PL199352B1 - Izolowane kwasy nukleinowe, oligonukleotyd, wektory, wektory plazmidowe, komórka gospodarza, polipeptydy, sposób wytwarzania polipeptydu, szczepionka, zastosowania szczepionki i zastosowania polipeptydu - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy wyizolowanego oraz oczyszczonego DNA, koduj acego koci ligand CD80, koci ligand CD86, koci receptor CD28, koci receptor CTLA-4, jak równie z wektorów zwieraj acych kwa- sy nukleinowe koduj ace koci CD80, kociCD86, koci CD28 lub koci CTLA-4. Wynalazek dotyczy tak ze transformowanych komórek gospodarza za spraw a wektorów koduj acych CD80, wektorów koduj acych CD86, wektorów koduj acych CD28 lub wektorów koduj acych CTLA-4, dostarcza bia lka kodowane przez kwasy nukleinowe kociego CD80, kociego CD86, kociego CD28, kociego CTLA-4, szczepionk e zawieraj ac a skuteczn a ilo sc bia lek kodowanych przez kwas nukleinowy kociego CD80, kociego CD86 lub kociego CTLA-4, szczepionk e, która zawiera tak ze immunogeny otrzymane z patogenów, szcze- pionk e zdoln a do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej oraz szczepionk e zdoln a do t lumienia odpowiedzi immunologicznej. W American Type Culture Collection zosta ly zdeponowane wektory plazmidowe o numerach dost epu ATCC 209817, ATCC 209821, ATCC 209819 i ATCC 209820. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowany kwas nukleinowy kodujący koci polipeptyd CD86, izolowany kwas nukleinowy kodujący koci polipeptyd CTLA-4, oligonukleotyd, wektory zawierające takie kwasy nukleinowe, wektory plazmidowe, komórka gospodarza zawierająca taki wektor, polipeptydy kodowane przez takie kwasy nukleinowe, sposób wytwarzania takiego polipeptydu, szczepionka zawierająca taki polipeptyd, zastosowania takiej szczepionki i zastosowania takiego polipeptydu.

Obecnie nie ma skutecznej szczepionki do zapobiegania niedoborowi odpornościowemu kotów i zakaźnemu zapaleniu otrzewnej kotów. Obecnie są dostępne szczepionki z kocim wirusem białaczki, ale poziom ich skuteczności jest wątpliwy, a w niektórych przypadkach mogą one powodować choroby. Dlatego w danej dziedzinie poszukiwane są środki lub kompozycje, które dostarczą ochrony przed tą i innymi chorobami, wobec których nie istnieją jeszcze szczepionki lub które poprawią skuteczność istniejących i powszechnie używanych szczepionek. Dodatkowo szczepienie kociąt jest trudne z powodu niemożności uniknięcia przeciwciał matczynych. Poszukiwane są także skuteczne środki mające pomóc ominąć te bariery.

Uważa się, że stymulacja aktywacji komórek T i proliferacji w odpowiedzi na chorobę u gospodarza zależy od dwóch interakcji: rozpoznania receptora komórek T (TCR) przez immunogenne białka w kontekś cie czą steczek MHC klasy I oraz druga interakcja dodatkowych ligandów, takich jak CD80 i CD86, z ich koreceptorami, CD-28 i/lub CTLA-4 na komórkach T. Pomyślna interakcja tych dwóch ścieżek prowadzi do aktywacji i proliferacji zarówno komórek T CD4+, jak i CD8+ oraz wzrostu produkcji immunoregulacyjnych cytokin typu Th1 i Th2. W nieobecności odpowiednich kostymulujących komórek T może rozwinąć się stan anergiczny, w którym to komórki T nie proliferują i nie wydzielają cytokin. Przez lata dwie cząsteczki były uważane jako kluczowe regulatory odpowiedzi komórki T, CD28 i jej ligandy, CD80 i CD86. CD28 jest podstawowym receptorem kostymulującym komórki T, który w czasie interakcji z CD80 i CD86 podnosi proliferację komórek T oraz syntezę cytokin, zapobiegając śmierci komórek T. CTLA-4 (nazywana także CD152), homolog CD-28, odgrywa także ważną rolę w kostymulacji. Pomimo tego wydaje się, ale bez całkowitej pewności, że powoduje inhibicję kostymulujących odpowiedzi komórek T. Interakcje i wzajemne oddziaływanie pomiędzy CD28, CTLA-4 i ich ligandami CD80 i CD86 w procesie kostymulacyjnym jest kluczem do cał kowitej indukcji i tł umienia odpowiedzi immunologicznej wobec choroby gospodarza. Poprzez zmianę ekspresji tych czterech kostymulujących cząsteczek wydaje się możliwa regulacja odpowiedzi komórek T poprzez zwiększenie, tłumienie lub przekierowanie w celu zwiększenia pożądanej odpowiedzi immunologicznej wobec poszczególnych patogenów lub stanów chorobowych. W szczególności mogą być one użyteczne do szczepienia przeciwko chorobom zakaźnym, do leczenia chorób zakaźnych, leczenia stanów nowotworowych, degeneracyjnych, autoimmunologicznych.

Limfocyty T ssaczego układu immunologicznego posiadają zarówno funkcję kontrolną, jak i efektorową . Komórki prekursorowe T powstają w szpiku kostnym z komórek macierzystych i migrują do grasicy. W grasicy ma miejsce dojrzewanie i selekcja w celu wyprodukowania dziewiczej populacji komórek immunologicznych, które są zdolne do rozpoznania przeciwciała w kontekście prezentacji głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), ale nie są autoreaktywne. Po dojrzewaniu w grasicy, każda komórka T posiada klonalnie rozmieszczone receptory komórek T (TCR), które determinują jej specyficzność antygenową. Ponadto komórki T CD4⁺ i CD8⁺, dwie główne podgrupy występujące u większości dorosłych ssaków, posiadają TCR złożone z podjednostek α i β (Allison i Lanier,1987).

Organizacja białkowa oraz genowa białka TCR jest podobna do tej obserwowanej w cząsteczkach immunoglobulin (Ig) i posiada wiele właściwości podobnych do związanej z błoną Ig na komórkach B (Allison i Lanier, 1987). Podobnie jak cząsteczka Ig TCR musi posiadać zdolność do rozpoznawania ogromnej liczby potencjalnych sekwencji antygenowych. Z tego powodu organizacja genowa TCR oraz jej przebudowa jest podobna w swej złożoności do tej w kompleksach komórek B (Davis i Bjorkman, 1988). Tak jak przy czą steczkach przeciwciał produkowanych przez komórki B, pokolenie różnorodnych idiotypów komórek T wymaga wielu kopii genów zmiennych (v) w linii zarodkowej, różnych układów podjednostek α i β oraz zmienności wytwarzanej przez łączenie i wprowadzanie (Davis i Bjorkman, 1988). W odróżnieniu od komórek B, komórki T nie wydają się tworzyć zmienności dzięki mutacjom somatycznym, natomiast potencjalny repertuar TCR wydaje się być tak duży jak cząsteczek Ig (Lechler i inni, 1990).

Pomimo że TCR jest odpowiedzialny za rozpoznanie antygenu to nie posiada zdolności dostarczania sygnału (Allison i Lanier, 1987). Zmiany konformacyjne TCR następujące po związaniu antyPL 199 352 B1 genu prezentowanego w kontekście MHC na komórce prezentującej antygen (APC), wywołują dostarczenie sygnału przez niekowalencyjnie połączony kompleks cząsteczek powierzchniowych zawierających łańcuchy CD3 i ς, (Clevers i inni, 1988). Wiązanie TCR powoduje fosforylację kompleksu CD3, która pośrednio prowadzi do napływu Ca⁺ do komórki, zapoczątkowując produkcję IL-2 i IL-2R (Weiss i Littman, 1994). Kaskada ta jest uważ ana za wydarzenie inicjują ce aktywację komórki T.

TCR rozpoznaje antygen tylko gdy jest obecny wraz z MHC. Istnieją dwie podgrupy białek MHC związanych z prezentacją wobec komórek T. Klasa I MHC występuje w prawie wszystkich komórkach jądrzastych organizmu, a jej funkcje to powierzchniowa ekspresja endogennie produkowanych białek (Matasamura i inni, 1992). Białko prezentowane w kontekście MHC klasy I jest rozpoznawane przez komórki T ekspresjonujące CD8 w połączeniu z TCR (Littman, 1987). Komórki T CD8⁺ w kontrolnym mechanizmie immunologicznym usuwają komórki zakażone wirusem i złośliwe. Rozpoznanie obcych cząsteczek przez komórki T CD8⁺ (peptydy lub zmienione peptydy własne, które mogą indukować nowotwory) powoduje zniszczenie komórek przez cytotoksyczne limfocyty T (CTL) (Berke, 1994).

Cząsteczki MHC klasy II, druga główna podgrupa cząsteczek zgodności tkankowej, występują zwykle w wysoce wyspecjalizowanych komórkach prezentujących antygen, obejmujących komórki B, makrofagi/ monocyty i komórki dendrytyczne, chociaż możliwa jest indukcja na innych populacjach komórek w odpowiedzi na specyficzne bodźce (Germain, 1993). Cząsteczka MHC klasy II jest odpowiedzialna za prezentację egzogennego antygenu komórkom T CD4⁺. Antygen, który jest fagocytowany, endocytowany lub powierzchniowo związany z Ig i absorbowany przez komórki prezentujące antygen, jest endogennie przetwarzany i wiązany z MHC klasy II (Unanue, 1987). Cząsteczka jest następnie ekspresjonowana powierzchniowo i zdolna do rozpoznania przez komórki T ekspresjonujące CD4 αβ (Littman, 1987). Rozpoznanie antygenu przez komórki T CD4⁺ powoduje produkcję cytokin i wzrost czynników potrzebnych do inicjacji i promulgacji wielu aspektów aktywnej odpowiedzi immunologicznej (Mosmann i Coffman, 1987).

CD4 i CD8 odróżniają podgrupy komórek T αβ oraz definiują funkcjonalne właściwości każdej grupy. Prezentacja CD4 lub CD8 na komórkach T jest wzajemnie rozłączna (Littman, 1987). Tak więc po selekcji grasiczej oraz dojrzewaniu komórki T αβ prezentują tylko CD4 albo CD8. Działanie cząsteczek ma na celu stabilizację interakcji pomiędzy TCR a MHC wiążącym antygeny oraz określeniu czy komórka T rozpoznaje antygen prezentowany w kontekście MHC klasy I albo klasy II (Littman, 1987). Wiążąca domena cząsteczek CD4 albo CD8 rozpoznaje swoje niepolimorficzne regiony cząsteczek klasy I lub klasy II (Clayberger i inni, 1994). Wiązanie CD4 albo CD8 do tych specyficznych regionów powoduje stabilizację interakcji TCR/antygen związany z MHC, dla inicjacji aktywacji komórek T (Littman, 1987). Tak więc komórki T CD4⁺ współdziałają tylko funkcjonalnie z APC prezentującymi antygen w kontekście klasy II i inicjują odpowiedź pomocniczych komórek T, podczas gdy komórki T CD8⁺ rozpoznają tylko antygen prezentowany w kontekście klasy I, i po związaniu inicjują odpowiedź cytotoksyczną (Germain, 1993). Dwa odrębne fenotypy pomocniczych komórek T i CTL mogą być rozróżnione przez ekspresję powierzchniową CD4 albo CD8.

Ogólnie uważa się, że większość limfocytów T noszących CD4 jest rozpatrywana jako komórki pomocnicze mimo, że istnieje zaproponowana podgrupa CTL CD4⁺ (Yasukawa, i inni, 1989). Pomocnicze komórki T CD4⁺ są głównymi regulatorami odpowiedzi immunologicznej bezpośrednio przez produkcję serii stymulujących i tłumiących cytokin (Mosmann i Coffman, 1987). Czynniki wyprodukowane przez te komórki są ważnymi mediatorami inicjacji zarówno humoralnej lub zależnej od przeciwciał odpowiedzi, jak i odpowiedzi komórkowej lub nadwrażliwości typu późnego (DTH) (Mosman i Coffman, 1987). Aby komórki T CD4⁺ został y zaktywowane i produkował y rozpuszczalne czynniki wzrostu musi pojawić się kompleksowa kaskada zjawisk. Antygen zostaje wykryty i endocytowany przez wysoce wyspecjalizowane APC, a zazwyczaj makrofagi (Unanue, 1984). APC denaturuje białko i rozbija je na mniejsze fragmenty peptydowe o długości 15-18 reszt aminokwasowych, które są następnie wiązane przez MHC w retikulum endoplazmatycznym i następnie przenoszone na powierzchnię w celu ekspresji (Rotzschke i inni, 1994). Powierzchniowo ekspresjonowany antygen jest więc widoczny dla limfocytów T i może zostać rozpoznany przez podgrupy komórek T z odpowiednim idiotypem i ekspresjonujące CD4 (Germain, 1993). Gdy komórki T rozpoznają odpowiedni antygen oraz gdy towarzyszy temu dodatkowy odpowiedni sygnał to pojawiają się limfocyty dziewicze i może zajść rozwój klonalny. Jak dotąd nieokreślony bodziec powoduje rozwój preferencyjnej odpowiedzi typu 1 (komórkowego) względem odpowiedzi typu 2 (humoralna) (Mosman i Coffman, 1989).

Pomoc komórki T jest pożądana w celu zwiększenia aktywności odpowiedzi zarówno humoralnej, jak i komórkowej. Zależna od komórki T odpowiedź komórki B, która jest wymagana dla wytwo4

PL 199 352 B1 rzenia przeciwciał wobec większości antygenów, wymaga pomocy komórki T dla zajścia odpowiedniego dojrzewania komórki B (Chesnut i inni, 1986). Po związaniu antygenu przez Ig na komórce B, następuje internalizacja, obróbka oraz powierzchniowa ekspresja antygenów w kontekście MHC klasy II (Germain, 1993). Bezpośredni kontakt komórki z komórką pomiędzy komórką CD4⁺ o odpowiednim idiotypie TCR z komórką B przyczynia się do aktywacji oraz proliferacji komórek T (Chesnut i inni, 1986). Zaktywowana komórka pomocnicza T może być zdolna do promowania odpowiedzi typu II przez wydzielanie czynników potrzebnych do wzrostu komórek B i różnicowania (Mosmann i Coffman, 1989). Czynniki te obejmują IL-4, IL-5 oraz IL-13, które mogą indukować aktywację komórek B oraz proliferację, i są ważne w zmianach izotypowych cząsteczek Ig, podczas gdy IL-10 zapobiega inicjacji odpowiedzi typu I, która z kolei pomniejszyłaby aktywność humoralną (Mosmann i Coffman, 1989).

Odpowiedzi komórkowe (typ I) nie dojrzewają w ten sam sposób jak odpowiedzi humoralne (typ II) (Sher i inni, 1992). Po aktywacji komórki T oraz dojrzewaniu do odpowiedzi typu I produkowane są przez komórki T czynniki, które sprzyjają odporności komórkowej. IL-2 jest czynnikiem wzrostu komórki T, który także sprzyja odpowiedziom CTL, podczas gdy IFN-y aktywuje makrofagi, CTL i neutrofile (Wang i inni, 1993).

Komórki pomocnicze T są zatem zdolne do pośredniczenia dwóm wzajemnie rozłącznym odpowiedziom. Wzorzec wydzielania cytokin, który prowadzi do inicjacji odpowiedzi humoralnej obejmuje czynniki, które tłumią odpowiedź komórkową i vice versa (Mosmann i Coffman, 1989). Nie wiadomo co determinuje zależność czy komórki T będą produkować wzorzec typu I (IL-2, IFN-γ i limfotoksyna) lub wzorzec typu 2 (IL-4, -5, -6, -10, i -13) chociaż proponuje się, że typ APC prezentujący antygen lub rozpuszczalne czynniki produkowane przez APC mogą mieć wpływ na typ rozwijającego się wzorca cytokin (Mosmann i Coffman, 1989). Dodatkowo do komórek pomocniczych typu 1 i typu 2 istnieją podgrupy komórek pomocniczych typu 0, w których wzorce wydzielnicze są pośrednie pomiędzy typem 1 i typem 2 (Gajewski i inni, 1989). Podczas gdy podgrupy komórek pomocniczych T zostały przedstawione głównie w eksperymentach in vitro, i mogą być artefaktami hodowli, są one ważnymi modelami dla roli komórek pomocniczych T w modulowaniu rozwoju specyficznych odpowiedzi w środowisku in vivo.

Oprócz podgrupy limfocytów pomocniczych T CD4⁺, druga populacja komórek T αβ składa się z limfocytów cytotoksycznych noszących CD8. CTL CD8⁺ wydają się być głównym składnikiem układu kontrolnych mechanizmów immunologicznych, którego główna funkcja polega na niszczeniu wirusowych i wewnątrzkomórkowo zakażonych bakteriami komórek, jak również komórek złośliwych (Berke, 1994). Komórki te są także zdolne do produkcji cytokin, ale generalnie tylko tych związanych z indukowaniem odpowiedzi komórkowych (IL-2, IFN-γ i TNF) (Fong i Mosmann, 1990). TCR tych komórek, w połączeniu z CD8, rozpoznaje antygen prezentowany w kontekście MHC klasy I (Littman, 1987). Ogólnie wszystkie komórki jądrzaste wykazują powierzchniową ekspresję klasy I prezentującej endogennie syntetyzowane peptydy (Matasumara, 1992). Specyficzne, immuno-uprzywilejowane miejsca, włącznie z mózgiem i jądrami wykazują niski poziom ekspresji białek, chociaż jest ona indukowana w tych rejonach przez ekspozycję na działanie interferonu (Moffett i Paden, 1994). Białka produkowane w retikulum endoplazmatycznym podczas normalnego metabolizmu komórki są denaturowane, częściowo degradowane i wiązane do MHC klasy I w celu ekspresji powierzchniowej (Engelhard, 1994). Polipeptydy są proteolitycznie linearyzowane i wiązane w 9-12 aminokwasowych epitopach do klasy I, która jest następnie ekspresjonowana na powierzchni komórki (Engelhard, 1994). Teoretycznie wszystkie peptydy wyprodukowane endogennie są w ten sposób ekspresjonowane powierzchniowo, a grasicza selekcja idealnie eliminuje wszystkie autoreaktywne komórki T, a kontrola układu immunologicznego może wykryć obecność zarażonych wirusem lub komórek transformowanych (Berke, 1993). Rozpoznanie obcych peptydów ekspresjonowanych przez klasę I jest ułatwione przez antygenowe specyficzne receptory komórek T na CTL CD8⁺ (Lechler i inni, 1990). Kontakt pomiędzy komórką efektorową a docelową jest wymagany aby zaszła aktywacja (Berke, 1994). Gdy antygen widziany jako obcy, jest rozpoznany przez TCR, interakcja pomiędzy cząsteczkami jest stabilizowana przez wiązanie CD8 do klasy I na zinfekowanej komórce (Littman, 1987). Bezpośrednio po rozpoznaniu i aktywacji komórki T formy koniugatu pomiędzy komórką docelową a efektorem T oraz komórka efektora zostają rozdzielone. Tak więc w ten sposób jeśli białka własne zostaną zmienione lub jeśli mechanizmy komórkowe są przejęte przez patogen, to peptydy będą mogły być rozpoznane przez kontrolny mechanizm immunologiczny, który będąc częścią układu immunologicznego może eliminować chore komórki (Berke, 1994).

PL 199 352 B1

Cytotoksyczność komórkowa wydaje się powstawać z jednej lub dwóch głównych ścieżek. Komórka może być indukowana aby ulec apoptotycznej śmierci albo zostać poddana lizie przez uwolnienie cytotoksycznych ziaren przez CTL (Berke, 1993). Apoptoza jest indukowana w komórkach docelowych dzięki uwolnieniu czynników przez CTL, które indukują ekspresję genową, która prowadzi do śmierci komórki (Russel, 1983). Zaletą tego mechanizmu jest to, że nie zachodzi liza komórek oraz to, że możliwość uwolnienia potencjalnie zakaźnych składników komórki jest zredukowana (Nagata i Golstein, 1995). Liza komórek jednakże może być częstszym mechanizmem przebiegu docelowej eliminacji. Perforyna, której działanie polega na perforacji błon komórek docelowych, jest głównym składnikiem cytotoksycznych ziaren CTL (Liu i inni, 1995). Chociaż istnieją inne typy komórek biorących udział w kontrolnych mechanizmach immunologicznych, CTL wydaje się być głównym składnikiem odporności antywirusowej oraz antynowotworowej, a także wydaje się być niezastąpionym składnikiem ochronny przeciwko specyficznym patogenom (Kupfer i Singer, 1989).

Białka powierzchniowe komórek inicjujących były początkowo używane do rozróżniania specyficznych populacji komórek. Ostatnio odkryto wiele funkcji tych cząsteczek, a ze względu na to, że obecnie są one nadal przydatne do rozróżniania populacji komórek, natomiast coraz bardziej widoczna jest ich znacząca rola w funkcjonowaniu wielu komórek.

Różne pomocnicze oraz adhezyjne komórki, które odgrywają pewną rolę w rozwinięciu odpowiedzi immunologicznej są ekspresjonowane przez komórki T i komórki prezentujące antygen (van Seventer i inni, 1991). Cząsteczki adhezyjne są ekspresjonowane na pewnym poziomie w większości komórek układu immunologicznego. Są one ważne przy utrzymywaniu komórek wewnątrz obszaru, a takż e przy inicjacji oraz podtrzymywaniu kontaktu komórki z komórk ą (Mescher, 1992).

CD-2/LFA 3 (CD58) i LFA-1/ICAM-1 to dwa kompleksy cząsteczek adhezyjnych zaangażowanych w stabilizację interakcji komórek T/APC oraz poprawę aktywności (Springer i inni, 1987). CD2 jest jednym z pierwszych markerów ekspresjonowanych na komórkach pre-T utrzymujących się później przez całe życie komórki, podczas gdy LFA-1 są ekspresjonowane później na komórkach T, a ich poziom jest zwiększany w komórkach pamięci lub poprzez indukcję (Springer i inni, 1987).

Kompleksy cząsteczek pomocniczych wykazują także właściwości adhezyjne, ale ich główną funkcją jest prawdopodobnie dostarczenie międzykomórkowego sygnału po związaniu ligandu (Anderson i inni, 1988). Po ustabilizowaniu interakcji pomiędzy receptorem i jego ligandem zachodzi zmiana konformacyjna w strukturze cząsteczki, która powoduje dostarczenie sygnału do cytoplazmy jednej lub obydwu komórek (Hutchcroft i Bierer, 1994). Sygnały dostarczone przez te komórki odgrywają różne role w rozwoju komórek T, natomiast w przypadku braku sygnału zależnego od tych komórek, komórki T mogą stać się anergiczne (Leung i Linsley, 1994).

Interakcja CD28/CD80 jest głównym składnikiem wydajnej, zależnej od komórek T odpowiedzi immunologicznej (Linsley i inni, 1993a). Interakcja pomocniczych cząsteczek CD28 z ich ligandami CD80 jest niezbędna do pełnej aktywacji i proliferacji dziewiczych komórek T (Linsley i inni, 1991a). Interakcja wydaje się także odgrywać znaczącą rolę w proliferacji aktywowanych komórek T oraz komórek T CD4⁺ pamięci i zapobieganiu apoptycznej śmierci komórki (Linsley i inni, 1991a). Stwierdzenie interakcji oraz objaśnienie jej mechanizmu dostarczyło ważnego ogniwa do zrozumienia odporności zależnej od komórki T.

Zgodnie z wynalazkiem dostarczono wyizolowany oraz oczyszczony DNA kodujący koci ligand CD86 (B7-2), koci receptor CTLA-4 (CD152), jak również wektory zwierające kwasy nukleinowe kodujące koci CD86, lub koci CTLA-4. Transformowane komórki gospodarza mogą zawierać wektory kodujące CD86, lub kodujące CTLA-4. Przez te kwasy nukleinowe kodowane są białka kociego CD86, lub kociego CTLA-4. Zgodnie z wynalazkiem dostarczono także szczepionkę zawierającą skuteczną ilość białek kodowanych przez kwas nukleinowy kociego CD86 lub kociego CTLA-4. Taka szczepionka może zawierać immunogeny otrzymane z patogenów. Takie szczepionki są zdolne do poprawiania odpowiedzi immunologicznej, jej tłumienia, lub zmiany kierunku odpowiedzi immunologicznej.

Przedmiotem wynalazku jest izolowany kwas nukleinowy charakteryzujący się tym, że koduje koci ligand CD86 lub koci rozpuszczalny ligand CD86.

Przedmiotem wynalazku jest izolowany kwas nukleinowy charakteryzujący się tym, że koduje koci receptor CTLA-4 lub koci rozpuszczalny receptor CTLA-4.

Korzystnie koci ligand CD86 posiada sekwencję oznaczoną jako sekwencja ID nr 5.

Korzystniej koci receptor CTLA-4 posiada sekwencję oznaczoną jako sekwencja ID nr 9.

Korzystnie kwas nukleinowy stanowi DNA lub RNA.

Korzystniej DNA stanowi cDNA lub genomowy DNA.

PL 199 352 B1

Przedmiotem wynalazku jest również oligonukleotyd charakteryzujący się tym, że złożony jest z co najmniej 12 nukleotydów, posiadający sekwencję komplementarną do sekwencji unikalnie obecnej w kwasie nukleinowym kodującym koci ligand CD86 lub koci rozpuszczalny ligand CD86 albo koci receptor CTLA-4 lub koci rozpuszczalny receptor CTLA-4.

Korzystnie złożony jest z co najmniej 15 lub 16 nukleotydów.

Korzystnie oligonukleotyd jest znakowany w sposób wykrywalny.

Korzystniej znakowanie wykrywalne obejmuje znakowanie radioizotopem, fluoroforem lub biotyną.

Korzystnie oligonukleotyd jest selektywnie metylowany.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor charakteryzujący się tym, że zawiera kwas nukleinowy kodujący koci ligand CD86 lub koci rozpuszczalny ligand CD86.

Przedmiotem wynalazku jest też wektor plazmidowy oznaczony jako B7-2#19-2/011298 (numer dostępu ATCC 209821).

Przedmiotem wynalazku jest także wektor charakteryzujący się tym, że zawiera kwas nukleinowy kodujący koci receptor CTLA-4 lub koci rozpuszczalny receptor CTLA-4.

Przedmiotem wynalazku jest też wektor plazmidowy oznaczony jako CTLA-4#1/091997 (numer dostępu ATCC 209820).

Korzystnie powyższe wektory zawierają promotor operacyjnie związany z kwasem nukleinowym.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera dowolny z określonych powyżej wektorów.

Korzystnie komórka gospodarza stanowi komórkę eukariotyczną lub prokariotyczną.

Korzystniej komórka gospodarza wybrana jest z grupy składającej się z: E. coli, drożdży, komórek COS, komórek PC12, komórek CHO, i komórek GH4C1.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd, charakteryzujący się tym, że kodowany jest przez kwas nukleinowy kodujący koci ligand CD86 lub koci rozpuszczalny ligand CD86.

Przedmiotem wynalazku jest też polipeptyd, charakteryzujący się tym, że kodowany jest przez kwas nukleinowy kodujący koci receptor CTLA-4 lub koci rozpuszczalny receptor CTLA-4.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania polipeptydu kodującego koci ligand CD86 lub koci rozpuszczalny ligand CD86 albo koci receptor CTLA-4 lub koci rozpuszczalny receptor CTLA-4, polegający na tym, że obejmuje etapy, w których hoduje się komórkę gospodarza z ekspresją polipeptydu i odzyskuje się tak wyprodukowany polipeptyd.

Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka, charakteryzująca się tym, że zawiera skuteczną ilość polipeptydu kociego ligandu CD86 lub kociego rozpuszczalnego ligandu CD86 albo polipeptydu kociego receptora CTLA-4 lub kociego rozpuszczalnego receptora CTLA-4 oraz odpowiedni nośnik.

Korzystnie jako skuteczną ilość zawiera ilość od około 0,01 mg do około 100 mg na dawkę.

Korzystniej jako skuteczną ilość zawiera ilość od około 0,25 mg/kg masy ciała kota/dzień do około 25 mg/kg masy ciała kota/dzień.

Korzystnie zawiera dodatkowo immunogen pochodzący od patogenu.

Korzystniej patogen jest patogenem kocim wirusa wścieklizny, chlamydii, Toksoplazmy gondii, Dirofilaria imitis, pchły, lub patogenem bakteryjnym.

Jeszcze korzystniej patogenem kocim jest koci wirus niedoboru odpornościowego (FIV), koci wirus białaczki (FeLV), koci wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej (FIP), koci wirus panleukopenii, koci kalcywirus, koci reowirus typu 3, koci rotawirus, koci koronawirus, koci wirus syncytialny, koci wirus mięsaka, koci wirus opryszczki, koci wirus choroby Borna lub pasożyt koci.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie szczepionki określonej powyżej, zawierającej ewentualnie dodatkowo immunogen pochodzący od patogenu, którym korzystnie jest koci wirus wścieklizny, chlamydia, Toksoplazma gondii, Dirofilaria imitis, pchła, lub patogenem bakteryjnym, a zwł aszcza koci wirus niedoboru odpornoś ciowego (FIV), koci wirus biał aczki (FeLV), koci wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej (FIP), koci wirus panleukopenii, koci kalcywirus, koci reowirus typu 3, koci rotawirus, koci koronawirus, koci wirus syncytialny, koci wirus mięsaka, koci wirus opryszczki, koci wirus choroby Borna lub pasożyt koci, do wytwarzania leku do indukowania odporności u kota.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie szczepionki określonej powyżej, do wytwarzania leku do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej u kota.

PL 199 352 B1

Korzystnie lek przeznaczony jest do podawania podskórnie, śródmięśniowo, układowo, miejscowo lub doustnie.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie polipeptydu kociego ligandu CD86 lub kociego rozpuszczalnego ligandu CD86, do wytwarzania leku do tłumienia odpowiedzi immunologicznej u kota.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu kociego receptora CTLA-4 lub kociego rozpuszczalnego receptora CTLA-4, do wytwarzania leku do tłumienia odpowiedzi immunologicznej u kota.

Korzystnie lek przeznaczony jest do podawania w ilości od około 0,25 mg/kg masy ciała/dzień do około 25 mg/kg masy ciała/dzień.

Korzystnie kot cierpi na chorobę autoimmunologiczną lub jest biorcą przeszczepu tkanki lub organu.

Krótki opis figur

Figura 1A: DNA oraz sekwencja aminokwasowa kociego CD86 (B7-2) (SYNTRO). (SEQ ID NO. 5 i 6)

Figura 1B: Wykres hydrofobowości sekwencji aminokwasowej kociego CD86 (B7-2)

Figura 2A: DNA oraz sekwencja aminokwasowa kociego CD28. (SEQ ID NO. 7 i 8)

Figura 2B: Wykres hydrofobowości sekwencji aminokwasowej kociego CD28.

Figura 3A: DNA oraz sekwencja aminokwasowa kociego CTLA-4 (CD152). (SEQ ID NO. 9 i 10)

Figura 3B: Wykres hydrofobowości sekwencji aminokwasowej kociego CTLA-4 (CD152).

Zgodnie z wynalazkiem dostarczono wyizolowany kwas nukleinowy kodujący koci ligand CD86 lub koci rozpuszczalny ligand CD86. Zgodnie z wynalazkiem dostarczono wyizolowany kwas nukleinowy kodujący koci receptor CTLA-4 lub koci rozpuszczalny receptor CTLA-4.

W jednym wykonaniu dostarczono kwas nukleinowy kodujący koci ligand CD86, który posiada sekwencję przedstawioną na Figurze 1A rozpoczynającą się od metioniny a kończąca się glutaminą (SEQ ID NO.: 5). W innym wykonaniu dostarczono kwas nukleinowy kodujący koci receptor CTLA-4, który posiada sekwencję przedstawioną na Figurze 3A rozpoczynającą się od metioniny a kończącą się asparginą (SEQ ID NO.: 9).

W innym wykonaniu kwasem nukleinowym jest DNA lub RNA.

W innym wykonaniu DNA stanowi cDNA lub genomowy DNA.

