PL202369B1

PL202369B1 - Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB oraz zestaw zawierający to przeciwciało

Info

Publication number: PL202369B1
Application number: PL353750A
Authority: PL
Inventors: Sharon Ann Baughman; Steven Shak
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2009-06-30
Also published as: KR20110008112A; ES2330301T3; KR20090024308A; US7371379B2; NZ517150A; PL353750A1; US20060210561A1; US20040037824A1; JP5818545B2; US10160811B2; JP2003508447A; EP2111870A1; KR101261749B1; CA2382100A1; AU2006200146A1; TR200200472T2; WO2001015730A1; EP1210115B1; IL148114A; DE60042693D1

Abstract

Wynalazek dotyczy leczenia zaburzeń charakteryzujących się nadekspresją ErbB2. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy leczenia przeciwciałami skierowanymi przeciw ErbB2 pacjentów podatnych na lub, u których zdiagnozowano raka z nadekspresją ErbB2.

Description

Opis wynalazku

Zakres wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 i zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB oraz zestaw zawierający to przeciwciało. Przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 i ErbB służą do leczenia zaburzeń charakteryzujących się nadekspresją ErbB2 lub zaburzeń, w których zachodzi ekspresja receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGFR). Leczenie to obejmuje podawanie człowiekowi lub zwierzęciu posiadającemu te zaburzenia, terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała, które wiąże ErbB2.

Leczenie dotyczy pacjentów podatnych na raka lub u których zdiagnozowano raka, u których zachodzi nadekspresją ErbB2 lub ekspresja EGFR, przy czym leczenie prowadzi się stosując skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało podawane podczas leczenia, dożylne i/lub podskórne, najpierw w dawce uderzeniowej. Leczenie raka u pacjentów może obejmować kombinację przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 i czynnika chemioterapeutycznego, takiego jak taksanu. Taksanem może być, paklitaksel lub docetaksel. W wynalazku omawia się także leczenie raka u pacjentów kombinacją przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 i czynnika chemioterapeutycznego, takiego jak, pochodna antracyklinowa. Ewentualnie, leczenie przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2 i pochodną antracyklinową obejmuje leczenie skuteczną ilością czynnika chroniącego serce.

Stwierdzono, że protoonkogeny, kodujące czynniki wzrostowe i receptory czynników wzrostowych, odgrywają ważną rolę w patogenezie różnych ludzkich nowotworów złośliwych, włącznie z rakiem sutka. Ustalono, że ludzki gen ErbB2 (erbB2, znany również jako her2 lub c-erbB-2), który koduje receptor będący glikoproteiną transbłonową o masie cząsteczkowej 185 kd (p185^HER2), zbliżony do receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGFR), ulega nadekspresji w około od 25% do 30% ludzkich raków sutka (Slamon i in., Science 235: 177-182 [1987]; Slamon i in., Science 244: 707-712 [1989].

Kilka grup dowodów potwierdza bezpośrednią rolę ErbB2 w patogenezie i kliniczną agresywność nowotworów, w których występuje nadekspresja ErbB2. Wykazano, że wprowadzenie ErbB2 do komórek nienowotworowych powoduje ich transformację nowotworową (Hudziak i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7159-7163 [1987]; DiFiore i in., Science 237: 78-182 [1987]). Stwierdzono, że u myszy transgenicznych, u których występuje ekspresja HER2, rozwijają się nowotwory sutka (Guy i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10578-10582 [1992].

Opisano przeciwciała skierowane przeciw ludzkim produktom białkowym erbB2 oraz białkom kodowanym przez szczurzy odpowiednik genu erbB2 (neu). Drebin i in., Cell 41: 695-706 (1985) odnoszą się do monoklonalnego przeciwciała IgG2a, które jest skierowane przeciw produktowi genu neu szczura. Przeciwciało to, nazwane 7.16.4, powoduje zmniejszenie ekspresji p185 na powierzchniach komórkowych komórek B104-1-1 (komórki NIH-3T3 stransfekowane protoonkogenem neu) i hamuje tworzenie kolonii tych komórek. W Drebin i in., PNAS (USA) 83: 9129-9133 (1986) wykazano, że przeciwciało 7.16.4 hamuje rakotwórczy wzrost stransformowanych neu komórek NIH-3T3, jak również wszczepionych myszom „nude” szczurzych komórek niedojrzałego nerwiaka (z których początkowo wyizolowano onkogen neu). Drebin i in., Oncogene 2: 387-394 (1988) dyskutują tworzenie zestawu przeciwciał skierowanych przeciw produktowi genu neu. Stwierdzono, że wszystkie z tych przeciwciał wywierają cytostatyczny wpływ na wzrost stransformowanych komórek neu zawieszonych w miękkim agarze. Przeciwciała izotypów IgM, IgG2a i IgG2b były zdolne do doprowadzania do wysokich poziomów zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC) komórek stransformowanych neu. Drebin i in., Oncogene 2: 273-277 (1988) donoszą, że w wyniku stosowania mieszanin przeciwciał reaktywnych wobec dwóch odrębnych regionów p185^neu uzyskuje się synergistyczne wpływy przeciwnowotworowe wobec stransformowanych neu komórek NIH-3T3 wszczepionych myszom „nude”. Przeglądu wpływów biologicznych przeciwciał skierowanych przeciw neu dokonano w Myers i in., Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991). Patrz także publikacja WO numer 94/22478, opublikowana 13 października 1994 r.

Hudziak i in., Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) opisują tworzenie zestawu przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2, które scharakteryzowano stosując linię komórek ludzkiego nowotworu sutka, SKBR3. Względną proliferację komórkową komórek SKBR3 po ekspozycji na przeciwciała określano przez wybarwianie fioletem krystalicznym monowarstw po 72 godzinach. Stosując to oznaczenie, najwyższe hamowanie otrzymano dla przeciwciała nazwanego 4D5, które hamowało proliferację komórkową o 56%. Inne przeciwciała z zestawu, włączając 7C2 i 7F3, w mniejszym stopniu obniżały proliferację komórkową w tym oznaczeniu. Hudziak i in. wywnioskowali, że wpływ przeciwciała 4D5 na

PL 202 369 B1 komórki SKBR3 był raczej cytostatyczny, niż cytotoksyczny, ponieważ wzrost komórek SKBR3 powrócił do prawie normalnej szybkości po usunięciu przeciwciała z podłoża. Stwierdzono ponadto, że przeciwciało 4D5 uczula linie komórek nowotworów sutka, w których zachodzi nadekspresja p185^Erb2, na cytotoksyczne wpływy TNF-α. Patrz także publikacja WO 89/06692, opublikowana 27 lipca 1989 r. Dyskutowane w Hudziak i in. przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 scharakteryzowano dalej w Fendly i in., Cancer Research 50: 1550-1558 (1990); Kotts i in., In Vitro 26(3): 59A (1990); Sarup i in., Growth Regulation 1: 72-82 (1991); Shepard i in., J. Clin. Immunol. 11(3): 117-127 (1991); Kumar i in., Mol. Cell. Biol. 11(2): 979-986 (1991); Lewis i in., Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263 (1993); Pietras i in., Oncogene 9: 1829-1838 (1994); Vitetta i in., Cancer Research 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski i in., J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott i in., J. Biol. Chem. 266: 14300-5 (1991) oraz D'souza i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7202-7206 (1994).

Tagliabue i in., Int. J. Cancer 47: 933-937 (1991) opisują dwa przeciwciała, które wybrano ze względu na ich reaktywność wobec linii komórkowej gruczolakoraka płuc (Calu-3), w której zachodzi nadekspresją ErbB2. Stwierdzono, że jedno z przeciwciał, nazwane MGR3, ulega internalizacji, indukuje fosforylację ErbB2 i hamuje wzrost komórek nowotworowych in vitro.

McKenzie i in., Oncogene 4: 543-548 (1989) utworzyli zestaw skierowanych przeciw ErbB2 przeciwciał o różnych specyficznościach epitopowych, włącznie z przeciwciałem oznaczonym TAI. Stwierdzono, że to przeciwciało TA1 indukuje przyspieszoną endocytozę ErbB2 (patrz Maier i in., Cancer Res. 51: 5361-5369 [1991]. Bacus i in., Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990) donieśli, że przeciwciało TA1 indukowało dojrzewanie linii komórek raka sutka AU-565 (w której zachodzi nadekspresja genu erbB2) oraz MCF-7 (w której nie występuje nadekspresja). Stwierdzono, że hamowanie wzrostu i nabywanie dojrzałego fenotypu przez te komórki jest związane z obniżonymi poziomami receptora ErbB2 na powierzchniach komórkowych oraz przejściowo zwiększonymi poziomami w cytoplazmie.

Stancovski i in., PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991) utworzyli zestaw przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2, wstrzykiwali je dootrzewnowo myszom „nude” i oceniali ich wpływ na nowotworowy wzrost mysich fibroblastów stransformowanych przez nadekspresję genu erbB2. Dla czterech z przeciwciał wykryto różne poziomy hamowania nowotworu, ale jedno z przeciwciał (N28) konsekwentnie stymulowało wzrost nowotworu. Monoklonalne przeciwciało N28 indukowało znaczącą fosforylację receptora ErbB2, podczas gdy pozostałe cztery przeciwciała generalnie wykazywały niską lub brak aktywności indukowania fosforylacji. Oszacowano również wpływ skierowanych przeciw ErbB2 przeciwciał na proliferację komórek SKBR3. W tym oznaczeniu proliferacji komórek SKBR3, dwa z przeciwciał (N12 i N29) powodowały obniżenie proliferacji komórkowej w stosunku do kontroli. Oceniano zdolność różnych przeciwciał do indukowania lizy komórek in vitro na drodze cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) i cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), i autorzy pracy wywnioskowali, że hamujące działanie przeciwciał nie było znacząco związane z CDC lub ADCC.

Bacus i in., Cancer Research 52: 2580-2589 (1992) dalej scharakteryzowali przeciwciała opisane w Bacus i in. (1990) oraz Stancovsky i in., patrz poprzednie akapity. Rozszerzając badania Stancovsky'ego i in. prowadzone przy podawaniu dootrzewnowym, oceniali wpływ przeciwciał po dożylnej iniekcji myszom „nude” posiadającym mysie fibroblasty, w których zawodziła nadekspresja ludzkiego ErbB2. Jak obserwowano w ich wcześniejszej pracy, N28 przyspieszało wzrost nowotworów, podczas gdy N12 i N29 znacząco hamowały wzrost komórek z ekspresją ErbB2. Częściowe hamowanie nowotworów obserwowano również dla przeciwciała N24. Bacus i in. testowali również zdolność przeciwciał do pobudzania powstawania dojrzałego fenotypu w linach komórek ludzkiego raka sutka AU-565 i MDA-MB452 (w których zachodzi nadekspresja ErbB2), jak również MCF-7 (zawierających niskie poziomy receptora). Bacus i in. dostrzegli korelację pomiędzy hamowaniem nowotworów iv vivo i różnicowaniem komórkowym; stymulujące nowotwór przeciwciało N28 nie miało wpływu na różnicowanie, a hamujące nowotwory działanie przeciwciał N12, N29 i N24 skorelowane było ze stopniem indukowanego przez nie różnicowania.

Xu i in., Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993) oceniali zestaw przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2 pod względem specyficzności wiązania epitopów, jak również zdolności do hamowania niezależnego od przylegania i zależnego od przylegania wzrostu komórek SKBR3 (przez poszczególne przeciwciała lub ich kombinacje), modulowania ErbB2 na powierzchni komórek i hamowania stymulowanego ligandami wzrostu niezależnego od przylegania. Patrz także publikacja WO numer 94/00136, opublikowana 6 stycznia 1994 r., oraz Kasprzyk i in., Cancer Research 52: 2771-2776 (1992) dotyczące kombinacji przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2. Inne przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 dyskutowano w Hancock i in., Cancer Res. 51: 4575-4580 (1991); Shawver i in., Cancer Res.

PL 202 369 B1

54: 1367-1373 (1994); Arteaga i in., Cancer Res. 54: 3758-3765 (1994) oraz Harwerth i in., J. Biol. Chem. 267: 15160-15167 (1992).

Rekombinowane, humanizowane przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw ErbB2 (zrekombinowana, humanizowana wersja mysiego, skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała 4D5, określanego jako rhuMAb HER2, HERCEPTIN^®, lub skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało HERCEPTIN^®) jest klinicznie aktywne u pacjentów z przerzutowymi rakami sutka z nadekspresją ErbB2, którzy uprzednio przeszli intensywną terapię przeciwrakową (Baselga i in., J. Clin. Oncol. 14: 737-744 (1996)). Zalecana początkowa dawka uderzeniowa HERCEPTIN^® wynosi 4 mg/kg, podawane jako infuzja w ciągu 90 minut. Zalecana cotygodniowa dawka podtrzymująca wynosi 2 mg/kg i można podawać ją jako infuzję w ciągu 30 minut, jeśli początkowa dawka obciążająca jest dobrze tolerowana.

Nadekspresję ErbB2 powszechnie uważa się za prognostyk złych rokowań, szczególnie u pacjentów z chorobą pierwotną, która obejmuje pachowe węzły chłonne (Slamon i in., [1987] i [1989], supra; Ravdin i Chamness, Gene 159: 19-27 [1985] oraz Hynes i Stern, Biochim. Biophys. Acta 1198: 165-184 [1994]) i jest związana z podatnością i/lub opornością na terapię hormonalną i schematy chemioterapeutyczne, obejmujące CMF (cyklofosfamid, metotreksat i fluorouracyl) i antracykliny (Baselga i in., Oncogene 11(3 Suppl 1): 43-48 [1997]). Jednakże, pomimo związku nadekspresji ErbB2 ze złymi rokowaniami, szanse pacjentów HER2-dodatnich odpowiadających klinicznie na leczenie taksanami, były ponad trzykrotnie większe niż pacjentów HER2-ujemnych (ibid). Wykazano, że rhuMab HER2 wzmacnia aktywność paklitakselu (TAXOL^®) i doksorubicyny wobec heteroprzeszczepów raka sutka u myszy „nude”, którym wstrzyknięto ludzkie komórki gruczolakoraka sutka BT-474, w których zachodziła ekspresja wysokich poziomów HER2 (Baselga i in., Breast Cancer, Proceedings of ASCO, tom 13, streszczenie 53 [1994]).

Niniejszy wynalazek związany jest z odkryciem, że wczesne osiągnięcie skutecznego docelowego obniżonego stężenia w surowicy przez dostarczanie początkowej dawki lub dawek przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2, a następnie kolejnej dawki równej lub mniejszej ilości przeciwciała (większa dawka uderzeniowa) jest bardziej skuteczne od terapii konwencjonalnych. Skuteczne docelowe obniżone stężenie w surowicy osiąga się w ciągu 4 tygodni lub mniej, korzystnie 3 tygodni lub mniej, korzystniej 2 tygodni lub mniej, a najkorzystniej 1 tygodnia lub mniej, włącznie z 1 dniem lub mniej. Docelowe stężenie w surowicy jest następnie utrzymywane dzięki podawaniu dawek podtrzymujących równych lub mniejszych ilości podczas pozostałej części schematu leczenia lub do uzyskania objawów zahamowania choroby.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 do wytwarzania leku do leczenia pacjenta będącego człowiekiem, u którego zdiagnozowano raka charakteryzującego się nadekspresją ErbB2, przy czym leczenie obejmuje etap podawania pacjentowi, dawki początkowej wynoszącej co najmniej około 5 mg/kg przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2; oraz podawanie pacjentowi wielu kolejnych dawek przeciwciała w ilości, która jest taka sama lub mniejsza niż dawka początkowa, przy czym kolejne dawki są oddzielone od siebie w czasie o co najmniej dwa tygodnie.

Korzystnie dawkowanie w zastosowaniu według wynalazku stosuje się tak aby początkowa dawka wynosiła co najmniej 6 mg/kg, ewentualnie 8 mg/kg, ewentualnie 12 mg/kg, a kolejne dawki były oddzielone od siebie w czasie o co najmniej trzy tygodnie. Korzystnie co o najmniej jedna kolejna dawka wynosi 2 mg/kg, ewentualnie 6 mg/kg.

Bardziej korzystnie początkowa dawka wynosi 8 mg/kg i co najmniej jedna kolejna dawka wynosi również 8 mg/kg.

Początkową dawkę można korzystnie podawać przez iniekcję dożylną lub podskórną i co najmniej jedną kolejną dawkę też można podawać podskórnie.

Możliwe jest także korzystnie takie podawanie, aby początkową dawkę podać przez iniekcję dożylną a co najmniej dwie kolejne dawki, podaje się przez iniekcję dożylną lub iniekcję podskórną.

Korzystnie początkowa dawka wynosi 8 mg/kg a podawanie początkowej dawki i kolejnych dawek jest oddzielone od siebie w czasie o co najmniej 2 tygodnie, ewentualnie o co najmniej trzy tygodnie.

W zastosowaniu według wynalazku leczenie dotyczy raka którego wybiera się z grupy obejmującej raka sutka, białaczki, raka płaskonabłonkowego, drobnokomórkowego raka płuc, niedrobnokomórkowego raka płuc, raka przewodu pokarmowego, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajników, raka wątroby, raka pęcherza moczowego, wątrobiaka, raka okrężnicy, raka okrężnicy i odbytnicy, raka śluzówki macicy, raka gruczołów ślinowych, raka nerek, raka wątroby, raka gruczołu krokowego, raka sromu, raka tarczycy, raka wątroby i różnych rodzajów raka głowy i szyi.

PL 202 369 B1

W zastosowaniu według wynalazku przeciwciało korzystnie wiąże się z zewną trzkomórkową domeną receptora ErbB2, a bardziej korzystnie przeciwciało wiąże się z epitopem 4D5 w obrębie wspomnianej domeny. Także korzystnie przeciwciało jest humanizowanym przeciwciałem 4D5 skierowanym przeciw ErbB2.

W zastosowaniu wedł ug wynalazku podaje się ponadto skuteczną iloś ci czynnika chemioterapeutycznego, przy czym czynnikiem chemioterapeutycznym jest taksan, w tym jest to paklitaksel lub docetaksel.

Czynnikiem chemioterapeutycznym jest też korzystnie pochodna antracyklinowa, to jest doksorubicyna lub epirubicyna. W wynalazku ponadto podaje się czynnik chroniący serce.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB do wytwarzania leku do leczenia raka u pacjenta, będącego człowiekiem, przy czym leczenie obejmuje podawanie pacjentowi pierwszej dawki tego przeciwciała a następnie podawanie co najmniej jednej kolejnej dawki tego przeciwciała, przy czym pierwsza dawka i kolejna dawka są oddzielone od siebie w czasie o co najmniej dwa tygodnie.

Korzystnie pierwsza dawka i kolejna dawka są oddzielone od siebie w czasie o co najmniej trzy tygodnie, a pierwsza dawka i kolejna dawka lub każda kolejna dawka korzystnie wynoszą od 2 mg/kg do 16 mg/kg. W następnym korzystnym rozwiązaniu pierwsza dawka i kolejna dawka lub każda kolejna dawka wynoszą od 4 mg/kg lub 6 mg/kg do około 12 mg/kg.

W zastosowaniu wedł ug wynalazku pacjentowi podaje się dwie lub wię cej kolejnych dawek przeciwciała, ewentualnie możliwe jest podanie od dwóch do dziesięciu kolejnych dawek przeciwciała. Korzystnie dwie lub więcej kolejnych dawek są oddzielone od siebie w czasie o co najmniej dwa tygodnie lub ewentualnie są oddzielone od siebie w czasie o co najmniej około trzy tygodnie.

Można także korzystnie podać pacjentowi ponadto skuteczną ilość czynnika chemioterapeutycznego, którym korzystnie może być taksan, a przeciwciałem jest przeciw skierowane ErbB2.

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw składający się z pojemnika, kompozycji i ulotki, który zawiera przeciwciało skierowane przeciw ErbB i ulotkę informacyjną zawierającą instrukcje dotyczące podawania tego przeciwciała.

Korzystnie zestaw zawiera ponadto drugi pojemnik zawierający farmaceutycznie akceptowalny bufor.

Zestaw może też zawierać jeden lub więcej buforów, rozpuszczalników, filtrów, igieł lub strzykawek.

Początkową dawkę (lub dawki), leku zawierającego przeciwciałao ErbB2, jak również następną dawkę lub dawki podtrzymujące podaje się podskórnie. Ewentualnie, gdy tolerancja pacjenta na przeciwciało jest nieznana, początkową dawkę podaje się przez infuzję dożylną, po której następuje podskórne podawanie dawek podtrzymujących, jeśli tolerancja przeciwciała przez pacjenta jest akceptowalna.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, leczenie obejmuje podawanie początkowej dawki przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 wyższej niż około 4 mg/kg, korzystnie wyższej niż około 5 mg/kg. Maksymalna początkowa dawka lub następna dawka nie przekracza 50 mg/kg, korzystnie nie przekracza 40 mg/kg, a najkorzystniej nie przekracza 30 mg/kg. Podawanie jest podawaniem dożylnym lub podskórnym, korzystnie dożylną infuzją lub szybką iniekcją dawki, a korzystniej podskórną iniekcją dawki. Początkową dawką może być jedno lub więcej podawań leku wystarczających do osiągnięcia docelowego obniżonego stężenia w surowicy w ciągu 4 tygodni lub mniej, korzystnie 3 tygodni lub mniej, korzystniej 2 tygodni lub mniej, a najkorzystniej 1 tygodnia lub mniej, włącznie jednym dniem lub mniej.

Zgodnie z wynalazkiem, po początkowej dawce lub dawkach następują kolejne dawki równej lub mniejszej ilości przeciwciała w odstępach dostatecznie bliskich dla utrzymywania obniżonego stężenia w surowicy przeciwciała na lub powyżej skutecznego poziomu docelowego. Korzystnie, początkowa dawka lub kolejna dawka nie przekracza 50 mg/kg, a każda następna dawka wynosi co najmniej 0,01 mg/kg. Korzystnie, ilość podawanego leku jest wystarczająca do utrzymania docelowego obniżonego stężenia w surowicy, tak że odstęp pomiędzy cyklami podawania wynosi co najmniej jeden tydzień. Korzystnie, podczas leczenia obniżone stężenie w surowicy nie przekracza 2500 μg/ml i nie spada poniżej 0,01 μg/ml. Zaletą sposobu leczenia według wynalazku polegającego na podawaniu najpierw dawki uderzeniowej jest zwiększona skuteczność dzięki wczesnemu osiąganiu docelowego stężenia leku w surowicy podczas leczenia. Zaletą podskórnego dostarczania dawek podtrzymujących według wynalazku jest dogodność dla pacjenta i pracowników służby zdrowia, oraz zmniejszanie czasu i kosztów terapii lekiem. Korzystnie, dawka początkowa (lub ostatnia dawka w serii dawek

PL 202 369 B1 początkowych) jest oddzielona w czasie od pierwszej kolejnej dawki o 4 tygodnie lub mniej, korzystnie 3 tygodnie lub mniej, korzystniej 3 tygodnie lub mniej, najkorzystniej 1 tydzień lub mniej.

W rozwiązaniu według wynalazku, początkowa dawka przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 wynosi 6 mg/kg, 8 mg/kg lub 12 mg/kg, dostarczana przez podawanie dożylne lub podskórne, takie jak infuzja dożylna lub podskórna szybka iniekcja dawki. Następne dawki podtrzymujące wynoszą 2 mg/kg i podaje się je raz w tygodniu przez infuzję dożylną, dożylną szybką iniekcję dawki, infuzję podskórną lub podskórną szybką iniekcję dawki. Wyboru sposobu podawania dawek początkowej i podtrzymujące dokonuje się zgodnie ze zdolnoś cią pacjenta, zwierzę cia lub czł owieka, do tolerowania wprowadzania przeciwciała do organizmu. Jeśli przeciwciało jest dobrze tolerowane, czas infuzji może zostać zmniejszony. Wybór metod podawania, jak ujawniono dla tego rozwiązania, stosuje się do wszystkich schematów podawania leku rozważanych zgodnie z tym wynalazkiem.

W innym rozwiązaniu, wynalazek obejmuje początkową dawkę przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 wynoszącą 12 mg/kg, po której następują kolejne dawki podtrzymujące wynoszące 6 mg/kg raz na 3 tygodnie.

W jeszcze innym rozwiązaniu, wynalazek obejmuje początkową dawkę przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 wynoszącą 8 mg/kg, po której następują dawki wynoszące 6 mg/kg raz na 3 tygodnie.

W jeszcze innym rozwiązaniu, wynalazek obejmuje początkową dawkę przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 wynoszącą 8 mg/kg, po której następują kolejne dawki podtrzymujące wynoszące 8 mg/kg raz co od 2 do 3 tygodni.

W innym rozwią zaniu, wynalazek obejmuje dawki począ tkowe przeciwcia ł a skierowanego przeciw ErbB2, wynoszące co najmniej 1 mg/kg, korzystnie 4 mg/kg, w każdym z dni 1, 2 i 3, po których następują kolejne dawki podtrzymujące wynoszące 6 mg/kg raz na 3 tygodnie.

W innym rozwiązaniu, wynalazek obejmuje początkową dawkę przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 wynoszącą 4 mg/kg, po której następują kolejne dawki podtrzymujące wynoszące 2 mg/kg dwa razy w tygodniu, przy czym dawki podtrzymujące oddzielone są o 3 dni.

W jeszcze innym rozwiązaniu, wynalazek obejmuje cykl dawkowania, w którym dostarczanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 odbywa się 2-3 razy na tydzień w ciągu 3 tygodni. W jednym rozwiązaniu wynalazku, każda dawka wynosi około 25 mg/kg lub mniej dla pacjenta, korzystnie około 10 mg/kg lub mniej. Ten trwający 3 tygodnie cykl korzystnie powtarza się, jak jest to konieczne do zahamowania objawów choroby.

