PL199644B1 - Zastosowanie frakcji białkowej z młóta browarnianego oraz podłoże mikrobiologiczne - Google Patents

Abstract

Ujawniono zastosowanie frakcji bialkowej z m lóta browarnianego jako g lównego sk ladnika no- wego pod lo za mikrobiologicznego. Opisywana frakcja bia lkowa jest produktem ubocznym w procesie warzenia piwa. Proponowane pod lo ze mikrobiologiczne daje si e doskonale stosowa c do hodowli Gram-dodatnich bakterii glebowych z rz edu promieniowców (Actinomycetes), a szczególnie gatunków Streptomyces. Stosowany roztwór ekstraktu frakcji bia lkowej (PFE) jest niezwykle ekonomiczny i po- zwala uzyskiwa c hodowle bakterii wytwarzaj ace metabolity wtórne. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowanie frakcji białkowej z młóta browarnianego jako głównego składnika nowego podłoża mikrobiologicznego. Opisywana frakcja białkowa jest produktem ubocznym w procesie warzenia piwa. Proponowane podłoże mikrobiologiczne daje się doskonale stosować do hodowli Gram-dodatnich bakterii glebowych z rzędu promieniowców (Actinomycetes) a szczególnie gatunków Streptomyces. Stosowany roztwór ekstraktu frakcji białkowej (PFE) jest niezwykle ekonomiczny i pozwala uzyskiwać hodowle bakterii wytwarzające metabolity wtórne.

W praktyce mikrobiologicznej poza dobrze zdefiniowanymi podłożami hodowlanymi stosuje się wiele podłoży opartych o składniki pochodzące z odpadów produkcyjnych przemysłu spożywczego. Jednym z produktów ubocznych powstających w procesie produkcji piwa jest przefermentowane ziarno jęczmienne. Produkt ten stanowi duży problem utylizacyjny.

W procesie fermentacji piwa (fig. 1) brzeczkę niechmieloną przygotowuje się z suszonego sł odu w procesie zacierania. Do suszonego sł odu dodawana jest woda i powoli zwię kszana temperatura, następuje enzymatyczna hydroliza węglowodanów i białek. Następnie po zakończonej hydrolizie brzeczka jest oddzielana od osadu w procesie filtrowania, uzyskana brzeczka jest przedmiotem dalszych procesów prowadzących do uzyskana piwa. Osad nazywany młótem browarnianym (spent grain SG) stanowi odpad produkcyjny. W wyniku mielenia młóta i frakcjonowania uzyskuje się trzy frakcje: frakcje grubą (fiber fraction FF, frakcja włókien) o dużej zawartości włókien, frakcje średnią i frakcje drobną zawierającą dużo białka (protein fraction PF, w dalszej części pracy opisywana jako frakcja białkowa) (Ishiwaki i współpr. 2000). Młóto składa się głównie z części owocni i łupin ziarna jęczmienia, zawiera odpowiednio 28% białka, 17% lipidów, i 55% włókien (Hassona 1993). Młóto browarniane stosuje się powszechnie jako dodatek do pasz przeżuwaczy oraz dodatek w piekarnictwie. Frakcje białkową stosuje się również jako środek poprawiający właściwości śmietan i sosów.

Typowe poszukiwania mikroorganizmów użytecznych przemysłowo są prowadzone w procesie testowania właściwości próbek ziemi pochodzących z różnych niszy ekologicznych. Bakterie rodzaju Streptomyces są niezwykle bogatym źródłem związków aktywnych biologicznie. Tylko kilka podłoży jest proponowanych w literaturze do wzrostu Streptomyces (Kieser i współpr. 2000). Dla poprawienia właściwości selekcyjnego wzrostu Actinomycetes proponowano stosowanie takich substancji jak L-arginina (El-Nkeeb, Lechevalier 1963) kwasy huminowe (Hayakawa, Nonomura 1987) i trojmetyloprim z kwasem nalidiksowym (Hayakawa i wspó ł pr. 1996).

