PL198237B1

PL198237B1 - Kompozycja farmaceutyczna zawierająca ß-D-D4FC, zastosowanie kompozycji i zastosowanie ß-D-D4FC

Info

Publication number: PL198237B1
Application number: PL349576A
Authority: PL
Inventors: Raymond F. Schinazi; Jennifer Hammond; John W. Mellors; Dennis C. Liotta
Original assignee: Univ Emory
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-21
Publication date: 2008-06-30
Also published as: CA2360039C; KR20020068260A; NO323586B1; WO2000043014A8; WO2000043014A2; CN1337880A; EP1143976B1; IL144382A0; WO2000043014A3; NO20013599D0; ATE324894T1; NZ528156A; HK1040064A1; HK1040064B; RU2254133C2; MXPA01007359A; BR0007627A; DK1143976T3; KR100745408B1; IL144382A

Abstract

1. Kompozycja farmaceutyczna zawieraj aca ß-D-D4FC, znamienna tym, ze zawiera sku- teczn a ilo sc ß-D-D4FC albo jego farmaceutycz- nie dopuszczalnej soli lub estru, ewentualnie w farmaceutycznie dopuszczalnym no sniku, oraz skuteczn a ilo sc co najmniej jednego dru- giego leku wybranego z grupy sk ladaj acej si e z indinawiru, nelfinawiru, sakwinawiru, ampre- nawiru, efawirenzu, delawirdyny, newirapiny i abakawiru, do leczenia lub profilaktyki zaka- ze n HIV u cz lowieka. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca e-D-D4FC do leczenia lub profilaktyki zakażeń HIV u człowieka, zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zakażeń HIV u człowieka oraz zastosowanie e-D-D4FC w kombinacji z drugim lekiem do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zakażeń HIV u człowieka.

W 1983 określono, że etiologiczną przyczyną AIDS jest ludzki wirus niedoboru odporności (HIV). W 1985 doniesiono, iż syntetyczny nukleozyd 3'-azydo-3'-deoksytymidyny (AZT) hamuje replikację ludzkiego wirusa niedoboru odporności. Od tego czasu dowiedziono, że wiele nukleozydów jest skutecznych w walce z HIV: 2',3'-dideoksyinozyna (DDI), 2',3'-dideoksycytydyna (DDC), 2',3'-dideoksy-2',3'-didehydrotymidyna (D4T), cis-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozyna-1-yl)-1,3-oksytiolan (FTC), (-)-cis-2-hydroksymetylo-5-(cytozyno-1-yl)-1,3-oksytiolan (3TC). Po komórkowej fosforylacji do 5'-trifosforanu przez kinazę komórkową, te syntetyczne nukleozydy zostają wbudowywane do rosnącej nici wirusowego DNA, powodując terminację łańcucha z powodu braku grupy 3'-hydroksylowej. Mogą one także hamować wirusowy enzym odwrotnej transkryptazy.

Rozpoznano, że odmiany HIV oporne na leki mogą pojawić się po przedłużonym leczeniu czynnikami antywirusowymi. Oporność na leki pojawia się przeważnie dzięki mutacji genu, który koduje enzym używany w czasie replikacji wirusowej, a w szczególności w przypadku HIV, odwrotną transkryptazę, proteazę lub polimerazę DNA. Ostatnio stwierdzono, że skuteczność leków przeciwko HIV może być wydłużona, zwiększona lub odnowiona przez podawanie tych składników w połączeniu z drugim, a być może trzecim, związkiem antywirusowym, który indukuje mutacje różne od tych powodowanych przez leki podstawowe. Ewentualnie, takie skojarzone lub naprzemienne leczenie może zmieniać farmakokinetykę, biodystrybucję lub inny parametr leku. Ogólnie terapia skojarzona jest zalecana zamiast terapii naprzemiennej, ponieważ indukuje złożoną jednoczesną presję na wirusa. Trudno jednak przewidzieć jakie mutacje zostaną indukowane w genomie HIV przez podanie leku oraz czy mutacja jest trwała czy przejściowa, lub jak komórki zakażone zmutowanym wirusem HIV-1 będą odpowiadać na terapie innymi czynnikami w skojarzeniu lub naprzemiennie. Pogarsza to jeszcze fakt, że istnieje niedostatek danych dotyczących kinetyki oporności na lek w dłuższym okresie traktowania hodowli komórkowych nowoczesnymi czynnikami antyretrowirusowymi.

Odmiany HIV-1 oporne na 3'-azydo-3'-deoksytymidynę (AZT), 2',3'-dideoksyinozynę (DDI) lub 2',3'-dideoksycytydynę (DDC) zostały wyizolowane od pacjentów otrzymujących długoterminową monoterapię tymi lekami (Larder BA, Darby G, Richman DD. Science 1989; 243: 1731-4; St Clair MH, Martin JL, Tudor WG inni Science 1991; 253: 1557-9; St Clair MH, Martin JL, Tudor WG i inni Science 1991; 253:1557-9, oraz Fitzgibbon JE, Howell RM, Haberzettl CA, Sperber SJ, Gocke DJ, Dubin DT. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36:153-7). Uzyskane dowody kliniczne pokazują, że oporność na AZT jest przewidywana przy słabych wynikach u dorosłych jak i dzieci (Mayers DL. wykłady z trzydziestej drugiej Interscience Conference na temat Antimicrobial Agents and Chemoteraphy. (Anaheim, CA. 1992); Tudor-Williams G, St Clair MH, McKinney RE, i inni, Lancet 1992; 339:15-9; Ogino MT, Danker WM, Spector SA J Pediatr 1993; 123:1-8; Crumpacker CS, D' Aquila RT, Johnson VA, i inni. Third Workshop on Viral Resistence (Gaithersburg, MD. 1993); oraz Mayers D, oraz RV43 Study Group. Third Workshop on Viral Resistence. (Gaithersburg, MD. 1993)). Szybki rozwój oporności HIV-1 wobec inhibitorów nienukleozydowych odwrotnej transkryptazy (NNRTI) został zaobserwowany zarówno w hodowlach komórkowych jak i klinicznych badaniach u ludzi (Nunberg JH, Schleif WA, Boots EJ, i inni. J Virol 1991; 65 (9) : 4887- 92; Richman D, Shih CK, Lowy I, i inni, Proc Natl Acad Sci (USA) 1991; 88: 11241-5; Mellors JW. , Dutschman GE, Im GJ, Tramontano E, Winkler SR, Cheng YC, Mol Pharm 1992; 41:446-51; Richman DD oraz ACTG 164/168 Study Team. Second International HIV-1 Drug Resistance Workshop (Noordwijk, Holandia, 1993) oraz Saag MS, Emini EA, Laskin OL, i inni N Engl J Med. 1993; 329:1065-1072). W przypadku NNRTI L'697, 661 oporny na lek HIV-1 pojawił się po 2-6 tygodniach od rozpoczęcia terapii w połączeniu z nawrotem wiremii na poziomie sprzed leczenia (Saag MS, Emini EA, Laskin OL, i inni. N Engl J Med. 1993; 329:1065-1072). Przełom związany z wiremią związany z obecnością szczepów opornych na lek zaobserwowano także dla innych klas inhibitorów HIV-1, obejmujących inhibitory proteazy (Jacobsen H, Craig CJ, Duncan IB, Haenggi M, Yasargil K, Mous J. Third Workshop on Viral Resistence (Gaithersburg, MD. 1993)). Doświadczenie to doprowadziło do uświadomienia faktu, iż potencjał oporności na leki HIV-1 musi być testowany szybko we wczesnym stadium przedklinicznej oceny wszystkich nowych terapii HIV-1.

PL 198 237 B1

2'3'-dideoksy-2'3'-didehydro-5-fluorocytydyna (D4FC) jest znanym związkiem. Europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 409 227 A2 zgłoszone przez Ajinomoto Co., Inc., ujawnia e-D-D4FC (przykład 2) oraz jego użycie w leczeniu zapalenia wątroby typu B. Holenderski opis patentowy nr 8901258 dla Stichting Rega V.Z.W ujawnia ogólnie pochodne 5-fluorowco-2',3'-dideoksy-2',3'-didehydrocytydyny do użycia w leczeniu HIV oraz zapalenia wątroby typu B („HBV). Opis patentowy U.S. nr 5,703,058 ujawnia metodę leczenia zakażenia HIV oraz zakażenia HBV, które obejmują podawanie skutecznej ilości e-L-D4FC w połączeniu lub w zamian za cis-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozyno-1-yl)-1,3-oksatiolan, cis-2-hydroksymetylo-5-(cytozyno-1-yl)-1,3-oksotiolan, 9-[4-(hydroksymetylo)-2-cyklopentan-1-yl)-guaninę (karbowir), 9-[(2-hydroksyetoksy)metylo]guaninę (acyklowir), interferon, 3'-deoksy-3'-azydotymidynę (AZT), 2'3'-dideoksyinozydynę (DDI), 2',3'-dideoksycytydynę (DDC), (-)-2'-fluoro-5-metylo-e-L-ara-urydynę (L-FMAU) lub 2',3'-didehydro-2',3'-dideoksytymidynę (D4T). Patent U.S. nr 5,905,070 ujawnia metodę leczenia zakażenia HIV oraz HBV, która obejmuje podawanie skutecznej ilości e-D-D4FC w połączeniu lub w zamian za cis-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozyno-1-yl)-1,3-oksotiolan, cis-2-hydroksometylo-5-(cytozyno-1-yl)-1,3-oksotiolan, 9-[4-(hydroksometylo)-2-cyklopenteno-1-yl)guaninę (karbowir), 9-[(2-hydroksyetoksy)metyl]guaninę (acyklowir), interferon, 3'-deoksy-3'-azydotymidynę (AZT), 2',3'-dideoksyinozynę (DDI), 2',3'-dideoksycytydynę (DDC), (-)-2'-fluoro-5-metylo-e-L-ara-urydynę (L-FMAU) lub 2',3'- didehydro-2',3'-dideoksytymidynę (D4T).

Zgłoszenie patentowe U.S. nr 5,905,070, odpowiadające zgłoszeniu U.S. 5,703,058, ujawnia kombinację nukleozydu z grupy obejmującej D4FC ze związkami: FTC, 3TC, karbowir, acyklowir, interferon, famcyklowir, pencyklowir, pencyklowir, AZT, DDI, DDC, D4T, L-(-)-FMAU, CS-92, DG, DAPD lub ACP. Zgłoszenie to nie ujawnia, ani nawet nie sugeruje innych kompozycji farmaceutycznych lub zastosowań związków w kombinacji z e-D-D4FC. Kombinacje ujawnione w tym zgłoszeniu wykazują tylko minimalną skuteczność w leczeniu zakażenia HIV. Kombinacja e-D-D4FC albo z 3TC albo z FTC w istocie zmniejsza aktywność e-D-D4FC o ponad 50%.

Zgodnie z wynalazkiem określano optymalne do leczenia HIV podawanie e-D-D4FC.

Zgodnie z wynalazkiem udostępniono sposób oraz dostarczono kompozycję, która zawiera β-D-D4FC, do leczenia pacjentów zakażonych HIV, która charakteryzuje się lepszą lub poprawioną farmakokinetyką, biodystrubucją, metabolizmem, opornością lub innymi parametrami, niż sama β-D-D4FC.

Zgodnie z wynalazkiem udostępniono sposób oraz dostarczono kompozycję, która zawiera e-D-D4FC, do leczenia pacjentów zakażonych HIV, przez podawanie e-D-D4FC w połączeniu lub naprzemiennie z drugim związkiem, który działa synergistycznie z e-D-D4FC przeciwko wirusowi.

Tego rodzaju sposoby i kompozycje mogą być wykorzystane do leczenia pacjentów zakażonych lekooporną formą HIV.

Zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że e-D-D4FC indukuje mutacje w HIV-1 kodonach 70 (K do N), 90 i 172 regionu odwrotnej transkryptazy wirusa. Bazując na tym stwierdzeniu, przewidziano sposób leczenia HIV, który obejmuje podawanie e-D-D4FC lub jego dopuszczalnych soli lub proleku ludziom potrzebującym leczenia w połączeniu lub naprzemiennie z lekiem, który indukuje mutacje w miejscach innych niż kodony 70 (K do N), 90 lub 172 regionu odwrotnej transkryptazy. Wynalazek może być zastosowany zgodnie z opublikowanymi wzorami mutacji dla znanych leków anty-HIV, lub poprzez określenie wzorów mutacji dla nowego leku.

