PL197848B1 - Sposób wytwarzania (1S, 4R)- lub (1R, 4S)-4-(2-amino-6-chloro-9H-purynylo-9)-2-cyklopenteno-1-metanolu lub jego soli, sposób wytwarzania enancjomeru pochodnej (1R, 4S)- lub (1S, 4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu oraz racemiczny 1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten i enancjomeryczny (1R, 4S)-1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten - Google Patents

Sposób wytwarzania (1S, 4R)- lub (1R, 4S)-4-(2-amino-6-chloro-9H-purynylo-9)-2-cyklopenteno-1-metanolu lub jego soli, sposób wytwarzania enancjomeru pochodnej (1R, 4S)- lub (1S, 4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu oraz racemiczny 1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten i enancjomeryczny (1R, 4S)-1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten

Info

Publication number
PL197848B1
PL197848B1 PL326267A PL32626798A PL197848B1 PL 197848 B1 PL197848 B1 PL 197848B1 PL 326267 A PL326267 A PL 326267A PL 32626798 A PL32626798 A PL 32626798A PL 197848 B1 PL197848 B1 PL 197848B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cyclopentene
amino
formula
general formula
hydroxymethyl
Prior art date
Application number
PL326267A
Other languages
English (en)
Other versions
PL326267A1 (en
Inventor
Christine Bernegger
Eva Maria Urban
Olwen Mary Birch
Kurt Burgdorf
Frank Brux
Kay-Sara Etter
Pierre Bossard
Walter Brieden
Laurent Duc
John Gordon
Colm O'murchu
Yves Guggisberg
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of PL326267A1 publication Critical patent/PL326267A1/xx
Publication of PL197848B1 publication Critical patent/PL197848B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/26—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
    • C07D473/32—Nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C231/00—Preparation of carboxylic acid amides
    • C07C231/16—Preparation of optical isomers
    • C07C231/18—Preparation of optical isomers by stereospecific synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/23—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/24—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/56—Ring systems containing three or more rings
    • C07D209/80—[b, c]- or [b, d]-condensed
    • C07D209/94—[b, c]- or [b, d]-condensed containing carbocyclic rings other than six-membered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/40—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with halogen atoms or perhalogeno-alkyl radicals directly attached in position 2 or 6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
    • C07C2601/10—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring the ring being unsaturated

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania (1S,4R)- lub (1R,4S)-4-(2- -amino-6-chloro-9H-purynylo-9)-2-cyklopenteno-1-metanolu lub jego soli, o wzorze - odpowiednio, 1 lub 2, znamienny tym, ze w pierwszym etapie acyluje si e (±)-2-azabicyklo- [2.2.1]hept-5-en-3-on o wzorze 5 otrzymuj ac pochodn a (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu o wzorze ogólnym 6, w którym R 1 oznacza grup e C 1-4 -alkilow a, C 1-4 -alkoksylow a, aryIow a lub aryloksylow a, a nast epnie w drugim etapie zwi azek o wzorze ogólnym 6 poddaje si e redukcji do po- chodnej cyklopentenu o wzorze ogólnym 9, w którym R 1 ma wy zej podane znaczenie, z kolei w trzecim etapie zwi azek o wzorze ogólnym 9 przekszta lca si e stosuj ac mikroorga- nizm zdolny do wykorzystania pochodnej cyklopentenu o wzorze ogólnym 9 w charakterze wy lacznego zród la azotu, wy lacznego zród la w egla lub wy lacznego zród la w egla i azotu, enzym posiadaj acy aktywno sc hydrolazy N-acetyloamino- alkoholowej b ad z acylaz e penicyliny G, z wytworzeniem (1R,4S)- lub (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklo- pentenu o wzorze 10 lub 11, po czym zwi azek o wzorze 10 lub 11 poddaje si e w czwartym etapie reakcji z N-(2-amino- -4,6-dwuchloro-5-pirymidylo)formamidem o wzorze 12 z wytwo- rzeniem (1S,4R)- lub (1R,4S)-4-[(2-amino-6-chloro-5-forma- mido-4-pirymidynylo)amino]-2-cyklopenteno-1-metanolu o wzorze - odpowiednio, 13 lub 14, a w pi atym etapie zwi a- zek ten poddaje si e cyklizacji w znany sposób otrzymuj ac ko ncowy produkt o wzorze - odpowiednio, 1 lub 2. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wytwarzania (1S,4R)- lub (1R,4S)-4-(2-amino-6-chloro-9H-purynylo-9)-2-cyklopenteno-1-metanolu o wzorze 1, bądź jego soli o wzorze 2, sposób wytwarzania enancjomeru pochodnej (1R,4S)- lub (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu o wzorach - odpowiednio, 3 i 4 oraz racemiczny 1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten i enancjomeryczny (1R,4S)-1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten (1S,4R)-4-(2-amino-6-chloro-9H-purynylo-9)-2-cyklopenteno-1-metanol jest ważnym związkiem pośrednim do wytwarzania nukleozydów 2-aminopurynowych, jak przykładowo do wytwarzania (1S,4R)-4-[2-amino-6-(cyklopropyloamino)-9H-purynylo-9]-2-cyklopenteno-1-metanolu (WO 95/21161) lub do wytwarzania 1592U89 (J. Org. Chem., 1996, 61,4192-4193; J. Org. Chem., 1996, 61,7963-7966).
Sposób wytwarzania (1S,4R)-4-(2-amino-6-chloro-9H-purynylo-9)-2-cyklopenteno-1-metanolu z (1 S,4R)-4-amino-2-cyklopenteno-1-metanolu opisano w WO 95/21161. Ujemną stroną tego sposobu jest to, że prekursorowy (1S,4R)-4-amino-2-cyklopenteno-1-metanol można otrzymać tylko przez (±)-2-azabicyklo-[2.2.1]hept-5-en-3-on podstawiony kosztowną grupą ochronną BOC (grupa tert-butyloksykarbonylowa) (J. Org. Chem., 1995, 60, 4602-4616).
Głównym celem obecnego wynalazku jest zapewnienie prostego, niedrogiego i bardziej ekonomicznego sposobu wytwarzania (1S,4R)- lub (1R,4S)-4-(2-amino-6-chloro-9H-purynylo-9)-2-cyklopenteno-1 -metanolu.
Cel ten osiągnięto dzięki opracowaniu rozwiązania według wynalazku.
Sposób wytwarzania (1S,4R)- lub (1R,4S)-4-(2-amino-6-chloro-9H-purynylo-9)-2-cyklopenteno-1-metanolu o wzorze 1 lub jego soli o wzorze 2, według wynalazku polega na tym, że w pierwszym etapie acyluje się (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-on o wzorze 5 otrzymując pochodną (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu o wzorze ogólnym 6, w którym R1 oznacza grupę C^-alkilową, C1-4-alkoksylową, aryIową lub aryloksylową, a następnie w drugim etapie związek o wzorze ogólnym 6 poddaje się redukcji do pochodnej cyklopentenu o wzorze ogólnym 9, w którym R1 ma wyżej podane znaczenie, z kolei w trzecim etapie związek o wzorze ogólnym 9 przekształca się stosując mikroorganizm zdolny do wykorzystania pochodnej cyklopentenu o wzorze ogólnym 9 w charakterze wyłącznego źródła azotu, wyłącznego źródła węgla lub wyłącznego źródła węgla i azotu, enzym posiadający aktywność hydrolazy N-acetyloaminoalkoholowej bądź acylazę penicyliny G, z wytworzeniem (1R,4S)lub (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu o wzorze 10 lub 11, po czym związek o wzorze 10 lub 11 poddaje się w czwartym etapie reakcji z N-(2-amino-4,6-dwuchloro-5-pirymidylo)formamidem o wzorze 12 z wytworzeniem (1S,4R)- lub (1R,4S)-4-[(2-amino-6-chloro-5-formamido-4-pirymidynylo)amino]-2-cyklopenteno-1-metanolu o wzorze - odpowiednio, 13 lub 14, a w piątym etapie związek ten poddaje się cyklizacji w znany sposób otrzymując końcowy produkt o wzorze - odpowiednio, 1 lub 2.
Zgodnie z wynalazkiem, w pierwszym etapie acylowanie prowadzi się stosując halogenek karbonylowy o wzorze ogólnym 7, w którym R1 ma wyżej podane znaczenie, zaś X oznacza atom chlorowca, albo stosując bezwodnik karboksylowy o wzorze ogólnym 8, w którym R1 ma wyżej podane znaczenie.
Korzystnie, acylowanie w pierwszym etapie prowadzi się w środowisku rozpuszczalnika aprotycznego.
Zgodnie z wynalazkiem, redukcję w drugim etapie prowadzi się stosując borowodorek metalu alkalicznego lub metalu ziem alkalicznych, wodorku glinowego metalu alkalicznego lub metalu ziem alkalicznych lub z Vitride.
Korzystnie, redukcję w drugim etapie prowadzi się w środowisku rozpuszczalnika protycznego.
Zgodnie z wynalazkiem, reakcję w trzecim etapie prowadzi się stosując mikroorganizmy rodzaju Rhodococcus, Gordono, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas lub Alcaligenes/Bordetella.
Korzystnie, reakcję w trzecim etapie prowadzi się stosując acylazę penicyliny G z mikroorganizmów gatunku Bacillus megaterium lub Escherichia coli.
Korzystnie, biotransformację w trzecim etapie prowadzi się w temperaturze od 20°C do 40°C i w przedziale pH od 5 do 9.
Zgodnie z wynalazkiem, reakcję w czwartym etapie prowadzi się w obecności zasady.
Korzystnie, reakcję w czwartym etapie prowadzi się w środowisku rozpuszczalnika protycznego.
PL 197 848 B1
Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania enancjomeru pochodnej (1R,4S)- lub (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu o wzorze ogólnym - odpowiednio, 3 lub 4, w którym R1 ma wyżej podane znaczenie, polegającego na tym, że w pierwszym etapie pochodną cyklopentenu o wzorze ogólnym 9, w którym R1 ma wyżej podane znaczenie poddaje się konwersji stosując mikroorganizm zdolny do wykorzystania pochodnej cyklopentenu o wzorze ogólnym 9 w charakterze wyłącznego źródła azotu, wyłącznego źródła węgla lub wyłącznego źródła węgla i azotu, enzym posiadający aktywność hydrolazy N-acetyloaminoalkoholowej lub acylazę penicyliny G, z wytworzeniem (1R,4S)- lub (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu o wzorze - odpowiednio, 10 lub 11, a następnie w drugim etapie związek ten poddaje się acylowaniu otrzymując związek o wzorze - odpowiednio, 3 lub 4.
Wynalazkiem objęty jest także enancjomer (1R,4S)-1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu o wzorze 18, o nadmiarze enancjomeru większym od 0%, wytworzony sposobem podanym bezpośrednio wyżej.
Korzystnie enancjomer według wynalazku cechuje się nadmiarem enancjomeru większym niż 80%, w szczególności większym niż 90%, a zwłaszcza większym niż 95%. Najkorzystniej enancjomer według wynalazku cechuje się nadmiarem enancjomeru większym niż 98%.
Wynalazek dotyczy także racemicznego 1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu.
Jak wspomniano, pierwszy etap nowego sposobu prowadzi się poprzez acylowanie (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu o wzorze 5, do pochodnej (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu o wzorze ogólnym 6, w którym R' oznacza grupę C^-alkilową, C^-alkoksylową, aryIową lub aryloksylową.
