PL198749B1 - Sposób oznaczania skierowanych na fosfatazę toksyn, które hamują fosfatazy białkowe, zestawy do wykrywania tych toksyn oraz ich zastosowanie - Google Patents
Sposób oznaczania skierowanych na fosfatazę toksyn, które hamują fosfatazy białkowe, zestawy do wykrywania tych toksyn oraz ich zastosowanieInfo
- Publication number
- PL198749B1 PL198749B1 PL347632A PL34763299A PL198749B1 PL 198749 B1 PL198749 B1 PL 198749B1 PL 347632 A PL347632 A PL 347632A PL 34763299 A PL34763299 A PL 34763299A PL 198749 B1 PL198749 B1 PL 198749B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- immobilized
- ligand
- toxin
- phosphatase
- binding
- Prior art date
Links
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 169
- 239000003053 toxin Substances 0.000 title claims abstract description 169
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 title claims abstract description 169
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 155
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 58
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108010073357 cyanoginosin LR Proteins 0.000 claims description 56
- OWHASZQTEFAUJC-GJRPNUFSSA-N (5r,8s,11r,12s,15s,18s,19s,22r)-15-[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-8-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-18-[(1e,3e,5s,6s)-6-methoxy-3,5-dimethyl-7-phenylhepta-1,3-dienyl]-1,5,12,19-tetramethyl-2-methylidene-3,6,9,13,16,20,25-heptaoxo-1,4,7,10,14,17,21-heptazac Chemical compound C([C@H](OC)[C@@H](C)\C=C(/C)\C=C\[C@H]1[C@@H](C(=O)N[C@H](CCC(=O)N(C)C(=C)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@H]([C@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1)C(O)=O)C(O)=O)C)C1=CC=CC=C1 OWHASZQTEFAUJC-GJRPNUFSSA-N 0.000 claims description 43
- OWHASZQTEFAUJC-UHFFFAOYSA-N MCYR Natural products COC(Cc1ccccc1)C(C)C=C(/C)C=CC2NC(=O)C(CCCNC(=N)N)NC(=O)C(C)C(NC(=O)C(Cc3ccc(O)cc3)NC(=O)C(C)NC(=O)C(=C)N(C)C(=O)CCC(NC(=O)C2C)C(=O)O)C(=O)O OWHASZQTEFAUJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 108010080307 microcystin YR Proteins 0.000 claims description 41
- OWHASZQTEFAUJC-BKBILFGQSA-N microcystin-YR Natural products CO[C@@H](Cc1ccccc1)[C@@H](C)C=C(C)C=C[C@@H]2NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@@H](C)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc3ccc(O)cc3)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(=C)N(C)C(=O)CC[C@@H](NC(=O)[C@H]2C)C(=O)O)C(=O)O OWHASZQTEFAUJC-BKBILFGQSA-N 0.000 claims description 41
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 102000006478 Protein Phosphatase 2 Human genes 0.000 claims description 26
- 108010058956 Protein Phosphatase 2 Proteins 0.000 claims description 26
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 21
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims description 18
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 claims description 17
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 17
- QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N okadaic acid Chemical compound C([C@H](O1)[C@H](C)/C=C/[C@H]2CC[C@@]3(CC[C@H]4O[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]4O3)=C)[C@@H](O)C[C@H](C)[C@@H]3[C@@H](CC[C@@]4(OCCCC4)O3)C)O2)C(C)=C[C@]21O[C@H](C[C@@](C)(O)C(O)=O)CC[C@H]2O QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N 0.000 claims description 17
- VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N okadaic acid Natural products CC(CC(O)C1OC2CCC3(CCC(O3)C=CC(C)C4CC(=CC5(OC(CC(C)(O)C(=O)O)CCC5O)O4)C)OC2C(O)C1C)C6OC7(CCCCO7)CCC6C VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 claims description 16
- ZYZCGGRZINLQBL-GWRQVWKTSA-N microcystin-LR Chemical compound C([C@H](OC)[C@@H](C)\C=C(/C)\C=C\[C@H]1[C@@H](C(=O)N[C@H](CCC(=O)N(C)C(=C)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]([C@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(O)=O)C(O)=O)C)C1=CC=CC=C1 ZYZCGGRZINLQBL-GWRQVWKTSA-N 0.000 claims description 15
- DIDLWIPCWUSYPF-UHFFFAOYSA-N microcystin-LR Natural products COC(Cc1ccccc1)C(C)C=C(/C)C=CC2NC(=O)C(NC(CCCNC(=N)N)C(=O)O)NC(=O)C(C)C(NC(=O)C(NC(CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)C(C)NC(=O)C(=C)N(C)C(=O)CCC(NC(=O)C2C)C(=O)O)C(=O)O DIDLWIPCWUSYPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- IXBQSRWSVIBXNC-HSKGSTCASA-N Nodularin Chemical compound C([C@H](OC)[C@@H](C)\C=C(/C)\C=C\[C@H]1[C@@H](C(=O)N[C@H](CCC(=O)N(C)C(=C\C)/C(=O)N[C@H]([C@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1)C(O)=O)C(O)=O)C)C1=CC=CC=C1 IXBQSRWSVIBXNC-HSKGSTCASA-N 0.000 claims description 12
- IXBQSRWSVIBXNC-UHFFFAOYSA-N Nodularin Natural products N1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(=CC)N(C)C(=O)CCC(C(O)=O)NC(=O)C(C)C1C=CC(C)=CC(C)C(OC)CC1=CC=CC=C1 IXBQSRWSVIBXNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108010065793 nodularin Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 12
- 231100000784 hepatotoxin Toxicity 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 3
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 241000199914 Dinophyceae Species 0.000 description 7
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 7
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 7
- 241000237536 Mytilus edulis Species 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 235000020638 mussel Nutrition 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 6
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRUWWOSWHXIIIA-UKPGNTDSSA-N Cyanoginosin Chemical compound N1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](C)[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)N(C)C(=O)CC[C@H](C(O)=O)N(C)C(=O)[C@@H](C)[C@@H]1\C=C\C(\C)=C\[C@H](C)[C@@H](O)CC1=CC=CC=C1 SRUWWOSWHXIIIA-UKPGNTDSSA-N 0.000 description 4
- -1 Haugland Substances 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108010067094 microcystin Proteins 0.000 description 4
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 4
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000059630 Nodularia <Cyanobacteria> Species 0.000 description 3
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 3
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 3
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 3
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 3
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 3
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 241000192660 Aphanizomenon Species 0.000 description 2
- 206010011703 Cyanosis Diseases 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 241000192709 Microcystis sp. Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000237503 Pectinidae Species 0.000 description 2
- 241000571822 Prorocentrum sp. Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- RFCWHQNNCOJYTR-IRCAEPKSSA-N Tautomycin Chemical compound O([C@H]([C@H](CC1)C)[C@H](C)CC[C@H](O)[C@H](C)C(=O)C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C=2C(OC(=O)C=2C)=O)C(C)C)[C@@]21CC[C@@H](C)[C@H](CC[C@H](C)C(C)=O)O2 RFCWHQNNCOJYTR-IRCAEPKSSA-N 0.000 description 2
- RFCWHQNNCOJYTR-UHFFFAOYSA-N Tautomycin Natural products CC=1C(=O)OC(=O)C=1C(O)CC(=O)OC(C(C)C)C(OC)C(O)CC(=O)C(C)C(O)CCC(C)C(C(CC1)C)OC21CCC(C)C(CCC(C)C(C)=O)O2 RFCWHQNNCOJYTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 239000003673 groundwater Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 2
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 235000020637 scallop Nutrition 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- BFYCFODZOFWWAA-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethylpyridine-3-carbaldehyde Chemical compound CC1=CC(C)=C(C=O)C(C)=N1 BFYCFODZOFWWAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000237519 Bivalvia Species 0.000 description 1
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 1
- 241000218612 Dinophysis Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000192701 Microcystis Species 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 241000192520 Oscillatoria sp. Species 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- PSKIOIDCXFHNJA-UHFFFAOYSA-N Sanshool Natural products CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(=O)NC(C)C PSKIOIDCXFHNJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 208000004891 Shellfish Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- SBXYHCVXUCYYJT-UEOYEZOQSA-N alpha-Sanshool Chemical compound C\C=C\C=C\C=C/CC\C=C\C(=O)NCC(C)C SBXYHCVXUCYYJT-UEOYEZOQSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000012206 bottled water Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 235000020639 clam Nutrition 0.000 description 1
- 239000003653 coastal water Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000741 diarrhetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 1
- 235000001497 healthy food Nutrition 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000334 hepatotoxic Toxicity 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- CSMWJXBSXGUPGY-UHFFFAOYSA-L sodium dithionate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)S([O-])(=O)=O CSMWJXBSXGUPGY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Devices For Conveying Motion By Means Of Endless Flexible Members (AREA)
- Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
Abstract
1. Sposób oznaczania toksyn skierowanych na fosfataz e, które hamuj a fosfatazy bia lkowe, znamienny tym, ze obejmuje kontaktowanie pod loza sta lego z immobilizowanym na nim ligandem, z: (i) próbk a podejrzan a o zanieczyszczenie toksyn a i (ii) nieimmobilizowanym ligandem, przy czym immobilizowany ligand jest zdolny do wi azania z przynajmniej jedn a z toksyn, z nieimmobilizowanym ligan- dem lub z kompleksami toksyny i nieimmobilizowanego liganda, a nieimmobilizowany ligand jest zdolny do wi azania z przynajmniej jednym immobilizowanym ligandem, z toksyn a lub z kompleksami toksyny i immobilizowanego liganda, przez co ilo sc immobilizowanego liganda zwi azanego przez toksyn e, nieimmobilizowany ligand lub kompleksy toksyny i nieimmobilizowanego liganda zale zy od zawarto sci toksyny w próbce, a immobilizowany i/lub nieimmobilizowany wiazacy toksyn e ligand jest enzymem fosfataz a bia lkow a oraz immobilizowany ligand jest zdolny do generowania bezpo- srednio lub po srednio wykrywalnego sygna lu, gdy nie jest skom- pleksowany, gdy jest skompleksowany przez toksyn e, gdy jest skompleksowany przez kompleks toksyny i nieimmobilizowane- go liganda lub gdy jest skompleksowany przez nieimmobilizowa- ny ligand, lub nieimmobilizowany ligand jest zdolny do generowa- nia sygna lu wykrywalnego bezpo srednio lub po srednio, gdy nie jest skompleksowany lub gdy jest skompleksowany,…. PL PL PL PL
Description
(i) próbką podejrzaną o zanieczyszczenie toksyną i (ii) nieimmobilizowanym ligandem, przy czym immobilizowany ligand jest zdolny do wiązania z przynajmniej jedną z toksyn, z nieimmobilizowanym ligandem lub z kompleksami toksyny i nieimmobilizowanego liganda, a nieimmobilizowany ligand jest zdolny do wiązania z przynajmniej jednym immobilizowanym ligandem, z toksyną lub z kompleksami toksyny i immobilizowanego liganda, przez co ilość immobilizowanego liganda związanego przez toksynę, nieimmobilizowany ligand lub kompleksy toksyny i nieimmobilizowanego liganda zależy od zawartości toksyny w próbce, a immobilizowany i/lub nieimmobilizowany wiążący toksynę ligand jest enzymem fosfatazą białkową oraz immobilizowany ligand jest zdolny do generowania bezpośrednio lub pośrednio wykrywalnego sygnału, gdy nie jest skompleksowany, gdy jest skompleksowany przez toksynę, gdy jest skompleksowany przez kompleks toksyny i nieimmobilizowanego liganda lub gdy jest skompleksowany przez nieimmobilizowany ligand, lub nieimmobilizowany ligand jest zdolny do generowania sygnału wykrywalnego bezpośrednio lub pośrednio, gdy nie jest skompleksowany lub gdy jest skompleksowany,....
