PL201183B1

PL201183B1 - Zastosowanie bakterii propionowych do optymalizacji wytwarzania kwasów w okrężnicy

Info

Publication number: PL201183B1
Application number: PL353020A
Authority: PL
Inventors: Edmond Daniel Roussel; Charles Gabriel Legrand; Marc Henri Legrand; Nathalie Roland; Dominique Bougle
Original assignee: Standa Lab Sa
Priority date: 1999-07-20
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2009-03-31
Also published as: CN1166371C; CN1371283A; BR0012681A; PT1194154E; EP1194154A1; AU765371B2; DE60018567D1; CA2379727C; WO2001005413A1; RU2225215C2; HK1047400A1; DE60018567T2; HK1047400B; KR20020072273A; EP1194154B1; FR2796554A1; JP2003504409A; DK1194154T3; CA2379727A1; ATE290392T1

Abstract

Wynalazek dotyczy zastosowania bakterii propionowych nale zacych do szczepów s labo autoli- tycznych oraz zdolnych do wytwarzania co najmniej 2 g/l kwasu propionowego i/lub propionianów do wytwarzania kompozycji spo zywczej lub kompozycji dietetycznej, lub kompozycji medycznej, absor- bowanej przez cz lowieka lub zwierz e, otrzymywanej w taki sposób, ze bakterie s a chronione co naj- mniej cz esciowo przed kwasami zo ladkowymi i zawieraj acej co najmniej 10 6 komórek/gram tych bak- terii zdolnych do istotnego zwi ekszenia syntezy kwasu propionowego i/lub propionianów oraz, w razie potrzeby, kwasu octowego i/lub octanów w okr eznicy poprzez bakteryjn a fermentacj e beztlenow a. PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 353020	(11) 201183 (13) B1
	(22) Data zgłoszenia: 19.07.2000	(51) Int.Cl. A61K 35/74 (2006.01)
•υΑ Υ	(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:	A61P 1/00 (2006.01)
'F’	19.07.2000, PCT/FR00/02072	A23L 1/308 (2006.01)
Urząd Patentowy	(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
Rzeczypospolitej Polskiej	25.01.2001, WO01/05413 PCT Gazette nr 04/01

Zastosowanie bakterii propionowych do optymalizacji wytwarzania kwasów w okrężnicy (73) Uprawniony z patentu:

LABORATOIRES STANDA S.A.,Caen Cedex,FR (30) Pierwszeństwo:

20.07.1999,FR,9909385 (72) Twórca(y) wynalazku:

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

06.10.2003 BUP 20/03 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

Edmond Daniel Roussel,Avenay,FR Charles Gabriel Legrand,Caen,FR Marc Henri Legrand,Caen,FR

Nathalie Roland,Rennes,FR

Dominique Bougle,Caen,FR

31.03.2009 WUP 03/09 (74) Pełnomocnik:

Marta Kawczyńska, POLSERVICE,

Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o.

⁽⁵⁷⁾ Wynalazek dotyczy zastosowania bakterii propionowych należących do szczepów słabo autolitycznych oraz zdolnych do wytwarzania co najmniej 2 g/l kwasu propionowego i/lub propionianów do wytwarzania kompozycji spożywczej lub kompozycji dietetycznej, lub kompozycji medycznej, absorbowanej przez człowieka lub zwierzę, otrzymywanej w taki sposób, że bakterie są chronione co najmniej częściowo przed kwasami żołądkowymi i zawierającej co najmniej 10⁶ komórek/gram tych bakterii zdolnych do istotnego zwiększenia syntezy kwasu propionowego i/lub propionianów oraz, w razie potrzeby, kwasu octowego i/lub octanów w okrężnicy poprzez bakteryjną fermentację beztlenową.

PL 201 183 B1

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania bakterii propionowych do wytwarzania kompozycji spożywczej, dietetycznej lub medycznej, do optymalizacji wytwarzania kwasu propionowego i/lub propionianów oraz kwasu octowego i/lub octanów w okrężnicy.

Od wielu lat dietetycy doradzają swoim pacjentom spożywanie żywności bogatej w błonnik, któremu przypisuje się korzystne dla zdrowia efekty fizjologiczne i metaboliczne.

Wiadomo, że włókna błonnika są odporne na trawienie enzymatyczne w jelicie cienkim i ulegają degradacji oraz asymilacji dopiero na poziomie okrężnicy, to znaczy w części końcowej jelita. Wspomniany korzystny wpływ błonnika ma zatem miejsce pod warunkiem, że degradacja i asymilacja jest możliwa w okrężnicy.

Można również stwierdzić, że te reakcje biologiczne są konsekwencją fermentacji beztlenowej zachodzącej pod wpływem mikroorganizmów w okrężnicy. Fermentacja prowadzi do powstania krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (AGCC), wodoru, dwutlenku węgla oraz biomasy.

Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe zasadniczo obejmują kwas octowy, propionowy oraz masłowy i w zdrowym organizmie mogą powstawać tylko w okrężnicy, ponieważ jest to jedyne miejsce w ciele czł owieka gdzie panują warunki ś ciś le beztlenowe pozwalają ce na fermentację stanowią c ą podstawę syntezy tego rodzaju kwasów. Wyjątek stanowi tutaj kwas octowy, którego niewielkie ilości mogą powstawać w wątrobie.

Różnego rodzaju badania udowodniły znaczenie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych dla zdrowia. Na podstawie literatury wiadomo, że te trzy krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe różnią się rolami - kwas octowy i propionowy są bezpośrednio transportowane do wątroby, gdzie całość kwasu propionowego ulega metabolizacji podczas, gdy część kwasu octowego jest następnie kierowana do różnych tkanek, zaś kwas masłowy jest specyficznie wykorzystywany w ścianie okrężnicy.