Grupa C1,-alkilowa może być podstawiona lub niepodstawiona. Przez określenie podstawiona grupa C1-4-alkilowa rozumie się tu grupę C·-.-alkilową podstawioną atomem chlorowca. F, Cl, Br lub J mogą być użyte jako atom chlorowca. Przykładami grupy C1-4-alkilowej są grupy: metylowa, etylowa, propylowa, butylowa, izobutylowa, tert-butylowa, izopropylowa, chlorometylowa, bromometylowa, dwuchlorometylowa, dwubromometylowa. Korzystnie jako grupę C1-4-alkilową stosuje się grupę metylową, etylową, propylową, butylową, izobutylową lub chlorometylową.
Jako grupę C-alkoksylową stosować można przykładowo, grupę metoksylową, etoksylową, propoksylową, butoksylową, tert-butoksylową lub izobutoksylową. Korzystnie, jako grupę C1-4-alkoksylową stosuje się grupę tert-butoksylową.
Jako grupę arylową stosować można przykładowo, grupę fenylową lub benzylową, korzystnie fenylową. Przykładowo grupa benzoksylowa lub fenoksylowa może być stosowana jako grupa aryloksylowa.
Prekursorowy (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-on może być wytworzony w sposób opisany w EP-A 0 508 352.
Acylowanie można przeprowadzić stosując halogenek karbonylowy o wzorze ogólnym 7, lub bezwodnik karboksylowy o wzorze ogólnym 8, w których R1 ma wyżej podane znaczenie, a X oznacza atom chlorowca. F, Cl, Br lub J mogą być stosowane jako atom chlorowca. Korzystnie stosuje się Cl lub F.
Przykładami halogenków karbonylowych są: chlorek acetylu, chlorek chloroacetylu,chlorek butyrylu, chlorek izobutyrylu, chlorek fenyloacetylu, chloromrówczan benzylu (Cbz-Cl), chlorek propionylu, chlorek benzoilu, chloromrówczan allilu lub fluorek tert-butyloksykarbonylu. Przykładami bezwodników karboksylowych są: bezwodnik kwasu dwu-tert-butylodwukarboksylowego, bezwodnik kwasu masłowego, bezwodnik kwasu octowego lub bezwodnik kwasu propionowego.
Acylowanie można przeprowadzić bez udziału rozpuszczalnika lub w rozpuszczalniku aprotycznym.
Acylowanie dogodnie prowadzi się w rozpuszczalniku aprotycznym. Przykładami odpowiednich rozpuszczalników aprotycznych są: eter dwuizopropylowy, pirydyna, acetonitryl, dwumetyloformamid, trójetyloamina, czterowodorofuran, toluen, chlorek metylenu, N-metylopirolidon lub ich mieszaniny.
Acylowanie dogodnie prowadzi się w temperaturze od -80°C do 50°C, korzystnie od 0°C do 25°C.
W drugim etapie obecnego nowego sposobu redukuje się pochodną (±)-2-aza-bicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu o wzorze 6 z wytworzeniem pochodnej cyklopentenu o wzorze ogólnym 9, w którym R ma wyżej podane znaczenie.
Redukcję dogodnie prowadzi się stosując borowodorek metalu alkalicznego lub metalu ziem alkalicznych, glinowodorek metalu alkalicznego lub metalu ziem alkalicznych lub związek o nazwie Vitride [bis(2-metoksyetoksy)glinowodorek sodu]. Glinowodorek sodu lub potasu można stosować jako
PL 197 848 B1 glinowodorek metalu alkalicznego. Borowodorek sodu lub potasu można stosować jako borowodorek metalu alkalicznego. Borowodorek wapnia można stosować jako borowodorek metalu ziem alkalicznych. Azotek glinu przykładowo można stosować jako azotek.
Redukcję dogodnie prowadzi się w rozpuszczalniku protycznym. Rozpuszczalnikami protycznymi, które można stosować, są niższe alkohole alifatyczne takie jak metanol, etanol, propanol, izopropanol, butanol, sec-butanol, tert-butanol, izobutanol, albo woda, lub mieszaniny wymienionych alkoholi z wodą.
Redukcję korzystnie prowadzi się w temperaturze od -40°C do 40°C, korzystnie od 0°C do 20°C.
W trzecim etapie obecnego nowego sposobu przeprowadza się konwersję pochodnej cyklopentenu o wzorze ogólnym 9 w (1R,4S)- lub (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten o wzorach - odpowiednio, 10 i 11 stosując albo mikroorganizmy lub enzym przejawiający aktywność hydrolazy N-acetyloamino-alkoholowej, bądź też stosując acylazy penicyliny G. W wyniku tej biotransformacji acylowana pochodna (1S,4R)- lub (1R,4S)-aminoalkoholu ulega przekształceniu w (1R,4S)- lub (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten (wzory 10 i 11).
Wszystkie mikroorganizmy, które wykorzystują pochodną cyklopentenu o wzorze ogólnym 9 jako wyłączne źródło azotu, jako wyłączne źródło węgla lub jako wyłączne źródło węgla i azotu są odpowiednie dla przeprowadzenia biotransformacji. Te mikroorganizmy można wyizolować z próbek gleby, szlamu lub ścieków za pomocą znanych technik mikrobiologicznych. Mikroorganizmy te izoluje się prowadząc w konwencjonalny sposób ich hodowlę w pożywkach zawierających pochodną cyklopentenu o wzorze ogólnym 9, w którym R1 ma wyżej podane znaczenie, jako
- wyłączne źródło węgla i azotu,
- wyłączne źródło azotu z odpowiednim źródłem węgla lub
- wyłączne źródło węgla z odpowiednim źródłem azotu.
Przykładami odpowiednich pochodnych cyklopentenu o wzorze ogólnym 9 są: N-acetylo-, N-propionylo-, N-izobutyrylo, N-tert-butoksykarbonylo- (N-BOC), N-butyrylo- lub N-fenyloacetylo-1-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopenten.
Mikroorganizmy mogą wykorzystywać jako odpowiednie źródło azotu przykładowo, amon, azotany, aminokwasy lub moczniki - jako substrat dla wzrostu. Jako odpowiednie źródło węgla mikroorganizmy mogą wykorzystywać przykładowo cukry, alkohole cukrowe, kwasy C2-C4-karboksylowe lub aminokwasy - jako substrat dla wzrostu. Heksozy takie jak glukoza lub pentozy można stosować jako cukry. Glicerynę przykładowo można stosować jako alkohol cukrowy. Kwas octowy lub kwas propionowy można stosować przykładowo jako kwasy C2-C4-karboksylowe. Leucynę, alaninę, asparaginę można stosować przykładowo jako aminokwasy.
Pożywkami do selekcji i do hodowli, przydatnymi do stosowania są pożywki znane biegłym w sztuce, takie jak przykładowo pożywka opisana w tabeli 1 lub kompletna pożywka (pożywka zawierająca ekstrakt drożdży) taka jak przykładowo drożdżowa pożywka bulionowa (NYB). Korzystnie stosuje się pożywkę opisaną w tabeli 1.
Podczas hodowli i selekcji indukowane są odpowiednio aktywne enzymy mikroorganizmów. Jako czynnik indukujący enzymy można stosować pochodne cyklopentenu o wzorze ogólnym 9.
Hodowlę i selekcję normalnie prowadzi się w temperaturze od 20°C do 40°C, korzystnie od 30°C do 38°C i w zakresie pH między 5,5 a 8, korzystnie przy pH między 6,8 a 7,8.
Biotransformację dogodnie przeprowadza się przy użyciu mikroorganizmów wykorzystujących izomer (1R,4S) pochodnej cyklopentenu jako wyłączne źródło węgla, jako wyłączne źródło węgla i azotu lub jako wyłączne źródło azotu.
Biotransformację korzystnie przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów rodzaju Alcaligenes/Bordetella, Rhodococcus, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas lub Gordona, w szczególności gatunków Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ17 (DSM 10329). Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32 lub Gordona sp. CB 100 (DSM 10687), oraz przy użyciu ich odmian i mutantów równoważnych funkcjonalnie. Złożenie zgodnie z układem budapesztańskim w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, przy Mascheroderweg 1B, D-38125 Braunschweig, Niemcy miało miejsce w dniu 20 maja 1996 roku w przypadku mikroorganizmów DSM 10686 i 10687, w dniu 6 listopada 1995 roku dla mikroorganizmów DSM 10328 i DSM 10329, w dniu 8 października 1996 roku dla mikroorganizmu DSM 11291 i w dniu 20 września 1996 roku dla mikroorganizmu 11172.
PL 197 848 B1
T-rmin odmiany i mutanty równoważn- funkcjonalni- oznaczają mikroorganizmy o zasadniczo
tych samych właściwościach i funkcjach co mikroorganizmy oryginaln-. Odmiany i mutanty t-go ro-
dzaju można wytworzyć przypadki-m, przykładowo pod wpływ-m promi-niowania ultrafiol-tow-go.
Opis taksonomiczny Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11171)
Postać komórki pał-czki
sz-rokość, um 0,5 - 0,6
długość, um 1,0 - 2,5
Ruchliwość +
Flag-lacja o równomi-rni- rozłożonych rzpskach
R-akcja Grama -
Liza przy użyciu 3% KOH +
Aminop-ptydaza (C-rny) +
Spory -
Oksydaza +
Katalaza +
ADH (d-hydrog-naza alkoholowa) -
AO2 z AO3 -
D-nitryfikacja -
Ur-aza -
Hydroliza ż-latyny -
Kwas z (próba OF):
glukozy -
fruktozy -
arabinozy -
adypinianu +
kaprynianu +
cytrynianu +
jabłczanu +
mannitolu -
Opis taksonomiczny Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686)
1. Morfolooiai baova kklooii: krótkieroozałęzioonstrzzpPi, które - g dy s ąstare - ulegająroozpdowi na pałrczki i ziarniaki, koloni- błyszcząc- i częściowo zlrwającr sip, arżowr z odci-ni-m różowym, RAL 1001;
2. Rozpoznany aminokwas p-ptydoglikanu: kwas mrzodwuaminopimglowy;
3. Kwasąmyyolowa:kwasą mykolowaRΛhcfoococcu; oonaaczrie d łuuaśśi łańcuuha kwassmykolow-ao (C32-C44) - oraz porównani- tych danych z pozycjami wystppującymi w banku danych o kwasach mykolowych DSM - ujawniły bardzo duż- podobi-cstwo z- sch-matami szcz-pów Rhodococcus erythropolis (podobi-cstwo 0,588).
4. ScUama- kwańąw ałuuązczwayU:nieroozałępiośa,nańąycśai niegańąycśakwańątłuuązczwa plus kwas tub-rkulost-arynowy.
5. Przz cunPśUłśwm sągwagcjośawańiu 16S rDDA sszcz-u pątaerDynśa wasąśi ppożom zziod ności (100%) z s-kw-ncjami sp-cyficznych obszarów Rhodococcus erythropolis.
Wynik id-ntyfikacji j-st b-zdyskusyjny, poni-waż trzy wzaj-mni- ni-zal-żn- m-tody (kwasy mykolow-, kwasy tłuszczow-, 16S rDAA) przypisały szcz-p do gatunku Rhodococcus erythropolis.
Opis taksonomiczny Gordona sp. CB 100 (DSM 10687)
1. Morfolooiai bbńDa kokuni któtkieroozałępiośastrzzpUi, - g dd s ąstare - ulegająroozρdowi na pał-czki i ziarniaki, koloni- są blado pomaracczow-, (RAL 2008);
2. Rozpoznany aminokwas p-ptydoalikanu: kwas m-zodwuaminopim-lowy
3. Sch-mat m-nachinonu: MK-9 (H2) 100%;
4. Kwańsmykolowa:kwańs mykolowaGonronn; długdśśłańcucUakwańąmykolowagd(C5C)5C6C)) oznaczono za pomocą wysokot-mp-raturow-j chromatografii gazow-j. Sch-mat t-n odpowiada sch-matowi wystppując-mu u prz-dstawici-li rodzaju Gordona.
