PL197667B1

PL197667B1 - Sposób obniżania poziomu aktywnych biologicznie zanieczyszczeń lub patogenów w tkance, próbce białka lub w osoczu lub w surowicy

Info

Publication number: PL197667B1
Application number: PL358451A
Authority: PL
Inventors: Randall S. Kent; Edward A. Horton
Original assignee: Clearant
Priority date: 2000-03-23
Filing date: 2001-03-23
Publication date: 2008-04-30
Also published as: AU2001259031B2; CA2403834A1; EA200201012A1; EP1299131A4; CN1427729A; KR20030011279A; EP1762251A1; NZ521392A; JP2003527210A; BR0109764A; IL151881A0; US20030143106A1; EP1299131A1; WO2001070279A1; PL358451A1; ZA200208120B; MXPA02009321A; EA005977B1; AU5903101A

Abstract

1. Sposób obni zania poziomu aktywnych biolo- gicznie zanieczyszcze n lub patogenów w tkance, próbce bia lka lub w osoczu lub surowicy, znamienny tym, ze (i) dodaje si e do tkanki, próbki bia lka, osocza lub surowicy, przynajmniej dwa srodki stabilizuj ace wy- brane z grupy obejmuj acej: alkohol wielowodorotle- nowy i DMSO oraz (ii) na swietla si e tkank e, próbk e bia lka, osocze, lub surowic e dawk a promieniowania gamma odpo- wiedni a do obni zenia poziomu aktywnych biologi- cznych zanieczyszcze n lub patogenów. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu obniżania poziomu aktywnych biologicznie zanieczyszczeń lub patogenów w tkance, próbce białka lub w osoczu lub surowicy, zwłaszcza takich jak wirusy, bakterie, drożdże, pleśń, mikoplazma i/lub pasożyty.

Pewne produkty pozyskane z tkanek ludzkich, zwierzęcych lub uzyskane eksperymentalnie mogą zawierać niepożądane i potencjalnie niebezpieczne zanieczyszczenia, takie jak wirusy, bakterie, drożdże, mikoplazmę i pasożyty. Jest niezwykle ważne, aby przed użyciem produktu zanieczyszczenia biologiczne pozbawić aktywności. Jest to w szczególności krytyczne jeśli produkt jest podawany pacjentowi bezpośrednio, na przykład przy transfuzji krwi, transplantacji organów. Podobnie, w przypadku produktów inżynierii genetycznej, uzyskiwanych z organizmów hodowanych z różnymi typami osoczy, które mogą być skażone mikoplazmą lub wirusami.

Większość znanych procedur obejmowała badanie lub przeszukiwanie produktów pod kątem występowania konkretnych zanieczyszczeń biologicznych, zamiast ich usuwania bądź dezaktywacji. Produkty, w których wykryto obecność zanieczyszczeń biologicznych były wykluczane. Przykłady procedur badawczych obejmują testy na obecność konkretnego wirusa we krwi dawcy. Takie procedury nie zawsze są wiarygodne, gdyż nie umożliwiają wykrycia wirusów, jeśli występują one w bardzo małej ilości. Prowadzi to do zmniejszenia wartości lub pewności testu, z punktu widzenia konsekwencji związanych z nieprawdziwym wynikiem negatywnym. Fałszywe wyniki negatywne mogą w niektórych przypadkach, jak w przypadku zespołu nabytego upośledzenia odporności (AIDS), prowadzić do zagrożenia życia pacjenta. Ponadto, w niektórych przypadkach sprawdzenie obecności zanieczyszczeń biologicznych w produkcie zabiera kilka tygodni, a nawet miesięcy.

Nowsze rozwiązania koncentrowały się na sposobach ograniczenia lub dezaktywacji zanieczyszczeń biologicznych w produktach. Sposoby te obejmowały obróbkę ciepłem, filtrację oraz dodanie chemicznych środków dezaktywujących lub środków uczulających do produktu. Obróbka ciepłem wymaga podgrzania produktu do temperatury około 60°C przez około 70 godzin, co może jednak zniszczyć zbyt wrażliwe produkty. Dezaktywacja zanieczyszczeń za pomocą ciepła może prowadzić nawet do 50% spadku aktywności biologicznej produktu. Filtracja obejmuje przefiltrowanie produktu w celu fizycznego usunięcia zanieczyszczeń. Metoda ta może jednak prowadzić do usunięcia produktów o dużej masie cząsteczkowej. Ponadto, w niektórych przypadkach małe wirusy mogą nie zostać usunięte przez filtr ze względu na większą strukturę molekularną produktu. Procedury chemicznego uczulania obejmują dodanie czynników niszczących, które wiążą się z DNA/RNA wirusa, po czym po aktywowaniu za pomocą promieniowania UV lub jonizującego, w celu wytworzenia wolnych rodników, niszczą wiązania chemiczne szkieletu nici DNA/RNA wirusa lub tworzą kompleksy, uniemożliwiając replikację wirusa. W procedurze tej konieczne jest usunięcie z produktów komórkowych niezwiązanych czynników uczulających, gdyż są one toksyczne, nawet jeżeli nie mutagenne lub rakotwórcze, a więc nie mogą być podane pacjentowi.

Innym sposobem sterylizacji produktów jest ich napromieniowanie promieniowaniem gamma. Promieniowanie gamma jest skuteczne w niszczeniu wirusów i bakterii wówczas, kiedy jest ono podawane w dużych dawkach (Keathly i wsp: „Is There Life After Irradiation” Part 2, „BioPharm, lipiec - sierpień: 1993 oraz Leitmen, Use of Blood Cell Irradiation in the Prevention of Post Transfusion Graft-vs-Host Disease”, Transfusion Science 10 (1989), str. 219-239). Jednakże, zgodnie z literaturą naukową, promieniowanie gamma może być niszczące dla produktów czułych na promieniowanie, takich jak krew. W szczególności wykazano, że duże dawki promieniowania gamma mogą niszczyć czerwone krwinki, płytki krwi i granulocyty (Leitman). W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr US 4 620 908 ujawniono, że produkty białkowe, w celu utrzymania ich aktywności, muszą być przed napromieniowaniem zamrożone. W podsumowaniu tego patentu stwierdzono, że „jeżeli promieniowanie gamma zastosowano do produktu białkowego w temperaturze otoczenia, wówczas materiał ten zostanie całkowicie zniszczony, to znaczy jego aktywność zostaje na tyle obniżona, że staje się on nieskuteczny”. Jednakże wiele wrażliwych materiałów biologicznych może po zamrożeniu w celu napromieniowania, a następnie po odmrożeniu przed podaniem pacjentowi, stracić swą aktywność.

Ze względu na omówione powyżej trudności w uzyskaniu skutecznych sposobów sterylizacji materiałów biologicznych, istnieje potrzeba opracowania takich sposobów, które będą skutecznie redukowały poziom aktywnych biologicznie zanieczyszczeń, bez negatywnego wpływu na sterylizowany materiał biologiczny.

PL 197 667 B1

Celem wynalazku jest opracowanie takich sposobów sterylizacji materiałów biologicznych, które obniżą poziom aktywnych biologicznie zanieczyszczeń, bez negatywnego wpływu na materiał biologiczny. Inne cele, cechy i korzyści niniejszego wynalazku, przedstawiono w opisie przykładowych rozwiązań, lub mogą być wywiedzione ze stosowania wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób obniżania poziomu aktywnych biologicznie zanieczyszczeń lub patogenów w tkance, próbce białka lub w osoczu lub surowicy, który charakteryzuje się tym, że (i) dodaje się do tkanki, próbki białka, osocza lub surowicy, przynajmniej dwa środki stabilizujące wybrane z grupy obejmującej: alkohol wielowodorotlenowy i DMSO oraz naświetla się tkankę, próbkę białka, osocze, lub surowicę dawką promieniowania gamma odpowiednią do obniżenia poziomu aktywnych biologicznych zanieczyszczeń lub patogenów.

Korzystnie jako tkankę stosuje się tkankę twardą. W korzystnym rozwiązaniu jako tkankę twardą stosuje się tkankę wybraną z grupy obejmującej: kość, demineralizowaną substancję międzykomórkową kości, stawy, kości udowe, głowy kości udowej lub zęby. W innym korzystnym rozwiązaniu jako tkankę stosuje się tkankę miękką. Korzystniej jako tkankę miękką stosuje się tkankę wybraną z grupy obejmującej: szpik kostny, więzadła, ścięgna, nerwy, przeszczepy skóry, zastawki serca, chrząstkę, rogówkę, żyły i tętnice.

W innym korzystnym rozwiązaniu jako tkankę stosuje się połączenie tkanki miękkiej i tkanki twardej.

Korzystnie w czasie naświetlania stosuje się tkankę albo próbkę w temperaturze poniżej jej temperatury zamarzania. Ponadto korzystnie w czasie naświetlania utrzymuje się tkankę albo próbkę w atmosferze gazu obojętnego albo w próżni.

W korzystnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku stosuje się próbkę zawierającą przynajmniej jedno białko. Korzystnie jako białko stosuje się przeciwciało, immunoglobulinę, hormon, czynnik wzrostu, antykoagulant, czynnik krzepliwości krwi lub białko dopełniacza. Korzystniej jako czynnik krzepliwości krwi stosuje się trombinę, czynnik II, czynnik V, czynnik VII, czynnik Vlla, czynnik VIII, czynnik IX, czynnik X, czynnik XIII, czynnik Xllla, czynnik Von Willebranda, fibrynę i fibrinogen, a jako immunoglobulinę stosuje się immunoglobuliny poliklonalne lub monoklonalne lub ich mieszaniny. Jeszcze korzystniej jako immunoglobuliny stosuje się immunoglobulinę G, immunoglobulinę M, immunoglobulinę A, immunoglobulinę E lub ich mieszaniny. Zgodnie ze sposobem według wynalazku, korzystnie stosuje się białko wybrane z grupy obejmującej: białko C, białko S, alfa-1-anty-trypsynę (inhibitor proteazy alfa-1), heparynę, insulinę, butylo-cholinesterazę, warfarynę, streptokinazę, tkankowy aktywator plasminogenu (TPA), erytropoetynę (EPO), urokinazę, neupogen, antytrombinę-3, alfa-glukozydazę lub albuminę. Korzystnie stosuje się białko uzyskane metodami rekombinacyjnymi.

