PL198981B1 - Sposób wytwarzania zakaźnego mutanta IBDV, zakaźny mutant IBDV uzyskany metodami inżynierii genetycznej oraz szczepionka do stosowania do ochrony drobiu przed chorobą wynikającą z zakażenia IBDV - Google Patents
Sposób wytwarzania zakaźnego mutanta IBDV, zakaźny mutant IBDV uzyskany metodami inżynierii genetycznej oraz szczepionka do stosowania do ochrony drobiu przed chorobą wynikającą z zakażenia IBDVInfo
- Publication number
- PL198981B1 PL198981B1 PL338773A PL33877300A PL198981B1 PL 198981 B1 PL198981 B1 PL 198981B1 PL 338773 A PL338773 A PL 338773A PL 33877300 A PL33877300 A PL 33877300A PL 198981 B1 PL198981 B1 PL 198981B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- ibdv
- mutant
- amino acid
- segment
- variant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 50
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 49
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 13
- 244000144977 poultry Species 0.000 title claims description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 claims abstract description 198
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 36
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 27
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 25
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 3
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 claims description 19
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- 101500001532 Avian infectious bursal disease virus Capsid protein VP2 Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 101150063690 GLS gene Proteins 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 60
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 48
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 37
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 23
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 9
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 9
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 9
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 6
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 6
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 6
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000002045 capillary electrochromatography Methods 0.000 description 3
- 208000015636 celiac disease-epilepsy-cerebral calcification syndrome Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AWHJQEYGWRKPHE-LSJOCFKGSA-N His-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AWHJQEYGWRKPHE-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- WRPDZHJNLYNFFT-GEVIPFJHSA-N His-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O WRPDZHJNLYNFFT-GEVIPFJHSA-N 0.000 description 2
- FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N His-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- 241000711955 Turkey rhinotracheitis virus Species 0.000 description 2
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 244000144980 herd Species 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N Asn-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N 0.000 description 1
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702628 Birnaviridae Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- FRJIAZKQGSCKPQ-FSPLSTOPSA-N His-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 FRJIAZKQGSCKPQ-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- VOEGKUNRHYKYSU-XVYDVKMFSA-N His-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VOEGKUNRHYKYSU-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- YOSQCYUFZGPIPC-PBCZWWQYSA-N His-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YOSQCYUFZGPIPC-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 241000272458 Numididae Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 101150042119 VP5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 229940024548 aluminum oxide Drugs 0.000 description 1
- 229940009859 aluminum phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003323 beak Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N d-alpha-Tocopheryl acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000009526 moderate injury Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102200076357 rs121909720 Human genes 0.000 description 1
- 102220277619 rs562833260 Human genes 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L thiosulfate(2-) Chemical compound [O-]S([S-])(=O)=O DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Sposób wytworzenia zaka znego mutanta IBDV zdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF jest z lo zony z etapów: (i) oddzielnego przygotowania konstruktu cDNA odcinków genomowych A i B IBDV niezdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF, (ii) wprowadzanie mutacji w: a) jednym lub wi ecej kodonów dla reszt aminokwasów 253 i 284 genu VP2 szczepów IBDV Wariantu-E lub Klasycz- nego lub w b) kodonie dla reszt aminokwasu 284 genu VP2 szczepu GLS IBDV, w cDNA zawieraj a- cym odcinek A tak, ze kodony dla reszt aminokwasów 253 i 284 zmutowanego genu VP2 koduj a od- powiednio reszt e histydyny i treoniny, w przypadku szczepu wariantu-E lub Klasycznego IBDV lub tak, ze kodon dla reszty aminokwasu 284 zmutowanego genu VP2 koduje treonin e w przypadku szczepu GLS IBDV, (iii) pozwolenie transkryptom RNA cDNA obejmuj acego odcinek A i odcinek B na inicjacj e replikacji mutanta IBDV w komórkach gospodarza w po zywce hodowlanej i (iv) izolacj e mutanta IBDV z hodowli. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zakaźnego mutanta IBDV, zakaźny mutant IBDV uzyskany metodami inżynierii genetycznej oraz szczepionka do stosowania do ochrony drobiu przed chorobą wynikającą z zakażenia IBDV.
Wirus choroby zakaźnej torebki (Infectious bursal disease virus IBDV) jest członkiem rodziny Birnaviridae. Wirusy tej rodziny mają bardzo podobną genomową organizację i podobny cykl replikacji. Genomy tych wirusów składają się z 2 odcinków (A i B) dwuniciowego (ds) RNA. Większy odcinek A koduje polibiałko, które jest cięte przez autoproteolizę, z wytworzeniem dojrzałych białek wirusowych VP2, VP3 i VP4. VP2 i VP3 są głównymi białkami strukturalnymi wirionu. VP2 jest głównym chroniącym przed gospodarzem immunogenem birnawirusów, i zawiera regiony antygenowe odpowiedzialne za indukcję neutralizujących przeciwciał. Białko VP4 wydaje się być kodowaną przez wirus proteazą, która bierze udział w obróbce polibiałka prekursora białek VP2, VP3 i VP4. Większy odcinek A zawiera także drugą otwartą ramkę odczytu (ORF), przed genem polibiałka i częściowo zachodzącą na ten gen. Ta druga otwarta ramka odczytu koduje białko VP5 o nieznanej funkcji, które jest obecne w komórkach zakażonych IBDV. Mniejszy odcinek B koduje VP1, wielofunkcyjne białko 90 kDa o aktywności polimerazy i enzymu przyłączającego czapeczkę.
Dla IBDV istnieją dwa serotypy, serotyp 1 i serotyp 2. Dwa serotypy mogą być odróżnione przez testy neutralizacji wirusa (VN). Co więcej, wyizolowano podtypy serotypu 1. Te tak zwane warianty wirusów o serotypie 1 można zidentyfikować za pomocą testów neutralizacji krzyżowej, panelu monoklonalnych przeciwciał lub RT-PCR. Te podtypy serotypu 1 IBDV opisano również w literaturze, na przykład, szczepy klasyczny, wariant-E, GLS, RS593 i DS326 (Van Loon i wsp., Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, Niemcy, 179-187, 1994).
Zakaźna choroba torebki (IBD), zwana też chorobą Gumboro, jest ostrą, wysoce zakaźną chorobą wirusową u kurcząt, dla której głównym celem jest tkanka limfatyczna z wybiórczym tropizmem do komórek torebki Fabrycjusza. Częstość występowania choroby w podatnych stadach jest wysoka, z szybką utratą wagi i umiarkowanym tempem śmiertelności. Kurczęta, które zdrowieją, mogą mieć niedobory odporności ze względu na zniszczenie torebki Fabrycjusza, która jest niezbędna dla mechanizmów obronnych kurcząt. Wirus IBD powoduje ostrą immunosupresję u kurcząt młodszych niż 3 tygodnie i indukuje uszkodzenia torebki u kurczą t w wieku do 3 miesię cy.
Przez wiele lat chorobie można było zapobiegać przez indukowanie wysokich poziomów przeciwciał w stadach rozpłodowych przez podanie inaktywowanej szczepionki kurczętom stymulowanym atenuowaną żywą szczepionką IBDV. To redukowało straty ekonomiczne powodowane przez IBD do minimum. Matczyne przeciwciała u kurcząt pochodzących od szczepionych niosek zapobiegają wczesnym zakażeniom przez IBDV i zmniejszają problemy związane z immunosupresją. Dodatkowo, żywe atenuowane szczepionki były też z powodzeniem stosowane w handlowych stadach kurcząt po spadku poziomu przeciwciał matczynych.
Ostatnio bardzo wirulentne szczepy IBDV spowodowały wybuchy choroby z wysoką śmiertelnością w Europie. Obecny program szczepień niedostatecznie chronił kurczęta. Załamania szczepień były przede wszystkim powodowane przez niezdolność żywych szczepionek do zakażenia ptaków przed prowokacją przez wirulentny terenowy szczep wirusa.
Tak więc istnieje ciągła potrzeba poprawy istniejących szczepionek i opracowania nowych typów szczepionek. Do rozwinięcia żywych szczepionek wymagane są wirusy IBD w postaci atenuowanej. Konwencjonalnie może to być osiągnięte przez seryjne pasażowanie izolatów terenowych (dzikich) IBDV na odpowiednim substracie. Do opracowania inaktywowanych szczepionek IBDV potrzebny jest odpowiedni substrat do generacji wysokich ilości masy antygenowej IBDV wynikającej z namnażania wirusów IBD na substracie.
Wiadomo, że terenowe IBDV mogą być z łatwością namnażane in vivo w torebce zakażonych ptaków lub w jajach z zarodkami. Jednak choć opisano udane przystosowanie namnażania pewnych szczepów IBDV do hodowli komórek pochodzących od zarodków kurczęcia in vitro, na ogół uznaje się, że większość szczepów IBDV izolowanych z zakażonej torebki w terenie, w szczególności tak zwane wirulentne lub bardzo wirulentne szczepy IBDV, nie mogą być przystosowane do komórek pochodzących z zarodków kurczęcia, takich jak fibroblasty z zarodków kurczęcia (CEF) lub komórki z innych narządów, takich jak nerka i wą troba (Brown i wsp., J. Gen. Virology 75, 675-680, 1994; van Loon i wsp., 1994, powyżej).
PL 198 981 B1
Wady substratów hodowli in vivo są oczywiste. Takie metody hodowli są nieprzyjazne w stosunku do zwierząt, potrzebują wielu zwierząt, są czasochłonne i nie można ich przeprowadzić w warunkach standaryzowanych i surowych.
W dodatku ograniczona liczba szczepów IBDV, które nie są oporne na adaptację do substratów hodowli komórkowej in vitro wykazuje taką wadę, że w wyniku seryjnego procesu pasażowania prowadzącego do adaptacji szczepów IBDV, w genomie wirusa są indukowane losowe mutacje w sposób niekontrolowany. Takie mutacje mogą wpływać na właściwości wirusa inne niż związane z adaptacją wirusa do hodowli komórkowej np. właściwości związane z immunogennością wirusa. Takie dodatkowe losowe mutacje nie są pożądane.
Adaptacja IBDV przez pasażowanie wirusa in vitro w hodowlach komórkowych CEF była związana z atenuacją wirulencji, jak wykazano przez obniżenie zdolności wirusa do powodowania uszkodzeń w torebce zakażonego ptaka. Yamaguchi i wsp. (Virology 223, 219-223, 1996) badali molekularne podstawy wirulencji wirusów IBD i atenuację tych wirusów w wyniku adaptacji IBDV z torebki do hodowli komórkowej CEF.
Wywnioskowano, że na podstawie badań Yamaguchi i wsp. nie jest możliwe dokładne zidentyfikowanie mutacji związanych z atenuacją dzikiego typu IBDV. Zasugerowano, że reszty aminokwasów w pozycji 279 (Asp/Asn) i 284 (Ala/Thr) polibiałka kodowanego przez długą otwartą ramkę odczytu odcinka A są ważne dla wirulencji lub namnażania IBDV w komórkach CEF.
Namnażanie IBDV potwierdził Lim, B-L (Proceeddings of the 4th Asia Pacific Poultry Health Conference, 22-26 listopada, 1998, Melbourne, Australia, Abst. 79). W publikacji ujawniono, że podstawienie reszt aminokwasów 279 (Asp->Asn) i 284 (Ala->Thr) w białku VP2 IBDV daje w efekcie mutanta IBDV, który może być namnażany w hodowli komórek CEF. Jednak w stanie techniki nie ujawniono alternatywnego typu i minimalnej liczby mutacji aminokwasów, które są wymagane i wystarczające, aby możliwa była adaptacja IBDV z torebki do hodowli komórek CEF.
Jest celem tego wynalazku dostarczenie ogólnie możliwej do stosowania metody adaptacji izolatów IBDV, które tylko rosną in vivo w torebce zakażonych ptaków do wzrostu w hodowli komórek.