A zatem, synteza krótkołań cuchowych kwasów tł uszczowych wymaga z jednej strony substratu w postaci błonnika dostarczanego z pokarmem, zaś z drugiej strony, zrównoważonej i zaadaptowanej flory bakteryjnej obecnej w sposób stały i optymalny.

Tego rodzaju flora bakteryjna może pochodzić przykładowo ze stałej flory bakteryjnej każdego osobnika, czyli z pożywienia.

Wiadomo, że zawartość przewodu pokarmowego człowieka jest specyficzna dla każdego osobnika i odpowiada około 1 do 1,5 kg pokarmu poddawanego trawieniu, zawierającego istotną populację mikroorganizmów stanowiących mieszaninę licznych gatunków ocenianą w okrężnicy na od 10¹¹ do 10⁷ komórek na gram. Tego rodzaju populacja bakteryjna stanowi ciężar sama w sobie i nie może być w łatwy sposób zmodyfikowana w sposób radykalny oraz jest trwała wobec samego przepływu pożywienia.

Ponadto pokarm, który codziennie przyjmujemy nie jest nigdy sterylny i mniej lub bardziej obfituje w bakterie (mleko, produkty fermentacji mlecznej, sery, jabłecznik, wino, piwo, wędliny, etc). Modyfikacje flory pokarmowej wynikające z wchłonięcia tych bakterii są jedynie tymczasowe.

Należy tym samym zauważyć, że proponowano już próby modyfikacji populacji bakteryjnej przewodu pokarmowego poprzez podawanie a w szczególności swobodne przyjmowanie komórek bakteryjnych o korzystnym wpływie na zdrowie (zwanych probiotycznymi), a w szczególności bakterii mlekowych i bifidowych.

Wprowadzenie do organizmu ważnej populacji bakteryjnej, w szczególności na drodze pożywienia czy poprzez bezpośrednie przyjmowanie ma na celu ograniczenie rozwoju gatunków patogennych i gnilnych. Wiadomo, że flora endogenna obecna w okrężnicy składa się z różnych grup bakteryjnych, z których niektóre są niegroźne, a nawet korzystne, podczas gdy inne, a w szczególności te z rodzaju Clostridium oraz bakterie gnilne wytwarzają substancje toksyczne i negatywnie wpływają na zdrowie.

Podstawową ideą wynalazku jest regularne wprowadzanie do organizmu, na drodze doustnej, istotnej ilości probiotycznej flory bakteryjnej zdolnej do sprzyjania regularnej syntezie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych na poziomie jelitowym. Spośród gatunków bakteryjnych zdolnych do wykazania tego efektu, bakterie mlekowe nie nadają się ze względu na ich naturę - przede wszystkim produkują kwas mlekowy i jedynie drugorzędowo niewielkie ilości kwasu octowego oraz nie produkują kwasu propionowego ani masłowego.

Bakterie innego typu - bakterie propionowe, potrafią obficie produkować kwas propionowy i kwas octowy, dwa krótko ł a ń cuchowe kwasy tł uszczowe zasilają ce tkanki oraz produkować je w ilości

PL 201 183 B1

2/3 kwasu propionowego i 1/3 kwasu octowego. Tego rodzaju bakterie są obecne w żywności człowieka od stuleci, a w szczególności w serach twardych podpuszczkowych i są dodatkowo lepiej przystosowane niż bakterie mlekowe, ponieważ są aktywne w okrężnicy gdzie panuje środowisko całkowicie beztlenowe oraz są bardziej odporne na procesy technologiczne niż bakterie mlekowe i bifidowe.

Warto również zauważyć, że zaproponowano przyjmowanie bakterii propionowych, w szczególności do stymulacji rozwoju bakterii bifidowych w jelicie (dokument WO-97/19689) lub celem usunięcia tlenku azotu z przewodu pokarmowego człowieka lub zwierzęcia (dokument WO-98/27991). Do chwili obecnej nie zaproponowano użycia tych bakterii celem produkcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w okrężnicy.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bakterii propionowych należących do szczepów słabo autolitycznych oraz zdolnych do wytwarzania co najmniej 2 g/l kwasu propionowego i/lub propionianów, a zwłaszcza ponad 4 g/l kwasu propionowego i/lub propionianów, hodowanych w 30°C, w podło żu YEL zawierają cym 11,4 g/l mleczanu przez 2 do 3 dni, a następnie rozcieńczonych 1/10 w podło żu YEL zawierają cym 0,6% ż ółci bydlę cej i inkubowanych w 37°C przez 90 min., wirowanych, zawieszonych ponownie w podłożu YEL i poddanych ponownie inkubacji w 37°C przez 24 godziny, do wytwarzania kompozycji spożywczej lub kompozycji dietetycznej, lub kompozycji medycznej, absorbowanej przez człowieka lub zwierzę, otrzymywanej w taki sposób, że bakterie są chronione co najmniej częściowo przed kwasami żołądkowymi i zawierającej co najmniej 10⁶ komórek/gram tych bakterii zdolnych do istotnego zwiększenia syntezy kwasu propionowego i/lub propionianów oraz, w razie potrzeby, kwasu octowego i/lub octanów w okrężnicy poprzez bakteryjną fermentację beztlenową.

Korzystnie przeznaczone jest do wytwarzania kompozycji do ułatwiania przyswajania substancji mineralnych, a zwłaszcza wapnia i/lub żelaza i/lub cynku i/lub magnezu w okrężnicy.

Korzystnie wytwarzana kompozycja wykazuje właściwości anty-grzybiczne w okrężnicy, a zwłaszcza posiada zdolność do redukowania rozwoju grzybów patogennych typu drożdżaki/pleśnie.

Korzystnie bakterie propionowe należą do szczepów wykazujących właściwości adhezyjne do komórek okrężnicy.