Zgodnie z wynalazkiem dostarczono oligonukleotyd z co najmniej 12 nukleotydami, który ma sekwencję komplementarną do sekwencji unikalnie występującej w kwasie nukleinowym kodującym CD86, lub CTLA-4, opisanym powyżej. Inne wykonanie wynalazku dostarcza oligonukleotydu, który jest długi na co najmniej 15 lub 16 nukleotydów i ma sekwencję komplementarną do sekwencji występującej unikalnie w kwasie nukleinowym kodującym CD86 lub CTLA-4, opisanym powyżej.

W innym wykonaniu dostarczono oligonukleotydu, który jest znakowany w sposób wykrywalny. W jednym wykonaniu wykrywalny znacznik obejmuje izotop radioaktywny, fluorofor lub biotynę. W innym wykonaniu oligonukleotyd jest selektywnie metylowany.

Zgodnie z wynalazkiem dostarczono wektor zawierający kwas nukleinowy kodujący koci ligand CD86 lub koci rozpuszczalny ligand CD86 oraz wektor plazmidowy oznaczony B7-2#19-2/011298 (numer dostępu ATCC 209821). Plazmid ten został zdeponowany 29 kwietnia 1998 w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va 20108-0971, U.S.A., zgodnie z Traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytów drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego.

Zgodnie z wynalazkiem dostarczono wektor zawierający kwas nukleinowy kodujący koci receptor CTLA-4 lub koci rozpuszczalny receptor CTLA-4 oraz wektor plazmidowy oznaczony CTLA-4#1/091997 (numer dostępu ATCC 209820). Plazmid ten został zdeponowany 29 kwietnia 1998 w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va 20108-0971, U.S.A., zgodnie z Traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytów drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego.

Opisany powyżej wektor może zawierać ponadto promotor przyłączony operacyjnie do kwasu nukleinowego. W innym wykonaniu komórka gospodarza może zawierać dowolny z opisanych powyżej wektorów. Komórką gospodarza może być komórka eukariotyczna lub prokariotyczna, a zwłaszcza E. Coli, drożdże, komórki COS, komórki PC12, komórki CHO lub komórki GH4C1.

Zgodnie z wynalazkiem dostarczono szczepionkę zawierającą immunogen otrzymany z patogenu. Immunogen szczepionki może pochodzić z patogenu kociego, wirusa wścieklizny, chlamydii,

PL 199 352 B1 toksoplazmy Toxoplasmosis gondii, Dirofilaria imitis, pchły, patogenu bakteryjnego. W następnym wykonaniu patogenem kocim może być koci wirus niedoboru odpornościowego (FIV), koci wirus białaczki (FeLV), infekcyjny koci wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej (FIP), koci wirus panleukopenii, kalcywirus, koci reowirus typ 3, koci rotawirus, koci koronawirus, koci wirus syncytialny, koci wirus mięsaka, koci wirus opryszczki, koci wirus choroby Borna lub pasożyt koci.

Zgodnie z wynalazkiem umożliwiono metodę indukowania odporności u kotów, przez co rozumie się podawanie kotom dawki szczepionki zawierającej jakikolwiek z wyżej opisanych immunogenów. Zgodnie z wynalazkiem umożliwiono także metodę wzmacniania odpowiedzi immunologicznej u kotów, przez co rozumie się podawanie kotom skutecznej dawki polipeptydów, immunogenu, i odpowiedniego nośnika. Szczepionka według wynalazku może być podawana podskórnie, śródmięśniowo, układowo, miejscowo lub doustnie.

Zgodnie z wynalazkiem umożliwiono też metodę tłumienia odpowiedzi immunologicznej u kotów, przez podawanie kotom skutecznej do tł umienia odpowiedzi immunologicznej iloś ci polipeptydu kodowanego przez koci kwas nukleinowy CTLA-4. W innym wykonaniu umożliwiono metodę tłumienia odpowiedzi immunologicznej u kotów przez podawanie kotom skutecznej do tłumienia odpowiedzi immunologicznej ilości rozpuszczalnego polipeptydu kodującego koci CD86.

Zgodnie z wynalazkiem umożliwiono także metodę tłumienia odpowiedzi immunologicznej u kotów przez podawanie od około 0,25 mg/kg masy ciała/dzień do około 25 mg/kg masy ciała/dzień polipeptydu kodowanego przez koci kwas nukleinowy CTLA-4. W innym wykonaniu umożliwiono metodę tłumienia odpowiedzi immunologicznej u kotów przez podawanie od około 0,25 mg/kg masy ciała/dzień do około 25 mg/kg masy ciała/dzień polipeptydu kodującego koci CD86.

Zgodnie z wynalazkiem umożliwiono także metodę tłumienia odpowiedzi immunologicznej u kotów cierpiących na choroby autoimmunologiczne lub u biorców tkanek lub organów przeszczepionych przez podanie kotom skutecznej do tłumienia odpowiedzi immunologicznej ilości polipeptydu kodującego koci kwas nukleinowy CTLA-4.

Zgodnie z wynalazkiem umożliwiono również metodę tłumienia odpowiedzi immunologicznej u kotów cierpią cych na choroby autoimmunologiczne lub u biorców tkanek lub organów przeszczepionych przez podanie kotom skutecznej do tłumienia odpowiedzi immunologicznej ilości polipeptydu kodującego koci CD86.

Wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CD80 (B7-1) ma około 941 nukleotydów. Wyizolowany i oczyszczony koci polipeptyd CD80 ma około 292 aminokwasów, przy czym natywna, związana z błoną postać ma masę cząsteczkową około 33 485 kDa, punkt izoelektryczny około 9,1 końcowy ładunek netto w pH 7 wynoszący 10. Koekspresja CD80 z kostymulującą cząsteczką CD28 i antygenem nowotworowym lub antygenem z organizmu patogennego ma zdolność do aktywacji lub poprawienia aktywacji limfocytów T, indukując produkcję cytokin immuno-stymulujących, a także regulację wzrostu innych typów komórek. Koekspresja CD80, z kostymulującą cząsteczką CTLA-4 ma zdolność do regulacji aktywacji limfocytów T.

Wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CD86 (B7-2) według wynalazku ma około 1176 nukleotydów. Wyizolowana i oczyszczona cząsteczka polipeptydu kociego CD86 według wynalazku ma około 320 aminokwasów, przy czym natywna związana z błoną lub dojrzała forma ma masę cząsteczkową około 36,394 kDa i punkt izoelektryczny 9,19 a ładunek netto w pH 7 wynoszący 11,27. Koekspresja CD86 z kostymulującą cząsteczką CD28 i antygenem nowotworowym lub antygenem pochodzącym z organizmu patogennego ma zdolność do aktywacji lub poprawiania aktywacji limfocytów T, indukując produkcję cytokin immuno-stymulujących i regulacji wzrostu innych typów komórek. Koekspresja CD86 z kostymulującą cząsteczką CTLA-4 ma zdolność do regulacji aktywacji limfocytów T.

Koci CD86 według wynalazku uzyskuje się z natywnych lub rekombinacyjnych źródeł. Koci CD86 według wynalazku obejmuje natywną i związaną z błoną formę lub formę wydzielaną bez domeny przezbłonowej.

Wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CD28 ma około 689 nukleotydów. Wyizolowany i oczyszczony polipeptyd kociego CD28 ma okoł o 221 aminokwasów, przy czym natywna forma zwią zana z błoną lub forma dojrzała ma masę cząsteczkową około 25319 kDa, punkt izoelektryczny około 9,17, a ładunek netto w pH 7 wynoszący 9,58.

Wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CTLA-4 według wynalazku ma około 749 nukleotydów. Wyizolowany i oczyszczony polipeptyd kociego CTLA-4 ma około 223 aminokwasów, przy czym natywna, związana z błoną forma lub forma dojrzała, ma masę cząsteczkową około 24381 kDa, punkt izoelektryczny około 6,34, a ładunek netto w pH 7 wynoszący -0,99.

PL 199 352 B1

Zgodnie z wynalazkiem umożliwiono również metodę poprawiającą u kotów odpowiedź immunologiczną wobec immunogenu, przez podanie immunogenu przed, po, lub zasadniczo równolegle z kocim CD86 wraz z lub bez kociego CTLA-4 w ilości skutecznej do poprawy odpowiedzi immunologicznej.

W innym aspekcie umożliwiono metodę poprawiającą odpowiedź immunologiczną u kotów wobec immunogenu, przez podanie immunogenu przed, po lub zasadniczo równolegle z kocim kocim CD86 wraz z lub bez kociego CD28 lub kociego CTLA-4, lub antysensownym RNA lub DNA, kodującym w całości lub w części koci CD86 lub koci CD28 lub koci CTLA-4, w ilości skutecznej do tłumienia odpowiedzi immunologicznej.

W innym aspekcie dostarczono szczepionkę do indukowania odpowiedzi immunologicznej u kotów wobec immunogenu przez podawanie DNA lub RNA immunogenu i DNA lub RNA kociego CD86, cząsteczki pomocniczej kodującej białko lub fragment białka, w ilości skutecznej do modulowania odpowiedzi immunologicznej.

Kocie białko CD86 posiada sekwencję aminokwasową, która jest w 68% i 64% identyczna z ludzkimi i króliczymi białkami, odpowiednio. Kocie białko CTLA-4 posiada sekwencję aminokwasową, która jest w 88% i 78% identyczna z ludzkimi i mysimi białkami, odpowiednio. Ludzkie lub mysie białka CD86 nie mogą funkcjonalnie zastąpić kocich białek CD86. Tak więc koci CD86 i koci CTLA-4 są nowymi reagentami wymaganymi w regulacji odporności u kotów.

Zgodnie z wynalazkiem opisano regulatorowe cząsteczki pomocnicze komórek T, CD86 (B7-2) lub CD28, lub CTLA-4 (CD152) kocich gatunków. Zgodnie z wynalazkiem dostarczono wyizolowany i oczyszczony kwas nukleinowy kodujący, w całości lub części, koci CD86 lub koci CD28, lub koci CTLA-4, jak również polipeptydy CD86, CD28 lub CTLA-4 oczyszczone z natywnych jak i rekombinacyjnych źródeł. Koci CD86, CD28, lub CTLA-4 wyprodukowany zgodnie z wynalazkiem jest stosowany do poprawy skuteczności szczepionek kocich przeciwko nowotworowym, jak i patogennym organizmom a także jako terapia do leczenia chorób wirusowych i bakteryjnych u kotów. Koci CD86 lub CTLA-4 wyprodukowany zgodnie z wynalazkiem może być także stosowany do łagodzenia chorób spowodowanych błędnie ukierunkowaną, nadmierną lub hiperaktywną odpowiedzią immunologiczną.

Kwasy nukleinowe, wektory, transformanty

Sekwencje cDNA kodujące koci CD86 (SEQ ID NO: 5), koci CD28 (SEQ ID NO: 7), koci CTLA-4 (SEQ ID NO: 9), są pokazane na Figurach od 1 do 3, a przewidywane sekwencje aminokwasowe kociego CD86 (SEQ ID NO: 6), kociego CD28 (SEQ ID NO: 8), lub kociego CTLA-4 (SEQ ID NO: 10), są pokazane na Figurach od 1 do 3. Oznaczenie tych kocich polipeptydów jako CD86, CD28 lub CTLA-4 bazuje na częściowej homologii sekwencji aminokwasowej do ludzkiego lub mysiego, lub króliczego homologu tych polipeptydów, i zdolności polipeptydów CD86 do wiązania kociego receptora CD28 (zobacz poniżej) lub CTLA-4, a także do aktywowania lub stymulowania lub innej regulacji aktywacji limfocytów T. Ponadto nie chcąc się ograniczać do teorii przewidziano polipeptydy kociego CD86, które także wykazują jedną lub więcej z następujących bioaktywności: aktywacja komórek NK (naturalnych komórek zabójczych), stymulacja dojrzewania komórek B, aktywacja ograniczonych MHC cytotoksycznych limfocytów T, proliferacja komórek tucznych, interakcja z receptorami cytokin i indukcja cytokin immunoregulacyjnych.

Z powodu degeneracji kodu genetycznego (tj. wiele kodonów koduje pewne aminokwasy), sekwencja DNA inna niż przedstawiona na Figurze od 1 do 3 może także kodować kocie sekwencje aminokwasowe CD86, CD28 lub CTLA-4 pokazane na Figurach od 1 do 3. Takie inne DNA obejmują „sekwencyjnie-konserwatywne odmiany, w których zmiana jednego lub więcej nukleotydów w danych kodonach nie powoduje zmian w kodowanych aminokwasach w tym miejscu. Co więcej dane grupy boczne aminokwasów białek mogą być często zmienione bez zmiany całej konformacji i funkcji natywnego polipeptydu. Takie „funkcjonalnie-konserwatywne odmiany obejmują, ale bez ograniczenia, zastąpienia aminokwasów na mające podobne właściwości fizyko-chemiczne, takie jak np. kwasowe, zasadowe, hydrofobowe, hydrofilowe, aromatyczne, i tym podobne (np. zamiana lizyny na argininę, asparginianu na glutaminę, glicyny na alaninę). Dodatkowo dodawane są sekwencje aminokwasowe lub usuwane bez niszczenia bioaktywności cząsteczki. Na przykład dodatkowe sekwencje aminokwasowe są dodawane do końca C lub N tak, aby służyły jako znaczniki do oczyszczania takie jak znaczniki histydynowe (tj. aby zezwoliły na jednoetapowe oczyszczanie białka, po którym są one chemicznie lub enzymatycznie usuwane). Alternatywnie, dodatkowe sekwencje stwarzają dodatkowe miejsca

PL 199 352 B1 wiązania na powierzchni komórki lub w inny sposób zmieniają specyficzność komórek docelowych kocich CD86, CD28 lub CTLA-4, takich jak dodatkowe miejsca wiążące antygen dla przeciwciał.

cDNA kociego CD86 lub kociego CD28 lub kociego CTLA-4 są przedstawione na Figurze od 1 do 3, oraz odmiany DNA sekwencyjnie-konserwatywne, sekwencje DNA kodujące odmiany polipeptydów funkcjonalnie-konserwatywne i ich kombinacje. Fragmenty kociego CD86, CD28 lub CTLA-4 mogą wykazywać przydatny stopień bioaktywności, zarówno same jak i w połączeniu z innymi sekwencjami lub składnikami. Jak wyjaśniono poniżej specjaliści w dziedzinie mogą z przewidywalnym skutkiem manipulować sekwencją CD86, CD28 lub CTLA-4 i ustalić czy dana odmiana kociego CD86, CD28 lub CTLA-4 posiada odpowiednią stabilność i bioaktywność dla danego zastosowania, lub odmiany, która wpływa na aktywność wiążącą tych cząsteczek prowadzącą do wzrostu wydajności. Koci CD86 będzie wiązać koreceptor CD28 lub koreceptor CTLA-4. Może to być osiągnięte przez ekspresję i oczyszczanie odmiany polipeptydu CD86, CD28 lub CTLA-4 w układach rekombinacyjnych i testowanie ich aktywności stymulacyjnej komórek T i/lub aktywności zwiększającej wzrost w komórkach hodowli i u zwierząt, a następnie testowanie ich zastosowań. Odmiana CD86 jest testowana na bioaktywność przez wiązanie funkcjonalne receptorów C28 lub CTLA-4.

Zgodnie z wynalazkiem opisano DNA kociego CD86, CD28 lub CTLA-4 (oraz polipeptydy) otrzymane z innych gatunków kocich, obejmujących bez ograniczeń koty domowe, lwy, tygrysy, gepardy, dzikiego kota północno-amerykańskiego (ang. bobcat) i tym podobne. Kocie homologii CD86, CD28 lub CTLA-4 o sekwencjach pokazanych na Figurach od 1 do 3 mogą być z łatwością zidentyfikowane przez skrining cDNA lub bilbliotek genomowych w celu zidentyfikowania klonów, które hybrydyzują się z próbkami zawierającymi całą lub część sekwencji z Figur od 1 do 3. Ewentualnie ekspresyjne biblioteki są poddane skriningowi przy użyciu przeciwciał, które rozpoznają koci CD86, CD28 lub CTLA-4. Nie chcąc się ograniczać do teorii przewiduje się, że geny CD80 lub CD86 innych gatunków kocich będą posiadać co najmniej 70% homologię z kocimi genami CD86, CD28 lub CTLA-4. DNA kodujące homologii CD86 lub CTLA-4 mogą być zdefiniowane jako DNA kodujące polipeptydy, które w co najmniej 25% s ą identyczne z kocim CD86 lub CTLA-4.

Generalnie manipulacje na kwasie nukleinowym zgodnie z wynalazkiem wykorzystują metody dobrze znane w danej dziedzinie, takie jak zawarte np. w Molecular Cloning, A Laboratory Manual (drugie wydanie, Sambrook, Fritsch i Maniatis, Cold Spring Harbor), lub Current Protocols in Molecular Biology (Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith i Stuhl, Greene Publ. Assoc., WileyInterscience, NY, NY, 1992).

Zgodnie z wynalazkiem opisano sekwencje cDNA i RNA, sensowne i antysensowne. Opisano także kocie sekwencje genomowe CD86, CD28 lub CTLA-4 oraz sekwencje flankujące, zawierające, ale bez ograniczenia sekwencje regulatorowe. Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące koci(e) polipeptyd(y) CD86, CD28 lub CTLA-4 są także związane z sekwencjami heterologicznymi, zawierającymi promotory, sekwencje wzmacniające (enhancery), elementy odpowiedzi, sekwencje sygnałowe, sekwencje poliadenylowe, introny, niekodujące regiony 5' i 3' i tym podobne. Transkrypcyjne składniki regulujące, które są operacyjnie połączone, bez ograniczeń, z sekwencjami cDNA kociego CD86, lub CTLA-4 mają zdolność do bezpośredniej ekspresji genów pochodzących z komórek prokariotycznych, eukariotycznych, wirusów komórek prokariotycznych, wirusów komórek eukariotycznych oraz ich kombinacji. Inne przydatne heterologiczne sekwencje regulatorowe są dobrze znane specjalistom w dziedzinie.

Kwasy nukleinowe według wynalazku są zmodyfikowane przy użyciu metod dobrze znanych specjalistom w dziedzinie tak, aby zmienić ich stabilność, rozpuszczalność, powinowactwo wiązania, i specyficzność. Przykł adowo sekwencje są selektywnie metylowane. Sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku mogą być także modyfikowane przy użyciu wykrywalnych znaczników, albo bezpośrednio albo pośrednio. Przykładowe znaczniki to izotopami radioaktywne, cząsteczki fluoroscencyjne, biotyna i tym podobne.

Zgodnie z wynalazkiem opisano wektory, które zawierają kwasy nukleinowe kodujące polipeptyd(y) CD86, CD28 lub CTLA-4, w części lub w całości. Wektory takie obejmują, przykładowo wektory plazmidowe do ekspresji u różnych gospodarzy eukariotycznych, jak i prokariotycznych. Najlepiej jeśli wektory zawierają także promotor operacyjnie połączony z częścią polipeptydów kodujących CD86, CD28 lub CTLA-4. Kodowane polipeptyd(y) CD86, CD28 lub CTLA-4 jest (są) ekspresjonowane przy użyciu odpowiednich wektorów i komórek gospodarza jak wyjaśniono tutaj lub innych metod znanych specjalistom w dziedzinie.

PL 199 352 B1

Odpowiednie wektory do zastosowania w realizacji praktycznej wynalazku obejmują, bez ograniczenia, YEp352, pcDNAI (Invitrogen, Carlsbad), pRc/ CMV (Invitrogen), i pSFV1 (GIBCO/ BRL, Gaithersburg, MD). Zalecanym wektorem do użycia w wynalazku jest pSFV1. Odpowiednią komórką gospodarza jest E. coli, komórki drożdży, komórki COS, komórki PC12, komórki CHO, komórki GH4C1, komórki BHK-21 oraz melanoforowe komórki płazów. Komórki BHK-21 są zalecaną linią komórek gospodarza do zastosowania w realizacji praktycznej wynalazku. Odpowiednie wektory do konstrukcji nagiego DNA lub szczepionek genetycznych obejmują, bez ograniczenia, pTarget (Promega, Madison, Wi), Psi (Promega, Madison, WI) i pcDNA (Invitrogen, Carlsbad, Ca).

Kwasy nukleinowe kodujące koci polipetyd CD86, CD28 lub CTLA-4 są także wprowadzone do komórek przy użyciu procesów rekombinacyjnych. Przykładowo sekwencje takie są mikrowstrzykiwane do komórek, co skutkuje rekombinacją homologiczną w miejscu endogennego genu kodującego polipeptyd, analogu, lub pseudogenu, lub sekwencji ze znaczącym podobieństwem do genu kodującego koci polipeptyd CD86, CD28 lub CTLA-4. Inne metody bazujące na rekombinacji, takie jak niehomologiczne rekombinacje są także używane, zwłaszcza w przypadku komórek pluripotencjalnych.

Zgodnie z wynalazkiem umożliwiono metodę zwiększania odpowiedzi immunologicznej u kotów wobec immunogenu, przez podawanie immunogenu wcześniej, po lub równocześnie z kocim CD86 wraz lub bez kociego CD28 lub kociego CTLA-4, w ilości wystarczającej do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej.

Zgodnie z wynalazkiem umożliwiono metodę zwiększania odpowiedzi immunologicznej u kotów wobec immunogenu, przez podawanie wektora ekspresyjnego, który zawiera immunogen pochodzący z kociego patogenu i czą steczek pomocniczych kociego CD86 wraz lub bez kociego CD28 lub kociego CTLA-4, w ilości wystarczającej do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej.

Zgodnie z wynalazkiem umożliwiono metodę zmieniania kierunku odpowiedzi immunologicznej u kotów wobec immunogenu, przez podawanie wektora ekspresyjnego, który zawiera immunogen pochodzący z kociego patogenu i komórek pomocniczych kociego CD86 wraz lub bez kociego CD28 lub kociego CTLA-4, w ilości wystarczającej do zmiany kierunku odpowiedzi immunologicznej.

Zgodnie z wynalazkiem umożliwiono metodę tłumienia odpowiedzi immunologicznej u kotów wobec immunogenu, przez podawanie immunogenu wcześniej, po lub równocześnie z kocim CD86 wraz lub bez kociego CD28 lub kociego CTLA-4 lub antysensownego RNA lub DNA kodującego koci CD86 lub koci CD28 lub koci CTLA-4, w ilości wystarczającej do tłumienia odpowiedzi immunologicznej.

Szczepionka według wynalazku do indukowania odpowiedzi immunologicznej u kotów wobec immunogenu(ów), zawiera immunogen i skuteczną ilość kociego CD86 wraz z lub bez kociego CD28 lub kociego CTLA-4, w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej, lub kociego CD86 wraz z kocim CTLA-4 w celu tłumienia odpowiedzi immunologicznej. W innym wykonaniu wynalazku szczepionka według wynalazku zawiera wektor ekspresyjny zawierający geny immunogenu(ów) dla kocich patogenów i geny CD86, wraz lub bez kociego CD28 lub kocim CTLA-4 w celu zwiększenia lub tłumienia odpowiedzi immunologicznej.

Kocie polipeptydy CD86, CD28 lub CTLA-4.

Koci gen CD86 (cDNA oraz aminokwasowa sekwencja pokazana na Figurze 1) koduje polipeptyd o około 320 aminokwasach. Koci gen CD28 (cDNA oraz aminokwasowa sekwencja pokazana na Figurze 2) koduje polipeptyd o około 221 aminokwasach. Koci gen CTLA-4 (cDNA oraz aminokwasowa sekwencja pokazana na Figurze 3) koduje polipeptyd o około 223 aminokwasach.

Oczyszczenie kociego CD86, CD28 lub CTLA-4 z naturalnych lub rekombinacyjnych źródeł uzyskuje się przy użyciu metod dobrze znanym specjalistom w dziedzinie, obejmujących, ale bez ograniczenia, chromatografię jonowowymienną, chromatografię z odwróconą fazą na kolumnach C4, filtrację żelową, ogniskowanie izoelektryczne, chromatografię powinowactwa i tym podobne. Duże ilości bioaktywnych CD86, CD28 lub CTLA-4 można uzyskać przez konstruowanie sekwencji rekombinacyjnej DNA zawierającej region kodujący koci CD86, CD28 lub CTLA-4 poddany fuzji w ramce odczytu z sekwencją kodują 6 C-końcowych reszt histydyny w replikonie pSFV1 (GIBCO/ BRL). mRNA kodowany przez ten plazmid jest syntetyzowany przy użyciu technik dobrze znanych specjalistom w dziedzinie i wprowadzany do komórek BHK-21 przy użyciu elektroporacji. Komórki syntetyzują i wydzielają dojrza łe kocie glikopolipeptydy CD86, CD28 lub CTLA-4 zawierające 6 C- końcowych histydyn. Zmodyfikowane kocie polipeptydy CD86, CD28 lub CTLA-4 są oczyszczane z supernatantu komórkowego przy użyciu chromatografii powinowactwa z użyciem żywicy wiążącej histydynę (Hisbind, Novagen, Madison, WI).

PL 199 352 B1

Kocie polipeptydy CD86 izolowane z jakichkolwiek źródeł są modyfikowane przy użyciu metod dobrze znanych w dziedzinie. Przykładowo koci CD86, CD28 lub CTLA-4 są fosforylowane lub defosforylowane, glikozylowane lub deglikozylowane i tym podobne. Szczególnie przydatne są modyfikacje, które zmieniają rozpuszczalność, stabilność, i specyficzność oraz powinowactwo wiązania kocich CD86, CD28 lub CTLA-4.

Cząsteczki chimeryczne kociego CD86, CD-28, CTLA-4.

Zgodnie z wynalazkiem można wytwarzać chimeryczne cząsteczki zbudowane z fragmentów kocich CD28, CTLA-4, CD86 w różnych kombinacjach. Przykładowo można wprowadzić miejsce wiążące CTLA-4 w miejsce miejsca wiążącego CD-28 w celu zwiększenia powinowactwa wiązania CD28 przy utrzymaniu nasilenia odpowiedzi immunologicznej.

W innym wykonaniu miejsca wiążące dla CD86 na CTLA-4 i CD28 moż na zmieniać tak, że wiążące regiony na CD28 są wymienione przez wiążące regiony CTLA-4. Skutkiem powstania chimerycznej cząsteczki CD28 wraz z wiążącym regionem CTLA-4 jest wzrost powinowactwa CD28 do CD86 i wzrost rozmiaru nasilenia odpowiedzi immunologicznej. W innym wykonaniu chimeryczne cząsteczki CD28 lub CD86 i CD28, lub ich fragmenty są związane z błoną i poprawiają zdolności do zwiększania odporności dla tych cząsteczek. W innym wykonaniu chimeryczne cząsteczki CTLA-4 lub CD86 i CTLA-4 lub ich fragmenty są związane z błoną i poprawiają zdolności tłumienia odporności dla tych cząsteczek. W innym wykonaniu chimeryczne cząsteczki CTLA-4 lub CD86 i CTLA-4 lub ich fragmenty są związane z błoną i zmieniają kierunek odpowiedzi immunologicznej tak, aby otrzymać pożądany skutek.

Przeciwciała przeciwko kociemu CD86, CD28 lub CTLA-4

Zgodnie z wynalazkiem opisano przeciwciała, które są specyficzne dla kocich polipeptydów CD86, CD28 lub CTLA-4 identyfikowanych tak jak opisano powyżej. Przeciwciała są monoklonalne lub poliklonalane, i rozróżniają kocie CD86, CD28 lub CTLA-4 z różnych gatunków, rozpoznają funkcjonalne domeny, i tym podobne. Takie przeciwciała uzyskuje się przy użyciu konwencjonalnych metod i kompozycji opisanych w Harlow i Lane, Przeciwciał a, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, jak również technologii immunologicznych, jak i technologii hybrydowych dobrze znanych specjalistom w dziedzinie. Tam gdzie używa się naturalnych lub sztucznych pochodnych kocich peptydów CD86, CD28 lub CTLA-4 w celu indukowania odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla kocich CD86, CD28 lub CTLA-4, białka są dogodnie sprzęgane z odpowiednimi nośnikami, takimi jak KLH i podawane w odpowiednim adiuwancie, takim jak adiuwant Freunda.

Najlepiej jeśli wyselekcjonowane białka są sprzęgane z jądrem nośnika lizynowego zgodnie z metodami Tan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5409-5413. Otrzymane przeciwciała, zwłaszcza wewnętrznie znakowane przeciwciała anty-idiotypowe, są także przygotowywane przy użyciu dobrze znanych metod.

W jednym wykonaniu oczyszczone kocie CD86, CD28 lub CTLA-4 są używane do immunizowania myszy, po czym usuwa się im śledzionę, a limfocyty śledziony używa się do stworzenia hybryd komórek z komórkami szpiczaka w celu uzyskania klonów komórek wydzielających przeciwciała zgodnie ze standardowymi technikami w dziedzinie. Uzyskane przeciwciała monoklonalne wydzielane przez takie komórki są poddawane skriningowi przy użyciu testów in vitro pod kątem poszczególnych aktywności: wiązania kociego CD86, CD28 lub CTLA-4, inhibitowania aktywności wiązania receptora CD86, CD28, CTLA-4, oraz inhibitowania aktywności stymulacyjnej komórek T wobec CD86, CD28 lub CTLA-4.

Przeciwciała przeciwko kociemu CD86, kociemu CD28 lub kociemu CTLA-4 są używane do identyfikacji i zliczania kociego CD86, CD28 lub CTLA-4 przy użyciu takich immunotestów jak: ELISA, RIA i tym podobne. Przeciwciała przeciwko kociemu CD86, kociemu CD28 lub kociemu CTLA-4 mogą być także używane do usuwania kocich CD86, CD28 lub CTLA-4 z wyciągów. Dodatkowo przeciwciała mogą być użyte do identyfikacji, izolacji i oczyszczania kociego CD86, CD28 lub CTLA-4 z różnych źródeł, a także w celu przeprowadzenia badań nad lokalizacją wenątrzkomórkową i histochemiczną.

Zastosowania

Koci ligand CD86 (B7-2), lub koci receptor CTLA-4 (CD152) wytworzone zgodnie z wynalazkiem, lub koci receptor CD28, mogą być dogodnie wykorzystywane jako szczepionki w celu profilaktyki chorób zakaźnych lub w celu wsparcia wzrostu homologicznych lub heterologicznych gatunków kocich. Przykładowo może następować koekspresja CD86 z kostymulującymi cząsteczkami CD28 lub CTLA-4, w jakichkolwiek kombinacjach, oraz z antygenem nowotworowym lub antygenem z organizmów patogennych. Koekspresja kociego CD86 z kocim receptorem CTLA-4

PL 199 352 B1 ma zdolność do inhibitowania aktywacji limfocytów T i tłumienia odpowiedzi immunologicznej. Specyficznym przykładem byłaby koekspresja CD86, z immunogenami pochodzącymi z FIV, FeLV, lub FIP w wektorach wirusowych lub w wektorach z ekspresją DNA, które w czasie podawania jako szczepionka aktywowałyby, zwiększały lub regulowały proliferację limfocytów T CD4+ i CD8+ oraz indukowałaby cytokiny immuno-regulacyjne, takie jak IL-2, IFN-γ, IL-12, TNF-α, IL-6 i tym podobne. Innym specyficznym przykładem byłaby ekspresja CD86, CD28 lub CTLA-4 w wektorach wirusowych lub wektorach z ekspresją DNA, która po podawaniu jako terapia regulowałaby lub zmieniała kierunek odpowiedzi immunologicznej.