W innym rozwiązaniu, wynalazek obejmuje cykl dawkowania, w którym dostarczanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 odbywa się codzienne w ciągu 5 dni. Zgodnie z wynalazkiem, cykl korzystnie powtarza się, jak jest to konieczne do zahamowania objawów choroby.

Zaburzeniem korzystnie jest łagodny lub złośliwy nowotwór charakteryzujący się nadekspresją receptora ErbB2, np. rak, taki jak rak sutka, rak płaskonabłonkowy, drobnokomórkowy rak płuc, niedrobnokomórkowy rak płuc, rak układu pokarmowego, rak trzustki, glejak, rak szyjki macicy, rak jajnika, rak wątroby, rak pęcherza moczowego, wątrobiak, rak okrężnicy, rak okrężnicy i odbytnicy, rak śluzówki macicy, rak gruczołów ślinowych, rak nerek, rak gruczołu krokowego, rak sromu, rak tarczycy, rak wątroby i różne rodzaje raka głowy i szyi. Można także podawać jako czynnik terapeutyczny inny niż antracyklinowy, np. doksorubicyny lub epirubicyny. Czynnikiem chemioterapeutycznym korzystnie jest taksan, taki jak TAXOL^® (paklitaksel) lub pochodna TAXOLU^®.

Korzystne przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 wiążą się z zewnątrzkomórkową domeną receptora ErgbB2, a korzystnie wiążą się z epitopem 4D5 lub 3H4 w obrębie sekwencji domeny zewnątrzkomórkowej ErbB2. Korzystniej, przeciwciałem jest przeciwciało 4D5, najkorzystniej w postaci humanizowanej. Inne korzystne przeciwciała wiążące ErbB2 obejmują, ale nie ograniczają się do przeciwciał 7C2, 7F3, i 2C4, korzystnie w postaci humanizowanej.

Niniejszy wynalazek jest szczególnie użyteczny do leczenia raka sutka lub jajnika, charakteryzującego się nadekspresją receptora ErbB2.

Umożliwia on także leczenie obejmujące nieczęste dawkowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2. W szczególności, do leczenia raka (np. raka charakteryzującego się nadekspresją receptora ErbB2) u pacjenta, obejmujący podawanie pacjentowi pierwszej dawki przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, po której następuje co najmniej jedna kolejna dawka przeciwciała, przy czym pierwsza dawka i kolejna dawka oddzielone są od siebie wzajemnie w czasie o co najmniej około dwa tygodnie (np. od około dwóch tygodni do około dwóch miesięcy), a ewentualnie o co najmniej około trzy tygodnie (np. od około trzech tygodni do około 6 tygodni). Na przykład, przeciwciało można podawać co około trzy tygodnie, od około dwóch do około 20 razy, np. około sześciu razy. Każda z pierwszej

PL 202 369 B1 dawki i kolejnej dawki może wynosić od około 2 mg/kg do około 16 mg/kg, np. od około 4 mg/kg do około 12 mg/kg, a ewentualnie od około 6 mg/kg do około 12 mg/kg. Generalnie, pacjentowi podaje się dwie lub więcej kolejnych dawek (np. od około dwóch do około dziesięciu kolejnych dawek) przeciwciała i te kolejne dawki oddzielone są od siebie wzajemnie w czasie o co najmniej około dwa tygodnie (np. od około dwóch tygodni do około dwóch miesięcy), a ewentualnie o co najmniej około trzy tygodnie (np. od około trzech tygodni do około 6 tygodni). Każda z dwóch lub więcej kolejnych dawek może wynosić od około 2 mg/kg do około 16 mg/kg, lub od około 4 mg/kg do około 12 mg/kg lub od około 6 mg/kg do około 12 mg/kg. Wynalazek dodatkowo dostarcza wyrób obejmujący pojemnik i zawartą w nim kompozycję zawierającą przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 i ulotkę informacyjną zawierającą instrukcje podawania przeciwciała według takiego sposobu.

Obecnie opisane protokoły dawkowania można stosować dla innych przeciwciał skierowanych przeciw ErbB, takich jak przeciwciała skierowane przeciw receptorowi naskórkowego czynnika wzrostowego (EGFR), przeciw ErbB3 i przeciwciała przeciw ErbB4. A zatem, wynalazek pozwala także na leczenie raka u pacjenta będącego człowiekiem, obejmujący podawanie pacjentowi skutecznej ilości przeciwciała skierowanego przeciw ErbB, przy czym sposób obejmuje podawanie pacjentowi dawki początkowej wynoszącej co najmniej 5 mg/kg przeciwciała skierowanego przeciw ErbB oraz podawanie pacjentowi wielu kolejnych dawek przeciwciała w ilości, która jest w przybliżeniu taka sama lub niższa niż dawka początkowa. Alternatywnie, lub dodatkowo, możliwy też jest sposob leczenia raka u pacjenta będącego człowiekiem, obejmujący podawanie pacjentowi pierwszej dawki przeciwciała skierowanego przeciw ErbB, po której następuje co najmniej jedna kolejna dawka przeciwciała, przy czym pierwsza dawka i kolejna oddzielone są od siebie wzajemnie w czasie o co najmniej około dwa tygodnie. Wynalazek dodatkowo dostarcza wyrób obejmujący pojemnik, zawartą w nim kompozycję zawierającą przeciwciało skierowane przeciw ErbB i ulotkę informacyjną zawierającą instrukcje podawania przeciwciała według takiego sposobu.

W innym aspekcie, wynalazek dotyczy wyrobu obejmującego pojemnik, zawartą w nim kompozycję zawierającą przeciwciało skierowane przeciw ErbB2, ewentualnie etykietę na lub dołączoną do pojemnika, która wskazuje, że kompozycję można stosować do leczenia stanu charakteryzującego się nadekspresją receptora ErbB2 oraz ulotkę informacyjną zawierającą instrukcję, aby unikać stosowania antracyklinowych czynników chemioterapeutycznych w kombinacji z kompozycją. Zgodnie z wynalazkiem, ulotka informacyjna zawiera ponadto instrukcje podawania przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 w początkowej dawce wynoszącej 5 mg/kg, po której następuje taka sama lub niższa kolejna dawka lub dawki. W innym rozwiązaniu wynalazku, ulotka informacyjna zawiera ponadto instrukcje podawania przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 podskórnie w przypadku co najmniej jednej z dawek, korzystnie wszystkich kolejnych dawek po dawce początkowej, najkorzystniej w przypadku wszystkich dawek.

Zgodnie z wynalazkiem możliwe jest także leczenie raka, w którym zachodzi ekspresja ErbB2, u pacjenta będącego człowiekiem, obejmujące podawanie pacjentowi skutecznych ilości przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 i czynnika chemioterapeutycznego. Czynnikiem chemioterapeutycznym jest taksan, obejmujący paklitaksel i docetakselu. W innym rozwiązaniu czynnikiem chemioterapeutycznym jest pochodna antracyklinowa, obejmująca, doksorubicynę i epirubicynę. W jeszcze innym rozwiązaniu wynalazku, leczenie przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2 i pochodną antracyklinową, obejmuje ponadto podawanie pacjentowi czynnika chroniącego serce. W jeszcze innym rozwiązaniu, pacjentowi nie podaje się pochodnej antracyklinowej z przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2. Pacjentowi można również podawać jeden lub więcej dodatkowych czynników chemioterapeutycznych. Rak korzystnie charakteryzuje się nadekspresją ErbB2.

Wynalazek dostarcza ponadto wyrób obejmujący pojemnik i zawartą w nim kompozycję zawierającą przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 i ulotkę informacyjną instruującą użytkownika kompozycji jak podawać pacjentowi kompozycję przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 i czynnik chemioterapeutyczny. W jednym rozwiązaniu, czynnik chemioterapeutyczny jest inny niż antracyklinowy, a korzystnie jest to taksan, taki jak TAKSOL^®. W jeszcze innym rozwiązaniu, czynnikiem chemioterapeutycznym jest pochodna antracyklinowa, obejmująca, ale nie ograniczająca się do doksorubicyny i epirubicyny. W jeszcze innym rozwiązaniu, czynnikiem chemioterapeutycznym jest czynnik antracyklinowy, a ulotka informacyjna zawiera ponadto instrukcje dla użytkownika kompozycji dotyczące podawania czynnika chroniącego serce.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie humanizowanego przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 do leczenia raka, w którym zachodzi ekspresja ErbB2, w szczególności raka, w którym zachodzi

PL 202 369 B1 nadekspresja ErbB2, u człowieka. Wynalazek dotyczy również stosowania przeciwciała do leczenia raka, w którym zachodzi ekspresja EGFR. Korzystnie, przeciwciałem jest monoklonalne przeciwciało 4D5, np. monoklonalne przeciwciało 4D5 (a korzystnie huMAb4D5-8 (skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało HERCEPTIN^®) lub monoklonalne humanizowane 2C4, np. humanizowane 2C4. Przeciwciałem może być nienaruszone przeciwciało (np. nienaruszone przeciwciało IgG1) lub fragment przeciwciała (np. Fab, F(ab)2, diaciało i podobne). Region zmienny łańcucha lekkiego i zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, 2C4, przedstawiono na Fig. 5A i 5B.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia mapowanie epitopowe zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2, jak określono przez analizę skróconych mutantów i ukierunkowaną mutagenezę (Nakamura i in., J. of Virology 67 (10): 6179-6191 (1993) [październik 1993]; Renz i in., J. Cell Biol. 125 (6): 1395-1406 (1994) [czerwiec 1994]). Wywierające wpływ przeciwproliferacyjne przeciwciała monoklonalne 4D5 i 3H3 wiążą się w sąsiedztwie domeny transbłonowej. Różne skrócone wersje lub mutacje punktowe ECD ErbB2 przygotowano z cDNA stosując technikę reakcji łańcuchowej polimerazy. Ekspresję mutantów ErbB2 prowadzono w postaci białek fuzyjnych z gD w ssaczym plazmidzie ekspresyjnym. Plazmid ekspresyjny wykorzystuje promotor/sekwencję wzmacniającą cytomegalowirusa oraz sygnały terminacji i poliadenylacji SV40 położone za wstawionym cDNA. Plazmidowym DNA transfekowano komórki 293S. Jeden dzień po transfekcji komórki znakowano metabolicznie przez noc w wolnym od metioniny i cysteiny podłożu DMEM o niskim stężeniu glukozy, zawierającym 1% dializowaną płodową surowicę bydlęcą i 25 pCi każdej z ³⁵S-metioniny i ³⁵S-cysteiny. Zbierano supernatanty i dodawano do nich albo przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw ErbB2, albo przeciwciała kontrolne, i inkubowano w temperaturze 4°C w ciągu 2-4 godzin. Kompleksy wytrącano, nakładano na żel z 10-20% gradientem akryloamidu w Tricine z SDS i elektroforezę prowadzono przy napięciu 100 V. Żel przenoszono na membranę przez elektobloting i analizowano przez autoradiografię. Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 8 i 9 przedstawiają odpowiednio epitopy 3H4 i 4D5.

Figura 2 przedstawia podkreśloną sekwencję aminokwasową Domen 1 ErbB2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1). Aminokwasy pogrubione wskazują położenie epitopu rozpoznawanego przez przeciwciała monoklonalne 7C2 i 7F3, jak określono przez mapowanie delecyjne, tj. „epitop 7C2/7F3” (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2).

Figura 3 jest wykresem cotygodniowych stężeń przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 (HERCEPTIN®) w surowicy (pg/ml, średnia ± SE, ciemne kółka) od tygodnia 2 do tygodnia 36 u pacjentów, u których występowała nadekspresją ErbB2, leczonych skierowanym przeciw ErbB2 przeciwciałem HERCEPTIN^® przy dawce początkowej wynoszącej 4 mg/kg, po której następowały cotygodniowe dawki wynoszące 2 mg/kg. Liczbę pacjentów dla każdego punktu czasowego przedstawiono jako „n” (białe kwadraty).

Figura 4 jest liniowym wykresem zmian objętości nowotworu w czasie u myszy leczonych skierowanym przeciw ErbB2 przeciwciałem HERCEPTIN^®. Fig. 4B jest półlogarytmicznym wykresem tych samych danych, jak na Fig. 4A, tak że zróżnicowanie objętości nowotworów u leczonych zwierząt jest lepiej widoczne.

Figury 5A i 5B przedstawiają przyporządkowania sekwencji aminokwasowych domen zmiennej łańcucha lekkiego (VL) (Fig. 5A) i zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) (Fig. 5B) mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4 (odpowiednio sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 10 i 11); domen VL i VH humanizowanej wersji Fab 574 (odpowiednio sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 12 i 13) oraz ludzkich sekwencji konsensu zrębów VL i VH (hum κ1, łańcuch lekki kappa podgrupy I, humlll, łańcuch ciężki podgrupy III) (odpowiednio sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 14 i 15). Gwiazdki wskazują różnice pomiędzy humanizowaną wersją Fab 574, a mysim przeciwciałem monoklonalnym 2C4 lub pomiędzy humanizowaną wersją Fab 574 a ludzką sekwencją zrębu. Regiony determinujące komplementarność (CDR) znajdują się w nawiasach. Okazało się, że humanizowana wersja Fab 574, ze zmianami ArgH71Val, AspH73Arg i IleH69Leu, posiada wiązanie przywrócone do tego oryginalnego chimerycznego fragmentu Fab 2C4. Można modyfikować dodatkowe reszty FR i/lub CDR, takie jak L2, L54, L55, L56, H35 i/lub H48 (np. podstawiać w następujący sposób: IleL2Thr, ArgL54Leu, TyrL55Glu, Thr56Ser, AspH35Ser i ValH48Ile) w celu dalszego udoskonalenia lub wzmocnienia wiązania humanizowanego przeciwciała. Alternatywnie, lub dodatkowo, humanizowane przeciwciało można poddawać dojrzewaniu powinowactwa w celu dalszej poprawy lub udoskonalania jego powinowactwa i/lub innych aktywności biologicznych.

PL 202 369 B1

Szczegółowy opis korzystnych rozwiązań

I. Definicje „Receptor ErbB” jest receptorem o aktywności tyrozynowej kinazy białkowej, który należy do rodziny receptorów ErbB i obejmuje receptory EGFR, ErbB2, ErbB3 i ErbB4, jak również TEGFR (opis patentowy Stanów Zjednoczonych numer 5 708 156) oraz innych przedstawicieli tej rodziny pozostających do zidentyfikowania w przyszłości. Receptor ErbB będzie generalnie zawierać domenę zewnątrzkomórkową, która może wiązać ligand ErbB; lipofilową domenę transbłonową; konserwatywną wewnątrzkomórkową domenę kinazy tyrozynowej oraz karboksykońcową domenę sygnałową, niosącą kilka reszt tyrozynowych, które mogą ulegać fosforylacji. Receptorem ErbB może być natywna sekwencja receptora ErbB lub jego wariant sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, receptorem ErbB jest natywna sekwencja ludzkiego receptora ErbB.

Terminy „ErbB1”, „receptor naskórkowego czynnika wzrostowego” lub „EGFR” stosuje się w niniejszym opisie wymiennie i odnoszą się one do natywnej sekwencji EGFR ujawnionej, na przykład, w Carpenter i in., Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914 (1987), włącznie z wariantami (np. delecyjnym mutantem EGFR, jak w Humphrey i in., PNAS (USA) 87: 4207-4211 (1990)). erbB1 odnosi się do genu kodującego białkowy produkt EGFR. Przykłady przeciwciał, które wiążą się z EGFR, obejmują przeciwciało monoklonalne 579 (ATCC CRL HB 8506), przeciwciało monoklonalne 455 (ATCC CRL HB8507), przeciwciało monoklonalne 225 (ATCC CRL 8508), przeciwciało monoklonalne 528 (ATCC CRL 8509) (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 943 533, Mandelsohn i in.) oraz ich warianty, takie jak chimeryczne 225 (C225) i przekształcone ludzkie 225 (H225) (patrz światowy opis patentowy numer 96/40210, Imclone Systems Inc.).

„ErbB3” i „HER3” odnoszą się do polipeptydu receptora ujawnionego, na przykład, w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 183 884 i 5 480 968, jak również w Kraus i in., PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989), włącznie z jego wariantami. Przykłady przeciwciał, które wiążą się z HER3, opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 968 511 (Akita i Sliwkowski), np. przeciwciało 8B8 (ATCC HB 12 070), lub ich humanizowane warianty.

Terminy „ErbB4” i „HER4” odnoszą się w niniejszym opisie do polipeptydu receptora ujawnionego, na przykład, w europejskim zgłoszeniu patentowym numer 599 274; Plowman i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993) i Plowman i in., Nature, 366: 473-475 (1993), włącznie z jego wariantami, takimi jak izoformy ujawnione w światowym opisie patentowym numer 99/19488.

Terminy „HER2”, „ErbB2” i „c-Erb-B2” stosuje się wymiennie. O ile nie wskazano inaczej, terminy „ErbB2”, „c-Erb-B2” i HER2, gdy stosowane są w niniejszym opisie, odnoszą się do białka ludzkiego, a „erbB2”, „c-erb-B2” i „her2” odnoszą się do ludzkiego genu. Ludzki gen erbB2 i białko ErbB2 opisano, na przykład, w Semba i in., PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) i Yamamoto i in., Nature 319: 230-234 (1986) (numer dostępu Genbank X03363). ErbB2 zawiera cztery domeny (Domeny 1-4).

„Epitop 4D5” jest regionem w zewnątrzkomórkowej domenie ErbB2, z którym wiąże się przeciwciało 4D5 (ATCC CRL 10463). Epitop ten położony jest blisko regionu transbłonowego ErbB2. W celu przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z epitopem 4D5, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego, takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopu w celu oszacowania, czy przeciwciało wiąże się z epitopem 4D5 ErbB2 (np. którąkolwiek jedną lub więcej resztami w regionie od około reszty 529, np. około reszty 561, do około reszty 625 włącznie).

„Epitop 3H4” jest regionem w zewnątrzkomórkowej domenie ErbB2, z którym wiąże się przeciwciało 3H4. Epitop ten przedstawiono na Fig. 1 i obejmuje on reszty od około 541 do około 599 włącznie w sekwencji aminokwasowej zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2.

„Epitop 72C/7F3” jest regionem na końcu N zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2, z którym wiążą się przeciwciała 7C2 i/lub 7F3 (każde z nich zdeponowano w ATCC, patrz poniżej). W celu przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z epitopem 72C/7F3, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego, takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopu w celu ustalenia, czy przeciwciało wiąże się z epitopem 72C/7F3 ErbB2 (np. którąkowiek jedną lub więcej z reszt w regionie od około reszty 22 do około reszty 53 ErbB2; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2).

Terminy „indukuje śmierć komórkową” lub „zdolne do indukowania śmierci komórkowej” odnoszą się do zdolności przeciwciała do stawania się zdolnej do życia komórki niezdolną do życia.

PL 202 369 B1 „Komórką” w niniejszym opisie jest komórka, w której zachodzi ekspresja receptora ErbB2, szczególnie jeśli w komórce zachodzi nadekspresją receptora ErbB2. Komórka, w której zachodzi „nadekspresja” ErbB2, posiada znacząco wyższy od normalnego poziom ErbB2 w porównaniu z nierakową komórką tkanki tego samego typu. Korzystnie, komórką jest komórka rakowa, np. komórka sutka, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, gruczołu ślinowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki lub pęcherza moczowego. In vitro komórką może być komórka SKBR3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 lub SKOV3. Śmierć komórkową in vitro można określać w nieobecności dopełniacza i odpornościowych komórek efektorowych w celu rozróżnienia śmierci komórkowej indukowanej przez zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC) lub cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC). A zatem, oznaczenie ś mierci komórkowej mo ż na przeprowadzić stosują c surowicę inaktywowaną termicznie (tj. w nieobecności dopełniacza) i w nieobecności odpornościowych komórek efektorowych. W celu okreś lenia, czy przeciwciał o jest zdolne do indukowania ś mierci komórkowej, utratę integralności błony komórkowej ocenianą przez pobieranie jodku propidionowego (PI), błękitu tryptanu (patrz Moore i in., Cytotechnology 17: 1-11 [1995]) lub 7AAD można oceniać w stosunku do komórek nietraktowanych. Korzystnymi przeciwciałami indukującymi śmierć komórkową są te, które indukują pobieranie PI w „oznaczeniu pobierania PI przez komórki BT474”.

Zwrot „indukuje apoptozę” lub „zdolne do indukowania apoptozy” odnosi się do zdolności przeciwciała do indukowania programowej śmierci komórkowej, określonej przez wiązanie aneksyny V, fragmentację DNA, obkurczanie się komórek, powiększanie się retikulum endoplazmatycznego, fragmentację komórek i/lub tworzenie pęcherzyków błonowych (nazywanych ciałkami apoptycznymi). Komórką jest komórka, w której zachodzi nadekspresja receptora ErbB2. Korzystnie, „komórką” jest komórka rakowa, np. komórka sutka, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, gruczołu ślinowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki lub pęcherza moczowego. In vitro komórką może być komórka SKBR3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 lub SKOV3. Dostępne są różne metody oceniania zachodzących w komórkach zdarzeń związanych z apoptozą. Na przykład, można mierzyć translokację fosfatydyloseryny (PS) przez wiązanie aneksyny; fragmentację DNA można oceniać przez obserwację fragmentów DNA w żelu elektroforetycznym, jak ujawniono w przykładzie w niniejszym opisie, a kondensację jąder/chromatyny wraz z fragmentacją DNA można oceniać przez wzrost ilości komórek hipodiploidalnych. Korzystnie, przeciwciałem indukującym apoptozę jest przeciwciało, które powoduje indukcję wiązania aneksyny silniejszą o około od 2- do 50-krotnie, korzystnie o około od 5- do 50-krotnie, a najkorzystniej o okoł o od 10- do 50-krotnie w stosunku do komórek nietraktowanych w „oznaczeniu wiązania aneksyny z zastosowaniem komórek BT474” (patrz poniżej).

Niekiedy, przeciwciałem proapoptycznym będzie przeciwciało, które blokuje wiązanie/aktywację przez HRG kompleksu ErbB2/ErbB3 (np. przeciwciało 7F3). W innych sytuacjach, przeciwciałem jest przeciwciało, które nie blokuje znacząco aktywacji kompleksu receptora ErbB2/ErbB3 przez HRG (np. 7C2). Ponadto, przeciwciałem może być przeciwciało podobne do 7C2, które, chociaż indukuje apoptozę, nie indukuje dużego obniżenia procentu komórek w fazie S (np. przeciwciało, które indukuje tylko około 0-10% obniżenie procentu tych komórek w stosunku do kontroli).

Przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania może być podobne do 7C2, które specyficznie wiąże się z ludzkim ErbB2 i znacząco nie reaguje krzyżowo z innymi białkami, takie jak te kodowane przez geny erbB1, erbB3 i/lub erbB4. Niekiedy, przeciwciało może znacząco nie reagować z białkiem neu szczura, np. jak opisano w Schecter i in., Nature 312: 513 (1984) oraz Drebin i in., Nature 312: 545-548 (1984). W takim rozwiązaniu, stopień wiązania przeciwciała z tymi białkami (np. wiązania z endogennym receptorem na powierzchni komórek), określony przez analizę sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) lub radioimmunoprecypitację (RIA), będzie niższy niż około 10%.

„Heregulina” (HRG), gdy stosuje się ją w niniejszym opisie, odnosi się do polipeptydu, który aktywuje kompleksy białkowe ErbB2-ErbB3 i ErbB2-ErbB4 (tj. indukuje fosforylację reszt tyrozynowych w kompleksie po związaniu się z nim). Róż ne obję te tym terminem polipeptydy heregulin ujawniono na przykład w Holmes i in., Science, 256: 1205-1210 (1992), światowym opisie patentowym numer 92/20789; Wen i in., Mol. Cell. Biol., 14: (3): 1909-1919 (1994) i Marchionni i in., Nature, 362: 312-318 (1993). Termin obejmuje biologicznie aktywne fragmenty i/lub warianty sekwencji naturalnie występującego polipeptydu HRG, takie jak jego fragment domeny EGF-podobnej (np. HRGei _177-244).

„Kompleks białkowy ErB2-ErbB3” i „kompleks białkowy ErB2-ErbB3” są niekowalencyjnie związanymi oligomerami receptora ErbB2 i odpowiednio receptora ErbB3 lub ErbB4. Kompleksy tworzą się, gdy komórka, w której zachodzi ekspresja obu tych receptorów, eksponowana jest na HRG,

PL 202 369 B1 i można je izolować przez immunoprecypitację i analizować przez SDS-PAGE, jak opisano w Sliwkowski i in., J. Biol. Chem., 269 (20): 14661-14665 (1994).

„Przeciwciała” (Ab) i „immunoglobuliny” (Ig) są glikoproteinami posiadającymi taką samą charakterystykę strukturalną. Podczas gdy przeciwciała wykazują specyficzność wiązania określonego antygenu, immunoglobuliny obejmują zarówno przeciwciała, jak i inne cząsteczki podobne do przeciwciał, które pozbawione są specyficzności wiązania. Polipeptydy tego ostatniego rodzaju są, na przykład, wytwarzane na niskich poziomach przez układ limfatyczny, a na podwyższonych poziomach przez szpiczaki.

„Natywne przeciwciała” i „natywne immunoglobuliny” są zazwyczaj heterotetramerycznymi glikoproteinami o masach cząsteczkowych około 150 000 daltonów, złożonymi z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki połączony jest z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem disiarczkowym, podczas gdy liczba wiązań disiarczkowych występujących pomiędzy łańcuchami ciężkimi różnych izotypów immunoglobulin jest różna. Każdy łańcuch ciężki i lekki posiada również, w regularnych odstępach, wewnątrzłańcuchowe mostki disiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki posiada na jednym końcu domenę zmienną (VH), po której następują domeny stałe. Każdy łańcuch lekki posiada na jednym końcu domenę zmienną (VL), a na drugim końcu domenę stałą; domena stała łańcucha lekkiego jest położona równolegle do pierwszej domeny stałej łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego jest położona równolegle do domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Uważa się, że określone reszty aminokwasowe tworzą granicę pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego.