Korzystnie wytwarzana kompozycja składa się z preparatu suchego lub uwodnionego w postaci indywidualnych, frakcji od 100 mg do 1 g, a zwłaszcza od 200 do 500 mg, zawierających co najmniej 10 komórek.

Korzystniej wytwarzana kompozycja ma postać kapsułek żelatynowych lub kapsułek odpornych na działanie kwasów żołądkowych.

Korzystnie wytwarzana kompozycja składa się z preparatu bakterii propionowych dodanych lub połączonych z fermentowalnym substratem, a zwłaszcza błonnikiem spożywczym.

Korzystnie wytwarzana kompozycja składa się z preparatu bakterii propionowych dodanych lub wprowadzonych do pokarmu takiego jak pokarm płynny, pastowaty lub stały.

Korzystnie wytwarzana kompozycja zawiera bakterie kwasu mlekowego i/lub bakterie bifidowe.

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania bakterii propionowych wyselekcjonowanych pod względem ich właściwości słabo autolitycznych oraz ich odporności na sole żółciowe do wytwarzania prostej kompozycji spożywczej, dietetycznej, bądź medycznej, absorbowanej przez człowieka lub zwierzę. Jest ona tak opracowana, że bakterie są chronione co najmniej częściowo przed kwasami żołądkowymi oraz zawiera co najmniej 10⁶ komórek/gram bakterii zdolnych do zwiększenia w sposób znaczący syntezy kwasu propionowego i/lub propionianów oraz kwasu octowego i/lub octanów w okrężnicy dzięki bakteryjnej fermentacji beztlenowej.

Ponieważ tego rodzaju bakterie powinny wywierać korzystny wpływ, niezbędne jest wybranie szczepów w niewielkim stopniu autolitycznych, zdolnych bez szkody dotrzeć do okrężnicy, namnożyć się i produkować wystarczające ilości kwasu propionowego.

Jak wiadomo, istnieją dwa rodzaje stresu, któremu poddawane są przyjęte bakterie podczas przechodzenia przez górną cześć przewodu pokarmowego - z jednej strony kwasowość środowiska żołądka (pH 4 do 1) aż drugiej strony, obecność soli żółciowych w jelicie cienkim (rzędu maksimum 15 mmol/l na poziomie dwunastnicy).

Koniecznym było określenie, czy po ekspozycji na kwasy żołądkowe bakterie są uwrażliwione i w konsekwencji niezdolne do odporności na sole żółciowe, a tym samym czy są żywe po opuszczeniu żołądka.

PL 201 183 B1

Następnie, zgodnie z wynalazkiem, konieczne było poddanie bakterii propionowych naturalnemu działaniu umożliwiającemu zwalczenie stresu gastrycznego odpowiadającego ogólnej zasadzie enkapsulacji, dobrowolnej lub nie, przykładowo w przypadku pożywienia typu sery.

Tego rodzaju sytuacja jest możliwa dzięki testowi oceniającemu wpływ kwaśnego pH i soli żółciowych, razem lub osobno, na żywotność dwóch szczepów bakterii propionowo-mlekowych należących do kolekcji TL w LRTL (Laboratoire de Recherches de Technologie laitiere - INRA de Rennes), to jest szczepów TL 162 i TL 24 należących do gatunku P. freudenreichii subsp shezTuanii.

Wyniki testów opisano poniżej. Bakterie hodowano w 30°C na podłożu YEL przez 2 dni (początek fazy stacjonarnej). Gęstość optyczna (OD) przy 650 nm wynosiła odpowiednio, 2,28 i 2,64 dla TL 162 i TL 24.

- stres kwasowy

Hodowle rozcieńczano do 1/10 w podłożu S (trypton-mleczan) o pH 2,5 (pH końcowe 3,0). Po inkubacji w 37°C przez 45 min, hodowle wirowano a bakterie zawieszano w tej samej objętości YEL. Komórki liczono przed końcem pierwszej inkubacji a wznowienie podziału mierzono poprzez badanie OD przez 5 dni w 37°C.

- stres żó ł ciowy

Początkowe hodowle wirowano, a komórki zawieszano w 10 razy większej objętości YEL zawierającego 0,3 % żółci bydlęcej (-50 % soli żółciowych). Po inkubacji w 37°C przez 90 min., hodowle wirowano a bakterie zawieszano w tej samej objętości YEL. Komórki liczono przed końcem pierwszej inkubacji a wznowienie podziału mierzono poprzez badanie OD przez 5 dni w 37°C.

- jednoczesny stres kwasowy i ż ó ł ciowy

Komórki poddawano stresowi kwasowemu jak opisano wcześniej, jednak przed wirowaniem, komórki zawieszano w YEL zawierającym 0,3% żółci. Po drugiej inkubacji w 37°C przez 90 min, hodowle wirowano a bakterie zawieszano w tej samej 30 objętości YEL. Komórki liczono przed końcem pierwszej inkubacji a wznowienie podziału mierzono poprzez badanie OD przez 5 dni w 37°C.

Otrzymane wyniki są przedstawione, częściowo, w tabeli 1 poniżej, przedstawiającej wpływ stresu kwasowego i/lub żółciowego na żywotność bakterii oraz, w pozostałej części, na figurze 1 stanowiącej schemat wznowienia podziału po zadziałaniu różnych stresów.

T a b e l a 1

	żywotność (cfu/ml)
Przed stresem	Po stresie kwasowym	Po stresie żółciowym
Sam stres	TL 162	3,0 x 10⁸	9,7 x 10⁶	/
kwasowy	TL 24	4,0 x 10⁸	1,0 x 10⁷	/
Sam stres	TL 162	3,0 x 10⁸	/	4,4 x 10⁸
żółciowy	TL 24	4,0 x 10⁸	/	4,7 x 10⁸
Stres	TL 162	3,0 x 10⁸	9,7 x 10⁶	2600
jednoczesny	TL 24	4,0 x 10⁸	1,0 x 10⁷	< 10

Stwierdzono, że:

- Kwasowość powoduje istotną śmiertelność bakterii (96,8% dla TL 162 i 97,5% dla TL 24), co tłumaczy długi okres opóźnienia przed wznowieniem wzrostu (Figura 1).