PL 198 749 B1
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu oznaczania toksyn skierowanych na fosfatazę, zazwyczaj wytwarzanych przez mikroskopijne glony, takie jak sinice i bruzdnice.
Bruzdnice są zazwyczaj jednokomórkowymi, fotosyntetyzującymi glonami posiadającymi dwie wici. Pewne morskie bruzdnice (np. Prorocentrum sp. i Dinophysis sp.) wytwarzają toksyny ukierunkowane na fosfatazę, takie jak kwas okadaikowy i toksyna dinofizynowa, powodujące problemy żołądkowo-jelitowe u ludzi, którzy pobrali je z pokarmem. Tak więc glony te mogą stanowić problem, gdy zanieczyszczą środowisko życia przeznaczonych do spożycia skorupiaków/mięczaków.
Sinice, które są często określane jako niebiesko-zielone glony, są również organizmami fotosyntetyzującymi, które są zasadniczo organizmami wodnymi zasiedlającymi wody przybrzeżne, otwarte morza i oceany, rzeki, jeziora i wody gruntowe, lecz mogą być również organizmami ziemnymi znajdowanymi w butwiejących liściach i glebie.
Wiele gatunków i szczepów sinic, w szczególności Microcystis sp., Aphanizomenon sp., Anabena sp., Nodularia sp. i Oscillatoria sp., wytwarza toksyny, które wywołują chorobę w przypadku przyjmowania ich przez ludzi lub inne ssaki, ptaki i nawet ryby. Wprowadzenie takich toksyn do układu pokarmowego następuje dwoma podstawowymi drogami, zarówno przez wypicie zanieczyszczonej wody lub spożycie zanieczyszczonych owoców morza.
Sinice i bruzdnice wytwarzają dwa szczególne rodzaje toksyn. Neurotoksyny, przykładowo anatoksyny i saksitoksyny, powodują u ofiary paraliż, a co za tym idzie stan najczęściej określany jako porażenie w wyniku zatrucia skorupiakami/mięczakami. Zatrucia takimi neurotoksynami są rzadkie, lecz mogą okazać się śmiertelne.
Inna postać toksyny inaktywuje enzymy fosfatazy białkowe w komórce organizmu, wiążąc się z enzymami i wpł ywając na ich zdolność do defosforylacji substratów białkowych. Toksyny te są względnie powszechne i pewne z nich (takie jak pochodzące z bruzdnic kwas okadaikowy i toksyna dinofizynowa) mogą powodować nudności, wymioty i biegunkę, i co za tym idzie stan najczęściej określany jako zatrucie skorupiakami/ mięczakami z biegunką. Pewne toksyny skierowane na fosfatazę sprzyjają powstawaniu guzów i wystawienie na ich działanie może prowadzić do rozwoju raka. Inne, takie jak pochodzące z sinic mikrocystyna i nodularyna są toksyczne wobec wątroby, powodując jej uszkodzenie. Dominującymi toksynami skierowanymi na fosfatazę są mikrocystyna, nodularyna i kwas okadaikowy.
Najpowszechniejszymi źródłami zatruć toksyną bruzdnic są skorupiaki/mięczaki i rybie wątroby i najpowszechniejszą przyczyną zatrucia toksyną sinicy są zakażona woda pitna i/lub do kąpieli. Jednakże skorupiaki/mięczaki i woda mogą być siedliskiem zarówno toksyny sinicy jak i bruzdnicy. Szczególnie powszechnym źródłem toksyn pochodzących od glonów są omułki, gromadzą one bowiem toksyny odżywiając się wytwarzającym toksynę glonem. Zatrute mogą być również inne skorupiaki/mięczaki, przykładowo ostrygi, małże i przegrzebki.
Zanieczyszczone sinicami mogą zostać również zasoby wodne gospodarstw domowych, szczególnie pochodzenia gruntowego i w ten sposób stać się źródłem toksyny wprowadzonej bezpośrednio drogą pokarmową.
Istnieje pewne zainteresowanie dotyczące konsumpcji glonów i sinic jako wysokobiałkowej, zdrowej żywności i uzupełnienia diety. Nie istnieją oficjalne wytyczne regulujące sprawdzanie zbieranych glonów lub sinic pod kątem zanieczyszczenia szczepami wytwarzającymi toksyny i wprowadzanie na rynek takich rodzajów jak Anabena i Aphanizomenon jest szczególnie niepokojący bowiem wraz z nimi można znaleźć wiele szczepów wytwarzających toksyny.
Poza krótkotrwałymi dolegliwościami, kosztami leczenia, kosztami komercyjnymi w przemyśle wykorzystującym skorupiaki/mięczaki, stratami spowodowanymi nieobecnością w pracy itp., będącymi wynikiem wystawienia na działanie pochodzących z glonów toksyn, stwierdzono, jak wspomniano powyżej, że toksyny skierowane na fosfatazę, mikrocystyna i nodularyna, wywołują guzy i uważa się, że wielokrotne wystawienie na działanie tych toksyn na poziomie klinicznym lub subklinicznym, szczególnie w połączeniu z przyjmowaniem alkoholu na wysokim poziomie lub paleniem papierosów może wywoływać raka, w szczególności raka wątroby.
PL 198 749 B1
Obecnie istnieje szereg sposobów wykrywania i ilościowego oznaczania toksyn skierowanych na fosfatazę pochodzących z glonów i sinic. Pewna klasyczna metoda wymaga zmielenia omułków lub innych potencjalnych źródeł toksyn skierowanych na fosfatazę i wstrzyknięciu myszy uzyskanego z mielonych mięśni omułków ekstraktu. Występowanie i poziom zanieczyszczenia toksyną skierowaną na fosfatazę są określone w zależności od przeżywalności myszy (Stabell i wsp., (1992), Food. Chem. Toxicol. 30(2): 139-44). Jednoznacznie jest to przybliżona, wymagająca czasu i droga metoda oceny bezpieczeństwa pokarmu i kontroli jego jakości.
Inny sposób oznaczania wywołujących biegunkę toksyn skorupiaków (DSP, ang. diarrheal shellfish poisons) (EP-554458 na rzecz latron Laboratories Inc.) polega na zastosowaniu pierwszego i drugiego przeciwciał a skierowanego wobec toksyny w konwencjonalnym te ś cie „kanapkowym”.
Inny sposób obejmuje pomiar zmniejszenia aktywności enzymatycznej egzogennie dodanej fosfatazy, a co za tym idzie wykrycia w skorupiakach/mięczakach toksyn fosfatazy. Ponownie wymaga to zmielenia omółków lub innej tkanki skorupiaków/mięczaków, uwolnienia endogennej fosfatazy, której aktywność nakłada się na aktywność dodanej fosfatazy wpływając na czułość i dokładność testu (Sini i Mudge (1994)) w Detection Methods for Cyanobacterial Toxins, Red. Codd, Jeffries, Keevil i Potter, Royal Society of Chemistry oraz US-A-5180665 dla Charlesa Holmesa.
