PL198507B1 - Liaza pektynianowa, wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa, wektor ekspresyjny, hodowana komórka, sposób wytwarzania polipeptydu, preparat enzymu, kompozycja detergentowa, sposób prania tkanin, sposób polepszania właściwości celulozowych włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny, sposób degradacji lub modyfikowania materiału roślinnego, sposób wytwarzania paszy dla zwierząt i sposób obróbki wina lub soku - Google Patents

Liaza pektynianowa, wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa, wektor ekspresyjny, hodowana komórka, sposób wytwarzania polipeptydu, preparat enzymu, kompozycja detergentowa, sposób prania tkanin, sposób polepszania właściwości celulozowych włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny, sposób degradacji lub modyfikowania materiału roślinnego, sposób wytwarzania paszy dla zwierząt i sposób obróbki wina lub soku

Info

Publication number
PL198507B1
PL198507B1 PL341143A PL34114398A PL198507B1 PL 198507 B1 PL198507 B1 PL 198507B1 PL 341143 A PL341143 A PL 341143A PL 34114398 A PL34114398 A PL 34114398A PL 198507 B1 PL198507 B1 PL 198507B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
enzyme
polypeptide
gly
pectin
asn
Prior art date
Application number
PL341143A
Other languages
English (en)
Other versions
PL341143A1 (en
Inventor
Lene Nonboe Andersen
Martin Schülein
Niels Erik Krebs Lange
Mads Eskelund Bjornvad
Kirk Schnorr
Original Assignee
Novozymes As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/073,684 external-priority patent/US6124127A/en
Application filed by Novozymes As filed Critical Novozymes As
Priority claimed from PCT/DK1998/000514 external-priority patent/WO1999027083A1/en
Publication of PL341143A1 publication Critical patent/PL341143A1/xx
Publication of PL198507B1 publication Critical patent/PL198507B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)

Abstract

1. Liaza pektynianowa, która jest i) polipeptydem zawieraj acym sekwencj e aminokwasow a przedstawion a w pozycjach 28-341 SEQ ID NO: 8, albo ii) analogiem polipeptydu okre slonego w i), który jest w co najmniej 70% homologiczny z tym polipeptydem. PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są liaza pektynianowa, wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa, wektor ekspresyjny, hodowana komórka, sposób wytwarzania polipeptydu, preparat enzymu, kompozycja detergentowa, sposób prania tkanin, sposób polepszania właściwości celulozowych włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny, sposób degradacji lub modyfikowania materiału roślinnego, sposób wytwarzania paszy dla zwierząt i sposób obróbki wina lub soku.
Polimery pektyny są ważnymi składnikami ścian komórkowych roślin. Pektyna jest heteropolisacharydem o szkielecie złożonym z naprzemiennych regionów homogalakturonanowych (regionów gładkich) i ramnogalakturonanowych (regionów rozgałęzień). Regiony gładkie są liniowymi polimerami połączonego wiązaniami 1,4 kwasu α-D-galakturonowego. Reszty kwasu galakturonowego mogą być w różnym stopniu zestryfikowane resztami metylowymi w grupach karboksylowych, zazwyczaj w sposób nielosowy, z odcinkami całkowicie zestryfikowanego resztami metylowymi kwasu poligalakturonowego.
Pektynazy można sklasyfikować na podstawie ich preferowanego substratu, w wysokim stopniu zestryfikowanego grupami metylowymi lub w niskim stopniu zestryfikowanego grupami metylowymi pektyny i kwasu poligalakturonowego (pektynian), oraz mechanizmu ich reakcji, β-eliminacji lub hydrolizy. Pektynazy mogą działać głównie w środkowej części cząsteczki substratu, tnąc polimer w losowych miejscach w łańcuchu w wyniku czego powstają mieszaniny oligomerów, bądź mogą one działać w końcowej części cząsteczki substratu, atakując polimer na jednym końcu i w wyniku czego powstają monomery lub dimery. W klasyfikacji enzymów podanej w Nomenklaturze Enzymów (1992) znajduje się kilka enzymów o aktywnościach pektynazowych działających na regiony gładkie pektyny, takich jak liaza pektynianowa (EC 4.2.2.2.), liaza pektynowa (EC 4.2.2.10), poligalakturonaza (EC 3.2.1.15), egzo-poligalakturonaza (EC 3.2.1.67), liaza egzo-poligalakturonowa (EC 4.2.2.9) oraz egzo-poli-a-galakturonozydaza (EC 3.2.1.82).
Liazy pektynianowe sklonowano z kilku różnych rodzajów bakteryjnych, takich jak Erwinia, Pseudomonas, Klebsiella i Xanthomonas. Opisano także klonowanie liazy pektynynianowej z Bacillus subtilis (Nasser i inni (1993) FEBS 335: 319-326) i Bacillus sp. YA-14 (Kim i inni (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58: 947-949). Donoszono o oczyszczaniu liaz pektynianowych o maksimum aktywności w zakresie pH 8-10, wytwarzanych przez Bacillus pumilus (Dave i Vaughn (1971) J. Bacteriol. 108: 166-174), B. polymyxa (Nagel i Vaughn (1961) Arch. Biochem. Biophys. 93: 344-352), B. stearothermophilus (Karbassi i Vaughn (1980) Can. J. Microbiol. 26: 377-384), Bacillus sp. (Hasegawa i Nagel (1966) J. Food Sci. 31: 838-845) oraz .Bacillus sp. RK9 (Kelly i Fogarty (1978) Can. J. Microbiol. 24: 1164-1172), nie stwierdzono jednakże żadnej publikacji dotyczącej klonowania genów kodujących liazy pektynianowe tych organizmów. Wszystkie opisane liazy pektynianowe wymagają kationów dwuwartościowych dla maksymalnej aktywności, przy czym jony wapniowe wykazują największy stopień stymulacji.
Publikacja WO 98/45393 ujawnia kompozycje detergentowe, zawierające protopektynazę o znacznych zdolnościach piorących wobec zabrudzeń błotem.
Generalnie, mikroorganizmy wytwarzające pektynazy wykazują szeroki zakres enzymów rozkładających lub modyfikujących pektynę. Często mikroorganizmy wytwarzają również celulazy i/lub hemicelulazy, a złożone, wieloskładnikowe preparaty enzymów z takich mikroorganizmów mogą być trudne do optymalizacji do różnych zastosowań, mogą one nawet zawierać enzymy o szkodliwym wpływie. A zatem, celem wynalazku jest dostarczenie enzymu rozkładającego pektynę wykazującego tylko pożądany wpływ, np. w detergentach lub różnych procesach przemysłowych.
Autorzy wynalazku odkryli enzym rozkładający pektynę, szczególnie alkaliczny enzym rozkładający pektynę, który jest endogenny dla bakteryjnego szczepu z rodzaju Bacillus, w szczególności szczepu Bacillus licheniformis, i udało się im zidentyfikować sekwencje DNA kodujące taki enzym.
Zatem, w pierwszej postaci wynalazek dotyczy liazy pektynianowej, która jest
i) polipeptydem zawierającym sekwencję aminokwasową przedstawioną w pozycjach 28-341 SEQ ID NO: 8, albo ii) analogiem polipeptydu określonego w i), który jest w co najmniej 70% homologiczny z tym polipeptydem.
Korzystnie liaza pektynianowa według wynalazku pochodzi z Bacillus licheniformis ATCC 14580 lub gatunków Bacillus, przy czym wszystkie gatunki są korzystnie homologiczne w co najmniej 99% do Bacillus licheniformis w oparciu o dopasowane sekwencje rDNA 16S.
PL 198 507 B1
Korzystnie liaza pektynianowa według wynalazku wykazuje swoją optymalną aktywność przy pH wyższym niż 8, korzystnie przy pH wyższym niż 9.
Sekwencję DNA liazy pektynianowej według wynalazku podano w liście sekwencji jako sekwencję SEQ ID NO: 7, a przewidywaną sekwencję aminokwasową podano w liście sekwencji jako sekwencję SEQ ID NO: 8. Uważa się, że ten nowy enzym zostanie zaklasyfikowany zgodnie z Nomenklaturą Enzymów do klasy enzymatycznej EC 4.2.2.2. Jednakże, należy zauważyć, że enzym według wynalazku wykazuje aktywność katalityczną także wobec pektyny (która może być zestryfikowana), poza aktywnością wobec pektynianu i poligalakturonidów, zazwyczaj przypisywaną enzymom należącym do EC 4.2.2.2.
W jednej postaci wynalazek dotyczy wyizolowanej cz ą steczki polinukleotydowej, kodują cej polipeptyd wykazujący aktywność liazy pektynianowej, wybranej z grupy obejmującej:
a) cząsteczki polinukleotydowe o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO: 7 od nukleotydu 82 do nukleotydu 1026;
b) cząsteczki polinukleotydowe kodujące polipeptyd, który jest w co najmniej 70% identyczny z sekwencją aminokwasową z SEQ ID NO: 8 od reszty aminokwasowej 28 do reszty aminokwasowej 341 i
c) zdegenerowane sekwencje nukleotydowe z (a) lub (b).
Korzystnie w wyizolowanej cząsteczce polinukleotydowej według wynalazku polinukleotyd stanowi DNA.
Plazmidem pSJ1678, zawierającym cząsteczkę polinukleotydową (sekwencję DNA) kodującą liazę pektynianową według wynalazku, przedstawioną w sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 8, stransformowano szczep Escherichia coli, który został w dniu 25 września 1997 r. zdeponowany przez autorów wynalazku na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego o Międzynarodowym Uznawaniu Depozytu Mikroorganizmów dla Celów Postępowania Patentowego w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Republika Federalna Niemiec pod numerem depozytowym DSM 11789.
W innych postaciach wynalazek dotyczy wektora ekspresyjnego, zawierającego następujące funkcjonalnie połączone elementy: promotor transkrypcji; odcinek DNA wybrany z grupy obejmującej a) cząsteczki polinukleotydowe kodujące polipeptyd wykazujący aktywność liazy pektynianowej, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO: 7 od nukleotydu 1 do nukleotydu 1026; b) cząsteczki polinukleotydowe kodujące polipeptyd wykazujący aktywność liazy pektynianowej, który jest w co najmniej 70% identyczny z sekwencją aminokwasową z SEQ ID NO: 8 od reszty aminokwasowej 28 do reszty aminokwasowej 341 i c) zdegenerowane sekwencje nukleotydowe z (a) lub (b); oraz terminator transkrypcji.
W jeszcze innej postaci wynalazek dotyczy hodowanej komórki, która cechuje się tym, ż e do komórki tej wprowadzono określony powyżej wektor ekspresyjny, przy czym w tej komórce zachodzi ekspresja polipeptydu kodowanego przez odcinek DNA.
W innej postaci wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania polipeptydu wykazują cego aktywność liazy pektynianowej, który charakteryzuje się tym, że hoduje się komórkę, do której wprowadzono określony powyżej wektor ekspresyjny, przy czym w tej komórce zachodzi ekspresja polipeptydu kodowanego przez odcinek DNA; oraz odzyskuje się polipeptyd.
W innej postaci wynalazek dotyczy preparatu zawierają cego oczyszczony polipeptyd wedł ug wynalazku w połączeniu z innymi polipeptydami.
Zatem preparat enzymu, według wynalazku zawiera oczyszczony polipeptyd wytworzony określonym powyżej sposobem lub określoną powyżej liazę pektynianową.
Korzystnie preparat enzymu według wynalazku ponadto zawiera jeden lub większą liczbę enzymów wybranych z grupy obejmującej proteazy, celulazy (endoglukanazy), β-glukanazy, hemicelulazy, lipazy, peroksydazy, laktazy, α-amylazy, glukoamylazy, kutynazy, pektynazy, reduktazy, oksydazy, fenoloksydazy, ligninazy, pululanazy, arabinozydazy, mannanazy, ksyloglukanazy, ksylanazy, acetyloesterazy pektynowe, poligalakturonazy, ramnogalakturonazy, galaktanazy, liazy pektynowe, inne liazy pektynianowe, metyloesterazy pektynowe, celobiohydrolazy, transglutaminazy i ich mieszaniny.
Nowy enzym według wynalazku użyteczny jest do traktowania materiału celulozowego, szczególnie zawierających celulozę włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny, traktowania mechanicznie otrzymanej masy papierniczej lub powtórnie przetwarzanej makulatury, oraz do roszenia włókien. Traktowanie można prowadzić podczas przetwarzania materiału celulozowego do materiału gotowego do produkcji odzieży lub tkanin, np. na etapie usuwania klejonki lub prania; bądź podczas przemysłowego lub domowego prania takiej tkaniny lub odzieży.
PL 198 507 B1
Zgodnie z tym, w kolejnej postaci wynalazek dotyczy kompozycji, detergentowej, zawierającej enzym wykazujący znaczną aktywność rozkładania pektyny; oraz stosowania enzymu według wynalazku do traktowania zawierających celulozę włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny.
Zatem kompozycja detergentowa, według wynalazku, cechuje się tym, że zawiera określony powyżej preparat enzymu lub określony powyżej enzym, oraz środek powierzchniowo czynny.
Enzym według wynalazku jest bardzo skuteczny do stosowania w procesie prania enzymatycznego w przygotowywaniu materiału celulozowego np. do właściwej odpowiedzi podczas późniejszych operacji farbowania. Ponadto, uważa się, że kompozycje detergentowe zawierające nowy enzym, są zdolne do usuwania lub wybielania niektórych zabrudzeń lub plam w praniu, szczególnie zabrudzeń i plam z pokarmu, roś lin i podobnych zawierają cych galaktan lub arabinogalaktan. Uważ a się również , że traktowanie kompozycjami detergentowymi zawierającymi nowy enzym może zapobiegać wiązaniu pewnych zabrudzeń z materiałem celulozowym.
Zatem wynalazek dotyczy sposobu prania tkanin w pralkach, który charakteryzuje się tym, że na tkaninę podczas cyklu prania w procesie prania w pralkach działa się roztworem piorącym zawierającym określony powyżej preparat enzymu lub określony powyżej enzym.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu polepszania właściwości celulozowych włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny, który charakteryzuje się tym, że na włókna, przędzę lub tkaninę działa się skuteczną ilością określonego powyżej preparatu enzymu lub skuteczną ilością określonego powyżej enzymu.
Korzystnie w sposobie polepszania właściwości celulozowych włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny według wynalazku, preparat enzymu lub enzym stosuje się na etapie procesu prania.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu degradacji lub modyfikowania materiału roślinnego, który charakteryzuje się tym, że na materiał roślinny działa się skuteczną ilością określonego powyżej preparatu enzymu lub skuteczną ilością określonego powyżej enzymu.
Korzystnie w sposobie degradacji lub modyfikowania materiału roślinnego, według wynalazku, jako materiał rośliny stosuje się materiał, który stanowi powtórnie przetwarzana makulatura, mechanicznie otrzymana masa papiernicza lub włókna poddane procesowi roszenia.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania paszy dla zwierząt, który charakteryzuje się tym, że skuteczną ilość określonego powyżej preparatu enzymu lub skuteczną ilość określonego powyżej enzymu dodaje się jako dodatek paszowy dla zwierząt do powszechnie stosowanych składników paszy dla zwierząt.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu obróbki wina lub soku, który charakteryzuje się tym, że na wino lub sok działa się skuteczną ilością określonego powyżej preparatu enzymu lub skuteczną ilością określonego powyżej enzymu.
Enzym według wynalazku może być również użyteczny jako składnik kompozycji do czyszczenia twardych powierzchni, usuwający lub wspomagający usuwanie pewnych zabrudzeń lub plam z twardych powierzchni wymagają cych czyszczenia.
Przed dalszą szczegółową dyskusją wynalazku, najpierw zdefiniowane zostaną następujące określenia.
Określenie „ortolog (lub „homolog gatunkowy) oznacza polipeptyd lub białko otrzymane z jednego gatunku, które wykazują homologię do analogicznego polipeptydu lub białka z innego gatunku.
Określenie „paralog oznacza polipeptyd lub białko otrzymane z danego gatunku, które wykazują homologię do odrębnego polipeptydu lub białka z tego samego gatunku.
Określenie „wektor ekspresyjny oznacza cząsteczkę DNA, liniową lub kolistą, która zawiera odcinek kodujący polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania, funkcjonalnie połączony z dodatkowymi elementami, które zapewniają jego transkrypcję. Takie dodatkowe elementy mogą obejmować sekwencje promotorowe i terminatorowe, a ewentualnie mogą obejmować jedno lub więcej miejsc początku replikacji, jeden lub więcej markerów selekcyjnych, sekwencję wzmacniającą, sygnał poliadenylacji itp. Wektory ekspresyjne generalnie otrzymuje się z DNA plazmidowego lub wirusowego, lub mogą zawierać oba elementy. Wektorem ekspresyjnym według wynalazku może być jakikolwiek wektor ekspresyjny, który dogodnie poddaje się procedurom rekombinacji DNA, a wybór wektora często zależeć będzie od komórki gospodarza, do której wektor ten ma być wprowadzony. A zatem, wektorem może być wektor ulegający autonomicznej replikacji, tj. wektor, który istnieje jako jednostka pozachromosomalna, której replikacja jest niezależna od replikacji chromosomalnej, np. plazmid. Alternatywnie, wektorem może być wektor, który, po wprowadzeniu do komórki gospodarza, ulega integracji z genomem gospodarza i replikacji razem z chromosomem(ami), z którym został zintegrowany.
PL 198 507 B1
Określenie „ulegający rekombinacyjnej ekspresji lub „rekombinacyjnie eksprymowany stosowany w opisie w odniesieniu do ekspresji poiipeptydu lub białka, zdefiniowane jest zgodnie ze standardową definicją. Rekombinacyjną ekspresję białka generalnie prowadzi się przez stosowanie opisanego bezpośrednio powyżej wektora ekspresyjnego.
Określenie „wyizolowana, gdy stosowane jest wobec cząsteczki polinukleotydu, oznacza, że polinukleotyd usunięto z jego naturalnego otoczenia genetycznego i jest on zatem wolny od innych nie związanych lub niepożądanych sekwencji kodujących oraz ma postać odpowiednią do stosowania w otrzymanych metodami inżynierii genetycznej układach wytwarzania białek. Takimi wyizolowanymi cząsteczkami są te cząsteczki, które zostały wydzielone z ich naturalnego środowiska i obejmują one klony cDNA i genomowe. Wyizolowane cząsteczki DNA według wynalazku są wolne od innych genów z którymi są zazwyczaj związane, ale mogą obejmować naturalnie występujące 5' i 3'-końcowe regiony nieulegające translacji, takie jak promotory i terminatory. Identyfikacja towarzyszących regionów będzie oczywista dla fachowca (patrz, np., Dynan i Tijan, Nature 316: 774-78, 1985). Określenie „wyizolowany polinukleotyd może być alternatywnie zastąpione określeniem „sklonowany polinukleotyd.
Jeśli określenie „wyizolowany stosuje się odnośnie białka/polipeptydu, wówczas wskazuje ono, że białko występuje w warunkach innych niż jego natywne otoczenie. W korzystnej postaci, wyizolowane białko jest zasadniczo wolne od innych białek, szczególnie innych białek homologicznych (tj. „homologicznych zanieczyszczeń (patrz poniżej)). Korzystne jest dostarczenie białka w postaci o czystości wyższej niż 40%, korzystniej w postaci o czystości wyższej niż 60%.
Nawet korzystniej, korzystne jest dostarczenie białka w postaci o wysokiej czystości, tj. o czystości wyższej niż 80%, korzystniej czystości wyższej niż 95%, a jeszcze korzystniej czystości wyższej niż 99%, oznaczanej przez SDS-PAGE.
Określenie „wyizolowane białko/wyizolowany polipeptyd alternatywnie może być zastąpione określeniem „oczyszczone białko/oczyszczony polipeptyd.
Określenie „zanieczyszczenia homologiczne oznacza jakiekolwiek zanieczyszczenia (np. polipeptyd inny, niż polipeptyd według wynalazku), które pochodzą z komórki homologicznej, z której oryginalnie otrzymano polipeptyd według wynalazku.
Określenie „otrzymany z w znaczeniu stosowanym w opisie w odniesieniu do określonego źródła mikrobiologicznego oznacza, że polinukleotyd i/lub polipeptyd wytwarzany jest przez określone źródło, lub przez komórkę, do której wstawiono gen z tego źródła.
Określenie „endogenny dla w znaczeniu stosowanym w opisie w odniesieniu do określonego źródła mikrobiologicznego oznacza, że polipeptyd wytwarzany jest przez określone źródło w wyniku obecności w nim natywnego genu, tj. którego nie wstawiono do komórki źródła poprzez rekombinację.
Określenie „funkcjonalnie połączone, jeśli odnosi się do odcinków DNA, oznacza, że odcinki ułożone są w taki sposób, że działają wspólnie w ich zamierzonych celach, np. transkrypcja rozpoczynana jest w promotorze i przebiega poprzez sekwencję kodującą do terminatora.
Określenie „polinukleotyd oznacza jedno- lub dwuniciowy polimer zasad deoksyrybonukleotydowych lub rybonukleotydowych, odczytywanych od końca 5' do końca 3'. Polinukleotydy obejmują RNA i DNA i mogą być wyizolowane ze źródeł naturalnych, zsyntetyzowane in vitro lub przygotowane przez połączenie cząsteczek naturalnych i syntetycznych.
Określenie „komplementarne do cząsteczek polinukleotydowych oznacza cząsteczki polinukleotydowe zawierające komplementarną sekwencję zasad i odwróconą orientację w porównaniu z sekwencją odniesienia. Tak np. sekwencja 5' ATGCACGGG 3' jest komplementarna do sekwencji 5' CCCGTGCAT 3'.
Określenie „zdegenerowana sekwencja nukleotydowa oznacza sekwencję nukleotydów, która obejmuje jeden lub większą liczbę zdegenerowanych kodonów (w porównaniu z polinukleotydową cząsteczką odniesienia, która koduje polipeptyd). Zdegenerowane kodony zawierają odmienne triplety nukleotydów, ale kodują taką samą resztę aminokwasową (tj. każdy z tripletów GAU i GAC koduje Asp).
Określenie „promotor oznacza część genu zawierającą sekwencje DNA, które zapewniają wiązanie polimerazy RNA i inicjację transkrypcji. Sekwencje promotorowe powszechnie, ale nie zawsze, występują w 5'-końcowych niekodujących regionach genów.