Dalszym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania atenuowanych mutantów IBDV przez wprowadzenie mutacji w genomie IBDV w sposób kontrolowany.
Co więcej, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie mutanta IBDV uzyskanego metodami inżynierii genetycznej zawierającego odpowiednie reszty aminokwasów, które umożliwiają mutantowi wzrost w hodowli komórkowej.
Sposób wytwarzania zakaźnego mutanta IBDV zdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF według wynalazku, obejmuje etapy:
(i) oddzielnego przygotowania konstruktu obejmującego cDNA odcinków genomowych A i B IBDV niezdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF, (ii) wprowadzenia mutacji w:
a) jednym lub więcej kodonach dla reszt aminokwasów 253 i 284 genu VP2 szczepów IBDV Wariantu-E lub Klasycznego, lub w
b) kodonie dla reszty aminokwasu 284 genu VP2 szczepu GLS IBDV, w cDNA zawierającym odcinek A, tak że kodony dla reszt aminokwasów 253 i 284 zmutowanego genu VP2 kodują odpowiednio resztę histydyny i treoniny, w przypadku szczepu Wariantu-E lub Klasycznego IBDV lub tak, że kodon dla reszty aminokwasu 284 zmutowanego genu VP2 koduje treoninę w przypadku szczepu GLS IBDV (iii) umożliwienie transkryptom RNA cDNA obejmującego odcinek A i odcinek B inicjacji replikacji mutanta IBDV w komórkach gospodarza w pożywce hodowlanej, i (iv) izolacji mutanta IBDV z hodowli.
Niniejszy wynalazek po raz pierwszy określa, które reszty aminokwasów są wymagane i wystarczające do umożliwienia replikacji IBVD w hodowli komórek CEF. Podczas gdy większość izolatów IBDV z torebki zawiera reszty aminokwasów 253 (Gln), 284 (Ala) i 330 (Ser) białka VP2, mutanty Wariantu-E lub Klasycznego IBDV, których kodony w pozycjach 253 i 284 zostały zmienione tak, że obecnie kodują reszty aminokwasów 253 (His) i 284 (Thr) są zdolne do wzrostu w hodowli CEF.
Dla mutantów GLS IBDV stwierdzono, że jest wystarczająca zmiana kodonu w pozycji 284 tak, że obecnie koduje resztę aminokwasu 284 (Thr).
Stwierdzono także, że aminokwas w pozycji 330 nie jest krytyczny dla replikacji mutantów IBDV Klasycznego lub Wariantu-E w CEF.
PL 198 981 B1
Jednak w sposobie według wynalazku korzystnie mutant IBDV przystosowany do hodowli komórek CEF zawiera serynę, argininę lub lizynę, korzystnie argininę, jako resztę aminokwasu w pozycji 330 białka VP2.
Korzystniej, mutacja jest wprowadzana we wszystkich kodonach 253, 284 i 330 genu VP2 IBDV Klasycznego lub Wariantu-E.
A szczególnie korzystnie, mutacje są wprowadzane w kodonach 253 (Gln), 284 (Ala) i 330 (Ser).
Dodatkowo stwierdzono, że aminokwas w pozycji 253 dla GLS IBDV nie jest krytyczny dla replikacji i zazwyczaj jest resztą glutaminy.
T a b e l a 1
| IBDV | Zmiany aminokwasów | Wzrost na CEF | ||
| 253 | 284 | 330 | ||
| D78/Wariant-E/ rodzicielski | Gln | Ala | Ser | |
| mutant | His | Ala | Ser | - |
| mutant | Gln | Thr | Ser | - |
| mutant | Gln | Ala | Arg | - |
| mutant | His | Thr | Ser | + |
| mutant | Gln | Thr | Arg | - |
| mutant | His | Ala | Arg | - |
| mutant | His | Thr | Arg | + |
Stwierdzono, że w genomie (hybrydowego) Wariantu-E IBDV, który był zdolny do replikacji tylko w torebce zakaż onych kurcząt (D78/Wariant-E), potrzebne są dwie zmiany do przystosowania izolatów IBDV do hodowli w komórkach CEF. Te pozycje dotyczą reszt aminokwasów 253 i 284. Reszty aminokwasów histydyny i treoniny w tych pozycjach, odpowiednio, pozwalają mutantowi IBDV na replikację w hodowli komórek CEF (Tabela 1 i Przykład 1). Co więcej, stwierdzono, że mutanty IBDV przystosowane do hodowli w komórkach CEF sposobem według wynalazku też są atenuowane (Przykład 2).
Aby dalej udowodnić, że o adaptacji klasycznych szczepów IBDV z komórek torebki do komórek CEF decydują też dwa aminokwasy, kodony szczepu IBDV D78, który jest zdolny do replikacji w komórkach CEF zmieniono w pozycjach 253, 284 i 330. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2A.
T a b e l a 2A
| IBDV | Zmiany aminokwasów | Wzrost na CEF | ||
| 253 | 284 | 330 | ||
| D78 rodzicielski | His | Thr | Arg | + |
| mutant | Gln | Thr | Arg | - |
| mutant | His | Ala | Arg | - |
| mutant | His | Thr | Ser | + |
| mutant | Gln | Ala | Ser | - |
Klasyczny bardzo wirulentny (VV) europejski izolat UK661 (Brown i wsp., J. Gen. Virology, 75, 675-680 (1994); Brown i Skinner, Virus Res. 40, 1-15, 1996) nie może być namnażany in vitro i musi więc być namnażany in vivo w kurczętach. Kurczęta muszą być zakażone szczepem VV i kilka dni po infekcji ptaki, które przeżyły zabija się i usuwa torebkę. Następnie z homogenatu torebki można wyizolować wirusy do dalszego stosowania. W eksperymentach stanowiących podstawę niniejszego wynalazku wykazano, że zmiany aminokwasów w pozycjach 253 i 284 jak określono powyżej umożliwiają wzrost szczepu VV UK661 w hodowli komórek. Wyniki doświadczeń z mutagenezą i transfekcją z tym Klasycznym szczepem IBDV są podsumowane w Tabeli 2B.
PL 198 981 B1
T a b e l a 2B
| IBDV | Zmiany aminokwasów | Wzrost na CEF | ||
| 253 | 279 | 2840 | ||
| D78/661 rodzicielski | Gln | Asp | Ala | |
| mutant | Gln | Asn | Thr | + * |
| mutant | His | Asp | Ala | - |
| mutant | Gln | Asp | Thr | - |
| mutant | His | Asp | Thr | + |
*replikuje się bardzo wolno
Te dane dalej dowodzą, że zmiany aminokwasów w pozycjach 253 i 284 są wystarczające by możliwy był wzrost Klasycznych szczepów IBDV z torebki w hodowli komórkowej. Wszystkie inne mutacje dają mutanty, które albo nie replikują się w hodowli komórkowej albo replikują się bardzo słabo (patrz też Lim i wsp., J. Virol. 73, 2854-62, 1999).
Dodatkowo, stwierdzono, że w GLS IBDV pojedyncza zmiana reszty aminokwasu w pozycji 284 była wystarczająca, aby umożliwić pozwolić IBDV przystosowanemu do torebki replikację w komórkach CEF (Tabela 3).
T a b e l a 3
| IBDV | Zmiany aminokwasów | Wzrost na CEF | ||
| 253 | 284 | 330 | ||
| D78/GLS-BU | Gln | Ala | Ser | - |
| D78/GL-CEF | Gln | Thr | Ser | + |
Tak więc sposób według wynalazku pozwala na przystosowanie izolatów IBDV z torebki do wzrostu w hodowli komórkowej za pomocą technik zrekombinowanego DNA. Zaletą niniejszego sposobu jest to, że w wyniku procesu adaptacji do genomu IBDV wprowadzane są tylko mutacje w jednym lub więcej kodonach w pozycjach 253 i 284. Liczby wskazują pozycje kodonów i aminokwasów polibiałka i dużej otwartej ramki odczytu na odcinku A genomu IBDV, odpowiednio (Mundt i Mueller, J. Gen. Virol. 77, 437-443, 1995; numer dostępu NCBI X 84034).
Większość, ale nie wszystkie szczepy IBDV, które nie rosną na hodowli komórek CEF, zawierają kodony 253 (Gln), 284 (Ala) i 330 (Ser) w genie VP2. Niektóre szczepy Wariantu-E lub Klasycznego IBVD, które nie rosną na hodowli komórek CEF, mogą już mieć jeden z wymaganych kodonów 253 (His) i 284 (Thr). Tak więc sposób według wynalazku obejmuje wprowadzenie mutacji w jednym lub dwóch z wymaganych kodonów wymienionych powyżej, tak że powstający mutant IBDV zawiera kodony w genie VP2 kodujące reszty aminokwasów 253 (His) i 284 (Thr).
Bardziej korzystnie, sposób wynalazku jest stosowany do IBDV, który nie jest zdolny do replikacji w komórkach CEF i który zawiera kodony dla reszt aminokwasów 253 (Gln) i 284 (Ala), a jeszcze bardziej korzystnie 330 (Ser). W przypadku szczepów Klasycznego i Wariantu-E, mutacje są wprowadzane w dwóch z trzech kodonów genu VP2, dając w efekcie kodony 253 (His) i 284 (Thr) i ewentualnie 330 (Arg). Nowymi kodonami dla aminokwasów w tych pozycjach mogą być: kodony dla His (CAT lub CAC) , dla Thr (ACT, ACC, ACA, ACG) i dla Arg (CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG).
Jeszcze bardziej korzystnie, sposób według wynalazku jest stosowany do IBDV, który nie jest zdolny do replikacji w komórkach CEF i który zawiera kodony Gln 253 (CAA), Ala 284 (GCC) i ewentualnie Ser 330 (AGT) lub dowolną ich kombinację.
Sposób wytwarzania mutanta IBDV według niniejszego wynalazku obejmuje ostatnio ustalony system genetyki odwrotnej dla birnawirusów (Mundt i Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996 i WO 98/09646). Ten system genetyki odwrotnej otworzył możliwość wprowadzania mutacji w genomie RNA wirusa IBD. Zasadą metody genetyki odwrotnej według wynalazku jest, że odcinki genomowego RNA A i B izoluje się z wirusa, następnie za pomocą odwrotnej transkrypcji przepisuje RNA na cDNA, po czym cDNA są transkrybowane do RNA. Wprowadzanie wymaganej (wymaganych) mutacji do odcinka wirusa A (lub B) zachodzi na poziomie cDNA. Ważnym etapem tego systemu genetyki odwrotnej jest dostarczenie oddzielnych konstruktów DNA obejmujących czą6
PL 198 981 B1 steczkę DNA wektora (np. plazmid) i klony cDNA pełnej długości odcinków A lub B IBDV. Konstrukty DNA zawierające cDNA odcinka A lub B wraz z nukleotydami na końcach 5' i 3' obu tych odcinków mogą być wygenerowane według metody opisanej przez Mundt i Vakharia (1996, powyżej). Kolejnym etapem w metodzie genetyki odwrotnej jest transfekcja komórek odpowiedniego gospodarza materiałem genetycznym odpowiedniego odcinka A lub B tak, że w transfekowanych komórkach gospodarza transkrypty RNA z cDNA odcinków A i B mogą inicjować replikację wirusa, dając w wyniku zakaźny IBDV, który może być wyizolowany z pożywki, w której hodowane są komórki gospodarza.
Do ostatniego etapu systemu genetyki odwrotnej może być stosowanych kilka metod.
Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje przygotowanie syntetycznych transkryptów RNA z cDNA zawierającego zmutowany odcinek A i odcinek B in vitro, a następnie transfekowanie komórek gospodarza syntetycznymi transkryptami RNA.