W sposobie według wynalazku korzystnie jako surowicę stosuje się bydlęcą surowicę płodową. W czasie naświetlania korzystnie utrzymuje się osocze lub surowicę w temperaturze poniżej jej temperatury zamarzania. Korzystnie w czasie naświetlania utrzymuje się osocze lub surowicę w atmosferze gazu obojętnego albo w próżni.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się stężenie przynajmniej dwóch środków stabilizujących wynoszące przynajmniej 20 mM albo przynajmniej 50 mM, albo przynajmniej 100 mM.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się alkohole wielowodorotlenowe wybrane z grupy obejmującej mannitol i trehalozę.

Ponadto korzystnie kontaktuje się tkankę, próbkę białka, osocze lub surowicę z jednym lub więcej środkiem zwiększającym czułość.

W korzystnym rozwiązaniu stosuje się tkankę, próbkę białka, osocze lub surowicę zawierające jeden lub więcej resztkowe roztwory, korzystnie wodę albo roztwór organiczny. Korzystnie obniża się ilość resztkowego roztworu przez liofilizację, a zawartość resztkowego roztworu jest mniejsza niż 2,0%, korzystnie mniejsza niż 1,0%, korzystnie mniejsza niż 0,5%, korzystnie mniejsza niż 0,2%.

Korzystnie stosuje się naświetlanie promieniami gamma na poziomie przynajmniej od 3,0 kGy/godzinę do 30,0 kGy/godzinę, korzystnie na poziomie przynajmniej od 3,0 kGy/godzinę, korzystnie przynajmniej od 6,0 kGy/godzinę, korzystnie przynajmniej od 16 kGy/godzinę, korzystnie przynajmniej od 30 kGy/godzinę, korzystnie przynajmniej od 45 kGy/godzinę.

Wynalazek przedstawiono w przykładzie rozwiązania na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia wykres ilustrujący ochronny wpływ pierwotnej i wtórnej liofilizacji na czułość przeciwciała monoklonalnego, fig. 2 - wykres ilustrujący ochronny wpływ liofilizacji i/lub stabilizatora na aktywność czynnika VIII, fig. 3 - chromatogram ilustrujący wpływ promieniowania gamma na albuminę.

PL 197 667 B1

Szczegółowy opis korzystnych rozwiązań wynalazku.

Definicje.

O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie użyte wyrażenia techniczne i naukowe mają takie same znaczenie pod jakim są one rozumiane przez specjalistów tej dziedziny. Przywołane opisy patentowe i publikacje są użyte jedynie jako odniesienie.

W zakresie wynalazku po pojęciem „materiał biologiczny” rozumie się każdy materiał uzyskany lub otrzymany z organizmu żywego. Przykłady materiału biologicznego obejmują między innymi: komórki; tkanki; krew i składniki krwi; białka, w tym białka rekombinacyjne i transgeniczne; produkty botaniczne; żywność i tym podobne. Korzystne przykłady materiału biologicznego obejmują między innymi: wiązadła; ścięgna; nerwy; kości, w tym zdemineralizowana substancja międzykomórkowa kości, przeszczepy, stawy, kości udowe, główki udowe, i tak dalej; zęby; przeszczepy skóry; szpik kostny, w tym zawiesiny komórkowe szpiku kostnego, całe lub przetworzone; zastawki sercowe; chrząstki; rogówki; tętnice i żyły; organy do transplantacji, takie jak serca, płuca, wątroby, nerki, jelita, trzustki, kończyny i palce; lipidy; węglowodany; kolagen. (macierzysty, fibrylowy, atelo-kolagen, rozpuszczalny lub nierozpuszczalny); chityna i jej pochodne, w tym chitozan i jego pochodne, jak NO-karboksychitozan (NOCC); komórki macierzyste; wyspy trzustkowe Langerhansa, i inne transplanty komórkowe, w tym komórki zmodyfikowane genetycznie; krwinki czerwone; krwinki białe, w tym monocyty i komórki macierzyste oraz płytki krwi.

Pod pojęciem „sterylizacja” rozumie się zmniejszenie poziomu przynajmniej jednej formy aktywnego biologicznie zanieczyszczenia obecnego w materiale biologicznym traktowanym zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Pod pojęciem „zanieczyszczenia biologiczne” rozumie się takie zanieczyszczenia, które w wyniku bezpośredniego lub pośredniego kontaktu z materiałem biologicznym mogą mieć działanie niepożądane. Takie zanieczyszczenia biologiczne obejmują różne wirusy, bakterie i pasożyty, które znane są specjalistom i które mogą być obecne w materiale biologicznym lub którymi materiał biologiczny, taki jak krew czy jej składniki, może zostać zainfekowany. Przykłady zanieczyszczeń biologicznych obejmują między innymi: wirusy, takie jak wirusy ludzkiego niedoboru odporności (HIV) i inne retrowirusy, wirusy opryszczki, paramiksowirusy, wirusy cytomegalii, wirusy wywołujące zapalenie wątroby (wirusowe zapalenie wątroby typu B i C), wirusy ospy, togawirusy, wirusy Epsteina-Barr i parwowirusy; bakterie, jak Escherichia, Bacillus, Campylobacter, Streptococcus i Stapholococcus; pasożyty, takie jak Trypanosoma i pasożyty malarii, w tym Plasmodium; drożdże; pleśnie; mikoplazma; oraz priony. Pod pojęciem „aktywne biologicznie zanieczyszczenia” rozumie się takie biologiczne zanieczyszczenia, która może powodować szkodliwe działanie.

Pod pojęciem „składniki krwi” rozumie się jeden lub więcej składników które mogą być wydzielone z krwi oraz które między innymi obejmują: komórkowe składniki krwi, takie jak krwinki czerwone, krwinki białe i płytki krwi; białka krwi, takie jak czynniki krzepnięcia krwi, enzymy, albuminy, plazminogen, fibrynogen i immunoglobuliny; oraz ciekłe składniki krwi, takie jak osocze i kompozycje zawierające osocze.

Pod pojęciem „komórkowe składniki krwi” rozumie się jeden lub więcej składników krwi, które stanowią komórki, takie jak krwinki czerwone, krwinki białe, lub płytki krwi.

Pod pojęciem „białka krwi” rozumie się jedno lub więcej białek występujących we krwi. Przykłady białek krwi znalezionych u ssaków (w tym u człowieka), obejmują między innymi: białka krzepnięcia (obydwa czynniki zależne od witaminy K, takie jak czynnik VII lub czynnik IX oraz czynniki niezależne od witaminy K, takie jak czynnik VIII i czynnik Willebranda), albuminy, lipoproteiny, globuliny (takie jak immunoglobuliny IgA, IgM, IgG i IgE) i tym podobne. Grupa białek krwi obejmuje: czynnik l (fibrynogen), czynnik II (protrombinę), czynnik III (tromboplastynę), czynnik IV (wapń), czynnik V (proakcelerynę), czynnik VI (akceirynę), czynnik VII (prokonwertynę, odpowiedzialną za przekształcenie protrombiny w surowicy), czynnik VIII (przeciwkrwiawiączkowy czynnik A), czynnik IX (przeciwkrwiawiączkowy czynnik B), czynnik X (Stuarta-Prowera), czynnik XI (PTA), czynnik XII (czynnik Hagemana), czynnik XIII (stabilizujący fibrynę), czynnik von Willebranda (vWF), czynnik la, czynnik IIa, czynnik Va, czynnik VIa, czynnik Vlla, czynnik Vllla, czynnik IXa, czynnik Xa i czynnik XIIIa.

Pod pojęciem „płynne składniki krwi” rozumie się jeden lub więcej płynnych bezkomórkowych składników krwi, takich jak osocze (płynne bezkomórkowe składniki krwi u ludzi lub zwierząt przed koagulacją), lub surowicę (płynne bezkomórkowe składniki krwi znajdowane u ludzi lub zwierząt po koagulacji).

PL 197 667 B1

Pod pojęciem „roztwór kompatybilny biologicznie” rozumie się roztwór z którym materiał biologicznie będzie miał kontakt, na przykład przez utworzenie zawiesiny lub rozpuszczenie materiału biologicznego w tym roztworze, przy zachowaniu żywotności materiału biologicznego, to jest charakterystyka biologiczna i fizjologiczna materiału biologicznego zostanie nie zmieniona. Takie roztwory kompatybilne biologicznie zawierają korzystnie skuteczną ilość przynajmniej jednego antykoagulanata.

Pod pojęciem „roztwór buforowy kompatybilny biologicznie” rozumie się roztwór kompatybilny biologicznie mający pH i właściwości osmotyczne (na przykład toniczność, osmolowość i/lub ciśnienie onkotyczne) odpowiednie do utrzymywania materiału biologicznego w niezmienionej formie. Odpowiednie roztwory buforujące kompatybilne biologicznie mają typowo pH w zakresie 5 do 8,5 oraz są izotoniczne lub umiarkowanie hipotoniczne lub hipertoniczne. Roztwory buforujące kompatybilne biologicznie są znane specjalistom i łatwo dostępne.

Pod pojęciem „stabilizator” rozumie się związek lub materiał, który zmniejsza uszkodzenia materiału biologicznego spowodowane zastosowaną dawką promieniowania, do poziomu, który jest na tyle mały, że nie powoduje wykluczenia bezpiecznego i efektywnego zastosowania materiału biologicznego.