Określenie „sekwencja sygnałowa sekrecji oznacza sekwencją DNA, która koduje polipeptyd („peptyd sekrecyjny), który, jako składnik większego polipeptydu, kieruje większy polipeptyd na szlak sekrecji w komórce, w której jest syntetyzowany. Większy peptyd jest najczęściej rozszczepiany w celu usunięcia peptydu sekrecyjnego podczas przechodzenia przez szlak sekrecji.
PL 198 507 B1
Określenie „pektyna oznacza pektynian, kwas poligalakturonowy i pektynę, która może być w wię kszym lub mniejszym stopniu zestryfikowana.
Określenie „enzym rozkładający pektynę lub „pektynaza oznacza enzym pektynazę zdefiniowany zgodnie z dziedziną techniki, w której pektynazy są określone jako enzymy rozszczepiające wiązania glikozydowe substancji pektynowych, głównie poli (1,4-a-D-galakturonidu i jego pochodnych (Sakai i inni, 1993).
Korzystnie, pektynazą według wynalazku jest enzym pektynaza, który katalizuje losowe rozszczepianie wiązań a-1,4-glikozydowych w kwasie pektynowym, noszącym również nazwę kwasu poligalakturonowego, przez transeliminację, taki jak klasa enzymów liaza poligalakturonowa (EC 4.2.2.2.) (PGL), znana również jako liaza poli(1-4-a-D-galakturonidowa) i znana także jako liaza pektynianowa.
Jak stosować sekwencję według wynalazku do otrzymywania innych, zbliżonych sekwencji: Ujawnione w opisie informacje o sekwencjach, dotyczące sekwencji polinukleotydu kodującego liazę pektynianową według wynalazku można stosować jako narzędzie do identyfikacji innych, homologicznych liaz pektynianowych. Tak np. można zastosować reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) do amplifikacji sekwencji kodujących inne, homologiczne liazy pektynianowe z licznych źródeł jakie stanowią mikroorganizmy, w szczególności innych gatunków Bacillus.
Polinukleotydy
W korzystnych rozwiązaniach według wynalazku, wyizolowany polinukleotyd według wynalazku hybrydyzował będzie z podobnej wielkości regionem sekwencji SEQ ID NO: 7, lub sekwencji do niej komplementarnej, przynajmniej w warunkach średniej ostrości.
W szczególności, polinukleotyd według wynalazku hybrydyzować będzie ze zdenaturowaną sondą dwuniciowego DNA, zawierającego albo pełną sekwencję (kodującą dojrzałą część polipeptydu), przedstawioną w pozycjach 82-1026 sekwencji SEQ ID NO: 7, bądź jakiejkolwiek sondy zawierającej częściową sekwencję sekwencji SEQ ID NO: 7, o długości co najmniej około 100 par zasad, przynajmniej w warunkach średniej ostrości, ale korzystnie w warunkach wysokiej ostrości, jak opisano szczegółowo poniżej. Odpowiednie warunki doświadczalne do określania hybrydyzacji w warunkach średniej lub wysokiej ostrości pomiędzy sondą nukleotydową a sekwencją homologicznego DNA lub RNA obejmują wstępne moczenie sączka zawierającego fragmenty DNA lub RNA przeznaczone do hybrydyzacji w 5 x SSC (chlorek sodowy/cytrynian sodowy, Sambrook i inni, 1989) w ciągu 10 minut, wstępną hybrydyzację sączka w roztworze 5 x SSC, 5 x roztworu Denhardta (Sambrook i inni, 1989), 0,5% SDS i 100 μg/ml denaturowanego, poddanego sonikacji DNA spermy łososia (Sambrook i inni, 1989), a następnie hybrydyzację w tym samym roztworze zawierającym stężenie 10 ng/ml sondy wyznakowanej 32P-dCTP z zastosowaniem losowych starterów (aktywność właściwa wyższa niż 1 x 109 cpm^g) (A. P. Feinberg i B. Vogelstein (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13) w ciągu 12 godzin w temperaturze około 45°C. Następnie sączek dwukrotnie przemywa się w ciągu 30 minut w 2 x SSC, 0,5% SDS w temperaturze co najmniej 60°C (warunki średniej ostrości), jeszcze korzystniej w temperaturze 65°C (warunki średniej/wysokiej ostrości), jeszcze korzystniej w temperaturze co najmniej 70°C (warunki wysokiej ostrości), a nawet korzystniej w temperaturze co najmniej 75°C (warunki bardzo wysokiej ostrości).
Cząsteczki, z którymi w tych warunkach hybrydyzuje sonda oligonukleotydowa, wykrywa się stosując błonę rentgenograficzną.
Jak stwierdzono uprzednio, wyizolowane polinukleotydy według wynalazku obejmują DNA i RNA. Metody izolowania DNA i RNA są dobrze znane w nauce. DNA lub RNA kodujące geny będące przedmiotem zainteresowania można sklonować w bankach genów lub bibliotekach DNA metodami znanymi w nauce.
Polinukleotydy kodujące polipeptydy wykazujące aktywność liazy pektynianowej według wynalazku identyfikuje się i izoluje następnie przez, np. hybrydyzację lub PCR.
Wynalazek dostarcza ponadto odpowiednich polipeptydów i polinukleotydów z innych szczepów bakteryjnych (ortologi lub paralogi). Przedmiotem szczególnego zainteresowania są polipeptydy rozkładające pektynę z Gram-dodatnich szczepów alkalofilnych, obejmujących gatunki Bacillus.
Homologi gatunkowe polipeptydów wykazujących aktywność rozkładania pektyny według wynalazku można klonować stosując informacje i kompozycje według wynalazku w połączeniu ze zwykłymi technikami klonowania. Tak np. DNA można sklonować stosując chromosomalny DNA otrzymany z rodzaju komórki, w którym zachodzi ekspresja białka. Odpowiednie źródła DNA można zidentyfikować sondując blot typu Northern sondami zaprojektowanymi na podstawie sekwencji ujawnionych w opisie. Następnie przygotowuje się bibliotekę z chromosomalnego DNA dodatniej linii komórkowej.
PL 198 507 B1
DNA kodujący polipeptyd wykazujący aktywność rozkładania pektyny według wynalazku można następnie wyizolować różnymi metodami, takimi jak stosowanie jako sondy pełnego lub częściowego DNA lub jednego bądź więcej zestawów zdegenerowanych sond opartych na ujawnionej sekwencji. DNA można również sklonować stosując reakcję łańcuchową polimerazy, lub PCR (Mullis, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4683202), wykorzystując startery zaprojektowane na podstawie sekwencji ujawnionych w opisie. W dodatkowej metodzie, bibliotekę DNA można zastosować do transformacji lub transfekcji komórek gospodarza, a ekspresję DNA będącego przedmiotem zainteresowania można wykrywać stosując przeciwciało (monoklonalne lub poliklonalne) wywołane przeciw liazom pektynianowym, sklonowanym z B. licheniformis, ATCC 14580, uzyskanym w wyniku ekspresji i oczyszczonym w sposób opisany w Materiałach i Metodach oraz Przykładach, bądź poprzez test aktywności dotyczący polipeptydu wykazującego aktywność rozkładania pektyny. Podobne techniki można również stosować do izolowania klonów genomowych.
Polipeptyd kodujący część sekwencji DNA sklonowanej w plazmidzie pSJ1678, obecnym w Escherichia coli DSM 11789, i/lub sekwencję analogicznego DNA według wynalazku można sklonować ze szczepu bakteryjnego gatunku Bacillus licheniformis, korzystnie szczepu ATCC 14580, wytwarzającego enzym o aktywności rozkładania pektyny lub innego bądź zbliżonego organizmu, jak opisano w opisie.
Alternatywnie, analogiczne sekwencje można konstruować na podstawie sekwencji DNA możliwej do otrzymania z plazmidu obecnego w Escherichia coli DSM 11789, np. będącej jego częściową sekwencją, i/lub przez wprowadzanie podstawień nukleotydowych, które nie powodują powstawania innej sekwencji aminokwasowej enzymu rozkładającego pektynę kodowanego przez sekwencję DNA, ale które odpowiadają wykorzystywaniu kodonów przez organizm gospodarza przeznaczonego do wytwarzania enzymu, lub przez wprowadzanie podstawień nukleotydowych, które mogą powodować powstawanie innej sekwencji aminokwasowej (tj. wariantu enzymu rozkładającego pektynę według wynalazku).
W oparciu o ujawnione w opisie informacje dotyczące sekwencji, można sklonować pełnej długości sekwencję DNA kodującą pektynazę według wynalazku i obejmującą sekwencję przedstawioną w sekwencji SEQ ID NO: 7.
Klonowanie przeprowadza się stosując standardowe procedury znane w nauce, takie jak przygotowywanie biblioteki genomowej ze szczepu Bacillus; wysianie takiej biblioteki na odpowiednie płytki z substratem;
identyfikowanie klonu zawierającego sekwencję polinukleotydową według wynalazku standardowymi technikami hybrydyzacji z zastosowaniem sondy opartej na sekwencji SEQ ID NO: 7; bądź przez identyfikowanie klonu z rzeczonej biblioteki genomowej Bacillus licheniformis ATCC 14580 poprzez strategię odwróconej PCR z zastosowaniem starterów opartych na informacji dotyczącej sekwencji SEQ ID NO: 7. Dla dalszych szczegółów dotyczących odwróconej PCR należy się odnieść do M. J. McPherson i inni („PCR A practical approach, Information Press Ltd, Oxford, Anglia).
W oparciu o ujawnione w opisie informacje dotyczące sekwencji (sekwencje SEQ ID NO: 7 i 8), dla fachowca jest rutynową pracą wyizolowanie homologicznych sekwencji polinukleotydowych kodujących homologiczne pektynazy według wynalazku dzięki podobnej strategii z zastosowaniem bibliotek genomowych ze zbliżonych mikroorganizmów, w szczególności z bibliotek genomowych z innych szczepów z rodzaju Bacillus, takich jak szczepy Bacillus subtilis.
Alternatywnie, DNA kodujący enzym rozkładający pektynę według wynalazku można, zgodnie z dobrze znanymi procedurami, dogodnie sklonować z odpowiedniego źródła, takiego jak którykolwiek z organizmów wymienionych poniżej, dzięki zastosowaniu syntetycznych sond oligonukleotydowych przygotowanych na podstawie sekwencji DNA możliwej do uzyskania z plazmidu obecnego w Escherichia coli DSM 11789.
Zgodnie z tym, cząsteczkę polinukleotydową według wynalazku można wyizolować z Escherichia coli DSM 11789, w której zdeponowano plazmid otrzymany przez takie klonowanie, jak opisano powyżej. Wynalazek dotyczy również wyizolowanej, zasadniczo czystej, biologicznej hodowli odpowiednio szczepu Escherichia coli DSM 11789.
Polipeptydy
Sekwencja aminokwasów o numerach 28-221 sekwencji SEQ ID NO: 4 stanowi sekwencję dojrzałej liazy pektynianowej; pozycje 1-27 są prosekwencją. Sekwencja aminokwasów o numerach 28-341 sekwencji SEQ ID NO: 8 stanowi sekwencję dojrzałej liazy pektynianowej; pozycje 1-27 są prosekwencją. Sekwencja aminokwasów o numerach 31-494 sekwencji SEQ ID NO: 2 stanowi sekwencję
PL 198 507 B1 dojrzałej liazy pektynowej; pozycje 1-30 są prosekwencją. Sekwencja aminokwasów o numerach
1-415 sekwencji SEQ ID NO: 6 stanowi sekwencję dojrzałej poligalakturonazy.
Wynalazek dostarcza także polipeptyd rozkładający pektynę, który jest zasadniczo homologiczny do polipeptydu według sekwencji SEQ ID NO: 8, oraz jego homologi gatunkowe (paralogi lub ortologi). Termin „zasadniczo homologiczny w znaczeniu stosowanym w opisie oznacza polipeptydy wykazujące co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 85%, korzystniej co najmniej 90% identyczności sekwencji z sekwencją przedstawioną w sekwencji SEQ ID NO: 8 lub ich ortologami bądź paralogami. Takie polipeptydy będą korzystniej co najmniej w 95% identyczne, a najkorzystniej w 98% lub więcej identyczne z sekwencją przedstawioną w sekwencji SEQ ID NO: 8 lub ich ortologami bądź paralogami. Procent identyczności sekwencji oznacza się zwykłymi metodami, dzięki programom komputerowym znanym w nauce, takim jak GAP dostarczany w pakiecie programowym GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, sierpień 1994 r., Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, Stany Zjednoczone Ameryki 53711), jak ujawnili S. B. Needleman i C. D. Wunsch (1970), w Journal of Molecular Biology, 48, 443-453, który włącza się w ten sposób w całości do opisu jako odnośnik literaturowy. GAP stosuje się przy następujących ustawieniach do porownywania sekwencji polipeptydów: punkty ujemne GAP za utworzenie 3,0 i punkty ujemne GAP za wydłużenie 0,1.
Identyczność sekwencji cząsteczek polinukleotydowych określa się podobnymi metodami, stosując GAP przy następujących ustawieniach do porównywania sekwencji DNA: punkty ujemne GAP za utworzenie 5,0 i punkty ujemne GAP za wydłużenie 0,3.
Wynalazek oparty jest częściowo na odkryciu kilku nowych sekwencji polinukleotydowych, otrzymanych ze szczepu Bacillus licheniformis, które kodują sekwencje polipeptydowe wykazujące homologię do innych pochodzących z mikroorganizmów sekwencji aminokwasowych pektynaz.
Nową pektynazę Bacillus licheniformis oznaczono:
II: liaza pektynianowa (EC 4.2.2.2)
Nową sekwencję polipeptydu pektynazy według wynalazku początkowo zidentyfikowano przez wprowadzenie poszukiwanych sekwencji, szczególnie sekwencji aminokwasowych znanych pektynaz, do bazy danych sekwencji Bacillus licheniformis w celu zidentyfikowania sekwencji homologicznych do pektynaz.
Stosując zwyczajny program do określania procentowej identyczności sekwencji, jak opisano bardziej szczegółowo w opisie (vide infra), poniżej w tabeli 1, przedstawiono identyczności sekwencji aminokwasowych dołączonej sekwencji SEQ ID NO: 8 (II) z najbardziej zbliżonymi pektynazami znanymi z wcześniejszych prac.
T a b e l a 1:
Homologia pomiędzy sekwencjami aminokwasowymi dla liaz pektynianowych (II)
Sekwencjami zastosowanymi do określania podobieństwa są sekwencje białkowe z TREMBLREL z miejsc wymienionych na schemacie.
II: Sekwencja aminokwasowa według wynalazku (sekwencja SEQ ID NO: 8)
B: o08454.sp_bacteria liaza pektynianowa Amycolata sp.
C: q00893.sp_fungi Glomerella cingulata
II B C
II 100% 40,8% 40,5%
B 40,8% 100%
C 40,5% 100%
Preparat enzymu według wynalazku pochodzi korzystnie z mikroorganizmu, korzystnie bakterii, archebakterii lub grzyba, szczególnie z bakterii, takiej jak bakteria należąca do rodzaju Bacillus, korzystnie z alkalofilnego szczepu Bacillus, który można wybrać z grupy obejmującej gatunek Bacillus licheniformis i blisko spokrewnione gatunki Bacillus, przy czym wszystkie gatunki są w co najmniej 99% homologiczne do Bacillus licheniformis w oparciu o dopasowane sekwencje rDNA 16S.
Zasadniczo homologiczne białka i polipeptydy charakteryzuje się jako zawierające jedno lub więcej podstawień, delecji lub addycji aminokwasowych. Zmiany te korzystnie są nieznaczne, to jest są konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi (patrz tabela 1) i innymi podstawieniami, które zasadniczo nie wpływają na ufałdowywanie lub aktywność białka lub polipeptydu; małymi delecjami, zazwyczaj od jednego do około 30 aminokwasów; i małymi wydłużeniami końca aminowego lub karPL 198 507 B1 boksylowego, takimi jak amino-końcowa reszta metioniny, mały łącznik peptydowy o długości do około 20-25 reszt, lub małe wydłużenie, które ułatwia oczyszczanie (znacznik powinowactwa), takie jak odcinek polihistydynowy, białko A (Nilsson i inni, EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson i inni, Methods Enzymol. 198:3, 1991. Patrz, ogólnie, Ford i inni, Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991, które włącza się do opisu jako odnośnik literaturowy. DNA kodujące znaczniki powinowactwa są dostępne u dostawców (np. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England BioLabs, Beverly, MA).
T a b e l a 2
Konserwatywne podstawienia aminokwasowe
Zasadowe: arginina lizyna histydyna
Kwaśne: kwas glutaminowy kwas asparaginowy
Polarne: glutamina asparagina
Hydrofobowe: leucyna izoleucyna walina
Aromatyczne: fenyloalanina tryptofan tyrozyna
Małe: glicyna alanina seryna treonina metionina
Poza 20 aminokwasami standardowymi, za reszty aminokwasowe polipeptydu według wynalazku można podstawiać aminokwasy niestandardowe (np. 4-hydroksyprolinę, 6-N-metylolizynę, kwas
2-aminoizomasłowy, izowalinę i α-metyloserynę). Za reszty aminokwasowe można podstawiać ograniczoną liczbę aminokwasów niekonserwatywnych, aminokwasów, które nie są kodowane przez kod genetyczny, oraz aminokwasów nienaturalnych. „Aminokwasy nienaturalne zostały zmodyfikowane po syntezie białka i/lub mają budowę chemiczną swojego/swoich łańcucha/łańcuchów bocznego/bocznych inną niż dla aminokwasów standardowych. Aminokwasy nienaturalne można syntetyzować chemicznie lub, korzystnie, są one dostępne w handlu i obejmują kwas pipekolinowy, kwas tiazolidynokarboksylowy, dehydroprolinę, 3- i 4-metyloprolinę oraz 3,3-dimetyloprolinę.
Zasadnicze aminokwasy w polipeptydach liazy pektynianowej według wynalazku można zidentyfikować zgodnie ze znanymi procedurami, takimi jak ukierunkowana mutageneza lub mutageneza przeszukiwania alaninowego (Cunningham i Wells, Science 244: 1081-1085, 1989). W tej ostatniej technice, dla każdej reszty w cząsteczce wprowadza się pojedyncze mutacje alaninowe i otrzymane w wyniku zmutowane cząsteczki sprawdza się pod kątem aktywności biologicznej (tj. aktywności liazy pektynianowej) w celu identyfikacji reszt aminokwasowych mających krytyczne znaczenie dla aktywności cząsteczki. Patrz także Hilton i inni, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996. Miejsce aktywne enzymu lub innego oddziaływania biologicznego można również określić przez fizyczną analizę struktury, badaną takimi technikami, jak magnetyczny rezonans jądrowy, krystalografia, dyfrakcja elektronowa lub znakowanie fotopowinowactwa, łącznie z mutacjami przypuszczalnego miejsca kontaktu. Patrz np. de Vos i inni, Science 255:306-312, 1992; Smith i inni, J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver i inni, FEBS Lett. 309:59-64, 1992. O identyczności zasadniczych aminokwasów można także wnioskować na podstawie analizy homologii z polipeptydami, które są zbliżone do polipeptydu według wynalazku.
Można dokonywać podstawień wielu aminokwasów i testować je stosując znane metody mutagenezy, rekombinacji i/lub tasowania mutacji, po których następuje odpowiednia procedura przeszukiwania, taka jak te ujawnione w Reidhaar-Olson i Sauer Science 241:53-57, 1988; Bowie i Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989, w publikacjach WO 95/17413 lub WO 95/22625. W skrócie, autorzy ci ujawniają metody jednoczesnego losowego zmieniania dwóch lub większej liczby pozycji w polipeptydzie lub rekombinacji/tasowania różnych mutacji (publikacje WO 95/17413, WO 95/22625), po których następuje selekcjonowanie pod kątem funkcjonalnego polipeptydu, a następnie sekwencjonowanie mutagenizowanych polipeptydów w celu określenia zakresu dopuszczal10
PL 198 507 B1 nych podstawień w każdej pozycji. Inne metody, które można stosować, obejmują prezentację na fagach (np. Lowman i inni, Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner i inni, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5223409; Huse, publikacja WIPO WO 92/06204) i mutagenezę ukierunkowaną wobec regionu (Derbyshire i inni, Gene 46:145, 1986; Ner i inni, DNA 7:127, 1988).
Ujawnione powyżej metody mutagenezy/tasowania mutacji można łączyć z automatycznymi metodami przeszukiwania o wysokiej przepustowości w celu wykrywania aktywności sklonowanych, mutagenizowanych polipeptydów w komórkach gospodarza. Mutagenizowane cząsteczki DNA, które kodują aktywne polipeptydy, można odzyskiwać z komórek gospodarza i szybko sekwencjonować stosując nowoczesną aparaturę. Metody te umożliwiają szybkie określanie ważności poszczególnych reszt aminokwasowych w polipeptydzie będącym przedmiotem zainteresowania i można je stosować wobec polipeptydów o nieznanej strukturze.
Stosując metody przedstawione powyżej fachowiec może identyfikować i/lub otrzymywać różne polipeptydy, które są zasadniczo homologiczne do reszt od 28 do 341 w SEQ ID NO: 8, które zachowują aktywność białka typu dzikiego w degradacji pektyny.
Ponadto, wynalazek dotyczy w jednym aspekcie enzymu liazy pektynianowej zawierającego sekwencję aminokwasową w pozycji 28-341 sekwencji SEQ ID NO: 8 lub sekwencję aminokwasową otrzymaną z niej przez delecję, zastąpienie lub addycję jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych (poniżej określane jako mutacje), z tym, że liaza pektynianowa nie ulega inaktywacji i mutacja zachowuje reszty arginin w pozycji 233 i 238 (R233 i R238) sekwencji SEQ ID NO: 8. Stopień mutacji również nie jest szczególnie ograniczony, z tym, że zachowane zostają opisane powyżej reszty R233 i R238. Korzystnie, pomiędzy takimi wariantami mutacyjnymi natywnego lub macierzystego enzymu liazy pektynianowej istnieje 70% lub wyższa homologia obliczana dla dojrzałej sekwencji z sekwencji SEQ ID NO: 8. Korzystniej, homologia jest 80% lub wyższa.
