PL202041B1 - Zastosowanie prazikwantelu do wytwarzania kompozycji do leczenia chorych ssaków cierpiących na pasożytniczą chorobę neurologiczną lub powodującą poronienie, wywoływaną przez kokcydia - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy zastosowania prazikwantelu do wytwarzania kompozycji do leczenia chorych ssaków cierpi acych na paso zytnicz a chorob e neurologiczn a lub powoduj ac a poronienie, wywo lywan a przez kokcydia, zw laszcza tak a jak sarkocytoza, neosporoza lub toksoplazmoza albo izosporoza. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania prazikwantelu do wytwarzania kompozycji do leczenia chorych ssaków cierpiących na pasożytniczą chorobę neurologiczną lub powodującą poronienie, wywoływaną przez kokcydia.

Do zapobiegania i leczenia różnych ssaków, owadów i ryb, w przypadku chorób powodowanych przez pierwotniaki podejrzewane o wywoływanie chorób neurologicznych i/lub chorób powodujących poronienie, w znanym stanie techniki stosuje się liczne związki, wśród których ostatnio wymienia się związki triazynonowe. Zazwyczaj pierwotniakami wrażliwymi na te związki są pasożyty, które infekują jelita ptaków, ssaków i owadów, powodując biegunkę, wyniszczenie, mdłości i wymioty. Ostatnio stwierdzono, że niektóre pasożyty, które przenikają przez barierę krew-mózg, jak również pasożyty, które przenikają przez barierę łożyskową, można traktować triazynonami. Jako przykłady pasożytów, o których wiadomo, że przenikają przez barierę krew-mózg albo przez barierę łożyskową, wymienia się pasożyty powodujące choroby związane z kokcydiami, takie jak Toxoplasma gondii, Sarcocystis neurona, Neospora caninum, Neospora hugesii i Isospora suis. Przykładami związków triazynonowych są triazynodiony, takie jak związki diklazurylowe, oraz triazynotriony, takie jak związki toltrazurylowe. Patrz opisy patentowe St. Zjedn. Am. 4933341, 4935423, 5114938, 5141938, 5188832, 5196562, 5256631 i 5464837.

Podczas gdy o innych omawianych w znanym stanie techniki związkach, wśród których jest prazikwantel (pochodne 2-acylo-4-okso-heksahydro-4H-pirazyno[2,1-a]izochinoliny), wspomina się, że stosuje się je do traktowania pasożytów, to w publikacjach tych brak jest jakichkolwiek wskazówek lub sugestii dotyczących tego, aby związki te nadawały się do traktowania pasożytów, które przenikają przez barierę krew-mózg lub barierę łożyskową. Na ogół prazikwantel stosuje się sam albo w zestawieniu z innymi związkami do otrzymywania kompozycji przeciwrobaczych do traktowania inwazji tasiemców i nicieni i tym podobnych. Patrz opisy patentowe St. Zjedn. Am. 4001411, 4447414 i 5824653.

Opis patentowy St. Zjedn. Am. 5663155 omawia zastosowanie prazikwantelu do zapobiegania i leczenia zakaż enia pasożytami, które powodują choroby takie, jak malaria, trypanosomatoza, leiszmania, schistosomatoza i słoniowacizna. Ten opis patentowy sugeruje również, że prazikwantel można stosować do leczenia zakażenia pasożytniczego ograniczonego do krwi, limfy i tkanek. W szczególności wymienia się toksoplazmozę i sarkocystozę w związku z zakażeniem tkanki mięśniowej lub jelit. Nie wspomina się tam o leczeniu lub zapobieganiu w przypadku chorób, w których Toxoplasma, Sarcocystis, Neospora lub Isospora występują w mózgu dojrzałych ssaków albo przenikają przez barierę łożyskową, zakażając tkanki ośrodkowego układu nerwowego płodu, wywołując poronienie albo słabość noworodków.