W tym przypadku konstrukty DNA zawierają promotor polimerazy RNA funkcjonalnie połączony z jednym z odcinków. Promotor może być promotorem dla polimerazy T7, SP6 lub T3; korzystny jest promotor T7. Syntetyczne transkrypty odcinka A i B izoluje się i stosuje do transfekcji odpowiednich komórek gospodarza.
Alternatywny jest sposób, w którym dostarczona jest linia komórkowa obejmująca komórki gospodarza zdolne do ekspresji polimerazy RNA, i które są transformowane konstruktem DNA zawierającym cDNA odcinka B i promotor polimerazy RNA, tak że transkrypty RNA odcinka B są wyrażane konstytutywnie. Po transfekcji takich komórek syntetycznym transkryptem RNA z cDNA zawierającego zmutowany odcinek A, inicjowana jest replikacja mutanta IBDV w komórkach gospodarza. W szczególności, mogą być stosowane komórki gospodarza, które są zdolne do ekspresji polimerazy RNA zależnej od DNA bakteriofaga T7, wyrażanej na przykład cytoplazmatycznie ze zrekombinowanego wirusa krowianki.
Żądane mutacje mogą być wprowadzane do genu VP2 za pomocą metod ogólnie znanych do tego celu w dziedzinie. W szczególności mutacja (mutacje) jest wprowadzana za pomocą mutagenezy ukierunkowanej. Sposoby wprowadzania mutacji do genomu IBDV są tu opisane, ale są one też ogólnie stosowane w dziedzinie (Mundt i Vakharia, 1996, powyżej; Yao i wsp., J. Virology 72, 2647-2654, 1998; Mundt i wsp. Europejskie zgłoszenie patentowe nr 0887,412 i Current Protocols in Molecular Biology, red. F.M. Ausubel i wsp., Wiley N.Y., wydanie 1995, strony 8.5.1.-8.5.9.).
Sposób według wynalazku może być stosowany do wszystkich szczepów IBDV, które są niezdolne do replikacji w hodowlach komórek CEF, i które są antygenowymi podtypami IBDV Klasycznym, Wariantem-E, lub GLS.
Ponadto, sposób według wynalazku może być stosowany do wszystkich szczepów IBDV, które nie są zdolne do replikacji w hodowli komórek CEF, niezależnie od wirulencji szczepów, i obejmuje bardzo wirulentne szczepy (takie jak CS89 i UK661), wirulentne szczepy (takie jak F52/70 i STC) i szczepy szczepionkowe (takie jak 228E i 2512). Mutanty IBDV, które są przystosowane do replikacji w hodowli komórek, pochodzące ze szczepów wirulentnych i bardzo wirulentnych, będą mniej wirulentne i mogą być stosowane jako szczepy do żywych szczepionek. Alternatywnie, takie mutanty IBDV mogą być namnażane w dogodny sposób w hodowli komórkowej i formułowane jako szczepionki inaktywowane.
Sposób według wynalazku może być też korzystnie stosowany do atenuowanych szczepów IBDV, które nie są zdolne do replikacji w hodowli komórek CEF. Mutanty pochodzące z takich atenuowanych wirusów mogą być stosowane w systemie hodowli komórek do produkcji szczepionek zamiast systemu wytwarzania in vivo.
Korzystny sposób według wynalazku obejmuje dodatkowe etapy przygotowania hybrydowego IBDV, zdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF. Sposób obejmuje dodatkowy etap wprowadzania mutacji do genu odcinka A, korzystnie genu VP2, pierwszego IBDV, w wyniku czego białko wyrażane przez ten gen zawiera determinantę epitopu drugiego IBDV.
Hybrydowy IBDV jest to wirus, który zawiera jako szkielet genetyczny odcinek A lub gen VP2 pierwszego podtypu antygenowego i dodatkowo zawiera informację genetyczną kodującą determinantę epitopu drugiego podtypu antygenowego IBDV. W szczególności, takie hybrydowe IBDV wyrażają jedną lub więcej epitopowych determinant białka VP2 IBDV pierwszego podtypu antygenowego. Zaletą takiego hybrydowego IBDV jest to, że może być stosowany jako pojedynczy immunogen, który indukuje oporność na przynajmniej dwa podtypy antygenowe IBDV.
W szczególnoś ci przygotowuje się mutanty IBDV, które zawierają jako szkielet odcinek A lub gen VP2 Klasycznego IBDV, GLS lub Wariantu-E. Klony cDNA zawierające cały region kodujący odcinka A różnych szczepów IBDV można przygotować stosując standardowe procedury klonowania
PL 198 981 B1 i metody opisane w stanie techniki (Vakharia i wsp., Avian Diseases 36, 736-742, 1992; J. Gen. Virology 74, 1201-1206, 1993). Sekwencje aminokwasów i sekwencje nukleotydów odcinka A różnych szczepów IBDV są ujawnione w stanie techniki (np. WO 95/26196 i Vakharia i wsp., Avian Diseases 36, 736-742, 1992).
Co więcej, WO 95/26196 ujawnia sekwencje aminokwasów kilku determinant epitopowych podtypów antygenowych IBDV, które są charakterystyczne dla każdego podtypu. Dodatkowo, w WO 95/26196 ujawniono antygenową charakterystykę różnych szczepów IBDV przez ich reaktywność z panelem neutralizujących monoklonalnych przeciwciał. Co jest istotne, epitopowe determinanty reagujące z takimi neutralizującymi Moab są determinantami epitopowymi B69 (podtyp klasyczny), R63 i 67 (wariant-E) i 57 (GLS). Region biał ka VP2 zawierają cy sekwencje aminokwasów dla tych determinant epitopowych jest opisany w Vakharia i wsp. (Virus Res. 31, 265-273, 1994).
Korzystnie, w sposobie według niniejszego wynalazku przygotowywany jest hybrydowy mutant IBDV zdolny do replikacji w hodowli komórek CEF zawierający klasyczny szkielet odcinka A i sekwencję nukleotydów kodującą wariantową determinantę epitopu 67, lub determinantę epitopu GLS 57. Alternatywnie, hybrydowy mutant IBDV zawiera szkielet GLS i sekwencje nukleotydowe kodujące determinanty epitopowe B69, R63 lub 67.
W szczególnoś ci, sposób wedł ug wynalazku obejmuje przygotowanie hybrydowego szczepu IBDV (D78/Wariant E) pochodzącego od szczepu D78 (handlowo dostępny od Intervet International B.V., Niderlandy), w którym (i) gen VP2 jest zastąpiony przez gen VP2 szczepu Wariantu-E, i (ii) kodony w pozycjach 253, 284 i 330 są zmienione jak zdefiniowano powyżej (Przykład 1).
Etapy wprowadzania sekwencji nukleotydowych kodujących epitopowe determinanty w odcinku szkieletowym A pierwszego IBDV są zasadniczo takie same jak etapy wprowadzania mutacji określone powyżej. Najłatwiej można tego dokonać przez dostarczenie cDNA odcinków genomowych A i B i (i) zastąpienie sekwencji kodującej dla determinanty epitopowej pierwszego IBDV przez sekwencję drugiego IBDV, lub (ii) zamianę specyficznego kodonu w pierwszym IBDV za pomocą mutagenezy ukierunkowanej. Takie metody są też opisane w WO 95/26196. W końcu transkrypty RNA tych cząsteczek cDNA inicjują replikację w transfekowanym gospodarzu i uzyskuje się zakaźny, hybrydowy IBDV.
Powstały mutant IBDV zawiera również inne mutacje, które atenuują wirus. Przykładem takiej mutacji jest mutacja w genie VP5 odcinka A genomu IBDV dająca w efekcie mutant IBDV, który nie jest zdolny do wyrażania natywnego biała VP5. Przygotowanie mutanta VP5- IBDV opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP 887,412.
W zakres wynalazku wchodzi też zakaź ny mutant IBDV, uzyskany metodami inż ynierii genetycznej, zdolny do replikacji w hodowli komórek CEF, zawierający kodony dla aminokwasów 253 (His) i 284 (Thr) i ewentualnie 330 (Arg) w genie VP2 IBDV Klasycznego lub Wariantu-E, lub kodon dla aminokwasu 284 (Thr) w genie VP2 GLS IBDV.
Korzystnie mutant jest hybrydowym mutantem IBDV.
Korzystnie mutant jest D78/Wariantem-E (przystosowanym do CEF).
Takie mutanty IBDV nadal zawierają informację genetyczną IBDV z torebki, które nie są zdolne do replikacji w hodowli komórek CEF, z wyjątkiem nowych kodonów wspomnianych powyżej, które zostały wprowadzone w sposób kontrolowany za pomocą technik inżynierii genetycznej.
W szczególnoś ci dostarczony jest mutant Wariantu-E IBDV jak zdefiniowano powyż ej, który nie ma glicyny i/lub waliny odpowiednio w pozycjach 318 i 325. Mutanty Wariantu-E uzyskane za pomocą technik inżynierii genetycznej, zawierające kwas asparaginowy i/lub metioninę w tych pozycjach, są najbardziej korzystne.
W korzystnej postaci, uzyskany za pomocą inż ynierii genetycznej mutant IBDV wedł ug wynalazku jest hybrydowym mutantem IBDV pochodzącym od szczepu D78, zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą gen VP2 szczepu Wariantu-E i mającym trzy nowe kodony wymienione powyżej.
Niniejszy wynalazek dotyczy również szczepionki do stosowania do ochrony drobiu przed chorobą wynikającą z zakażenia IBDV, obejmującej uzyskany technikami inżynierii genetycznej mutant IBDV wytworzony sposobem określonym powyżej, wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.
Dodatkową zaletą niniejszego wynalazku jest możliwość (dalszego) atenuowania w kontrolowany sposób, sposobem opisanym powyżej. Takie atenuowane mutanty IBDV mogą być stosowane jako czynne składniki w żywych szczepionkach IBDV.
Mutant IBDV może być włączony do szczepionki jako żywy atenuowany lub inaktywowany wirus.
PL 198 981 B1
Szczepionka według wynalazku może być przygotowana konwencjonalnymi metodami, takimi jak, na przykład, stosowanie do handlowo dostępnych żywych i inaktywowanych szczepionek IBDV. Pokrótce, wrażliwy substrat zaszczepia się mutantem IBDV według wynalazku i namnaża, aż wirus zreplikuje się do żądanego miana zakaźnego, poczym zbiera się materiał zawierający IBDV.
Każdy substrat, który jest zdolny do podtrzymywania replikacji mutantów IBDV, może być stosowany do przygotowania szczepionki według niniejszego wynalazku, w tym hodowle pierwotnych linii komórkowych (ptasich), takie jak fibroblasty zarodka kurczęcia (CEF) lub komórki wątroby zarodka kurczęcia (CEL), linie ssacze takie jak linia komórkowa VERO lub linia komórkowa BGM-70, lub linie komórek ptasich, takie jak QT-35, QM-7 lub LMH. Zazwyczaj, po zaszczepieniu komórek wirus jest namnażany przez 3-10 dni, po czym zbiera się supernatant hodowli komórek, i jeśli jest to pożądane sączy się go lub wiruje, aby usunąć szczątki komórek.
Alternatywnie, mutant IBDV namnaża się w jajach z zarodkami kurcząt. W szczególności, substratem na którym namnaża się IBDV, są jaja SPF z zarodkami. Jaja z zarodkami można zaszczepić na przykład 0,2 ml zawiesiny lub homogenatu, który zawiera mutanta IBDV w ilościo przynajmniej 102 TCID50 na jajo i następnie inkubuje się je w 37°C. Po około 2-5 dniach można zebrać IBDV przez zebranie zarodków i/lub błon i/lub płynu omoczniowego, a następnie odpowiednią homogenizację materiału. Homogenat może być następnie wirowany przez 10 minut przy 2500 x g z późniejszym sączeniem supernatantu przez filtr (100 Mm).
