PL197668B1

PL197668B1 - Nowe analogi 2',3'-dideoxy-3'-fluorotymidyny stanowiące proleki o wysokiej aktywności (54) przeciwko wirusowi ludzkiego niedoboru immunologicznego (HIV), sposób ich wytwarzania oraz zawierające je środki farmaceutyczne

Info

Publication number: PL197668B1
Application number: PL353852A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Miazga; Tadeusz Kulikowski; Andrzej Piasek
Original assignee: Pan
Priority date: 2002-05-13
Filing date: 2002-05-13
Publication date: 2008-04-30
Also published as: PL353852A1

Abstract

1. Nowe analogi 2',3'-dideoxy-3'-fluorotymidyny stanowiące pro-leki o wysokiej aktywności przeciwko wirusowi ludzkiego niedoboru immunologicznego (HIV), o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupę 12-bromododekanoilową, 12-metoksydodekanoilową, 11-etylotiododekanoilową, 12-etylotiododekanoilową, tetradekanoilową lub 12-azydododekanoilową (o symbolach odpowiednio XF306, XF307, XF308, XF309, XF310, XF311).

Description

(22) Data zgłoszenia: 13.05.2002

RZECZPOSPOLITA

POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

Nowe analogi 2',3'-dideoxy-3'-fluorotymidyny stanowiące proleki o wysokiej aktywności
(54) przeciwko wirusów i ludkkiego niedoboru immunologicnnego(HIV) , sposóbich
wytwarzania oraz zawierające je środki farmaceutyczne
	(73) Uprawniony z patentu:
	Polska Akademia Nauk, Instytut Biochemii i Biofizyki,Warszawa,PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
17.11.2003 BUP 23/03	(72) Twórca(y) wynalazku: Agnieszka Miazga,Nisko,PL Tadeusz Kulikowski,Warszawa,PL Andrzej Piasek,Warszawa,PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2008 WUP 04/08	(74) Pełnomocnik:
	Iwona Brodowska, Rzecznik Patentowy, LEXPAT Biuro Prawno-Patentowe S.C.

(57) 1. Nowe analogi 2',3'-dideoxy-3'-fluorotymidyny stanowiące pro-leki o wysokiej aktywności przeciwko wirusowi ludzkiego niedoboru immunologicznego (HIV), o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupę 12-bromododekanoilową, 12-metoksydodekanoilową, 11-etylotiododekanoilową, 12-etylotiododekanoilową, tetradekanoilową lub 12-azydododekanoilową (o symbolach odpowiednio XF306, XF307, XF308, XF309, XF310, XF311).

PL 197 668 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe proleki o wysokiej aktywności przeciwko wirusowi ludzkiego niedoboru immunologicznego (HIV), będące analogami 2-tio i 5'-podstawionej 2',3'-dideoksy-3'-fluorotymidyny o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupę 12-bromododekanoilową, 12-metoksydodekanoilową, 11-etylotiododekanoilową, 12-etylotiododekanoilową, tetradekanoilową lub 12-azydododekanoilową, sposób ich wytwarzania oraz zawierające je środki farmaceutyczne.

Nowe związki według wynalazku są prolekami selektywnego, kompetytywnego inhibitora retrowirusa HIV - 2',3'-dideoksy-3'-fluoro-2-tiotymidyny (S2FLT, XF302), wymagającymi wewnątrzkomórkowego hydrolitycznego rozszczepienia do S2FLT, a następnie wewnątrzkomórkowej aktywacji-fosforylacji S2FLT przez kinazy gospodarza do jej nukleozydo-5'-trifosforanu.

