropu glukozowego, pH spada poniżej 5,5.

Poziom piany kontroluje się przez wprowadzenie mieszaniny oleju słonecznikowego: PPG w stosunku 95:5, aby nie dopuścić, żeby objętość piany przekroczyła 25% objętości roboczej fermentora.

Usuwanie części brzeczki z fermentora przeprowadza się w 112, 138, 178 i 200 godzinie, usuwając 0 razy 0 m³ brzeczki.

Dane dotyczące wytwarzania składnika aktywnego:

197 647 B1

Czas fermentacji: 226 godzin. Aktywność mierzona HPLC (część macierzysta): 1825 mg/kg. Zebrana aktywność (razem z aktywnościami w usuwanej podczas procesu brzeczce): 1788 mg/kg. W konsekwencji powyższego, ilość uzyskanego w wyniku fermentacji składnika aktywnego wynosi 95 ton x 1788 g/tonę/1000/105 m³ objętości całkowitej.

Claims

1. Sposób wytwarzania mewinoliny w procesie fermentacji obejmującym etap hodowll zarodowej i etap fermentacji zasadniczej szczepu z rodzaju Aspergillus, znamienny tym, że szczep Aspergillus poddaje się kontrolowanej metabolicznie hodowli wgłębnej, przy pH od 5,2 do 7,0, w temperaturze od 24 do 30°C, w podłożu zawierającym przyswajalne źródła węgla i azotu oraz sole mineralne, przy czym podczas przebiegu fazy fermentacji zasadniczej kontroluje się całkowitą zawartość substancji redukujących, wprowadza się źródło azotu organicznego i azotu nieorganicznego a także kontroluje się poziom piany w fermentorze oraz przeprowadza się częściowe zbieranie brzeczki.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako źródło węgla wprowadza się glukozę.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że zawartość glukozy kontroluje się utrzymując jej zawartość od 60-tej godziny do końca fermentacji na poziomie poniżej 0,2%.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako źródło węgla wprowadza się hydrolizowaną skrobię i/lub olej roślinny.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako źródło azotu wprowadza się namok kukurydziany i/lub wodorotlenek amonowy.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podczas przebiegu fazy fermentacjj zasadniczej kontroluje się pH tak, aby pozostawało w zakresie od 5,2 do 6,2.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że kontrolowanie pH przeprowadza się przez wprowadzanie źródeł węgla i/lub zasady.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako źródło zasady stosuje się wodorotlenek amonowy i/lub wodorotlenek metalu alkalicznego.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kontrolowanie poziomu piany przeprowadza się za pomocą oleju roślinnego lub czynnika syntetycznego.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że olejem rośllnnymjest olej słonecznikowy i/lub olej sojowy.

11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szybkość mieszania i/lub szybkość napowietrzania kontroluje się przez mieszanie i/lub napowietrzanie brzeczki fermentacyjnej.

12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inokulację fazy fermentaccj zasadniczej przeprowadza się hodowlą mikroorganizmu Aspergillus prowadzoną w następującym podłożu do hodowli zarodowej:

2-6% w/v 0,002-0,006% w/v 0,2-0,8% w/v 1,5-5% w/v 0,05-0,18% w/v glukoza kwas fosforowy kwaśna kazeina namok kukurydziany, 50% olej słonecznikowy pankreatyna, 4 razy aktywniejsza niż według Farmakopei Węgierskiej VII

0,002-0,008% w/v uzupełnione wodą i regularnie dodawanymi solami mikro- i makroelementów (np. nieorganicznymi solami sodu, potasu, magnezu i żelaza).

13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeniesienie hodowll zarodowej do fermantacji zasadniczej przeprowadza się, stosując wydłużony o 10-25% czas hodowli w stosunku do czasu wyjściowego i/lub w fazie wzrostu pH po osiągnięciu jego minimalnej wartości.

14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosowanym mikroorganizmem jest szczep Aspergillus obscurus, jego wariant lub mutant.

15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że mikroorganizmem stosowanym do fermentacji jest holotyp szczepu Aspergillus obscurus n. sp. MV-1 zdeponowany pod numerem dostępu NCAIM(P)F 001189.