Termin „zmienna” odnosi się do faktu, że pewne części domeny zmiennej znacząco różnią się sekwencją pomiędzy przeciwciałami i są wykorzystywane w wiązaniu i specyficzności każdego określonego przeciwciała z jego określonym antygenem. Jednakże, zmienność nie jest równo rozłożona w cał ych domenach zmiennych przeciwciał . Koncentruje się ona w trzech odcinkach, nazywanych regionami determinującymi komplementarność (CDR) lub regionami hiperzmiennymi, zarówno w domenach zmiennych łańcuchów lekkich, jak i łańcuchów ciężkich. Bardziej konserwatywne części domen zmiennych nazywane są regionami zrębu (FR). Każda z domen zmiennych natywnych łańcuchów ciężkich i lekkich zawiera cztery FR, w większości przyjmujące konfigurację struktury β, połączone przez trzy CDR, tworzące pętle łączące, a w niektórych przypadkach tworzące część struktury β. CDR w każdym łańcuchu są utrzymywane w bliskim sąsiedztwie przez FR i, z CDR drugiego łańcucha, biorą udział w tworzeniu wiążącego antygen miejsca przeciwciał (patrz Kabat i in., NIH Publ. No. 91-3242, tom I, strony 647-669 [1991]). Domeny stałe nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu przeciwciała z antygenem, ale posiadają różne funkcje efektorowe, takie jak udział przeciwciała w zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej.

Trawienie przeciwciał papainą daje dwa identyczne fragmenty wiążące antygen, nazwane fragmentami „Fab”, z których każdy posiada pojedyncze miejsce wiążące antygen, oraz pozostający fragment „Fc”, którego nazwa odzwierciedla jego zdolność do łatwego krystalizowania. Traktowanie pepsyną daje fragment F(ab')2, który posiada dwa miejsca wiążące antygen i jest nadal zdolny do sieciowania antygenu.

„Fv” jest minimalnym fragmentem przeciwciała, który zawiera pełne miejsce rozpoznawania i wią zania antygenu. Region ten skł ada się z dimeru domeny zmiennej jednego ła ń cucha ciężkiego i jednego ł ańcucha lekkiego, połączonych silnym, niekowalencyjnym wią zaniem. Ma on taką konfigurację, że trzy CDR każdej domeny zmiennej oddziałują dla zdefiniowania miejsca wiążącego antygen na powierzchni dimeru VH-VL. Łącznie, sześć CDR nadaje przeciwciału specyficzność wiązania antygenu. Jednakże, nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv, zawierająca tylko trzy CDR specyficzne wobec antygenu) posiada zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, chociaż z niższym powinowactwem niż całe miejsce wiążące.

Fragment Fab zawiera również domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab dodatkiem kilku reszt na karboksylowym końcu domeny CH1 łańcucha ciężkiego, obejmujących jedną lub więcej cystein z regionu zawiasowego przeciwciała. Fab'-SH jest oznaczeniem w niniejszym opisie dla Fab', w którym reszta(ty) cysteiny domen stałych posiadają wolną grupę tiolową. Fragmenty F(ab')2 przeciwciał pierwotnie tworzono jako pary fragmentów Fab', pomiędzy którymi występowały cysteiny zawiasowe. Znane są również inne chemiczne sposoby sprzęgania fragmentów przeciwciał.

PL 202 369 B1 „Łańcuchy lekkie” przeciwciał (immunoglobulin) z jakiegokolwiek gatunku kręgowca można, w oparciu o sekwencje aminokwasowe ich domen stałych, zakwalifikować do jednego z dwóch wyraźnie odrębnych typów, nazwanych kappa (κ) i lambda (λ).

Zależnie od sekwencji aminokwasowej domeny stałej ich łańcuchów ciężkich, immunoglobuliny można przypisać do różnych klas. Istnieje pięć głównych klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich można dalej podzielić na podklasy (izotypy), np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Domeny stałe łańcuchów ciężkich, które odpowiadają różnym klasom immunoglobulin, nazwano odpowiednio α, δ, ε, γ i μ. Struktury podjednostek i przestrzenne konfiguracje różnych klas immunoglobulin są dobrze znane.

Termin „przeciwciało” stosuje się w najszerszym znaczeniu i w szczególności obejmuje on nienaruszone przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała multispecyficzne (np. przeciwciała bispecyficzne), utworzone z co najmniej dwóch nienaruszonych przeciwciał, oraz fragmenty przeciwciał, dotąd jak wykazują one pożądaną aktywność biologiczną.

„Fragmenty przeciwciał” obejmują część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie jego region wiążący antygen czyli zmienny. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 i Fv; diaciała; przeciwciała liniowe (Zapata i in., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]); cząsteczki przeciwciał jednołańcuchowych oraz multispecyficzne przeciwciała tworzone z fragmentu(ów) przeciwciał.

Termin „przeciwciało monoklinalne” w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała tworzące populację są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w nieznacznych ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne, skierowane przeciw pojedynczym miejscom antygenowym. Ponadto, w przeciwieństwie do konwencjonalnych (poliklonalnych) preparatów przeciwciał, które zazwyczaj obejmują różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne skierowane jest przeciw pojedynczej determinancie na antygenie. Poza ich specyficznością, przeciwciała monoklonalne są korzystne pod tym względem, że są one syntetyzowane przez hodowlę hybrydomy bez zanieczyszczeń innymi immunoglobulinami. Określenie „monoklonalne” wskazuje na charakter przeciwciała jako otrzymanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał, i nie oznacza ono wymagania wytwarzania przeciwciała jakąkolwiek określoną metodą. Na przykład, przeciwciała monoklonalne przeznaczone do stosowania według niniejszego wynalazku można tworzyć metodą hybrydom, po raz pierwszy opisaną przez Kohlera i in., Nature, 256: 495 (1975), lub można tworzyć metodami rekombinacji DNA (patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 567). „Przeciwciała monoklonalne” można również izolować z fagowych bibliotek przeciwciał, stosując techniki opisane na przykład w Clackson i in., Nature, 352: 624-628 (1991) oraz Marks i in., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Przeciwciała monoklonalne w niniejszym opisie w szczególności obejmują przeciwciała (immunoglobuliny) „chimeryczne”, w których część łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego jest identyczna z lub homologiczna do odpowiadających sekwencji w przeciwciałach pochodzących od określonego gatunku lub należących do określonej klasy lub podklasy przeciwciał, podczas gdy pozostała część łańcucha(ów) jest identyczna z lub homologiczna do odpowiadających sekwencji w przeciwciałach pochodzących od innego gatunku lub należących do innej klasy lub podklasy przeciwciał, jak również fragmenty takich przeciwciał, dokąd wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 567; Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 68516855 (1984)).

„Humanizowane” postacie przeciwciał gatunków innych niż człowiek (np. myszy) są chimerycznymi immunoglobulinami, łańcuchami immunoglobulin lub ich fragmentami (takimi jak Fv, Fab, Fab', F(ab')2 lub inne subsekwencje wiążące antygen), które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z immunoglobuliny gatunku innego niż człowiek. W większej części, przeciwciała humanizowane są immunoglobulinami ludzkimi (przeciwciało-biorca), w których reszty z regionu determinującego komplementarność (CDR) biorcy zastąpiono resztami z CDR przeciwciała gatunku innego niż człowiek (przeciwciało-dawca), takiego jak przeciwciała myszy, szczura, królika lub Naczelnego innego niż człowiek, posiadającego pożądaną specyficzność, powinowactwo i zdolność wiązania. W niektórych przypadkach reszty regionu zrębu (FR) immunoglobuliny ludzkiej zastępuje się odpowiadającymi resztami gatunku innego niż człowiek. Ponadto, przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty, które nie występują ani w przeciwciele-biorcy, ani w „importowanych” sekwencjach CDR lub zrębu. Modyfikacji tych dokonuje się w celu dalszego udoskonalania i maksymalizacji wydajności przeciwciała. Generalnie,

PL 202 369 B1 przeciwciało humanizowane zawierać pędzie co najmniej jedną, a zazwyczaj dwie domeny zmienne, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie CDR odpowiadają tym z immunoglobuliny gatunku innego niż człowiek, a wszystkie lub zasadniczo wszystkie z FR są tymi o sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Optymalnie, humanizowane przeciwciało będzie również zawierać co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj tego immunoglobuliny ludzkiej. Dla zapoznania się z dalszymi szczegółami patrz Jones i in., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann i in., Nature 332: 323-329 (1988) oraz Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Przeciwciało humanizowane obejmuje przeciwciało PRIMATIZED™, w którym region przeciwciała wiążący antygen pochodzi z przeciwciała utworzonego przez immunizację antygenem będącym przedmiotem zainteresowania makaków.

„Jednołańcuchowe Fv” lub „sFv” fragmenty przeciwciał zawierają domeny VH i VL przeciwciała, przy czym domeny te występują w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Korzystnie, polipeptyd Fv zawiera ponadto polipeptydowy łącznik pomiędzy domenami VH i VL, który umożliwia tworzenie przez scFv struktury pożądanej do wiązania antygenu. Dla zapoznania się z przeglądem dotyczącym scFv patrz Plijckthun, w: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg i Moore, red., Springer-Verlag, Nowy Jork, str. 269-315 (1994).

Termin „diaciała” odnosi się do małych fragmentów przeciwciał o dwóch miejscach wiążących antygen, które to fragmenty zawierają zmienną domenę łańcucha ciężkiego (VH) połażoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (VH-VL). Przez zastosowanie łącznika, który jest zbyt krótki, aby umożliwiał parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, wymusza się parowanie domen z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzenie dwóch miejsc wiążących antygen. Diaciała opisano dokładniej w, na przykład, europejskim opisie patentowym numer 404 097, światowym opisie patentowym numer 93/11161 oraz w Hollinger i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Przeciwciałem „wyizolowanym” jest przeciwciało, które zidentyfikowano i wydzielono i/lub odzyskano ze składnika jego naturalnego otoczenia. Zanieczyszczającymi składnikami jego naturalnego otoczenia są materiały, które mogłyby zakłócać diagnostyczne lub terapeutyczne stosowanie przeciwciała, i mogą obejmować enzymy, hormony i inne białkowe i niebiałkowe substancje rozpuszczone. W korzystnych rozwiązaniach, przeciwciało będzie oczyszczone (1) do stopnia wyższego niż 95% wagowych przeciwciała, jak określono metodą Lowry'ego, a najkorzystniej wyższego niż 99% wagowych, (2) do stopnia wystarczającego do otrzymania sekwencji co najmniej 15 reszt N-końcowych i wewnętrznych przy zastosowaniu sekwenatora wirowego, lub (3) do homogenności w SDS-PAGE w warunkach redukujących lub nieredukujących, przy zastosowaniu wybarwiania błękitem Coomassie'go lub, korzystnie, srebrem. Wyizolowane przeciwciało obejmuje przeciwciało in situ w zrekombinowanych komórkach, ponieważ co najmniej jeden składnik naturalnego otoczenia przeciwciała nie będzie obecny. Zazwyczaj, jednakże, wyizolowane przeciwciało będzie przygotowane przez co najmniej jeden etap oczyszczania.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin „epitop wiążący receptor ratunkowy” odnosi się do epitopu regionu Fc cząsteczki IgG (np. IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4), który jest odpowiedzialny za zwiększanie okresu półtrwania cząsteczki IgG w surowicy in vivo.

„Traktowanie” odnosi się do zarówno traktowania terapeutycznego, jak i profilaktycznego lub pomiarów dla celów zapobiegawczych. Osobnicy potrzebujący traktowania obejmują tych, u których zaburzenie już występuje, jak również tych, u których zapobiega się zaburzeniu.

„Ssak” dla celów traktowania odnosi się do jakiegokolwiek zwierzęcia sklasyfikowanego jako ssak, włącznie z człowiekiem, zwierzętami domowymi i hodowlanymi oraz zwierzętami z zoo, zwierzętami wykorzystywanymi w sportach lub ulubieńcami domowymi, takimi jak psy, konie, koty, krowy itp. Korzystnie, ssakiem jest człowiek.

„Zaburzeniem” jest jakikolwiek stan, który może się poprawić w wyniku traktowania przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2. Obejmuje on przewlekłe lub ostre zaburzenia lub choroby, włącznie z tymi stanami patologicznymi, które predysponują ssaka do zaburzenia będącego przedmiotem zainteresowania. Nieograniczające przykłady zaburzeń, które będą traktowane według niniejszego wynalazku, obejmują nowotwory łagodne i złośliwe, białaczki i nowotwory złośliwe tkanki limfatycznej; zaburzenia neuronalne, glejowe, astrocytarne, podwzgórzowe i inne gruczołowe, zaburzenia makrofagowe, nabłonkowe, zrębowe i blastoceliczne oraz zaburzenia zapalne, angiogenne i immunologiczne.

Termin „ilość skuteczna terapeutycznie” odnosi się do ilości wywierającej wpływ przeciwproliferacyjny. Korzystnie ilość skuteczna terapeutycznie posiada aktywność apoptotyczną lub jest zdolna do indukowania śmierci komórkowej, korzystnie śmierci komórek nowotworów łagodnych lub złośliwych,

PL 202 369 B1 w szczególności komórek rakowych. Skuteczność można mierzyć konwencjonalnymi sposobami, zależnie od stanu przeznaczonego do leczenia. W przypadku leczenia raka, skuteczność można, na przykład, mierzyć przez ocenianie czasu rozwoju choroby (TTP) i/lub określanie szybkości odpowiedzi (RR) (patrz Przykład 1 poniżej). Ilość skuteczna terapeutycznie odnosi się także do docelowego stężenia w surowicy, tak jak obniżonego stężenia w surowicy dla którego wykazano, że jest skuteczne pod względem hamowania objawów choroby przy utrzymywaniu przez pewien okres czasu.

Terminy „rak” i „rakowy” odnoszą się do lub opisują fizjologiczny stan u ssaków, który zazwyczaj charakteryzuje się nieregulowanym wzrostem komórkowym. Przykłady raka obejmują, ale nie ograniczają się do raka, chłoniaka, blastomy, mięsaka i białaczki. Bardziej szczegółowe przykłady takich raków obejmują raka płaskonabłonkowego, drobnokomórkowego raka płuc, niedrobnokomórkowego raka płuc, raka przewodu pokarmowego, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajników, raka wątroby, raka pęcherza moczowego, wątrobiaka, raka sutka, raka okrężnicy, raka okrężnicy i odbytnicy, raka śluzówki macicy, raka gruczołów ślinowych, raka nerek, raka gruczołu krokowego, raka sromu, raka tarczycy, raka wątroby i różne rodzaje raka głowy i szyi.

Termin „czynnik cytotoksyczny” w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do substancji, która hamuje lub zapobiega funkcji komórek i/lub powoduje niszczenie komórek. Termin w zamierzeniu obejmuje izotopy promieniotwórcze (np. I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ i Re¹⁸⁶), czynniki chemioterapeutyczne i toksyny, takie jak toksyny aktywne enzymatycznie pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, bądź ich fragmenty.

„Czynnikiem chemioterapeutycznym” jest związek chemiczny użyteczny w leczeniu raka. Przykłady czynników chemioterapeutycznych obejmują czynniki alkilujące, takie jak tiotepa i cyklofosfamid (CYTOXAN™); sulfoniany alkilowe, takie jak busulfan, improsulfan i piposulfan; azyrydyny, takie jak benzodopa, karbokwon, meturedopa i uredopa; etylenoiminy i metyloamelaminy, obejmujące altretaminę, trietylenomelaminę, trietylenofosforoamid, trietylenotiofosforoamid i trimetylolomelaminę; pochodne iperytu azotowego, takie jak chlorambucyl, chlornafazyna, cholofosfamid, estramustyna, ifosfamid, mechloroetamina, chlorowodorek tlenku mechloroetaminy, melfalan, nowembichina, fenesteryna, prednimustyna, trofosfamid, iperyt uracylowy; nitrozomoczniki, takie jak karmustyna, chlorozotocyna, fotemustyna, lomustyna, nimustyna, ranimustyna; antybiotyki, takie jak aklacynomycyny, aktynomycyna, autramycyna, azaseryna, bleomycyny, kaktynomycyna, kalicheamicyna, karabicyna, karminomycyna, karzinofilina, chromomycyny, daktynomycyna, daunorubicyna, detorubicyna, 6-diazo-5-okso-L-norleucyna, doksorubicyna, epirubicyna, ezorubicyna, idarubicyna, marcelomycyna, mitomycyny, kwas mykofenolowy, nogalamycyna, oliwomycyny, peplomycyna, potfiromycyna, puromycyna, kwelamycyna, rodorubicyna, streptonigryna, streptozocyna, tubercydyna, ubenimeks, zinostatyna, zorubicyna; antymetabolity, takie jak metotreksat i 5-fluorouracyl (5-FU); analogi kwasu foliowego, takie jak denopteryna, metotreksat, pteropteryna, trimetreksat; analogi purynowe, takie jak fludarabina, 6-merkaptopuryna, tiamipryna, tioguanina; analogi pirymidynowe, takie jak ancytabina, azacytydyna, 6-azaurydyna, karmofur, cytarabina, dideoksyurydyna, doksyflurydyna, enocytabina, floksourydyna, 5-FU; androgeny, takie jak kalusteron, propionian dromostanolonu, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; czynniki przeciwnadnerczowe, takie jak aminoglutetymid, mitotan, trilostan; środek uzupełniający działanie kwasu foliowego, taki jak kwas frolinowy; aceglaton; glikozyd aldofosfamidowy; kwas aminolewulinowy; amsakryna; bestrabucyl; bizantren; edatraksat; defofamina; demekolcyna; diazykwon; elfornityna; octan eliptynium; etoglucyd; azotan galu; hydroksymocznik; lentinan; lonidamina; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakryna; pentostatyna; fenamet; pirarubicyna; kwas podofilinowy; 2-etylohydrazyd; prokarbazyna; PSK^®; razoksan; sizofiran; spirogerman; kwas tenuazonowy; triazykwon; 2,2',2-trichlorotrietyloamina; uretan; windezyna; dakarbazyna; mannomustyna; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacytozyna; arabinozyd („Ara-C”); cyklofosfamid; tiotepa; taksany, np. paklitaksel (TAXOL^®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) i docetaksel (TAXOTERE^®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francja); chlorambucyl; gemcytabina; 6-tioguanina; merkaptopuryna; metotreksat; analogi platyny, takie jak cisplatyna i karboplatyna; winblastyna; platyna; etopozyd (VP-16); ifosfamid; mitomycyna C; mitoksantron; winkrystyna; winorelbina; nawelbina; nowantron, tenipozyd; daunomycyna; aminopteryna; kseloda; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomerazy RFS 2000; difluorometyloornityna (DMFO); kwas retinowy; esperamicyny; kapecytabina oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy i pochodne któregokolwiek z powyższych. Definicja ta obejmuje również czynniki antyhormonalne, które działają regulując lub hamując działanie hormonów na nowotwory, takie jak antyestrogeny, obejmujące na przykład tamoksyfen, raloksyfen, 4(5)-imidazole hamujące aromatazę, 4-hydroksytamoksyfen, trioksyfen, keoksyfen, LY 117018, onapriston i toremifen (Fareston)

PL 202 369 B1 oraz antyandrogeny, takie jak flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelina oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy i pochodne któregokolwiek z powyższych.

„Czynnik hamujący wzrost” w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do związku lub kompozycji, które hamują wzrost komórki, zwłaszcza komórki rakowej, w której zachodzi nadekspresja ErbB, albo in vitro, albo in vivo. A zatem, czynnikiem hamującym wzrost może być czynnik, który znacząco zmniejsza procent komórek, w których zachodzi nadekspresja ErbB, w fazie S. Przykłady czynników hamujących wzrost obejmują czynniki, które blokują postęp cyklu komórkowego (w fazie innej niż faza S), takie jak czynniki, które indukują zatrzymanie w fazie G1 i zatrzymanie w fazie M. Klasyczne czynniki blokujące fazę M obejmują alkaloidy barwinka (winkrystyna i winblastyna), TAKSOL^®i inhibitory topoizomerazy II, takie jak doksorubicyna, epirubicyna, daunorubicyna, etopozyd i bleomycyna. Działanie tych czynników, które powodują zatrzymanie w fazie G1, na przykład czynników alkilujących DNA, takich jak tamoksyfen, prednizon, dakarbazyna, mechloretamina, cisplatyna, metotreksat, 5-fluorouracyl i ara-C, rozciąga się również na zatrzymywanie w fazie S. Dalsze informacje można znaleźć w The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn i Israel, red., rozdział 1 zatytułowany „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs” autorstwa Murakami'ego i in. (WB Saunders, Filadelfia, 1995), zwłaszcza na str. 13. Do tego celu można również wykorzystywać przeciwciało 4D5 (i jego funkcjonalne równoważniki).

„Doksorubicyna” jest antybiotykiem antracyklinowym. Pełna nazwa chemiczna doksorubicyny brzmi (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoksy-a-L-liksoheksopiranozylo)oksy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroksy-8-(hydroksyacetylo)-1-metoksy-5,12-naftacenedion.

Termin „cytokina” jest ogólnym terminem dla białek uwalnianych przez jedną populację komórek, które działają na inną komórkę jako mediatory międzykomórkowe. Przykładami takich cytokin są limfokiny, monokiny i tradycyjne hormony polipeptydowe. Cytokiny obejmują hormon wzrostu, taki jak ludzki hormon wzrostu, N-metionylo- ludzki hormon wzrostu i bydlęcy hormon wzrostu; hormon przytarczyc; tyroksynę; insulinę; proinsulinę; relaksynę; prorelaksynę; hormony glikoproteinowe, takie jak hormon folikulotropowy (FSH), hormon tyrotropowy (TSH) i hormon luteinizujący (LH); wątrobowy czynnik wzrostowy; fibroblastowy czynnik wzrostowy; prolaktynę; laktogen łożyskowy; czynnik martwicy nowotworów α i β; substancję hamującą rozwój przewodów Miillera; mysi peptyd związany z gonadotropiną; inhibinę; aktywinę; naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostowy; integrynę; trombopoetynę (TPO); czynnik wzrostu nerwów, taki jak NGF-β; płytkowy czynnik wzrostowy; transformujące czynniki wzrostowe (TGF), takie jak TGF-α i TGF-β; insulinopodobny czynnik wzrostowy I i II; erytropoetynę (EPO); czynniki indukcyjne kości; interferony, takie jak interferon α, β i γ; czynniki stymulujące tworzenie kolonii (CSF), takie jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) i czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF); interleukiny, takie jak IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; czynnik martwicy nowotworów, taki jak TNF-α lub TNF-β, oraz inne czynniki polipeptydowe, włącznie z LIF i ligandem receptora Kit (KL). W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin cytokina obejmuje białka ze źródeł naturalnych lub z hodowii komórek zrekombinowanych oraz aktywne biologicznie równoważniki cytokin o natywnych sekwencjach.

Termin „prolek” w znaczeniu stosowanym w tym zgłoszeniu odnosi się do prekursorowej lub pochodnej postaci substancji aktywnej farmaceutycznie, która jest mniej cytotoksyczna dla komórek nowotworowych w porównaniu z lekiem macierzystym i jest zdolna do ulegania enzymatycznej aktywacji lub przekształcania w bardziej aktywną postać macierzystą. Patrz np., Wilman, „Prodrugs in Cancer Chemotherapy”, Biochemical Society Transactions, 14, str. 375-382, 615th Meeting, Belfast (1986) oraz Stella i in., „Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Directed Drug Delivery, Borchardt i in. (red.), str. 247-267, Humana Press (1985). Proleki według tego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do proleków zawierających grupę fosforanową, proleków zawierających grupę tiofosforanową, proleków zawierających grupę siarczanową, proleków zawierających grupę peptydową, proleków zmodyfikowanych D-aminokwasów, proleków glikozylowanych, proleków zawierających pierścień β-laktamowy, dowolnie podstawionych proleków zawierających grupę fenoksyacetamidową lub dowolnie podstawionych proleków zawierających grupę fenyloacetamidową, 5-fluorocytozyny i innych proleków 5-fluorourydynowych, które mogą być przekształcane w bardziej aktywne cytotoksyczne wolne leki. Przykłady leków cytotoksycznych, które można przeprowadzać w pochodne do postaci proleku do stosowania w tym wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do opisanych powyżej czynników chemioterapeutycznych.

PL 202 369 B1

Przez „fazę stałą” rozumie się substancję niewodną, z którą można wiązać przeciwciała stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Przykłady faz stałych według niniejszego wynalazku obejmują te utworzone częściowo lub całkowicie ze szkła (np. szkła o kontrolowanej wielkości porów, polisacharydów (np. agarozy), poliakryloamidów, polistyrenu, alkoholu poliwinylowego i silikonów. W niektórych rozwiązaniach, zależnie od kontekstu, fazę stałą może stanowić studzienka płytki do oznaczania, w innych kolumna do oczyszczania (np. kolumna do chromatografii powinowactwa). Termin ten obejmuje również nieciągłą fazę stałą oddzielnych cząstek, takich jak te opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 275 149.

„Liposom” jest małym pęcherzykiem złożonym z różnego rodzaju lipidów, fosfolipidów i/lub środka powierzchniowo czynnego, użytecznym do dostarczania ssakowi leku (takiego jak skierowane przeciw ErbB2 przeciwciała ujawnione w niniejszym opisie i, ewentualnie, czynnik chemioterapeutyczny). Składniki liposomu są zazwyczaj ułożone dwuwarstwowo, podobnie do ułożenia lipidów w błonach biologicznych.

Termin „ulotka informacyjna” stosuje się jako odnoszący się do instrukcji zazwyczaj włączanych do komercjalnych opakowań produktów terapeutycznych, które zawierają informacje o wskazaniach, stosowaniu, dawkowaniu, podawaniu, przeciwwskazaniach i/lub ostrzeżeniach dotyczących stosowania takich produktów terapeutycznych.