W dotychczasowym stanie wiedzy znane jest sześć 5'-O-mirystoilowych pochodnych 2',3'-dideoksy-3'-fluorotymidyny należących do najbardziej aktywnych inhibitorów HIV w rozmaitych komórkach T, znacznie silniejszych inhibitorów HIV niż standardowy lek AZT. Niestety, uwolniona w komórce FLT w stosunku do nie zakażonych limfocytów jest bardziej toksyczna od AZT (Balzarini J., Baba M., Pauwels R., Herdewijn P., De Clercq E. Biochem. Pharmacol. 1988, 37, 2847-2856). Badania kliniczne wykazały, że trombocytopenia i anemia są ograniczającymi dawkę toksycznymi efektami (Balzarini J., Baba M., Pauwels R., Herdewijn P., De Clercq E. Biochem. Pharmacol. 1988, 37, 2847-2856; Kong X.-B., Zhu Q.-Y., Vidal P.M., Watanabe K.A., Polsky B., Armstrong D., Ostrander M., Lang S.A. Jr., Muchmore E., Chou T.-C. Antimicrob. Agents Chemother., 1992, 36, 808-818; Matthes E., Lehnmann C.M., Scholz D., Rosenthal H.A., Langen P. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988, 153, 825-831), w związku z czym zaniechano dalszych badań klinicznych. Te zaobserwowane efekty uboczne skłoniły Zgłaszającego do poszukiwań bliskich analogów FLT o obniżonej cytotoksyczności z klasy 2-tiopochodnych (Poopeiko N.E., Poznański J., Drabikowska A.K., Balzarini J., De Clercq E., Mikhailopulo I.A., Shugar D., Kulikowski T. Nucleosides & Nucleotides 1995, 14, 435-437). Związki tego typu wykazują w porównaniu z FLT niższą toksyczność, zwiększoną lipofilowość i lepszą penetrację przez błony komórek zwierzęcych oraz przez barierę krew-mózg. 2',3'-Dideoksy-3'-fluoro-2-tiotymidyna (S2FLT, XF302) została uprzednio zsyntetyzowana drogą katalizowanej przez kwasy Lewisa kondensacji nukleozydowej diTMS-2-tiotyminy z 1,5-di-O-benzoilo-2,3-dideoksy-3-fluoro-p-ery/Z)ro-pentafuranozą (Poopeiko N.E., Poznański J., Drabikowska A.K., Balzarini J., De Clercq E., Mikhailopulo l.A., Shugar D., Kulikowski T. Nucleosides & Nucleotides 1995, 14, 435-437). Ta pracochłonna procedura dostarczyła trudnej do rozdzielenia mieszaniny β- i α-anomerów w stosunku 1:3 czyli mieszaniny zawierającej w większości nieaktywny anomer α. W rezultacie końcowa wydajność S₂FLT spadła do ~ 5%. Nowszą bardziej dogodną metodę syntezy S2FLT opartą na transformacji 3'-O-acetylo-2',3'-dideoksy-3'-fluoro-2-etoksytymidyny opisano w zgłoszeniu patentowym nr P.-352532 z dnia 28.02.2002.

Ze względu na bardzo niską toksyczność powyższe związki mogą być stosowane we wszystkich etapach rozwoju AIDS, również w fazie końcowej tj. w momencie, gdy ilość limfocytów T4 u pacjentów spada poniżej 200/jL krwi obwodowej.

Nieoczekiwanie okazało się, że sposobem według wynalazku możliwe jest uzyskanie nowej nieznanej grupy 2,5'-podstawionych analogów FLT o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupę 12-bromododekanoilową, 12-metoksydodekanoilową, 11-etylotiododekanoilową, 12-etylotiododekanoilową, tetradekanoilową lub 12-azydododekanoilową, poprzez transformację znanego związku 1-(5-O-trytylo-2-deoksy-3-D-fhreo-pentafuranozylo)-2-etoksytyminy (4) (Joshi B.V., Reese C.B., Varaprasad C.N.N.S. Nucleosides Nucleotides 1995, 14, 209-218) do związków o charakterze proleków wykazujących silne działanie antyretrowirusowe (anty HIV).

Nieoczekiwanie okazało się także, że nowe analogi FLT według wynalazku, posiadające grupę tionową w pozycji 2 pierścienia pirymidynowego FLT oraz grupę mirystoilową (12-bromododekanoilową, 12-metoksydodekanoilową, 11-etylotiododekanoilową, 12-etylotiododekanoilową, tetradekanoilową lub 12-azydododekanoilową) w 5'-pozycji reszty 2,3,-dideoksyrybozy, charakteryzują się bardzo wysoką aktywnością przeciwwirusową i bardzo wysokim indeksem selektywności.

