PL201679B1 - Cząsteczka oligomeryczna, sposób otrzymywania cząsteczek oligomerycznych, kompozycja zawierająca taką cząsteczkę, zastosowanie cząsteczki oligomerycznej, zastosowanie kompozycji, zestaw zawierający cząsteczkę immunologiczną oraz test immunologiczny - Google Patents

Abstract

Niniejszy wynalazek zosta l oparty na odkryciu, ze bia lka otoczki HCV indukuj a korzystn a odpo- wied z immunologiczn a u szympansów przewlekle zaka zonych HCV. Immunizacja mo ze korzystnie by c prowadzona przy zastosowaniu bia lek otoczki HCV w postaci cz asteczek, które s a otrzymywane przy pomocy detergentu. Bia lka otoczki, je sli zostan a wprowadzone do takiego nosiciela chronicznie zaka zonego HCV s a wysoce immunogeniczne i stymuluj a komórkow a i humoraln a odpowied z odpor- no sciow a. PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201679 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 345018 ⁽¹³⁾ (22) Data zgłoszenia: 23.06.1999 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

23.06.1999, PCT/EP99/04342 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

29.12.1999, WO99/67285 PCT Gazette nr 52/99 (51) Int.Cl.

C07K 14/18 (2006.01) A61K 39/29 (2006.01) C07K 16/10 (2006.01) G01N 33/576 (2006.01)

Cząsteczka oligomeryczna, sposób otrzymywania cząsteczek oligomerycznych, kompozycja zawierająca taką cząsteczkę, zastosowanie cząsteczki oligomerycznej, zastosowanie kompozycji, zestaw zawierający cząsteczkę immunologiczną oraz test immunologiczny (30) Pierwszeństwo:

24.06.1998,EP,98870142.1

22.02.1999,EP,99870033.0 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

19.11.2001 BUP 24/01 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.04.2009 WUP 04/09 (73) Uprawniony z patentu:

INNOGENETICS N.V.,Ghent,BE (72) Twórca(y) wynalazku:

Erik Depla,Destelbergen,BE

Geert Maertens,Brugge,BE

Alfons Bosman,Opwijk,BE

Frans Van Wijnendaele,Laarne,BE (74) Pełnomocnik:

Łazewska Sławomira,

Łazewska i Łazewski sp.j.

⁽⁵⁷⁾ Niniejszy wynalazek został oparty na odkryciu, że białka otoczki HCV indukują korzystną odpowiedź immunologiczną u szympansów przewlekle zakażonych HCV. Immunizacja może korzystnie być prowadzona przy zastosowaniu białek otoczki HCV w postaci cząsteczek, które są otrzymywane przy pomocy detergentu. Białka otoczki, jeśli zostaną wprowadzone do takiego nosiciela chronicznie zakażonego HCV są wysoce immunogeniczne i stymulują komórkową i humoralną odpowiedź odpornościową.

PL 201 679 B1

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy cząsteczki oligomerycznej, sposobu otrzymywania cząsteczek oligomerycznych, kompozycji zawierającej taką cząsteczkę, zastosowania wspomnianej cząsteczki oligomerycznej i wspomnianej kompozycji, jak również zestawu zawierającego cząsteczkę immunologiczną oraz testu immunologicznego wykorzystującego taką cząsteczkę.

Niniejszy wynalazek został oparty na stwierdzeniu, że białka otoczki HCV indukują korzystną odpowiedź immunologiczną u szympansów, które cierpią na zakażenie przewlekłe szczepem heterologicznym HCV podtypu 1a lub 1b. Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek dotyczy stwierdzenia, że białka otoczki są wysoce immunogeniczne i prowadzą do stymulacji zarówno odpowiedzi immunologicznej komórkowej jak i humoralnej. Ponadto, niniejszy wynalazek dotyczy stwierdzenia, że blokowanie cystein przez alkilowanie prowadzi do nawet bardziej immunogennych białek. Ponadto, białka otoczki według niniejszego wynalazku mogą być włączone do cząsteczek, które wykazują wysoką immunogenność i immunoreaktywność. W wynalazku wykazano również, że takie cząsteczki mogą obejmować inne białka.

Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) jest głównym problemem zdrowotnym, zarówno w krajach rozwiniętych jak i rozwijających się. Szacuje się, że około 1 do 5% populacji światowej jest dotknięta tym wirusem. Zakażenie HCV wydaje się być najważniejszą przyczyną zapalenia wątroby związanego z transfuzją i często prowadzi do przewlekłego uszkodzenia wątroby. Ponadto, istnieją dowody wskazujące na to, iż HCV bierze udział w indukcji raka komórek wątroby. W związku z powyższym, istnieje ogromna potrzeba dostarczenia godnych zaufania metod diagnostycznych i skutecznych środków terapeutycznych. Potrzebne są również czułe i specyficzne sposoby badania produktów krwiopochodnych, które mogą być zakażone HCV i ulepszonych metod prowadzenia hodowli HCV.

HCV jest wirusem o pozytywnej nici RNA zawierającej około 9600 zasad, które kodują przynajmniej trzy strukturalne i sześć nie-strukturalnych białek. W oparciu o homologię sekwencji, białka strukturalne zostały określone funkcjonalnie jako białka o pojedynczym rdzeniu i dwóch białkach otoczki: E1 i E2. Białko E1 składa się z 192 reszt aminokwasowych i zawiera 5 do 6 miejsc N-glikozylacji, w zależności od genotypu HCV. Białko E2 składa się z 363 do 370 reszt aminokwasowych i zawiera 9-11 miejsc N-glikozylacji, w zależności od genotypu HCV (przegląd patrz: Major i Feinstone, 1997; Maertens i Stuyver,1997). Białko E1 zawiera różne zmienne domeny (Maertens i Stuyver, 1997), podczas gdy białko E2 zawiera trzy hiperzmienne domeny, z których główna domena jest zlokalizowana na N-końcu białka (Maertens i Stuyver,1997). Białka otoczki zostały otrzymane technikami rekombinacji w Escherichia coli, komórkach owadów, komórkach drożdży i komórkach ssaków. Zastosowanie układu ekspresyjnego u wyższych eukariontów, a zwłaszcza w hodowlach komórek ssaków prowadzi do otrzymania białek otoczki, które są skutecznie rozpoznawane przez przeciwciała w próbkach pobranych od pacjentów (Maertens i wsp., 1994).

Sugerowano, że białko otoczki E1 potrzebuje białka otoczki E2, aby osiągnąć odpowiedni układ składania (Deleersnyder i wsp., 1997). Ponadto, sugerowano, że E1 i E2 tworzą heterodimery, które mogą tworzyć podstawowe jednostki otoczki wirusowej (Yi i wsp., 1997). W opisie zgłoszenia patentowego WO 98/21338 zgłoszonego przez Liang i wsp. założenia te zostały zastosowane do stworzenia cząsteczki HCV, która składa się z E1 i E2, jak i rdzenia oraz P7. Innymi słowy, zastosowanie do immunizacji lub innych celów, E1 lub E2 oddzielnie, nie jest wskazane w stanie techniki. Jednakże,

Houghton (1997) opisał, że powtarzane immunizacje przy pomocy zrekombinowanego gpE1E2 (4 x μg) u 3 szympansów cierpiących na przewlekłe zakażenie HCV, nie indukuje znaczącej odpowiedzi immunologicznej. Twórcy niniejszego zgłoszenia patentowego, udowadniają, że indukcja odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko otoczce, u pacjentów cierpiących na przewlekłe zapalenie wątroby typu C, byłaby zdecydowanie pożądana i korzystna dla pacjenta. Dzieje się tak dlatego, że wyższe poziomy przeciwciał wydają się mieć związek z dobrą odpowiedzią na terapię interferonem i dlatego mogą pomagać pacjentowi pozbyć się wirusa (PCT/EP 95/03031 zgłoszony przez Maertensa i wsp.). Twórcy niniejszego wynalazku ponadto twierdzą, że ze względu na fakt, że poziom przeciwciał przeciwko E1 u chronicznych nosicieli HCV jest jednym z najniższych, może być korzystne podniesienie poziomu przeciwciał i w miarę możliwości odpowiedzi komórkowej, aby zaindukować kontrolowanie lub nawet pozbycie się przez gospodarza zakażenia wirusem. Również wyższy poziom komórkowej odporności przeciwko E1 wydaje się mieć związek z dobrą odpowiedzią na terapię interferonem (Leroux-Roels i wsp., 1996).

PL 201 679 B1

Oprócz ważności odporności skierowanej przeciwko E1 w odpowiedzi na terapię interferonem, inne wskazania podkreślają, że niektóre inne części genomu HCV, mogą być ważne w indukowaniu specyficznej odpowiedzi immunologicznej, która może umożliwiać opanowanie infekcji. Znaczenie częściej u pacjentów reagujących pozytywnie na terapię interferonem obserwowano również reaktywność limfocytów przeciwko obszarowi C-końcowemu biała rdzenia (Leroux-Roels i wsp, 1996). Skutecznie neutralizujące przeciwciało przeciwko białku NS4B wykazano u pacjentów usuwających HCV po przeszczepie wątroby (Villa i wsp, 1998). Również w obrębie NS3 zostało zmapowanych kilka typów epitopów chłoniaków z limfocytów T epitopów, które wydają się mieć związek z usuwaniem HCV w czasie fazy ostrej (patrz: PCT/EP 94/03555 zgłoszony przez Leroux-Roels i wsp.; Leroux-Roels i wsp., 1996; Rehermann i wsp., 1996 i 1997; Diepolder i wsp., 1995 i 1997). Ponadto, przeciwciał a skierowane przeciwko NS5A, podobnie jak przeciwciała E1, wykazują wyższy poziom podstawowy przed terapią interferonem-alfa u długoterminowych osobników odpowiadających na terapię (LTR) w porównaniu do osobników nie odpowiadają cych na terapię .

Do tej pory, szczepienia terapeutyczne przeciwko HCV nie były skuteczne. Również wykazano, że szczepienia profilaktyczne były skuteczne przeciwko szczepom homologicznym HCV (Choo i wsp., 1994). Niniejszy wynalazek dotyczy niespodziewanego wyniku, że podawanie antygenu otoczki HCV może bardzo poprawić stan pacjenta cierpiącego na czynne przewlekłe zapalenie wątroby, zakażonego szczepem lub izolatem heterologicznym, zarówno w zakażeniach szczepem heterologicznym HCV podtypu 1a jak i szczepem heterologicznym HCV podtypu 1b. Faktycznie, szympansy zakażone przewlekle, którym podawano sześć dawek 50 μg E1s (to jest: reszty aminokwasowe 192-326 E1) niespodziewanie wykazały silne odpowiedzi humoralną i komórkową, które nie zostały podniesione w całym czasie trwania zakażenia przewlekłego, przed podaniem ostatniego szczepienia. Ponadto, antygen wirusowy staje się nie możliwy do wykrycia w wątrobie w czasie dwóch do pięciu miesięcy i pozostaje nie możliwy do wykrycia w przeciągu przynajmniej pięciu miesięcy po szczepieniu. Pomimo, że miano RNA HCV w osoczu nie zmniejsza się, poziomy enzymów wątrobowych w osoczu wykazały zdecydowaną tendencję do normalizacji. Najważniejsze jest, że histologia wątroby była dużo lepsza w przypadku obu szczepionek. Niniejszy wynalazek dotyczy również niespodziewanego stwierdzenia, że białko E1 stosowane do szczepionek, którego ekspresję prowadzono jako pojedynczego białka HCV bez jego hydrofobowego umocowania, prowadzi do utworzenia stabilnej cząsteczki. Należy również zauważyć, że aby uniknąć indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko nie-związanym epitopom, białko E1 stosowane do szczepionek skonstruowano jako sekwencję zgodną z poszczególnymi klonami pochodzącymi z pojedynczej próbki osocza pobranej od jednego nosiciela przewlekłego. Ponadto, niniejsze zgłoszenie dotyczy stwierdzenia, że indukcja takich odpowiedzi skierowanych przeciwko - E1 może być zwiększona przez zastosowanie antygenów o różnych genotypach, niż w przypadku zakażenia wykrytego u gospodarza. Ponadto, niniejsze zgłoszenie dotyczy stwierdzenia, że jeśli cysteiny białka otoczki HCV są alkilowane, na przykład za pomocą N-(jodoetylo)trifluoroacetamidu, etylenoiminy lub aktywnych pochodnych fluorowcowych, takich jak jodoacetamid, to oligomeryczne cząsteczki jak opisano powyżej wykazują nawet wyższą immunogenność. Na koniec, niniejszy wynalazek dotyczy również stwierdzenia, że mutacje cystein białka otoczki HCV na inne występujące w naturze reszty aminokwasowe, korzystnie na metioninę, kwas glutaminowy, glutaminę lub lizynę, w oligomerycznej cząsteczce jak opisano powyżej, również prowadzi do wyższej immunogenności, w porównaniu do pierwotnego białka otoczki.

Na podstawie cytowanej literatury staje się jasne, że istnieje ogromna potrzeba opracowania godnych zaufania szczepionek i skutecznych środków terapeutycznych do leczenia HCV. Dlatego też, niniejszy wynalazek ma na celu dostarczenie preparatu antygenowego, który będzie skuteczny w indukowaniu specyficznej humoralnej i komórkowej odporności na białka otoczki HCV, nawet (ale nie jedynie) u nosicieli chronicznego zakażenia HCV. Takie same antygeny mogą być stosowane do diagnozowania odpowiedzi immunologicznej.

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka oligomeryczna charakteryzująca się tym, że zawiera oczyszczone białka otoczki HCV i ma średnicę od 5 do 100 nanometrów, przy czym co najmniej jedna reszta cysteinowa białka otoczki jest alkilowana.

W innym korzystnym wariancie wynalazku, cząsteczka oligomeryczna składa się ze skorupy z oczyszczonych białek otoczki.

W jeszcze innym korzystnym wariancie wynalazku, cząsteczka oligomeryczna składa się z całej sfery z oczyszczonych białek otoczki.

Korzystnie, cząsteczka oligomeryczna ma średnicę 5 do 40 nanometrów.

PL 201 679 B1

Korzystnie, sekwencja aminokwasowa białka otoczki HCV jest sekwencją zgodną, pochodzącą z sekwencji zgodnej z izolatu HCV, podtypu HCV, szczepu HCV, lub rodzaju HCV.

Korzystnie, przynajmniej jedna reszta cysteinowa białka otoczki jest alkilowana czynnikiem alkilującym.

Korzystnie, czynnik alkilujący wybrany jest z grupy obejmującej etylenoiminę lub N-(jodoetylo)trifluoroacetamid, oraz czynną pochodną fluorowcową o wzorze X(CH2)nR, gdzie X oznacza atom fluorowca, R oznacza H, COOH, NH2, CONH2, fenyl oraz jego dowolne pochodne, a n oznacza 0, 1,2, 3, albo 4.

Korzystnie, białka otoczki stanowią białka HCV E1 lub ich części.

W innym korzystnym wariancie wynalazku, białka otoczki stanowią białka HCV E1s lub ich części.

W jeszcze innym korzystnym wariancie wynalazku, białka otoczki stanowią białka HCV E2 lub ich części.

W innym korzystnym wariancie wynalazku, bia ł ka otoczki stanowią biał ka o sekwencji przedstawionej jako SEQ ID No 13 i/lub SEQ ID No 14, lub ich części.

Korzystnie, białka otoczki są kodowane przez zgodną sekwencję nukleotydową izolatu HCV, zgodną sekwencję nukleotydową podtypu HCV, zgodną sekwencję nukleotydową gatunku HCV, zgodną sekwencję nukleotydową rodzaju HCV, lub ich części.

Korzystnie, białka otoczki stanowią mieszaninę białek wybranych z grupy obejmującej HCV E1, HCV E1s, HCV E2, oraz ich części.

Korzystnie, białka HCV E2 albo ich części określone są przez sekwencje wybrane z grupy obejmującej SEQ ID No 13. SEQ ID No 14 oraz ich części.

Korzystnie, białka otoczki, lub ich części, pochodzą z różnych szczepów HCV, podtypów HCV lub genotypów HCV.

Korzystnie, białka otoczki, lub jej części, stanowią mieszaninę zawierającą białka otoczki HCV z jednego szczepu HCV lub genotypu HCV i białka otoczki HCV z przynajmniej jednego innego szczepu HCV lub genotypu HCV.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania cząsteczek oligomerycznych według wynalazku, charakteryzujący się tym, że obejmuje oczyszczanie białka otoczki HCV w roztworze przy zastosowaniu środka alkilującego zastąpienie roztworu oczyszczonego białka otoczki HCV detergentem lub solą, i utworzenie cząsteczek oligomerycznych, oraz oczyszczanie utworzonych cząsteczek oligomerycznych.

Korzystnie, do oczyszczania białka otoczki HCV w pierwszym etapie stosuje się dodatkowo pierwszy detergent.

Korzystnie, w pierwszym etapie stosuje się dodatkowo środek tnący wiązania disiarczkowe.

Korzystnie, przy oczyszczaniu utworzonych cząsteczek oligomerycznych w trzecim etapie, dodatkowo obniża się stężenie detergentu albo soli zastosowanych w etapie drugim.

Korzystnie, jako pierwszy detergent stosuje się Empigen-BB, jako detergent w etapie drugim lub trzecim stosuje się CHAPS, oktyloglukozyd, Tween, lub dowolny inny detergent, a jako sól stosuje się betainę.

Korzystnie, stosuje się Empigen-BB w stężeniu od 1% do 10%; CHAPS lub Tween w stężeniu od 0,01% do 10%, lub betainę w stężeniu od 0,01% do 10%.

Przedmiotem wynalazku jest również, kompozycja charakteryzująca się tym, że zawiera cząsteczkę oligomeryczną według wynalazku.

Korzystnie, kompozycja według wynalazku dodatkowo zawiera białko rdzenia HCV, P7, E1, E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i/lub NS5B, lub jego części.

Korzystnie, białko NS3, lub jego części, mają sekwencję aminokwasową określoną przez SEQ ID No 1 lub SEQ ID No 2.

Korzystnie, kompozycja według wynalazku stanowi szczepionkę.

Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka oligomeryczna określona powyżej, do zastosowania jako lek.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie cząsteczki oligomerycznej określonej powyżej, do wytwarzania szczepionki HCV; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u przewlekłych nosicieli HCV; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u przewlekłych nosicieli HCV przed, w czasie, albo po stosowaniu innej terapii; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u osób zakaż onych HCV przed lub po przeszczepie wą troby albo po przypuszczalnym zakaż eniu; leku do profilaktycznego indukowania odporności przeciwko HCV; leku do indukowania odporności przePL 201 679 B1 ciwko HCV, gdzie cząsteczka oligomeryczna stosowana jest w odstępach czasowych lub leku do leczenia zakażenia HCV.

Korzystnie, inna terapia stanowi leczenie interferonem.

Korzystnie, inna terapia stanowi połączenie leczenia interferonem z leczeniem przy użyciu leków o małej wielkości cząsteczki.

Korzystnie, lek o małej wielkości cząsteczki stanowi rybawiryna.