5. ScUama- Pwańątłusązczwagdι pieroozdłępiośa, pańąycśa i piegańąycśa Pwańą tłusązczwa plus kwas tub-rkulost-arynowy.
PL 197 848 B1
6. Przy częściowym sekwencjonowaniu 16S rDNA szczepu stwierdzono jedynie stosunkowo małą zgodność 98,8% z sekwencjami specyficznych obszarów Gordona rubropertincta.
Na podstawie dostępnych wyników (menachinony, kwasy mykolowe, kwasy tłuszczowe, 16S rDNA) jakkolwiek wyizolowany organizm można bezdyskusyjnie przypisać rodzajowi Gordona, nie jest możliwe na podstawie tych wyników przypisanie go do znanych gatunków Gordona. Zakłada się zatem, że szczep DSM 10687 jest nowym i uprzednio nieopisanym gatunkiem rodzaju Gordona.
Opis taksonomiczny Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329) Właściwości szczepu:
Postać komórki szerokość, um długość, um
Ruchliwość
Flagelacja
Reakcja Grama
Liza przy użyciu 3% KOH Aminopeptydaza (Cerny)
Spory
Oksydaza
Katalaza
Wzrost beztlenowy
ADH (dehydrogenaza alkoholowa)
NO2 z NO3
Denitryfikacja
Ureaza
Hydroliza pałeczki
0,5 - 0,6
1,5 - 3,0 +
o równomiernie rozłożonych rzęskach +
+ +
+ +
+ +
żelatyny Tween 80 Kwas z (próba OF):
glukozy aerobowej ksylozy 80 Wykorzystanie substratu glukoza fruktoza arabinoza cytrynian + jabłczan + mannitol Opis taksonomiczny Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328)
Charakterystyka: Nieregularne gram-dodatnie pałeczki z wyraźnym cyklem wzrostu pałeczki-ziarniaki; ściśle tlenowy; bez tworzenia kwasu ani gazu z glukozy
Ruchliwość Spory Katalaza + kwas mezo-dwuaminopimelowy w ściankach komórki: brak
Peptydoglikan typu: A3a, L-Lys-L-Ser-L-Ser-L-Thr-L-Ala
Podobieństwo sekwencji 16S rDNA: Najwyższe wartość i stwierdzone przy sekwencjonowaniu obszaru o największej zmienności wyniosły 98,2% względem Arthrobacter pascens, A. ramosus i A. oxydans.
Opis taksonomiczny Agrobacterium/Rhizobium HSZ30 Postać komórki szerokość, um długość, um
Reakcja Grama
Liza przy użyciu 3% KOH pałeczki wielopostaciowe 0,6 -1,0 1,5 -3,0 +
PL 197 848 B1
Aminopeptydaza +
Spory Oksydaza +
Katalaza +
Ruchliwość +
Wzrost beztlenowy Azotyn z azotanu Denitryfikacja Ureaza +
Hydroliza żelatyny Kwas z:
L-arabinozy + galaktozy melezytozy fruktozy + arabitolu mannitolu erytritolu Alkalinizacja mleka lakmusowego +
Ketolaktoza Częściowe sekwencjonowanie 16S rDNA ujawniło stosunkowo duże podobieństwa około 96% z przedstawicielami rodzajów Agrobacterium i Rhizobium. Jednoznaczne przypisanie do gatunków opisanych w tych rodzajach nie jest możliwe.
Opis taksonomiczny Bacillus simplex K2
Postać komórki pateczki szerokość, um 0,8 -1,0 długość, um 350 - 5,0
Spory Elipsoidalne Okrągłe Sporangium (zarodnia) Katalaza +
Wzrost beztlenowy Reakcja VB n.g.
Maksymalna temperatura:
pozytywna dla wzrostu 40°C negatywna dla wzrostu 45°C
Wzrost w pożywce o pH=5,7 NaCl 2% +
5% 7% 10% Pożywka lizozymowa +
Kwas z (ASS)
D-glukozy +
L-arabinozy +
D-ksylozy D-mannitolu +
D-fruktozy +
Gaz z fruktozy Lecytynaza Hydroliza skrobi + żelatyny + kazeiny 8
PL 197 848 B1
Tween 80 +
eskuliny -
Wykorzystanie
cytrynianu +
propionianu -
Azotyn z azotanu +
Indol -
Deaminaza fenyloalaninowa -
Dihydrolaza argininowa -
Analiza komórkowych kwasów tłuszczowych zapewniła potwierdzenie przypisania do rodzaju
Bacillus.
Częściowe sekwencjonowanie 16S rDNA ujawniło 100% podobieństwo z Bacillus simplex.
Opis taksonomiczny Pseudomonas putida K32
Postać komórki pałeczki
szerokość, um 0,8 - 0,9
długość, um 1,5 - 4,0
Ruchliwość +
Flagelacja polarna >1
Reakcja Grama -
Liza przy użyciu 3% KOH +
Aminopeptydaza +
Spory -
Oksydaza +
Katalaza +
Wzrost beztlenowy -
Pigmenty
fluorescencyjny +
pyocyjanian -
ADH +
Azotyn z azotanu -
Denitryfikacja -
Ureaza -
Hydroliza żelatyny -
Wykorzystanie substratu
adypinian -
cytrynian +
jabłczan +
D-migdalan +
fenylooctan +
D-winian -
D-glukoza +
trehaloza -
mannitol -
benzoilomrówczan -
glikol propylenowy +
butyloamina +
benzyloamina +
tryptamina -
acetamid +
hipuran +
Profil komórkowych kwasów tłuszczowych jest typowy dla Pseudomonas putida.
Częściowe sekwencjonowanie 16S rDNA ujawniło podobieństwa około 98% z Pseudomonas
mendocina i Pseudomonas alcaligenes. Podobieństwo z Pseudomonas putida wyniosło 97,4%.
PL 197 848 B1
Opis taksonomiczny Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291)
1. Morfologia i barwa koloniii krótkie rozgałęzione strzępki które - kiedy są stare - rozpadają się na pałeczki i ziarniaki, kolonie są matowe, blado czerwono-pomarańczowe, RAL 2008;
2. Rozpoznany aminokwas peptydoglikanu : kwas mezodwuaminopimelinowy;
3. Kwasy mykolowe: kwasy mykdowe Rhodococcus·, Oznaczenie długości -ańcuchakwasu mykolowego (C32-C44) i porównanie wyników z danymi z pozycjami znajdującymi się w banku danych kwasu mykolowego DSMZ ujawniło jedynie nieznaczne podobieństwo z wzorcowymi schematami szczepów Rhodococcus ruber (podobieństwo 0,019). Ten czynnik korelacji jest zbyt niski, by można było użyć go do identyfikacji gatunku.
4. Schemat kwasów tłuszczowych: nierozgałęzione, nasycone i nienasycone tłuszczowe plus kwas tuberkulostearynowy. Ten schemat kwasów tłuszczowych jest identyfikujący dla wszystkich przedstawicieli rodzaju Rhodococcus i ich bliskich krewnych takich, jak: Mykobacterium, Nocardia i Gordona. Przeprowadzono próbę zróżnicowania do poziomu gatunków wykorzystując różnice jakościowe i ilościowe w schemacie kwasów tłuszczowych. Dla porównania schematu kwasów tłuszczowych Rhodococcus sp. FB 387 z pozycjami występującymi w banku danych zastosowano metody numeryczne. Przy pomocy tej metody nie było możliwe również przypisanie Rhodococcus sp. FB 387 do jakiegokolwiek opisanego gatunku Rhodococcus na skutek małego podobieństwa (0,063).
5. Częściowo sekwencjonując 16S rDNA szczepu, 96-818 przypisano do opacus z korelacją 97,9%. Ta zgodność sekwencji jest znacznie poniżej wymaganej zgodności 99,5% dla jednoznacznego przypisania gatunków w tym taksonie.
Na podstawie dostępnych wyników można założyć, że szczep Rhodococcus sp. FB 387 jest nowy i nie jest uprzednio opisanym gatunkiem Rhodococcus.
Biotransformację można przeprowadzić po wstępnym hodowaniu tych mikroorganizmów znanymi metodami, stosując komórki nieaktywne (komórki nierosnące, które nie wymagają już źródła węgla i energii) lub komórki rosnące. Biotransformację przeprowadza się korzystnie przy użyciu komórek nierosnących.
Enzymy o aktywności hydrolazy N-acetyloaminoalkoholowej odpowiednie dla powyższej biotransformacji można wyodrębnić z komórek opisanych mikroorganizmów, przykładowo przez rozerwanie, zgodnie ze stanem techniki. Jest możliwe zastosowanie w tym celu przykładowo ultradźwięków lub metody z użyciem prasy francuskiej. Enzymy te korzystnie wyodrębnia się z mikroorganizmów Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686).
Odpowiednie acylazy penicyliny G otrzymuje się z wielu mikroorganizmów takich, jak przykładowo bakterie lub promieniowce, w szczególności z następujących mikroorganizmów: Escherichia coli ATCC 9637, Bacillus megaterium, Streptomyces lavendulae ATCC 13664, Nocardia sp. ATCC 13635, Providencia rettgeri ATCC 9918, Arthrobacter viscosus ATCC 15294, Rhodococcus fascinans ATCC 12975, Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289, Achromobacter ATCC 23584 i Micrococcus roseus ATCC 416. Spośród dostępnych w handlu acylaz penicyliny G stosuje się w szczególności takie, jak acylaza penicyliny G EC 3.5.1.11 z E. coli (Boehringer Mannheim) lub z Bacillus megaterium.
W korzystnym wykonaniu stosuje się immobilizowane acylazy penicyliny G.
Biotransformację można przeprowadzić w pożywkach typowych dla tej dziedziny techniki takich, jak przykładowo w fosforanie o niskiej molarności, buforze cytrynianowym lub Hepesa, w wodzie, w pożywkach pełnych takich, jak przykładowo drożdżowa pożywka bulionowa (Nutrient Yeast Broth, NYB) lub w pożywce opisanej w tabeli. Korzystnie biotransformację przeprowadza się w pożywce podanej w tabeli 1 lub w buforze fosforanowym o niskiej molarności.
Biotransformację dogodnie prowadzi się przy jednorazowym lub ciągłym dodawaniu pochodnej cyklopentenowej (wzór 9) tak, że stężenie nie przekracza 10% wagowych, a korzystnie - 2% wagowych.
Wartość pH podczas biotransformacji może wynosić od 5 do 9, korzystnie od 6 do 8. Biotransformację dogodnie prowadzi się w temperaturze od 20°C do 40°C, korzystnie od 25°C do 30°C.
W czwartym etapie pochodną cyklopentenu (wzór 10 lub 11) poddaje się konwersji - stosując N-(2-amino-4,6-dwuchloro-5-pirymidynylo)formamid o wzorze 12, do (1S,4R)- lub (1R,4S)-4-[(2-amino-6-chloro-5-formamido-4-pirymidynylo)amino]-2-cyklopenteno-1-metanolu o wzorze 13 lub 14.
N-(2-amino-4,6-dwuchloro-5-pirymidynylo)formamid można wytworzyć jak to ujawniono w WO 95/21161.
Reakcję w czwartym etapie dogodnie prowadzi się w obecności zasady. Jako zasadę można stosować zasady organiczne lub zasady nieorganiczne. Jako zasady organiczne mogą być stosowane trójalkiloaminy. Przykładami stosowanych trójalkiloamin są trójetyloamina, trójbutyloamina, trójbenzyloamina, pirydyna lub N-metylopirolidyna. Przykładami zasad nieorganicznych, które mogą być stoso10
PL 197 848 B1 wane, są węglany metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych bądź kwaśne węglany metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych takie, jak przykładowo węglan potasu i kwaśny węglan sodu.