Wzrost odporności przez interakcje kociego CD86 z CD28 lub CTLA-4 lub inhibicja odpowiedzi immunologicznej przez interakcje kociego CD86 z CTLA-4 wykorzystuje raczej naturalny proces regulacji, niż korzysta z obcych dodawanych substancji, które mogłyby powodować różne szkodliwe skutki zdrowotne w czasie całego okresu życia lub jego części. Cząsteczki CD86 lub CTLA-4 mogą być podawane z innymi cząsteczkami rekombinacyjnymi, takimi które kodują antygeny, które są pożądane ze względu na indukowanie odporności. Koci gen CD86, i/lub CTLA-4 jest insertowany do wektora ekspresyjnego i infekowany lub transfekowany do komórki docelowej i następnie ekspresjonuje produkt genowy w komórce docelowej tak, aby przyczepił się do błony komórkowej komórki docelowej lub komórki prezentującej antygen albo został wydzielony na zewnątrz komórki docelowej lub komórki prezentującej antygen. Wektor ekspresyjny, taki jak plazmid, wirus gorączki Semliki Forest, wirus ospy lub wirusy opryszczki przenosi gen do komórki prezentującej antygen. Koci gen CD86 i/lub CTLA-4 lub ich jest insertowany do wektora ekspresyjnego DNA lub RNA i wstrzykiwany kotu, i ekspresjonuje produkt genowy u kota jako „nagi DNA/RNA lub jako szczepionka genetyczna. Koekspresja immunogenu i CD86, CD28 i/lub CTLA-4 w komórce docelowej lub u kota przyczynia się do aktywacji, wzrostu aktywacji lub regulacji limfocytów T, limfocytów B i innych komórek. Ewentualnie zekspresjonowane białko może być podawane po ekspresji w plazmidzie. Kocie białko CD86, CD28 lub CTLA-4, normalnie funkcjonuje jako cząsteczka pomocnicza związana z błoną komórkową, ale może być także obecne w innych formach, szczególnie bez przymocowania do błony komórkowej.

W innym wykonaniu koci CD86 jest rozpuszczalny, bez omen przezbłonowych lub regionów hydrofobowych, i współdziała z kostymulującymi cząsteczkami CD28 lub CTLA-4 w formie połączonej z błoną lub rozpuszczalnej. W alternatywnym wykonaniu, kocie CD86 są związane z błoną a cząsteczki kostymulujące CD28 i CTLA-4 są w formie rozpuszczalnej i nie posiadają domen przezbłonowych lub regionów hydrofobowych. Rozpuszczalne CD28 lub CTLA-4, dogodnie w formie dimeru, są przydatne w leczeniu chorób związanych z immunosupresją zależną od komórek T u kotów. Rozpuszczalne CD28 lub CTLA-4 zapobiegają odrzuceniu przeszczepianych tkanek i mogą zostać użyte do leczenia choroby autoimmunologicznej. Specyficznie rozpuszczalne CD28 lub CTLA-4 są przydatne w zapobieganiu reakcji przeszczepu przeciwko gospodarzowi. Rozpuszczalne CD28 lub CTLA-4 zapobiegają wiązaniu komórek zawierających kocie CD86 związane z błoną.

Sekwencyjnie-konserwatywne i funkcjonalnie-konserwatywne odmiany DNA i polipeptydów kociego CD86, CD28 lub CTLA-4 lub bioaktywne fragmenty kociego CD86, CD28 lub CTLA-4 są poddawane fuzji w ramce z inną sekwencją, taką jak sekwencja cytokiny, interleukiny, interferonu, czynnika stymulującego kolonie, antygenu drobnoustroju patogennego, przeciwciała lub sekwencji do oczyszczania, takiej jak znacznik his lub genu receptorowego, takiego jak lacZ E. coli, uidA. E. coli, lub zielone białko fluoroscencyjne.

Szczepionki

Zgodnie z wynalazkiem opisano metody i kompozycje stosowane do zwiększania skuteczności odpowiedzi immunologicznej u różnych gatunków kotów. W jednym wykonaniu kocie CD86, CD28 lub CTLA-4 są używane w połączeniu z immunogenami, wobec których pożądane jest wzbudzenie odpowiedzi immunologicznej. Przykładowo w szczepionkach kocich zawierających immunogeny takich patogenów jak koci wirus niedoboru odpornościowego i koci wirus białaczki, oraz inne patogeny takie jak koci parwowirus, koci leptowirus, koci koronawirus, jest pożądane aby zwierały one koci CD86, lub CTLA-4 po to, aby regulowały rozmiar i jakość odpowiedzi immunologicznej. Z tego powodu oczyszczony koci CD86 oraz CTLA-4 oczyszczony z natywnych lub rekombinacyjnych źródeł, jak opisano powyżej, jest zawarty w kompozycji szczepionki w stężeniu wahającym się od 0,01 do 100,0 mg na szczepionkę na kota.

PL 199 352 B1

Komercyjne źródła szczepionek kocich są dobrze znane specjalistom w dziedzinie (Kompendium weterynaryjnych środków farmaceutycznych) i mogą być wykorzystywane w połączeniu z rozwiązaniami tu opisanymi w celu zwiększenia skuteczności szczepionki.

Szczepionka indukująca i regulująca odpowiedź immunologiczną u kota na immunogen składa się z immunogenu oraz skutecznej ilości kociego CD86 wraz lub bez kociego CD28 lub kociego CTLA-4 w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej, lub kociego CD86 wraz z kocim CTLA-4 w celu tłumienia odpowiedzi immunologicznej.

Immunogen uzyskuje się z grupy obejmującej, ale bez ograniczenia, kocie patogeny, takie jak koci wirus niedoboru odpornościowego, koci wirus białaczki, koci wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej, koci wirus panleukopeni (parvo), koci kalcywirus, koci reowirus typu 3, koci rotavirus, koci koronawirus, wirus wścieklizny, koci wirus syncytialny, koci wirus mięsaka, wirusy opryszczki (wirus zapalenia błony śluzowej nosa i tchawicy), koci wirus choroby Borna, chlamydia, toksoplazmoza, kocie pasożyty, Dirofilaria imitis, pchły, patogeny bakteryjne i tym podobne.

Regulacja wzrostu lub regulacja aktywacji komórek typów takich jak limfocyty T, wskazuje, że odpowiedź regulatorowa albo stymuluje, albo tłumi wzrost komórek. Regulacja odpowiedzi immunologicznej u kotów wskazuje, że odpowiedź immunologiczna jest albo stymulowana, albo tłumiona w celu leczenia choroby lub czynnika zakaźnego u kotów.

Ekspresja kocich CD86, CD28 lub CTLA-4, w wektorach ekspresyjnych zawierających gen(y) kocich immunogenów ma na celu podawanie jako szczepionkę genetyczną lub szczepionkę z nagim DNA. Wektorami mogą być, ale bez ograniczenia: pTarget (Promega, Madison, WI), pcDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA). (Donnelly JJ, i inni, 1997; Hassett i Whitton, 1996).

Geny lub fragmenty genów CD86, CD28 oraz CTLA-4, mogą być insertowane lub transfekowane do chromosomów kocich lub innych ssaków. Taka integracja tych genów lub ich fragmentów może być uzyskana dzięki wektorom retrowirusowym i może być użyta jako forma terapii genowej.

Zgodnie z wynalazkiem opisano metody i kompozycje zwiększające odporność na choroby gatunków kocich w celach medycznych i/lub komercyjnych. W wykonaniu tym koci CD86, CD28 lub CTLA-4, w części lub w całości, wraz z lub bez genów kodujących kocie immunogenny, jest podawany kotom przy użyciu odpowiednich dróg podawania. W celu wsparcia wzrostu lub odporności na chorobę, koci CD86, CD28 lub CTLA-4, lub w połączeniu jest podawany w kompozycji o stężeniu w zakresie od 0,01 do 100,0 mg na szczepionkę na kota, najlepiej w kompozycji o stężeniu w zakresie od około 0,25 mg/kg/dzień do około 25 mg/kg/dzień. Powyższe dawki CD86 lub CTLA-4 mogą być określone przez rutynowe eksperymenty dobrze znane w dziedzinie, takie jakie jak ustalanie wzorców dawek oraz częstości a także porównywanie grupy eksperymentalnych jednostek lub pacjentów do każdego punktu wzorca.

Zgodnie z wynalazkiem, natywne lub zrekombinowane kocie CD86 lub CTLA-4 są preparowane wraz z fizjologicznie akceptowanym nośnikiem, takim jak przykładowo sól fizjologiczna buforowana fosforanem lub zdejonizowana woda. Kompozycja może również zawierać zaróbki, obejmujące smar(y), uplastyczniacze, środki zwiększające absorpcję, środki bakteriobójcze i tym podobne dobrze znane w dziedzinie. Kocie polipeptydy CD86, CD28 lub CTLA-4 tu opisane można podawać przy użyciu jakichkolwiek skutecznych dróg, do których należą, ale bez ograniczenia: podawanie dożylne, podskórne, domięśniowe, miedzymięśniowe, miejscowe lub doustne. Przy podawaniu podskórnym, postać dawkowania obejmuje CD86 lub CTLA-4 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Do podawania doustnego lub wziewnego koci CD86 lub CTLA-4, wraz lub bez zaróbek, może być mikro- lub makro- kapsułkowany przykładowo w liposomach i mikrosferach. Przezskórne plastry (lub innego typu formy powolnego uwalniania dawek) mogą być także używane.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1A

Klonowanie cDNA kociego CD86 (B7-2), CD28, i CTLA-4 cDNA kociego CD86 (B7-2), CD28 i CTLA-4 zklonowano przy użyciu RT-PCR (reakcja łańcuchowa odwrotnej transkryptazy/polimerazy) amplifikującej region pomiędzy dwoma sekwencjami, które były wystarczająco konserwatywne aby wytworzyć startery degenerowane, które odziaływują z kocim cDNA. Źródłem mRNA są komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) stymulowane przez co najmniej 16 godzin Con A. Ten produkt PCR został zsekwencjonowany. Sekwencje zostały użyte do wytworzenia starterów dla RACE (szybkie amplifikowanie końców cDNA) PCR. Koniec 5' został amplifikowany najpierw poprzez tworzenie cDNA z leżącym poniżej starterem (ang. downstream) komplementarnym do nowo zsekwencjonowanego regionu konserwatywnego. Oligonukleotyd został zligowany do 3' końca cDNA (komplementarny

PL 199 352 B1 do 5' końca mRNA). Sekwencja ta służyła jako region wiążący dla wyżej leżącego startera (ang. upstream), który był PCR kompatybilny z niżej leżącym starterem do PCR, który odpowiadał innym regionom nowo powstałego regionu. Zdegenerowany starter został użyty w wieloetapowej reakcji zagnieżdżonej (ang. nested PCR) w celu uzyskania końca 3'. Wyżej leżący starter do PCR został tak zaprojektowany, aby reagować z sekwencją w nowo sekwencjonowanym regionie. Produkty były zsekwencjonowane bezpośrednio lub wklonowane do wektora do klonowania TA i sekwencjonowane z plazmidu. Cała otwarta ramka odczytu (ORF) została zklonowana w całości przy użyciu techniki PCR z użyciem starterów zbudowanych ze znanych sekwencji. ORF zostały zklonowane i zsekwencjonowane trzy razy. (zobacz powyżej dla kompletnej listy starterów dla kociego cDNA CD28).

Starterami DNA użytymi do RT/PCR kociego cDNA CD28 były:

5' starter: 5'-CGC GGA TCC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG-3'; (SEQ ID NO. 13)

3' starter: 5'-CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G-3'; (SEQ ID NO. 14) (zobacz powyżej dla kompletnej listy starterów dla kociego cDNA CD28).

Starterami DNA użytymi do RT/PCR kociego cDNA CTLA-4 były:

1. Startery zdegenerowane dla pierwszego produktu PCR (672 pz):

Deg 5'p: 5'-ATGGCTT(C)GCCTTGGATTT(C)CAGC(A)GG-3'; (SEQ ID NO. 15)

Deg 3'p: 5'-TCAATTG(A)ATG(A)GGAATAAAATAAGGCTG-3'; (SEQ ID NO. 16)

2. 5' koniec CTLA-4 (455 PZ): startery zdegenerowane, genowo-specyficzne (GSP) oraz zagnieżdżone genowo-specyficzne (NGSP):

Pierwszy etap PCR:

Deg 5'p: 5'-TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3'; (SEQ ID NO. 17)

3' GSP 5'-GCATAGTAGGGTGGTGGGTACATG-3'; (SEQ ID NO. 18)

Zagnieżdżony PCR z produktem PCR z pierwszego etapu:

Deg 5'p: 5'-TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3'; (SEQ ID NO. 19)

3' NGSP: 5'-ACATGAGCTCCACCTTGCAG-3' (SEQ ID NO. 20)

3. 3' koniec CTLA-4: starter adaptorowy 1 (AP1, Clonetech Lab, Inc., Palo Alto, CA); zagnieżdżony starter adaptorowy (AP2, Clonetech Lab), starter genowo-specyficzny (GSP), zagnieżdżony starter genowo-specyficzny (NGSP):

3' RACE PCR:

AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 21)

5' GSP: 5'-GTGAATATGGGTCTTCAGGCAATG-3'; (SEQ ID NO. 22)

3' zagnieżdżony RACE PCR z produktem z 3' RACE PCR:

AP2: .5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID NO. 23)

5' NGSP: 5'-GAAATCCGAGTGACTGTGCTGAG-3'; (SEQ ID NO. 24)

4. Startery dla całego genu CTLA-4

Fel CTLA-4 5' starter: 5'-AACCTGAACACTGCTCCCATAAAG-3'; (SEQ ID NO. 25)

Fel CTLA-4 3' Starter: 5'-GCCTCAGCTCTTAGAAATTGGACAG-3'; (SEQ ID NO. 26)

Starterami DNA użytymi do RT/PCR cDNA kociego CD86 (B7-2) były:

1. Startery zdegenerowane dla pierwszego produktu PCR (423 pz):

Deg 5'p: 5'-TAGTATTTTGGCAGGACCAGG-3'; (SEQ ID NO. 27)

Deg 3'p: 5'-CTGTGACATTATCTTGAGATTTC-3'; (SEQ ID NO. 28)

2. Startery zdegenerowane dla drugiego produktu PCR (574 pz):

Deg 5'p: 5'-GA(G)CA(T)GCACT(A)ATGGGACTGAG-3'; (SEQ ID NO. 29)

Deg 3'p: 5'-CTGTGACATTATCTTGAGATTTC-3'; (SEQ ID NO. 30)

3. 5' koniec CD86: startery AP1, AP2 (Clontech Lab), zdegenerowane 3'-genowo-specyficzne (GSP) oraz 3'-zagnieżdżone genowo-specyficzne (NGSP):

5' RACE PCR:

AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 31)

3' GSP: 5'-TGGGTAACCTTGTATAGATGAGCAGGTC-3'; (SEQ ID NO. 32)

5' zagnieżdżony RACE PCR z produktem 5' RACE PCR:

AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID NO. 33)

3' NGSP: 5'-CAGGTTGACTGAAGTTAGCAAGCAC-3'; (SEQ ID NO. 34)

4. 3' koniec B7-2: startery AP1, AP2, 5'GSP oraz 5'NGSP 5' RACE PCR:

AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 35)

5' GSP: 5'-GGACAAGGGCACATATCACTGTTTC-3'; (SEQ ID NO. 36)

PL 199 352 B1

3' zagnieżdżony RACE PCR z produktem 3' RACE PCR:

AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID NO. 37)

5' NGSP: 5'-CAGTGCTTGCTAACTTCAGTCAACC-3'; (SEQ ID NO. 38)

Cały gen CD86

Fel b72 (1)5' Starter: 5'-CGGGAATGTCACTGAGCTTATAG-3'; (SEQ ID NO. 39)

Fel B72 (1176) 3' Starter: 5'-GATCTTTTTCAGGTTAGCAGGGG-3'; (SEQ ID NO. 40)

P r z y k ł a d 1B:

Sub-klonowanie CD-28 w wirusowym wektorze homologicznym ospy:

W celu ułatwienia klonowania CD-28, w pozycji za jakimkolwiek promotorem ospy do konstrukcji wektora homologicznego specyficznego dla ospy, amplifikowano za pomocą reakcji PCR, wykorzystującej syntetyczne startery obejmujące dogodne miejsca klonowania, region kodujący dla kociego CD28. Syntetyczne startery zostały przygotowane tak, aby umożliwić wprowadzenie miejsca klonowania Eco RI i Bgl II na 5' oraz 3' końcu fragmentu PCR, odpowiednio. Zastosowane startery to: sensowny starter, 7/97.1 (5'-GATGAATTCCATGATCCTCAGGCTGGGCTTCT-3'); (SEQ ID NO. 54) oraz antysensowny starter 7/97.2 (5'-GATCAGATCTCAGGAACGGTATGCCGCAA-3'); (SEQ ID NO. 55). Otrzymany w ten sposób fragment PCR trawiono za pomocą Eco RI i Bgl II i klonowano do wektora homologicznego O1L SPV w celu uzyskania rekombinowanego wirusa SPV. Dało to w wyniku kasetę 930-26.A1, wektor homologiczny SPV O1L (miejsce insercji AccI we fragmencie genomowym wirusa ospy świni Hind III M), zawierający kocią CD80 ORF, w położeniu za wczesnym / późnym syntetycznym promotorem ospy, LP2EP2, i sąsiadujący z, pochodzącą z E. coli, kasetą genu markerowego lacZ, podlegającą syntetycznemu późnemu promotorowi ospy, LP2. W celu otrzymania rekombinowanego wirusa SPV, ekspresjonującego kocie białko CD-28 oraz β-galaktozydazę dokonano kotransfekcji, za pomocą SPV 001, plazmidowego wektora homologicznego, 930-26.A1.

P r z y k ł a d 2

Charakterystyka cDNA i polipeptydów kociego CD86 (B7-2), CD28 oraz CTLA-4

Wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CD86 (B7-2), o długości średnio 1176 nukleotydów kodował otwartą ramkę odczytu dla polipeptydu kociego CD86 o średniej długości 320 aminokwasów. Natywna, związana z błoną lub dojrzała forma tego polipeptydu posiadała masę cząsteczkową około 36,394 kDa, punkt izoelektryczny około 9,19 i ładunek netto w pH 7,0 równy 11.27.

Wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CD28 o długości średnio 689 nukleotydów kodował otwartą ramkę odczytu dla polipeptydu kociego CD28, liczącego średnio 221 aminokwasy. Natywna, związana z błoną lub dojrzała forma tego polipeptydu posiadała masę cząsteczkową około 25,319 kDa, punkt izoelektryczny około 9,17 i ładunek netto w pH 7,0 równy 9,58.

Wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CTLA-4 o długości średnio 749 nukleotydów kodował otwartą ramkę odczytu polipeptydu kociego CTLA-4 o średniej długości 223 aminokwasów. Natywna, związana z błoną lub dojrzała forma tego polipeptydu posiadała masę cząsteczkową około 24,381 kDa, punkt izoelektryczny około 6,34 i ładunek netto w pH 7,0 równy -0,99.

Koekspresja CD86, wraz z kostymulującymi cząsteczkami CD28 lub CTLA-4, i antygenem nowotworowym lub antygenem pochodzącym z organizmu patogennego, daje możliwość aktywacji lub wzmocnienia aktywacji limfocytów T, bardziej specyficznie limfocytów Th-1 oraz promuje wzrost innych typów komórek. Koekspresja CD86, wraz z kostymulującą cząsteczką CTLA-4 daje natomiast możliwość znoszenia efektów aktywacji limfocytów T, bardziej specyficznie limfocytów Th-1.

procentowa identyczność sekwencji DNA i aminokwasowej	ludzki homolog (sekwencja DNA) % identyczności	ludzki homolog (sekwencja aminokw.) % identyczności	mysi homolog(sekwencja DNA) % identyczności	mysi homolog (sekwencja aminokw.) % identyczości	króliczy homolog (sekwencja DNA/aminokw.) % identyczności	kurzy homolog (sekwencja DNA/aminokw.) % identyczności
Koci CD80	77	59	62	46	-	-
Koci CD86	72	68	-	-	67/64	-
Koci CD28	85	82	77	74	84/84	59/50
Koci CTLA-4	88	88	79	78	-	-

PL 199 352 B1

P r z y k ł a d 3

Zastosowanie kociego CD86 (B7-2), CD28 oraz CTLA-4 w szczepionkach

W celu określenia aktywności immuno-wzmacniającej kociego CD80, CD86, CD28 oraz CTLA-4 w szczepionkach wykonano następujące eksperymenty.

W alternatywnej metodzie, 8-tygodniowe koty szczepiono domięśniowo 100 μg plazmidu zawierającego cDNA kocich cząsteczek CD86, CD28 oraz CTLA-4, w mieszaninie z plazmidem zawierającym cDNA kodujący env i gag FIV lub env i gag FeLV, lub też zamiennie, domięśniowe zaszczepienie 100 μg plazmidu zawierającego cDNA ekspresjonującego określone pary kombinacji CD86 i CD28 lub CD86 i CTLA-4, w parze z CD28 lub CTLA-4, w mieszaninie z plazmidem zawierającym cDNA, kodujący env i gag FIV lub env i gag FeLV. Koty służące za kontrole nie otrzymały CD80, CD86, CD28 oraz CTLA-4. Na badanych kotach przeprowadzano test prowokacji, stosując wirulentne FeLV lub FIV, a następnie prowadzono obserwację, opisanych powyżej, objawów chorobowych. Wyniki testu prowokacji wskazują, że koty, które otrzymały wektor cDNA, zawierający koci CD80, CD86, CD28 i CTLA-4 oraz wektor cDNA, zawierający geny FIV lub geny FeLV charakteryzują się 100% ochroną przed rozwojem choroby, w porównaniu z kotami, które otrzymały tylko wektor cDNA, zawierający geny FIV lub geny FeLV, i które wykazywały 75% zabezpieczenie przed rozwojem choroby.

W zamiennej metodzie, 8-tygodniowe koty domięśniowo zaszczepiano 0,1 do 100 mg oczyszczonego białka kocich cząsteczek CD86, CD28 oraz CTLA-4, lub alternatywnie, określonymi parami kombinacji CD80 i CD86 w połączeniu z białkami CD28 lub CTLA-4, z rekombinowanych wektorów cDNA, opisanych powyżej, i zaszczepiano domięśniowo 0,1 do 100 mg szczepionki podjednostkowej, zawierającej env i gag FIV lub env i gag FeLV. Kontrolne koty nie otrzymały CD80, CD86, CD28 oraz CTLA-4. Koty poddano testowi prowokacji za pomocą wirulentnego szczepu FIV lub szczepu FeLV, a następnie prowadzono obserwację rozwoju choroby. Wyniki testu prowokacji wskazują, że koty, które otrzymały oczyszczone białko kociego CD86, CD28 oraz CTLA-4 wraz z szczepionką podjednostkową zawierającą FIV lub FeLV wykazywały znaczną redukcję liczby przypadków wystąpienia choroby, w porównaniu do kotów, które otrzymały jedynie szczepionkę podjednostkową zawierającą białka FIV lub FeLV.

P r z y k ł a d 4

Zastosowanie kociego CD86, CD28 oraz CTLA-4 do inhibicji i zaburzenia wzrostu komórek nowotworowych

Komórki nowotworowe, pochodzące z kota, poddano transfekcji za pomocą wektora, ekspresjonującego koci CD80 lub CD86 w połączeniu z CD28 lub CTLA-4. Transfekowane komórki nowotworowe podano ponownie kotom, a obecność CD86, CD28 oraz CTLA-4 na powierzchni komórek nowotworowych wywoływała silną odpowiedź immunologiczną względem transfekowanych i nietransfekowanych komórek nowotworowych, powodując w efekcie uśmiercenie tych komórek nowotworowych, zarówno pochodzących z ogniska pierwotnego, jak i z przerzutów. Alternatywnym sposobem jest wstrzyknięcie bezpośrednio do komórek nowotworowych kota wektora ekspresjonującego koci CD86, w połączeniu z CD28 lub CTLA-4, co powoduje silną odpowiedź immunologiczną względem komórek nowotworowych, co powoduje w efekcie uśmiercenie tych komórek, zarówno pochodzących z ogniska pierwotnego, jak i z przerzutów.

CD86 (B7-2) wykazuje pewne podobieństwa z CD80, posiadając strukturalnie podobny, zewnątrzkomórkowy region V IgSF oraz region C (Freeman i wsp., 1993). Jednakże, całkowita homologia pomiędzy cząsteczkami jest mniejsza niż 25% z resztami konserwatywnymi rozproszonymi po przeciwnych stronach obu zewnątrzkomórkowych domen (Bajorath i wsp., 1994). Podczas gdy dla żadnej cząsteczki nie zdefiniowano regionu wiążącego, na podstawie homologii sekwencji zaproponowano określone obszary jako potencjalne miejsca oddziaływania (Lindley i wsp., 1994a). Pomimo braku charakteru konserwatywnego, CD80 oraz CD86 posiadają podobną właściwość wiązania dla obu receptorów, mimo że CD86 odłącza się szybciej od CTLA-4 (Linsley i wsp., 1995a).

Wydaje się, że CD86 wykazuje podobny przebieg ekspresji jak CD80, ulegając ekspresji na aktywowanych komórkach B, komórkach T, makrofagach i monocytach (Azuma i wsp., 1993a). Cząsteczki te różni jednak nieznacznie kinetyka ekspresji (Hathcock i wsp., 1994). CD86 ogólnie, pojawia się wcześniej niż CD80, podczas aktywnej odpowiedzi immunologicznej i jest konstytutywnie ekspresjonowany na monocytach (Freeman i wsp., 1991). Podczas gdy CD80 mogą pojawiać się tak późno,

PL 199 352 B1 jak 24 godziny po inicjującej stymulacji, CD86 występuje we wczesnym etapie odpowiedzi lub ulega konstytutywnie ekspresji w niskich stężeniach, w komórkach mieloidalnych (Hathcock i wsp., 1994). Dwa białka powierzchniowe wywołują podobne wewnątrzkomórkowe odpowiedzi, poprzez wiązanie z odpowiednimi dla nich receptorami na komórkach T CD4⁺ lub CD8⁺ (Lanier i wsp., 1995). Nie wydaje się istnieć jakakolwiek różnica pomiędzy tymi cząsteczkami w zdolności inicjowania aktywacji i proliferacji komórek T lub indukowania aktywności CTL (Hathcock i wsp., 1994). Zatem, dane sugerują, że obie cząsteczki inicjują podobną kaskadę sygnałową aż do wiązania, odpowiednio, z CD28 lub CTLA-4 (Hathcock i wsp., 1994). Ponieważ obie cząsteczki mają również właściwość wiązania receptora z taką samą kinetyką i nie wywołują odrębnych efektów, nie jest jasne ewolucyjne znaczenie istnienia systemu „dwa ligandy/dwa receptory (Lanier i wsp., 1995).

CD80 opisano początkowo jako marker komórek B. Stwierdzono występowanie wysokiego poziomu zarówno CD80, jak i CD86 na komórkach B stymulowanych za pomocą lipopolisacharydu (LPS), anty-Ig, anty-CD40, konkanwaliny A (Con A), cAMP, IL-2 oraz IL-4 (Hathcock i wsp.,

1994). Wykazano działanie pobudzające IFN-γ oraz IL-5 względem CD86 w mysich komórkach B, jednak nie znane są podobne dane dotyczące organizmu ludzkiego lub CD80 w odniesieniu do tych immunoregulatorów (Azuma i wsp., 1993a). Istnieje nieznaczna różnica w kinetyce ekspresji komórek B dla każdej z omawianych cząsteczek. CD86 ulega ekspresji we wczesnym etapie po stymulacji (6 godzin), podczas gdy CD80 nie jest obecne przez niemal 24 godziny, a jego ekspresja osiąga szczyt po 48 godzinach (Lenschow i wsp., 1993). Pobudzanie CD80 na komórkach B jest również regulowane poprzez sygnalizację zależną od cząsteczek MHC klasy II (Nabavi i wsp.,

1992) . Dwa inne receptory powierzchniowe mają również znaczenie w powierzchniowej ekspresji CD80. Sieciowanie CD40, ekspresjonowanego na komórkach B przez Ig lub komórki T, ekspresjonujące odpowiedni receptor, daje w wyniku wzrost ekspresji CD80 (Azuma i wsp., 1993b), podczas gdy sieciowanie receptora Fc inhibuje ekspresję obu cząsteczek (Barcy i wsp., 1995).

Sugerowano, że CD40 i jego ligand CD40L uczestniczą w ścieżce, poprzez którą regulowana jest ekspresja CD80 na APC (Page i wsp., 1994). CD40 ekspresjonowany na różnych typach komórek, włączając komórki B, monocyty, komórki dendrytyczne, fibroblasty i ludzkie komórki śródbłonka, i może być pobudzany na tych komórkach w obecności IFN-γ (de Boer i wsp., 1993). Ligand CD40 (CD40L) ekspresjonowany jest na komórkach T CD4⁺. Stwierdzono, że wiązanie CD40 przez CD40L powoduje pobudzenie ekspresji CD80 na APC, chociaż nie wywołuje ekspresji w innych typach komórek, ekspresjonujących receptor, włączając komórki śródbłonkowe (Page i wsp., 1994).

Cząsteczki CD80 i CD86, mimo identyczności sekwencji aminokwasowej mniejszej niż 25%, posiadają strukturalne podobieństwa i uznaje się je za daleko spokrewnione (Freeman i wsp.,

1993) . Reszty homologiczne występują licznie w Ig-podobnej domenie, wraz z kilkoma konserwatywnymi resztami w domenach przezbłonowej lub cytoplazmatycznej (June i wsp., 1995). Sugerowano, że rodzina obejmująca geny B7, obok CD80 oraz CD86, zawiera butyrofilinę (BT), glikoproteinę mielino/oligodendrocytową (MOG), analog MHC, pochodzący z kurczaka, B-G (Lindley i wsp., 1994b). BT, MOG oraz B-G kodowane są wszystkie przez kompleks genów MHC, stanowiący potencjalny ewolucyjny łącznik pomiędzy MHC a cząsteczkami kostymulującymi (Lindley i wsp., 1994b).

Spoczynkowe mysie i ludzkie komórki T ekspresjonują niskie poziomy CD86, podczas gdy ludzkie i mysie komórki T (oraz klony komórek T) aktywowane przez anty-CD3, ekspresjonują CD80 i CD86 na wysokim poziomie (Hathcock i wsp., 1994). Ekspresja, zarówno CD80, jak i CD28 na aktywowanych komórkach T może odzwierciedlać zdolność komórek T do namnażania drogą autokrynnej kostymulacji (Azuma i wsp., 1993b). Interesujące jest odkrycie, że CD80 ulegają pobudzeniu na zainfekowanych wirusem HIV komórkach T CD4⁺, z towarzyszącą temu inhibicją CD28. Możliwy jest mechanizm wirusowego przekazu, w przypadku gdy niezainfekowane komórki T CD4⁺ inicjują zależny od CD28/CD80 kontakt z zainfekowanymi limfocytami (Haffar i wsp., 1993).

Ludzkie monocyty krwi obwodowej ekspresjonują niski poziom CD80 i wysoki poziom CD86, podczas gdy pod wpływem GM-CSF lub IFN-γ następuje pobudzenie powierzchniowej ekspresji zarówno CD80, jak i CD86 (Barcy i wsp., 1995). LPS jest silnym induktorem ekspresji CD80 na ludzkich monocytach krwi obwodowej (Schmittel i wsp., 1994). Nie istnieją doniesienia na temat makrofagów otrzewnowych w organizmie ludzkim, natomiast wiadomo, że mysie spoczynkowe makrofagi ekspresjonują niski poziom CD80 i CD86 (Freeman i wsp., 1991; Hathcock i wsp., 1994). Pobudzanie za

PL 199 352 B1 pomocą LPS oraz IFN-γ mysich makrofagów zwiększa ekspresję powierzchniową, mimo że połączenie IFNy z interleukiną 10 inhibuje oba receptory (Ding i wsp., 1993).

Komórki dendrytyczne śledziony ekspresjonują niski poziom obu cząsteczek, przy czym komórki Langerhansa ekspresjonują niski poziom CD86, ale podczas hodowli występuje tendencja do wzrostu ekspresji w obu typach komórek (Larsen i wsp., 1994). W komórkach dendrytycznych, CD86 jest silniej pobudzany po hodowli, pojawia się wcześniej i może pełnić bardziej istotną rolę w procesie sygnalizacji, w którym uczestniczą komórki dendrytyczne (Hathcock i wsp., 1994). Interesujące jest spostrzeżenie, że mimo że IL-10 nie oddziałuje na ekspresję CD80 w komórkach dendrytycznych, działa jako inhibitor ekspresji CD86 (Buelens i wsp., 1995). O'Doherty et al. (1993) odkryli, że, podczas gdy początkowy poziom CD80 był niski, po procesie dojrzewania, komórki dendrytyczne wykazywały wyższy poziom CD80. Ekspresja CD80 przez komórki Langerhansa inhibowana jest zarówno poprzez IL-10, jak i IFNy, przy czym wpływ GM-CSF może niwelować inhibicję wywołaną przez IFN-γ, jednak nie powoduje zniesienia inhibicji IL-10 (Ozawa i wsp., 1996).