Na ogół sposobem działania triazynonów jest atakowanie pośrednich stadiów pasożytów występujących w komórkach przewodu pokarmowego i ścianki jelit, powodując obrzęk siateczki śródcytoplazmatycznej, przestrzeni okołojądrowej i mitochondriów pasożytów. Zakłóca to znacznie zdolność do podziału jąder powodując, że schizonty i mikrogamonty pozostają małe, tworząc odpowiednio tylko kilka merozoitów i mikrogamet. Uważa się, że skutkiem tego jest zmniejszenie zdolności tych ostatnich stadiów pasożytów do penetracji nowych komórek ssaków, co skutecznie hamuje replikację pasożytów w gospodarzu.

Sposób działania prazikwantelu, jak podaje się w opisie patentowym St. Zjedn. Am. 5663155 (tamże), polega na przerwaniu procesów enzymatycznych pasożytów w odniesieniu do metabolizmu pochodnych puryny i struktur chemicznych typu puryny. Pasożyty są bardzo wrażliwe na zakłócanie tych procesów, a więc kompozycje, które są specyficznie ukierunkowane na te procesy, można stosować do selektywnego eliminowania zakażenia pasożytami. Prazikwantel podaje się w przypadku zaatakowania pasożytami w odniesieniu do tkanki mięśniowej, jelit lub zakażenia krwi. Nie wspomina się o traktowaniu pasożytów ośrodkowego układu nerwowego (mózg i rdzeń kręgowy) albo pasożytów, które mogą przenikać przez barierę łożyskową.

Podczas gdy pierwotniakami podejrzewanymi o powodowanie u ssaków chorób neurologicznych i/lub wywołujących poronienie zajmowano się od lat 1970-tych, udane wyodrębnianie i hodowanie in vitro niektórych z tych pierwotniaków okazało się trudne. Na przykład udanego wyodrębniania pasożytów z mózgu lub płynu mózgowo-rdzeniowego nie przeprowadzono do późnych lat 1980-tych. Jednak, gdy stwierdzono, że choroby neurologiczne mogą być wywoływane przez pierwotniaki zakażające mózg, a choroby powodujące poronienie mogą być wywoływane przez pierwotniaki zakażające płód, wystąpiło zapotrzebowanie na skuteczne leki przeciw-pierwotniakowe, które mogłyby przekraczać

PL 202 041 B1 barierę krew-mózg i barierę łożyskową, nie powodując szkodliwych skutków ubocznych. Niewiele leków jest zdolnych do przekraczania bariery krew-mózg lub bariery łożyskowej u ssaków. Niestety wiele spośród znanych leków, które przekraczają barierę krew-mózg i/lub barierę łożyskową w celu skutecznego leczenia infekcji pasożytniczych mózgu, wykazuje szkodliwe działania uboczne tak, że nie można ich stosować bez wielkiego ryzyka. Tak więc nie ma dotychczas skutecznych leków, które by zapewniały skuteczne leczenie takich chorób neurologicznych lub wywołujących poronienie.

Należy podkreślić, że opierając się na opisanym sposobie działania prazikwantelu w opisie patentowym St. Zjedn. Am. 5663155 odnośnie jego szerokiego ataku na enzymy wywołujące metabolizm puryn, należałoby się spodziewać, że związek ten będzie również wywoływał szkodliwe efekty uboczne w przypadku stosowania do leczenia ssaków z pasożytniczymi zakażeniami mózgu.

Poniżej podaje się krótki opis chorób pasożytniczych, które zgodnie z wynalazkiem można leczyć za pomocą prazikwantelu. Końskie pierwotniakowe zapalenie mózgu i rdzenia (Equine Protozoal Myeloencephalitis - EPM) jest neurologiczną chorobą koni, szczególnie młodych koni podlegających stresom (np. konie wyścigowe czystej krwi i konie tresowane czystej krwi), i w związku z tym jest chorobą o dużym znaczeniu ekonomicznym w przemyśle końskim. EPM, po raz pierwszy rozpoznana w latach 1970-tych, nie był a badana w zwią zku z koniem z EPM i uzyskał a nazwę Sarcocystis neurona od roku 1991. W roku 1997 Neospora spp., obecnie nazywana Neospora hugesi, została wyodrębniona z mózgu konia z EPM. Tak więc obecnie proponuje się, aby przyjąć, że EPM jest wywoływana przez ten ostatnio rozpoznany organizm sam, przez organizm Sarcocystis neurona sam albo przez kombinację tych dwóch organizmów.