Tak więc istnieje zapotrzebowanie na szybki, czuły i tani test lub sposób pozwalający na jakościowe i/lub ilościowe oznaczenie obecności toksyn skierowanych na fosfatazę, w szczególności toksyn skierowanych na fosfatazę pochodzących z glonów lub sinic, w wodzie, skorupiakach/mięczakach i/lub jadalnych produktach z glonów lub sinic. W szczególności istnieje zapotrzebowanie na sposób oznaczania, który jest dostatecznie prosty, aby mógł być przeprowadzony na miejscu przez względnie mało biegły lub nie posiadający umiejętności personel, przykładowo sprzedawców ryb lub personel uzdatniający wodę, i nie wymaga wyposażenia laboratoryjnego lub specjalnych urządzeń do jego przeprowadzenia.
Tak więc, zgodnie z pierwszym aspektem obecny wynalazek dostarcza sposobu oznaczania toksyn skierowanych na fosfatazę, które hamują fosfatazy białkowe, obejmującego kontaktowanie podłoża stałego z immobilizowanym na nim ligandem, z:
(i) próbką podejrzaną o zanieczyszczenie toksyną i (ii) nieimmobilizowanym ligandem, przy czym immobilizowany ligand jest zdolny do wiązania z przynajmniej jedną z toksyn, z nieimmobilizowanym ligandem lub z kompleksami toksyny i nieimmobilizowanego liganda, a nieimmobilizowany ligand jest zdolny do wiązania z przynajmniej jednym immobilizowanym ligandem, z toksyną lub z kompleksami toksyny i immobilizowanego liganda, przez co ilość immobilizowanego liganda zwią zanego przez toksynę, nieimmobilizowany ligand lub kompleksy toksyny i nieimmobilizowanego liganda zależy od zawartości toksyny w próbce, oraz immobilizowany ligand jest zdolny do generowania bezpośrednio lub pośrednio wykrywalnego sygnału, gdy nie jest skompleksowany, gdy jest skompleksowany przez toksynę, gdy jest skompleksowany przez kompleks toksyny i nieimmobilizowanego liganda lub gdy jest skompleksowany przez nieimmobilizowany ligand, lub nieimmobilizowany ligand jest zdolny do generowania sygnału wykrywalnego bezpośrednio lub pośrednio, gdy nie jest skompleksowany lub gdy jest skompleksowany, oddzielenie związanej frakcji od frakcji niezwiązanej; oraz bezpośrednie lub pośrednie oznaczenie nieimmobilizowanego liganda związanego z immobilizowanym ligandem (frakcja związana) lub nieskompleksowanego w roztworze wodnym (frakcja niezwiązana);
przy czym nanoszenie (i) i (ii) na podłoże stałe może być prowadzone oddzielnie, kolejno lub równocześnie, a jeśli prowadzone jest oddzielnie lub kolejno, to może być prowadzone w dowolnej kolejności.
Zatem w pewnej postaci wykonania oznaczenie toksyny może wymagać oznaczenia nieimmobilizowanego liganda, który nie związał się bezpośrednio lub pośrednio z immobilizowanym ligandem. Gdy nieimmobilizowany ligand współzawodniczy w wiązaniu do immobilizowanego liganda z toksyną, wysoki poziom niezwiązanego liganda jest miarą wysokiego stężenia toksyny. Gdy nieimmobilizowany ligand może łączyć się z toksyną związaną z immobilizowanym ligandem, wtedy wysoki poziom niezwiązanego liganda wskazuje na niskie stężenie toksyny.
PL 198 749 B1
W kolejnej postaci wykonania, oznaczenie toksyny wymaga oznaczenia nieimmobilizowanego liganda, który wiąże się bezpośrednio lub pośrednio z immobilizowanym ligandem. Gdy toksyna i nieimmobilizowany ligand współzawodniczą o wiązanie do z immobilizowanym ligandem, wtedy wysoki poziom związanego liganda wskazuje na niskie stężenie toksyny. Gdy nieimmobilizowany ligand może łączyć się z toksyną związaną z immobilizowanym ligandem, wtedy wysoki poziom związanego liganda wskazuje na wysokie stężenie toksyny.
Jednakże, korzystnie sposób według wynalazku wykorzystuje test wiązania kompetycyjnego w celu oznaczenia toksyn skierowanych na fosfatazę , w szczególnoś ci toksyn z glonów i sinic, przy czym cząsteczki toksyny występujące w próbce współzawodniczą z nieimmobilizowanym ligandem o ograniczoną liczbę miejsc wiążących immobilizowanego liganda i jakakolwiek toksyna wystę pują ca we wspomnianej próbce jest określona w zależności od ilości nieimmobilizowanego liganda związanego z, lub niezwiązanego z miejscami wiążącymi immobilizowango liganda.
Stosowane niniejszym określenia „wykrycie, „oznaczenie lub „oszacowanie obejmują zarówno oznaczenia ilościowe w sensie uzyskania bezwzględnej wartości dla ilości lub stężenia występujących w próbce toksyn skierowanych na fosfatazę, jak również półilościowe i jakościowe oszacowania lub oznaczenia. Wskaźnik, proporcja, stężenie procentowe lub molarne określające poziom lub ilość występującej toksyny, mogą być określone lub alternatywnie można uzyskać proste wskazanie występowania lub nieobecności takich toksyn w próbce. W korzystnym aspekcie wynalazku uzyskiwane jest proste oznaczenie występowania lub braku lub półilościowe oznaczenie obecności toksyny. Zgodnie z tym „brak toksyny może oznaczać, że stężenie toksyny jest poniżej granicy wykrywania testu lub poniżej poziomu przyjętego za bezpieczny, lub który może być tolerowany.
Próbkami stosowanymi w sposobie oznaczania według wynalazku mogą być dowolne próbki podejrzane jako wystawione na działanie toksyn skierowanych na fosfatazę, możliwie przez ekspozycję wobec mikroorganizmów wytwarzających toksynę skierowaną na fosfatazę, przykładowo woda, która może być wodą morską, wodą słodką, wodą gruntową, wodą pobraną z jezior, rzek, studni, strumieni, zbiorników, zasobów wodnych gospodarstw domowych lub wilgoć uzyskana ze skorupiaków/mięczaków, przykładowo przez proste odwodnienie lub ekstrakcję przy pomocy pipety lub woda, w której umieszczono skorupiaki/mię czaki w celu ich namoczenia lub pokarm, dodatek pokarmowy, suplement żywieniowy, alternatywnie lekarstwa lub podobne produkty, które są wytwarzane przez lub z glonów lub sinic. Gdy skorupiak/mięczak zawiera niezwiązaną wodę (np. jak ma to miejsce w ostrygach), oznaczenie może wymagać zanurzenia absorbenta (podł oż a stałego) w wodzie. Alternatywnie może to po prostu wymagać ucisku adsorbenta na mokre ciało skorupiaka/mięczaka, np. po otwarciu muszli.
W korzystnej aspekcie wynalazku badana próbka jest wilgocią powierzchnią lub wolną ze skorupiaka/mięczaka.
Wszystkie rodzaje skorupiaków/mięczaków, przykładowo przegrzebki, krewetki, omułki i ostrygi mogą być poddane oznaczaniu sposobem według wynalazku, lecz w korzystnej postaci skorupiakami są omułki. W kolejnym, korzystnym aspekcie badana próbka jest wodą pobraną ze środowiska, w którym taki skorupiak/mię czak ż yje i w dalszym korzystnym aspekcie próbka jest wodą pobran ą z zasobów wodnych gospodarstw domowych.
Próbka stosowana do badania może być użyta zasadniczo w postaci nie poddanej obróbce, lecz może być ewentualnie filtrowana jakimkolwiek znanym sposobem, lub rozcieńczona przez dodanie wody, buforu lub jakiegokolwiek innego wodnego ośrodka przed analizą i może być przed analizą przechowywana lub zachowana przykładowo przez schłodzenie lub zamrożenie.
W sposobie wedł ug wynalazku jako immobilizowany lub nieimmobilizowany ligand mo ż e być użyty jakikolwiek wiążący toksynę ligand, przykładowo przeciwciała, które mogą być poliklonalnymi lub monoklonalnymi lub fragmentami przeciwciał, przykładowo fragmentami F(ab), F(ab')2 lub F(v). Takie przeciwciała lub fragmenty przeciwciał mogą być jednowartościowe lub dwuwartościowe i mogą być wytwarzane techniką hybrydom lub mogą być pochodzenia syntetycznego, jako produkty techniki rekombinowanego DNA lub syntezy chemicznej. Przykładowo, mogą być użyte przeciwciała jednołańcuchowe lub inne pochodne lub mimetyki przeciwciał. Przeciwciała lub fragmenty przeciwciał mogą być w zależności od potrzeb skierowane lub wywołane przeciwko jakiemukolwiek epitopowi, składnikowi lub strukturze toksyn nakierowanych na fosfatazę. Alternatywnie mogą być stosowane związki wykazujące powinowactwo do toksyny, przykładowo małe cząsteczki organiczne lub peptydy, np. oligopeptydy lub polipeptydy, zdolne do specyficznego wiązania toksyny, przykładowo specyficzna
PL 198 749 B1 substancja wiążąca otrzymana metodą chemii kombinatorycznej lub z biblioteki prezentacji na fagu, lub specyficznie wiążące sekwencje DNA lub RNA.
Jednak korzystnie ligand wiążący toksynę według wynalazku jest enzymem fosfatazą białkową, a nawet korzystniej jako wiążący ligand stosuje się w sposobie oznaczania według wynalazku fosfatazę białkową 2A (pp2A).