Wykazano, że u ludzi i myszy specyficzne cytokiny kontrolują ekspresję CD80 oraz CD86. IL-4 jest silnym induktorem CD86 i, w mniejszym zakresie, CD80, na komórkach B (Stack i wsp., 1994), natomiast IFN-γ zwiększa ekspresje CD86 na różnych typach komórek, włączając monocyty i makrofagi komórek B (Hathcock i wsp., 1994). Mimo że IFNy pobudza ekspresję CD80 w monocytach, może on działać jako inhibitor ekspresji w makrofagach. IL-10, nawet w obecności IFN-γ, powoduje inhibicję ekspresji CD80 i CD86 na monocytach (Ding i wsp., 1993). Takie oddziaływanie może służyć jako potencjalny mechanizm skierowania odpowiedzi z Th1 (DTH) do odpowiedzi Th2 (humoralnej). Jednakże, IL-10 nie ma wpływu na ekspresję CD80 w komórkach dendrytycznych (Buelens i wsp., 1995). Może to odzwierciedlać rolę tych cząsteczek w procesie regulacji komórek pomocniczych T, ponieważ komórki dendrytyczne uważa się za ważne w inicjacji odpowiedzi 2 typu. IL-7 zwiększa ekspresję CD80 na komórkach T, mimo że tego typu działanie nie jest określone dla innych typów komórek (Yssel i wsp., 1993). Wiadomo natomiast, że ekspresja CD80 przez komórki B jest uzależniona od sieciowania receptora TNF p75 i ekspresja ta może ulec zwiększeniu w obecności IL-4 (Ranheim i Kipps,

1995). Interesujący jest fakt, że TNF należy do tej samej rodziny cząsteczek, co CD40, inny silny inicjator ekspresji CD80. GM-CFS pobudza ekspresję powierzchniową CD80 przez komórki dendrytyczne i komórki Langerhan'a, podczas, gdy IFNy powoduje jedynie pobudzenie CD86 w tych komórkach (Larsen i wsp., 1994).

Rozpoznanie, wiązanie i liza transformowanych i zainfekowanych wirusem komórek docelowych przez cytotoksyczne limfocyty T CD8⁺ (CTL) długo uważane było jedynie za proces pośredniczący w rozpoznaniu przez TCR obcych peptydów, ekspresjonowanych w kontekście cząsteczek MHC klasy I (Berke, 1993). Ostatnio stwierdzono, że różne cząsteczki powierzchniowe, ekspresjonowane zarówno przez CTL, jak i docelowe komórki, są konieczne do przebiegu całkowitego procesu oddziaływania (Mescher, 1992). Kluczowym czynnikiem w tych oddziaływaniach jest obecność CD80 oraz jego receptora CD28. Do procesu różnicowania do stanu litycznego wymagany jest również przez małe spoczynkowe limfocyty CD8⁺ dodatkowy sygnał, dostarczany w wyniku oddziaływania B7-CD28, (Mescher, 1992). Interesujące jest jednak to, że raz ulegające różnicowaniu CTL nie wymagają dłużej wtórnego sygnału do ekspresji litycznych właściwości (Hodge i wsp., 1994).

CTL znany był od dawna jako pośrednik w procesie wirusowej odporności. U ludzi zakażonych wirusem niedoboru odporności (HIV) długotrwały brak rozwoju choroby związany jest z wysokim poziomem komórek pamięci CTL CD8⁺, specyficznych dla Gag, Pol oraz Env i bardzo niską liczbą kopii wirusowego DNA HIV, jak również RNA w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (Rinaldo, 1995). Odwrotnie, u osobników w późnym stadium infekcji, poziom komórek pamięci CTL (mCTL) jest znacznie obniżony (Zanussi i wsp., 1996). Korelacja tych stwierdzeń stanowi poparcie dla idei, że mCTL mogą być kluczowym czynnikiem kontrolnym gospodarza dotyczącym zakażenia i może odgrywać kluczową rolę w powstawaniu ochronnej odporności u naiwnych niezakażonych osobników. Ponadto, patologiczne powiązania z infekcją wirusa HIV odzwierciedlają potencjalną rolę CD80 i CD28 w rozwoju choroby.

Wysunięto przypuszczenie, że CD80 odgrywa rolę w przebiegu patogenezy infekcji wirusem HIV (Haffar i wsp., 1993). Komórki T normalnie ekspresjonują CD80, ale tylko na niskim poziomie i jedynie w następstwie aktywacji (Schwartz, 1992). Badania in vitro infekcji HIV w allo-stymulowanych pierwotnych liniach komórek T, wykazały, że CD28 był inhibowany, natomiast ekspresja CD80 wzmacniana wraz z MHC CII (Haffar i wsp., 1993). Mimo że nie podano wytłumaczenia tych zjawisk, można wysnuć hipotezę dwóch potencjalnie szkodliwych funkcji. Obecność

PL 199 352 B1

CD80 na powierzchni, w połączeniu z cząsteczkami klasy II może powodować w rezultacie zwiększenie kontaktu pomiędzy zainfekowanymi komórkami T a niezainfekowanymi komórkami CD4⁺ (Haffar i wsp., 1993). Podczas gdy takie oddziaływanie może wywołać wzrost szybkości przekazu pomiędzy komórkami T, inną rolą może być wzmacnianie zależnego od CTL procesu rozpoznawania i uśmiercania, poprzez dostarczenie wtórnego sygnału, w wyniku oddziaływania CD80 na zainfekowanych komórkach z CD28, ekspresjonowanymi przez komórki CD8⁺ T (Haffar i wsp., 1993). Może to przyspieszyć zanik populacji CD4⁺, związany z początkiem choroby związanej z AIDS (Haffar i wsp., 1993).

W obu organizmach, myszy i człowieka, ekspresja rodziny białek B7 wydaje się być ważnym czynnikiem w rozpoznaniu transformowanych komórek przez układ immunologiczny (Chen i wsp., 1993). Mimo że ekspresję obserwowano w niektórych transformowanych komórkach, większość komórek nowotworowych normalnie nie ekspresjonuje CD80 lub CD86, zatem wydaje się mało prawdopodobne, że podczas ekspresji potencjalnie immunogennego, nowotworowego antygenu zajdzie pełne rozpoznanie go przez komórki T (Chen i wsp., 1993). Jednakże, eksperymenty, związane z transfekcją i użyciem cząsteczki CD80, mające na celu zwiększenie cytolizy nowotworowej, zakończyły się sukcesem (Hodge i wsp., 1994).

Wektory retrowirusowe oraz wektory oparte na wirusie krowianki, ekspresjonujące funkcjonalną cząsteczkę CD80 zostały zastosowane do transfekcji komórek złośliwych (Li i wsp., 1994; Hodge i wsp., 1994). Komórki te, ekspresjonujące CD80 w połączeniu z normalnie s łabo rozpoznawanymi antygenami nowotworowymi, wprowadzono następnie powtórnie do organizmu gospodarza, gdzie miała miejsce komórkowa odpowiedź immunologiczna względem antygenów nowotworowych, ekspresjonowanych przez złośliwe komórki (Townsend i Allison, 1993). Wyniki uzyskane na podstawie tych eksperymentów okazały się zaskakująco interesujące. W wielu przypadkach, w organizmie gospodarza możliwe było wywołanie silnej odpowiedzi komórkowej, skierowanej przeciwko złośliwym komórkom możliwa była ich kontrola i ich eliminacja (Hodge i wsp., 1994). Kolejne ponowne wprowadzenia do organizmu gospodarza komórek nowotworowych, posiadających lub nie, powierzchniową cząsteczkę CD80 powodowały w rezultacie wywołanie na podobnym poziomie oporności anty-nowotworowej (Hodge i wsp., 1994). Wynika z tego zatem, że raz zakodowany w pamięci proces nie wymaga później obecności cząsteczki CD80 do podtrzymania odpowiedzi lub do jej inicjowania, w przypadku ponownego wprowadzenia (Hodge i wsp., 1994).

Eksperymenty te wykazały, że cząsteczka CD80 jest skutecznym pośrednikiem w mechanizmie oporności komórkowej, i że, w przypadku określonych nowotworów, możliwe jest indukowanie odpowiedzi komórkowej, umożliwiającej kontrolę złośliwych komórek i zapobieganie ich nawrotu (Hodge i wsp., 1994).

Wzrost ekspresji CD80 może wywołać szkodliwy skutek, jak w przypadku niektórych form autoimmunologicznych. Uważa się, że synergistyczne działanie CD80 i IL-12 posiada znaczenie we wczesnym rozwoju stwardnienia rozsianego (MS) oraz powoduje pobudzenie komórek T i rozwój DTH (Windhagen i wsp., 1995). Doświadczalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) może być częściowo inhibowane w wyniku podawania rozpuszczalnego CTLA-4Ig. Inhibicja demielinacji poprzez blokowanie oddziaływania CD28/CD80, odzwierciedla potencjalną rolę tego oddziaływania w procesie zaostrzenia przebiegu choroby (Arima i wsp., 1996).

Znaczenie cząsteczki CD80 w przebiegu efektywnej odpowiedzi immunologicznej jest jasne. Wyizolowano cDNA kodujące to białko jedynie u gryzoni i naczelnych. Kot jest ważnym zwierzęciem-towarzyszem oraz potencjalnym modelem przebiegu chorób retrowirusowych. Klonowanie immunologicznych czynników z gatunków kotowatych dostarcza narzędzia do badań weterynaryjnych nad tymi chorobami, mających potencjalny związek z ich przebiegiem lub zapobieganiem im u innych gatunków.

P r z y k ł a d 5

Klonowanie i sekwencjonowanie kociego CD28 cDNA

CD28 jest powierzchniową glikoproteiną, ekspresjonowaną normalnie w postaci homodimeru, złożonego z identycznych, połączonych wiązaniem siarczkowym, 44 kDa podjednostek. Jest członkiem supergenowej rodziny immunoglobulin i charakteryzuje się pojedynczym, zewnątrzkomórkowym regionem V, domeną przezbłonową oraz krótkim, wewnątrzkomórkowym fragmentem końcowym (ogonem). (Aruffo i Seed, 1987). Mimo że cząsteczka ta ulega glikozylacji, fragmenty te nie wydają się odgrywać znaczącej roli w wiązaniu i przypuszcza się, że zwiększają one rozpuszczalność domeny zewnątrzkomórkowej (Peach i wsp., 1994). Klonowano, a następnie sekwencjonowano cDNA kodująPL 199 352 B1 cy ludzki, szczurzy, mysi oraz króliczy peptyd, a także analogiczną cząsteczkę, występującą u drobiu (Linsley i wsp., 1995a).

CD28 występuje na większości tymocytów CD4⁺ i CD8⁺ oraz obwodowych komórkach T CD4⁺ i CD8+, przy czym zwiększona ekspresja wywoływana jest przez stymulację avu-XA3, PHA i PMA a jej zmniejszenie wywoływane jest pod wpływem konkurencyjnego wiązania CD28 (Linsley i wsp., 1995b). Wykazano, wkrótce po odkryciu tej cząsteczki, że CD28 pełni istotną rolę w regulacji aktywacji komórek T CD4⁺ i CD8⁺ (June i wsp., 1990). Ponadto, oprócz wzmocniania aktywacji komórek T, wykazano następnie, że dostarczenie tego wtórnego sygnału również powoduje indukcję cytolitycznej aktywności w CTL (Azuma i wsp., 1993c).

CD28 ekspresjonowana jest wcześnie podczas dojrzewania komórek T. Podczas gdy niedojrzałe komórki CD3^- są zazwyczaj CD28^-, pośrednie komórki CD4⁺ CD8⁺, ekspresjonują niskie poziomy białka CD4⁺ i CD8⁺, a tymocyty CD4⁺ CD8⁺ lub CD3⁺ ekspresjonują CD28 na wysokim poziomie (Turka i wsp., 1991). Po etapie dojrzewania receptor występuje na niemal wszystkich CD4⁺ i na ponad połowie wszystkich komórek T CD8⁺ u ludzi (Turka i wsp., 1991) i prawie na 100% mysich komórek T (June i wsp., 1990). Cząsteczka nie jest ekspresjonowana na stałym poziomie na powierzchni komórki (Turka i wsp., 1990). W następstwie aktywacji komórek T obserwowany jest wzrost ekspresji powierzchniowej, podczas gdy wiązanie przez cząsteczkę jej liganda lub specyficzne mAb powoduje w aktywowanych komórkach zahamowanie ekspresji genu, zarówno na poziomie mRNA, jak i na poziomie białka (Linsley i wsp., 1993a). Pomimo powszechnego występowania na limfocytach pochodzących od komórek T, cząsteczka CD28 została znaleziona w próbie plazmocytomach pochodzących z biopsji szpiku kostnego (Kozber i wsp., 1987) oraz była ekspresjonowana przez hodowle białaczkowej linii komórkowej komórek naturalnych zabójców (Azuma i wsp., 1992).

CD28 charakteryzuje pewna strukturalna homologia z innym receptorem B7 CTLA-4 i tworzą one podrodzinę w obrębie grupy IgSF (Linsley i wsp., 1995a). Te dwie cząsteczki posiadają zewnątrzkomórkowy region IgV, pojedynczą, domenę przechodzącą przez błonę oraz krótką, cytoplazmatyczną domenę sygnalizującą (Aruffo i wsp., 1987). Pomimo tych podobieństw, całkowita homologia pomiędzy tymi cząsteczkami wynosi tylko około 31%, w obrębie cząsteczek istnieją krótkie regiony i specyficzne reszty charakteryzujące się zachowaniem całkowitej konserwatywności, co odzwierciedla potencjalnie istotną rolę tych obszarów w rozpoznawaniu B7 i utrzymaniu strukturalnej integralności (Leung i Linsley, 1994). Motyw MYPPPY, region zawierający sześć reszt, występuje we wszystkich izolatach, pochodzących z rodziny CD28/CTLA-4 (Peach i wsp.,

1994). Pozwala to na zmapowanie zapętlonego regionu CD3-podobnego w tych cząsteczkach a w przypadku wprowadzenia w tym obszarze zmian mutacyjnych, skutkują one zredukowaniem właściwości wiązania w obu cząsteczkach, CD28 oraz CTLA-4 (Peach i wsp., 1994). Region ten jest potencjalnym miejscem wiązania ligandu na białkach CD28 i CTLA-4, lecz nie zostało określone czy jest on miejscem wiążącym dla B7 lub też, czy zapewnia strukturalne motywy wymagane pośrednio do takiego wiązania (Peach i wsp., 1994). Pomimo istnienia konserwatywnych reszt pomiędzy sekwencjami CD28 i CTLA-4, CTLA-4 wiąże silniej niż CD28 zarówno CD80, jak i CD86 (Ellis i wsp., 1996). Zatem, podczas gdy CTLA-4 ekspresjonowany jest na poziomie 2-3% ekspresji CD28 na aktywowanych komórkach T, jego wiązanie jest 20 razy silniejsze in vitro (Lindley i wsp., 1995b).

Mimo istnienia ewolucyjnego pokrewieństwa pomiędzy cząsteczkami CTLA-4 oraz CD28, ich ligandy, funkcjonowanie i ich zdolności sygnalizacyjne nie wydają się być związane (Balazano i wsp., 1992). Porównanie regionów sygnalizacyjnych tych cząsteczek nie wskazuje na wysokie podobieństwo i sugeruje, że każda z tych cząsteczek inicjuje inną ścieżkę sygnalizacyjną (Hutchcroft i Bierer,

1996).

Podczas gdy CD28 ekspresjonowany jest w spoczynkowych komórkach T i jest aktywowany natychmiast w odpowiedzi na aktywację, ekspresja CTLA-4 osiąga maksimum po 48 godzinach po aktywacji i powraca do poziomu wyjściowego po 96 godzinach po aktywacji (Linsley i wsp., 1992a). Ekspresja CTLA-4 wydaje się być związana z inhibicją. CD28 (Lindsten i wsp., 1993). Ponadto, ścieżka sygnalizacyjna, pośrednicząca w wiązaniu ligandu z cząsteczką CD28 ma istotne znaczenie w pobudzaniu ekspresji CTLA-4 (Linsley i wsp., 1993a). Komórki T, będące CD28^- nie ekspresjonują na znacznym poziomie CTLA-4 w odpowiedzi na pobudzenie za pomocą PMA lub jonoforu wapnia (Lindsten i wsp., 1993).

Całkowity przebieg ścieżki sygnalizacyjnej, w której uczestniczy CD28, nie jest w pełni określony, mimo że zaproponowano kaskadowy model dla tego zjawiska (Hutchcroft i Bierer, 1996). Przyjęto,

PL 199 352 B1 że sygnalizacja CD28 związana jest z wykorzystaniem wewnątrzkomórkowego Ca⁺, metabolizmem fosfoinozytolu oraz indukcją fosforylacji białkowej tyrozyny (Hutchcroft i Bierer, 1996).

Określono cytoplazmatyczny fragment końcowy cząsteczki CD28, prawdopodobnie uczestniczący w wewnątrzkomórkowej sygnalizacji po sieciowaniu CD80 lub CD86 (June i wsp., 1994). Wewnątrz-cytoplazmatyczny region długości 41 aminokwasów nie posiada określonej aktywności enzymatycznej i nie zawiera wewnątrzkomórkowych motywów związanych z aktywacją tyrozynową (tak jak TCR), ani też reszt cysternowych do wiązania cytoplazmatycznych kinaz tyrozynowych rodziny Src kinaz tyrozynowych (June i wsp., 1994). Jednakże, w obrębie izolowanych sekwencji zachowanych jest kilka potencjalnych miejsc fosforylacji (Hutchcroft i Bierer, 1996). Wewnątrzkomórkowa aktywność enzymatyczna oraz oddziaływania typu białko-białko regulowane są często poprzez różnorodne fosforylacje białka, jednak enzymy odpowiedzialne za taką aktywność, związaną z CD28 nie zostały wyjaśnione (Lu i wsp., 1992). Miejsce konsensusowe, YMXM, zlokalizowane jest w końcowym obszarze cytoplazmatycznym uważane jest miejsce wiązania kinazy 3 fosfoinozytolu zależnego od homologu domeny 3 wiązania fosfotyrozyny (kinaza PI3) (domena SH2), (Prasad i wsp., 1995). Mimo że jest to jedna, potencjalna sygnalizacyjna ścieżka CD28, wykazano że aktywność kinazy PI3 nie jest związana z aktywnością IL-2, a wzrost produkcji IL-2 jest początkową konsekwencją sygnalizacji CD28. Uważa się, że inne ścieżki uczestniczą w procesie aktywacji, wynikającym z wewnątrzkomórkowego znakowania (June i wsp., 1994).

Podczas gdy rola tych procesów nie jest całkowicie zrozumiana, kostymulacja CD28 prowadzi do wzrostu produkcji cytokin przez komórki T. W komórkach T CD28⁺, aktywowanych anty-CD3 lub PHA, anty-CD28 wpływa na wzrost trwałego poziomu RNA serii cytokin, włączając w to IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, czynnik martwicy nowotworu (TNF-α), limfotoksynę, IFN-γ oraz czynnik stymulujący kolonie granulocytowo-monocytowe (GM-CSF), jak również receptor IL-2 (Lenschow i wsp., 1996). Wzrost trwałego poziomu mRNA jest wynikiem zarówno stabilizacji transkryptów, jak i wzrostu samej transkrypcji (Hutchcroft i Bierer, 1996).

Mimo, że kostymulacja CD28 została po raz pierwszy udokumentowana dla klonów komórek T CD4⁺ (Martin i wsp., 1986), obecnie znana jest rola CD28 w aktywacji wielu typów komórek. Wykazano że, kostymulacja tej ścieżki wpływa na regulację produkcji IFN-γ, cytokin typu Th1 oraz produkcji IL-4, cytokiny typu Th2, w populacjach niepobudzonych komórek T CD4⁺ (Seder i wsp., 1994). Kostymulacyjna ścieżka CD28 jest równnież istotna w aktywacji CTL CD8⁺, mimo że jej obecność nie wydaje się być konieczna w fazie efektorowej uśmiercania zależnego od CTL (Hodge i wsp., 1994). Interesujący jest także fakt, że CD28 może odgrywać rolę w infekcjach HIV. W limfocytach pochodzących z niektórych zainfekowanych wirusem organizmów, wiązanie CD28 z przeciwciałem monoklonalnym wywoływało wzrost produkcji HIV (Asjo i wsp., 1993).

U naczelnych i gryzoni, wtórny sygnał, dostarczany poprzez wiązanie CD80 z CD28 potwierdził znaczenie tej cząsteczki w początkowej aktywacji komórek T (Aruffo i Seed, 1987). Obecne dane wskazują jednak, że głównym efektem oddziaływania może być zawieszenie proliferacji poprzez zapobieganie rozpoczęciu apoptozy (Lenschow i wsp., 1996). Spoczynkowe komórki T, w fazie G0 wzrostu, mogą ulec aktywacji w wyniku utworzenia kompleksu TCR, ale nie są zdolne do proliferacji lub wydzielania IL-2 przy braku sieciowania CD28, stan nazywany klonalną anergią (Linsley i wsp., 1991a). Dojrzałe komórki T mogą być aktywowane jedynie poprzez wiązanie TCR z MHC na APC, ale ta ewentualność prowadzi do indukowanej śmierci komórki drogą apoptozy (Radvanyi i wsp., 1996). Podczas gdy inne drugorzędowe oddziaływania (np. kostymulacja ICAM-1) mogą dostarczać pomocnicze sygnały do proliferacji, wydaje się, że kostymulacja, w której pośredniczy CD28 jest unikalnym mechanizmem, zapobiegającym rozpoczęciu klonalnej anergii i apoptozy (Linsley i wsp., 1993a). Wykazano, że CD28 pełni rolę w regulacji genów, znanych z kluczowej funkcji ochrony limfocytów T przed apoptozą (Boise i wsp., 1995). Zawieszenie wzrostu ekspresji w bcl-x± obserwowano w komórkach T, kostumulowanych poprzez sieciowanie CD28 (Boise i wsp., 1995). Uważa się, że kostymulacja poprzez CD28 może działać stabilizująco na mRNA bcl-x±, przy czym ekspresja kodowanego polipeptydu zapobiega rozpoczęciu apoptozy (Radvanyi i wsp., 1996).

Stwierdzono, że ligacja CD28 wywołuje wzmocnienie produkcji różnych cytokin pomocniczych komórek T, zarówno typu 1, jak i typu 2 (Lenschow i wsp., 1996). Zaobserwowano także rolę tej cząsteczki w oddziaływaniu podczas rozwoju specyficznych pomocniczych komórek T. Naiwne komórki T CD4⁺, w przypadku aktywowania przy braku sygnalizacji z udziałem CD28/CD80, nabywają zazwyczaj fenotyp Th1 (Lenschow i wsp., 1996). Może wskazywać to na

PL 199 352 B1 pośrednią rolę, jako że produkcja IL-4 może być indukowana poprzez dodatek egzogennej IL-2, a znaczenie zależnej od CD28 ścieżki sygnalizacyjnej w produkcji IL-2 było już dyskutowane (Seder i wsp., 1994). Dodatkowe badania, obejmujące wyłączenie funkcji CD28 u myszy, potwierdziły znaczenie receptora w rozwoju komórek Th2.

Badania prowadzone przez Shahinian'a i współpracowników nad myszami CD28^-/- miały na celu ustalenie procesu adaptacji zwierzęcia do infekcji przy braku wtórnego sygnału, dostarczanego poprzez CD28 (Shahinian i wsp., 1993). Zablokowanie funkcji genu uzyskano poprzez częściowe zastąpienie drugiego egzonu genem oporności na neomycynę w komórkach embrionowych myszy (Shahinian i wsp., 1993). Zaobserwowano, że w przypadku PBMC z homozygotycznych myszy z zablokowaną funkcją genu nie zachodziła ekspresja CD28 na ich komórkach T, natomiast heterozygotyczne CD28^-/+ charakteryzowały się zredukowaną ekspresją powierzchniową tej cząsteczki (Shahinian i wsp., 1993). Mitogenowa stymulacja komórek T, pochodzących z CD28^-/- myszy powodowała redukcję proliferacji komórek T i produkcję cytokin, które mogły być tylko częściowo odtwarzane przez egzogenną IL-2 (Shahinian i wsp., 1993). Wykazano, że wysoko oczyszczone komórki T nie ulegają aktywowaniu poprzez lektyny w nieobecności APC (Unanue, 1984). Na przykładzie myszy z zablokowaną funkcją genu stwierdzono, że oddziaływanie CD28/CD80 wymagane jest do mitogenności lektyn dla komórek T (Shahinian i wsp., 1993). Oddziaływanie to jest również ważne w pośredniczeniu podczas izotypowego przełączania komórek B, w odpowiedzi na antygen (Shahinian i wsp., 1993). Inaczej niż w przypadku wyłączania funkcji genu CD80, rola CD28 mogła być określona dzięki zastosowaniu genetycznych metod wyłączania genu. Badania nad zablokowaniem funkcji genu CTLA-4 u myszy nie zostały jeszcze przeprowadzone, ale badano już myszy transgeniczne z nadprodukcją CTLA-4 Ig (Lane i wsp., 1994). Jak można przewidzieć, szczep ten posiada charakterystykę fenotypową, podobną do szczepów z niedoborem CD28 (Lane i wsp., 1994). Podczas gdy wyizolowane komórki T produkowały normalne ilości IFNy, znacznie mniej IL-4 powstawało po stymulacji (Ronchese i wsp., 1994). Powodowało to brak zdolności komórek B do wywołania lub utrzymania prawidłowej odpowiedzi humoralnej (Ronchese i wsp., 1994). Mimo że istnieje wiele proponowanych ścieżek różnicowania Th1 i Th2, oddziaływanie CD28/B7 wywiera oczywisty wpływ na różnicowanie komórek T.

Stabilizacja mRNA interleukiny 2 może pełnić kluczową funkcję w sieciowaniu CD28, jednak liczne inne cytokiny okazały się, bezpośrednio lub pośrednio, wpływać na to oddziaływanie (Linsley i wsp., 1991a). W populacjach komórek T pamięci, w odpowiedzi na sygnały przenoszone za pośrednictwem CD28, produkowane są mediatory zapalne IL-1a, IL6 oraz TNFa, natomiast w populacjach komórek naiwnych, powstaje tylko IL-1a (Cerdan i wsp., 1991; van Kooten i wsp., 1991). Ekspresja IL-4 jest również regulowana poprzez ścieżkę sygnalizacyjną, w której uczestniczy CD28 (Seder i wsp., 1994). Inne ważne mediatory odpowiedzi humoralnej, IL-5, IL-10 oraz IL13, są także pobudzane w wyniku takiego oddziaływania (deWaal Malefyt i wsp., 1993; Minty i wsp., 1993). Za pomocą sygnałów dostarczanych przez CD28 ulegają pobudzeniu także czynniki stymulujące i czynniki wzrostu, obejmujące GM-CSF, CSF-1 i IL-3 oraz chemotaktyczne czynniki, jak IL-8 (Harlan i wsp., 1995).

Podczas gdy zastosowanie CD80 w indukowaniu reakcji immunologicznej względem komórek nowotworowych było poprzednio omawiane, to istnieją liczne, inne proponowane kliniczne sposoby wykorzystania CD28 i CD80. Na przykładzie modelowych organizmów gryzoni wykazano, że zapobieganie oddziaływaniu pomiędzy CD28 a CD80 może wpłynąć na ułatwienie profilaktyki lub leczenia niektórych chorób autoimmunologicznych, pojawiania się odrzutów narządów lub choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, a także uwalniania związanych z posocznicą cytokin (Harlan i wsp., 1995; Nickoloff i wsp., 1993; Thomas i wsp., 1994; Zhou i wsp., 1994). Dodatek CTLA-4 Ig w celu zablokowania oddziaływania CD28/CD80 u myszy zapobiegał objawom toczniopodobnym u myszy NZB/NZW, i mógł częściowo chronić przed letalnym EAE i letalnym zapaleniem nerek u szczurów (Harlan i wsp.,

1995). Podczas gdy ta forma terapii chorób autoimmunologicznych u ludzi nie była praktykowana, zaobserwowano u ludzi, że w przypadku łuszczycy i reumatoidalnego zapalenia stawów w biopsjach stwierdzono występowanie ekspresji CD80, podczas gdy w normalnych próbkach taka ekspresja nie miała miejsca (Nickoloff i wsp., 1993; Thomas i wsp., 1994). W przypadku badań nad przeszczepami szpiku kostnego i transplantacjami narządów u myszy oraz eksperymentami in vitro, dotyczącymi organizmu ludzkiego, zaobserwowano, że dodatek CTLA-4 Ig oraz zapobieganie oddziaływaniu CD28/B7 może powodować przynajmniej częściową ochronę przed odrzuceniem narządów, GVHD lub indukcję antygenowo-specyficznej tolerancji (Harlan i wsp., 1995). Ostatecznie, wykazano, że

PL 199 352 B1 poprzez podawanie in vivo CTLA-4 Ig, możliwe jest zapobieganie występowania u myszy uwalniania cytokin oraz wystąpienia i rozwoju posocznicy, która może prowadzić do pojawienia się wstrząsu septycznego i septikemii (Zhou i wsp., 1994). Zatem, odpowiednie manipulowanie oddziaływaniem CD28/CD80 wpływa na lepsze zrozumienie mechanizmu kostymulacji komórek T i dostarcza rozwiązań różnorodnych problemów.

Izolacja początkowego fragmentu CD28 mRNA otrzymano w wyniku ekstrakcji z limfocytów krwi obwodowej HK5, stymulowanych przez 16 godzin za pomocą Con A, stosując RNAzolB, odczynnik do ekstrakcji RNA (Biotexc, Houston, TX). Początkowo cDNA uzyskano z RNA dzięki zastosowaniu reakcji odwrotnej transkryptazy (RT), w której wykorzystano jako starter 3' oligo dT. W skrócie, w celu usunięcia drugorzędowej struktury, RNA wraz z oligo dT ogrzewano w 75°C przez 3 minuty. Następnie dodano RT, dNTP, bufor oraz wodę destylowaną, i tak otrzymaną mieszaninę inkubowano przez godzinę w 42°C. W kolejnym etapie, w celu inaktywowania RT, próbkę ogrzewano do 95°C przez 5 minut. W reakcji początkowej amplifikacji 673 nukleotydowego fragmentu, kodującego większość otwartej ramki odczytu, zastosowano zdegenerowane startery, pochodzące z regionów konsensusowych w obrębie znanych ludzkich, mysich i króliczych sekwencji CD28 (GeneBank, Bethesda, MD):

CD28-113: CAA CCT TAG CTG CAA GTA CAC (SEQ ID NO.: 70)

CD28-768: GGC TTC TGG ATA GGG ATA GG (SEQ ID NO.: 71)

W celu amplifikacji produktu zastosowano protokół reakcji PCR z gorącym startem i następnie wykorzystano polimerazę Taq (1 cykl - 95°C przez 5 minut; 30 cykli - 95°C przez 30 sekund, 48°C przez 30 sekund i 72°C przez 45 sekund oraz 1 cykl - 72°C przez 7 minut). Po wizualizacji na 1% żelu agarozowym, przeprowadzono reakcję ligacji do wektora do klonowania TA (InVitrogen, San Diego, CA) i sekwencjonowano, jak poprzednio opisano. Na podstawie sekwencji cDNA konstruowano specyficzne 3' startery, które następnie zastosowano w reakcjach 5' RACE.