Termin „stężenie w surowicy”, „stężenie leku w surowicy” „stężenie skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® w surowicy” odnosi się do stężenia leku, takiego jak skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało HERCEPTIN^®, w surowicy krwi leczonego lekiem pacjenta, będącego zwierzęciem lub człowiekiem. Stężenie skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^®w surowicy, na przykład, korzystnie określa się w oznaczeniu immunologicznym. Korzystnie, oznaczeniem immunologicznym jest ELISA według procedury ujawnionej w niniejszym opisie.

Termin „szczytowe stężenie w surowicy” odnosi się do maksymalnego stężenia leku w surowicy wkrótce po podaniu leku pacjentowi, będącemu zwierzęciem lub człowiekiem, po rozprowadzeniu leku w układzie krwionośnym, ale przed wystąpieniem znaczącego rozprowadzania do tkanek, metabolizmu lub wydalania przez organizm.

Termin „obniżone stężenie w surowicy” odnosi się do stężenia leku w czasie po podaniu uprzedniej dawki, a bezpośrednio przed podaniem następnej kolejnej dawki leku w szeregu dawek. Generalnie, obniżone stężenie w surowicy jest utrzymującym się minimalnym skutecznym stężeniem leku w szeregu podawanych dawek leku. Obniżone stężenie w surowicy jest również często stosowane w odniesieniu do minimalnego stężenia w surowicy koniecznego do uzyskania skuteczności, ponieważ stanowi ono stężenie w surowicy, przy którym należy podawać kolejną dawkę leku jako część schematu terapeutycznego. Jeśli lek dostarcza się przez podawanie dożylne, obniżone stężenie w surowicy najkorzystniej osiąga się w ciągu 1 dnia podania początkowej dawki uderzeniowej. Jeśli lek jest dostarczany przez podawanie podskórne, obniżone stężenie w surowicy osiąga się korzystnie w ciągu 3 dni lub mniej. Zgodnie z wynalazkiem, stosując którykolwiek ze sposobów ujawnionych w niniejszym opisie, obniżone stężenie w surowicy osiąga się korzystnie w ciągu 4 tygodni lub mniej, korzystnie 3 tygodni lub mniej, korzystniej 2 tygodni lub mniej, najkorzystniej 1 tygodnia lub mniej, włącznie z 1 dniem lub mniej.

Termin „infuzja dożylna” odnosi się do wprowadzania leku do żyły pacjenta, będącego zwierzęciem lub człowiekiem, w ciągu czasu dłuższego niż około 5 minut, korzystnie pomiędzy około od 30 do 90 minut, chociaż, zgodnie z wynalazkiem, infuzję dożylną podaje się w ciągu 10 godzin lub mniej.

Termin „szybka dożylna iniekcja dawki” lub „wstrzyknięte dożylne” odnosi się do podawania leku do żyły pacjenta, będącego zwierzęciem lub człowiekiem, tak że organizm otrzymuje lek w ciągu około 15 minut lub mniej, korzystnie 5 minut lub mniej.

Termin „podawanie podskórne” odnosi się do wprowadzania leku pod skórę pacjenta, będącego zwierzęciem lub człowiekiem, korzystnie do „kieszeni” pomiędzy skórą a znajdującą się pod nią tkanką, przez stosunkowo wolne, przedłużone, podawanie ze zbiornika z lekiem. „Kieszeń” można tworzyć przez schwycenie lub odciągnięcie skóry od znajdującej się pod nią tkanki.

Termin „infuzja podskórna” odnosi się do wprowadzania leku pod skórę pacjenta, będącego zwierzęciem lub człowiekiem, korzystnie do „kieszeni” pomiędzy skórą a znajdującą się pod nią tkanką, przez stosunkowo wolne, przedłużone, podawanie ze zbiornika z lekiem w ciągu czasu obejmującego, ale nie ograniczającego się do 30 minut lub mniej, bądź 90 minut lub mniej. Ewentualnie, infuzji można dokonywać przez podskórne wszczepienie pompy podającej lek, wszczepionej pod skórę pacjenta, będącego zwierzęciem lub człowiekiem, gdzie pompa podaje wstępnie określoną ilość leku

PL 202 369 B1 w ciągu wstępnie określonego czasu, takiego jak 30 minut, 90 minut, bądź czasu obejmującego długość schematu terapeutycznego.

Termin „szybka podskórna iniekcja dawki” odnosi się do podawania leku pod skórę pacjenta, będącego zwierzęciem lub człowiekiem, przy czym szybkie podawanie dawki leku odbywa się korzystnie w ciągu mniej niż około 15 minut, korzystniej mniej niż około 5 minut, a najkorzystniej mniej niż 60 sekund. Podawanie przeprowadza się korzystnie do „kieszeni” pomiędzy skórą a znajdującą się pod nią tkanką, przy czym „kieszeń” tworzy się przez schwycenie lub odciągnięcie skóry od znajdującej się pod nią tkanki.

Termin „początkowa dawka uderzeniowa”, gdy odnosi się do podawania leku, oznacza początkowo wyższą dawkę, po której w odstępach następują takie same lub niższe dawki. Początkowa wyższa dawka lub dawki mają na celu szybciej zwiększać stężenie leku w surowicy pacjenta, będącego zwierzęciem lub człowiekiem, do skutecznego docelowego stężenia w surowicy. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, początkową dawkę uderzeniową uzyskuje się dzięki początkowej dawce lub dawkom, podawanym w ciągu trzech tygodni lub mniej, które powodują osiąganie stężenia w surowicy zwierzęcia lub pacjenta docelowego obniżonego stężenia w surowicy. Korzystnie, początkową dawkę lub serię dawek uderzeniowych podaje się w ciągu dwóch tygodni lub mniej, korzystniej w ciągu 1 tygodnia lub mniej, włącznie z 1 dniem lub mniej. Najkorzystniej, jeśli początkowa dawka jest pojedynczą dawką i w ciągu co najmniej 1 tygodnia nie następuje po niej kolejna dawka podtrzymująca, początkową dawkę podaje się w ciągu 1 dnia lub mniej. Jeśli początkową dawką jest seria dawek, każda dawka jest oddzielona o co najmniej 3 godziny, ale nie więcej niż o 3 tygodnie lub mniej, korzystnie 2 tygodnie lub mniej, korzystniej 1 tydzień lub mniej, najkorzystniej 1 dzień lub mniej. Dla uniknięcia niekorzystnej odpowiedzi odpornościowej na lek będący przeciwciałem, takim jak przeciwciało skierowane przeciw skierowane przeciw ErbB2 (na przykład skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało HERCEPTIN^®) u zwierzęcia lub pacjenta, którego uprzednio nie leczono przeciwciałem, może być korzystne podawanie początkowych dawek przeciwciała przez infuzję dożylną. Niniejszy wynalazek obejmuje podawanie początkowych dawek uderzeniowych i podtrzymujących, dożylnie lub podskórnie, przez infuzję lub szybkie podawanie dawek.

Opublikowane informacje dotyczące przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2 obejmują następujące wydane opisy patentowe i opublikowane zgłoszenia: opis patentowy numer PCT/US89/00051, opublikowany 5 stycznia 1989 r., opis patentowy numer PCT/US90/02697, opublikowany 18 maja 1990 r., europejski opis patentowy numer 0474727, wydany 23 lipca 1997 r.; opis patentowy numer DE 69031120.6, wydany 23 lipca 1997 r., opis patentowy numer PCT/US97/18385, opublikowany 9 października 1997 r., opis patentowy numer_SA 97/9185, wydany 14 października 1997 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5677171, wydany 14 października 1997 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5720937, wydany 24 lutego 1998 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5720954, wydany 24 lutego 1998 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5725856, wydany 10 marca 1998 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5770195, wydany 23 czerwca 1998 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5772997, wydany 30 czerwca 1998 r., opis patentowy numer PCT/US98/2626, opublikowany 10 grudnia 1998 r. oraz opis patentowy numer PCT/US99/06673, opublikowany 26 marca 1999 r., które to opisy patentowe i publikacje w całości włączono do niniejszego opisu.

II. Wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2

Poniżej opisano przykładowe techniki wytwarzania przeciwciał stosowanych według niniejszego wynalazku. Antygenem ErbB2 przeznaczonym do stosowania w wytwarzaniu przeciwciał może być np. rozpuszczalna postać zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2 lub jej części, zawierająca pożądany epitop. Alternatywnie, do tworzenia przeciwciał można stosować komórki, w których zachodzi ekspresja ErbB2 na powierzchniach komórkowych (np. komórki NIH-3T3 stransformowane dla nadekspresji ErbB2 lub linię komórek raka, taką jak komórki SKBR3, patrz Stancovsky i in., PNAS (USA) 88: 8691-8695 [1991]). Inne postacie ErbB2 użyteczne do tworzenia przeciwciał będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie.

(i) Przeciwciała poliklonalne

Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych u zwierząt korzystnie pobudza się przez kilkakrotne podskórne (sc) lub dootrzewnowe (ip) iniekcje odpowiedniego antygenu i adiuwanta. Użyteczne może być skoniugowanie odpowiedniego antygenu z białkiem, które jest immunogenne u gatunku przeznaczonego do immunizacji, np. hemocyjaniną skrzypłocza, albuminą surowicy, tyroglobuliną bydlęcą lub sojowym

PL 202 369 B1 inhibitorem trypsyny, stosując czynnik bifunkcjonalny lub modyfikujący przez tworzenie pochodnej, na przykład ester maleimidobenzoilowy sulfosukcynimidu (koniugacja poprzez reszty cysteiny), N-hydroksysukcynimid (poprzez reszty lizyny), glutaraldehyd, bezwodnik bursztynowy, SOCl2 lub R¹N=C=NR, gdzie R i R¹ są różnymi grupami alkilowymi.

Zwierzęta immunizuje się antygenem, immunogennymi koniugatami lub pochodnymi przez połączenie np. 100 μg lub 5 μg białka lub koniugatu (odpowiednio dla królików lub myszy) z 3 objętościami kompletnego adiuwanta Freunda i wstrzykiwanie roztworu śródskórnie w kilku miejscach. Po jednym miesiącu stosuje się u zwierząt dawkę przypominającą od 1/5 do 1/10 początkowej ilości peptydu lub koniugatu w kompletnym adiuwancie Freunda przez podskórne iniekcje w kilku miejscach. Po upływie od 7 do 14 dni od zwierząt pobiera się krew i oznacza miano przeciwciał w surowicy. Zwierzętom podaje się dawki przypominające do osiągnięcia stałego poziomu przeciwciał. Korzystnie, zwierzętom podaje się dawki przypominające koniugatu tego samego antygenu, ale skoniugowanego z innym białkiem i/lub poprzez inny odczynnik sieciujący. Koniugaty można sporządzać w hodowli zrekombinowanych komórek jako białka fuzyjne. Do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej można również odpowiednio stosować czynniki agregujące, takie jak ałun.

(ii) Przeciwciała monoklonalne

Przeciwciała monoklonalne otrzymuje się z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. pojedyncze przeciwciała stanowiące populację są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. A zatem, określenie „monoklonalne” wskazuje, że przeciwciało nie ma charakteru mieszaniny różnych przeciwciał.

Na przykład, przeciwciała monoklonalne można otrzymywać stosując metodę hybrydom, po raz pierwszy opisaną przez Kohlera i in., Nature, 256: 495 (1975), lub można je otrzymywać metodami rekombinacji DNA (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 567).

W metodzie hybrydom mysz lub inne odpowiednie zwierzę będące gospodarzem, takie jak chomik, immunizuje się w opisany powyżej sposób w celu pobudzenia limfocytów, które wytwarzają lub są zdolne do wytwarzania przeciwciał, które będą specyficznie wiązać się z białkiem zastosowanym do immunizacji. Alternatywnie, limfocyty można immunizować in vitro. Następnie limfocyty poddaje się fuzji z komórkami szpiczaka, stosując odpowiedni czynnik indukujący fuzję, taki jak glikol polietylenowy, z utworzeniem komórki hybrydomy (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 [Academic Press, 1986]).

Tak przygotowane komórki hybrydom wysiewa się i hoduje w odpowiednim podłożu hodowlanym, które korzystnie zawiera jedną lub więcej substancji, które hamują wzrost lub przeżywanie macierzystych komórek szpiczaka, które nie uległy fuzji. Na przykład, jeśli macierzyste komórki szpiczaka pozbawione są enzymu fosforybozylotransferazy guanino-hipoksantynowej (HGPRT lub HPRT), podłoże hodowlane hybrydom zazwyczaj zawierać będzie hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę (podłoże HAT), które to substancje zapobiegają wzrostowi komórek pozbawionych HGPPRT.

Korzystnymi komórkami szpiczaka są te, które wydajnie ulegają fuzji, podtrzymują stabilne wytarzanie przeciwciała na wysokim poziomie przez wyselekcjonowane komórki wytwarzające przeciwciała i są wrażliwe na podłoże, takie jak podłoże HAT. Wśród nich korzystnymi liniami komórek szpiczaka są linie komórek szpiczaka mysiego, takie jak te pochodzące z mysich nowotworów MOPC-21 i MPC-11, dostępne w Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornia, USA, oraz komórki SP-2 lub X63-Ag8-653, dostępne w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Opisano również linie komórek szpiczaka ludzkiego i heteroszpiczaka mysio-ludzkiego do wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur i in., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 [Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, 1987]).

W podłożu hodowlanym, w którym hodowano komórki hybrydom, oznacza się wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw antygenowi. Korzystnie, specyficzność wiązania wytwarzanych przez komórki hybrydom przeciwciał monoklonalnych określa się przez immunoprecypitację lub przez oznaczenie wiązania in vitro, takie jak oznaczenie radioimmunologiczne (RIA) lub enzymatyczne oznaczenie immunosorpcyjne ELISA).

Powinowactwo wiązania przeciwciała monoklonalnego można określić na przykład przez analizę Scatcharda, zgodnie z Munson i in., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Po zidentyfikowaniu komórek hybrydom, które wytwarzają przeciwciała o pożądanej specyficzności, powinowactwie i/lub aktywności, klony można subklonować zgodnie z procedurą kolejnych

PL 202 369 B1 rozcieńczeń i hodować standardowymi metodami (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 [Academic Press, 1986]). Podłoża hodowlane odpowiednie do tego celu obejmują, na przykład, podłoże D-DMEM lub RPMI-1640. Ponadto, komórki hybrydom można hodować in vivo jako nowotwory wysiękowe w zwierzętach.

Przeciwciała monoklonalne wydzielane przez subklony odpowiednio wyodrębnia się z podłoża hodowlanego, płynu wysiękowego lub surowicy zgodnie z konwencjonalnymi procedurami oczyszczania przeciwciał, takimi jak na przykład, stosowanie białka A-Sepharose, chromatografia na hydroksyapatycie, elektroforeza żelowa, dializa lub chromatografia powinowactwa.

DNA kodujące przeciwciała monoklonalne łatwo izoluje się i sekwencjonuje stosując konwencjonalne procedury (np. przez zastosowanie sond oligonukleotydowych, które są zdolne do specyficznego wiązania z genami kodującymi łańcuchy ciężki i lekki przeciwciał mysich). Jako korzystne źródło takiego DNA służą komórki hybrydom. Po wyizolowaniu, DNA można umieszczać w wektorach ekspresyjnych, którymi następnie transfekuje się komórki gospodarza, takie jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórki szpiczaka, które inaczej nie wytwarzają białka immunoglobuliny, w celu uzyskania syntezy przeciwciał monoklonalnych w zrekombinowanych komórkach gospodarza. Artykuły przeglądowe dotyczące rekombinacyjnej ekspresji DNA kodującego przeciwciało w bakteriach obejmują Skerra i in., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) oraz Ptockthun, Immunol. Revs, 130: 151-188 (1992).

W dalszym rozwiązaniu, przeciwciała lub fragmenty przeciwciał można izolować z fagowych bibliotek przeciwciał, utworzonych z zastosowaniem technik opisanych w McCafferty i in., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson i in., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks i in., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) opisują odpowiednio izolowanie przeciwciał mysich i ludzkich z zastosowaniem bibliotek fagowych. W późniejszych publikacjach opisano wytwarzanie ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (zakres nM) przez przetasowywanie łańcuchów (Marks i in., Bio/Technology 10: 779-783 [1992]), jak również kombinatoryczne infekowanie i rekombinację in vivo jako strategię konstruowania bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse i in., Nuc. Acids Res. 21: 2265-2266 [1993]). A zatem, techniki te stanowią dobre alternatywy tradycyjnych technik przeciwciał monoklonalnych hybrydom do izolowania przeciwciał monoklonalnych.

DNA można również modyfikować, na przykład przez podstawienie sekwencji kodujących domeny stałe łańcuchów ciężkiego i lekkiego w miejsce homologicznych sekwencji mysich (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 567; Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 [1984]) lub przez kowalencyjne połączenie z sekwencją kodującą immunoglobulinę całej lub części sekwencji kodującej polipeptyd nie będący immunoglobuliną.

Zazwyczaj takie polipeptydy nie będące immunoglobulinami podstawia się za stałe domeny przeciwciała, bądź podstawia się je za domeny zmienne jednego miejsca wiążącego antygen, tworząc chimeryczne przeciwciało biwalentne, zawierające jedno miejsce wiążące antygen wykazujące specyficzność wobec antygenu i drugie miejsce wiążące antygen wykazujące specyficzność wobec innego antygenu.

(iii) Przeciwciała humanizowane i przeciwciała ludzkie

Metody humanizowania przeciwciał gatunków innych niż człowiek są dobrze znane w tej dziedzinie. Korzystnie, humanizowane przeciwciało posiada jedną lub więcej reszt aminokwasowych wprowadzonych do niego ze źródła innego niż człowiek. Te reszty aminokwasowe nie pochodzące od człowieka często określa się jako reszty „importowane”, które zazwyczaj uzyskuje się z „importowej” domeny zmiennej. Humanizację można zasadniczo prowadzić zgodnie z metodą Wintera i współpracowników (Jones i in., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann i in., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen i in., Science, 239: 1534-1536 [1988]), przez podstawianie sekwencjami CDR gryzoni odpowiadających sekwencji przeciwciała ludzkiego. Zgodnie z tym, takie „humanizowane” przeciwciała są przeciwciałami chimerycznymi (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 816 567), w których zasadniczo mniej niż nienaruszoną ludzką domenę zmienną podstawiono odpowiadającą sekwencją z gatunku innego niż człowiek. W praktyce, przeciwciałami humanizowanymi są zazwyczaj ludzkie przeciwciała, w których niektóre reszty regionu CDR i ewentualnie niektóre reszty FR podstawiono resztami z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni.

Wybór ludzkich domen zmiennych, zarówno łańcucha lekkiego, jak i ciężkiego, przeznaczonych do stosowania w przygotowywaniu przeciwciał humanizowanych, jest bardzo ważny dla obniżania antygenowości. Zgodnie z tak zwaną metodą „najlepszego dopasowania”, sekwencję domeny zmiennej

PL 202 369 B1 przeciwciała gryzonia stosuje się do przeszukiwania całej biblioteki znanych ludzkich sekwencji domen zmiennych. Ludzką sekwencję, która jest najbardziej podobna do tej gryzonia, akceptuje się następnie jako ludzki region zrębu (FR) przeciwciała humanizowanego (Sims i in., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia i in., J. Mol. Biol., 196: 901 [1987]). W innych metodach wykorzystuje się określony region zrębu pochodzący z sekwencji konsensu wszystkich ludzkich przeciwciał z określonej podgrupy łańcuchów lekkich lub ciężkich. Ten sam zrąb można stosować dla kilku różnych przeciwciał humanizowanych (Carter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta i in., J. Immunol., 151: 2623 [1993]).

Ważne jest ponadto, aby przeciwciała poddawane humanizacji zachowywały wysokie powinowactwo wobec antygenu i inne korzystne właściwości biologiczne. Dla osiągnięcia tego celu, według korzystnego sposobu, przeciwciała humanizowane przygotowuje się dokonując analizy sekwencji macierzystych i różnych teoretycznych produktów humanizowanych z zastosowaniem przestrzennych modeli sekwencji macierzystej i humanizowanych. Przestrzenne modele immunoglobulin są powszechnie dostępne i znane specjalistom w tej dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe, które ilustrują i prezentują prawdopodobne przestrzenne struktury konformacyjne wybranych potencjalnych sekwencji immunoglobulin. Analiza tych struktur umożliwia analizę prawdopodobnej roli reszt w działaniu potencjalnej sekwencji immunoglobuliny, tj. analizę reszt, które wpływają na zdolność potencjalnej immunoglobuliny do wiązania jej antygenu. W ten sposób można wybrać reszty FR oraz połączyć z sekwencjami biorcy i importowanymi, tak że uzyskuje się pożądane cechy charakterystyczne przeciwciała, takie jak zwiększone powinowactwo do antygenu(ów) docelowego(wych). Generalnie, reszty CDR bezpośrednio i w największym stopniu uczestniczą we wpływaniu na wiązanie antygenu.

Alternatywnie, obecnie możliwe jest tworzenie zwierząt transgenicznych (np. myszy), które są zdolne, po immunizacji, do wytwarzania pełnego repertuaru przeciwciał ludzkich, przy braku wytwarzania immunoglobulin endogennych. Na przykład, opisano, że wynikiem homozygotycznej delecji genu regionu łączącego łańcucha ciężkiego (JH) przeciwciała u chimerycznych myszy ze zmutowaną linią płciową jest całkowite zahamowanie wytwarzania przeciwciał endogennych. Wynikiem przeniesienia ludzkiego układu genów immunoglobulin linii płciowej do takich myszy o zmutowanej linii płciowej będzie wytwarzanie przeciwciał ludzkich po stymulacji antygenem. Patrz np. Jakobovits i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits i in., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann i in., Year in Immuno., 7: 33 (1993). Przeciwciała ludzkie mogą również pochodzić z bibliotek prezentowanych przez fagi (Hoogenboom i in., J. Mol. Biol., 221: 381 (1991); Marks i in., J. Mol. Biol., 222: 581-597 [1991]).

(iv) Fragmenty przeciwciał

Opracowano różne techniki tworzenia fragmentów przeciwciał. Tradycyjnie fragmenty te otrzymywano przez proteolityczne trawienie nienaruszonych przeciwciał (patrz np. Morimoto i in., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) oraz Brennan i in., Science, 229: 81 [1985]). Jednakże, obecnie fragmenty te mogą być bezpośrednio wytwarzane przez zrekombinowane komórki gospodarza. Na przykład, fragmenty przeciwciał można izolować z dyskutowanych powyżej fagowych bibliotek przeciwciał. Alternatywnie, fragmenty Fab'-SH można bezpośrednio odzyskiwać z E. coli i chemicznie sprzęgać z utworzeniem fragmentów F(ab')2 (Carter i n., Bio/Technology 10: 163-167 [1992]). Zgodnie z innym podejściem, fragmenty F(ab)2 można izolować bezpośrednio z holowi i zrekombinowanych komórek gospodarza. Dla osób pracujących w tej dziedzinie oczywiste będą inne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał. W innych rozwiązaniach, przeciwciałem z wyboru jest jednołańcuchowy fragment Fv (scFv). Patrz światowy opis patentowy numer 93/16185.

(v) Przeciwciała bispecyficzne

Przeciwciałami bispecyficznymi są przeciwciała, które posiadają specyficzności wiązania wobec co najmniej dwóch różnych epitopów. Przykładowe przeciwciała bispecyficzne mogą wiązać się z dwoma różnymi epitopami białka ErbB2. Na przykład, jedno ramie może wiązać epitop w domenie 1 ErbB2, taki jak epitop 72C/7F3, a drugie może wiązać inny epitop ErbB2, np. epitop 4D5. Inne takie przeciwciała mogą łączyć miejsce wiązania ErbB2 z miejscem(ami) wiązania EGFR, ErbB3 i/lub ErbB4. Alternatywnie, ramię skierowane przeciw ErbB2 może być połączone z ramieniem, które wiąże się z pobudzającą cząsteczką na leukocycie, taką jak cząsteczka receptora komórek T (np. CD2 lub CD3) lub receptorami Fc IgG (FcyR), takimi jak FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) i FcyRIII (CD16), tak aby skoncentrować mechanizmy obrony komórkowej na komórkach, w których zachodzi ekspresja ErbB2. Przeciwciała bispecyficzne można również stosować do dostarczania czynników cytotoksycznych do komórek, w których zachodzi ekspresja ErbB2. Przeciwciała te posiadają ramię wiążące ErbB2 oraz

PL 202 369 B1 ramię, które wiąże czynnik cytotoksyczny (np. saporynę, antyinterferon-α, alkaloid barwinka, łańcuch A rycyny, metotreksat lub hapten z izotopem promieniotwórczym). Przeciwciała bispecyficzne można przygotowywać jako przeciwciała o pełnej długości lub fragmenty przeciwciał (np. bispecyficzne przeciwciała F(ab')2).