Enzym rozkładający pektynę może, poza rdzeniem enzymatycznym zawierającym domenę katalityczną, zawierać również domenę wiążącą celulozę (CBD), przy czym domena wiążąca celulozę i rdzeń enzymatyczny (domena aktywna katalitycznie) enzymu są funkcjonalnie połączone. Domena wiążąca celulozę (CBD) może istnieć jako integralna część kodowanego enzymu, albo do enzymu rozkładającego pektynę można wprowadzić CBD innego pochodzenia, w ten sposób tworząc hybrydę enzymatyczną. W tym kontekście, termin „domena wiążąca celulozę należy w zamierzeniu rozumieć w sposób zdefiniowany w Peter Tomme i inni, „Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties, w: „Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates, John N. Saddler i Michael H. Penner (red.), ACS Symposium Series, Nr 618, 1996. Definicja ta klasyfikuje ponad 120 domen wiążących celulozę w 10 rodzin (I-X) i wykazuje, że CBD występują, w różnych enzymach, takich jak celulazy, ksylanazy, mannanazy, arabinofuranozydazy, acetyloesterazy i chitynazy. CBD stwierdzono u glonów, np. krasnorostu Porphyra purpurea jako niehydrolityczne białko wiążące polisacharydy, patrz Tomme i inni, op. cit. Jednakże, większość CBD pochodzi z celulaz i ksylanaz; CBD występują na końcach N i C białek lub położone są wewnątrz sekwencji. Hybrydy enzymatyczne są znane nauce, patrz np. publikacje WO 90/00609 i WO 95/16782, i można je otrzymywać przez transformowanie komórki gospodarza konstruktem DNA zawierającym co najmniej fragment DNA kodujący domenę wiążącą celulozę, zligowany, z łącznikiem lub bez niego, z sekwencją DNA kodującą enzym rozkładający pektynę, oraz hodowanie komórki gospodarza w celu uzyskania ekspresji genu fuzyjnego. Hybrydy enzymatyczne można opisać następującym wzorem:
CBD - MR - X w którym CBD jest N-końcowym lub C-końcowym regionem sekwencji aminokwasowej odpowiadającym co najmniej jednej domenie wiążącej celulozę; MR jest regionem środkowym (łącznikiem) i może być wiązaniem lub krótką grupą łączącą, korzystnie od około 2 do około 100 atomów węgla, korzystniej od 2 do 40 atomów węgla; lub korzystnie od około 2 do około 100 aminokwasów, korzystniej od 2 do 40 aminokwasów; a X jest N-końcowym lub C-końcowym regionem enzymu rozkładającego pektynę według wynalazku.
Korzystnie, enzym według wynalazku wykazuje maksimum swojej aktywności katalitycznej przy pH co najmniej 8, korzystniej co najmniej 8,5, korzystniej co najmniej 9, korzystniej co najmniej 9,5, korzystniej co najmniej 10, jeszcze korzystniej co najmniej 10,5, zwłaszcza co najmniej 11, i korzystnie maksimum aktywności enzymu uzyskuje się w temperaturze co najmniej 50°C, korzystniej co najmniej 55°C.
Wytwarzanie białka
Polipeptydy według wynalazku, włącznie z białkami pełnej długości, ich fragmentami oraz białkami fuzyjnymi, można wytwarzać w zmodyfikowanych technikami inżynierii genetycznej komórkach
PL 198 507 B1 gospodarza zgodnie ze zwykłymi technikami. Odpowiednimi komórkami gospodarza są te rodzaje komórek, które można transformować lub transfekować egzogennym DNA i namnażać w hodowli, i obejmują one bakterie, komórki grzybowe oraz komórki wyższych organizmów eukariotycznych w hodowlach. Korzystne są komórki bakteryjne, szczególnie hodowane komórki organizmów Gramdodatnich. Szczególnie korzystne są komórki Gram-dodatnie z rodzaju Bacillus, takie jak Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis, Bacillus agaradhaerens, a w szczególności Bacillus licheniformis. ATCC 14580 jest typem szczepu Bacillus licheniformis.
Techniki manipulowania sklonowanymi cząsteczkami DNA oraz wprowadzania egzogennego DNA do różnych komórek gospodarza ujawniono w Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel i inni (red.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987; oraz Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim i inni, 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C., wszystkie te publikacje włącza się do opisu jako odnośniki literaturowe.
Ogólnie, sekwencja DNA kodująca liazę pektynianową według wynalazku jest funkcjonalnie połączona z innymi elementami genetycznymi wymaganymi do jej ekspresji, ogólnie zawierającymi promotor i terminator transkrypcji w wektorze ekspresyjnym. Wektor będzie również często zawierał jeden lub większą liczbę markerów selekcyjnych oraz jedno lub większą liczbę miejsc początku replikacji, chociaż fachowcy będą wiedzieć, że w niektórych układach markery selekcyjne można dostarczać w oddzielnych wektorach, a replikację egzogennego DNA można osiągnąć przez integrację z genomem komórki gospodarza. Wybór promotorów, terminatorów, markerów selekcyjnych, wektorów i innych elementów jest czynnością rutynową pozostającą w zakresie umiejętności fachowca. Wiele takich elementów opisano w literaturze i jest dostępnych u dostawców.
W celu skierowania polipeptydu na szlak sekrecyjny komórki gospodarza, w wektorze ekspresyjnym zapewnia się sekwencję sygnałową sekrecji (znaną również jako sekwencja liderowa, preprosekwencja lub presekwencja). Sekwencja sygnałowa sekrecji może pochodzić z polipeptydu lub z innego białka ulegającego sekrecji, bądź może zostać zsyntetyzowana de novo. Znane są liczne sekwencje sygnałowe sekrecji i dla dalszego opisu odpowiednich sekwencji sygnałowych sekrecji należy się odnieść do pozycji literaturowej Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim i inni, 1993, American Society for Microbiology, Washington D. C.; oraz S. M. Cutting (red.), „Molecular Biological Methods for Bacillus. John Wiley and Sons, 1990. Sekwencję sygnałową sekrecji łączy się z sekwencją DNA we właściwej ramce odczytu. Sekwencje sygnałowe sekrecji powszechnie zlokalizowane są po stronie 5' sekwencji DNA kodującej polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania, chociaż niektóre sekwencje sygnałowe mogą być umiejscowione gdzie indziej w sekwencji DNA będącej przedmiotem zainteresowania (patrz, np. Welch i inni, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5037743; Holland i inni, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5143830).
Stransformowane lub stransfekowane komórki gospodarza hoduje się zgodnie ze zwykłymi procedurami w podłożu hodowlanym zawierającym składniki odżywcze oraz inne składniki wymagane do wzrostu wybranych komórek gospodarza. Znane są różne odpowiednie podłoża, włącznie z podłożami zdefiniowanymi i podłożami złożonymi, i zazwyczaj zawierają one źródło węgla, źródło azotu, aminokwasy niezbędne, witaminy i składniki nieorganiczne. Podłoża mogą również zawierać takie składniki, jak czynniki wzrostowe lub surowicę, jeśli są potrzebne. Podłoże wzrostowe będzie generalnie selekcjonować komórki zawierające egzogennie dodany DNA poprzez np. selekcjonowanie lekiem lub niedoborem niezbędnego składnika odżywczego, który jest komplementowany przez marker selekcyjny zawarty w wektorze ekspresyjnym lub wprowadzonym przez kotransfekcję do komórki gospodarza.
Polipeptydy według wynalazku można również wytwarzać przez fermentację szczepu typu dzikiego, należącego do rodzaju Bacillus, korzystnie szczepu, który można wybrać z grupy obejmującej gatunki Bacillus licheniformis i blisko spokrewnione gatunki Bacillus, przy czym wszystkie gatunki są w co najmniej 99% homologiczne do Bacillus licheniformis w oparciu o dopasowane sekwencje rDNA 16S. Szczególnymi i bardzo korzystnymi przykładami są Bacillus licheniformis ATCC 14580.
Ponadto, polipeptydy według wynalazku można wytwarzać przez fermentację mutanta lub wariantu pochodzącego od wymienionego powyżej szczepu. Taki mutant można otrzymać przez zastosowanie zwykłych technik i dobór mutantów zapewniających wyższą aktywność pektynazową.
Fermentację można przeprowadzić przez hodowanie szczepu w warunkach tlenowych w podłożu odżywczym zawierającym źródła węgla i azotu, wraz z innymi niezbędnymi składnikami odżyw12
PL 198 507 B1 czymi, przy czym skład podłoża jest zgodny ze znanymi w tej dziedzinie zasadami. Podłoże może być złożonym, bogatym podłożem lub podłożem minimalnym. Źródło azotu może mieć charakter nieorganiczny i/lub organiczny. Odpowiednimi nieorganicznymi źródłami azotu są azotany i sole amonowe. Spośród organicznych źródeł azotu w fermentacjach z reguły stosuje się sporą ich liczbę. Przykładowo wymienić można mączkę sojową, kazeinę, kukurydzę, namok kukurydziany, ekstrakt drożdżowy, mocznik i albuminę. Odpowiednimi źródłami węgla są węglowodany lub materiały zawierające węglowodany. Korzystne podłoże odżywcze zawiera pektynian, kwas poligalakturonowy i/lub w większym lub mniejszym stopniu zestryfikowaną pektynę jako źródło węgla i/lub induktor wytwarzania pektynazy. Alternatywnie, podłoże zawiera materiał bogaty w pektynę, taki jak mączkę sojową, miazgę jabłkową lub skórki owoców cytrusowych.
Ponieważ gatunki Bacillus według wynalazku są alkalofilne, hodowlę korzystnie prowadzi się przy zasadowych wartościach pH, takich jak pH co najmniej 8 lub pH co najmniej 9, które można uzyskać przez dodanie odpowiednich buforów, takich jak węglan sodu lub mieszaniny węglanu sodu i wodorowęglanu sodu, po wyjałowieniu podłoża wzrostowego.
Uważa się, że wynikiem fermentacji szczepu typu dzikiego lub mutanta w odpowiednim podłożu może być wydajność co najmniej 0,5 g białka pektynazy na litr brzeczki hodowlanej, lub nawet co najmniej 1 g/litr bądź 2 g/litr.
Wydzielanie białka
Jeśli ulegający ekspresji polipeptyd dzikiego typu lub zrekombinowany ulega sekrecji, polipeptyd można oczyszczać z podłoża hodowlanego. Korzystnie, przed oczyszczaniem polipeptydu z podłoża usuwa się komórki gospodarza, w których zachodzi ekspresja (np. przez odwirowanie).
Jeśli ulegający ekspresji polipeptyd nie ulega sekrecji z komórki gospodarza, komórki gospodarza korzystnie rozbija się i uwalnia polipeptyd do wodnego „ekstraktu, co stanowi pierwszy etap takich technik oczyszczania. Korzystnie, przed rozbiciem komórek, komórki gospodarza, w których zachodzi ekspresja, usuwa się z podłoża (np. przez odwirowanie).
Rozbijanie komórek można prowadzić zwykłymi technikami, takimi jak trawienie lizozymem lub działanie na komórki wysokim ciśnieniem. Dalszy opis takich technik rozbijania komórek można znaleźć w K. Scobes, Protein Purification, wydanie 2, Springer-Verlag.
Niezależnie od tego, czy ulegające ekspresji zrekombinowane polipeptydy (lub polipeptydy chimeryczne) ulegają sekrecji, czy nie, można je oczyszczać stosując frakcjonowanie i/lub zwykłe metody i środki oczyszczania.
Do frakcjonowania próbek można stosować wytrącanie siarczanem amonu i ekstrakcję kwaśną lub chaotropową. Przykładowe etapy oczyszczania mogą obejmować chromatografię na hydroksyapatycie, sączenie molekularne, FPLC oraz wysokosprawną chromatografię cieczową w układzie faz odwróconych. Odpowiednie złoża anionowymienne obejmują pochodne dekstranu, agarozy, celulozy, poliakryloamidu, specjalnych krzemionek itp. Korzystne są pochodne PEI, DEAE, QAE i Q, przy czym szczególnie korzystna jest DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Przykładowe złoża chromatograficzne obejmują złoża przeprowadzone w pochodne grupami fenylowymi, butylowymi lub oktylowymi, takie jak Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) i podobne; lub żywice poliakrylowe, takie jak, Amberchrom CG 71 (Toso Haas) i podobne. Odpowiednie stałe nośniki obejmują perełki szklane, żywice oparte na krzemionce, żywice celulozowe, perełki agarozowe, perełki z usieciowanej agarozy, perełki polistyrenowe, usieciowane żywice poliakryloamidowe itp., które są nierozpuszczalne w warunkach, do stosowania w których są przeznaczone. Nośniki te można modyfikować grupami reaktywnymi, które umożliwiają przyłączanie białek poprzez grupy aminowe, grupy karboksylowe, grupy sulfhydrylowe, grupy hydroksylowe i/lub reszty węglowodanowe. Przykłady chemicznych reakcji sprzęgania obejmują aktywację bromocyjanem, aktywację N-hydroksysukcynimidem, aktywację epoksydami, aktywację resztami sulfhydrylowymi, aktywację hydrazydem oraz pochodne karboksylowe i aminowe do chemicznego sprzęgania karbodiimidami. Te i inne stałe złoża są dobrze znane i szeroko stosowane, oraz dostępne są u dostawców.
Wybór określonej metody jest czynnością rutynową i częściowo zdeterminowany jest właściwościami wybranego nośnika. Patrz np. Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Szwecja, 1988.
Polipeptydy według wynalazku lub ich fragmenty można również wytwarzać drogą syntezy chemicznej. Polipeptydy według wynalazku mogą być monomerami lub multimerami; mogą być glikoPL 198 507 B1 zylowane bądź nieglikozylowane, modyfikowane PEG bądź niemodyfikowane PEG i mogą zawierać lub nie zawierać początkowej reszty aminokwasowej metioniny.
Sposób wytwarzania preparatu enzymu według wynalazku obejmuje hodowanie mikroorganizmu zdolnego do wytwarzania liazy pektynianowej w warunkach umożliwiających wytwarzanie enzymu, oraz odzyskiwanie enzymu z hodowli. Hodowlę można prowadzić stosując zwykłe techniki fermentacji, np. hodowanie w wytrząsanych kolbach lub fermentorach z mieszaniem dla zapewnienia dostatecznego napowietrzenia podłoża wzrostowego pobudzającego wytwarzanie enzymu liazy pektynianowej. Podłoże wzrostowe może zawierać zwyczajne źródło azotu, takie jak pepton, ekstrakt drożdżowy lub hydrolizat kazeiny, zmniejszoną ilość zwykłego źródła węgla, takiego jak dekstroza lub sacharoza, oraz induktor, taki jak pektynian lub pektynę, bądź złożone substraty roślinne, takie jak otręby zbożowe (np. otręby pszenne lub łuski ryżu). Odzyskiwanie można prowadzić stosując zwykłe techniki, np. rozdzielania biomasy i supernatantu przez wirowanie lub filtrację, odzyskiwania supernatantu lub, jeśli enzym będący przedmiotem zainteresowania jest wewnątrzkomórkowy, rozbijania komórek, po którym następuje ewentualnie dalsze oczyszczanie, jak opisano w europejskim opisie patentowym numer 0406314, lub krystalizacja, jak opisano w publikacji WO 97/15660.
W jeszcze innej postaci wynalazek dotyczy wyizolowanego enzymu rozkł adają cego pektynę , wykazującego właściwości opisane powyżej i wolnego od homologicznych zanieczyszczeń oraz wytworzonego z zastosowaniem zwykłych technik rekombinacji.
Rośliny transgeniczne
Wynalazek umożliwia również konstruowanie rośliny transgenicznej, części rośliny lub komórki roślinnej poprzez transformowanie sekwencją DNA kodującą enzym rozkładający pektynę według wynalazku, tak aby zachodziła w nich ekspresja i aby wytwarzały one enzym w ilościach możliwych do odzyskania. Enzym można odzyskiwać z rośliny lub części rośliny. Alternatywnie, roślinę lub część rośliny zawierającą zrekombinowany enzym można stosować jako taką.
Roślina transgeniczna może być dwuliścienna lub jednoliścienna. Przykładami roślin jednoliściennych są trawy, takie jak wiechlina łąkowa (wyklina łąkowa, Poa), trawy pastewne, takie jak kostrzewa (Festuca), życica (Lolium), trawy klimatu umiarkowanego, takie jak mietlica (Agrostis), oraz zboża, np. pszenica, owies, żyto, jęczmień, ryż, sorgo i kukurydza.
Przykładami roślin dwuliściennych są tytoń, rośliny strączkowe, takie jak łubin, ziemniaki, burak cukrowy, groch, fasola i soja oraz rośliny krzyżowe (rodzina roślin kapustowatych, Brassicaceae), takie jak kalafior, rzepak i blisko spokrewniony organizm modelowy, Arabidopsis thaliana.
Przykładami części roślin są łodyga, kalus, liście, korzenie, owoce, nasiona i bulwy. W niniejszym kontekście, również specyficzne tkanki roślinne, takie jak chloroplast, apoplast, mitochondria, wakuole, peroksysomy i cytoplazma, uważa się za część rośliny. Ponadto, jakąkolwiek komórkę roślinną, pochodzącą z jakiejkolwiek tkanki, uważa się za część rośliny.
Pojęcie rośliny transgeniczne obejmuje również potomstwo takich roślin, części roślin i komórek roślinnych.
Roślinę transgeniczną lub komórkę roślinną, w których zachodzi ekspresja enzymu według wynalazku, można konstruować zgodnie ze znanymi metodami. W skrócie, roślinę lub komórkę roślinną konstruuje się przez wprowadzenie jednego lub większej liczby konstruktów ekspresyjnych kodujących enzym według wynalazku do genomu rośliny gospodarza i hodowanie otrzymanej w ten sposób zmodyfikowanej rośliny lub komórki roślinnej z otrzymaniem transgenicznej rośliny lub komórki roślinnej.
Dogodnie, konstruktem ekspresyjnym jest konstrukt DNA, który zawiera gen kodujący enzym według wynalazku w umożliwiającym działanie połączeniu z odpowiednimi sekwencjami regulatorowymi wymaganymi do ekspresji genu w wybranej roślinie lub części rośliny. Ponadto, konstrukt ekspresyjny może zawierać marker selekcyjny użyteczny do identyfikowania komórek gospodarza, w których został zintegrowany konstrukt ekspresyjny, oraz sekwencje DNA konieczne do wprowadzenia tego konstruktu do rośliny będącej przedmiotem zainteresowania (te ostatnie zależą od metody wprowadzania DNA, która ma być zastosowana).
Wybór sekwencji regulatorowych, takich jak sekwencje promotorowe i terminatorowe oraz ewentualnie sekwencje sygnałowe lub tranzytowe, zdeterminowany jest np. tym, kiedy, gdzie i w jakiej ilości pożądana jest ekspresja enzymu. Tak np. ekspresja genu kodującego enzym według wynalazku może być konstytutywna lub indukowalna, bądź może być specyficzna rozwojowo, w zależności od stadium lub tkankowo, oraz produkt genu może być ukierunkowany wobec określonej tkanki lub części rośliny, takiej jak nasiona lub liście. Sekwencje regulatorowe opisali np. Tague i inni, w Plant Phys., 86, 506, 1988.
PL 198 507 B1
Do konstytutywnej ekspresji można zastosować promotor 35S-CaMV (Franck i inni, 1980, Cell 21: 285-294). Promotorami specyficznymi wobec organu mogą być na przykład promotor z tkanek spichrzowych, takich jak nasiona, bulwy ziemniaczane i owoce (Edwards i Corruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24: 275-303) lub z tkanek aktywnych metabolicznie, takich jak merystemy (Ito i inni, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), promotor specyficzny wobec nasion, taki jak promotor gluteliny, prolaminy, globuliny lub albuminy z ryżu (Wu i inni, Plant and Cell Physiology, tom 39, nr 8, str. 885-889 (1998), promotor leguminy B4 Vicia faba i genu nieznanego białka nasion Vicia faba, opisany w U. Conrad i inni, Journal of Plant Physiology, tom 152, nr 6, str. 708-711 (1998), promotor białka ciał oleistych nasion (Chen i inni, Plant and Cell Physiology, tom 39, nr 9, str. 935-941 (1998), promotor białka zapasowego napA Brassica napus lub jakiekolwiek inne znane, specyficzne dla nasion promotory, np. opisane w publikacji WO 91/14772. Ponadto, promotorem może być promotor specyficzny dla liści, taki jak promotor rbcs z ryżu lub pomidora (Kyozuka i inni, Plant Physiology, tom 102, nr 3, str. 991-1000 (1993), promotor genu metylotransferazy adeninowej wirusa chlorelli (A. Mitra i D. W. Higgins, Plant Molecular Biology, tom 26, nr 1, str. 85-93 (1994) lub promotor genu aldP z ryżu (Kagaya i inni, Molecular and General Genetics, tom 248, nr 6, str. 668-674 (1995), bądź promotor indukowany ranami, taki jak promotor pin2 ziemniaka (Xu i inni, Plant Molecular Biology, tom 22, nr 4, str. 573-588 (1993).
Do uzyskania wyższej ekspresji enzymu w roślinie można zastosować element wzmacniający promotor. Tak np. elementem wzmacniającym promotor może być intron, który umieszczony jest pomiędzy promotorem, a sekwencją nukleotydową kodującą enzym. Tak np. Xu i inni, op. cit. ujawniają stosowanie pierwszego intronu genu aktyny 1 ryżu do wzmacniania ekspresji.
Gen markera selekcyjnego oraz inne części konstruktu ekspresyjnego można wybierać spośród dostępnych.
Konstrukt DNA wprowadza się do genomu rośliny zgodnie ze zwykłymi, znanymi technikami, obejmującymi transformację za pośrednictwem Agrobacterium, transformację za pośrednictwem wirusa, mikroiniekcję, bombardowanie cząstkami, transformację biolistyczną oraz elektroporację (Gasser i inni, Science 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto i inni, Nature, 338, 274, 1989).
Obecnie przenoszenie genów za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens jest metodą z wyboru tworzenia transgenicznych roślin dwuliściennych (przeglądu dokonano w Hooykas i Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38), jednakże można ją także stosować do transformowania roślin jednoliściennych, chociaż dla tych roślin generalnie korzystne są inne metody transformacji. Obecnie metodą z wyboru tworzenia transgenicznych roślin jednoliściennych jest bombardowanie cząstkami (mikroskopijnymi cząstkami złota lub wolframu pokrytymi transformującym DNA) zarodkowego kalusa lub rozwijających się zarodków (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil i inni, 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Alternatywna metoda transformowania roślin jednoliściennych oparta jest na transformacji protoplastów, jak opisali S. Omirulleh i inni w Plant Molecular Biology, tom 21, nr 3, str. 415-428 (1993).