Podobnie drugi ligand stosowany w sposobie według wynalazku może być dowolnym ligandem, który wiąże się z toksyną albo kompetycyjnie albo niekompetycyjnie względem wiązania pierwszego liganda. Alternatywnie drugi ligand może być dowolnym ligandem, który współzawodniczy z toksyną o wiązanie z pierwszym ligandem. Korzystnie pierwszy ligand jest ligandem wiążącym toksynę, korzystniej enzymem fostatazą białkową. Jeden z dwóch ligandów musi być immobilizowany, drugi musi być nieimmobilizowany, a jeden z ligandów musi być bezpośrednio lub pośrednio wykrywalny. W korzystnej postaci nieimmobilizowany ligand powinien spełniać wymagania funkcjonalne polegające na tym, że hamuje kompetycyjnie wiązanie toksyny do immobilizowanego liganda i może bezpośrednio lub pośrednio wytwarzać wykrywalny sygnał, np. może to być cząsteczka, która może być wyznakowana ugrupowaniem o jakiejkolwiek znanej postaci wytwarzającym bezpośredni lub pośredni sygnał. Takie ligandy mogą podobnie przybierać postać przeciwciał, które mogą być poliklonalnymi lub monoklonalnymi lub fragmentami przeciwciał przykładowo fragmentami F(ab), F(ab')2 lub F(b). Takie przeciwciała lub fragmenty przeciwciał mogą być jednowartościowe lub dwuwartościowe i mogą być wytwarzane techniką hybrydom lub mogą być pochodzenia syntetycznego, jako produkty techniki rekombinowanego DNA lub syntezy chemicznej. Przykładowo, mogą być użyte przeciwciała jednołańcuchowe lub inne pochodne lub mimetyki przeciwciał oraz małe cząsteczki organiczne, peptydy, oligopeptydy i polipeptydy wybrane z biblioteki kombinatorycznej lub z biblioteki prezentacji na fagu, lub specyficznie wiążące sekwencje DNA lub RNA zdolne do specyficznego wiązania toksyny, przykładowo specyficzna substancja wiążąca otrzymana. Przeciwciała lub fragmenty przeciwciał w zależności od potrzeb mogą być skierowane lub wywołane przeciw jakimkolwiek epitopom, składnikom lub strukturom cząsteczki toksyny skierowanej na fosfatazę lub liganda, który wiąże się z cząsteczką skierowaną na fosfatazę. Alternatywnie, mogą być użyte związki o powinowactwie do toksyny lub do liganda, który wiąże toksynę, przykładowo mała cząsteczka organiczna lub peptyd, oligopeptyd lub polipeptyd zdolny do specyficznego wiązania toksyny lub ligand, który wiąże toksynę, przykładowo specyficzna substancja wiążąca wybrana przy pomocy chemii kombinatorycznej lub biblioteki prezentacji na fagu lub specyficznie wiążące sekwencje DNA lub RNA.
Ugrupowanie reporterowe, które będzie zasadniczo niesione przez jeden ligand, może być miejscem wiążącym dla bezpośrednio wykrywalnego ugrupowania, np. koloidalnego metalu (np. kolidalengo złota), chromoforu lub fluoroforu (np. cjanianu, ftalocjanianu, merocjanitu, trójfenylometylu, echinaceiny itp. patrz Topics in Applied Chemistry, Infrared Absorbing Chromophores, pod redakcją M. Mutsuoka, Plenum Press, New York, N Y, 1990, Topics in Applied Chemistry, The Chemistry and Application of Dyes, Waring i wsp. Plenum Press, Nowy Jork, NY, 1990 i Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Haugland, Molecular Probes Inc. 1996), znacznika promieniotwórczego, enzymu, cząstki magnetycznej, czynnika wywołującego zmętnienie itp. lub może być bezpośrednio takim wykrywalnym ugrupowaniem. Gdy ugrupowanie repoterowe jest niesione przez immobilizowany ligand to będzie ono zazwyczaj miejscem wiążącym dla bezpośrednio wykrywalnego ugrupowania, które to miejsce wiążące jest albo aktywowane albo zazwyczaj inaktywowane, gdy ligand jest skompleksowany.
Korzystnie, cząsteczka reporterowa jest niesiona przez nieimmobilizowany ligand.
W korzystnej postaci wynalazku nieimmobilizowany ligand jest wyznakowany, np. jest znakowanym enzymem lub chromoforem lub flouroforem peptydem hepatotoksyny, przykładowo hepatotoksyny wybranej spośród nodularyny, mikrocystyny LR lub mikrocystyny YR, lub alternatywnie kwasem okadaikowym.
Choć możliwe jest wyznakowanie znacznikiem promieniotwórczym, ze względu na fakt, że oznaczenie jest głównie przeznaczone do stosowania na miejscu przez niebędącego specjalistą użytkownika, korzystne jest zastosowanie ugrupowań reporterowych dostarczających widzialnego sygnału, np. chromoforów, fluoroforów, ugrupowań fosforescencyjnych, czynników powodujących zmętnienie, czynników wywołujących przemianę gazową itp.
Gdy ugrupowanie generujące sygnał jest materiałem, który wiąże się do miejsca wiążącego jednego z ligandów, to dogodnie będzie doprowadzane do kontaktu ze związaną lub niezwiązaną frakcją, zgodnie z zapotrzebowaniem, po rozdzieleniu frakcji związanej i niezwiązanej.
PL 198 749 B1
Ogólnie, gdy sygnał pochodzi z frakcji związanej, korzystne będzie przepłukanie podłoża np. wodą, w celu odpłukania niezwiązanej frakcji zanim ligand będzie wykryty lub wygenerowany i wykryty.
Wynalazek może się odnosić do jakichkolwiek gatunków lub szczepów glonów lub sinic wytwarzające toksyny skierowane na fosfatazę, lecz ma on szczególne zastosowanie dla wytwarzających toksynę szczepów sinic, przykładowo Microcystis aeroginosa, gatunków Anabena, Nodularia spuragena i Anabenaflus-aquae, lub glonów. Na przykład, toksyny mikrocystyna-LR i mikrocystyna-YR są wytwarzane przez Microcystis sp., toksyna nodularyna jest wytwarzana przez Nodularia sp., będący toksyną kwas okadaikowy jest wytwarzany przez Prorocentrum sp.
Toksyny podlegające oznaczeniu z zastosowaniem niniejszego sposobu mogą być podobnie jakąkolwiek wytwarzaną przez glony lub sinice toksyną skierowaną na fosfatazę, lecz w korzystnej postaci toksyny peptydowe są hepatotoksynami (z których najpowszechniejszymi są mikrocystyna i nodularyna) lub kwasem okadaikowym.
Zatem, w swoim najogólniejszym sensie sposób według wynalazku obejmuje po prostu kontaktowania próbki podejrzanej o zanieczyszczenie toksynami skierowanymi na fosfatazę z ligandem wiążącym toksynę i cząsteczką reporterową zdolną do współzawodnictwa ze wspomnianą toksyną o miejsca wiążące na ligandach, równocześ nie, kolejno lub oddzielnie w dowolnej kolejnoś ci, przy czym cząsteczka reporterowa jest ewentualnie związana z ligandem przed wystawieniem na działanie badanej próbki, oraz oznaczenie albo cząsteczek reporterowych związanych z fazą stałą albo wolnych w roztworze.
Przed oznaczeniem cząsteczki reporterowej, związana frakcja może być oddzielona od nie związanej frakcji każdą odpowiednią metodą, np. przez wytrącenie, wirowanie, filtrację, metodami chromatograficznymi, przez działywanie kapilarnie lub po prostu przez drenowanie. Faza stała może być np. w postaci paska lub matrycy stałej w dowolnej znanej postaci np. polimerowych lub magnetycznych perełek, na przykład Dynabeads® (dostępnych z Dynal AS). W korzystnym wariancie wynalazku, faza stała na której unieruchamiane są ligandy wiążące toksyny, jest w postaci Dynabeads®.
Cząsteczka reporterową może być oznaczana zarówno w związanej jak i niezwiązanej frakcji, w zależności od specyficznej postaci wykonania wynalazku, lecz korzystnie jest oznaczana we frakcji związanej.
Ligandy mogą być immobilizowane różnymi znanymi sposobami, np. przez wiązanie lub sprzęganie liganda z dowolnym z dobrze znanych podłóż stałych lub macierzy obecnie szeroko używanych lub proponowanych do rozdzielania lub unieruchamiania, np. fazie stałej można nadać formę cząstek, arkuszy, żeli, filtrów, membran, włókien, kapilar lub pasków do mikromiareczkowania, rurek lub płytek ze studzienkami itd., które odpowiednio mogą być wykonane ze szkła, krzemu, lateksu, materiału polimerowego czy perełek magnetycznych. Techniki wiązania ligandów do podłuż stałych są dobrze znane i szeroko opisane w literaturze. W korzystnej postaci wykonania niniejszego wynalazku, faza stała na której są umieszczone ligandy wiążące toksyny skierowane na fosfatazę, jest w postaci Dynabeads®.
Zaletą sposobu oznaczania według wynalazku jest to, że do jego przeprowadzenia nie potrzebna jest złożona aparatura laboratoryjna i może być stosunkowo łatwo przeprowadzony przez słabo wykwalifikowanie lub niewykwalifikowane osoby. Stąd, sposób oznaczania jest odpowiedni do stosowania w domu, w sklepach lub w terenie i może być przeprowadzony szybko i łatwo bez dużego nakładu pracy lub niebezpiecznych substancji chemicznych.
Szczególną zaletą testu według wynalazku jest bardzo wysoki stopień czułości, która ma zasadnicze znaczenie przy analizowaniu próbek, w których toksyna jest obecna na bardzo niskich poziomach np. przy testowaniu wody pitnej lub oznaczaniu możliwych zanieczyszczeń toksynami skierowanymi na fosfatazy. Typowo test może wykryć toksyny w stężeniach pikomolarnych, np. tak niskich jak 10 pM. Test może być wygodnie użyty do wykrycia toksyn w zakresie 15 do 560 pM.