Celem wynalazku jest zaproponowanie sposobu utylizacji odpadów browarnianych, zwłaszcza młóta browarnianego. Kolejnym celem wynalazku jest zaproponowanie nowej pożywki hodowlanej dla mikroorganizmów, zwłaszcza pożywki selekcyjnej dla hodowli bakterii i rodzaju Actinomycetes i pokrewnych, która byłaby łatwo dostępna oraz zapewniała dostatecznie wysoki poziom produkcji metabolitów wtórnych.

Nieoczekiwanie powyżej opisane problemy zostały rozwiązane dzięki niniejszemu wynalazkowi. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie frakcji białkowej z młóta browarnianego do wytwarzania podłoża mikrobiologicznego. W korzystnej realizacji wynalazku wytwarzane podłoże mikrobiologiczne stosuje się do hodowli Gram-dodatnich bakterii glebowych z rzędu promieniowców (Actinomycetes). Wytwarzane podłoże mikrobiologiczne może być stosowane zgodnie z wynalazkiem do hodowli gatunków Streptomyces. Korzystnie, wytwarzane podłoże zawiera 2% roztwór ekstraktu frakcji białkowej (PFE) młóta browarnianego. Wytwarzane podłoże może być wykorzystywane jako podłoże dla hodowli przemysłowych, korzystnie przemysłowej hodowli szczepów bakterii rodzaju Streptomyces, zwłaszcza w kontrolowanych warunkach pH i/lub jako podł o ż e do izolacji szczepów Actinomycetes ze ś rodowiska, korzystnie nowych szczepów Actinomycetes i/lub jako podłoże do sporulacji i/lub produkcji metabolitów wtórnych i/lub jako podłoże do poszukiwania nowych aktywnych biologicznie związków i/lub monitorowania zmian środowiskowych.

Przedmiotem wynalazku jest także podłoże mikrobiologiczne do hodowli Gram-dodatnich bakterii glebowych z rzędu promieniowców (Actinomycetes), charakteryzujące się tym, że zawiera frakcję białkową z młóta browarnianego. Korzystnie, podłoże według wynalazku zawiera 2% roztwór ekstraktu frakcji białkowej (PFE) i/lub posiada pH wynoszące od 6 do 8, korzystnie około 7, zwłaszcza 7,2. W korzystnej realizacji, podłoże według wynalazku jest podłożem stałym, które zawiera dodatek agaru, korzystnie w ilości około 2% w/v. W innej korzystnej realizacji, podłoże według wynalazku jest podłożem płynnym, które zawiera 20 mM Tris-HCl pH 7,2.

Ujawniono zastosowanie frakcji SG jako głównego składnika nowego ekonomicznego podłoża mikrobiologicznego, mającego zastosowanie do izolacji, hodowli i sporulacji bakterii rodzaju Streptomyces

PL 199 644 B1 i pokrewnych. Dla pełnego scharakteryzowania opisywanego podłoża zostały przeprowadzone testy: wzrostu różnych rodzajów bakterii; wytwarzania zarodników (sporulacji); wytwarzania metabolitów wtórnych; zbadano również tempo wzrostu hodowli płynnych.

Podłoże mikrobiologiczne PFE przygotowane z odpadów produkcyjnych w procesie warzenia piwa posiada cechy istotne dla zastosowań w biotechnologii. Może być stosowane jako tanie, ekonomiczne podłoże dla hodowli przemysłowych, podłoże do izolacji szczepów Actinomycetes ze środowiska, jako podłoże do sporulacji i produkcji metabolitów wtórnych. Ważną cechą podłoża PFE jest selektywna stymulacja wzrostu bakterii z gatunku Actinomycetes, ta cecha pozwala na identyfikacje dotychczas nieznanych szczepów izolowanych ze środowiska. Podłoże PFE jest tanim i łatwym w przygotowaniu produktem uzyskiwanym z odpadów, dlatego przy zastosowaniu kontrolowanych warunków pH może być stosowane na szeroką skalę w przemysłowej hodowli szczepów bakterii rodzaju Streptomyces. Możliwe jest stosowanie tego podłoża do poszukiwania nowych aktywnych biologicznie związków oraz monitorowania zmian środowiskowych.