Bazując na tym stwierdzeniu przewidziano także sposób zastosowania e-D-D4FC jako „terapii ocalającej wobec pacjentów wykazujących oporność na inne czynniki anty-HIV. Stwierdzono, że e-D-D4FC nie jest zbyt oporny-krzyżowo na AZT, DDc, DDI, D4T, 3TC, (-)-FTC lub e-L-D4FC. Przeciwnie e-L-D4FC szybko indukuje mutacje w kodonie 184 (metionina do waliny) powodując wyższy stopień oporności na 3TC i FTC. e-D-D4FC może być użyty zasadniczo jako terapia ocalająca dla pacjentów, którzy wykazują oporność wobec leków, które indukują mutacje w innych kodonach niż 70 (K do N), 90 lub 172.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca e-D-D4FC, charakteryzująca się tym, że zawiera skuteczną ilość e-D-D4FC albo jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub estru, ewentualnie w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, oraz skuteczną ilość co najmniej jednego drugiego leku wybranego z grupy składającej się z indinawiru, nelfinawiru, sakwinawiru, amprenawiru, efawirenzu, delawirdyny, newirapiny i abakawiru, do leczenia lub profilaktyki zakażeń HIV u człowieka.

Korzystnie drugi lek w kombinacji z e-D-D4FC stanowi indinawir.

Korzystnie drugi lek w kombinacji z e-D-D4FC stanowi nelfinawir.

PL 198 237 B1

Korzystnie drugi lek w kombinacji z e-D-D4FC stanowi sakwinawir.

Korzystnie drugi lek w kombinacji z e-D-D4FC stanowi amprenawir.

Korzystnie drugi lek w kombinacji z e-D-D4FC stanowi efawirenz.

Korzystnie drugi lek w kombinacji z e-D-D4FC stanowi delawirdyna.

Korzystnie drugi lek w kombinacji z e-D-D4FC stanowi newirapina.

Korzystnie drugi lek w kombinacji z e-D-D4FC stanowi abakawir.

Korzystnie zawiera e-D-D4FC i drugi lek w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.

Korzystniej jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania doustnego, dożylnego, pozajelitowego, doskórnego, podskórnego lub miejscowego.

Korzystniej jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania doustnego.

Korzystniej jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania dożylnego.

Korzystniej jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania pozajelitowego.

Korzystniej jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania doskórnego.

Korzystniej jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania miejscowego.

Korzystnie e-D-D4FC i drugi lek są w postaci jednostki dawkowania.

Korzystniej jednostka dawkowania zawiera 10 do 1500 mg każdego związku.

Korzystniej jednostkę dawkowania stanowi tabletka lub kapsułka.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie skutecznej ilości kompozycji określonej w powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zakażenia HIV u człowieka.

Korzystnie drugim lekiem w kombinacji z e-D-D4FC jest indinawir.

Korzystnie drugim lekiem w kombinacji z e-D-D4FC jest nelfinawir.

Korzystnie drugim lekiem w kombinacji z e-D-D4FC jest sakwinawir.

Korzystnie drugim lekiem w kombinacji z e-D-D4FC jest amprenawir.

Korzystnie drugim lekiem w kombinacji z e-D-D4FC jest efawirenz.

Korzystnie drugim lekiem w kombinacji z e-D-D4FC jest delawirydna.

Korzystnie drugim lekiem w kombinacji z e-D-D4FC jest newirapina.

Korzystnie drugim lekiem w kombinacji z e-D-D4FC jest abakawir.

Korzystnie e-D-D4FC i drugi lek stosowane są w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.

Korzystniej farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem jest nośnik odpowiedni do podawania doustnego, dożylnego, pozajelitowego, doskórnego, podskórnego lub miejscowego.

Korzystnie e-D-D4FC i drugi lek stosowane są w postaci jednostki dawkowania.

Korzystniej jednostka dawkowania zawiera 10 do 1500 mg każdego związku.

Korzystniej jednostkę dawkowania stanowi tabletka lub kapsułka.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie skutecznej ilości e-D-D4FC lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub estru, ewentualnie w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zakażenia HIV u człowieka, w kombinacji ze skuteczną ilością drugiego leku wybranego z grupy składającej się z indinawiru, nelfinawiru, sakwinawiru, amprenawiru, efawirenzu, delawirdyny, newirapiny i abakawiru.

Korzystnie drugim lekiem stosowanym w kombinacji z e-D-D4FC jest indinawir.

Korzystnie drugim lekiem stosowanym w kombinacji z e-D-D4FC jest nelfinawir.

Korzystnie drugim lekiem stosowanym w kombinacji z e-D-D4FC jest sakwinawir.

Korzystnie drugim lekiem stosowanym w kombinacji z e-D-D4FC jest amprenawir.

Korzystnie drugim lekiem stosowanym w kombinacji z e-D-D4FC jest efawirenz.

Korzystnie drugim lekiem stosowanym w kombinacji z e-D-D4FC jest delawirdyna.

Korzystnie drugim lekiem stosowanym w kombinacji z e-D-D4FC jest newirapina.

Korzystnie drugim lekiem stosowanym w kombinacji z e-D-D4FC jest abakawir.

Korzystniej jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik stosowany jest nośnik odpowiedni do podawania doustnego, dożylnego, pozajelitowego, doskórnego, podskórnego lub miejscowego.

Korzystnie e-D-D4FC i drugi lek stosowane są w postaci jednostki dawkowania.

Korzystniej jednostka dawkowania zawiera 10 do 1500 mg każdego związku.

PL 198 237 B1

Korzystniej jednostkę dawkowania stanowi tabletka lub kapsułka.

Korzystnie e-D-D4FC i drugi lek stosowane są w kombinacji.

Korzystnie e-D-D4FC i drugi lek stosowane są naprzemiennie.

Krótki opis figur

Figura 1 przedstawia wzór e-D-D4FC.

Figura 2 jest wykresem stężenia e-D-D4FC w mikromolach względem procentowej inhibicji produkcji antygenu p24. Figura przedstawia selekcję wirusa o zredukowanej wrażliwości na e-D-D4FC.

I. Definicje

Użyty tutaj termin „oporny wirus odnosi się do wirusów, które wykazują trzykrotny a jeszcze częściej pięciokrotny lub większy wzrost EC50 w porównaniu do wirusa naiwnego w stałej linii komórkowej, włącznie z, ale bez ograniczenia, jednojądrzastymi komórkami krwi obwodowej (PBMC), lub komórkami MT2 lub MT4.

Termin D-D4FC jest używany zamiennie z terminem e-D-D4FC poniżej.

Użyty tutaj termin „zasadniczo czysty lub „zasadniczo w formie jednego izomeru optycznego odnosi się do kompozycji nukleozydu, która zawiera co najmniej 95% do 98%, lub więcej, dogodniej 99% do 100% pojedynczego enancjomeru tego nukleotydu. W zalecanym wykonaniu, e-D-D4FC jest podawany w zasadniczo czystej formie do jakichkolwiek ujawnionych oznaczeń.

Użyty tutaj termin „prolek odnosi się do 5' i N⁴ acylowanych, alkilowanych lub fosforylowanych (obejmujących estry mono-, di-, oraz trifosforanowe, jak również stabilizowane fosforany i fosfolipidy) pochodnych D-D4FC. W jednym wykonaniu grupa acylowa może być estrem kwasu karboksylowego, w którym ugrupowanie nie-karbonylowe grupy estrowej wyselekcjonowane jest z prostego, rozgałęzionego lub cyklicznego alkilu, alkoksyalkilu obejmującego metoksymetyl, arylu włącznie z benzylem, araloksyalkilu włącznie z fenoksymetylem, arylu włącznie z fenylem ewentualnie podstawionym fluorowcem, alkilem lub alkoksylem, estru sulfonowego takiego jak alkilo- lub aralkilo-sulfonyl obejmujący metanosulfonyl, tritylo- lub monometoksytritylo-, podstawiony benzyl, trialkiksilylo- lub difenylometylosilyl. Grupy arylowe w estrach optymalnie zawierają grupę fenylową. Grupa alkilowa może być prosta, rozgałęziona lub cykliczna a dogodnie stanowi C1 do C18.

Użyty tutaj termin „farmaceutycznie dopuszczalne sole odnosi się do farmaceutycznie dopuszczalnych soli, które po podaniu biorcy są w stanie dostarczyć bezpośrednio lub pośrednio e-D-D4FC lub same wykazują taką aktywność. Skróty aminokwasów użytych tutaj są podane w tabeli 1.

T a b e l a 1

Aminokwasy	Kodony
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Alanina	Ala	A	GCA	GCC	GCG	GCU
Cysteina	Cys	C	UGC	UGU
Kwas asparginowy	Asp	D	GAC	GAU	GAC	GAU
Kwas glutaminowy	Glu	E	GAA	GAG
Fenyloalanina	Phe	F	UUC	UUU
Glicyna	Gly	G	GGA	GCG	GGG	GGU
Histydyna	His	H	CAC	CAU
Iozleucyna	Ile	I	AUA	AUC	AU U
Lizyna	Lys	K	AAA	AAG
Leucyna	Leu	L	UUA	UUG	CUA	CUC	CUG	GUU
Metionina	Met	M.	AUG
Asparagina	Asn	N	AAC	AAU
Prolina	Pro	P	CCA	CCC	CCG	CCU

PL 198 237 B1 cd.tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7	8	9
Glutamina	Gln	Q	CAA	CAG
Arginina	Arg	R	AGA	AGG	CGA	CGC	CGG	CGU
Seryna	Ser	S	AGC	AGU	UCA	UCC	UCG	UCU
Treonina	Thr	T	ACA	ACC	ACG	ACU
Walina	Val	V	GUA	GUC	GUG	GUU
Tryptofan	Trp	W	UGG
Tyrozyna	Tyr	Y	UAC	UAU

II. Mutacje w odwrotnej transkryptazie HIV-1 wyselekcjonowane z użyciem e-D-D4FC

Dwa enancjomery D- oraz L-e-2',3'-didehydro-2',3'-dideoksy-5-fluorocytydyny (D4FC) są mocnymi, jak i selektywnymi inhibitorami HIV-1, chociaż enancjomer D jest bardziej selektywny. Rozwój in vitro oporności na D-D4FC oszacowano dzięki seryjnemu pasażowi HIV-1LAI w komórkach MT-2 oraz jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PBMC) w obecności wzrastających stężeń leku. Odmiany oporne na D-D4FC pojawiły się tylko po przedłużonej ekspozycji wobec leku. Uzyskany wirus po 20 pasażach w komórkach MT-2 wykazywał 5,3 krotną oporność na D-D4FC. Oporny wirus nie mógł być izolowany z PBMC pomimo kilkukrotnych prób. Sekwencjonowanie DNA z RT wirusa wyselekcjonowanego z komórek MT-2 ujawniło dwie mutacje: K65R oraz V179D. Selekcja wirusa opornego na D-D4FC została powtórzona w komórkach MT-2 a odmiany wykazujące 19,3 krotną oporność kodowały trzy nowe mutacje RT: K70N, V90I oraz R172K. Rekombinant K65R wirusa HIV-1LAI wykazał 3,9 krotną oporność na D-D4FC. V179D, mutacja nadająca oporność na nienukleozydowe inhibitory RT jest najprawdopodobniej kompensacyjna do K65R. Rola innych mutacji w oporności na D-D4FC została także określona przez skonstruowanie zrekombinowanych wirusów z pojedynczą lub wielokrotnymi mutacjami, jednakże, żaden z testowanych rekombinantów nie wykazywał większej oporności niż 2 krotna.

Materiały i metody.

Związki chemiczne. D-D4FC syntetyzowano w jednym z laboratoriów zgłaszającego jak to opisano wcześniej (Shi iinni, 1999). Został on przygotowany jako roztwór wyjściowy o stężeniu 10 mM, w sterylnej wodzie i przechowywany w -20°C. Związek rozmrożono i rozcieńczono do pożądanego stężenia bezpośrednio przed użyciem.

Komórki. Komórki MT-2 (AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health, z którym współpracował D. Richman) hodowano w RPMI 1640 (Whittaker M.A., Bioproducts, Walkersville, MD) uzupełnionej 10% płodową surowicą wołową, 10 mM buforem HEPES, penicyliną (50 IU/ml) oraz streptomycyną (50 μg/ml).

Wirusy. HIV-1LAI, molekularnie sklonowany izolat kliniczny użyto zarówno jako startowy wirus dla selekcji oporności, jak również do wytwarzania mutantów rekombinacyjnych. Preparaty wyjściowe HIV-1_lai przygotowano przez elektroporację 5-10 μg prowirusowego plazmidowego DNA do 1,3 x 10⁷komórek MT-2. Przy maksymalnym efekcie cytopatycznym wirusa (ogólnie 7 dni po transfekcji), supernatant z zainfekowanych hodowli zebrano, poporcjowano i przechowywano w -80°C aż do użycia. Preparaty wirusów miareczkowano do trzykrotnego końcowego rozcieńczenia w komórkach MT-2, a TCID50 obliczono za pomocą równania Reed i Muench.