Nowe analogi 2',3'-dideoksy-3'-fluorotymidyny stanowiące proleki o wysokiej aktywności przeciwko wirusowi ludzkiego niedoboru immunologicznego (HIV), o wzorze ogólnym 1, gdzie R oznacza grupę 12-bromododekanoilową, 12-metoksydodekanoilową, 11-etylotiododekanoilową 12-etylotiododekanoilową, tetradekanoilową lub 12-azydododekanoilową o symbolach odpowiednio XF306, XF307, XF308, XF309, XF310, XF311.

PL 197 668 B1

Szczególnie korzystnym analogiem FLT są związki o wzorze 1, w którym R oznacza grupę 12-metoksydodekanoilową oraz 12-azydododekanoilową czyli związki o symbolu XF307 i XF311.

Sposób wytwarzania analogów 2',3'-dideoksy-3'-fluorotymidyny o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupę 12-bromododekanoilową 12-metoksydodekanoilową, 11-etylotiododekanoilową, 12-etylotiododekanoilową tetradekanoilową lub 12-azydododekanoilową (o symbolach odpowiednio XF306, XF307, XF308, XF309, XF310, XF311) według wynalazku polega na tym, że:

(a) otrzymuje się związek o wzorze2 ze związku o wzorze 4 (Schemat 11 przez tionowanie grupy 2-OEt siarkowodorem w obecności tetrametyloguanidyny w temperaturze 0°C;

(b) otrzymuje się związek pośredni o wzorze 3 przez działanie trifluorku dietyloaminosiarki (DAST) na związek 2, w środowisku suchego, niepolarnego, organicznego rozpuszczalnika, korzystnie w dichlorometanie, w temperaturze 0°C;

(c) otrzymι.uesię związek pośredni o wzorze 1a (XF302) ze związku o wzorze 3 pr^^^ pienie grupy trytylowej 80% kwasem octowym, w ciągu 1,5 h w temperaturze 80°C;

(d) otrzymuje się związki o wzorze 1b - 1f, w których R oznacza resztę kwasu 12-bromododekanoilowego, 12-metoksydodekanoilowego, 11-etylotiododekanoilowego, 12-etylotiododekanoilowego lub tetradekanoilowego przez działanie odpowiedniego halogenku wyżej wymienionego kwasu tłuszczowego o wzorze RX, gdzie R ma wyżej podane znaczenie, a X oznacza halogen, na związek o wzorze 1a w obecności dimetyloaminopirydyny w dichlorometanie, w temperaturze pokojowej, przez jedną godzinę;

(e) o^ri^^ymu^ się związek o wzorze 1g, w którym R oznacza grupę 12-azydododekanoiiową, przez działanie azydku sodu na związek o wzorze 1b w dimetyloformamidzie w temperaturze pokojowej.

Środek farmaceutyczny o charakterze proleku nukleozydu S₂FLT, o wysokiej aktywności przeciwko wirusowi ludzkiego niedoboru immunologicznego (HIV), zawierający znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i substancje pomocnicze, według wynalazku charakteryzuje się tym, że jego składnikiem czynnym jest związek o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupę 12-bromododekanoilową, 12-metoksydodekanoilową, 11-etylotiododekanoilową, 12-etylotiododekanoilową, tetradekanoilową lub 12-azydododekanoilową, hydrolizujący w komórce pod działaniem esteraz do związku o wzorze 1a (XF302) lub zawiera mieszaninę któregokolwiek ze związków o wzorze 1b do 1g ze związkiem o wzorze 1a (XF302).

Korzystnie środek farmaceutyczny, według wynalazku zawiera związki o symbolu XF307 i/lub XF311, ewentualnie w mieszaninie ze związkiem o wzorze 1a (XF302).

Środek farmaceutyczny według wynalazku wykazuje silną inhibicję wzrostu wirusa HIV-1 i HIV-2 o ED₅₀ 0.01-0.05 μΜ w komórkach CEM-T₄, MT-2 i PBMC przy całkowitym braku cytotoksyczności w stężeniach terapeutycznych (CC_5O>200 μΜ).