Następną zaletą niniejszego testu, w porównaniu do istniejących technik, jest to że obecny test jest nie zależny od endogennych fosfataz, które mogą być obecne w próbkach podczas analizy, w szczególności np. jeżeli próbki są pobierane ze skorupiaków i mięczaków.
W jednej postaci wykonania wynalazku, fosfataza biał kowa jest immobilizowana na podł o ż u stałym, immobilizowaną fosfatazę kontaktuje się z badaną próbką i jakakolwiek obecna w próbce toksyna skierowana na fosfatazę wiąże się z immobilizowaną fosfatazą. Dodawane jest źródło cząsteczek reporterowych, które konkurują z toksyną o miejsca wiążące fosfatazy. Cząsteczki reporterowe wypierają cząsteczki toksyn z miejsc wiążących, w stopniu zależnym od względnego stężenia cząsteczek toksyn i cząsteczek reporterowych. Stopień wiązania cząsteczki reporterowej umożliwia wyznaczenie
PL 198 749 B1 stężenia toksyny obecnej w poddanej badaniu próbce. Wśród korzystnych reporterów/znaczników są znaczniki promieniotwórcze, chromofory (wraz z fluoroforami) i enzymy, które powodują powstawanie chromogennych lub fluorogennych produktów. Rozważane są znaczniki scyntylacyjne zależne od bliskości cząsteczek i znaczniki powodujące mierzalną zmianę w rozpraszaniu światła.
W alternatywnej postaci, zablokowane cząsteczkami reporterowymi cząsteczki fosfatazy immobilizowanej na podłożu stałym, kontaktuje się podczas badania z próbką i dowolne obecne w próbce toksyny skierowane na fosfatazy konkurują z cząsteczkami reporterowymi związanymi z fosfatazami, wypierając je z fazy stałej do fazy wodnej, w stopniu proporcjonalnym do ilości toksyny obecnej w próbce. Ilość cząsteczki reporterowej, która pozostała związana z fazą stałą jest następnie oznaczana, co umożliwia wyznaczenie stężenia toksyny obecnej w badanej próbce.
W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza zestawu do wykrywania toksyn skierowanych na fosfatazy z sinic lub glonów, przy czym zgodnie z wynalazkiem zestaw zawiera:
fazę stałą z immobilizowanym na niej ligandem;
nieimmobilizowany ligand, korzystnie w roztworze wodnym lub skompleksowany z immobilizowanym ligandem; gdzie żaden z rzeczonych immobilizowanych lub nieimmobilizowanych ligandów nie zawiera bezpośrednio lub pośrednio wykrywalnego ugrupowania, cząsteczkę reporterową zdolną do wiązania z jednym z rzeczonych immobilizowanych ligandów lub nieimmobilizowanych ligandów i generowania wykrywalnego sygnał u, przy czym korzystnie wykrywalne ugrupowanie lub sygnał jest odczytywany bez sprzętu laboratoryjnego.
W korzystnej postaci wykonania, zestaw wedł ug wynalazku zawiera:
fazę stałą z immobilizowanymi na niej ligandami wiążącymi toksyny skierowane na fosfatazy;
cząsteczkę reporterową zdolną do kompetycyjnego hamowania wiązania toksyn skierowanych na fosfatazę do ligandów wiążących toksyny i generowania sygnału, możliwego do odczytania bez aparatury laboratoryjnej.
W szczególnie korzystnej postaci zestaw według wynalazku zawiera zawiera polimerowe mikrosfery z immobilizowaną na nich fosfatazą białkową, które mogą być przesuwane w polu magnetycznym;
wyznakowane koloidalnym złotem cząsteczki peptydu hepatotoksyny zdolne do kompetycyjnego hamowania wiązania toksyny z sinic z białkową fosfatazą.
Następnie, w szczególnie korzystnej postaci wykonania zestaw według wynalazku zawiera polimerowe mikrosfery z przyłączoną do nich fosfatazą białkową, które mogą być przesuwane w polu magnetycznym;
wyznakowane koloidalnym złotem cząsteczki kwasu okadaikowego zdolne do kompetycyjnego hamowania wiązania toksyny z glonów z białkową fosfatazą.
W innym korzystnym aspekcie, zastosowanie zestawu polega na zanurzeniu porowatego, celulozowego podłoża, na którym immobilizowany jest ligand wiążący toksynę i które jest impregnowane kompetencyjnie wiążącym ligandem, znakowanym chromoforem (lub fluoroforem, itd.), w próbce wody lub płynu ze skorupiaków/mięczaków, inkubacji nasyconego podłoża przez wcześniej określony czas (albo po usunięciu z próbki albo w określonej wcześniej objętości próbki), usunięciu niezwiązanego znakowanego liganda, np. przez przepłukanie podłoża wodą wolną od toksyn lub pozostawienie podłoża zamoczonego przez określony czas w określonej objętości wody wolnej od toksyn, i sprawdzeniu koloru podłoża lub wody w której było ono pozostawione do zamoczenia. Wskazane jest aby, podłoże było przytwierdzone do podstawy, która jest korzystnie oznakowana kolorami kalibracyjnymi, ułatwiającymi porównanie koloru podłoża lub wody, w której było pozostawione do zamoczenia, w celu oznaczenia stężenia toksyn lub wykazania czy stężenie toksyn jest powyżej lub poniżej jednej lub więcej wartości granicznych.
Wynalazek został zilustrowany przez następujące, nie ograniczające go, przykłady:
Materiały
Mikrocystyna YR, Mikrocystyna-LR, kwas okadaikowy, nodularin, kalikulina A i tautomycyna zostały nabyte w Calbiochem (San Diego, CA). Wolny od nośnika Na125I i [Y-32P]ATP zostały otrzymane z Amersham (Little Chalfont, UK). Albumina (czystość dla testów RIA), octan amonu, Chloramina T, dwumetylosulfotlenek (DMSO), ditioerytrytol (DTE), EDTA, EGTA, glicerol, Hepes, histon II-AS, pirosiarczan sodu i inhibitor trypsyny (z ziaren soi) zostały nabyte w Sigma (St Louis, MO). Acetonitryl i kwas trójfluorooctowy (TFA) zostały nabyte w Rathburn (Walkerburn, Szkocja). Częściowo oczyszczona fosfataza białkowa 2A została nabyta w Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) lub oczyszczona zgodnie z Resink i wsp. (Eur. J. Biochem. 133: 455-461 (1983)).
PL 198 749 B1
Jodowanie mikrocystyny-YR
Mikrocystynę YR (10 μg) joduje się 1 mCi wolnym od nośnika Na125I (37 MBq) z użyciem chloraminy T, jak opisał Ciechanover i wsp. (PNAS 77: 1365-1368 (1980)). Po reakcji jodowania, jodek oddziela się od [125I] mikrocystyny YR z użyciem wkładów Sep-Pak® Plus (Waters, Milford, MA) zgodnie z metodą Runnegar i wsp. (Toxicon 24: 506-509 (1986)). [125I] mikrocystynę YR nanosi się na kolumnę HPLC Intersil ODS-2 3x250 mm z Chrompack (Raritan, NJ) i eluuje gradientem acetonitrylu.
Oznaczenie wiązania kompetycyjnego
Oznaczenie wiązania kompetycyjnego prowadzi się w objętości 0,5 ml buforowanej 50 mM Hepes (pH 7,2), 1 mM EDTA, 0,3 mM EGTA, 1 mM DTE, 5 mM MnCl2, 0,5 mg ml-1 BSA i 0,2 mg ml-1 inhibitorem trypsyny. Toksyny z glonów rozcieńczone w 100% DMSO dodaje się do oznaczenia w stężeniu 0-100nM w końcowym stężeniu 10% DMSO. [125I] mikrocystyna-YR (1 Ci/13 ng) została dodana w stężeniu 35pM. Fosfataza białkowa 2A (30pM) została dodana na końcu, a mieszanina reakcyjna była inkubowana w lodzie prze noc. [125I] mikrocystyna-YR związana z fosfatazą białkową 2A została oddzielona od wolnej [125I] mikrocystyny-YR przez filtrację w żelu z użyciem Sephadex® G-50 z Pharmacia (Uppsala, Szwecja) na kolumnach 0,7 x 15 cm z Bio-Rad (Hercules, CA). Rozdział prowadzi się w temperaturze 4°C z użyciem buforu 50 mM Hepes (pH 7,2) z 1 mM EDTA i 0,3 mM EGTA. Frakcja zawierająca [125I] mikrocystynę-YR związana z fosfatazą białkową 2A została zebrana i radioaktywność zliczono poprzez pomiar scyntylacji. Wykryto niespecyficzne wiązanie [125I] mikrocystyny-YR w reakcji kontrolnej, gdzie dodano nadmiar mikrocystyny-LR (1 μM).
P r z y k ł a d 1
Fosfataza białkowa 2A jest sprzęgana do perełek magnetycznych (bezpośrednio do perełek lub przez biotynylację fosfatazy). Immobilizowana fosfataza białkowa jest następnie mieszana z próbką i wyznakowaną radioaktywnie toksyną (np. [125I] mikrocystyna-YR). Immobilizowana fosfataza białkowa jest oddzielona od mieszaniny reakcyjnej w polu magnetycznym. Radioaktywność związana z fosfatazą białkową (perełki magnetyczne) jest wykrywana przez zliczanie scyntylacji. Ilość znacznika promieniotwórczego związanego z białkiem fosfatazy zmniejsza się jako funkcja ilości toksyny wiążącej fosfatazę w próbce.