Selekcja opornego wirusa. Przed rozpoczęciem selekcji wirusa opornego na D-D4FC, startowy wirus (HIV-1LAI) pasażowano jako wirus wolny od komórek przez 10 cykli w komórkach MT-2 przy nieobecności leku. Wirus oporny na D-D4FC selekcjonowano przez kolejne pasażowanie HIV-1LAI w komórkach MT-2 w obecności gradientowo wzrastających stężeń D-D4FC. Selekcję wirusów opornych na D-D4FC przeprowadzono dwukrotnie. Selekcję inicjowano przez inokulację 1 x 10⁶ komórek MT-2 przy życiu 0,01 mola wirusa. Przy maksymalnym efekcie cytopatycznym wirusa (4-7 dni po infekcji) zebrano supernatant z infekowanych hodowli, a 0,1 - 0,3 ml następnie używano do zapoczątkowania następnego cyklu infekcji. Supernatant także porcjowano i przechowywano w -80°C w celu scharakteryzowania selekcjonowanego wirusa. Wirusy pasażowano co najmniej trzy razy w każdym stężeniu, przy czym liczba cykli w jakimkolwiek stężeniu leku zależała od zdolności wirusa do wzrostu przy poszczególnym stężeniu D-D4FC. Podczas pierwszego etapu selekcji wirusa pasażowano raz przy nieobecności leku zanim zastosowano wzrastające stężenie leku (Tabela 2). Jako kontrolę, wiruPL 198 237 B1 sa także pasażowano równolegle bez leku. Pierwszą selekcję inicjowano przy 0,75 μM, a następnie zwiększano stopniowo do 4,0 μM podczas procesu złożonego z 37 cykli pasażu bez komórek. Drugą selekcję inicjowano 0,2 μM i następnie wzrastało stopniowo do 6,2 μM podczas procesu złożonego z 27 cykli pasażu bez komórek (Tabela 2).

T a b e l a 2 selekcja #1 selekcja #2

Numer pasażu	[D-Fd4C^M.	Numer Pasażu	[D-Fd4C^M.
1-2	0,75	1-3	0,2
3-4	1,5	4-6	0,4
5	1,0	7-9	0,8
6	0	10-12	1,6
7-9	1,5	13	3,2
10-12	2,0	14-16	1,6
13-16	3,0	17-19	3,2
17	0	20-22	4,8
18-20	4,5	23-25	6,2
21	0	26	12,0
22-35	4,5	27	6,2
36-38	1,0
39-41	2,0
42-43	4,0

Testy na wrażliwość antywirusową. Wrażliwość wirusowa wobec D-D4FC została zmierzona przez pomiar procentu inhibicji produkcji antygenu p24. Streszczając, komórki MT-2 (1 x 10⁵ komórek/ml) zostały infekowane wirusem przy moi 0,01 w obecności seryjnych rozcieńczeń D-D4FC. Każde rozcieńczenie było testowane w trzech powtórzeniach. Supernatanty hodowli zebrano 7 dnia po infekcji i testowano na produkcję antygenu p24 przy użyciu komercyjnego testu (DuPont, NEN Products, Wilmington, Del.). Wrażliwość wirusa jest wyrażona jako stężenie leku wymagane do zahamowania produkcji antygenu p24 o 50% (EC50).

Sekwencjonowanie DNA odwrotnej transkryptazy z wyselekcjonowanego wirusa. RNA wirusowy (vRNA) z wyselekcjonowanego wirusa wyizolowano przy użyciu TRIzol Reagent (GibcoBRL, Grand Island, NY). Region kodujący pełnej długości RT powielono przy użyciu RT-PCR. Produkt PCR następnie oczyszczono przy użyciu Wizard PCR (Promega, Madison, WI) i sekwencjonowano.

Produkcja mutantów rekombinacyjnych HIV-1. Zmutowaną RT wytworzono przy użyciu Altered SitesII in vitro Mutagenesis System (Promega, Madison, WI). Mutagenezę przeprowadzono na HIV-1LAI, RT klonowano do wektora do mutagenezy (PLATER, Promega). Obecność pożądanej mutacji określano przez bezpośrednie sekwencjonowanie genu RT. Mutanta RT następnie ligowano do wektora pxxHIV-1_LA|. Wyjściowego wirusa przygotowano następnie przez elektroporację 5-10 μg DNA do

1,3 x 10⁷ komórek MT-2 jak opisano powyżej.

Wyniki oraz dyskusja.

Fenotypowanie opornego wirusa. Wirusa opornego na D-D4FC wyselekcjonowano po 37 (selekcja#1) i 20 (selekcja#2) cyklach infekcji w komórkach MT-2. Test na wrażliwość wirusa na D-D4FC z selekcji#1 pasażu 37 (p37 D-D4FC#1) pokazał, że p37D-D4FC#1 jest 19,4 razy mniej wrażliwy na D-D4FC niż dziki typ jak to przedstawiono przez wzrost EC₅₀, z 0,21 μM do 4,07 μM. (Figura 2, Tabela 3). Test na wrażliwość wirusa na D-D4FC z selekcji#2 pasażu 20 (p20 D-D4FC#2) pokazał, że p20D-D4FC#5 jest 5,4 razy mniej wrażliwy na D-D4FC niż dziki typ jak to przedstawiono przez wzrost EC50, z 0,21 μM do 1,1 μM (Figura 2, Tabela 3).

Genotypowanie opornego wirusa. vRNA z p37 D-D4FC#1 i p20D-D4FC#2 izolowano i powielono (amplifikowano) stosując RT-PCR. Sekwencjonowanie produktów PCR pokazało obecność trzech

PL 198 237 B1 nowych mutacji w p37 D-D4FC#1: K70N (AAA >4AAT), V90I (GTT >ATT) oraz R172K (AGA >AAA) (Tabela 2). Zidentyfikowano dwie różne mutacje w p20 D-D4FC#2: K65R (AAA >AGA) oraz v179D (GTT >GAT) (Tabela 3). Nie odnaleziono żadnych innych mutacji w genach RT wirusa (z aminokwasów 8-330). Dodatkowo nie stwierdzono żadnych mutacji w wirusach kontrolnych pasażowanych równolegle pod nieobecność leku.

Izolacja wirusów opornych na D-D4FC z różnymi powiązanymi mutacjami może być skutkiem różnych technik selekcji użytych do izolowania wirusów opornych na D-D4FC. W selekcji#1 presję selekcyjną usunięto na jeden cykl infekcji przed zwiększeniem stężenia leku. Nie zrobiono tego podczas drugiej selekcji. Dodatkowo początkowe stężenie D-D4FC użyte do każdej selekcji różniło się w przybliżeniu 3-krotnie. O wiele wyższe stężenie początkowe leku zostało użyte do selekcji#1 (0,75 μM). Te dwie różnice wydają się być powodem różnych mutacji, jakie zaszły w selekcjonowanych wirusach.

Mutant rekombinacyjny HIV-1. Mutanta rekombinacyjnego HIV-1 zawierającego mutację zidentyfikowano w wyselekcjonowanych wirusach wytworzono przez mutagenezę ukierunkowaną. Tabela 4 pokazuje listę wytworzonych mutantów wirusów rekombinacyjnych, jak również odpowiednie EC50. Podczas gdy wirus xxHIV-1LAI, K65R wykazywał 3,9 krotny spadek wrażliwości na D-D4FC, to żaden z innych wirusów nie wykazał oporności większej od 3 krotnej. Należy zauważyć, że potrójny mutant (xxHIV-1LAI, K70/V90I/RI72K) nie rósł dobrze, co mogło być przyczyną niemożności do reprodukcji oporności obserwowanej w wirusach selekcjonowanych in vitro.

T a b e l a 3

Wrażliwość oraz mutacje związane z D-D4FC w komórkach MT-2

Wirusy	Ec50 ^M)	wielokrotność oporności	mutacje punktu wyjściowego
HIV-1lai p0	0,21	- -	- -
HIV-1p37 D-Fd4C#1	4,07	19,4	K70N V90I R172K
HIV-1p20 D-Fd4C#2	1,11	5,3	K65R V179D

T a b e l a 4

Wrażliwość zrekombinowanych HIV-1 na D-D4FC w komórkach MT-2

Wirusy	EC50	wielokrotność oporności
xxLAI	0,320	- -
xxK65R	1,240	3,9

xxLAI	0,170	- -
xxK70N	0,240	1,4
xxV90	0,250	1,5

xxLAI	0,280	- -
xxR172K	0,230	0,8
xxV90I/R172K	0,260	1,3

xxLAI	0,130	- -
xxK70/V90I/R172K	0,056	0,4

PL 198 237 B1

Tabela 5 dostarcza medianę skutecznego stężenia oraz wartości współczynnika kombinacji (C.I) dla D-D4FC, samej i w kombinacji z AZT i D4T w ludzkich komórkach PBM w fazie ostrej infekcji (dzień 6). Tabela 6 opisuje skutek β-D oraz e-L-D4FC przeciwko HIV-1 i sklonowanym wirusom w ludzkich komórkach PBM.

T a b e l a 5

Mediana skutecznego stężenia oraz wartości współczynnika kombinacji (C.I) dla D-D4FC, samej i w kombinacji z AZT i D4T w ludzkich komórkach PBM w fazie ostrej infekcji (dzień 6).

Leczenie (stosunek leku)	Parametr³	C.I. przy F_a ^b z
m± SE	EC50 (μίΓΌβ	EC90 ^mol)	r	0,50	0,75	0,90	0,95
D-D4FC	0,95±0,17	0,0076	0,078	0,97
AZT	0,96±0,17	0,0033	0,032	0,98
D4T	0,82±0,16	0,015	0,22	0,95
D- D4FC/AZT	0,65±0,09	0,0012	0,035	0,96	0,164±0,134	0,276±0,233	0,465±0,407	0,664±0,598
(100:1)					0,163+0,120	0,274±0,215	0,460+0,384	0,654±0,571
D- D4FC/D4T	0,86±0,11	0,0087	0,11	0,98	1,14	1,25	1,38	1,47±1,44
(5:1)					1,045	1,154	1,276	1,37±1,27

^am oznacza spadek ± S.E., EC50 to mediana skutecznego stężenia a r to współczynnik korelacji, określony z wykresu mediany. ^bC.I.<1, równy 1 lub > 1 pokazuje synergizm, addytywność oraz antagonizm. Fa to składnik równania mediany odnoszący się do ułamka dotkniętego układu (np. 0,50 oznacza, C.I. przy 50% redukcji aktywności RT). Wartości C.I. określono dla wzajemnych niewyłącznych oddziaływań (wartości kursywą odnoszą się do wzajemnych niewyłącznych oddziaływań mniej żywotnych).

T a b e l a 6

Efekt β-D- i e-L-D4FC przeciwko HIV-1 i sklonowanym wirusom w ludzkich komórkach PBM

Wirusy	e-D-D4FC	e-L-D4FC
EC50μM	EC^m	FI50	FI90	EC50 μΜ	ECg0 μΜ	FI50	FI90
HIV-1lai	0,22	1,32	-	-	0,034	0,16	-	-
xxBRUpitt	0,065	0,46	-	-	0,025	0,088	-	-
M184Vpitt	0,14	1,04	2	2	3,66	14,3	146	163
4XAZTpitt (67N,70R,215Y,219Q)	0,072	0,46	1	1	0,016	0,11	1	1
T215Ypitt	0,067	0,35	1	1	0,0047	0,03	0,2	0,3
M184V/T215Ypitt	0,057	0,47	1	1	8,3	74,6	332	848
215/41pitt	0,13	0,49	2	1	0,018	0,066	1	1
4XM184Vpitt³ (184V,67N,79R,215Y,219Q)	0,045		0,2		>3,3		>47
G2-2pitt³ (103N,41L,184V,210W,inne^b)	0,04		0,2		>3,3		>47
L-D4FC-res. (25 pmola)	ND	ND	ND	ND	7,56	33,3	222	208

FI50=EC50 dane z opornego wirusa EC50 dane z HIV-1LAV lub xxBRUPITT FI90=EC90 dane z opornego wirusa EC90 dane z HIV-1LAV lub xxBRUPITT Wartości wytłuszczone obrazują FI>10 ^a w komórkach MT-2: Cortesy Dr. J. Mellors (pittsburgh) ^b dodatkowe mutacje:203D,207A,211K,214F,245M,277N,283I,284K,200D,311R

PL 198 237 B1

III. Połączenie lub zastąpienie czynników HIV

Ogólnie, podczas terapii naprzemiennej, skuteczne dawkowanie każdego składnika jest podawane seryjnie, podczas gdy w terapii skojarzonej, skuteczne dawkowanie dwóch lub większej ilości czynników jest podawane razem. W terapii naprzemiennej, np. jeden lub większa ilość czynników może być podawana w skutecznej ilości przez skuteczny okres czasu tak, aby wyleczyć infekcję wirusową, a następnie jeden lub następny czynnik zastępuje pierwszy czynnik w leczeniu i jest także podawany w skutecznej ilości przez skuteczny okres czasu.

Dawkowanie będzie zależeć od takich czynników jak absorpcja, biodystrybucja, metabolizm, a także tempo wydalania dla każdego leku, jak również innych czynników znanych osobom biegłym w dziedzinie. Należy zauważyć, iż wartości dawkowania będą także zależeć od ciężkości stanu, który ma być złagodzony.