Żółć nie wywoływała żadnej śmiertelności bakterii a wzrost był bardzo szybko odzyskiwany.

Jeśli bakterie poddano działaniu żółci po uprzednim zadziałaniu kwasu, prowadziło to do niemal całkowitej śmiertelności bakterii. Ten nieoczekiwany wynik wskazuje, że bakterie poddane stresowi kwasowemu, które mimo wszystko pozostały żywe stają się całkowicie wrażliwe na żółć, pomimo iż bez wcześniejszego stresu kwasowego są całkowicie odporne na sole żółciowe.

Biorąc pod uwagę te sytuację, podjęto próbę preadaptacji celem zwiększenia odporności bakterii. Wiadomo, że stres pre-kwasowy (pH 4,5-5) wydajnie chroni komórki przed stresem kwasowym (pH 2). Wykonano trzy próby adaptacji dla TL 162:

- prestres kwasowy: wstępna inkubacja komórek w 37°C przez 30 min. w pH 5

- prestres żółciowy: inkubacja przez 30 min. w obecności 0,08% żó łci

- prestres kwasowy i ż ółciowy: inkubacja przez 30 min. w pH 5 i w obecności 0,08% żółci.

PL 201 183 B1

Zastosowano ten sam protokół co poprzednio i otrzymano wyniki przedstawione w tabeli 2 poniżej:

T a b e l a 2

	żywotność (cfu/ml)
Przed stresem	Po stresie jednoczesnym
bez preadaptacji	3 x 10⁸	2600
Preadaptacja kwasowa	3 x 10⁸	100
Preadaptacja żółciowa	3 x 10⁸	1400
Preadaptacja kwasowa i żółciowa	3 x 10⁸	< 100

Ustalono zatem, że preadaptacja kwasowa zwiększa wrażliwość komórek, a zatem preadaptacja żółciowa nie ma żadnego wpływu.

Wyniki te wskazują zatem na konieczność pokonania stresu w sposób jednoczesny, nie zaś oddzielny, jak pisano w większości badań wykonywanych w tym zakresie.

Tym samym, można założyć, że warunki in vivo są dla bakterii mniej drastyczne (efekt tamponu w ż ołądku, mniejszy efekt bakteriobójczy soli żółciowych w formie miceli z fosfolipidami).

Biorąc pod uwagę wcześniejsze doświadczenia, dla zwiększenia ilości żywych bakterii zwiększenie odporności na kwaśne pH nie ma znaczenia, ponieważ bakterie pozostają wrażliwe na wpływ soli żółciowych.

Jednak zabezpieczywszy bakterie przed stresem kwasowym oraz przyjmując je w postaci kapsułek odpornych na działanie soków trawiennych, możliwe jest znalezienie w kale bakterii w sposób naturalny odpornych na żółć o podniesionym poziomie żywotności.

Biorąc pod uwagę te wyniki, wykonano komplementarny test służący do porównania zdolności różnych szczepów bakterii propionowych do produkcji istotnych ilości kwasu propionowego po kontakcie z solami żółciowymi.

W teś cie, porównano 33 szczepy bakterii propionowo-mlekowych należących do kolekcji TL w LRTL (INRA de 20 Rennes) pod wzglę dem ich zdolnoś ci do przeż ycia w obecnoś ci ż ó łci oraz pod względem produkcji kwasu propionowego:

- 20 szczepów należących do gatunku P. freudenreichii subsp shermanii.

- 6 szczepów nale żących do gatunku P. freudenreichii subsp freudenreichii

- 7 szczepów nale żących do gatunku P. acidipropionici.

Protokół eksperymentu był następujący: Hodowle na początku fazy stacjonarnej (2 do 3 dni hodowli w podłożu YEL inkubowanym w 30°C) zostały rozcieńczone 1/10 w podłożu YEL zawierającym 0,6% żółci bydlęcej (około 7-8 mmol soli żółciowych). Stężenie żółci wybrano tak, aby wybrać jak najlepsze szczepy oraz ustanowić szczepy odporne na sole żółciowe w stopniu przypominającym komórki znajdowane w dwunastnicy.

Rozcieńczenia inkubowano w 37°C i przez 90 min., a następnie wirowano. Bakterie zawieszano w podło ż u YEL (obję tość począ tkowa) i kontynuowano inkubacj ę w 37°C.

Po 24 h inkubacji, mierzono OD przy 650 nm celem pomiaru wznowienia wzrostu. Zbierano supernatant i mrożono celem pomiaru kwasów tłuszczowych.

Dla niektórych szczepów, powtarzano doświadczenie celem potwierdzenia wyników.

Wartości gęstości optycznej przy 650 nm przed stresem żółciowym i 24 h po zakończeniu stresu zostały podane w tabeli 3 poniżej:

T a b e l a 3

szczepy :	OD przed stresem żółciowym (OD początkowa/10)	w 24 h inkubacji po stresie żółciowym	% OD w 24 h/OD początkowa
1	2	3	4
P - shermanii TL 125	0,32	2,02	63
TL 134	0,29 - 0,26	2,60 - 2,04	90 - 78
TL 144	0,39	3,62	93
TL 146	0,27	1,56	58