P r z y k ł a d 2
Fosfataza białkowa 2A jest przyłączona do perełek magnetycznych (bezpośrednio do perełek lub przez biotynylację fosfatazy). Immobilizowana fosfataza białkowa jest następnie mieszana z próbką i toksyną związaną z kolorowymi perełkami. Immobilizowana fosfataza białkowa jest oddzielona od mieszaniny reakcyjnej w polu magnetycznym. Barwne perełki związane z fosfatazą białkową (perełki magnetyczne) są oceniane wzrokowo lub w mikroskopie o małym powiększeniu (np. Nikon TMS). Ilość barwnych perełek związanych z fosfatazą białkową (perełki magnetyczne) zmniejsza się w funkcji ilości toksyny wiążącej fosfatazę w próbce.
P r z y k ł a d 3
Fosfataza białkowa 2A jest przyłączona do perełek magnetycznych (bezpośrednio do perełek lub przez biotynylację fosfatazy). Immobilizowana fosfataza białkowa jest następnie mieszana z próbką i z toksyną immobilizowaną na ziarnach niosących immobilizowany enzym. Enzym jest zdolny do wytworzenia wykrywalnego produktu (barwnego lub fluorescencyjnego) po odpowiedniej inkubacji z chromogennym lub fluorogennym substratem. Immobilizowana fosfataza białkowa jest oddzielana od mieszaniny reakcyjnej w polu magnetycznym. Barwa lub fluorescencja towarzysząca fosfatazie białkowej (perełki magnetyczne) jest mierzona odpowiednio spektroskopowo lub fluorometrycznie. Ilość barwy/fluorescencji związanej z magnetycznymi perełkami zmniejsza się jako funkcja ilości toksyny wiążącej fosfatazę w próbce.
P r z y k ł a d 4
Scyntylacyjny test bliskości: fosfataza białkowa jest biotynylowana i immobilizowaną w studzienkach wcześniej opłaszczonych streptawidyną i scytylatorem (np. FlashPlate PLUS Streptavidin SMP103 dostarczonych przez NEN). Próbka i [125I]mikrocystyna-YR są dodane do studzienek. Ilość [125I]mikrocystyny-YR związanej z immobilizowaną fosfatazą białkową jest wykryta przez zliczanie scyntylacji.
PL 198 749 B1
P r z y k ł a d 5
Hamowanie wiązania [125I]mikrocystyny-YR z fosfatazą białkową 2A w obecności różnych toksyn.
| Badany związek | IC502(pM) |
| nodularyna | 15 |
| mikrocystyna-LR | 17 |
| mikrocystyna-YR | 75 |
| kwas okadaikowy | 100 |
| kalikulina A | 251 |
| tautomycyna | 562 |
1 jak opisano powyżej badane związki są inkubowane z [125I]mikrocystyną -YR i fosfatazą białkową 2A.
2 wartość IC50 przedstawia stężenie potrzebne do uzyskania 50% hamowania wiązania [125I]mikrocystyna-YR do fosfatazy biał kowej 2A. Wartości te są określone zgodnie z fig. 3, dane przedstawiają średnie z trzech niezależnych doświadczeń.
P r z y k ł a d 6
Wpływ egzogennych związków na oznaczenie przez wiązanie kompetycyjne w porównaniu z oznaczeniem fosfatazy biał kowej.
| Badany związek1 | Procent aktywności | |
| Oznaczenie wiązania kompetycyjnego | Oznaczenie białka fosfatazy | |
| 2 mM ATP | 103,3 ± 0,2 | 9,8 ± 3,4 |
| 0,5 mM ATP | 101,6 ± 1,7 | 29,8 ± 5,6 |
| 0,05 mM NaPPi | 101,4 ± 4,1 | 14,2 ± 1,2 |
| 50 mM NaF | 101,5 ±1,9 | 7,7 ±1,4 |
| 5 mM NaF | 102,0 ± 3,3 | 62,6 ± 0,4 |
| kazeina 1 mg/ml | 98,6 ± 4,5 | 3,4 ± 0,2 |
| kazeina 0,02 mg/ml | 98,9 ± 6,1 | 33,3 ± 4,9 |
| histon 2A 5 mg/ml | 91,9 ± 1,8 | 1,4 ± 0,1 |
| histon 0,002 mg/ml | 95,2 ± 4,7 | 63,6 ± 4,0 |
| 0,5 M NaCl | 41,2 ±0,7 | 44,4 ±1,6 |
| woda morska | 34,8 ± 0,4 | ND |
| 10% woda morska | 87,3 ± 0,4 | ND |
| 10% DMSO | 72,8 ± 2,3 | 97,9 ± 3,3 |
| 10%MeOH | 73,9 ±0,5 | 87,4 ±4,1 |
| 10% acetonitryl | 90,4 ± 5,4 | 88,2 ± 2,7 |
| 0,4%Triton X-100 | 122,3±1,0 | 60,2 ± 5,7 |
| 0,4% Nonidet P-40 | 106,0 ± 2,0 | 61,1 ± 1,3 |
| 0,4% CHAPS | 90,9 ± 9,9 | 138,0 ± 34,4 |
1 fosfataza biał kowa 2A był a wstę pnie inkubowana ze zwią zkami rozpuszczonymi w 50 mM Hepes (pH 7,2) lub w samym buforze (kontrola) przez 30 min. w lodzie. Jak to opisano aktywność fosfatazy mierzono przez defosforylację fosfohistonu. Procent aktywności jest określony względem reakcji kontrolnej.
2 aktywność w oznaczeniu wią zania kompetycyjnego przedstawia zdolność fosfatazy biał kowej 2A do wiązania [125I]mikrocystyny-YR w obecnoś ci egzogennego związku rozpuszczonego w odpowiednim buforze w odniesieniu do samego buforu. Dane przedstawiają wartość ś rednią uzyskaną dla przynajmniej trzech niezależnych doświadczeń ±SEM.
PL 198 749 B1
P r z y k ł a d 7
Czułość testu wiązania dla nodularyny i mikrocystyny-LR
| hamowanie wiązania [125I]mikrocystyny-LR (%)1 | |||||
| toksyna | (M) | woda miliQ | woda pitna | woda morska | woda morska, 1/10 |
| nodularyna | 1E-10 | 88,37±0,31 | 88,75±0,16 | 72,18±0,82 | 67,24+0,66 |
| mikrocystyna-LR | 5E-11 | 36,37±2,28 | 36,12±1,04 | 48,47±0,79 | 52,98±1,98 |
| 1E-10 | 84,91±0,42 | 86,97±1,12 | 73,31±1,20 | 46,41±5,97 | |
| 5E-11 | 13,87±3,16 | 12,85±0,88 | 49,34±3,82 | 38,61±1,49 |
1 nodularyna i mikrocystyna-LR były rozpuszczone w wodzie MiliQ, pitnej lub morskiej o podanym wyżej stężeniu. Próbki tych roztworów o objętości 300 μΙ badano pod kątem ich zdolności do współzawodniczenia z [125I]mikrocystyną-YR o wiązanie z fosfatazy białkowej 2A jak to opisano powyżej.
2 woda morska rozcieńczona 1/10 w wodzie MiliQ.
Wyniki są przedstawione jako wartości średnie ±SEM.
P r z y k ł a d 8
Równoważniki kwasu okadaikowego (OA) w ekstraktach ze skorupiaków/mięczaków jak to określono przez badania HPLC i przez oznaczenie wiązania fosfatazy.
| Ekstrakt1 | równoważ OA. przez analizę HPLC2 | równoważ OA. w oznaczeniu wiązania3 | |
| (pg/g trzustkowątroby) (nM) | (nM) | ||
| 1 | 0 | 0 | 85 |
| 2 | 0 | 0 | 45 |
| 3 | 0 | 0 | 70 |
| 4 | 4 | 2480 | 2100 |
| 5 | 1,2 | 748 | 755 |
| 6 | 0,8 | 496 | 805 |
1 ekstrakty sporządzano z trzustkowątrób omułków zebranych wzdłuż wybrzeża Norwegii.
2 ekstrakty analizowano przez HPLC z uwagi na ilość równoważników kwasu okadaikowego.
3 ekstrakty rozcieńczono w 100% DMSO i badano z uwagi na ich zdolność do współzawodniczenia z [125I]mikrocystyną-YR o wiązanie do fosfatazy białkowej 2A przy pomocy opisanego powyżej testu wiązania. Stężenie kwasu okadaikowego określono przez porównanie danych z krzywymi standardowymi dla kwasu okadaikowego rozpuszczonego w 100% DMSO.
P r z y k ł a d 9 Załączone Figury
Figura 1 jest schematycznym przedstawieniem testu kompetycyjnego wiązania w celu wykrycia toksyn wiążących fosfatazę białkową.
125
Fosfataza białkowa 2A jest inkubowana z [125I]mikrocystyną-YR i innymi toksynami skierowa125 nymi przeciwko fosfatazie białkowej 2A. Toksyny współzawodniczą z [125I]mikrocystyną-YR o wiązanie
125 z fosfatazą . Dodanie duż ej iloś ci toksyny powoduje ograniczenie wią zania [125I]mikrocystyny-YR i vice
125 versa. Po osiągnięciu równowagi [125I]mikrocystyna-YR związana z fosfatazą białkową 2A jest oddzie125 lona od wolnej [125I]mikrocystyny-YR przez chromatograficzne filtrowanie w żelu. Frakcja zawierająca
125
[125I]mikrocystynę-YR związaną z fosfatazą jest zbierana i ilość radioaktywności określona przez zliczanie scyntylacji.