Poniżej przedstawiono przykłady ilustrujące wynalazek nie ograniczające jego zakresu.

P r z y k ł a d I.

1-(2-Deoksy-5-O-trytylo-3-D-threo-rybofuranozylo)-2-tiotymina (2)

Przez roztwór 3,71 g (7,23 mmola) 1-(5-O-trytylo-2-deoksy-3-D-threo-rybofuranozylo)-2-etoksytyminy (4) i 8 ml (63,5 mmola) tetrametyloguanidyny w 36 ml suchej pirydyny przepuszczono siarkowodór w temperaturze 0°C przez 45 min. Po zakończeniu nasycania mieszaninę pozostawiono na 20 h w temperaturze pokojowej. Mieszaninę poreakcyjną rozcieńczono 150 ml chloroformu i przez roztwór przepuszczono argon przez 30 min, a następnie przemyto nasyconym roztworem NaHCO₃ (2 x 100 ml) i wodą (2 x 100 ml). Warstwę organiczną oddzielono, suszono nad bezwodnym Na₂SO4 i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono chromatograficznie na kolumnie z żelem krzemionkowym. Elucję prowadzono cykloheksanem-octanem etylu (2:1). Frakcje zawierające produkt połączono i odparowano do sucha. Produkt krystalizowano z etanolu otrzymując 3,1 g (82%) związku 2 w postaci białego osadu: tt. 116-118°C; UV Xmax (MeOH) 278 nm; TLC (żel krzemionkowy) R_f (CHCI₃:MeOH 95:) 0.53; ¹H NMR δ [ppm] (CDCI₃) 1.77 (s, 3H, 5-CH₃), 2.25 (d, 1H, H2), 2.65 (m, 1H, H2'), 2.71 (s, 1H, 3'-OH), 3.53 (dd, 1H, H5), 3.70 (dd, 1H, H5'), 4.14 (m, 1H, H4'), 4.48 (m, 1H, H3'), 6.70 (d, 1H, H1'), 7.28-7.46 (m, 15H, Ph), 7.74 (s, 1H, H6), 9.52 (s, 1H, NH).

P r z y k ł a d II

1-(5-O-trytylo-2,3-dideoksy-3-fluoro-3-D-rybofuranozylo)-2-tiotymina (3)

3,1 g (6,2 mmola) 1-(5-O-trytylo-2-deoksy-p-D-//i/'eo-rybofuranozylo)-2-tiotyminy (2) zawieszono w 150 ml suchego dichlorometanu i wkroplono 2,96 ml (22,38 mmola) trifluorku dietyloaminosiarki (DAST) w temperaturze 0°C. Mieszaninę mieszano 2 h w temperaturze 0°C, następnie dodano 12 ml

PL 197 668 B1 pirydyny i mieszano jeszcze przez 1h. Mieszaninę poreakcyjną rozcieńczono chloroformem (100 ml) i przemyto nasyconym roztworem NaHCO3 (2 x 100 ml) oraz wodą (100 ml). Warstwę organiczną oddzielono i suszono nad bezwodnym Na₂SO4 i zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem do oleju. Olej oczyszczono chromatograficznie na kolumnie z żelem krzemionkowym. Elucję prowadzono gradientem octanu etylu w cykloheksanie (10-60%). Frakcje zawierające związek 3 połączono i odparowano do sucha. Wydajność 1,23g (38,1%), UV X_max (MeOH) 278 nm; TLC (żel krzemionkowy) Rf (CHCh:MeOH 95:5) 0.77; ¹H NMR δ [ppm] (CDCI3) 1.47 (s, 3H, 5-CH3), 2.26 (m, 1H, H2'), 2.96 (m, 1H, H2), 3.43 (d, 1H, H5), 3.61 (d, 1H, H5'), 4.41 (d, 1H, H4'), 5.32 (dd, 1H, H3'), 7.11 (dd, 1H, H1'), 7.20-7.45 (m, 15H, Ph), 7.70 (s, 1H, H6).

