PL198363B1

PL198363B1 - Zastosowanie kwasów a i -aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinowych do indukcji apoptozy komórek rakowych oraz sposób ich wytwarzania

Info

Publication number: PL198363B1
Application number: PL370190A
Authority: PL
Inventors: Marcin Drąg; Anna Marcinkowska; Małgorzata Drąg-Zalesińska; Maciej Zabel; Józef Oleksyszyn
Original assignee: Politechnika Wroclawska
Priority date: 2004-09-20
Filing date: 2004-09-20
Publication date: 2008-06-30
Also published as: PL370190A1

Abstract

Zastosowanie kwasów a 1-aminoalkano- -a 2-hydroksyalkanofosfinowych, o wzorze ogólnym I, w którym R1 i R2 są takie same lub różne i oznaczają podstawnik analogiczny do ł a ńcucha bocznego naturalnych aminokwasów, do indukcji apoptozy komórek rakowych.

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kwasów a 1-aminoalkano-a ₁-hydroksyalkanofosfinowych do indukcji apoptozy komórek rakowych oraz sposób wytwarzania kwasów a 1-aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinowych.

Strukturalnie zbliżone do będących przedmiotem wynalazku kwasy a--aminoalkano-a-hydroksy-32-amino-alkanofosfinowe i ich pochodne są związkami znanymi w literaturze naukowej, a ich znane biologiczne własności dotyczą głównie ich aktywności przeciwko proteazie HIV (Stowasser B. i inni w Tetrahedron Lett, 1992, 33, 6625-6628). Brak jest w literaturze naukowej i patentowej jakichkolwiek wzmianek o sposobie wytwarzania kwasów a1-aminoalkano-a1-hydroksyalkanofosfinowych, jak również ich zdolnościach do inhibicji aminopeptydazy N oraz indukcji apoptozy komórek rakowych.

Klasyczna terapia przeciwnowotworowa jest ciągle mało skuteczna, szczególnie w przypadku litych guzów nowotworowych. Stąd też, trwają intensywne poszukiwania nowych leków przeciwnowotworowych, szczególnie tych o nowym mechanizmie działania. Jedną z cech odróżniających komórki nowotworowe od normalnych są mutacje genetyczne prowadzące do utraty przez nie zdolności do ulegania apoptozie - programowanej genetycznie śmierci samobójczej komórek. W literaturze opisano wiele przykładów niskocząsteczkowych związków zdolnych, w miarę selektywnie, indukować apoptozę komórek rakowych. Niektóre z nich to znane leki przeciwnowotworowe, inne zaś stanowią potencjalne źródło nowych leków.

Niestety, w większości przypadków molekularny cel, enzym lub białko funkcyjne inhibitowane przez tego typu związki nie jest znane. W takiej sytuacji nie jest możliwe racjonalne podejście do ulepszania tych struktur na drodze klasycznych metod chemii medycznej i biochemii. Zdecydowanym wyjątkiem są tu inhibitory aminopeptydaz, takich jak aminopeptydaza N (CD13). Inhibicja tego enzymu u pacjentów z chorobą nowotworową np. przez bestatynę prowadzi do apoptozy komórek rakowych, inhibicji angiogenezy i w rezultacie do wyraźnego efektu terapeutycznego (Sekine K., i inni w Leukemia, 1999, 13, 729-734;).

Bestatyna jest praktycznie jedynym inhibitorem aminopeptydazy N stosowanym do tej pory w leczeniu chorób nowotworowych.

Według wynalazku jako czynnik aktywny, zdolny do indukcji apoptozy komórek rakowych, stosuje się kwasy a 1-aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinowe, o wzorze ogólnym I, w którym R i R2 są takie same lub różne i oznaczają podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego naturalnych aminokwasów.

Wynalazek obejmuje również związki o wzorze ogólnym I, w postaci akceptowanych farmakologicznie soli albo geometrycznych i/lub optycznych izomerów.

Związki według wynalazku wykazują dużą aktywność inhibitorową w stosunku do enzymu proteolitycznego - aminopeptydazy N oraz wykazują zdolność do indukcji apoptozy komórek rakowych in vitro.

Związki o nazwie kwasy a 1-aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinowe o wzorze ogólnym I są skutecznymi inhibitorami aminopeptydazy N, enzymu, który według ostatnich doniesień może uczestniczyć w procesie indukcji apoptozy (Sekine K., i inni w Leukemia, 1999, 13, 729-734; Scornik O.A. i inni w Curr. Drug Metab. 2001,2, 67-85). Powiązanie tego enzymu z procesem apoptozy czyni jego inhibitory w postaci związków objętych wynalazkiem potencjalnymi lekami przeciwnowotworowymi. W leczeniu chorób nowotworowych kwasy a 1-aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinowe będące przedmiotem wynalazku, mogą być podawane pacjentowi poprzez każdą farmaceutycznie akceptowalną drogę np. doustnie lub dożylnie, podskórnie lub topikalnie. Dawki są uzależnione od stanu pacjenta, rodzaju związku a także od towarzyszącej terapii innymi lekami. Efektywną dawką terapeutyczną jest dawka wystarczająca do indukcji apoptozy komórek rakowych, która oscyluje w granicach od 0.01 mg/kg do 200 mg/kg masy ciała pacjenta, a preferowana dawka wynosi od 1 mg do 100 mg dla pacjenta w trzech dawkach dziennie.