Przedmiotem wynalazku jest także, kompozycja określona powyżej do zastosowania do jako lek.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kompozycji określonej powyżej, do wytwarzania szczepionki przeciw HCV; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u przewlekłych nosicieli HCV; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u przewlekłych nosicieli HCV przed, w czasie lub po stosowaniu innej terapii; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u osób zakażonych HCV przed lub po przeszczepie wątroby albo po przypuszczalnym zakażeniu; leku do profilaktycznego indukowania odporności przeciwko HCV albo leku do indukowania odporności przeciwko HCV, gdzie cząsteczka oligomeryczna stosowana jest w odstępach czasowych.

Korzystnie, inna terapia stanowi leczenie interferonem.

Korzystnie, inna terapia stanowi połączenie leczenia interferonem z leczeniem przy użyciu leków o małej wielkości cząsteczki.

Korzystnie, lek o małej wielkości cząsteczki stanowi rybawiryna.

Przedmiot wynalazku stanowi również zestaw do wykrywania przeciwciał przeciwko HCV obecnych w próbce biologicznej, charakteryzujący się tym, że obejmuje cząsteczkę oligomeryczną określoną powyżej w odpowiednim pojemniku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku, jest zestaw do wykrywania odpowiedzi komórek chłoniaka z limfocytów T na HCV, obejmujący cząsteczkę oligomeryczną okreś loną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także, test immunologiczny do wykrywania przeciwciał HCV w próbce biologicznej, obejmujący dostarczenie cząsteczki oligomerycznej okreś lonej powyżej, inkubowanie próbki biologicznej z cząsteczką oligomeryczną w warunkach umożliwiających tworzenie kompleksu pomiędzy cząsteczką oligomeryczną a przeciwciałem HCV, oraz określenie czy utworzył się kompleks co oznacza obecność przeciwciał HCV w próbce.

Kompozycja antygenowego według wynalazku składa się ze stabilnych cząsteczek pojedynczych białek otoczki HCV. Powinno być jasne, że obecnie, cząsteczki takie lub sposób otrzymywania takich cząsteczek, nie są znane w stanie techniki. Ponadto, nie ma żadnych wskazówek w stanie techniki, że jakakolwiek kompozycja antygenowa, włącznie z takimi stabilnymi cząsteczkami lub takim oczyszczonym pojedynczym HCV białkiem otoczki, mogłaby skutecznie być stosowana jako (heterologiczna) profilaktyczna lub terapeutyczna szczepionka przeciwko HCV.

Dostarczenie antygenu, którego sekwencja jest zgodna z sekwencją pojedynczego klonu, może umożliwić bardziej prawidłowe składanie białka. Postępuje się w ten sposób, aby uniknąć stymulowania odporności przeciwko nie związanym epitopom.

Kompozycja antygenowa według wynalazku przeznaczona jest w szczególności do szczepienia terapeutycznego, w oparciu o genotyp HCV, którym jest nosiciel zakażony chronicznie. W odniesieniu do powyższego, niniejszy wynalazek ma na celu dostarczenie białka otoczki o różnym bądź homologicznym genotypie lub podtypie w porównaniu do genotypu lub podtypu nosiciela cierpiącego na zapalenie chroniczne.

Wynalazek może znaleźć zastosowanie w leczeniu lub terapeutycznym szczepieniu pacjentów cierpiących na zakażenie przewlekłe przy zastosowaniu określonych powyżej antygenów lub DNA w szczepionkach, jeśli jest to możliwe w połączeniu z innymi zwią zkami. Niniejszy wynalazek może również służyć do profilaktycznego szczepienia ludzi przeciwko HCV.

Cząsteczki oligomeryczne według wynalazku wykazują nadzwyczajną immunogenność, ze względu na mutację przynajmniej jednej reszty cysteinowej białka otoczki HCV przez zastąpienie występującym w naturze aminokwasem korzystnie metioniną, kwasem glutaminowym, glutaminą lub lizyną. W innym rozwiązaniu, może być przeprowadzone alkilowanie przynajmniej jednej reszty cysteinowej białka otoczki HCV.

Tabela 1 przedstawia sekwencje klonów E1 otrzymanych od jednego nosiciela cierpiącego na zapalenie przewlekłe, konstrukt E1 stosowany do otrzymywania szczepionki jest zgodny ze wszystkimi tymi poszczególnymi klonami. V1-V5, zmienne regiony 1-5; C4, stała domena 4; HR, region hydrofobowy; HCV-B con, sekwencje zgodne w pozycjach, które są zmienne w różnych klonach i HCV-J.

PL 201 679 B1

Tabela 2 przedstawia sekwencje białka E1 szczepionki i białko E1, takie jak odkryto u zakażonych szympansów Phila i Tona. Podtyp 1b izolatu pobranego od Phila różnił się w 5,92% od szczepu szczepionki. Różnica pomiędzy szczepionką a podtypem 1a isolatu pobranego od Tona wynosiła 20,74%.

Tabela 3 przedstawia schematyczny przegląd zmian wywołanych przez szczepienia terapeutyczne u dwóch zakażonych przewlekle szympansów (Ton i Phil). Analizę przeprowadzono jak wyjaśniono w opisie fig. 8 i 11. Ponadto, histologia i stan zapalny były określane na podstawie biopsji wątroby.

Tabela 4 przedstawia sekwencje peptydów stosowane do mapowania epitopów chłoniaka z limfocytów B. Należy zauważyć, że HR zachodzi na V4V5.

Tabela 5 przedstawia zmianę uporządkowania NS3 w celu stworzenia krótszego białka niosącego wszystkie główne epitopy mające związek z usuwaniem wirusów.

Tabela 6 przedstawia reaktywność LIA acetamidu-E1s względem maleimidu-E1s z użyciem surowicy krwi od przewlekłych nosicieli HCV. Białka unieruchamiano na błonach LIA. E1s-acetamid był rozpylany w swojej postaci na paski LIA, podczas gdy maleimid-E1s (również zawierający maleimido-biotynę) przeprowadzano w kompleks ze streptawidyną przed rozpyleniem. Przeprowadzano wiązanie antygenów z błonami LIA i paski poddawano obróbce zasadniczo jak opisano w Zrein i wsp. (1998). Ludzkie przeciwciała skierowane przeciwko tym antygenom uwidaczniano stosując ludzkie przeciwciała skierowane przeciwko IgG związane z fosfatazą alkaliczną. NBT i BCIP stosowano do kolorowego wywołania paska. Barwienie oznaczano od 0,5 do 4, jak wyjaśniono w Zrein i wsp. (1998). Stosując zakończenie tego badania liczba próbek pozytywnych wynosiła 0,5 (# poz), a procent (% poz) został wymieniony na dole niniejszej tabeli.

Fig. 1 przedstawia nałożone przebiegi chromatografii wykluczającej w PBS/3% Empigen-BB białek E1s i E2s wyrażonych i oczyszczonych według Maertensa i wsp. (PCT/EP95/03031),

Fig. 2 przedstawia nałożone przebiegi chromatografii wykluczającej (SEC) białek E1s i E2s wyrażonych i oczyszczonych według Maertensa i wsp. (PCT/EP95/03031), i wprowadzonego do następnego przebiegu na tej samej kolumnie w PBS/0,2% CHAPS, aby otrzymać specyficzne oligomeryczne struktury o przybliżonej rzeczywistej masie cząsteczkowej wynoszącej 250000-300000. Podobne stopnie asocjacji mogą być otrzymane przez zastosowanie 3% betainy.

Fig. 3 przedstawia nałożone przebiegi chromatografii wykluczającej, białek E1s i E2s wyrażonych i oczyszczonych według Maertensa i wsp. (PCT/EP95/03031), i wprowadzonego do następnego przebiegu na tej samej kolumnie w PBS/0,2% CHAPS lub 3% betainie, aby otrzymać specyficzne oligomeryczne struktury jak pokazano na fig. 2 i wprowadzonego do trzeciego przebiegu na tej samej kolumnie SEC w 0,05% CHAPS, aby otrzymać specyficzne homo- oligomeryczne struktury o przybliżonej rzeczywistej masie cząsteczkowej wynoszącej 250000-300000 (E2s) i > 600000 (E1s). Podobne stopnie asocjacji mogą być otrzymane przez zastosowanie 0,1 lub 0,5% betainy.

Fig. 4 przedstawia analizę dynamicznego rozpraszania światła, wyrażoną jako procent ilości cząsteczek w odniesieniu do obserwowanej średnicy w nm, E1s w PBS/0,05% CHAPS.

Fig. 5 przedstawia analizę dynamicznego rozpraszania światła, wyrażoną jako procent ilości cząsteczek w odniesieniu do obserwowanej średnicy w nm, E1s w PBS/0,1% betainy (górna) lub 0,5% betainy (dolna).

Fig. 6 przedstawia barwienie EM (A) E1s w PBS/0,05% CHAPS i (B) E1s w PBS/3% betainy.

Fig. 7 przedstawia rozkład rozmiarów cząsteczek E1s w PBS/0,05% CHAPS.

Fig. 8 przedstawia ewolucję przeciwciał skierowanych przeciwko E1 wywołaną przez sześć kolejne i wzmocnione immunizacje (wskazane małymi strzałkami) u szympansa zakażonego 1b (Phil) i ewolucję ALT, RNA HCV oraz przeciwciał skierowanych przeciwko E1. Wiązanie przeciwciał skierowanych przeciwko E1 z nośnikiem E1 wykrywano stosując drugorzędową surowicę odpornościową przeciwko ludzkiemu IgG związaną z peroksydazą. TMB stosowano jako substrat do wywołania kolorów. Wyniki przedstawiono jako punkt końcowy miareczkowania. Poziomy ALT określano przy pomocy analizatora klinicznego i przedstawiono jako U/I. RNA HCV w osoczu oznaczano stosując HCV Monitor (Roche, Bazylea, Szwajcaria). Obciążenie wirusowe w wątrobie określano wyznaczając półilościowo ilość antygenu E2 barwionego przy biopsji wątroby, stosując specyficzne przeciwciała monoklonalne (ECACC numer dostępu 98031215 jak opisano w zgłoszeniu EP nr 98870060.5).

Fig. 9 przedstawia mapowanie epitopu odpowiedzi przeciwciał indukowanych przez immunizację E1 u szympansa Phila. Reaktywność przeciwciał względem różnych peptydów zmierzono metodą pośrednią ELISA, w której prowadzono adsorpcję biotynylowanych peptydów (patrz również Tabela 4) na płytkach do mikromiareczkowania poprzez streptawidynę. Specyficzne przeciwciała wykrywano

PL 201 679 B1 stosując drugorzędową surowicę odpornościową przeciwko ludzkiemu IgG związane z peroksydazą. TMB stosowano jako substrat do wywołania kolorów.

Fig. 10 przedstawia wyniki wyznaczania proliferacji limfocytów przed i po podaniu szczepionek szympansowi Philowi. Zamrożone PBMC roztopiono i stymulowano w trzech powtórzeniach różnymi antygenami. Jako kontrolę negatywną stosowano jedynie pożywkę, podczas gdy konkanawalina A była stosowana jako kontrola pozytywna w stężeniu 5 μg/ml. Hodowlę PBMC o stężeniu 2-4 x 10⁵ komórek/studzienkę w całkowitej objętości 150 μl prowadzono w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% inaktywowanym wysoką temperaturą FCS w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania ze studzienkami w kształcie litery U wraz z kontrolami lub 1 (gg/ml E1 przez 90 godzin w temp. 37°C w wilgotnej atmosferze, zawierającej 5% CO2. Podczas ostatnich 18 godzin komórkom podawano pulsacyjnie 0,5 μ Ci (³H) tymidyny na studzienkę. Następnie, kultury zbierano na filtrach z włókien szklanych i określano pobór sondy. Wyniki przedstawiono jako wskaźniki stymulacji (Stimulation Indices (SI)): średnie zliczenie w cpm antygenu/ średnie zliczenie w cpm samej pożywki w trzykrotnych powtórzeniach.

Fig. 11 przedstawia ewolucję przeciwciał skierowanych przeciwko E1 wywołanych przez sześć kolejnych i 3 wzmocnionych immunizacji (wskazane małymi strzałkami) u szympansa Tona zakażonego podtypem 1a. Przedstawiono ewolucję ALT, RNA HCV w surowicy i wyznaczenie antygenu HCV w wątrobie. Przeciwciała skierowane przeciwko E1 zmierzono metodą pośrednią ELISA: specyficzne przeciwciała związane z nośnikiem E1 wykrywano stosując drugorzędową surowicę odpornościową przeciwko ludzkiemu IgG związaną z peroksydazą. TMB stosowano jako substrat do wywołania kolorów. Wyniki przedstawiono jako punkt końcowy miana. Poziomy ALT określano przy pomocy analizatora klinicznego i przedstawiono jako U/I. RNA HCV w osoczu określano stosując HCV Monitor (Roche, Bazylea, Szwajcaria). Antygen E2 barwiono przy biopsji wątroby, stosując specyficzne przeciwciała monoklonalne (ECACC numer dostępu 98031215 jak opisano w zgłoszeniu EP nr 98870060.5). Wyniki analizy półilościowej wskazano jako czarne kwadraty, w przypadku wyraźnie pozytywnego barwienia w większości komórek, jako szare kwadraty, w przypadku mniejszości komórek, i jako białe w przypadku biopsji nie wykazujących wykrywalnego barwienia. RNA HCV przedstawiono małymi czarnymi sześcianami. Barwienie E2 może być potwierdzone barwieniem Core i E1 (dane nie przedstawione).

Fig. 12 przedstawia mapowanie epitopu odpowiedzi przeciwciał wywołanych przez immunizację E1 u Tona. Reaktywność przeciwciał względem różnych peptydów zmierzono metodą pośrednią ELISA, w której prowadzono adsorpcję biotynylowanych peptydów (patrz również Tabela 4) na płytkach do mikromiareczkowania poprzez streptawidynę. Specyficzne przeciwciała wykrywano stosując drugorzędową surowicę odpornościową przeciwko ludzkiemu IgG związane z peroksydazą. TMB stosowano jako substrat do wywołania kolorów.

Fig. 13 przedstawia analizę odpowiedzi E1 przeciwciał na podtyp 1a i podtyp 1b E1 białka u szympansa Tona. W tym celu, genotyp E1 1a, pochodzący z sekwencji HCV-H, wytworzono zrekombinowany wirus krowianki, w którym zachodzi ekspresja tej samej części E1 jak w przypadku genotypu 1b (patrz poniżej). E1 otrzymano z surowego lizatu wirusa krowianki zakażonych komórek RK13 (otrzymanych jak opisano w Maertens i wsp. (PCT/EP95/03031)). Przeciwciał reaktywność zmierzono metodą pośrednią ELISA, w której prowadzono adsorpcję E1 na płytkach mikrofiltracyjnych poprzez wiązanie wysoko-mannozowe aglutyniny z Galanthus nivalis (GNA). Specyficzne przeciwciała wykrywano stosując drugorzędową surowicę odpornościową przeciwko ludzkiemu IgG związane z peroksydazą. TMB stosowano jako substrat do wywołania kolorów. Wyniki przedstawiono jako różnicowe OD (OD studzienki z zaadsorbowanym E1 minus OD studzienki bez E1).

Fig. 14 przedstawia wyniki wyznaczania proliferacji limfocytów przed i po podaniu szczepionek szympansowi Tonowi. Zamrożone PBMC roztopiono i stymulowano w trzech powtórzeniach różnymi antygenami. Jako kontrolę negatywną stosowano jedynie pożywkę, podczas gdy konkanawalinę A stosowano jako kontrolę pozytywną o stężeniu 5 gg/ml. Hodowlę PBMC o stężeniu 2-4 x 10⁵ komórek/studzienkę w całkowitej objętości 150 gl prowadzono w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% inaktywowanym wysoką temperaturą FCS w 96-studzienkowych płytkach mikrofiltracyjnych w kształcie litery U wraz z kontrolami lub 1 gg/ml E1 przez 90 godzin w temp. 37°C w wilgotnej atmosferze, zawierającej 5% CO₂. Podczas ostatnich 18 godzin komórkom podawano pulsacyjnie 0,5 gCi (³H) tymidyny na studzienkę. Następnie, kultury zbierano na filtrach z włókien i określano pobór sondy. Wyniki przedstawiono jako wskaźniki stymulacji (Stimulation Indices (SI): średnie liczenie w cpm antygenu/średnie liczenie w cpm samej pożywki w trzykrotnych powtórzeniach.

PL 201 679 B1

Fig. 15 przedstawia mapy konstruktów stosowane, aby otrzymać ekspresję białka E2, w którym jego hiper-zmienny region N-końcowy został usunięty. Konstrukty pvHCV-92 i pvHCV-99 stanowią konstrukty pośrednie, stosowane do konstrukcji mutantów z delecją pvHCV-100 i pvHCV-101.

Fig. 16 przedstawia sekwencję (nukleotydów: A; po translacji: B) odpowiadającą konstruktom przedstawionym na fig. 15 (patrz powyżej).

Fig. 17 przedstawia miana przeciwciał otrzymane u myszy po immunizacji różnymi preparatami E1 jak opisano w przykładzie 9. Miana określano za pomocą ELISA: mysią surowicę krwi rozcieńczoną 1/20, a następnie na (0,5 log10) i inkubowano na E1s (zmodyfikowanym bądź acetamidem bądź maleimidem) powlekanym na płytkach mikrofiltracyjnych. Po przemyciu związane przeciwciała wykrywano stosując drugorzędową surowicę odpornościową przeciwko mysiemu IgG związane z peroksydazą. TMB stosowano jako substrat do wywołania kolorów. Wyniki przedstawiono jako punkt końcowy miana i odchylenie standardowe (n=6).

Fig. 18 przedstawia mapowanie epitopu odpowiedzi przeciwciał wywołanych przez immunizację myszy różnymi preparatami E1s. Reaktywność przeciwciał względem różnych peptydów zmierzono metodą pośrednią ELISA, w której prowadzono adsorpcję biotynylowanych peptydów (patrz również Tabela 4) na płytkach do mikromiareczkowania poprzez streptawidynę. Mysią surowicę krwi rozcieńczoną 1/20 i specyficzne przeciwciała wykrywano stosując drugorzędową surowicę odpornościową przeciwko mysiemu IgG związane z peroksydazą. TMB stosowano jako substrat do wywołania kolorów.

Fig. 19 przedstawia profil izotypowy immunoglobulin myszy immunizowanych różnymi preparatami E1s. Specyficzną klasę i podklasę przeciwciał Ig adsorbowano na płytkach do mikromiareczkowania. Po wychwyceniu mysiego Ig z immunizowanej surowicy krwi rozcieńczonej 1/500, E1s inkubowano w stęż. 1 μg/ml. Utworzone immunokompleksy w dalszym ciągu inkubowano z króliczą poliklonalną surowicą odpornościową skierowaną przeciwko E1. Na zakończenie, królicze przeciwciała wykrywano stosując drugorzędową surowicę odpornościową przeciwko koziemu i króliczemu IgG związane z peroksydazą. TMB stosowano jako substrat do wywołania kolorów. Wyniki normalizowano z IgG1 (to jest sygnał IgG1, dla każdego zwierzęcia był uznawany jako 1 i wszystkie wyniki odnośnie innych izotypów przedstawiono względem tych wyników otrzymanych dla IgG1).