Szczepionka według wynalazku zawierająca żywy wirus może być przygotowana i sprzedawana w postaci zawiesiny lub w postaci liofilizowanej i zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik zwyczajowo stosowany w takich kompozycjach. Nośniki obejmują stabilizatory, konserwanty i bufory. Odpowiednimi stabilizatorami są na przykład, SPGA, węglowodany (takie jak sorbitol, manitol, skrobia, sacharoza, dekstran, glutaminian lub glukoza), białka (takie jak wysuszona serwatka mleka, albumina lub kazeina) lub produkty ich degradacji. Odpowiednimi buforami są, na przykład, fosforany metali alkalicznych. Odpowiednimi konserwantami są timerosal, mertiolat i gentamycyna. Rozcieńczalniki obejmują wodę, wodne bufory (takie jak buforowany roztwór soli fizjologicznej), alkohole i poliole (takie jak glicerol).
Jeśli jest to pożądane, żywe szczepionki według wynalazku mogą zawierać adiuwant. Przykłady odpowiednich związków i kompozycji z aktywnością adiuwantów są te same, jak wymienione poniżej.
Choć podanie przez wstrzyknięcie, na przykład domięśniowe, podskórne, żywej szczepionki według niniejszego wynalazku jest możliwe, szczepionka jest korzystnie podawana za pomocą niedrogich technik masowego podawania powszechnie stosowanych do szczepień IBDV. Dla szczepień IBDV te techniki obejmują podawanie w wodzie pitnej i stosowanie szczepionki w postaci spreju.
Alternatywne metody podawania żywej szczepionki obejmują in ovo, krople do oczu i zanurzanie dzioba.
Szczepionka według wynalazku może zawierać mutant IBDV w postaci inaktywowanej. Główną zaletą inaktywowanej szczepionki jest wysoki poziom ochronnych przeciwciał o długim okresie trwania, który może być uzyskany.
Celem inaktywacji wirusów zebranych po etapie namnażania jest eliminacja rozmnażania się wirusów. Na ogół można ją uzyskać za pomocą środków chemicznych lub fizycznych. Chemiczną inaktywację można osiągnąć przez działanie na wirusy na przykład enzymami, formaldehydem, β-propionolaktonem, etylenoiminą lub ich pochodną. Jeśli jest to konieczne, związek inaktywujący można potem zneutralizować. Materiał inaktywowany formaldehydem może być na przykład neutralizowany tiosiarczanem. Inaktywacja fizyczna może być korzystnie przeprowadzona przez poddanie wirusów promieniowaniu bogatemu w energię, takiemu jak światło UV lub promieniowanie γ. Jeśli trzeba, pH po traktowaniu może być doprowadzone do wartości około 7.
Szczepionka zawierająca zinaktywowanego mutanta IBDV może, na przykład, zawierać jeden lub więcej z powyżej wymienionych farmaceutycznie dopuszczalnych nośników lub rozcieńczalników odpowiednich do tego celu.
Korzystnie zinaktywowana szczepionka według wynalazku zawiera jeden lub więcej związków o aktywności adiuwanta. Odpowiednie związki lub kompozycje dla tego celu obejmują wodorotlenek, fosforan lub tlenek glinu, emulsję olej w wodzie lub woda w oleju opartą, na przykład, na oleju mineralnym, takim jak Bayol F® lub Marcol 52® lub oleju roślinnym, takim jak octan witaminy E i saponiny.
Szczepionka według wynalazku zawiera jako składnik czynny skuteczną dawkę mutanta IBDV, tzn. ilość immunizującego materiału IBDV, który zaindukuje u zaszczepionych ptaków oporność przeciwko prowokacji przez wirulentny wirus. Oporność jest tu definiowana jako indukcja znacząco wyższego poziomu ochrony w populacji ptaków po szczepieniu w porównaniu z nieszczepioną grupą.
PL 198 981 B1
Typowo, żywa szczepionka według wynalazku może być podana w dawce 102-109 TCID50 (zakaźna dawka50 (TCID50) ) na zwierzę, korzystnie w dawce w zakresie od 105,0 - 107,0 TCID50, a zinaktywowane szczepionki mogą zawierać antygenowy równoważnik 105-109 TCID50 na zwierzę.
Inaktywowane szczepionki są na ogół podawane pozajelitowo, np. domięśniowo lub podskórnie.
Choć szczepionka IBDV według niniejszego wynalazku może być skutecznie stosowana u kurcząt, również inny drób, taki jak indyki, perliczki i kuropatwy, może być skutecznie szczepiony szczepionką. Kurczęta obejmują brojlery, reproduktory i nioski.
Wiek zwierząt otrzymujących żywą lub inaktywowaną szczepionkę według wynalazku jest taki sam jak zwierząt otrzymujących konwencjonalne żywe lub inaktywowane szczepionki IBDV. Na przykład jednodniowe brojlery (wolne od pochodzących od matki przeciwciał-MDA) mogą być szczepione, podczas gdy brojlery z wysokimi poziomami MDA są korzystnie szczepione w wieku 2-3 tygodni. Nioski lub reproduktory z niskimi poziomami MDA mogą być szczepione w wieku 1-10 dni, a następnie z późniejszym doszczepianiem przypominającym w wieku 6-8 i 16-20 tygodni inaktywowaną szczepionką.
Może być stosowana szczepionka skojarzona dodatkowo zawierająca jeden lub więcej szczepów szczepionkowych zakaźnego wirusa zapalenia oskrzeli (IBV), wirusa choroby Newcastle, wirusa syndromu spadku nośności (EDS), wirusa nieżytu nosa i tchawicy indyka (TRTV) lub reowirusa.
P r z y k ł a d 1
Konstrukcja mutantów IBDV i ich właściwości replikacji w komórkach hodowli CEF
Materiał i metody
Konstrukcja (międzyrodzajowych) plazmidów IBDV zawierających region zmienny VP2 szczepów IBDV Klasycznego, Wariantu-E lub GLS.
(i) VP2 klasycznego szczepu IBDV
D78
Wymaganiem wstępnym dla następującej mutagenezy ukierunkowanej była modyfikacja plazmidu pUC 18. W tym celu pUC 18 przecięto Ndel i BamHI, poddano elektroelucji, stępiono końce za pomocą enzymu Klenowa i ponownie zligowano, aby uzyskać pUC18 ΔNdel- BamHI (pUC18/ANB).
Plazmid pAD78/EK (Mundt i wsp., J. Virology 71, 5647-51, 1997) strawiono EcoRI i Kpn I, aby uzyskać sekwencję pełnej długości odcinka A serotypu I szczepu D78 wraz z miejscem promotora polimerazy RNA T7. W celu uzyskania pD78/.-\NB (Fig. 1A) fragment wligowano do pUC18/.-\NB strawionego EcoRI i KpnI. Plazmidu pD78A/.-\NdB użyto jako szkieletu do klonowania i w procedurach mutagenezy ukierunkowanej.
UK661
Plazmidu pD78-E/DEL (patrz poniżej) użyto do konstrukcji hybrydowych plazmidów zawierających sekwencje odcinka A szczepu UK 661. Po strąceniu wirusowego RNA przeprowadzono odwrotną transkrypcję i PCR według standardowych procedur stosując oligonukleotydy UK661AFor1 i UK661ARev1 (Brown i Skinner, Virus Res. 40, 1-15, 1996, numery nukleotydów 621-644 sens i 1201-1223 antysens, odpowiednio). Powstałe fragmenty PCR sklonowano na tępe końce do wektora pUC 18 strawionego Smal (Pharmacia, Szwecja) w celu uzyskania p661Apart. Po zsekwencjonowaniu p661Apart strawiono enzymami restrykcyjnymi Nde I i Spe I w nukleotydach 647 i 1182, odpowiednio (numeracja jest zgodna z sekwencją pełnej długości szczepu P2: numer dostępu NCBI X 84034), aby uzyskać fragment 535 bp obejmujący sekwencje kodujące regionu zmiennego VP2 szczepu UK661. Po ligacji z pD78-E/DEL strawionym Nde I i Spe I, uzyskano hybrydowy plazmid pD78A-E661 o pełnej długości zawierający sekwencje odcinka A szczepu D78, E/Del i UK661 (Fig. 4).
(ii) VP2 Wariantu-E IBDV
W celu substytucji specyficznych sekwencji IBDV wzięto plazmid zawierający całkowitą sekwencję kodującą region Wariantu E szczepu E/Del (pEDEL22BacII, Vakharia, Biotechnology annual review 3, 151-168, 1997). pEDELBacII (Fig. 1A) przecięto enzymami restrykcyjnymi Nde I i Sal I, odpowiednio nukleotydy 647 i 1725, zgodnie z sekwencją pełnej długości szczepu P2 (numer dostępu NCBI X 84034), celu uzyskania fragmentu 1078 bp obejmującego sekwencje kodujące regionu zmiennego VP2 i sekwencje VP4 szczepu E/Del. Po ligacji z pD78AAANB strawionym Nde I i Sall uzyskano hybrydowy plazmid pełnej długości pD78/ANB-E/Del (Fig. 1 A) zawierający sekwencje odcinka A szczepu D78 jak i E/del. Plazmidów pAD78/DNB i pD78A/DNB -E/Del użyto do mutagenezy ukierunkowanej.
(iii) VP2 IBDV GLS
Dalej skonstruowano parę plazmidów zawierających odpowiednio region zmienny GLS-B i GLSTC. Do sklonowania regionów hiperzmiennych, GLS-TC namnożono w CEF i oczyszczono za pomocą ultrawirowania. Homogenat GLS-B z torebki oczyszczono za pomocą wirowania przy niskiej szybkości
PL 198 981 B1 i supernatant użyto do następują cych procedur. Po trawieniu proteinazą K (0,5 mg/ml)/siarczanem dodecylu sodu (SDS, 0,5%) wirusowy RNA oczyszczono, poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA, i amplifikowano za pomocą reakcji ł a ń cuchowej polimerazy (PCR) stosując standardowe procedury i oligonukleotydy A14 i A44 (Tabela 4). Produkt amplifikacji sklonowano na tępe końce i zsekwencjonowano plazmidy zawierające odpowiednie fragmenty PCR zawierające plazmidy. Plazmidy zawierające każdy wstawkę albo GLS-TC (pGLS-TC) albo GLS-B (pGLS-B) stosowano w następujących eksperymentach. Do konstrukcji międzyrodzajowego odcinka A użyto klonu pełnej długości pD78A/VNBE/Del. pGLS-TC i pGLS-B, odpowiednio, strawiono Sac I i Spe I. Po elektroelucji fragmenty wligowano następnie do pD78A/VNB-E/Del uprzednio strawionego Sac I i Spe I, aby uzyskać pD78A/VNB -E/DelGLS - TC i pD78A/VNB -E/Del - GLS - B, odpowiednio. Mapy plazmidowe obu plazmidów przedstawiono na Figurze 1B.