Zaprezentowane figury stanowią uzupełnienie treści niniejszego opisu. Na fig. 1 zaprezentowano schemat procesu warzenia piwa i produkowania odpadów produkcyjnych. Na fig. 2 zaprezentowano obserwowane wytwarzanie zarodników przez szczep Streptomyces coelicolor na podłożu stałym PFE a) po 43 godzinach; b) po 72 godzinach. Na fig. 3 zaprezentowano obserwowane wytwarzanie undecylprodigiosyny przez szczep Streptomyces coelicolor na podłożu stałym PFE: a) po 43 godzinach; b) po 72 godzinach. Na fig. 4 zaprezentowano obserwowane wytwarzanie aktynorodyny przez szczep Streptomyces coelicolor na podłożu stałym PFE: a) po 43 godzinach; b) po 72 godzinach. Na fig. 5 zaprezentowano krzywe wzrostu Streptomyces coelicolor i ilości barwnych metabolitów produkowanych w pł ynnej hodowli: a) wzrost na podł o ż u minimalnym SMM; b) wzrost na podł o żu PFE.

W niniejszym opisie zastosowano nastę pują ce skróty: BSG (od ang. brewers' spent grain) oznacza młóto browarniane (przefermentowane ziarno jęczmienne), FF (od ang. fibre fraction) oznacza frakcję włókien, PF (od ang. protein fraction) oznacza frakcję białkową, PFE (od ang. protein fraction extract) oznacza frakcję ekstraktu białkowego, SMM (od ang. supplemented minimal medium) oznacza wbogacone podłoże minimalne.

P r z y k ł a d 1

Przygotowanie podłoża PFE (Protein Fraction Extract)

Podłoże było przygotowywane jak następuje: dwa gramy suchej frakcji białkowej (PF) z młóta browarnianego dodawano do 100 ml wody destylowanej i autoklawowano przez 30 min w 121°C. Schłodzony roztwór sączono przez bibułę Whatman #1. Następnie po usunięciu części stałych roztwór doprowadzano do pH 7,2 1 M NaOH i ponownie autoklawowano przez 25 min. Podłoże stałe zawierało dodatek agaru (2% w/v). Podłoże płynne zawierało 20 mM Tris-HCl pH 7,2.

P r z y k ł a d 2

Wykorzystanie podłoża PFE do hodowli różnych mikroorganizmów

W celu uzyskania charakterystyki podłoża PFE zbadano jego przydatność w hodowli różnorodnych mikroorganizmów, zwłaszcza promieniowców.

Materiały

Frakcja białkowa (PF) i frakcja włókien (FF) z młóta pochodziła od dr. Bo Lofquist, BoMill AB, Sweden. Szesnaście szczepów Actinomycetes i sześć innych szczepów było hodowanych na podłożu PFE. Szczep Streptomyces coelicolor A3(2) M145 (SCP1^_ SCP2^_) (Kieser et al., 2000), został otrzymany od H. Kieser (Norwich, UK). Następujące szczepy pochodzące z Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) zostały użyte w eksperymentach: Nocardia asteroides PCM 2254^T, Nocardia otitidiscaviarum PCM 2143, Rhodococcus equi PCM 559^T, Rhodococcus erythropolis PCM 2150, Rhodococcus rhodochrous PCM 909, Gordonia bronchialis PCM 2167^T, Dietzia maris PCM 2292, Streptomyces griseus PCM 2448, Streptomyces albus PCM 2319, Streptomyces flavoscleroticus PCM 2303, Streptomyces exfoliatus PCM 2367, Nocardiopsis dassonvillei PCM 2492, Nocardiopsis alborubida PCM 2490, Citrobacter freundii PCM 2346, Salmonella enterica subsp. salamae ser. Erlangen PCM 2533, Shigella flexneri PCM 1793, Pseudomonas aeruginosa PCM 2058, Staphylococcus aureus PCM 2101.