Fig. 20 przedstawia miana przeciwciał wywołanych przez dwie immunizacje w ciągu dnia 1000 acetamido-E1s u szympansa Phila. Przeciwciała skierowane przeciwko E1 zmierzono metodą pośrednią ELISA: specyficzne przeciwciała związane z nośnikiem E1 wykrywano stosując drugorzędową surowicę odpornościową przeciwko ludzkiemu IgG związaną z peroksydazą. Miano wyrażono w jednostkach/ml, jednostki te dotyczą standardów miejscowych, które oparto ludzkiej surowicy krwi.

Fig. 21 przedstawia miana przeciwciał wywołanych przez dwie immunizacje w ciągu dnia 900 acetamido-E1s u szympansa Tona. Przeciwciała skierowane przeciwko E1 zmierzono metodą pośrednią ELISA: specyficzne przeciwciała związane z nośnikiem E1 wykrywano stosując drugorzędową surowicę odpornościową przeciwko ludzkiemu IgG związaną z peroksydazą. Miano wyrażono w jednostkach/ml, jednostki te dotyczą standardów miejscowych, które oparto ludzkiej surowicy krwi.

Fig. 22 przedstawia profil SEC końcowego etapu redukcji detergentem (0,2 do 0,05% CHAPS): pojedyncza cząsteczka E1 (A), pojedyncza cząsteczka E2 (B) lub równomolowa mieszanina E1 i E2; cząsteczki mieszane (C). Figura ta również przedstawia nakładanie się wartości OD uzyskanych w analizie ELISA specyficznie wykrywającej jedynie E1 (górny), jedynie E2 (środkowy) i analizie ELISA wykrywającej jedynie cząsteczki mieszane (dolny).

Fig. 23 przedstawia profil SEC końcowego etapu redukcji detergentem (0,2 do 0,05% CHAPS): genotyp E1 1b pojedyncza cząsteczka (górny), genotyp E1 4 pojedyncza cząsteczka (środkowy) lub równomolowa mieszanina genotypów E1 1b i 4, cząsteczki mieszane (dolny). Figura ta przedstawia również zachodzenie wartości OD uzyskanych w analizie ELISA specyficznie wykrywającej jedynie cząsteczki mieszane (patrz również Fig. 22).

Wynalazek opisany w niniejszym opisie opiera się na opublikowanych pracach i nierozpatrzonych zgłoszeniach patentowych. Przykładowo, prace takie obejmują publikacje naukowe, patenty lub zgłoszenia patentowe. Wszystkie te publikacje i zgłoszenia cytowane uprzednio lub poniżej są zamieszczone jako odnośniki.

Po raz pierwszy skuteczną immunoterapię szympansów cierpiących na poważne, przewlekłe, aktywne zapalenie wątroby C można było uzyskać stosując szczepionki z antygenem HCV. Szczepionka nie tylko indukowała znaczące odpowiedzi immunologiczne, ale również indukowała usuwanie antygenu wirusowego z wątroby i znaczącą poprawę aktywności histologicznej i w chorobie wątroby.

PL 201 679 B1

Cząsteczki oligomeryczne zawierają zasadniczo białka otoczki HCV i mają średnicę od 1 do 100 nm jak zmierzono metodą dynamicznego rozpraszania światła lub w innym przypadku techniką mikroskopii elektronowej. W tym zakresie należy podkreślić, że cząsteczki mogą być utworzone jedynie przez białka E1 i/lub E2, lub ich części (patrz poniżej). Dlatego też, cząsteczki oligomeryczne według niniejszego wynalazku różnią się zasadniczo od cząsteczek typu HCV opisanych w opisie patentowym nr WO 98/21338, które zawsze zawierają E1 i E2 oraz rdzeń i P7. Określenie cząsteczki oligomeryczne zawierające zasadniczo białka otoczki HCV są tutaj definiowane jako struktury o specyficznej naturze i kształcie zawierające kilka podstawowych jednostek białek otoczki HCV E1 i/albo E2, które z kolei mogą zawierać odpowiednio jeden lub dwa monomery E1 i/albo E2. Powinno być jasne, że cząsteczki według niniejszego wynalazku są definiowane tak, aby były pozbawione zakaźnych genomów RNA HCV. Cząsteczki według niniejszego wynalazku mogą stanowić cząsteczki o wyższym uporządkowaniu o naturze sferycznej, które mogą być puste i składać się ze skorupy z białek otoczki do której mogą być włączone lipidy, detergenty, białka rdzeniowe HCV lub cząsteczki adjuwanta. Te ostatnie cząsteczki mogą również być zamknięte w liposomach lub apolipoproteinach, takich jak na przykład, apolipoproteina B lub białka lipidowe o niskiej gęstości, lub wszystkie inne środki umieszczania danych cząsteczek w specyficznym organie lub tkance. W tym przypadku, takie puste sferyczne cząsteczki są często określane jako cząsteczki typu wirusowego lub VLP. W innym rozwiązaniu, cząsteczki o wyższym uporządkowaniu mogą być całymi sferycznymi strukturami, w których cała sfera składa się z oligomerów białka otoczki E1 lub E2 HCV, w których mogą być dodatkowo włączone lipidy, detergenty, białka rdzeniowe HCV, lub cząsteczki adjuwanta, lub które z kolei mogą być same otoczone liposomami lub apolipobiałkami, takimi jak, na przykład, apolipobiałko B, lipobiałka o niskiej gęstości, lub wszystkimi innymi środkami umieszczania danych cząsteczek w specyficznym organie lub tkance, np. asialoglikoproteiny. Cząsteczki mogą również zawierać mniejsze struktury (w porównaniu do pustych lub wypełnionych sferycznych struktur opisanych powyżej) które są zwykle okrągłego kształtu (patrz poniżej) i które zazwyczaj nie zawierają więcej niż jedną warstwę białka otoczki HCV. Typowym przykładem takiej mniejszej cząsteczki są struktury typu rozety, które zawierają mniejszą ilość białka otoczki HC, zazwyczaj pomiędzy 4 a 16. Specyficzny przykład tego ostatniego obejmuje mniejsze cząsteczki otrzymane z E1s w 0,2% CHAPS jak przykładowo podano w niniejszym opisie, które rzeczywiście zawierają 8-10 monomerów E1s. Wspomniane struktury typu rozety są zazwyczaj zorganizowane w płaszczyźnie i mają kształt okrągły, np. w postaci koła. Ponownie, lipidy, detergenty, białka rdzeniowe HCV, lub cząsteczki adjuwanta mogą być dodatkowo włączone, lub mniejsze cząsteczki mogą być otoczone liposomami lub apolipobiałkami, takimi jak, na przykład, apolipoproteina B lub lipobiałka o niskiej gęstości, lub wszystkimi innymi środkami umieszczania danych cząsteczek w specyficznym organie lub tkance. Mniejsze cząsteczki mogą również tworzyć małe sferyczne lub ziarniste struktury zawierające podobnie zmniejszą ilość białka E1 lub E2 otoczki HCV, do których lipidy, detergenty, białka rdzeniowe HCV, lub cząsteczki adjuwanta mogą być dodatkowo włączone, lub mniejsze cząsteczki mogą być otoczone liposomami lub apolipobiałkami, takimi jak, na przykład, apolipoproteina B lub lipoproteiny niskiej gęstości, lub wszystkimi innymi środkami umieszczania danych cząsteczek w specyficznym organie lub tkance. Wielkość (czyli średnica) zdefiniowanych powyżej cząsteczek, jak zmierzono sposobami znanymi w stanie techniki, dynamicznego rozpraszania światła (patrz poniżej w części przykłady), zazwyczaj zawiera się pomiędzy 1 a 100 nm, korzystniej pomiędzy 2 a 70 nm, nawet bardziej korzystnie pomiędzy 2 a 40 nm, pomiędzy 3 a 20 nm, pomiędzy 5 a 16 nm, pomię dzy 7 a 14 nm lub pomię dzy 8 a 12 nm.

Wynalazek obejmuje również cząsteczki oligomeryczne określone powyżej, w których białka otoczki zostały wybrane z grupy zawierającej białka E1 HCV, E1s HCV, E2 HCV, SEQ ID Nr 13 lub SEQ ID Nr 14, lub ich części. Białka E1 HCV i E2 HCV, i szczegółowy opis jak się oczyszcza te białka, są dobrze opisane i scharakteryzowane w zgłoszeniu patentowym PCT/EP 95/03031 zgłoszonym przez Maertensa i wsp. E1s HCV, SEQ ID Nr 13 lub SEQ ID Nr 14, ich części, mogą być oczyszczone podobnie jak opisano dla E1 HCV lub E1s HCV w zgłoszeniu patentowym PCT/EP 95/03031 zgłoszonym przez Maertensa i wsp.

Należy podkreślić, że cała treść, włącznie z definicjami ostatniego dokumentu jest włączona jako odnośnik do niniejszego zgłoszenia. Białko E1s HCV odnosi się do reszt aminokwasowych od 192 do 326 E1 i oznacza E1 białko pozbawione jego C-końcowej hydrofobowej części zakotwiczającej w błonie. Termin lub jego części odnosi się do dowolnej cz ęści biał ek okreś lonych w niniejszym zgł oszeniu, które są immunogenne, gdy stanowią one część cząsteczki według niniejszego wynalazku.

PL 201 679 B1

Wynalazek również odnosi się do cząsteczek oligomerycznych jak opisano w niniejszym zgłoszeniu, w których przynajmniej jedna reszta cysteinowa białka otoczki HCV jak opisano powyżej, jest alkilowana, korzystnie alkilowana za pomocą czynników alkilujących, takich jak na przykład, aktywne pochodne fluorowcowe, etylenoimina lub N-(jodoetylo)trifluoroacetamid. W odniesieniu do powyższego, zrozumiałe jest że alkilowanie cystein odnosi się do cystein, w których wodór związany z atomem siarki zastąpiono (CH2)nR, w którym n oznacza 0, 1, 2, 3 lub 4 i R= H, COOH, NH2, CONH2, fenyl, lub jego dowolna pochodna. Alkilacja może być przeprowadzona dowolną metodą znaną w stanie techniki, taką jak na przykład, stosując aktywne pochodne fluorowcowe X(CH2)nR, w którym X oznacza atom fluorowca taki jak I, Br, Cl lub F. Jako przykłady aktywnych pochodnych fluorowcowych można wymienić: jodek metylu, kwas jodooctowy, jodoacetamid, i 2-bromoetyloamina. Inna metoda alkilacji obejmuje zastosowanie etylenoiminy lub N-(jodoetylo)trifluoroacetamidu, przy czym obie prowadzą do podstawienia H grupą -CH2-CH2-NH2 (Henrmanson, 1996). Termin czynniki alkilujące zgodnie z niniejszym zgłoszeniem dotyczy związków, które mogą przeprowadzać alkilowanie jak opisano w niniejszym zgłoszeniu. Takie reakcje alkilowania mogą prowadzić do otrzymania zmodyfikowanej cysteiny, która może naśladować inne aminokwasy. Alkilowanie etylenoiminą prowadzi do struktury przypominającej lizynę, w taki sposób, że zostają wprowadzone nowe miejsca cięcia w trypsynie (Hermanson 1996). Podobnie, zastosowanie jodku metylu prowadzi do aminokwasu przypominającego metioninę, podczas gdy zastosowanie jodooctanu i jodoacetamidu prowadzi do reszt aminokwasowych przypominających odpowiednio kwas glutaminowy i glutaminę. Analogicznie, te reszty aminokwasowe są korzystnie stosowane do bezpośredniej mutacji cysteiny. Dlatego też, niniejszy wynalazek odnosi się do cząsteczek oligomerycznych jak opisano w niniejszym zgłoszeniu, w których przynajmniej jedna reszta cysteinowa białka otoczki HCV jak opisano w niniejszym zgłoszeniu, została poddana mutacji do aminokwasu naturalnego, korzystnie metioniny, kwasu glutaminowego, glutaminy lub lizyny. Termin zmutowany odnosi się do mutagenezy kwasów nukleinowych ukierunkowanej miejscowo, kodujących te reszty aminokwasowe, to jest do dobrze znanych sposobów w stanie techniki, takich jak, na przykład, mutagenezy ukierunkowanej miejscowo za pomocą PCR lub poprzez mutagenezę, w której pośredniczą oligonukleotydy, jak opisano w Sambrook i wsp. (1989).

Termin oczyszczony według niniejszego zgłoszenia odnosi się do kompozycji, w której żądane składniki, takie jak na przykład, białka otoczki HCV lub cząsteczki oligomeryczne, stanowią przynajmniej 35% wszystkich składników kompozycji. Żądane składniki korzystnie stanowią przynajmniej około 40%, korzystniej przynajmniej około 50%, jeszcze korzystniej przynajmniej około 60%, jeszcze korzystniej przynajmniej około 70%, nawet bardziej korzystnie przynajmniej około 80%, nawet bardziej korzystnie przynajmniej około 90%, jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej około 95% i najkorzystniej przynajmniej około 98% całej części składników kompozycji. Kompozycja może zawierać inne związki, takie jak, na przykład, węglowodory, sole, lipidy, roztwory i tym podobne, nie wpływające na określenie czystości procentowej według niniejszego opisu. Izolowana oligomeryczna cząsteczka HCV określa kompozycję zawierającą oligomeryczną cząsteczkę HCV, o przynajmniej 35% czystości. W odniesieniu do powyższego powinno być jasne, że termin oczyszczone pojedyncze białko otoczki HCV według niniejszego opisu, odnosi się do izolowania białka otoczki HCV w zasadniczo czystej postaci. Określenia zasadniczo oczyszczone cząsteczki oligomeryczne i pojedyncze białka otoczki HCV według niniejszego opisu odnoszą się do HCV cząsteczek oligomerycznych lub pojedynczego białka otoczki HCV, takie że mogą być stosowane do metod diagnostycznych i terapeutycznych in vitro. Te HCV cząsteczki oligomeryczne są zasadniczo wolne od białek komórkowych, białek pochodzących z wektora lub innych składników wirusa HCV. Zazwyczaj, te cząsteczki lub białka są oczyszczone do jednorodności (przynajmniej 80% czystości, korzystnie 85%, korzystniej 90%, korzystniej 95%, korzystniej 97%, korzystniej 98%, korzystniej 99%, nawet bardziej korzystnie 99,5%, i najkorzystniej zanieczyszczające białka powinny być niemożliwe do wykrycia konwencjonalnymi metodami, takimi jak SDS-PAGE i barwienie azotanem srebra).

Niniejszy wynalazek obejmuje również cząsteczki oligomeryczne zdefiniowane powyżej, w których białka otoczki stanowią dowolną mieszaninę białek E1 HCV, E1s HCV, E2 HCV, SEQ ID No 13 i/lub SEQ ID No 14, lub ich części, takich jak na przykład, cząsteczka według niniejszego wynalazku może zasadniczo składać się z białek E1 HCV - i E2 HCV, białek E1 HCV i E1s HCV, białek E1s-HCV i E2 HCV i białek E1 HCV, E1s-HCV i E2 HCV. Ponadto, niniejszy wynalazek obejmuje również cząsteczki oligomeryczne zdefiniowane powyżej, w których białka pochodzą z różnych szczepów, podtypów i genotypów HCV, takich jak na przykład, białka pochodzą z genotypu 1b i genotypu 4, lub stanowią mieszaninę zawierającą białka otoczki HCV z jednego szczepu lub genotypu HCV i przynajmPL 201 679 B1 niej jednego innego szczepu lub genotypu HCV. Różne szczepy lub genotypy HCV zostały dobrze definiowane i scharakteryzowane w opisie zgłoszenia patentowego PCT/EP 95/04155 zgłoszonego przez Maertens i wsp. Należy podkreślić ponownie, że cała treść, włącznie z definicjami tego dokumentu jest włączona jako odnośnik do niniejszego zgłoszenia. Zatem, niniejszy wynalazek obejmuje cząsteczki oligomeryczne zawierające białka otoczki pochodzące z dowolnego szczepu lub genotypu HCV znanego w stanie techniki lub cząsteczek obejmujących mieszaninę białek pochodzących z dowolnego szczepu lub genotypu HCV znanego w stanie techniki. W tym zakresie niniejszy wynalazek obejmuje również sekwencje zgodne, pochodzące z poszczególnych klonów, jak przykładowo przedstawiono poniżej w części Przykłady (patrz poniżej).

Niniejszy wynalazek obejmuje również cząsteczki oligomeryczne opisane w niniejszym zgłoszeniu otrzymywane w sposób opisany poniżej, jak sam sposób otrzymywania cząsteczki oligomerycznej. Sposób ten charakteryzuje się następującymi etapami:

(I) Oczyszczanie białka otoczki HCV, możliwe jest zastosowanie pierwszego detergentu. Zasadniczo, etap I procedury oczyszczania (1) został opisany szeroko w opisie zgłoszenia patentowego PCT EP 95/03031 zgłoszonego przez Maertensa i wsp. Co ważne, według niniejszego wynalazku, etap blokowania w procedurze oczyszczania jak opisano w opisie zgłoszenia patentowego PCT/EP95/03031, np. NEM-biotyną, prowadzi się przez etap alkilowania jak opisano w niniejszym zgłoszeniu, korzystnie stosując jodoacetamid. Ponadto, w etapie I procedury oczyszczania możliwe jest zastosowanie środka, którym tnie się wiązanie dwusiarczkowe i oraz zastosowanie środka alkilującego. Na koniec, etap I procedury (I) prowadzi do uzyskania oczyszczonego białka otoczki HCV w roztworze.

(II) Zmiana roztworu oczyszczonego białka otoczki HCV na detergent lub sól, prowadząca do utworzenia cząsteczek oligomerycznych.

(III) Odzyskiwanie lub oczyszczanie cząsteczek oligomerycznych, przy czym możliwe jest zastosowanie dalszego zmniejszania stężenia detergentu lub soli z etapu II, któremu nadal towarzyszy tworzenie i stabilizacja cząsteczek oligomerycznych, utworzonych po zmianie roztworu.

Korzystnie, możliwym pierwszym detergentem jest Empigen-BB. Korzystniej, stosowanym detergentem w etapie II jest CHAPS, oktyloglukazyd lub Tween, korzystniej Tween-20 lub Tween-80, lub dowolny inny detergent. Korzystnie, solą jest betaina. Korzystnie, Empigen-BB jest stosowany w stężeniu od 1% do 10% i w którym CHAPS lub Tween jest stosowany w stężeniu od 0,01% do 10%, lub betaina jest stosowana w stężeniu od 0,01% do 10%. Korzystniej, Empigen-BB jest stosowany w stężeniu 3% i w którym CHAPS lub betaina są stosowane w stężeniach odpowiednio od 0,2% lub 0,3%, po czym bufor zostaje zmieniony i CHAPS lub betaina są stosowane odpowiednio w stężeniach 0,05% lub 0,1-0,5%. Zrozumiałe jest, że wszystkie wartości procentowe stosowane w opisanych powyżej sposobach podano jako masa/objętość. Powinno być jasne, że sposoby opisane powyżej (patrz również opis patentowy PCT/EP95/03031 i część Przykłady niniejszego zgłoszenia) stanowią przykład otrzymywania cząsteczki według niniejszego wynalazku. W tym zakresie, niniejszy wynalazek obejmuje również wszystkie inne sposoby znane w stanie techniki, które mogą być stosowane do otrzymywania cząsteczek oligomerycznych według niniejszego wynalazku, takie jak na przykład, nie stosowanie czynnika redukującego opisano w opisie zgłoszenia patentowego PCT/EP95/03031 i część przykładów (poniżej) i stosując zamiast komórki gospodarza, które mają zoptymalizowany układ redoks w siateczce endoplazmatycznej umoż liwiają cy redukcję mostków cysteinowych. Ponadto należ y wyjaśnić, że cały zakres alkilobetain może być stosowany, taki jak na przykład, z resztą Cp, w której n = liczba dodatnia od 1 do 20, jak i pochodne betainy, takie jak na przykład, sulfobetainy.