Zrozumiałym jest fakt, że dla jakiegokolwiek szczególnego pacjenta, sposób podawania leku oraz czas powinny być dostosowywane w czasie zgodnie z indywidualnymi potrzebami a także profesjonalną oceną osoby podającej lub nadzorującej podawanie kompozycji. Przykłady odpowiednich zakresów dawkowania dla związków anty-HIV, włącznie z pochodnymi nukleozydów (np. AZT, D4T, DDI i 3TC) lub inhibitorami proteaz, np. nelfinawirem lub idiniwarem mogą być odnalezione w literaturze naukowej, a także w Physicians Desk Reference. Wiele przykładów odpowiednich zakresów dawkowania dla innych związków opisanych tutaj można także znaleźć w literaturze publicznie dostępnej lub można określić przy użyciu znanych procedur. Te zakresy dawkowania można modyfikować tak, aby otrzymać pożądany skutek.

W jednym zalecanym wykonaniu D-D4FC może być podawany w połączeniu z inhibitorem proteazy. W szczególnym wykonaniu D-D4FC może być podawany w połączeniu lub naprzemiennie z idinawirem (Crixivan), nelfinawirem ([3S-[2(2S*,3S*),3-alfa, 4-a-beta,8a-beta-]]-N-(1,1-dimetyloetylo)dekahydro-2-)2-hydroksy-3-[3-hydroksy-2-metylobenzoilo-amino]-4-(phenylotio)butylo]-3-izochinolinolinokarboksyamid mono-metanosulfonianu) (Viracept), sakwinawirem (Invirase), lub 141W94 (amprenawir; (S)-terahydrofuran-3-yl-N-[(1S,2R)-3-[N-[(4-aminofenylo)sulfonylo]-N-izobutyloamino]-1-benzylo-2-hydroksypropylo] karbaminian; lub efawirenzem (S)-6-chloro-4-(cyklopropyloetynylo)-1,4-dihydro-4-(trifluorometylo)-2H-3,1-benzoksazyno-2-on).

W innym preferowanym wykonaniu D-D4FC może być podawany w połączeniu z nukleozydowym analogiem, obejmującym abakawir 159U89), którym jest bursztynian (1S,4R)-4-[2-amino-6-cyklopropylo-amino)-9H-puryno9-yl]-2-cyklopenteno-1-metanolu.

D-D4FC może być podawany w połączeniu z nienukleozydowym inhibitorem odwrotnej transkryptazy, takim jak DMP-266 ((S)-6-chloro-4-cyklopropyloetynylo-4-trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyno-2-on (SUSTIVA, zobacz patent U.S. nr 5,519021); delawirdyna, (1-[3-(1-metylo-etylo)amino]-2-pirydynylo]-4-[[5-[(metylosulfonylo)amino]-1H-indolo-2-yl]karbonylo]monoetanosulfonian, newirapina lub delawirdyna.

W innych wykonaniach D-D4FC może być podawany w połączeniu lub naprzemiennie z inhibitorem integrazy HIV lub inhibitorem chemokiny.

II. Analiza indukowanych D-D4FC mutacji genomu HIV

Metody oraz zestawy podobne do tych opisanych w opisie patentowym U.S. nr 5, 409, 810, dla Larder i innych, dla AZT, ale bazujące na profilu mutacji dla D-D4FC, mogą być użyte do analizy obecności mutacji indukowanych D-D4FC a zatem mogą być w części wykorzystane w tutaj opisanym wynalazku. Oprócz włączenia patentu Lardera przez odesłanie, techniki te przedstawiono poniżej.

Sposób do testowania wrażliwości próbki HIV-1 na D-D4FC obejmuje:

(i) izolację kwasu nukleinowego z próbki, (ii) hybrydyzację oligonukleotydu do kwasu nukleinowego, przy czym oligonukleotyd jest komplementarny do regionu dzikiego typu sekwencji DNA (lub odpowiadającego jemu RNA) lub do regionu sekwencji mutanta DNA (lub odpowiadającego jemu RNA);

(iii) polimeryzację kwasu nukleinowego od 3' końca oligonuklotydu.

(iv) ustalanie czy jest obecny lub nie produkt wydłużony przez starter oligonuleotydowy.

W powyższej metodologii możliwe jest użycie genomowego DNA lub RNA izolowanego z próbek HIV-1. Odpowiednie komórki wspierające wzrost izolatu HIV-1 są inkubowane przez pewien okres czasu. Komórki są odzyskiwane przez wirowanie. Następnie można izolować DNA przez trawienie komórek proteinazą K w obecności EDTA oraz detergentu, takiego jak SDS, a następnie ekstrakcję fenolem.

PL 198 237 B1

Dobrze znane sposoby ekstrakcji oraz oczyszczania są dostępne do izolacji DNA z próbek. RNA może być izolowany przy użyciu następującej metodologii. Odpowiednie komórki są infekowane i inkubowane przez pewien czas. Komórki odzyskuje się przez wirowanie. Komórki zawiesza się w buforze do ekstrakcji RNA, a następnie trawi się przy użyciu proteinazowego buforu do trawienia i proteinazy K. Białka usuwa się w obecności mieszanki fenol/chloroform. RNA może być odzyskany po następnych etapach wirowania. (Maniatis, T., i inni, Molecular Coning, A laboratory Manual, druga edycja, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).

Chociaż możliwe jest użycie niepowielonego kwasu nukleinowego, to jednak z powodu niedoboru kwasu nukleinowego w próbce HIV-1 zalecane jest jego powielenie. Kwas nukleinowy może być selektywnie powielony (amplifikowany) przy użyciu technik łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), która jest metodą in vitro do wytwarzania ogromnych ilości specyficznych fragmentów kwasów nukleinowych o zdefiniowanej długości oraz sekwencji z małych ilości matrycy.

PCR obejmuje standardowe składniki, wykorzystuje Mg²⁺, startery oligonukleotydowe oraz przebiega w warunkach cyklicznych zmian temperaturowych, co pozwala na powielenie genu RT przy użyciu starterów. Startery dobiera się tak, aby mogły powielić cały gen RT lub wyselekcjonowaną sekwencję, która zawiera nukleotydy odpowiadające regionowi dzikiego typu sekwencji DNA HIV-1, która zawiera zmutowany kodon.

RNA nie może być bezpośrednio powielony przez PCR. Można wytworzyć odpowiadający mu cDNA. Synteza cDNA normalnie zachodzi przy użyciu odwrotnej transkryptazy z użyciem startera oligo-dT. Dogodnie startery dobiera się w taki sposób, aby uprościły sekwencję kwasu nukleinowego dla RT lub wybranej sekwencji, która zawiera nukleotydy odpowiadające regionowi RNA odpowiadające dzikiego typu sekwencji DNA lub regionowi zmutowanej sekwencji DNA odpowiadającej kodonom 70 (K do N), 90 lub 172 regionu odwrotnej transkryptazy. Może to być uzyskane przez przygotowanie startera oligonukleotydowego, który jest komplementarny do regionu nici RNA, który jest powyżej odpowiadającej sekwencji dzikiego typu DNA. cDNA przygotowany przy użyciu tej metody (zobacz Maniatis., i inni., supra.) może być użyty w ten sam sposób jak dla wcześniej przedyskutowanego DNA.

Następny etap metody to hybrydyzacja kwasu nukleinowego z oligonukleotydem, który jest komplementarny do regionu dzikiego typu sekwencji DNA (lub odpowiadającego RNA) lub do regionu zmutowanej sekwencji DNA (lub odpowiadającego RNA).

Następnie stosuje się warunki oraz reagenty pozwalające na polimeryzację kwasu nukleinowego od końca 3' startera oligonukletydowego. Takie reakcje polimeryzacji są dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie.

Jeśli starter oligonukleotydowy na swym końcu 3' posiada nukleotyd, który jest komplementarny do genotypu mutanta, to znaczy genotypu, który zawiera zmianę nukleotydu w kodonie 70 (K do N), 90 lub 172 regionu RT, to polimeryzacja sekwencji kwasu nukleinowego pojawi się tylko dla kwasu nukleinowego próbki, który jest taki sam jak genotyp mutanta. Polimeryzacja dzikiego typu sekwencji kwasu nukleinowego nie pojawi się lub co najmniej w niezadowalającym rozmiarze z powodu nie dopasowania nukleotydów na 3' końcu startera oligonukletydowego i sekwencji kwasu nukleinowego próbki.

Jeśli starter oligonukleotydowy posiada na swym końcu 3' nukleotyd, który jest komplementarny do dzikiego typu genotypu, to znaczy genotypu, który posiada dziki-typ nukleotydu w kodonie 70 (K do N), 90 lub 172 regionu RT, to następnie nastąpi polimeryzacja sekwencji kwasu nukleinowego, która jest typu dzikiego w tej pozycji. Nie zajdzie polimeryzacja kwasu nukleinowego, który posiada zmutowany nukleotyd w pozycji 3'.

Zalecana długość każdego oligonukleotydu wynosi 15-20 nukleotydów. Oligonukleotyd może być przygotowany zgodnie z metodami dobrze znanymi osobom biegłym w dziedzinie (Koster, H., Drug research, 30 str. 548 (1980); Koster, H., Tetrahedron Letters str. 1527 (1972); Caruthers, Tetrahedron Letters, str. 719, (1980), Tetrahedron Letters, str. 1859, (1981); Tetrahedron Letters 24, str. 245, (1983); Gate. M. Nucleic Acid Research, 8, p1081, (1980)) oraz jest przygotowywany w sposób automatyczny przy użyciu automatycznego syntezatora DNA takiego jak Applied Biosystems 381A.

Zalecane jest określenie obecności produktu wydłużonego przez starter oligonukleotydowy. Odpowiednim środkiem do określania obecności produktu jest zastosowanie odpowiedniego znacznika.

Znacznik może być dogodnie przyłączony do startera oligonukleotydowego lub do innych cząsteczek, które będą wiązać produkt polimeryzacji wydłużony przez starter.

Znacznik może być np. enzymem, radioizotopem lub fluorochromem. Zalecanym znacznikiem może być biotyna, która może być następnie wykrywana przy użyciu streptawidyny sprzężonej z en12

PL 198 237 B1 zymem, takim jak peroksydaza lub alkaliczna fosfataza. Obecność produktu polimeryzacji wydłużonego przez starter oligonukleotydowy może być wykrywana np. przez rozwinięcie produktu reakcji polimeryzacji na żelu agarozowym i obserwowanie specyficznego fragmentu DNA znakowanego bromkiem etydyny, lub za pomocą hybrydyzacji typu Southern lub autoradiografii w celu określenia obecności lub braku obecności prążków odpowiadających spolimeryzowanemu produktowi. Jeśli obecny jest dominujący prążek, odpowiadający tylko znakowanemu oligonukleotydowi to oznacza to, że polimeryzacja zaszła. Jeśli są obecne prążki w odpowiednim przewidzianym wcześniej rozmiarze oznacza to iż zaszła polimeryzacja.

Przykładowo DNA wyizolowany z limfocytów pacjentów, jak tu opisano używa się jako matrycę do powielania PCR przy użyciu syntetycznych starterów oligonukleotydowych, które mogą albo pasować albo nie pasować do powielanych sekwencji. Zdolność PCR do wykrywania takich mutacji została już wcześniej wykazana. PCR z użyciem układu Amplification Refractory Mutation („ARMS) (Newton, C.R., i inni, Nucleic Acids Research, 17 str. 2503 (1989)) pozwala na wytworzenie syntetycznych oligonukleotydów, które hybrydyzują z regionami przylegającymi i zawierającymi specyficzne mutacje, takie jak 3' ENDE oligonukleotydu, albo dopasowane albo niedopasowane do sekwencji mutanta lub sekwencji typu dzikiego. PCR przeprowadza się, co skutkuje identyfikacją fragmentu DNA (przy użyciu elektroforezy żelowej), gdzie pojawiło się dopasowanie lub niedopasowanie fragmentów.

DNA ekstrahuje się z komórek T zainfekowanych HIV-1 jak opisano wcześniej i poddaje analizie „ARMS PCR przy użyciu tych starterów.

Obecność fragmentu identyfikuje się przy użyciu startera oligonukleotydowego jak opisano powyżej, tj. przez polimeryzację przy użyciu startera oligonukleotydowego, który może być znakowany, powielonego fragmentu DNA w surowych warunkach, co pozwala na hybrydyzację tylko komplementarnego DNA (jedyną różnicą jest to, że hybrydyzacja różnicująca nie musi być przeprowadzana, ponieważ fragmenty DNA powielonego przy użyciu „ARMS będą takie same zarówno jeśli otrzymane są z mutanta jak i dzikiego typu DNA, tak więc do wykrycia obecności tych fragmentów może być użyty wspólny oligonukleotyd. Sekwencja takiego oligonukleotydu pochodzi z sekwencji DNA z fragmentu DNA, który jest konserwatywny wśród szczepów HIV-1).