Inny pasożyt kokcydiowy, Toxoplasma gondii, jest znany od pewnego czasu i pierwotnie był wyodrębniony z jelit i tkanki mięśniowej kotów. Końcowym gospodarzem tych pasożytów jest kot, który może dawać schronienie temu organizmowi przez długi okres czasu, szerząc oocysty do innych ssaków, takich jak bydło, owce, świnie i ludzie. Zakażenie owiec, bydła i ludzi związane jest z poronieniem i zaburzeniami wrodzonymi, które przede wszystkim atakują ośrodkowy układ nerwowy. Ostatnio jest to też związane z poronieniem i wadami rozwojowymi u kociąt urodzonych z zakażonych matek, które były surowiczo-ujemne przed zakażeniem w czasie ciąży. Nie będący kotami gospodarze, tacy jak bydło, owce, świnie i ludzie, nie wytwarzają oocyst, lecz rozwijają je i mogą cierpieć w związku z inwazją w mięśniach i mózgu tachyzoitów i bradyzoitów, które wywoł ują objawy kliniczne choroby objawy neurologiczne i poronienie z wadami płodu. Podaje się, że 60% kotów jest surowiczo dodatnich wobec T. gondii. Dotychczas nie ma dobrego sposobu leczenia lub zapobiegania w przypadku toksoplazmozy.

Jeszcze inny kokcydiowy pasożyt, Neospora caninum, po raz pierwszy wyodrębniony u psów w roku 1988, wywoł uje zarówno neurologiczne jak i powodujące poronienie schorzenia u zwierzą t. Początkowo był on mylony z Toxoplasma gondii. Choroba wywoływana przez tego pasożyta występuje najpoważniej u szczeniaków zakażonych przezłożyskowo i charakteryzuje się stopniowo nasilającym się paraliżem szczeniaków, zwłaszcza ich tylnych kończyn; może również występować zapalenie wielomięśniowe i zapalenie wątroby. Schorzenie to rozpoznano ostatnio jako główną przyczynę poronienia i neurologicznych wad kończyn u nowonarodzonych cieląt. U poronionych płodów w mózgu, rdzeniu kręgowym i sercu można zauważyć mikroskopijne uszkodzenia nie ropiejącego zapalenia mózgu i zapalenia mięśnia sercowego. Ostatnio stwierdzono, że końcowym gospodarzem Neospora caninum jest pies. Obecnie nie ma dobrego sposobu leczenia lub zapobiegania w przypadku Neospora u psów lub bydła albo Neospora hugesi u koni.

Jak wynika z powyższego, znany stan techniki obejmujący wyżej cytowane odnośniki nie sugeruje ani nie wspomina o zastosowaniu prazikwantelu do leczenia zwierząt zakażonych przez kokcydia, albo w szczególności przez rodzinę Sarcocystidae, które powodują choroby wywołujące poronienie albo choroby neurologiczne, bez powodowania nie dających się tolerować skutków ubocznych. Wynalazek proponuje polepszony i bezpieczny sposób leczenia zwierząt zaatakowanych przez choroby pasożytnicze objawiające się jako choroby neurologiczne albo choroby wywołujące poronienie.

Zgodnie z powyższym, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie prazikwantelu do wytwarzania kompozycji do leczenia chorych ssaków cierpiących na pasożytniczą chorobę neurologiczną lub powodującą poronienie, wywoływaną przez kokcydia, a w szczególności przez kokcydia, które są członkiem grupy obejmującej Sarcocystis spp., Neospora spp., Toxoplasma spp. i Isospora spp.