Ze względu na fakt, że po raz pierwszy skuteczną immunoterapię szympansów cierpiących na poważne, przewlekłe, aktywne zapalenie wątroby typu C uzyskano w wyniku podania szczepionek z oczyszczonego antygenu HCV, niniejszy wynalazek obejmuje również oczyszczone pojedyncze białko otoczki HCV, w szczególności E1 lub E1s.

W celu uniknięcia indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko niezwiązanym epitopom, białka otoczki HCV stosowane do szczepionek są korzystnie skonstruowane jako sekwencja zgodna z poszczególnych podtypów, szczepów, lub klonów. Dlatego też , niniejszy wynalazek również odnosi się do zastosowania antygenu HCV (bądź w postaci peptydu, białka, lub polinukleotydu) do szczepionek lub diagnostyki. Ponadto, niniejszy wynalazek również odnosi się do cząsteczki oligomerycznej, jak zdefiniowano powyżej i jej zastosowania w którym białko otoczki HCV jest kodowane przez sekwencje zgodne w oparciu o quasi-gatunkową zmienność w obrębie izolatów (izolatowe sekwencje zgodne) lub w oparciu o sekwencję zgodną różnych izolatów w obrębie podtypu (sekwencja zgodna

PL 201 679 B1 podtypu), typu lub gatunku (sekwencja zgodna typu lub gatunku), lub całego rodzaju HCV (sekwencja zgodna rodzaju). W wyniku tego, sekwencja aminokwasowa tego zgodnego białka otoczki HCV jest sekwencją zgodną pochodzącą z izolatu-, podtypu-, szczepu-, lub rodzaju. W celu objęcia terminu zgodny odnosi się on w szczególności do publikacji Maertensa i Stuyvera (1997) i tam stosowanych odnośników.

Cząsteczka oligomeryczna według niniejszego wynalazku wykazuje epitopy wyjątkowo skutecznie (patrz poniżej). Stąd, cząsteczka oligomeryczna stanowi środek do wprowadzania epitopów w taki sposób, że mogą one wywołać skuteczną odpowiedź immunologiczną. W tym kontekście, zrozumiałe jest, że białka otoczki HCV jak określono powyżej nie muszą zawierać wyłącznie epitopów HCV. Białka otoczki HCV, które tworzą cząsteczki oligomeryczne, mogą zawierać epitopy, które pochodzą jedynie z HCV i możliwe jest zastosowanie epitopów, które pochodzą z innych egzogenicznych antygenów, takich jak na przykład, HBV lub HIV. Innymi słowy, cząsteczka oligomeryczna ze szkieletem z białka otoczki HCV, może być stosowana jako nośnik do wprowadzania epitopów nie-HCV, możliwe jest zastosowanie jako dodatku do epitopów HCV. Dlatego też, niniejszy wynalazek również obejmuje cząsteczkę oligomeryczną, jak zdefiniowano powyżej ale również bez epitopów HCV oraz ich zastosowanie i otrzymywanie, wraz z epitopami nie-HCV. Termin czynnik egzogeniczny według niniejszego opisu, odnosi się do dowolnego czynnika, żyjącego lub nie, który może wywołać odpowiedź immunologiczną i który nie jest pochodzenia wewnętrznego gospodarza i który nie jest HCV. Szczegółowo, ostatni termin odnosi się do grupy zawierającej czynniki patogenne, alergeny i hapteny. Czynniki patogenne obejmują priony, wirusy, prokarionty i eukarionty. Bardziej szczegółowo, wirusy obejmują w szczególności HBV, HIV, lub wirus opryszczki, ale nie HCV. Alergeny obejmują substancje lub cząsteczki zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej u gospodarza, jeśli te alergeny dostaną się do organizmu gospodarza. Hapteny działają podobnie do alergenów w odniesieniu do zdolności do wywoływania odpowiedzi immunologicznej, ale w przeciwieństwie do alergenów, hapteny potrzebuj ą cząsteczki nośnikowej.

Termin kompozycja w postaci szczepionki dotyczy kompozycji immunogennej zdolnej do wywołania ochrony przeciwko HCV, bez względu na to czy jest część czy cała. Dlatego też kompozycja ta obejmuje peptydy HCV, białka, lub polinukleotydy. Ochrona przeciwko HCV dotyczy w szczególności ludzi, ale też odnosi się do innych naczelnych, myszy (trimer mouse) (Zauberman i wsp., 1999), lub innych ssaków.

Cząsteczki według niniejszego wynalazku mogą być stosowane w postaci natywnej, w postaci biotynylowanej (jak wyjaśniono w opisie zgłoszenia patentowego nr WO 93/18054) i/lub skompleksowane z Neutralite Avidin (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA). Należy również zauważyć, że kompozycja w postaci szczepionki obejmuje, ponadto substancje aktywne, odpowiednią zaróbkę, rozcieńczalnik, nośnik i/lub adjuwant które same nie indukują otrzymywania przeciwciał szkodliwych dla osobnika otrzymującego kompozycję ani nie wywołują ochrony. Odpowiednimi nośnikami są zazwyczaj duże makrocząsteczki metabolizowane powoli, takie jak białka, polisacharydy, kwasy polimlekowe, kwasy poliglikolowe, spolimeryzowane aminokwasy, kopolimery reszt aminokwasowych i nieaktywne cząsteczki wirusowe. Nośniki takie są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Korzystne adjuwanty do wzmacniania skuteczności kompozycji obejmują, między innymi: wodorotlenek glinu, glin w połączeniu z 3-O-deacylowanym monofosforylo lipidem A, jak opisano w opisie zgłoszenia patentowego WO 93/19780, fosforan glinu w opisie zgłoszenia patentowego WO 93/24148, N-acetylo-muramylo-L-treonylo-D-izoglutamina jak opisano w opisie patentowym U.S. nr 4,606,918, N-acetylo-muramylo-L-alanylo-D-izoglutamina, N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutamylo-L-alanino-(1',2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)etyloamina i RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, USA), które zawierają monofosforylo lipid A, detoksykowana endotoksyna, trehaloso-6,6-dimykolan i szkielet ściany komórkowej (MPL + TDM + CWS) w 2% emulsji skwalen/Tween 80. Każdy z trzech składników: MPL, TDM lub CWS może również być stosowany sam lub w połączeniu 2 na 2. Ponadto, adjuwanty takie jak Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA) lub SAF-1 (Syntex) mogą być stosowane, jak i adjuwanty takie jak połączenia pomiędzy QS21 a 3-de-O-acetylowanym monofosforylo lipidem A (WO94/00153), lub MF-59 (Chiron), lub adjuwanty oparte na poli[di(karboksylatofenoksy)fosfazenie (Virus Research Institute), lub adjuwanty oparte na blokokopolimerach takich jak Optivax (Vaxcel, Cythx) lub adjuwanty oparte na inulinie, takie jak Algammulin i Gammalnulin (Anutech), niepełny adjuwant Freunda (IFA) lub preparaty Gerbu (Gerbu Biotechnik). Zrozumiałe jest, że pełny adjuwant Freunda (CFA) może być również stosowany do zastosowań innych niż u ludzi i w celach badawczych, kompozycja w postaci szczepionki zawiera także zaróbki

PL 201 679 B1 i rozcieńczalniki, które są zawsze nietoksyczne i nie mają właściwości terapeutycznych, takie jak woda, roztwór soli, glicerol, etanol, czynniki zwilżające lub emulgujące, substancje buforujące, konserwanty itp. Zazwyczaj, kompozycja do szczepionki jest otrzymywana jako zawiesina bądź roztwór do iniekcji. Postać stała, odpowiednia do przygotowania roztworu, lub zawiesiny w płynnym nośniku, przed iniekcją może również zostać przygotowana. Preparat może również być w postaci emulsji lub zamknięty w liposomach, aby wzmocnić działanie adjuwanta. Polipeptydy mogą również być wprowadzone do kompleksów stymulujących odporność wraz z saponinami, na przykład do Quil A (ISCOMS). Kompozycja w postaci szczepionki obejmuje skuteczną immunologicznie ilość polipeptydów według niniejszego wynalazku, jak i inne wymienione powyżej składniki. Ilość skuteczna immunologicznie oznacza że podawanie tej ilości osobnikowi, bądź w postaci pojedynczej dawki, bądź w częściach jako seria, jest skuteczna w zapobieganiu lub leczeniu. Ilość ta może być różna i zależy od zdrowia i stanu fizycznego osobnika leczonego, grupy taksonomicznej leczonego osobnika (np. człowiek, inne naczelne itp.), zdolności układu odpornościowego danego osobnika do wytwarzania odpowiedzi immunologicznej, stopnia żądanej ochrony, przygotowania szczepionki, ustalenia lekarza w leczeniu, szczepu HCV i innych pokrewnych czynników. Należy się spodziewać, że ilość ta objęta jest stosunkowo szerokim zakresem i może być określana w rutynowych badaniach. Zazwyczaj, ilość będzie w zakresie od 0,01 do 1000 μg/dawkę, bardziej szczegółowo od 0,1 do 100 μg/dawkę. Kompozycje w postaci szczepionki są podawane konwencjonalnie, pozajelitowo, tradycyjnie przez iniekcję, na przykład, podskórnie lub domięśniowo. Dodatkowe preparaty odpowiednie do innych metod podawania obejmują preparaty doustne i czopki. Leczenie może obejmować pojedynczą dawkę lub wielokrotne dawki. Szczepionka może być podawana w połączeniu z innymi czynnikami immunoregulacyjnymi. Dlatego też, niniejszy wynalazek odnosi się, jak zdefiniowano powyżej, do zastosowania cząsteczek oligomerycznych profilaktycznego indukowania odporności przeciwko HCV. Należy zauważyć, że szczepionka może być również stosowana w leczeniu osobników, jak wskazano powyżej, w którym to przypadku jest ona nazywana szczepionką terapeutyczną.

Kompozycje według wynalazku, określone powyżej, mogą również zawierać rdzeń HCV, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NSSA i/lub białko NSSB, lub ich części. Cząsteczki E1, E2, i/lub E1E2 mogą, na przykład, być połączone z czynnikami stymulującymi limfocyty T, takie jak, na przykład, rdzeń, P7, NS3, NS4A, NS4B, NSSA i/lub NSSB. W szczególności, niniejszy wynalazek obejmuje kompozycje określone powyżej, w których białko NS3, lub jego części, mają sekwencje aminokwasowe dane sekwencją SEQ ID 1 lub SEQ ID 2 (patrz poniżej w części przykłady).

Oczyszczanie tych białek NS3 korzystnie obejmuje odwracalną modyfikację reszt cysteinowych, a nawet bardziej korzystnie sulfonowanie cystein. Sposób otrzymywania takich odwracalnych modyfikacji, obejmujący sulfonowanie opisano odnośnie białek NS3 w Maertens i wsp. (PCT/EP99/02547). Należy podkreślić, że cała treść, włącznie z definicjami ostatniego dokumentu jest włączona jako odnośnik do niniejszego zgłoszenia.

Jasne jest na podstawie powyższego, że niniejszy wynalazek obejmuje również zastosowanie cząsteczek oligomerycznych zdefiniowanych powyżej lub kompozycji zdefiniowanych powyżej do wytwarzania kompozycji do szczepionek HCV. W szczególności, niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie cząsteczek oligomerycznych zdefiniowanych powyżej do indukowania odporności przeciwko HCV u nosicieli przewlekle zakażonych HCV. W szczególności, niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie cząsteczek oligomerycznych zdefiniowanych powyżej do indukowania odporności przeciwko HCV u nosicieli przewlekle zakażonych HCV przed lub jednocześnie z inną dowolną terapią, taką jak na przykład, dobrze znaną terapią interferonem w połączeniu lub nie z podawaniem leków o małej wielkości cząsteczki do leczenia HCV, takich jak na przykład, rybawiryn. Kompozycja taka może również być stosowana przed lub po przeszczepie wątroby lub po przypuszczalnym zakażeniu takim jak na przykład uszkodzenia igłą. Ponadto, niniejszy wynalazek obejmuje zestaw zawierający cząsteczki oligomeryczne lub pojedyncze białka otoczki HCV według niniejszego wynalazku do wykrywania HCV przeciwciał obecnych w próbce biologicznej.

Termin próbka biologiczna według niniejszego opisu, odnosi się do a próbki tkanki lub płynu pobranej od osobnika, płynów takich jak między innymi surowicy, osocza, chłonki, skrawków zewnętrznych skóry, narządów oddechowych i dróg moczowopłciowych, oocytów, łez, śliny, mleka, komórek krwi, nowotworów, organów, wydzielin żołądkowych, śluzu, płynu rdzeniowego, wydzielin zewnętrznych, takich jak na przykład ekskrementy: mocz, sperma itp. Ze względu na fakt, że cząsteczki oligomeryczne i pojedyncze białka otoczki HCV według niniejszego wynalazku są wysoce immunogenne i stymulują odpowiedź immunologiczną zarówno humoralną jak i komórkową, niniejszy wynala14

PL 201 679 B1 zek obejmuje również zestaw do wykrywania odpowiedzi limfocytów T na HCV, obejmujący cząsteczki oligomeryczne lub oczyszczone pojedyncze białka otoczki HCV według wynalazku. Reakcja limfocytów T na HCV może być na przykład zmierzona jak opisano w części przykłady, lub jak opisano w opisie zgłoszenia patentowego PCT/EP 94/03555 zgłoszonego przez Leroux-Roels i wsp. Należ y podkreślić że cała treść, włącznie z definicjami ostatniego dokumentu jest włączona jako odnośnik do niniejszego zgłoszenia.

Powinno być jasne, że niniejszy wynalazek również odnosi się do zastosowania specyficznych immunoglobulin HCV do leczenia i zapobiegania zakażeniom HCV. W niniejszym zgłoszeniu po raz pierwszy wykazano, że wystarczający poziom przeciwciał przeciwko HCV, zwłaszcza przeciwciał przeciwko otoczce HCV, indukuje polepszenie w chorobie zapalenia wątroby typu C. Również wykazano po raz pierwszy, że wystarczający poziom przeciwciał może wiązać krążący wirus, i że obecność wirusa w kompleksie -Ab zbiega się w czasie z nie pojawianiem się antygenu HCV z wątroby, i z polepszeniem w chorobie wątroby. Przeciwciała przeciwko otoczce HCV mogą być wywołane przez szczepionkę lub mogą być biernie przenoszone przez iniekcję po tym jak przeciwciała zostały oczyszczone ze zbiorników krwi zakażonej HCV lub z krwi otrzymanej ze szczepienia HCV. Dlatego też, niniejszy wynalazek obejmuje również specyficzne przeciwciała, wytworzone przeciwko cząsteczkom oligomerycznym jak opisano powyżej lub przeciwko kompozycji jak opisano powyżej, lub pojedynczemu białku otoczki HCV. W szczególności, niniejszy wynalazek obejmuje zestaw zawierający te przeciwciała do wykrywania antygenów HCV. Termin specyficzne przeciwciała według niniejszego opisu, odnosi się do przeciwciała, które są skierowane przeciwko epitopom, które są specyficzne względem cząsteczek oligomerycznych jak ujawniono w niniejszym wynalazku. Innymi słowy, specyficzne przeciwciała są skierowane przeciwko epitopom, które powstają w czasie tworzenia i są jedynie obecne z czą steczkami oligomerycznymi. Ponadto istnieje szereg znanych procedur otrzymywania peptydów HCV. Procedury te mogą prowadzić do otrzymania peptydów HCV zdolnych do wprowadzania epitopów. Uważa się, że peptydy HCV, otrzymane tymi różnymi i różniącymi się procedurami, są zdolne do wprowadzania podobnych epitopów. Epitopy podobne są to epitopy otrzymywane w różnych układach, lub procedurach oczyszczania ale rozpoznawane przez jedno i to samo przeciwciało. Jednakże, cząsteczki oligomeryczne według wynalazku wprowadzają epitopy wyjątkowo skutecznie. W wyniku tego epitopy cząsteczek oligomerycznych są wysoce immunogenne. Dlatego też, niniejszy wynalazek również odnosi się do epitopów cząsteczek oligomerycznych, epitopy te są przynajmniej 10 razy, korzystnie przynajmniej 20 razy, korzystnie przynajmniej 50, korzystnie przynajmniej 100 razy, korzystnie przynajmniej 500 razy, a najkorzystniej przynajmniej 1000 razy bardziej immunogenne niż epitopy peptydów HCV, które nie są produkowane według niniejszego wynalazku, to jest nie produkowane przez tworzenie cząsteczek z użyciem detergentu. Specjalista w dziedzinie zrozumie, że ta immunogenność może, na przykład, być wykrywana i dlatego może być porównywana przez immunizowanie ssaków za pomocą podawania porównywalnej ilości peptydów, otrzymywanych dowolnym sposobem. Ponadto, termin specyficzne przeciwciała dotyczy również przeciwciał, które są skierowane przeciwko oczyszczonemu pojedynczemu białku otoczki HCV. Zgodnie z wynalazkiem, termin przeciwciała odnosi się do przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych. Termin przeciwciała monoklonalne odnosi się do kompozycji przeciwciał o jednorodnej populacji przeciwciał. Termin przeciwciała nie jest ograniczony do gatunku lub źródła przeciwciał, ani nie jest ograniczony sposobem otrzymywania przeciwciał. Ponadto, termin przeciwciała również odnosi się do ludzkich przeciwciał, w których przynajmniej część regionu ramki immunoglobulin pochodzi z sekwencji i pojedynczego łańcucha przeciwciała ludzkiej immunoglobuliny, takiej jak na przykład, jak opisano w opisie patentowym U.S. nr 4,946,778, z fragmentami przeciwciała takiego jak Fab, F(ab)2, Fv. Inne fragmenty, które zachowują funkcje wiązania antygenu i specyficzność względem przeciwciał rodzicielskich.

Ponadto, niniejszy wynalazek obejmuje również zastosowanie cząsteczek oligomerycznych opisanych powyżej, lub kompozycji opisanych powyżej do wykrywania przeciwciał przeciwko białkom otoczki HCV. Zgodnie z wynalazkiem, termin do wykrywania odnosi się do dowolnego testu znanego w stanie techniki odpowiedniego do wykrywania. W szczególnoś ci, termin odnosi się do dowolnego testu immunologicznego jak opisano w opisie zgłoszenia patentowego nr WO 96/13590.