PL 201 183 B1 cd. tabeli 3

1	2	3	4
TL 147	0,28	1,23	44
TL 148	0,23	0,04	2
TL 160	0,36 - 0,32	4,67 - 4,03	130 - 126
TL 167	0,26	1,05	40
TL 168	0,32	0,57	18
TL 4	0,32	0,29	9
TL 14	0,23	0,73	32
TL 17	0,29	0,55	19
TL 22	0,28	1,39	50
TL 24	0,28	1,65	59
TL 162	0,20	2,08	104
TL 34	0,26 - - 0,27	3,40 - 3,87	131 - 143
TL 50	0,26	2,05	79
TL 61	0,23	1,31	57
TL 63	0,27 - - 0,26	3,26 - 3,55	121 - 137
TL 40	0,30	1,46	49
P. freundenreichi TL 142	0,34 - - 0,31	2,95 - 2,80	87 - 90
TL 3	0,24	2,66	111
TL 19	0,30	2,66	89
TL 37	0,23	1,79	78
TL 33	0,26	2,38	92
TL 64	0,29	0,31	11
P. acidipropionici TL2	0,38	2,30	61
TL 9	0,34	2,29	67
TL 15	0,34	3,09	91
TL 54	0,34	1,39	41
TL 47	0,20	0,22	11
TL 223	0,29 - 0,38	2,59 - 2,91	89 - 77
TL 249	0,44	3,40	77

Zauważono, że dla pewnych szczepów, OD końcowe jest wyższe od OD początkowego, co można wytłumaczyć poprzez wznowienie wzrostu w 37°C nie zaś w 30°C jak początkowo.

Na podstawie otrzymanych wyników, można schematycznie rozróżnić trzy grupy szczepów:

- szczepy charakteryzujące się szybkim wznowieniem wzrostu, wskazującym na niewielką śmiertelność komórek w wyniku działania żółci (między innymi, TL 34, TL 160, TL 63, TL 33, TL 15, TL 3, TL 162),

- szczepy w niewielkim stopniu odporne na żó łć, wykazują ce się bardzo niewielkim wznowieniem wzrostu lub brakiem wznowienia wzrostu (TL 148, TL 4, TL 64, TL 47), szczepy pośrednie, charakteryzujące się średnią śmiertelnością związaną z żółcią (TL 146, TL 147, TL 167, TL 168, TL 14, TL 17, TL 22, TL 24, TL 61, TL 40, TL 54). Jedynie szczepy mające stosunek [(OD po 24 h/OD

PL 201 183 B1 początkowa) x 100] wyższy o 60% (wartość wybrana arbitralnie) zostały wyselekcjonowane do pomiaru mleczanu, octanu i propionianu na drodze HPLC z zamrożonych supernatantów. Wartość początkowa mleczanu w podłożu YEL wynosiła 11,4 g/l.

Stężenia mleczanu, octanu i propionianu w zebranych supernatantach po 24 h inkubacji są zebrane w tabeli 4 poniżej.

T a b e l a 4

szczepy :	Wchłonięty mleczan	Produkcja octanu	Produkcja propionianu
(w g/l)
P. shermanii TL 125	5,6	0,6	2,4
TL 134	8,9 - 7,3	0,9 - 0,9	4,0 - 3,4
TL 144	8,8	1,1	4,6
TL 160	9,9 - 8,8	1,3 - 1,1	4,7 - 4,6
TL 162	5,3	0,6	2,3
TL 34	9,7 - 10,1	1,0 - 1,2	4,9 - 4,7
TL 50	6,6	0,6	3,7
TL 63	9,1 - 10,0	1,0 - 1,1	4,4 - 4,4
P. freundenreichi TL 142	8,1 - 8,2	0,9 - 0,9	4,5 - 4,0
TL 3	7,8	0,9	3,6
TL 19	6,6	0,7	3,7
TL 37	5,5	0, 6	2,5
TL 33	7,2	0,8	3,4
P. acidipropionici TL 2	2,7	0,4	1,5
TL 9	5,3	0,6	2,4
TL 15	3,7	0,4	2,0
TL 223	2,8 - 3,8	0,4 - 0,4	1,8 - 1,7
TL 249	5,2	0, 6	3,2

Tabela pokazuje w sposób łatwy do przewidzenia, że ilość powstającego propionianu koreluje ze stopniem zużycia mleczanu.

Ogólnie, szczepy należące do gatunku P. acidipropionici produkują w ciągu 24 h mniej kwasu propionowego niż szczepy z gatunku P. freundenreichii.

Ze względu na powyższe wyniki, pewne szczepy okazują się być najlepszymi kandydatami do produkcji propionianu po zadziałaniu żółci. Dotyczy to szczepów produkujących co najmniej 2 g/l propionianu w warunkach opisanych powyżej: TL 134, TL 50, TL 3, TL 19, TL 33, TL 249, a najkorzystniej powyżej 4 g/l propionianu : TL 160, TL 144, TL 34, TL 63, TL 142.

Dodatkowo, zrealizowano na zdrowych ochotnikach eksperyment mający na celu zweryfikowanie korzystnego wpływu kapsułek odpornych na działanie soków trawiennych na zwiększenie stopnia przeżycia w jelicie szczepu serowych bakterii propionowych przyjmowanych w postaci zliofilizowanej 10 (TL 162).

Eksperyment zrealizowano na 7 osobach, z 3 okresami leczenia po 4 tygodnie, rozdzielonymi

3-tygodniową przerwą.

Leczenie 1 polegało na przyjmowaniu przez 2 tygodnie 5 x 10⁹ cfu/dzień bakterii, zawartych w kapsułkach nieodpornych na działanie soków trawiennych.

Leczenie 2 polegało na przyjmowaniu przez 2 tygodnie 5 x 10¹⁰ cfu/dzień bakterii, zawartych w kapsułkach nieodpornych na działanie soków trawiennych.

Leczenie 3 polegało na przyjmowaniu przez 2 tygodnie 5 x 10⁹ cfu/dzień bakterii, zawartych w kapsuł kach odpornych na działanie soków trawiennych.