Metody

Wyznaczanie krzywych wzrostu Streptomyces coelicolor

Wzrost S. coelicolor A3(2) był, prowadzony w dwu podłożach: Suplemented minimal medium (SMM) (Kieser i współpr. 2000, z modyfikacjami dr. E. Takano przekazanymi osobiście) i podłożu PFE. W obu przypadkach hodowle prowadzono w zlewkach 250 ml ze sprężynami napowietrzającymi. Zlewki i sprężyny

PL 199 644 B1 były pokrywane silikonem. 50 ml podłoża było zaszczepianych 5x10⁶ zarodników. Hodowle były prowadzone w temp. 28°C, w wytrząsarce przy 220 rpm/min przez 48 godzin.

Stężenia antybiotyków były sprawdzane jak następuje: stężenie aktynorodyny było badane w pożywce, 0,75 ml pożywki było dodawane do 0,75 ml 2 M KOH, mieszane i po 30 minutach wirowane (10 min, 20000 g). Następnie mierzono absorbancję przy 633 nm i obliczano stężenie aktynorodyny stosując współczynnik molowy ε-25320. Do oznaczenia stężenia undecyloprodigiozyny pobierano 10 ml hodowli którą wirowano (3000 g, 10 min), następnie komórki poddawano ekstrakcji 1 ml metanolu przez 24 godziny delikatnie mieszając. Ekstrakt był zakwaszany 1 ml 0,5 M HCl, wirowany i mierzono absorbancję supernatanty przy 530 nm, stężenie undecyloprodigiozyny wyliczano stosując współczynnik molowy ε=100500.

Test wytwarzania metabolitów wtórnych przez S. coelicolor

Zostały przygotowane dwa zestawy płytek: 2% PFE i standardowe podłoże BHI (Difco). Na płytki wysiewano zarodniki S. coelicolor w ilościach od 1x10¹ do 1x10⁸. Wytwarzanie barwnych metabolitów wtórnych było obserwowane prze siedem kolejnych dni. Wzrost prowadzono w temperaturze 28°C. Wytwarzanie metabolitów oceniano w skali 0-3 na podstawie obserwacji.

Przygotowanie próbek ziemi

Próbki ziemi pobierane były w mieście Lund i okolicach. Jeden gram każdej próbki ziemi był suszony ciepłym powietrzem w 40°C przez 24 godziny. Następnie próbka była przenoszona do sterylnej probówki i mieszano przez 5 min intensywnie z 3 ml sterylnej wody destylowanej. Z każdego roztworu μΐ było wysiewnych na podłoże stałe PFE, i inkubowane w 37°C przez 7 dni. Wzrost bakterii był badany przez obserwacje mikroskopowe, obserwacje okiem nieuzbrojonym, wytwarzanie barwników, i wytwarzanie zarodników.

Testy szczepów kolekcyjnych

Wzrost szczepów pochodzących z kolekcji prowadzono na podłożach BHI i PFE, w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Bakterie Gram-ujemne były również hodowane na podłożu stałym MacConkey w 37°C przez 24 godziny.

Wyniki

Testowano podłoża przygotowane w oparciu o: młóto browarniane (spent grain SG); frakcję włókien młóta (FF); frakcję białkową (PF) (tabela 1).

T a b e l a 1

Wzrost mikroorganizmów pochodzących z trzech różnych próbek gleby na podłożach przygotowanych w oparciu różne frakcje młóta.

Podłoże zawiera	Próbka ziemi	Kategoria mikroorganizmów (%)
Szczepu sporalujące	Szczepy niesporulujące	Grzyby
SG 2% - 6%	A	30	70	0
K	30	70	0
M	20	40	40
FF 2% - 6%	A	10	30	60
K	25	40	35
M	25	15	60
PF 2% - 4%	A	80	20	0
K	90	10	0
M	90	5	5

Próbki pobrane z trzech różnych miejsc zostały oznaczone jako A, K i M, SG - młóto browarniane (brewers' spent grains) PF - frakcja białkowa młóta (protein fraction), FF - frakcja włókien (fibre fraction). Liczbę koloni poszczególnych mikroorganizmów znalezionych na płytkach wyrażono w procentach.