Reakcję w czwartym etapie dogodnie prowadzi się w rozpuszczalniku protycznym. Jako rozpuszczalnik protyczny można stosować niskie alkohole alifatyczne takie jak metanol, etanol, propanol, izopropanol, butanol lub izobutanol.
Reakcję w czwartym etapie dogodnie prowadzi się w temperaturze od 0°C do 150°C, korzystnie od 20°C do 100°C.
W piątym etapie (1S,4R)- lub (1R,4S)-4-[(2-amino-6-chloro-5-formamido-4-pirymidynylo)amino]-2-cyklopenteno-1-metanol (wzory 13 i 14) podlega cyklizacji w znany sposób, jak to ujawniono w WO 95/21161, dając końcowy produkt o wzorze 1 lub 2.
Cyklizację normalnie prowadzi się w rozpuszczalniku takim jak trójalkiloortomrówczan i w obecności wodnego roztwory stężonego kwasu. Przykładami trójalkiloortomrówczanów które mogą być stosowane są trójmetylo- lub trójetyloortomrówczan. Jest możliwe zastosowanie jako wodnego roztworu kwasu, przykładowo, roztworu kwasu solnego, kwasu siarkowego lub kwasu metanosulfonowego.
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania optycznie czynnych związków o wzorach ogólnych 3 i 4, w których R1 ma wyżej podane znaczenie. Powyższe związki można otrzymać przez konwersję pochodnej cyklopentenowej o wzorze ogólnym 9, w którym R1 ma wyżej podane znaczenie, za pomocą mikroorganizmów, hydrolaz N-acetyloaminoalkoholowych lub acylaz penicyliny G, które zostały już uprzednio opisane - do (1R,4S)- lub (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu o wzorach 10 lub 11, przy czym ten ostatni jest acylowany do związku o wzorach 3 lub 4.
Zarówno konwersję mikrobiologiczną jak i acylowanie prowadzi się w warunkach, które jako takie są takie same jak opisano uprzednio.
Acylowanie to dogodnie prowadzi się w temperaturze od 20°C do 100°C, korzystnie od 0°C do 80°C.
Przykładami optycznie czynnych związków wytworzonych według tego sposobu są: (1R,4S)-N-tert-butoksy-karbonylo-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten z przewagą enancjomeru 98%, (1R,4S)-N-acetylo-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten z przewagą enancjomeru 98%, (1R,4S)-N-bytyrylo-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten z przewagą enancjomeru 98%, optycznie czynny (1S,4R)-N-acetylo-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten i optycznie czynny (1S,4R)-N-butyrylo-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten.
Spośród tych związków optycznie czynny (1R,4S)-N-butyrylo-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten jest związkiem, którego dotychczas nie opisano w literaturze. Stosownie do tego, niniejszy wynalazek dotyczy również optycznie czynnego (1R,4S)-N-butyrylo-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu o nadmiarze enancjomeru ponad 0%, korzystnie o nadmiarze enancjomeru co najmniej 80%, 90% lub 95%, w szczególności o nadmiarze enancjomeru co najmniej 98%. Te optycznie czynne związki można poddać racemizacji w sposób znany specjaliście uzyskując racemiczny N-butyrylo-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten, którego dotychczas nie opisano w literaturze.
Wynalazek bliżej objaśniają poniższe przykłady.
P r z y k ł a d 1.
Otrzymywanie (±)-2-acetylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3- onu
100 gramów (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu rozpuszczono w acetonitrylu (800 ml) i pirydynie (161,26 ml) w atmosferze azotu. W temperaturze 12°C dodano po kropli 104,5 g chlorku acetylu w ciągu 2 godzin. Całość następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 4,5 godziny. Do mieszaniny dodano 800 ml wody i odparowano acetonitryl pod zmniejszonym ciśnieniem. Wodną fazę poddano trzykrotnie ekstrahowaniu za pomocą 400 ml octanu etylu. Połączone fazy organiczne przemyto 400 ml 1N HCl, 400 ml wody, 400 ml nasyconego roztworu NaCl, suszono nad siarczanem magnezu i całkowicie odparowano. Pozostałość rozprowadzono chlorkiem metylenu i przefiltrowano przez silikażel. Przesącz zatężono i produkt oczyszczono przez destylację. Otrzymano 107,76 gramów produktu w postaci przejrzystej cieczy. Wydajność 71%.
Temperatura wrzenia (9,33 Pa /0,07 torr/): 51°C.
1H-NMR (CDCls): [ppm] 2,25 (AB syst., 2H);
400 MHz 2,8 (s, 3H);
3,42 (m, 1H);
5,30 (m, 1H);
6,89 (m, 1H);
6,92 (m, 1H);
PL 197 848 B1
P r z y k ł a d II.
Otrzymywanie (±)-2-butyrylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu
100 gramów (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu rozpuszczono w 720 ml acetonitrylu i 142 ml pirydyny w atmosferze azotu. W temperaturze 12°C dodano po kropli 141,8 g chlorku butyrylu w ciągu 1 godziny. Całość następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Do mieszaniny dodano 720 ml wody i rozdzielono fazy. Acetonitryl odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a warstwę wodną poddano trzykrotnej ekstrakcji octanem etylu (300 ml). Połączone fazy organiczne przemyto 350 ml 1N HCl, 400 ml nasyconego roztworu NaCl i 500 ml wody, wysuszono nad siarczanem magnezu i całkowicie odparowano. Produkt oczyszczono przez destylację. Otrzymano 107,76 gramów produktu w postaci przejrzystej cieczy. Wydajność 85%. Temperatura wrzenia (9,33 Pa /0,77 torr/): 70°C.
1H-NMR (CDCls): [ppm] 0,98 (t ,J = 8,5 Hz , 3H)
400 MHz 1,59-,,65 (2H);
2,23 (AB syst., 2H);
2,82 - 2,90 (2H);
3,42 (m, 1H);
5,30 (m, 1H);
6,62 (m, 1H);
6,0 (m, 1H);
P r z y k ł a d III.
Otrzymywanie (±)-2-fenyloacetylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu
33,4 gramów (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu rozpuszczono w 240 ml acetonitrylu i 48,3 ml pirydyny w atmosferze azotu. W temperaturze 12°C dodano po kropli 68,6 gramów chlorku fenyloacetylu w ciągu 30 minut. Całość następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 3,5 godziny. Do mieszaniny dodano 240 ml wody. Acetonitryl odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i warstwę wodną poddano trzykrotnej ekstrakcji octanem etylu (150 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto 150 ml 1N HCl, 150 ml nasyconego roztworu NaCl i 150 ml wody, wysuszono nad siarczanem magnezu i całkowicie odparowano. Surowy produkt przefiltrowano przez silikażel (heksan:octan etylu = 1:1). Otrzymano 78,34 gramów surowego produktu w postaci żółtego oleju.
P r z y k ł a d IV.
Otrzymywanie (±)-2-propionylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu gramów (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu rozpuszczono w 325 ml acetonitrylu i 41 ml pirydyny w atmosferze azotu. W temperaturze 12°C dodano po kropli 43,9 gramów chlorku propionylu w ciągu 1 godziny. Całość następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Do mieszaniny dodano 145 ml wody i odparowano acetonitryl pod zmniejszonym ciśnieniem. Warstwę wodną poddano trzykrotnej ekstrakcji octanu etylu (115 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto 140 ml 1N HCl, 40 ml nasyconego roztworu NaHCO3 i 40 ml nasyconego roztworu NaCl, wysuszono nad siarczanem magnezu i całkowicie odparowano. Pozostałość oczyszczono przez destylację. Otrzymano 55,8 gramów tytułowego związku i pozostawiono do zestalenia. Wydajność 81,6%.
Temperatura wrzeni (2,8 x 102 Pa /2,8 mHtóarów^ 75-80°C.
Temperatura topnienia: 54-56°C.
1H-NMR (CDCl3): [ppm] 0,95 (t,3^;
400 MHz 2,10 kwartet , 1H;;
2,28 (kwartet, 1H);
2,64 (m, 2H);
3,42 (s, 1H);
5,16 (s, 1H);
6,78 (m, 1H);
6,96 (m, 1H);
P r z y k ł a d V.
Otrzymywanie (±)-2-izobutyrylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu
45,1 gramów (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu rozpuszczono w 310 ml acetonitrylu i 39 ml pirydyny w atmosferze azotu. W temperaturze 10°C dodano po kropli 54,1 gramów chlorku izobutyrylu w ciągu 1 godziny. Całość następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Do mieszaniny dodano 140 ml wody i odparowano acetonitryl pod zmniejszonym ciśnieniem. Warstwę wodną ekstrahowano 4 porcjami po 120 ml octanu etylu. Połączone warstwy organiczne przemyto 50 ml
PL 197 848 B1
1N HCl, 50 ml nasyconego roztworu NaHCO3 i 50 ml nasyconego roztworu NaCl, wysuszono nad siarczanem magnezu i całkowicie odparowano. Pozostałość ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w 240 ml n-heksanu z aktywnym węglem. Po odsączeniu węgla aktywnego przesącz ochłodzono do temperatury 0°C i odsączono tytułowy związek. Otrzymano 54,5 gramów produktu. Wydajność 76%.
Temperatura topnienia: 41-42°C.
1H-NMR (CDCla): [ppm] 0,92 (d, 3H);
400 MHz 1,06 dd , 3H);
2,10 (m, 1H);
2.28 (m, 2H);
3,40 (m, 2H);
5,16 (s, 1H);
6,78 (m, 1H);
7,92 (m, 1H);
P r z y k ł a d VI.
Otrzymywanie (±)-2-chloroacetylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu
10,1 gramów (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu rozpuszczono w mieszaninie 10 ml dwuchlorometanu, 8,4 ml pirydyny i 0,22 gramów 4-N,N-dwumetyloaminopirydyny w temperaturze 10°C w atmosferze azotu. Następnie dodano po kropli 13,5 gramów chlorku chloroacetylu w ciągu 1 godziny. Temperatura wzrosła do 44°C. Mieszaninę następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez dalsze 2 godziny. Do mieszaniny dodano 100 ml wody. Po rozdzieleniu faz warstwę wodną ekstrahowano 100 ml dwuchlorometanu. Połączone warstwy organiczne suszono nad siarczanem magnezu i całkowicie odparowano. Pozostałość ogrzewano pod chłodnicą zwrotną do wrzenia w 100 ml eteru dwuizopropylowego w obecności 1 grama węgla aktywnego przez 10 minut. Po odsączeniu na gorąco przesącz ochłodzono do temperatury pokojowej i osad odsączono i suszono. Otrzymano 10,35 gramów tytułowego związku. Wydajność 60%.
Temperatura topnienia: 86-88°C.
1H-NMR (CDCls): [ppm] 2,28 dd , 1H);;
400 MHz 2,40 0 , W
3,48 (s, 1H);
4,56 (d, 2H);
5,30 (s, 1H);
6,70 (d, 1H);
6,94 (m, 1H);
P r z y k ł a d VII. Otrzymywanie (±)-1-acetyloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu 79,56 gramów (±)-2-acetylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu rozpuszczono w 450 ml etanolu w atmosferze azotu i oziębiono do temperatury -10°C. Następnie dodano porcjami 19,8 gramów borowodorku sodu w ciągu 45 minut. Mieszaninę następnie mieszano w temperaturze 0°C przez 3 godziny, po czym pH roztworu doprowadzono do 1,8 dodając stężony kwas siarkowy. Do mieszaniny dodano 200 ml octanu etylu i osad odsączono i całkowicie odparowano. Pozostałość rozprowadzono wodą, przemyto chlorkiem metylenu i odparowano. Surowy produkt oczyszczono na drodze filtracji przez silikażel. Otrzymano 51,83 gramów produktu w postaci białej substancji stałej. Wydajność wynosiła 64% względem zastosowanego (±)-2-acetylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu.