PL 201 183 B1

Dla każdego leczenia wykonano 4 lewatywy celem odnalezienia bakterii propionowych w kale przy pomocy podłoża selektywnego (Palpropiobac®, Standa-Industrie, z dodatkiem 4 mg/l metronidazolu). Daty lewatyw były następujące:

- S1 : tuż przed przyję ciem,

- S2 : 1 tydzień po rozpoczęciu przyjmowania,

- S3 : 2 tygodnie po rozpoczę ciu przyjmowania,

- S4 : 1 tydzień po zakoń czeniu okresu przyjmowania,

HP (dla okresu 3) : 3 tygodnie po zakończeniu okresu przyjmowania.

Podczas trwania całego eksperymentu ochotnicy nie mogli spożywać serów zawierających bakterie propionowe w znacznych ilościach (Emmental, Comte, Leer-dammer, Gruyeres Suisses,...), z wyją tkiem serów topionych

Tabela 5 pokazuje wyniki żywotności bakterii propionowych w kale.

Przy klasycznych kapsułkach, dawka 5 x 10⁹ cfu/dzień (okres 1) okazała się niewystarczająca dla stwierdzenia obecności żywych bakterii w wystarczających ilościach u wszystkich ochotników, jednak przy 10¹⁰ cfu/dzień (okres 2), u wszystkich ochotników stwierdzono w kale obecność ponad 5 log cfu/g bakterii propionowych w pierwszym tygodniu leczenia. Tym samym, maksymalne poziomy żywotności obserwowane przy pomiarach nie różnią się (~7 log).

Użycie kapsułek odpornych na działanie soków trawiennych (okres 3)poprawiło żywotność bakterii propionowych w kale, zwłaszcza u ochotników, u których zachowywała się niewielka ilość bakterii po pierwszym leczeniu (vol., 1, 2 i 6). W rzeczywistości, w porównaniu z okresem 2, otrzymane poziomy żywotności są podobne.

> na poziomie 5 x 10⁹ cfu/dzień, użycie kapsułek odpornych na działanie soków trawiennych jest usprawiedliwione dla pewnej liczby osobników (vol. 1, 2, 6), dla innych nie podnosi żywotności wcale lub niewiele (vol. 3/4 i 5), > kapsułki odporne na działanie soków trawiennych dają wyniki niemal jednakowe jak dla klasycznych kapsułek zawierających 5 x 10¹⁰ cfu.

Zmierzono AGCC w kale za pomocą chromatografii w fazie gazowej. Ilość propionianu w kale pokazano w tabeli 6. Do analizy statystycznej, porównano 2 grupy wartości 2 do 2: wartości odpowiadające próbkom kału gdzie nie wykryto bakterii propionowych (< 4 log), dla wszystkich połączonych sposobów leczenia i okresów oraz wartości odpowiadające próbkom kału gdzie wykryto bakterie propionowe w ilości co najmniej 6 log cfu/g. W pierwszym przypadku, średnia ilość propionianu wynosiła 5,06 ± 2,56 umol/g (n = 25) a w drugim przypadku, 7,19 + 3,18 umol/g (n = 30). Te dwie wartości są znacząco różne przy p < 0,02 (test Studenta). Dla pozostałych AGCC, nie wykryto znaczących różnic. Doświadczenie to wykazało zatem, że obecność znacznych ilości (> 6 log cfu/g) bakterii propionowych w okrężnicy wynikająca z przyjęcia TL 162 znacząco zwiększała ilość propionianu w kale. Chociaż szczep TL 162 nie był najlepszym kandydatem do optymalizacji produkcji kwasu propionowego w okrężnicy (kryteria selekcji in vitro), jest moż liwe, ż e wyniki mogły ulec poprawie przy szczepie wybranym na podstawie przedstawionych wcześniej kryteriów.

1. T a b e l a 5 : Liczba bakterii propionowych w kale w ciągu trzech okresów leczenia (wyniki w log cfu/g świeżego kału)

	Vol. 1	Vol. 2	Vol. 3	Vol. 4	Vol. 5	Vol. 6	Vol. 7	średni	s	n*
okres 2	S1	4,00	< 4	< 4	4,00	< 4	4,85	4,30	4,29	0,40	4/7
	S2	4,00	< 4	4,70	6,00	7,15	4,85	5,68	5,40	1,12	6/7
	S3	5,88	4,00	6,85	6,08	6,30	4,70	6,76	5,79	1,07	7/7
	S4	< 4	< 4	< 4	6,11	6,48	< 4	5,00	5,86	0,77	3/7
okres 2	S1	6,46	< 4	6,43	6,30	< 4			6,40	0,09	3/5
	S2	5,83	5,40	6,69	6,32	7,20			6,29	0,71	5/5
	S3	6,36	6,46	6,83	6,36	5,00			6,20	0,70	5/5
	S4	5,11	< 4	< 4	< 4	6,11			5,61	0,71	2/5
okres 3	S1	3,85	< 3	6,15	< 4	6,38	< 3		5,46	1,40	3/6
	S2	6,51	5,43	4,95	6,79	6,81	5,68		6,03	0,78	6/6
	S3	6,56	5,77	6,70	6,23	6,11	5,95		6,22	0,35	6/6
	S4	5,26	< 3	< 3	6,80	< 3	5,89		5,98	0,78	3/6
	HP	4,60	< 2	2,77	6,23	7,30	< 2		5,23	1,98	4/6

n* = liczba osobników u których policzono bakterie propionowe

Wytłuszczone cyfry : wszystkie wartości odpowiadające próbkom z bakteriami propionowymi powyżej 6 log cfu/g

PL 201 183 B1

T a b e l a 6 : Stężenie propionianu w świeżym kale (w μτΌ^)