Sposób wytwarzania kwasów a 1-aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinowych według wynalazku polega na tym, że substraty w postaci estrów benzylowych kwasów N-(benzyloksykarbonylamino)-alkanofosfinowego, poddaje się w pierwszym etapie reakcji z 1-4 równoważnikami molowymi aldehydu alifatycznego lub aromatycznego, korzystnie wybranego z grupy obejmującej, aldehyd 3-fenylopropionowy, aldehyd n-walerianowy lub aldehyd izo-walerianowy oraz 2-8 równoważnikami molowymi fluorku potasu w stosunku do fosfinowego substratu. Reakcję prowadzi się 24-72 godziny w temperaturze pokojowej w mieszaninie bezwodnych rozpuszczalników dimetyloformamidu i chloroformu CHCl3 w stosunku objętościowym od 1:1 do 20:1. Utrzymuje się przy tym całkowitą ilość rozpuszczalnika w granicach od 2 do 10 ml na 1 mM fosfinowego substratu. Otrzymane związki o nazwie ogólnej

PL 198 363 B1 kwasy a₁-aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinowe odblokowuje się następnie przy zastosowaniu standardowej procedury z użyciem 33% roztworu HBr/kwas octowy w ilości od 5-20 równoważników molowych w stosunku do fosfinowego substratu. Korzystny czas wykonywania reakcji deprotekcji wynosi 0.5-3 godziny.

Zasadnicze korzyści wynikające z wynalazku polegają na wytwarzaniu z wysoką wydajnością związków o silnej aktywności biologicznej - hamującej funkcjonowanie aminopeptydazy N i zdolności do indukowania apoptozy komórek rakowych.

Zdolność wybranych kwasów a 1-aminoalkano-a,2-hydroksyalkanofosfinowych do inhibicji aminopeptydazy N (E.C.3.4.14.2.) przetestowano przy użyciu enzymu wyizolowanego ze świńskiej nerki i zakupionego w firmie Sigma-Aldrich.

Aminopeptydaza N jest enzymem proteolitycznym występującym w błonach komórkowych (z ang. membrane protease) i posiadającym w centrum aktywnym jeden atom cynku. Jej największe stężenie u ssaków notuje się w nerkach. Katalizuje ona hydrolizę N-końcowego aminokwasu w polipeptydach i białkach. Preferencje substratowe enzymu oscylują przede wszystkim wokół takich aminokwasów jak leucyna, alanina, metionina, nor-leucyna i fenyloalanina.

Związki zdolne do wywoływania apoptozy komórek rakowych mogą być używane w leczeniu wielu różnych schorzeń nowotworowych. Przykładowo związki będące przedmiotem wynalazku mogą być użyte w leczeniu raków pęcherza, mózgu, karku i głowy, nerek, raków płuc takich jak drobnokomórkowy rak płuc i niedrobnokomórkowy rak płuc, melanoma, rak jajników, trzustki, prostaty, macicy, skóry, wątroby, jelita grubego, piersi i różnych form leukemii. Zdolność do indukcji apoptozy czyni związki będące przedmiotem wynalazku szczególnie przydatnymi w leczeniu guzów litych i zaawansowanych form raka, które nie mogą być leczone na drodze konwencjonalnych metod.

Zdolność związków według wynalazku do wywoływania apoptozy komórek rakowych przetestowano na komórkach nowotworowych ludzkiego, epitelialnego raka płuc (Lung carcinoma) - A549 i przylegających w hodowli do podłoża, a zdeponowanych w pracowni hodowli komórkowych Zakładu Biochemii Lekarskiej Akademii Medycznej we Wrocławiu.

Linia A549 jest scharakteryzowana w literaturze następująco: Ludzka linia komórkowa typu A549, Kaukaska, rak płuc, ECACC 86012804. Pochodzenie komórek - 58 letni mężczyzna z Kaukazu. Komórki mogą syntezować lecytynę używając cytydynową difosfocholinową ścieżkę metaboliczną. Czasami komórki mogą zawierać ciała inkluzyjne, jednakże nie posiadające żadnych ludzkich patogenów.

Morfologia: Epiteliczny, ludzki, kaukaski rak płuc. Deponent: ATCC, USA.

Szczególne właściwości i zawartość: Lecytyna, duże stężenia nienasyconych kwasów tłuszczowych (ECACC, Salisbury, Wiltshire).

Subkulturowe optymalne tempo podziału wynosi 1:3 do 1:6 przy posiewie w ilości 2-4x10,000 komórek/cm2 używając 0.25% trypsyny lub trypsyny/EDTA; 5% CO2; 37C. Kariotyp: Hypotryploidalny

Medium hodowlane: Dla linii Jurkat używano medium RPMI-1640 (R8758) firmy Sigma z dodatkiem 10% FBS (Fetal Bovine Serum) firmy Cambrax., dla linii A549 stosowano medium MEM (Minimum Essential Medium Eagle M2279) firmy Sigma z suplementacją 0,292 g/l L-glutaminą i 10% FBS firmy Cambrax.