Szczególnie korzystne efekty uzyskuje się, gdy Sarcocystis spp. stanowi Sarcocystis neurona, Neospora spp. stanowi Neospora caninum albo Neospora hugesi, Toxoplasma spp. stanowi Toxoplasma gondii, a Isospora spp. stanowi Isospora suis, przy czym zwłaszcza, gdy Sarcocystis neurona jest

PL 202 041 B1 czynnikiem wywołującym końskie pierwotniakowe zapalenie mózgu i rdzenia (Equine Protozoal Myeloencephalitis), Neospora caninum jest czynnikiem wywołującym neosporozę bydlęcą lub psią, Neospora hugesi jest czynnikiem wywołującym końskie pierwotniakowe zapalenie mózgu i rdzenia (Equine Protozoal Myeloencephalitis) oraz, gdy Toxoplasma gondii jest czynnikiem wywołującym poronienie związane z Toxoplasma u ssaków.

W wytwarzanej kompozycji prazikwantel powinien się znajdować w iloś ci farmaceutycznie skutecznej, co oznacza, że podawana ilość prazikwantelu albo jego pochodnej jest dostateczna do hamowania in vivo lub in vitro wzrostu pasożytniczych pierwotniaków, bez powodowania szkodliwych reakcji ubocznych u traktowanych ssaków. Zazwyczaj pasożytniczymi pierwotniakami są kokcydia, które wywołują choroby neurologiczne i/lub poronienia. Ilość skuteczna farmaceutycznie hamuje rozwój pasożytów w zakażonych tkankach; dzięki temu zdrowie zwierzęcia ulega poprawie. Ponadto farmaceutycznie skuteczna ilość jest skuteczna neurologicznie albo skuteczna łożyskowo w ten sposób, że prazikwantel lub jego pochodna występuje w ilości, która jest zdolna do przekroczenia bariery krew-mózg w celu działania na pasożyty atakujące ośrodkowy układ nerwowy, albo bariery łożyskowej, nie powodując szkodliwych reakcji ubocznych u traktowanych ssaków.

Wytwarzaną kompozycję stosuje się do metafilaktycznego traktowania zwierząt zakażonych pasożytem, który może powodować chorobę neurologiczną lub powodującą poronienie, wywoływaną przez kokcydia. Traktowanie metafilaktyczne polega na podawaniu zwierzęciu prazikwantelu z zastosowaniem trybu metafilaktycznie skutecznego. Określenie „tryb metafilaktycznie skuteczny” oznacza podawanie według schematu przerywanych dawek związku prazikwantelowego albo jego pochodnej w cią gu dł u ż szego czasu, aż do chwili, gdy dane zwierzę pokona atakują ce pasoż yty przez rozwój ochronnej odpowiedzi immunologicznej albo przez inne usunięcie pasożytów. Zazwyczaj stosuje się taki tryb, który skutecznie zwalcza pasożyty i zapobiega przed występowaniem klinicznych objawów choroby. Dawkę metafilaktycznie skuteczną można też podawać przez dłuższy okres czasu do 5 lat albo przez cały okres życia zwierzęcia, zwłaszcza gdy pasożyt jest trudny do zwalczenia.

Leczenie może także polegać na traktowaniu zwierząt jedną wysoką dawką. Sposób ten polega na podawaniu jednej wysokiej dawki farmaceutycznie skutecznej ilości prazikwantelu choremu zwierzęciu cierpiącemu na pasożytniczą chorobę neurologiczną albo powodującą poronienie, która jest wrażliwa na traktowanie prazikwantelem lub jego pochodną. Określenie „jedna wysoka dawka” oznacza ilość, którą podaje się tylko raz dla zwalczenia pasożytów wywołujących chorobę. Ilość ta jest znacznie wyższa od dawki stosowanej w traktowaniu terapeutycznym lub metafilaktycznym i jest skuteczna w zwalczaniu pasożytów wywołujących choroby i nie powoduje szkodliwych skutków ubocznych, takich jak toksyczność. Jedna wysoka dawka prazikwantelu jest w związku z tym większa niż 10 mg/kg. Poniżej opisano bardziej szczegółowo te zagadnienia.