Po transformacji selekcjonuje się transformanty zawierające wprowadzony konstrukt ekspresyjny i regeneruje się całe rośliny zgodnie z dobrze znanymi metodami.
Preparat enzymu
W niniejszym kontekście, termin „preparat enzymu w zamierzeniu oznacza albo produkt zwykłej fermentacji enzymatycznej pojedynczego mikroorganizmu, ewentualnie wyizolowany i oczyszczony, przy czym preparat taki zazwyczaj zawiera liczne różne aktywności enzymatyczne; albo mieszaninę jednoskładnikowych enzymów, korzystnie enzymów otrzymanych z gatunków bakteryjnych lub grzybowych przy użyciu zwykłych technik rekombinacji, które to enzymy otrzymano w wyniku fermentacji i, ewentualnie, wyizolowano oraz oczyszczono oddzielnie, które mogą pochodzić z różnych gatunków, korzystnie gatunków grzybowych lub bakteryjnych; albo produkt fermentacji mikroorganizmu, który działa jako komórka gospodarza do ekspresji zrekombinowanego enzymu rozkładającego pektynę, ale który to mikroorganizm wytwarza jednocześnie inne enzymy, np. inne enzymy rozkładające pektynę, proteazy lub celulazy, będące naturalnie występującymi produktami fermentacji mikroorganizmu, tj. kompleks enzymów konwencjonalnie wytwarzany przez odpowiadający mikroorganizm występujący naturalnie.
Preparat enzymu rozkładającego pektynę według wynalazku może ponadto zawierać jeden lub większą liczbę enzymów wybranych z grupy składającej się z proteaz, celulaz (endo-e-1,4-glukanaz), β-glukanaz (endo-e-1,3(4)-glukanaz), lipaz, kutynaz, peroksydaz, lakkaz, amylaz, glukoamylaz, pektynaz, reduktaz, oksydaz, fenolooksydaz, ligninaz, pululanaz, arabinanaz, hemicelulaz, mannanaz, ksyloglukanaz, ksylanaz, acetyloesteraz pektynowych, acetyloesteraz ramnogalakturonanowych, poligaPL 198 507 B1 lakturonaz, ramnogalakturonaz, galaktanaz, liaz pektanianowych, liaz pektynowych, metyloesteraz pektynowych, celobiohydrolaz, transglutaminaz lub ich mieszanin. W korzystnej postaci jeden lub większą liczbę, bądź wszystkie enzymy w preparacie wytwarza się stosując techniki rekombinacji, tj. jeden lub większą liczbę enzymów stanowią jednoskładnikowe enzymy, które są zmieszane z innymi enzymami, tworząc preparat enzymu o żądanym składzie enzymów.
Immunologiczna reaktywność krzyżowa
Przeciwciała poliklonalne (które są monospecyficzne wobec białka danego enzymu) przeznaczone do stosowania w określaniu immunologicznej reaktywności krzyżowej można otrzymywać przez zastosowanie oczyszczonego enzymu rozkładającego pektynę. W szczególności antysurowicę skierowaną przeciw enzymowi rozkładającemu pektynę według wynalazku można wywołać przez immunizowanie królików (lub innych gryzoni) zgodnie z procedurą opisaną w Axelsen i inni, w: A Manuał of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, rozdział 23, lub A. Johnstone i R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (w szczególności str. 27-31). Z antysurowic można otrzymywać oczyszczone immunoglobuliny, na przykład przez wytrącanie solą ((NH4)2SO4), po którym następuje dializa i chromatografia jonowymienna, np. na DEAE-Sephadex. Immunochemicznej charakterystyki białek można dokonywać albo przez analizę metodą podwójnej dyfuzji Outcherlony'ego (O. Ouchterlony, w: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, red.), Blackwell Scientific Publications, 1967, str. 655-706), przez immunoelektroforezę krzyżową (N. Axelsen i inni, supra, rozdziały 3 i 4), bądź przez immunoelektroforezę rakietkową (N. Axelsen i inni, rozdział 2).
Stosowanie w przemyśle wytwarzania detergentów i środków czystości
W dalszych postaciach wynalazek dotyczy kompozycji detergentowej zawierającej enzym rozkładający pektynę lub preparat enzymu według wynalazku, do prania tkanin w pralkach, obejmującego działanie na tkaninę podczas cyklu prania pralki, roztworem piorącym zawierającym enzym rozkładający pektynę lub preparat enzymu według wynalazku, oraz kompozycji czyszczących, obejmujących środki czyszczące do prania, zawierających enzym rozkładający pektynę lub preparat enzymu według wynalazku, zapewniających ulepszone właściwości czyszczące, tj. lepsze usuwanie plam.
Nie ograniczając się tą teorią, uważa się, że mannanaza jest zdolna do efektywnego rozkładania lub hydrolizowania jakichkolwiek zabrudzeń lub plam zawierających galaktomannany i, zgodnie z tym, do czyszczenia pranego wsadu zabierają cego takie zabrudzenia lub plamy.
Kompozycje czyszczące według wynalazku muszą zawierać co najmniej jeden dodatkowy składnik detergentowy. Dokładny charakter tych dodatkowych składników oraz ilości w jakich będą wprowadzane, zależeć będą od fizycznej postaci kompozycji oraz od charakteru operacji czyszczenia, do stosowania w której jest ona przeznaczona.
Kompozycje czyszczące według wynalazku korzystnie zawierają ponadto składnik detergentu wybrany spośród wybranego środka powierzchniowo czynnego, innego enzymu, wypełniacza aktywnego i/lub układu bielącego.
Kompozycje czyszczące według wynalazku mogą być w postaci płynu, pasty, żeli, kostek, tabletek, aerozolu, piany, proszku lub granulatu. Granulaty mogą mieć również postać „zagęszczoną, a kompozycje płynne mogą mieć również postać „zatężoną.
Kompozycjom według wynalazku można np. nadawać postać kompozycji do ręcznego i maszynowego mycia naczyń, kompozycji detergentowych do prania ręcznego i w pralkach, włącznie z kompozycjami dodatków do prania, oraz kompozycji odpowiednich do stosowania w namaczaniu i/lub wstępnej obróbce zaplamionych tkanin, kompozycji zmiękczających dodawanych do płukania tkanin i kompozycji do stosowania ogólnie w domowych procesach czyszczenia twardych powierzchni. Kompozycjom zawierającym takie karbohydrazy można również nadawać postać produktów odkażających, środków czyszczących szkła kontaktowe oraz produktów ochrony zdrowia i produktów kosmetycznych, takich jak kompozycje do ochrony jamy ustnej/zębów i higieny osobistej.
Jeśli kompozycjom nadaje się postać do stosowania w sposobach ręcznego mycia naczyń, kompozycje według wynalazku korzystnie zawierają środek powierzchniowo czynny i korzystnie inne związki detergentowe wybrane spośród organicznych związków polimerycznych, środków intensyfikujących pienienie, jonów metali z grupy II, rozpuszczalników, hydrotropów i dodatkowych enzymów.
Jeśli kompozycjom nadaje się postać odpowiednią do stosowania w sposobach prania w pralkach, kompozycje według wynalazku korzystnie zawierają zarówno środek powierzchniowo czynny, jak i wypełniacz aktywny, oraz dodatkowo jeden lub większą liczbę składników detergentowych, korzystnie wybranych spośród organicznych związków polimerycznych, środków bielących, dodatkowych
PL 198 507 B1 enzymów, środków gaszących pianę, dyspergatorów, dyspergatorów typu mydła wapniowego, środków zawieszających zabrudzenia i zapobiegających powtórnemu osadzaniu się brudu, oraz inhibitorów korozji. Kompozycje do prania mogą również zawierać środki zmiękczające jako dodatkowe składniki detergentowe. Takie kompozycje zawierające karbohydrazy, jeśli nadaje się im postać detergentowych kompozycji do prania, mogą zapewniać czyszczenie tkanin, usuwanie plam, utrzymanie bieli, zmiękczanie, utrzymywanie barw, hamowanie przenoszenia się barwnika i odkażanie.
Kompozycje według wynalazku można również stosować jako produkty stanowiące dodatki detergentowe w postaci stałej lub płynnej. Takie produkty stanowiące dodatki przeznaczone są do uzupełniania lub zwiększania działania zwykłych kompozycji detergentowych i można je dodawać na jakimkolwiek etapie procesu czyszczenia.
Jeśli zachodzi taka potrzeba, gęstość kompozycji detergentowych do prania według niniejszego opisu pozostaje w zakresie 400 - 1200 g/litr, korzystnie 500 - 950 g/litr kompozycji, przy pomiarze w temperaturze 20°C.
Termin „zagęszczona postać kompozycji według opisu najlepiej odzwierciedla gęstość i, w odniesieniu do składu, ilość nieorganicznych soli wypełniających; nieorganiczne sole wypełniające są zwykłymi składnikami kompozycji detergentowych w postaci proszku; w zwykłych kompozycjach detergentowych sole wypełniające obecne są w znacznych ilościach, zazwyczaj 17 - 35% wagowych całej kompozycji. W zagęszczonych kompozycjach sól wypełniająca obecna jest w ilości nie przekraczającej 15% całej kompozycji, korzystnie nie przekraczającej 10%, najkorzystniej nie przekraczającej 5% wagowych kompozycji. Nieorganiczne sole wypełniające, takie jak przeznaczone do kompozycji według wynalazku, wybiera się spośród siarczanów i chlorków metali alkalicznych i ziem alkalicznych. Korzystną solą wypełniającą jest siarczan sodu.
Płynne kompozycje detergentowe według wynalazku mogą mieć także „postać zatężoną; w takim przypadku, płynne kompozycje detergentowe według wynalazku zawierać będą mniejszą ilość wody w porównaniu ze zwykłymi płynnymi detergentami. Zazwyczaj zawartość wody w zatężonym płynnym detergencie jest korzystnie niższa niż 40%, korzystniej niższa niż 30%, najkorzystniej niższa niż 20% wagowych kompozycji detergentowej.
Odpowiednie specyficzne związki detergentowe do stosowania zgodnie z wynalazkiem wybiera się z grupy obejmującej konkretne związki, jak opisano w publikacji WO 97/01629, którą włącza się w całości do opisu jako odnośnik literaturowy.
Mannanazę można wprowadzać do kompozycji czyszczących według wynalazku korzystnie na poziomie 0,0001% - 2%, korzystniej 0,0005% - 0,5%, najkorzystniej 0,001% - 0,1% czystego enzymu w stosunku do wagi kompozycji.
Celulazy użyteczne w niniejszym wynalazku obejmują zarówno celulazy bakteryjne, jak i grzybowe. Korzystnie, wykazywać one będą optimum pH pomiędzy 5 a 12 i aktywność właściwą powyżej 50 CEVU/mg (jednostek lepkości celulozy). Odpowiednie celulazy ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4435307, japońskim opisie patentowym nr 61078384 oraz w publikacji WO 96/02653, które ujawniają grzybową celulazę wytwarzaną odpowiednio z Humicola insolens, Trichoderma, Thielavia i Sporotrichum. Publikacja EP 739982 opisuje celulazy wyizolowane z nowego gatunku Bacillus. Odpowiednie celulazy ujawniono również w brytyjskim zgłoszeniu patentowym nr 2075028; brytyjskim zgłoszeniu patentowym nr 2095275; w DE-OS-2247832 oraz w publikacji WO 95/26398.
Przykładami takich celulaz są celulazy wytwarzane przez szczep Humicola insolens (Humicola grisea var. thermoidea), szczególnie szczep DSM 1800 Humicola insolens. Innymi odpowiednimi celulazami są celulazy pochodzące z Humicola insolens, o masie cząsteczkowej około 50000 (50 kD), o punkcie izoelektrycznym 5,5 i zawierające 415 amiokwasów oraz endo-e-1,4-glukanaza o masie cząsteczkowej około 43000 (43 kD) pochodząca z Humicola insolens DSM 1800; korzystna celulaza zawiera sekwencję aminokwasową ujawnioną w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego PCT nr WO 91/17243. Odpowiednimi celulazami są również celulazy EGIII z Trichoderma longibrachiatum, opisane w publikacji WO 94/21801. Szczególnie odpowiednimi celulazami są celulazy wykazujące zalety ochrony barwy. Przykładami takich celulaz są celulazy opisane w publikacji WO 96/29397, europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP 0495257, publikacjach WO 91/17243, WO 91/17244 oraz WO 91/21801. Inne odpowiednie celulazy do ochrony tkanin i/lub o właściwościach czyszczących opisano w publikacjach WO 96/34092, WO 96/17994 oraz WO 95/24471.
Celulazy te zwykle wprowadza się do kompozycji detergentowej w ilości 0,0001% - 2% czystego enzymu w stosunku do wagi kompozycji.
PL 198 507 B1
Korzystnymi celulazami do celów wynalazku są celulazy alkaliczne, tj. enzymy wykazujące co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 40% swojej maksymalnej aktywności przy pH w zakresie 7-12. Korzystniejszymi celulazami są enzymy wykazujące maksimum aktywności przy pH w zakresie 7-12. Korzystną celulazą alkaliczną jest celulaza dostępna pod nazwą handlową Carezyme® przez Novo Nordisk A/S.
Do usuwania plam opartych na węglowodanach można włączyć amylazy (α i/lub β). W publikacji WO 94/02597, Novo Nordisk A/S, z 3 lutego 1994 r., opisano kompozycje czyszczące, które zawierają zmutowane amylazy. Patrz również publikacja WO 95/10603, Novo Nordisk A/S, z 20 kwietnia 1995 r. Inne amylazy znane do stosowania w kompozycjach czyszczących obejmują zarówno α-, jak i β-amylazy. α-Amylazy są znane i obejmują te ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5003257, europejskim opisie patentowym nr EP 252666, publikacji WO 91/00353, francuskim opisie patentowym nr 2676456, europejskim opisie patentowym nr EP 285123, europejskim opisie patentowym nr EP 525610, europejskim opisie patentowym nr EP 368341 oraz brytyjskim opisie patentowym nr 1296839 (Novo). Innymi odpowiednimi amylazami są amylazy o polepszonej stabilości opisane w publikacji WO 94/18314 z 18 sierpnia 1994 r., oraz w publikacji WO 96/05295, Genencor, z 22 lutego 1996 r., oraz warianty amylaz wykazujące dodatkową modyfikację w bezpośrednich postaciach macierzystych, dostępne z Novo Nordisk A/S, ujawnione w publikacji WO 95/10603 z kwietnia 1995 r. Odpowiednie są również amylazy opisane w europejskim opisie patentowym nr EP 277216, oraz w publikacjach WO 95/26397 i WO 96/23876 (wszystkie Novo Nordisk).
Przykładami handlowych produktów α-amylazowych są Purafect Ox Am® z Genencor oraz Termamyl®, Ban®, Fungamyl® i Duramyl®, wszystkie dostępne z Novo Nordisk A/S Dania. W publikacji WO 95/26397 opisano inne odpowiednie amylazy: α-amylazy charakteryzujące się aktywnością właściwą co najmniej o 25% wyższej od aktywności właściwej Termamyl® w zakresie temperatur 25°C - 55°C i przy wartościach pH w zakresie 8 - 10, mierzonej w oznaczeniu aktywności α-amylazy Phadebas®. Odpowiednie są warianty powyższych enzymów, opisane w publikacji WO 96/23873 (Novo Nordisk). Inne enzymy amylolityczne, o ulepszonych właściwościach pod względem poziomu aktywności oraz połączenia termostabilności i wyższego poziomu aktywności opisano w publikacji WO 95/35382.
Korzystnymi amylazami do celów wynalazku są amylazy dostępne pod nazwami handlowymi Termamyl, Duramyl i Maxamyl, oraz wariant α-amylazy wykazujący zwiększoną termostabilność, ujawniony jako SEQ ID No: 2 w publikacji WO 96/23873.
Amylazami korzystnymi do specyficznych zastosowań są amylazy alkaliczne, tj. enzymy wykazujące aktywność enzymatyczną wynoszącą co najmniej 10%, korzystnie co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 40% ich maksymalnej aktywności przy pH w zakresie 7-12. Korzystniejsze amylazy są enzymami wykazującymi maksimum aktywności w zakresie pH 7-12.
Enzymy amylolityczne wprowadza się do kompozycji detergentowych według wynalazku na poziomie 0,0001% - 2%, korzystnie 0,00018% - 0,06%, korzystniej 0,00024% - 0,048% wag. czystego enzymu w kompozycji.
Termin ksyloglukanaza obejmuje rodzinę enzymów opisaną przez Vinckena i Voragena z Wageningen University [Vincken i inni (1994) Plant Physiol., 104, 99-107] i zdolnych do rozkładania ksyloglukanów, jak opisali Hayashi i inni (1989) w Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 139-168. Vincken i inni wykazali usuwanie otoczki ksyloglukanowej z celulozy izolowanych ścian komórkowych jabłka przez ksyloglukanazę oczyszczoną z Trichoderma viride (endo-IV-glukanaza). Enzym ten wzmacnia enzymatyczną degradację celulozy znajdującej się w ścianach komórkowych i synergistycznie współdziała z enzymami rozkładającymi pektynę. Rapidase LIQ+ z Gist-Brocades zawiera aktywność ksyloglukanazy.
Ksyloglukanazę tę wprowadza się do kompozycji czyszczących według wynalazku korzystnie na poziomie 0,0001% - 2%, korzystniej 0,0005% - 0,5%, najkorzystniej 0,001% - 0,1% wag. czystego enzymu w kompozycji.
Korzystnymi ksyloglukanazami do specyficznych zastosowań są ksyloglukanazy alkaliczne, tj. enzymy wykazujące aktywność enzymatyczną wynoszącą co najmniej 10%, korzystnie co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 40% ich maksymalnej aktywności przy pH pozostającym w zakresie 7-12. Korzystniejsze ksyloglukanazy są enzymami wykazującymi maksimum aktywności w zakresie pH 7 - 12.
Wymienione powyżej enzymy mogą być dowolnego pochodzenia, np. pochodzenia roślinnego, zwierzęcego, bakteryjnego, grzybowego lub drożdżowego. Mogą one ponadto pochodzić z mezofili lub ekstremofili (psychrofili, psychrotrofów, termofili, barofili, alkalofili, kwasofili, halofili itp.). Można stosować oczyszczone lub nieoczyszczone postaci tych enzymów. Obecnie, powszechną praktyką jest modyfikowanie enzymów typu dzikiego poprzez białko lub technikami inżynierii białkowej lub ge18
PL 198 507 B1 netycznej, w celu optymalizacji ich skuteczności działania w kompozycjach czyszczących według wynalazku. Tak np. można zaprojektować warianty tak, że zwiększona jest kompatybilność enzymu z powszechnie spotykanymi składnikami takich kompozycji. Alternatywnie, wariant można zaprojektować, tak że optimum pH, stabilność w warunkach środka bielącego lub chelatora, aktywność katalityczna itp., wariantu enzymu jest dopasowana do potrzeb określonego zastosowania do czyszczenia.
W szczególności, powinno się skupić uwagę na aminokwasach wrażliwych na utlenianie w przypadku stabilności w warunkach bielenia i na ładunkach powierzchniowych dla kompatybilności ze środkiem powierzchniowo czynnym. Punkt izoelektryczny takich enzymów można modyfikować przez podstawianie niektórych zawierających ładunek aminokwasów, np. zwiększenie punktu izoelektrycznego może pomóc w poprawie kompatybilności z anionowymi środkami powierzchniowo czynnymi. Stabilność enzymów można dalej wzmacniać przez tworzenie np. dodatkowych mostków solnych i wprowadzenia miejsc wiążących metal w celu zwiększenia stabilności w obecności chelatora.
Stosowanie w przemysłach włókienniczym i przetwórstwa włókien celulozowych
Enzym rozkładający pektynę według wynalazku można stosować w kombinacji z innymi enzymami rozkładającymi węglowodany (na przykład arabinanazą, ksyloglukanazą, pektynazą) do biologicznej obróbki włókien lub do czyszczenia włókien w kombinacji z detergentami. Włókna bawełny składają się z warstwy pierwotnej ściany komórkowej, zawierającej pektynę, oraz drugiej warstwy, zawierającej głównie celulozę. Podczas preparowania bawełny lub oczyszczania bawełny, część pierwotnej ściany komórkowej zostanie usunięta. Wynalazek dotyczy albo wspomagania podczas oczyszczania bawełny przez usuwanie pierwotnej ściany komórkowej, albo podczas czyszczenia bawełny w celu usunięcia pozostających substancji pektynowych i zapobiegania szarzeniu materiału włókienniczego.
W niniejszym kontekście, termin „materiał celulozowy w zamierzeniu oznacza włókna, uszyte i nieuszyte tkaniny, włącznie z dzianinami, materiałami tkanymi, drelichami, przędzami i materiałami na ręczniki, wykonane z bawełny, mieszanek bawełny lub naturalnych bądź syntetycznych tworzyw celulozowych (np. pochodzących z zawierających ksylan włókien celulozowych, takich jak ze ścieru drzewnego) lub ich mieszanek. Przykładami mieszanek są mieszanki bawełny lub sztucznego jedwabiu/wiskozy z jednym lub większą liczbą materiałów towarzyszących, takich jak wełna, włókna syntetyczne (np. włókna poliamidowe, włókna akrylowe, włókna poliestrowe, włókna z polialkoholu winylowego, włókna z polichlorku winylu, włókna z polichlorku winylidenu, włókna poliuretanowe, włókna polimocznikowe, włókna aramidowe) i włókna zawierające celulozę (np. sztuczny jedwab/wiskoza, rami, konopie, len/płótno, juta, włókna z octanu celulozy, lyocell).
Enzym lub preparat enzymu według wynalazku jest użyteczny w przemyśle przetwórstwa włókien celulozowych do obróbki wstępnej lub roszenia włókien z konopi, lnu lub płótna.
Przetwórstwo materiału celulozowego dla przemysłu włókienniczego, jak na przykład włókien bawełny, w materiał gotowy do produkcji odzieży, obejmuje kilka etapów: przędzenie włókna w przędzę, tworzenie tkaniny lub dzianiny z przędzy i dalsze przygotowywanie, farbowanie i operacje wykończeniowe. Tkaniny tworzy się przez wplatanie wątku przędzy pomiędzy osnowę przędzy; przędze mogą być dwóch różnych typów. Dzianiny tworzy się przez utworzenie siatki splecionych oczek z jednej ciągłej przędzy. Włókna celulozowe można również stosować do włókniny.