	Vol. 1	Vol. 2	Vol. 3	Vol. 4	Vol. 5	Vol. 6	Vol. 7
	S1	7,70	4,82	3,73	2,38		3,70	13,83
okres 1	S2	10,03	3,61	5,43	5,32	4,84	3,86	18,08
S3	9,44	3,88	2,29	4,35	3,36	7,99	12,01
	S4	6,00	2,60	3,68	8,40	5,06	5,17	10,45
	S1	9,56	7,36	13,77	8,49	6,14
okres 2	S2	7,12	1,86	7,26	5,82	3,72
S3	10,60	5,11	3,99	6,42	4,83
	S4	19,16	3,12	3,58	2,16	7,68
okres 3	S1	11,90	5.05	10,82	3,43	13,45	2,04
	S2	9,29	8,34	7,82	6,45	3,28	7,56
	S3	10,91	6,62	10,60	7,72	4,99	2,25
	S4	11,93	2,89	8,91	3,47	6,15	5,20
	HP		3,58			6,57	6,49

Wytłuszczone cyfry: wszystkie wartości odpowiadające próbkom z bakteriami propionowymi powyżej 6 log cfu/g

Biorąc pod uwagę wyniki oraz korzystną charakterystykę wynalazku, zastosowane bakterie propionowe zostały wybrane spośród szczepów produkujących kwas propionowy w ilości istotnej fizjologicznie, a w szczególności spośród szczepów produkujących co najmniej 2 g/l kwasu propionowego i/lub propionianów, a zwłaszcza ponad 4 g/l kwasu propionowego i/lub propionianów podczas hodowli w 30°C, w podł oż u YEL zawierającym około 11,4 g/l mleczanu w trakcie 2 do 3 dni, następnie rozcieńczonych 1/10 w podłożu YEL zawierającym 0,6% żółci bydlęcej i inkubowanych w 37°C przez 90 min, żwirowanych, zawieszonych w podłożu YEL i poddanych kolejnej inkubacji w 37°C przez 24 godziny.

Innym kryterium selekcji, które może być wzięte pod uwagę w zgodzie z wynalazkiem są zdolności adhezyjne szczepów do komórek okrężnicy - szczepy posiadające dobre zdolności adhezyjne są korzystne, ponieważ utrzymują się w okrężnicy dłużej, co pozostawia więcej czasu na syntezę kwasu propionowego a ponadto, szczepy związane z komórkami mogą zająć miejsce czynników patogennych.

Warto zauważyć, że celem uzyskania oczekiwanego efektu nie należy brać pod uwagę samej absorpcji kwasu propionowego zwłaszcza, że ze względu na szlak metaboliczny człowieka nie dotarłby on do okrężnicy oraz, jak wykazano jest on w wysokich dawkach szkodliwy dla żołądka.

Do dobroczynnych efektów przypisywanych krótkołańcuchowym kwasom tłuszczowym, a w szczególności kwasowi octowemu i propionowemu, syntetyzowanym w okrężnicy, trzeba zaliczyć ich rolę w przyswajaniu podstawowych składników mineralnych, a zwłaszcza: wapnia, żelaza, cynku oraz magnezu. Możemy zatem założyć, że kwas propionowy i w mniejszym stopniu kwas octowy mogą sprzyjać absorpcji minerałów na poziomie jelita oraz wykorzystaniu przez organizm pobranej frakcji.

Należy tu wspomnieć szczególnie dobroczynny aspekt, iż przyswajaniu minerałów towarzyszą efekty funkcjonalne, takie jak na przykład: złagodzenie niedokrwistości z niedoboru żelaza lub udział wapnia w mineralizacji kości.

Wykonane badania eksperymentalne i kliniczne dostarczają szeregu argumentów potwierdzających dobroczynny wpływ kwasu propionowego i propionianów oraz w mniejszym stopniu kwasu octowego i octanów na metabolizm minerałów. Wpływ ten jest szczególnie ważny w sytuacji pogorszenia warunków trawienia, prowadzącej do zatrzymania wchłaniania na poziomie jelita cienkiego znacznych ilości minerałów, a tym samym do zwiększenia zapotrzebowania na nie.

Istnienie związku pomiędzy krótkołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi a metabolizmem minerałów zostało w sposób znaczący wykazane w badaniach z zastosowaniem rozpuszczalnego błonnika. Wykazano również, że polisacharydy lub oligosacharydy nie strawione przez enzymy trawienne, które są następnie fermentowane do krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (a zwłaszcza propionianów) przez florę jelitową zwiększają wchłanianie minerałów, takich jak wapń, cynk, żelazo, a wzrost ten jest jeszcze ważniejszy w warunkach patologicznych (niedobory, gastroektomia...).

Badania perfuzji jelitowej i brak efektów u osób z kolonoktomią pozwalają na potwierdzenie miejsca wchłaniania na poziomie jelitowym. Stwierdzono ponadto, że zjawisku temu towarzyszy obniżenie pH oraz syntezy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych - sugeruje to udział tych kwasów na

PL 201 183 B1 poziomie fermentacji, co więcej, wiadomo, że nierozpuszczalny błonnik, nie ulegający fermentacji nie ma tutaj wpływu. Co więcej stwierdzono hipertrofię jelita ślepego oraz wzrost ukrwienia jelita, co pociąga za sobą efekt troficzny.

Badania kliniczne związane z tym tematem są nieliczne, ale pozwalają na potwierdzenie, że działanie rozpuszczalnego błonnika wynika z fermentacji jelitowej. Badania te bezpośrednio wykazują wpływ krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych na absorpcję minerałów.