Pod pojęciem „zawartość roztworu resztkowego” rozumie się ilość łatwo dostępnej cieczy w materiale biologicznym. Łatwo dostępna ciecz oznacza ciecz taką jak woda lub rozpuszczalnik organiczny (na przykład etanol, izopropanol, glikol polietylenowy i podobne), która jest obecna w materiale biologicznym w postaci niezwiązanej lub nie tworzącej kompleksów z jednym lub więcej nieciekłych składników materiału biologicznego (na przykład białkami, jonami metali, solami i tym podobnymi). Łatwo dostępna ciecz obejmuje również wodę wewnątrzkomórkową. Zawartość roztworu resztkowego odnosi się do poziomów wyznaczonych metodą FDA zmodyfikowaną przez Karla Fishera (Meyer i Boyd, Analytical Chem., 31 (1959) str. 215-219; May i wsp, J. Biol. Standardization 10 (1982) str. 249-259; Centers for Biologics Evaluation and Research, FDA, Docket No. 89D-0140 (1990) str.83-93).

Pod pojęciem „czynnik uczulający” rozumie się substancję, która jest skierowana selektywnie przeciwko zanieczyszczeniom wirusowym, bakteryjnym i/lub pasożytniczym, czyniąc je bardziej wrażliwymi na dezaktywację za pomocą promieniowania, co umożliwia zastosowanie mniejszych dawek i/lub krótszego czasu napromieniowania niż miałoby to miejsce w przypadku braku czynnika uczulającego. Przykłady odpowiednich czynników uczulających obejmują między innymi: psoralen, jego analogi i pochodne (w tym 3-karboetoksypsoraleny); angelicyny, khelliny i kumaryny, które zawierają podstawniki halogenowe i część cząsteczki rozpuszczalną w wodzie, taką jak poczwórny jon amonowy, jon fosfoniowy; związki wiążące się z kwasami nukleinowymi; bromohematoporfiryna; ftalocyjaniny; purpuryny; porforyny; estry pochodnych dihematoporfiryny z podstawionym atomem metalu lub halogenizowanych; pochodne hematoporfiryny, pochodne benzoporfiryny, dimaleimad hydrodibenzoporfiryny, hydrodibenzoporfiryna, disulfon dicyjanu, tetrakarboetoksyhydrodibenzoporfiryna oraz dipropionamid tetrakarboetoksyhydrodibenzoporfiryny; doksorubicyna i daunomycyna, które mogą być zmodyfikowane atomami metalu lub halogenu; netropsyna; peptyd BD; peptyd S2; S-303 (związki ALE); barwniki, takie jak hiperycyna, błękit metylenowy, eozyna, fluorosceiny (i ich pochodne), flawiny, merocyjanina 540, związki fotoaktywne, jak bergapten; oraz peptyd SE.

Pod pojęciem „materiał białkowy” rozumie się materiał komórki zawierający przynajmniej jedno białko lub peptyd. Materiał białkowy korzystnie składa się głównie z białek i/lub peptydów. Taki materiał może być materiałem występującym naturalnie, zarówno w swym stanie naturalnym, lub po przetworzeniu/oczyszczeniu i/lub przeprowadzeniu w pochodne. Materiał białkowy może być wytworzony sztucznie, w wyniku syntezy chemicznej, albo technikami rekombinacji/transgenicznymi. Taki materiał również może być poddany przetworzeniu/oczyszczeniu i/lub przeprowadzeniu w pochodne. Przykłady materiałów białkowych obejmują między innymi: białka/peptydy wytwarzane w hodowli tkankowej; mleko (produkty mleczarskie); płyn z wodobrzusza; hormony; czynniki wzrostu; materiały, takie jak leki pozyskane lub wyodrębnione z tkanek zwierzęcych (heparyna i insulina) lub materiał roślinny, osocze (w tym świeże, zamrożone i liofilizowane); fibrynogen; fibryna i/lub fibrynowe produkty uszczelniające; całkowita krew; białko C; białko S; antytrypsyna alfa-1 (inhibitor proteazy alfa-1); butylo-cholinoesteraza; antykoagulanty, jak leki zawierające kumarynę (warfarin); streptokinaza; tkankowy aktywator plazminogenu (TPA); erytropoetyna (EPO); urokinaza; neupogen; antytrombina-3; alfa-glukozydaza; (płodowa) surowica bydlęca/surowica końska; mięso; immunoglobuliny, w tym surowica odpornościowa; przeciwciała monoklonalne; przeciwciała poliklonalne i przeciwciała wytworzone lub uzyskane z wykorzystaniem inżynierii genetycznej; albuminy; globuliny alfa; globuliny beta; globuliny gamma; białka krzepnięcia; białka uzupełniające; oraz interferony.

PL 197 667 B1

Pod pojęciem „promieniowanie jonizujące” rozumie się promieniowanie o energii wystarczającej do jonizacji (czyli wytworzenia jonów) napromieniowanego materiału biologicznego. Rodzaje promieniowania obejmują między innymi: (i) promieniowanie korpuskularne (czyli strumienie cząsteczek subatomowych, takich jak neutronów, elektronów i/lub protonów); oraz (ii) promieniowanie elektromagnetyczne (powstające w zmiennym polu elektromagnetycznym, jak fale radiowe, światło widzialne i niewidzialne, promieniowanie X i promieniowanie gamma).

Szczególnie korzystne przykłady wykonania wynalazku

Materiał biologiczny sterylizowany sposobami według wynalazku może być materiałem otrzymanym lub pozyskanym z organizmu żywego lub martwego, który obejmuje materiał w stanie stałym lub ciekłym, lub materiały w postaci zawiesiny jakichkolwiek ciał stałych w cieczy, lub w postaci powłok jakichkolwiek materiałów w stanie stałym lub ciekłym na podłożu biologicznym lub niebiologicznym.

Zgodnie ze sposobami według wynalazku, zawartość rozpuszczalnika resztkowego materiału biologicznego jest redukowana przed napromieniowaniem materiału biologicznego promieniowaniem jonizującym. Zawartość rozpuszczalnika resztkowego jest redukowana do poziomu, który jest efektywny do ochrony materiału biologicznego przed promieniowaniem jonizującym. Właściwe poziomy zawartości rozpuszczalnika resztkowego są zmienne i zależą od natury i charakterystyk danego materiału biologicznego poddanego napromieniowaniu. Poziomy te mogą być wyznaczone przez specjalistów empirycznie.

Twórcy wynalazku uważają, iż redukcja zawartości rozpuszczalnika resztkowego zmniejsza stopnie swobody materiału biologicznego, chroniąc go tym samym przed promieniowaniem jonizującym. Podobny efekt, to jest zmniejszenie stopni swobody, może być uzyskany przez obniżenie temperatury materiału biologicznego poniżej jego punktu eutektycznego, lub poniżej jego temperatury zamarzania. Umożliwia to zastosowanie większych szybkościach napromieniowania niż było by to akceptowalne w innych przypadkach.

Zawartość rozpuszczalnika resztkowego materiału biologicznego może być zredukowana dowolnymi znanymi metodami i technikami dotyczącymi usuwania rozpuszczalnika z materiału biologicznego. Szczególnie korzystną metodą usuwania zawartości rozpuszczalnika resztkowego z materiału biologicznego jest liofilizacja. Zgodnie ze szczególnie korzystnym rozwiązaniem wynalazku, materiał biologiczny po liofilizacji, ale przed napromieniowaniem, jest przechowywany w próżni lub atmosferze obojętnej (korzystnie w atmosferze gazu szlachetnego, jak hel lub argon, korzystnie w atmosferze gazu szlachetnego o dużym ciężarze cząsteczkowym, najkorzystniej argonu).

Promieniowanie jonizujące wykorzystywane w sposobach według wynalazku może być dowolnym promieniowaniem efektywnym do dezaktywacji jednej lub więcej biologicznych zanieczyszczeń w materiale biologicznym poddanym obróbce. Promieniowaniem jonizującym jest korzystnie promieniowanie elektromagnetyczne, najkorzystniej promieniowanie gamma.

Zgodnie ze sposobami według wynalazku, w celu dezaktywacji jednej lub więcej zanieczyszczeń materiał biologiczny, ten ostatni jest napromieniowany promieniowaniem jonizującym z efektywną szybkością.

Stosowne szybkości napromieniowania mogą się zmieniać w zależności od rodzaju zastosowanego promieniowania, natury i charakterystyk materiału biologicznego poddanego działaniu promieniowania oraz zanieczyszczeń poddawanych dezaktywacji. Właściwe szybkości napromieniowania mogą być wyznaczone przez specjalistów empirycznie. Szybkość napromieniowania w czasie danej procedury sterylizacji jest korzystnie stała.

W korzystnym rozwiązaniu wynalazku, szybkość napromieniowania jest nie większa niż 3,0 kGy/h, korzystnie w zakresie między 0,1 kGy/h i 3,0 kGy/h, korzystniej w zakresie między 0,25 kGy/h i 2,0 kGy/h, jeszcze korzystniej w zakresie między 0,5 kGy/h i 1,5 kGy/h, a najkorzystniej w zakresie między 0,5 kGy/h i 1,0 kGy/h.

Materiał biologiczny jest napromieniowany w czasie efektywnym do dezaktywacji jednej lub więcej zanieczyszczeń zawartych w materiale biologicznym. Właściwe czasy jonizacji mogą się zmieniać w zależności rodzaju i szybkości promieniowania jonizującego, natury i charakterystyk materiału biologicznego poddanego napromieniowaniu oraz substancji skażającej poddawanej dezaktywacji. Właściwe czasy jonizacji mogą być wyznaczone przez specjalistów empirycznie.

P r z y k ł a d y

Poniższe przykłady wykonania wynalazku przedstawiono jedynie w celach ilustracyjnych i nie powinny ograniczać jego istoty. Specjaliści tej dziedziny mogą na podstawie istoty wynalazku i zakresu ochrony dokonać szereg różnych modyfikacji i adaptacji niniejszego wynalazku.