W procesie przygotowywania preparuje się materiał włókienniczy do właściwej reakcji w operacji farbowania. Podetapami wchodzącymi w proces przygotowywania są:
a. Usuwanie klejonki (dla tkanin) przy zastosowaniu polimerycznej klejonki, takiej jak np. skrobia, CMC lub PVA, którą dodaje się przed tkaniem w celu zwiększenia szybkości tkania; materiał ten musi zostać usunięty przed dalszą obróbką.
b. Obróbka alkaliczna, której celem jest usunięcie niecelulozowego materiału z włókna bawełnianego, szczególnie kutikuli (składającej się głównie z wosków) i pierwotnej ściany komórkowej (składającej się głównie z pektyny, białka i ksyloglukanu). Właściwe usunięcie wosków jest konieczne do uzyskania wysokiej zwilżalności, będącej warunkiem dobrego farbowania. Usunięcie pierwotnej ściany komórkowej - szczególnie pektyn - poprawia usuwanie wosków i zapewnia bardziej równomierne farbowanie. Poprawia to ponadto biel w procesie bielenia. Głównym środkiem chemicznym stosowanym w obróbce alkalicznej jest wodorotlenek sodu o wysokim stężeniu, do 70 g/kg bawełny, w wysokich temperaturach, 80-95°C; oraz
c. Bielenie; zwykle po praniu następuje bielenie z zastosowaniem nadtlenku wodoru jako środka utleniającego, albo w celu otrzymania tkaniny w pełni wybielonej (białej), albo dla zapewnienia czystego odcienia barwy.
PL 198 507 B1
W przemyśle stosuje się również jeden etap połączonego procesu obróbki alkalicznej/bielenia.
Chociaż procesy przygotowywania najczęściej stosuje się na etapie tkaniny, operacje obróbki alkalicznej, bielenia i farbowania można również wykonywać na etapie włókna lub przędzy.
Proces obróbki może mieć charakter periodyczny albo ciągły, z kontaktowaniem tkaniny w postaci rozłożonej albo w postaci pasma, z procesowym strumieniem cieczy. W operacjach ciągłych na ogół wykorzystuje się nasycalnik, za pomocą którego na tkaninę nanosi się w przybliżeniu równą wagowo ilość kąpieli chemicznej, a następnie ogrzewaną komorę, w której zachodzi reakcja chemiczna. Sekcja płukania przygotowuje następnie tkaninę do następnego etapu obróbki. Proces periodyczny zachodzi zasadniczo w jednej kąpieli, w której tkaninę kontaktuje się z kąpielą chemiczną w ilości stanowiącej w przybliżeniu 8-15-krotność wagi tkaniny. Po okresie reakcji chemikalia odprowadza się, tkaninę płucze się i stosuje się następny środek chemiczny. W nieciągłej obróbce z mieszaną kąpielą stosuje się nasycalnik, w którym z tkaniną kontaktuje się w przybliżeniu równą wagowo ilość kąpieli chemicznej w stosunku do wagi tkaniny, po czym następuje okres utrzymywania wsadu, który w przypadku procesu nasycania zimnego może wynosić jeden lub kilka dni.
Tkaniny są rozpowszechnioną postacią wyborów włókienniczych. Proces tkania wymaga „zaklejenia przędzy osnowowej w celu jej ochrony przed ścieraniem. Z uwagi na dostępność i koszty, do przykładowych, typowo stosowanych klejonek, należy skrobia, polialkohol winylowy (PVA), karboksymetyloceluloza, woski i akrylowe środki wiążące. Klejonka musi zostać usunięta po procesie tkania, na pierwszym etapie przygotowywania tkanin. Zaklejoną tkaninę, w postaci pasma lub w postaci rozłożonej, kontaktuje się z cieczą do obróbki, zawierającą środki usuwające klejonkę. Stosowany środek usuwający klejonkę zależy od rodzaju klejonki, która ma być usunięta. W przypadku klejonek PVA często stosuje się gorącą wodę lub proces utleniania. Najbardziej rozpowszechniona klejonka dla tkanin bawełnianych oparta jest na skrobi. Dlatego też, najczęściej, klejonkę z tkanin bawełnianych usuwa się stosując kombinację gorącej wody, enzymu α-amylazy do hydrolizy skrobi oraz środka zwilżającego lub powierzchniowo czynnego. Materiał celulozowy z usuwającymi klejonkę środkami chemicznymi pozostawia się na „okres utrzymywania, dostatecznie długi, do usunięcia klejonki. Okres utrzymywania zależy od charakteru procesu obróbki i temperatury i może wynosić od 15 minut do 2 godzin lub, w niektórych przypadkach, kilku dni. Zazwyczaj usuwające klejonkę środki chemiczne stosuje się w kąpieli w nasycalniku, która zazwyczaj przebiega w temperaturze od około 15°C do około 55°C. Następnie tkaninę trzyma się w urządzeniu, takim jak urządzenie typu „J-box, który zapewnia wystarczającą temperaturę, zazwyczaj pomiędzy około 55°C i około 100°C, dla zwiększenia aktywności środków usuwających klejonkę. Środki chemiczne, włącznie z usuniętymi klejonkami, odmywa się z tkaniny po zakończeniu okresu utrzymywania.
W celu zapewnienia wysokiego stopnia bieli lub dobrej zwilżalności i będącej jej wynikiem podatności na barwienie, klejonki i inne stosowane środki chemiczne muszą zostać dokładnie usunięte. Zazwyczaj uważa się, że skuteczne usunięcie klejonki ma bardzo istotne znaczenie dla następnych procesów obróbki: obróbki alkalicznej i bielenia.
Proces obróbki alkalicznej usuwa wiele niecelulozowych związków normalnie występujących w bawełnie. Poza naturalnymi zanieczyszczeniami niecelulozowymi, obróbka alkaliczna może usuwać brud, plamy i pozostające materiały wprowadzone podczas wytwarzania, takie jak smary pochodzące z przędzenia, stożkowania lub klejenia. W procesie obróbki alkalicznej stosuje się wodorotlenek sodu lub zbliżone środki alkalizujące, takie jak węglan sodu, wodorotlenek potasu, bądź ich mieszaniny. Zazwyczaj do procesu dodaje się stabilny w warunkach alkalicznych środek powierzchniowo czynny dla wzmocnienia solubilizacji związków hydrofobowych i/lub zapobiegania ich ponownemu osadzaniu się na tkaninie. Obróbka przebiega zazwyczaj w wysokiej temperaturze, 80 - 100°C, z użyciem silnie zasadowych roztworów, o pH 13 - 14, jako środków do obróbki alkalicznej. Z powodu niespecyficznego charakteru procesów chemicznych, atakowane są nie tylko zanieczyszczenia, ale i sama celuloza, co prowadzi do osłabienia wytrzymałości lub innych pożądanych właściwości tkaniny. Miękkość tkaniny celulozowej jest funkcją pozostających naturalnych wosków bawełny. Niespecyficzny charakter procesu obróbki alkalicznej w wysokiej temperaturze i silnie zasadowym środowisku powoduje, że niemożliwe jest rozróżnienie pomiędzy pożądanymi naturalnymi substancjami poślizgowymi bawełny, a smarami wprowadzonymi podczas produkcji. Ponadto, zwykły proces obróbki alkalicznej może powodować problemy dla środowiska, ze względu na silnie zasadowe ścieki pochodzące z tych procesów. W etapie obróbki alkalicznej przygotowuje się tkaninę do optymalnej reakcji podczas bielenia. Tkanina po nie właściwie wykonanej obróbce alkalicznej wymagać będzie wyższego poziomu chemicznych środków bielących w prowadzonych następnie etapach bielenia.
PL 198 507 B1
W etapie bielenia następuje odbarwienie naturalnych pigmentów bawełny i usunięcie wszystkich pozostających naturalnych zdrewniałych składników zanieczyszczających bawełnę, nie usuniętych całkowicie podczas odziarniania bawełny, gręplowania lub obróbki alkalicznej. Głównym stosowanym obecnie procesem jest bielenie nadtlenkiem wodoru w warunkach zasadowych. W wielu przypadkach, szczególnie gdy nie jest konieczna bardzo wysoka biel, bielenie można połączyć z obróbką alkaliczną.
W przykładach poniżej wykazano, że etap obróbki alkalicznej można prowadzić z użyciem liazy pektynianowej lub preparatu liazy pektynianowej według wynalazku, w temperaturze około 50°C - 80°C i przy pH około 7 - 11, co zastępuje lub uzupełnia stosowanie wysoce alkalizujących środków. Zoptymalizowany proces enzymatyczny zapewnia wysoki stopień usuwania pektyny i pełną zwilżalność.
Rozkładanie lub modyfikowanie materiału roślinnego
Enzym lub preparat enzymu według wynalazku korzystnie stosuje się jako środek do rozkładania lub modyfikowania ścian komórkowych roślin lub jakiegokolwiek zawierającego pektynę materiału pochodzącego ze ścian komórkowych roślin w wyniku wysokiej aktywności rozkładania ścian komórkowych roślin enzymu według wynalazku.
Enzym rozkładający pektynę według wynalazku można stosować sam lub łącznie z innymi enzymami, w rodzaju glukanaz, pektynaz i/lub hemicelulaz, do poprawy ekstrakcji oleju z bogatego w olej materiału roś linnego, takiego jak oleju sojowego z soi, oliwy z oliwek lub oleju rzepakowego z rzepaku bąd ź oleju słonecznikowego ze słonecznika.
Enzym rozkładający pektynę według wynalazku można stosować do rozdzielania składników materiałów komórek roślinnych. Przedmiotem szczególnego zainteresowania jest rozdzielanie materiału roślinnego bogatego w cukier lub skrobię na składniki o dużym znaczeniu przemysłowym (takie jak sacharoza z buraka cukrowego lub skrobia z ziemniaków) oraz składniki o niewielkim znaczeniu (takie jak frakcje miazgi lub łusek). Przedmiotem szczególnego zainteresowania jest także rozdzielanie bogatych w białko lub bogatych w olej roślin uprawnych na wartościowe frakcje białka i oleju oraz bezwartościowe frakcje łusek. Proces rozdzielania można prowadzić przez zastosowanie znanych metod.
Enzym rozkładający pektynę według wynalazku można również stosować podczas wytwarzania soku owocowego lub warzywnego, w celu zwiększenia wydajności, oraz w enzymatycznej hydrolizie różnych materiałów pochodzących ze ścian komórkowych roślin lub materiałów odpadowych, np. z produkcji wina lub soku, bą d ź pozostał o ś ci produktów rolnych, takich jak ł uski warzyw, ł upiny fasoli, miazga buraków cukrowych, miazga oliwek, miazga ziemniaków itp.
Materiał roślinny można poddawać rozkładowi w celu ulepszenia różnych rodzajów przetwarzania, ułatwiania oczyszczania i ekstrakcji innego składnika, niż galaktany, np. przy oczyszczaniu pektyn z owoców cytrusowych, poprawy wartości odżywczej, zmniejszania zdolności wiązania wody, poprawy zdolności ulegania degradacji w oczyszczalniach ścieków, poprawy przekształcania materiału roślinnego w kiszonki itp.
Dzięki preparatowi enzymu według wynalazku możliwe jest regulowanie konsystencji i wyglądu przetwarzanych owoców lub warzyw. Wykazano, że konsystencja i wygląd są wynikiem kombinacji enzymów aktualnie stosowanych w przetwórstwie, tj. specyficzności enzymów, z którymi łączy się liazę pektynianową według wynalazku. Przykłady obejmują wytwarzanie klarownego soku np. z jabłek, gruszek, owoców jagodowych; stabilnego soku mętnego np. z jabłek, gruszek, owoców jagodowych, owoców cytrusowych lub pomidorów, oraz puree, np. z marchwi i pomidorów.
Enzym rozkładający pektynę według wynalazku można stosować w modyfikowaniu lepkości materiału pochodzącego ze ścian komórkowych roślin. Tak np. liazę pektynianową można stosować do obniżania lepkości pokarmu, który zawiera galaktan, oraz do ułatwiania przetwórstwa lepkiego materiału zawierającego galaktan. Obniżenie lepkości można uzyskać przez obróbkę zawierającego galaktan materiału roślinnego preparatem enzymu według wynalazku w warunkach odpowiednich do pełnego lub częściowego rozkładu materiału zawierającego galaktan.
Enzym rozkładający pektynę można stosować, np. w połączeniu z innymi enzymami, do usuwania substancji pektynowych z włókien roślinnych. Usuwanie to jest konieczne np. w produkcji włókien tekstylnych lub innych materiałów celulozowych. W tym celu materiał włókien roślinnych poddaje się działaniu odpowiedniej ilości enzymu rozkładającego pektynę według wynalazku w warunkach odpowiednich do uzyskania pełnego lub częściowego rozkładu substancji pektynowych towarzyszących materiałowi włókien roślinnych.
Dodatek do paszy dla zwierząt
Enzym rozkładający pektynę według wynalazku można stosować do modyfikowania paszy dla zwierząt i może ona wywierać swój wpływ albo in vitro (przez modyfikowanie składników paszy), albo
PL 198 507 B1 in vivo. Enzym rozkładający pektynę jest szczególnie odpowiedni do dodawania do kompozycji paszy dla zwierząt zawierających duże ilości arabinogalaktanów lub galaktanów, np. paszy zawierającej materiał roślinny z soi, rzepaku, łubinu itp. Po dodaniu do paszy, enzym rozkładający pektynę znacząco poprawia rozkładanie materiału ścian komórkowych roślin in vivo, dzięki czemu uzyskuje się lepsze wykorzystywanie roślinnych składników odżywczych przez zwierzę. W ten sposób poprawia się szybkość wzrostu i/lub współczynnik konwersji paszy (tj. waga spożytej paszy w stosunku do przyrostu wagi) zwierzęcia. Tak np. niestrawialny galaktan rozkładany jest przez liazę pektynianową, np. w kombinacji z β-galaktozydazą, do galaktozy lub oligomerów galaktozy, które mogą być trawione przez zwierzę, a zatem wnoszą wkład w dostępną energię paszy. Rozkład galaktanu przez liazę pektynianową może również poprawiać możliwości trawienia i przyswajanie niewęglowodanowych składników paszy, takich jak białko, tłuszcz i sole mineralne.
W poniższym opisie należy się odnieść do międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr PCT/DK 96/00443 oraz przykładu zawartego w tym zgłoszeniu.
Produkcja wina i soku
Enzym lub preparat enzymu według wynalazku można stosować do depektynizacji i obniżania lepkości soku warzywnego lub owocowego, szczególnie soku jabłkowego lub gruszkowego. Można to przeprowadzić przez działanie na sok owocowy lub warzywny preparatem enzymu według wynalazku w ilości skutecznej dla rozkładania zawierającego pektynę materiału, zawartego w soku warzywnym lub owocowym.
Enzym lub preparat enzymu można stosować do obróbki miazgi z owoców i warzyw w celu poprawienia możliwości ekstrakcji i degradacji miazgi. Tak np. preparat enzymu można stosować do obróbki miazgi z jabłek i gruszek do produkcji soku oraz do obróbki miazgi z winogron do produkcji wina.
Oznaczanie aktywności katalitycznej enzymów rozkładających pektynę
Oznaczenie lepkości APSU
Jednostki APSU: jednostka oznaczenia APSU jest miarą lepkości przy zastosowaniu kwasu poligalakturonowego bez dodanego wapnia.
Substrat, 5% sól sodową kwasu poligalakturonowego (Sigma, P-1879) rozpuszcza się w 0,1 M buforze glicynowym, pH 10. 4 ml substratu preinkubuje się w ciągu 5 minut w temperaturze 40°C. Dodaje się enzym (w objętości 250 μΓ> i miesza w ciągu 10 s w mikserze przy najwyższej szybkości, a następnie inkubuje się w ciągu 20 minut w temperaturze 40°C. W celu otrzymania krzywej standardowej wykonuje się podwójne oznaczenia dla rozcieńczeń stężenia enzymu w zakresie od 5 APSU/ml do powyżej 100 APSU/ml, z co najmniej 4 stężeniami pomiędzy 10 a 60 APSU/ml.
Lepkość mierzy się stosując aparat MIVI 600 firmy Sofraser, 45700 Villemandeur, Francja. Lepkość mierzy się jako mV po 10 s.
Do obliczania jednostek APSU zastosowano rozcieńczenia wzorca enzymu do otrzymania krzywej standardowej, jak opisano powyżej:
APSU/ml mV
0,00 300
4,00 276
9,00 249
14,00 227
19,00 206
24,00 188
34,00 177
49,00 163
99,00 168
Do obliczeń zastosowano program GrafPad Prism, stosując nieliniowe dopasowanie do jednofazowej krzywej zaniku wykładniczego z plateau. Plateau plus wielkość zmiany stanowią mV otrzymane bez enzymu. Plateau stanowią mV powyżej 100 APSU, i stwierdzono, że połowiczne obniżenie lepkości w obu przykładach wynosiło 12 jednostek APSU z błędem standardowym 1,5 APSU.
Oznaczenie liazy (przy długości fali 235 nm)
Do oznaczania β-eliminacji, prowadzono oznaczenie mierzące przyrost absorbancji przy długości fali 235 nm, stosując jako substrat 0,1% sól sodową kwasu poligalakturonowego (Sigma P-1879) rozpuszczoną w 0,1 M buforze glicynowym, pH 10. Do obliczania szybkości katalizy, wzrost 5,2 jednostek absorbancji przy długości fali 235 nm na minutę odpowiada tworzeniu 1 μmola nienasyconego produktu (Nasuna i Starr (1966) J. Biol. Chem., tom 241, str. 5298-5306, oraz Bartling, Wegener i Olsen (1995) Microbiology, tom 141, str. 873-881).
PL 198 507 B1
Stosowano warunki równowagowe z zastosowaniem kuwety o pojemności 0,5 ml i długości drogi optycznej 1 cm w spektrofotometrze HP z układem diodowym, w statywie kuwet o kontrolowanej temperaturze z ciągłym pomiarem absorbancji przy długości fali 235 nm. Dla stanu równowagi w obliczeniach szybkości stosowano liniowy przyrost w ciągu co najmniej 200 s. Stosowano go do przeliczania danych o tworzeniu produktu w pmolach na minutę.
Oznaczenie agarowe
Aktywność liazy pektynianowej można mierzyć przez wprowadzenie testowego roztworu do otworów o średnicy 4 mm, wykonanych w płytkach agarowych (takich jak np. z agaru LB), zawierających 0,7% w/v poligalakturonianu sodowego (Sigma, P 1879). Płytki inkubuje się następnie w ciągu 6 godzin w określonej temperaturze (takiej jak, np., 75°C). Następnie płytki moczy się albo w (i) 1 M CaCl2 w ciągu 0,5 godziny, albo w (ii) 1% bromku alkilotrimetyloamoniowym (MTAB, Sigma, M-7635) w ciągu 1 godziny. Obie te procedury powodują wytrącenie poligalakturonianu w agarze. Aktywność liazy pektynianowej można wykrywać przez pojawianie się przejrzystych stref na tle wytrąconego poligalakturonianu. Czułość oznaczenia kalibruje się stosując rozcieńczenia standardowego preparatu liazy pektynianowej.
Analiza w punkcie końcowym - pomiar transeliminacji przy długości fali 235 nm dla liaz pektynianowych (metoda z zastosowaniem wysokiego stężenia wapnia: 1 mM wapnia w końcowej mieszaninie inkubacyjnej)
W metodzie tej substrat i enzym inkubuje się w ciągu 20 minut w temperaturze 37°C, a następnie dokonuje pomiaru tworzenia wiązań podwójnych przy długości fali 235 nm. Ostatecznie, szybkość rozkładania oblicza się w oparciu o molowy współczynnik ekstynkcji w odniesieniu do jednostek trans.
Procedura:
Mieszanie rozcieńczenia enzymu o objętości 0,5 ml z 0,5 ml 2x roztworu substratu.
Substrat: kwas poligalakturonowy z Sigma, P-1879, nr serii 77H3784.
Bufor 2x: 0,1 M glicyna, pH 10, + 2,0 mM CaCl2
Odczynnik zatrzymujący reakcję: 0,02 M H3PO4
Temperatura inkubacji 37°C
Czas reakcji 20 minut
Współczynnik ekstynkcji transeliminacji 0,0052 μmola cm-
Enzym rozcieńczony w wodzie dejonizowanej do stężenia od 0,5 do 5 APSU na ml. Główna wartość w dwóch powtórzeniach po 0,5 ml. 2% w/v substrat w buforze 2x miesza się z 0,5 ml rozcieńczonego enzymu. Oba preinkubuje się w ciągu 5 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37°C. Inkubację prowadzi się w ciągu 20 minut. W celu zatrzymania reakcji stosuje się 5 ml odczynnika zatrzymującego reakcję i miesza się. Próba ślepa: zmieszać najpierw enzym i odczynnik zatrzymujący reakcję, a następnie dodać substrat, wszystkie w takich samych objętościach.
Enzym 0,5 ml
Substrat 0,5 ml
Odczynnik zatrzymujący reakcję 5 ml
Łączna objętość 6 ml
Mierzy się absorbancję przy długości fali 235 nm w kuwecie o długości drogi optycznej 1 cm.
Oblicza się powstawanie produktu transeliminacji na minutę stosując współczynnik ekstynkcji 0,0052 μmola cm-1
Obliczenia: [(wartość główna plus wartość główna)/2 - próba ślepa] 0,0052*6*2*rozcieńczenie enzymu/20 minut/1000 ml = μmole /minutę.
Analiza w punkcie końcowym - pomiar transeliminacji przy długości fali 235 nm dla liaz pektynowych przy pH 9,0
Metodę wykonuje się w sposób opisany powyżej dla analizy w punkcie końcowym - pomiaru transeliminacji przy długości fali 235 nm dla liaz pektynianowych (metoda z zastosowaniem wysokiego stężenia wapnia), ale stosując następujący substrat i bufor:
Substrat: Pektyna estryfikowana z owoców cytrusowych z Sigma, P-9561, numer serii 125HO123.
Bufor 2x: 0,1 M boran, pH 9,0, 5 mM EDTA.