Powyższy test PCR może być dostosowany do bezpośredniego wykrywania mutacji powiązanych z opornością na D-D4FC w DNA z próbek PBL od zainfekowanych osobników, które nie były hodowane w celu uzyskania wirusa. Ponieważ materiał ten zawiera znacznie mniej DNA HIV-1 niż ten z zainfekowanych hodowli limfoidalnych to można zastosować „podwójne PCR (lub zestaw zagnieżdżony) (Simmonds, P., Balfe, P, Peutherer, J.F., Ludlam, C.A., Bishop, J.O. oraz Leigh Brown, A.J.,J. Virol.; 64, 864-872, (1990)) w celu zwiększenia ilości sygnału docelowego DNA RT HIV-1 w próbkach. Podwójny PCR przezwycięża problemy ograniczonej amplifikacji sekwencji rzadkiej matrycy. Mała ilość materiału przed-amplifikacyjnego może być użyta w drugim PCR z parami starterów zaprojektowanymi tak, aby umożliwić odróżnienie reszt dzikiego typu oraz mutanta.

Odpowiedni zestaw testowy do użycia w teście do określenia statusu oporności próbki HIV-1 na D-D4FC, wykorzystujący metodologię opisaną powyżej obejmuje oligonukleotyd komplementarny do regionu dzikiego typu sekwencji DNA (lub odpowiadającego RNA) lub do regionu sekwencji mutanta DNA opisanego tutaj, inny materiał odpowiedni do polimeryzacji kwasu nukleinowego z 3'końcem oligonukleotydu i środki do określania obecności produktu wydłużonego przez starter oligonukleotydowy. Takie inne materiały obejmują odpowiednie enzymy, bufory i roztwory do płukania oraz znacznik i substrat dla znacznika, jeśli jest to wymagane. Jeśli PCR stosuje się do amplifikacji kwasu nukleinowego to następnie powinny być także zawarte dodatkowe materiały, takie jak odpowiednie startery oligonukleotydowe, które powielą region typu dzikiego sekwencji DNA (lub odpowiedniego RNA) lub region sekwencji mutanta DNA (lub odpowiedniego RNA) i dNTP.

Sposób określania wrażliwości próbki HIV-1 na D-D4FC, obejmuje:

(i) izolację kwasu nukleinowego z próbki (ii) hybrydyzację kwasu nukleinowego z oligonukleotydem komplementarnym do regionu typu dzikiego sekwencji DNA (lub odpowiadającego mu RNA) lub do regionu sekwencji mutanta DNA przytoczonej na Figurze 1 (lub odpowiadającego mu RNA) zawierający co najmniej jeden lub więcej nukleotydów z kodonu 70 (K do N), 90 lub 172 w regionie RT i (iii) ustalanie czy jakiekolwiek powstałe hybrydy oligonukleotydu i kwasu nukleinowego mają komplementarne nukleotydy w jednym z tych punktów.

Dogodnie oligonukleotyd jest tak zaprojektowany, aby wytworzyć perfekcyjnie dopasowaną hybrydę z jej komplementem.

PL 198 237 B1

Kwas nukleinowy (DNA lub RNA) izoluje się z próbki przy użyciu wcześniej wspomnianej metody, jak to opisano powyżej.

Podobnie reakcja PCR może zostać użyta do amplifikacji DNA RT (lub odpowiedniego RNA) lub korzystnie do amplifikacji regionu DNA RT (lub odpowiadającego RNA), który zawiera DNA (lub odpowiadający mu RNA) posiadający jeden lub więcej nukleotydów w oznakowanej pozycji.

W drugim etapie tej metodologii kwas nukleinowy następnie używa się do hybrydyzacji z oligonukleotydami komplementarnymi do regionu dzikiego typu sekwencji DNA (lub odpowiadającego mu RNA) lub do regionu sekwencji mutanta DNA.

Oligonukleotyd może być jakiejkolwiek długości, w zależności od liczby pozycji nukleotydów leżących w naszym zainteresowaniu, które mają być badane. Jeśli oligonukleotyd jest zaprojektowany tak, aby zawierał nukleotyd tylko w jednym interesującym nas położeniu, to ten nukleotyd, dogodnie znajduje się w centralnej pozycji oligonukleotydu lub blisko niej.

Aby ustalić czy oligonukleotyd i sekwencja kwasu nukleinowego utworzyły, czy nie, dopasowaną hybrydę, dobiera się specyficzne warunki hybrydyzacji tak, aby hybrydy były tylko utworzone w sytuacjach gdy nukleotyd lub nukleotydy w kodonach 70 (K do N), 90 lub 172 regionu odwrotnej transkryptazy były komplementarne do odpowiadającego nukleotydu lub nukleotydów oligonukleotydu, który albo pozwala na hybrydyzację albo nie pozwala na hybrydyzację. Ważne jest przykładowo ustanowienie temperatury reakcji oraz stężenia roztworu soli przed przeprowadzeniem hybrydyzacji, aby znaleźć warunki, które są wystarczająco surowe do zagwarantowania specyficzności (Maniatis, T., i inni, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, drugie wydanie, Cold Spring Laboratory Press (1989). Jeśli próbka oligonukloetydu ma sekwencję DNA, która jest komplementarna do dzikiego typu sekwencji kwasu nukleinowego w jednym lub większej ilości nukleotydów odpowiadających kodonom 70 (K do N), 90 lub 172 regionu odwrotnej transkryptazy, to ten oligonuklotyd będzie hybrydyzował dokładnie z dzikim typem kwasu nukleinowego. Natomiast, jeśli nie zachodzi dokładna hybrydyzacja do dzikiego typu kwasu nukleinowego, to będzie to sugerowało, że wyizolowany kwas nukleinowy zawiera jedną lub większą ilość mutacji.

Jeśli próbka oligonukleotydu ma sekwencję DNA, która jest komplementarna do sekwencji kwasu nukleinowego mutanta, to ten oligonukleotyd będzie hybrydyzował z kwasem nukleinowym mutanta. Jeśli nie ma hybrydyzacji, to będzie to sugerowało, że wyizolowany kwas nukleinowy z próbki nie zawiera takiej lub takich mutacji. Próbki oligonukleotydu mogą być znakowane w celu ułatwienia detekcji jak to zostało już opisane powyżej.

Hybrydyzację oraz następujące później usuwanie niezhybrydyzowanych kwasów nukleinowych przeprowadza się w surowych warunkach, które pozwalają na hybrydyzację tylko komplementarnego DNA a nie oligonukleotydu zawierającego błędy (tj. oligonukleotydowo-specyficzna hybrydyzacja, jak opisano do wykrycia mutacji komórek sierpowatych przy użyciu genu β-globiny lub genu HLA-DQa (Saikt, R. K. i inni, Nature, 324, str. 163, (1986), aktywowanego genu Ras (Ver Laan-de, Vries, M., i inni, Gene, 50, 313, (1986)) oraz β-talassemii Wong, C., i inni, Nature 330, str. 384, (1987)).

Hybrydyzację można przeprowadzić przez immobilizację sekwencji kwasu nukleinowego RT na nitrocelulozie, nylonie lub innym stałym podłożu (np. dot-blot). Zalecane jest określenie obecności hybrydy przy użyciu środków do znakowania. Przykładowo chemicznie syntetyzowane próbki oligonukleotydu mogą być odpowiednio znakowane przy użyciu enzymu, radioizotopu lub fluorochromu. Zalecanym znacznikiem może być biotyna, która może być następnie wykryta przy użyciu streptawidyny sprzężonej z enzymem, takim jak peroksydaza lub fosfataza alkaliczna.

Ewentualnie, hybrydyzację można przeprowadzić immobilizując chemicznie zsyntetyzowane oligonukleotydy jak opisano powyżej, które są nieznakowane, na stałym podłożu jak opisano powyżej, a następnie przez hybrydyzację znakowanej sekwencji kwasu nukleinowego RT jak to opisano powyżej.

W obu sytuacjach opisanych powyżej wprowadza się odpowiednie reakcje kontrolne hybrydyzacji w celu określenia czy zaszła skuteczna hybrydyzacja (np. hybrydyzacja oligonukleotydów z komplementarnym oligonukleotydem).

Wyniki mogą być z łatwością zinterpretowane, ponieważ wyizolowany kwas nukleinowy będzie hybrydyzował zarówno z dzikim typem oligonukleotydu, jak i ze zmutowanym oligonukleotydem.

Odpowiedni zestaw testowy do użycia w teście przy badaniu wrażliwości próbek HIV-1 na D-D4FC, wykorzystujący opisaną powyżej metodologię obejmuje oligonukleotyd komplementarny do regionu dzikiego typu sekwencji DNA (lub odpowiadający mu RNA) lub do adekwatnego regionu sekwencji mutanta DNA, wraz z innymi materiałami wymaganymi do przeprowadzenia hybrydyzacji. Materiały takie obejmują odpowiednie bufory oraz roztwory do płukannia oraz znaczniki i substraty dla

PL 198 237 B1 znaczników, jeśli jest to wymagane. Przeważnie oligonukleotyd będzie znakowany. Jeśli do amplifikacji kwasu nukleinowego używa się PCR przed hybrydyzacją to dodatkowymi materiałami, które powinny być także zawarte są odpowiednie startery oligonukleotydowe, które będą amplifikowały regiony dzikiego typu sekwencji DNA (lub odpowiadającego RNA) lub region sekwencji mutanta DNA, odpowiedni enzymu i dNTP (trifosforany deoksynukleotydów).

W innej formie testu dNTP w czasie amplifikacji mogą być sprzężone, lub nie, z cząsteczką detektora, taką jak radioizotop, biotyna, fluorochrom lub enzym.

Można także wykryć mutacje oporności na zydowudynę w RNA RT H|V-1, izolowanego z próbek klinicznych przy użyciu systemu amplifikacji RNA. Przy użyciu metodologii opisanej przez Guatelli i innych (Proc. Natl. Acad. Sci, (USA), 8/7, 1874-1878, (Marzec 1990) sekwencja docelowa kwasu nukleinowego może zostać replikowana (powielona) wykładniczo in vitro w warunkach izotermicznych przy zastosowaniu trzech aktywności enzymatycznych zasadniczych dla replikacji retrowirusów: odwrotna transkrypcja, RNaza H oraz polimeraza RNA zależna od DNA. Taka metodologia może być użyta przed hybrydyzacją, aby odróżnić mutanty od dzikiego typu nukleotydów omawianych wcześniej.

Wytwarzanie kompozycji farmaceutycznych

Ludzie cierpiący na skutki chorób opisanych tutaj, a w szczególności infekcje H|V, mogą być leczeni przez podawanie skutecznej ilości D-D4FC lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub proleku, w obecności farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika lub rozcieńczalnika w dowolnym wskazaniu lub drodze podawania, opisanych tutaj w szczegółach. Aktywne materiały mogą być podawane jakąkolwiek odpowiednią drogą, np. doustnie, pozajelitowo, jelitowo, dożylnie, doskórnie, podskórnie, przezskórnie, donosowo lub miejscowo, w formie ciekłej lub stałej.

Związek (związki) aktywne są zawarte w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub rozcieńczalniku w ilości wystarczającej do dostarczenia pacjentom terapeutycznie skutecznej ilości związku do hamowania replikacji wirusowej in vivo, zwłaszcza replikacji H|V, bez powodowania poważnych skutków toksycznych u leczonych pacjentów. Poprzez „ilość hamującą rozumie się skuteczną ilość aktywnego składnika wystarczającą do spowodowania efektu hamowania, zmierzonego za pomocą, np. testu tutaj opisanego.

Zalecana dawka składnika dla wszystkich wyżej wspomnianych stanów będzie wahać się od około 1 do 75 mg/kg, dogodnie od 1 do 20 mg/kg masy ciała dziennie, a bardziej ogólnie od około 0,1 do 100 mg na kilogram masy ciała pacjenta na dzień. Zakres skutecznego dawkowania farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych może być obliczony na bazie macierzystego nukleozydu, który ma być dostarczony. Jeśli pochodne wykazują aktywność jako takie, to skuteczne dawkowanie może być oszacowane jak powyżej przy użyciu masy pochodnej, lub przy użyciu innych metod dobrze znanych osobom biegłym w dziedzinie.

Związki są dogodnie podawane w jakiejkolwiek odpowiedniej jednostkowej postaci dawkowania, obejmującej, ale bez ograniczenia, taką zawierającą od 7 do 3000 mg, dogodnie od 70 do 1400 mg aktywnego składnika na jednostkową postać dawkowania. Dogodna dawka do podawania doustnego zwykle wynosi od 50 do 1000 mg.

|dealnie aktywny składnik powinien być podawany tak, aby uzyskać maksymalne stężenie w osoczu składników aktywnych od około 0,02 do 70 μmoli, dogodnie około 0,5 do 10 mM. Można to osiągnąć przykładowo poprzez dożylne wstrzyknięcie około 0,1 do 25% roztworu aktywnego składnika, alternatywnie w soli fizjologicznej lub podanie jednej dużej dawki składnika aktywnego.