Figura 2 przedstawia wpływ wzrostu ilości różnych toksyn pochodzących z glonu na wiązanie
125
[125I]mikrocystyny-YR do fosfatazy białkowej 2A.
125
Fosfataza białkowa 2A (30 pM) była inkubowana w obecności 35 pM [125I]mikrocystyny-YR (1 Ci/13 ng) i 0-100 nM różnych pochodzących z glonów toksyn jakie wyszczególniono na figurze.
125
[125I]mikrocystynę-YR związaną z fosfatazą białkową 2A izolowano przez chromatograficzne filtrowanie w żelu i radioaktywność określano przez zliczanie scyntylacji. Każda krzywa przedstawia wartości średnie dla przynajmniej trzech niezależnych doświadczeń.
PL 198 749 B1
Figura 3 przedstawia IC50 dla wiązania mikrocystyny-LR w teście wiązania kompetycyjnego.
Wiązanie [125I]mikrocystyny-YR do fosfatazy białkowej 2A zostało wykreślone jako proporcja pomiędzy niezwiązaną [125I]mikrocystyną-YR (Co-Cx) i związaną [125I]mikrocystyną-YR (Cx) względem stężenia mikrocystyny-LR. „Co oznacza ilość związanej [125II]mikrocystyny-YR w nieobecności mikrocystyny-YR, a Cx oznacza ilość związanej [125I]mikrocystyny-YR w obecności różnych stężeń mikrocystyny-LR.
Figura 4 przedstawia stabilność [125I]mikrocystyny-YR związanej z fosfatazą białkową 2A w obecności nadmiaru mikrocystyny LR.
Fosfataza białkowa 2A (1 nM) była inkubowana w obecności [125I]mikrocystyny-YR (100 pM) przez 1 godz. Mikrocystyna-LR (2 μM) była dodana do mieszaniny reakcyjnej w czasie 0. Ilość [125I]mikrocystyny-YR związanej z fosfatazą białkową 2A określano dla wskazanych punktów czasowych przez filtrowanie w żelu i zliczanie scyntylacyjne jak to opisano. Krzywa przedstawia wartość średnią dla czterech niezależnych doświadczeń.
Claims (25)
1. Sposób oznaczania toksyn skierowanych na fosfatazę, które hamują fosfatazy białkowe, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie podłoża stałego z immobilizowanym na nim ligandem, z:
(i) próbką podejrzaną o zanieczyszczenie toksyną i (ii) nieimmobilizowanym ligandem, przy czym immobilizowany ligand jest zdolny do wiązania z przynajmniej jedną z toksyn, z nieimmobilizowanym ligandem lub z kompleksami toksyny i nieimmobilizowanego liganda, a nieimmobilizowany ligand jest zdolny do wiązania z przynajmniej jednym immobilizowanym ligandem, z toksyną lub z kompleksami toksyny i immobilizowanego liganda, przez co ilość immobilizowanego liganda związanego przez toksynę, nieimmobilizowany ligand lub kompleksy toksyny i nieimmobilizowanego liganda zależy od zawartości toksyny w próbce, a immobilizowany i/lub nieimmobilizowany wiążący toksynę ligand jest enzymem fosfatazą białkową oraz immobilizowany ligand jest zdolny do generowania bezpośrednio lub pośrednio wykrywalnego sygnału, gdy nie jest skompleksowany, gdy jest skompleksowany przez toksynę, gdy jest skompleksowany przez kompleks toksyny i nieimmobilizowanego liganda lub gdy jest skompleksowany przez nieimmobilizowany ligand, lub nieimmobilizowany ligand jest zdolny do generowania sygnału wykrywalnego bezpośrednio lub pośrednio, gdy nie jest skompleksowany lub gdy jest skompleksowany, oddzielenie związanej frakcji od frakcji niezwiązanej; oraz bezpośrednie lub pośrednie oznaczenie nieimmobilizowanego liganda związanego z immobilizowanym ligandem (frakcja związana) lub nieskompleksowanego w roztworze wodnym (frakcja niezwiązana);
przy czym nanoszenie (i) i (ii) na podłoże stałe może być prowadzone oddzielnie, kolejno lub równocześnie, a jeśli prowadzone jest oddzielnie lub kolejno, to może być prowadzone w dowolnej kolejności.
2. Sposób oznaczania według zastrz. 1, znamienny tym, że toksyna skierowana na fosfatazę jest wytwarzana przez glony lub sinice.
3. Sposób oznaczania według zastrz. 1, znamienny tym, że oznaczana toksyna jest hepatotoksyną lub kwasem okadaikowym.
4. Sposób oznaczania według zastrz. 1, znamienny tym, że obecne w próbce cząsteczki toksyny współzawodniczą z nieimmobilizowanym ligandem o ograniczoną liczbę miejsc wiążących liganda immobilizowanego i dowolna toksyna obecna w próbce jest oznaczana w odniesieniu do ilości nieimmobilizowanego liganda związanego lub niezwiązanego z miejscami wiążącymi immobilizowanego liganda.
5. Sposób oznaczania według zastrz. 1, znamienny tym, że oznacza się obecność lub brak toksyny skierowanej na fosfatazę.
6. Sposób oznaczania według zastrz. 1, znamienny tym, że badaną próbką jest wilgoć powierzchniowa lub wolna ze skorupiaka/mięczaka lub woda pobrana ze środowiska, w którym skorupiak/mięczak żyje lub wodą pobraną z zasobów wodnych gospodarstw domowych.
7. Sposób oznaczania według zastrz. 1, znamienny tym, że immobilizowany lub nieimmobilizowany ligand jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała.
PL 198 749 B1
8. Sposób oznaczania według zastrz. 1, znamienny tym, ż e jako enzym fosfataza białkowa będący wiążącym ligandem stosuje się fosfatazę białkową 2A.
9. Sposób oznaczania według zastrz. 1, znamienny tym, że immobilizowany lub nieimmobilizowany ligand niesie ugrupowanie reporterowe.
10. Sposób oznaczania według zastrz. 9, znamienny tym, że ugrupowanie reporterowe niesie nieimmobilizowany ligand.
11. Sposób oznaczania według zastrz. 10, znamienny tym, że nieimmobilizowany ligand jest wyznakowanym peptydem hepatotoksyny lub wyznakowanym kwasem okadaikowym.
12. Sposób oznaczania według zastrz. 11, znamienny tym, że hepatotoksyna jest wybrana spośród nodularyny, mikrocystyny LR lub mikrocystyny YR.
13. Sposób oznaczania według zastrz. 1, znamienny tym, że jako podłoże stałe stosuje się pasek lub macierz stałą.
14. Sposób oznaczania według zastrz. 13, znamienny tym, że macierz stałą stanowią polimerowe lub magnetyczne perełki.
15. Zestaw do wykrywania toksyn skierowanych na fosfatazę, które hamują fosfatazy białkowe, znamienny tym, że zawiera:
fazę stałą, na której jest immobilizowany ligand;
nieimmobilizowany ligand, korzystnie w roztworze wodnym lub skompleksowany z immobilizowanym ligandem;
przy czym immobilizowany i/lub nieimmobilizowany ligand jest enzymem fosfatazą białkową; gdzie żaden spośród immobilizowanych i nieimmobilizowanych ligandów nie zawiera bezpośrednio lub pośrednio wykrywalnego ugrupowania, reporterowe ugrupowanie zdolne do wiązania jednego spośród immobilizowanego i nieimmobilizowanego liganda i generowania wykrywalnego sygnału, przy czym korzystnie wykrywalne ugrupowanie lub sygnał są bezpośrednio czytelne bez użycia sprzętu laboratoryjnego.
16. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że toksyna skierowana na fosfatazę jest wytwarzana przez glony lub sinice.
17. Zestaw do wykrywania toksyn skierowanych na fosfatazę, które hamują fosfatazy białkowe, znamienny tym, że zawiera:
fazę stałą na której jest immobilizowany enzym białkowa fosfataza jako ligand wiążący toksynę; cząsteczkę reporterową zdolną do kompetycyjnego hamowania wiązania toksyn skierowanych na fosfatazę do liganda wiążącego toksynę i generowania sygnału czytelnego bez użycia sprzętu laboratoryjnego.
18. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera polimerowe mikrosfery z przyłączoną do nich fosfatazą białkową, które mogą być przesuwane w polu magnetycznym;
wyznakowane koloidalnym złotem cząsteczki peptydu hepatotoksyny zdolne do kompetycyjnego hamowania wiązania toksyny z sinic z białkową fosfatazą.
19. Zestaw według zastrz. 17, znamienny tym, że zawiera polimerowe mikrosfery z przyłączoną do nich fosfatazą białkową, które mogą być przesuwane w polu magnetycznym;
wyznakowane koloidalnym złotem cząsteczki peptydu hepatotoksyny zdolne do kompetycyjnego hamowania wiązania toksyny z sinic z białkową fosfatazą.
20. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera polimerowe mikrosfery z przyłączoną do nich fosfatazą białkową, które mogą być przesuwane w polu magnetycznym;
wyznakowane koloidalnym złotem cząsteczki kwasu okadaikowego zdolne do kompetycyjnego hamowania wiązania toksyny z glonów z białkową fosfatazą.
21. Zestaw według zastrz. 17, znamienny tym, że zawiera polimerowe mikrosfery z przyłączoną do nich fosfatazą białkową, które mogą być przesuwane w polu magnetycznym;
wyznakowane koloidalnym złotem cząsteczki kwasu okadaikowego zdolne do kompetycyjnego hamowania wiązania toksyny z glonów z białkową fosfatazą.