Mutageneza ukierunkowana
Mutagenezę ukierunkowaną przeprowadzono za pomocą PCR. Oligonukleotydy zawierały mutacje prowadzące do zmian aminokwasów i dodatkowe miejsca cięcia przez enzymy restrykcyjne (Tabela 4). Po amplifikacji PCR stosując plazmidy pAD78/VNB, pD78A/VNB -E/Del i pD78A-E-661, odpowiednio, fragmenty klonowano na tępe końce i sekwencjonowano (pfrag). Klony zawierające zmutowane kodony ligowano do uprzednio ciętych plazmidów w następujący sposób:
(i) IBDV Wariant-E
W celu uzyskania klonów peł nej dł ugoś ci odcinka A plazmidu pD78A/VNB -E/Del zawierają cego zmutowane kodony otrzymano następujące fragmenty PCR: użyto starterów E/Del-MutQH i A14 (pfragQH) , E/Del-MutAT i A14 (pfragAT), E/Del-MutSR i P21F (pfragSR) do otrzymania fragmentów z odpowiednimi zamianami pojedynczych aminokwasów Q253H, A284T i S330R, odpowiednio, sekwencji E-Del. PfragQH i pfragSR strawiono Sac I i Spe I i zligowano z uprzednio strawionym Sac I i Spe I pD78A/ANB-E/Del, aby uzyskać pD78A/DNB-E/DelQH (Fig. 1C) i pD78A/ANB-E/DelSR (Fig. 1C) odpowiednio. W celu skonstruowania pD78A/ANB-E/DelAT (Fig. 1C) pfragAT strawiono Nar I - Spe I, a następnie zligowano z uprzednio strawionym pD78A/DNB-E/Del. Aby uzyskać plazmidy zawierające dwa zmutowane kodony przeprowadzono następujący PCR: do amplifikacji odpowiednio fragQH-SR i fragAT-SR na pD78A/ANB-E/Del użyto starterów E/Del-MutQH i E/Del-MutSR, i E/DelMutAT, i E/Del-MutSR. Po sklonowaniu i zsekwencjonowaniu pfragQH-SR strawiono Sac I - Spe I, a następnie zligowano z uprzednio strawionym pD78A/ANB-E/Del, aby uzyskać pD78A/ANB-E/DelQH-SR (Fig. 1D). Do konstrukcji pD78A/ANB-E/Del-AT-SR (Fig. 1D) plazmid pfragAT-SR strawiono Nar I i Spe I i zligowano z tak samo strawionym pD78A/ANB-E/Del. Do konstrukcji plazmidu zawierającego dwa zmutowane kodony dla dwóch wymian aminokwasów (Q253H; A284T) PCR przeprowadzono stosując plazmid pD78A/ANB-E/DelAT i startery E/Del-MutQH, A14. Uzyskany fragment plazmidu pfragQH-AT strawiono Sac I -Spe I i zligowano z pD78A/ANB-E-Del, aby uzyskać pD78A/ANBE/DelQH-AT (Fig. 1D). Do sklonowania plazmidu zawierającego zmutowane kodony dla wszystkich trzech wymian aminokwasów (Q253H, A284T, i S330R) startery E/Del-MutQH i E/DelMutSR zastosowano do amplifikacji fragQH-AT SR na pD78A/ANB-E/Del-AT. Po strawieniu pfragQH-AT SR Sac I i Spe I wyeluowany fragment zligowano z pD78A/ANB-E/Del strawionym Sac I i Spe I aby uzyskać pD78A/ANB-E/DelQH-AT-SR (Fig. 1E).
(ii) Klasyczny IBDV
D78
Dla uzyskania klonów pełnej długości odcinka A plazmidu pD78A/ANB zawierającego zmutowane kodony fragment Nde I -Hind III pD78A/ANB subklonowano do uprzednio strawionego Nde I Hind III pUC19, aby otrzymać pojedyncze miejsca restrykcyjne dla następujących procedur (pUC19/NH-D78A). Oligonukleotydy D78-MutHQ i A14 (pfragHQ), D78-MutTA i A14 (pfragTA), D78MutRS i P21F (pfragRS) zastosowano do amplifikacji PCR w celu uzyskania fragmentów z odpowiednimi zmianami pojedynczych aminokwasów H253Q, T284A, i R330S, odpowiednio, sekwencji D78. Fragment. PfragHQ trawiono Sac I i Sty I, pfragTA strawiono Nar I i Sty I, pfragRS strawiono Sac I i Sty I, i zligowano ponownie z odpowiednio strawionym pUC19/NH-D78A. Plazmid pUC19/NH-D78A zawierający zmutowany kodon strawiono Nde I i Sac II, odpowiednie fragmenty elektroeluowano i ligowano z pD78A/ANB uprzednio strawionym Nde I i Sac II, aby uzyskać pD78A/ANB-HQ, pD78A/DNB-TA i pD78A/DNB-RS, odpowiednio. W celu skonstruowania klonu pełnej długości zawierającego podstawienia nukleotydów prowadzące do wymiany wszystkich trzech aminokwasów (H253Q, A284T, E330S) przeprowadzono PCR stosując oligonukleotydy D78-MutHQ, D78-MutRS i plazmid pD78A/DNB-TA. Uzyskany fragment PCR wklonowano na tępe końce, aby uzyskać
PL 198 981 B1 pfragHQ-TA-RS. Po strawieniu pfragHQ-TA-RS Sac I i Sty I elektroeluowany fragment sklonowano w pUC19/NH-D78A strawionym Sac I i Sty I. Uzyskany plazmid strawiono Nde I i Sac II, odpowiedni fragment elektroeluowano i w końcu ligowano z pD78A/DNB, uprzednio strawionym Nde I i Sac II, aby uzyskać pD78A/DNB-HQ-TA-RS. Sekwencje nukleotydowe otrzymanych zmutowanych plazmidów potwierdzano za pomocą sekwencjonowania. Sekwencje analizowano za pomocą Wisconsin Package, wersja 8 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Plazmidy pD78A/.-\NB-HQ, pD78A/ANB-TA, pD78A/.-\NB-RS i pD78A/.-\NB-HQ-TA-RS przedstawiono na Fig. 2.
UK661
Dla mutagenezy ukierunkowanej plazmid pD78A-E-UK661 strawiono EcoR I /Kpn I i sekwencję pełnej długości fragmentu zawierającego odcinek A następnie zligowano z trawionym EcoR I /Kpn I wektorem plazmidowym pBS- (Stratagene). Powstały plazmid pBSD78A-E-661 użyto do doświadczeń z mutagenezą ukierunkowaną według wcześniej opisanej metody (Kunkel i wsp., Methods Enzymol. 154, 367-382, 1987). W oparciu o wyniki Lim i wsp. (1999, powyżej) sekwencję nukleotydową dla aminokwasu 279 i 284 plazmidu pBSD78A-E-661 wymieniono (D279N, A284T) stosując oligonukleotyd Mut1 w kierunku antysensownym (Brown i Skinner, powyżej; nukleotydem nr. 947-1001, 946-966 jest AAC, a 979-981 jest ACG dając w efekcie podstawienia aminokwasów D279N i A284T). Odpowiednią część powstałego plazmidu pBSD78A-E-661-DN-AT zsekwencjonowano. Po strawieniu pBSD78A-E-661-DN-AT Nde I/ Spe I fragment 535 bp wligowano do odpowiednio strawionego pD78A-E-661, aby uzyskać pD78A-E-661-DN-AT.
Ponadto, sekwencję nukleotydową aminokwasu Q253 zamieniono na sekwencję nukleotydową kodującą H253 przez zastosowanie skierowanego antysensownie oligonukleotydu Mut 2 (Brown i Skinner powyżej, nukleotydem nr 874-900, 868-888 jest CAT dając podstawienie aminokwasu Q253H). Powstały plazmid pD78A-E-661-QH zawierał wymianę aminokwasu Q253H. Wymianę aminokwasu 284 (A284T) przeprowadzono stosując skierowany w kierunku antysensownym oligonukleotyd Mut3 (Brown i wsp., powyżej, nukleotydem numer 966-993, 979-981 jest ACC dając podstawienie aminokwasu A284T) uzyskując plazmid p78A-E-661-AT. Czwarty plazmid pD78A-E-661-QH-AT zawierał wymianę obu aminokwasów (Q253H, A284T) przez zastosowanie obu oligonukleotydów (Mut 2, Mut3) w jednej reakcji ukierunkowanej mutagenezy. Plazmidy p661Apart, pD78A-E-661, pD78A-E661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT, i pD78A-E-661-QH-AT przedstawiono na Figurze 4.
PL 198 981 B1
Oligonukleotydy stosowane do konstrukcji klonów cDNA odcinka A IBDV pełnej długości zawierającego podstawienia aminokwasów
Skiad i położenie primerow ohgonukleotydowych stosowanych do mutagenezy ukierunkowanej i klonowania. Stosowane miejsca restrykcyjne podkreślono i odpowiednie enzymy restrykcyjne są narwane. Zmienione nukleotydy do mutagenezy są podane kodem z małych liter i kodujące tryplety nukleotydów podane są drukiem wytłuszczonym. Pozycje, gdzie wiążą się primery (numer nukleotydu) i numerowanie aminokwasów są zgodne z opublikowaną sekwencją szczepu P2 (Mundt i Muller, 1995, powyżej; numer dostępu NCBI X 84034
PL 198 981 B1
Konstrukcja pełnej długości klonu cDNA odcinka B
Szczep 78
W celu sklonowania pełnej długości cDNA odcinka B serotypu I szczepu D78, wirus namnożono w CEF i oczyszczono przez ultrawirowanie. Genomowy wirusowy RNA szczepu D78 oczyszczono, poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA i zamplifikowano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) według procedur -standardowych stosując oligonukleotydy tak jak opisano (Mundt i Vakharia, 1996). Produkt amplifikacji sklonowano na tępe końce i zsekwencjonowano plazmidy zawierające odpowiednie fragmenty PCR. Procedura klonowania do uzyskania plazmidu zawierającego pełnej długości cDNA odcinka B (pUC18BD78) pod kontrolą promotora polimerazy RNA T7 odpowiadała procedurze, którą opisali Mundt i Vakharia (1996 powyżej) dla odcinka B szczepu P2 (Figura 3).
Szczep UK661
Zastosowano trzy pary oligonukleotydów pochodzących z informacji o sekwencji podanej w Brown i Skinner (1996 powyżej):
i) UK661BFor1 (sekwencja zgodnie z oligonukleotydem B5'-P2, Mundt i Vakharia, 1996 powyżej), skierowany w kierunku antysensownym UK661BRev1 (nukleotyd nr 708-736). Koniec 5' oligonukleotydu UK661Rev1 zawiera oprócz sekwencji odcinka B szczepu UK-661 miejsce restrykcyjne enzymu Xba I zawierające sekwencję dziewięcionukleotydową 5'-CTCTAGAGG.
ii) UK661Bfor2 (nukleotyd 751-677), skierowany w kierunku antysensownym UK661Brev2 (nukleotyd nr 2089-2133). Koniec 5' oligonukleotydu UK661Brev2 zawiera oprócz sekwencji odcinka B szczepu UK-661 miejsce restrykcyjne enzymu Xba I zawierające sekwencję dziewięcionukleotydową 5'-CTCTAGAGG.
iii) UK661BFor3 (nukleotyd 2011-2035), skierowany w kierunku antysensownym UK661BRev3 (Mundi i Mueller, 1996 powyżej, nukleotyd nr 2804-2827). Koniec 5' oligonukleotydu UK661BRev3 zawiera oprócz sekwencji odcinka B szczepu UK-661 miejsca restrykcyjne enzymu Xba I zawierające sekwencję dziewięcionukleotydową 5'-TCTAGAGCCC Tam trójka CCC stworzyła miejsce cięcia dla Sma I wraz z ostatnimi trzema nukleotydami wirusowej genomowej sekwencji odcinka B (nukleotyd 28252827). Przez użycie tych trzech par oligonukleotydów UK661BFor1; UK661BRev1, UK661BFor2; UK661BRev2, i UK661BFor3, UK661BRev3 w czasie RT-PCR zamplifikowano trzy fragmenty cDNA i sklonowano na tępe końce w strawionym Smal wektorze pUC18, aby uzyskać odpowiednio pUK661B1, pUK661B2 i pUK661B3. Po zsekwencjonowaniu trzech wstawionych fragmentów, pUK661B2 strawiono Age I i Xba I, aby uzyskać fragment 1441 bp, który następnie zligowano ze strawionym Age I/Xba I pUK661B1 w celu uzyskania pUK661B12. Dla konstrukcji klonu cDNA pełnej długości odcinka B pUK661B3 strawiono BstB I/Xba I i uzyskany fragment 694 bp zligowano ze strawionym BstB I/Xba I pUK661B12. Powstały plazmid pB661 zawierał pełnej długości sekwencję cDNA odcinka B szczepu UK661 pod kontrolą promotora T7. pB661 jest przedstawiony na Figurze 5 (numeracja zgodna z sekwencją szczepu P2 w Mundt i Mueller, 1995, powyżej).