Sposoby przygotowywania przeciwciał bispecyficznych są znane w nauce. Tradycyjne wytwarzanie bispecyficznych przeciwciał o pełnej długości opiera się na koekspresji dwóch par łańcuch ciężki/łańcuch lekki immunoglobuliny, gdzie oba łańcuchy posiadają różne specyficzności (Millstein i in., Nature, 305: 537-539 [1983]). Z powodu losowego doboru łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin, te hybrydomy (kwadromy) wytwarzają potencjalną mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których tylko jedna posiada właściwą bispecyficzną strukturę. Oczyszczanie właściwej cząsteczki, którego zazwyczaj dokonuje się dzięki etapom chromatografii powinowactwa, jest raczej niewygodne, a wydajności produktu są niskie. Podobne procedury ujawniono w światowym opisie patentowym numer 93/08829 i w Traunecker i in., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Według innego podejścia, domeny zmienne przeciwciał o pożądanych specyficznościach wiązania (miejscach wiązania przeciwciało-antygen) poddaje się fuzji z sekwencjami domen stałych immunoglobulin. Fuzję korzystnie prowadzi się z domeną stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, zawierającą co najmniej część regionów zawiasowego, CH2 i CH3. Korzystne jest, aby pierwszy region stały łańcucha ciężkiego (CH1) zawierający miejsce konieczne do wiązania łańcucha lekkiego, był obecny co najmniej w jednej z fuzji. DNA kodujące fuzje łańcuchów ciężkich immunoglobulin i, jeśli jest to pożądane, łańcuchów lekkich immunoglobulin, wstawia się do oddzielnych wektorów i kotransfekuje odpowiedni organizm gospodarza. Zapewnia to dużą elastyczność pod względem doprowadzania wzajemnych proporcji trzech łańcuchów polipeptydowych w rozwiązaniach, w których nierówne stosunki trzech łańcuchów polipeptydowych stosowanych w konstruowaniu zapewniają optymalną wydajność. Możliwe jest jednak wstawienie sekwencji kodujących dwa lub trzy łańcuchy polipeptydowe do jednego wektora ekspresyjnego, jeśli wynikiem ekspresji co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych stosunkach jest wysoka wydajność lub jeśli stosunki nie mają większego znaczenia.

W korzystnym rozwiązaniu, przeciwciała bispecyficzne składają się z hybrydowego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny o pierwszej specyficzności wiązania w jednym ramieniu i pary hybrydowy łańcuch ciężki-łańcuch lekki immunoglobuliny (zapewniającej drugą specyficzność wiązania) w drugim ramieniu. Stwierdzono, że ta asymetryczna struktura ułatwia oddzielanie pożądanego związku bispecyficznego od niepożądanych kombinacji łańcuchów immunoglobulin, ponieważ obecność lekkiego łańcucha immunoglobuliny tylko w jednej połowie bispecyficznej cząsteczki zapewnia łatwy sposób oddzielania. Podejście to ujawniono w światowym opisie patentowym numer 94/04690. Dla dalszych szczegółów tworzenia przeciwciał bispecyficznych patrz, na przykład, Suresh i in., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

Według innego podejścia, opisanego w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym numer 96/27011, region kontaktu pary cząsteczek przeciwciał można konstruować zapewniając maksymalizację procentu heterodimerów, które odzyskuje się z hodowli zrekombinowanych komórek. Korzystny region kontaktu zawiera co najmniej część domeny CH3 domeny stałej przeciwciała. W sposobie tym łańcuchy boczne jednego lub więcej małych aminokwasów z regionu kontaktu pierwszej cząsteczki przeciwciała zastępuje się większymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyny lub tryptofanu). W regionie kontaktu drugiej cząsteczki przeciwciała tworzy się odpowiadające „wgłębienia” o identycznej lub podobnej wielkości przez zastąpienie łańcuchów bocznych dużych aminokwasów mniejszymi (np. alaniny lub treoniny). Zapewnia to mechanizm zwiększania wydajności heterodimeru w stosunku do niepożądanych produktów końcowych, takich jak homodimery.

Przeciwciała bispecyficzne obejmują przeciwciała usieciowane, czyli „heterokoniugaty”. Na przykład, jedno z przeciwciał heterokoniugatu można sprzęgać z awidyną, a drugie z biotyną. Takie przeciwciała proponowano na przykład do kierowania komórek układu odpornościowego do niepożądanych komórek (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 676 980) i do leczenia infekcji HIV (światowe opisy patentowe o numerach 91/00360 i 92/200373 oraz europejski opis patentowy numer 03089). Przeciwciała będące heterokoniugatami można przygotować stosując jakąkolwiek odpowiednią metodę sieciowania. Odpowiednie czynniki sieciujące są dobrze znane w nauce i zostały ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 676 980, wraz z licznymi technikami sieciowania.

W literaturze opisano również techniki tworzenia przeciwciał bispecyficznych z fragmentów przeciwciał. Na przykład, przeciwciała bispecyficzne można przygotowywać stosując wiązanie chemiczne.

PL 202 369 B1

Brennan i in., Science, 229: 81 (1985) opisują procedurę, w której nienaruszone przeciwciała rozszczepia się proteolitycznie z utworzeniem fragmentów F(ab')2. Fragmenty te redukuje się w obecności czynnika kompleksującego ditiole, arseninu sodowego, w celu stabilizacji sąsiednich ditioli i zapobiegania tworzenia międzycząsteczkowych wiązań disiarczkowych. Utworzone fragmenty Fab' przekształca się w pochodne tionitrobenzoesanowe (TNB). Jedną z pochodnych Fab'-TNB następnie ponownie przekształca się w Fab'-tiol przez redukcję merkaptoetyloaminą i miesza z równomolową ilością drugiej pochodnej Fab'-TNB z utworzeniem przeciwciała bispecyficznego. Utworzone przeciwciała bispecyficzne można stosować jako czynniki do selektywnej immobilizacji enzymów.

Ostatnie postępy w badaniach ułatwiły bezpośrednie odzyskiwanie fragmentów Fab'-SH z E. coli, które można chemicznie sprzęgać z utworzeniem przeciwciał bispecyficznych. Shalaby i in., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) opisują wytwarzanie w pełni humanizowanej cząsteczki F(ab') przeciwciała bispecyficznego. Każdy z fragmentów Fab' jest oddzielnie wydzielany przez E. coli i poddawany bezpośredniemu sprzęganiu chemicznemu in vitro z utworzeniem bispecyficznego przeciwciała. Tak utworzone przeciwciało bispecyficzne było zdolne do wiązania z komórkami, w których zachodziła nadekspresja receptora ErbB2 i normalnymi ludzkimi komórkami T, jak również wyzwalania litycznej aktywności ludzkich limfocytów cytotoksycznych wobec stanowiących cel ludzkich nowotworów sutka.

Opisano również różne techniki przygotowywania i izolowania fragmentów przeciwciał bispecyficznych bezpośrednio z hodowli zrekombinowanych komórek. Na przykład, przeciwciała bispecyficzne przeciwciała tworzono stosując leucynowe zamki błyskawiczne. Kostelny i in., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Peptydy leucynowego zamka błyskawicznego z białek Fos i Jun połączono z częściami Fab' dwóch różnych przeciwciał przez fuzje genów. Homodimery przeciwciał redukowano w regionie zawiasowym z utworzeniem monomerów, a następnie ponownie utleniano tworząc heterodimery przeciwciał. Metodę tę można również wykorzystywać do tworzenia homodimerów przeciwciał. Technika „diaciał”, opisana w Hollinger i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), zapewniła alternatywny mechanizm przygotowywania fragmentów przeciwciał bispecyficznych. Fragmenty zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) poprzez łącznik, który jest zbyt krótki do umożliwienia parowania pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha. Zgodnie z tym, domeny VH i VL jednego fragmentu zmuszone są do parowania z komplementarnymi domenami VL i VH drugiego fragmentu, w ten sposób tworząc dwa miejsca wiążące antygeny. Doniesiono również o innej strategii przygotowywania fragmentów przeciwciał bispecyficznych dzięki stosowaniu dimerów jednołańcuchowych Fv (sFv). Patrz Gruber i in., J. Immunol., 152: 5368 (1994).

Bierze się również pod uwagę przeciwciała o więcej niż dwóch wartościowościach. Można na przykład przygotowywać przeciwciała trispecyficzne. Tutt i in., J. Immunol. 147: 60 (1991).

(vi) Przeszukanie pod kątem przeciwciał o pożądanych właściwościach

Powyżej opisano techniki tworzenia przeciwciał. Selekcjonuje się te przeciwciała, które posiadają opisane w niniejszym opisie pożądane właściwości.

W celu wyselekcjonowania przeciwciał, które indukują śmierć komórkową, ocenia się, w porównaniu z kontrolą, utratę integralności błony komórkowej, wskazywaną przez pobieranie PI, błękitu tryptanu lub 7AAD. Korzystnym oznaczeniem jest „oznaczenie pobierania PI z zastosowaniem komórek BT474”. Według tego oznaczenia, komórki BT474 (które można otrzymać z American Type Culture Collection [Rockville, MD]), hoduje się w Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM):Ham's F-12 (50:50), wzbogaconym o 10% inaktywowaną termicznie FBS (Hyclone) i 2 mM L-glutaminę. (A zatem, oznaczenie prowadzi się w nieobecności dopełniacza i efektorowych komórek odpornościowych). Komórki BT474 wysiewa się z gęstością 3 x 10⁶ komórek na szalkę w szalkach o wymiarach 100 x 20 mm i umożliwia przyłączanie przez noc. Następnie podłoże usuwa się i zastępuje samym świeżym podłożem lub podłożem zawierającym 10 pg/ml odpowiedniego przeciwciała monoklonalnego. Komórki inkubuje się w ciągu okresu 3 dni. Po każdym traktowaniu monowarstwy przemywa się PBS i odłącza stosując trypsynę. Następnie komórki wiruje się przy 1200 obrotach na minutę w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C, osad ponownie zawiesza w 3 ml schłodzonego lodem buforu do wiązania z Ca²⁺ (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) i rozdziela do probówek 12 x 75 zamkniętych 35 mm filtrem (1 ml na probówkę, 3 probówki na traktowaną grupę) w celu usunięcia agregatów komórkowych. Do probówek dodaje się następnie PI (10 pg/ml). Próbki można analizować stosując cytometr przepływowy FACSCAN™ i oprogramowanie FACSCONVERT™ Cell Quest (Becton

PL 202 369 B1

Dickinson). Selekcjonuje się te przeciwciała, które indukują istotne statystycznie poziomy śmierci komórek określone dzięki pobieraniu PI.

Do selekcji pod kątem przeciwciał, które indukują apoptozę, dostępne jest „oznaczenie wiązania aneksyny z zastosowaniem komórek BT474”. Komórki BT474 hoduje się i wysiewa w szalkach, jak dyskutowano w poprzednim akapicie. Następnie podłoże usuwa się i zastępuje samym świeżym podłożem lub podłożem zawierającym 10 μg/ml przeciwciała monoklonalnego. Po inkubacji w ciągu okresu 3 dni, monowarstwy przemywa się PBS i odłącza stosując trypsynę. Następnie komórki wiruje się, ponownie zawiesza w buforze do wiązania z Ca²⁺ i rozdziela do probówek, jak dyskutowano powyżej dla oznaczenia śmierci komórkowej. Do probówek dodaje się następnie wyznakowaną aneksynę (np. aneksynę V-FITC) (1 μg/ml). Próbki można analizować stosując cytometr przepływowy FACSCAN™ i oprogramowanie FACSCONVERT™ Cell Quest (Becton Dickinson). Te przeciwciała, które indukują istotne statystycznie poziomy wiązania aneksyny w stosunku do kontroli wybiera się jako przeciwciała indukujące apoptozę.

Poza oznaczeniem wiązania aneksyny, dostępne jest „oznaczenie wybarwiania DNA z zastosowaniem komórek BT474”. W celu przeprowadzenia tego oznaczenia, komórki BT474, które traktowano przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania w sposób opisany w poprzednich dwóch akapitach, inkubuje się z 9 μg/ml HOECHST 33342™ w ciągu dwóch godzin w temperaturze 37°C, a następnie analizuje w cytometrze przepływowym EPICS ELITE™ (Coulter Corporation) stosując oprogramowanie MODFIT LT™ (Verity Software House). Stosując to oznaczenie, przeciwciała, które indukują zmianę procentu komórek apoptycznych, który jest 2-krotny lub wyższy (a korzystnie 3-krotny lub wyższy) niż w przypadku komórek nietraktowanych (do 100% komórek apoptycznych), można wybrać jako przeciwciała proapoptyczne.

Do przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z epitopem w ErbB2 wiązanym przez przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego, takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, lub dodatkowo, metodami znanymi w tej dziedzinie można prowadzić mapowanie epitopowe.

W celu identyfikacji skierowanych przeciw ErbB2 przeciwciał, które hamują wzrost komórek SKBR3 w hodowli komórkowej o około 50-100%, można przeprowadzić opisane w światowym opisie patentowym numer 89/06692. Według tego oznaczenia, komórki SKBR3 hoduje się w mieszaninie podłuż F12 i DMEM w stosunku 1:1, wzbogaconej o 10% płodową surowicę bydlęcą, glutaminę i penicylinę/streptomycynę. Komórki SKBR3 wysiewa się w ilości 20 000 komórek w szalkach do hodowli komórek o średnicy 35 mm (2 ml/szalkę o średnicy 35 mm). Dodaje się od 2,5 μg/ml przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 na szalkę. Po sześciu dniach zlicza się liczbę komórek, w porównaniu z komórkami nietraktowanymi, stosując elektroniczne urządzenie do zliczania komórek COULTER™. Te przeciwciała, które hamują wzrost komórek SK-BR-3 o około o około 50-100%, wybiera się do łączenia z przeciwciałami apoptycznymi, jeśli jest to pożądane.

(vii) Modyfikowanie funkcji efektorowej

Może być pożądane modyfikowanie przeciwciała według wynalazku pod względem funkcji efektorowej, na przykład dla wzmocnienia skuteczności przeciwciała w leczeniu raka. Na przykład, w regionie Fc można wprowadzić resztę(y) cysteiny, w ten sposób umożliwiając tworzenie międzyłańcuchowego wiązania disiarczkowego w tym regionie. Tak utworzone przeciwciało homodimeryczne może wykazywać poprawioną zdolność do ulegania internalizacji i/lub zwiększone zależne od dopełniacza zabijanie komórek oraz zależną od przeciwciała cytotoksyczność komórkową (ADCC). Patrz Caron i in., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) i Shopes, B., J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Homodimeryczne przeciwciała o wzmocnionej aktywności przeciwnowotworowej można również przygotowywać stosując heterobifunkcjonalne czynniki sieciujące, jak opisano w Wolff i in., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternatywnie, można skonstruować przeciwciało, które posiada podwójne regiony Fc i dlatego może posiadać wzmocnione możliwości zależnej od dopełniacza lizy i ADCC. Patrz Stevanson i in., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).

(viii) Immunokoniugaty

Wynalazek dotyczy również immunokoniugatów zawierających przeciwciało skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym, takim jak czynnik chemioterapeutyczny, toksyna (np. aktywna enzymatycznie toksyna pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, lub ich fragmenty) lub izotopem promieniotwórczym (tj. radiokoniugat).

PL 202 369 B1

Czynniki chemioterapeutyczne użyteczne w tworzeniu takich immunokoniugatów opisano powyżej. Enzymatycznie aktywne toksyny i ich fragmenty, które można stosować, obejmują łańcuch A toksyny błoniczej, niewiążące aktywne fragmenty toksyny błoniczej, łańcuch A egzotoksyny (z Pseudomonas aeruginosa), łańcuch A rycyny, łańcuch A abryny, łańcuch A moddecyny, alfa-sarcynę, białka Aleurites fordii, białka diantyn, białek Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcynę, krotynę, inhibitor Saponaria officinalis, geloninę, mitożelinę, restryktocynę, fenomycynę, enomycynę i trikoteceny. Do tworzenia skierowanych przeciw ErbB2 przeciwciał skoniugowanych z izotopami promieniotwórczymi dostępne są różne nuklidy promieniotwórcze. Przykłady obejmują ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹ln, ⁹⁰Y i ¹⁸⁶Re.

Koniugaty przeciwciała i czynnika cytotoksycznego przygotowuje się stosując szereg bifunkcjonalnych czynników sprzęgających z białkami, takich jak N-sukcynimidylo-3-(2-pirydylotio)propionian (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcjonalne pochodne imidoestrów (takie jak chlorowodorek adypimidynianu dimetylowego), aktywne estry (takie jak suberynian disukcynimidylowy), aldehydy (takie jak glutaraldehyd), związki bis-azydowe (takie jak bis (p-azydobenzoilo)heksanodiamina), pochodne bis-diazoniowe (takie jak bis-(p-diazoniobenzoilo)-etylenodiamina), diizocyjaniany (takie jak 2,6-diizocyjanian tolienu) i dwuaktywne związki fluorowe (takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na przykład, immunotoksynę rycynową można przygotować w sposób opisany w Vitetta i in., Science 238: 1098 (1987). Wyznakowany C¹⁴ kwas 1-izotiocyjanatobenzylo-3-metylodietylenotriaminopentaoctowy (MX-DPTA) jest przykładowym czynnikiem chelatującym do koniugowania rybonukleotydu z przeciwciałem. Patrz światowy opis patentowy numer 94/11026.

W jeszcze innym rozwiązaniu, przeciwciało można skoniugować z „receptorem” (takim jak streptawidyna) do wykorzystywania we wstępnym kierowaniu do nowotworu, podczas którego pacjentowi podaje się koniugat przeciwciało-receptor, a następnie usuwa się niezwiązany koniugat z krążenia stosując czynnik usuwający, po czym podaje się „ligand” (np. awidynę), który skoniugowano z czynnikiem cytotoksycznym (np. nuklidem promieniotwórczym).

(ix) Immunoliposomy

Ujawnione w niniejszym opisie przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 można również tworzyć w postaci immunoliposomów. Liposomy zawierające przeciwciało przygotowuje się metodami znanymi w tej dziedzinie, takimi jak opisane w Epstein i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985), Hwang i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 4030 (1980); opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 485 045 i 4 544 545. Liposomy o wydłużonym czasie trwania w krążeniu ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 013 556.

Szczególnie użyteczne liposomy można tworzyć metodą odparowywania o odwróconych fazach z kompozycji lipidów zawierającej fosfatydylocholinę, cholesterol i zmodyfikowaną PEG fosfatydyloetanoloaminę (PEG-PE). Liposomy przepuszcza się przez sączki o określonej wielkości porów dla uzyskania liposomów o pożądanej średnicy. Fragmenty Fab' przeciwciał według niniejszego wynalazku można koniugować z liposomami w sposób opisany w Martin i in., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) dzięki reakcji wymiany disiarczkowej. Liposomy ewentualnie zawierają czynnik chemioterapeutyczny. Patrz Gabizon i in., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).

(x) Zależna od przeciwciał terapia prolekiem z udziałem enzymu (ADEPT)

Przeciwciała według niniejszego wynalazku można również stosować w ADEPT, dzięki koniugowaniu przeciwciała z enzymem aktywującym prolek, który przekształca prolek (np. peptydylowy czynnik chemioterapeutyczny, patrz światowy opis patentowy numer 81/01145) w aktywny lek przeciwrakowy. Patrz, na przykład, światowy opis patentowy numer 88/07378 i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 975 278.

Enzymatyczna składowa immunokoniugatu użytecznego w ADEPT obejmuje jakikolwiek enzym zdolny do działania na prolek w taki sposób, że przekształca go w bardziej aktywną, cytotoksyczną postać.

Enzymy, które są użyteczne w sposobie według tego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do alkalicznej fosfatazy użytecznej do przekształcania proleków zawierających grupę fosforanową w wolne leki, arylosulfatazy użytecznej do przekształcania leków zawierających grupę siarczanową w wolne leki, deamianzy cytozynowej użytecznej do przekształcania nietoksycznej 5-fluorocytozyny w lek przeciwrakowy, 5-fluorouracyl, proteaz, takich jak proteaza Serratia, termolizyna, subtylizyna, karboksypeptydazy i katepsyny (takie jak katepsyny B i L), które są użyteczne do przekształcania proleków zawierających peptydy w wolne leki, D-alanylokarboksypeptydaz, użytecznych do przekształcania

PL 202 369 B1 proleków, które zawierają podstawniki D-aminokwasowe, enzymów rozszczepiających węglowodany, takich jak β-galaktozydaza i neuraminidaza, użytecznych do przekształcania proleków glikozylowanych w wolne leki, β-laktamazy użytecznej do przekształcania leków zmodyfikowanych β-laktamami w wolne leki oraz amidaz penicylinowych, takich jak amidaza penicyliny V lub amidaza penicyliny G, użytecznych do przekształcania leków zmodyfikowanych przy atomach azotu grup aminowych, odpowiednio, grupami fenoksyacetylowymi lub fenyloacetylowymi, w wolne leki. Alternatywnie, do przekształcania proleków według wynalazku w wolne aktywne leki można stosować przeciwciała o aktywności enzymatycznej, znane również w nauce jako „abzymy” (patrz np. Massey, Nature, 328: 457-458 [1987]). Koniugaty przeciwciało-abzym można przygotowywać w sposób opisany w niniejszym opisie w celu dostarczania abzymu do populacji komórek nowotworowych.

Enzymy według tego wynalazku można kowalencyjnie wiązać z przeciwciałami skierowanymi przeciw ErbB2 stosując techniki dobrze znane w tej dziedzinie, takie jak stosowanie dyskutowanych powyżej heterobifunkcjonalnych odczynników sieciujących. Alternatywnie, stosując dobrze znane w tej dziedzinie techniki rekombinacji DNA, można konstruować białka fuzyjne zawierające co najmniej wiążący antygen region przeciwciała według wynalazku połączony z co najmniej funkcjonalnie aktywną częścią enzymu według wynalazku (patrz np. Neuberger i in,., Nature, 312: 604-608 [1984]).

(xi) Fuzje przeciwciało-epitop wiążący receptor ratunkowy

W niektórych rozwiązaniach wynalazku może być pożądane stosowanie raczej fragmentu przeciwciała niż nienaruszonego przeciwciała, na przykład w celu zwiększenia penetracji do nowotworu. W tym przypadku, może być pożądane zmodyfikowanie fragmentu przeciwciała w celu zwiększenia jego okresu półtrwania w surowicy. Można to uzyskać na przykład przez wprowadzenie do fragmentu przeciwciała epitopu wiążącego receptor ratunkowy (na przykład przez mutację odpowiedniego regionu fragmentu przeciwciała lub przez wprowadzenie epitopu do znacznika peptydowego, który następnie poddaje się fuzji z fragmentem przeciwciała albo na końcu, albo w środku cząsteczki, np. przez syntezę DNA lub peptydu).

Złożony sposób przygotowywania takiego wariantu przeciwciała, posiadającego zwiększony okres półtrwania in vivo, obejmuje kilka etapów. Pierwszy z nich obejmuje identyfikację sekwencji i konformacji epitopu wiążącego receptor ratunkowy regionu Fc cząsteczki IgG. Po zidentyfikowaniu tego epitopu, sekwencję przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania modyfikuje się, tak aby obejmowała sekwencję i konformację zidentyfikowanego epitopu wiążącego. Po zmutowaniu sekwencji, wariant przeciwciała testuje się dla sprawdzenia, czy posiada on dłuższy okres półtrwania in vivo niż oryginalne przeciwciało. Jeśli podczas testowania wariant przeciwciała nie ma dłuższego okresu półtrwania, jego sekwencję zmienia się dalej tak, aby zawierał sekwencję i konformację zidentyfikowanego epitopu wiążącego. Zmienione przeciwciało testuje się pod kątem dłuższego okresu półtrwania in vivo i proces ten kontynuuje się do chwili otrzymania cząsteczki, która wykazuje dłuższy okres półtrwania in vivo.

Tak wprowadzonym do przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania epitopem wiążącym receptor ratunkowy jest jakikolwiek zdefiniowany powyżej taki epitop, a jego charakter zależeć będzie np. od rodzaju modyfikowanego przeciwciała. Przeniesienia dokonuje się w taki sposób, że przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania nadal posiada opisaną w niniejszym opisie aktywność biologiczną.

Epitop korzystnie stanowi region, w którym którąkolwiek jedną lub więcej reszt aminokwasowych z jednej lub dwóch pętli domeny Fc przenosi się w analogiczną pozycję fragmentu przeciwciała. Jeszcze korzystniej, przenosi się trzy lub więcej reszt z jednej lub dwóch pętli domeny Fc. Jeszcze bardziej korzystnie, epitop pobiera się z domeny CH2 regionu Fc (np. IgG) i przenosi do regionu CH1, CH3 lub VH bądź więcej niż jednego takiego regionu przeciwciała. Alternatywnie, epitop pobiera się z domeny CH2 regionu Fc i przenosi do regionu CL lub regionu VL, bądź obu, fragmentu przeciwciała.

W jednym najkorzystniejszym rozwiązaniu, epitop wiążący receptor ratunkowy obejmuje sekwencję (w kierunku od 5' do 3'): PKNSSMISNTP (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3), a ewentualnie obejmuje ponadto sekwencję wybraną z grupy składającej się z HQSLGTQ (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4), HQNLSDGK (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5), HQNISDGK (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6) lub VISSHLGQ (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7), szczególnie jeśli fragmentem przeciwciała jest Fab lub F(ab')2. W innym najkorzystniejszym rozwiązaniu, epitopem wiążącym receptor ratunkowy jest polipeptyd obejmujący sekwencję(e) (w kierunku od 5' do 3') HQNLSDGK (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5), HQNISDGK (sekwencja o numerze

PL 202 369 B1 identyfikacyjnym: 6) lub VISSHLGQ (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7) oraz sekwencję PKNSSMISNTP (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3).

(xii) Oczyszczanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2

Przy stosowaniu technik rekombinacyjnych, przeciwciało może być wytwarzane wewnątrzkomórkowo, w przestrzeni periplazmatycznej lub może być bezpośrednio wydzielane do podłoża. Jeśli przeciwciało jest wytwarzane wewnątrzkomórkowo, na pierwszym etapie usuwa się cząstkowe pozostałości, albo komórki gospodarza albo zlizowane fragmenty, na przykład przez wirowanie lub ultrafiltrację. Carter i in., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisują procedurę izolowania przeciwciał, które są wydzielane do przestrzeni periplazmatycznej E. coli. Krótko, masę komórkową rozmraża się w obecności octanu sodowego (pH 3,5), EDTA i fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) w ciągu około 30 minut. Pozostałości komórkowe można usunąć przez wirowanie. Jeśli przeciwciało jest wydzielane do podłoża, supernatanty z takich układów ekspresyjnych generalnie najpierw zatęża się stosując komercjalnie dostępny sączek do zatężania białek, na przykład jednostkę do ultrafiltracji Amicon lub Millipore Pellicon. Na każdym z powyższych etapów można włączyć inhibitor proteaz, taki jak PMSF, w celu zahamowania proteolizy, oraz antybiotyki, w celu zapobiegnięcia wzrostu przypadkowych zanieczyszczeń.