1H-NMR (DMSO-d6): [ppm] ^(ιη , m;;
400 MHz W, 3H;;
2.29 (m, 1H);
2,66 (m, 1H);
3,35 (s, 2H);
4,58 (s, 1H);
4,72 (m, 1H);
5,61 (d, 1H);
5,85 (d, 1H);
7,83 (d, 1H).
P r z y k ł a d VIII.
Otrzymywanie (±)-1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu
PL 197 848 B1
73,87 gramów (±)-2-butyrylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu rozpuszczono w 400 ml etanolu w atmosferze azotu i oziębiono do temperatury -10°C. Następnie dodano porcjami 15,68 gramów borowodorku sodu w ciągu 45 minut. Mieszaninę następnie mieszano w temperaturze 0°C przez 3 godziny, po czym pH roztworu doprowadzono do 1,5 dodając stężony kwas siarkowy. Do mieszaniny dodano 200 ml octanu etylu i osad odsączono a następnie całkowicie odparowano. Pozostałość rozprowadzono wodą, przemyto chlorkiem metylenu, odparowano i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 60,55 gramów produktu. Wydajność wynosiła 80% względem (±)-2-butyrylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu.
Temperatura topnienia: 71-72°C.
1H-NMR (CDCls): [ppm] 0,98 ^t, J=8,5 Hz , 3H;;
400 MHz 14^O-1^^O11H);
1,58 - 1,68 (2H);
2,10 - 2,18 (2H);
2,42 - 2,55 (1H);
2,85 (m, 1H);
3,62 (AB syst., 2H);
4,98 (m, 1H);
5.78 - 5,82 (1H);
6.38 (m, 1H).
P r z y k ł a d IX.
Otrzymywanie (±)-1-fenyloacetamido-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu gramów surowego (±)-2-fenyloacetylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu rozpuszczono w 450 ml etanolu w atmosferze azotu i oziębiono do temperatury -10°C. Następnie dodano porcjami
13,2 gramów bbrowoodrku soou w ciągu 1 ggodiny. Mieszzninę nastęęnie mieszzno w temppraturzz 0°C przez 3,5 godziny, po czym pH roztworu doprowadzono do 1,8 dodając stężony kwas siarkowy. Mieszaninę tę oczyszczono metodą filtracji przez silikażel (heksan:octan etylu = 2:8). Po rekrystalizacji z octanu etylu otrzymano 15,89 gramów białej substancji stałej. Wydajność wynosiła 80% względem (±)-2-fenyloacetylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu.
1H-NMR (CDCla): [ppm] 1,28 - T35 1 HI
400 MHz 1,40 (m , m;;
2.38 - 2,45 (2H);
2.79 (m, 1H);
3,50 (AB syst., 2H);
3,52 (s, 3H);
4.98 (m, 1H);
5,75 (m, 2H);
5.98 (m, 1H);
7,20 - 7,38 (5H);
P r z y k ł a d X.
Otrzymywanie (±)-1-BOC-arnino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu (BOC = grupa tert-butoksykarbonylowa) gramów surowego chlorowodorku (±)-1-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopentenu (otrzymanego w sposób opisany w J. Org. Chem. 1981, 46, 3268) rozpuszczono w mieszaninie 150 ml wody i 150 ml dioksanu w temperaturze pokojowej w atmosferze azotu. Odczyn roztworu doprowadzono do wartości pH=14 dodając 1N roztwór NaOH, po czym dodano roztwór fluorku tert-butoksykarbonylu (BOC-F, 20% nadmiar) w eterze dwuetylowym i mieszaninę mieszano przez dalsze 3 godziny w temperaturze pokojowej (BOC-F otrzymano w sposób podany w Synthesis 1975, 599). Odczyn roztworu doprowadzono do pH=2 dodając stężony HCl. Po oddestylowaniu organicznych rozpuszczalników do pozostałości dodano 50 ml wody i mieszaninę ekstrahowano trzema porcjami po 100 ml octanu etylu. Połączone fazy organiczne całkowicie odparowano. Pozostałość krystalizowano z mieszaniny 110 ml eteru dwuizopropylowego i 80 ml n-heksanu. Otrzymano 11,95 gramów tytułowego związku. Wydajność wynosiła 56%.
Temperatura topnienia: 68-70°C.
1H-NMR (DMSO-d6): [ppm] T18(m , m;;
400 MHz 1,38 Ss, 9H;;
2,26 (m, 1H);
PL 197 848 B1
2.65 (m, 1H);
3.33 (t, 2H);
4,45 (m, 1H);
4,55 (t, 1H);
5,62 (m, 1H);
5,79 (m, 1H);
6,73 (d, 1H);
P r z y k ł a d XI.
Otrzymywanie (±)-1-propionyloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu
16,6 gramów (±)-2-propionylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu rozpuszczono w 140 ml wody i 66 ml 2-butanolu w atmosferze azotu i oziębiono do temperatury -5°C. Następnie dodano porcjami 3 gramy borowodorku sodu w ciągu 2 godzin. Mieszaninę mieszano w temperaturze 10°C przez 2,5 godziny, po czym odczyn roztworu doprowadzono do pH=2,2 dodając stężony kwas solny i wodę (1:1). Roztwór odparowano do masy 40 gramów i doprowadzono do pH=6,2 dodając 2N NaOH. Mieszaninę ekstrahowano pięcioma porcjami po 50 ml dwuchlorometanu. Połączone fazy organiczne całkowicie odparowano, a pozostałość rekrystalizowano ze 150 ml toluenu. Otrzymano 11,1 gramów tytułowego związku. Wydajność wynosiła 65%.
Temperatura topnienia: 67-68°C.
1H-NMR (DMSO-d6): [ppm] 0,96 (t, 3H);
400 MHz 1,16 (kwintet , 11-0;
2,04 (kwartet, 2H);
2,26 (m, 1H);
2.66 (m, 1H);
3.34 (m, 2H);
4,58 (t, 1H);
4.72 (m, 1H);
5,61 (m, 1H);
5,84 (m, 1H);
7.72 (d, 1H).
P r z y k ł a d XII.
Otrzymywanie (±)-1-izobutyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu 9 gramów (±)-2-izobutyrylo-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu rozpuszczono w 32 ml wody i 84 ml 2-butanolu w atmosferze azotu i oziębiono do temperatury 0°C. Następnie dodano porcjami 1,37 grama borowodorku sodu w ciągu 3,5 godziny. Mieszaninę mieszano w temperaturze 20°C przez dalsze 3 godziny, po czym odczyn roztworu doprowadzono do pH=2,5 dodając mieszaninę stężonego kwasu solnego i wody (1:1), a następnie zobojętniono 2N NaOH. Roztwór odparowano do masy 40 gramów. Pozostałość ekstrahowano trzema porcjami po 80 ml dwuchlorometanu. Połączone fazy organiczne całkowicie odparowano. Otrzymaną substancję krystalizowano z 25 ml toluenu. Otrzymano 6,8 grama tytułowego związku. Wydajność wynosiła 73,6%.
Temperatura topnienia: 80-81°C.
1H-NMR (DMSO-d6): [ppm] 0,98 (d, 61-0;
400 MHz ,116 , H-0;
2,30 (m, 2H);
2.68 (m, 1H);
3,32 (t, 2H);
4,58 (t, 1H);
4,70 (m, 1H);
5,61 (m, 1H);
5,82 (m, 1H);
7.68 (d, 1H).
P r z y k ł a d XIII.
Otrzymywanie (1R,4S)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu przy użyciu acylaz penicyliny G. Do biotransformacji stosowano acylazy penicyliny G EC 3.5.1.11 z E.coli (Boehringer Mannheim) 165 U (jednostek)/gram lub acylazę penicyliny G EC 3.4.1.11 z Bacillus megaterium.
PL 197 848 B1
W tym celu inkubowano 50 mM bufor fosforanowy (pH=5 - 9; 4 ml) z 1% wag. nieracemicznego 1-fenyloacetyloamino-4-hydroksymetylo-2-cyklopentenu i 400 mg odpowiedniej acylazy penicyliny G, w temperaturze 37°C.
Próbki pobierano po upływie określonych przedziałów czasu i analizowano metodą chromatografii cienkowarstwowej (silikażel 60, butanol:woda:kwas octowy lodowaty=3:1:1; detekcja ninhydryną), chromatografii gazowej (kolumna kapilarna, HP-5, 5% fenylometylosiloksan) lub HPLC. Enzym usuwał grupę fenyloacetylową z wysoką aktywnością i tym samym uwalniał do 40% odpowiedniego aminoalkoholu. Wolny aminoalkohol otrzymano z 80% nadmiarem enancjomeru.
P r z y k ł a d XIV.
Otrzymywanie (1R,4S)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu przy użyciu mikroorganizmów. XIV.1 Szlam ściekowy (20%) ze stacji uzdatniania wody ARA w Visp inkubowano w środowisku pożywki A + N (patrz Tabela 1) zawierającym 0,5% wagowych 1-acetylo-, 1-propionylo-, 1-izobutyrylolub 1-butyrylo-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopentenu, z wytrząsaniem, w temperaturze 37°C. Tworzenie się (1R,4S)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu monitorowano metodą chromatografii cienkowarstwowej.
Przeniesienia 1-3 przeprowadzono przy użyciu 1% tych substancji wzbogacających, a wyodrębnienie miało miejsce na stałych pożywkach (agar ze zliczaniem płytek w pożywce z Tabeli 1; 20 g/l). W ten sposób wyodrębniono Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Gordona sp. CB 100 (DSM 10687) oraz Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11292).
XIV.2 Mikroorganizmy wyodrębnione na tej drodze hodowano w pożywce (Tabela 1) zawierającej 0,5% 1-acetylo-, 1-propionylo-, 1-izobutyrylo- lub 1-butyrylo-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopentenu. Wzrost gęstości optycznej (OD) ich kultur od 2 do 3 następował w czasie od 24 do 36 godzin. Komórki otrzymane w ten sposób zebrano w ostatniej wykładniczej fazie wzrostu i przemyto 10 mM. buforem fosforanowym.
Następną biotransformację prowadzono w 50 mM buforze fosforanowym (pH=4,5-9) zawierającym 1% wagowych 1-acetylo-, 1-izobutyrylo- lub 1-butyrylo-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopenten. Metodą chromatografii cienkowarstwowej stwierdzono, że 50% substratu zhydrolizowało do (1R,4S)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu. Metodą analizy HPLC stwierdzono nadmiar enancjomerów pomiędzy 80 a 93 %.
Kiedy jako substrat zastosowano 1-butyryloamino-4-hydroksymetylo-2-cyklopenten szybkość biotransformacji wyniosła 0,14 (g/l/h/OD) dla szczepu DSM 10686 kiedy hodowla przebiegała w pożywce A + N, zaś 0,03 (g/l/h/OD) kiedy hodowla przebiegała w pożywce NYB (drożdżowa pożywka bulionowa) zawierającej 1-butyrylo-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopenten.
W przypadku kiedy taka sama konwersja miała miejsce w przypadku szczepu DSM 10687 przy stężeniu substratu (1-butyryloamino-4-hydroksymetylo-2-cyklopenten) 200 mM - szybkość biotransformacji wynosiła 0,161 (g/l/h/OD).