PL 197 667 B1

P r z y k ł a d 1

Sterylizacja krwi

Użyto 200 ml opakowanie jednodniowych krwinek czerwonych. Do krwinek dodano etanol w celu uzyskania końcowego stężenia etanolu 0,01% obj./obj.. Krwinki czerwone rozcieńczono w stosunku jeden do dziesięciu zmodyfikowanym roztworem obejmującym dekstrozę, fosforan i cytrynian (CPC), o pH około 6,4 do 6,7, mającym następujący skład (w całkowitej objętości 500 ml):

Jednowodzian kwasu cytrynowego 0,2 g

Dwuwodzian cytrynianu sodu 27,3 g

Fosforan jednozasadowy sodu 2,2 g

Fosforan dwuzasadowy sodu 1,0 g

Dekstroza 3,2 g

Krwinki zostały napromieniowane komercyjnym generatorem promieniowania gamma wyposażonym w kobaltowe źródło promieniowania Co⁶⁰. Napromieniowanie zostało wykonane bez nośnika w niechronionym pudełku. Krwinki zostały napromieniowane z szybkością 1 kGy/godzinę przez 24 godziny. Po napromieniowaniu krwinki czerwone zostały przebadane wizualnie. Wyniki tych badań wykazały zachowanie przez te krwinki żywotności i znakomitego koloru czerwonego. Kontrolna próbka opakowania krwinek czerwonych, która nie została rozcieńczona w powyższym roztworze CPD, utraciła po napromieniowaniu żywotność.

Cztery dni po napromieniowaniu, rozcieńczone krwinki czerwone zostały przebadane pod kątem zawartości różnych składników krwi. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Próbka kontrolna obejmuje krew z tego samego opakowania co próbka testowa, lecz krew ta nie została napromieniowana. Wyniki w tabeli 1 wykazały, że rozcieńczenie i napromieniowanie krwinek pobranych od człowieka, nie spowodowało znaczącej zmiany w liczbie krwinek białych. Liczba płytek krwi i wartości hematokrytów były nieznacznie mniejsze od kontrolnych, ale wartości te mieszczą się w normalnym zakresie krwi dorosłego człowieka. Poziom hemoglobiny był większy niż w próbce kontrolnej, co oznacza, że część krwinek czerwonych uległa rozpadowi w czasie tej procedury. Wynika to również z mniejszej liczby krwinek czerwonych. Niemniej jednak, w przeciwieństwie do opublikowanych wcześniej danych, promieniowanie o dawce do 50 kGy nie zniszczyło składników krwi po przeprowadzonej procedurze. Krwinki wykazywały dużą liczebność i żywotność po dawce 25 kGy promieniowania gamma o małej szybkości napromieniowania 1 kGy/godzinę.

T a b e l a 1

Składnik	Krew napromieniowana	Krew kontrolna
Krwinki białe	4 K/^mm3	4,8 K/^mm3
Krwinki czerwone	^{3 Mi/}mm³	7,2 Mi/^mm3
Hemoglobina	42 g/dl	21 g/dl
Hematokryt	46%	64%
Płytki krwi	100 k/mm³	120 k/ιτιιτι³

P r z y k ł a d 2

Sterylizacja dekstrozy

Roztwory zawierające dekstrozę (lub glukozę) są stosowane do leczenia nadmiernej utraty węglowodanów i płynów, do leczenia hipoglikemii, jako środek osoczozastępczy, w dializach nerkowych oraz do przeciwdziałania uszkodzeniom wątroby (The Merck lndex, wyd. 11, Merck & Co., Inc., (1989); oraz Martindale's Extra Pharmacopecia, str. 1,265). Dekstroza jest również korzystnym źródłem węglowodanów w trybie żywienia pozajelitowego (The Merck lndex, wyd. 11, Merck & Co., Inc., (1989); oraz Martindale's Extra Pharmacopecia, str. 1265). We wszystkich tych zastosowaniach wymagana jest sterylizacja dekstrozy przed jej użyciem. Sterylizacja produktów zawierających dekstrozę jest w ogólności realizowana za pomocą sterylizacji cieplnej lub autokławowanie. Jednakże metody te powodują degradację lub karmelizację roztworów zawierających dekstrozę, przejawiającą się zmianą koloru (Martindale's Extra Pharmacopecia, str. 1265). Opisano również, że napromieniowanie roztworów zawierających glukozę promieniowaniem gamma powodowało ich rozkład (Kawakishi i wsp. “Radiation-lnduced Degradation of D-glucose in Anaerobic Contition”, Agric. Biol. Chem., czerwiec 1977). Tak więc istnieje potrzeba opracowania takiego sposobu sterylizacji produktów zawierających dek8

PL 197 667 B1 strozę, który nie spowoduje ich rozkładu. W celu wyeliminowania problemów znanych sposobów, produkty zawierające dekstrozę poddano sterylizacji sposobem według wynalazku następująco.

5% roztwór dekstrozy został napromieniowany przez 24 godziny promieniowaniem z szybkością 1 kGy/h. Po przebadaniu napromieniowanego produktu stwierdzono, że w porównaniu do próbki nie poddanej napromieniowaniu, widmo w zakresie światła widzialnego wykonane dla próbki napromieniowanej nie uległo zmianom. Oznacza to, że sposób według wynalazku może być bardzo użyteczny do sterylizacji produktów zawierających dekstrozę.

W dodatkowym doświadczeniu, świeży roztwór zawierający 5°% i 50°% dekstrozy napromieniowano dawką 25 kGy przez 36 godzin w temperaturze otoczenia. Uzyskano takie same wyniki jak w poprzednim doświadczeniu. Wykonano ponadto badania optyczne napromieniowanych produktów w zakresie widm UV/VIS, które wykazały brak piku przy długości fali 283,4 nm charakterystycznego dla „furfuralu” (zgodnie z U.S.P.). W przeciwieństwie do tych wyników, próbki sterylizowane w autoklawach zawierały pik 283,4 nm charakterystyczny dla „furfuralu”. „Furfurale” są rakogenne.

P r z y k ł a d 3

Sterylizacja albuminy z surowicy ludzkiej

Albumina z surowicy ludzkiej w postaci słabego 25% roztworu solnego, została napromieniowana całkowitą dawką 25 kGy przez 36 godzin za pomocą urządzenia Gammacell 220 (ze źródłem kobaltowym Co⁶⁰ promieniowania gamma). W czasie napromieniowania temperatura nie była kontrolowana, ale oszacowano, że pojemnik z roztworem albuminy miał temperaturę około 23°C. Wyniki analizy HPLC przedstawiono w tabeli 2.

T a b e l a 2

Parametr	Próbka kontrolna [%]	Próbka napromieniowana [%]
Polimer	2	3
Dimer	7	8
Monomer	90	86
Związki o małej masie cząsteczkowej	1	3
PH	7,05	6,97
NTU (musi być > 20)	11,40	11,40

Jak pokazują wyniki, albumina z surowicy ludzkiej może być bezpiecznie napromieniowana dawką do 25 kGy (z szybkością około 0,7 kGy/godzinę) w temperaturze pokojowej bez szkodliwego wpływu na istotne właściwości białek. Takie wyniki nie były wcześniej prezentowane. Wszystkie inne, znane dotychczas próby napromieniowania albuminy surowicy wymagały napromieniowania albuminy w stanie zamrożonym. Zatem sposoby te są bardziej kosztowne i trudniejsze w realizacji.

P r z y k ł a d 4

Normalna krew od zdrowego człowieka została wprowadzona do próbki zawierającej heparynę, płukana trzy razy standardowym roztworem CPD, a następnie rozcieńczona w stosunku 1:20 roztworem CPD zawierającym 0,01% obj./obj. etanolu. Roztwór CPD z 0,01% obj./obj. etanolu dalej nazwano SCPD. Próbki o równiej objętości 2 ml zostały umieszczone w 10 ml probówkach testowych z tworzywa sztucznego, a następnie napromieniowane różnymi dawkami promieniowania do wartości 26 kGy przez 36 godzin w temperaturze pokojowej. Nie zaobserwowano hemolizy, a komórki pozostały nienaruszone, nawet jeżeli były duże i miały nieregularny kształt. Wyniki trzech doświadczeń przedstawiono w tabeli 3.

T a b e l a 3

Parametr	RCB¹	HCB²	HCT³	MCV⁴	MCH⁵	MCHC⁶	RDW⁷	^Flagⁱ
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1*	1,08	41	0,097	89,5	38,3	427	17,7	Prawie normalny
Kontrola	0,99	33	0,89	90,2	33,0	366	15,3
2*				95,0	32,3	339	12,0
12 kGy1	1,22	45	0,166	135,8	36,5	269	27,3	1 + anizocytoza
	1,38	45	0,199	144,7	33,0	228	24,9	3 + makrocytemia

PL 197 667 B1 cd. tabeli 3

1	2	3	4	5	6	7	8	9
1	1,04	32	0,169	163,0	31,3	152	18,8	1 + anizocytoza
16 kGy	0,54	29	0,088	162,5	54,5	335	18,8	3 + makrocytemia
2	0,82	27	0,128	156,5	32,8	209	19,8	2 + anizocytoza
	0,81	26	0,124	152,6	32,4	212	20,2	3 + makrocytemia
1	0,79	244	0,125	158,4	30,8	194	19,4	1 + anizocytoza
20 kGy	1,26	28	0,203	161,5	22,1	137	19,0	3 + makrocytemia
2	0,93	30	0,141	151,5	32,3	213	20,1	2 + anizocytoza
	0,92	30	0,143	155,5	32,1	207	20,5	3 + makrocytemia
26 kGy 1	1,15	34	0,180	155,9	29,4	189	19,1	1 + anizocytoza
	1,15	34	0,176	153,0	29,9	195	23,4	3 + makrocytemia

* Doświadczenie 1 i Doświadczenie 2 ¹ Liczba krwinek czerwonych: krwinki x 10¹²/litr ²Hemoglobina: g/litr ^{3 H}emato^kryt ⁴ Średnia objętość cząsteczek: femtolltry ⁵ Średni ciężar cząsteczek hemoglobiny: pikogramy ⁶ Średnie stężenie cząsteczek hemoglobiny: g/litr

Komórki zostały łatwo umieszczone w zawiesinie a następnie odtworzone w świeżym buforze.