CD28 190: CGG AGG TAG AAT TGC ACT GTC C (SEQ ID NO.: 72)

CD28 239: ATT TTG CAG AAG TAA ATA TCC (SEQ ID NO.: 73)

Izolacja regionu 5'

W celu otrzymania pozostałej 5' sekwencji kociej cząsteczki CD28, zastosowano zmodyfikowaną metodę GIBCO 5' RACE (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). RNA otrzymano ze stymulowanych przez 16 godzin za pomocą Con A PBMC. Do syntezy pierwszej nici cDNA zastosowano starter 3' genowospecyficzny. Przed dodaniem pozostałych odczynników RT, RNA wraz ze starterem ogrzewano do 75°C przez 5 minut. Po denaturacji, mieszaninę oziębiano do 4°C i dodawano bufor reakcyjny, chlorek magnezu, dNTP, DTT oraz SuperScript RT (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Mieszaninę RT następnie inkubowano w 42°C przez 30 minut, po czym, w celu denaturacji RT, ogrzewano do 70°C przez 15 minut. Następnie dodawano „koktajl Rnazowy i inkubowano mieszaninę reakcyjną w 55°C przez 10 minut, w celu usunięcia pozostałego RNA i zapobiegnięcia nieprawidłowemu wydłużeniu przez transferazę (TdT). Następnie cDNA był oczyszczany na kolumnie GlassMax (Gibco BRL, Gaitherburg, MD), w celu usunięcia niewbudowanych dNTP i starterów. Oczyszczony cDNA eluowany z kolumny zakończano za pomocą TdT. TdT wykorzystano do dodawania 20-30 nukleotydowej końcówki dC do cDNA. Enzym dodawano do mieszaniny oczyszczonego cDNA, chlorku magnezu, buforu reakcyjnego i dCTP, poddanego denaturacji cDNA w 95°C przez 3 min. Reakcję inkubowano w 37°C przez 10 min. Wykończone cDNA amplifikowano polimerazą Taq z wykorzystaniem reakcji PCR z gorącym startem (95°C przez 5 min., 95°C przez 30 sek., 55°C przez 30 sek. 72°C przez 45 sek., 35 cykli; 72°C przez 7 min.). Startery do tej reakcji obejmowały 3' starter zlokalizowany w kierunku 5' od startera syntezy cDNA, oraz starter kotwiczący specyficzny wobec łącznika dC i złożony w większości z dG z kilkoma resztami dI. Jeden μl z tej mieszaniny reakcyjnej rozcieńczano w 50 μl wody i 5 μl z tego rozcieńczenia stosowano następnie w reakcji zagnieżdżonego PCR (95°C przez 5 min. 1 cykl, 95°C przez 30 sek., 55°C przez 30 sek. 72°C przez 45 sek., 30 cykli stosując mieszaninę polimerazową KlenTaq) wraz z 5' dG/dl starterem kotwiczącym i dodatkowym 3' starterem specyficznym wobec miejsca leżącego przed genem. Trzydzieści μl mieszaniny reakcyjnej wizualizowano na 1,5% żelu agarozowym, i odpowiedni fragment ekstrahowano z żelu. cDNA oczyszczano zgodnie z wcześniejszym opisem za pomocą żelu Ammicon i filtrów micropure (Amicon, Beverly, MA). Oczyszczone próbki cDNA sekwencjonowano techniką wybarwianego na końcu cyklicznego sekwencjonowania (Perkin Elmer, Norwalk, CN). Z uzyskanych fragmentów uzyskano sekwencję konsensusową. W oparciu o sekwencję, syntetyzowano parę starterów obejmującą całą otwartą ramkę odczytu genu kociego CD28:

feCD28 5' : CGC GGA TCC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG (SEQ ID NO.: 13)

PL 199 352 B1 feCD28 3' : CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G (SEQ ID NO.: 14)

Stosując te startery, amplifikowano cząsteczkę cDNA zawierającą cały region kodujący korzystając z cDNA pochodzącego ze stymulowanych Con A EK6 i ED3 PBMC. Ten cDNA PBMC był produkowany uprzednio i wykazano, że zawiera gen kodujący RNA. Ta reakcja PCR (95°C przez 5 min. 1 cykl; 95°C przez 30 sek., 42°C przez 30 sek. i 72°C przez 45 sek., 30 cykli; 72°C przez 7 min) stosująca polimerazę DNA KlenTaq w nadziei zredukowania przypadkowych błędów często wiązanych z polimerazą Taq, pozwoliła uzyskać fragment o długości 754 pz, który został sklonowany do wektora do klonowania TA i zsekwencjonowany jak opisano poprzednio. Podobnie jak w przypadku cząsteczki CD80, każda pozycja nukleotydowa została potwierdzona przynajmniej trzema niezależnymi sekwencjami.

Zdegenerowane startery wybrane z regionów konsensusowych z mysiej, ludzkiej i króliczej sekwencji cDNA CD28 zostały wykorzystane w reakcji PCR i pozwoliły uzyskać produkt obejmujący prawie całą kocią sekwencję kodującą. Ze względu na wyższy stopień konserwowania sekwencji stwierdzony dla cząsteczki CD28, początkowa amplifikacja z użyciem zdegenerowanych dawała właściwie całą cząsteczkę. W przeciwieństwie do kociej cząsteczki CD80, w której początkowo otrzymywano tylko mały fragment centralny, w większości brakowało tylko 113 nukleotydów na 5' otwartej ramki odczytu cDNA CD28. Ten początkowy fragment sekwencji wykazywał 86% homologii z analogicznym regionem ludzkiej sekwencji, 86% identyczności z króliczym cDNA i 79% homologii z mysią sekwencją kodującą.

5' ATG i dodatkowe 110 nukleotydów oraz pewne sekwencje powyżej 5' końca zostały wyizolowane za pomocą 5' RACE PCR (Gibco, Gaithersburg, MA). cDNA transkrybowany z PBMC stymulowanych EK6 Con A został zastosowany w reakcji zakańczania. Z tym materiałem, amplifikacja z użyciem startera CD28-786 i kotwiczącego startera dG dawała słabo definiowalny materiał.

Pomimo tego, że za pomocą kombinacji starterów dG/CD-786 nie były amplifikowane identyfikowalne prążki, rozcieńczony cDNA pochodzący z tej reakcji był amplifikowany za pomocą starterów zagnieżdżonych CD28, CD28-182 i CD28-239. Zaobserwowano prążek obserwowany dla około 600 pz. Produkt ten izolowany z żelu agarozowego i sekwencjonowany zawierał sekwencję poprzedzającą 5' i jej kontynuację przez kodon startu.

Z sekwencji tych produktów wywodził się starter 5' zawierający kodon startu. Starter ten, w połączeniu z konstruktem 3', został zastosowany do amplifikowania cDNA z RNA ekstrahowanego z PBMC stymulowanych EK6 i ED3 Con A, produkujących produkt 754 pz.

Przynajmniej dwa z tych produktów z każdego ze zwierząt całkowicie sekwencjonowano i każde miejsce kwasu nukleinowego kontrolowano i potwierdzano przynajmniej 3 niezależnymi sekwencjami właściwie odczytanymi. Po zsekwencjonowaniu produkt pełnej długości był sekwencjonowany z wektora dp klonowania TA, w celu upewnienia się o istnieniu całego i powtarzalnego produktu.

W ostatecznym fragmencie o długości 685 pz kodującym całą otwartą ramkę odczytu, 5'ATG był umieszczany w pozycji 1, kodon stopu znajdował się w pozycji 664-666, wraz z dodatkowymi 19 nukleotydami na 3'UTR. Podobnie jak w cząsteczce kociego CD80, pozycja 5' kodonu ATG została potwierdzona poprzez sekwencjonowanie produktów PCR 5'RACE (dane nie pokazane).

Koci gen CD28, po zsekwencjonowaniu, okazał ogólne podobieństwo do sekwencji króliczej i ludzkiej. Homologia z mysim cDNA była jeszcze silniejsza, natomiast sekwencja kurza była bardziej rozbieżna, podobnie jak w przypadku porównania sekwencji kurzej z innymi sekwencjami ssaczymi (Tabela 2).

T a b e l a 2: Porównanie homologii sekwencji kociego CD28 z sekwencją mysią, ludzką, kurzą i króliczą.

gatunek	Procentowa homologia z sekwencją kocią
	aminokwasowa	nukleotydowa
człowiek	85%	82%
mysz	77%	74%
królik	84%	84%
kura	59%	50%

Sekwencja aminokwasowa białka była uzyskana na podstawie sekwencji kwasu nukleinowego jak to opisano poprzednio. Identyczność z sekwencjami peptydów pochodzących z innych opubliko26

PL 199 352 B1 wanych genów była zbliżona do identyczności na poziomie nukleotydowym. Sekwencja sygnałowa peptydu rozciągała się od 5' metioniny do reszty 19. Wydaje się, że w tej kociej cząsteczce, tak jak w innych sklonowanych polipeptydach CD28, pojedyncza zewnątrzkomórkowa domena zmienna podobna do IgSF rozciąga się od reszty 19 do 153. Hydrofobowa domena przezbłonowa rozciąga się przez kolejne 27 reszt, po czym następuje 41 aminokwasowa część cytoplazmatyczna. Podobnie jak w cząsteczce ludzkiej CD28, koci polipeptyd posiada 5 potencjalnych N-wiążących miejsc glikozylacji.

Porównanie przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej kociego i ludzkiego białka CD28 zaprezentowało regiony homologii z pewnymi rozbieżnościami. Większość zmian może być stwierdzona w domenie przezbłonowej i w sekwencji sygnałowej oraz domenie końcowej NH3. Wyższy stopień homologi stwierdzono w centralnej podobnej do IgSFV domenie i części cytoplazmatycznej.

Porównania mysiej cząsteczki CD28 z przypuszczalnymi sekwencjami aminokwasowymi mysich i ludzkich członków rodziny CD28/CTLA-4 pokazały, że pomimo iż istnieje jedynie 25% ogólnej homologii pomiędzy członkami tej grupy, specyficzne regiony i reszty są zachowywane. Motyw MYPPPY jest utrzymywany u wszystkich członków tej grupy. Wydaje się, że zachowane zostają dodatkowe reszty w kociej cząsteczce, którym przypisuje się znaczenie dla strukturalnej integralności, obejmujące pewną liczbę zachowywanych reszt cysteinowych.

Domena cytoplazmatyczna kociej cząsteczki CD28 jest umiarkowanie zachowywana w innych opublikowanych sekwencjach, zwłaszcza sekwencjach ssaczych. Różnorodne ścieżki sygnalizacji wewnątrzkomórkowej są przypuszczalnie regulowane w wyniku sieciowania zewnątrzkomórkowych części receptora (Hutchcroft i Bierer, 1995).

Wykresy hydrofilowości przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej kociego CD28 w porównaniu z podobnymi wykresami dla ludzkiego polipeptydu, dodatkowo wskazują na prawdopodobieństwo, że każde białko zachowuje podobną strukturalną integralność. Jednakże gdy następują zmiany w sekwencji aminokwasowej, zdają się to nie być zmiany znaczące dla hydrofilowości cząsteczki, co odzwierciedla fakt, że zmiany w sekwencji aminokwasowej są w większości homologiczne. Znacząca jest hydrofobowa domena przezbłonowa, w której kocie i ludzkie peptydy wykazują jedynie 75% homologii, lecz posiadają nadal bardzo podobne profile hydrofilowości.

Sekwencje sklonowanych cząsteczek CD28 wykazywały średni poziom konserwowania sekwencji w trakcie ewolucji. Przypuszcza się, że rola cząsteczki w aktywacji i regulacji odporności zależnej od komórki T jest zachowywana wśród różnych wyższych kręgowców, od ptaków, przez gryzonie i mięsożerne, aż do wyższych naczelnych.

Porównanie przypuszczalnych sekwencji aminokwasowych każdej cząsteczki wykazuje średnią homologię w częściach domeny zewnątrzkomórkowej przypuszczalnie zaangażowanej we wiązanie ligandu i w regionach wewnątrzkomórkowych przypuszczalnie promujących sygnalizację wewnątrzkomórkową. Ogólnie, najwyższy stopień homologii stwierdzono w regionie otaczającym proponowane miejsce wiązania ligandu, MYPPPY, zlokalizowany w domenie IgV od reszt 118-123 w polipeptydzie kocim.

Proponowana sekwencja sygnałowa peptydu rozciąga się od 5' metioniny do reszty 19 (Aruffo i wsp., 1987). Monomeryczny CD28 składa się z pojedynczej zewnątrzkomórkowej domeny podobnej do zmiennej IgSF, która rozciąga się przez reszty 19-153 (Aruffo i wsp., 1987). Hydrofobowa domena przezbłonowa rozciąga się przez kolejne 27 reszt, po czym następuje 41 aminokwasowa część cytoplazmatyczna (Aruffo i wsp., 1987). Kocie białko posiada 5 potencjalnych N-wiążących miejsc glikozylacji, w takich samych pozycjach jak stwierdzone w ludzkim białku. Co ciekawe, miejsce glikozylacji znajdujące się w miejscu reszty 105 w białku kocim jest NQS, natomiast w białku ludzkim mamy do czynienia z NQT. Te rozbieżności aminokwasowe dodatkowo odzwierciedlają fakt, że pomimo różnic w sekwencjach tych cząsteczek, jest jednak zachowana ogólna charakterystyka strukturalna tych białek.

Jak tego można oczekiwać w oparciu o poziom homologii wykazywany przez białka, porównanie wykresów hydrofilowości kociego i ludzkiego CD28 wykazuje, że cząsteczki wykazują potencjalnie podobny układ konformacyjny. Jednakże, stwierdzono także, że w przypadku zmian reszt, występuje zmiana ogólnie homologiczna. Podczas gdy domena przezbłonowa jest obszarem cząsteczki z najniższym stopniem konserwacji, jedynie zwykłe jej zachowanie jest wymagane do utrzymania charakteru hydrofobowego, to domena cytoplazmatyczna cząsteczki kociego CD28 jest umiarkowanie zachowywana wśród opublikowanych sekwencji. Rożne ścieżki sygnalizacji wewnątrzkomórkowej są sugerowane jako zależne od sieciowania zewnątrzkomórkowej części receptora i pomimo tego, że wewnątrzkomórkowa część polipeptydu CD28 nie posiada aktywności enzymatycznej, to wiązanie liganPL 199 352 B1 du powoduje raczej aktywację wewnątrzkomórkowych cząsteczek efektorowych (Aruffo i wsp., 1987).

173 188 191 200

Istnieją cztery konserwowane reszty tyrozynowe (Y¹⁷³, Y¹⁸⁸, Y¹⁹¹ i Y²⁰⁰), które są uznawane za potencjalne miejsca fosforylacji tyrozynowej (Lu i wsp., 1992). Ponadto, sekwencja MNM rozpoczynająca się w pozycji 193 kociej cząsteczki jest przypuszczalnie miejscem domeny SH2 w białkach ludzkim i mysim (Prasad i wsp., 1995). Potencjalne miejsce fosforylacji przez kinazę białkową C jest zachowane w S¹⁸⁵, natomiast T²⁰² może być miejscem dla aktywności kinazy serynowo-treoninowej Erk1 lub Erk2 (Hutchcroft i Bierer, 1996). Jak wspomniano uprzednio, rola sygnałowa receptora CD28 jest wielofunkcyjna, dlatego, też nie stanowi zaskoczenia fakt, że część cytoplazmatyczna białka posiada wiele potencjalnych mediatorów sygnałowych.

Przyszłe zastosowania cząsteczki kociego CD28 powinny obejmować otrzymywanie narzędzi do wykrywania ekspresji powierzchniowej receptora i monitorowania ekspresji CD28 po zakażeniu z wirusami, takimi jak FIV. Jeśli możliwe było by połączenie wykrywania białka z istniejącymi metodami wykrywania przekazu, można by było określić wartościowe informacje o poziomach ekspresji podczas infekcji. Dodatkowa korelacja wzorców ekspresji CD28 podczas przebiegu chronicznej infekcji FIV może służyć jako przykładowy koci układ oraz odpowiedni układ modelowy dla infekcji HIV u człowieka, i może prowadzić do bardziej konkretnej odpowiedzi odnoszącej się do przebiegu infekcji w obydwu układach.

P r z y k ł a d 6

Ekspresja białek CD28/CD80

Stwierdzono, że podczas gdy przekazywanie informacji w układzie odpornościowym jest w dużej mierze przenoszone przez czynniki rozpuszczalne, to rozpoczynanie pierwotnej odpowiedzi komórek T u naczelnych i gryzoni wymaga bezpośredniego kontaktowania się komórki z komórką (Mescher, 1992). Pierwotnie, myślano, że oddziaływanie to angażuje jedynie oddziaływanie pomiędzy TCR na powierzchni komórki T i MHC na komórce prezentującej antygen, jednak stało się jasne, że wiązanie zachodzące pomiędzy cząsteczkami wspomagającymi jest wymagane do pełnej aktywacji komórki T (Schwartz, 1992). Jak omówiono dowody wspierają fakt, że oddziaływanie pomiędzy CD28 i CD80 pełni rolę przenośnika tego sygnału wspomagającego (Linsley i wsp., 1991a).

Większość z ważnych receptorów i ligandów u kręgowców należy do nadrodziny IgSF (Springer, 1990). Cząsteczki te charakteryzują się obecnością regionu immunoglobinopodobnego, zwykle w części zewnątrzkomórkowej cząsteczki (Buck, 1992). Pomimo zmienności konserwowania, są one często ograniczone do reszt wymaganych do wytworzenia ufałdowania Ig (Beale, 1985). Charakterystyka domeny Ig obejmuje dwa blisko związane antyrównoległe β łańcuchy połączone pętlami posiadającymi konserwowaną topologię (Williams i Barclay, 1988). Pomimo istnienia podobnych właściwości strukturalnych wśród członków tej rodziny, istnieją różne sposoby wiązania i właściwości sygnalizacyjnych charakterystycznych dla tej rodziny (Andersen i wsp. 1988).

Jako członkowie rodziny IgSF, CD28 i CD80 wykazują stopień strukturalnego podobieństwa swych domen zewnątrzkomórkowych. CD28 posiada pojedynczy zewnątrzkomórkowy region V, który jednak jest ekspresjonowany jako połączony mostkami siarczkowymi heterodimer (Aruffo i wsp., 1987). Jednak zewnątrzkomórkowy region cząsteczki CD80 posiada zarówno domenę V-podobną oraz C-podobną i jest ekspresjonowany jako monomer (Freedman i wsp., 1989). Ponieważ członkowie nadrodziny IgSF mają wspólne cechy strukturalne w ograniczony sposób można wykorzystać wzorce informacji podstawowych do ustalania proponowanej trójwymiarowej struktury białek pokrewnych, które nie zostały jeszcze wykrystalizowane (Bajorath i wsp., 1993). Mimo, że nie wykrystalizowano ani polipeptydu CD28 ani CD80, CD2 (Driscoll i wsp., 1991) i CD8 (Leahy i wsp., 1992), cząsteczki posiadające analogiczne domeny zewnątrzkomórkowe, zostały poddane rentgenowskim badaniom krystalograficznym, które mogą być pomocne w ustalaniu proponowanej struktury pokrewnych członków grupy IgSF (Linsley i wsp., 1995a).

Jak opisano poprzednio, CD80 i CD86 posiadają podobną skłonność do wiązania się z CD28 i CTLA-4. Jednak CD28 jest receptorem niskiego powinowactwa wobec ligandów, natomiast CTLA-4 posiada wysokie powinowactwo do obydwu cząsteczek (Linsley i wsp., 1994a). Pomimo zaproponowania potencjalnego mechanizmu nie jest jasne w jaki sposób receptor niskiego powinowactwa z wysokim tempem dysocjacji, taki jak CD28, jest zdolny do dostarczania koniecznego sygnału kostymulacji dla rozwoju komórki T (Linsley i wsp., 1995a). Przypuszcza się, że wiązanie CD80 przez CD28 na powierzchni komórki T może wywoływać oligomeryzację receptora, który może wspomagać produktywne sieciowanie i dostarczanie sygnału (Linsley i wsp., 1995a). CD28 jest rozmieszczony równomiernie na powierzchni aktywowanych komórek T, dzięki czemu postuluje się, że cząsteczka ta migru28

PL 199 352 B1 je na powierzchnię po pobudzeniu komórek T (Damle i wsp., 1994). Wysokie stężenie oligomeryzowanych CD28 może wspomagać reasocjację wolnych CD28 w regionie kontaktu komórka:komórka i wyzwalać dostarczanie sygnału pomimo wysokiego tempa dysocjacji (Linsley i wsp., 1995a). Proces ten, określany jako wspólne okrywanie (ang. mutual capping), mimo, że nie obserwowany bezpośrednio dla oddziaływań CD28/CD80 został stwierdzony dla innych receptorów, dla których wymagany jest podobny inicjujący kontakt komórka:komórka (Singer, 1992).

Ponieważ oddziaływania CD28/CD80 zostały wykazane jako krytyczne dla szerzenia zależnej od komórki T odpowiedzi immunologicznej, wielkim zadaniem pozostaje nadal wyjaśnienie dokładnego mechanizmu tej ścieżki sygnalizacji (Linsley i wsp., 1993a). Istnienie dwóch receptorów i dwóch ligandów w tym oddziaływaniu stawia pytanie o rolę jaką odgrywa każdy z nich w aktywności komórki T (Linsley i wsp., 1992b). Ze względu na to, że CTLA-4 wiąże się silniej, jest ekspresjonowany znacznie później, i chociaż aproponowano ścieżki sygnalizacji dla CD28, nie zostało określone czy sygnał jest dostarczany przez wiązanie ligandu do CTLA-4 (Linsley i wsp., 1995a).

Przygotowywanie insertów

Następujące startery zastosowano do amplifikacji pełnej ramki odczytu genów kociego CD28 i CD80 dla insercji do wektorów ekspresyjnych:

feCD80 5': CGC GGA TCC GCA CCA TGG GTC ACG CAG CAA AGT GGA AAA C SEQ ID. NO.: 11) feCD80-960: CCT AGT AGA GAA GAG CTA AAG AGG C (SEQ ID. NO.: 12) feCD28 5': CGC GGA TCC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG (SEQ ID. NO.: 13) feCD28 3': CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G (SEQ ID. NO.: 14)

Starter 5' CD80 i oba startery CD28 zaprojektowano tak aby zawierały miejsca BamHI i odpowiednie łączniki ułatwiające insercję w miejscu wielokrotnego klonowania. Miejsce 3' BamHI zostało uzyskane na sekwencji CD80 poprzez trawienie wektora do klonowania TA. Startery 5' zawierały także kasetę Kozaka i 5'ATG w przypadku obydwu genów. W każdym przypadku, startery stosowano do amplifikacji z matrycy kodującej pełnej sekwencję każdego z genów, które były poprzednio sklonowane do wektora do klonowania TA, jak to opisano poprzednio. W przybliżeniu dziesięć nanogramów każdego plazmidu stosowano w amplifikacji PCR wykorzystującej polimerazę Taq (95°C przez 5 min. 1 cykl; 95°C przez 30 sek., 60°C przez 30 sek. i 68°C przez 45 sek., 30 cykli; 68°C przez 7 min. 1 cykl). Amplifikowane produkty wizualizowano elektroforetycznie na żelu agarozowym i następnie ligowano do wektora do klonowania TA (Invitrogen, San Diego, CA), jak to poprzednio opisano. Reakcja ligacji była stosowana do transformacji komórek kompetentnych InvaF', i klony pozytywne poddawano skriningowi i selekcji zgodnie z poprzednim opisem.

Klonowanie do pSI

W celu sklonowania do wektora pSI, który ma być stosowany do transformacji komórek COS-7, plazmid trawiono EcoRI, a następnie enzym usuwano za pomocą kolumny wirówkowej Micropure EZ (Amicon, Beverly, MA). Po usunięciu enzymu, plazmid traktowano fenol:chloroform w celu usunięcia obecnych białek i wytrącano alkoholem. Inserty wycinano z 50 μg oczyszczanego na QIAGEN plazmidowego DNA (Qiagen, Chatsworth, CA) z klonów zawierających wektor do klonowania TA i odpowiednie inserty, stosując miejsca EcoRI znajdujące się w wektorze i flankujące insert. 100 μl mieszaniny po trawieniu poddawano elektroforezie na 1,5% żelu agarozowym i wycinano trawiony fragment. Insert oczyszczano następnie z agarozy za pomocą rozpuszczalnika do żeli (nebulizera) i zestawu do filtrowania microcon (Amicon, Beverly, MA). Traktowanie alkaliczną fosfatazą trawionych EcoRI produktów trawienia pSI redukowało szansę samoligacji wektora. Jednogodzinne tratkowanie w 37°C wraz z 0,1 U/ng fosfatazy alkalicznej z jelita cieląt (CIP) defosforylowało trawione końce wektora. CIP usuwano przez denaturację termiczną w 65°C przez 30 min. poprzedzającą oczyszczanie przez odwirowanie na kolumnie wirówkowej Micropure EZ (Amicon, Beverly, MA). Inserty ligowano bezpośrednio do trawionego i defosforylowanego wektora pSI przez noc w 16°C, stosując ligazę T4 DNA. Stosunek molowy ligandu do wektora wynosił około trzy do jednego, 0,05 μg insertu CD28 lub CD80 do 0,1 μg pSI. Jeden μg mieszaniny reakcyjnej po ligacji stosowano następnie do transformowania komórek kompetentnych InvaF'. Komórki wysiewano na płytki LB zawierające 50 μg/ml ampicyliny. Płytki inkubowano przez noc w 37°C i następnego dnia kolonie inokulowano do 5 ml pożywek LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Po całonocnej inkubacji w 37°C z wytrząsaniem przy 220 rpm, plazmidowy DNA poddawano ekstrakcji poprzez lizę alkaliczną, DNA oczyszczano ekstrakcją fenol:chloroform, i wytrącano dwiema objętościami 95% etanolu. DNA traktowano RNazą i trawiono 10 U EcoRI. Produkty

PL 199 352 B1 trawienia wizualizowano na 1% żelu agarozowym w celu zidentyfikowania klonów pozytywnych. Plazmidowy DNA ekstrahowano wstępnie z 5 ml całonocnej hodowli klonów pozytywnych, stosując kolumny wirówkowe QIAprep (QIAGEN, Chatsworth, Ca). Oczyszczony DNA następnie sekwencjonowano, stosując cykliczne sekwencjonowanie z wybarwianiem końcowym za pomocą wewnętrznego startera 3' do określania orientacji insertu w plazmidzie. Lokalizacja startera była taka, że sekwencjonowanie przebiegało przez połączenie pomiędzy wektorem i insertem w celu zapewnienia by orientacja była odpowiednia. Klon każdego genu z plazmidem, w odpowiedniej orientacji, był następnie namnażany w 100 ml hodowli i plazmid ekstrahowano, stosując kolumnę do dużych preparatyk QIAGEN (Chatsworth, CA).

Klonowanie do SFV.

W celu insercji do wektora SFV, inserty i plazmid traktowano prawie tak samo. Sto μg wektora SFV trawiono 120 U BamHI przez 1 godzinę w 37°C. Enzym usuwano z mieszaniny reakcyjnej poprzez odwirowywanie przez filtr micropure EZ (Amicon, Beverly, MA). Następnie plazmid traktowano CIP. CIP inaktywowano termicznie i plazmid ponownie oczyszczano na filtrze micropure EZ. Inserty ekstrahowano z oczyszczonego DNA wektora do klonowania TA poprzez trawienie BamHI. Inserty oczyszczano i ligowano do wektora jak to opisano poprzednio. Po transformacji komórek kompetentnych InvaF', insercja plazmidu i orientacja były potwierdzane, stosując cykliczne sekwencjonowanie z wybarwianiem końcowym jak opisano. Preparatyka na dużą skalę była prowadzona dla pozytywnych klonów dla każdego genu.

Ekspresja białka pSI

Do transformacji pSI komórek eukariotycznych, pozyskano komórki COS-7 pochodzące z American Type Culture Collection (ATCC). Mrożone porcje rozpuszczano w 15 ml DMEM wraz z 10% płodowej surowicy cielęcej (FTS). Następnie hodowle prowadzono w postaci monowarstw w butelkach T-75. Wieczorem przed transfekcją, komórki usuwano z butelek po potraktowaniu 0,25% roztworem trypsyna EDTA i przemywano PBS. Komórki wysiewano następnie przy około 20% konfluencji do 100 mm naczyń do hodowli tkankowych i pozwalano wzrastać do stopnia około 50% konfluencji do następnego dnia. Dla każdego naczynia do transfekcji 5 ml DMEN-NuSerum (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) mieszano z 0,2 ml roztworu DEAE-dekstran/chlorochina. Dziesięć μg/ml oczyszczonego plazmidu pSI dodawano następnie do mieszaniny. Pożywkę odsączano od komórek COS, do komórek dodawano roztwór DMEM-NuSerum/DEAE-dekstran/chlorochina/DNA. Hodowle inkubowano przez 3,5 godziny w inkubatorze z 5% CO2, następnie usuwano pożywkę i zastępowano ją 5 ml 10% DMSO w PBS. Po 2 minutach usuwano ten rozwór, i komórki hodowano przez noc w 5 ml DMEN/10% FBS. Następnego dnia, komórki zbierano do 100 mm naczyń hodowlanych. Po 3 dniach, usuwano pożywkę, a transformowane komórki usuwano PBS/0,5 μM EDTA. Mieszaninę PBS/EDTA dodawano do komórek i inkubowano je przez 15 min. w 37°C. Supernatant usuwano i mieszano następnie z następną porcją popłuczyn PBS. Roztwór i popłuczyny były następnie odwirowywane. Powstający osad rozpuszczano ponownie w DMEN/PBS i zliczano komórki COS.

Ekspresja białka SFV

Transfekcję wektorem SFV prowadzono w komórkach nerki młodych chomików (BHK). Trzydzieści μg oczyszczonego plazmidu trawiono Spel przez 1 godzinę w 37°C. Enzym był następnie usuwany na filtrze micropure EZ (Amicon, Beverly, MA) i wytrącano DNA 2,5 objętościami 95% EtOH. Jeden i pół μg plazmidu było następnie stosowane jako matryca dla transkrypcji in vitro zależnej od Sp6. W skrócie, DNA inkubowano przez 1 godzinę w 37 °C wraz z: buforem transkrypcyjnym, 100 mM DTT, 10 mM G(5')ppp(5')G, mieszaninę rNTP, wodą, RNazyną, i 60 U polimerazą RNA Sp6. Po transkrypcji mieszaninę reakcyjną rozporcjowywano i próbki wizualizowano 1% żelu agarozowym. Czterdzieści pięć μl mieszaniny transkrypcyjnej stosowano do transfekowania komórek BHK przy około 80% konfluencji w butelkach T-75. Pożywkę GMEN plus 10% pożywkę FCS oddzielano od komórek i zastępowano pożywką Opti-MEM. Po 2 minutach inkubacji pożywkę tę zastępowano pożywkami Opti-MeM /9 μg/ml lipofektyny/transkrybowane RNA. Hodowle inkubowano przez 2 godziny w 37°C w 5% CO2 z częstym ręcznym mieszaniem. Po 2 godzinach pożywkę usuwano i zastępowano GMEN-10% FCS. Hodowle inkubowano przez 7-9 godzin i komórki usuwano przez trypsynizację.

Klonowanie do pQE

Bakteryjny wektor ekspresyjny, pQE był także konstruowany w połączeniu z kocim genem CD80 i CD28. Trawiony i traktowany CIP plazmid, przygotowany i oczyszczony jak poprzednio opisano, był ligowany za pomocą ligazy T4, w stosunku molowym insertu do plazmidu wynoszącym cztery

PL 199 352 B1 do jednego, z 50 ng oczyszczonego na żelu CD28 lub CD80. Mieszaniny ligacyjne inkubowano przez 16 godzin w 16°C. Dwa μl mieszaniny ligacyjnej stosowano następnie do transformowania komórek kompetentnych InvaF'. Selekcjonowano pozytywne kolonie i potwierdzano orientację insertu przez sekwencjonowanie. Dokonywano preparatyki na dużą skalę oczyszczonego plazmidu, który był stosowany do transformowania komórek M15 pREP4, kompetentnych poprzez traktowanie chlorkiem rubidu. Transformowane komórki hodowano na płytach LB z 50 μg/ml kanamycyny i ampicyliny, w celu zapewnienia, że plazmidy pQE i pomocniczy pREP4 zostały zachowane w tych koloniach. Pozytywne kolonie poddawno skriningowi, stosując mini preparacje z lizą alkaliczną i trawienie restrykcyjne BamHI. Kolonie z potwierdzonymi insertami zamrażano w 50% roztworach glicerolowych do przyszłego stosowania.