Warunki hodowli: Hodowle komórkowe prowadzono w temp. 37°C w atmosferze 5% CO₂. W celu odklejenia komórek linii A549 od podłoża stosowano trypsynizację używając 0,25% Trypsin-EDTA solution (T4049) firmy Sigma.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładach wytwarzania a1_aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinianów, z których pierwszy dotyczy sposobu wytwarzania kwasu (a--amino-3-metylobutano)-(a2-hydroksy-3-fenylopropano)fosfinowego przedstawionego wzorem II, przykład drugi dotyczy kwasu (a 1-amino-3-metylobutano)-(a2-hydroksy-n-pentano)fosfinowego przedstawionego wzorem III, a przykład trzeci kwasu (a1-amino-1-fenylometano)-(a2-hydroksy-3-metylobutano)-fosfinowy przedstawionego wzorem IV.

Poniższe przykłady mają na celu lepsze objaśnienie wynalazku, ale w żadnej mierze nie ograniczają jego zakresu.

P r z y k ł a d I

Sposób wytwarzania kwasu (a1-amino-3-metylobutano)-(a2-hydroksy-3-fenylopropano)fosfinowego przedstawionego wzorem II rozpoczyna się od otrzymania substratu w postaci estru benzylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutanofosfinowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 1.53 g (5.4 mM) kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutanofosfinowego oraz dodaje 0.6 ml (5.94 mM) alkoholu benzylowego. Całość

PL 198 363 B1 zalewa się 15 cm³ bezwodnego THF, a następnie dodaje 1.22g DCC (5.94 mM) oraz 0.065 g dimetyloaminopirydyny (0.54 mM). Całość miesza się intensywnie przez 2-8 godzin. Następnie do mieszaniny poreakcyjnej dodaje się 10 ml octanu etylu i odsącza powstały DCU na lejku Buchnera. Mieszaninę ekstrahuje się kolejno 20 ml 5% wodnego roztworu KHSO4, 20 ml nasyconego, wodnego roztworu NaHCO3 i solanką. Następnie do warstwy organicznej dodaje się 2 gramy bezwodnego MgSO4. Całość sączy się przez filtr bibułowy i odparowuje. Po usunięciu lotnych składników pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej uzyskuje się klarowny olej, który krzepnie po ostudzeniu. Po reakcji uzyskuje się 1.9 g surowego produktu (93.7% wagowo) w postaci białego osadu o konsystencji lekko oleistej, który używa się w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania. Wzór sumaryczny C20H26NO4P. Masa cząsteczkowa: 375.4 l/mol.

Widmo 3¹P NMR (roztwór w CDCh, δ [ppm]): 35.34 (s, 42%) i 36.76 (s, 58%)

Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCŁ, δ [ppm]: 0.9 (m, 6H, 2xCH₂), 1.52-1.88 (m, 3H, CH2 CH), 4.08 (m, 1H, CHP), 4,87 (d, 1H, J=9.4, NH), 4.97-5.13 (m, 4H, CH₂OCO, CH₂Ph), 6.08 i 7.93 (d, 1H, J=552.8Hz, 42% PH), 6.12 i 7.96 (d, 1H, J=552.0Hz, 42% PH), 7.24-7.40 (m, 5H, aromat.).

W następnym etapie do kolby okrągłodennej odważa się 0.5 g (1.3 mM) estru benzylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutanofosfinowego i zalewa się 5 cmi³ bezwodnej mieszaniny DMF i CHCl3 w stosunku objętościowym 1:1. Do tak przygotowanego roztworu wprowadza się 3-krotny molowy nadmiar KF w ilości 0.226 g (3.9 mM), a następnie dodaje 2-krotny molowy nadmiar aldehydu 3-fenylopropionowego 0.35 g (2.6 mM). Całość miesza się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie odsącza się KF na lejku Buchnera, a z pozostałości usuwa lotne składniki na wyparce obrotowej. Otrzymany gęsty olej, który krzepnie spontanicznie na powietrzu oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej (15 g żelu) przy użyciu mieszaniny rozpuszczalników heksan/octan etylu w stosunku objętościowym 30:70. Po zebraniu odpowiednich frakcji, rozpuszczalniki usuwa się na wyparce obrotowej i otrzymuje się 0.48 g (72.5%-wagowo) estru benzylowego kwasu (a rN-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano)-(a2-hydroksy-3-fenylopropano)fosfinowego w postaci półprzeźroczystego, gęstego oleju. Wzór sumaryczny C29H36NO5P. Masa cząsteczkowa: 509.6 l/mol. Widmo 3¹P NMR (roztwór w CDCl2, δ [ppm]): 51.01 (s, 54%), 51.23 (s, 26%), 52.12 (s, 5%) i 52.75 (s, 15%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl₂, δ [ppm], J [Hz]): 0,82 (m, 6H), 1,25-1,87 (m, 4H), 2,66 (m, 1H), 2.88-2,93 (m, 2H), 3,88 (s, 1H), 4.31 (m, 1H), 5,05 (m, 5H), 7,16-7,35 (m, aromat., 15H).