Określenie peptyd, polipeptyd i białko są stosowane wymiennie w niniejszym wynalazku. Polipeptyd odnosi się do polimeru z reszt aminokwasowych (sekwencja aminokwasowa) i nie odnosi się do specyficznej długości cząsteczki. Zatem, oligopeptydy obejmują w zakresie definicji polipeptyd. Zrozumiałe jest, że związki imitujące peptydy są objęte określeniem polipeptyd, peptyd i białko.

PL 201 679 B1

Również, niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie cząsteczek oligomerycznych jak opisano w niniejszym zgł oszeniu do indukowania odporności przeciwko HCV, charakteryzują cych się tym, że są stosowane jako część „serii czasowych związków. W tym zakresie, zrozumiałe jest, że termin seria czasowa związków odnosi się do podawania osobnikowi w okresach czasowych związków stosowanych do wywołania odpowiedzi immunologicznej. Końcowe związki obejmują dowolny z następujących składników: cząsteczki oligomeryczne, kompozycja DNA HCV do szczepionki, polipeptydy HCV.

W odniesieniu do powyż szego, serie obejmują podawanie:

(I) antygenu HCV, takiego jak, na przykład, cząsteczka oligomeryczna, w okresach czasowych, lub (II) antygenu HCV, takiego jak, na przykład, cząsteczka oligomeryczna w połączeniu z kompozycją DNA HCV do szczepionki, w której ta cząsteczka oligomeryczna i kompozycja DNA HCV do szczepionki, może być podawana jednocześnie lub w różnych odstępach czasowych, włącznie ze zmiennymi odstępami czasowymi, lub (III) (I) lub (II), możliwie w połączeniu z innymi peptydami HCV, z odstępami czasowymi.

W odniesieniu do powyż szego, powinno być jasne, ż e kompozycja HCV DNA do szczepionki zawiera kwas nukleinowy kodujący peptyd otoczki HCV, obejmujący peptydy E1-, E2-, E1/E2-, peptyd E1s, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, peptyd NS3, inne peptydy HCV, lub części tych peptydów. Ponadto, zrozumiałe jest, że te peptydy HCV zawierają peptydy otoczki HCV, obejmujące peptydy E1-, E2-, E1/E2-, peptyd E1s, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, peptyd NS3, inne peptydy HCV, lub ich części. Termin inne peptydy HCV odnosi się do dowolnego peptydu HCV lub jego fragmentu pod warunkiem, że ten peptyd HCV nie jest E1, E2, Els, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, lub NS3. W punkcie II powyższego schematu, kompozycja HCV DNA do szczepionki zawiera korzystnie kwas nukleinowy kodujący peptydy otoczki HCV. W punkcie II powyższego schematu, kompozycja HCV DNA do szczepionki zawiera nawet bardziej korzystnie kwas nukleinowy kodujący peptyd otoczki HCV, możliwe jest zastosowanie w połączeniu z kompozycją HCV-NS3 DNA do szczepionki. W związku z powyższym, powinno być jasne, że kompozycja HCV DNA do szczepionki zawiera wektor plazmidowy obejmujący polinukleotydową sekwencję kodującą peptyd HCV jak opisano powyżej, funkcjonalnie związany z elementami regulują cymi transkrypcję . Zgodnie z wynalazkiem, wektor plazmidowy odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnego do przenoszenia innego kwasu nukleinowego, z którym został połączony. Korzystne wektory są zdolne do autonomicznej replikacji i/albo ekspresji kwasów nukleinowych, z którymi są one związane. W ogólności, ale nie ograniczając zakresu wynalazku wektory plazmidowe to kolista podwójna nić DNA która, w postaci wektorowej nie jest związana z chromosomem. Zgodnie z wynalazkiem, sekwencja polinukleotydowa odnosi się do polinukleotydu takiego jak kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA), oraz, gdzie jest to wskazane do kwasu rybonukleinowego (RNA). Termin ten również powinien również obejmować, jako ekwiwalenty, analogi zarówno RNA jak i DNA wytworzone z analogów nukleotydów i pojedyncze (sensowe lub antisensowe) oraz dwuniciowe polinukleotydy. Zgodnie z wynalazkiem, termin elementy regulujące transkrypcję odnosi się do sekwencji nukleotydowej, która zawiera konieczne elementy regulujące, takie, że po wprowadzeniu do żywej komórki kręgowców będzie on w stanie skierować maszynerię komórkową do otrzymywania produktów translacji kodowanych przez polinukleotydy. Termin funkcjonalnie związane odnosi się do umieszczenia obok siebie składników, które są tak skonfigurowane, że wykonują swoje zwykłe funkcje. Zatem, elementy regulujące transkrypcję funkcjonalnie związane z sekwencją nukleotydową są zdolne do skutecznej ekspresji danej sekwencji nukleotydowej. Specjalista w dziedzinie uzna, że różne promotory, terminatory transkrypcji, wektory lub specyficzne sekwencje genowe mogą być skutecznie stosowane.

Na zakończenie, niniejszy wynalazek obejmuje test immunologiczny do wykrywania przeciwciał przeciwko HCV, który to test obejmuje: (1) zapewnienie cząsteczki oligomerycznej lub oczyszczonego pojedynczego białka otoczki HCV jak zdefiniowano powyżej, lub jego funkcjonalnego ekwiwalentu, (2) inkubowanie próbki biologicznej z cząsteczką oligomeryczną, lub białkiem otoczki HCV w takich warunkach, które umożliwiają tworzenie kompleksu przeciwciało-antygen, (3) określenie czy został utworzony kompleks przeciwciało-antygen zawierający tę cząsteczkę oligomeryczną lub białka otoczki HCV.

Niniejszy wynalazek zostanie przedstawiony na załączonych przykładach, które przedstawiają najbardziej korzystne rozwiązania. Jednakże, należy zauważyć, że te rozwiązania stanowią jedynie ilustrację i nie mogą być uważane za ograniczenie wynalazku.

PL 201 679 B1

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1: Ekspresja, oczyszczanie, i homo-oligomeryzacja z zastosowaniem detergentu białka HCV E1

Prowadzono ekspresję białka HCV E1s (reszt aminokwasowych 192-326) i oczyszczono z komórek RK13, stosując zrekombinowany wirus krowianki pvHCV-1 1A według protokołu opisanego w Maertens i wsp. (PCT/EP 95103031). Ponadto, oczyszczone białko E1 w 3% Empigen-BB, które wykazuje rzeczywistą masę cząsteczkową odpowiadającą homo-dimerowi E1 (około 60000; Fig. 1), zebrano razem i zebrane frakcje ponownie naniesiono na kolumnę chromatografii wykluczającej (według PCT/EP 95/03031) i analizowano w obecności 0,2% CHAPS lub 3% betainy. Niespodziewanie, pomimo, że białko E1s jest pozbawione regionu zakotwiczającego w błonie, jednorodna populacja specyficznie zasocjowanych E1 homo-oligomerów o rzeczywistej masie cząsteczkowej wynoszącej 260-280000 może być otrzymana z obydwoma detergentami (Fig. 2). Takie struktury homooligomeryczne mogą zawierać przybliżoną liczbę 9 monomerów E1s. Powinno być jasne że ostatnia wartość jest tylko zgrubnym przybliżeniem ze względu fakt, że kształt oligomeru może bardzo wpływać na rzeczywistą masę cząsteczkową co zmierzono przy wykorzystaniu chromatografii wykluczającej. W wyniku zmiany z 0,2% CHAPS na 0,05% CHAPS i powtarzając tą samą procedurę, rzeczywista masa cząsteczkowa jest przesuwana dalej powyżej rozdzielczości kolumny (pusta przestrzeń kolumny, > 600000, Fig. 3), sugerując tworzenie cząsteczek. Zmiana z 3% betainy na 0,1% betainy prowadzi do otrzymania populacji oligomerów E1s o podobnym zachowaniu (dane nie przedstawione). Inne detergenty mogą być wybrane tak, aby uzyskać podobną oligomeryzację jak w sposobie z zastosowaniem detergentu. Oligomeryzacja prowadząca do tworzenia cząstki nie jest ograniczona do CHAPS lub betainy, gdyż podobne wyniki otrzymano przez zastosowanie Tween-20 lub Tween-80, lub oktyloglukazydu. Ponadto, dalsze usuwanie detergentu jest możliwe, co umożliwi utworzenie nawet większej cząsteczki. Obecność detergentu może, dlatego nie być wymagana do otrzymywania cząsteczek. Cząsteczki mogą być otrzymane stosując np. SCC, bez żadnego detergentu. Należy zauważyć, że monomer, E1 ma w przybliżeniu masę 31000, podczas gdy monomer E2 - 70000. Wartości te, jednakże, mogą się różnić w zależności od stopnia glikozylacji białka.

P r z y k ł a d II: Analiza oligomerycznych struktur E1s wyższego rzędu za pomocą dynamicznego rozpraszania światła.

W celu potwierdzenia niespodziewanego wyniku, że otrzymano cząsteczki, preparaty E1s w 0,05% CHAPS i 0,1% betainy otrzymane według przykładu 1, lub w 0,1% betainy, otrzymane w wyniku rozcieńczenia preparatów w 0,5% betainy, poddano analizie za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS).

Metodą dynamicznego rozpraszania światła mierzono ruchy Browna i odnoszono je do wielkości cząsteczek. Im większa cząsteczka, tym powolniejsze ruchy Browna. Szybkość ruchów Browna jest definiowana własnością znaną jako współczynnik dyfuzji (zazwyczaj określaną symbolem D). Rozmiar cząsteczki obliczono na podstawie współczynnika dyfuzji przez zastosowanie równania Stokesa-Einsteina: d(H)=kT/3nqD, w którym d(H) oznacza średnicę hydrodynamiczną, k oznacza stałą Boltzmanna, T oznacza temperaturę w Kelwinach, η oznacza szybkość. Należy podkreślić, że zmierzona średnica jest wartością, która odnosi się do tego jak cząsteczka dyfunduje w płynie. Zatem, określana jest jako średnica hydrodynamiczna. Współczynnik dyfuzji pochodzi z funkcji autokorelacji (zmiany intensywności fluktuacji światła w czasie). Przyrząd automatycznie wykorzystuje korelator kontrolowany komputerowo w celu obliczenia intensywności funkcji autokorelacji.

Do pomiarów rozmieszczenia wielkości, powyższa funkcja autokorelacji jest korygowana aby otrzymać krzywe liniowe oraz przyrząd jest wyposażony w program komputerowy do analizy rozmieszczenia wielkości. Jednakże, technika ta ma założenia ograniczające, podobnie jak technika zwana - wielokątowe laserowe rozpraszanie światła (MALLS - multi angle laser light scattering) i w żadnej z metod nie można uważać, że otrzymane dane są absolutne. Wyniki rozmieszczenia wielkości uzyskane DLS muszą być interpretowane jako półilościowe wskaźniki polirozproszenia, raczej niż prawdziwego oznaczenia rozmieszczenia.

Próbki zawierające cząsteczki E1s (80-400 gg E1s/ml PBS-0,05% CHAPS, 0,1% lub 0,5% betainy) odpipetowano do komórek pomiarowych urządzenia LSP 3.53 DLS wyposażonego w 10 mW laser HeNe (PolimerLabs). Odczyt wyników analizy przedstawiono na fig. 4 (E1s w 0,05% CHAPS) i 5 (E1s w 0,1% lub 0,5% betainy).

Powyższe analizy w rzeczywistości potwierdziły niespodziewany wynik, że otrzymane struktury E1s były monorozproszonymi cząsteczkami sferycznymi. Cząsteczki E1s w PBS/0,1% betainy wykaPL 201 679 B1 zały średni rozkład wielkości 21,3 ± 4 nm, w PBS/0,5% betainy: 27,9 ± 5 nm, podczas gdy otrzymano średnicę 12,5 dla E1s w PBS/0,05% CHAPS.

P r z y k ł a d III: Analiza wielkości i kształtu za pomocą mikroskopii elektronowej.

Dziesięć μl E1s (226 μg/ml w PBS/0,05% CHAPS; i 143 μg/ml w PBS 3% betainy) uwidoczniono standardowym negatywnym barwieniem 1% octanem uranylu na stabilizowanej siatce węglowej (formvar grids). Próbkę nanoszono przez 30 sekund a następnie przemyto dH2O przed barwieniem przez 5 sekund i sfotografowano (Fig. 6).

W analizie statystycznej otrzymano następujące wyniki: cząsteczki E1s w CHAPS mają średnią średnicę 8,7 ± 0,27 nm (zakres 4,3-29,0; 95% CI 5,4) i cząsteczka E1s w betainie była mniej jednorodna o średniej średnicy 9,7 ± 0,55 nm (zakres 4,3-40,5; 95% CI 11,0). Niespodziewanie, preparat 3% betainy, który początkowo wykazywał Mcz 250000-300000 jak wyznaczano metodą SEC wykazuje nawet większe cząsteczki niż preparaty 0,05% CHAPS, który początkowo wykazywał Mcz >600000. Dlatego też postawiono hipotezę, że pośrednie formy homo-oligomeryczne E1s otrzymane w 3% betainie mogą tworzyć cząsteczki wyższego rzędu wraz z upływem czasu. Ten niespodziewany efekt, wskazuje na inne możliwości otrzymywania cząsteczek wyższego rzędu. Rozmieszczenie wielkości cząsteczek (Fig. 7) wykazuje, że preparat CHAPS jest monorozproszony, pomimo, że tworzenie się ogonów do większej wielkości cząsteczki jest obserwowana (aż do 29 nm w 0,05% CHAPS). Ze względu na fakt, że większe struktury są szacowane zbyt wysoko w analizach DLS, obecność tych większych cząsteczek, pomimo, że w mniejszej ilości, może wyjaśniać większą średnicę otrzymaną analizą DLS (przykład II). Różnica w średnicy może również być wyjaśniona faktem że pomiary DLS cząsteczki dokonywane są w ruchu, podczas gdy mikroskopii elektronowej mierzy się cząsteczki stabilne. Powinno być jasne, że immunogenność tych preparatów jak pokazano w przykładach poniżej, wynika z całości preparatu i może wynikać ze średniej, mniejszej, lub większej cząsteczki, lub ich mieszaniny.

P r z y k ł a d IV: Immunizacja szympansa z zakażeniem przewlekłym HCV podtypu 1b

Szympansa (Phil) już zakażonego przez ponad 13 lat (5015 dni przed immunizacją) podtypu HCV szczepu 1b zaszczepiono szczepionką z E1 (reszty aminokwasowe 192-326), która pochodziła z innego szczepu o genotypie 1b, o 95,1% identyczności na poziomie aminokwasowym (patrz również Tabela 2), i które otrzymano jak opisano w przykładach I-III. Szympans otrzymał całkowitą ilość 6 domięśniowych immunizacji, każdy 50 μg E1 w PBS/0,05% CHAPS zmieszane z RIBI R-730 (MPLA+TDM+CWS) według protokołu producenta (Ribi Inc. Hamilton, MT). 6 immunizacji podano w dwóch seriach po trzy zastrzyki z trzytygodniową przerwą i z okresem latencji 4 tygodnie pomiędzy dwoma seriami. Rozpoczynając 250 dni przed immunizacją, w czasie okresu immunizacji i do 9 miesięcy po immunizacji (ale patrz poniżej) szympans był stale monitorowany pod kątem różnych parametrów charakteryzujących aktywność choroby indukowanej przez HCV. Parametry te obejmują analizę krwi, ALT, AST, gammaGT, analizę krwi, obciążenie wirusowe w osoczu, obciążenie wirusowe w wątrobie i histologię wątroby. Ponadto, odpowiedź immunologiczną na immunizację monitorowano zarówno na poziomie humoralnym jak i komórkowym. W tym okresie zwierzę było również monitorowane pod kątem ubocznego działania szkodliwego immunizacji, takiego jak zmiana zachowania, objawy kliniczne, masa ciała, temperatura ciała, miejscowe odczyny (zaczerwienienie, opuchlizna, stwardnienie). Żadnych takich działań nie wykryto.

Jasne jest, że poziom ALT (a zwłaszcza gammaGT, dane nie przedstawione) obniżył się jak tylko poziom przeciwciał przeciwko E1 osiągnął maksimum (Fig. 11). Poziom ALT wrócił do poprzedniego raczej szybko, jak tylko poziom przeciwciał zaczął się obniżać, lecz poziom gammaGT pozostał na niższym poziomie tak długo jak przeciw-E1 pozostał wykrywalny. Poziomy

Antygen E2 w wątrobie obniżył się do prawie niewykrywalnego poziomu w okresie, w którym poziom przeciwciał skierowanych przeciwko E1 był wykrywalny i antygen E2 wrócił do poprzedniego tuż po zniknięciu tych przeciwciał. Gdy antygen rdzenia i antygen E2 staje się niewykrywalny w wątrobie, zapalenie wątroby znacząco obniża się (patrz również Tabela 3). Jest to główny dowód, że szczepionka indukuje redukcję uszkodzenia wątroby, prawdopodobnie przez usuwanie, przynajmniej częściowo, antygenów wirusowych z głównego organu zaatakowanego przez ten wirus, wątroby.

Poziom wiremii, jak zmierzono stosując Ampliclub HCV Monitlub (Roche, Bazylea, Szwajcaria), pozostał w przybliżeniu niezmieniony w osoczu w czasie całego okresu badań.

Bardziej szczegółowe analizy odpowiedzi humoralnej ujawniły, że najwyższy punkt końcowy miana osiągnął 14,5 x 10³ (po szóstej immunizacji) i że miano to spadło do poziomu niewykrywalnego 1. rok po immunizacji (fig. 8). Fig. 9 przedstawia że główne epitopy, które mogą być naśladowane przez peptydy, rozpoznawane przez chłoniaki z limfocytów B są zlokalizowane na N-końcowym regio18

PL 201 679 B1 nie E2 (peptydy V1V2 i V2V3, szczegóły dotyczące stosowanych peptydów patrz Tabela 4). Ze względu na fakt, że reaktywność przeciwko zrekombinowanemu E1 jest wyższa i trwa dłużej, można to również wywnioskować z tej figury, że przeciwciała rozpoznające te peptydy oznaczają jedynie część całej populacji przeciwciał przeciwko E1. Pozostała część jest skierowana przeciwko epitopom, które nie mogą być naśladowane przez peptydy, to jest epitopom nieciągłym. Epitopy takie są jedynie obecne w całej cząsteczce E1 lub nawet jedynie w strukturach typu cząsteczki. Taka odpowiedź immunologiczna przeciwko E1 wyjątkowa, przynajmniej w porównaniu do tego co jest normalnie obserwowane u ludzi zakażonych chronicznie HCV (WO 96/13590 zgłoszone przez Maertens i wsp.) i u szympansów (van Doorn i wsp., 1996), które produkują przeciwciał a skierowane przeciwko E1s w swojej naturalnej odpowiedzi na zakaż enie. U tych pacjentów, przeciwciała skierowane przeciwko E1 są również po części skierowane przeciwko nieciągłym epitopom, ale w znacznej części są skierowane przeciwko epitopowi C4 (±50% surowicy krwi pacjenta), w mniejszej proporcji przeciwko V1V2 (w zakresie od 2-70% w zależności od genotypu), a reaktywność przeciwko V2V3 była jedynie wyjątkowo notowana (Maertens i wsp., 1997).