Wśród tych badań należy wspomnieć publikację « Trinidad TP, Wolever TMS, Thompson LU, Effect of acetate and propionate on calcium absorption froin the rectum and distal cólon of humans. An J Clin Nutr 1996, 63/574-578 » przedstawiającą testy, w których poddawano perfuzji dystalny odcinek okrężnicy zdrowych osobników za pomocą kwasu octowego, kwasu propionowego lub łącznie w stężeniu odpowiadają cym stężeniu fizjologicznemu. Wykazano również , ż e wchł anianie wapnia ze światła jelita wzrasta pod wpływem obydwu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, lecz pod wpływem kwasu propionowego wzrasta znacząco. Badania wykazały brak wpływu dawki na wysycenie systemu. Autorzy sugerują, że większa lipofilność kwasu propionowego w stosunku do kwasu octowego może sprzyjać jego absorpcji oraz uwalnianiu przez kolonocyty do światła przewodu protonów sprzyjających wchłanianiu wapnia.

Mając na względzie powyższe dane wynalazek dotyczy zastosowania bakterii propionowych wyselekcjonowanych pod względem ich właściwości słabo autolitycznych oraz ich odporności na sole żółciowe wytwarzania prostej kompozycji spożywczej, dietetycznej, bądź medycznej, absorbowanej przez człowieka lub zwierzę. Jest ona tak opracowana, że bakterie są chronione co najmniej częściowo przed kwasami żołądkowymi oraz zawiera co najmniej 10⁶ komórek/gram bakterii zdolnych do zwiększenia przyswajania podstawowych minerałów, w szczególności wapnia i/lub żelaza i/lub cynku i/lub magnezu w okrężnicy.

Zgodnie z wariantem wynalazku, proponuje się jednocześnie aby zastosować bakterie propionowe celem wytwarzania kompozycji mającej właściwości antygrzybiczne na poziomie okrężnicy, a w szczególności, zdolnej do powstrzymania rozwoju grzybów patogennych typu droż dż aki/pleśnie.

Wynalazek dostarcza dzięki znakomitym właściwościom anty-grzybiczym kwasu propionowego, możliwość leczenia drożdżyc wynikających z terapii antybiotykowej.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku kompozycja może, w razie potrzeby, zawierać inne bakterie, a w szczególności bakterie mlekowe i/lub bakterie bifidowe zdolne do działania w synergii z bakteriami propionowymi i zwię kszania wspomnianych efektów poprzez dostarczanie mleczanu jako substratu do fermentacji.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku kompozycja może stanowić preparat suchy lub uwodniony w postaci pojedynczych frakcji od 100 mg do 1 g, korzystnie od 200 do 500 mg, zawierających co najmniej 10⁸ komórek; frakcje mogą występować w formie kapsułek lub kapsułek odpornych na działanie soków trawiennych.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku kompozycja może również składać się z preparatu, w którym bakterie propionowe są dodane lub związane z substratem ulegającym fermentacji, bądź włączone do pokarmu płynnego, o konsystencji pasty lub stałego.

W preparacie bakterie propionowe mogą odgrywać podwójną rolę - technologiczną poprzez fermentację składników oraz, po przyjęciu i dotarciu do okrężnicy, wspomnianą rolę probiotyczną, a w szczególnoś ci mogą odgrywać rolę na poziomie optymalizacji syntezy kwasu propionowego.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie bakterii propionowych należących do szczepów słabo autolitycznych oraz zdolnych do wytwarzania co najmniej 2 g/l kwasu propionowego i/lub propionianów, a zwłaszcza ponad 4 g/l kwasu propionowego i/lub propionianów, hodowanych w 30°C, w podłożu YEL zawierającym 11,4 g/l mleczanu przez 2 do 3 dni, a następnie rozcieńczonych 1/10 w podłożu YEL zawierającym 0,6% żółci bydlęcej i inkubowanych w 37°C przez 90 min., wirowanych, zawieszonych ponownie w podł oż u YEL i poddanych ponownie inkubacji w 37°C przez 24 godziny, do wytwarzania kompozycji spożywczej lub kompozycji dietetycznej, lub kompozycji medycznej, absorbowanej przez człowieka lub zwierzę, otrzymywanej w taki sposób, że bakterie są chronione co najmniej częściowo przed kwasami żołądkowymi i zawierającej co najmniej 10⁶ komórek/gram tych bakterii zdolnych do istotnego

PL 201 183 B1 zwiększenia syntezy kwasu propionowego i/lub propionianów oraz, w razie potrzeby, kwasu octowego i/lub octanów w okrężnicy poprzez bakteryjną fermentację beztlenową.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosowane jest do wytwarzania kompozycji do ułatwiania przyswajania substancji mineralnych, a zwłaszcza wapnia i/lub żelaza i/lub cynku i/lub magnezu w okrężnicy.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wytwarzana kompozycja wykazuje właściwości anty-grzybiczne w okrężnicy, a zwłaszcza posiada zdolność do redukowania rozwoju grzybów patogennych typu drożdżaki/pleśnie.
4. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1 do 3, znamienne tym, że bakterie propionowe należą do szczepów wykazujących właściwości adhezyjne do komórek okrężnicy.
5. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1 do 4, znamienne tym, że wytwarzana kompozycja składa się z preparatu suchego lub uwodnionego w postaci indywidualnych frakcji od 100 mg do 1 g, a zwł aszcza od 200 do 500 mg, zawieraj ą cych co najmniej 10⁸ komórek.
6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że wytwarzana kompozycja ma postać kapsułek żelatynowych lub kapsułek odpornych na działanie kwasów żołądkowych.
7. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1 do 6, znamienne tym, że wytwarzana kompozycja składa się z preparatu bakterii propionowych dodanych lub połączonych z fermentowalnym substratem, a zwłaszcza błonnikiem spożywczym.
8. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1 do 6, znamienne tym, że wytwarzana kompozycja składa się z preparatu bakterii propionowych dodanych lub wprowadzonych do pokarmu takiego jak pokarm płynny, pastowaty lub stały.
9. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1 do 7, znamienne tym, że wytwarzana kompozycja zawiera bakterie kwasu mlekowego i/lub bakterie bifidowe.