Kompozycję przeciwciała przygotowaną z komórek można oczyszczać stosując, na przykład, chromatografię na hydroksyapatycie, elektroforezę żelową, dializę i chromatografię powinowactwa, przy czym korzystną techniką jest chromatografia powinowactwa. To, czy białko A jest odpowiednie jako ligand powinowactwa zależy od gatunku i izotypu domeny Fc immunoglobuliny, która jest obecna w przeciwciele. Białko A można stosować do oczyszczania przeciwciał, które oparte są na ludzkich łańcuchach ciężkich γ1 γ2 lub γ4 (Lindmark i in., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983]). Białko G jest zalecane dla wszystkich izotypów mysich oraz ludzkiego γ3 (Guss i in., EMBO J. 5: 1567-1575 [1986]). Złożem, do którego przyłącza się ligand powinowactwa, najczęściej jest agaroza, ale dostępne są inne złoża. Złoża stabilne mechanicznie, takie jak szkło lub poli(styrenodiwinylo)benzen o kontrolowanej wielkości porów, pozwalają na wyższe szybkości przepływu i krótsze czasy obróbki niż możliwe do uzyskania w przypadku agarozy. Jeśli przeciwciało zawiera domenę CH3, do oczyszczania użyteczna jest żywica Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ). Dostępne są również inne techniki oczyszczania białek, takie jak frakcjonowanie na kolumnie jonowymiennej, wytrącanie etanolem, HPLC z odwróconymi fazami, chromatografia na krzemionce, chromatografia na heparyna-SEPHAROSE™, chromatografia na żywicy aniono- lub kationowymiennej (takiej jak kolumna z kwasem poliaspartylowym), chromatoogniskowanie, SDS-PAGE i wytrącanie siarczanem amonowym, zależnie od odzyskiwanego przeciwciała.

Po jakimkolwiek wstępnym etapie(ach), oczyszczania, mieszaninę zawierającą przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania i zanieczyszczenia można poddać chromatografii oddziaływań hydrofobowych w niskim pH z zastosowaniem buforu do elucji o pH pomiędzy około 2,5-4,5, korzystnie prowadzonej przy niskim stężeniu soli (np. od około 0 do 0,25 M soli).

III. Określanie stężenia przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 w surowicy

Poniższe, nie ograniczające oznaczenie jest użyteczne do określania obecności i ilości specyficznego rhuMab HER2 (humanizowanego przeciwciała skierowanego przeciw p185^HER2, włącznie ze skierowanym przeciw ErbB2 przeciwciałem HERCEPTIN^®) w płynach ciała ssaka, obejmujących, ale nie ograniczających się do surowicy, płynu owodniowego, mleka, surowicy pępowinowej, cieczy wodnistej oka i cieczy szklistej oraz galaretowatej cieczy szklistej.

Płytkowe oznaczenie aktywności wiązania dla rhuMab HER2 (humanizowanego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw p185^HER2)

Opisany w niniejszym opisie sposób oznaczania rhuMAb HER2 należy rozumieć jako przykład takiego sposobu, a nie jakiekolwiek ograniczenie. Standaryzowany preparat rhuMAb HER2 (Genentech, Inc., South San Francisco, CA), kontrole i próbki surowicy rozcieńczano rozcieńczalnikiem do oznaczania (PBS/0,5% BSA/0,5% Polysorbate 20/0,01% Thimerosal). Rozcieńczenia standaryzowanego rhuMAb HER2 przygotowywano tak, aby obejmował zakres stężeń użytecznych do stworzenia krzywej standardowej. Próbki rozcieńczano, aby mieściły się w zakresie krzywej standardowej.

Do każdej studzienki płytki do mikromiareczkowania dodawano próbkę antygenu opłaszczającego w buforze do opłaszczania (zrekombinowane p185^HER2 (Genentech, Inc.) w 0,05 M buforze węglanu sodowego) i inkubowano w temperaturze 2-8°C w ciągu 12-72 godzin. Roztwór opłaszczający usuwano i każdą studzienkę przemywano sześć razy wodą, a następnie osuszano w celu usunięcia nadmiaru wody.

PL 202 369 B1

Do każdej studzienki dodawano próbkę rozcieńczalnika do oznaczania i inkubowano w ciągu 1-2 godzin w temperaturze otoczenia z wytrząsaniem. Studzienki przemywano jak na poprzednim etapie.

Do studzienek dodawano próbki rozcieńczonych roztworów standardu, kontrolnych i próbek i studzienki inkubowano w temperaturze otoczenia w ciągu 1 godziny z wytrząsaniem, dla umożliwienia wiązania przeciwciała z antygenem opłaszczającym. Studzienki ponownie przemywano wodą jak na poprzednich etapach.

Koniugat peroksydazy chrzanowej (koniugat HRP, kozie przeciwciało skierowane przeciw Fc ludzkich IgG skoniugowane z peroksydazą chrzanową; nr katalogowy 55253 Organon Teknika lub równoważne) rozcieńczano rozcieńczalnikiem do oznaczania w celu uzyskania odpowiedniego zakresu gęstości optycznej pomiędzy najwyższą a najniższą wartością dla standardu. Do każdej studzienki dodawano próbkę roztworu koniugatu HRP i inkubowano w temperaturze otoczenia w ciągu 1 godziny z wytrząsaniem. Studzienki przemywano wodą jak na poprzednich etapach.

Do każdej studzienki dodawano próbkę roztworu substratu (5 mg tabletka o-fenylenodiaminy (OPD) (P6912, Sigma lub równoważna) w 12,5 ml 4 mM H2O2 w PBS) i inkubowano w ciemności w temperaturze otoczenia w ciągu czasu wystarczającego do umożliwienia wywołania barwy (około 8-10 minut). Reakcję zatrzymywano dodając 4,5 N kwas siarkowy. Gęstość optyczną odczytywano przy długościach fal 490-492 nm dla określenia absorbancji oraz 405 nm dla określenia absorbancji odniesienia. Wykreślano dane dla krzywej standardowej i z krzywej standardowej określano wyniki dla kontroli i próbek.

IV. Postacie farmaceutyczne

Terapeutyczne postacie przeciwciał stosowanych zgodnie z niniejszym wynalazkiem przygotowuje się do przechowywania przez mieszanie przeciwciała posiadającego pożądany stopień czystości z ewentualnymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, zaróbkami lub czynnikami stabilizującymi (Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 16, Osol, A., red. [1980]) do uzyskania postaci zliofilizowanych lub roztworów wodnych. Dopuszczalne nośniki, zaróbki lub czynniki stabilizujące są nietoksyczne dla biorców w stosowanych dawkach i stężeniach, i obejmują bufory, takie jak fosforan, cytrynian i inne kwasy organiczne; środki przeciwutleniające, włącznie z kwasem askorbinowym i metioniną; środki konserwujące (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamonowy, chlorek heksametoniowy, chlorek benzalkoniowy, chlorek benzotoniowy, fenol, alkohol butylowy lub benzylowy, parabeny alkilowe, takie jak paraben metylowy lub propylowy, katechol, rezorcinol, cykloheksanol, 3-pentanol i m-krezol); niskocząsteczkowe (o długości mniejszej niż 10 reszt) polipeptydy; białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny, polimery hydrofiłowe, takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina lub lizyna, monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany, włącznie z glukozą, mannozą i dekstrynami, czynniki chelatujące, takie jak EDTA, cukry, takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol, przeciwjony tworzące sole, takie jak sodowy; kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko) i/lub niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak TWEEN™, PLURONICS™ lub glikol polietylenowy (PEG). Korzystne liofilizowane postacie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 opisano w światowym opisie patentowym, formalnie włączonym do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Postać według niniejszego wynalazku może również zawierać więcej niż jeden związek aktywny, jak jest to konieczne dla określonego leczonego wskazania, korzystnie związki o uzupełniających się aktywnościach, które nie wpływają niekorzystnie wzajemnie na siebie. Na przykład, może być pożądane dalsze dostarczenie przeciwciał, które wiążą się z EGFR, ErbB2 (np. przeciwciała, które wiąże się z innym epitopem na ErbB2), ErbB3, ErbB4 lub naczyniowym czynnikiem śródbłonkowym (VEGF) w jednym preparacie. Alternatywnie, lub dodatkowo, kompozycja może ponadto zawierać czynnik chemioterapeutyczny, czynnik cytotoksyczny, cytokinę lub czynnik hamujący wzrost. Takie cząsteczki są odpowiednio obecne w kombinacji w ilościach, które są skuteczne pod względem zamierzonego celu.

Składniki aktywne mogą być również uwięzione w mikrokapsułkach, przygotowanych na przykład technikami koacerwacji lub przez polimeryzację międzyfazową, na przykład odpowiednio mikrokapsułkach hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych oraz mikrokapsułkach poli-(metylometa-cylanowych)), w koloidalnych układach dostarczania leków (na przykład liposomach, mikrokuleczkach albuminowych, mikroemulsjach, nanocząstkach i nanokapsułkach) bądź w makroemulsjach. Takie techniki ujawniono w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 16, Osol, A., red. (1980).

Postacie przeznaczone do podawania in vivo muszą być jałowe. Osiąga się to w prosty sposób przez sączenie przez membrany do wyjaławiania przez sączenie.

PL 202 369 B1

Można przygotowywać preparaty o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują zawierające przeciwciało półprzepuszczalne macierze stałych polimerów hydrofobowych, mające postać ukształtowanych artykułów, np. błon bądź mikrokapsułek. Przykłady macierzy o przedłużonym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele (na przykład poli(2-hydroksyetylometakrylan) lub polialkohol winylowy, polilaktydy (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 3 773 919), kopolimery kwasu L-glutaminowego i γ-etylo-L-glutaminy, niedegradowalny octan etyleno-winylowy, degradowalne kopolimery kwas mlekowy-kwas glikolowy, takie jak LUPRON DEPOT™ (mikrokuleczki do iniekcji złożone z kopolimeru kwas mlekowy-kwas glikolowy i octanu leuprolidu) oraz kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy. O ile takie polimery, jak etylen-octan winylu i kwas mlekowy-kwas glikolowy umożliwiają uwalnianie w ciągu ponad 100 dni, niektóre hydrożele uwalniają białka w ciągu krótszych okresów. Gdy zamknięte w kapsułki przeciwciała pozostają w organizmie w ciągu długiego czasu, nogą ulegać denaturacji lub agregacji w wyniku ekspozycji na wilgoć w temperaturze 37°C, czego wynikiem jest utrata aktywności biologicznej i możliwe zmiany immunogenności. Zależnie od mechanizmu takiego procesu, można zaprojektować racjonalne strategie zapewniające stabilizację. Na przykład, jeśli stwierdzono, że mechanizm agregacji polega na tworzeniu międzycząsteczkowego wiązania S-S poprzez zamianę grup tiolowych na disiarczkowe, stabilizację można uzyskać przez modyfikację reszt sulfhydrylowych, liofilizację z roztworów kwaśnych, kontrolowanie zawartości wilgoci, stosowanie odpowiednich dodatków i opracowywanie specyficznych kompozycji macierzy polimerycznej.

V. Leczenie przeciwciałami skierowanymi przeciw ErbB2

Uważa się, że zgodnie z niniejszym wynalazkiem, przeciwciała skierowane przeciw ErbB2 można stosować do leczenia różnych stanów charakteryzujących się nadekspresją i/lub aktywacją receptora ErbB2.

Przykładowe stany lub zaburzenia obejmują nowotwory łagodne i złośliwe (np. raki nerek, wątroby, nerek, pęcherza moczowego, sutka, żołądka, jajnika, okrężnicy i odbytnicy, gruczołu krokowego, trzustki, płuc, sromu, tarczycy, wątroby; mięsaki, glejaki i różne nowotwory głowy i szyi); białaczki i nowotwory złośliwe tkanki limfatycznej, inne zaburzenia, takie jak zaburzenia neuronalne, neuroglejowe, astrocytarne, podwzgórzowe i inne gruczołowe, makrofagowe, nabłonkowe, zrębowe, blastoceliczne oraz zaburzenia zapalne, angiogenne i immunologiczne.

Przeciwciała według wynalazku podaje się pacjentowi będącemu człowiekiem zgodnie ze znanymi metodami, takimi jak podawanie dożylne, takie jak szybkie wstrzyknięcie lub przez ciągłą infuzję w ciągu dłuższego czasu bądź drogą domięśniową, dootrzewnową, domózgowo-rdzeniową, podskórną, dostawową, domaziówkową, doosłonkową, doustną, miejscową lub inhalacyjną. Korzystne jest dożylne lub podskórne podawanie przeciwciała.

Leczenie według niniejszego wynalazku obejmuje podawanie skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała pacjentowi, będącemu zwierzęciem lub człowiekiem, po którym w odstępach czasu następują kolejne dawki równe lub mniejsze, tak że uzyskuje się i utrzymuje podczas leczenia docelowe stężenie w surowicy. Korzystnie, dawki podtrzymujące podaje się jako szybkie wstrzyknięcia całej dawki, korzystnie przez podskórne szybkie podawanie całej dawki, co czyni leczenie dogodnym i efektywnym pod względem ekonomicznym dla pacjenta i pracowników służby zdrowia.

Jeśli pożądane jest łączne podawanie czynnika chemioterapeutycznego (innego niż antracyklina), łączne podawanie obejmuje jednoczesne podawanie, z zastosowaniem oddzielnych preparatów lub pojedynczego preparatu farmaceutycznego, oraz kolejne podawanie w dowolnej kolejności, przy czym korzystnie występuje okres, podczas którego oba (lub wszystkie) czynniki aktywne jednocześnie wywierają swoje aktywności biologiczne. Preparaty i schematy dawkowania takich czynników chemioterapeutycznych można stosować zgodnie z instrukcjami producentów lub jak określi empirycznie praktyk w tej dziedzinie. Preparaty i schematy dawkowania dla takiej chemioterapii opisano również w Chemotherapy Service, red. M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). Czynnik chemioterapeutyczny może poprzedzać lub następować po podawaniu przeciwciała, lub może być podawany jednocześnie z nim. Przeciwciało można łączyć ze związkiem antyhormonalnym, np. związkiem antyestrogennym, takim jak tamoksyfen lub antyprogesteronem, takim jak onapriston (patrz europejski opis patentowy numer 616 812), w dawkach znanych dla takich cząsteczek.

Może być również pożądane podawanie przeciwciał skierowanych przeciw innemu antygenowi związanemu z nowotworem, takich jak przeciwciał, które wiążą się EGFR, ErbB3, ErbB4 lub naczyniowym śródbłonkowym czynnikiem wzrostowym (VEGF). Alternatywnie, lub dodatkowo, pacjentowi można podawać jednocześnie dwa lub więcej przeciwciał skierowanych przeciw ErbB2. Niekiedy,

PL 202 369 B1 korzystne może być podawanie pacjentowi również jednej lub więcej cytokin. Przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 można podawać jednocześnie z czynnikiem hamującym wzrost. Na przykład, czynnik hamujący wzrost można podawać jako pierwszy, a następnie przeciwciało skierowane przeciw ErbB2. Jednakże, bierze się również pod uwagę podawanie jednoczesne lub podawanie najpierw przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2. Odpowiednimi dawkami czynnika hamującego wzrost są te, obecnie stosowane, i mogą być obniżane z powodu łącznego działania (synergii) czynnika hamującego wzrost i przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2.

Poza powyższymi schematami terapeutycznymi, pacjenta można również poddawać chirurgicznemu usunięciu komórek rakowych i/lub radioterapii.

Odpowiednie dawkowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 do zapobiegania lub leczenia choroby zależeć będzie od rodzaju leczonej choroby, jak zdefiniowano powyżej, ciężkości i przebiegu choroby, tego, czy przeciwciało podaje się w celach zapobiegawczych, czy leczniczych, wcześniejszego leczenia, historii klinicznej pacjenta i odpowiedzi na przeciwciało oraz od uznania lekarza prowadzącego. Przeciwciało odpowiednio podaje się pacjentowi w toku leczenia raz lub w seriach. Jeśli leczenie obejmuje serie podawań, po początkowej dawce lub dawkach następują dawki podtrzymujące w odstępach dniowych lub tygodniowych. Każda dawka podtrzymująca zapewnia taką samą lub mniejszą ilość przeciwciała w porównaniu z ilością przeciwciała podawaną w początkowej dawce lub dawkach.

Zależnie od rodzaju i ciężkości choroby, początkową proponowaną dawką do podawania pacjentowi jest około od 1 μg/kg do 15 mg/kg (np. 0,1-20 mg/kg) przeciwciała, zależnie od tego, na przykład, czy będzie to jedno czy więcej oddzielnych podań, czy też podawanie przez ciągłą infuzję. Typowa dawka dzienna może pozostawać w zakresie od około 1 μg/kg do 100 mg/kg lub więcej, zależnie od wymienionych powyżej czynników. Postęp tej terapii łatwo monitoruje się stosując konwencjonalne techniki i oznaczenia.

Zgodnie z wynalazkiem, schematy dawkowania mogą obejmować początkową dawkę przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 wynoszącą 6 mg/kg, 8 mg/kg lub 12 mg/kg podawaną przez infuzję dożylną lub podskórną, po której następują cotygodniowe dawki podtrzymujące wynoszące 2 mg/kg przez infuzję dożylną, dożylną szybką iniekcję całej dawki, infuzję podskórną lub podskórną szybką iniekcję całej dawki iniekcję. Jeśli pacjent dobrze tolerować przeciwciało, można skracać czas infuzji.

Alternatywnie, wynalazek obejmuje początkową dawkę wynoszącą 12 mg/kg przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, po której następują kolejne dawki podtrzymujące wynoszące 6 mg/kg raz na 3 tygodnie.

Inny schemat dawkowania obejmuje początkową dawkę wynoszącą 8 mg/kg przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, po której następują dawki wynoszące 6 mg/kg raz na 3 tygodnie.

Jeszcze inny schemat dawkowania obejmuje początkową dawkę wynoszącą 8 mg/kg przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, po której następują kolejne dawki podtrzymujące wynoszące 8 mg/kg raz na tydzień lub 8 mg/kg raz na 2 do 3 tygodni.

Jako schemat alternatywny, w każdym z dni 1, 2 i 3 można podawać początkowe dawki wynoszące 4 mg/kg przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, po których następują kolejne dawki podtrzymujące wynoszące 6 mg/kg raz na 3 tygodnie.

Dodatkowy schemat obejmuje początkową dawkę wynoszącą 4 mg/kg przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, po której następują kolejne dawki podtrzymujące wynoszące 2 mg/kg dwa razy na tydzień, przy czym dawki podtrzymujące są oddzielone o 3 dni.

Alternatywnie, wynalazek może obejmować cykl dawkowania, w którym podawanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 odbywa się 2-3 razy na tydzień w ciągu 3 tygodni. 3-tygodniowy cykl korzystnie powtarza się tak długo jak jest to konieczne dla osiągnięcia zahamowania objawów choroby.

Wynalazek obejmuje ponadto cykliczny schemat dawkowania, w którym podawanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 odbywa się codzienne w ciągu 5 dni. Zgodnie z wynalazkiem, cykl korzystnie powtarza się tak długo jak jest to konieczne dla osiągnięcia zahamowania objawów choroby. Dalsze informacje o odpowiednich dawkowaniach podano w Przykładach poniżej.

VI. Wyroby

W innym rozwiązaniu wynalazku, zapewnia się zestaw zawierający materiały użyteczne do leczenia opisanych zaburzeń. Zestaw obejmuje pojemnik, etykietę i ulotkę informacyjną. Odpowiednie pojemniki obejmują, na przykład, butelki, fiolki, strzykawki itp. Pojemniki mogą być utworzone z różnych materiałów, takich jak szkło lub plastik. Pojemnik zawiera kompozycję, która jest skuteczna w leczeniu stanu chorobowego i może posiadać jałowe miejsce dostępu (na przykład pojemnikiem

PL 202 369 B1 może być worek z roztworem do podawania dożylnego lub fiolka z korkiem, który można przebić igłę do iniekcji podskórnej). Co najmniej jednym czynnikiem aktywnym w kompozycji jest przeciwciało skierowane przeciw ErbB2. Etykieta na, lub dołączona do pojemnika wskazuje, że kompozycję stosuje się do leczenia wybranego stanu. Ponadto, wyrób może obejmować drugi pojemnik zawierający farmaceutycznie dopuszczalny bufor, taki jak sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanami, roztwór Ringera lub roztwór dekstrozy. Może on ponadto obejmować inne materiały pożądane z punktu widzenia komercjalnego lub użytkownika, obejmujące inne bufory, rozcieńczalniki, sączki, igły i strzykawki. Ponadto, wyrób może zawierać ulotkę informacyjną z instrukcjami stosowania, np. ostrzeżeniem, że kompozycja nie jest przeznaczona do stosowania z antracyklinowym czynnikiem chemioterapeutycznym, np. doksorubicyna lub epirubicyną.

Depozyt materiałów

Poniższe linie komórek hybrydom zdeponowano w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, Stany Zjednoczone Ameryki (ATCC):

Oznaczenie przeciwciała	Nr ATCC	Data depozytu
7C2	ATCC HB-12215	17 października 1996 r.
7F3 '	ATCC HB-12216	17 października 1996 r.
4D5	ATCC CRL 10464	24 maja 1990 r.
2C4	ATCC HB-12697	8 kwietnia 1999 r.

Dalsze szczegóły wynalazku zilustrowano poniższymi nieograniczającymi Przykładami.

P R Z Y K Ł A D Y

P r z y k ł a d 1: Przygotowywanie i skuteczność skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN®

Materiały i metody

Skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało monoklonalne. Skierowane przeciw ErbB2 mysie przeciwciało monoklonalne gG₁K, 4D5, specyficzne wobec zewnątrzkomórkowej domeny ErbB2, utworzono w sposób opisany w Fendly i in., Cancer Research, 50: 1550-1558 (1990) oraz światowym opisie patentowym numer 89/06692. Krótko, komórki NIH 3T3/HER2-3400 (w których zachodzi ekspresja około 1 x 10⁵ cząsteczek ErbB2/komórkę) otrzymane jak opisano w Hudziak i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 7158-7163 (1987) zebrano stosując sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 25 mM EDTA i zastosowano do immunizacji myszy BALB/c. Myszy otrzymywały dootrzewnowe iniekcje 10⁷ komórek w 0,5 ml PBS w tygodniach 0, 2, 5 i 7. Myszy o antysurowicach, które immunoprecypitowały wyznakowane ³²P ErbB2, otrzymywały dootrzewnowe iniekcje ekstraktu błonowego ErbB2 oczyszczanego na Sepharose z immobiliozowaną aglutyniną kiełków pszenicy (WBA) w tygodniach 9 i 13. Następnie stosowano dożylne iniekcje 0,1 ml preparatu ErbB2 i limfocyty śledzionowe poddawano fuzji z linią X63-Ag8.633 szpiczaka mysiego. Supernatanty hybrydom przeszukiwano pod kątem wiązania ErbB2 przez ELISA i radioimmunoprecypitację. Jako kontrolę o tym samym izotypie stosowano MOPC-21 (IgG1) (Cappel, Durham, NC).

Leczenie prowadzono humanizowaną wersją mysiego przeciwciała 4D5 (skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało HERCEPTIN^®). Humanizowane przeciwciało zmodyfikowano przez wstawienie regionów determinujących komplementarność mysiego przeciwciała 4D5 do zrębu konsensu ludzkiej immunoglobuliny IgG1 (IgG1) (Carter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 [1992]). Otrzymane w wyniku humanizowane przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw ErbB2 posiada wysokie powinowactwo do p185^HER2 (stała dysocjacji [Kd] = 0,1 mmola/litr), znacząco hamuje, in vitro i heteroprzeszczepach u ludzi, wzrost komórek raka sutka, które zawierają wysokie poziomy p185^HER2, indukują zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC) i stwierdzono, że jest aktywne klinicznie, jako pojedynczy czynnik, u pacjentów z przerzutowymi rakami sutka, w których zachodzi nadekspresja ErbB2, u których stosowano wcześniej leczenie. Skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało HERCEPTIN^® wytwarzane jest przez hodowaną na dużą skalę zmodyfikowaną technikami inżynierii genetycznej linię komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), które wydzielają przeciwciało do podłoża hodowlanego. Przeciwciało oczyszcza się podłoża hodowlanego CHO stosując standardowe metody chromatograficzne i filtracji. Każdą serię przeciwciała stosowanego w tych badaniach oznaczano w celu weryfikacji tożsamości, czystości i siły działania, jak również co do spełniania wymagań Food and Drug Administration pod względem jałowości i bezpieczeństwa.

Kryteria wybieralności. Pacjenci musieli spełniać wszystkie poniższe kryteria, aby byli dopuszczeni do badań:

- Przerzutowy rak sutka

PL 202 369 B1

- Nadekspresja onkogenu ErbB2 (HER2) (od 2+ do 3+, co określa się przez immunohistochemię lub fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH). [Ekspresję ErbB2 w nowotworze można określać przez analizę immunohistochemiczną, jak opisano uprzednio (Slamon i in., [1987] i [1989], supra), zestawu cienkich skrawków przygotowanych z bloczków utrwalonych w parafinie nowotworów pacjenta. Pierwszym, wykrywającym stosowanym przeciwciałem jest mysie przeciwciało monoklonalne 4D5, które posiada takie same CDR, jak humanizowane przeciwciało stosowane w leczeniu. Przyjmuje się, że w nowotworze zachodzi nadekspresja ErbB2, jeśli co najmniej 25% komórek nowotworowych wykazuje charakterystyczne wybarwienie błon pod względem p185^HER2].