Odzyskanie wirusa z cRNA w hodowli tkankowej
Do transkrypcji in vitro plazmidów RNA pAD78/DNB, pAD78/ANB-HQ, pAD78/ANB-TA, pAD78/ANB-RS, pAD78/ANB-HQ-TA-RS, pD78A/ANB-E/Del, pD78A/ANB-E/Del-QH, pD78A/ANBE/Del-AT, pD78A/ANB-E/Del-SR, pD78A/ANB-E/Del-QH-AT, pD78A/ANB-E/Del-AT-SR, pD78A/ANBE/Del-QH-SR, pD78A/ANB-E/Del-QH-AT-SR i pD78 linearyzowano przez trawienie BsrGI albo Pst I. Dalszą obróbkę linearyzowanego DNA i transkrypcję przeprowadzono jak opisali Mundt i Vakharia (1996), z dwoma wyjątkami: i) mieszaniny transkrypcyjne nie były oczyszczane za pomocą fenolu/chloroformu, i ii) stosowano komórki QM-7 do doświadczeń z transfekcją. Dwa dni po transfekcji komórki zamrożono/rozmrożono, odwirowano przy 700 x g, aby wyeliminować szczątki komórek i powstałe supernatanty dalej klarowano przez przesączenie przez filtry 0,45 mm i przechowywano w -70°C. Do badań immunofluorescencji komórki QM-7 hodowano na sterylnych szkiełkach przykrywkowych.
Do transkrypcji RNA in vitro plazmidy zawierające odcinek A UK661 (Figura 5) linearyzowano za pomocą trawienia BsrGI. Odcinek B szczepu D78 linearyzowano Pst I podczas, gdy odcinek B szczepu UK661 linearyzowano Sma I. Dalszą obróbkę linearyzowanego DNA i transkrypcję przeprowadzono, jak opisano powyżej.
Detekcja antygenu IBDV
Antygen IBDV wykrywano za pomocą oznaczenia pośredniej immunofluorescencji (IFA) i techniką typu Western stosując króliczą surowicę anty-IBDV. Dla wzrostu IFA CEF hodowano na szkiełkach przykrywkowych inkubowano z supernatantami transfekowanych komórek QM-7, CEF i CAM, odpowiednio, użytych do pasażowania. Po 16 godzinach inkubacji CEF utrwalano w acetonie i obra14
PL 198 981 B1 biano do IFA. Do badania replikacji IBDV po transfekcji, komórki QM-7 hodowane na szkiełkach przykrywkowych przez 24 godziny lub 48 godzin, utrwalano w acetonie i obrabiano do IFA.
Doświadczenia transfekcji międzyrodzajowym cRNA
Do doświadczeń nad transfekcją klon cDNA pełnej długości odcinka A szczepu D78 (pD78/ANB) i międzyrodzajowy odcinek A pD78A/ANB-E/Del transkrybowano na syntetyczny cRNA i kotransfekowano z odcinkiem B (pD78B) cRNA pełnej długości do komórek QM-7 jak również równolegle do komórek CEF. Dwa dni po transfekcji komórki zamrażano i rozmrażano, a uzyskane supernatanty pasażowano dwukrotnie na CEF. W każdym pasażu CEF inkubowano do pięciu dni po zakażeniu. Po zamrożeniu/rozmrożeniu każdy supernatant transfekcyjny jak i supernatant każdego pasażu każdej transfekcji badano na antygen IBDV za pomocą IFA stosując CEF. Doświadczenia z transfekcją powtórzono trzykrotnie. Wirus generowano po transfekcji cRNA z plazmidu pDB78 w kombinacji z pAD78/ANB prowadząc do wytworzenia szczepu D78r. Przeciwnie, po doświadczeniach z transfekcją stosując cRNA z pD78A/ANB-E/Del i pD78B nie można było wyizolować wirusa zakażającego hodowle tkankowe. W celu analizowania czy po transkrypcji zachodzi replikacja, przeprowadzono transfekcję stosując komórki QM-7 rosnące na szkiełkach przykrywkowych. Tu w obu przypadkach antygen wirusa wykrywano 24 godziny po transfekcji stosując IFA. Tak więc udowodniliśmy, że replikacja wirusa zachodziła w obu przypadkach ale tylko w przypadku D78r było możliwe wygenerowanie IBDV zakażającego hodowle tkankowe.
Doświadczenie z transfekcją ze zmutowanym cRNA
Opierając się na wynikach porównania sekwencji uzyskano za pomocą mutagenezy ukierunkowanej pewną ilość zmutowanych pełnej długości klonów cDNA.
(i) IBDV Wariant-E
Wygenerowano zmutowane plazmidy pD78A/ANB-E/Del zawierające podstawienia aminokwasów w pozycjach 253, 284 i 330 we wszystkich siedmiu możliwych kombinacjach (Tabela 5). Doświadczenia z transfekcją i pasażowanie przeprowadzono równolegle trzy razy na komórkach CEF i QM-7. Infekcyjność supernatantów analizowano za pomocą IFA. Po transfekcji cRNA plazmidów pD78A/ANB-E/Del, pD78A/ANB-E/Del-QH, pD78A/ANB-E/DekAT, pD78A/ANB-E/DekSR, pD78A/ANBE/Del-AT-SR i pD78A/ANB-E/Del-QH-SR w kombinacji z cRNA pD78B nie można było wyizolować wirusa zakażającego komórki QM-7 lub CEF. Transfekcja cRNA uzyskanego z pD78A/ANB-E/Del-QH-AT lub pD78A/ANB-E/Del-QH-AT-SR doprowadziła do powstania zakaźnego wirusa (D78A/Del-QH-AT i D78E/Del-QH-AT-SR). Swoistość tego wirusa potwierdzono za pomocą IFA na komórkach CEF jak i QM7. To wskazywało, że VP2 IBDV odgrywa decydującą rolę w zakażaniu hodowli tkankowych. Podstawienia aminokwasów (BU) Q-253-H (TC) i (BU) A-284-T (TC) były konieczne i wystarczające, aby wygenerować IBDV zakaźny dla stosowanych hodowli tkankowych. Mutant IBDV mający trzy podstawienia aminokwasów (D78/Wariant-E przystosowany do CEF) był stosowany do dalszych badań (Przykład 2).
(ii) Klasyczny IBDV
D78
W celu potwierdzenia tych wyników skonstruowano drugi zestaw plazmidów stosując pAD78/ANB do mutagenezy ukierunkowanej do otrzymania plazmidów z podstawieniem pojedynczego aminokwasu (pAD78/ANB-HQ, pAD78/ANB-TA, pAD78/ANB-RS) lub wszystkich trzech aminokwasów (pAD78/ANB-HQ-TA-RS). Te cztery plazmidy zastosowano do doświadczeń z transfekcją w kombinacji z pD78B jak opisano powyżej. Zakaźny IBDV mógł być wygenerowany po transfekcji cRNA z pAD78/ANB-RS, co wykryto za pomocą IFA. Ponownie, aminokwas 330 nie miał żadnego wpływu na zdolność do infekcji hodowli tkankowej przez wygenerowany wirus.
Po transfekcji dla wszystkich konstruktów badano replikację za pomocą IFA. Antygen IBDV mógł być wykryty specyficznie 24 godziny i 48 godzin po transfekcji, wykazując typowe duże intensywnie barwiące się agregaty w obrębie cytoplazmy.
UK661
Do doświadczeń z transfekcją klon pełnej długości cDNA hybrydowych odcinków A pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT i pD78A-E-661-QH-AT transkrybowano na syntetyczny cRNA i kotransfekowano z odcinkiem B szczepu D78 albo odcinkiem B szczepu UK661 cRNA pełnej długości do komórek QM-7 jak również równolegle do komórek CEF. Dwa dni po transfekcji komórki zamrażano i rozmrażano, a powstałe supernatanty pasażowano dwukrotnie na CEC. CEC inkubowano 24 lub 48 godzin po zakażeniu, utrwalano i obrabiano pod kątem immunofluorescencji. Wirus zakaźny na CEC wygenerowano po transfekcji cRNA z plazmidu pD78A-EPL 198 981 B1
661-QH-AT w kombinacji z obydwoma, pD78B i pB661 prowadząc do hybrydowego IBDV D78A-E-661QH-AT. Przeciwnie, po doświadczeniach z transfekcją stosując cRNA z pD78A-E-661, pD78A-E-661-DNAT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT w kombinacji z cRNA z albo pBD78, albo pB661 nie można było wyizolować wirusów zakażających hodowle tkankowe. Po inkubacji supernatantu po transfekcji 72 godziny po zakażeniu w przypadku D78-E-661-DN-AT można wykryć pojedyncze zakażone CEF.
(iii) GLS-IBDV
Aby potwierdzić wyniki doświadczenia transfekcji ze stosowaniem międzyrodzajowych jak i zmutowanych plazmidów wykorzystaliśmy parę naturalnie występujących szczepów IBDV. Zamplifikowano, sklonowano i zanalizowano region zmienny VP2 szczepu GLS pochodzącego z torebki (GLS-B) i przystosowanego do hodowli komórkowej wariantu GLS-TC. Porównanie sekwencji aminokwasów dwóch szczepów GLS uzyskanych odpowiednio z pGLS-B i pGLS-TC wykazało jedną wymianę aminokwasu w pozycji 284 [(GLS-B)A->T (GLS-TC)] między obydwoma sekwencjami (Fig. 1B). Aminokwasy 253 (Q) i 330 (S) były identyczne jak aminokwasy grupy BU jak opisano powyżej. Aby zanalizować, czy wymiana w pozycji 284 (A->T) była wystarczająca do wytworzenia zakaźnego wirusa, skonstruowano dwa plazmidy (pD78A/.-\NB-E/Del-GLS-TC i pD78A/.-\NB-E/Del-GLS-B) zawierające dwa regiony hiperzmienne VP2 obu wariantów GLS. Odpowiednio cRNA pD78A/ANB-E/Del-GLSTC i pD78A/ANB-E/Del-GLS-B transfekowano równolegle w kombinacji z cRNA pD78B do komórek QM-7 jak i CEF. Po pasażowaniu supernatantów w hodowlach tkankowych można było wykryć wirus zakaźny za pomocą IFA jak i CPE po transfekcji cRNA pD78A/VNB-E/Del-GLS-TC. W kilku próbach transfekcja cRNA z pD78A/.-\NB-E/Del-GLS-B nie dała supernatantów zawierających IBDV zakaźny dla hodowli tkankowych. Transkrypcja/translacja in vitro obu plazmidów pD78A/NB-E/Del-GLS-TC i pD78A/ANB-E/Del-GLSB wykazała całkowitą obróbkę polibiałek. Po transfekcji cRNA obu plazmidów razem z cRNA z pD78B wykryto antygen wirusowy za pomocą IFA. Tak więc obie hybrydy okazały się być kompetentne pod względem replikacji. Łącznie wymiana w regionie hiperzmiennym VP2 prowadząca do pojedynczej wymiany w pozycji 284 była wystarczająca do generacji zakaźnego międzyrodzajowego IBDV.