Podłoże przygotowane z młóta promowało wzrost bakterii, podłoże z frakcji włókien faworyzowało wzrost grzybów. Frakcja włókien zawiera głownie celulozę, a grzyby są znanymi producentami celulaz. Podłoże przygotowane z frakcji białkowej okazało się selektywne względem bakterii Streptomyces i innych bakterii rodzaju Actinomycetales. Z wyjątkiem dwu szczepów Nocardiopsis: szczepu N. dassonvillei i N. alborubida które są szczepami podobnymi do Nocardia należącymi do rzędu ActinomycePL 199 644 B1 tes wszystkie badane szczepy rosły na stałym podłożu PFE. Szczepy Streptomyces rosnąc na podłożu PFE wytwarzały zarodniki po takim samym czasie co przy wzroście na bogatym organicznym podłożu BHI. Zaobserwowano słaby wzrost wybranych szczepów innych badanych bakterii gram dodatnich i gram ujemnych na podłożu PFE (tabela 2).

T a b e l a 2

Hodowle szczepów rosnących na 2% (w/v) podłożu PFE

Actinomycetes i szczepy pokrewne	Inne szczepy
Nocardia asteroides PCM 2254T Nocardia brasiliensis Nocardia otitidiscayiarum PCM 2143	Gram-ujemne: Citrobacter freundii PCM 2346 Salmonella enterica subsp. salamae ser. Erlangen PCM 2533
Rhodococcus equi PCM 559T Rhodococcus erythropolis PCM 2150 Rhodococcus rhodochrous PCM 909	Shigella flexneri PCM 1793 Pseudomonas aeruginosa PCM 2058
Gordonia bronchialis PCM 2167T	Gram-dodamie: Staphylococcus aureus PCM 2101
Dietzia maris PCM 2292
Streptomyces griseus PCM 2448 Streptomyces albus PCM 2319 Streptomyces flavoscleroticus PCM 2303 Streptomyces exfoliatus PCM 2367
Coryneform clinical isolate CI

Wzrost organizmów nie należących do rodzaju Actinomycetes był słabszy na podłożu stałym PFE niż na podłożu stałym BHI. Ponieważ ziemia i podobne nisze ekologiczne są zdominowane przez szczepy Streptomyces oraz organizmy pokrewne podłoże PFE okazało się dobre do selekcji szczepów produkujących nowe nieznane aktywne biologicznie substancje. Badanie dalszych cech wzrostu na podłożu PFE prowadzono posługując się szczepem modelowym dla rodzaju Streptomyces, Streptomyces coelicolor A3(2). Szczep S. coelicolor stanowi przedmiot wielu badań i jest dobrze scharakteryzowanym szczepem Streptomyces (Kieser i współpr. 2000). Dla porównania w testach stosowano bogate organiczne podłoże BHI i płynne podłoże minimalne SMM.

Jednym z głównych problemów hodowli szczepów Streptomyces w warunkach przemysłowych jest uzyskanie powtarzalnych warunków wzrostu prowadzących do sporulacji. Na przebieg wzrostu i sporulacji Streptomyces kluczowy wpływ ma skład podłoża. Na podłoża PFE i BHI wysiewaliśmy zarodniki szczepu S. coelicolor A3(2) w różnych stężeniach. Na podłożu PFE kolonie wytworzyły zarodniki początkowo białe później zabarwione barwnikiem poliketydowym na szaro (fig. 2a i 2b). Na podłożu BHI Streptomyces nie wytwarzały zarodników.

Badano wytwarzanie dwóch barwnych związków poliketydowych aktynorodyny i undecyloprodigiozyny (Ishizuka i współpr 1992) będących jednocześnie związkami o aktywności antybiotycznej. Jak przedstawiono na fig.3a aktynorodyna, ciemno niebieski barwnik pojawił się wokół koloni po 72 godzinach wzrostu na płytkach gdzie wysiano zarodniki w ilościach od 10¹ do 10⁴. Po 5 dniach wszystkie hodowle S. coelicolor na podłożu PFE były zabarwione na granatowo. W grupie kontrolnej na podłożu BHI nie obserwowano wytwarzania aktynorodyny.