- Dwuwymiarowo mierzalna zmiana chorobowa (włącznie z litycznymi uszkodzeniami kości) stwierdzona metodami radiograficznymi, badaniem fizykalnym lub na podstawie zdjęć

Mierzalną zmianę chorobową zdefiniowano jako dowolną masę odtwarzalnie mierzalną w dwóch prostopadłych do siebie średnicach przez badanie fizykalne, rentgenograficzne (zdjęcia przeglądowe), tomografię komputerową (CT), obrazowanie przez rezonans magnetyczny (MRI), badanie z wykorzystaniem ultradźwięków lub na podstawie zdjęć.

Za mierzalne nie uznawano przerzutów osteoblastycznych, wysięków opłucnowych lub puchliny brzusznej. Mierzalne uszkodzenia muszą mieć większą średnicę co najmniej 1 cm. Liczbę dających się oszacować miejsc przerzutowej choroby i liczbę uszkodzeń w dającym się oszacować miejscu (np. płucach) odnotowywano na odpowiednim formularzu raportu przypadku chorobowego (CRF). Jeśli występowała duża liczba uszkodzeń płucnych lub wątrobowych, monitorowano sześć największych uszkodzeń na miejsce.

- Zdolność do zrozumienia i gotowość do podpisania pisemnej zgody po wyjaśnieniu

- Kobiety > 18 lat

- Odpowiednie kandydatki do otrzymywania towarzyszącej chemioterapii cytotoksycznej, jak wykazano przez badania laboratoryjne oceniające funkcje hematologiczne, nerkowe, wątrobowe i metaboliczne.

Kryteria wykluczające. Pacjenci spełniający którekolwiek z poniższych kryteriów zostali wykluczeni z możliwości przystąpienia do badań:

- Wcześniejsza chemioterapia cytotoksyczna przerzutowego raka sutka

- Pacjenci mogli przechodzić wcześniejszą terapię hormonalną (np. tamoksyfenem) choroby przerzutowej lub terapię cytotoksyczną w układzie wspomagającym

- Współistniejący nowotwór złośliwy, który nie był poddawany leczeniu

- Stan czynnościowy <60% według skali Karnofsky'ego

Kobiety ciężarne lub karmiące piersią; kobiety, które potencjalnie mogą być w ciąży, o ile nie stosują skutecznej antykoncepcji, jak określono przez badaczy

- Dwustronny rak sutka (albo oba nowotwory pierwotne muszą wykazywać nadekspresję HER2 od 2+ do 3 +, albo miejsce przerzutu musi wykazywać nadekspresję HER2 od 2+ do 3+)

- Stosowanie czynników będących w trakcie badań lub nie posiadających licencji w ciągu 30 dni przed przystąpieniem do badań

- Klinicznie niestabilne lub nieleczone przerzuty do mózgu (np. wymagające radioterapii)

W oparciu o powyższe kryteria, wybrano i włączono do badań 469 pacjentek. Połowę pacjentek (po podziale na podstawie chemioterapii) wybrano losowo do dodatkowego otrzymywania skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® (patrz poniżej).

Podawanie i dawkowanie

Przeciwciało skierowane przeciw ErbB2

W dniu 0 dożylnie podawano dawkę 4 mg/kg humanizowanego przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 (HERCEPTIN^®, H) w ciągu okresu 90 minut. Począwszy od dnia 7, pacjentki co tydzień otrzymywały 2 mg/kg przeciwciała (dożylnie) w ciągu okresu 90 minut.

Chemioterapia

Pacjentki poddawano chemioterapii według jednego z dwóch schematów przez minimum sześć cykli, co zapewniało, że ich choroba nie postępowała: a) cyklofosfamid i doksorubicyna lub epirubicyna (AC), jeśli pacjentki nie otrzymywały leczenia antracyklinami w układzie wspomagającym, lub b) paklitaksel (T, TAXOL^®), jeśli pacjentki otrzymywały leczenie antracyklinami w układzie wspomagającym. Początkowa dawka skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® poprzedzała pierwszy cykl chemioterapii, według obu schematów, o 24 godziny. Kolejne dawki przeciwciała podawano bezpośrednio przed chemioterapią, jeśli początkowa dawka była dobrze tolerowana. Jeśli pierwsza dawka przeciwciała nie była dobrze tolerowana, kolejne infuzje nadal poprzedzały podawanie chemioterapii o 24 godziny. Pacjentkom umożliwiano kontynuowanie chemioterapii dłużej niż przez sześć

PL 202 369 B1 cykli, jeśli w opinii lekarza prowadzącego mogłyby nadal odnosić korzyści z otrzymywania takiego leczenia.

Cyklofosfamid (600 mg/m²) podawano albo przez wstrzyknięcie dożylne w ciągu okresu minimum 3 minut, albo przez infuzję w ciągu okresu maksimum 2 godzin.

Doksorubicynę (600 mg/m²) lub epirubicynę (75 mg/m²) podawano albo przez wolne wstrzyknięcie dożylne w ciągu okresu minimum 3-5 minut, albo przez infuzję w ciągu okresu maksimum 2 godzin, zgodnie z obowiązującym protokołem.

Paklitaksel (TAXOL^®) podawano w dawce 175 mg/m² w ciągu 3 godzin przez podawanie dożylne. Wszystkie pacjentki otrzymujące paklitaksel leczono wcześniej deksametazonem (lub jego równoważnikiem) w dawce 20 mg x 2, podawanym doustnie 12 i 6 godzin przed paklitakselem, difenhydraminą (lub jej równoważnikiem) w dawce 50 mg, podawaną dożylnie 30 minut przed paklitakselem, oraz dimetydyną (lub innym blokerem H2) w dawce 300 mg, podawaną dożylnie 30 minut przed paklitakselem.

Kryteria odpowiedzi

Choroba postępująca. Obiektywny dowód na wzrost o 25% lub więcej któregokolwiek z mierzalnych uszkodzeń. Choroba postępująca obejmuje również te przypadki, w których pojawiały się nowe uszkodzenia. Dla uszkodzeń kości, postęp definiuje się jako 25% wzrost pod względem obiektywnych pomiarów uzyskanych na podstawie zdjęć przeglądowych, CT, CT, MRI; nowe uszkodzenia objawowe nie spowodowane złamaniem; lub potrzeba radioterapii paliatywnej.

Odpowiedź pełna. Zanik wszystkich wykrytych radiograficznie i/lub wzrokowo guzów na minimum 4 tygodnie. Brak zmian chorobowych w skórze i ścianie klatki piersiowej należy potwierdzić przez biopsję.

Odpowiedź częściowa. Obniżenie o co najmniej 50% sumy średnic prostopadłych wszystkich mierzalnych uszkodzeń na okres minimum 4 tygodni. Nie mogą pojawić się żadne nowe uszkodzenia, ani nie może zwiększyć się wielkość któregokolwiek z uszkodzeń.

Odpowiedź słaba. Zmniejszenie od 25% do 49% sumy średnic prostopadłych wszystkich mierzalnych uszkodzeń. Nie mogą pojawić się żadne nowe uszkodzenia, ani nie może zwiększyć się wielkość któregokolwiek z uszkodzeń.

Choroba stabilna. Brak zmian większych niż 25% wielkości mierzalnych uszkodzeń. Nie mogą pojawić się nowe uszkodzenia.

Czas do postępu choroby (TTP) obliczano od początku terapii do postępu. Przedziały ufności dla częstości odpowiedzi obliczano stosując dokładną metodę pojedynczych proporcji (Fleiss, JL., Statistical Methods for Rates and Proportions (wyd. 2), Nowy Jork, NY, Wiley, 1981, str. 13-17).

Wyniki

Po upływie 10,5 miesięcy (mediana), długości czasu do postępu choroby (TTP w miesiącach) i częstości odpowiedzi (RR) wykazywały znaczący wzrost wpływu chemioterapeutycznego przez skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało HERCEPTIN^®, bez wzrostu ogólnych skutków ubocznych (AE).

T a b l i c a 1

Skuteczność skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^®

	Liczba pacjentek objętych badaniem	TTP (miesiące)	RR (%)	AE (%)
CRx	234	5,5	36,2	66
CRx+H	235	8,6*	62,00**	69
AC	145	6,5	42,1	71
AC+H	146	9,0	64,9	68
T	89	4,2	25,0	59
T+H	89	7,1	57,3	70

*p < 0,001 test logarytmicznej korelacji kolejności;

**p < 0,01 w teście X²;

CRx: chemioterapia

AC: leczenie antracykliną/cyklofosfamidem;

H: skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało HERCEPTIN^®; T: TAXOL^®

PL 202 369 B1

Zespół dysfunkcji mięśnia sercowego, podobny do tego obserwowanego dla antracykliny donoszono częściej w przypadku terapii kombinowanej (AC+H (18% stopień 3/4) niż samą AC (3%), T (0%) lub T+H (2%).

Dane te wskazują, że kombinacja leczenia przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2 z chemioterapią znacznie zwiększa korzyści kliniczne, jak oszacowano na podstawie częstości odpowiedzi i ocenie postępu choroby. Jednakże, z powodu podwyższonych wpływów ubocznych na serce doksorubicyny i epirubicyny, łączne stosowanie antracyklin z terapią przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2 jest przeciwskazane. Biorąc pod uwagę ryzyko i korzyści, wyniki przemawiają za leczeniem skierowanym przeciw ErbB2 przeciwciałem HERCEPTIN^® i paklitakselem (TAXOL^®), jeśli pożądany jest łączony schemat leczenia.

P r z y k ł a d 2: Farmakokinetyczne i farmakodynamiczne właściwości przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 (HERCEPTIN®)

Skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało HERCEPTIN® podawano przez dożylną infuzję pacjentkom wybranym zgodnie z kryteriami podanymi w Przykładzie 1. Początkową dawkę 4 mg/kg skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® podawano przez infuzję dożylną, a następnie stosowano kolejne infuzje dożylne dawki wynoszącej 2 mg/kg skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® co tydzień w ciągu kilku tygodni. Dwieście trzynaście pacjentek rozpoczęło ten schemat leczenia i stężenie leku w surowicy uzyskano w okresie dłuższym niż 8 tygodni dla mniej niż 90 pacjentek w powodu przerwania leczenia u pacjentek, u których wystąpił szybki postęp choroby. Z 213 pacjentek, które rozpoczęły leczenie, dane o obniżonym stężeniu surowicy były dostępne dla 80 pacjentek w tygodniu 12, dla 77 pacjentek w tygodniu 16, dla 44 pacjentek w tygodniu 20, dla 51 pacjentek w tygodniu 24, dla 25 pacjentek w tygodniu 28, dla 23 pacjentek w tygodniu 32 i dla 37 pacjentek w tygodniu 36.

_®

Obniżone stężenia w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN w tygodniach 0-36

Obniżone stężenia w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN® (pg/ml, średnia ± SE) od tygodnia 2 do tygodnia 36 wykreślono na Fig. 3 (ciemne kółka). Liczba pacjentów była dość stała, ponieważ dane dla pacjentek wykluczonych z programu z powodu gwałtownego postępu choroby wyłączono z tej analizy. Obniżone stężenie w surowicy wykazywało tendencję wzrostu w ciągu 12 tygodni, a po tym czasie wykazywało tendencję do utrzymywania plateau.

Obniżone i szczytowe stężenia w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN® w tygodniach 1-8

Niektóre dane dotyczące stężenia w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® były dostępne dla 212 spośród 213 pierwotnych pacjentek. Dane dotyczące obniżonego i szczytowego stężenia w surowicy, odzwierciedlające pierwszą infuzję skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® były dostępne dla 195 z 212 pacjentek. Dla siódmej infuzji, dane dotyczące obniżonego stężenia w surowicy były dostępne dla 137/212 pacjentek, a dane dotyczące szczytowego stężenia w surowicy były dostępne dla 114/212 pacjentek. Tablica 2 przedstawia podsumowanie statystyki dla obniżonych i szczytowych stężeń w surowicy w ciągu pierwszych 8 tygodni leczenia.

Próbki dla stężeń szczytowych pobierano krótko po zakończeniu podawania skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^®, próbki dla stężeń obniżonych pobierano przed kolejną dawką (tj. 1 tydzień później). Stężenia w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® określano w sposób ujawniony w niniejszym opisie.

T a b l i c a 2

Obniżone i szczytowe stężenia w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® w pierwszych 8 tygodniach leczenia (pg/ml)

Stężenie	Numer dawki	n	średnia	SD	Minimum	Maksimum
1	2	3	4	5	6	7
szczytowe	1	195	100,3	35,2	30,7	274,6
obniżone		195	25,0	12,7	0,16	60,7
szczytowe	2	190	74,3	31,3	20,8	307,9
obniżone		167	30,4	16,0	0,2	74,4
szczytowe	3	167	75,3	26,8	16,1	194,8
obniżone		179	33,7	17,9	0,2	98,2

PL 202 369 B1 cd. tablicy 2

1	2	3	4	5	6	7
szczytowe	4	175	80,2	26,9	22,2	167
obniżone		132	38,6	20,1	0,2	89,4
szczytowe	5	128	85,9	29,2	27,8	185,8
obniżone		141	42,1	24,8	0,2	148,7
szczytowe	6	137	87,2	32,2	28,9	218,1
obniżone		115	43,2	24,0	0,2	109,9
szczytowe	7	114	89,7	32,5	16,3	187,8
obniżone		137	48,8	24,9	0,2	105,2
szczytowe obniżone	8	133	95,6	35,9	11,4	295,6

Dane w Tablicy 2 sugerują, że występował wzrost obniżonego stężenia surowicy w czasie. Spośród wielu badanych pacjentek, u 18 pacjentek obniżone stężenie nie przekraczało 20 μg/ml od tygodnia 2 do tygodnia 8. Obniżone stężenie w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN® wynoszące 20 μg/ml było nominalnie docelowe dla tych badań w oparciu o wcześniejsze badania farmakologiczne na zwierzętach i analizy badań w próbach klinicznych.

Status odpowiedzi pacjentki oceniano w stosunku do stężenia w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^®. W tym celu, obliczono średnie stężenie w surowicy (średnia stężeń obniżonych i szczytowych) dla różnych czasów i status odpowiedzi pacjentki (gdzie status odpowiedzi pacjentki był określany przez niezależny Komitet Oceniający Odpowiedź). Wzrost stężenia w surowicy pomiędzy tygodniami 2 a 8 okazał się większy u pacjentek u których wystąpiła odpowiedź, niż u pacjentek u których brak było odpowiedzi, co sugeruje, że występuje współzależność pomiędzy statusem odpowiedzi a stężeniem w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^®. Analiza statystyczna (analiza wariancji) wartości obniżonego stężenia w surowicy w tygodniu 2 i średniej dla tygodnia 7 i 8 w odniesieniu do statusu odpowiedzi wskazywała na wysoce znaczącą współzależność pomiędzy statusem odpowiedzi a średnim obniżonym stężeniem w tygodniach 7 i 8 (p < 0,001). Wyniki wskazywały, że występowała istotna różnica pomiędzy obniżonym stężeniem w surowicy (średnia obniżonych stężeń w tygodniach 7 i 8) u pacjentek u których wystąpiła odpowiedź i u pacjentek u których brak było odpowiedzi: obniżone stężenia wynosiły 60 ± 20 μg/ml u pacjentek u których wystąpiła odpowiedź wobec 44 ± 25 μg/ml u pacjentek u których brak było odpowiedzi (średnia ± SD). Poziom nadekspresji HER2 i rodzaj miejsc przerzutów były związane ze znaczącymi różnicami obniżonego stężenia w surowicy. W tygodniu 2 pacjentki z nadekspresją HER2 2+ posiadały znacząco wyższe obniżone stężenia w surowicy (n = 40, średnia = 28,8 μg/ml, SD = 10,4) w porównaniu z pacjentkami z nadekspresją HER2 3+ (n = 155, średnia = 24,1 μg/ml, SD = 13,1). Ta różnica średnich obniżonych stężeń w surowicy w tygodniach 7 i 8 nie była już istotna statystycznie. Ponadto, w tygodniu 2, pacjentki z chorobą powierzchniową miały znacząco wyższe obniżone stężenia w surowicy (n = 12, 34,1 μg/ml, SD = 12) w porównaniu z pacjentkami z chorobą trzewną (n = 183, średnia 24,4 μg/ml, SD = 12,6). Ta różnica średnich obniżonych stężeń w surowicy w tygodniach 7 i 8 była istotna. Dane te wskazują, że wzrost obniżonego stężenia w surowicy pomiędzy tygodniami 2 i 7/8 występował u pacjentek z różnymi profilami choroby.

W kolejnych, w podobny sposób zaplanowanych badaniach, kobiety z rakiem piersi leczono stosując dawkę uderzeniową wynoszącą 8 mg/kg, po której następowały dawki podtrzymujące wynoszące 4 mg/kg co tydzień. Wyniki tych wstępnych badań na ludziach wskazywały, że schemat dawka uderzeniowa 8 mg/kg: cotygodniowa dawka podtrzymująca 4 mg/kg był skuteczny pod względem zmniejszania objętości nowotworów u pacjentek.

Dane ujawnione w przykładzie wskazują, że zastosowanie pierwszej uderzeniowej dawki przeciwciała, tak że szybciej osiąga się docelowe stężenie w surowicy, może wiązać się z polepszeniem wyników.

P r z y k ł a d 3: Dożylne szybkie podawanie dawki i podskórna infuzja skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN® skutecznie zmniejszają objętość nowotworów u myszy

Badano skuteczność podawania przez infuzję lub szybkie podawanie dawki humanizowanego przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 (HERCEPTIN^®, przygotowywanie patrz Przykład 1) albo dożylnie, albo podskórnie. Celem tych badań było stwierdzenie, czy podawanie podskórne było odpowiednie,

PL 202 369 B1 oraz czy dogodne podawanie przez szybkie podskórne wstrzyknięcie dawki było użyteczne w leczeniu przerzutowego raka sutka u zwierząt zainokulowanych linią komórek, w których zachodzi nadekspresja genu HER2. Wyniki, szczegółowo przedstawione poniżej, wykazują, że dożylne i podskórne infuzje i podawanie leku przez szybkie wstrzyknięcie stanowią odpowiednią metodologię leczenia.

Badania w modelu myszy „nude”, które zawierają ludzką linię komórek raka sutka, w których naturalnie zachodzi nadekspresja genu HER2 (BT-474M1, pochodzące od komórek BT-474, numer dostępu ATCC HTB-20), porównujące objętość nowotworów jako funkcję szybkiego dożylnego podawania dawki w stosunku do infuzji podskórnej, przeprowadzono w następujący sposób. W pierwszym badaniu, samice pozbawionych grasicy myszy „nude” nu nu w wieku 7-9 tygodni, otrzymano z Taconic Inc (Germantown, NY). W celu pobudzenia rozwoju nowotworu, każdą mysz zainokulowano podskórnie 3 x 10⁶ komórek BT474M1, zawieszonych w Matrigel™. Gdy guzki nowotworów osiągnęły objętość około 100 mm³, zwierzęta losowo podzielono na 4 grupy traktowania. Grupy leczono zgodnie z Tablicą 3.

T a b l i c a 3

Grupy zwierząt i dawki do porównywania dożylnej szybkiej iniekcji dawki i infuzji podskórnej

Grupa, dawka, przeciwciało	Docelowe stężenie w surowicy pg/ml	Droga podawania	Dawka uderzeniowa (mg/kg)	Dawka podtrzymująca
1- kontrola, rhuMAb E25	20	LD dożylnie i infuzja podskórna	2,20	0,250 mg/ml (płyn do infuzji)
2 - niska dawka podskórna rhuMAb HER2	1	LD dożylnie i infuzja podskórna	0,313	0,050 mg/ml (płyn do infuzji)
3 - wysoka dawka podskórna rhuMAb HER2	20	LD dożylnie i infuzja podskórna	6,25	1,00 mg/ml (płyn do infuzji)
4 - doż ylnie wiele dawek rhuMAb HER2	20 (obniżone)	LD i MD dożylnie	4,00	2 mg/kg/tydzień (dożylna szybka iniekcja)

LD = dawka uderzeniowa, MD = dawka podtrzymująca

Stężenie w płynie infuzyjnym obliczano tak, aby uzyskać docelowe stężenie w surowicy przy zastosowaniu minipompy osmotycznej Alzer^® (Alza Corp., Palo Alto, CA).

Zwierzęta eksponowano na estrogen przez wszczepienie podskórnie tabletki estrogenów o przedłużonym uwalnianiu 9 dni przed rozpoczęciem dawkowania w celu pobudzenia wzrostu przeszczepionych komórek nowotworowych. Zwierzęta inokulowano komórkami BT474M1 8 dni przed rozpoczęciem leczenia i umożliwiano wzrost nowotworów. Następnie zwierzęta traktowano kontrolnym przeciwciałem E25 (niespecyficznym wobec receptora HER2, ale należącym do klasy monoklonalnych IgG) lub testowanym przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2, HERCEPTIN^®, jak wskazano w Tablicy 3. Poziomy dawkowania wybrano w taki sposób, aby osiągnąć docelowe stężenia HERCEPTIN^®, albo 1 pg/ml lub 20 pg/ml, przez podskórną infuzję przez pompę infuzyjną lub przez dożylną szybką iniekcję dawki. Badane grupy poddawano traktowaniu do dnia 35. Stężenie w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® mierzono co tydzień (bezpośrednio przed podawaniem dawki w grupie 4), stosując 3 myszy/grupę/punkt czasowy. Stężenie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 określano zgodnie ze sposobem ujawnionym w niniejszym opisie, obejmującym standardowe techniki. Objętości nowotworów w badaniu, dla którego dane przedstawiono w tablicy poniżej, mierzono dwa dni przed rozpoczęciem dawkowania i dwa razy w tygodniu od dnia 6 do dnia 35. Nowotwory mierzono w trzech wymiarach i objętości wyrażano w mm³. Skuteczność określano przez statystyczne porównanie (ANOVA) objętości nowotworów testowanych zwierząt w stosunku do nieleczonych zwierząt kontrolnych.

Jak przedstawiono w Tablicy 4 poniżej, leczenie myszy, posiadających nowotwory BT474M1, _® skierowanym przeciw ErbB2 przeciwciałem HERCEPTIN^® z zastosowaniem sposobu wskazanego dawkowania znacząco hamowało wzrost nowotworów. Wszystkie grupy leczone HERCEPTIN^® wykazywały podobne hamowanie wzrostu nowotworów w stosunku do grupy kontrolnej. Nie obserwowano odpowiedzi zależnej od dawki.

PL 202 369 B1

T a b l i c a 4

Porównanie podawania przez infuzję podskórną i szybką iniekcję dożylną dawki

Grupa badana	Objętość nowotworu (mm³), dzień 35, (n = 14)	Objętość nowotworu (pole powierzchni pod krzywą), dzień 6 - dzień 35 (n = 13)	Stężenie HERCEPTIN® w surowicy ^g/ml, dzień 27, (n = 3)
kontrolna infuzja podskórna	764 ±700	5650 ± 4700	4,16 ± 1,94
infuzja podskórna (niska dawka)	80,6 ± 158	1610±1250	2,11 ± 1,74
infuzja podskórna (wysoka dawka)	31 ± 75,6	1440±1140	22,1 ± 5,34
dożylna szybka iniekcja dawki*	49,7 ± 95,7	2150±1480	21,7 ± 17,1**

* dawka uderzeniowa 4,0 mg/kg i dawka podtrzymująca 2,0 mg/kg/tydzień ** przed podaniem dawki (obniżone stężenie w surowicy bezpośrednio przed dawką podtrzymującą)

Wyniki przedstawione w tablicy powyżej wskazują, że w badaniu tym utrzymywanie stężenia w surowicy wynoszącego około 2 μg/ml było równie skuteczne, jak stężenia 20 μg/ml. Wyniki wskazywały, że podawanie dawek przez infuzję podskórną było równie skuteczne, jak podawanie dawek przez szybką dożylną iniekcję i pozwalało uzyskiwać podobne obniżone stężenia w surowicy. Wyniki wskazują również, że badane poziomy dawek znajdują się w górnej części krzywej dawka-odpowiedź w tym modelu, oraz że podskórne podawanie dawek jest skuteczne w leczeniu raka sutka. A zatem, podskórne podawanie dawek podtrzymujących jest odpowiednie jako część schematu leczenia skierowanym przeciw ErbB2 przeciwciałem HERCEPTIN^®.

P r z y k ł a d 4: Szybkie podawanie dożylne i szybkie podawanie podskórne skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN® skutecznie zmniejszają objętość nowotworów u myszy

Szybkie podawanie podskórne jest wygodne i efektywne z ekonomicznego punktu widzenia dla pacjenta i pracowników służby zdrowia. Wyniki badania ujawnionego w tym przykładzie wskazują, że szybkie podawanie podskórne było równie skuteczne, jak szybkie podawanie dożylne pod względem zmniejszania wielkości nowotworu raka sutka u myszy.

Badanie to przeprowadzono jak ujawniono w niniejszym opisie w Przykładzie 3 dla porównania podawania przez szybką iniekcję dożylną i szybką iniekcję podskórną. Jeden dzień przed inokulacją komórek nowotworowych podskórnie wprowadzono wszczep estrogenów o przedłużonym uwalnianiu, jak opisano w Przykładzie 3. Sześć dni po inokulacji komórek nowotworowych przeprowadzono początkowy pomiar nowotworów. Siedem dni po inokulacji komórek nowotworowych podano pierwszą dawkę przeciwciała kontrolnego lub skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^®. Grupy zwierząt, drogę podawania, dawkę uderzeniową i dawki podtrzymujące podano w Tablicy 4. Zwierzętom podawano dawki raz w tygodniu w ciągu 4 tygodni.