W celu określenia skuteczności sposobu według wynalazku w sterylizacji krwi skażonej wirusem HIV, przeprowadzono opisane poniżej trzy doświadczenia (przykład 5, 6 i 7). W każdym przykładzie komórki były traktowane w podobny sposób. Komórki z przeprowadzonych doświadczeń zostały łagodnie wymieszane po 12, 16 i 24 godzinach po napromieniowaniu. Ponadto, w trzecim doświadczeniu (przykład 7) komórki zostały umieszczone w kolbach T25 w celu uzyskania większej powierzchni i redukcji stężenia wskutek osiadania na dnie probówek. W każdym przypadku komórki były napromieniowane z szybkością około 0,7 kGy/godzinę.

P r z y k ł a d 5

Sterylizacja krwi zawierającej wirusy HIV

Poniższe doświadczenia zostały przeprowadzone w celu:

1. Zbadania toksycznego wpływu sposobu sterylizacji na krwinki czerwone (RBCs);

2. Zbadania skuteczności procesu w zwalczaniu retrowirusów.

Metoda

Od dawcy seronegatywnego względem HIV pobrano 2 ml krwi do probówki ze środkiem przeciwzakrzepowym. Krew została odwirowana i osocze usunięte. Pozostały osad krwinek zawieszono w 10 ml buforu CPD i żwirowano. Proces płukania powtórzono trzy razy. Otrzymany osad krwinek ponownie zawieszono w 40 ml buforu SCPD oraz umieszczono w 16 równych 2 ml porcjach w probówkach z tworzywa sztucznego, przeznaczonych do dalszej obróbki. Do ośmiu z tych probówek dodano jednakowe objętości HTLV-IIIB. Jest to szczep laboratoryjny wirusa HIV. W celu skażenia krwi, do każdej z tych probówek dodano 100 skażających dawek z hodowli tkankowej (TCID). Natomiast w pozostałych 8 probówkach dokonano „pozornego” skażenia krwi, przez dodanie małej ilości nie skażającego laboratoryjnego buforu fosforanowego (PBS). Cztery skażone i cztery nieskażone probówki zostały poddane sposobowi według wynalazku. Dla porównania, pozostałe 8 probówek (cztery skażone i cztery nieskażone) przetrzymywano w identyczny sposób, poza tym, że nie były poddane sposobowi według wynalazku.

Należy zaznaczyć, że na początku badań, od tego samego dawcy pobrano oddzielną porcję krwi, z której, po przetworzeniu w klinice hematologii, uzyskano kompletne hemogramy. Te wyniki jako wartości odniesienia zostały porównane z powtórzonymi testami na próbkach kontrolnych, nie skażonych wirusem HIV, obejmujących cztery próbki poddane sposobowi według wynalazku i cztery nie poddane sposobowi według wynalazku.

Równe porcje 0,5 ml z każdej skażonej badanej próbki wysiano na komórkach jednojądrowych (MCs), otrzymanych trzy dni wcześniej. Komórki te zawieszono w pożywce hodowlanej RMPI z 10% płodową surowicą cielęcą i innymi dodatkami (penicylina, streptomycyna, glutamina i bufor HEPES), razem z 1 ng/ml PHA-P. W tym samym czasie co posiew, komórki ponownie zawieszono w świeżej

PL 197 667 B1 pożywce z rlL-2 (20 U/ml). Hodowlę prowadzono przez 7 dni. Dwa razy w tygodniu pobierano część pożywki hodowlanej do pomiarów poziomu antygenów p24 HIV (za pomocą komercyjnego zestawu ELISA, Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA), w celu oznaczenia wzrostu wirusów.

Oddzielne próbki z ośmiu skażonych badanych próbek zostały użyte do doświadczeń z oznaczeniem miana wirusów. Czterokrotnie rozcieńczenia płynów zawierających wirusy (w zakresie od 1:16 do 1:65 536) wysiano w trzech powtórzeniach w 96-dołkowych, płaskodennych płytkach do hodowli tkankowych. Do każdego dołka dodano komórki MC stymulowane PHA (4 miliony komórek w 2 ml pożywki hodowlanej, z IL-2). Dwa razy w tygodniu pobierano z każdego dołka hodowlanego porcję supernatantu do pomiaru poziomów antygenów p24 wirusa HIV. Dołek kwalifikowano jako „pozytywny”, jeżeli ilość antygenu p24 była większa niż 30 pg/ml.

Miano wirusów obliczono metodą Spearmana-Karbera (protokół wirusologiczny ACTG) w sposób następujący:

gdzie M: miano (w Iog4) xk: dawka największego rozcieńczenia d: odstęp między rozcieńczeniami n: liczba dołków na rozcieńczenie r: suma wszystkich dołków.

Wyniki

Parametry krwinek czerwonych dla próbki odniesienia, jak również poddanych i nie poddanych sposobowi według wynalazku próbek badawczych, przedstawiono w tabeli 4.

T a b e l a 4

Próbka/Numer	MCV	MCH	MCHC
Odniesienia	94,5	32,0	339
Nie poddana sposobowi -1	91,4	34,4	376
Nie poddana sposobowi - 2	90,2	37,9	420
Nie poddana sposobowi - 3	92,1	40,0	433
Nie poddana sposobowi - 4	91,0	40,2	442
Poddana sposobowi - 1	133,4	37,8	284
Poddana sposobowi - 2	131,5	45	342
Poddana sposobowi - 3	128,5	38,9	303
Poddana sposobowi - 4	131,1	39,4	301

Skróty użyte w tabeli 4 są takie jak wyjaśnione poniżej tabeli 3.

Jak zaznaczono powyżej, hodowle HIV założono stosując 0,5 ml poddanych i nie poddanych sposobowi próbek badawczych. Poziomy antygenów p24 (pg/ml) próbek badanych w 4 i 7 dniu hodowli przedstawiono w tabeli 5.

T a b e l a 5

Próbka/Numer	p24	p24
1	2	3
Nie poddana sposobowi -1	1360	484
Nie poddana sposobowi - 2	1180	418
Nie poddana sposobowi - 3	1230	516
Nie poddana sposobowi - 4	1080	563
Poddana sposobowi - 1	579	241

PL 197 667 B1 cd. tabeli 5

1	2	3
Poddana sposobowi - 2	760	303
Poddana sposobowi - 3	590	276
Poddana sposobowi - 4	622	203

Na koniec, w celu przeprowadzenia bezpośredniego oznaczenia miana wirusów bez hodowli wybrano jedną próbkę nie poddaną sposobowi i jedną próbkę poddaną sposobowi. Wyniki tego badania przedstawiono w tabeli 6.

T a b e l a 6

Próbka/Numer	Miano (log 10 ml)
Nie poddana sposobowi - 1	1,5
Poddana sposobowi - 1	0,0

Zastosowanie sposobu według wynalazku jedynie w niewielkim stopniu miało niekorzystny wpływ na krwinki czerwone, zaobserwowano jedynie reprodukcyjną makrocytemię. Pomimo, wrażenia że w równolegle hodowanych próbkach poddanych sposobowi według wynalazku, występują resztkowe żywe wirusy, to jednak nie zostało to potwierdzone w bezpośrednich doświadczeniach oznaczania miana.

P r z y k ł a d 6

Celem tego doświadczenia było zbadanie toksycznego wpływu sposobu według wynalazku na krwinki czerwone.

Metoda

Od tego samego dawcy seronegatywnego względem HIV, pobrano 1 ml krwi do probówki ze środkiem przeciwzakrzepowym. Krew odwirowano i osocze usunięto. Pozostały osad krwinek zawieszono w 10 ml buforu CPD oraz odwirowano. Płukanie powtórzono trzy razy. Końcowy osad krwinek ponownie zawieszono w 20 ml buforu SCPD oraz umieszczono w 10 równych 2 ml porcjach w probówkach z tworzywa sztucznego, które pozostawiono do dalszej obróbki. Osiem probówek poddano sposobowi według wynalazku, zaś dwie pozostałe - pozostawiono jako nie poddane sposobowi próbki kontrolne. Po procesie wszystkie próbki zostały odwirowane, zaś pozostały krwinek zawieszono w 100 μl buforu. Dla wszystkich rozcieńczonych próbek wykonano pełne hemogramy.

Tak jak w poprzednim doświadczeniu, od tego samego dawcy pobrano, oprócz próbek do badań, również oddzielną porcję krwi jako odniesienie, dla której wykonano kompletny hemogram. Po ponownym zatężeniu próbek do 33% - 50% ich stanu wyjściowego, możliwe było wykonanie bardziej bezpośrednich porównań z próbką odniesienia niż to miało miejsce w poprzednich doświadczeniach.

Wyniki

Parametry dla krwinek czerwonych z próbki odniesienia, jak również z próbek poddanych i nie poddanych sposobowi według wynalazku próbek, przedstawiono w tabeli 7. Zastosowane skróty są wyjaśnione poniżej tabeli 3.

T a b e l a 7

Próbka/Numer	RBC	HGS	MCV	MCH	MCHC
1	2	3	4	5	6
Próbka odniesienia	4,76	152	94,9	31,9	336
Nie poddana sposobowi - 1	0,99	33	90,2	33,0	366
Nie poddana sposobowi - 2	1,08	41	89,5	38,3	427
Poddana sposobowi - 1	1,15	34	153,0	29,9	195
Poddana sposobowi - 2	1,15	34	155,9	29,4	189
Poddana sposobowi - 3	1,26	28	161,5	22,1	137
Poddana sposobowi - 4	0,79	24	158,4	30,8	194
Poddana sposobowi - 5	0,54	29	162,5	54,5	335

PL 197 667 B1 cd. tabeli 7

1	2	3	4	5	6
Poddana sposobowi - 6	1,04	32	163,0	31,3	192
Poddana sposobowi - 7	1,35	45	144,7	33,0	228
Poddana sposobowi - 8	1,22	45	135,8	36,5	269

We wszystkich próbkach poddanych sposobowi zaobserwowano makrocytemię komórek. Zmierzono porównywalne poziomy hemoglobiny w próbkach poddanych i nie poddanych sposobowi. Wartości bezwzględne odpowiadały rozpuszczeniu resztkowego. Krwinki czerwone nie uległy uszkodzeniu.