Analiza reaktywności chłoniaków z limfocytów T wskazała, że również ta część układu immunologicznego jest stymulowana szczepionką w specyficzny sposób, gdyż wskaźnik stymulacji chłoniaków z limfocytów T wzrasta od 1 do 2,5, i pozostaje w pewien sposób podniesiony w czasie nastę pującym (fig. 10). Tylko taka reaktywność chłoniaków z limfocytów T jest obserwowana jako długoterminowa odpowiedź na terapię interferonem (patrz: opis zgłoszenia patentowego PCT/EP 94/03555 zgłoszonego przez Leroux-Roels i wsp.; Leroux-Roels i wsp., 1996).

P r z y k ł a d V: Immunizacja nosicieli zakażonych chronicznie HCV o różnym podtypie

Szympansa (Ton) już zakażonego HCV przez ponad 10 lat (3809 dni przed immunizacją) o genotypie 1a zaszczepiono szczepionką z E1 o genotypie 1b, o jedynie 79,3% identyczności na poziomie aminokwasowym (patrz również Tabela 2), i otrzymano jak opisano w uprzednich przykładach. Szympans otrzymał całkowitą ilość 6 domięśniowych immunizacji, każdy 50 μg E1 w PBS/0,05% CHAPS zmieszane z RIBI R-730 (MPLA+TDM+CWS) według protokołu producenta (Ribi Inc. Hamilton, MT). 6 immunizacji podano w dwóch seriach po trzy zastrzyki z trzytygodniową przerwą i z okresem latencji 6 tygodni pomiędzy dwoma seriami. Rozpoczynając 150 dni przed immunizacją, w czasie okresu immunizacji i do 1 roku po immunizacji (ale patrz poniżej) szympans był stale monitorowany pod kątem różnych parametrów charakteryzujących aktywność choroby indukowanej przez HCV. Parametry te obejmują analizę krwi, ALT, AST, gammaGT, analizę krwi, obciążenie wirusowe w osoczu, obciążenie wirusowe w wątrobie i histologię wątroby. Ponadto, odpowiedź immunologiczną na immunizację monitorowano zarówno na poziomie humoralnym jak i komórkowym. W tym okresie zwierzę było również monitorowane pod kątem ubocznego działania szkodliwego immunizacji, takiego jak zmiana zachowania, objawy kliniczne, masa ciała, temperatura ciała, miejscowe odczyny (zaczerwienienie, opuchlizna, stwardnienie). Żadnych takich działań nie wykryto.

Jasne jest że, poziom ALT (a zwłaszcza gammaGT, dane nie przedstawione) obniżył się jak tylko poziom przeciwciał przeciwko E1 osiągnął maksimum (Fig. 8). Poziom ALT wrócił do poprzedniego raczej szybko, jak tylko poziom przeciwciał zaczął się obniżać, lecz poziom gammaGT pozostał na niższym poziomie tak długo jak przeciw-E1 pozostał wykrywalny. Poziom ALT był nawet znacząco obniżony po szczepieniu (62 ± 6 U/I) jak porównano do okresu przed szczepieniem (85 ± 11 U/I). Ze względu na fakt, że mniej markerów uszkodzenia tkanki odzyskało właściwości w surowicy, uzyskane wyniki były pierwszą wskazówką, że szczepienie indukowało poprawę w chorobach wątroby.

Poziom antygenu E2 w wątrobie stał się prawie niewykrywalny w okresie, w którym poziom przeciwciał skierowanych przeciwko E1 pozostał powyżej miana 1,0 x 10³, ale ponownie stał się wykrywalny w czasie gdy poziom przeciwciał E1 był niższy. Wraz ze zniknięciem antygenów HCV, zapalenie wątroby znacząco zmniejszyło się z umiarkowanie aktywnej postaci chronicznego zapalenia wątroby do postaci minimalnej przetrwałej zapalenia wątroby (patrz również Tabela 3). Jest to kolejny główny dowód, że szczepionka indukuje redukcję uszkodzenia wątroby, prawdopodobnie przez usuwanie, przynajmniej częściowo, antygenów wirusowych z głównego organu zaatakowanego przez ten wirus, wątroby.

Poziom wiremii, jak zmierzono stosując Ampliclub HCV Monitlub (Roche, Bazylea, Szwajcaria), pozostał w przybliżeniu niezmieniony w osoczu w czasie całego okresu badań. Bardziej szczegółowa analiza odpowiedzi humoralnej ujawniła, że najwyższy punkt końcowy miana osiągnął 30 x 10³ (po szóstej immunizacji) i że miano to spadło do poziomu niewykrywalnego dziewięć miesięcy po immunizacji (fig. 8). Fig. 12 przedstawia że główne epitopy, które mogą być naśladowane przez peptydy, rozpoznawane przez chłoniaki z limfocytów B są zlokalizowane na N-końcowym regionie E2 (peptydy

PL 201 679 B1

V1V2 i V2V3, szczegóły dotyczące stosowanych peptydów patrz Tabela 4). Ze względu na fakt, że reaktywność przeciwko zrekombinowanemu E1 jest wyższa i trwa dłużej, można to również wywnioskować z tej figury, że przeciwciała rozpoznające te peptydy oznaczają jedynie część całej populacji przeciwciał przeciwko E1. Pozostała część jest skierowana przeciwko epitopom, które nie mogą być naśladowane przez peptydy, to jest epitopom nieciągłym. Epitopy takie są jedynie obecne w całej cząsteczce E1 lub nawet jedynie w strukturach typu cząsteczki. Taka odpowiedź immunologiczna przeciwko E1 wyjątkowa, przynajmniej w porównaniu do tego co jest normalnie obserwowane u ludzi zakażonych przewlekle HCV, które produkują przeciwciała skierowane przeciwko E1s w swojej naturalnej odpowiedzi na zakażenie. U tych pacjentów, przeciwciała skierowane przeciwko E1 są również po części skierowane przeciwko nieciągłym epitopom, ale w znacznej części są skierowane przeciwko epitopowi C4 (±50% surowicy krwi pacjenta), w mniejszej proporcji przeciwko V1V2 (w zakresie od 270% w zależności od genotypu), a reaktywność przeciwko V2V3 była jedynie wyjątkowo notowana (Maertens i wsp., 1997).

Ze względu na zakażenie szympansa izolatem 1a odpowiedź przeciwciał była również oszacowana ze względu na tworzenie sieciowania z antygenem E1-1a. Jak widać na fig. 13, takie sieciujące przeciwciała są w rzeczywistości tworzone, pomimo, że tworzą one jedynie część całkowitej populacji przeciwciał. Godna zauważenia jest korelacja pomiędzy ponownym pojawieniem się antygenu wirusowego w wątrobie i zniknięciem wykrywalnego przeciwciała skierowanego przeciw 1a E1 w osoczu.

Analiza reaktywności chłoniaków z limfocytów T wskazała, że również ta część układu immunologicznego jest stymulowana szczepionką w specyficzny sposób, gdyż wskaźnik stymulacji chłoniaków z limfocytów T wzrasta od 0,5 do 5, i pozostaje w pewien sposób podniesiony w czasie następującym (fig. 14).

P r z y k ł a d VI: Ponowne wzmocnienie E1 nosicieli cierpiących na chroniczne zapalenie HCV

Ze względu na to, że miana przeciwciał E1 obserwowane w przykładach IV i V nie były stabilne i zmniejszało się z upływem czasu, nawet do niewykrywalnego poziomu u zakażonego 1b szympansa, badano, jeśli ta odpowiedź przeciwciał mogłaby wzrosnąć ponownie przez dodatkowe wzmocnienie. Oba szympansy immunizowano ponownie podając trzy kolejne domięśniowe immunizacje z trzytygodniową przerwą (50 μg E1 zmieszany z adjuwantem RIBI). Jak można wywnioskować z fig. 8 i 11, odpowiedź przeciwciał skierowanych przeciwko E1 może rzeczywiście być wzmocniona, ponownie poziom antygenu wirusowego w wątrobie obniżył się poniżej wykrywalnego poziomu. Pomimo to u Tona obciążenie wirusowe w osoczu pozostało stałe (Fig. 11). Po raz pierwszy w następującym okresie zmierzono poziom wiremii < 10⁵ ekwiwalentów genomowych na ml.

Ważne jest odkrycie, że podobnie jak w pierwszej serii immunizacji szympans zakażony podtypem szczep 1b HCV (Phil) odpowiada niższym mianem przeciwciał skierowanych przeciwko E1, niż u szympansa zakażonego podtypem szczepu 1a HCV (najwyższe miano w pierwszej serii 14,5 x 10³ względem 30 x 10³ u Tona i po dodatkowym wzmocnieniu jedynie 1,2 x 10³ u Phila względem 40 x 10³ u Tona). Pomimo, że u obu zwierząt korzystne działanie wydaje się podobne, można wywnioskować z tego doświadczenia, że immunizacja nosicieli cierpiących na zapalenie chroniczne przy pomocy białek E1 pochodzących z innego podtypu lub genotypu może być szczególnie korzystne w osiągnięciu wyższego miana, być może otoczenie wcześniej istniejących i specyficznej supresji immunologicznej obecne u gospodarza i wywołanych przez zakażający podtyp lub genotyp. W innym rozwiązaniu, niższe miana obserwowane w jednorodnych zestawieniach (1b szczepionka + zakażenie 1b) może wykazywać wiązanie przeważającej części przeciwciał skierowanych przeciwko wirusowi. Dlatego też, zaindukowane przeciwciała mogą mieć zdolności neutralizujące.

P r z y k ł a d VIIa: Konstrukcja białka NS3 łącząca główne epitopy znane z korelacji z opanowaniem infekcji

Również inne epitopy oprócz E1 mogą być związane z usuwaniem HCV w czasie fazy ostrej lub terapii interferonem. Kilka z tych epitopów jest zlokalizowane w obrębie NS3 (Leroux-Roels i wsp., 1996; Rehermann i wsp., 1996 i 1997; Diepolder i wsp., 1995 i 1997). Dwa z głównych epitopów stanowią epitopy CTL zmapowane przez Rehermanna i współpracowników (reszty aminokwasowe 1073-1081) i epitop chłoniaków z limfocytów T (CD4) zmapowany przez Diepoldera i współpracowników (reszty aminokwasowe 1248-1261). Niestety epitopy te są rozrzucone w obrębie całego białka NS3. W celu otrzymania przynajmniej tych dostępnych epitopów, potrzebne byłoby stosunkowo duże białko (reszty aminokwasowe 1073-1454). Produkowanie takiego dużego białka zazwyczaj prowadzi do niskich wydajności i może mieć wpływ na odpowiedź na szczepionki, która następuje jedynie na małe cząsteczki docelowe w ważnych epitopach. Dlatego też, otrzymywanie mniejszego białka było by

PL 201 679 B1 bardziej odpowiednie do rozwiązania tego problemu. W tym celu, niektóre epitopy muszą być przeniesione w obręb takiego mniejszego białka. Wykorzystując obecną wiedzę, że inny epitop CTL (reszty aminokwasowe 1169-1177), który nie jest związany z usuwaniem HCV (Rehermann i wsp. 1996, 1997), cząsteczka NS3 została zaprojektowana tak, że rozpoczyna się przy resztach aminokwasowych 1166 i kończy przy reszcie aminokwasowej 1468 (Tabela 5). Konstrukt ten już obejmuje epitopy opisane przez Weinera i współpracowników, i Diepoldera i współpracowników. W wyniku mutacji regionu 1167 do 1180 do sekwencji regionu od 1071 do 1084, nie-związany epitop CTL został zmieniony przez epitop Rehermanna i współpracowników, który jak stwierdzono jest związany z usuwaniem wirusów. Konstrukt ten był dodatkowo zmodyfikowany tak aby zawierał metioninę w pozycji 1166 umożliwiając inicjację translacji. Ta reszta metioninowa będzie odcięta w E. coli gdyż po niej następuje alanina. W ten sposób, wprowadzenie nowych epitopów, które nie są obecne w naturalnym NS3, jest ograniczone do minimum. W innym rozwiązaniu, jeśli ekspresja tego białka mogłaby być nieporęczna, epitop CTL może być związany z C-końcowym przy resztach aminokwasowych 1468 jak przedstawiono szczegółowo w Tabeli 5.

Sekwencja kodująca fragment NS-3 HCV została wyizolowana i poddana ekspresji jak opisano w Maertens i WSP. (PCT/EP99/02547; klon 19b; reszty aminokwasowe 1188-1468 HCV stosowano jako materiał wyjściowy). Epitop CTL jak opisano przez Rehermanna i nie obecny we fragmencie 19b NS-3 stosowano do tego fragmentu. Skonstruowano fuzję obu N-końca i C-końca, gdyż wpływ fuzji na poziom ekspresji, podatność na rozkład proteolityczny i funkcjonalność może zależeć od decyzji epitopu.

Stosując plazmid pIGRI2NS-3, który jest plazmidem ekspresyjnym E. coli umożliwiającym ekspresję fragmentu NS-3 19b pod kontrolą lewoskrętnego promotora faga lambda, jak matrycy do PCR, sekwencje kodujące NS3 19b, stosowane odpowiednio N- i C-końcowo z epitopem Rehermanna CTL (nazwanymi odpowiednio NS-319bTn i NS-3 19bTc), zostały wklonowane jako pierwsze do pGEM-T (Promega) wektora do klonowania, powodując powstanie wektorów pGEM-TNS-319bTn i pGEM-TNS-319bTc. Sekwencje otrzymane metodą PCR zweryfikowano analizując sekwencje DNA.

W przypadku fuzji sekwencji epitopu chł oniaków z limfocytów T z regionem N-koń cowym NS-3, prowadzono PCR stosując starter o długości sekwencji zawierający epitop CTL i krótki antysensowny starter homologiczny z sekwencją 3' kodonu stop NS-3 19b.

Sekwencje startera przedstawiono poniżej.

Starter 9038 (sensowy)

5'GCCATGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTCGTGCGG

CTGTTTGCACCCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGG-3' (SEQ ID NO 5)

Starter 1901 (antysensowy)

5'-TTTTATCAGACCGCTTCTGCG-3' (SEQ ID NO 6)

W przypadku fuzji C-koń cowej NS-3, PCR prowadzono stosując krótki starter sensowy homologiczny z sekwencją 5' kodonu start NS-3 19b i długi antysensowy starter zawierający epitop CTL po którym w ramce występują kodony stop. Startowe sekwencje przedstawiono poniżej.

Starter 1052 (sensowy)

Starter 9039 (antysensowy)

5'-CTCTAGACTATTAACCGTGGTAAACGGTCCAGCAAACACCGTTGATGCAGGTC

GCCAGGCTGAAGTCGACTGTCTGG-3' (SEQ ID NO 8)

Rozpoczynając od sekwencji kodującej wklonowanej do wektorów pGEM-T, sekwencje NS-3 19bT wprowadzono do wektora ekspresyjnego pIGRI2 w E. coli. Do fuzji N-końca NS-3 19bT, sekwencję kodującą NS-3 19bT wyizolowano jako fragment 379 bp NcoI/SnaBI i ligowano z fragmentami SnaB1/AIIwNI i ALwNI/NcoI z wektora pIGRI2NS-3, otrzymując wektor pIGRI2NS-3Tn. Do fuzji C-końcowej NS-3 19bT, sekwencję kodującą NS-3 19bT wyizolowano jako fragment 585 bp SnaPL 201 679 B1

BI/SpeI i wprowadzono do SnaBI/SpeI otwartego wektora pIGRI2NS2-3, prowadzącą do wektora pIGRI2NS-3Tc.

Zarówno wektorem pIGRI2NS-3Tn jak i pIGRI2NS-3Tc następnie transformowano ekspresyjnego szczepu E. coli MC1061(pAcI) i po indukcji temperaturą promotora lambda PL poziom ekspresji analizowano metodami SDS-PAGE i Western blot, stosując poliklonalną surowicę króliczą anty NS-3.

Sekwencja aminokwasowa białka NS-3 19bTn

MATCINGVCWTVYHGRAAVCTRGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQ

TFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDP

NIRTGVRTITTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDinCDECHSIDSTSILGIGTVLDQAE

TAGARLVVLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSSTGEIPFYGKAIPIEVIKGGRHLIFCHSK

KKCDELAAKLSGFGINAVAYYRGLDVSVIPTSGDVVVVATDALMTGFTGDFDSVIDC

NTCVTQTVDFS (SEQ ID NO 1)

Sekwencja aminokwasowa białka NS-3 19bTc

MGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPA

AYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPNIRTGVRTITTGAPTTYSTYGKF

LADGGCSGGAYDIHCDECHSIDSTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTVPH

PNIEEVALSSTGEIPFYGKAIPIEVIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLSGFGINAVAYYR

GLDVSVIPTSGDWVVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLATCINGVCWTV

YHG (SEQIDNO2)

Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego NS-3 19bTn

ATGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTCGTGCGGCTG

TTTGCACCCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGA

AACCACCATGCGGTCCCCGGTCTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCG

CAGACATTCCAAGTGGCCCATCTACACGCCCCCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTA

AGGTGCCGGCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGGTACTTGTCCTGAACCCATC

CGTTGCCGCCACCTTAGGATTCGGGGCGTATATGTCTAAAGCACATGGTGTCGAC

CCTAACATTAGAACTGGGGTAAGGACCATCACCACGGGCGCCCCCATTACGTACT

CCACCTACGGCAAGTTTCTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGGGGCGCTTACGACAT

CATAATATGTGATGAGTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTGGGCATCGGC

PL 201 679 B1

ACCGTCCTGGATCAGGCGGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACTG

CTACACCTCCGGGGTCGGTCACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCT

GTCCAGCACTGGAGAGATCCCCTTTTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATC

AAAGGGGGGAGGCACCTCATTTTCTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCG

CCGCAAAGCTATCGGGCTTCGGAATCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGA

TGTGTCCGTCATACCGACTAGCGGAGACGTCGTTGTTGTGGCAACAGACGCTCTA

ATGACGGGCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCA

CCCAGACAGTCGACTTCAGCTAA(SEQ ID NO 3)

Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego NS-3 19bTc

ATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGAAACCACCA

TGCGGTCCCCGGTCTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGCAGACATTC

CAAGTGGCCCATCTACACGCCC.CCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTAAGGTGCCG

GCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGGTACTTGTCCTGAACCCATCCGTTGCCG

CCACCTTAGGATTCGGGGCGTATATGTCTAAAGCACATGGTGTCGACCCTAACAT

TAGAACTGGGGTAAGGACCATCACCACGGGCGCCCCCATTACGTACTCCACCTAC

GGCAAGTTTCTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGGGGCGCTTACGACATCATAATAT

GTGATGAGTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTGGGCATCGGCACCGTCCT

GGATCAGGCGGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACTGCTACACCT

CCGGGGTCGGTCACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCTGTCCAGCA

CTGGAGAGATCCCCTTTTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATCAAAGGGG

GGAGGCACCTCATTTTCTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGCAAA

GCTATCGGGCTTCGGAATCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGATGTGTCC

GTCATACCGACTAGCGGAGACGTCGTTGTTGTGGCAACAGACGCTCTAATGACGG

GCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCACCCAGAC

AGTCGACTTCAGCCTGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTAC

CACGGTTAA (SEQ ID NO 4)

PL 201 679 B1

P r z y k ł a d VIIb: Oczyszczanie białek NS-3 19bTn i NS-3 19bTc

Komórki E. coli pobrane z hodowli komórkowych w kolbach stożkowych rozbito homogenizatorem (CSL, model B) przy 1,4 kbar w 50 mM TRIS, pH 8. Otrzymany lizat oczyszczono przez wirowanie (15000 g, 30 min, 4°C). Nadsącz usunięto, gdyż zarówno konstrukt N- jak i C-końca NS3 pozostał w peletce. Okazało się, że peletka ta jest bardziej stabilna względem N-końcowego konstruktu, umożliwiając przemywanie (pierwsze przemywanie 2% sarkozylem, 0,5 M chlorkiem guanidyny i 10 mM DTT, drugie i trzecie przemycie 1% Triton X-100, 0,5 M chlorkiem guanidyny i 10 mM EDTA) przed rozpuszczeniem. Nie możliwe jest takie postępowanie w przypadku C-końcowego konstruktu. Oczyszczanie dalej prowadzono dla N-końowego konstruktu. Przemytą peletkę na zakończenie rozpuszczono w 6 M chlorku guanidyny/ 50 mM Na2HPO4, przy pH 7,2 i sulfonowano jak opisano w Maertens i wsp. (PCT/EP99/02547). Sulfonowana peletka została wstępnie pozbawiona soli na kolumnie Sephadex G25, do 6 M mocznik/50 mM trietanoloamina, pH 7,5, i ostatecznie oczyszczona w dwóch kolejnych anionowymiennych kolumnach chromatograficznych o tym samym składzie buforu. Pierwszą chromatografię anionowymienną przeprowadzono na kolumnie Hiper DQ (50 pm) (BioSpra Inc. Marlborough, Ma. USA) i NS3 uzyskano pomiędzy 0,11 i 0,19 M NaCl. Po rozcieńczeniu, frakcje te naniesiono na drugą kolumnę Hiper DQ (20 pm) (BioSpra Inc. Marlborough, Ma. USA) i NS3 uzyskano we frakcjach w zakresie 0,125 M NaCl. Frakcje te pozbawiono soli do 6M mocznika w PBS, pH 7,5. Końcową czystość oszacowano na > 90% w oparciu o analizę SDS-PAGE i barwienie azotanem srebra. Sekwencjonowanie N-końca stosując degradację EDMAN wykazało, że NS3 ma nienaruszony Nkoniec, w którym żądany epitop jest obecny o właściwej sekwencji. Potwierdzono również, że metionina zastosowana do rozpoczęcia translacji została odcięta, jak przewidywano.

P r z y k ł a d VIII: Konstrukcja białka E2 bez kiper-zmiennego regionu I

Immunodominacyjna homologiczna odpowiedź została stwierdzona względem regionu E2 HVR I. Odpowiedź ta będzie miała niewielkie zastosowanie w szczepionce, ze względu na fakt, że szczepionka jest zestawem heterologicznym (szczep szczepionki jest zawsze różny od szczepu zewnętrznego). Dlatego też, delecja tego regionu może być konieczna do otrzymania białka E2 indukującego przeciwciała przeciwko bardziej konserwowanego, lecz mniej immunogennego regionu E2. W wyniku szczegółowej analizy sekwencji liderowej E2 i E2 hiper-zmiennego regionu, zaprojektowano najlepszy konstrukt do ekspresji białka E2 bez HVR I. Konstrukt ten umożliwia ekspresję peptydu E2 rozpoczynając w pozycji reszty aminokwasowej 409 zamiast reszty aminokwasowej 384. Jako sekwencję sygnałową stosowano C-końcowe 20 reszt aminokwasowych E1. Jednakże, ze względu na fakt, że delineacja tego HVR nie jest przebiega w obu kierunkach, przygotowano drugą wersję (rozpoczynając od reszty aminokwasowej 412), która również miała wysokie prawdopodobieństwo cięcia w odpowiedniej pozycji.

Pośredni konstrukt twHCV-99 (patrz również Fig. 15 i 16)

W kasecie ekspresyjnej, sekwencja kodująca E2-715 powinna być poprzedzona liderowym peptydem sygnałowym E1, rozpoczynając od Met364. Dlatego też, w plazmidzie pvHCV-92 (Fig. 15), który zawiera sekwencję kodującą EZ-715 HCV typu 1b z długą wersją peptydu sygnałowego E1 (rozpoczynając od Met347), a delecję przeprowadzono przez dwukrotne trawienie EcoIII i Ncol, a następnie wypełniającą reakcję wystającego końca 5'- z polimerazą T4 DNA. Ligacja otrzymanego lepkiego końca (ponowne zamknięcie w pętlę fragmentu 6621 bp), prowadzi do otrzymania plazmidu pvHCV-99, który koduje to samo białko (E2-715) o krótszym sygnałowym peptydzie liderowym E1 (rozpoczynając od Met364). pvHCV-99 został złożony w depozycie szczepów jako ICCG 3635. Powinno być jasne że HCV lub heterologiczna sekwencja sygnałowa o zmiennej długości może być stosowana.

Plazmidy pvHCV-100 i -101 powinny zawierać delecję w sekwencji E2, to jest delecja hiperzmiennego regionu I (HYR-1). W plazmidzie pvHCV-100, reszty aminokwasowe 384(His)-408(Ala) zostały usunięte, podczas gdy w plazmidzie pvHCV-101 aminokwasy 384(His)-411 (Ile) zostały usunięte.

KonstrukcjanvHCV-100

Do konstrukcji pvHCV-100, dwa oligonukloetydy zostały zaprojektowane: HCV-pr 409 [8749]:

5'-CTT TGC CGG CGT CGA CGG GCA GAA AAT CCA GCT CGT AA-31 (SEQ ID NO 9)

HCV-pr 408 [8750]:

5'- TTA CGA GCT GGA TTT TCT GCC CGT CGA CGC CGG CAA AG -3' (SEQ ID NO 10)

Amplifikacja PCR (denaturacja 5 min 95°C, 30 cykli amplifikacji zawierające annealing w 55°C, polimeryzacja w 72°C i denaturacja w 95°C przez 1 min każda, wydłużenie przez 10 min w 72°C) matrycy pvHCV-99 stosując Gpt-pr [3757] i HCV-pr 408 [8750] doprowadziła do otrzymania fragmentu

PL 201 679 B1 o 221 bp, podczas gdy amplifikacja HCV-pr 409 [8749] i TKr-pr [3756] doprowadziła do otrzymania fragmentu 1006 bp. Oba fragmenty PCR nachodzą na siebie 19 nukleotydami. Te dwa fragmenty złożono i amplifikowano PCR stosując startery Gpt-pr [3757] i TKr-pr [3756]. Otrzymany fragment 1200 bp trawiono EcoRI i HinDIII i ligowano z EcoRI/HinDIII trawionym pgsATAlS [ICCG 1998] wektora (5558 bp). Konstrukt ten pvHCV-100, analizowano przez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie i złożono w depozycie szczepów jako ICCG 3636.

Konstrukcja pvHCV-l01

Do konstrukcji pvHCV-101, zaprojektowano dwa oligonukleotydy:

HCV-pr411 [8747]:

5'- CTT TGC CGG CGT CGA CGG GCA GCT CGT AAA CAC CAA CG -3' (SEQ ID NO 11)

HCV-pr 410 [8748]:

5'- CGT TGG TGT TTA CGA GCT GCC CGT CGA CGC CGG CAA AG -3' (SEQ ID NO 12)

W wyniku amplifikacji PCR matrycy pvHCV-99 stosując Gpt-pr [3757] i HCV-pr 410 [8748] otrzymano fragment o 221 bp, podczas gdy w wyniku amplifikacji HCV-pr 411 [8747] i TKr-pr [3756] otrzymano fragment o 997 bp. Oba PCR fragmenty nachodzą na siebie 19 nukleotydami. Te dwa fragmenty złożono i amplifikowano PCR stosując startery Gpt-pr [3757] i TKr-pr [3756]. Otrzymany 1200 bp fragment trawiono EcoRI i HinDIII i ligowano z EcoRI/HinDIII trawionego pgsATAlS [ICCG 1998] wektora (5558 bp). Konstrukt ten, pvHCV-101, analizowano przez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie i złożono w depozycie szczepów jako ICCG 3637.

Wszystkie plazmidy sprawdzono analizą sekwencyjne i złożono w depozycie szczepów Innogenetics. Dla każdego plazmidu dwa mini-preparaty DNA (PLASmix) wykonano w warunkach sterylnych i połączono je. Stężenie DNA określano i QA przeprowadzono analizą mapowania restrykcyjnego. Oczyszczone DNA stosowano do otrzymania zrekombinowanego wirus krowianki jak opisano w Maertens i wsp. (PCT/EP95/03031). Zrekombinowane wirusy vvHCV-100 i vvHCV-101, jednakże, otrzymano na zatwierdzonych przez WHO komórkach Vero. Po dwóch przebiegach oczyszczania szalek, produkt ekspresji analizowano metodą Western-blot jak opisano w Maertens i wsp. (PCT/EP95/03031). Białka uwidaczniano stosując specyficzne monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko E-2 (IGH 212, które mogą być otrzymane od twórców w N.V., Zwijnaarde, Belgia) o przybliżonej masie cząsteczkowej wynoszącej 69000 i 37000 -vvHCV-100 oraz 68000 i 35000 - vvHCV-101. Wymienione masy cząsteczkowe wskazują na obecność zarówno glikozylowanych jak i nie-glikozylowanych białek E2, które zostały potwierdzone przez obróbkę próbek metodą Western-blot stosując PNGaseF. Doświadczenie to prowadzi do wykrycia jedynie pojedynczego białka o masie odpowiednio 37000 i 35000-vvHCV-100 i vvHCV-101.

Sekwencja aminokwasowa dojrzałego E2, pochodzące z pvHCV-100

QKIQLVNTNGSWHINRTALNCNDSLQTGFFAALFKHFNSSGCPERLASCRSIDKFAQG

WGPLTYTEPNSSDQRPYCWHYAPRPCGIVPASQVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRFGVP

TYNWGANDYLILNNTRPPRGNWFGCTWMNGTGFTKTCGGPPCNIGGAGNNTLTCPT 1

DCFRKHPEATYARCGSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYGGVEHRF

EAACNWTRGERCDLEDRDRSELSPLLLSTTEWQILPCSFTTLPALSTGLIHLHQNIVDV

QYLYGVGSAVVSLVIK (SEQ ID NO 13)

Sekwencja aminokwasowa dojrzałego E2 pochodzące z pvI3CV-101

QLVNTNGSWHINRTALNCNDSLQTGFFALFYKHKFNSSGCPERLASCRSIDKFAQGW

GPLTYTEPNSSDQRPYCWHYAPRPCGIVPASQVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRFGVPTY

NWGANDSDYLILNNTRPPRGNWFGCTWMNGTGFTKTCGGPPCNIGGAGNNTLTCPT ,

DCFRKHPEATYARCGSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTVNFTIFKVFRMYVGGVEH

RFEAACNWTRGERCDLEDRDRSELSPLLLSTTEWQILPCSFTTLPALSTGLIHLHQNIV

DVQYLYGVGSAVVSLVIK (SEQ ID NO 14)

P r z y k ł a d IX: cząsteczka E1o jeszcze bardziej poprawionej immunogenności

Jak przedstawiono w przykładzie I, białko E1s oczyszczono według protokołu opisanego w opisie zgłoszenia patentowego PCT/EP 95/03031 zgłoszonego przez Maertensa i wsp. Protokół ten obejmuje kowalencyjne modyfikacje cysteiny (wolna cysteina i cysteiny biorące udział w zewnątrzcząsteczkowe mostki, po redukcji mostków cysteinowych przez DTT), stosując pochodne maleimidowe (maleimid N-etylowy i maleimid biotiny, również otrzymany z Sigmy). W innym sposobie do blokowania maleimidu, stosowano również aktywne halogeny. Związki te, to jest aktywne halogeny, blokują wolne cysteiny za pomocą alkilacji. Jako przykład, oceniano aktywny halogen (jodoacetamid, Merck). Ten sam protokół stosowano do oczyszczania E1 jak opisano w Maertens i wsp. (PCT/EP 95/03031),

PL 201 679 B1 ale zamiast maleimidowych związków zastosowano jodoacetamid. Białko E1s otrzymane tym sposobem zachowywało się w trakcie całej procedury oczyszczania podobnie jak białka blokowane maleimidem. Po końcowym obniżeniu stężenia detergentu do 0,05% CHAPS lub zmianie na 0,5% betainy jak opisano w przykładzie 1, otrzymano pojedyncze cząsteczki jak określono metodą DLS. Stwierdzono niespodziewane działanie, po immunizacji myszy E1s zmodyfikowanym acetamidem.

W całkowitej liczbie trzech serii immunizowano E1 6 myszy w każdej serii, stosując trzy iniekcje z trzytygodniową przerwą, każda iniekcja zawierała 5 μg E1s w 100 μg/ml PBS i zmieszana z równą objętością adjuwanta RIBI (R-700). Pierwsza seria myszy otrzymała E1-maleimid w kompozycji z 0,05% CHAPS, a druga seria otrzymała E1-acetamid również w kompozycji z 0,05% CHAPS, podczas gdy trzecia seria otrzymała E1-acetamid w kompozycji z 0,12% betainy. Na koniec, wszystkie myszy skrwawiano w 10 dni po trzeciej immunizacji. Miana punktu końcowego przeciwko E1-maleimidu i E1-acetamidu (definiowane jako rozcieńczenie surowicy prowadzące do wartości OD 2 razy wyższej niż wartości tła) określano indywidualnie dla każdego zwierzęcia. Fig. 17 przedstawia te miana punktu końcowego, przedstawione jako średnia z odchyleniem standardowym. U myszy, które otrzymały E1-maleimid uzyskano jedynie odpowiedź przeciwciał, która będzie skuteczna w rozpoznawaniu epitopów zawierających maleimid (brak reaktywności w odpowiedzi na E1-acetamid), u myszy, które otrzymały E1-acetamid wyraźnie uzyskano odpowiedź przeciwciał przeciwko prawdziwym epitopom E1, gdyż przeciwciała są reaktywne przeciwko zarówno E1-acetamid jak i E1-maleimid. W ten sposób wyraźnie wykazano w dodatkowym doświadczeniu, w którym przeciwciała dla specyficznych regionów E1 określano stosując peptydy, które nie były ani zmodyfikowane acetamidem ani maleimidem. Wyniki, jak pokazano na Fig. 18, wykazały że myszy immunizowane E1-acetamidem (w kompozycji z CHAPS i betainą) wykazywały odpowiedź przeciwciał które będą skuteczne do rozpoznawania peptydów V1V2, V2V3, V3V4, VSC4, C4V6. Ze względu na to, że V6 nie były częścią E1s, można podsumować, że przeciwciała były skierowane przeciwko C4, V3 (V3V4 jest pozytywne podczas gdy V4V5 nie jest) i V1V2. Myszy immunizowane E1s-maleimidem wykazywały jedynie bardzo niską odpowiedź przeciwko peptydom V1V2 i V2V3. Podkreśla to jeszcze raz fakt, że rozsądnie wysokie miano zmierzone dla tych mysich przeciwciał przeciwko maleimido-E1s jest głównie skierowane przeciwko epitopom zależnym od maleimidu. Ponadto, byliśmy w stanie udowodnić, że odpowiedź indukowana przez E1s-acetamid jest częściowo typu Th1, gdyż zasadnicza ilość indukowanych przeciwciał jest podtypu IgG2(a+b). Ilość IgG2 jest nawet wyższa w przypadku kompozycji z betainą, w porównaniu kompozycji z CHAPS (Fig. 19). Z tych wyników można wywnioskować, że białka otoczki HCV, w których przynajmniej jedna reszta cysteiny (ale możliwa jest więcej niż jedna reszta cysteiny) jest alkilowana, są wyjątkowo immunogennymi białkami.

W konsekwencji, zmodyfikowany acetamidem E1 w kompozycji z betainą był również stosowany do wzmocnienia szympansów Phila i Tona. Oba szympansy immunizowano ponownie dwoma kolejnymi domięśniowymi immunizacjami z trzytygodniową przerwą (50 μg E1 zmieszany z adjuwantem RIBI jak w przykładach VI i V). Jak można stwierdzić na podstawie fig. 20 i 21, że odpowiedź przeciwciał skierowanych przeciwko E1 może zostać rzeczywiście wzmocniona ponownie i do wyższego poziomu, niż otrzymany w poprzednich immunizacjach po dwóch iniekcjach. To określenie miana przeprowadzono przeciwko standardowi, który stanowi mieszanina trzech ludzkich mian przeciwciał skierowanych przeciwko E1 z surowicy krwi (otrzymane od nosicieli zakażonych przewlekle HCV). Miano anty-E1 tych surowic krwi jest definiowane jako jedna jednostka /ml. U szympansa Phila (Fig. 20), zaindukowano miano dwukrotnie wyższe niż u ludzkich nosicieli jedynie po dwóch immunizacji. U szympansa Tona (Fig. 21), zaindukowano miano aż do 140-razy wyższego. Podkreśla to jeszcze raz, wysoką immunogenność tych cząsteczek E1.

P r z y k ł a d X: Alkilowane E1 ma wyższe wskazania do zastosowania diagnostycznego

E1s-acetamid jak opisano w przykładzie IX w dalszym ciągu badano jako antygen do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko E1a w próbkach surowicy od ludzkich nosicieli zakażonych chronicznie HCV. Jako przykład antygeny te wiążą się z błonami LIA i paski poddawano obróbce jak opisano w Zrein i wsp. (1998). Próbki surowic od 72 dawców krwi wstępnie oceniano, w celu określenia najkorzystniejszego stężenia antygenu E1, który może być stosowany w tym teście, w celu wykluczenia fałszywych odpowiedzi pozytywnych. W przypadku E1s-maleimidu, udowodniono, że stężenie to wynosi 8 μg/ml, podczas gdy w przypadku E1s-acetamidu stężenie do 50 μg/ml nie powodowało fałszywych pozytywnych wyników (żadne próbki nie wykazywały stosunkowo kolorowego barwienia powyżej 0,5). Stosując odpowiednio 8 i 50 μg/ml, dla E1s-maleimidu i E1s-acetamidu 24 próbki surowicy krwi od nosicieli cierpiących na zapalenie chroniczne HCV, przebadano pod kątem przeciwciał

PL 201 679 B1 przeciwko E1s. Jak pokazano w Tabeli 6, E1s-acetamid wyraźnie prowadzi do uzyskania większej ilości próbek dających wyniki pozytywne (67% względem 38% dla E1s-maleimidu). Nie stwierdzono próbki, która jedynie dawała wynik pozytywny dla E1s-maleimidu. W próbkach dających wynik pozytywny zarówno dla E1s-maleimidu i E1s-acetamidu, reaktywność dla tego ostatniego jest wyższa. Na tej podstawie można stwierdzić, że alkilowane białka otoczki HCV są lepszymi antygenami do wykrywania ludzkich przeciwciał niż białka otoczki modyfikowane maleimidem.