Materiały i metody
Szczepy
Bacillus licheniformis ATCC 14580
B. subtilis PL2306. Szczep ten stanowi B. subtilis DN1885 z uszkodzonymi genami apr i npr (B. Diderichsen, U. Wedsted, L. Hedegaard, B. R. Jensen, C. Sj0holm (1990) Cloning of aldB, which
PL 198 507 B1 encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315-4321) w jednostce transkrypcyjnej znanego genu celulazy Bacillus subtilis, czego wynikiem są komórki ujemne pod względem celulazy. Uszkodzenie genów przeprowadzono zasadniczo w sposób opisany w (red. A. L. Sonensheim, J. A. Hoch i Richard Losick (1993) Bacillus subtilis and other GramPositive Bacteria, American Society for Microbiology, str. 618)
Kompetentne komórki przygotowano i stransformowano je w sposób opisany przez R. E. Yasbin, G. A. Wilson i F. E. Young (1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol., 121: 296-304.
Plazmidy pMOL944:
Plazmid ten jest pochodną pUB110, zasadniczo zawierającą elementy umożliwiające namnażanie plazmidu w Bacillus subtilis, gen oporności na kanamycynę i zawierającą silny promotor oraz peptyd sygnałowy sklonowane z genu amyL B. licheniformis ATCC14580. Peptyd sygnałowy zawiera miejsce SacII, co czyni go dogodnym do klonowania DNA kodującego dojrzałą część białka w fuzji z peptydem sygnałowym. Wynikiem tego staje się ekspresja prebiałka, które kierowane jest na zewnątrz komórki.
Plazmid skonstruowano za pomocą zwykłych technik inżynierii genetycznej, które krótko opisano poniżej.
Konstruowanie pMOL944:
Plazmid pUB110 (T. McKenzie i inni, 1986, Plasmid 15: 93-103) strawiono rozpoznającym unikatowe miejsce enzymem restrykcyjnym NciI. Otrzymany przez PCR fragment zamplifikowany z promotora amyL kodowanego w plazmidzie pDN1981 (P. L. J0rgensen i inni, 1990, Gene, 96, str. 37-41) strawiono NciI i wstawiono do strawionego NciI pUB110, otrzymując plazmid pSJ2624.
Dwa zastosowane startery zawierały następujące sekwencje:
# LWN5494 5'-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3' #LWN5495 5'-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3'
Starter #LWN5494 wstawia do plazmidu miejsce Notl.
Plazmid pSJ2624 strawiono następnie enzymami SacI i Notl i nowy fragment zamplifikowany w PCR z promotora amyL kodowanego przez plazmid pDN1981 strawiono enzymami SacI i Notl.
Ten fragment DNA wstawiono do pSJ2624 strawionego SacI-Notl, otrzymując pSJ2670.
Klonowanie to zastępuje pierwsze klonowanie promotora amyL tym samym promotorem, ale w przeciwnym kierunku. Dwa startery zastosowane do amplifikacji w PCR zawierają następujące sekwencje:
#LWN5938 5' -GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGG CAGCAAGAAGAT-3' #LWN5939 5' -GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'
Plazmid pSJ2670 strawiono enzymami restrykcyjnymi Pstl i BclI i otrzymany w PCR fragment zamplifikowany ze sklonowanej sekwencji DNA kodującej alkaliczną amylazę SP722 (ujawnioną w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym opublikowanym jako WO 95/26397, włączonym w całości do opisu jako odnośnik literaturowy) strawiono Pstl i Bcll i wstawiono, otrzymując plazmid pMOL944. Dwa startery zastosowane do amplifikacji PCR posiadły następujące sekwencje:
#LWN7864 5'-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3' #LWN7901 5'-AACTGC-AGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3'
Starter #LWN7901 wstawia do plazmidu miejsce SacII.
Ogólne metody inżynierii genetycznej
O ile nie stwierdzono inaczej, manipulacje DNA i transformacje prowadzono stosując standardowe metody biologii molekularnej (Sambrook i inni (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor; F. M. Ausubel i inni (red.) „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1995; C. R. Harwood i S. M. Cutting (red.) „Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley and Sons, 1990).
Enzymy do manipulacji DNA stosowano zgodnie z instrukcjami dostawców (np. endonukleazy restrykcyjne, ligazy itp. można otrzymać z New England Biolabs, Inc.).
Podłoża
TY (jak opisano w F. M. Ausubel i inni (red.) „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1995).
PL 198 507 B1
Agar LB (jak opisano w F. M. Ausubel i inni (red.) „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1995).
LBPG jest agarem LB wzbogaconym o 0,5% glukozę i 0,05 M fosforan potasu, pH 7,0.
Podłoże BPX opisano w europejskim opisie patentowym nr EP 0506780 (publikacja WO 91/09129).
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.
P r z y k ł a d 1
Klonowanie, ekspresja, oczyszczanie i charakterystyka liazy pektynianowej (II) z Bacillus licheniformis
Przygotowywanie genomowego DNA
Szczep Bacillus licheniformis ATCC 14580 namnożono w podłożu płynnym 3, jak określono przez ATCC (American Type Culture Collection, Stany Zjednoczone Ameryki). Po inkubacji w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C i przy 300 obrotach/minutę, komórki zebrano i genomowy DNA wyizolowano metodą opisaną przez Pitchera i innych (D. G. Pitcher, N. A. Saunders, R. J. Owen (1989), Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol., 8, 151-156).
Sekwencję DNA według wynalazku, kodującą liazę pektynianową II (vide supra, przedstawioną w sekwencji minokwasowej SEQ ID NO: 8) zamplifikowano przez PCR stosując zestaw starterów PCR, składający się z tych dwóch oligonukleotydów: Pecl.B.lich.upper.SacII
5'-CTA ACT GCA GCC GCG GCA GCT TCT GCC TTA AAC TCG GGC-3' Pecl.B.lich.lower.Notl
5'-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT GAA TGC CCC GGA CGT TTC ACC-3'
Podkreślono miejsca restrykcyjne SacII i Notll.
Chromosomalny DNA, wyizolowany z B. licheniformis ATCC 14580 w opisany powyżej sposób, zastosowano jako matrycę w reakcji PCR z zastosowaniem Amplitaq DNA Polimerase (Perkin Elmer) zgodnie z instrukcjami producenta. Reakcję PCR prowadzono w buforze do PCR (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% (w/v) żelatyna) zawierającym 200 μM każdego z dNTP, 2,5 jednostek polimerazy AmpliTaq (Perkin Elmer, Cetus, USA) oraz 100 pmoli każdego startera.
Reakcje PCR prowadzono stosując urządzenie do cyklicznych zmian temperatury DNA (Landgraf, Niemcy). Po jednej inkubacji w temperaturze 94°C w ciągu 1 minuty następowało 30 cykli PCR prowadzonych z zastosowaniem następującego profilu cykli: denaturacja w temperaturze 94°C w ciągu 30 sekund, hybrydyzacja w temperaturze 60°C w ciągu 1 minuty i wydłużanie w temperaturze 72°C w ciągu 2 minut. Próbki produktów amplifikacji o objętości 5 μl analizowano przez elektroforezę w 0,7% żelach agarozowych (NiSieve, FMC). Pojawienie się fragmentu DNA o wielkości 1,0 kz (kilozasad) wskazywało na właściwą amplifikację odcinka genu.
Subklonowanie fragmentu otrzymanego przez PCR
Próbki utworzonych w sposób opisany powyżej produktów PRC o objętości 45 μl oczyszczano stosując zestaw do oczyszczania produktów PCR QIAquick (Qiagen, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczony DNA eluowano w 50 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5. 5 μg pMOL944 i 25 μl oczyszczonego fragmentu otrzymanego przez PCR trawiono SacII i Notl, poddawano elektroforezie w 0,8% żelach agarozowych o niskiej temperaturze krzepnięcia (SeaPlaque GTG, FMC), odpowiednie fragmenty wycinano z żeli i oczyszczano stosując QIAquick Gel extraction Kit (Qiagen, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Wyizolowany fragment DNA otrzymany przez PCR ligowano następnie ze strawionym SacII-Notl i oczyszczonym pMOL944. Ligację prowadzono przez noc w temperaturze 16°C stosując 0,5 μg każdego fragmentu DNA, 1 U ligazy DNA T4 i bufor do ligazy T4 (Boehringer Mannheim, Niemcy).
Mieszaninę ligacyjną stosowano do transformacji kompetentnych komórek B. subtilis PL2306. Stransformowane komórki wysiewano na płytki LBPG z 10 μg/ml kanamycyny. Po 18 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C kilka klonów przesiano na świeże płytki agarowe, a także namnażano w płynnych hodowlach w podłożu TY z 10 μg/ml kanamycyny i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia 1 ml komórek stosowano do izolowania plazmidu z komórek z zastosowaniem Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106 zgodnie z zaleceniami producenta dla przygotowywania plazmidów B. subtilis. Ten plazmidowy DNA stosowano jako matrycę do sekwencjonowania DNA.
Zachowano jeden klon zawierający gen liazy pektynianowej; klon ten nazwano MB541.
DNA odpowiadający dojrzałej części liazy pektynianowej scharakteryzowano przez zsekwencjonowanie DNA poprzez przemieszczanie starterów stosując zestaw Taq deoxy-terminal cycle sequencing kit (Perkin-Elmer, USA), wyznakowane fluorescencyjnie terminatory i odpowiednie oligonukleotydy jako startery.
PL 198 507 B1
Analizę danych sekwencyjnych przeprowadzono zgodnie z Devereux i innymi (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395. Przeprowadzono ekspresję sklonowanej sekwencji DNA w B. subtilis i białko, które pojawiło się w supernatancie, odpowiadało dojrzałemu białku przedstawionemu w SEQ ID NO: 8.
Oczyszczanie
MB541 namnażano w 25 x 200 ml podłoża BPX z 10 Lil/ml kanamycyny w dwóch kolbach do wytrząsania, z niepełnymi przegrodami, o pojemności 500 ml w ciągu 5 dni, w temperaturze 37°C przy 300 obrotach/minutę, w ten sposób otrzymując 3500 ml brzeczki hodowlanej. Wartość pH doprowadzono do 5,0 stosując kwas octowy i podczas wytrząsania dodano 100 ml środka kationowego (C521) oraz 200 ml środka anionowego (A130) do flokulacji. Flokulowany materiał oddzielono przez wirowanie w ciągu 30 minut w temperaturze 6°C przy 10000 obrotach/minutę stosując wirówkę Sorval RC 3B. Uzyskany w wyniku supernatant zawierał 370 APSU/ml w objętości całkowitej 3600 ml.
Supernatant sklarowano stosując szklane sączki Whatman GF/D i C i ostatecznie zatężono na membranie do ultrafiltracji Filtron o granicy przepuszczalności masy cząsteczkowej 10000 (10 kDa). Objętość całkowitą 2000 ml doprowadzono do pH 8,5. 50 gramów DEAE A-50 Sephadex (Pharmacia) poddano spęcznianiu w 2000 ml 50 mM Tris, pH 8,5. Nadmiar buforu odrzucono i klarowny, zatężony roztwór enzymu mieszano z zawiesiną w ciągu 15 minut. Enzym oddzielono od materiału jonowymiennego przez odessanie na lejku Buchnera. Uzyskany roztwór zatężono na membranie Filtron o granicy przepuszczalności masy cząsteczkowej 10000 (10 kDa) do objętości końcowej 800 ml.
W celu otrzymania liazy pektynianowej o wysokim stopniu oczyszczenia, przeprowadzono końcowy etap z zastosowaniem chromatografii kationowymiennej na S-Sepharose. 50 ml roztworu o stężeniu 950 APSU na ml (patrz powyżej) doprowadzono do pH 5,0 stosując kwas octowy. Nałożono go na kolumnę o pojemności 50 ml, zawierającą S-Sepharose (Pharmacia) zrównoważoną buforem 50 mmolowego octanu sodowego, pH 5,0. Liaza pektynianowa związała się i przeprowadzono elucję stosując gradient 0,5 M chlorku sodu.
Charakterystyka
Czysty enzym dał w SDS-PAGE pojedynczy prążek odpowiadający masie cząsteczkowej 35000 (35 kDa) i wykazywał punkt izoelektryczny około 6,1.
Stężenie białka oznaczano stosując molowy współczynnik ekstynkcji 57750 (w oparciu o skład aminokwasowy wydedukowany na podstawie sekwencji).
Stosując oznaczenie do wykrywania zachodzenia rozszczepiania przez tworzenie podwójnego wiązania, które można mierzyć przy długości fali 235 nm, otrzymano następujące dane
1. (warunki: pH 10, bufor glicynowy, brak wapnia, kwas poligalakturonowy, Sigma P-1879, jako substrat) : 1 μmol na minutę na mg.
2. (warunki: pH 10, bufor glicynowy, brak wapnia, DE35 (pektyna zestryfikowana w 35%) jako substrat) : 4 μmole na minutę na mg.
Czysty enzym dializowano wobec EDTA o pH 8,0 (20 mM Tris, pH 8,0) oraz o pH 10 (20 mM glicyna, pH 10) i enzym analizowano przez dichroizm kołowy; nie zaobserwowano żadnych różnic w widmach z i bez EDTA.
Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) 4 próbek wykazała, że enzym był najbardziej stabilny przy pH 8,0, z temperaturą topnienia około 70°C w Tris pH 8,0 oraz temperaturą topnienia 75°C po dializie wobec EDTA. W pH 10 enzym ulegał topnieniu w temperaturze 55°C z i bez EDTA.
Aktywność katalityczna liazy pektynianowej hamowana jest pod wpływem obecności EDTA podczas inkubacji z substratem, ale enzym dializowany wobec EDTA był nadal aktywny, jeśli EDTA pomijano podczas inkubacji z substratem. Kationy dwuwartościowe, takie jak Fe++, Li++, Mg++, Cu++, Mn++, nie wywierają żadnego wpływu na aktywność katalityczną.
Aktywność β-transeliminacji (z zastosowaniem oznaczenia liazy przy długości fali 235 nm) przy różnych wartościach pH oznaczano jako kinetyki równowagowe w temperaturze 40°C z zastosowaniem następujących buforów:
pH 6,0: 0,1 M Na-MES pH 6,5, 7,0 i 7,5: 0,1 M Na-MOPS pH 8,0 i 8,5: 0,1 M Tris pH 9,0, 9,5, 10,0 i 10,5: 0,1 M Na-glicyna pH 11-11,5: 0,1 M Na-węglan
MES: z Sigma, nr M-8250 (kwas 2-[N-morfolino]etanosulfonowy).
MOPS: z Sigma, nr M-1254 (kwas 3-[N-morfolino]propanosulfonowy).
Tris: z Merck, nr 1.08382
PL 198 507 B1
Glicyna z Merck i węglan sodu z Merck, nr 6392.
Aktywność względną (stosunek) oblicza się jako procent optymalnej aktywności; otrzymano na-
stępujące wyniki:
pH % aktywności
6,5 1
7 5
7,5 4
8 4
8,5 4
9 6
9,5 23
10 100
10,5 nie oznaczono
11 52
11,2 0
Odpowiednio, stwierdzono względną aktywność w różnych temperaturach (w pH 10):
temperatura, °C % aktywnoś ci
40 65
50 87
55 87
60 100
65 90
Aktywność w detergentach : Stosują c handlowe detergenty zamiast buforów i inkubację w cią gu
minut w temperaturze 40°C z solą sodową kwasu poligalakturonowego (Sigma, P-1879), po której następowało oznaczanie cukrów redukujących, stwierdzono, że enzym był aktywny w europejskim handlowym proszku do prania Ariel Futur z 44% aktywnością względną, handlowym proszku Tide ze Stanów Zjednoczonych Ameryki z 51% aktywnością względną i w handlowym płynnym detergencie Tide ze Stanów Zjednoczonych Ameryki z 30% aktywnością względną w stosunku do aktywności mierzonej w buforze glicynowym. Stężenie detergentu było takie, jak zalecane do stosowania, i stosowano wodę wodociągową o twardości 18 stopni niemieckich w warunkach europejskich i twardości 9 stopni w warunkach Stanów Zjednoczonych Ameryki.
Właściwości immunologiczne: Stosując zwykłe techniki, w duńskiej firmie DAKO wyhodowano króliczą poliklonalną, monospecyficzną surowicę skierowaną przeciw oczyszczonej w wysokim stopniu liazie pektynianowej. Surowica tworzyła delikatny pojedynczy precypitat w żelach agarozowych z liazą pektynianową według wynalazku, i tylko jeden łuk precypitacyjny z nieoczyszczonymi produktami Bacillus licheniformis, takimi jak Pulpzyme HC nr serii CKF0054 lub nr serii CKN00009 z Novo Nordisk A/S.
P r z y k ł a d 2
Konstruowanie i ekspresja białka fuzyjnego pomiędzy liazą pektynianową a CBD
Sekwencję DNA kodującą CBD genu CipB ze szczepu YS Clostridium thermocellum (D. M. Poole; E. Morag; R. Lamed; E. A. Bayer; G. P. Hazlewood; H. J. Gilbert (1992) Identification of the cellulose-binding domain of the cellulosome subunit S1 from Clostridium thermocellum YS, Fems Microbiology Letters, tom 78, nr 2-3, str. 181-186) zamplifikowano przez PCR stosując zestaw starterów składający się z następujących dwóch oligonukleotydów:
CIPCBD.upper.PECL.Sall
5'-CGA CAA TGT CGA CAA TGT AAA ATC AAT CGT CAA GCA AAA TGC CGG AGT CGG CAA AAT CCA GCG CAG ACC GCC AAC ACC GAC CCC GAC TTC ACC GCC AAG CGC AAA TAC ACC GGT ATC AGG CAA TTT G-3' CIPCBD.lower.Notl
5'-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT ATA CCA CAC TGC CAC CGG GTT CTT TAC-3'
Podkreślono miejsca restrykcyjne Sall i Notl.
Chromosomalny DNA kodujący CBD można otrzymać w sposób opisany przez D. M. Poole; E. Morag; R. Lamed; E. A. Bayer, G. P. Hazlewood; H. J. Gilbert (1992) Identification of the cellulosebinding domain of the cellulosome subunit S1 from Clostridium thermocellum YS, Fems Microbiology Letters, tom 78, nr 2-3, str. 181-186. Próbkę DNA kodującego CBD zastosowano jako matrycę w reakcji PCR przeprowadzonej w sposób opisany w przykładzie 1. Pojawienie się fragmentu DNA o wielkości około 0,5 kz (kilozasad) wskazywało na właściwą amplifikację odcinka genu.
PL 198 507 B1
Subklonowanie fragmentu otrzymanego przez PCR
Subklonowanie przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 1, z tym wyjątkiem, że oczyszczony fragment otrzymany przez PCR strawiono SalI i Notl. Kilka klonów analizowano przez wyizolowanie plazmidowego DNA z całonocnej brzeczki hodowlanej.
Jeden taki dodatni klon kilkakrotnie przesiewano na płytki agarowe, takie jak stosowano powyżej; klon ten nazwano MB914. Klon MB914 hodowano przez noc w TY-10 μg/ml kanamycyny w temperaturze 37°C, a następnego dnia 1 ml komórek zastosowano do wyizolowania plazmidu z komórek z użyciem Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106 zgodnie z zaleceniami producenta dla przygotowywania plazmidów B. subtilis. DNA ten zsekwencjonowano i ujawniono sekwencję DNA odpowiadającą białku fuzyjnemu: liaza pektynianowa-łącznik-cbd, przedstawioną w SEQ ID NO: 9 i odpowiadającą sekwencji białka w załączonej SEQ ID NO: 10.
Ekspresja i wykrywanie białka fuzyjnego liaza pektynianowa-cbd
MB914 inkubowano w ciągu 20 godzin w podłożu TY w temperaturze 37°C i przy 250 obrotach na minutę. 1 ml wolnego od komórek supernatantu zmieszano z 200 μl 10% Avicel (Merck, Darmstadt, Niemcy) w wodzie oczyszczonej w Millipore. Mieszaninę pozostawiono do inkubacji w ciągu pół godziny w temperaturze 0°C. Po tym wiązaniu białka fuzyjnego liaza pektynianowa-łącznik-CBD z Avicel, Avicel ze związanym białkiem wirowano w ciągu 5 minut przy 5000 x g. Osad ponownie zawieszono w 100 μl buforu do SDS-PAGE, ogrzewano w temperaturze 95°C w ciągu 5 minut, wirowano w ciągu 5 minut przy 5000 x g i 25 μl nałożono na 4-20% żel do SDS-PAGE w warunkach buforowych Trisglicyna według Laemmli'ego NOVEX (Novex, USA). Próbki poddawano elektroforezie w Xcell™ MiniCell (NOVEX, USA) zgodnie z zaleceniami producenta. Wszystkie czynności związane z dalszą obróbką żeli, obejmujące wybarwianie kumazyną, odbarwianie i suszenie prowadzono w sposób opisany przez producenta.
Pojawienie się prążka białkowego odpowiadającego masie cząsteczkowej około 55000 (55 kDa) wskazało na ekspresję w B. subtilis fuzji liaza pektynianowa-łącznik-CBD kodowanej przez plazmid pMB914.
P r z y k ł a d 3
Obróbka materiału celulozowego liazą pektynianową:
Wpływ temperatury na usuwanie pektyny i zwilżalność 100% bawełniany diagonal, pozbawioną klejonki tkaninę testową nr 428U, reprezentującą typowy materiał celulozowy, poddano obróbce wodnym roztworem enzymu, zawierającym liazę pektynianową B. licheniformis z przykładu 1 w ilości 9 APSU/g tkaniny, w pH 9 i przy krotności kąpieli 15:1. Czas obróbki wynosił 2 godziny, a temperatura wahała się w zakresie 35-75°C. Po obróbce enzymem tkaninę dokładnie wypłukano, wysuszono, a następnie farbowano czerwienią rutenową. Pobieranie barwnika mierzono spektrofotometrycznie; jest ono miarą pozostałości pektyny na włóknie. Procent pozostałości pektyny obliczano traktując pobieranie barwnika przez materiał wyjściowy jako 100% pozostałości pektyny, a przez w pełni poddaną chemicznej obróbce alkalicznej i wybieloną tkaninę jako 0%. Wyniki przedstawiono w tabeli 3. Następnie zmierzono zwilżalność (test kroplowy - mierzący czas w sekundach, po jakim kropla wody zostanie wchłonięta przez tkaninę) i porównano ją z nie poddaną obróbce enzymatycznej próbką kontrolną. Wyniki przedstawiono w tabeli 4.