P r z y k ł a d III

1-(2,3-dideoksy-3-fluoro-e-D-rybofuranozylo)-2-tiotymina (1a) (S₂FLT. XF302)

1,18 g (2,14 mmola) związku 3 w 20 ml 80% kwasu octowego ogrzewano w temperaturze 80°C przez 1,5 h. Mieszaninę odparowano z toluenem i etanolem do sucha a pozostałość oczyszczono chromatograficznie na kolumnie z żelem krzemionkowym stosując gradient metanolu w chloroformie (0-2%) jako eluent. Frakcje zawierające związek 1a odparowano do sucha i krystalizowano z mieszaniny heksan-etanol. Wydajność 0,3 g (49,1%); tt. 183-184°C; UV X_max (MeOH) 277,5 nm; TLC (żel krzemionkowy) Rf (CHCł^MeOH 95:5) 0.18; ¹H NMR δ [ppm] (CD3OD) 1.92 (s, 3H, 5-CH3), 2.12 (m, 1H, H2'), 2.76 (m, 1H, H2), 3.83 (2H, d, H5', H5), 4.32 (m, 1H, H4'), 5.28 (dd, 1H, H3'), 7.04 (dd, 1H, H1'), 8.06 (s, 1H, H6).

P r z y k ł a d IV

Ogólna metoda syntezy 5'-mirystoilowych pochodnych S₂FLT (1b-e)

Do roztworu odpowiedniego kwasu tłuszczowego (5 mmoli) w suchym dichlorometanie (100 ml) wkroplono chlorek kwasu szczawiowego (1 ml, 10,5 mmola). Całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h, a następnie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do sucha. Suchą pozostałość rozpuszczono w 50 ml suchego dichlorometanu i wkroplono do chłodzonego w wodzie z lodem roztworu S₂FLT (1,3 g, 5 mmoli) i 4-dimetyloaminopirydyny (DMAP) (880 mg, 7 mmoli) w suchym dichlorometanie (100 ml). Roztwór mieszano w temperaturze 0°C przez 20 min a następnie w temp pokojowej przez 2 h. Mieszaninę przemyto nasyconym wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu (2 x 50 ml) i wodą (2 x 50 ml). Warstwę organiczną suszono nad bezwodnym Na₂SO4 i zatężono pod próżnią do sucha. Suchą pozostałość oczyszczono chromatograficznie na żelu krzemionkowym stosując chloroform jako eluent, otrzymując homogeniczne produkty 1 b-e w postaci olejów.

-(5-O-(12-bromododekanoilo)-2,3-dideoksy-3-fluoro-e-D-rybofuranozylo)-2-tiotymina (1 b) (XF306)

Wydajność: 2,08 g, 80%; TLC (żel krzemionkowy) Rf (toluen - i-PrOH - octan etylu 7:1:2) 0.78 ¹H NMR (CDCI3) 1.20-1.50 (br m; 14H, (CH₂)₇); 1.58-1.70 (m, 2H; CH₂CH₂CO), 1.84 (quintet, 2H, CH₂CH₂Br), 1.85-1.95 (m, 1H, H-2'), 1.97 (d, 3H, 5-CH3), 2.33 (t, 2H, CH₂CO), 3.04 (ddd, 1H, H2), 3.41 (t, 3H, CH₂Br), 4.32 i 4.45 (dwa dd, 1H każdy, H5', H5), 4.56 (dt, 1H, H4'), 5.17 (dd, 1H, H3'), 6.91 (dd, 1H, H1% 7.49 (d, 1H, H6), 9.46 (s, 1H, NH^); MS ⁽M+H⁾⁺ 521.1701

-(2,3-dideoksy-3-fluoro-5-O-(12-metoksydodekanoilo)-3-D-rybofuranozylo)-2-tiotymina (1 c) (XF307)