Czerwony barwnik undecyloprodigiozyna jest w rzeczywistości mieszaniną undecyloprodigiozyny, butylocykloheptyloprodigiozyny i meta-cykloprodigiozyny (Tsao i współpr. 1985). Wytwarzanie undecyloprodigiozyny było obserwowane tylko w grupie kontrolnej na podłożu BHI. Komórki wytwarzały barwnik już po 43 godzinach hodowli (fig. 4a i 4b). Brak wytwarzania undecyloprodigiozyny przez komórki na podłożu PFE może wynikać z gwałtownego tempa wzrostu koloni lub obecności albo braku specyficznych składników podłoża. Znany jest wpływ różnorodnych czynników występujących w podłożu na syntezę metabolitów wtórnych (Kang i współpr. 1998).

PL 199 644 B1

Użyteczność podłoża PFE do stosowania w przemysłowych hodowlach płynnych została zbadana przez porównanie krzywych wzrostu oraz wytwarzania barwnych metabolitów przez szczep S. coelicolor, porównywano wzrost na podłożu PFE i wystandaryzowanym podłożu minimalnym (SMM) (fig. 5a i 5b).

W czasie wzrostu S. coelicolor na podłożu płynnym PFE zaobserwowano znaczny wzrost zakwaszenia podłoża, co mogło być powodem zahamowania wzrostu i spadku masy komórek (fig. 5b). Wzrost zakwaszenia może być spowodowany wydzielaniem do podłoża specyficznych proteaz serynowych, które hydrolizują prolaminy. Donoszono o wydzielaniu proteaz serynowych przez gatunek Streptomyces griseus. Opisane proteazy znalazły zastosowanie przy sekwencjonowaniu białek i ekspresji białek fuzyjnych (Svendsen i współpr. 1991). Można przypuszczać, że opisywane podłoże będzie przydatne w poszukiwaniu mikroorganizmów wydzielających podobne proteazy.

Bakterie Streptomyces wykazują niezwykła zdolność do spontanicznego powielania pewnych fragmentów DNA. Ta właściwość jest wykorzystywania do molekularnego monitorowania zanieczyszczeń gleby. Poziom ekspresji i występowanie genu markerowego umieszczonego w chromosomie Streptomyces violaceoruber i wprowadzonego do badanego środowiska jest wyznacznikiem zanieczyszczenia. (Wellington i współpr. 1990, Cresswell i współpr. 1991). Wymaganie stawiane podłożom w tych badaniach są doskonale spełniane przez medium PFE, które pozwala na selekcyjny wzrost bakterii Streptomyces i szybką izolację DNA.

Praca została sfinansowana w ramach grantu KBN numer 4PO5A 073 19, oraz przez Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN w ramach działalności statutowej.

Literatura

Cresswell N., Saunders V.A, Wellington E.M.H (1991) Detection and quantification of Streptomyces violaceolatous plasmid DNA in soil. Lett.Appl. Microbiol. 13, 193-197.

Cooper D.J., Stewart G.G., Bryce J.H., 1998. Hydrophobic polypeptide extraction during high gravity mashing - experimental approaches for its improvement. J. Inst. Brewing 104, 283-287.

El-Nakeeb, M.A., Lechevalier, H.A., 1963. Selective isolation of aerobic Actinomycetes. Appl. Microbiol. 11, 75-77.

Hassona H.Z., 1993. High fibre bread containing brewer's spent grains and its effect on lipid metabolism in rats. Nahrung, 37, 576-582.

Hayakawa, M. & Nonomura, H., 1987. Efficacy of artificial humic acid as a selective nutrient in HV agar used for the isolation of soil actinomycetes. J. Ferment. Technol. 65, 609-616.

Hayakawa M.; Takeuchi T., Yamazaki T., 1996. Combined use of trimethoprim with nalidixic acid for the selective isolation and enumeration of actinomycetes from soil. Actinomycetologica, 10, 80-90.