T a b e l a 3 (% pozostającej pektyny)
Temperatura, °C 35 45 55 65 75
bez enzymu 100 100 93 90 85
Enzym 52 40 32 28 26
- obróbka alkaliczna pozostawia zazwyczaj 20-25% resztkowej pektyny
T a b e l a 4
Temperatura, °C 35 45 55 65 75
bez enzymu 32 29 29 12 11
Enzym 15 10 7 5 3
- zwilżalność docelowa wynosi zazwyczaj < 5 s
Korzystny wpływ wzrastającej temperatury jest wyraźnie widoczny w obydwu grupach odpowiedzi.
PL 198 507 B1
P r z y k ł a d 4
Obróbka materiału celulozowego liazą pektynianową: wpływ pH na usuwanie pektyny
100% bawełniany diagonal, pozbawioną klejonki tkaninę testową nr 428U, reprezentującą typowy materiał celulozowy, poddano obróbce wodnym roztworem enzymu, zawierającym liazę pektynianową B. licheniformis z przykładu 1 w ilości 9 APSU/g tkaniny przy krotności kąpieli 15:1. Czas obróbki wynosił 2 godziny, a temperatura 55°C. pH było zróżnicowane pomiędzy 8 - 11. Po obróbce enzymem tkaninę dokładnie wypłukano, wysuszono, a następnie farbowano czerwienią rutenową. Pobieranie barwnika mierzono spektrofotometrycznie; jest ono miarą pozostałości pektyny na włóknie. Procent pozostałości pektyny obliczano traktując pobieranie barwnika przez materiał wyjściowy jako 100% pozostałości pektyny, a przez w pełni poddaną chemicznej obróbce alkalicznej i wybieloną tkaninę jako 0%. Wyniki przedstawiono w tabeli 5.
T a b e l a 5
pH 8 9 10 10,5 11
% pozostałości pektyny 35 32 30 48 61
Stwierdzono, że optimum pH wynosi około 9,5, ale dobrą aktywność wykazano w bardzo szerokim zakresie zasadowego pH.
P r z y k ł a d 5
Stosowanie enzymu według wynalazku w detergentach
Oczyszczony enzym otrzymany w sposób opisany w przykładzie 1 (seria 9751) wykazywał polepszone właściwości czyszczące podczas testowania na poziomie 1 ppm w teście miniprania z zastosowaniem zwykłego handlowego płynnego detergentu. Test przeprowadzono w zwykłych północnoamerykańskich warunkach prania.
P r z y k ł a d 6
Wpływ karbohydraz na zaplamioną bananem tkaninę bawełnianą
Metoda
Trzy banany roztarto na papkę i zhomogenizowano w Ultra Turrax z 40 ml wody. W roztworze moczono tkaninę bawełnianą Style 400 (Testfabrics, Inc.), przeciśnięto pomiędzy dwoma wałkami i wysuszono przez noc.
Zaplamioną tkaninę bawełnianą prano w handlowym płynnym detergencie, znak towarowy Ariel Futur Liquid w europejskich warunkach prania z dodaniem do płynnego detergentu odpowiednio 0,1 ppm, 0,2 ppm, 1 ppm i 10 ppm liazy pektynianowej z przykładu 1. Test powtórzono.
Wyniki
Płyn Ariel: % usunięcia plam z banana (100% odpowiada całkowitemu usunięciu plam).
Test A Test B
bez enzymu 26% 32%
10 ppm enzymu, przykład 1 59% 58%
1 ppm enzymu, przykład 1 47% 48%
0,1 ppm enzymu, przykład 1 35% 34%
Literatura
M. Lever (1972) A new reaction for colormetric determination of carbohydrases. Anal. Biochem. 47, str. 273-279. N. C. Carpita i D. M. Gibeaut (1993) The plant Journal 3:1-30.
B. Diderichsen, U. Wedsted, L. Hedegaard, B. R. Jensen, C. Sj0holm (1990) Cloning of aldB, which encodes alphaacetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol. 172: 4315-4321.
Sakai i inni, Pectin, pectinase and protopectinase: production, properties and applications, str. 213-294, w: Advances in Applied Microbiology, tom 39, 1993.
PL 198 507 B1
Wykaz sekwencji (1) Informacja ogólna;
(i) Zgłaszający:
(A) Nazwa: NOTOZYMES A/S (B) Ulica: Krogshajvej (C) Miasto: Bagsvaerd (E) Kraj : Dania (F) Kod pocztowy (ZIP): DK-2880 (G) Telefon:
(H) Telefaks:
(ii) Tytuł wynalazku:
Liaza pektynianowa, wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa, wektor ekspresyjny, hodowana komórka, sposób wytwarzania połipeptydu, preparat enzymu, kompozycja detergentowa, sposób prania tkanin, sposób polepszania właściwości celulozowych włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny, sposób degradacji lub modyfikowania materiału roślinnego, sposób wytwarzania paszy dla zwierząt i sposób obróbki wina lub soku (iii) Liczba sekwencji: 10 (iv) Sposób odczytu komputerowego:
(A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: PatentIn Release #1.0
Wersja #1.30 (EPO) (2) Informacja o SEQ ID NO: 1:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość; 1485 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Opis sekwencji: SEQ ID NO. 1:
aTGaAACIGA TCArtArtACGC ATTTCTTTTT TGGCTGCGGC CGGGATTTAT 60
TCTTTATTAG GTACAGTCGC TGCTTGTGCG GCAAACGAAG ATTATGCGGA ACAGATGA™ 12 C
AGGCTGGAAA GCTGATCAGG CTTAAATATT ACGCCCG-CCG GGAATCAAGA CAACGCACCG ISO
OGAACAGv2AA AACAGA.CGAG CGGAGrtAArsA GAAGAAAGaG1 GGAGGCTTGA TACGTGTGAC 240
PL 198 507 B1
GGCAAACAAT TCAAAATCAG AAATATGGAT AGCGGCAAAA TTATCATCCC TGCCCATTAC 300
GCACTGTCAG ACAATAATCC GGCTGTGGTC TACTATGACA ATTCACGGAA GGAAGAGTTG 360
TGGAATATCA TCGGGGCCGA CAAAGACGGA AACGGAGATT TTATCACGTA TAAAATCGTC 420
AGTGCACAAA ACAGCAGCCT TGCACTGACA CTGGACGGCA GCGGAGTGAA GCTTGCCAAA 480
TATACGGGCA GCTCCGTCCA AAAGTGGAAG CTTCCAAGCG ACGGGCTCGA AGGTTTCGCA 540
GGCTATGCAA GGGAAACGAA CGGCAAGCAG AAAACAGGCA CAACCGGCGG CCTGCTTGGA 600
AAAGTCGTCT ATGTCAATAA TCTGGGCGAA CTGAAGGCCA ATATTGAAGA TTCAACGCCG 660
CGCACGATTG TCGTCTCCAG CAATATCGGC GCTTCAGCCA AAACGGTATT AACGGTGGGC 720
GCCAATAAAA CAATCATCGG CTCGTATGAA AAACATAAGC TGAATAACAT TTACTTTAAA 780
ACAAAAGCGG ACTCTGGCAA CGTTATTTTC AAAAATCTGG TCATTGCACA TGATGCATCC B40
ATAAATGAAA ACAATGACAT CCCTGTTTAC ATTACCGATT CGAGAAACTA CTGGATTGAC 800
CATGTCACAT TCCAAGGCCA CAGCTATACG GCAAACGGCC ACGATCTCGA CAAGCTCTTA 960
TACGTCGGCG CTAAAGCCGA TTACGTCACA CTGTCGCACA GCACATTCAC AGACCACAGG 1020
TACGGCCTGA TTCTCGGCTG GCCTCAAGAT GACAAGCAAT AC2ACAGTAT ATATAATGGC 1080
TATCCGCGGA TGACAATCAG CCACAATCGC TTTGAGAATC TCTATGTCAG GGCGCCCGGG 1140
TTGATGCGTT ACGGCTATTA TCACGTGAAA AGCAATTATA TCAACAATTA CCACCTTGGC 1200
TTCACGATTA CGACATTGGC GAAAATATAT TCTGAAGCCA ATTACTTCGG CACGGGCAAT 1260
GAGAAAGGCA TACTGGATGA TTACGGAGAC GGCGCGTTTA AAGATGTCGG GTCATATCCG 1320
GCGATAAAGG GGCAGAAATC GCCTGAGACA AGCTGGACAC CTTCATCCAA CTACAGCTAT 1380
CGGACGATGA AGGCCGGCAA TGCCAAAGCT TTTGCCAAAC GGTACGCAGG TGCGCAGCGC 1440
ACCGCTCTGT ACTATGCGAA TTACAGCCAG TTTAAAAAAG ACTAA 1485
(2) Informacja o SEQ ID NO: 2:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 494 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd
>i; i Opis sekwencj i: SEQ ID NO : 2:
Met 1 Lys Leu Ile Lys Asn Ala 5 Ser Phe Ile 10 Ile Ser Phe Leu Ala Ala 15
Ala Gly Ile Tyr Phe Leu Leu 20 Gly Thr 25 Val Ala Ala Ser Ala Ala Asn 30
Glu Asp Tyr 35 Pro Glu Gin Met Ile 40 Arg Leu Glu Ser Ser Ser Gly Leu 45
Asn Ile Thr 50 pro Ala Gly Αεη 55 Gin Asp Asn Ala Pro Leu Thr Ala Lys 60
Gin 65 Thr Ser Gly Glu Lys Glu 70 Glu Arg Trp Arg Leu Asp Thr Ser Asp 75 60
PL 198 507 B1
Gly Lys Gin Phe Lys 85 Ile Arg Asn Het Asp Ser Gly 90 Lys Ile Ile 95 Ile
Pro Ala His Tyr Ala Leu Ser Asp Asn Asn Pro Ala Val Val Tyr Tyr
100 105 110
Asp Asn Ser Arg Lys Glu Glu Leu Trp Asn Ile Ile Gly Ala Asp Lys
115 120 125
Asp Gly Asn Gly Asp Phe Ile Thr Tyr Lys Ile Val Ser Ala Gin Asn
130 135 140
Ser Ser Leu Ala Leu- Thr Leu Asp Gly Ser Gly Val Lys Leu Ala Lys
145 150 155 160
Tyr Thr Gly Ser Ser Val Gin Lys Trp Lys Leu Pro Ser Asp Gly Leu
165 170 175
Glu Gly Phe Ala Gly Tyr Ala Arg Glu Thr Asn Gly Lys Gin Lys Thr
180 185 ISO
Gly Thr Thr Gly Gly Leu Leu Gly Lys Val Val Tyr Val Asn Asn Leu
195 200 205
Gly Glu Leu Lys Ala Asn Ile Glu Asp Ser Thr Pro Arg Thr Ile Val
210 215 220
Val Ser Ser Asn Ile Gly Ala Ser Ala Lys Thr Val Leu Thr Val Gly
225 230 235 240
Ala Asn Lys Thr Ile Ile Gly Ser Tyr Glu Lys His Lys Leu Asn Asn
245 250 255
Ile Tyr Phe Lys Thr Lys Ala Asp Ser Gly Asn Val Ile Phe Lys Asn
2S0 265 270
Leu Val Ile Ala His Asp Ala Ser Ile Asn Glu Asn Asn Asp Ile Pro
275 280 285
Val Tyr Ile Thr Asp Ser Arg Asn Tyr Trp Ile Asp His Val Thr Phe
290 295 300
Gin Gly Hib Ser Tyr Thr Ala Asn Gly His Asp Leu Asp Lye Leu Leu
305 310 315 320
Tyr Val Gly Ala Lys Ala Asp Tyr Val Thr Leu Ser His Ser Thr Phe
325 330 335
Thr Asp His Arg Tyr Gly Leu Ile Leu Gly Trp Pro Gin Asp Asp Lys
340 345 350
Gin Tyr His Ser Ile Tyr Asn Gly Tyr Pro Arg Met Thr Ile Ser His
355 360 365
Asn Arg Phe Glu Asn Leu Tyr Val Arg Ala Pro Gly Leu Het Arg Tyr
370 375 380
Gly Tyr Tyr His Val Lys Ser Asn Tyr Ile Asn Asn Tyr His Leu Gly
385 390 395 400
Phe Thr Ile Thr Thr Leu Ala Lys Ile Tyr Ser Glu Ala Asn Tyr Phe
405 410 415
Gly Thr Gly Asn Glu Lys Gly Ile Leu Asp Asp Tyr Gly Asp Gly Ala
420 425 430
Phe Lys Asp Val Gly Ser Tyr Pro Ala Ile Lys Gly Gin Lys Ser Pro
435 440 445
Glu Thr Ser Trp Thr Pro Ser Ser Asn Tyr Ser Tyr Arg Thr Met Lys
450 455 460
Ala Gly Asn Ala Lys Ala Phe Ala Lys Arg Tyr Ala Gly Ala Gin Arg
465 470 475 480
Thr Ala Leu Tyr Tyr Ala Asn Tyr Ser Gin Phe Lys Lys Asp
485 450
PL 198 507 B1 )2) Informacja o SEQ ID NO: 3:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 666 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 3:
ATGAAGAGAT TAGCAGGTAC GGTTATTTTG TCAGGTTTGC TCGTATGCGG GTTTGGACAG 60
GCTCTGCCTG AAAAAGCTTT GGCCGCCGAG gtcgttcaca AAACGATCGT AGTCGAGAAA 120
GGCCAAACGT ATGACGGAAA AGGCAAGCGG CTGATTGCAG GTCCGGAGCT CGGGGACGGC 180
AGCCAACGCG AGGATCAAAA ACCGATTTTC AAAGTGGAGG ATGGTGCAAC GCTCAAAAAT 240
GTCGTGCTTG GCGCTCCTGC TGCTGATGGT GTTCACACAT ATGGAAACGC TTCCATAAAC 300
AACGTTGTTT GGGAAGATGT CGGCGAAGAT GCCTTGACTG TCAAAAGCGA AGGAAGTGTC 360
ACGATAAACG GAGGATCGGC CCGGCTTGCC GCGGACAAAA TCTTTCAGAT TAATAAAGCG 420
AGCACATTTA CCGTGAAAAA TTTTACTGCC GATCAAGGAG GCAAATTCAT TCGCCAGCTC 480
GGAGGCTCGA CATTTAAAGC CGTGGTCAAT ATTGATAACT GTACGATTAC AAACATGAAA 540
GAGGCGATCT TCCGAACCGA CAGCAGTACA AGTTCCGTTA CAATGACAAA TACAAGATAC 600
TCAAAAGTCG GTCAGAAATG GATCGGTGTG AAGCATGCTA CGGAAAGAAA CAATCATGAA 660
TTTTAA 666
)2) Informacja o SEQ ID NO: 4:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 221 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd
(xi) Opis sekwencj i: SEQ ID NO : 4
Met Lys Arg Leu Ala Gly Thr Val Ile Leu Ser Gly Leu Leu Val Cys
1 5 10 15
Gly Phe Gly Gin Ala Leu Pro Glu Lys Ala Leu Ala Ala Glu Val Val
20 25 30
His Lys Thr Ile Val Val Glu Lys Gly Gin Thr Tyr Aep Gly Lys Gly
35 40 45
Lys Arg Leu Ile Ala Gly Pro Glu Leu Gly Asp Gly Ser Gin Arg Glu
50 55 60
Asp Gin Lys Pro Ile Phe Lys Val Glu Asp Gly Ala Thr Leu Lys Asn
65 70 75 80
PL 198 507 B1
Val Val Leu Gly Ala 85 Pro Ala Ala Asp □ly 90 Val His Thr Tyr Gly 95 Asn
Ala Ser Ile Asn 100 Asn Val Val Trp Glu 105 Asp Val Gly Glu Asp 110 Ala Leu
Thr Val Lys 115 Ser Glu Gly Ser Val 120 Thr Ile Asn Gly Gly 125 Ser Ala Arg
Leu Ala 130 Ala Asp Lys Ile Phe 135 Gin Ile Asn Lys Ala 14 0 Ser Thr Phe Thr
Val 145 Lya Asn Phe Thr Ala 150 Asp Gin Gly Gly Lys 155 Phe Ile Arg Gin Leu 160
Gly Gly Ser Thr Phe 165 Lys Ala val Val Asn 170 Ile Asp Asn Cys Thr 175 Ile
Thr Asn Met Lys 180 Glu Ala Ile Phe 185 Thr Asp Ser Ser Thr 190 Ser Ser
Val Thr Met 195 Thr Asn Thr Arg Tyr 200 Ser Lys Val Gly Gin 20Ξ Lys Trp Ile
Gly Val 210 Lys His Ala Thr Glu 215 Arg Asn Asn His Glu 220 Phe
(2) Informacja o : 3EQ ID NO : 5
(i) Charakterystyka sekwencji
(A) Długość: 1248 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Rodzaj niciowości: pojedyn
(D) Topologia: liniowa
ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)
xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 5:
TTGCGATATT TAAAACAGGC GTCACATTAT AAAGGGAGCG GTAACGTGAG TCTACAGAAA 60
ATAAAACAAG AGATTGTAAA GAAGCTGAAG GTTCCGGTAT TTCCGAATCG CTCATTTGAT 120
GTCACATCGT TTGGGGCTGA CGAAAACGGA AAAAACGATT CGACCGAAGC GATACAGAAG 180
GCGATTGATC AAGCCCACCA AGCCGGCGGC GGAAGAGTAA CGGTTCCTGA AGGCGTGTTT 240
CTTTCCGGTG CGCTCAGATT GAAAAGCAAT GTGGATCTTC ATATTGCAAA OGGAGCGGTG 300
ATCAAATTCA GTCAGAACCC TGAAGATTAT CTCCCTGTTG TGCTGACGAG GTTTGAAGGA 360
GTCGAGCTCT ATAATTATTC ACCGCTCATC TACGCTTACG AAGCCGATAA TATTGCGATA 420
ACCGGAAAGG GCACGCTTGA CGGTCAAGGA GATGACGAGC ATTGGTGGCC GTGGAAAAGA 480
GGAACGAACG GCCAGCCTTC ACAGGAAAAA GATCGGAACG CTTTGTTTGA AATGGCTGAG 540
CGCGGTATCC CGGTCACTGA GCGGCAGTTT GGAAAAGGGC ATTATTTGCG GCCGAATTTC 600
ATTCAGCCGT ATCGCTGCAA ACATATATTG ATTCAAGGCG TCACTGTGCT GAATTCGCCG £60
ATGTGGCAAG TTCATCCCGT GCTTTGCGAG AATGTGACAG TGGACGGCAT CAAAGTCATC 720
GGACACGGCC CCAATACCGA CGGAGTCAAC CCGGAATCGT GTAAAAACGT GGTGATCAAG 780
GGCTGCCATT TTGATAATGG AGACGACTGC ATCGCCGTCA AATCGGGAAG AAATGCGGAC 840
GGCCGAAGGA TCAACATTCC GTCGGAAAAC ATCGTCATTG AACATAACGA AATGAAAGAC 900
GGGCATGGAG GGGTCACGAT CGGAAGCGAA ATTTCCGGCG GCGTGAAGAA CGTCATCGCA 960
PL 198 507 B1
GAGGGCAATC TTATGGACAG CCCGAACTTG GACAGAGCCC TCCGCATTAA aacgaattcg 1020
GTGCGTGGCG □CGTTCTTGA AAACATCTAC TTTCACAAAA ATACGGTCAA AAGCTTGAAG 1000
CGCGAATTGA TCGCCATCGA TATGGAATAT GAAGAAGGAG ATGCCGOAGA TTTCAAACCT 1140
GTCGTCCGCA CGGTTGGATG TTTAACAACT GAAAAGCATG GGCGGACATT ACGGGATCAG 1200
GGTGCTGGCA TACGACCACT CTCCGGTCAC CGGGCTGAAA GTGGCTGA 12 4 B
(2) Informacja o SEQ ID NO: 6:
(i) Charakterystyka sekwencji:
Łeu 1 ' Arg Tyr Leu Lys 5 Gin Ala Ser His Tyr 10 Lys Gly Ser Gly Asn 15 Val
Ser Leu Gin Lys 20 Ile Lys Gin Glu Ile 25 Val Lys Lys Leu Lys 30 Val Pro
Val Phe Pro 35 Asn Arg Ser Phe Asp 40 Val Thr Ser Phe Gly 45 Ala Asp Glu
Asn Gly 50 Lys Asn Asp Ser Thr 55 Glu Ala Ile Gin Lys 60 Ala Ile Asp Gin
Ala 65 His Gin Ala Gly Gly 70 Gly Arg Val Thr Val 75 Pro Glu Gly Val Phe 80
Leu Ser Gly Ala Leu 85 Arg Leu Lys Ser Asn 90 Val Asp Leu His Ile 95 Ala
Lys Gly Ala Val 100 Ile Lys Phe Ser Gin 105 Asn Pro Glu Asp Tyr 110 Leu Pro
Val Val Leu 115 Thr Arg Phe Glu Gly 120 Val Glu Leu Tyr Asn 125 Tyr Ser Pro
Leu Ile 130 Tyr Ala Tyr Glu Ala 135 Asp Asn Ile Ala Ile 140 Thr Gly Lys Gly
Thr 145 Leu Asp Gly Gin Gly 150 Asp Asp Glu His Trp 155 Trp Pro Trp Lys Arg 160
Gly Thr Asn Gly Gin 165 Pro Ser Gin Glu Lys 170 Asp Arg Asn Ala Leu 175 phe
Glu Met Ala Glu 180 Arg Gly Ile Pro Val 185 Thr Glu Arg Gin Phe 190 Gly Lys
Gly His Tyr 195 Leu Arg Pro Asn Phe 200 Ile Gin Pro Tyr Arg 205 Cys Lys His
Ile Leu 210 Ile Gin Gly Val Thr 215 Val Leu Asn Ser Pro 220 Met Trp Gin Val
Els 225 Pro Val Leu Cys Glu 230 Asn Val Thr val Asp 235 Gly Ile Lys Val Ile 240
Gly His Gly Pro Asn 245 Thr Asp Gly Val Asn 250 Pro Glu Ser cys Lys 255 Asn
Val Val Ile Lys 260 Gly Cys His Phe Asp 265 Asn Gly Asp Asp Cys 270 Ile Ala
Val Lys Ser 275 Gly Arg Asn Ala Asp 280 Gly Arg Arg Ile Asn 285 Ile Pro Ser
PL 198 507 B1
Glu Asn 290 Ile Val Ile Glu His 295 Asn Glu Met Lys Asp 300 Gly His Gly Gly
val 305 Thr Ile Gly Ser Glu 310 Ile Ser Gly Gly Val 315 Lys Asn Val Ile Ala 320
Glu Gly Asn Leu Met 325 Asp Ser Pro Asn Leu 330 Asp Arg Ala Leu Arg 335 Ile
Lys Thr Asn Ser 340 val Arg Gly Gly Val 345 Leu Glu Asn Ile Tyr 350 Phe His
Lys Asn Thr 355 Val Lys Ser Leu Lys 360 Arg Glu Leu Ile Ala 365 Ile Asp Met
Glu Tyr 370 Glu Glu Gly Asp Ala 375 Gly Asp Phe Lys Pro 3ao Val Val Arg Thr
Val 3B5 Gly Cys Leu Thr Thr 390 Glu Lys His Gly Arg 395 Thr Leu Arg Asp Gin 400
Gly Ala Gly Ile Arg 405 Pro Leu Ser Gly His 410 Arg Ala Glu Ser Gly 415
(2) Informacja o SEQ ID NO: 7:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1026 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 7
ATGAAGAAAT taatcagcat CATCTTTATC TTTGTATTAG GGGTTGTCGG gtcattgaca 60
GCGGCGGTTT CGGCAGAAGC AGCTTCTGCC TTAAACTCGG GCAAAGTAAk TCCGCTTGCC 120
GACTTCAGCT TAAAAGGCTT TGCCGCACTA AACGGCGGAA CAACGGGCGG AGAAGGCGGT 1B0
CAGACGGTAA CCGTAACAAC GGGAGATCAG CTGATTGCGG CATTAAAAAA TAAGAATGCA 240
AATACGCCTT TAAAAATTTA TGTCAACGGC ACCATTACAA CATCAAATAC ATCCGCATCA 300
AAGATTGACG TCAAAGACGT GTCAAACGTA TCGATTGTCG GATCAGGGAC CAAAGGGGAA 360
CTCAAAGGGA TCGGCATCAA AATATGGCGG GCCAACAACA TCATCATCCG CAACTTGAAA 420
ATTCACGAGG TCGCCTCAGG CGATAAAGAC GCGATCGGCA TTGAAGGCCC TTCTAAAAAC 4B0
ATTTGGGTTG ATCATAATGA GCTTTACCAC AGCCTGAACG TTGACAAAGA TTACTATGAC 540
GGATTATTTG ACGTCAAAAG AGATGCGGAA TATATTACAT TCTCTTGGAA CTATGTGCAC 600
GATGGATGGA AATCAATGCT GATGGGTTCA TCGGACAGCG ATAATTACAA CAGGACGATT 660
ACATTCCATC ATAACTGGTT TGAGAATCTG AATTCGCGTG TGCCGTCATT CCGTTTCGGA 720