Test wiązania

Testy wiązania komórek transferowanych ekspresjonujących koci CD80 i koci CD28 prowadzono zgodnie z protokołem opisanym przez Linsley i wsp., 1994a. Jeden dzień po transfekcji, komórki COS-7 ekspresjonujące CD28 były usuwane z butelek T-75 poprzez traktowanie trypsyną-EDTA. Komórki przenoszono do 24 studzienkowych płytek w stężeniu 1x10⁵ komórek na ml i pozwalano na adhezję. Dwa dni później, komórki COS-7 transfekowane feCD80/pSI usuwano z butelek T-75 roztworem PBS/0,5 μM EDTA. Komórki te znakowano następnie fluorescencyjnie 5 μM roztworu Calcein AM (Molecular Probes, Eugene, OR) w sterylnym PBS/1% BSA przez 30 minut w 37°C (Akeson i Woods, 1993). Komórki kontrolne COS-7 wyznakowywano w ten sam sposób. Znakowane komórki były następnie przemywane trzykrotnie DMEM plus 10% FCS w celu usunięcia niewbudowanego znacznika, zliczano, i dodawano bezpośrednio do monowarstwy. Dwie populacje komórek kontaktowano przez 1 godzinę przy 37°C. Nie ulegające adhezji komórki usuwano delikatnie przemywając monowarstwę 3 krotnie za pomocą DMEM +10% FCS. Po przemywaniu, określano fluorescencję każdej ze studzienek w fluorymetrze mikropłytkowym. Fluorescencja studzienek zawierających transfekowane populacje była porównywana ze studzienkami, w których komórki ekspresjonujące CD80 były dodawane do komórek COS-7 transfekowanych wyłącznie plazmidem pSI.

Testy kompetycyjnego wiązania, stosujące białka fuzyjne CTLA-4 Ig i CD80 Ig (uprzejmie udostępnione przez P. Linsley, Bristol-Meyers Squib) do inhibitowania oddziaływań komórka/komórka, są przeznaczone do prezentowania specyficzności oddziaływań. Po wyznakowaniu kalceiną, lecz przed dodaniem komórek ekspresjonujących CD80 do monowarstwy, CTLA-4 Ig w DMEM/FCS w stężeniu 1 μg/ml inkubowano ze znakowanymi transfekowanymi komórkami przez 30 minut. Komórki przemywano dwukrotnie DMEM/FCS i dodawano do monowarstwy. Alternatywnie, komórki ekspresjonujące CD28 były inkubowane w monowarstwie przez 30 minut wraz z CD80 Ig o stężeniu 1 μg/ml w DMEN/FCS i następnie przemywane, po czym dodawano fluorescencyjne znakowane komórki ekspresjonujące CD80. Inhibitowanie wiązania białek fuzyjnych było szacowane w oparciu o porównanie fluorescencji w tych studzienkach z wiązaniem w studzienkach bez kompetytorów.

RT-PCR

Transfekowane komórki COS testowano także na transkrypcję mRNA, stosując RT-PCR. Po trzech dniach, RNA ekstrahowano z komórek transfekowanych pSI z kocim CD28, kocim CD80 lub bez insertu. RNA traktowano DNazą nie zawierającą RNazy w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń DNA. Jedną połowę μg RNA następnie poddawano odwrotnej transkrypcji do cDNA, stosując starter oligo dT i odwrotną transkryptazę MuMLV. Każdą próbkę cDNA następnie amplifikowano z zestawem starterów specyficznych wobec CD28, CD80 i G3PDH, przy użyciu następujących cykli temperaturowych: 95°C 5 min. 1 cykl; 95°C 30 sek., 55°C 30 sek., 72°C 30 sek., 30 cykli; 72°C 5 min., 1 cykl. 20 μl z każdej reakcji wizualizowano na 1% żelu agarozowym.

Geny kociego CD28 i CD80 zostały z powodzeniem wbudowane do trzech wektorów ekspresji białek (pSI, SFV i pQE). Po ligacji w odpowiednich wektorach, geny zostały wykorzystane do transformacji komórek kompetentnych InvaF'. Na figurach przedstawiono każdy z wektorów wraz z odpowiednim insertem cDNA.

Testy wiązania przeprowadzono w celu wykazania, że mogą być ekspresjonowane białka funkcjonalne. Początkowe testy prowadzono w celu określenia związków pomiędzy wiązaniem transfekowanych CD28 i transfekowanych CD28 komórek COS-7, transfekowanych CD80 COS-7 oraz kontrolnie transfekowanych komórek COS-7. Fluorescencja studzienek, do których dodano znakowane fluorescencyjnie nieprzylegające komórki transfekowane CD80 była wyższa niż dla studzienek kontrolnych w obydwu początkowych rozcieńczeniach. Oddziaływania były zależne od dawki, a po dwóch początkowych rozcieńczeniach, pozostała fluorescencja była taka sama w studzienkach, w których

PL 199 352 B1 komórki przylegające ekspresjonowały białko powierzchniowe, jak i dla ślepo transformowanych komórek kontrolnych.

W celu pokazania, że to oddziaływanie może być wyhamowane, linie komórek transfekowanych przed zmieszaniem inkubowano z rozpuszczalnym receptorem konkurencyjnym. Przy stężeniach 5x10⁵ i 1x10⁵ komórek, fluorescencja w studzienkach zawierających komórki COS ekspresjonujące CD28 i CD80 była podobna do obserwowanej w poprzednim eksperymencie. W studzienkach, w których komórki przylegające przed zmieszaniem inkubowano z receptorem obliczeniowym CD80Ig, pozostałość fluorescencji była porównywalna do stwierdzonej dla studzienek zawierających komórki kontrolne. Jednakże w przypadku komórek COS transfekowanych CD80 pSI inkubowanych wraz z rozpuszczalnym CTLA-4, przed eksponowaniem ich na komórki transfekowane CD28 pSI, fluorescencja nie była całkowicie inhibitowana. Podczas gdy poziomy nie były tak znaczące jak obserwowane w grupie nie poddawanej inhibicji, były one wyraźnie większe niż w grupie kontrolnej lub innych grupach eksperymentalnych.

RT-PCR przeprowadzono na RNA pochodzącym z komórek COS-7 transfekowanych pSI-CD28, pSI-CD80 i transfekowanych pustym wektorem w celu wykazania obecności mRNA specyficznego dla każdego genu w linii komórkowej. Przeprowadzono elektroforezę w 1% żelu agarozowym dla każdej linii komórkowej. Gen dla G3PDH amplifikowano w każdym zestawie aby pokazać integralność RNA oraz aby uzyskać kontrolę pozytywną w komórkach transfekowanych pustym wektorem. Komórki COS-7 transfekowane CD80 pSI ekspresjonowały mRNA dla CD80 i G3PDH, natomiast komórki COS-7 transfekowane CD28 pSI ekspresjonowały mRNA dla CD28 i G3PDH. Komórki kontrolne ekspresjonowały jedynie G3PDH.

Brak odpowiednich przeciwciał spowodował, że nie mógł być przeprowadzony bezpośredni test pokazujący ekspresjonowanie białek. Komercyjnie dostępne przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD28 i przeciwko ludzkiemu CD80 zastosowano do testów z użyciem izolowanych limfocytów w celu stwierdzenia występowania reaktywności krzyżowej. Analiza FACS wykorzystująca przeciwciała, na komórkach, dla których potwierdzono z użyciem PCR ekspresjonowanie matrycy dla obydwu białek powierzchniowych, nie powiodła się. Połączenie tego z faktem, że przeciwciała nie rozpoznają ekspresji powierzchniowej na komórkach transfekowanych pSI, doprowadziła do wniosku, że te przeciwciała nie są krzyżowo reaktywne. Nie oczekiwano takiej aktywności krzyżowej dla przeciwciał specyficznych wobec CD80. Ograniczona homologia pomiędzy ludzkimi i kocimi cząsteczkami CD80 ogranicza możliwość krzyżowej reaktywności dla przeciwciał monoklonalnych. Jednakże było nieco zaskakujące, że anty-hu CD28 nie były reaktywne krzyżowo. Pomimo istnienia wyższego stopnia konserwowania pomiędzy sklonowanymi cząsteczkami CD28, komercyjnie dostępne przeciwciało anty-hu CD28 reagujące krzyżowo z mysim białkiem nie zostało wykryte. Podobnie jak w przypadku przeciwciała anty-hu CD80, testy monoklonalnych przeciwciał hu CD28 nie powiodły się. Zatem zaczęto poszukiwania testu, który mógłby pokazać nie tylko prawdopodobieństwo, że białka ulegają ekspresji, ale także, wykazywać, że są funkcjonalne i zdolne do oddziaływań.

cDNA dla kocich CD80 i CD28 został z powodzeniem wbudowany do szeregu wektorów ekspresyjnych. Podczas gdy wektor pSI spełnia wymagania niezbędne do przeprowadzenia testu wiązania, dodatkowe wektory mogą ułatwić przyszłą ekspresję białka.

Po transfekcji, ekspresję mRNA CD28 i CD80 przez transformowane linie komórkowe COS-7 potwierdzono techniką RT-PCR. Traktowanie RNA DNazą przed reakcją PCR powinno było znacznie zredukować możliwość zanieczyszczeń genomowym lub plazmidowym DNA. Ponadto, nie oczekiwano, że komórki COS-7 mogą naturalnie ekspresjonować dowolny z ligandów, co zostało dodatkowo potwierdzone przez brak matrycy dla obydwu białek powierzchniowych w kontrolnych komórkach transfekowanych pustym wektorem. Amplifikacja właściwej matrycy z RNA z komórek transfekowanych wydaje się zatem odzwierciedlać obecność matrycy pSI w komórkach i potwierdzać transkrypcję matrycy plazmidowej.

Przeprowadzone testy wiązania opracowane zgodnie z testami opracowanymi przez Peter Linsley wykazały podobne właściwości wiązania ludzkich CD80 i CD86 (Linsley i wsp., 1994). Zmodyfikowany schemat zastosowano do pokazania, że ekspresjonowany powierzchniowo koci CD28 wiąże się z ekspresjonowanym powierzchniowo kocim CD80 i że to oddziaływanie może być inhibitowane przez receptor rozpuszczalny. Poziom wiązania może być wnioskowany na podstawie zatrzymania fluorescencyjnie znakowanych komórek w specyficznych studzienkach. Po32

PL 199 352 B1 nieważ zastosowano płytkowy czytnik fluorescencji, nie było wymagane poddawanie lizie komórek przed dokonywaniem pomiarów fluorescencji.

Początkowy test pokazał, że zatrzymanie fluorescencyjnie znakowanych komórek COS transfekowanych CD80-pSI było większe w studzienkach, w których komórki przylegające były transfekowane CD28-pSI, niż w studzienkach w których komórki transfekowano pustym wektorem. Komórki kontrolne, komórki COS transfekowane pSI pozbawionym insertu, pozwoliły stwierdzić, że ani obecność wektora, ani sam proces transfekcji, ani adhezyjne właściwości komórek nie powodują adhezji pomiędzy komórkami wywoływanej przez oddziaływanie pomiędzy ekspresjonowanymi powierzchniowo CD80 i CD28. Przy początkowym rozcieńczeniu 1x10⁶ komórek, fluorescencja w studzienkach z komórkami ekspresjonującymi CD28 była blisko pięciokrotnie większa niż w studzienkach, w których fluorescencyjnie znakowane komórki transfekowane CD80 były wprowadzane do studzienek zawierających komórki transfekowane pustym wektorem. Przy 5x10⁵ komórek, fluorescencja spadała wyraźnie z powodu zmniejszenia liczby komórek, lecz poziom pozostał nadal znacząco wyższy niż poziom fluorescencji w kontroli. Przy stężeniu komórek 1x10⁵ różnica pomiędzy komórkami, eksperymentalnymi i kontrolnymi nie była wykrywalna statystycznie, a przy 1x10⁴ była ona prawie identyczna. Test ten sugeruje, że oddziaływania występują pomiędzy komórkami COS transfekowanymi CD80 i transfekowanymi CD28, co powoduje pozostawanie w studzienkach fluorescencyjnie znakowanych komórek znakowanych CD80. Jednak gdy komórki przylegające nie ekspresjonowały powierzchniowo białka, komórki transfekowane CD80 były usuwane przez delikatne przemywanie. Efekt ten może być miareczkowany, i przy 1x10⁴ komórek fluorescencja w studzienkach była prawie identyczna. Aby potwierdzić występowanie oddziaływania wprowadzano rozpuszczalne receptory w celu inhibitowania oddziaływań CD28/CD80.

Drugi test obejmował wprowadzanie rozpuszczalnych postaci receptorów konkurencyjnych dla każdego białka z zamiarem inhibitowania oddziaływań pomiędzy partnerami adhezyjnymi. Rozpuszczalny receptor dla CD80, huCTLA-4Ig i dla CD28, huCD80-Ig były inkubowane wraz z odpowiednimi transfekowanymi komórkami COS ekspresjonującymi konkurencyjny receptor dla każdej cząsteczki, przed zmieszaniem dwóch typów komórek. Pomimo, że białka rozpuszczalne nie pochodziły od kotów, przypuszczano, że ze względu na poziom konserwowania stwierdzony pomiędzy sugerowanym regionem wiązania ludzkich i analogicznymi regionami kocich cząsteczek, zostanie osiągnięta wystarczająca reaktywność krzyżowa. Ponadto, ludzkie białka fuzyjne wiążą się z mysimi receptorami konkurencyjnymi (P. Linsley, osobista komunikacja). Ze względu na ilość komórek wymaganą do testu, nie było możliwe przeprowadzenie testu z 1x10⁶ komórek. Pierwszym stężeniem było 5x10⁵ komórek, z komórkami transfekowanymi CD28/CD80 samotnie wykazującymi fluorescencję podobną do tej jaką obserwowano w poprzednim eksperymencie. Nie jest jasne dlaczego komórki przylegające inkubowane wraz z rozpuszczalnym receptorem CD80 wykazywały fluorescencję zbliżoną do tej, jaką posiadają komórki poddane transfekcji kontrolnej, natomiast komórki nieprzylegające transfekowane CD80 znakowane fluorescencyjnie, inkubowane z rozpuszczalnym CTLA-4 wykazywały około dwu do trzech rzędów wyższą fluorescencję. Pomimo różnic wynikających z typu rozpuszczalnego receptora, obserwowano znaczącą redukcję w ilości fluorescencji w studzienkach, do których wprowadzany był receptor rozpuszczalny w porównaniu ze studzienkami w których nie było receptora. Oddziaływanie przedstawione w poprzednich testach może być inhibitowane przez wprowadzenie właściwego rozpuszczalnego receptora konkurencyjnego przed zmieszaniem komórek.

Podczas gdy przeciwciała monoklonalne specyficzne wobec białek powierzchniowych wydają się być ogólnie bardziej odpowiednie w tego typu testach, przy braku właściwych odczynników, wydają się być odpowiednim środkiem, dzięki któremu można zaprezentować ekspresję funkcjonalnego receptora konkurencyjnego. Wyniki początkowych testów wiązania połączone z konkurencyjnymi testami wiązania potwierdzają, że wyizolowano funkcjonalny cDNA kociego CD80 i CD28, a ponadto, że białka ekspresjonowane z matryc współdziałają funkcjonalnie. Pomimo, że stosowanie tego typu testów wiązania jest ograniczone, pozostaje on skutecznym układem służącym prezentowaniu prawdopodobieństwa funkcjonalnej ekspresji powierzchniowej i oddziaływań.

P r z y k ł a d 7

Infekcja

Lwoff zdefiniował wirusy jako „ściśle wewnątrzkomórkowe i potencjalnie patogenne czynniki w fazie infekcyjnej i 1) posiadające tylko jeden typ kwasu nukleinowego, 2) powielające się w poPL 199 352 B1 staci ich matariału genetycznego, 3) niezdole do wzrostu i rozmnażania przez podział, i 4) pozbawione systemu Lippmanna (Lwoff, 1957). Wirusy nie posiadają natury komórkowej, ich genom, RNA lub DNA, kieruje syntezą kolejnych cząsteczek wirionów poprzez zainfekowane komórki gospodarza (Luria i Darnell, 1968). Choroby wirusowe stanowią interesujący układ, w którym mogą być przedstawione praktyczne zastosowania kompleksu sygnalizacyjnego B7/CD28. Wśród retrowirusów, infekcja HIV u ludzi i kocim wirusem niedoboru odpornościowego (FIV) u kotów powodują zaburzenia w naturalnym funkcjonowaniu odporności, co hipotetycznie następuje poprzez eliminowanie komórek T CD4⁺ (Fauci i wsp., 1984; Pedersen i wsp., 1987). Przypuszcza się, że kompleks sygnalizacyjny CD28/CD80 odgrywa rolę w rozwoju choroby, a manipulowanie ekspresją receptora może zaostrzać infekcję (Harlan i wsp., 1995).

FIV jest rzeczywistym problemem klinicznym dotyczącym kotów domowych, powodującym szereg klinicznych i paraklinicznych objawów, które przypominają infekcję HIV u ludzi (Pedersen i wsp., 1987). Im więcej gromadzi się informacji dotyczących FIV, tym bardziej uzasadnione staje się uznawanie go za zwierzęcy model ludzkiego AIDS, i pomimo tego, że jest to model u nie-naczelnych, to bardzo przypomina on przebieg choroby u ludzi (Siebelink, 1990). Molekularne, biologiczne i patogenne podobieństwa sugerują także, że większość informacji uzyskiwanych w trakcie badań HIV może przyspieszać zrozumienie infekcji FIV u kotów.

Początkowo, zakażenie HIV objawia się przejściową limfopenią wraz z rozwojem objawów przypominających mononukleozę w fazie serokonwersji (Clark i wsp., 1991). Występuje krótki okres spadku populacji komórek T CD4⁺ i rozwój komórek T CD8⁺, co powoduje początkowy spadek stosunku CD4:CD8, co może prowadzić do dodatkowego spadku podczas bezobjawowej fazy choroby (Cooper i wsp., 1984). Do czasu wystąpienia początkowych objawów związanych z AIDS, populacja komórek T CD4⁺ jest już poważnie ograniczona, i wraz z postępowaniem choroby aż do fazy końcowej następuje drastyczne ograniczenie liczebności całej populacji limfocytów (Fauci i wsp., 1984). Podczas gdy początkowa limfocytopenia jest prawdopodobnie wynikiem działania kortykosterydów powodujących zmiany w populacji komórek odpornościowych jak to jest obserwowane w przypadku innych chorób wirusowych, dalsza utrata komórek T CD4⁺ i ekspansja komórek T CD8⁺ są wiązane z namnażaniem się wirusa i patogenezą (Fauci i Dale, 1975; Fauci i wsp., 1984). Opracowanie odpowiednich układów modelowych jest istotnym etapem w dalszym poznawaniu mechanizmów infekcji i choroby wywoływanej przez wirusa.

FIV, retrowirus atakujący limfocyty T, został pierwotnie opisany dla populacji kotów kalifornijskich, w której występowały częste, przewlekłe infekcje (Pedersen i wsp., 1987). Pomimo tego, że choroba przebiega w podobny sposób jak HIV u ludzi i jest odlegle spokrewniona taksonomicznie, jest ona antygenowo różna od czynników wywołujących AIDS u ludzi (Siebelink i wsp., 1990). Zakażenie następuje przez wymianę zainfekowanych płynów ustrojowych, tak jak w przypadku HIV, lecz inaczej niż w przypadku HIV, dla którego przekazywanie drogą płciową jest główną drogą zakażenia, wydaje się, że w przypadku FIV większość infekcji następuje poprzez przekazanie śliny w trakcie ukąszeń (Yamamoto i wsp., 1989). Pomimo różnic w przekazywaniu, powstały tak zespół niedoboru odporności jest jednym z lepszych modeli pokrewnej choroby u ludzi (Siebelink i wsp., 1990).

Postęp kliniczny FIV jest podobny do HIV, przy czym chorobę dzieli się na pięć etapów klinicznych. Początkowe stadium cechuje się gorączką, złym samopoczuciem i obrzękiem naczyń limfatycznych, po infekcji następuje długa faza bezobjawowa poprzedzająca rozwój infekcji i występowanie trzech końcowych faz, w których dochodzi do utraty masy ciała i występowania różnorodnych zakażeń wtórnych i oportunistycznych (English i wsp., 1994). Pomimo tego, że nie jest jasne czy droga infekcji komórkowej jest taka sama, FIV wykazuje tropizm do komórek T CD4⁺ oraz komórek T CD8⁺ (Brown i wsp., 1991). Zwierzęta zainfekowane wirusami wykazują spadek aktywności komórek T CD4⁺, prawdopodobnie ze względu na tworzenie syncytiów i lizę komórek (Siebelink i wsp., 1990). Początkowi fazy końcowej infekcji towarzyszy znaczny spadek ilości CD4⁺ komórek T i spadek stosunku CD4:CD8 (Novotney i wsp., 1990). Podczas gdy indukowane przez HIV i FIV choroby mogą nie wywoływać utraty komórek T CD4⁺ w taki sam sposób, uzyskany fenotyp i zaburzenia układu odpornościowego wydają się objawiać się w całkiem podobny sposób.

Chociaż jest jasne, że infekowanie komórek T CD4⁺ przez HIV nieuchronnie wpływa na rozwój prawidłowej odpowiedzi immunologicznej, dokładny mechanizm oddziaływań prowadzących do niedoboru odpornościowego nie został ostatecznie określony. W późnych fazach infekcji nie są poznane przyczyny redukcji komórek T CD4⁺ (Connor i wsp., 1993). Podczas gdy rozwój tworzenia syncytiów, indukowanie apoptozy i eliminowanie przez CTL zostały dowiedzione jako czynniki redukujące popu34

PL 199 352 B1 lację komórek T w przypadku infekcji HIV (Schattner i Laurence, 1994; Fouchier i wsp., 1996), proponowano także mechanizm związany z CD28 (Haffar i wsp., 1995). Zainfekowane linie komórek T wykazywały obniżanie ekspresji CD28 zarówno na poziomie białkowym jak i mRNA po stymulacji allo-antygenowej (Haffar i wsp., 1995). Jak już wspomniano poprzednio, sieciowanie CD28 jest krytycznym sygnałem wywołującym dojrzewanie odpowiedzi komórek T (Linsley i wsp., 1991a). Jeśli infekcja HIV powoduje obniżanie ekspresji powierzchniowej CD28, to zainfekowane komórki T rozpoznające prezentowany antygen mogą ulegać apoptozie zamiast pełnej aktywacji (Schattner i Laurence, 1994). Podczas gdy apoptoza jest naturalnym mechanizmem śmierci komórek zainfekowanych HIV, ścieżka ta może być dodatkowym czynnikiem towarzyszącym eliminowaniu komórek T (Brinchmann i wsp. 1994).

CTL CD8⁺ są wiązane z powstawaniem długoterminowego przeżycia w zakażeniach HIV, przy czym wysoki poziom CTL kojarzony jest z długoterminowym brakiem postępów AIDS u pacjentów zakażonych (Landay i wsp., 1994). W przeciwieństwie do tego, odporność humoralna jest nie tylko ogólnie nieskuteczna w zwalczaniu zakażeń wywoływanych przez Lentiviridae, pokazano że przeciwciała mogą faktycznie wzmacniać chorobę (Lombardi i wsp., 1994; Siebelink i wsp., 1995). Początek końcowej fazy klinicznej zakażenia HIV i towarzyszącego niedoboru odporności jest korelowany u wielu pacjentów z przejściem z odpowiedzi komórkowej typu 1 do odpowiedzi humoralnej, typu 2 (Schattner i Laurence, 1994). Jest to zgodne z obserwacją, że przejście od stanu zdrowego do AIDS wiąże się ze spadkiem aktywności antywirusowej zależnej od CTL CD8⁺ (Lewis i wsp., 1994). Ekspresja CD28 na CTL CD8⁺ zdaje się być także związana z ich aktywnością antywirusową, przy czym silna zależna od CTL aktywność antywirusowa związana jest z ekspresją CD28 na populacjach CD8 u pacjentów zakażonych (Landay i wsp., 1993).

Na ekspresję powierzchniową CD28, chociaż proponowaną jako czynnik wymagany do stymulowania oporności na HIV, niekorzystnie wpływa obecność HIV w zainfekowanych i niezainfekowanych komórkach T (Caruso i wsp., 1994). Wraz z rozpoczęciem stadium bezobjawowego zakażenia HIV, wykrywane jest zmniejszenie udziału procentowego komórek T CD4⁺ i CD8⁺ noszących CD28 (Lewis i wsp., 1994). Postuluje się, że może to przyczyniać się do zaburzeń w wydzielaniu cytokin obserwowanym we wczesnej fazie zakażenia (Caruso i wsp., 1994) oraz zmieniać odpowiedź komórek T CD8⁺ w późniejszych stadiach (Zanussi i wsp., 1996). Postuluje się, że u osób zakażonych HIV redukcja proliferacji komórek T CD8⁺ we wczesnym stadium zakażenia jest związana z tłumieniem CD28, gdyż tylko komórki T CD8⁺ ekspresjonujące CD28 proliferują w odpowiedzi na IL-2 (Brinchmann i wsp., 1994). Niestety, u osób zakażonych, komórki T CD28^-, CD8⁺ mogą stanowić 75% populacji CD8⁺, podczas gdy u osób zdrowych stanowią one zaledwie 25% populacji (Saukkonen i wsp., 1993). Zatem, ponieważ populacje CD8⁺ mogą pozostać prawidłowe u zainfekowanych osobników, skuteczność tej populacji w wyzwalaniu efektywnej antywirusowej odpowiedzi immunologicznej może być niekorzystnie zmieniana nawet we wczesnej fazie zakażenia (Caruso i wsp., 1994).

Badania wykazały także, że przenoszenie sygnału CD28 może być także zaangażowane w aktywność wirusa (Asjo i wsp., 1993; Smithgall i wsp., 1995). Kostymulacja zakażonych HIV obecnych we krwi obwodowej komórek T CD4⁺ za pomocą anty-CD3 i anty-CD28 wywołuje wyższą replikację wirusa niż stymulowanie samym anty-CD3 (Smithgall i wsp., 1995). Odpowiedź ta może być usunięta przez dodanie CTLA-4 Ig jako rozpuszczalnej postaci receptora CD80 i w mniejszym stopniu przez anty-IL-2 (Smithgall i wsp., 1995). W innych badaniach dotyczących zainfekowanych limfocytów T CD4⁺, u 40% pacjentów wykazano, że sama ligacja CD28 skutkuje podwyższeniem produkcji wirusa bez konieczności innych czynników stymulujących (Asjo i wsp., 1993).

Wstępne traktowanie populacji limfocytów powierzchniowych białkiem glikoproteiną HIV gp120 skutkowało spadkiem CD80 na powierzchni APC (Chirmule, 1995). Podczas gdy ekspresja CD28 na komórkach T zdaje się być obniżana przez zakażenie HIV, ekspresja CD80 na tych komórkach jest zwiększona (Haffer i wsp., 1993). Jest to postulowany mechanizm przenoszenia zakażenia do niezainfekowanych komórek T, który zakłada, że oddziaływania pomiędzy CD28 na niezainfekowanej komórce T i CD80 na zainfekowanej komórce T ułatwiają kontaktowanie się komórek, co ułatwia przenoszenie wirusa (Haffar i wsp., 1993).

Podczas gdy wpływy CD28 w przypadku HIV zostały zbadane, to rola tego białka powierzchniowego dla FIV nie została wyjaśniona. Jeśli uzyskane zostaną podobne wyniki, będzie, to potwierdzało przydatność kotów jako modelu retrowirusowego.

PL 199 352 B1

Infekcja in vivo

Trzy dorosłe wolne od patogenów (SPF) samice kotów zakażano dożylnie 1x10⁵ TCID50 szczepu Maryland wirusa FIV. Dwie podobne samice infekowano kontrolnie surowicą nie zawierającą wirusa w celu uzyskania kontroli. Krew pobierano przed infekcją i raz w tygodniu przez siedem tygodni. W pierwszym tygodniu zakażenia, koty monitorowano dwa razy dziennie w celu upewnienia się, że nie doszło do rozpoczęcia reakcji na zastrzyk. Wraz z postępem infekcji, zwierzęta monitorowano codziennie. Każdego tygodnia, podczas ostrej fazy klinicznej choroby, zbierano 5-10 ml krwi w celu określenia CBC i izolacji PBMC. CBC określano zliczając typy komórek w barwionym wymazie krwi z szybkim zanurzeniem (Jorgensen Lab., Loveland, CO).

PBMC ekstahowano z krwi poprzez rozdzielanie w gradiencie histopaku (Sigma, St. Louis, MO). Po wstępnym przemywaniu roztworem Alsevera, około 5x10⁵ komórek usuwano i dzielono na 5 studzienek w 48 studzienkowej płytce. Komórki zawieszano ponownie w 500 μl kompletnej RPMI, i następnie znakowano przeciwciałami skierowanymi wobec albo CD4 albo CD8. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej z delikatnym wytrząsaniem, komórki przemywano dwukrotnie PBS. Po przemywaniu, dodawano drugie przeciwciało, kozie anty-mysie IgG (H+L) znakowane FITC (KP&L, Gaithersburg, MD) w stężeniu 1:500 i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę delikatnie wstrząsając. Komórki były następnie przemywane trzykrotnie PBS i utrwalane w 3,7% formaldehydzie. Fluorescencyjnie znakowana populacja była następnie zliczana w cytometrze przepływowym FACSCalibur.

Pozostałe PBMC przemywano dodatkowo 10 ml roztworu Alsever-a. Po odwirowaniu, usuwano roztwór, i dodawano 1 ml ULTRACPEC (Biotexc, Houston, TX) w celu ekstrahowania RNA. RNA oczyszczano i wytrącano jak opisano poprzednio. Stężenie oceniano mierząc spektrofotometrycznie absorbancję przy 260 nm. Następnie RNA rozpuszczano w 50 μl wody traktowanej DEPC i mrożono w -70°C do późniejszego stosowania.

Półilościowy RT-PCR

Przed amplifikacją PCR próbki RNA, pobierano 60 ml krwi poprzez wykrwawianie kotów. PBMC izolowano zgodnie z poprzednim opisem. Komórki zliczano w hemacytometrze i dzielono na 4 butelki przy stężeniu 5x10⁵ komórek na ml. Komórki stymulowano Con A przez 0, 8, 16 i 24 godziny przed odwirowaniem i ekstrahowaniem RNA z osadu komórkowego za pomocą ULTRASPEC zgodnie z poprzednim opisem. RT-PCR prowadzono stosując 1,5 μg RNA transkrybowanego do cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy MMLV i 3' startera oligo dT. RNA, dT starter i dH2O traktowaną DEPC inkubowano przez 5 minut w 70°C w celu usunięcia drugorzędowej struktury RNA i umożliwienia przyłączania startera. Bufor transkrypcyjny, MgCl2, dNTP, i DTT dodawano następnie do mieszaniny i inkubowano przez 2 minuty w 42°C. Jeden μl mieszaniny reakcyjnej RT dodawano następnie do każdej z trzech probówek do amplifikacji CD80 i trzech probówek do amplifikacji CD28. Mieszaninę 10x buforu do PCR, dNTP i startery specyficzne dla CD28 lub CD80 dodawano następnie do cDNA. Starterami dla CD80 były:

B7-S220 5' starter: CAT GTC TGG CAA AGT ACA AG (SEQ ID NO.: 74)

B7-284 3' starter: TTA TAC TAG GGA CAG GGA AG (SEQ ID NO.: 75)

Natomiast starterami zastosowanymi dla CD28 były:

CD28 5' start: CGC GGA TCC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG (SEQ ID NO.: 13)

CD28-239 3': ATT TTG CAG AAG TAA ATA TCC (SEQ ID NO.: 73)

Trzy probówki dla każdego produktu były następnie inkubowane przez 5 minut w 95°C i następnie dodawano 0,25 μl polimerazy Taq w 10 μl wody do każdej probówki. Reakcje przebiegały z wykorzystaniem następującego profilu temperaturowego: 95°C 30 sek., 55°C 30 sek., i 72°C 30 sek. Probówkę usuwano odpowiednio po 20, 25 i 30 cyklach. Dwadzieścia μl każdej reakcji wizualizowano na 1% żelu agarozowym. Żel agarozowy fotografowano i określano liczbę cykli, w trakcie których powstał produkt. Po tych wstępnych eksperymentach, RNA poprzednio ekstrahowane z zakażonych i kontrolnych zwierząt amplifikowano w podobny sposób.