P r z y k ł a d 7

Metoda

Od tego samego dawcy seronegatywnego względem HIV, co w dwóch poprzednich doświadczeniach, pobrano 1 ml krwi do probówki ze środkiem przeciwzakrzepowym. Krew odwirowano i osocze usunięto. Pozostały osad krwinek zawieszono w 100 ml buforu CPD oraz odwirowano. Płukanie powtórzono trzy razy. Końcowy osad krwinek zawieszono w 100 ml buforu SCPD oraz rozdzielono w równych 25 ml porcjach do 4 kolb z hodowlą tkankową T25. Dwie kolby poddano sposobowi, zaś dwie pozostałe - pozostawiono jako nie poddane sposobowi kolby kontrolne. Następnie obserwowano zawartość każdej kolby oraz wyznaczono obserwacyjnie zdolność komórek do absorpcji tlenu (które krwinki powracają do koloru bardziej jasnoczerwonego przy dostępie tlenku powietrza). Następnie zawartość kolb została wyssana i odwirowana, otrzymany osad krwinek zawieszono ponownie w małej objętości buforu. Dla tych zatężonych próbek wykonano kompletne hemogramy.

Tak jak w przykładach 5 i 6, od tego samego dawcy pobrano oprócz próbek do badań, również oddzielną porcję krwi jako odniesienie, dla której wykonano kompletny hemogram. Po zatężeniu próbek badawczych do 33% - 50% ich pierwotnego stanu możliwe było wykonanie bezpośredniego porównania specyficznych parametrów z parametrami próbki odniesienia.

Wyniki

Po inspekcji wizualnej nie wykryto znaczących różnic między próbkami poddanymi sposobowi, a próbkami nie poddanymi takiemu sposobowi. W szczególności odnotowano jednorodny rozkład dobrze zawieszonych komórek. Zawartość kolb w powietrzu stała się bardziej jasnoczerwona. Nie wykonano żadnych pomiarów ilościowych dotyczących utleniania.

Parametry krwinek czerwonych próbki odniesienia, jak również poddanych i nie poddanych sposobowi próbek do badań, przedstawiono w tabeli 8. Zastosowane skróty są wyjaśnione poniżej tabeli 3.

T a b e l a 8

Próbka/Numer	RBC	HGS	MCV	MCH	MCHC
Próbka odniesienia	4,75	153	95,0	32,3	339
Nie poddana sposobowi - 1	0,93	30	151,5	32,3	213
Nie poddana sposobowi - 2	0,92	30	155,5	32,1	207
Poddana sposobowi - 1	0,82	27	156,5	32,8	209
Poddana sposobowi - 2	0,81	26	152,6	32,4	212

To doświadczenie zostało tak zaplanowane, aby było możliwie najbardziej zbliżone do warunków występujących przy transfuzji krwinek czerwonych. Wstępne badania wykazały, że sposób według wynalazku nie wpłynął ujemnie na zdolność komórek do transportu tlenu, chociaż badania powinny być przeprowadzone ilościowo. Interesującym w tym doświadczeniu okazał się fakt, że nie zaobserwowano różnic w wielkości pomiędzy komórkami w próbkach poddanych sposobowi a próbkami nie poddanymi sposobowi, przy czym komórki w obu próbkach okazały się duże w porównaniu do komórek w próbce odniesienia. Jak zmierzono, poziomy hemoglobiny we wszystkich badanych próbkach były porównywalne.

P r z y k ł a d 8

W tym doświadczeniu napromieniowano immunoglobulinę G (IgG) w postaci zliofilizowanej.

PL 197 667 B1

Metoda

Wyniki analizy HPLC immunoglobuliny IgG przedstawiono w tabeli 9. Wyniki pokazują, że napromieniowanie produktu dawką 25 kGy w temperaturze pokojowej, z szybkością 0,7 kGy/godzinę, nie wpłynęło na jego właściwości. Takie wyniki nie były wcześniej przedstawiane.

T a b e l a 9

Parametr	Próbka kontrolna [%]	Próbka napromieniowana [%]
Polimer (musi być > 2%)	1	1
Dimer	10	13
Monomer	88	84
Substancja o małej masie cząsteczkowej	1	2

Wyniki

Wyniki przedstawione Gergely'ego i współautorów, dotyczące liofilizowanej IgG pokazują, że część białka po napromieniowaniu dawką 12 kGy do 25 kGy ze standardową szybkością, stała się nierozpuszczalna (Gergely i wsp. „Studies of Gamm-Ray-Irradieted Human Immunoglobulin G”, SM-92/12

I.A.E.A.). W przeciwieństwie do tych wyników, stosując sposób według wynalazku przy szybkości napromieniowania 0,7 kGy/godzinę, żadna część białka nie była nierozpuszczalna. Oznacza to, że nastąpiła bardzo mała lub nie nastąpiła żadna degradacja białka. Ponadto, Gergely i współautorzy odkryli, że ludzka IgG w postaci płynnej po napromieniowaniu utraciła całkowicie swą aktywność. Natomiast stosując sposób według niniejszego wynalazku do preparatu dożylnego w postaci ciekłej immunoglobuliny (IVIG) uzyskano powyżej 70% specyficznego przeciwciała w przypadku IVIG o wysokim mianie przeciwciał.

P r z y k ł a d 9

W tym doświadczeniu napromieniowano inhibitor proteinazy alfa-1 i fibrynogen w postaci zliofilizowanej.

Metoda

Próbki umieszczono w urządzeniu Gammacell 220 i napromieniowano sposobem według wynalazku całkowitą dawką 25 kGy. Próbki po napromieniowaniu poddano badaniom w laboratorium. Szybkość napromieniowania wynosiła 0,72 kGy/godzinę.

Wyniki

Inhibitory proteinazy alfa-1, poddane napromieniowaniu i kontrolne, stanowiły 40% standardowej normalnej zebranej próbki osocza. Do testów zastosowano technikę radialnej immunodyfuzji Manciniego.

Fiolki z kompleksami fibrynogenu zostały odtworzone w 10 ml wody. Fiolki z siarczanem protaminy również zostały odtworzone w 10 ml wody. Do próbek dodano siarczan protaminy o stężeniu 10 mg/ml. We wszystkich trzech preparatach nastąpiło natychmiastowe tworzenie się monomeru.

P r z y k ł a d 10

W tym doświadczeniu napromieniowano czynniki VII, VIII i IV w postaci liofilizowanej.

Metoda

Próbki zostały umieszczone w urządzeniu Gammacell 220 i napromieniowane różnymi całkowitymi dawkami z szybkością około 1 kGy/godzinę.

Wyniki

Czynnik VII zachował 67% swej aktywności przy dawce 20 kGy oraz 75% przy dawce 10 kGy. Czynnik VIII zachował 77% swej aktywności przy dawce 20 kGy oraz 88% przy dawce 10 kGy. Natomiast czynnik IV zachował 70% swej aktywności przy dawce 20 kGy oraz 80% przy dawce 10 kGy.

Dla wszystkich trzech czynników uzyskano doskonałe wyniki. Zgodnie z wiedzą twórców, wcześniej nikt nie był w stanie uzyskać takich wyników przez napromieniowanie czynników krwi dużą dawką, w temperaturze otoczenia, z nieznaczną utratą ich aktywności. Wyniki te są w sprzeczności z wcześniejszymi wynikami Kitchena i współautorów, „Effect of Gamma Irradiation on the Human Immunodeficiency Virus and Human Coagulation Proteins”, Vox Sang 56 (1989) str. 223-229, którzy wykazali, że „napromieniowanie liofilizowanych koncentratów nie jest odpowiednią procedurą”. Analogicznie, Hiemstra i współautorzy, „lnactivation of human immunodeficiency virus by gamma radiation and its effect on plasma and coagulation factors”, Transfusion 31 (1991) str. 32-39, przedstawiają we wnioskach, że „Promieniowanie gamma nie może być stosowane jako sposób sterylizacji osocza i produk14

PL 197 667 B1 tów uzyskanych z osocza, ze względu na małą redukcję skażenia wirusowego przy dawkach promieniowania, które zapewniają akceptowalną regenerację aktywności biologicznej składników osocza”.

P r z y k ł a d 11

W tym doświadczeniu napromieniowywano krwinki czerwone z szybkością 0,5 kGy/godzinę przez 7,5 do 90 minut, w celu usunięcia zanieczyszczeń bakteryjnych.

Metoda

Pobrane od zdrowego dawcy krwinki czerwone zebrano w EDTA, płukano trzykrotnie roztworem CPD i ponownie zawieszono w DPC w celu uzyskania rozcieńczenia 1:20 w oparciu o pierwotne objętości krwi. Zawiesina komórek została podzielona i umieszczona w 14 probówkach. Do siedmiu z tych probówek wprowadzono około 1 x 10⁴ komórek gronkowca skóry. W czasie transportu komórek do urządzenia w celu napromieniowania, komórki te umieszczano na lodzie. Wszystkie próbki zostały umieszczone w komorze w temperaturze otoczenia oraz napromieniowane z szybkością 0,5 kGy/godzinę przez czas, w którym uzyskano całkowite dawki wynoszące odpowiednio: 0,625, 0,125, 0,250, 0,375, 0,500 i 0,750 kGy. Próbki wyjęto, wymieszano i umieszczono na lodzie w celu przetransportowania do analizy do laboratorium mikrobiologicznego i hematologicznego.

Wyniki

Wyniki testów mikrobiologicznych przedstawiono w tabeli 10.