22. Zestaw do wykrywania toksyn skierowanych na fosfatazę, które hamują fosfatazy białkowe, znamienny tym, że zawiera:
fazę stałą, na której jest immobilizowany ligand;
nieimmobilizowany ligand, korzystnie w roztworze wodnym lub skompleksowany z imniobilizowanym ligandem;
przy czym immobilizowany i/lub nieimmobilizowany ligand jest enzymem fosfatazą białkową;
PL 198 749 B1 gdzie jeden spośród immobilizowanego i nieimmobilizowanego liganda niesie ugrupowanie reporterowe zdolne do generowania wykrywalnego sygnału, przy czym korzystnie wykrywalny sygnał jest bezpośrednio czytelny bez użycia sprzętu laboratoryjnego.
23. Zastosowanie zestawu według zastrz. 15 lub 16, lub 18, lub 20 do oznaczania toksyn skierowanych na fosfatazę.
24. Zastosowanie zestawu według zastrz. 17 lub 19, lub 21 do oznaczania toksyn skierowanych na fosfatazę.
25. Zastosowanie zestawu według zastrz. 22 do oznaczania toksyn skierowanych na fosfatazę.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9824772.9A GB9824772D0 (en) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | Assay |
| PCT/GB1999/003756 WO2000028325A1 (en) | 1998-11-11 | 1999-11-11 | Assay for phosphatase-targeting toxins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL347632A1 PL347632A1 (en) | 2002-04-22 |
| PL198749B1 true PL198749B1 (pl) | 2008-07-31 |
Family
ID=10842302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL347632A PL198749B1 (pl) | 1998-11-11 | 1999-11-11 | Sposób oznaczania skierowanych na fosfatazę toksyn, które hamują fosfatazy białkowe, zestawy do wykrywania tych toksyn oraz ich zastosowanie |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1129352B1 (pl) |
| JP (1) | JP4460779B2 (pl) |
| KR (1) | KR100674517B1 (pl) |
| CN (1) | CN1249435C (pl) |
| AT (1) | ATE288588T1 (pl) |
| AU (1) | AU769203B2 (pl) |
| BR (1) | BR9915299A (pl) |
| CA (1) | CA2349942A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ20011673A3 (pl) |
| DE (1) | DE69923581T2 (pl) |
| DK (1) | DK1129352T3 (pl) |
| EA (1) | EA002710B1 (pl) |
| ES (1) | ES2237953T3 (pl) |
| GB (1) | GB9824772D0 (pl) |
| HK (1) | HK1040546B (pl) |
| HU (1) | HUP0104194A2 (pl) |
| ID (1) | ID30236A (pl) |
| IL (2) | IL143047A0 (pl) |
| NO (1) | NO328021B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ511757A (pl) |
| PL (1) | PL198749B1 (pl) |
| WO (1) | WO2000028325A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA200103796B (pl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100381718B1 (ko) * | 2000-06-26 | 2003-04-26 | 한국생명공학연구원 | 프로테인 포스파테이스를 이용한 마이크로시스틴의비색정량법 |
| JP2003079365A (ja) * | 2001-09-07 | 2003-03-18 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 環境有害化学物質の高感度検出法 |
| CN110129253A (zh) * | 2016-09-14 | 2019-08-16 | 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 | 人工组织前体及制备其的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1302920C (en) * | 1987-10-09 | 1992-06-09 | Taizo Uda | Monoclonal antibody to okadaic acids, process for producing the monoclonal antibody, assay reagent for assaying okadaic acids using the monoclonal antibody, and assay method |
| US5180665A (en) * | 1990-11-21 | 1993-01-19 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The National Research Council Of Canada | Method for quantitatively assaying the presence of diarrhetic shellfish poisoning toxins in marine samples |
| US5525476A (en) * | 1991-08-09 | 1996-06-11 | Iatron Laboratories, Inc. | Immunoassay, monoclonal antibody, and hybridoma |
| US5525525A (en) * | 1994-05-11 | 1996-06-11 | Asian Pacific Research Foundation | Immuno-latex chromatographic procedure for detection of ciguatoxin, and related polyether marine toxins |
-
1998
- 1998-11-11 GB GBGB9824772.9A patent/GB9824772D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-11-11 DK DK99954218T patent/DK1129352T3/da active
- 1999-11-11 DE DE69923581T patent/DE69923581T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-11 BR BR9915299-1A patent/BR9915299A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-11-11 ES ES99954218T patent/ES2237953T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-11 IL IL14304799A patent/IL143047A0/xx active IP Right Grant
- 1999-11-11 WO PCT/GB1999/003756 patent/WO2000028325A1/en not_active Ceased
- 1999-11-11 EA EA200100452A patent/EA002710B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-11-11 NZ NZ511757A patent/NZ511757A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-11-11 HU HU0104194A patent/HUP0104194A2/hu unknown
- 1999-11-11 PL PL347632A patent/PL198749B1/pl unknown
- 1999-11-11 CN CNB998145688A patent/CN1249435C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-11 CZ CZ20011673A patent/CZ20011673A3/cs unknown
- 1999-11-11 KR KR1020017005894A patent/KR100674517B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-11 AU AU10635/00A patent/AU769203B2/en not_active Ceased
- 1999-11-11 ID IDW00200101252A patent/ID30236A/id unknown
- 1999-11-11 EP EP99954218A patent/EP1129352B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-11 CA CA002349942A patent/CA2349942A1/en not_active Abandoned
- 1999-11-11 HK HK02101402.8A patent/HK1040546B/en not_active IP Right Cessation
- 1999-11-11 JP JP2000581452A patent/JP4460779B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-11 AT AT99954218T patent/ATE288588T1/de not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-05-08 IL IL143047A patent/IL143047A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-05-10 NO NO20012304A patent/NO328021B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-05-10 ZA ZA200103796A patent/ZA200103796B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20010092728A (ko) | 2001-10-26 |
| JP4460779B2 (ja) | 2010-05-12 |
| CA2349942A1 (en) | 2000-05-18 |
| NO20012304L (no) | 2001-06-28 |
| GB9824772D0 (en) | 1999-01-06 |
| AU769203B2 (en) | 2004-01-22 |
| AU1063500A (en) | 2000-05-29 |
| BR9915299A (pt) | 2001-08-07 |
| DK1129352T3 (da) | 2005-06-06 |
| CN1338051A (zh) | 2002-02-27 |
| CZ20011673A3 (cs) | 2001-11-14 |
| DE69923581T2 (de) | 2005-12-29 |
| ZA200103796B (en) | 2001-11-22 |
| DE69923581D1 (de) | 2005-03-10 |
| ATE288588T1 (de) | 2005-02-15 |
| KR100674517B1 (ko) | 2007-01-26 |
| NO20012304D0 (no) | 2001-05-10 |
| EP1129352B1 (en) | 2005-02-02 |
| NZ511757A (en) | 2003-10-31 |
| EP1129352A1 (en) | 2001-09-05 |
| WO2000028325A1 (en) | 2000-05-18 |
| EA200100452A1 (ru) | 2002-02-28 |
| CN1249435C (zh) | 2006-04-05 |
| HK1040546B (en) | 2005-06-24 |
| IL143047A0 (en) | 2002-04-21 |
| JP2002529738A (ja) | 2002-09-10 |
| PL347632A1 (en) | 2002-04-22 |
| HUP0104194A2 (hu) | 2002-03-28 |
| IL143047A (en) | 2007-07-04 |
| EA002710B1 (ru) | 2002-08-29 |
| HK1040546A1 (en) | 2002-06-14 |
| ES2237953T3 (es) | 2005-08-01 |
| ID30236A (id) | 2001-11-15 |
| NO328021B1 (no) | 2009-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5585277A (en) | Screening method for identifying ligands for target proteins | |
| Xiulan et al. | Development of an immunochromatographic assay for detection of aflatoxin B1 in foods | |
| JP3253300B2 (ja) | ダイオキシン類似化合物の間接的な免疫学的検定法 | |
| Dimitriadis et al. | Monitoring the biochemical and cellular responses of marine bivalves during thermal stress by using biomarkers | |
| JPH09503291A (ja) | 特にレセプター結合分析における生物学的相互作用の検出方法 | |
| JP2004524516A (ja) | 麻痺性貝毒のアッセイ | |
| CN108700583A (zh) | 用于检测神经毒素的装置及其制造方法 | |
| CN109188003A (zh) | 测定25-羟基维生素d的方法 | |
| Wang et al. | Rapid quantitative detection of okadaic acid in shellfish using lanthanide-labelled fluorescent-nanoparticle immunochromatographic test strips | |
| US6127136A (en) | Detection of dioxin-like compounds by detection of transformed Ah receptor/ARNT complex | |
| US5525525A (en) | Immuno-latex chromatographic procedure for detection of ciguatoxin, and related polyether marine toxins | |
| EP1129352B1 (en) | Assay for phosphatase-targeting toxins | |
| Bacigalupo et al. | Homogeneous immunoassay of atrazine in water by terbium-entrapping liposomes as fluorescent markers | |
| MXPA01004700A (en) | Assay for phosphatase-targeting toxins | |
| WO2009013053A1 (en) | Combined method and kit for the sequential measurement of (1) the enzymatically active fraction and (2) the total amount of an enzyme | |
| JP4547538B2 (ja) | ダイオキシン結合材料及びダイオキシンの検出又は定量方法 | |
| AU2007200433B2 (en) | Biomolecular toxicity assay | |
| EP1143010B1 (en) | Quantification of paralyzing toxins (psp) by fluorimetry in excitable cells | |
| JP2002529738A5 (pl) |