Infekcja in vitro

Infekowane in vitro FIV komórki T stymulowano Con A przez 0, i 16 godzin, i testowano ekspresję CD28 i CD80 metodą półilościowego RT-PCR. Linię komórkową FETJ mieszano z populacją limfocytów, które wzrastały przy braku IL-2 w pożywce wzrostowej. Niezależnie od tego subpopulacja tych komórek była eksponowana na działanie szczepu Maryland i szczepu Petaluma wirusa FIV. Zwykle około dwudziestu milionów prawidłowych, zakażonych Petaluma i zakażonych Maryland FETJ stymulowano przez 0 i 16 godzin 8 μg/ml Con A. RNA ekstahowano z tych komórek po inkubacji

PL 199 352 B1 z odczynnikiem do ekstrakcji RNA ULTRASPEC (Biotexc, Houston, TX) i oczyszczano jak opisano poprzednio.

MCH 5.4 jest linią komórek T pochodzących od kota, w której kolonii istnieją wielokrotne infekcje FIV pomimo, że ta linia nie jest chronicznie zakażona FIV. Około dwudziestu milionów komórek MCH 5.4 wytrącano przez odwirowywanie i zawieszano w 5 ml zatężonego supernatantu zakażonego FIV. Komórki inkubowano w tym roztworze przez 30 minut w inkubatorze z 5% CO2 w 37°C przed wyrównaniem stężeń do około 5x10⁵ i hodowano przez 24 godziny. Po stymulowaniu zdrowych i zainfekowanych. MCH 5.4 przez 0 i 26 godzin 8 μg/ml Con A RNA ekstrahowano odczynnikiem do ekstrakcji RNA ULTRASPEC (Biotexc, Hauston, TX) i oczyszczano zgodnie z poprzednim opisem.

Northern blotting

Dla celów analizy Northern blot określano stężenie RNA analizą spektrofotometryczną przy 260 nm. Piętnaście μq z każdej próby RNA zatężano do 3 pg/pl i rozpuszczano w 3 objętościach buforu do nakładania prób. Następnie próby podgrzewano do 70°C przez 15 minut w celu zdenaturowania RNA usunięcia struktur drugorzędowych. Próbki o objętości 20 pl nakładano na 1% żel agarozowy i poddawano elektroforezie przy 70 woltach przez 2,5 godziny aż błękit bromofenolowy osiągał odległość cm do końca żelu. RNA przenoszono z żelu na błonę nylonową Genescreen (Dupont NEN, Boston, MA) techniką kapilarną. RNA sieciowano z użyciem UV na błonie poprzez eksponowanie na światło UV o niskim natężeniu przez 3 minuty i następnie wizualizowano prążki pod kątem integralności prążków rybosomalnych w świetle UV.

Próbę specyficzną dla kociego CD28 były przygotowywane za pomocą znakowania cDNA techniką przypadkowego startu replikacji. Pełnej długości cząsteczka CD28 była wycinana z wektora do klonowania TA z wykorzystaniem flankujących miejsc EcoRI. Fragment był oczyszczany przez elektroforezę żelową i ekstrahowany z agarozy upłynniaczem żelowym (nebulizerem) Amicon (Amicon, Beverly, MA). 25 ng oczyszczonego produktu inkubowano z przypadkowymi dekamerami przez 5 minut w 95°C w celu usunięcia struktury drugorzędowej (Ambion, Austin, TX). Mieszanina reakcyjna była następnie gwałtownie zamrażana w ciekłym azocie i dodawano do mieszaniny dNTP nie zawierające dATP, i P³²adATP. Po 1 minucie inkubacji w 37°C, dodawano 1 pl polimerazy DNA Klenowa i mieszaninę inkubowano przez 30 minut. Reakcję zatrzymywano dodając 1 pl 0,5 M EDTA, i następnie oczyszczano na kolumnie wirówkowej Sephadex G-50 (Sigma, St. Louis, MO) w celu usunięcia niezwiązanych znakowanych izotopem nukleotydów. 1 pl mieszaniny reakcyjnej rozcieńczano w 1 ml płynu scyntylacyjnego, i określano aktywność próby w liczniku scyntylacyjnym. Bloty prehabrydyzowano przez 15 minut w 65°C w 5 ml płynu hybrydyzacyjnego Rapid Hyb (Amersham Life Science, Cleveland, OH). Pięć pl próby, o stężeniu 3-5x10⁶ cpm/pl dodawano do każdego blotu i inkubowano mieszając przez 1,5 godziny w 65°C. Próbę usuwano i blot przemywano dwukrotnie w 1% SSC/0,1% SDS w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie bloty skanowano licznikiem Geigera i przemywano ponownie w razie potrzeby w 65°C. Znakowanie było oceniane w urządzeniu skanującym Betagen. Przeprowadzano ostatnie przemywanie w 65°C przez 15 minut, i blot umieszczano na błonie światłoczułej o dużej czułości na 16-24 godziny w - 70°C. Autoradiogram wywoływano i oceniano prążki densytometrycznie. Integralność RNA i stężenie potwierdzano dla specyficznej dla G3PDH próby (uzyskanej dzięki uprzejmości Prof.J. Piedrahita, Texas A&M University) znakowanej i hybrydyzowanej w podobny sposób.

Półilościowy RT-PCR z komórek infekowanych in vitro

Obecność CD28 była ponadto wyznaczana w półilościowym PCR. Jak poprzednio opisano, stężenie ekstrahowanego RNA szacowano odczytami spektrofotometrycznymi przy 260 nm. Dwa pg RNA (25 pl objętości końcowej) transkrybowano do cDNA stosując starter oligo dT i odwrotną transkryptazę MMLV jak poprzednio opisano. Trzy i pół pl mieszaniny reakcyjnej RT przenoszono następnie do siedmiu probówek do PCR. Trzy probówki amplifikowano stosując startery specyficzne dla CD80, trzy probówki amplifikowano stosując startery specyficzne dla CD28 a pozostałą probówkę amplifikowano stosując startery specyficzne dla G3PDH:

G3PDH 5': CCT TCA TTG ACC TCA ACT ACA T (SEQ ID. NO.: 76)

G3PDH 3': CCA AAG TTG TCA TGG ATG ACC (SEQ ID. NO.: 77)

Jak opisano poprzednio probówki usuwano po 20, 25 i 30 cyklach. Dwadzieścia pl z każdej probówki wizualizowano na 1% żelu agarozowym. Ponadto, obecność pewnych cytokin pochodzących z komórek T testowano podobnie badając RNA z komórek PETJ i MCH 5.4. Startery specyficzne dla:

PL 199 352 B1

IL-2 5': CAA CCC CAA ACT CTC CAG GAT G (SEQ ID. NO.: 77)

IL-2 3': GGT CAG CGT TGA GAA GAT GCT TTG (SEQ ID. NO.: 78)

IL-4 5': TAT TAA TGG GTC TCA CCT ACC (SEQ ID. NO.: 79)

IL-4 3': TTG GCT TCA TTC ACA GAA CAG (SEQ ID. NO.: 80)

IFNa 5': GGG TCG CTT TTC GTA GAC ATT TTG (SEQ ID. NO.: 81)

IFNa 3': CAG GCA GGA CAA CCA TTA TTT C (SEQ ID. NO.: 82) zostały zastosowane do amplifikowania cDNA transkrybowanego z 1,25 μg RNA. Dwadzieścia procent transkrypcyjnej mieszaniny reakcyjnej amplifikowano dla każdej cytokiny. Pozostały cDNA amplifikowano stosując startery dla G3PDH. cDNA amplifikowano przez 30 cykli stosując następujące parametry: 95°C 5 minut 1 cykl; 95°C 30 sek., 55°C 30 sek., i 72°C 30 sek. 30 cykli; 72°C 5 minut 1 cykl. Dwadzieścia μl mieszaniny reakcyjnej wizualizowano następnie na 1% żelu agarozowym.

RT-PCR do określania infekcji

Zakażenie komórek FETJ i MCH 5.4 potwierdzano amplifikacją RT-PCR specyficznej sekwencji gag. RNA o stężeniu 1,25 μg transkrybowano do cDNA w opisanych uprzednio warunkach stosując MMLV RT i starter 3' specyficzny dla gag. Dziesięć μl mieszaniny reakcyjnej RT amplifikowano z użyciem PCR z gorącym startem w następujących warunkach: 95°C 5 minut; 95°C 30 sek., 55°C 30 sek., 72°C 30 sek. 30 cykli; 72°C 5 minut 1 cykl. Dwadzieścia μl mieszaniny reakcyjnej wizualizowano następnie na 1% żelu agarozowym.

Aby określić wpływ ostrej infekcji in vivo na ekspresję CD28, koty AUO4, AUU3 i OAC2 zakażano wirusem poprzez zastrzyk dożylny, natomiast koty AWG3 i OAE6 zaszczepiano samą pożywką. Analiza FACS pokazała pewne różnice pomiędzy stosunkiem CD4:CD8 u zwierząt eksperymentalnych i kontrolnych. Zwierzęta kontrolne ogólnie utrzymywały prawie stały stosunek około dwa do jednego, natomiast w grupie eksperymentalnej zauważono pewne fluktuacje ze stosunkiem spadającym aż do jeden do jednego u jednego ze zwierząt (Tabela 3).

T a b e l a 3. Stosunki CD4:CD8 limfocytów T z PBMC poddanych ostrej infekcji i niezakażonych kotów.

CD4:CD8 zakażone	Tydz. 1	Tydz. 2	Tydz. 4	Tydz. 5	Tydz. 6	Tydz. 7	Tydz. 8
AUO 4	4.5	N/D	1.9	1.2	1.0	1.5	1.6
AUU 3	N/D	2.3	2.9	1.3	1.2	1.1	2.1
OAC2	2.8	1.48	2.3	1.9	1.1	1.14	1.1
Niezakaż.
AWG 3	2.6	1.5	1.9	2.0	1.8	1.9	2.2
OAE 6	2.1	1.5	1.9	1.2	1.8	2.0	2.0

Przebieg ekspresji RNA dla CD80 i CD28 w czasie kontrolowano w celu pokazania, że matryca dla każdej z cząsteczek była obecna i mogła być amplifikowana z użyciem PCR dla czasów 0, 8, 16 i 24 godzin po stymulacji Con A. To półilościowe PCR wykrywało widoczne prążki przy niższych liczbach cykli amplifikacji, co może wiązać się ze względną obfitością matrycy. Prążek specyficzny dla CD80 nie był obserwowany przy 20 do 25 cyklach w dowolnym czasie po zakażeniu, lecz matryca CD80 była widoczna na żelu po 30 cyklach dla każdej grupy eksperymentalnej. Matryca CD28 była także widoczna dla każdego czasu po 30 cyklach, lecz dla punktu czasowego po 16 godzinach występowa także dobrze widoczny prążek po 25 cyklach.

Podobny protokół został wykorzystany dla RNA wyizolowanego z PBMC kotów zakażonych i niezakażonych FIV. Amplifikacja RT-PCR RNA specyficznego dla CD28 i CD80 została zastosowana do wykazania względnej ilości matrycy transkrybowanej dla każdego peptydu. Jak to przeprowadzono w poprzednich eksperymentach, próbki usuwano po 20, 25 i 30 cyklach. Nie można było wykryć sygnału po 20 cyklach, ale produkty CD80 i CD28 były widoczne po 25 cyklach (Tabela 4). Nie było widocznych różnic w ekspresji żadnej matrycy pomiędzy grupami eksperymentalną i kontrolną. Obydwa podzbiory wykazują fluktuacje odnośnie różnych ilości cykli amplifikacji, dla których widoczny był produkt.

PL 199 352 B1

T a b e l a 4. Półilościowe określanie produktów CD80 i CD28 po amplifikacji RT-PCR z RNA z PBMC zakażonych i niezakażonych w okresie odpowiadającym ostremu stadium infekcji FIV.

CYC B/C zakażone	Przed inf.	Tydz. 1	Tydz. 3	Tydz. 4	Tydz. 6	Tydz. 8
AUO 4	30/30	30/30	30/30	-/25	30/25	25/25
AUU 3	30/30	30/30	25/25	-/25	30/25	-/30
OAC2	30/30	30/30	30/30	-/30	25/30	25/25
niezakażone
AWG 3	25/30	30/30	30/25	-/30	30/25	25/25
OAE 6	30/30	-/30	-/30	-/25	30/30	25/25

Amplifikacja PCR mRNA linii komórek FETJ i MCH 5.4 z użyciem starterów specyficznych dla gag FIV pokazała, że linia komórkowa MGR 5.4 jest zakaźna, i przechodzi aktywne zakażenie, natomiast linia komórkowa FETJ nie skutkowała specyficzną dla gag amplifikacją RNA. Produkt specyficzny dla FIV był łatwy do amplifikacji z ekstraktów RNA z zakażonych komórek MCH 5.4, lecz nie z RNA podobnie ekstrahowanego z niezakażonych kontroli. Podobnie, reakcje prowadzone na RNA ekstrahowanym z linii komórkowej FETJ eksponowanej na szczepy FIV Petaluma i Maryland nie dawały widocznych produktów w podobnych warunkach (dane nie pokazane).

Northern blot i półilościowy PCR służący wykryciu matrycy CD28 prowadzono na zdrowych liniach komórkowych FETJ i MCH 5.4. Dla linii komórkowej MCH 5.4 była zakażona grupa eksperymentalna i niezakażona grupa kontrolna, natomiast linia komórkowa FETJ była zastosowana jako kontrolne komórki T niepermisywne.

Półilościowy PCR wykazał, że każda linia komórkowa jest zdolna do produkcji matrycy CD28. Amplifikacja kontrolnych niezakażonych FETJ wykazała podobny rodzaj ekspresji do obserwowanego w obserwacjach czasowych dla CD28 opisanych poprzednio. Dla 0 godzin po stymulacji nie były widoczne prążki nawet po 30 cyklach, dla 16 godzin po stymulacji prążki były widoczne po 25 cyklach. Podobny układ był obserwowany dla niezakażonych linii komórkowych MCH 5.4, dla których nie obserwowano prążków poniżej 30 cykli dla 0 godzin i prążki były widoczne po 25 cyklach po 16 godzinnej inkubacji. Co ciekawe, zakażone linie komórkowe MCH 5.4 wykazywały układ różny od każdej kontroli. W grupie eksperymentalnej, matryca nie była widoczna ani po 0 ani po 16 godzinach, po 30 cyklach. Matryca G3PDH była amplifikowana jako kontrola potwierdzająca integralność RNA i stężenie. Infekcja wydawała się wpływać na ekspresję matrycy RNA CD28.

Analizy techniką Northern blot zastosowano do potwierdzenia danych uzyskanych techniką półilościowej RT-PCR. RNA z niezakażonych komórek MCH 5.4 stymulowanych przez 16 godzin Con A wykazywał silniejszą hybrydyzację z sondą. Niestymulowane próby z linii niezakażonych wykazywały silniejszy poziom hybrydyzacji niż RNA z linii komórkowych MCH 5.4, które były stymulowane lub niestymulowane.

Poza autoradiografią, radioaktywność mierzono za pomocą BetaGen. Świeże próby z hybrydyzacji CD28 standaryzowano próbami otrzymanymi dla kolejnych prób GAPDH na blocie (Tabela 5).

T a b e l a 5. Znormalizowane wyniki dla prób CD28 Nothern blot z BetaGen.

	G3PDH	CD28	CD28 norm.
MCH 5.4 nor	14995	14921	14807
MCH 5.4 Con A	13336	13270	15430
MCH 5.4 inf	16700	10854	9867
MCH 5.4 I Con A	15112	11077	10967

Amplifikacja RT-PCR RNA cytokin z linii komórkowej MCH 5.4 wykazywało amplifikowalną matrycę jedynie dla IL-2. Ani IL-4, IL-6 ani IFN nie były amplifikowane po 30 cyklach, ale matryca IL-2 była łatwo wykrywalna.

Matrycę CD28 mierzono dla zakażeń in vitro oraz in vivo, w celu określenia czy ekspresja CD28 może być testowana i czy zakażenie retrowirusowe zmienia ekspresję matrycy. Gdy można było

PL 199 352 B1 otrzymać wystarczającą ilość RNA, CD28 mierzono z użyciem techniki Northern blot, natomiast z użyciem półilościowej RT-PCR gdy otrzymywanie było ograniczone.

Po eksperymentach in vivo dotyczących zakażenia trzech zwierząt szczepem Maryland FIV jak opisano uprzednio, matrycę specyficzną dla CD28 i CD80 amplifikowano z RNA ekstrahowanego z PBMC z izolatów krwi od tych trzech zakażonych zwierząt i niezakażonej kontroli. Pomimo, że badania techniką Northern blotting powinny być zalecane, wykorzystano półilościowy RT-PCR ze względu na ograniczenie liczby komórek i dostępnego RNA. Koty były wykrwawiane w okresach tygodniowych, przez co maksymalnie 10 ml krwi było dostępne w każdym eksperymencie.

Analiza FACS stosunków CD4/CD8 z PBMC od zakażonych zwierząt wykazywała spadek w ciągu 8 tygodni w porównaniu z niezakażonymi zwierzętami, u których stosunki te pozostawały na względnie stałym poziomie. Istnieją różnice pomiędzy dwoma grupami eksperymentalnymi. Chociaż stosunki CD4/CD8 wydają się być odmienne dla zakażonych zwierząt w porównaniu z niezakażonymi zwierzętami, nie wykryto faktycznych różnic w CBC lub ekspresji CD80 i CD28 (dane nie pokazane).

Aby optymalnie określić ekspresję CD28 konieczne były czyste komórki T. Dla izolatów PBMC, przeciętnie około 40% komórek było w rzeczywistości komórkami T. Jednocześnie wśród tych komórek tylko połowę stanowiły komórki T CD8⁺, które nie ekspresjonowały CD28 w tym samym stężeniu co komórki T CD4⁺. Połączenie tego z faktem, że w innych gatunkach, CD28 nie jest ekpresjonowany na wysokim poziomie poprzez spoczynkowe komórki T (które stanowią większość krążących komórek T) prowadzi do podjęcia decyzji o zastosowaniu pomiarów PCR zamiast Northern blotting. Poprzednie eksperymenty dążące do wykrycia matrycy CD28 z 20 μg RNA ekstrahowanego z PBMC były nieskuteczne. Reakcja półilościowego RT-PCR, pozwala wykryć obecność RNA kodującego CD28. Technika ta była także stosowana do amplifikowania matrycy specyficznej dla CD80. Linie komórowe in vitro dostarczały RNA, z którego techniką Northern blotting wykrywano matrycę CD28. MCH 5.4 zostały wybrane ze względu na to, że jako linia komórek T, wszystkie te komórki potencjalnie ekspresjonują matrycę CD28, a pochodne linie wykazywały uprzednio chroniczne zakażenie wirusem. Ostatnią korzyścią z tej linii komórkowej jest dużo większa dostępność RNA niż w przypadku limfocytów pochodzących z krwi uzyskanej od jednego zwierzęcia.

Matrycę CD80 próbowano także wykrywać techniką Northern blotting. CD80 występuje w niskim stężeniu w spoczynkowych komórkach B, i monocytach, natomiast najwyższe poziomy ekspresji stwierdzono dla stymulowanych monocytów i makrofagów. Kocia linia komórek prezentujących antygen nie była dostępna, a komórki T zazwyczaj naturalnie ekspresjonują białko na bardzo niskim poziomie. Eksperymenty służące wykrywaniu specyficznej dla CD80 matrycy w RNA ekstrahowanym z PBMC nie powiodły się, prawdopodobnie z powodu podobnych powodów jak dyskutowano dla CD28. Alternatywnie, półilościowy PCR zastosowano wobec komórek pochodzących z zakażonych zwierząt w celu wykrycia matrycy CD28 i CD80. Chociaż nie uzyskano definitywnej odpowiedzi dotyczącej ilości matrycy, testy te wykazały obecność matrycy i względną obfitość.

Analiza Northern blot matrycy CD28 z kociej linii komórek T powiodła się. Gdy matryca dla CD28 była porównywana dla zainfekowanych i niezainfekowanych komórek uzyskano różnice we wzorcach ekspresji. Matryca CD28 była najobficiej dostępna w niezainfekowanych komórkach eksponowanych na Con A przez 16 godzin. Matryca była także wykrywana w niezainfekowanych i niestymulowanych komórkach. Matryca była wykrywana w RNA ze stymulowanych i niestymulowanych komórek zakażonych FIV, natomiast poziomy były znacząco niższe niż dla komórek niezakażonych. Dane te są zgodne z podobnymi odkryciami obejmującymi stosowanie RT-PCR jako techniki detekcji.

Zdolność do wykrywania matrycy CD28 nie jest ograniczona tymi samymi czynnikami, które dotyczą cząsteczki CD80. Jednakże, jeśli mogła by być izolowana duża populacja komórek ekspresjonujących CD80 było by możliwe łatwe wykrywanie matrycy techniką Northern blotting. Gdyby uzyskano specyficzne wobec tego białka powierzchniowego przeciwciała monoklonalne, było by interesujące skorelowanie poziomu matrycy z ilością powierzchniowej ekspresji tego białka.

cDNA cytokin amplifikowano w celu stwierdzenia czy nie ma różnic dla linii zainfekowanych i niezainfekowanych. IL-2 była amplifikowana dla każdej grupy, niezależnie od statusu zainfekowania. Żadna inna matryca cytokinowa nie ulegała amplifikacji.

PL 199 352 B1

Northern blot wskazuje, że ekspresja CD28 na poziomie mRNA jest obniżana in vitro przez obecność FIV. Podczas gdy to stwierdzenie powinno być potwierdzone przez pomiary powierzchniowej ekspresji białka, wydaje się, że zakażenie FIV in vitro może wpływać na ekspresję CD28 tak, jak to pokazano dla ludzkich komórek T zakażonych HIV (Brinchmann i wsp., 1994).

Sklonowanie i zsekwencjonowanie cDNA kodującego kompleks sygnałowy CD28 i CD80 z układu kociego dało produkt analogiczny jak cząsteczki uzyskane w innych układach. Domniemana sekwencja aminokwasowa białka kociego wykazywała względnie niską identyczność z ludzkimi i mysimi polipeptydami, natomiast porównanie homologii pomiędzy poprzednio sklonowanymi cząsteczkami, utrzymywanie charakterystycznych reszt, i fakt, że ligand powierzchniowy nie posiada prawdopodobnie funkcji sygnalizacyjnej, prowadzi do wniosku, że wyizolowany produkt jest w rzeczywistości kocim analogiem CD80. Przeciwnie, kocia cząsteczka CD28 posiadała umiarkowaną identyczność zarówno na poziomie aminokwasowym jak i nukleinowym, i jest analogiczna dla cząsteczek sklonowanych z innych gatunków.

Charakter cząsteczek był ponadto badany poprzez wykazanie oddziaływań w testach wiązania. Monoklonalne przeciwciała specyficzne wobec analogicznych białek z innych gatunków nie mogły reagować z ekspresjonowanymi białkami kocimi. Zatem testy wiązania były przeznaczone do tego, aby pokazać, że dochodzi do oddziaływań i że są one inhibitowane przez rozpuszczalne receptory przeciwne. W tych testach wiązanie wykazywano poprzez zatrzymanie fluorescencyjnie znakowanych komórek, co było inhibitowane przez wprowadzenie rozpuszczalnych receptorów konkurencyjnych. Testy te wykazały nie tylko, że kocie białka CD80 i CD28 mogą być ekspresjonowane, lecz także, że ekspresjonowane powierzchniowo białka były zdolne do oddziaływań.

Ekspresja cząsteczek w aktywnym zakażeniu została także scharakteryzowana. Ekspresja CD28 i CD80 była testowana w układach in vivo i in vitro eksponowanych na wirusa FIV. Ekspresja CD28, która w ludzkich komórkach zakażonych HIV ulega wyraźnej zmianie (Asjo i wsp., 1993) była również podobnie zmieniana w przypadku zakażenia FIV kocich komórek T. Dodatkowe informacje dotyczące ekspresji każdej z tych cząsteczek w postępie choroby powinny być nadal zbierane, ponieważ układ koci stanowi istotny układ modelowy dla infekcji retrowirusowych.

Perspektywiczne zastosowanie tych cząsteczek jest potencjalnie szerokie. Zrozumienie układu immunologicznego ewolucyjnie różnego do układu ludzkiego może prowadzić do lepszego zrozumienia jak ten układ funkcjonuje u człowieka. Ponadto znaczenie układu kociego jako modelowego układu dla zakażeń retrowirusowych zostało jasno określone (Siebelink i wsp., 1990). Postuluje się, że CD80 jest potencjalnym adiuwantem, indukującym CTL pamięci w szczepionkach antyretrowirusowych. Układ koci może być wyjątkowym modelem do testowania wydajności tego układu.

LITERATURA:

Azuma, M., et al., J. Immunology 149, 1115-1123 (1992).

Azuma, M., et al., Nature 366, 76-79 (1993).

Chambers, et al., Current Opinion in Immunology 9, 396-404. (1997)

Chen, et al., J. Immunology 148, 2617-2621 (1992).

Chen, et al., Cell 71, 1093-1102 (1992).

Donnelly JJ, et al., Annu Rev Immunol 1997; 15: 617-648

Freeman, et al., J. Immunology 143 2714-2722 (1989).

Freeman, et al., J. Exp. Med. 174, 625-631 (1991).

Gimmi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6575-6579 (1991).

Hathcock, et al., J. of Exp. Med. 180, 631-640 (1994)

Hassett and Whitton, Trends Microbiol 1996; 4: 307-312.)

Linsley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5031-5035 (1990).

Jenkins, et al., J. Immunology 147, 2461-2466 (1991).

Riley, et al., J. Immunology 158, 5545-5553 (1997).

Tsuji, et al., Eur J Immunology 27(3), 782-787 (1997).

PCT International Application WO 92/00092, Bristol Myers Squibb.

PCT International Application WO 92/15671, Cytomed, Inc. 17 September 1992.

PCT International Application WO 93/00431, Bristol Myers Squibb, 7 January 1993.

Akeson, A.L. and Woods, C.W. (1993). A fluorometric assay for the quantitation of cell adherance to endothelial cells. J. Immunol. Meth. 163, 181-185.

PL 199 352 B1

Allison, J.P:, and Lanier L. (1987). The structure, serology, and function of the T-cell antigen receptor. Annu. Rev. Inmunol. 5, 503-540.

Allison, J.P. (1994). CD28-B7 interaction in T-cell activation, Current Opinion Immunol. 6, 414-419.

Anderson, P., Morimoto, C., Breitmeyer, J.B., Schlossman, S.F. (1988). Regulatory interactions between members of the immunoglobulin superfamily. Immunol Today 9, 199-203.

Antonia, S.J., Munoz,-Antonia, T., Soldevila, G., Miller, J., Flavell, R.A. (1995). B7-1 expression by a nonantigen presenting cell- derived tumor. Can. Res. 55, 2253-2256.

Arima, T., Rehman, A., Hickey, W., Flye, M. (1996). Inhibition by CTLA-4 Ig of experimental allergic encephalomyelitis. J. Immunol. 156, 4917-4924.

Arruffo, A. and Seed, B. (1987). Molecular cloning of a CD28 cDNA by a COS cell expression system. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 8573-8577.

Asjo, B., Cefai, D., Debre, P., Dudoit, Y., Autran, B. (1993). A novel mode of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) activation: ligation of CD28 alone induces HIV-1 replication in naturally infected lymphocytes. J. Virol. 67, 4395-4398.

Azuma, M., Cayabyab, M., Buck, M., Phillips, J.K., Lanier, L.L. (1992). Involvement of. CD28 in MHC unrestricted cytotoxicity mediated by a human killer leukaemic cell line. J. Immunol. 149, 1115-1123.

Azuma, M., Yssel, H., Phillips, J.H., Spits, H., Lanier, L.L., (1993b) Functional expression of B7/BB1 on activated T-lymphocytes. J. Exp. Med. 177, 845-850.

Azuma, M., Cayabyab, M., Phillips, J.H., Lanier, L.L. (1993c). Requirements for CD28dependant T cell-mediated cytotoxicity. J. Immunol. 150, 2091-2101.

Bajorath, J., Stenkamp, R., Aruffo, A. (1993). Knowledge based protein modeling: concepts and examples. Prot. Sci. 2,1798- 1810.

Bajorath, J., Peach, R., Linsley, P.S. (1994). Immunoglobulin fold characteristics of B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86). Prot. Sci. 3, 2148-2150.

Balazano, C., Buonavista, N., Rouvier, E., Golstein, P. (1992) CTLA-4 and CD28: similar proteins, neighbouring genes. Int. J. Can. Suppl. 7, 28-32.

Barcy, S., Wettendorf, M., Leo, O., Urbain, J., Kruger, M., Ceuppens, J.L., de Boers, M. (1995). FcR crosslinking on monocytes results in impaired T cell stimulatory capacity. Int. Immunol. 7, 179-189.

Beale, D. (1985). A comparison of the amino acid sequences of the extracellular domains of the immunoglobulin superfamily. Possible correlations between conservancy and conformation. Comp Biochem Physiol. 80, 181-194.

Bellone, M., lezzi, G., Manfredi, A.A., Protti, M.P., Dellabona, P., Casorati, G., Rugarli, C. (1994). In vitro priming of cytotoxic T lymphocytes against poorly immunogenic epitopes by engineered antigen presenting cells. Eur. J. Immun. 24, 2691-2698.

Berke, G. (1993). The functions and mechanisms of action of cytolytic lymphocytes. In Fundamental Immunology, (W. Paul), pp. 965-1014. New York: Raven Publ. 3rd ed.

Berke, G. (1994). The binding and lysis of target T-cells by cytotoxic lymphocytes. Annu. Rev. of Immunol. 12, 735-773.

Boise, L.H., Minn, A.J., Noel, P.J., June, C.H., Accavitti, M., Lindstein, T., Thompson, C.B. (1993). CD28 costimulation can promote T cell survival by enhancing the expression of Bcl-xL. Immunity 3, 87-89.

Brinchmann, J.E., Doblung, J.H., Heger, B.H., Haaheim, L.L., Sannes, M., Egeland, T. (1994). Expression of costimulatory molecule CD28 on T-cells in human immunodeficiency virus type 1 infection: functional and clinical coorelations. J. Inf Dis. 169, 730-738.

Brown, W.C., Bissey, L., Logan, K.S., Pedersen, N.C., Elders, J.H., Collisson, E.W. (1991). Feline immunodeficiency virus infects both CD4⁺ and CD8⁺ T-lymphocytes. -J. of Virol. 62, 3359- 3364.

Buck, C.A. (1992). Immunoglobulin Superfamily: structure function and relationship to other receptor molecules. Semin. Cell Biol. 3, 179-188.

Buelens, C., Willems, F., Delvaux, A., Pierard, G., Delville, J.P., Velu, T., Goldman, M. (1995). Interleukin 10 differentially regulates B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) expression on human peripheral blood dendritic cells. Eur. J. Immunol. 25, 2668- 2675.

Caruso, A., Cantalamessa, A., Licenziati, S., Peroni , L., Prati, E., Martinelli, F., Canaris, A. D., Folghera, S., Gorla, R., Balsari, A. (1994). Expression of CD28 on CD8⁺ and CD4⁺ lymphocytes during HIV infection. Scan. J. Immunol. 40, 485-490.

PL 199 352 B1

Cerdan, C., Martin, Y., Brailly, H., Courcoul, M., Flavetta, S., Costello, R., Mawas , C., Birg, F., Olive, D. (1991). IL-1 is produced by T lymphocytes activated via the CD2 plus CD28 pathways.

J. Immunol. 146, 560-564.

Chen, L., Linsley, P.S., Hellstrom, K.E. (1993). Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol. Today 14, 483-486.

Chesnut, R. W. and Grey, H. M. (1986). Antigen presentation by B cells and its significance in T-B interactions. Adv. Immunol. 39, 51-59.

Clark, S. J., Saag M.S., Decker, W. D., Campbell, H. S., Roberson, J.L., Veldkamp, P.J. (1991). High titers of cytopathic virus in plasma of patients with symptoms of primary HIV-1 infection. N. Eng. J. Med. 324, 954-960.