Stężenie aktywnego składnika w kompozycji będzie zależeć od absorpcji, dystrybucji, metabolizmu oraz tempa wydalania kompozycji, jak również innych czynników dobrze znanych specjalistom danej dziedziny. Dawka będzie również różnić się w zależności od ciężkości stanu, jaki ma być złagodzony. Zrozumiałym jest fakt, iż dla poszczególnych pacjentów specyficzne dawki powinny być dopasowywane w czasie, zgodnie z indywidualnymi potrzebami i profesjonalnym osądem osób podających lub nadzorujących podawanie kompozycji a zakresy stężeń pokazane tutaj mają jedynie służyć jako przykład a nie ograniczenie celu i zastosowania opisanej kompozycji. Aktywne składniki mogą być podawane jednokrotnie lub mogą być podzielone na wiele mniejszych dawek do podawania w zmiennych odstępach czasu.

Zalecaną drogą podawania aktywnego składnika jest droga doustna. Kompozycje doustne będą zasadniczo zawierać obojętny rozcieńczalnik lub jadalny nośnik. Mogą one być zawarte w kapsułkach żelatynowych lub mogą być sprasowane w tabletki. W celu terapeutycznego podawania doustnego, aktywne składniki mogą być zawarte z zaróbkami i stosowane w postaci tabletek, kołaczyków lub kapPL 198 237 B1 sułek. Farmaceutycznie kompatybilne środki wiążące oraz/lub adiuwanty mogą być zawarte jako część kompozycji.

Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki i tym podobne mogą zawierać którekolwiek z następujących składników lub związki o podobnej naturze: środek wiążący taki jak mikrokrystaliczna celuloza, guma tragakantowa lub żelatyna, zaróbki takie jak skrobia lub laktoza, środki rozsadzające takie jak kwas algininowy, Primogel, skrobia kukurydziana; środek zwilżający taki jak stearynian magnezu lub Sterotes, środek poślizgowy taki jak koloidalny ditlenek krzemu; środek słodzący taki jak sacharoza lub sacharyna; środek smakowy taki jak mięta pieprzowa, salicylan metylu, aromat pomarańczowy. Gdy jednostkowa postać dawkowania jest kapsułką, to może dodatkowo zawierać materiał z powyższej listy jak również ciekły nośnik taki jak olej tłuszczowy. Dodatkowo jednostkowa postać dawkowania może zawierać różne inne materiały, które modyfikują postać fizyczną jednostkowej postaci dawkowania, np. powłoki cukrowe, szelakowe lub inne środki jelitowe.

Związki mogą być podawane jako składnik eliksiru, zawiesiny, syropu, opłatka, gumy do żucia lub tym podobnych. Syrop może zawierać dodatkowo, oprócz związków aktywnych, sacharozę jako środek słodzący i pewne środki konserwujące, barwniki oraz środki koloryzujące i aromaty.

Związki oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne lub ich sole mogą być także zmieszane z innymi materiałami aktywnymi, które nie osłabiają pożądanej aktywności lub z materiałami które uzupełniają pożądaną aktywność, takimi jak antybiotyki, związki antygrzybiczne, przeciwzapalne, inhibitory proteaz lub inne nukleozydowe lub nienukleozydowe czynniki antywirusowe jak dyskutowano bardziej szczegółowo powyżej. Roztwory albo zawiesiny stosowane do podawania pozajelitowego, doskórnego, podskórnego lub miejscowego mogą zawierać następujące składniki: sterylny rozcieńczalnik taki jak woda do iniekcji, roztwór soli fizjologicznej, olej tłuszczowy, glikole polietylenowe, gliceryna, glikol propylenowy lub inne syntetyczne rozpuszczalniki; środki antybakteryjne takie jak alkohol benzylowy lub parabeny metylowe, antyutleniacze takie jak kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodu, środki chelatujące takie jak kwas etylenodiamintetraoctowy, bufory takie jak octany, cytryniany lub fosforany oraz czynniki tonizujące takie jak chlorek sodu lub dekstroza. Preparaty pozajelitowe mogą być zawarte w ampułkach, jednorazowych strzykawkach, wielodawkowych fiolkach zrobionych ze szkła lub plastiku.

Jeśli kompozycja podawana jest dożylnie to zalecanymi nośnikami są sól fizjologiczna lub buforowana fosforanem sól fizjologiczna (PBS).

Zawiesiny liposomalne (zawierające liposomy ukierunkowane na zainfekowane komórki z przeciwciałami monoklonalnymi wobec antygenów wirusowych) są także zalecane jako farmaceutycznie dopuszczalne nośniki. Mogą być one przygotowane zgodnie z metodami znanymi specjalistom danej dziedziny, np. jak opisano w opisie patentowym U.S. nr 4 522 811 (który jest tutaj załączony w całości przez odesłanie). Przykładowo kompozycje liposomalne mogą być przygotowane przez rozpuszczenie odpowiedniego(ch) lipidu(ów) (takiego jak stearoilofosfatydyloetanolamina, stearoilofosfatydylocholina, arachidoilofosfatydylocholina oraz cholesterol) w nieorganicznym rozpuszczalniku, który jest następnie odparowany, pozostawiając cienką warstwę wysuszonych lipidów na powierzchni pojemniczka. Wodny roztwór aktywnego składnika lub jego pochodnej monofosforanowej, difosforanowej, i/lub trifosforanowej jest następnie wprowadzany do pojemniczka. Następnie pojemniczek jest odwirowywany ręcznie, aby uwolnić materiał lipidowy ze ścianek pojemnika, a także by zdyspergować agregaty tłuszczowe przez to tworząc zawiesinę liposomalną.

Preparaty o kontrolowanym uwalnianiu

Wszystkie patenty U.S. cytowane w tej sekcji dotyczące preparatów o kontrolowanym uwalnianiu są załączone tutaj przez odesłanie, w całej swojej rozciągłości.

Dziedzina biodegradowalnych polimerów rozwinęła się bardzo szybko od momentu opublikowania syntezy oraz biodegradowalności kwasu polimlekowego, opisanego przez Kulkarni i inni, w 1966 („Polilactic acid for surgical implants”, Arch. Surg., 93: 839). Przykłady innych polimerów, które zostały opisane jako przydatny materiał na macierze do urządzeń do dostarczania obejmują polibezwodniki, poliestry takie jak poliglikolidy oraz kopolimery polilaktydoglikolidowe, kwasy poliaminowe takie jak polilizyna, polimery i kopolimery tlenku polietylenu, tlenku polietylenu zakończonego akrylem, poliamidy, poliuretany, poliortoestry, poliakrylonitryłe i polifosfazeny. Zobacz, np. patent U.S. nr 4,891,225 oraz 4,906,474 Langer, 4,767,628 Hutchinson (polilaktyd, kopolimer kwasu mlekowego i glikolowego), oraz 4,530,840 Tice i inni (polilaktyd, poliglikolid i kopolimery). Zobacz także Patent U.S. nr 5,626,863 Hubbell i inni, którzy opisują fotopolimeryzujące biodegradowalne hydrożele jako materiały kontaktujące się z tkanką oraz nośniki o kontrolowanym uwalnianiu (Hydrożele polimeryzo16

PL 198 237 B1 wanych i usieciowanych makromerów zawierające hydrofilowe oligomery z biodegradowalnymi monomerycznymi lub oligomerycznymi wydłużeniami, które są ograniczone na końcu monomerami lub oligomerami zdolnymi do polimeryzacji i sieciowania); oraz PCT WO 97/05185 Focal inc ukierunkowane na wieloblokowe biodegradowalne hydrożele do użycia jako czynniki o kontrolowanym uwalnianiu dla czynników do dostarczania leków oraz leczenia tkanek.

Degradowalne materiały pochodzenia biologicznego są także dobrze znane, np. sieciowana żelatyna. Usieciowany kwas hialuronowy został użyty jako biodegradowalny polimer pęczniejący do zastosowań biomedycznych (U.S. Patent 4,957,744 Dell Valle i inni; (1991) Surface modification of polimeric biomaterials for reduced thrombogenicity, Polym. Mater. Sci. Eng, 62:731-735]).

Wiele układów dyspersyjnych jest aktualnie używanych lub opracowywanych jako nośniki substancji, szczególnie związków biologicznie aktywnych. Układy dyspersyjne stosowane do preparatów kosmetycznych oraz farmaceutycznych można podzielić na dwie kategorie: zawiesiny i emulsje. Zawiesiny definiuje się jako stałe cząstki o rozmiarach wahających się od kilku nanometrów do setek mikronów rozpuszczone w ciekłym ośrodku przy użyciu czynników zawieszających. Stałe cząstki obejmują mikrosfery, mikrokapsułki i nanosfery. Emulsje definiuje się jako rozproszenie jednej cieczy w drugiej, stabilizowane przez film emulgatora na granicy faz, takiego jak związki powierzchniowo czynne, jak i lipidy. Preparaty emulsji obejmują emulsje woda w oleju oraz olej w wodzie, wieloskładnikowe emulsje, mikroemulsje, mikrokropelki i liposomy. Mikrokropelki są to unilamelarne kropelki fosfolipidowe, które składają się ze sferycznej warstwy tłuszczowej z fazą olejową w środku, jak to zdefiniowano w opisach patentowych U.S. nr 4,622,219 oraz 4,725,442 Haynes. Liposomy to fosfolipidowe pęcherzyki przygotowane przez mieszanie nierozpuszczalnych w wodzie polarnych lipidów z roztworem wodnym. Niekorzystna entropia spowodowana przez mieszanie nierozpuszczalnego lipidu w wodzie wytwarza wysoce uporządkowane zgromadzenie koncentrycznie pozamykanych błon fosfolipidowych z zamkniętym wewnątrz roztworem wodnym.

Opis patentowy U.S. nr 4,938,763 Dunn i inni, ujawnia sposób tworzenia implantu in situ przez rozpuszczenie niereaktywnych, nierozpuszczalnych w wodzie termoplastycznych polimerów w biokompatybilnym rozpuszczalniku wodnym w celu wytworzenia cieczy, którą umieszcza się w ciele, pozwalając rozpuszczalnikowi na rozproszenie w celu wytworzenia stałego implantu. Roztwór polimeru może być dostarczony do organizmu przez strzykawkę. implant może przybrać kształt otaczającej jamy ciała. W alternatywnych wykonaniach implant jest formowany z reaktywnych ciekłych polimerów oligomerycznych, który nie zawieraja rozpuszczalnika i który leczy przez tworzenie fazy stałej na miejscu, przeważnie z dodatkiem leczniczego katalizatora.

Wiele patentów opisuje układy dostarczania leku, które mogą być użyte do podawania D-D4FC lub nukleotydu lub innego zdefiniowanego proleku. Opis patentowy U.S. nr 5,749,847 opisuje metodę dostarczania nukleotydów do organizmu przez elektroporację. Opis patentowy U.S. nr 5,718,921 opisuje mikrosfery składające się z polimeru i rozproszonego w nim leku. Opis patentowy U.S. nr 5,629,009 opisuje układ dostarczania do kontrolowanego uwalniania czynników bioaktywnych. Opis patentowy U.S. nr 5,578,325 opisuje nanocząsteczki i mikrocząsteczki nieliniowych hydrofilowohydrofobowych wieloblokowych kopolimerów. Opis patentowy U.S. nr 5,545,409 opisuje układ dostarczania do kontrolowanego uwalniania czynników bioaktywnych. Opis patentowy U.S. nr 5,494,682 opisuje jonowo usieciowane polimerowe mikrokapsułki.

Opis patentowy U.S. nr 5,728,402 Andrx Pharmaceuticals, inc. opisuje preparat o kontrolowanym uwalnianiu, który obejmuje wewnętrzną fazę, która zawiera aktywny lek, jego sól lub prolek, w mieszaninie z czynnikiem tworzącym hydrożel i zewnętrzną fazę, która zawiera powłokę, która jest odporna na rozpuszczanie w żołądku. Opis patentowy U.S. nr 5,736,159 oraz 5,558,879 Andrx Phaarmaceuticals, inc opisują preparaty o kontrolowanym uwalnianiu do leków o małej rozpuszczalności w wodzie, w których utworzona jest droga in situ. Opis patentowy U.S. nr 5,567,441 Andrx Phaarmaceuticals, inc opisuje preparat do podawania raz dziennie. Opis patentowy U.S. nr 5,508,040 opisuje wielocząsteczkowy tętniący układ dostarczania leku. Opis patentowy U.S. nr 5,472,708 przedstawia układ dostarczania leku bazujący na pulsującej cząsteczce. Opis patentowy U.S. nr 5,458,888 opisuje preparat tabletki o kontrolowanym uwalnianiu, który może być przygotowany przy użyciu mieszanki posiadającej wewnętrzną fazę zawierającą lek oraz fazę zewnętrzną, która składa się z polimeru glikolu polietylenowego, którego średnia masa cząsteczkowa waha się od 3000 do 10000. Opis patentowy U.S. nr 5,419,917 opisuje metody modyfikacji szybkości uwalniania leku z hydrożelu, które bazują na użyciu skutecznej ilości farmaceutycznie akceptowanego jonizowanego składnika, który jest zdolny do

PL 198 237 B1 zapewnienia szybkości uwalniania z hydrożelu dawki leku rzędu zerowego. Opis patentowy U.S. nr 5,458,888 opisuje preparat tabletki o kontrolowanym uwalnianiu.