W kolejnym etapie do kolby odważa się 0.3 g (0.59 mM) estru benzylowego kwasu (α-ι-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano)-(a2-hydroksy-3-fenylopropano)fosfinowego oraz dodaje 1 ml 33% roztwór HBr/kwas octowego. Całość zostawia się na 90 minut w zamkniętej kolbie, a następnie odparowuje lotne składniki na wyparce obrotowej. Do pozostałości, po ostudzeniu dodaje się 5 ml bezwodnego eteru dietylowego i miesza, a następnie dekantuje eter znad osadu. Czynność tę powtarza się 2-4 razy. Następnie do powstałego osadu dodaje się 1 ml metanolu i 10 ml bezwodnego eteru dietylowego. pH mieszaniny doprowadza się do 6 przy użyciu tlenku propylenu. Całość pozostawia się w lodówce na noc, a następnie odsącza powstały osad na lejku Buchnera, przemywając 10 ml bezwodnego eteru dietylowego. Po wysuszeniu, otrzymuje się 0.11 g (65.5%-wagowo) kwasu (a_ramino-3-metylobutano)-(a2-hydroksy-3-fenylopropano)fosfinowego przedstawionego wzorem II w formie białego osadu. Wzór sumaryczny C^H₂4NO3P. Masa cząsteczkowa: 285.3 l/mol. Widmo 3¹P NMR (roztwór w D2O), δ [ppm]): 40.18 (s, 50%) i 40.28 (s, 50%). Widmo ¹H NMR (roztwór w D2O, δ [ppm], J [Hz]): 0.75 (d, J=5.8, 3H, CH3), 0.81 (d, J=5.8, 3H, CH3), 1.53 (m, 3H, CH₂, CH), 1.82-1.97 (m, 2H, CH₂), 1.82-1.97 (m, 2H, CH), 2.59 i 2.77 (2m, 2H, CH), 3.53 (m, 1H, CHNH₂), 3.81 (m, 1H, CHOH), 7.117.27 (m, 5H, aromat.).

P r z y k ł a d II

Sposób wytwarzania kwasu (a1-amino-3-metylobutano)-(a2-hydroksy-n-pentano)fosfinowego przedstawionego wzorem III rozpoczyna się od otrzymania substratu w postaci estru benzylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutanofosfinowego i przebiega identycznie jak przedstawiono w przykładzie pierwszym.

W następnym etapie do kolby okrągłodennej odważa się 0.5 g (1.3 mM) estru benzylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutanofosfinowego i zalewa się 5 cm3 bezwodnej mieszaniny DMF i CHCl3 w stosunku objętościowym 1:1. Do tak przygotowanego roztworu wprowadza się 3-krotny molowy nadmiar KF w ilości 0.226 g (3.9 mM), a następnie dodaje 3-krotny molowy nadmiar świeżo przedestylowanego aldehydu n-walerianowego 0.49 g (3.9 mM). Całość miesza się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie odsącza się KF na lejku Buchnera, a z pozostałości usuwa lotne składniki na wyparce obrotowej. Otrzymany gęsty olej oczyszcza się za pomocą chromatografii

PL 198 363 B1 kolumnowej (15 g żelu) przy użyciu mieszaniny rozpuszczalników heksan/octan etylu w stosunku objętościowym 25:75. Po zebraniu odpowiednich frakcji, rozpuszczalniki usuwa się na wyparce obrotowej i otrzymuje się 0.42 g (66.6%-wagowo) estru benzylowego kwasu (a ₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano)-(a,2-hydroksy-n-pentano)fosfinowego w postaci gęstego oleju o słomkowym zabarwieniu. Wzór sumaryczny C25H36NO5P. Masa cząsteczkowa: 461.5 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCla, δ [ppm]): 51.36 (s, 27%), 51.48 (s, 33%), 52.40 (s, 21%) i 52.93 (s, 19%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCla, δ [ppm], J [Hz]): 0.77-0.91 (m, 9H, 3xCH₈), 1.21-1.51 (m, 6H, 3xCH2), 1.52-1.66 (m, 3H, CH·· CH), 2.91 (bs, 1H, OH), 3.91 (m, 1H, CHOH), 4.10 (m, 1H, CHNH), 5.01-5.15 (m, 5H, CH₂OCO, CH^Ph, NH), 7.24-7.34 (m, 10H, aromat.,).