Sposób leczenia wytwarzaną kompozycją polega na podawaniu ssakom kompozycji zawierającej farmaceutycznie skuteczną ilość prazikwantelu. Jako przykłady takich ssaków ilustrujące, lecz nie ograniczające można wymienić konie, bydło, koty, psy, świnie, owce, ptaki, owady i ludzi. Jako pasożyty powodujące zakażenie lub chorobę wymienia się kokcydia z rodziny Sarcocystidae, co może się objawiać w postaci choroby neurologicznej albo powodującej poronienie. Ilustrujące, lecz nie ograniczające przykłady można wybrać z grupy obejmującej Sarcocystis spp., Neospora spp. i Toxoplasma spp. Sarcocystidae wybiera się zazwyczaj z grupy obejmującej S. neurona, N. hugesi, N. caninum i T. gondii. Pierwotniakowe zakażenia lub choroby obejmują, lecz nie są do nich ograniczone, EPM, neosporozę i toksoplamozę.

W praktyce, skutkiem traktowania pasoż ytniczych zakaż eń lub chorób wywoływanych przez opisane tu pierwotniaki jest polepszenie się objawów chorób neurologicznych i powodujących poronienie. Na ogół objawy takie obejmują utykanie, ataksję, paraliż, poronienie, słabość noworodków i inne wspomniane zaburzenia.

W celu traktowania leczniczego zwierzę ta wykazują ce już powyż sze objawy chorobowe traktuje się prazikwantelem. Zazwyczaj okres traktowania wynosi od około 28 dni do 90 dni, a korzystnie od około 28 do 60 dni. Rozumie się, że w przypadku traktowania leczniczego tryb traktowania może przewidywać podawanie raz dziennie, dwa razy lub więcej w ciągu dnia, raz na każdy inny dzień albo nawet raz na tydzień, w zależności od czynników takich, jak powaga choroby i typ pasożyta wywołującego chorobę. W niektórych przypadkach jednak tryb traktowania może trwać bez końca, czasem przez całe pozostałe życie zwierzęcia. Ten ostatni tryb traktowania może być pożądany w przypadku zakażenia zwierzęcia bardziej opornym szczepem pasożyta. Jednak traktowanie można przedłużać w dłuższych okresach czasu aż do wyeliminowania objawów choroby. Korzystnie traktowanie prowadzi

PL 202 041 B1 się raz dziennie w ciągu około 28 dni. Korzystna dawka lecznicza wynosi od 1 mg/kg do 100 mg/kg, zwłaszcza od 2,5 mg/kg do 25 mg/kg.

W przypadku traktowania metafilaktycznego zakażone zwierzęta traktuje się w celu chronienia ich przed klinicznymi objawami choroby. Traktowanie to skutkuje nabyciem przez zwierzęta zdolności do zwalczania pasożytów przez ustalenie skutecznej odpowiedzi immunologicznej dla udzielenia ochrony przeciwko przyszłym zakażeniom, bez potrzeby dalszego podawania prazikwantelu. Działanie metafilaktyczne zgodnie z wynalazkiem dotyczy stosowania kompozycji prazikwantelowych w zaprogramowanym, przerywanym trybie leczenia (tryb metafilaktycznie skuteczny) w celu zwalczania pierwotniaków, które mogły zakazić zwierzę od czasu poprzedniego traktowania. I tak tryb metafilaktycznie skuteczny stosuje się w celu zmniejszenia zdolności pasożytów do wywoływania choroby przez zabicie ich albo przez zmniejszenie ich liczby. Zasadniczo tryb metafilaktycznie skuteczny można stosować w przybliżeniu raz na miesiąc, w ciągu całego życia zwierzęcia albo aż do powstania w zwierzę ciu samorzutnego mechanizmu oczyszczają cego, np. skutecznej odpowiedzi immunologicznej, dla chronienia go przed przyszłym zakażeniem. Może to wystąpić po upływie 5 lat lub mniej. Należy sobie uświadomić, że traktowanie metafilaktyczne opiera się na stwierdzeniu, że gdy zwierzęta są zakażone opisanymi tu pierwotniakami, to kliniczne objawy, takie jak objawy neurologiczne albo poronienie, nie występują wcześniej niż upłynie znaczny okres czasu (np. 2-6 miesięcy po zakażeniu). W przeciwień stwie do tego jelitowe infekcje pierwotniakowe objawiają się wkrótce po zakaż eniu. Zgodnie z wynalazkiem traktowanie metafilaktyczne zapobiega ustabilizowaniu się pasożytów i spowodowaniu przez nie klinicznych objawów chorobowych. Tryb leczenia w schemacie przerywanym wynosi w przybliżeniu raz na miesiąc, raz na dwa miesiące albo raz na dwa tygodnie w dawce odpowiadającej około 1,0 do 100 mg/kg, korzystnie około 1,0 do 25 mg/kg, zwłaszcza około 2,5 do 10 mg/kg. Wysoki poziom dawkowania jest pożądany w przypadkach szczególnie opornych (np. gdy zwierzę jest zakażone przez oporny szczep). Pożądany poziom dawkowania i czas trwania leczenia mieści się w zakresie znanym fachowcom. Korzystny tryb leczenia w przypadku koni z EPM albo bydła i psów z neosporozą mieści się w granicach około 1,0 do 25 mg/kg, a zwłaszcza około 2,5 do 10 mg/kg prazikwantelu lub jego pochodnych w ciągu 28 dni.