Wydajność 1,56 g, 66%; TLC (żel krzemionkowy) Rf (toluen - i-PrOH - octan etylu 7:1:2) 0.68 ¹H NMR (CDCI3) 1.23-1.34 (br m, 14H, (CH₂)₇), 1.53-1.65 (m, 4H, CH₂CH₂CO, OCH₂CH₂), 1.98 (d, 3H, 5-CH3), 1.82-1.96 (m, 1H, H2'), 2.33 (td, 2H, CH₂CO), 3.04 (m, 1H, H2), 3.34 (s, 3H, OCH3), 3.37 (t, 2H, OCH₂CH₂), 4.32 i 4.45 (dwa dd, 1H każdy, H5', H5), 4.56 (dt, 1H, H4'), 5.17 (dd; 1H, H3'), 6.92 (dd, 1H, H1% 7.49 (d, 1H, H6^ 9.49 (s, 1H, NH^); MS ⁽M+H)+ 473.2431.

-(5-O-(2,3-dideoksy-11 -etylotiododekanoiio))3-fluoro-p-D-rybofuranozylo)-2-tiotymina(1d) (XF308)

Wydajność 1,32 g, 54%); TLC (żel krzemionkowy) Rf (toluen - i-PrOH - octan etylu 7:1:2) 0.78 ¹H NMR (CDCI3) 1.24-1.38 (br m, 12H, (CH₂)6), 1.25 (t, 3H, CH3), 1.54-1.62 (m, 4H, CH₂CH₂CO, CI±CH₂S), 1.82-1.95 (m, 1H, H-2'), 1.97 (d, 3H, 5-CH3), 2.33 (td, 2H, CH₂CO), 2.50-2.55 (m, 4H, CH₂CH2S, CH3CH₂S), 3.04 (m, 1H, H-2), 4.32 i 4.45 (dwa dd, 1H każdy, H5', H5), 4.56 (dt, 1H, H4'), 5.17 (dd, 1H, H3) 6.91 (dd, 1H, H1’), 7.48 (d, 1H, H6), 9.37 (s, 1H, NH^); MS ⁽M+H)+ 489.3606.

1-(2.3-dideoksy-5-O-(12-etylotiododekanoilo)-3-fluoro-3-D-rybofuranozylo)-2-tiotymina (1e) (XF309)

Wydajność 1,25 g, 50%; TLC (żel krzemionkowy) Rf (toluen - i-PrOH - octan etylu 7:1:2) 0.80 ¹H NMR (CDCI3) 1.21-1.41 (br m, 14H, (CH₂)₇), 1.25 (t, 3H, CH3), 1.50-1.66 (m, 4H, CH₂CH₂S, CI±CH₂CO), 1.72-1.91 (m, 1H, H-2'), 1.97 (d, 3H, 5-CH3), 2.33 (t, 2H, CH₂CO), 2.48-2.59 (m, 4H, CH₂C]H₂S, CH3CH₂S), 3.04 (m, 1H, H-2), 4.31 i 4.45 (dwa dd, 1H każdy, H5', H5), 4.56 (dt, 1H, H4'), 5.17 (dd, 1H, H3'^ 6.91 (dd, 1H, H1·), 7.49 (d, 1H, H6), 9.35 (s, 1H, NH^); MS ⁽M+H)+ 503.5422.

PL 197 668 B1

P r z y k ł a d V

1-(2.3-dideoksy-3-fluoro-5-O-(tetradodekanoilo)-e-D-rybofuranozylo)-2-tiotymina (1 f) (XF310)

Chlorek mirystoilu (2,1 ml, 7,7 mmola) wkroplono do chłodzonej w wodzie z lodem mieszaniny S2FLT (2 g, 7,7 mmola) i 4-dimetyloaminopirydyny (1,5 g, 12,3 mmola) w suchym dichlorometanie (100 ml). Całość mieszano w temperaturze 0°C przez 1 h, a następnie 2 h w temp pokojowej. Roztwór przemyto nasyconym wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu (2 x 50 ml) i wodą (2 x 50 ml). Warstwę organiczną suszono nad bezwodnym Na2SO4 i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do sucha. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując chloroform jako środek eluujący. Otrzymano oleisty związek 1f (3,77 g, 80%); TLC (żel krzemionkowy) Rf (toluen - i-PrOH - octan etylu 7:1:2) 0.79 ¹H NMR (CDCI3) 0.88 (t, 3H, CH3), 1.16-1.34 (br m, 20H, (CH2)10); 1.68-1.80 (m, 2H, CH2CH2CO), 1.84-1.96 (m, 1H, H2'), 1.97 (d, 3H, 5-CH3), 2.33 (t, 2H, CH2CO), 3.04 (ddd, 1H, H-2), 4.32 i 4.45 (dwa dd, 1H każdy, H5', H5), 4.56 (dt, 1H, H4'), 5.17 (dd, 1H, H3') 6.91 (dd, 1H, H1·), 7.49 (d, 1H, H6), 9.41 (s, 1H, NH^); MS⁽M+H⁾⁺ 471.3048.