W kolejnym etapie do kolby odważa się 0.3 g (0.65 mM) estru benzylowego kwasu (a 1-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano)-(a2-hydroksy-n-pentano)fosfinowego oraz dodaje 1 ml 33% HBr/kwas octowego. Całość zostawia się na 90 minut w zamkniętej kolbie, a następnie odparowuje lotne składniki na wyparce obrotowej. Do pozostałości, po ostudzeniu dodaje się 5 ml bezwodnego eteru dietylowego i miesza, a następnie dekantuje eter znad osadu. Czynność tę powtarza się 2-4 razy. Następnie do powstałego osadu dodaje się 0.5 ml metanolu i 10 ml bezwodnego eteru dietylowego. pH mieszaniny doprowadza się do 6 przy użyciu tlenku propylenu. Całość pozostawia się w lodówce na noc, a następnie odsącza powstały osad na lejku Buchnera, przemywając 15 ml bezwodnego eteru dietylowego. Po wysuszeniu, otrzymuje się 0.12 g (69.6%-wagowo) kwasu (a 1-amino-3-metylobutano)-(a2-hydroksy-n-pentano)fosfinowego przedstawionego wzorem III w formie białego osadu. Wzór sumaryczny C11H24NO4P. Masa cząsteczkowa: 265.3 l/mol. Widmo 3¹p NMR (roztwór w D2O), δ [ppm]): 40.14 (s, 32%) i 40.31 (s, 68%). Widmo ¹H NMR (roztwór w D2O, δ [ppm], J [Hz]): 0.68-0.80 (m, 9H, 3xCH), 1.14-1.32 (m, 4H, 2xCH₂), 1.33 (m, 1H, CH), 1.35-1.57 (m, 4H, 2xCH), 3.35 (32%) i 3.51 (68%) (m, 1H, CHNH₂, diastereotopowe), 3.84 (m, 1H, CHOH).

P r z y k ł a d III

Sposób wytwarzania kwasu (a_ramino-1-fenylometano)-(a2-hydroksy-3-metylobutano)fosfinowego przedstawionego wzorem IV rozpoczyna się od otrzymania substratu w postaci estru benzylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-1-fenylometanofosfinowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 1.0 g (3.2 mM) kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-1-fenylometanofosfinowego oraz 0.35 g (3.2 mM) alkoholu benzylowego. Całość zalewa się 10 cm3 bezwodnego THF, a następnie dodaje 0.66 g DCC (3.2 mM) oraz 0.039 g dimetyloaminopirydyny (0.32 mM). Całość miesza się intensywnie przez 2-8 godzin. Następnie do mieszaniny poreakcyjnej dodaje się 20 ml dichlorometanu i odsącza powstały DCU na lejku Buchnera. Lotne składniki usuwa się na wyparce próżniowej, a pozostałość rozpuszcza w 20 ml dichlorometanu i ekstrahuje kolejno 20 ml 5% wodnego roztworu KHSO4, 20 ml nasyconego, wodnego roztworu NaHCO3 i solanką. Następnie do warstwy organicznej dodaje się 2 gramy bezwodnego MgSO4. Całość sączy się przez filtr bibułowy i odparowuje. Po usunięciu lotnych składników pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej uzyskuje się półprzeźroczysty olej, który krzepnie po ostudzeniu. Po reakcji uzyskuje się 1.12 g surowego produktu (88.5%-wagowo) w postaci białego osadu o konsystencji lekko oleistej, który używa się w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania. Wzór sumaryczny C22H22NO4P. Masa cząsteczkowa: 395.4 l/mol. Widmo 3¹P NMR (roztwór w CDCh, δ [ppm]): 30.88 (s, 55%) i 34.63 (s, 45%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCla, δ [ppm]: 4.76 (s, 2H, CH₂Ph), 4.82-5.21 (m, 4H, CH2OCO, CHP, NH), 6.16 i 8.11 (d, 1H, J=585.0, 42% PH), 6.21 i 8.17 (d, 1H, J=588.0, 42% PH), 7.26-7.43 (m, 15H, aromat.,).

W następnym etapie do kolby okrągłodennej odważa się 0.5 g (1.26 mM) estru benzylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-1-fenylometanofosfinowego i zalewa się 5 cmi³ bezwodnej mieszaniny DMF i CHCl3 w stosunku objętościowym 2:3. Do tak przygotowanego roztworu wprowadza się 3-krotny molowy nadmiar KF w ilości 0.22 g (3.78 mM), a następnie dodaje 3-krotny molowy nadmiar świeżo przedestylowanego aldehydu izo-walerianowego 0.435 g (3.78 mM). Całość miesza się w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Następnie odsącza się KF na lejku Buchnera, a z pozostałości usuwa lotne składniki na wyparce obrotowej. Otrzymany gęsty olej, który krzepnie po ochłodzeniu, oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej (15 g żelu) przy użyciu mieszaniny rozpuszczalników heksan/octan etylu w stosunku objętościowym 40:60. Po zebraniu odpowiednich frakcji, rozpuszczalniki usuwa się na wyparce obrotowej i otrzymuje się 0.38 g (61.7%-wagowo) estru benzylowego kwasu (a 1-N-(benzyloksykarbonylamino)-1-fenylometano)-(a2-hydroksy-3-metylobutano)fosfinowego w postaci gęstego oleju o półpłynnej konsystencji. Wzór sumaryczny C27H3₂NO₅P. ^Masa cząsteczkowa: ⁴⁸¹.⁵ ^mok Wdmo ^{31p nmr} (roztwór w ^δ [^ppm]): ⁴⁸.⁰⁶ (s, 37%), ⁴⁸.²²

PL 198 363 B1 (s, 8%), 48.63 (s, 7%) i 48.85 (s, 48%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm], J [Hz]): 0.76-0.83 (m, 6H, 2xCH3), 1.73-2.22 (m, 3H, CH, CH2), 2.43 (bs, 1H, OH), 3.53 i 3.82 (m, 1H, CHOH, diastereotopowe), 4.75 (s, 2H, CH-Ph), 4.92-5.23 (m, 4H, CH₂OCO, NH, CHNH), 7.26 i 7.49 (m, 10H, aromat.,).