W przypadku leczenia jedną wysoką dawką prazikwantel podaje się w ilościach farmaceutycznie skutecznych, które są większe niż 10 mg/kg i wynoszą do około 100 mg/kg. Odrębną cechą wynalazku jest to, że związki według wynalazku nie są toksyczne i w związku z tym można je podawać w wysokich dawkach. Korzyścią podawania wysokich dawek jest fakt, że powtórne dawki nie są już potrzebne.

Nie wiążąc się z żadną szczególną teorią, uważa się, że nieoczekiwany sukces opisanego tu leczenia wynika ze zdolności prazikwantelu do przekraczania bariery krew-mózg albo bariery łożyskowej. Uważa się, że związek stosowany według wynalazku łatwo przekracza barierę krew-mózg, a także jest zdolny do penetracji łożyska i uś miercania pierwotniaków in situ w mózgu i w płynie mózgowo-rdzeniowym/w rdzeniu kręgowym. Ponadto stwierdzono, że związki z tej klasy są nie toksyczne i nie mutagenne nawet w wysokich dawkach niezbędnych w opisanym tu trybie leczenia jedną wysoką dawką.

Dotychczas nie były dostępne żadne efektywne pod względem nakładów, łatwe w podawaniu leki dla skutecznego leczenia i zapobiegania tym chorobom bez występowania niedopuszczalnych skutków ubocznych, takich jak toksyczność lub mutagenność u ssaków.

W praktyce, prazikwantel moż na przeprowadzać w preparaty w dowolny sposób odpowiedni dla podawania zwierzętom. Preparatami do podawania doustnego, co jest tu korzystne, mogą być zawiesiny, tabletki, kapsułki, żele, pasty, gałki albo preparaty w postaci proszków, granulatów albo pigułek. Szczególnie korzystnym preparatem podawanym doustnie jest pasta albo dodatek do pasz. Można też stosować inne sposoby podawania, takie jak podawanie pozajelitowe, miejscowe, domięśniowe i doś luzówkowe, albo inne drogi znane fachowcom. Korzystne jest również podawanie miejscowe w postaci polewania.

Zazwyczaj w preparatach stosuje się farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i substancje pomocnicze. Jako przykłady takich substancji wymienia się środki zagęszczające wybrane z grupy obejmującej Carbopol; zagęszczacze nieorganiczne, takie jak krzemiany, bentonity albo koloidalna krzemionka; zagęszczacze organiczne, takie jak alkohole szeregu tłuszczowego albo estry kwasów tłuszczowych, i środki zwilżające wybrane z grupy obejmującej glikol polietylenowy i laurylosiarczan sodu z Carbopolami. Jako korzystne środki zagęszczające do preparatów w postaci pasty wymienia się Carbopol 974P i Carbopol 934P. Można tu też stosować środki konserwujące wybrane z grupy

PL 202 041 B1 obejmującej parabeny, alkohole i aldehydy. Mogą to być substancje ciekłe, stałe lub gazowe, które ponadto są obojętne lub medycznie dopuszczalne i są kompatybilne z substancjami czynnymi.