P r z y k ł a d VI

1-(5-O-(12-azydododekanoilo)-2.3-dideoksy-3-fluoro-e-D-rybofuranozylo)-2-tiotymina (1g) (XF311)

Do roztworu 5'-O-(12-bromododekanoilo)-3'-fluoro-2-tiotymidyny (1,29 g, 2,4 mmola) w dimetyloformamidzie (28 ml) dodano azydek sodu (230 mg, 3,5 mmola) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 h. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do sucha, a pozostałość rozpuszczono w chloroformie (100 ml) i przemyło wodą (2 x 100 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym Na2SO4 i odparowano pod próżnią do sucha. Oleistą pozostałość oczyszczono chromatograficznie na żelu krzemionkowym. Kolumnę eluowano chloroformem otrzymując oleisty związek 1g (1.1 g, 92%); TLC (żel krzemionkowy) Rf (toluen - i-PrOH - octan etylu 7:1:2) 0.79 ¹H NMR (CDCI3) 1.26-1.37 (br m, 14H, (CHab); 1.56-1.65 (m, 4H; CH2CH2CO, CH2CH2N3), 1.82-1.96 (m, 1H, H2'), 1.97 (d, 3H, 5-CH3), 3.04-3.08 (dddd, 1H, H2), 2.33 (t, 2H, CH2CO), 3.26 (t, 2H, CH2N3), 4.32 i 4.45 (dwa dd, 1H każdy, H5', H5), 4.56 (dt, 1H, H4'), 5.15 (dd, 1H, H3'), 6.91 (dd, 1H, H1'), 7.49 (d, 1H, H6) 9.37 (s, 1H, NH^); MS ⁽M+H)+ 484.2583.

P r z y k ł a d VII.

Oznaczanie aktywności inhibitującej zakażenia wirusem HIV.

Badanie aktywności antywirusowej (ED₅₀) przeprowadzano stosując indukujący powstawanie syncytiów laboratoryjny szczep HIV-1 (cat#3) oraz hodowle komórek CEM-T4 i MT-2. Komórki preinkubowano przez 16 h w 10% FCS-RPM1 medium wzbogaconym o różne stężenia badanego związku. Adsorpcje wirusa prowadzono przez 4h w 37°C. Po inkubacji z wirusem komórki odwirowano (6 x 1000 rpm/min), a nie zaadsorbowany wirus odmyto. Komórki ponownie zawieszono w medium zawierającym badane związki. Stosowano 3 rodzaje kontroli: kontrolę wzrostu wirusa (zakażone komórki bez związku badanego), kontrolę negatywną (nie zakażone komórki) oraz komórki hodowane ze znanymi inhibitorami AZT i ddC o identycznych stężeniach jak związki badane. Próby prowadzono na 96 zagłębieniowych płytkach hodowlanych. Każde zagłębienie zawierało 2 x 10⁵ komórek zawieszonych w 200 ąl medium. Próby dla każdego stężenia wykonano 3- krotnie. Wzrost wirusa badano co 3 dni oznaczając zawartość wirusowego białka p24 według metody „Coulter HIV p24 Antigen Assay. Powstawanie syncytiów obserwowano w mikroskopie odwróconym. W celu oznaczenia indeksu selektywności badanych związków zbadano minimalne stężenia cytotoksyczne (CC₅₀). Komórki hodowano przez 5 dni w warunkach standartowych, w 10% FCS-RPM1 medium wzbogaconym w różne stężenia badanych związków i związków kontrolnych. Po 5 dniach oznaczono przeżywalność komórek przy użyciu metody wypierania błękitu trypanowego. Spośród zbadanych związków ujętych wzorem 1 najwyższą aktywność przeciwko HIV wykazały związki XF307 i XF311 (ED₅₀ = 0,01-0,05 ąM) przy bardzo niskiej cytotoksyczności (CC5>200ąM). W. wym. wyniki wykazały, że związki te są selektywnymi inhibitorami HIV o bardzo dobrym indeksie terapeutycznym i perspektywicznymi lekami przeciwko HIV/AIDS.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowe analogi Z^S^dideozy-S^fluorotymidyny stanowiące proleki o wysokiej aktywności przeciwko wirusowi ludzkiego niedoboru immunologicznego (HIV), o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupę 12-bromododekanoilową, 12-metoksydodekanoilową, 11-etylotiododekanoilową, 12-etylotiododekanoilową, tetradekanoilową lub 12-azydododekanoilową (o symbolach odpowiednio XF306, XF307, XF308, XF309, XF310, XF311).