Clayberger, C., Lyu, S.C., DeKruyff, R., Parham, P., Krensky, A.M. (1994). Peptides corresponding to the CD8 and CD4 binding domains of HLA molecules block T-lymphocyte immune responses in vitro. J. Immunol. 153, 946-951.

Clevers, H., Alarcon, B., Wileman, T., Terhorst, C. (1988). The T-cell receptor-CD3 complex: A dynamic protein ensemble. Annu. Rev. Immunol. 6, 629-662.

Connor, R.I., Mohri, H., Cao, Y., Ho, D.D. (1993). Increased viral burden and cytopathicity correlate temporally with CD4+T- lymphocyte decline and clinical progression in human immunodeficiency virus type 1-infected individuals. J Virol. 67, 1772-1777.

Cooper, D.A., Tindall, B., Wilson, E.J., Imreie, A.A., Penny, R. (1988). Characterization of T-lymphocyte responses during primary infection with human immunodeficiency virus. J. Inf. Dis. 157, 889-896.

Damle, N.K., Doyle, L.V., Grossmaire, L.S., Ledbetter, J.A. (1988). Differential regulatory signals delivered by antibody binding to the CD28 molecule during the activation of human T lymphocytes. J. Immunol. 140, 1753-1761.

Damle, N.K., Klussman, K., Leytze, G., Myrdal, S., Arruffo, A., Ledbetter, J.A., Linsley, P.S. (1994). Costimulation of lymphocytes with integrin ligands ICAM-1 or VCAM-1 induces fuctional expression of CTLA-4 a second receptor for B7. J. Immunol. 152, 2686-2697.

Davis, M.M. and Bjorkman, P.K. (1988). T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.

Nature 334, 395-402 .

de Boer, M., Kasran, A., Kwekkeboom, J., Walter, H., Vandenberghe, P., Ceuppens, J.L. (1993). Ligation of B7 with CD28/CTLA-4 on T-cells results in CD40 ligand expression, interleukin-4 secretion and efficient help for antibody production by B cells. Eur. J. Immunol. 23, 3120-3125.

deWaal Malefyt, R., Yssel, H., de Vries, J.E. (1993). Direct effects of IL-10 on subsets of human CD4+ T cell clones and resting T cells. Specific inhibition of IL-2 production and proliferation. J. Immunol. 150, 4754-4765.

Ding, L., Linsley, P.S., Huang, L.Y., Germain, R.N., Shevach, E.M. (1993). IL-10 inhibits macrophage costimulatory activity by selectively inhibiting upregulation of B7 expression. J. Immunol. 151, 1224-1234.

Driscoll, P.C., Cyster, J., Campbell, I., Williams, A. (1991). Structure of domain 1 of rat T-lymphocyte CD2 antigen. Nature 353, 762-765.

Ellis, J.H., Burden, M., Vinogradov, D., Linge, C., Crowe, J. (1996). Interactions of CD80 and CD86 with CD28 and CTLA-4. J. Immunol. 155, 2700-2709.

Englehard, V.H. (1994). Structure of peptides associated with MHC class I molecules. Curr. Op. Immunol. 6, 13-21.

English, R.V., Nelson, P., Johnson, C.M., Nasisse, M., Tompkins, W.A., Tompkins, M.B. (1994). Development of clinical disease in cats experimentally infected with feline immunodeficiency virus.

J. Inf. Dis. 170, 543-552.

Fauci, A.S. and Dale, D.C. (1975). The effect of hydrocortisone on the kinetics of normal human lymphocytes. Blood, 46, 235-243.

Fauci, A., Macher, A., Longo, D., Lane, H., Rook, A., Masur, H., Gelmann, E. (1984). Acquired immunodeficiency syndrome: epidemiological, clinical, immunological and therapeutic considerations.

Ann. Int. Med. 100, 92-106.

Fong, T.A. and Mosmann, T.R. (1990). Alloreactive murine CD8+ T cell clones secrete the Th1 pattern of cytokines. J Immunol. 144, 1744-1752.

Fouchier, R.A., Meyaard, L., Brouwer, M., Hovenkamp, E., Schuitemaker, H. (1996). Broader tropism and higher cytopathicity for CD4⁺ T-cells of asyncytium-inducing compared to a nonPL 199 352 B1

-syncytium-inducing HIV-1 isolate as a mechanism for accelerated CD4⁺ T cell decline in vivo. Virology 219, 87-95.

Freedman, A.S., Freeman, G., Horowitz, J.C., Daley, J., Nadler, L.M. (1987). A B-cell restricted antigen that identifies preactivated B cells. J. Immunol. 139, 3260-3267.

Freeman G.J., Borriello, F., Hodes, R.J., Reiser, H., Hathcock, K.S., Laszlo, G., McKnight, A.J., Kim, J., Du, L., Lombard, D.B., Gray, G.S., Nadler, L.M., Sharpe, A.H. (1993). Uncovering a functional alternative CTLA-4 counter receptor in B7-1 deficient mice. Science 262, 907-909.

Gajewski, T.F., Schell, S.R., Nau, G., Fitch, F. W. (1989). Regulation of T-cell activation: Differences among T-cell subsets. Immunol Rev. 111, 79-110.

Germain, R.N. (1993). The Biochemistry and cell biology of antigen processing and presentation. Annu. Rev. Immunol. 11, 403- 450.

Haffar, O.K., Smithgall, M.D., Bradshaw, J., Brady, W., Damle, N.K., Linsley, P.S. (1993). Costimulation of T-cell activation and virus production by B7 antigen on activated CD4⁺ T-cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors. Immunology 90, 11094-11098.

Harlan, D.M., Abe, R., Lee, K.P., June, C.H. (1995). Potential roles of the B7 and CD28 receptor families in autoimmunity and immune evasion. Clin. Immunol. Immunopath. 75, 99-111.

Hodge, J.W., Abrami, S., Schlom, J., Kantor, J.A. (1994). Induction of antitumor immunity by recombinant vaccinia viruses expressing B7-1 or B7-2 costimulatory molecules. Can. Res. 54, 5552-5555.

Hutchcroft, J.E. and Bierer, B.E. (1996). Signaling through CD28/CTLA-4 family receptors. J. Immunol. 155, 4071-4074.

Jenkins, M.K., Pardoll, D.M., Mizuguchi, J., Quill, H., Schwartz, R.H. (1987). T cell responsiveness in vivo and in vitro: Fine specificity of induction and molecular characterisation of the unresponsive state. Immunol. Rev. 95, 113-135.

June, C.H., Ledbetter, J.H., Linsley, P.S., Thompson, C.B. (1990). Role of the CD28 molecule in T-cell activation. Immunol. Today 11, 211-216.

June, C.M., Bluestone, J.A., Nadler, L.M., Thompson, C.B. (1994). The 37 and CD28 receptor families. Immunol. Today 12, 321-333.

Kozber, B., Moretta, A., Messner, H.A., Moretta, L., Croce, C.M. (1987). Tp44 molecules involved in antigen-independant T cell activation are expressed cn human plasma cells. J. Immunol. 138, 4128-4132.

Kupfer, A. and Singer, S.J. (1989). Cell biology of cytotoxic and helper T-cell functions. Annu. Rev. Immunol. 7, 309-337.

Landay, A.L., Mackewicz, C.E., Levy, J.A. (1993). An activated CD8+ T cell phenotype coorelates with an anti-HIV activity and assymptomatic clinical status. Clin Immun. Immunopath. 69, 106-116.

Lane, P., Burdet, C., Hubele, S., Scheidegger, D., Muller; U., McConnell, F., Kosco-Vilbois, M. (1994). B cell function in mice transgenic for mCTLA4-H gamma 1: lack of germinal centers correlated with poor affinity maturation and class switching despite normal priming of CD4 + T-cells. J Exp Med. 179, 819-830.

Lanier, L.L., O'Fallon, S., Somoza, C., Phillips, J.H., Linsley, P.S., Okumura, K., Ito, D., Azuma, M. (1995). CD80 (B7) and CD86 (B7O) provide similar costimulatory signals for T cell proliferation, cytokine production, and generation of CTL. J. Immunol. 154, 97-105.

Larsen, C.P., Ritchie, S.C., Pearson, T.C., Linsley, P.S., Lowry, R.P. (1992). Functional expression of the costimulatory molecule B7/BB1 in murine dendritic cell populations. J. Exp. Med. 176, 1215-1220.

Leahy, D., Axel , R., Hendrickson, W. (1992). Crystal structure of a soluble form of human T cell counter receptor CD8 at 2.8 resolution. Cell 68, 1145-1162.

Lechler, R.I., Lombardi, G., Batchelor J.R., Reinsmoen N., Bach, F.H. (1990). The molecular basis of alloreactivity. Annu. Rev. Immunol. 10, 83-88.

Lenschow, D.J., Su, G.H-T., Zuckermann, L.A., Nabavi, N., Jellis, C.L., Gray, G.S., Miller, J., Bluestone, J.A. (1993). Expression and functional significance of an additional ligand for CTLA-4. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 90, 11054-11058.

Lenschow, D.J., Walunas, T.L., Bluestone, J.A. (1996). CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu. Rev. Immunol. 14 233- 258.

PL 199 352 B1

Leung, H.T. and Linsley, P.S. (1994). The CD28 costimulatory pathway. Therap. Immunol 1, 217-228.

Lewis, D.E., Ng Tang, D.S., Adu-Oppong, A., Schober, W., Rodgers, J. (1994). Anergy and apoptosis in CD8+ T-cells from HIV infected persons. J. Immunol. 153, 412-420.

Li, Y., McGowan, P., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E., Chen, L. (1994). Costimulation of tumor reactive CD4 and CD8 T- lymphocytes by B7 a natural ligand for CD28 can be used to treat established mouse melanoma. J. Immunol. 153, 421-428.

Lindsten, T., Lee, K.P., Harris, E.S., Petryniak, B., Craighead, N., Reynolds, P.J., Lombard, D.B., Freeman, G.J., Nadler, L.M., Gray, G.S. (1993). Characterization of CTLA-4 structure and expression on human T-cells. J. Immunol. 151, 3489-3499.

Linsley, P. S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L.S., Damle, N.K., Ledbetter, J.A. (1991a). Binding of the B-cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T-cell proliferation and Interleukin-2 mRNA accumulation. J. Exp. Med. 173, 721- 730.

Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L.S., Damle, N.K., Ledbetter, J.A. (1991b). CTLA-4 is a second receptor for the B-cell activation antigen B7. J. Exp. Med. 174, 561-569.

Linsley, P.S., Wallace, P.M., Johnson, J., Gibson, M.G., Greene, J.L., Ledbetter, J. A., Singh, C., Tepper, M.A. (1992a). Immunosuppression in vivo by a soluble form of the CTLA-4 T cell activation molecule. Science 257, 792-795.

Linsley, P.S., Greene, J.L., Tan, P., Bradshaw, J., Ledbetter, J.A., Anasetti, C., Damle, N.K. (1992b). Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T-lymphocytes. J. Exp. Med. 176, 1595-1604.

Linsley, P.S. and Ledbetter, J.A. (1993a). The role of CD28 receptor during T cell responces to antigen. Ann. Rev. Immunol. 11, 191-212.

Linsley, P.S., Bradshaw, J., Urnes, M., Grosmaire, L., Thompson, C.B. (1993b). CD28 engagement by B7/BB-1 induces transient down-regulation of CD28 synthesis and prolonged unresponsiveness to CD28 signaling. J. Immunol. 150, 3161- 3169.

Linsley, P.S., Greene, J.L., Brady, W., Bajorath, J., Ledbetter, J.A., Peach, R. (1994a). Human B7-1 (CD80) and B7-2 (CDB6) bind with similar avidities but distinct kinetics to CD28 and CTLA-4 receptors. Immunity 1, 793-801.

Linsley, P.S., Peach, R., Gladstone, P., Bajorath, J. (1994b). Extending the B7(CD80) gene family. Prot. Sci. 3, 1341-1343.

Linsley, P.S., Ledbetter, J., Peach, R., Bajorath, J. (1995a). CD28/CTLA-4 receptor structure, binding stoichiometry and aggregation during T cell activation. Res. Immunol. 146, 130-140.

Linsley, P.S., Nadler, S.G., Bajorath, J., Peach, R., Leung, H.T., Rogers, J., Bradshaw, J., Stebbins, M., Leytze, G., Brady, W., Malacko, A.R., Marquardt, H., Shaw, S. (1995b). Binding stoichiometry of the cytotoxic T-lymphocyte-associated molecule-4 (CTLA-4). J. Biol. Chem. 270, 15417-15424.

Littman, D.R. (1987). The structure of the CD4 and CD8 genes. Annu. Rev. Immunol. 5, 561-584.

Liu, C.C., Welsh, C.M., Young, J. D-E. (1995). Perforin: Structure and function. Imnunol. Today 16, 194-201.

Liu, Y., Jones, B., Brady, W., Janeway, C.A., Linsley, P. (1992). Murine CD4 T cell growth: B7 and heat stable antigen both participate in co-stimulation. Eur. J. Immunol. 115, 1905-1912.

Lombardi, S., Garzelli, C., Pistello, M., Massi, C., Matteucci, D., Baldinotti, F., Cammarota, G., Da Prato, L., Bandecchi, P., Tozzini, F., Bendinelli, M. (1994). A neutralizing antibody- inducing peptide of the V3 domain of feline immunodeficiency virus envelope glycoprotein does not induce protective immunity. J. Virol. 68, 8374-8379.

Lu, Y., Granelli-Piperno, A., Bjorndahl, J.M., Phillips, C. A.,

Trevillyan J.M. (1992). CD28-induced T cell activation. Evidence for a protein-tyrosine kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 149, 24-29.

Luria, S.E. and Darnell, J.E. (1968). General Virology. New York: John Wiley and Sons, Inc.

Lwoff, A. (1957). The concept of virus. J. Gen. Microbiol. 17, 239-253.

Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Press.

Martin, P.J., Ledbetter, J.A., Morishita, Y., June, C.H., Beatty, P. J., Hansen, J.A. (1986). A 44 kilodalton cell surface homodimer regulates interleukin 2 production by activated human T lymphocytes. J. Immunol. 136, 3282-3287.

PL 199 352 B1

Matasumura, M., Fremont, D.H., Peterson, P.A., Wilson, I.A. (1992). Emerging principles for the recognition of peptide antigens by MHC class I molecules. Science 257, 927-934.

Mescher, M. F. (1992). Surface contact requirements for activation of cytotoxic T-lymphocytes. J. Immunol. 49, 2402-2405.

Minty, A., Chalon, P., Derocq, J.M., Dumont, X., Guillemot, J.C., Kaghad, M., Labit, C., Leplatois, P., Liauzun, P., Miloux, B., Minty, C., Casellas, P., Loison, G., Lupker, J., Shire, D., Ferrara, P., Caput, D., (1993). Interleukin 13 is a new human lymphokine regulating inflammatory and immune responses. Nature 362, 248-250.

Moffett, C.W. and Paden, C.M. (1994). Microglia in the rat neurohypophysis increase expression of class I major histocompatibility antigens following central nervous system injury. J Neuroimmunol. 50, 139-51.

Mosmann, T. and Coffman, R.L. (1989). TH1 and TH2 cells: Different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu. Rev. Immunol. 7, 145-173.

Nabavi, N., Freeman, G.J., Gault, D., Godfrey, G.N., Nadler, L.M., Glimcher, L.M. (1992). Signaling through the MHC CII cytoplasmic domain is required for antigen presentation and induces B7 expression. Nature 360, 266-268.

Nagata, S. and Golstein, P. (1995). The Fas death factor. Science 267, 1449-1465.

Nickoloff, B.J., Mitra, R.S., Lee, K., Turka, L.A., Greem, J., Thompson, C., Shimizu, Y. (1993). Discordant expression of CD28 ligands BB-1 and B7 on keratinocytes in vitro and psoriatic cells in vivo. Am J. Path. 142, 1029-1040.

Novotney, C., English, R., Housman, J., Davidson, M., Nasisse, M., Jeng, C.R. (1990). Lymphocyce population changes in cats naturally infected with feline immunodeficiency virus. AIDS 4, 1213-1218.

O'Doherty, U., Steinman, R.M., Peng, M., Cameron, P.U., Gezelter, S., Kopeloff, I., Swiggard, W.J., Pope, M., Bhardwaj, N. (1993). Dendritic cells freshly isolated from human blood express CD4 and mature into typical immunostimulatory dendritic cells after culture in monocyte-conditioned media. J. Exp. Med. 178, 1067-1076.

Ozawa, K., Aiba, S., Nakagawa, S., Tagami, H. (1995). Interferon gamma and interleukin 10 inhibit antigen presentation by Langerhan's cells for T helper type 1 cells by suppressing their CD80 (B7-1) expression. Eur. J. Immunol. 26 648-652.

Page, C., Thompson, C., Yacoub, M., Rose, M. (1994). Human endothelial stimulation of allogenic T-cells via a CTLA-4 independant pathway. Trans. Jmmunol. 2, 342-347.

Peach, R., Bajorath, J., Brady, W., Leytze, G., Greene, J., Naemura, J., Linsley, P.S. (1994). CDR1 and CDR3- analogous regions in CTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1. J. Exp. Med. 180, 2049-2058.

Peach, R., Bajorath, J., Naemura, J., Leytze, G., Greene, J., Aruffo, A., Linsley, P.S. (1995). Both extracellular immunoglobulin-like domains of CD80 contain residues critical for binding T-cell surface receptors CTLA-4 and CD28, J. Biol. Chem. 270, 21181-21187.

Pedersen, N.C., Ho, E., Brown, M.L., Yamamoto, J. K. (1987). Isolation of a T lymphotrophic virus from domestic cats with an immunodeficiency like syndrome. Science 235, 790-793.

Prasad, K.V., Cai Y.C., Raab, M., Duckworth, B., Cantley, L., Shoelson, S.E., Rudd, C.E. (1994). T-cell antigen CD28 interacts with the lipid kinase phosphatidylinositol 3-Kinase by a cytoplasmic Tyr(P)-Met-Xaa-Met motif. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 2834-2838.

Radvanyi, L. G., Shi, Y., Vaziri;, H., Sharma, A., Dhala, R., Mills, G.B., Miller, R.G. (1996). CD28 costimulation inhibits TCR-induced apoptosis during a primary T cell response. J. Immunol. 158, 1788-1798.

Ranheim, E.A. and Kipps, T.J. (1995). Tumor necrosis factor-alpha facilitates induction of CD80 (B7-1) on human B cells by activated T-cells: complex regulation by IL-4, IL-10, and CD40L. Cell. Immunol. 161, 226-235.

Razi-Wolf, Z., Freeman, G., Galvin, F., Benacerraf, B., Nadler, L., Reiser, H. (1992). Expression and function of the murine B7 antigen and the major, costimulatory molecule expressed by peritoneal exudate cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 89, 4210- 4214.

Ronchese, F., Hausmann, B., Hubele, S., Lane, P. (1994). Mice transgenic for a soluble form of murine CTLA-4 show enhanced expansion of antigen-specific CD4+ T-cells and defective antibody production in vivo. J. Exp Med. 179, 809- 817.

PL 199 352 B1

Rotzschke, O. and Falk, K. (1994). Origin structure and motifs of naturally processed MHC class II ligands. Curr. Op Immunol. 6, 45-51.

Russel, J.H. (1983). Internal disintegration model of cytotoxic lymphocyte induced target damage. Immunol. Rev. 72, 97- 118.

Saukkonen, J.J., Kornfield, H., Berman, J.S. (1993). Expansion of a CD8⁺ CD28+ cell populatioh in the blood and lung of HIV- positive patients. JAIDS 11, 1194-1199.

Schattner, E. and Laurence, J. (1994). HIV induced T-lymphocyte depletion. Clin. Lab. Med. 14, 221-227.

Schmittel, A., Scheibenbogen, C., Keilholz, U. (1995). Lipopolysaccharide effectively up-regulates B7-1 (CD80) expression and costimulatory function of human monocytes. Scan. J. Immunol. 42, 701-704.

Schwartz, R.H. (1992). Costimulation of T-lymphocytes: the role of CD28, CTLA-4 and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Cell 71, 1065-1068.

Seder, R.A., Germain, R.N., Linsley, P.S., Paul, W.E. (1994). CD28 mediated co-stimulation of IL-2 production plays a critical role in T cell priming for IL-4 and IFNy production, J. Exp Med. 179, 299-304.

Shahinian, A., Pfeffer, K., Lee, K.P., Kundig, T.M., Kishihara, K., Wakeham, A., Kawai,

K., Ohashi, P.S., Thompson, C.B., Mak, T.B, (1993). Differential T cell costimulatory requirements in CD28 deficient mice. Science 261, 609-612.

Sher, A., Gazzinelli, R.T., Oswald, I.P., Clerici, M., Kullberg, M., Pearce, E.J., Berzofsky, J.A. Mosmann, T.R., James, S.L., Morse, H.C. (1992). Role of T-cell derived cytokines in the downregulation of immune responses in parasitic and retroviral infection. Immunol Rev. 127, 183-204.

Siebelink, K.H., Chu, I.H., Rimmelzwaan, G.F., Weijer, K., van Herwijnen, H.R., Knell, P. (1990). Feline Immunodeficiency virus (FIV) infection in the cat as a model for HIV infection in man: FIV induced impairment of immune function. AIDS Res. Hum. Retroviruses 6, 1373-1378.

Siebelink, K.H., Tujhaar, E., Huisman, R.C., Huisman, W., deRonde, A., Darby, I.H., Francis, M.J., Rimmelzwaan, G.F., Osterhaus, A.D. (1995). Enhancement of feline immunodeficiency virus infection after immunization with envelope glycoprotein subunit vaccines. J. Virol. 69, 3704-3711.

Singer, S.J. (1992). Intracellular communication and cell:cell adhesion. Science 255, 1671-1674.

Smithgall, M.D., Wong, J.G., Linsley, P.S., Haffar, O.K. (1995). Costimulation of CD4+ T-cells via CD28 modullates human immunodeficiency type 1 infection and replication in vitro. AIDS Res. Hu.

Retro. 11, 885-892.

Springer, T.A., Dustin, M.L., Kishimoto, T.K., Marlin, S.D. (1987). The lymphocyte function associated LFA-1, CD2 and LFA-3 molecules: cell adhesion receptors of the immune system. Annu. Rev. Immunol. 5, 223-252.

Springer, T.A., (1990). Adhesion receptors of the immune system. Nature 346, 425-434.

Stack, R.M., Lenschow, D.J., Gray, G.S., Bluestone, J.A., Fitch, F.W. (1994). IL-4 treatment of small splenic B cells induces co- stimulatory molecules B7-1 and B7-2. J. Immunol. 152, 5723-5733.

Symington, F.W., Brady, W., Linsley, P.S. (1993). Expression and function of B7 on human epidermal Langerhan's cells. J. Immunol. 150, 1286-1295.

Taylor, M.K. and Cohen, J.J. (1992). Cell mediated cytotoxicity. Curr. Opin. Immunol. 4, 338-343.

Thomas, R., Davi, L.S., Lipsky, P.E. (1994). Rheumatoid synoviurn is enriched in mature antigen presenting dendritic cells. J. Immunol. 152, 2613-2623.

Townsend, S.E., and Allison, J.P. (1993). Tumor rejection after direct costimulation of CD8⁺ T-cells by B7 transfected melanoma cells. Science 259, 368-370.

Turka L.A., Ledbetter, J.A., Lee, K., June, C.H., Thompson, C.B. (1990). CD28 is an inducible T cell surface antigen that transduces a proliferative signal in CD3⁺ mature thymocytes. J. Immunol. 144, 1646-1653.

Turka, L.A., Linsley, P.S., Paine, R., Schieven, G.L., Thompson, C.B., Ledbetter, J.A. (1991). Signal transduction via CD4, CD8 and CD28 in mature and immature thymocytes. J. Immunol. 146, 1428-1436.

Unanue, E.R. (1984). Antigen presenting function of the macrophage. Annu. Rev. Immunol. 2, 395-428.

PL 199 352 B1 van Kooten, C., Rensink, I., Pascual, -Salcedo, D., van Oers, R., Aarden, L. (1991). Monokine production by human T-cells: IL-1 alpha production is limited to memory T-cells. J. Immunol. 146, 2654-2658.

van Seventer, G.A., Shimizu, Y., Shaw, S. (1991). Roles of multiple accessory molecules in T cell activation. Curr. Opin Immunol. 3, 294-303.

Wang, R., Murphy, K.M., Loh, D.Y., Weaver, C., Russell, J.H. (1993). Differential activation of antigenstimulated suicide and cytokine production pathways in CD4+ T-cells is regulated by the antigen-presenting cell. J Immunol. 150, 3832-42.

Weiss, A. and Littman, D.R. (1994). Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 76, 263-274.

Williams, A. and Barclay, A. (1988). The immunoglobulin superfamily-domains for cell surface recognition. Ann. Rev. Immunol. 6, 381-405.

Windhagen, A., Newcombe, J., Dangond, F., Strand, C., Woodroofe, M.N., Cuzner, M.L., Hafler, D.A. (1995). Expression of costimulatory molecules B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) and interleukin 12 in multiple schlerosis lesions. J. Exp. Med. 182, 1985-1996.

Yamamoto, J.K., Hansen, H., Ho, W.E., Morishita, T.Y., Okuda, T., Sawa, T.R. (1989). Epidemiological and clinical aspects of feline immunodeficiency virus infection in cats from the continental United States and Canada and possible mode of transmission. J.A.V.M.A. 194, 213-220.

Yasukawa, M., Inatsuki, A., Kobayashi, Y. (1989). Differential in vitro activation of CD4+CD8and CD8+CD4- herpes simplex virus-specific human cytotoxic T-cells. J. Immunol. 143, 2051-2057.

Yssel, H., Schneider, P.V., Lanier, L.L. (1993). Interleukin 7 specifically induces B7/BB1 antigen on human cord blood and peripheral blood T-cells and T cell clones. Int. Irmunol. 5, 753-759.

Zanussi, S., Simonelli, C., D'Andrea, M., Caffau, C Clerici, M., Tirelli, U., DePaoli, P. (1996). CD8⁺ lymphocyte phenotype and cytokine production in long-term non-progressor and in progressor patients with HIV-1 infection. Clin. Exp. Inmunol. 105, 220-224.

Zhou T., Weaver, C., Linsley, P.S., Mountz, J.D. (1994). T cells of staphylococcal enterotoxin B-tolerized autoimmune MRL- Ipr/lpr mice require costimulation through the B7- CD2B/CTLA-4 pathway for activation and can be reanergized in vivo by stimulation of the T cell receptor in the absence of costimulatory signal. Eur. J. Immunol. 24, 1019-1025.

Claims (35)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Izolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje koci ligand CD86 lub koci rozpuszczalny ligand CD86.
2. 2. Izolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje koci receptor CTLA-4 lub koci rozpuszczalny receptor CTLA-4.
3. 3. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że koci ligand CD86 posiada sekwencję oznaczoną jako sekwencja; ID nr 5.
4. 4. Kwas nukleinowy według zastrz. 2, znamienny tym, że koci receptor CTLA-4 posiada sekwencję oznaczoną jako sekwencja; ID nr 9.
5. 5. Kwas nukleinowy według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że kwas nukleinowy stanowi DNA lub RNA.
6. 6. Kwas nukleinowy według zastrz. 5, znamienny tym, że DNA stanowi cDNA lub genomowy

   DNA.
7. 7. Oligonukleotyd, znamienny tym, że złożony jest z co najmniej 12 nukleotydów, posiadający sekwencję komplementarną do sekwencji unikalnie obecnej w kwasie nukleinowym określonym w zastrz. 1 albo 2.
8. 8. Oligonukleotyd według zastrz. 7, znamienny tym, że złożony jest z co najmniej 15 lub 16 nukleotydów.
9. 9. Oligonukleotyd według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że oligonukleotyd jest znakowany w sposób wykrywalny.
10. 10. Oligonukleotyd według zastrz. 9, znamienny tym, że znakowanie wykrywalne obejmuje znakowanie radioizotopem, fluoroforem lub biotyną.
11. 11. Oligonukleotyd według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że oligonukleotyd jest selektywnie metylowany.

    PL 199 352 B1
12. 12. Wektor, znamienny tym, że zawiera kwas nukleinowy określony w zastrz. 1.
13. 13. Wektor plazmidowy według zastrz. 12 oznaczony jako B7-2#19-2/011298 (numer dostępu ATCC 209821).
14. 14. Wektor, znamienny tym, że zawiera kwas nukleinowy określony w zastrz. 2.
15. 15. Wektor plazmidowy według zastrz. 14 oznaczony jako CTLA-4#1/091997 (numer dostępu ATCC 209820).
16. 16. Wektor według zastrz. 12 albo 13, albo 14, albo 15, znamienny tym, że zawiera promotor operacyjnie związany z kwasem nukleinowym.
17. 17. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 12 albo 13, albo 14, albo 15, albo 16.
18. 18. Komórka gospodarza według zastrz. 17, znamienna tym, że stanowi komórkę eukariotyczną lub prokariotyczną.
19. 19. Komórka gospodarza według zastrz. 18, znamienna tym, że wybrana jest z grupy składającej się z: E. coli, drożdży, komórek COS, komórek PC12, komórek CHO, i komórek GH4C1.
20. 20. Polipeptyd, znamienny tym, że kodowany jest przez kwas nukleinowy określony w zastrz. 1.
21. 21. Polipeptyd, znamienny tym, że kodowany jest przez kwas nukleinowy określony w zastrz. 2.
22. 22. Sposób wytwarzania polipeptydu określonego w zastrz. 20 albo 21, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których hoduje się komórkę gospodarza z ekspresją polipeptydu i odzyskuje się tak wyprodukowany polipeptyd.
23. 23. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość polipeptydu określonego w zastrz. 20 albo 21 oraz odpowiedni nośnik.
24. 24. Szczepionka według zastrz. 23, znamienna tym, że jako skuteczną ilość zawiera ilość od około 0,01 mg do około 100 mg na dawkę.
25. 25. Szczepionka według zastrz. 23, znamienna tym, że jako skuteczną ilość zawiera ilość od około 0,25 mg/kg masy ciała kota/dzień do około 25 mg/kg masy ciała kota/dzień.
26. 26. Szczepionka według zastrz. 23 albo 24, albo 25, znamienna tym, że zawiera dodatkowo immunogen pochodzący od patogenu.
27. 27. Szczepionka według zastrz. 26, znamienna tym, że patogen jest patogenem kocim wirusa wścieklizny, chlamydii, Toksoplazmy gondii, Dirofilaria imitis, pchły, lub patogenem bakteryjnym.
28. 28. Szczepionka według zastrz. 27, znamienna tym, że patogenem kocim jest koci wirus niedoboru odpornościowego (FIV), koci wirus białaczki (FeLV), koci wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej (FIP), koci wirus panleukopenii, koci kalcywirus, koci reowirus typu 3, koci rotawirus, koci koronawirus, koci wirus syncytialny, koci wirus mięsaka, koci wirus opryszczki, koci wirus choroby Borna lub pasożyt koci.
29. 29. Zastosowanie szczepionki określonej w zastrz. 26 albo 27, albo 28, do wytwarzania leku do indukowania odporności u kota.
30. 30. Zastosowanie szczepionki określonej w zastrz. 23 albo 24, albo 25, albo 26 albo 27, albo 28, do wytwarzania leku do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej u kota.
31. 31. Zastosowanie według zastrz. 29 albo 30, znamienne tym, że lek przeznaczony jest do podawania podskórnie, śródmięśniowo, układowo, miejscowo lub doustnie.
32. 32. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 20 do wytwarzania leku do tłumienia odpowiedzi immunologicznej u kota.
33. 33. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 21 do wytwarzania leku do tłumienia odpowiedzi immunologicznej u kota.
34. 34. Zastosowanie według zastrz. 32 albo 33, znamienne tym, że lek przeznaczony jest do podawania w ilości od około 0,25 mg/kg masy ciała/dzień do około 25 mg/kg masy ciała/dzień.
35. 35. Zastosowanie według zastrz. 32 albo 33, znamienne tym, że kot cierpi na chorobę autoimmunologiczną lub jest biorcą przeszczepu tkanki lub organu.