Opis patentowy U.S. nr 5,641,745 Elan Corporation, plc opisuje farmaceutyczny preparat o kontrolowanym uwalnianiu, który zawiera aktywny lek w biodegradowalnym polimerze z utworzeniem mikrosfer lub nanosfer. Biodegradowalny polimer jest odpowiednim poli-D,L-laktydem lub mieszanką poli-D,L-laktydu i kopolimeru poli-D,L-laktydo-glikolidowego. Opis patentowy U.S. nr 5,616,345 Elan Corporation plc opisuje preparaty o kontrolowanej absorpcji do podawania raz dziennie, które zawierają aktywny składnik w połączeniu z kwasem organicznym oraz wielopowierzchniową błonę otaczającą jądro i zawierającą główną część farmaceutycznie dopuszczalnego tworzącego film nierozpuszczalnego w wodzie, syntetycznego polimeru i mniejszą część farmaceutycznie dopuszczalnego tworzącego film rozpuszczalnego w wodzie syntetycznego polimeru. Opis patentowy U.S. nr 5,641,515 opisuje preparat o kontrolowanym uwalnianiu bazujący na biodegradowalnych nanocząsteczkach. Opis patentowy U.S. nr 5,637,320 opisuje preparaty o kontrolowanej absorpcji do podawania raz dziennie. Opis patentowy U.S. nr 5,580,580 oraz 5,540,938 są ukierunkowane na preparaty i ich zastosowanie w leczeniu chorób neurologicznych. Opis patentowy U.S. nr 5,533,995 jest ukierunkowany na urządzenie do podawania biernego międzyskórnego o kontrolowanym uwalnianiu leku. Opis patentowy U.S. nr 5,505,962 opisuje preparat o kontrolowanym uwalnianiu.

Kompozycje proleku

D-D4FC lub jakiekolwiek nukleozydy lub inne związki, które zostały tutaj opisane do użycia w terapii skojarzonej lub naprzemiennej z D-D4FC lub jego pochodnymi związkami mogą być podawane jako acylowany prolek lub nukletydowy prolek jak to opisano szczegółowo poniżej.

Jakikolwiek z nukleozydów opisanych tutaj lub innych związków, zawierających grupę funkcyjną hydroksylową lub aminową może być podawany jako nukleotydowy prolek w celu zwiększenia aktywności, biodostępności, stabilności lub zmiany w inny sposób właściwości nukleozydu. Jest znane wiele nukleotydowych ligandów leków. Ogólnie alkilacja, acylacja lub inna lipofilowa modyfikacja grupy hydroksylowej składnika mono-, di- lub trifosforanu nukleozydu zwiększy stabilność nukleotydu. Przykładami grup podstawników, które mogą zastąpić jedną lub większą ilość wodorów w grupie fosforanowej lub hydroksylowej, są alkile, aryle, steroidy, węglowodany, obejmujące cukry, 1,2-diacyloglicerole i alkohole. Wiele z nich opisano w R. Jones i N. Bischofberger, Antiviral Research, 27 (1995) 1-17. Jakikolwiek z tych związków może być użyty w połączeniu z opisanymi nukleozydami lub innymi związkami w celu uzyskania odpowiedniego efektu.

Aktywne nukleozydy lub inne związki zawierające grupę hydroksylową mogą być także dostarczone jako lipidy eterowe (a zwłaszcza 5'-etero lipid dla nukleozydu), i są ujawnione w następujących odnośnikach, które są tutaj zawarte przez odesłanie: Kucera, L.S., N. lyer, E. Leake, A. Raben, Modest E.K., D.L.W., and C. Piantadosi. 1990. Novel membraneinteractive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation. AIDS Res. Hum. Retro Viruses. 6:491-501; Piantadosi, C., J. Marasco C.J., S.L. Morris-Natschke, K.L. Meyer, F. Gumus, J.R. Surles,

K.S. Ishaq, L.S. Kucera, N. lyer, C.A. Wallen, S. Piantadosi, and E.J. Modest. 1991. Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity J. Med. Chem. 34:1408.1414; Hosteller, K.Y., D.D. Richman, D.A. Carson, L.M. Stuhmiller, G.M. T. van Wijk, and H. van den Bosch. 1992. Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cells by 3'-deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol, a lipid prodrug of 3'-deoxythymidine. Antimicrob. Agents Chemother. 36:2025.2029; Hostetler, K.Y., L.M. Stuhmiller, H.B. Lenting, H. van den Bosch, i D.D. Richman, 1990. Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides. J. Biol. Chem. 265:61127.

Nieograniczające przykłady opisów patentowych U.S.A, które ujawniają odpowiednie lipofilowe podstawniki, które mogą być zawarte w sposób kowalencyjny w nukleozydzie lub innym związku zawierającym inną grupę hydroksylową lub aminową, dogodnie w pozycji 5'-OH dla preparatów nukleozydowych lub lipofilowych obejmują: patenty U.S. nr 5,149,794 (Sep. 22, 1992, Yatvin i inni); 5,194,654: S (Mar. 16, 1993, Hostetler i inni, 5,223,263 (June 29, 1993, Hostetler i inni); 5,256,641 (Oct. 26, 1993, Yatvin i inni); 5,411,947 (May 2, 1995, Hostetler i inni); 5,463,092 (Oct. 31, 1995, Hostetler i inni); 5,543,389 (Aug. 6; 1996, Yatvin i inni); 5,543,390 (Aug. 6, 1996, Yatvin i inni); 5,543,391 (Aug. 6, 1996, Yatvin i inni); and 5,554,728 (Sep. 10, 1996; Basava i inni), które wszystkie są zawarte tutaj przez odesłanie. Inne zgłoszenia patentowe, które ujawniają lipofilowe podstawniki, które mogą być przyłączone do nukleozydów opisywanych w prezentowanym wynalazku lub preparatów lipofilo18

PL 198 237 B1 wych obejmują WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4, i WO 91/19721.

Nieograniczające przykłady proleków nukleotydowych są opisane w następujących dokumentach: Ho, D.H. W. (1973) Distribution of Kinase and deaminase of 1 β-D-arabinofuranosylcytosine in tissues of man and muse. Cancer Res. 33, 2816-2820; Holy, A. (1993) Isopolar phosphorousmodified nucleotide analogues, In: De Clercq (Ed.), Advances in Antiviral Drug Design, Vol. I, JAI Press, str. 179-231; Hong, C.L, Nechaev, A., and West, C.R. (1979a) Synthesis and antitumor activity of 1 β-D-arabinofuranosylcytosine conjugates of cortisol and cortisone. Biochem. Biophys. Rs. Commun. 88, 1223-1229; Hong, C.L, Nechaev, A., Kirisits, A.J. Buchheit, D.J. and West, C.R. (1980) Nucleoside conjugates as potential antitumor agents. 3. Synthesis and antitumor activity of 1-e-D-arabinofuranosyl) cytosine conjugates of corticosteroids and selected lipophilic alcohols. J. Med. Chem. 28, 171-177; Hosteller, K.Y., Stuhmiller, L.M., Lenting, H.B.M. van den Bosch, H. and Richman

J. Biol. Chem. 265, 6112-6117; Hosteller, K.Y., Carson, D.A. and Richman, D.D. (1991); Phosphatidylazidothymidine: mechanism of antiretroviral action in CEM cells. J. Biol Chem. 266, 11714-11717; Hosteller, K.Y., Korba, B. Sridhar, C., Gardener, M. (1994a) Antiviral activity of phosphatidyldideoxycytidine in hepatitis B-infected cells and enhanced hepatic uptake in mice. Antiviral Res. 24, 59-67; Hosteller, K.Y., Richman, D.D., Sridhar. C.N. Felgner, P.L. Felgner, J., Ricci, J., Gardener, M.F. Selleseth, D.W. and Ellis, M.N. (1994b) Phosphatidylazidothymidine and phosphatidyl-ddC: Assessment of uptake in mouse lymphoid tissues and antiviral activities in human immunodeficiency virusinfected cells and in rauscher leukemia virus-infected mice. Antimicrobial Agents Chemother. 38, 2792-2797; Hunston, R.N., Jones, A.A. McGuigan, C., Walker, R.T., Balzarini, J., and DeClercq, E. (1984) Synthesis and biological properties of some cyclic phosphotriesters derived from 2'-deoxy-S-fluorouridine. J. Med. Chem. 27, 440-444; Ji, Y.H., Moog, C., Schmitt, G., Bischoff, P. and Luu, B. (1990); Monophosphoric acid esters of 7-e-hydroxycholesterol and of pyrimidine nucleoside as potential antitumor agents: synthesis and preliminary evaluation of antitumor activity. J. Med. Chem. 33 2264-2270; Jones, A.S., McGuigan, C., Walker, R.T., Balzarini, J. and DeClercq, E. (1984) Synthesis, properties, and biological activity of some nucleoside cyclic phosphoramidates. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1471-1474; Juodka, B.A. and Smart, J. (1974) Synthesis of diribonucleoside phosph (P-N) amino acid derivatives. Coll. Czech. Chem. Comm. 39, 363-968; Kataoka, S., Imai, J., Yamaji, N., Kato, M., Saito, M., Kawada, T. and Imai, S. (1989) Alkylated cAMP derivatives; selective synthesis and biological activities. Nucleic Acids Res. Sym. Ser. 21, 1-2; Kataoka, S., Uchida, (cAMP) benzyl and methyl triesters. Heterocycles 32, 1351-1356; Kinchington, D., Harvey, J. J., O'Connor, T.J., Jones, B.C.N.M., Devine, K.G., Taylor-Robinson D., Jeffries, D. J. and McGuigan, C. (1992) Comparison of antiviral effects of zidovudine phosphoramidate and phosphorodiamidate derivatives against HIV and ULV in vitro. Antiviral Chem. Chemother. 3, 107-112; Kodama, K., Morozumi, M., Saithoh,

K. L, Kuninaka, H., Yosino, H. and Saneyoshi, M. (1989) Antitumor activity and pharmacology of 1-β-D-arabinofuranosylcytosine -S-stearylphosphate; an orally active derivative of 1-e-D-arabinofuranosylcytosine. Jpn. J. Cancer Res. 80, 679-685; Korty, M. and Engels, J. (1979) The effects of adenosineand guanosine 3',5' phosphoric and acid benzyl esters on guineapig ventricular myocardium. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 310, 103-111; Kumar, A., Goe, P.L., Jones, A.S. Walker,

R. T. Balzarini, J. and DeClercq, E. (1990) Synthesis and biological evaluation of some cyclic phosphoramidate nucleoside derivatives. J. Med. Chem, 33, 2368-2375; LeBec, C., i Huynh-Dinh, T. (1991) Synthesis of lipophilic phosphate triester derivatives of 5-fluorouridine an arabinocytidine as anticancer prodrugs. Tetrahedron Lett. 32, 6553-6556; Lichtenstein, J., Barner, H.D. and Cohen, S.S. (1960) The metabolism of exogenously supplied nucleotides by Escherichia coli., J. Biol. Chem. 235, 457-465; Lucthy, J., Von Daeniken, A., Friederich, J. Manthey, B.7Zweifel, J., Schlatter, C, i Benn,

M.H. (1981) Synthesis and toxicological properties of three naturally occurring cyanoepithioalkanes. Mitt. Geg. Lebensmittelunters. Hyg. 72, 131-133 (Chem. Abstr. 95, 127093); McGigan, C. Tollerfield,

S. M. and Riley, P.a. (1989) Synthesis and biological evaluation of some phosphate triester derivatives of the anti-viral drug Ara. Nucleic Acids Res. 17, 6065-6075; McGuigan, C., Devine, K.G., O'Connor, T.J., Galpin, S. A., Jeffries, D.J. and Kinchington, D. (1990a) Synthesis and evaluation of some: S novel phosphoramidate derivatives of 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT) as anti-HIV compounds. Antiviral Chem. Chemother. 1 107-113; McGuigan, C., O'Connor, T.J., Nicholls, S.R. Nickson, C. and Kinchington, D. (1990b) Synthesis and anti-HIV activity of some novel substituted dialkyl phosphate derivatives of AZT and ddCyd. Antiviral Chem. Chemother. 1, 355-360; McGuigan, C., Nicholls, S.R., O'Connor, T.J., and Kinchington, D. (1990c) Synthesis of some novel dialkyl phosphate