T a b e l a 1. Pożywka A + N
MgCl2 0,4 g/l
CaCl2 0,014 g/l
FeCla 0,8 g/l
Na2SO4 0,1 g/l
KH2PO4 1 g/l
Na2HPO4 2,5 g/l
NaCl 3 g/l
Roztwór witamin 1ml/l
Roztwór mikroelementów 1 ml/l
pH=7,5
XIV.3 Rhodococcus erythropolis DSM 10686 hodowano w minimalnej pożywce (Tabela 2) z octanem amonu (3 g/l) jako źródłem węgla i azotu w 6-litrowym fermentorze, w temperaturze 30°C do stężenia komórek OD650 nm > 25. Podczas wzrostu komórek dodawano w sposób ciągły 50% kwas octowy jako dodatkowe źródło węgla. Aby indukować aktywność enzymatyczną dodano następnie 60 g (±)-1-acetyloamino-4-hydroksymetylo-2-cyklopentenu i inkubację kontynuowano przez kilka godzin. Na koniec dodano dalsze 40 g (±)-1-acetyloamino-4-hydroksymetylo-2-cyklopentenu, a następnie inkubację prowadzono przez dalsze 10 godzin. Postęp biotransformacji śledzono na bieżąco metodą HPLC.
PL 197 848 B1
Kiedy osiągnięto analityczną wydajność 40%, w przeliczeniu na wykorzystany substrat racemiczny zaś nadmiar enancjomeru - 85%, fermentację zatrzymano przez dodanie kwasu.
T a b e l a 2. Skład pożywki
Komponent: Stężenie
Ekstrakt drożdży 0,5 g/l
Pepton M66 0,5 g/l
KH2PO4 4,0 g/l
Na2HPO4 x 2H2O 0,5 g/l
K2SO4 2,0 g/l
octan amonu 3,0 g/l
CaCh 0,2 g/l
MgCh x 6H2O 1,0 g/l
Roztwór mikroelementów 1,5 g/l
(patrz poniżej)
PPG (glikol polipropylenowy) 0,1 g/l
Roztwór mikroelementów
KOH 15,1 g/l
EDTA-Na x 2^O 100,0 g/l
ZnSO4 x 7H2O 9,0 g/l
MnCl2 x 4H2O 4,0 g/l
H3BO3 2,7 g/l
CoCl2 x 6H2O 1,8 g/l
CuCl2 x 2H2O 1,5 g/l
NiCh x 6H2O 0,18 g/l
Na2MoO4 x 2^O 0,27 g/l
XIV.4 Podobnie jak w przykładzie XIV.3 mikroorganizmy Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium /Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2 i Pseudomonas putida K32 poddano hodowli z octanem sodu w pożywce (Tabela 1) z dodatkiem lub bez 1-acetylo-, 1-propionylo-, 1-izobutyrylolub 1-butyrylo-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopentenu, które dalej skrótowo nazywane są aminoalkoholami.
Szczep
HSZ 5 (DSM 10328) HSZ 17 (DSM 10329) K32
CB101 (DSM 10686)
Następujące wyniki uzyskano przy użyciu komórek eksponencjalnych hodowanych bez aminoalkoholi (analiza HPLC):
Stopień nddmia renancjomeru/
[mmol/OD.h] /Κοηννβ^3[%]
0,05 88,U/W
0,005 95/23
0,05 44H
0,1 84339
Szczepy K2 i K17 hodowlano, zebrano i poddano 60-godzinnej biotransformacji.
Szczep Sybbkśćć nddmie renancjomeru/
[mmol/OD.h] /konwercję [%]
K2 ć 9^110
HSZ 30 ć 9//,,5
Eksponencjalne i stacjonarne komórki zebrano ze wszystkich rzutów i wykorzystano jako komórki niewzrostowe dla biotransformacji. Nie zaobserwowano żadnych różnic na podstawie analizy metodą TLC (chromatografii cienkowarstwowej) pomiędzy początkową szybkością komórek indukowanych aminoalkoholem oraz nieindukowanych.
P r z y k ł a d XV.
Oczyszczanie hydrolazy N-acetyloaminoalkoholowej z Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686)
Enzym oczyszczono jak to opisano poniżej aż do chwili, gdy analiza metodą SDS-PAGE (Pharmacia Phast gel, gradient 10-15%) ujawniła pojedyncze pasmo białkowe, przy ciężarze cząsteczkowym 50 kD.
PL 197 848 B1
Komórki Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686) przemyto 50 mM buforem tris (pH=6,2) i zatężono do gęstości optycznej OD650 nm 190. Po dodaniu fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF) do końcowego stężenia 1 mM i DNAse komórki poddano działaniu prasy francuskiej w celu otrzymania surowego ekstraktu. Po odwirowaniu otrzymano 200 ml wolnego od komórek ekstraktu o stężeniu białek 4,8 mg/ml.
960 mg wolnego od komórek ekstraktu załadowano na jonowymienną kolumnę chromatograficzną HiLoad 26/10 Q-sepharose (Pharmacia), którą zrównoważono 50 mM buforem tris (pH=8,0) zawierającym 1 mM dwutiotreitolu (DTT).
Po przemyciu kolumny tym samym buforem białka eluowano przy użyciu buforu o liniowym gradiencie [1500 ml; gradient: 50 mM bufor tris (pH=8,0) zawierający 1 mM DTT - 50 mM bufor tris (pH=7,0) zawierający 1 mM DTT i 1 M NaCl. Enzym eluowano z kolumny między 370 i 430 mM NaCl i przy pH=7,0. Aktywne frakcje zebrano i zatężono do 9 ml. Zawartość białka wyniosła 41 mg.
W celu dalszego oczyszczania roztwór białka umieszczono na chromatograficznej kolumnie żelowej HiLoad 26/60 Superdex 75 (Pharmacia), którą zrównoważono 50 mM buforem tris zawierającego 50 mM NaCl i 1 mM DTT. Połączone aktywne frakcje zawierały całkowitą ilość białka 10,9 mg.
Ten roztwór białka umieszczono na kolumnie Mono Q HR5/5 (Pharmacia), którą zrównoważono 50 mM buforem tris (pH=8,5) zawierającym 1 mM DTT. Białka eluowano z liniowym gradientem (40 ml) 50 mM buforem tris zawierającym 1 mM DTT - 50 mM buforem tris (pH=8,5) zawierającym 1 mM DTT i 1 M NaCl. Enzym eluowano pomiędzy 390 mM NaCl i 440 mM NaCl. Aktywne frakcje zawierały 1,4 mg białka.
W ostatnim etapie oczyszczania stosowano tę samą kolumnę zrównoważoną takim samym buforem. Użyto do eluowania takiego samego gradientu buforu z dodatkiem 0-500 mM NaCl i pH=7,0 - 8,5. W ten sposób było możliwe wyodrębnienie 430 μο, czystego enzymu.
N-końcową sekwencję enzymu oznaczono bezpośrednio posługując się blotem proteinowym. Otrzymano sekwencję następujących 20 aminokwasów:
Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn.
Sekwencja ta nie wykazywała żadnej homologii ze znanymi białkami.
P r z y k ł a d XVI.
Charakterystyka enzymu
Charakterystykę enzymu przeprowadzono zarówno dla oczyszczonego enzymu jak i dla wolnego od komórek ekstraktu który odsolono przy użyciu kolumny Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia).
Stężenie białka w wolnym od komórek ekstrakcie wyniosło 7,3 mg/ml, a stężenie białka w oczyszczonym enzymie wyniosło 135 /ig/ml. Nie dodano PMSF do wolnego od komórek ekstraktu. XVI. 1 Oznaczenie Km
Oznaczenie Km przeprowadzono w ekstrakcie wolnym od komórek. Km dla reakcji przy pH=7,0 i w temperaturze 30°C wyniosło 22,5 mM dla substratu 1-acetyloamino-4-hydroksymetylo-2-cyklopentenu. XVI.2 Optymalna wartość pH
Optymalną wartość pH dla hydrolizy 1-acetamino-4-hydroksymetylo-2-cyklopentenu (25 mM) oznaczono dla oczyszczonego enzymu i w ekstrakcie wolnym od komórek w przedziale pH 6,2-9, w następujących roztworach buforowych:
Bufor tris 100 mM, pH: 9,0; 8,5; 8,0; 7,5; 7,0.
Bufor cytrynian/fosforan 100 mM, pH: 7,0; 6,55; 6,2.
Aktywność mierzono w ciągu 24 godzin.
Optymalna wartość pH dla reakcji zawierała się między 7,0 a 7,5 dla otrzymania enancjomerów (1R,4S) i (1S,4R).
Optymalna wartość pH dla aktywności w ekstrakcie wolnym od komórek wynosiła 7,0. Jednakże selektywność była lepsza w zakresie między pH=6,0 a pH=7,0.
Na rysunku Fig. 1 pokazano aktywność hydrolazy N-acetyloaminoalkoholowej (ekstrakt wolny od komórek) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) w funkcji pH. Optymalna temperatura dla reakcji wskazanej w przykładzie XVI2 wyniosła między 25°C a 30°C.
Na rysunku Fig. 2 pokazano aktywność hydrolazy N-acetyloaminoalkoholowej (ekstrakt wolny od komórek) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) w funkcji temperatury.
PL 197 848 B1
XVI.4 Ciężar cząsteczkowy określono metodą SDS-PAGE i wynosił 50 kD.
XVI.5 Następujące substraty poddano hydrolizie; 1-acetylo-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopenten, 1-butyrylo-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopenten. 1-propionylo-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopenten i 1-izobutyrylo-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopenten.
P r z y k ł a d XVII.
Otrzymywanie chlorowodorku (1R.4S)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu
374.1 grama roztworu (1R.4S)-1-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopentenu (otrzymanego w sposób podobny jak w przykładzie XIV) odparowano do 123.7 g. Roztwór zawierał 60.2 mmola powyższego związku (HPLC). Roztwór doprowadzono od pH=2 do pH=11.7 za pomocą 30% NaOH. po czym ekstrahowano 3 x 70 ml izobutanolu. Połączone ekstrakty izobutanolowe doprowadzono do pH=1 za pomocą gazowego HCl. zatężono do 65 gramów i przesączono (usunięto stałe zanieczyszczenia). Po kropli dodano 60 ml acetonu do energicznie mieszanego przesączu w temperaturze 20°C. Mętną mieszaninę zaszczepiono kryształami tytułowego związku i mieszano w temperaturze 5°C przez 1 godzinę. Po przesączeniu i wysuszeniu otrzymano 5.2 g produktu. Wydajność wyniosła 58%.
Temperatura topnienia: 125-127°C nadmiar enancjomeru 98% (kalibrowana chiralna kolumna HPLC).
1H-NMR (DMSO-d6): [ppm] 1,44 (m, 1H)
400 Hz 2,35(m ,-IH)
2.83 (m. 1H)
3.42 (m. 2H)
4.10 (s. 1H)
4.80 (s. 1H)
5.80 (d. 1H)
6.06 (d. 1H)
8.13 (s. 3H)
P r z y k ł a d XVIII.
Otrzymywanie (1R.4S)-1-BOC-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu gramów roztworu (1R.4S)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu (otrzymanego podobnie jak w przykładzie XIV; 44.6 mmoli związku) doprowadzono do pH=8 za pomocą 30% roztworu NaOH i dodano 6 gramów NaHCO3. Mieszaninę ogrzano do temperatury 52°C. Podczas energicznego mieszania dodano 60 ml eteru dwuizopropylowego. po czym stopniowo odmierzając dodano roztwór 11.12 g bezwodnika BOC w 18.2 ml eteru dwuizopropylowego w ciągu 2 godzin. Mieszaninę poddano filtracji przez Celite i rozdzielono fazy. Warstwę wodną ekstrahowano 65 ml eteru dwuizopropylowego. Połączone warstwy organiczne przemyto 45 ml wody po czym odparowano do 37.5 g i ogrzewano do temperatury 50°C. Następnie dodano po kropli 31 ml n-heksanu. Po powolnym (w ciągu 2 godzin) oziębieniu do temperatury 0°C odsączono tytułowy związek. przemyto 12 ml mieszaniny n-heksan/eter dwuizopropylowy 1:1 i wysuszono. Otrzymano 6.75 g produktu. Wydajność wyniosła 71%.