T a b e l a 5
Streszczenie klonów międzyrodzajowy cDNA odcinka A pełnej długości zawierającego podstawienia aminokwasów
| Plazmida | aab 253 | aa - 284 | aa - 330 | Hodowla tkankowa | |
| Transfekcjac | Pasażd | ||||
| pD78A7ÓNB-E/Del | Q | A | S | + | - |
| pD78A7ÓNB-E/Del-QH | H | A | S | + | - |
| pD78A^NB-E/Del-AT | Q | T | S | + | - |
| pD78A^NB-E/Del-SR | Q | A | R | + | - |
| pD78A7ÓNB-E/Del-QH-AT | H | T | S | + | + |
| pD78A^NB-E/Del-AT-SR | Q | T | R | + | - |
| pD78A7ÓNB-E/Del-QH-SR | H | A | R | + | - |
| pD78A^NB-E/Del-QH-AT-SR | H | T | R | + | + |
| pD78A7ÓNB | H | T | R | + | + |
| pD78A7ÓNB-HQ | Q | T | R | + | - |
| pD78A^NB-TA | H | A | R | + | - |
| pD78A^NB-RS | H | T | S | + | + |
| pD78A^NB-HQ-TA-RS | Q | A | S | + | - |
| pD78A7ÓNB -E/Del- GLS- TC | Q | T | S | + | + |
| pD78A7ÓNB -E/Del- GLS- BU | Q | A | S | + | - |
aPlazmidy są oparte na klonie cDNA odcinka A pełnej długości przystosowanego do hodowi tkankowej serotypu I szczepu D78. Sekwencje szczepów torebkowych serotypu I GLS-BU, Delaware E (E/Del) i przystosowanego do hodowli tkankowej serotypu I szczepu GLS-TC podstawiono sekwencjami D78.
PL 198 981 B1 bNumerowanie aminokwasów (aa) według opublikowanej sekwencji szczepu P2 (Mundt i Mueller, 1995, powyżej; NCBI numer dostępu NCBI X 84034). Naturalnie występujące aminokwasy są podane kursywą a zmienione aminokwasy wytłuszczone.
cKomórki zarodka kurczęcia (CEF) jak i QM-7 stosowano do doświadczeń nad transfekcją. Antygen IBDV wykrywano za pomocą pośredniej immunofluorescencji stosując surowicę królika antyIBDV (Mundt i wsp., 1995) 24 godziny po transfekcji, antygeno dodatnie (+) i antygeno ujemne (-).
dCEF stosowano do pasażowania supernatantów transfekcyjnych. Antygen IBDV wykrywano za pomocą pośredniej immunofluorescencji stosując surowicę królika anty-IBDV (Mundt i wsp., 1995) 24 godziny po transfekcji, antygeno dodatnie (+) i antygeno ujemne (-).
P r z y k ł a d 2.
Biologiczne właściwości mutanta Wariantu-EIBDV przystosowanego do CEF
Materiały i metody
Przygotowanie szczepionek IBDV
Hybryda D78/Wariant-E (przystosowana do torebki)
9-12 dniowe jaja SPF zakażono hybrydowym D78/Wariant-E/D78 (D78/wariant-E/D78) bez 3 podstawień aminokwasów w Q253H, A284T i S330R) za pomocą metody opuszczonej błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM). CAM i zarodki zebrano i homogenizowano pięć dni po zakażeniu. Homogenat miareczkowano na obecność CAM. Supernatant rozcieńczono tak, aby dał dawkę szczepionki 102'0 EID50/zwierzę do stosowania w postaci kropli do oczu.
Hybryda D78/Wariant E (przystosowana do CEF)
Pierwotne fibroblasty zarodków kurczęcia (CEF) przygotowano w ostatecznym stężeniu 2 x 106/ml. Komórki hodowano w minimalnej niezbędnej pożywce Eagle'a zawierającej 5% płodową surowicę cielęcą. Do 15 ml tej zawiesiny komórek dodano 0,1 ml wirusa IBDV (D78/Wariant-E/D78 z 3 podstawieniami aminokwasów w Q253H, A284T i S330R) rozpuszczonego w 1 ml. Po inkubacji przez 3-6 dni w in53 kubatorze o wysokiej wilgotności w 37°C supernatant rozcieńczono tak, aby dał szczepionkę mającą 105'3 lub 103'5 TCID50/zwierzę do zastosowania odpowiednio jako krople do oczu lub wstrzyknięcie domięśniowe.
Handlowo dostępna szczepionka IBDV szczep Nobilis D78
Szczepionkę rozcieńczono tak, aby otrzymać dawkę szczepionki 103'3 TCID50/zwierzę do stosowania jako krople do oczu.
Identyfikacja szczepionek IBDV za pomocą testu panelowego
Oba szczepy IBDV identyfikowano za pomocą ELISA stosując różne monoklonalne przeciwciała według Van Loon i wsp. (Van Loon, A.A.W.M., D. Lϋetticken i D.B. Snyder. Rapid qualification of infectious bursal disease (IBD) challenge, field or vaccine virus strains International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anemia, Rauischhilzhausen, Niemcy, 179-187, 1994).
Wzrost na CEF
Zastosowano oba szczepy IBDV do zakażenia CEF. Indukcja specyficznego CPE (efektu cytopatycznego) dla IBDV była badana pod mikroskopem przez okres 6 dni.
Szczepienie
Efekt różnych szczepionek oceniano przez pomiar odporności na prowokację wywołaną przez podanie wirusa prowokującego (Wariant-E wirulentnego szczepu IBDV) 14 dni po szczepieniu. Hybrydową szczepionkę D78/Wariant-E (przystosowany do torebki) 102,0 EID50/zwierzę zastosowano w postaci kropli do oczu w 2 tygodniu życia. Hybrydową szczepionkę D78/Wariant-E (przystosowany do CFE) 105,5 lub 103,5 TCID50/zwierzę zastosowano odpowiednio jako krople do oczu lub jako wstrzyknięcie domięśniowe w 2 tygodniu życia. W drugim tygodniu życia zastosowano w postaci kropli do oczu handlowo dostępny klasyczny szczep szczepionkowy Nobilis D78 (Intervet International B.V., Niderlandy), 103,3 TCID50/zwierzę. Obecność IBDV w torebce Fabrycjusza i mikroskopowe uszkodzenia w torebce 5 zwierząt w grupie badano 3, 7, 10 i 13 dni po szczepieniu i 3 dni po prowokacji. Określono ochronę przed prowokacją.
Wyniki
Identyfikacja szczepionek IBDV za pomocą testu panelowego
Jak widać w Tabeli 6, hybrydowy D78/Wariant-E (przystosowany do torebki) i hybrydowy D78/Wariant-E (przystosowany do CEF) mają identyczny wzór reakcji z różnymi MCA. To oznacza, że 3 zmiany aminokwasów nie mają wpływu na epitopy obecne na wirusach jak określono przez różne MCA. Klasyczna handlowa szczepionka ma różny wzór reakcji z różnymi MCA.
PL 198 981 B1
T a b e l a 6
Panelowy wzór różnych wirusów IBDV z różnymi MCA.
+ epitop obecny na wirusie, - epitop nieobecny na wirusie.
| Wirus /MCA | B29 | 8 | R63 | BK9 | 67 | 57 | B69 |
| Hybrydowy D78/Wariant-E (torebka) | + | + | + | + | + | - | - |
| Hybrydowy D78/Wariant-E (CEF) | + | + | + | + | + | - | - |
| Szczep Nobilis D78 | + | + | + | - | - | - | + |
Kontrolne szczepy IBDV
| Klasyczny | + | + | + | - | - | - | + |
| Wariant-E | + | + | + | + | + | - | - |
| GLS | + | + | - | - | + | + | - |
Wzrost na CEF
Jak widać w tabeli 7, hybrydowy D78/Wariant-E (torebka) nie jest zdolny do wzrostu na CEF. Hybrydowy D78/Wariant-E (CEF) i klasyczny szczep handlowy szczepionkowy Nobilis D78 są zdolne do replikacji na CEF indukując CPE.
T a b e l a 7
Zdolność do wzrostu na CEF i indukcja specyficznego IBDV-CPE. + = indukuje CPE na CEF; - = nie powoduje CPE na CEF
| Wirus | Wzrost na CEF |
| Hybrydowy szczep D78/Wariant-E (torebka) | - |
| Hybrydowy szczep D78/Wariant-E (CEF) | + |
| Szczep Nobilis D78 | + |
Średnia ilość mikroskopowych uszkodzeń w torebce 3, 7, 10 i 13 dni po szczepieniu i 3 i 10 dni po teście prowokacji
Wyniki przedstawiono w Tabeli 8. Jak widać z Tabeli 3, nie przystosowany do CEF szczep hybrydowy D78/Wariant-E (torebka) jest wirulentny i indukuje całkowite zubożenie w limfocyty, już 7 dni po szczepieniu. Przeciwnie, szczep D78/Wariant-E (CEF) przystosowany do hodowli tkankowej nie powoduje uszkodzeń po szczepieniu. Handlowa szczepionka po szczepieniu powoduje uszkodzenia łagodne do umiarkowanych. Indywidualne dane pokazały, że zwierzęta szczepione hybrydowym D78/Wariant-E (torebka) lub D78 były chronione przed prowokacją. Zwierzęta szczepione hybrydowym D78/Wariant-E drogą oczną lub domięśniową też uzyskiwały ochronę 3 dni po teście prowokacji, choć mniejszą niż indukowana przez wirulentny szczep rodzicielski.
T a b e l a 8
Średni wynik uszkodzeń torebki
| Dni po szczepieniu | Dni po prowokacji | |||||
| Wirus | 3 | 7 | 10 | 13 | 3 | 10 |
| D78/Wariant-E/D78 | 3,2 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 4,4C | 4,7 |
| D98/VP5+ (oc) | 0 | 0 | 0 | 0 | 3,0A | 4,1 |
| D98/VP5+ (im) | 0 | 0 | 0 | 0 | 1,0A | 2,8 |
| Szczep Nobilis D78 | 0,2 | 2,2 | 2,0 | 1,8 | 2,8C | 1,9 |
| Nieszczepione kontrole | 5,0A |
(oc) - droga oczna; (im) - droga domięśniowa; C = uszkodzenia przewlekłe; A = uszkodzenia ostre.
PL 198 981 B1
LISTA SEKWENCJI <110> AKZO Nobel NiV.
<120 Mutanty wirusa choroby zakaźnej torebki (IBDV) uzyskane technikami inżynierii genetycznej przystosowane do hodowli komórkowych <130> 9946.3 <150> 99200647.8 ' <151> 1999-03-05 <160> 9 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213:wirus choroby zakaźnej torebki <400> 1 gatcagcicg aagttgctca cccca <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213>
wi rus choroby zakaźne] torebki <400> 2 caagcctcag cgttggggga gagc <210> 3 <211> 99 <212> DNA <213>
wirus choroby zakaźnej torebki <400> 3 ggrcgccacc atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc 60 cgcaaacaat gggctgacga ccggcatcga caatettat <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> . , choroby zakaźnej torebki <400> 4 gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccaag g <210> 5 <211> 22 <212> DNA.
<213> wirus choroby zakaźnej torebki <400> 5 cgtcctagta ggggaagggg tc <210> 6 <211> 31 <212> DNA
PL 198 981 B1 <213> wirus choroby zakaźnej torebki <400> 6 gagagctcgt gttcaaaaca agcgtccata g
<210> 8 <211> 100 <212> DNA . .
<213> wirus choroby zakaźnej torebki cgtaggctac tagtgtgacg ggacggaggg ctcctggata gttgccacca ctgctaggct cccccgtgcc gaccatgaca tctgttcccc tggatcgtca
100 <210> 9 <211> 100 <212> DNA .