Niespodziewanie pasty są skuteczne w przypadku stosowania do traktowania pasożytów. Szczególnie zaskakujące jest to, że pasty można dostarczać w dawce neurologicznie skutecznej. Są one skuteczne w dostarczaniu prazikwantelu w celu przekraczania bariery krew-mózg lub bariery łożyskowej i atakowania pasożytów, które już wniknęły do mózgu albo zakaziły płód ciężarnego zwierzęcia. Poniżej podano opis specyficznej pasty i sposób jej wytwarzania. Korzystna pasta zgodnie z wynalazkiem zawiera mikronizowaną zawiesinę prazikwantelu, glikolu propylenowego, środka zagęszczającego, takiego jak Carbopol, środków konserwujących, takich jak metyloparaben i propyloparaben, oraz wodę. Pastę można otrzymywać przez łączenie wody, na ogół wody oczyszczonej, i glikolu propylenowego, ogrzewanie mieszaniny do temperatury około 70°C i dodawanie środków konserwujących w tej temperaturze. Uzyskaną mieszaninę chłodzi się do temperatury pokojowej, po czym dodaje się Carbopol, korzystnie jako Carbopol 974P albo 934P. Na koniec dodaje się prazikwantel. Po zakończeniu mieszania wartość pH doprowadza się do około 6,0 za pomocą wodorotlenku sodu. Szczególnie korzystna pasta zawiera 15% wagowych prazikwantelu, 20% wagowych glikolu propylenowego, 0,5% wagowych Carbopolu 974P, 0,14% wagowych metyloparabenu, 0,02% wagowych propyloparabenu, 0,1% wagowych wodorotlenku sodu, a resztę uzupełnia się oczyszczoną wodą. Dla polepszenia smaku można dodawać środki słodzące, takie jak dekstroza, sacharoza, laktoza, fruktoza, sorbitol, ksylitol, syntetyczne środki słodzące i melasę. Dodatkowo w tym samym celu można dodawać drożdże lub aromat wątrobiany.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w następujących przykładach, nie stanowiących ograniczenia zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1. W celu okreś lenia zakresu ochrony zapewnionej przez prazikwantel prowadzi się testowanie in vitro. Sarcocystis neurona bada się pod kątem wrażliwości na ten związek. Stosuje się szczep SN3 Sarcocystis neurona. Prazikwantel testuje się w dwóch stężeniach, 10 μg/ml i 20 μg/ml.

Komórki bydlęcej małżowiny nosa (BT) stosuje się we wszystkich testach in vitro. Komórki hoduje się do stadium zlewania się w kolbach 25 cm² w pożywce RMPI 1640 uzupełnionej przez 10% objętościowych płodowej surowicy cielęcej (FBS), 100 jednostek penicyliny (g/ml), 100 mg streptomycyny/ml i 5 x 10^-2 mM 2-merkaptoetanolu. Po zakończeniu zlewania się komórek komórki pozostawia się w tej samej pożywce o zmniejszonej ilości FBS (2% objętościowych). Kultury komórkowe poddaje się inkubacji w temperaturze 37°C w nawilżanej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza.

Dla zbadania wzrostu pasożytów monowarstwy komórek BT zakaża się pasożytami i bada się za pomocą odwróconego mikroskopu pod kątem rozwoju uszkodzeń (efekt cytopatyczny, „CPE”) albo obecności licznych pozakomórkowych merozoitów. Jeżeli zaobserwuje się uszkodzenia albo obecność wielu pozakomórkowych pasożytów, to monowarstwę zeskrobuje się końcem 5 ml pipety i 1 do 3 kropli cieczy zawierającej merozoity przenosi się do dwóch kolb ze świeżymi komórkami BT. Merozoity S. neurona poddaje się takiemu pasażowaniu co 5-10 dni.