Temperatura topnienia: 70-71°C;
nadmiar enancjomeru wyniósł 98% (kalibrowana chiralna kolumna HPLC).
1H-NMR (DMSO-d6): [ppm] υβ^η, m);
400 MHz T27 (s, 9H);
2.28 (m. 1H);
2.63 (m. 1H);
3.33 (q. 2H);
4.43 (m. 1H);
4.56 (t. 1H);
5.62 (m. 1H);
5.78 (m. 1H);
6.72 (d. 1H).
P r z y k ł a d XIX.
Otrzymywanie chlorowodorku (1R.4S)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu
87.8 gramów roztworu (1R.4S)-1-BOC-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu rozpuszczono w 270 ml roztworu 2N HCl i 1340 ml metanolu. Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 4.5 godziny. Po oddestylowaniu metanolu pozostałość rozpuszczono w 800 ml wody. Wodny roztwór ekstrahowano dwukrotnie 340 ml octanu etylu. Warstwę wodną całkowicie odparowaPL 197 848 B1 no (50°C, 6 x 103Pa /60 milibarów/). Stałą pozostałość wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 50°C, rozproszono w 150 ml eteru dwuetylowego, przesączono i przemyto dwukrotnie 50 ml eteru dwuetylowego. Po wysuszeniu otrzymano tytułowy związek z wydajnością 95% (58,4 gramów).
Dane fizyczne i spektroskopowe produktu były takie same jak w przykładzie XVII.
P r z y k ł a d XX.
Otrzymywanie (1R,4S)-1-acetyloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu gramów chlorowodorku (1R,4S)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu rozpuszczono w 182 ml bezwodnika octowego w temperaturze 0°C i dodano roztwór 18,25 g trójetyloaminy w 60 ml bezwodnika octowego. Mieszaninę mieszano w temperaturze 80°C przez 3 godziny po czym ochłodzono do temperatury pokojowej. Chlorowodorek trójetyloaminy odsączono i przemyto 120 ml n-heksanu. Przesącz odparowano. Pozostałość zmieszano z 300 ml toluenu i mieszano w temperaturze pokojowej w obecności 5,2 g węgla aktywnego i 13 g Celite przez 20 minut. Po odsączeniu i przemyciu placka filtracyjnego (3 x 40 ml toluenu) rozpuszczalnik całkowicie odparowano. Pozostałość zmieszano ze 180 ml metanolu i 15,5 g K2CO3 i mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 godzin. Zawiesinę przesączono, a przesącz odparowano. Pozostałość rozproszono w 750 ml octanu izopropylowego i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w obecności 0,5 grama węgla aktywnego. Po odsączeniu węgla aktywnego (70-80°C) przesącz oziębiono przez noc do temperatury 0°. Tytułowy związek odsączono, przemyto 80 ml zimnego octanu izopropylowego i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 17,2 g produktu.
Wydajność wyniosła 66%.
Temperatura topnienia: 77-80°C;
nadmiar enancjomeru wyniósł 98% (kalibrowana chiralna kolumna HPLC).
1H-NMR (DMSO-d6): [ppm] 1,15(m , 1H);
400 MHz 1/78 (s, 3H);
2,25 (m, 1H);
2,66 (m, 1H);
3,35 (m, 2H);
4,58 (t, 1H);
4,70 (m, 1H);
5,62 (m, 1H);
5,85 (m, 1H);
7,80 (d, 1H).
P r z y k ł a d XXI.
Otrzymywanie (1S,4R)-1-acetyloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu
Okazało się możliwe otrzymanie tytułowego enancjomeru w sposób opisany w przykładzie XVIII wychodząc z 25 gramów chlorowodorku (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu (wydajność 68%). Spektroskopowe i fizyczne dane produktu były takie same jak w przykładzie XX.
P r z y k ł a d XXII.
Otrzymywanie (1R,4S)-1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu
34,7 gramów chlorowodorku (1R,4S)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu i 2 gramy
4-N,N-dwumetyloaminopirydyny rozpuszczono w 600 ml chlorku metylenu. Roztwór oziębiono do temperatury 0°C. Następnie dodano po kropli 52 gramy trójetyloaminy w ciągu 5 minut. Mieszaninę mieszano przez dalsze 30 minut. Następnie do mieszaniny dodano w ciągu 1 godziny w temperaturze 0°C roztwór 35,2 g chlorku butyrylu w 60 ml chlorku metylenu. Mieszaninę mieszano w temperaturze między 0°C a 20°C przez dalsze 1,5 godziny, po czym dodano 600 ml wody. Po rozdzieleniu warstw fazę wodną ekstrahowano 600 ml chlorku metylenu. Połączone fazy organiczne przemyto trzykrotnie 500 ml 10% roztworu NaOH za każdym razem, po czym całkowicie odparowano. Wysuszoną stałą pozostałość rozpuszczono w 120 ml metanolu. Roztwór zmieszano z 5 g K2CO3 i mieszano przez dalsze 2 godziny w temperaturze pokojowej. Nieorganiczne sole odsączono i przemyto 20 ml metanolu. Przesącz zneutralizowano 2N HCl. Zawiesinę przesączono i placek filtracyjny przemyto 20 ml metanolu. Przesącz całkowicie odparowano. Stałą pozostałość suszono i krystalizowano ze 150 ml toluenu. Otrzymano 28,5 gramów tytułowego związku.
Wydajność wyniosła 67%.
Temperatura topnienia: 71-72°C;
nadmiar enancjomeru wyniósł 98% (kalibrowana chiralna kolumna HPLC).
PL 197 848 B1 1H-NMR (DMSO-ds): [ppm] 0,85 (t , 3H);
400 MHz 1i15mn ,1H);
1,50 (q, 2H);
2,03 (d, 2H);
2,28 (m, 1H);
2.67 (m, 1H);
3,35 (d, 2H);
4.62 (s, 1H);
4.76 (m, 1H);
5.63 (m, 1H);
5,85 (m, 1H);
7.77 (d, 1H).
P r z y k ł a d XXIII.
Otrzymywanie (1S,4R)-1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu
Okazało się możliwe otrzymanie tytułowego enancjomeru w sposób opisany w przykładzie XX wychodząc z 34,7 gramów chlorowodorku (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu (wydajność 63%). Spektroskopowe i fizyczne dane produktu były takie same jak w przykładzie XXII.
P r z y k ł a d XXIV.
Otrzymywanie (1R.4S)-1 -[(2-amino-6-chloro-5-ff>rmamido-4-pirymidynylo)amino]-4-(hydroksymetylo)-2-cyklo pentenu
2,07 gramów N-(2-amino-4,6-dwuchloro-5-pirymidynylo)formamidu ogrzano do temperatury 80°C w 40 ml izobutanolu (biała zawiesina). Do mieszaniny dodano roztwór 1,97 g chlorowodorku (1R,4S)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu, 3,8 g trójetyloaminy i 15 ml izobutanolu. Całość mieszano w temperaturze 80°C przez dalsze 13 godzin. Do przejrzystego roztworu dodano 10 ml 1N NaOH w temperaturze 20°C, po czym odparowano do sucha. Pozostałość poddano chromatografii impulsowej (kolumna wypełniona silikażelem 60, długość 8 cm, średnica 6,5 cm, eluent octan etylu/metanol 95:5). Po odparowaniu eluenta i wysuszeniu pozostałości otrzymano 2,1 g tytułowego związku. Wydajność wyniosła 74%.
Temperatura topnienia: 174-176°C;
nadmiar enancjomeru wyniósł 98% (kalibrowana chiralna kolumna HPLC).
1H-NMR (DMSO-d6): [ppm] , ,31 (m , H I-O;
400 MHz 2,35 (m, H-O;
2,73 (m, 1H);
3,38 (t, 2H);
4.68 (m, 1H);
5,08 (m, 1H);
5,70 (d, 1H);
6,40; 6,55 i 6,65 (s,d i d, razem 3H);
7.78 i 8,10 (d i s, razem 1H);
8,55 i 8,95 (d i s, razem 1H).
P r z y k ł a d XXV.
Otrzymywanie (1R.4S)-1-[(2-amino-6-chloro-5-forraamido-4-pirymidynylo)amino[-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu
145,2 ml roztworu (1R,4S)-1-amino-4-hydroksymetylo-2-cyklopentenu (otrzymywanie podobne do opisanego w przykładzie XIV) zatężono do 25,5 ml i poddano filtracji przez Celite. Placek filtracyjny przemyto 7,5 ml wody. Przesącz zawierał 17,7 mmoli powyższego związku (HPLC) i pH przesączu obniżono z 6,6 do pH = 1 dodając stężony HCl, po czym ekstrahowano trzykrotnie 20 ml izobutanolu. Organiczną warstwę odrzucono. Warstwę wodną doprowadzono do pH=12 dodając 30% NaOH i ekstrahowano trzykrotnie 10 ml izobutanolu. Połączone organiczne fazy odparowano do 15 ml i dodano 2,53 g trójetyloaminy. Do mieszaniny dodano roztwór 2,07 g N-(2-amino-4,6-dwuchloro-5-pirymidynylo)formamidu w 40 ml etanolu, jak w przykładzie XXIV. Mieszaninę mieszano w temperaturze 80°C przez 16 godzin. Postępując jak w przykładzie XXII otrzymano 2,4 g tytułowego związku. Wydajność wyniosła 85%.
Fizyczne i spektroskopowe dane produktu były takie same jak w przykładzie XXIV.
PL 197 848 B1

Claims (17)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania (1S,4R)- lub penteno-1 -metanolu lub jego soli, o wzorze - odpowiednio, 1 lub 2, znamienny tym, że w pierwszym etapie acyluje się (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-on o wzorze 5 otrzymując pochodną (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu o wzorze ogólnym 6, w którym r1 oznacza grupę C^-alkilową, C1-4-alkoksylową, aryIową lub aryloksylową, a następnie w drugim etapie związek o wzorze ogólnym 6 poddaje się redukcji do pochodnej cyklopentenu o wzorze ogólnym 9, w którym r1 ma wyżej podane znaczenie, z kolei w trzecim etapie związek o wzorze ogólnym 9 przekształca się stosując mikroorganizm zdolny do wykorzystania pochodnej cyklopentenu o wzorze ogólnym 9 w charakterze wyłącznego źródła azotu, wyłącznego źródła węgla lub wyłącznego źródła węgla i azotu, enzym posiadający aktywność hydrolazy N-acetyloaminoalkoholowej bądź acylazę penicyliny G, z wytworzeniem (1R,4S)lub (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu o wzorze 10 lub 11, po czym związek o wzorze 10 lub 11 poddaje się w czwartym etapie reakcji z N-(2-amino-4,6-dwuchloro-5-pirymidylo)formamidem o wzorze 12 z wytworzeniem (1S,4R)- lub (1R,4S)-4-[(2-amino-6-chloro-5-formamido-4-pirymidynylo)amino]-2-cyklopenteno-1-metanolu o wzorze - odpowiednio, 13 lub 14, a w piątym etapie związek ten poddaje się cyklizacji w znany sposób otrzymując końcowy produkt o wzorze - odpowiednio, 1 lub 2.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że acylowanie w pi^rr^^^'^rm etapie prowadzi się stosując halogenek karbonylowy o wzorze ogólnym 7, w którym r1 ma wyżej podane znaczenie, zaś X oznacza atom chlorowca, albo stosując bezwodnik karboksylowy o wzorze ogólnym 8, w którym r1 ma wyżej podane znaczenie.