PL 197 668 B1
2. Sposób wytwarzania 5'-podstawionych analogów 2',3'-dideoksy-3'-fluorotymidyny o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupę 12-bromododekanoilową, 12-metoksydodekanoilową, 11-etylotiododekanoilową, 12-etylotiododekanoilową, tetradekanoilową lub 12-azydododekanoilową (o symbolach odpowiednio XF306, XF307, XF308, XF309, XF310, XF311), znamienny tym, że:

(a) otrzymuje się związek pr^^r^^c^rn o wzorze 2 ze związku o 4 (Schemat 11 przez ttonowanie grupy 2-OEt siarkowodorem w obecności tetrametyloguanidyny w temperaturze 0°C;

(b) otrzymuje się związek pośredni o wzorze 3 przez działanie trifluorku dietyloaminosiarki (DAST) na związek 2, w środowisku suchego, niepolarnego, organicznego rozpuszczalnika, korzystnie w dichlorometanie, w temperaturze 0°C;

(c) otrzymuje się związek pośredni o wzoozela, w którym R oznacza wodór, tXF302) ze związku o wzorze 3 przez odszczepienie grupy trytylowej 80% kwasem octowym, w ciągu 1,5 h w temperaturze 80°C;

(d) otrzymuje się związki o wzorze 1b -1f, w których R oznacza resztę kwasu 12-bromododekanoilowego, 12-metoksydodekanoilowego, 11-etylotiododekanoilowego, 12-etylotiododekanoilowego lub tetradekanoilowego przez działanie odpowiedniego halogenku wyżej wymienionego kwasu tłuszczowego o wzorze RX, gdzie R ma wyżej podane znaczenie, a X oznacza halogen, na związek o wzorze 1a w obecności dimetyloaminopirydyny w dichlorometanie, w temperaturze pokojowej, przez jedną godzinę;

(e) otrzymuje się związek o wzorze 1g, w którym R oznacza gr^rua^ 12-azydododekanoiiową, przez działanie azydku sodu na związek o wzorze 1 b w dimetyloformamidzie w temperaturze pokojowej.
3. Środek farmaceutyczny o charakterze proleku nukleozydu S₂FLT, o wysokiej aktywności przeciwko wirusowi ludzkiego niedoboru immunologicznego (HIV), zawierający znane, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i substancje pomocnicze, znamienny tym, że jego składnikiem czynnym jest związek o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupę 12-bromododekanoilową, 12-metoksydodekanoilową, 11-etylotiododekanoilową, 12-etylotiododekanoilową, tetradekanoilową lub 12-azydododekanoilową hydrolizujący w komórce pod działaniem esteraz do związku o wzorze 1a (XF302) lub zawiera mieszaninę któregokolwiek ze związków o wzorze 1b do 1g ze związkiem o wzorze 1a (XF302).
4. Środek farmaceutyczny, według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera związki o symbotó XF307 i/lub XF311, ewentualnie w mieszaninie ze związkiem o wzorze 1a (XF302).