PL 198 237 B1 derivative of 3'-modified nucleosides as potential anti-AIDS drugs. Antiviral Chem. Chemother. 1, 25-33; McGuigan, C., Devin, K.G., O'Connor, T. J., and Kinchington, D. (1991) Synthesis and anti-HIV activity of some haloalkyl phosphoramidate derivatives of 3'-azido-3'deoxythylmidine (AZT); potent activity of the trichloroethyl methoxyalaninyl compound. Antiviral Res. 1 S, 255-263; McGuigan, C.,1 S Pathirana, R.N., Balzarini, J. and DeClercq, E. (1993b) Intracellular delivery of bioactive AZT nucleotides by aryl phosphate derivatives of AZT. J. Med. Chem. 36, 1048-1052.Alkyl hydrogen phosphate derivatives of the anti-HIV agent AZT may be less toxic than the parent nucleoside analogue. Antiviral Chem. Chemother. S, 271-277; Meyer, R. B., Jr., Shuman, D.A. i Robins, R.K. (1973) Synthesis of purine nucleoside 3',S'-cyclic phosphoramidates. Tetrahedron Lett. 269-272; Nagyvary, J. Gohil, R.N., Kirchner, C.R. and Stevens, J.D. (1973) Studies on neutral esters of cyclic AMP, Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1072-1077; Namane, A. Gouyette, C., Fillion, M.P., Fillion, G. and HuynhDinh, T. (1992) Improved brain delivery of AZT using a glycosyl phosphotriester prodrug. J. Med. Chem. 35, 3039-3044; Nargeot, J. Nerbonne, J.M. Engels, J. and Leser, H.A. (1983) Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2395-2399; Nelson, K.A., Bentrude, W.G. Stser, W.N. i Hutchinson, J.P. (1987) The question of chair-twist equilibria for the phosphate rings of nucleoside cyclic 3',5'monophosphates. 'HNMR and x-ray crystallographic study of the diastereomers of thymidine phenyl cyclic 3',S'-monophosphate. J. Am. Chem. Soc. 109, 4058-4064; Nerborme, J.M., Richard, S., Nargeot, J. and Lester, H.A. (1984) New photoactivatable cyclic nucleotides produce intracellular jumps in cyclic AMP and cyclic GMP concentrations. Nature 301, 74-76; Neumann, J.M., Herv, M., Debouzy, J.C.,Guerra, F.L, Gouyette, C., Dupraz, B. i Huyny-Dinh, T. (1989) Synthesis and transmembrane transport studies by NMR of a glucosyl phospholipid of thymidine. J. Am. Chem. Soc. 111, 4270-4277; Ohno, R., Tatsumi,

N., Hirano, M., Imai, K. Mizoguchi, H., Nakamura, T., Kosaka, M., Takatuski, K., Yamaya, T., Toyama

K. , Yoshida, T., Masaoka, T., Hashimoto, S., Ohshima, T., Kimura, L, Yamada, K. i Kimura, J. (1991) Treatment of myelodysplastic syndromes with orally administered 1-e-D-arabinouranosylcytosine5'stearylphosphate. Oncology 48, 451-455. Palomino, E., Kessle, D. andHorwitz, J.P. (1989) A dihydropyridine carrier system for sustained delivery of 2',3'dideoxynucleosides to the brain. J. Med. Chem. 32, 22-625; Perkins, R.M., Barney, S. Wittrock, R., Clark, P.H., Levin, R. Lambert, D.M., Petteway, S.R., Serafinowska, H.T., Bailey, S.M., Jackson, S., Harnden, M.R. Ashton, R., Sutton, D., Harvey, J.J. and Brown, A.G. (1993) Activity of BRL47923 and its oral prodrug, SB2036S7A against a rauscher murine leukemia virus infection in mice. Antiviral Res. 20 (Suppl. I). 84; Piantadosi, C., Marasco, C.J., Jr., NorrisNatschke, S.L., Meyer, K.L., Gumus, F., Surles, J.R., Ishaq, K.S., Kucera,

L. S. lyer, N., Wallen, C.A., Piantadosi, S. and Modest, E. J. (1991) Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV-1 activity. J. Med. Chem. 34, 1408-1414; Pompon, A., Lefebvre, L, Imbach, J.L., Kahn, S. and Farquhar, D. (1994). Decomposition pathways of the monoand bis(pivaloyloxymethyl) esters of azidothymidine-5'-monophosphate in cell extract and in tissue culture medium; an application of the on-line ISRP-cleaning HPLC technique. Antiviral Chem Chemother. S, 91-98; Postemark, T. (1974) Cyclic AMP and cyclic GMP. Annu. Rev. Pharmacol. 14, 23-33; Prisbe, E.3., Martin, J.C.M., McGhee, D.P.C., Barker, M.F., Smee, D. F. Duke, A.E., Matthews,

T. R. and Verheyden, J.P.J. (1986) Synthesis and antiherpes virus activity of phosphate an phosphonate derivatives of 9-[(1,3-dihydroxy-2-propoxy)methyl]guanine. J. Med. Chem. 29, 671-675; Pucch, F., Gosselin, G., Lefebvre, L, Pompon, a., Aubertin, A.M. Dim, i Imbach, J.L. (1993) Intracellular delivery of nucleoside monophosphate through a reductase-mediated activation process. Antiviral Res. 22, 1 SS-174; Pugaeva, V.P., Klochkeva, S.L, Mashbits, F.D. and Eizengart, R.S. (1969). Toxicological assessment and health standard ratings for ethylene sulfide in the industrial atrnosphere. Gig. Trf. Prof. Zabol. 14, 47-48 (Chem. Abstr. 72, 212); Robins, R. K. (1984) The potential of nucleotide analogs as inhibitors of Retro viruses and tumors Pharm. Res. 11-18; Rosowsky, A., Kim. S.H., Ross and J. Wick, M.M. (1982) Lipophilic 5'-(alkylphosphate) esters of 1-e-D-arabinofuranosylcytosine and its N4-acyl and 2.2'anhydro-3'-O-acyl derivatives as potential prodrugs. J. Med. Chem. 25, 171-178; Ross, W. (1961) Increased sensitivity of the walker turnout towards aromatic nitrogen mustards carrying basie side chains following glucose pretreatment. Biochem. Pharm. 8, 235-240; Ryu, E.K., Ross, R. J. Matsushita, T., MacCoss, M., Hong, C.I. and West, C.R. (1982). Phospholipidnucleoside conjugates. 3. Synthesis and preliminary biological evaluation of 1-e-D-arabinofuranosylcytosine S' diphosphate [-), 2-diacylglycerols. J. Med. Chem. 25, 1322-1329; Saffhill, R. and Hume, W.J. (1986) The degradation of 5-iododeoxyuridine and 5-bromoethoxyuridine by serum from different sources and its consequences for the use of these compounds for incorporation into DNA. Chem. Biol. Interact. 57, 347-355; Saneyoshi, M., Morozumi, M., Kodama, K., Machida, J., Kuninaka, A. and Yoshino, H.

PL 198 237 B1 (1980) Synthetic nucleosides and nucleotides. XVI. Synthesis and biological evaluations of a series of 1-e-D-arabinofuranosylcytosine S1-alky or arylphosphates. Chem Pharm. Bull. 28, 2915-2923; Sastry, J.K., Nehete, P.N., Khan, S., Nowak, B.J., Plunkett, W., Arlinghaus, R.B. and Farquhar, D. (1992) Membrane permeable dideoxyuridine 5'-monophosphate analogue inhibits human immunodeficiency virus infection. Mol. Pharmacol. 41, 441-445; Shaw, J.P., Jones, R.J. Arimilli, M.N., Louie, M.S., Lee, W.A. and Cundy, K.C. (1994) Oral bioavailability of PMEA from PMEA prodrugs in male Sprague-Dawley rats. 9th Annual AAPS Meeting. San Diego, CA (Abstract) . Shuto, S., Ueda, S., Imamura, S., Fukukawa, K. Matsuda, A. and Ueda, T. (1987) A facile one-step synthesis of 5'phosphatidiylnucleosides by an enzymatic two-phase reaction. Tetrahedron Leti. 28, 199-202; Shuto, S. Itoh, H., Ueda, S., Imamura, S., Kukukawa, K., Tsujino, M., Matsuda, A. and Ueda, T. (1988) Pharm Bull. 36, 209-217. Przykładem użytecznej grupy fosforanowej proleku jest S-acylo-2-tioetylowa grupa zwana także „SATE.

Claims

Zastrzeżenia patentowe ek w kombinacji ek w kombinacji ek w kombinacji ek w kombinacji ek w kombinacji ek w kombinacji ek w kombinacji ek w kombinacji

1. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca e-D-D4FC, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość e-D-D4FC albo jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub estru, ewentualnie w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, oraz skuteczną ilość co najmniej jednego drugiego leku wybranego z grupy składającej się z indinawiru, nelfinawiru, sakwinawiru, amprenawiru, efawirenzu, delawirdyny, newirapiny i abakawiru, do leczenia lub profilaktyki zakażeń HIV u człowieka.
2. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że drugi z e-D-D4FC stanowi indinawir.
3. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że drugi z e-D-D4FC stanowi nelfinawir.
4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że drugi z e-D-D4FC stanowi sakwinawir.
5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że drugi z e-D-D4FC stanowi amprenawir.
6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że drugi z e-D-D4FC stanowi efawirenz.
7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że drugi z e-D-D4FC stanowi delawirdyna.
8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że drugi z e-D-D4FC stanowi newirapina.
9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że drugi z e-D-D4FC stanowi abakawir.
10. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera e-D-D4FC i drugi lek w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania doustnego, dożylnego, pozajelitowego, doskórnego, podskórnego lub miejscowego.
12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania doustnego.
13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania dożylnego.
14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania pozajelitowego.
15. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania doskórnego.
16. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawiera nośnik odpowiedni do podawania miejscowego.
17. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że e-D-D4FC i drugi lek są w postaci jednostki dawkowania.
18. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 17, znamienna tym, że jednostka dawkowania zawiera 10 do 1500 mg każdego związku.

PL 198 237 B1
19. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 17, znamienna tym, że jednostkę dawkowania stanowi tabletka lub kapsułka.
20. Zastosowanie skutecznej ilości kompozycji określonej w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zakażenia H|V u człowieka.
21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że drugim lekiem w kombinacji z /-D-D4FC jest indinawir.
22. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że drugim lekiem w kombinacji z /-D-D4FC jest nelfinawir.
23. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że drugim lekiem w kombinacji z /-D-D4FC jest sakwinawir.
24. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że drugim lekiem w kombinacji z /-D-D4FC jest amprenawir.
25. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że drugim lekiem w kombinacji z /-D-D4FC jest efawirenz.
26. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że drugim lekiem w kombinacji z /-D-D4FC jest delawirydna.
27. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że drugim lekiem w kombinacji z /-D-D4FC jest newirapina.
28. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że drugim lekiem w kombinacji z /-D-D4FC jest abakawir.
29. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że 3-D-D4FC i drugi lek stosowane są w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem jest nośnik odpowiedni do podawania doustnego, dożylnego, pozajelitowego, doskórnego, podskórnego lub miejscowego.
31. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że 3-D-D4FC i drugi lek stosowane są w postaci jednostki dawkowania.
32. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że jednostka dawkowania zawiera 10 do 1500 mg każdego związku.
33. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że jednostkę dawkowania stanowi tabletka lub kapsułka.
34. Zastosowanie skutecznej ilości 3-D-D4FC lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub estru, ewentualnie w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zakażenia H|V u człowieka, w kombinacji ze skuteczną ilością drugiego leku wybranego z grupy składającej się z indinawiru, nelfinawiru, sakwinawiru, amprenawiru, efawirenzu, delawirdyny, newirapiny i abakawiru.
35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że drugim nacji z 3-D-D4FC jest indinawir.
36. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że drugim nacji z 3-D-D4FC jest nelfinawir.
37. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że drugim nacji z 3-D-D4FC jest sakwinawir.
38. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że drugim nacji z 3-D-D4FC jest amprenawir.
39. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że drugim nacji z 3-D-D4FC jest efawirenz.
40. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że drugim nacji z 3-D-D4FC jest delawirdyna.
41. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że drugim nacji z 3-D-D4FC jest newirapina.
42. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że drugim nacji z 3-D-D4FC jest abakawir.
43. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że 3-D-D4FC i drugi lek stosowane są w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.

lekiem stosowanym w kombilekiem stosowanym w kombilekiem stosowanym w kombilekiem stosowanym w kombilekiem stosowanym w kombilekiem stosowanym w kombilekiem stosowanym w kombilekiem stosowanym w kombi22

PL 198 237 B1
44. Zastosowanie według zastrz. 43, znamienne tym, że jako farmaceutycznie dopuszczalny nośnik stosowany jest nośnik odpowiedni do podawania doustnego, dożylnego, pozajelitowego, doskórnego, podskórnego lub miejscowego
45. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że 3-D-D4FC i drugi lek stosowane są w postaci jednostki dawkowania.
46. Zastosowanie według zastrz. 45, znamienne tym, że jednostka dawkowania zawiera 10 do 1500 mg każdego związku.
47. Zastosowanie według zastrz. 45, znamienne tym, że jednostkę dawkowania stanowi tabletka lub kapsułka.
48. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że 3-D-D4FC i drugi lek stosowane są w kombinacji.
49. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że 3-D-D4FC i drugi lek stosowane są naprzemiennie.