  3. 3. Sposób według zas-trz. 1 albo 2, tym, że acylowanie w pi^rr^^^'^rm eeapie prowadzi się w środowisku rozpuszczalnika aprotycznego.
  4. 4. Sposób wedługzassrz. 1, znamienny tym, że redukcję w drugim ee^f^i^pr^c^N^^c^^i się jąc borowodorek metalu alkalicznego lub metalu ziem alkalicznych, wodorku glinowego metalu alkalicznego lub metalu ziem alkalicznych lub z Vitride.
  5. 5. Sposób według zaskz 1 albo 4, znamienny tym, że redukcję w drugim eeapie prowaddi sśę w środowisku rozpuszczalnika protycznego.
  6. 6. Sposób według zas-trz. 1, tym, że reakcję w trzecim eeapie prowadzi się stosując mikroorganizmy rodzaju Rhodococcus, Gordono, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas lub Alcaligenes/Bordetella.
  7. 7. Sposób według zas-trz. 1, tym, że reakcję w trzecim prowadzi się stosując acylazę penicyliny G z mikroorganizmów gatunku Bacillus megaterium lub Escherichia coli.
  8. 8. Sposóbwedługzastrz. 1 albo6, albo 7, znamienny tym, że nsformacćę w etapie prowadzi się w temperaturze od 20°C do 40°C i w przedziale pH od 5 do 9.
  9. 9. Sposób wedhjg ż^^^Lz., 1, znamienny tym, że reakcję w czwartym ^-^γ5^ prowadź i się w obecności zasady.
  10. 10. Sposób według zastrz. 1 albo 9, znamienny tym, że reakcję w czwartym etapie prowadzi się w środowisku rozpuszczalnika protycznego.
  11. 11. Sposób wytwarzania enancjomeru pochodnej (1R,4S)- lub (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu o wzorze ogólnym - odpowiednio, 3 lub 4, w którym r1 ma wyżej podane znaczenie, znamienny tym, że w pierwszym etapie pochodną cyklopentenu o wzorze ogólnym 9, w którym r1 ma wyżej podane znaczenie poddaje się konwersji stosując mikroorganizm zdolny do wykorzystania pochodnej cyklopentenu o wzorze ogólnym 9 w charakterze wyłącznego źródła azotu, wyłącznego źródła węgla lub wyłącznego źródła węgla i azotu, enzym posiadający aktywność hydrolazy N-acetyloaminoalkoholowej lub acylazę penicyliny G, z wytworzeniem (1R,4S)- lub (1S,4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu o wzorze - odpowiednio, 10 lub 11, a następnie w drugim etapie związek ten poddaje się acylowaniu otrzymując związek o wzorze - odpowiednio, 3 lub 4.
  12. 12. (1R,4S)-1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten o wzorze 15, w nadmiarze enancjomerycznym większym od 0%.
  13. 13. Enancjomer według zastrz. 12, w nadmiarze enancjomerycznym większym niż 80%.
  14. 14. Enancjomer według zastrz. 12, w nadmiarze enancjomerycznym większym niż 90%.
  15. 15. Enancjomer według zastrz. 12, w nadmiarze enancjomerycznym większym niż 95%.
  16. 16. Enancjomer według zastrz. 12, w nadmiarze enancjomerycznym większym niż 98%.
  17. 17. Racemiczny 1-butyiyloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten.
PL326267A 1997-05-13 1998-05-13 Sposób wytwarzania (1S, 4R)- lub (1R, 4S)-4-(2-amino-6-chloro-9H-purynylo-9)-2-cyklopenteno-1-metanolu lub jego soli, sposób wytwarzania enancjomeru pochodnej (1R, 4S)- lub (1S, 4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu oraz racemiczny 1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten i enancjomeryczny (1R, 4S)-1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten PL197848B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH111697 1997-05-13
CH274097 1997-11-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL326267A1 PL326267A1 (en) 1998-11-23
PL197848B1 true PL197848B1 (pl) 2008-05-30

Family

ID=25686703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL326267A PL197848B1 (pl) 1997-05-13 1998-05-13 Sposób wytwarzania (1S, 4R)- lub (1R, 4S)-4-(2-amino-6-chloro-9H-purynylo-9)-2-cyklopenteno-1-metanolu lub jego soli, sposób wytwarzania enancjomeru pochodnej (1R, 4S)- lub (1S, 4R)-1-amino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentenu oraz racemiczny 1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten i enancjomeryczny (1R, 4S)-1-butyryloamino-4-(hydroksymetylo)-2-cyklopenten

Country Status (16)

Country Link
US (4) US6156893A (pl)
EP (2) EP1502914A1 (pl)
JP (3) JP4540136B2 (pl)
KR (2) KR100577886B1 (pl)
CN (2) CN1115343C (pl)
AT (1) ATE275206T1 (pl)
CA (1) CA2237297C (pl)
CZ (3) CZ297894B6 (pl)
DE (1) DE59811884D1 (pl)
DK (1) DK0878548T3 (pl)
ES (1) ES2223095T3 (pl)
HU (1) HU226327B1 (pl)
NO (1) NO324679B1 (pl)
PL (1) PL197848B1 (pl)
PT (1) PT878548E (pl)
SK (3) SK285228B6 (pl)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0705263T3 (da) * 1993-06-21 1997-05-05 Merrell Pharma Inc Carbocycliske nukleoside midler anvendelige som selektive inhibitorer af proinflammatoriske cytokiner
GB9717928D0 (en) * 1997-08-22 1997-10-29 Glaxo Group Ltd Process for the enatioselective hydrolysis of n-derivatised lactams
GB9721780D0 (en) * 1997-10-14 1997-12-10 Glaxo Group Ltd Process for the synthesis of chloropurine intermediates
CZ298144B6 (cs) * 1997-11-27 2007-07-04 Lonza Ag Zpusob výroby (1S,4R)- nebo (1R,4S)-4-(2-amino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-1-methanolu
CZ301107B6 (cs) 1998-12-23 2009-11-11 Lonza Ag Zpusob výroby enantiomerne obohacených derivátu 1-amino-4-(hydroxymethyl)-cyklopent-2-enu
PT1648851E (pt) * 2003-07-25 2007-05-31 Prometic Biosciences Inc Praparação de sais metálicos de ácidos gordos de cadeia média
DE102005061756B4 (de) * 2005-12-21 2008-01-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Ramipril
US8236853B1 (en) 2007-12-03 2012-08-07 University Of South Florida Formation of cyclopentene nitro-ester and derivatives
WO2012099904A1 (en) 2011-01-18 2012-07-26 General Atomics Hydrolase enzyme substrates and uses thereof
CN102557990B (zh) * 2011-04-25 2014-06-25 开原亨泰制药股份有限公司 (1s，4r)n-叔丁氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯的制备方法
CN119350339A (zh) * 2024-11-25 2025-01-24 安徽贝克制药股份有限公司 一种阿巴卡韦杂质的制备方法及用途

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4950758A (en) * 1988-01-20 1990-08-21 Regents Of The University Of Minnesota Optically-active isomers of dideoxycarbocyclic nucleosides
US4931559A (en) * 1988-01-20 1990-06-05 Regents Of The University Of Minnesota Optically-active isomers of dideoxycarbocyclic nucleosides
MY104575A (en) * 1989-12-22 1994-04-30 The Wellcome Foundation Ltd Therapeutic nucleosides.
CA2055086A1 (en) * 1991-02-12 1992-08-13 Chikara Kaneko Cyclopentene derivatives and their use
US5200527A (en) * 1991-04-08 1993-04-06 Lonza Ltd. Process for the production of 2-azabicyclo [2.2.1] hept-5-en-3-one
GB9204015D0 (en) * 1992-02-25 1992-04-08 Wellcome Found Therapeutic nucleosides
GB9205071D0 (en) * 1992-03-09 1992-04-22 Wellcome Found Therapeutic nucleosides
GB9217823D0 (en) * 1992-08-21 1992-10-07 Glaxo Group Ltd Chemical process
JPH06116217A (ja) * 1992-10-02 1994-04-26 Kuraray Co Ltd （±）−シス−４−アミノシクロペント−２−エンカルボン酸誘導体の光学分割法
GB9402161D0 (en) * 1994-02-04 1994-03-30 Wellcome Found Chloropyrimidine intermediates
CN1224697C (zh) * 1996-05-30 2005-10-26 隆萨股份公司 氨基醇及其衍生物的制备方法
GB9625455D0 (en) * 1996-12-07 1997-01-22 Glaxo Group Ltd Process for resolving mixtures of carbocyclic steroisomers

Also Published As

Publication number Publication date
CA2237297C (en) 2008-03-11
SK285229B6 (sk) 2006-09-07
CN1115343C (zh) 2003-07-23
HU226327B1 (en) 2008-08-28
EP0878548A2 (de) 1998-11-18
CN1201794A (zh) 1998-12-16
HUP9801083A2 (hu) 1999-11-29
CZ297888B6 (cs) 2007-04-18
KR100577886B1 (ko) 2006-08-30
NO982149L (no) 1998-11-16
HUP9801083A3 (en) 2001-09-28
JP4540136B2 (ja) 2010-09-08
ATE275206T1 (de) 2004-09-15
EP1502914A1 (de) 2005-02-02
SK285228B6 (sk) 2006-09-07
KR19980086933A (ko) 1998-12-05
PT878548E (pt) 2005-01-31
KR100601764B1 (ko) 2006-07-19
SK58998A3 (en) 1998-12-02
JPH115793A (ja) 1999-01-12
US6252112B1 (en) 2001-06-26
ES2223095T3 (es) 2005-02-16
US6137007A (en) 2000-10-24
JP2010116397A (ja) 2010-05-27
CZ297887B6 (cs) 2007-04-18
DK0878548T3 (da) 2004-12-06
US6156893A (en) 2000-12-05
JP2010106025A (ja) 2010-05-13
NO982149D0 (no) 1998-05-12
US6262295B1 (en) 2001-07-17
HK1092782A1 (en) 2007-02-16
CZ297894B6 (cs) 2007-04-25
PL326267A1 (en) 1998-11-23
CA2237297A1 (en) 1998-11-13
SK284810B6 (sk) 2005-12-01
NO324679B1 (no) 2007-12-03
CN1302116C (zh) 2007-02-28
DE59811884D1 (de) 2004-10-07
EP0878548A3 (de) 1999-10-13
CN1515673A (zh) 2004-07-28
CZ145898A3 (cs) 1998-12-16
HU9801083D0 (en) 1998-07-28
EP0878548B1 (de) 2004-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2010116397A (ja) （１ｓ，４ｒ）−または（１ｒ，４ｓ）−４−（２−アミノ−６−クロロ−９ｈ−プリン−９−イル）−２−シクロペンテン−１−メタノールの製造方法
US6787347B2 (en) Process for the preparation of amino alcohols and derivatives thereof and microorganisms useful in process
US20020037559A1 (en) Process for producing n-protected d-proline derivatives
KR100562734B1 (ko) 아미노 알코올 및 그의 유도체의 제조방법
HK1092782B (en) Process for preparing racimatic of optically active 4-(hydroxymethyl)-2-cyclopentene derivative
CA2274896A1 (en) Method for production of d-proline derivatives
HK1072933A (en) Process for the preparation of 1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyclopentene derivatives
CA2299324A1 (en) Method for producing cyclic .alpha.-amino acids free from enantiomers or their n-protected derivatives by means of a d-specific aminoacylase

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20120513