T a b ela 10

Dawka promieniowania	Czas [min]	Liczba bakterii, które przeżyły naświetlanie
0		92200
0,625	7,5	84500
0,125	15	35000
0,250	30	10067
0,375	45	1800
0,500	60	250
0,750	90	0

Z analizy wynika, że dawka promieniowania 0,75 kGy zapewnia zmniejszenie liczebności ocalałych bakterii na poziomie 4,5 log1₀, co daje bardzo duży wskaźnik bezpieczeństwa dla krwi. Ponadto, wartość D10 wynosi około 0,125 kGy, co jest w dobrej zgodności z wartościami literaturowymi dla podobnych bakterii z grupy gronkowców (B. A. Bridges, „The effect of N-Ethylmaleimide on the radiation sensitivity of bacteria”, J. Gen. Microbiol. 26 (1962) str. 467-472 oraz G. P. Jacobs i N. Sadeh “Radiosensitization of Staphyloccocus aureus by p-hydroxybenzoic acid”, Int. J. Radiat. Biol. 41 (1982) str. 351-356.

W celu wykazania, że czerwone krwinki pozostały żywotne po napromieniowaniu, dla komórek krwi wyznaczono następujące parametry: WBC, granulocyty obojętnochłonne, limfocyty, monocyty, granulocyty kwasochłonne i bazocyty. Uzyskane wyniki przedstawiają jedynie liczbę istniejących komórek. Wszystkie jądrzaste komórki mogły być oczywiście zdeaktywowane dostarczoną dawką promieniowania. Inne monitorowane parametry krwinek czerwonych przedstawiono w tabeli 11. Wartość methemoglobiny pozostała niezmieniona nawet przy dawce promieniowania 0,75 kGy. To doświadczenie pokazuje, że krwinki czerwone mogą być bezpiecznie napromieniowane sposobem według wynalazku dawką około 0,75 kGy w temperaturze pokojowej bez żadnej utraty funkcji.

T a b e l a 11

Wartości uzyskane dla krwinek czerwonych w zależności od otrzymanej dawki promieniowania

Całkowita dawka [kGy]
Parametr	Krew całkowita	0	0,625	0,125	0,250	0,500
RBC	5,06	1,490	1,27	1,770	1,730	1,43
HGB	153,00	43,000	41,00	56,000	56,000	46,00
HTC	0,483	0,142	0,12	0,156	0,163	1,31

PL 197 667 B1 cd. tabeli 11

MCV	95,50	95,600	94,30	94,200	93,700	32,10
MCH	31,20	31,100	32,20	31,700	32,200	32,50
MCHC	327,00	325,00	341,00	336,00	344,00	353,00
RDW	13,93	12,100	12,70	12,900	12,900	13,20
METHgB	0,90	0,300	0,30	0,300	0,000	0,90

P r z y k ł a d 12

To doświadczenie było przeprowadzone takim samym sposobem jak w przykładzie 11 oraz miało na celu zarówno potwierdzenie wyników przykładu 11, jak i poszerzenie o niektóre zmierzone parametry. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono w tabeli 12.

Wyniki

Wyniki tego doświadczenia potwierdzają poprzednie wyniki, co oznacza, że krwinki czerwone rzeczywiście mogą być napromieniowane dawką wystarczającą do uzyskania redukcji liczby bakterii na poziomie 4,5 log1₀.

Uważa się, że przyszłe doświadczenia dostarczą podobnych wyników dla płytek krwi. Zatem, poddając czerwone krwinki napromieniowaniu sposobem według wynalazku, przy niewielkiej lub bez dodatkowej obróbki i bez dodawania obcego materiału, uzyskuje się produkt bezpieczny bakteriologicznie, o zmniejszonym ryzyku wystąpienia niepożądanych reakcji u biorcy.

Tabela 12

Całkowita dawka [kGy]
Parametr	0	0,625	0,125	0,250	0,375	0,555	0,750
HGB	1,8	1,7	1,8	1,7	2,0	2,0	2,0
% 0	96,6	96,5	96,2	96,3	96,4	96,5	96,0
% CO	1,0	1,2	1,6	1,3	1,7	1,5	1,5
% NET	0,5	0,5	-0,5	0,4	-0,2	0,4	0,8
% Redukcji	1,9	1,9	2,7	2,4	3,2	1,7	1,7
p60 (mm Hg)	34	nd	nd	nd	nd	nd	24
Współczynnik Hilla	2,1	nd	nd	nd	nd	nd	1,8

nd = pomiar nie wykonany

Niepewność oszacowania poziomów methemoglobiny wynosi ±2%; przy p50 ±4% (95% ufności).

P r z y k ł a d 13

W tym doświadczeniu określono ochronny wpływ pierwotnej liofilizacji (która pozostawia w produkcie o „dużej zawartości wilgoci”) oraz wtórnej liofilizacji (która pozostawia w produkcie o „małej zawartości wilgoci”) na czułość przeciwciała monoklonalnego.

Metody

W 3 ml szklanych fiolkach poddano liofilizacji 1,0 ml całkowitej objętości zawierającej 100 ąg przeciwinsulinowych przeciwciał monoklonalnych, 10 mg albuminy z surowicy bydlęcej (1%), bez stabilizatora, albo z dodatkiem 100 mM askorbinianu sodu jako stabilizatora. Próbki zamknięto w próżni, a następnie napromieniowano promieniowaniem gamma (całkowita dawka wynosiła 45 kGy, szybkość promieniowania 2,03 - 2,13 kGy/godzinę, a temperatura 4°C) oraz odtworzono w 1,0 ml wody.

Aktywność wiązania przeciwciał w dwóch niezależnych próbkach wyznaczono za pomocą standardowego testu ELISA, z wykorzystaniem szalek Maxisorb, pokrytych przez noc 2,5 ng/ml antygenu insuliny. Zastosowano trzykrotne seryjne rozcieńczenie próbek przeciwinsulinowych mAb, rozpoczynając od 5 ąg/ml. Użyto 50 ąg/ml kozich przeciwciał skierowanych przeciwko Ig myszy skoniugowanych z fosfatazą. Aktywność wiązania była wyznaczona przez pomiar absorpcji w paśmie 405 - 620 nm.

PL 197 667 B1

Wyniki

W przypadku braku stabilizatora zaobserwowano po napromieniowaniu lepszą regenerację przeciwinsuliny mAb dla tych próbek, które zostały poddane wtórnemu cyklowi suszenia do uzyskania „niewielkiej wilgotności”, co oznacza, że mniejsza całkowita zawartość wilgoci przy braku stabilizatora poprawia regenerację aktywności.

Natomiast w przypadku zastosowania stabilizatora nastąpiła bardzo dobra regeneracja aktywności przeciwciał po napromieniowaniu dawką 45 kGy, niezależnie od tego, czy próbka została poddana tylko pierwotnemu cyklowi suszenia do uzyskania „znacznej wilgotności”, czy też również wtórnemu, cyklowi suszeniu do uzyskania „niewielkiej wilgotności”.

Wyniki tego doświadczenia zilustrowano na fig.1.

P r z y k ł a d 14

W tym doświadczeniu określono ochronny wpływ liofilizacji i/lub stabilizatora na aktywność czynnika VIII. Testowanymi stabilizatorami były: askorbinian sodu, moczan sodu, troloks oraz mieszanki askorbinian/troloks; askorbinian/moczan/troloks; moczan/troloks; askorbinian/moczan.

Metody

Próbki zostały poddane liofilizacji, zamknięciu w próżni, a następnie promieniowaniu gamma (całkowita dawka wynosiła 45 kGy, szybkość promieniowania 1,9 kGy/godzinę, a temperatura 4°C) oraz odtworzeniu w wodzie. Pomiary aktywności czynnika VIII w próbkach zostały przeprowadzone w jednostopniowym teście krzepnięcia, z wykorzystaniem analizatora MLA Electra 1400C Automatic Coagulation Analyzer.

Wyniki

W przypadku braku stabilizatora uzyskano bardzo dobrą regenerację aktywności czynnika VIII po napromieniowaniu liofilizowanej próbki (69% - 88% aktywności nie napromieniowanej próbki kontrolnej).

Kombinacja stabilizatora i liofilizacji spowodowała regenerację aktywności czynnika VIII na poziomie 83% - 90% aktywności nie napromieniowanej próbki kontrolnej (askorbinian sodu + liofilizacja: 90% regeneracji; troloks + liofilizacja: 84% regeneracji; moczan sodu + liofilizacja: 83% regeneracji aktywności). Wyniki tych doświadczeń przedstawiono na fig.2.

P r z y k ł a d 15

W tym doświadczeniu napromieniowaniu poddano liofilizowane i ciekłe próbki albuminy.

Metoda

Próbki zostały napromieniowane całkowitą dawką 10 kGy i 40 kGy promieniowania gamma. Po napromieniowaniu próbki zostały odtworzone w 1,1 ml buforu testowego (50 mM Tris, pH 8,8; 50 mM Nad; 0,1% PEG 8000).

Próbki liofilizowane i ciekłe zostały zbadane za pomocą chromatografii kolumnowej z (TSK, żel G4000 SWxl 30 cm x 7,8 mm; bufor elucyjny 0,1 M fosforan sodu pH 6,5/0,1 siarczan sodu; szybkość przepływu 1 ml/min) z wykorzystaniem systemu detekcji promieniowania UV na długości fali 280 nm.

Wyniki

Po napromieniowaniu ciekłych i liofilizowanych próbek albuminy całkowitą dawką 10 kGy nie zaobserwowano żadnej degradacji produktów. Chociaż zaobserwowano nieznaczną degradację produktu w ciekłej próbce po napromieniowaniu dawką 40 kGy, to jednak nie zaobserwowano żadnej degradacji próbek liofilizowanych, napromieniowanych dawką 40 kGy promieniowania gamma.

Wyniki chromatografii tego doświadczenia przedstawiono na fig. 3.

P r z y k ł a d 16

W tym doświadczeniu badano wrażliwość prionów (przekazujących gąbczastą encefalopatię) na promieniowanie jonizujące o małej szybkości.

Metoda

0,3 ml solanki buforowanej fosforanem i zawierającej 10% homogenatu (wycinki mózgów pobrane od chomików syryjskich w końcowych stadiach infekcji scrapie (trzęsawka)) dodano do 29,7 ml albuminy w 50 ml probówce polipropylenowej. Próbki zostały napromieniowane całkowitą dawką 30 kGy lub 55 kGy (próbki kontrolne nie były napromieniowane).