W kolejnym etapie do kolby odważa się 0.3 g (0.62 mM) estru benzylowego kwasu (αi-N-(benzyIoksykarbonyIamino)-1-fenyIometano)-(a₂-hydroksy-3-metyIobutano)fosfinowego oraz dodaje 1 ml 33% HBr/kwas octowego. Całość zostawia się na 90 minut w zamkniętej kolbie, a następnie odparowuje lotne składniki na wyparce obrotowej. Do pozostałości, po ostudzeniu dodaje się 5 ml bezwodnego eteru dietylowego i miesza, a następnie dekantuje eter znad osadu. Czynność tę powtarza się 2- 4 razy. Następnie do powstałego osadu dodaje się 0.5 ml metanolu i 10 ml bezwodnego eteru dietylowego. pH mieszaniny doprowadza się do 6 przy użyciu tlenku propylenu. Całość pozostawia się w lodówce na noc, a następnie odsącza powstały osad na lejku Buchnera, przemywając 15 ml bezwodnego eteru dietylowego. Po wysuszeniu, otrzymuje się 0.11 g (68.8%-wagowo) kwasu (a 1-amino-1-fenyIometano)-(a,2-hydroksy-3-metyIobutano)fosfinowego przedstawionego wzorem III w formie białego osadu. Wzór sumaryczny C1₂H₂0NOaP. Masa cząsteczkowa: 257.3 1/moI. Widmo ³¹P NMR (roztwór w D2O), δ [ppm]): 36.02 (s, 41%) i 37.11 (s, 59%). Widmo ¹H NMR (roztwór w D2O, δ [ppm], J [Hz]): 0.67-0.93 (m, 6H, 2xCH₂), 1.28-1.94 (m, 3H, CH, CH), 3.80 (m, 1H, CHOH,), 4.62 (d, J=13.6, 1H, CHNH₂), 7.34-7.42 (m, 5H, aromat.,).

P r z y k ł a d IV

Aktywność inhibitorową czynnika aktywnego w postaci kwasu (a 1-amino-3-metyIobutano)-(a2-hydroksy-3-fenyIopropano)fosfinowego testuje się wobec aminopeptydazy N.

Pomiary kinetyczne wykonuje się w 50 mM buforze fosforanowym o pH=7.2 i temperaturze 23°C. Jako substratu używa się L-Ieucylo-p-nitroanilidu z firmy Sigma rozpuszczonego w DMSO i o stężeniu końcowym 0.05 mM. Stężenia końcowe inhibitora rozpuszczonego w DMSO wynoszą 500 μM, 250 μM, 100 gM, 25 gM, 5 gM, 1 gM, 0.75 gM oraz 0.5 gM, natomiast stężenie końcowe aminopeptydazy N wynosi 2 gg/ml. Wyniki mierzy się jako zmianę absorbancji przy długości fali 410 nM w czasie 10 minut i porównuje z wynikami kontroli polegającej na identycznym pomiarze, lecz bez dodatku czynnika aktywnego. Końcowy skład objętościowy mieszaniny w czasie pomiaru był następujący: roztwór enzymu w buforze - 20 gl, roztwór czynnika aktywnego - 50 gl, roztwór substratu - 100 gl i bufor uzupełniający - 1830 gl. Otrzymana wartość inhibicji dla chlorowodorku bis(a-amino-1-difenyIometano)fosfinowego wobec aminopeptydazy N (IC₅₀) wynosiła 1 ± 0.1 gM.

P r z y k ł a d V

Aktywność inhibitorową czynnika aktywnego w postaci kwasu (a 1-amino-3-metyIobutano)-(a2-hydroksy-n-pentano)fosfinowego testuje się wobec aminopeptydazy N.

Pomiary kinetyczne wykonuje się w 50 mM buforze fosforanowym o pH=7.2 i temperaturze 23°C. Jako substartu używa się L-Ieucylo-p-nitroanilidu z firmy Sigma rozpuszczonego w DMSO i o stężeniu końcowym 0.05 mM. Stężenia końcowe inhibitora rozpuszczonego w DMSO wynoszą 500 gM, 25 gM, 5 gM, 2.5 gM, 1 gM oraz 0.5 gM, natomiast stężenie końcowe aminopeptydazy N wynosi 2 gg/ml. Wyniki mierzy się jako zmianę absorbancji przy długości fali 410 nM w czasie 10 minut i porównuje z wynikami kontroli polegającej na identycznym pomiarze, lecz bez dodatku czynnika aktywnego. Końcowy skład objętościowy mieszaniny w czasie pomiaru był następujący: roztwór enzymu w buforze 20gl, roztwór czynnika aktywnego - 50gl, roztwór substratu - 100 gl i bufor uzupełniający - 1830 gl. Otrzymana wartość inhibicji dla chlorowodorku bis(a-amino-(a 1-difenyIometano-a2-etano)fosfinowego wobec aminopeptydazy N (IC₅₀) wynosiła 3 ± 0.3

P r z y k ł a d VI

Aktywność inhibitorową czynnika aktywnego w postaci kwasu (a 1-amino-1-fenyIometano)-(a2-hydroksy-3-metyIobutano)fosfinowego testuje się wobec aminopeptydazy N.