Kang S.G., Jin W., Bibb M., Lee KJ. (1998) Actinorhodin and undecylprodigiosin production in wild-type and relA mutant strains of Streptomyces coelicolor A3(2) grown in continuous culture. FEMS Microbiol Lett, 168, 221-226.

Kieser T., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F, Hopwood D.A., (2000). Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation, Norwich, UK.

Lasztity R. The chemistry of Cereal proteins. In: Libry in Congress cataloging in Publication data), Barley Proteins, pp. 117-126, CRC Press, 1984.

Ishiwaki, N., Murayama, H., Awayama, H., Kanauchi, O., Sato, T. 2000. Development of high value uses of spent grain by fractionation technology. Tech. Q. - Master Brew. Assoc. Am. 37, 261-265.

Ishizuka H, Horinouchi S, Kieser HM, Hopwood DA, Beppu T (1992) A putative twocomponent regulatory system involved in secondary metabolism in Streptomyces spp. J. Bacteriol, 174, 7585-759.

Svendsen I; Jensen M R; Breddam K (1991) The primary structure of the glutamic acidspecific protease of Streptomyces griseus. FEBS LETTERS 292,165-7.

Szwajcer Dey E., Rasmussen J., Breddam K. (1992) Proline specific endopeptidases from microbial sources: isolation of an enzyme from Xanthomonas sp. J. Bacteriol. 174, 2454-2459.

Tsao S.W., Rudd B.A., He X.G., Chang C.J., Floss H.G., (1985). Identification of a red pigment from Streptomyces coelicolor A3(2) as a mixture of prodigiosin derivatives. J. Antibiot (Tokyo), 38, 128-131.

Tuomi T., Heino, M., Rosenqvist H., Nordstrom K., Laakso S. (2001). Fiber fractions from processing of barley in production and conservation of a biologie control agent. Appl. Biochem. Biotechnol. 94, 135-145.

Wellington E.M.H, Cresswell N. and Saunders V.A. (1990) Growth and survival of streptomycete inoculants and the extent of plasmid transfer in sterile and non-sterile soil. Appl. Environ. Microbiol. 56, 1413-1419.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie frakcji białkowej z młóta browarnianego do wytwarzania podłoża mikrobiologicznego do hodowli Gram-dodatnich bakterii glebowych z rzędu promieniowców (Actinomycetes), przy czym wytwarzane podłoże zawiera 2% roztwór ekstraktu frakcji białkowej (PFE) młóta browarnianego.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wytwarzane podłoże jest wykorzystywane jako podłoże dla hodowli przemysłowych, korzystnie przemysłowej hodowli szczepów bakterii rodzaju Streptomyces, zwłaszcza w kontrolowanych warunkach pH.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wytwarzane podłoże jest wykorzystywane jako podłoże do izolacji szczepów Actinomycetes ze środowiska, korzystnie nowych szczepów Actinomycetes.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wytwarzane podłoże jest wykorzystywane jako podłoże do sporulacji i/lub produkcji metabolitów wtórnych.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wytwarzane podłoże jest wykorzystywane jako podłoże do poszukiwania nowych aktywnych biologicznie związków i/lub monitorowania zmian środowiskowych.
6. 6. Podłoże mikrobiologiczne do hodowli Gram-dodatnich bakterii glebowych z rzędu promieniowców (Actinomycetes), znamienne tym, że zawiera 2% roztwór ekstraktu frakcji białkowej z młóta browarnianego.
7. 7. Podłoże według zastrz. 6, znamienne tym, że posiada pH wynoszące od 6 do 8, korzystnie około 7, zwłaszcza 7,2.
8. 8. Podłoże według zastrz. 6, znamienne tym, że jako podłoże stałe zawiera dodatek agaru, korzystnie w ilości około 2% w/v.
9. 9. Podłoże według zastrz. 6, znamienne tym, że jako podłoże płynne zawiera 20 mM Tris-HCl pH 7,2.