Młode chomiki syryjskie były zaszczepione domózgowo nierozcieńczoną próbką w ilości 50 μΙ. Wszystkie zwierzęta były badane na oznaki choroby scrapie i pojawienie się chwiejnego chodu, a kiedy zwierzęta nie mogły stawać na tylnych łapach lub dotrwać do warunków końcowych, wówczas poddawane zostały eutanazji. Odnotowano liczbę dni kiedy, po zaszczepieniu każdego zwierzęcia, pojawiły się oznaki choroby.

PL 197 667 B1

Wyniki

Napromieniowanie większą całkowitą dawką (55 kGy) spowodowało trzynastodniowe - piętnastodniowe opóźnienie w średnich czasach inkubacji w porównaniu do nie napromieniowanej próbki kontrolnej dla dowolnego z trzech objawowych punktów końcowych, co jest równoznaczne z redukcją około 2 log₁₀lD5₀ w mianie patogenu. Napromieniowanie mniejszą całkowitą dawką (30 kGy) spowodowało trzynastodniowe opóźnienie w inkubacji, co jest równoznaczne z redukcją około 1 log^ID50 w mianie patogenu. Czasy te są znacząco dłuższe niż w przypadku nie napromieniowanej próbki kontrolnej.

Analiza danych za pomocą regresji liniowej wykazała ufność okresów w 95%, co oznacza, że aktualna redukcja w poziomach patogenów może być tak duża jak obniżenie 3,5 log^ID50 miana patogenu.

Claims

1. Sposób obniżania poziomu aktywnych biologicznie zanieczyszczeń lub patogenów w tkance, próbce białka lub w osoczu lub surowicy, znamienny tym, że (i) dodaje się do tkanki, próbki białka, osocza lub surowicy, przynajmniej dwa środki stabilizujące wybrane z grupy obejmującej: alkohol wielowodorotlenowy i DMSO oraz (ii) naświetla się tkankę, próbkę białka, osocze, lub surowicę dawką promieniowania gamma odpowiednią do obniżenia poziomu aktywnych biologicznych zanieczyszczeń lub patogenów.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako tkankę stosuje się tkankę twardą.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako tkankę twardą stosuje się tkankę wybraną z grupy obejmującej: kość, demineralizowaną substancję międzykomórkową kości, stawy, kości udowe, głowy kości udowej lub zęby.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako tkankę stosuje się tkankę miękką.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako tkankę miękką stosuje się tkankę wybraną z grupy obejmującej: szpik kostny, więzadła, ścięgna, nerwy, przeszczepy skóry, zastawki serca, chrząstkę, rogówkę, żyły i tętnice.

6. Sppsóó weeług zzstrz. 1, znamienny tym, że jako tkankę stosuje się; ppłąccznie tkanki miękkiej i tkanki twardej.

7. CppoSó we^e^^u zz^ra. T zr^ć^r^^^r^r^^ tym, żż w ccz^e nknwienlania stc>suja się tkanka w temperaturze poniżej jej temperatury zamarzania.

8. Csposó weeług za^rz. 11 zznmieena tym, żż w ccz^e nknwieeaniaujrzymujesiętkanka w atmosferze gazu obojętnego.

9. Csposó weeług za^rz. 11 zznmieena yym, żż w ccz^e nknwieeaniau-rzzmujasiętkanka w próżni.

10. SppsUó weeług za^rz. T zznmieenatym. Sż w scz^e sknwietlania uu^^yn^u^^ się sróóko w temperaturze poniżej jej temperatury zamarzania.

11. SppsUóweeług za^rz. T zznmieenatym. Zż w zcznie sknwietlania się z^ΓZóka w atmosferze gazu obojętnego.

12. SppsUóweeług za^rz. T zznmieenatym. Zż w zcznie zknwietlania u-rzamuja się z^ΓZóka w próżni w czasie naświetlania.

13. SppsUóweeługzzntrz. T zznmieenatym. żż stosujasię zróókazzwienzjacą zrzznąjmuiej jedno białko.

14. SppsUóweeług za^rz. S3, zznmieenattm, Sż j jak Ziałka stosuja się zrzzeiweiało, i rnmiinoglobulinę, hormon, czynnik wzrostu, antykoagulant, czynnik krzepliwości krwi lub białko dopełniacza.

15. Csposó we^e^^u zzntrz. S1, zznmieena ttym że Jć^So czymnik krzzeliweSci krwi stksuja się trombinę, czynnik II, czynnik V, czynnik VII, czynnik Vlla, czynnik VIII, czynnik IX, czynnik X, czynnik XIII, czynnik Xllla, czynnik Von Willebranda, fibrynę i fibrinogen.

16. SppsUóweeług zan^z. S1, zznmieenatym. żż e ć^So i mmuukoloOulinkstosuja się i globuliny poliklonalne lub monoklonalne lub ich mieszaniny.

17. SppsUóweeług za^rz. t3,zznmieenatym. Sż e aak s mmuukoloOulink stosuja się i globulinę G, immunoglobulinę M, immunoglobulinę A, immunoglobulinę E lub ich mieszaniny.

18. SppsUóweeług za^rz. S13 zznmieenatym. żż s^^ou^^sU^ Siatko weyrankz grzgpoOejmującej: białko C, białko S, alfa-1-anty-trypsynę (inhibitor proteazy alfa-1), heparynę, insulinę, butylo-cholinesterazę, warfarynę, streptokinazę, tkankowy aktywator plasminogenu (TPA), ernrropoetynę (EPO), urokinażę, neupogen, antytrombinę-3, alfa-glukozydazę lub albuminę.

PL 197 667 B1

19. Sposóbwedługzastrz. 13, znamiennytym, że stosujesię białko uzyskane metodami rekombinacyjnymi.

20. Sposóbwedług zastrz. 1, znamiennytym, że -aSo suzowicc stosujesię bbSlęccsuzowicc płodową.

21. Sposóbwedług zastrz. 1, z namiennytym. że w ccysieneSwiedasiaujrzymejesięosóoca Izb uzrowicc w tdmodrstzrad poniż-j jdj tdmodrstzry aamaraania.

22. Sposóbwedług zastrZa 1, znnmliennytymi. że w ccyaienaawiedaaiaujrzysmjesięosóocy Izb uzrowicc w atmoufdrad gsaz obojctndgo.

23. Sposóbwedług zastrZa 1, znnmiennytym. że w ccyaiennawiedarłiaujrzymejesięosóoca Izb uzrowicc w orbeni.

24. Sposub według zastrz a1 ,znnmiennytym. że stosujes ięstęCeniepoίysajmeiaj roSa kbw utabiliazjących wynouaącd oraynsjmnidj 20 mM.

25. Sposub według zastrZa 1, znnmienny tym, sięstęcenie brzysałrτmie- bawbh śroSa kbw utabiliazjących wynouaącd oraynsjmnidj 50 mM.

26. Sposub rastrZa 1, znnmienny tym, be ζ^^! bięstęcedie brzysałmeie- bawcc siwS kbw utabiliazjących wynouaącd oraynsjmnidj W0 mM.

27. Sposóbwedług zastrz^ ,znnmiennytym. że stosujes ięalkoSolewieloweOarotlenewewes brsnd a grzoy obdjmzjącdj msnnitol i trdhsloac.

28. Sposóbwedług gasili , z nnmiennntymi. żed aOatkoweSontaatujen iętkoaeo,p róbbk b iaS ks, ouocad Izb uzrowicc a jddnym Izb wiccdj środkidm awickuaającym cazłowć.

29. Sposub zastrz^ , z nnmiennntymi. że stosuj es ięt koaeo,próbbo białko,osóoca luz uzrowicc aawidrającd jdddn Izb wiccdj rduatkowd roztwory.

30. Gosubb wddłzg asutra. 29, nnaminnny tym, ed rduatkowym roatwordm jdut wods.

3, posubb wddłzg asutry. 29, nnaminnny tyi, ed rduatkowym roatwordm jdut roatwbr orgsnicany.

32. Gosubb wddłzg asutra. 29, nnaminnny tyi, ed obnies uic iIowć rduatkowdgo roatworz orada IiofiIiascjc.

33. Sposóbwedług zastrZa2 9,znnmiennytym. że zyweaoSwrenótkowedgrootweru że-t mm^^juas nie 2,0%.

34. Sposóbwedług zastrZa2 2^nnmiennytym. że zyweaoSwrenótkowedgrootweru jent mmiejuas nie ,,0%.

35. Sposub «β-ις zastrZa2 2^nnmiennytym. że zyweaoSwrenótkowedgrootweru jent mmiejuas nie 0,5%.

36. Sposub zastrZa2 2^nnmiennytym. że zyweaoSwrenótkowedgrootweru jentmeiejuas nie 0,2%.

37. Sposub zastrZa 1, znnmiennytym. be ζ^^! uię uaSwie-lasie ua uooiomie brzys nsjmnidj od 3,0 kGy/goaainc do 30,0 kGy/goaainc.

38. Sposóbwedług zastrz^ , z nnmiennytym. że stosuj es ięnaawiedaaieggmmenapooiomie oraynsjmnidj od 3,0 kGy/godainc.

39. Sposub według zastrZa. , znnmiennytym. że stosuje! s ięn aawie-laaieggmmenapooiowie oraynsjmnidj od 6,0 kGy/godainc.

40. Sposub według zastrZa. , z nnmiennytym. że stosuje s ięn aawie-laaieggmmenapooiowie oraynsjmnidj od W kGy/godainc.

4, Sposub według zastrZa. , z nnmiennytym. że stosuje s ięn aawie-laaieggmmenapooiowie oraynsjmnidj od 30 kGy/godainc.

42. Sposub według zastrZa. , z nnmiennytym. że stosuje s ięn aawie-laaieggmmenapooiowie oraynsjmnidj od 45 kGy/godainc.