Pomiary kinetyczne wykonuje się w 50 mM buforze fosforanowym o pH=7.2 i temperaturze 23°C. Jako substratu używa się L-Ieucylo-p-nitroanilidu z firmy Sigma rozpuszczonego w DMSO i o stężeniu końcowym 0.05 mM. Stężenia końcowe inhibitora rozpuszczonego w DMSO wynoszą 500 gM, 25 gM, 5 gM, 2.5 gM oraz 1 gM, natomiast stężenie końcowe aminopeptydazy N wynosi 2 gg/ml. Wyniki mierzy się jako zmianę absorbancji przy długości fali 410 nM w czasie 10 minut i porównuje się z wynikami kontroli polegającej na identycznym pomiarze, lecz bez dodatku czynnika aktywnego. Końcowy skład objętościowy mieszaniny w czasie pomiaru był następujący: roztwór enzymu w buforze 20 gl, roztwór czynnika aktywnego - 50 gl, roztwór substratu - 100 gl i bufor uzupełniający - 1830 gl. Otrzymana wartość inhibicji dla chlorowodorku bis(a-amino-a1-difenylometano-a2-etano)fosfinowego wobec aminopeptydazy N (IC₅₀) wynosiła 12 ± 1.2 gM.

PL 198 363 B1

P r z y k ł a d VII

Zdolność do indukcji apoptozy czynnika aktywnego w postaci kwasu (a ₁-amino-3-metylobutano)-(a 2-hydroksy-3-fenylopropano)fosfinowego testuje się w hodowlach komórek A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 72 godzinach przy użyciu testu kometkowego.

Przygotowuje się hodowle komórkowe linii A549 tej samej liczebności wyjściowej zawieszonych w toni, w objętości 0.9 ml, w dołkach (obraz w mikroskopie - pojedyncze, średnio liczne w polu widzenia). Hodowle pozostawia się do zrównoważenia w medium. Po 24 godzinach obraz w polu widzenia mikroskopu taki sam we wszystkich dołkach hodowlanych - tylko komórki żywe, równomiernie rozmieszczone, niezbyt liczne (liczebność nie ogranicza proliferacji).

Preparat, w postaci roztworu o stężeniu wyjściowym - 10 mM, rozcieńcza się używając medium hodowlanego dla linii A549 do stężenie 0.5 mM i przefiltrowuje przez filtry bakteriologiczne. Dodaje się odpowiednio do hodowli uzyskując stężenia efektywne 50 pM, 125 pM i 250 pM. Po 72 godzinach wykonuje się test kometkowy polegający na identyfikacji rodzaju uszkodzenia DNA poszczególnych komórek identycznie jak opisano we wcześniejszych publikacjach (Drąg-Zalesińska, M., Wysocka, T., Dumańska, M., Jagoda, E., Zabel, M., Folia Histochemica et Cytobiologica, 40, 125 (2002); Drąg-Zalesińska, M., Wysocka, T., Gębarowska, E., Zabel, M., Folia Histochemica et Cytobiologica, 37, 133 (1999)). Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli I.

Stężenie związku	Komórki apoptotyczne	Niezidentyfikowane uszkodzenie DNA w komórkach	Brak uszkodzenia
50 pM	7.6%	31.5%	60.9%
125 pM	20.4%	43.0%	36.6%
250 pM	64.0%	0.0%	36.0%

T a b e l a I. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych (pH=7) wykonanego dla lini A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 72 godzinach od inkubacji z kwasem (a 1-amino-3-metylobutano)-(a 2-hydroksy-3-fenylopropano)fosfinowym.

P r z y k ł a d VIII

Zdolność do indukcji apoptozy czynnika aktywnego w postaci kwasu (a 1-amino-3-metylobutano)-(a 2-hydroksy-3-fenylopropano)fosfinowego testuje się w hodowlach komórek A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 48 godzinach przy użyciu testu kometkowego.

Preparat, w postaci roztworu o stężeniu wyjściowym - 10 mM, rozcieńcza się używając medium hodowlanego dla linii A549 do stężenie 0.5 mM i przefiltrowuje przez filtry bakteriologiczne. Dodaje się odpowiednio do hodowli uzyskując stężenia efektywne 50 pM, 125 pM i 250 pm. Po 48 godzinach wykonano test kometkowy polegający na identyfikacji rodzaju uszkodzenia DNA poszczególnych komórek identycznie jak opisano we wcześniejszych publikacjach (Drąg-Zalesińska, M., Wysocka, T., Dumańska, M., Jagoda, E., Zabel, M., Folia Histochemica et Cytobiologica, 40, 125 (2002); DrągZalesińska, M., Wysocka, T., Gębarowska, E., Zabel, M., Folia Histochemica et Cytobiologica, 37,133 (1999)). Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli II.