<213> Wirus choroby zakaźnej torebki gggcgccacc atctacctca taggctttga tgggacaacg gtaatcacca gggctgtggc 60θ cgcaaacaat gggctgacgg ccggcaccga caaccttatg *
Claims (10)
1. Sposób wytwarzania zakaźnego mutanta IBDV zdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF, znamienny tym, że obejmuje etapy:
(i) oddzielnego przygotowania konstruktu obejmującego cDNA odcinków genomowych A i B IBDV niezdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF, (ii) wprowadzenia mutacji w:
a) jednym lub więcej kodonach dla reszt aminokwasów 253 i 284 genu VP2 szczepów IBDV Wariantu-E lub Klasycznego, lub w
b) kodonie dla reszty aminokwasu 284 genu VP2 szczepu GLS IBDV, w cDNA zawierającym odcinek A, tak że kodony dla reszt aminokwasów 253 i 284 zmutowanego genu VP2 kodują odpowiednio resztę histydyny i treoniny, w przypadku szczepu wariantu-E lub Klasycznego IBDV lub tak, że kodon dla reszty aminokwasu 284 zmutowanego genu VP2 koduje treoninę w przypadku szczepu GLS IBDV (iii) umożliwienia transkryptom RNA z cDNA obejmującego odcinek A i odcinek B inicjacji replikacji mutanta IBDV w komórkach gospodarza w pożywce hodowlanej, i (iv) izolacji mutanta IBDV z hodowli.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mutant IBDV przystosowany do hodowli komórek CEF zawiera serynę, argininę lub lizynę, korzystnie argininę, jako resztę aminokwasu w pozycji 330 białka VP2.
3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że mutacja jest wprowadzana we wszystkich kodonach 253, 284 i 330 genu VP2 Klasycznego IBDV lub Wariantu-E.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że mutacje są wprowadzane w kodonach 253 (Gln), 284 (Ala) i 330 (Ser).
PL 198 981 B1
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przygotowuje się syntetyczne transkrypty RNA z cDNA zawierającego zmutowany odcinek A i odcinek B, a następnie transfekuje się komórki gospodarza syntetycznymi transkryptami RNA.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ż e sposób obejmuje dodatkowe etapy przygotowania hybrydowego IBDV.
7. Uzyskany metodami inż ynierii genetycznej zakaź ny mutant IBDV zdolny do replikacji w hodowli komórek CEF, zawierający kodony dla aminokwasów 253 (His) i 284 (Thr) i ewentualnie 330 (Arg) w genie VP2 IBDV Klasycznego lub Wariantu-E, lub kodon dla aminokwasu 284 (Thr) w genie VP2 GLS IBDV.
8. Uzyskany metodami inż ynierii genetycznej zakaź ny mutant IBDV wedł ug zastrz. 7, znamienny tym, że jest hybrydowym mutantem IBDV.
9. Uzyskany metodami inż ynierii genetycznej zakaź ny mutant IBDV wedł ug zastrz. 7 lub 8, znamienny tym, że jest D78/Wariantem-E (przystosowanym do CEF).
10. Szczepionka do stosowania do ochrony drobiu przed chorobą wynikającą z zakażenia IBDV, znamienna tym, że obejmuje mutant IBDV uzyskany metodami inżynierii genetycznej wytworzony sposobem określonym w zastrz. 1 lub 5 lub 6, wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99200647 | 1999-03-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL338773A1 PL338773A1 (en) | 2000-09-11 |
| PL198981B1 true PL198981B1 (pl) | 2008-08-29 |
Family
ID=8239949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL338773A PL198981B1 (pl) | 1999-03-05 | 2000-03-03 | Sposób wytwarzania zakaźnego mutanta IBDV, zakaźny mutant IBDV uzyskany metodami inżynierii genetycznej oraz szczepionka do stosowania do ochrony drobiu przed chorobą wynikającą z zakażenia IBDV |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6492148B1 (pl) |
| EP (1) | EP1035203B1 (pl) |
| JP (2) | JP4675447B2 (pl) |
| KR (1) | KR100709077B1 (pl) |
| AT (1) | ATE266097T1 (pl) |
| BR (1) | BR0001011B1 (pl) |
| CA (1) | CA2298956C (pl) |
| DE (1) | DE60010358T2 (pl) |
| DK (1) | DK1035203T3 (pl) |
| ES (1) | ES2220333T3 (pl) |
| HU (1) | HU226254B1 (pl) |
| PL (1) | PL198981B1 (pl) |
| PT (1) | PT1035203E (pl) |
| ZA (1) | ZA200001069B (pl) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL136232A0 (en) * | 2000-05-18 | 2001-05-20 | Bar Ilan University Res Author | Measurements of enzymatic activity in a single, individual cell in population |
| CN1592794A (zh) * | 2001-03-09 | 2005-03-09 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于合成感染性丙型肝炎病毒的细胞培养系统 |
| WO2003035824A1 (en) * | 2001-10-25 | 2003-05-01 | Bar-Ilan University | Interactive transparent individual cells biochip processor |
| IL154677A0 (en) | 2003-02-27 | 2003-09-17 | Univ Bar Ilan | A method and apparatus for manipulating an individual cell |
| US9200245B2 (en) * | 2003-06-26 | 2015-12-01 | Seng Enterprises Ltd. | Multiwell plate |
| US8597597B2 (en) | 2003-06-26 | 2013-12-03 | Seng Enterprises Ltd. | Picoliter well holding device and method of making the same |
| US20060240548A1 (en) * | 2003-06-26 | 2006-10-26 | Mordechai Deutsch | Materials for constructing cell-chips, cell-chip covers, cell-chips coats, processed cell-chips and uses thereof |
| US7888110B2 (en) | 2003-06-26 | 2011-02-15 | Seng Enterprises Ltd. | Pico liter well holding device and method of making the same |
| WO2005008626A1 (en) * | 2003-07-11 | 2005-01-27 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and systems for controlling a computer using a video image and for combining the video image with a computer desktop |
| US20050064524A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-03-24 | Mordechai Deutsch | Population of cells utilizable for substance detection and methods and devices using same |
| JP2007520546A (ja) * | 2004-02-03 | 2007-07-26 | ケマジス リミティド | モンテルカストナトリウムの安定な非晶質性形態 |
| EP1763665A1 (en) * | 2004-07-07 | 2007-03-21 | Seng Enterprises Limited | Method and device for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component |
| US7403647B2 (en) * | 2004-09-13 | 2008-07-22 | Seng Enterprises Ltd. | Method for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component |
| EP1781404A2 (en) * | 2004-08-25 | 2007-05-09 | Seng Enterprises Limited | Method and device for isolating cells |
| ATE480324T1 (de) | 2005-01-25 | 2010-09-15 | Seng Entpr Ltd | Mikrofluidische vorrichtung zur untersuchung zellen |
| DE102005034043B4 (de) * | 2005-07-18 | 2019-12-12 | Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt | Gemisch, enthaltend L-Carnitin und Trehalulose, sowie Produkt enthaltend das Gemisch |
| US20070141555A1 (en) * | 2005-10-11 | 2007-06-21 | Mordechai Deutsch | Current damper for the study of cells |
| US8288120B2 (en) | 2005-11-03 | 2012-10-16 | Seng Enterprises Ltd. | Method for studying floating, living cells |
| US20060223999A1 (en) * | 2006-05-10 | 2006-10-05 | Chemagis Ltd. | Process for preparing montelukast and precursors thereof |
| WO2009081409A2 (en) | 2007-12-26 | 2009-07-02 | Seng Enterprises Ltd. | Device for the study of living cells |
| US9145540B1 (en) | 2007-11-15 | 2015-09-29 | Seng Enterprises Ltd. | Device for the study of living cells |
| EP2407534A1 (en) | 2010-07-14 | 2012-01-18 | Neo Virnatech, S.L. | Methods and reagents for obtaining transcriptionally active virus-like particles and recombinant virions |
| CN102258777B (zh) * | 2011-06-30 | 2012-09-26 | 河南农业大学禽病研究所 | 用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法 |
| CN111235117B (zh) * | 2020-02-13 | 2021-08-27 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 一株自然适应体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典株及其应用 |
| TWI862969B (zh) * | 2022-08-23 | 2024-11-21 | 財團法人紡織產業綜合研究所 | 液態色母組合物及彩色纖維的製備方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5788970A (en) * | 1994-03-29 | 1998-08-04 | The University Of Maryland College Park | Chimeric infectious bursal disease virus CDNA clones, expression products and vaccines based thereon |
| US5871744A (en) * | 1996-09-05 | 1999-02-16 | University Of Maryland-Biotechnology Inst. | Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts |
-
2000
- 2000-02-25 US US09/513,487 patent/US6492148B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-28 DK DK00200709T patent/DK1035203T3/da active
- 2000-02-28 AT AT00200709T patent/ATE266097T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-02-28 ES ES00200709T patent/ES2220333T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-28 PT PT00200709T patent/PT1035203E/pt unknown
- 2000-02-28 DE DE60010358T patent/DE60010358T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-28 EP EP00200709A patent/EP1035203B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-02 CA CA002298956A patent/CA2298956C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-02 ZA ZA200001069A patent/ZA200001069B/xx unknown
- 2000-03-02 JP JP2000057146A patent/JP4675447B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-03 PL PL338773A patent/PL198981B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-03-03 HU HU0000992A patent/HU226254B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-03-03 BR BRPI0001011-1A patent/BR0001011B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-03-04 KR KR1020000010849A patent/KR100709077B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-07-10 US US10/192,469 patent/US6569422B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-09-08 JP JP2010201298A patent/JP2011036255A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0000992A2 (hu) | 2000-11-28 |
| ES2220333T3 (es) | 2004-12-16 |
| DK1035203T3 (da) | 2004-08-30 |
| ZA200001069B (en) | 2000-10-20 |
| EP1035203A1 (en) | 2000-09-13 |
| US6492148B1 (en) | 2002-12-10 |
| KR20010069175A (ko) | 2001-07-23 |
| JP4675447B2 (ja) | 2011-04-20 |
| PL338773A1 (en) | 2000-09-11 |
| PT1035203E (pt) | 2004-08-31 |
| HUP0000992A3 (en) | 2005-06-28 |
| ATE266097T1 (de) | 2004-05-15 |
| CA2298956C (en) | 2009-12-01 |
| JP2000312593A (ja) | 2000-11-14 |
| HU226254B1 (en) | 2008-07-28 |
| EP1035203B1 (en) | 2004-05-06 |
| DE60010358T2 (de) | 2004-09-23 |
| KR100709077B1 (ko) | 2007-04-19 |
| US6569422B1 (en) | 2003-05-27 |
| CA2298956A1 (en) | 2000-09-05 |
| JP2011036255A (ja) | 2011-02-24 |
| DE60010358D1 (de) | 2004-06-09 |
| HU0000992D0 (en) | 2000-05-28 |
| BR0001011A (pt) | 2001-07-03 |
| BR0001011B1 (pt) | 2011-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL198981B1 (pl) | Sposób wytwarzania zakaźnego mutanta IBDV, zakaźny mutant IBDV uzyskany metodami inżynierii genetycznej oraz szczepionka do stosowania do ochrony drobiu przed chorobą wynikającą z zakażenia IBDV | |
| JP2018501792A (ja) | 改良されたｈｖｔベクターｎｄ−ｉｂｄワクチン | |
| WO1999016866A1 (en) | A method for generating nonpathogenic, infectious birnavirus from synthetic rna transcripts | |
| US7022327B1 (en) | Recombinant birnavirus vaccine | |
| EP0887412B1 (en) | Recombinant birnavirus vaccine | |
| US6451321B1 (en) | IBDV strain in ovo administration | |
| US6699479B1 (en) | Recombinant newcastle disease virus as an embryo vaccine | |
| KR100759769B1 (ko) | 광범위한 감염성 활액낭 질병 바이러스 백신 | |
| EP1170302B1 (en) | Infectious bursal disease virus vaccines | |
| EP1074614B1 (en) | A recombinant Newcastle disease virus for in ovo vaccination | |
| MXPA00002278A (en) | Genetically engineered cell culture adapted infectious bursal diseases virus (ibdv) mutants | |
| EP1161953A2 (en) | IBDV strain for in OVO administration | |
| MXPA00007313A (en) | A recombinant newcastle disease virus for in ovo vaccination |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification | ||
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20130303 |