Testem do określania skuteczności prazikwantelu jest test Microtiter Monolayer Disruption Assay (MMDA). Test ten stosuje się do określania, czy pasożyty lub związek są toksyczne wobec komórek BT. Płytki do mikromiareczkowania o płaskim dnie o 96 zagłębieniach poddaje się inokulacji za pomocą komórek BT i uzyskane monowarstwy stosuje się do określania działania prazikwantelu na wytwarzanie merozoitów, co mierzy się za pomocą CPE (efekt cytopatyczny - tworzenie płytek). Monowarstwy poddaje się inokulacji za pomocą pasożytów (S. neurona w liczbie 50000/zagłębienie). Wszystkie zagłębienia poddaje się inokulacji za pomocą odpowiedniego stężenia prazikwantelu po upływie 2 godzin po zakażeniu monowarstw. Nietraktowane i niezakażone monowarstwy w zagłębieniach służą jako próba kontrolna pasożytów, a niezakażone, traktowane środkiem komórki BT służą jako próba kontrolna toksyczności. Każde traktowanie bada się w 6 replikacjach. Każde zagłębienie monitoruje się wizualnie w ciągu dnia i próbę zatrzymuje się, gdy 90-100% nietraktowanych, zakażonych merozoitami komórek ulega lizie (90-100% CPE). Wszystkie zagłębienia przemywa się solanką buforowaną fosforanem (PBS) i utrwala w 100% metanolu w ciągu 5 minut, po czym zabarwia się w roztworze krystalicznego fioletu. Obszary objęte destrukcją wywołaną przez merozoity albo śmiercią komórek BT w związku z toksycznością nie przyjmują fioletu krystalicznego. Czytnik płytek ELISA stosuje się do ilościowego określania stopnia przyjmowania krystalicznego fioletu i dane te stosuje się do określania stężenia prazikwantelu hamującego destrukcję o 50% (stężenie hamujące 50 albo IC50). Te dane obrazujące hamowanie przedstawia tabela 1. Odnotowuje się, że tak mała ilość jak 10 μg/ml

PL 202 041 B1 prazikwantelu powoduje 51% hamowania destrukcji komórek. Prazikwantel w stężeniu 20 μg/ml powoduje 69% hamowania destrukcji komórek. Wskazuje to, że prazikwantel jest skuteczny w leczeniu chorób wywoływanych przez kokcydia, o których wiadomo, że są związane z objawami chorób neurologicznych i powodujących poronienie, obejmując choroby wywoływane przez S. neurona, N. caninum, N. hugesi, T. gondii i I. suis. Ponadto prazikwantel nie jest toksyczny wobec komórek BT.

T a b e l a 1

Dane in vitro dotyczące działania prazikwantelu na Sarcocystis neurona

Organizm	Hamowanie destrukcji komórek w procentach
0 μg/ml	10 μg/ml	20 pg/ml
Sarcocystis neurona	0%	51%	69%

Dane te wskazują, że dawka 2,5-10 mg/kg jest neurologicznie skuteczna w przypadku traktowania ssaków cierpiących na chorobę wywoływaną przez Sarcocystis neurona.

Claims (7)

1. Zastosowanie prazikwantelu do wytwarzania kompozycji do leczenia chorych ssaków cierpiących na pasożytniczą chorobę neurologiczną lub powodującą poronienie, wywoływaną przez kokcydia.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kokcydia są członkiem grupy obejmującej Sarcocystis spp., Neospora spp., Toxoplasma spp. i Isospora spp.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że Sarcocystis spp. stanowi Sarcocystis neurona, Neospora spp. stanowi Neospora caninum albo Neospora hugesi, Toxoplasma spp. stanowi Toxoplasma gondii, a Isospora spp. stanowi Isospora suis.

4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że Sarcocystis neurona jest czynnikiem wywołującym końskie pierwotniakowe zapalenie mózgu i rdzenia (Equine Protozoal Myeloencephalitis).

5. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że Neospora caninum jest czynnikiem wywołującym neosporozę bydlęcą lub psią.

6. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że Neospora hugesi jest czynnikiem wywołującym końskie pierwotniakowe zapalenie mózgu i rdzenia (Equine Protozoal Myeloencephalitis).

7. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że Toxoplasma gondii jest czynnikiem wywołującym poronienie związane z Toxoplasma u ssaków.