Stężenie związku	Komórki apoptotyczne	Niezidentyfikowane uszkodzenie DNA w komórkach	Brak uszkodzenia
50 pM	79.8%	3.4%	16.8%
125 pM	100.0%	0.0%	0.0%
250 pM	100.0%	0.0%	0.0%

PL 198 363 B1

T a b e l a II. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych (pH=7) wykonanego dla linii

A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 48 godzinach od inkubacji z kwasem (a ₁-amino-3-metylobutano)-(a 2-hydroksy-3-fenylopropano)fosfinowym.

P r z y k ł a d IX

Zdolność do indukcji apoptozy czynnika aktywnego w postaci kwasu (a 1-amino-3-metylobutano)-(a2-hydroksy-3-fenylopropano)fosfinowego testuje się w hodowlach komórek A549 we wstępnej fazie wzrostu po 48 godzinach przy użyciu testu kometkowego.

Preparat, w postaci roztworu o stężeniu wyjściowym - 10 mM, rozcieńcza się używając medium hodowlanego dla linii A549 do stężenie 0.5 mM i przefiltrowuje przez filtry bakteriologiczne. Dodaje się odpowiednio do hodowli uzyskując stężenia efektywne 10 ąM, 50 ąM i 125 ąM. Po 48 godzinach wykonuje się test kometkowy polegający na identyfikacji rodzaju uszkodzenia DNA poszczególnych komórek identycznie jak opisano we wcześniejszych publikacjach (Drąg-Zalesińska, M., Wysocka, T., Dumańska, M., Jagoda, E., Zabel, M., Folia Histochemica et Cytobiologica, 40, 125 (2002); Drąg-Zalesińska, M., Wysocka, T., Gębarowska, E., Zabel, M., Folia Histochemica et Cytobiologica, 37,133 (1999)). Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli III.

Stężenie związku	Komórki apoptotyczne	Niezidentyfikowane uszkodzenie DNA w komórkach	Brak uszkodzenia
10 ąM	20.0%	27.2%	52.8%
50 ąM	32.6%	25.6%	41.8%
125 ąM	52.1%	43.8%	4.1%

T a b e l a III. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych (pH=7) wykonanego dla lini A549 we wstępnej fazie wzrostu po 48 godzinach od inkubacji z kwasem (a 1-amino-3-metylobutano)-(a 2-hydroksy-3-fenylopropano)fosfinowym.

Claims

1. Zastosowanie kwasów a 1-aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinowych, o wzorze ogólnym I, w którym R1 i R2 są takie same lub różne i oznaczają podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego naturalnych aminokwasów, do indukcji apoptozy komórek rakowych.

2. Zastosowanie kwasów a 1-aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinowych według zastrz. 1, znamienne tym, że związki określone wzorem ogólnym I, stosuje się w postaci geometrycznych izomerów.

3. Zastosowanie kwasów a 1-aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinowych według zastrz. 1, znamienne tym, że związki określone wzorem ogólnym I, stosuje się w postaci optycznych izomerów.

4. Zastosowanie kwasów a 1-aminoalkano-a2-hydroksyalkanofosfinowych według zastrz. 1, znamienne tym, że ilość czynnika aktywnego wystarczająca do indukcji apoptozy komórek rakowych, mieści się w przedziale od 0.01 mg do 200 mg na kilogram masy ciała pacjenta.

5. Sposób wytwarzania a1-aminoalkano-a2-hydroksy-alkanofosfinianów o wzorze ogólnym I, w którym R1 i R2 są takie same lub różne i oznaczają podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego naturalnych aminokwasów, znamienny tym, że substraty w postaci estrów benzylowych kwasów N-(benzyloksykarbonylamino)-alkanofosfinowego, poddaje się w pierwszym etapie reakcji z 1-4 równoważnikami molowymi aldehydu alifatycznego lub aromatycznego, korzystnie wybranego z grupy obejmującej, aldehyd 3-fenylopropionowy, aldehyd n-walerianowy lub aldehyd izo-walerianowy oraz 2-8 równoważnikami molowymi fluorku potasu w stosunku do fosfinowego substratu, reakcję prowadzi się 24-72 godziny w temperaturze pokojowej w mieszaninie bezwodnych rozpuszczalników dimetyloformamidu i chloroformu w stosunku objętościowym od 1:1 do 20:1, deprotekcję grupy benzylowej i grupy

PL 198 363 B1 benzyloksykarbonylowej z otrzymanych związków prowadzi się jednocześnie z użyciem 33% roztworu HBr/kwas octowy w ilości od 5-20 równoważników molowych w stosunku do fosfinowego substratu.

6. Sppsóóweeług g zstrz. 5 ,z namiennytym, ż żp pddzzsreekcji synteey u trzymujes ięccłkowitą ilość rozpuszczalnika w granicach od 2 do 10 ml na 1 mM fosfinowego substratu.

7. Bsposó weSług zasrrz. 5, znamienny tym, żż reeScjęddsroteScji wencsuje się w czasie