P r z y k ł a d XI: Otrzymywanie cząsteczek mieszanych zawierających E1 i E2

E1s i E2s (vvHCV-44) otrzymano i oczyszczono jak opisano w Maertens i wsp. PCT/EP95/030301 z wyją tkiem modyfikacji maleimidowej zast ą pionej przez alkilację stosują c jodoacetamid. E1s i E2s w 3% jedynie w empigenie lub jako równomolowa mieszanina wstrzyknięto na kolumnę Superdex-200 PC 3.2/30 zrównoważonej w PBS/0,2% CHAPS. Kolumna ta została zaprojektowana do stosowania z wyposaż eniem SMARTTM HPLC z Pharmacia LKB (Sweden). Frakcje przeszukiwano za pomocą trzech różnych zestawów ELISA. Do tych zestawów ELISA specyficzne przeciwciała monoklonalne

E1-7 (IGH 207) i E2- (IGH 223) pokryto w stęż. 1 μg/ml. Frakcje filtracji na żelu inkubowano w rozcieńczeniu 1/2500. Dwa inne przeciwciała monoklonalne El (IGH 200) i E2 (IGH 212), po koniugacji z biotyną stosowano do wykrywania związanego antygenu. Układ streptawidyna-HRP/TMB stosowano do wywoływania związanej biotyny w żółty kolor, który zmierzono przy 450 nm.

Układy ELISA stosowano w układach homologicznych (przeciwciała skierowane przeciwko powlekanych E1/przeciwciała skierowane przeciwko detekcji E1 lub przeciwciała skierowane przeciwko E-2 powlekane/przeciwciała skierowane przeciwko E-2 wykrywaniu) i heterologicznych (przeciwciała skierowane przeciwko E1 powlekanych/anty -E2 wykrywaniu). Ostatni z wymienionych teoretycznie wykrywa cząsteczki, w których E1 i E2 są włączone. Reaktywne frakcje zebrano i zatężono na filtrze 10 kDa ponownie poddano chromatografii na Superdex-200 w PBS/0,05% CHAPS. Wszystkie te frakcje badano reaktywność przez zastosowanie różnych zestawów ELISA. Jak można sądzić na podstawie fig. 22, dodanie E2 do E1 nie prowadzi do znaczących zmian w czasie retencji, w porównaniu do samego E1, co wskazuje że cząsteczki są w rzeczywistości jeszcze obecne. Cząsteczki te zawierają zarówno E1 jak i E2, gdyż jedynie w tym zestawie heterologiczny ELISA daje wynik pozytywny.

P r z y k ł a d XII: Otrzymywanie cząsteczek mieszanych zawierający E1 o 2 różnych genotypach

Genotyp 1b E1s i genotyp 4 (vvHCV-72) otrzymano i oczyszczono jak opisano w Maertens i wsp., PCT/EP95/030301 z wyjątkiem modyfikacji maleimidowej zastąpionej przez alkilację stosując jodoacetamid dla genotypu 1b. E1s-1b i E1s-4 w samym 3% empigenie lub jako równomolowej mieszaninie wstrzyknięto na kolumnę Superdex-200 PC 3.2/30 zrównoważoną w PBS/0,2% CHAPS. Kolumna ta została zaprojektowana do stosowania z wyposażeniem SMARTTM HPLC z Pharmacia LKB (Szwecja). Główne białko zawierające frakcje zebrano, zatężono na filtrze 10 kDa, ponownie poddano chromatografii na kolumnie Superdex-200 w PBS/0,05% CHAPS. Wszystkie te frakcje badano pod kątem reaktywności przez zastosowanie zestawów ELISA, które powinny wykryć cząsteczki zawierające E1 z obu genotypów. W tym celu ELISA streptawidyna została powleczona 2 μg/ml. Frakcje z filtracji żelowej inkubowano w rozcieńczeniu 1/2500. Przeciwciała monoklonalne E1 (IGH 200), które jedynie rozpoznają E1 z genotypu 1 i 10 stosowano do wykrywania związanego antygenu. Kozi układ przeciwko mysi-HRPITMB stosowano do wywołania testu do koloru żółtego, który zmierzono przy 450 nm. Jak można sądzić na podstawie Fig. 23, dodanie E1-4 do E1-1b nie prowadzi do znaczących zmian w czasie retencji, w porównaniu do samego E1, co wskazuje, że cząsteczki są w rzeczywistości jeszcze obecne. Cząsteczki te zawierają zarówno białka E1, czyli E1s genotypu 1b i genotypu 4, gdyż jedynie ten zestaw ELISA daje wynik pozytywny.

Lista odnośników

Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C., Blight K., Xu J., Hahn Y.S., Rice C.M., Dubuisson J. Formation of native Hepatitis C virus glycoprotein complexes. J. Virol. 1997: 71:697-704.

Diepolder HM, Zachoval R, Hoffmann RM, Wierenga EA, Santantonio T, Jung MC, Eichenlaub D, Pape GR. Possible mechanism involving T-lymphocyte response to non-structural protein 3 in viral clearance in acute Hepatitis C virus infection. Lancet 1995: 346: 1006-1007.

Diepolder HM, Gerlach JT, Zachoval R, Hoffmann RM, Jung MC, Wierenga EA, Scholz S, Santantonio T, Houghton M, Southwood S, Sette A, Pape GR. Immunodominant CD4+ T-cell epitope within nonstructural protein 3 in acute hepatitis C virus infection. J. Virol., 1997: 71:6011-6019.

PL 201 679 B1

Fancy, D.A., Melcher, K., Johnston, S. T. and Kodadek, T. New chemistry for the study of multiprotein complexes: the six-histidine tag as a receptor for a protein crosslinking reagent. ChemBiol (1996) 3: 551-559.

G.T. Henmanson in Bioconjugate Techniques (1996) Part I section 1.43 and section 2.2.1, Academic Press San Diego CA, USA.

Houghton M. Immunity to HCV: The case for vaccine development. 4th International meeting on hepatitis C Virus and related viruses. Sattelite Symposiurn: New approach to prevention and therapy of HCV infection. March 7 1997, Kyoto, Japan.

Leroux-Roels G, Esquivel CA, DeLeys R, Stuyver L, Elewaut A, Philippe J, Desombere I, Paradijs J, Maertens G Lymphoproliferative responses to hepatitis C virus core, E1, E2, and NS3 in patients with chronic hepatitis C infection treated with interferon alfa. Hepatology 1996: 23: 8-16.

Maertens G. and Stuyver L. Genotypes and genetic variation of hepatitis C virus. In: The molecular medicine of viral hepatitis. Ed: Harrison T.J. and Zuckerman A.J. 1997

Major M.E. and Feinstone S.M. The molecular virology of hepatitis C. Hepatology 1997:25:1527-1538.

Maertens G., Depla E., Ducatteeuw A., Vandeponseele P., Bosman F., Venneman A., de Martynoff G., Stuyver L., Dekeyser F., Vandeperre B., Zrein M. and Buyse M,-A. Hepatology 1997: 26: 186A.

Rehermann B, Chang KM, McHutchinson J, Kokka R, Houghton M, Rice CM, Chisari FV. Differential cytotoxic T-lymphocyte responsiveness to the hepatitis B and C viruses in chronically infected patients. J Virol 1996 70: 7092-7102.

Rehermann B, Takaki A, Liebetrau A, Luda S, Seifert U, Salha K, Manns M, Wiese M. Characterization of the cytotoxic and helper T cell response in patients 18 years after a single source outbreak of HCV infection. Hepatology, 1997:26: 406A

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor, NY USA van Doorn LJ, Kleter B, Pike 1, Quint W. Analysis of hepatitis C virus isolates by serotyping and genotyping. J Clin Microbiol 1996; 34: 1784-1787.

Villa E., Buttafoco P., Grottola A., Scarcelli A. Giannini F., Manerti F. Neutrtalizing antibodies against HCV: liver transplant as an experimental model. J. Hepatol. 1998: 28:

Weiner AJ, Erickson AL, Kansopon J, Crawford K, Muchmore E, Houghton M, Walker CM Association of cytotoxic T lymphocyte (CTL) escape mutations with persistent hepatitis C virus (HCV) infection. Princess Takamatsu Symp, 1995: 25: 227-235.

Y i M., Nakamoto Y., Kaneko S., Yamashita T., Murakami S. Delineation of regions important for heteromeric association of Hegatitis C virus E1 and E2. Virol. 1997a: 231: 119-129.

Zauberman, A., Nussbaum, O., llan, E., Eren, R., Ben-Moshe, O., Arazi, Y., Bezre, S., Lubin, L, Shouval, D., Galun, E., Reisner, Y. and Dagan, 5. The trimera mouse system: a mouse model for hepatitis C infection and evaluation of therapeutic agents. June 6-9, 1999; Oral 4.3. In: 6th International Symposium on Hepatitis C & Related Viruses. Bethesda USA Zrein, M., Louwagie, J., Boeykens, H., Govers, L., Hendrickx, G., Bosman, F., Sablon, E., Demarquilly, C., Boniface, M. and Saman, E. (1998) Assessment of a new immunoassay for serologacal confirmation and discrimination of human T-cell lymphotropic virus infections. Clin. Diagn. Lab. Imm. 5: 45-49.

PL 201 679 B1

Tabela 1. Sekwencje zgodne Els HCV-B

♦Pozycje aminokwasów pomiędzy 192 a 326 Els, które są całkowicie konserwowane nie są przedstawione

PL 201 679 B1

PL 201 679 B1

Tabela 3. Zmiany indukowane przez szczepienia terapeutyczne (6 x 50 gg Els)

PL 201 679 B1

PL 201 679 B1

Tabela 5 aa 1188 *

MATCINGVCWTVYHGRAAVCTRGVAK ... sekwencja proponowana GGPLLCPAGHAVGIFRAAVCTRGVAK ... sekwencja naturalna

Podwójne podkreślenie: minimalny epitop CTL

Pojedyncze podkreślenie: dodatkowe otaczające aminokwasy naturalne

Przy C-końcu epitop i elementy go otaczające mogą być połączone bezpośrednio

VDFSŁATCINGVCV?TVYHG sekwencja proponowana

VDFSLDPTFTIETITLPQD sekwencja naturalna *

aa 1468

PL 201 679 B1

Tabela 6

Antygen	maleimido-E 1 s	acetamido-Els
pg/ml	8	50
17758	2	4
17761	0	OJ
17763	0	OJ
17766	0	1
17767	0	1
17771	OJ	2
17773	0	0
17775	0	OJ
17776	0	OJ
17777	OJ	2
17779	0	0
17784	3	4
17785	OJ	2
17786	0	2
17789	2	4
17790	2	4
17794	2	4
17795	0	1
17796	0	0
17798	0	OJ
17820	2	4
17825	2	3
17827	2	4
17842	1	2
#pos	9	16
%pos	38	67

PL 201 679 B1

Claims (39)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Cząsteczka oligomeryczna, znamienna tym, że zawiera oczyszczone białka otoczki HCV i ma średnicę od 5 do 100 nanometrów, przy czym co najmniej jedna reszta cysteinowa białka otoczki jest alkilowana.
2. 2. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1, znamienna tym, że składa się ze skorupy z oczyszczonych białek otoczki.
3. 3. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1, znamienna tym, że składa się z całej sfery z oczyszczonych białek otoczki.
4. 4. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że ma średnicę 5 do 40 nanometrów.
5. 5. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że sekwencja aminokwasowa białka otoczki HCV jest sekwencją zgodną, pochodzącą z sekwencji zgodnej z izolatu HCV, podtypu HCV, szczepu HCV, lub rodzaju HCV.
6. 6. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że przynajmniej jedna reszta cysteinowa białka otoczki jest alkilowana czynnikiem alkilującym.
7. 7. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 6, znamienna tym, że czynnik alkilujący wybrany jest z grupy obejmującej etylenoiminę lub N-(jodoetylo)trifluoroacetamid, oraz czynną pochodną fluorowcową o wzorze X(CH2)nR, gdzie X oznacza atom fluorowca, R oznacza H, COOH, NH2, CONH2, fenyl oraz jego dowolne pochodne, a n oznacza 0, 1,2, 3, albo 4.
8. 8. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że białka otoczki stanowią białka HCV E1 lub ich części.
9. 9. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że białka otoczki stanowią białka HCV E1s lub ich części.
10. 10. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że białka otoczki stanowią białka HCV E2 lub ich części.
11. 11. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że białka otoczki stanowią białka o sekwencji przedstawionej jako SEQ ID No 13 i/lub SEQ ID No 14, lub ich części.
12. 12. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że białka otoczki są kodowane przez zgodną sekwencję nukleotydową izolatu HCV, zgodną sekwencję nukleotydową podtypu HCV, zgodną sekwencję nukleotydową gatunku HCV, zgodną sekwencję nukleotydową rodzaju HCV, lub ich części.
13. 13. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że białka otoczki stanowią mieszaninę białek wybranych z grupy obejmującej HCV E1, HCV E1s, HCV E2, oraz ich części.
14. 14. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 13, znamienna tym, że białka HCV E2 albo ich części określone są przez sekwencje wybrane z grupy obejmującej SEQ ID No 13. SEQ ID No 14 oraz ich części.
15. 15. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że białka otoczki, lub ich części, pochodzą z różnych szczepów HCV, podtypów HCV lub genotypów HCV.
16. 16. Cząsteczka oligomeryczna według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że białka otoczki, lub jej części, stanowią mieszaninę zawierającą białka otoczki HCV z jednego szczepu HCV lub genotypu HCV i białka otoczki HCV z przynajmniej jednego innego szczepu HCV lub genotypu HCV.
17. 17. Sposób otrzymywania cząsteczek oligomerycznych określonych w zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że obejmuje oczyszczanie białka otoczki HCV w roztworze przy zastosowaniu środka alkilującego, zastąpienie roztworu oczyszczonego białka otoczki HCV detergentem lub solą, i utworzenie cząsteczek oligomerycznych, oraz oczyszczanie utworzonych cząsteczek oligomerycznych.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że do oczyszczania białka otoczki HCV w pierwszym etapie stosuje się dodatkowo pierwszy detergent.
19. 19. Sposób według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że w pierwszym etapie stosuje się dodatkowo środek tnący wiązania disiarczkowe.
20. 20. Sposób według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że przy oczyszczaniu utworzonych cząsteczek oligomerycznych w trzecim etapie, dodatkowo obniża się stężenie detergentu albo soli zastosowanych w etapie drugim.

    PL 201 679 B1
21. 21. Sposób według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że jako pierwszy detergent stosuje się Empigen-BB, jako detergent w etapie drugim lub trzecim stosuje się CHAPS, oktyloglukozyd, Tween, lub dowolny inny detergent, a jako sól stosuje się betainę.
22. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że stosuje się Empigen-BB w stężeniu od 1% do 10%; oraz że stosuje się CHAPS lub Tween w stężeniu od 0,01% do 10%, lub betainę w stężeniu od 0,01% do 10%.
23. 23. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę oligomeryczną określoną w zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 5 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11 albo 12 albo 13 albo 14 albo 15 albo 16.
24. 24. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, że dodatkowo zawiera białko rdzenia HCV, P7, E1, E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i/lub NS5B, lub jego części.
25. 25. Kompozycja według zastrz. 24, znamienna tym, że białko NS3, lub jego części, mają sekwencję aminokwasową określoną przez SEQ ID No 1 lub SEQ ID No 2.
26. 26. Kompozycja według zastrz. 23 albo 24 albo 25, znamienna tym, że stanowi szczepionkę.
27. 27. Cząsteczka oligomeryczna określona w zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 7 do zastosowania jako lek.
28. 28. Zastosowanie cząsteczki oligomerycznej określonej w zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 5 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11 albo 12 albo 13 albo 14 albo 15 albo 16 do wytwarzania szczepionki HCV; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u przewlekłych nosicieli HCV; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u przewlekłych nosicieli HCV przed, w czasie, albo po stosowaniu innej terapii; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u osób zakażonych HCV przed lub po przeszczepie wątroby albo po przypuszczalnym zakażeniu; leku do profilaktycznego indukowania odporności przeciwko HCV; leku do indukowania odporności przeciwko HCV, gdzie cząsteczka oligomeryczna stosowana jest w odstępach czasowych lub leku do leczenia zakażenia HCV.
29. 29. Zastosowanie cząsteczki oligomerycznej według zastrz. 28, znamienne tym, że inna terapia stanowi leczenie interferonem.
30. 30. Zastosowanie cząsteczki oligomerycznej według zastrz. 28, znamienne tym, że inna terapia stanowi połączenie leczenia interferonem z leczeniem przy użyciu leków o małej wielkości cząsteczki.
31. 31. Zastosowanie cząsteczki oligomerycznej według zastrz. 30, znamienne tym, że lek o małej wielkości cząsteczki stanowi rybawiryna.
32. 32. Kompozycja określona w zastrz. 23 albo 24 albo 25 do zastosowania do jako lek.
33. 33. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 23 albo 24 albo 25 do wytwarzania szczepionki przeciw HCV; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u przewlekłych nosicieli HCV; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u przewlekłych nosicieli HCV przed, w czasie lub po stosowaniu innej terapii; leku do indukowania odporności przeciwko HCV u osób zakażonych HCV przed lub po przeszczepie wątroby albo po przypuszczalnym zakażeniu; leku do profilaktycznego indukowania odporności przeciwko HCV albo leku do indukowania odporności przeciwko HCV, gdzie cząsteczka oligomeryczna stosowana jest w odstępach czasowych.
34. 34. Zastosowanie według zastrz. 33, znamienne tym, że inna terapia stanowi leczenie interferonem.
35. 35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że inna terapia stanowi połączenie leczenia interferonem z leczeniem przy użyciu leków o małej wielkości cząsteczki.
36. 36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że lek o małej wielkości cząsteczki stanowi rybawiryna.
37. 37. Zestaw do wykrywania przeciwciał przeciwko HCV obecnych w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę oligomeryczną określoną w zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 5 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11 albo 12 albo 13 albo 14 albo 15 albo 16 w odpowiednim pojemniku.
38. 38. Zestaw do wykrywania odpowiedzi komórek chłoniaka z limfocytów T na HCV, obejmujący cząsteczkę oligomeryczną określoną w zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 5 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11 albo 12 albo 13 albo 14 albo 15 albo 16.
39. 39. Test immunologiczny do wykrywania przeciwciał HCV w próbce biologicznej, obejmujący: dostarczenie cząsteczki oligomerycznej określoną w zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 5 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11 albo 12 albo 13 albo 14 albo 15 albo 16, inkubowanie próbki biologicznej z cząsteczką oligomeryczną w warunkach umożliwiających tworzenie kompleksu pomiędzy cząsteczką oligomeryczną a przeciwciałem HCV, oraz określenie czy utworzył się kompleks co oznacza obecność przeciwciał HCV w próbce.