GAAGGCCATA TTTACAACAA CTATTTCAAT AAAATCATCG ACAGCGGAAT TAATTCGAGG 780
ATGGGCGCGC GCATCAGAAT TGAGAACAAC CTCTTTGAAA ACGCCAAAGA TCCGATTGTC 840
TCTTGGTACA GCAGTTCACC GGGCTATTGG CATGTATCCA ACAACAAATT TGTAAACTCT 900
aggggcagta TGCCGACTAC CTCTACTACA ACCTATAATC CGCCATACAG CTACTCACTC 960
PL 198 507 B1
GACAATGTCG ACAATGTAAA ATCAATCGTC AAGCAAAATG CCGGAGTCGG CAAAATCAAT 1020 CCATAA 1026 (2) Informacja o SEQ ID NO: 8:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 341 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd
(xi ) Opis sekwe ncj i: SEQ ID NO : 8:
Met 1 Lys Lys Leu Ile 5 Ser Ile Ile Phe Ile 10 Phe Val Leu Gly Val Val 15
Gly Ser Leu Thr Ala 20 Ala val Ser Ala 25 Glu Ala Ala Ser Ala Leu Asn 30
Ser Gly Lys 35 Val Asn Pro Leu Ala 40 Asp Phe Ser Leu Lys Gly Phe Ala 45
Ala Leu Asn 50 Gly Gly Thr Thr 55 Gly Gly Glu Gly Gly Gin Thr Val Thr 60
Val 65 Thr Thr Gly Asp Gin Leu 70 Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys Asn Ala 75 BO
Asn Thr Pro Leu Lys 85 Ile Tyr Val Asn Gly 90 Thr Ile Thr Thr Ser Asn 95
Thr Ser Ala Ser Lys 100 Ile Asp Val Lys 105 Asp val ser A3n Val Ser Ile 110
Val Gly Ser 115 Gly Thr Lys Gly Glu 12 0 Leu Lys Gly Ile Gly Ile Lys Ile 125
Trp Arg Ala 13 0 Asn Asn Ile Ile 135 Ile Arg Asn Leu Lys ile His Glu Val 140
Ala 145 Ser Gly Asp Lys Asp Ala 150 Ile Gly Ile Glu Gly Pro Ser Lys Asn 155 160
Ile Trp Val Asp His 165 Asn Glu Leu Tyr His 170 Ser Leu Asn Val Asp Lys 175
Aep Tyr Tyr Asp Gly 180 Leu Phe Asp Val 185 Lys Arg Asp Ala Glu Tyr Ile 190
Thr Phe Ser 195 Trp Asn Tyr Val His 200 Asp Gly Trp Lys Ser Met Leu Met 205
Gly Ser Ser 210 Asp Ser Asp Asn 215 Tyr Asn Arg Thr Ile Thr Phe His His 220
Asn 225 Trp Phe Glu Asn Leu Asn 230 Ser Arg Val Pro Ser Phe Arg Phe Gly 235 240
Glu Gly His Ile Tyr 245 Asn Asn Tyr Phe Asn 250 Lys Ile Ile Asp Ser Gly 255
ile Asn Ser Arg Met 260 Gly Ala Arg Ile 265 Arg Ile Glu Asn Asn Leu Phe 270
Glu Asn Ala 275 Lys Aep Pro Ile Val 280 Ser Trp Tyr Ser Ser Ser Pro Gly 285
Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly Ser Met
290 295 300
PL 198 507 B1
Pro Thr Thr 305 Ser Thr Thr 310 Thr Tyr Asn Pro Pro 31S Tyr Ser Tyr Ser Leu 320
Asp Asn Val Asp Asn 325 Val Lys Ser Ile Val 330 Lys Gin Asn Ala Gly 335 Val
Gly Lys Ile Asn 340 Pro
iformacj a O SDQ ID NO : 9:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1482 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 9:
GCTTCTGCCT TAAACTCGGG CAAAGTAAAT CCGCTTGCCG ACTTCAGCTT AAAAGGCTTT
GCCGCACTAA ACGGCGGAAC AACGGGCGGA GAAGGCGGTC AGACGGTAAC CGTAACAACG
GGAGATCAGC TGATTGCGGC ATTAAAAAAT AAGAATGCAA ATACGCCTTT AAAAATTTAT GTCAACGGCA CCATTACAAC ATCAAATACA TCCGCATCAA AGATTGACGT CAAAGACGTG
TCAAACGTAT CGATTGTCGG ATCAGGGACC AAAGGGGAAC TCAAAGGGAT CGGCATCAAA
ATATGGCGGG CCAACAACAT CATCATCCGC AACTTGAAAA TTCACGAGGT CGCCTCAGGC
GATAAAGACG CGATCGGCAT TGAAGGCCCT TCTAAAAACA TTTGGGTTGA TCATAATGAG
CTTTACCACA GCCTGAACGT TGACAAAGAT TACTATGACG GATTATTT3A CGTCAAAAJGA
GATGCGGAAT ATATTACATT CTCTTGGAAC TATGTGCACG ATGGATGGAA ATCAATGCTG
ATGGGTTCAT CGGACAGCGA TAATTACAAC AGGACGATTA CATTCCATCA TAACTGGTTT
GAGAATCTGA ATTCGCGTGT GCCGTCATTC CGTTTCGGAG AAGGCCATAT TTACAACAAC TATTTCAATA AAATCATCGA CAGCGGAATT AATTCGAGGA TGGGCGCGCG CATCAGAATT
GAGAACAACC TCTTTGAAAA CGCCAAAGAT CCGATTGTCT CTTGGTACAG CAGTTCACCG ggctattggc atgtatccaa caacaaattt gtaaactcta ggggcagtat gccgactacc
TCTACTACAA CCTATAATCC GCCATACAGC TACTCACTCG ACAATGTCGA CAATGTAAAA
TCAATCGTCA AGCAAAATGC CGGAGTCGGC AAAATCCAGC GCAGACCGCC AACACCGACC
CCGACTTCAC CGCCAAGCGC AAATACACCG GTATCAGGCA ATTTGAAGGT TGAATTCTAC
AACAGCAATC CTTCAGATAC TACTAACTCA ATCAATCCTC AGTTCAAGGT TACTAATACC
GGAAGCAGTG CAATTGATTT GTCCAAACTC ACATTGAGAT ATTATTATAC AGTAGACGGA CAGAAAGATC AGACCTTCTG GTGTGACCAT GCTOCAATAA TCGGCAGTAA CGGCAGCTAC AACGGAATTA CTTCAAATGT AAAAGGAACA TTTGTAAAAA TGAGTTCCTC AACAAATAAC GCAGACACCT ACCTTGAAAT AAGCTTTACA GGCGGAACTC TTGAACCGGG TGCACATGTT CAGATACAAG GTAGATTTGC AAAGAATGAC TGGAGTAACT ATACACAGTC AAATGACTAC TCATTCAAGT CTCGTTCACA GTTTGTTGAA TGGGATCAGG TAACAGCATA CTTOAACGGT GTTCTTGTAT GGGGTAAAGA ACCCGGTGGC AGTGTAGTAT AG (2) Informacja o SEQ ID NO: 10:
120
180
240
300
360
420
4B0
540
600
660
720
780
B40
900
960
1020
1080
114 0
1200
1260
1320
1380
1440
82
PL 198 507 B1 (i) Charakterystyka sekwencji
(A) Dłu igość: 493 aminokwasy
(B) (C) (D) (ii) Typ (xi) Opis Typ: aminokwas Rodzaj niciowości: pojedyncza Topologia: liniowa cząsteczki: peptyd sekwencji: SEQ ID NO: 10:
Ala 1 Ser Ala Leu Asn Ser 5 Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser 10 15
Leu Lys Gly Phe 20 Ala Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly ' 25 30
Gly Gin Thr 35 Val Thr Val Thr Thr Gly Asp Gin Leu Ile Ala Ala Leu 40 45
Lys Asn Lys 50 Asn Ala Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr 55 60
Ile 65 Thr Thr Ser Asn Thr 70 Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val 75 80
Ser Asn Val Ser Ile Val 85 Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly 90 95
Ile Gly Ile Lys 100 Ile Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu 105 110
Lys Ile His 115 Glu Val Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu 120 125
Gly Pro Ser 130 Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser 135 140
Leu 145 Asn Val Asp Lys Asp 150 Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg 155 160
Asp Ala Glu Tyr Ile Thr 165 Phe Ser Trp Asn Tyr Val Hie Asp Gly Trp 170 ' 175
Lys Ser Met Leu 180 Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr 185 190
Ile Thr Phe 195 His His Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro 200 205
Ser Phe Arg 210 Phe Gly Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys 215 220
Ile 225 Ile Asp Ser Gly Ile 230 Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg Ile Arg Ile 235 240
Glu Asn Asn Leu Phe Glu 245 Asn Ala Lys Asp Pro Ile Val Ser Trp Tyr 2S0 255
Ser Ser Ser Pro 260 Gly Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys phe Val Asn 265 270
Ser Arg Gly 275 Ser Met Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro 2S0 235
Tyr Ser Tyr 290 Ser Leu Asp Asn Val Asp Asn Val LyB Ser Ile Val Lys 295 300
Gin 305 Asn Ala Gly val Gly 310 Lys Ile Gin Arg Arg Pro Pro Thr Pro Thr 315 320
PL 198 507 B1
Pro Thr Ser Pro Pro 325 Ser Ala Asn Thr Pro Val Ser Gly Asn 330 Leu 335 Lys
Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp Thr Thr Asn Ser Ile Asn
340 345 350
Pro Gin Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser Ser Ala Ile Asp Leu Ser
355 360 365
Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val Asp Gly Gin Lys Asp Gin
370 375 380
Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile Gly Ser Asn Gly Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr Phe Val Lys Met Ser Ser
405 410 415
Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Ile Ser Phe Thr Gly Gly
420 425 430
Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gin Ile Gin Gly Arg Phe Ala Lys
435 440 445
Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gin Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Lys Ser
450 455 460
Arg Ser Gin Phe Val Glu Trp Asp Gin Val Thr Ala Tyr Leu Asn Gly
465 470 475 480
Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Val Val
485 490
Zastrzeżenia patentowe

Claims (18)

1. Liaza pektynianowa, która jest
i) polipeptydem zawierającym sekwencję aminokwasową przedstawioną w pozycjach 28-341 SEQ ID NO: 8, albo ii) analogiem polipeptydu określonego w i), który jest w co najmniej 70% homologiczny z tym polipeptydem.
2. Liaza pektynianowa według zastrz. 1 pochodząca z Bacillus licheniformis ATCC 14580 lub gatunków Bacillus, przy czym wszystkie gatunki są korzystnie homologiczne w co najmniej 99% do Bacillus licheniformis w oparciu o dopasowane sekwencje rDNA 16S.
3. Liaza pektynianowa według zastrz. 1, która wykazuje swoją optymalną aktywność przy pH wyższym niż 8, korzystnie przy pH wyższym niż 9.
4. Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa, kodująca polipeptyd wykazujący aktywność liazy pektynianowej, wybrana z grupy obejmującej:
a) cząsteczki polinukleotydowe o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO: 7 od nukleotydu 82 do nukleotydu 1026;
b) cząsteczki polinukleotydowe kodujące polipeptyd, który jest w co najmniej 70% identyczny z sekwencją aminokwasową z SEQ ID NO: 8 od reszty aminokwasowej 28 do reszty aminokwasowej 341 i
c) zdegenerowane sekwencje nukleotydowe z (a) lub (b).
5. Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 4, gdzie polinukleotydem jest DNA.
6. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera następujące funkcjonalnie połączone elementy: promotor transkrypcji; odcinek DNA wybrany z grupy obejmującej a) cząsteczki polinukleotydowe kodujące polipeptyd wykazujący aktywność liazy pektynianowej, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO: 7 od nukleotydu 1 do nukleotydu 1026; b) cząsteczki polinukleotydowe kodujące polipeptyd wykazujący aktywność liazy pektynianowej, który jest w co najmniej 70% identyczny z sekwencją aminokwasową z SEQ ID NO: 8 od reszty aminokwasowej 28 do reszty aminokwasowej 341 i c) zdegenerowane sekwencje nukleotydowe z (a) lub (b); oraz terminator transkrypcji.
PL 198 507 B1
7. Hodowana komórka, znamienna tym, że do komórki tej wprowadzono wektor ekspresyjny określony w zastrz. 6, przy czym w tej komórce zachodzi ekspresja polipeptydu kodowanego przez odcinek DNA.
8. Sposób wytwarzania polipeptydu wykazującego aktywność liazy pektynianowej, znamienny tym, że hoduje się komórkę, do której wprowadzono wektor ekspresyjny określony w zastrz. 6, przy czym w tej komórce zachodzi ekspresja polipeptydu kodowanego przez odcinek DNA; oraz odzyskuje się polipeptyd.
9. Preparat enzymu, znamienny tym, że zawiera oczyszczony polipeptyd wytworzony sposobem określonym w zastrz. 8 lub liazę pektynianową określoną w zastrz. 1.
10. Preparat według zastrz. 9, znamienny tym, że ponadto zawiera jeden lub większą liczbę enzymów wybranych z grupy obejmującej proteazy, celulazy (endoglukanazy), β-glukanazy, hemicelulazy, lipazy, peroksydazy, lakkazy, α-amylazy, glukoamylazy, kutynazy, pektynazy, reduktazy, oksydazy, fenoloksydazy, ligninazy, pululanazy, arabinozydazy, mannanazy, ksyloglukanazy, ksylanazy, acetyloesterazy pektynowe, poligalakturonazy, ramnogalakturonazy, galaktanazy, liazy pektynowe, inne liazy pektynianowe, metyloesterazy pektynowe, celobiohydrolazy, transglutaminazy i ich mieszaniny.
11. Kompozycja detergentowa, znamienna tym, że zawiera preparat enzymu określony w zastrz. 9 lub enzym określony w zastrz. 1, oraz środek powierzchniowo czynny.
12. Sposób prania tkanin w pralkach, znamienny tym, że na tkaninę podczas cyklu prania w procesie prania w pralkach działa się roztworem piorącym zawierającym preparat enzymu określony w zastrz. 9, lub enzym określony w zastrz. 1.
13. Sposób polepszania właściwości celulozowych włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny, znamienny tym, że na włókna, przędzę lub tkaninę działa się skuteczną ilością preparatu enzymu określonego w zastrz. 9, lub skuteczną ilością enzymu określonego w zastrz. 1.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że preparat enzymu lub enzym stosuje się na etapie procesu prania.
15. Sposób degradacji lub modyfikowania materiału roślinnego, znamienny tym, że na materiał roślinny działa się skuteczną ilością preparatu enzymu określonego w zastrz. 9, lub skuteczną ilością enzymu określonego w zastrz. 1.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako materiał rośliny stosuje się materiał, który stanowi powtórnie przetwarzana makulatura, mechanicznie otrzymana masa papiernicza lub włókna poddane procesowi roszenia.
17. Sposób wytwarzania paszy dla zwierząt, znamienny tym, że skuteczną ilość preparatu enzymu określonego w zastrz. 9, lub skuteczną ilość enzymu określonego w zastrz. 1 dodaje się jako dodatek paszowy dla zwierząt do powszechnie stosowanych składników paszy dla zwierząt.
18. Sposób obróbki wina lub soku, znamienny tym, że na wino lub sok działa się skuteczną ilością preparatu enzymu określonego w zastrz. 9, lub skuteczną ilością enzymu określonego w zastrz. 1.
PL341143A 1997-11-24 1998-11-24 Liaza pektynianowa, wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa, wektor ekspresyjny, hodowana komórka, sposób wytwarzania polipeptydu, preparat enzymu, kompozycja detergentowa, sposób prania tkanin, sposób polepszania właściwości celulozowych włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny, sposób degradacji lub modyfikowania materiału roślinnego, sposób wytwarzania paszy dla zwierząt i sposób obróbki wina lub soku PL198507B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK134497 1997-11-24
US09/073,684 US6124127A (en) 1997-11-24 1998-05-06 Pectate lyase
PCT/DK1998/000514 WO1999027083A1 (en) 1997-11-24 1998-11-24 PECTIN DEGRADING ENZYMES FROM $i(BACILLUS LICHENIFORMIS)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL341143A1 PL341143A1 (en) 2001-03-26
PL198507B1 true PL198507B1 (pl) 2008-06-30

Family

ID=26065617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL341143A PL198507B1 (pl) 1997-11-24 1998-11-24 Liaza pektynianowa, wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa, wektor ekspresyjny, hodowana komórka, sposób wytwarzania polipeptydu, preparat enzymu, kompozycja detergentowa, sposób prania tkanin, sposób polepszania właściwości celulozowych włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny, sposób degradacji lub modyfikowania materiału roślinnego, sposób wytwarzania paszy dla zwierząt i sposób obróbki wina lub soku

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP1032657B1 (pl)
JP (1) JP4246385B2 (pl)
KR (1) KR20010032381A (pl)
CN (1) CN1231581C (pl)
AT (1) ATE373087T1 (pl)
AU (1) AU1433999A (pl)
BR (1) BR9815015A (pl)
CA (1) CA2310806C (pl)
DE (1) DE69838433T2 (pl)
PL (1) PL198507B1 (pl)
TR (1) TR200001494T2 (pl)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008024778A1 (de) * 2008-05-23 2009-11-26 Ab Enzymes Gmbh Verwendung von pektinolytischen Enzymen zur Behandlung von Obst- und Gemüsemaische und Enzymsequenzen dazu
CN109385416B (zh) * 2018-10-09 2021-03-26 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 果胶酸裂解酶pl1w及其基因和应用
BR112021018461A2 (pt) * 2019-03-19 2023-02-28 Bayer Cropscience Lp Proteínas de fusão, bactérias recombinantes e fragmentos de exospório para saúde da planta
CN110819649A (zh) * 2019-10-08 2020-02-21 南京农业大学 一种重组果胶甲酯酶PbrPME的体外表达方法及其编码基因与应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP1032657B1 (en) 2007-09-12
CA2310806C (en) 2011-02-22
DE69838433T2 (de) 2008-06-12
CN1231581C (zh) 2005-12-14
JP2001524310A (ja) 2001-12-04
TR200001494T2 (tr) 2000-09-21
BR9815015A (pt) 2000-10-03
ATE373087T1 (de) 2007-09-15
PL341143A1 (en) 2001-03-26
JP4246385B2 (ja) 2009-04-02
CN1283225A (zh) 2001-02-07
CA2310806A1 (en) 1999-06-03
KR20010032381A (ko) 2001-04-16
DE69838433D1 (de) 2007-10-25
EP1032657A1 (en) 2000-09-06
AU1433999A (en) 1999-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4246386B2 (ja) 新規なペクチン酸リアーゼ
US7273745B2 (en) Pectate lyases
EP1305408B1 (en) Cell-wall degrading enzyme variants
US6124127A (en) Pectate lyase
WO1999027083A1 (en) PECTIN DEGRADING ENZYMES FROM $i(BACILLUS LICHENIFORMIS)
JP4047545B2 (ja) 新規マンナナーゼ
CN101864406A (zh) 内切-β-1,4-葡聚糖酶
JP2004500004A5 (pl)
US6808915B2 (en) Cell-wall degrading enzyme variants
US6429000B1 (en) Pectin degrading enzymes from Bacillus licheniformis
JP4837855B2 (ja) 新規エンド−β−１，４−グルカナーゼ
US6399351B1 (en) Pectate lyases
WO2000055309A1 (en) Novel pectate lyases
JP4246385B2 (ja) バチルス・リケニホルミスからのペクチン分解酵素
MXPA00005110A (en) Pectin degrading enzymes from bacillus licheniformis
MXPA00005108A (es) Nuevas pactato liasas
US6331426B1 (en) Bacterial galactanases and use thereof