T a b l i c a 5

Grupy zwierząt i dawki do porównywania podawania przez szybką dożylną iniekcję i szybką podskórną iniekcję

Grupa	Droga podawania	Dawka uderzeniowa (mg/kg)	Dawka podtrzymująca (mg/kg/tydzień)	n
1 - kontrola, rhuMAb E25	IV	8	4	10
2 - rhuMAb HER2	IV	2	1	10
3 - rhuMAb HER2	IV	4	2	10
4 - rhuMAb HER2	IV	8	4	10
5 - rhuMAb HER2	SC	4	2	10

IV = dożylna;

SC = podskórna; n = liczba zwierzą t na grup ę

PL 202 369 B1

Myszy poddawano traktowaniu zgodnie z informacjami zawartymi w Tablicy 4 stosując techniki ujawnione w Przykładzie 3. Stężenie w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^®mierzono bezpośrednio przed każdą cotygodniową dożylną dawką podtrzymującą zgodnie z procedurą opisaną w niniejszym opisie i z zastosowaniem standardowych technik. Stężenie w surowicy kontrolnego przeciwciała E25 określano zgodnie ze standardowymi technikami oznaczeń immunologicznych. Tablica 6 _® przedstawia wzrost w czasie stężeń w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^®.

T a b l i c a 6

Szybkie podawanie dożylne w stosunku do szybkiego podawania podskórnego: stężenie skierowanego przeciw

ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN® w surowicy, Stężenie w surowicy, μg/ml

Grupa badana (podawanie, MD)	Dzień 0 Średnia (SD)	Dzień 7 Średnia (SD)	Dzień 14 Średnia (SD)	Dzień 21 Średnia (SD)
1 - kontrola, rhuMAb E25	0	25,9	34,6	38,5
(IV, 4 mg/kg)	(0)	(8,29)	(11,2)	(14,4)
2 - rhuMAb HER2	0	4,96	8,55	8,05
(IV, 1 mg/kg)	(0)	(3,79)	(5,83)	(4,67)
3 - rhuMAb HER2	0	13,4	18,9	22,6
(IV, 2 mg/kg)	(0)	(9,24)	(12,0)	(9,21)
4 - rhuMAb HER2	0	29,6	37,7	46,2
(IV, 4 mg/kg)	(0)	(13,5)	(14,4)	(13,8)
5 - rhuMAb HER2	0	12,5	16,9	17,6
(SC, 2 mg/kg)	(0)	(7,33)	(10,2)	(10,7)

n = 10 dla na punktów czasowych w dniach 0, 7, n = 9 dla dnia 21

Tablica 7 przedstawia względną skuteczność dożylnego szybkiego podawania i podskórnego szybkiego podawania dla grup 1-5, które osiągnęły przedstawione w Tablicy 7 stężenia przeciwciała w surowicach. W badaniu tym skuteczność mierzono jako zmniejszanie objętości nowotworu. Objętość nowowtworu mierzono dwa razy w tygodniu.

T a b l i c a 7

Porównanie skuteczności, mierzonej jako zmiana objętości nowotworu, skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® przy podawaniu przez dożylną szybką iniekcję i podskórną szybką iniekcję, Średnia (SD)

Grupa badana (podawanie, MD)	Objętość nowotworu dzień 6, _mm ³	Objętość nowotworu dzień 28, _mm ³	Objętość nowotworu dzień 31, _mm ³	Dzień 6-dzień 31* pola powierzchni pod krzywą objętości nowotworu, _mm ³	Szybkość wzrostu nowotworu jako Log (TM + 1)
1 - IV kontrola	321	1530	1630	13600	0,0660
	(190)	(1040)	(1170)	(7230)	(0,00200)
2 - IV	297	175	151	4690	-0,0505
Herceptin 1 mg/kg	(130)	(215)	(188)	(1400)	(0,142)
3 - IV	269	75,7	73,6	3510	-0,0608
Herceptin 2 mg/kg	(129)	(92,4)	(84,5)	(1220)	(0,110)
4 - IV	272	25,3	25,8	2880	-0,0810
Herceptin 4 mg/kg	(117)	(75,9)	(72,9)	(1230)	(0,0859)
5 - SC	268	76,2	90,4	3230	-0,0304
Herceptin 2 mg/kg	(117)	(98,8)	(105)	(1440)	(0,104)

N = 10 dla każ dego punktu czasowego

TM = wymiar nowotworu

IV = dożylnie

SC = podskórnie

MD = dawka podtrzymująca *Dzień 17 wyłączono z powodu błędu pomiaru

PL 202 369 B1

Szybkość wzrostu nowotworu obliczano w dniach 21-31 jako Log (TM + 1). Polem powierzchni pod krzywą jest pole powierzchni poniżej wykresu objętości nowotworów wobec czasu.

Figury 4A i 4B są graficznymi wykresami zmian objętości nowotworów w czasie, niektóre z tych danych znajdują się w Tablicy 7. Fig. 4A jest liniowym wykresem objętości nowotworów wobec czasu. Fig. 4 jest półlogarytmicznym wykresem tych samych danych, umożliwiającym wyraźniejsze przedstawienie punktów testu. Dane w Tablicy 7 i na Fig. 4A i 4B wskazują, że chociaż nie obserwowano zależnej od dawki odpowiedzi w grupach traktowanych HERCEPTIN^®, podawanie dawek przez szybką iniekcję podskórną było równie skuteczne, jak podawanie dawek przez szybką iniekcję dożylną i pozwalało uzyskiwać podobne obniżone stężenia w surowicy.

P r z y k ł a d 5: Schematy dożylnego i podskórnego podawania przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2

Zgodnie z wynalazkiem, sposoby podawania przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 (np. HERCEPTIN^®) obejmują większą początkową dawkę uderzeniową leku w celu uzyskania docelowego stężenia w surowicy w ciągu około 4 tygodni lub mniej, korzystnie 3 tygodni lub mniej, korzystniej 2 tygodni lub mniej, a najkorzystniej 1 tygodnia lub mniej, włącznie z 1 dniem lub mniej. Zgodnie z wynalazkiem, po tym początkowym dawkowaniu następuje dawkowanie podtrzymujące docelowe stężenie w surowicy dzięki kolejnym dawkom równej lub mniejszej ilości. Zaletą sposobów według wynalazku jest to, że dawkowanie podtrzymujące może odbywać się rzadziej i/lub przez iniekcję podskórną, czyniąc schematy leczenia według wynalazku dogodnymi i efektywnymi z ekonomicznego punktu widzenia dla pacjenta i pracowników służby zdrowia podających przeciwciało. Ponadto, schemat podskórnego podawania dawki podtrzymującej można przerwać, stosując podawanie dożylne (takie jak infuzja), jeśli chemioterapia jaką otrzymuje pacjent wymaga podawania innych leków przez iniekcję dożylną.

Dla sprawdzenia poniższych schematów dawkowania, osobników ludzkich wybiera się zgodnie z kryteriami ujawnionymi w Przykładzie 1 powyżej. Liczba dawek początkowych wynosi jedną lub więcej dawek wystarczających do uzyskana skutecznego docelowego stężenia w surowicy w ciągu około 4 tygodni lub mniej, korzystnie 3 tygodni lub mniej, korzystniej 2 tygodni lub mniej, a najkorzystniej 1 tygodnia lub mniej, włącznie z 1 dniem lub mniej. Liczba dawek podtrzymujących może wynosić jedną lub więcej dawek wystarczających do uzyskania zahamowania objawów choroby, takich jak obniżenie objętości nowotworu. Dawki podtrzymujące są równe lub mniejsze niż początkowa dawka lub dawki, zgodnie z celem wynalazku podawania skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® według schematów zapewniających większą początkową dawkę uderzeniową. Ujawnione w niniejszym opisie szczegółowe schematy podawania leku są reprezentatywne dla wynalazku i nie należy ich traktować jako ograniczające.

W jednej próbie, początkową dawkę 6 mg/kg, 8 mg/kg lub 12 mg/kg skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® podaje się pacjentowi przez iniekcję dożylną lub podskórną. Dawki początkowe (dawki uderzeniowe) podaje się przez infuzję dożylną lub szybką dożylną iniekcję, bądź, korzystnie, podskórną szybką iniekcję. Korzystnie, uzyskuje się docelowe obniżone stężenie w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN®, wynoszące około 10-20 μg/ml (średnio dla wszystkich pacjentów w grupie traktowania), i utrzymuje się dzięki kolejnym dawkom przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, które są równe lub mniejsze niż dawka początkowa. W jednym sposobie, docelowe obniżone stężenie w surowicy osiąga się i utrzymuje przez podawanie raz w tygodniu 2 mg/kg skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® przez iniekcję dożylną lub podskórną w ciągu co najmniej 8 tygodni. Alternatywnie, w tym i dowolnym ujawnionym w niniejszym opisie schemacie dawkowania do podawania kolejnych dawek podtrzymujących stosuje się podskórną ciągłą infuzję z zastosowaniem pompy podskórnej.

W innym sposobie, początkową (pierwszą uderzeniową) dawkę wynoszącą 8 mg/kg skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® podaje się przez iniekcję dożylną (infuzję lub szybką iniekcję) lub przez podskórną szybką iniekcję. Po niej następują dożylne szybkie iniekcje, infuzja dożylna, infuzja podskórna lub podskórna szybka iniekcja dawki wynoszącej 6 mg/kg w odstępach 3 tygodni dla utrzymania obniżonego stężenia w surowicy wynoszącego około 10-20 μg/ml średnio dla całej grupy traktowania.

W innym sposobie, początkową (pierwszą uderzeniową) dawkę 12 mg/kg skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® podaje przez iniekcję dożylną (infuzję lub szybką Iniekcję) lub przez podskórną szybką iniekcję. Po niej następują dożylne szybkie iniekcje, infuzja dożylna, infuzja podskórna lub podskórna szybka iniekcja dawki wynoszącej 6 mg/kg w odstępach 3 tygodni dla utrzymania obniżonego stężenia w surowicy wynoszącego około 10-20 μg/ml.

PL 202 369 B1

W jeszcze innym sposobie, początkową (pierwszą uderzeniową) dawkę 8 mg/kg skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® podaje się przez dożylną infuzję lub szybką iniekcję lub, korzystnie, przez podskórną szybką iniekcję bądź infuzję. Po niej następuje podawanie dawki wynoszącej 8 mg/kg na tydzień lub 8 mg/kg na 2-3 tygodnie dla utrzymania obniżonego stężenia w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® wynoszącego około 10-20 pg/ml. Dawki podtrzymujące podaje się przez dożylną infuzję lub szybką iniekcję lub, korzystnie, przez podskórną infuzję bądź szybką iniekcję.

W innym sposobie, początkową dawką uderzeniową jest seria iniekcji dożylnych lub podskórnych, na przykład jednej w każdym z dni 1, 2 i 3, co najmniej 1 mg/kg dla każdej iniekcji (gdzie ilość przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 podawanych łącznie w początkowych iniekcjach jest większa niż 4 mg/kg), po czym następują podtrzymujące dawki wynoszące 6 mg/kg raz na 3 tygodnie dla utrzymania docelowego obniżonego stężenia w surowicy (na przykład około 10-20 pg/ml) skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^®. Dawki podtrzymujące podaje się przez dożylną infuzję lub szybką iniekcję bądź przez podskórną infuzję lub podskórną szybką iniekcję.

W jeszcze innym sposobie, dawkę uderzeniową podaje się przez dożylną infuzję co najmniej 1 mg/kg, korzystnie 4 mg/kg, w każdym z pięciu kolejnych pięciu dni, po czym następują powtórzenia tego cyklu dostateczną liczbę razy do uzyskania zahamowania objawów choroby. Po początkowej dawce lub dawkach, kolejne dawki można podawać przez podskórną infuzję lub szybką iniekcję, jeśli są one tolerowane przez pacjenta. Takie podskórne podawanie jest dogodne i efektywne pod względem ekonomicznym dla pacjenta i podających pracowników służby zdrowia.

W jeszcze innym sposobie, skierowane przeciw ErbB2 przeciwciało HERCEPTIN^® podaje się początkowo jako co najmniej 2 infuzje dożylne na tydzień w ciągu trzech tygodni, a następnie powtarza się ten cykl dla utrzymania skutecznego obniżonego stężenia w surowicy skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^®. Dawka przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 wynosi co najmniej 4 mg/kg, korzystnie co najmniej 5 mg/kg. Podtrzymujące podawania leku mogą być dożylne lub podskórne.

Jeśli zwierzę lub pacjent toleruje przeciwciało podczas i po dawce początkowej, podawanie kolejnych dawek może być podskórne, co zapewnia pacjentowi i pracownikom służby zdrowia dogodność i efektywność pod względem ekonomicznym.

W badaniach na zwierzętach, po początkowej dawce wyższej niż 4 mg/ml, korzystnie wyższej niż 5 mg/ml, podawanej przez iniekcję dożylną lub podskórną, następują podskórne szybkie iniekcje 2 mg/kg dwa razy na tydzień (oddzielone o 3 dni) dla utrzymania obniżonego stężenia w surowicy wynoszącego około 10-20 pg/ml. Ponadto, jeśli wiadomo, że zwierzę lub pacjent toleruje przeciwciało, początkowa dawka skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® może ewentualnie i korzystnie być podawana przez podskórną szybką iniekcję, po której następują podtrzymujące iniekcje podskórne.

Chociaż docelowe stężenia w surowicy ujawniono w niniejszym opisie w celu porównania badań na zwierzętach i próbach z udziałem ludzi, docelowe stężenia w surowicy w zastosowaniach klinicznych mogą być inne. Ujawnienia podane w niniejszym opisie stanowią wskazówkę dla użytkownika przy wyborze schematu podawania leku obejmującego dawkę uderzeniową, który zapewni skuteczne docelowe obniżone stężenie w surowicy.

Ujawnione w niniejszym opisie sposoby według wynalazku ewentualnie obejmują podawanie skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® w kombinacji z czynnikiem chemioterapeutycznym (innym niż pochodna antracyklinowa) dla uzyskania zahamowania objawów choroby. Czynnik chemioterapeutyczny można podawać ze skierowanym przeciw ErbB2 przeciwciałem HERCEPTIN^®lub osobno i zgodnie z odrębnym schematem dawkowania. Na przykład, wynalazek obejmuje podskórne podawanie skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® z TAXOL^®. Ponadto, dożylną lub podskórną iniekcję 8 mg/kg skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^®, po której następuje dożylna lub podskórna iniekcja 6 mg/kg skierowanego przeciw ErbB2 przeciwciała HERCEPTIN^® co 3 tygodnie, podaje się w kombinacji z czynnikiem chemioterapeutycznym, takim jak taksan (np. paklitaksel, 175 mg/m² co 3 tygodnie) lub pochodna antracyklinowa (np. doksorubicyna, 60 mg/m², lub epirubicyna, 75 mg/m², co 3 tygodnie). Ewentualnie, jeśli podaje się pochodną antracyklinową, podaje się również czynnik chroniący serce (np. 600 mg/m² cyklofosfamidu co 3 tygodnie). W innej terapii kombinowanej, przeciwciało skierowane przeciw ErbB2 podaje się w dawce uderzeniowej większej niż 4 mg/kg, korzystnie większej niż 5 mg/kg, a korzystniej co najmniej 8 mg/kg. Po dawce uderzeniowej następują podtrzymujące dawki co najmniej 2 mg/kg co tydzień, korzystnie 6 mg/kg

PL 202 369 B1 co trzy tygodnie. Terapia kombinowana obejmuje podawanie taksanu z przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB2. Zgodnie z jednym rozwiązaniem wynalazku, taksanem jest paklitaksel i podaje się do w dawce 70-100 mg/m²/tydzień. Zgodnie z innym rozwiązaniem wynalazku, taksanem jest docetaksel i podaje się go w dawce 30-70 mg/m²/tydzień.

P r z y k ł a d 6: HERCEPTIN® podawane dożylnie co trzy tygodnie w kombinacji z paklitakselem

Zalecana obecnie dawka HERCEPTIN® wynosi 2 mg/kg raz w tygodniu. HERCEPTIN® podawać się będzie pacjentkom co trzy tygodnie zamiast co tydzień, wraz z paklitakselem (175 mg/m² co trzy tygodnie). Symulacja proponowanego schematu leczenia sugeruje, że obniżone stężenia w surowicy wynosić będą 17 μg/ml, pozostając w zakresie (10-20 μg/ml) docelowego obniżonego stężenia w surowicy HERCEPTIN^® podawanej dożylnie z poprzednich prób klinicznych. Po ocenie parametrów farmakokinetycznych u pierwszych 12 pacjentek, jeśli ekspozycja okaże się niewłaściwa, to dla pozostałych 12 pacjentek dawka zostanie zwiększona do 8 mg/kg co trzy tygodnie.

Kryteria włączenia

1) Kobiety w wieku > 18 lat

2) Histologicznie potwierdzony przerzutowy rak sutka z nadekspresją ErbB2

3) Pacjentki, u których dopiero rozpoznano chorobę przerzutową

4) Wykazują stan czynnościowy > 70% według skali Karnofsky'ego

5) Dają pisemną zgodę po wyjaśnieniu przed każdą konkretną badawczą procedurą, ze świadomością, że pacjent posiada prawo wycofania się z badania w dowolnym czasie, bez uprzedzenia.

Kryteria wykluczające

1) Kobiety ciężarne lub karmiące piersią

2) Kobiety, które potencjalnie mogą być w ciąży, o ile nie (1) przeszły sterylizacji chirurgicznej lub (2) stosują odpowiednich sposobów antykoncepcji, takich jak doustne środki antykoncepcyjne, wkładki domaciczne lub metody mechaniczne antykoncepcji łącznie z żelem plemnikobójczym.

3) Kliniczne lub radiologiczne dowody na przerzuty do ośrodkowego układu nerwowego

4) Historia jakiejkolwiek istotnej choroby serca

5) LVEF < 50%

6) Brak wcześniejszego leczenia taksanem w dowolnym układzie traktowania.

7) Którakolwiek z poniższych nieprawidłowości pod względem podstawowych wartości hematologicznych:

- Hb poni ż ej 9 g/dl

- białe krwinki poniżej 3,0 x 10⁹/litr

- granulocyty poniżej 1,5 x 10⁹/litr

- płytki krwi poniżej 100 x 10⁹/litr

8) Którakolwiek z poniższych nieprawidłowości w podstawowych testach funkcjonowania wątroby:

- bilirubina surowicy powyżej 1,5 x ULN (górna granica normy)

- ALT i AST powyżej 2,5 x ULN (powyżej 4,0 x ULN w przypadku przerzutów do wątroby lub kości)

Alkaliczna fosfataza powyżej 2,5 x ULN (powyżej 4,0 x ULN w przypadku przerzutów do wątroby lub kości)

9) Poniższe nieprawidłowości w podstawowych testach funkcjonowania nerek:

- kreatynina w surowicy powyżej 1,5 x ULN

10) Historia innych poważnych stanów zdrowotnych, które mogłyby uniemożliwić udział pacjenta w badaniach.

HERCEPTIN® - Dawka uderzeniowa i schemat: 8 mg/kg dla pierwszej dawki. Dawka podtrzymująca i schemat: 6 mg/kg co 3 tygodnie.

Paklitaksel - 175 mg/m² dożylnie co 3 tygodnie x 6 cykli jako infuzję w ciągu 3 godzin.

UWAGA: Podczas pierwszego cyklu stosowania, paklitaksel będzie podawany 8 godzin przed HERCEPTIN^® w celu określenia farmakokinetyki samego paklitakselu. HERCEPTIN^® będzie podawane 8 godzin po paklitakselu tylko w pierwszym cyklu. W kolejnych cyklach stosowania, HERCEPTIN^®będzie podawane przed paklitakselem.

Całkowity czas trwania tego badania wynosi 18 tygodni. Osobnicy poddawani badaniu otrzymają łącznie do 6 dawek HERCEPTIN^®. Po otrzymaniu przez ostatniego osobnika ostatniego cyklu paklitakselu zbieranie danych do analizy bezpieczeństwa i farmakokinetycznej zostanie zakończone i badanie zamknie protokół określonego sposobu leczenia. Osobnicy biorący udział w badaniach mogą nadal otrzymywać HERCEPTIN^® +/- paklitaksel według uznania prowadzącego badania.

PL 202 369 B1

Uważa się, że powyższy schemat dawkowania będzie skuteczny w leczeniu przerzutowego raka sutka pomimo, że HERCEPTIN^® podaje się rzadko pacjentowi.

Chociaż przedstawione i szczegółowo ujawnione w niniejszym opisie określone aspekty i rozwiązania wynalazku są zupełnie wystarczające do zapoznania z celami i zaletami wynalazku, powinno być zrozumiałe, że stanowią one jedynie ilustrację dla niektórych z obecnie korzystnych rozwiązań wynalazku, oraz że nie jest zamiarem, aby ograniczały one w jakikolwiek sposób szczegóły sposobów i wyrobów inaczej niż to opisano w dołączonych zastrzeżeniach. Ujawnienia wszystkich cytowanych w opisie prac formalnie włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

Lista sekwencji <110> Genentech, Inc.

<120> Dawkowanie przy leczeniu przeciwciałami skierowanymi przeciw Erb2B <130> P1775R1PCT <141> 2000.08.25 <150> US 60/151 018 <151> 1999.08.27 <150> US 60/213 822 <151> 2000.06.23 <160> 15 <210> 1 <211> 166 <212> białko <213> Homo sapiens <400> 1

Cys 1

Thr

Gly

Thr Asp 5

Met

Lys

Leu

Arg

Leu 10

Pro

Ala

Ser

Pro

Glu 15

20 Thr

His

Leu

Asp

Met

Leu

Arg

His

Leu

Tyr

Gin

Gly

Cys

Gin

Val

20

25

30

Val

Gin

Gly

Asn

Leu

Glu

Leu

Thr

Tyr

Leu

Pro

Thr

Asn

Ala

Ser

35

4 0

45

PL 202 369 B1

Leu Ser Phe Leu Gin Asp Ile Gin Glu Val Gin Gly Tyr Val Leu

55 60

Ile Ala His Asn Gin Val Arg Gin Val Pro Leu Gin Arg Leu Arg

70 75

Ile Val Arg Gly Thr Gin Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala ' 85 90

Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr

100 105

Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gin Leu Arg Ser Leu

110 115 120

Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gin Arg Asn Pro Gin

125 130 135

Leu Cys Tyr Gin Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys

140 145 150

Asn Asn Gin Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg

155 160 165

Ala <210> 2 <211> 32 <212> białko <213> Homo sapiens <400> 2

Ser Thr Gin Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro 15 10 15

Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gin

25 30

Gly Cys '

PL 202 369 B1 <210> 3 <211> 11 <212> białko <213> sztuczna <220>

<221> sztuczna <222> 1-11 <223>

<400> 3

Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro 15 10 <210> 4 <211> Ί <212> białko <213> sztuczna <220>

<221> sztuczna <222> 1-7 <223>

<400> 4

His Gin Ser Leu Gly Thr Gin <210> 5 <211> 8 <212> białko <213> sztuczna

PL 202 369 B1

PL 202 369 B1 <222> 1-8 <223>

<400> 1

Val· Ile Ser Ser His Leu Gly Gin 5 1 5 <210> 8 <211> 59 <212> białko <213> Homo sapiens <400> 8

Val 1 Asn

Glu Glu Ala Arg

Cys His

Arg Val

Leu Gin Gly Leu 10

Pro Arg Glu Tyr

Val 15 Gin

5 Cys

Leu

Glu

Cys

Gin

Pro

Cys

His

Pro

15

20

25

30

Asn

Gly

Ser

Val

Thr

Cys

Phe

Gly

Pro

Glu

Ala

Asp

Gin

Cys

Val

35

40

45

Ala

Cys

Ala

His

Tyr

Lys

Asp

Pro

Phe

Cys

Val

Ala

Arg

50

55

<210> 9 <211> 65 <212> białko <213> Homo sapiens <400> 9

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gin Pro Gin Asn Gly Ser Val Thr 15 10 15

Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gin Cys Val Ala Cys Ala His Tyr 20 25 30

Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys

PL 202 369 B1

				35	40 45
Pro	Asp	Leu	Ser	Tyr Met	Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu
				50	55 ’ 60
Gly	Ala	Cys	Gin	Pro

65 <210> 10 <211> 107 <212> białko

10	<213> Mus musculus
	<400> 10
	Asp Thr Val Met Thr	Gin	Ser	His	Lys	Ile	Met	Ser	Thr	Ser	Val
	1 5					10					15
	Gly Asp Arg Val Ser	Ile	Thr	Cys	Lys	Ala	Ser	Gin	Asp	Val	Ser
15	20					25					30
	Ile Gly Val Ala Trp	Tyr	Gin	Gin	Arg	Pro	Gly	Gin	Ser	Pro	Lys
	35					40					45
	Leu Leu Ile Tyr Ser	Ala	Ser	Tyr	Arg	Tyr	Thr	Gly	Val	Pro	Asp
	50					55					60
20	Arg Phe Thr Gly Ser	Gly	Ser	Gly	Thr	Asp	Phe	Thr	Phe	Thr	Ile
	65					70					75
	Ser Ser Val Gin Ala	Glu	Asp	Leu	Ala	Val	Tyr	Tyr	Cys	Gin	Gin
	80					85					90
	Tyr Tyr Ile Tyr Pro	Tyr	Thr	Phe	Gly	Gly	Gly	Thr	Lys	Leu	Glu
25	95					100					105

Ile Lys <210> 11 <211> 119 <212> białko

PL 202 369 B1 <213> Mus musculus <400> 11

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15

Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu

Glu Tro Ile Gly Aso Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

Asn Gin Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser

Ser Arg Ile Val Tyr- Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

100

105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

110

115 <210> 12 <211> 107 <212> białko <213> Mus musculus <400> 12

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

PL 202 369 B1

40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser

55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin

85 90

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu

100 105 ile Lys <210> 13 <211> 119 ' <212> białko <213> sztuczna <220>

<221> sztuczna <222> 1-119 <223> VH Fab 574 <400> 13

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu

40 45

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

55 60

Asn Gin Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser. Val Asp Arg Ser

PL 202 369 B1

PL 202 369 B1 <211> 119 <212> białko <213> sztuczna

<400> 15

Gly Gly 10

Leu

Val

Gin

Pro

Gly 15

5

Glu 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys Ala

Ala Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

20

25

30

10

Ser

Tyr

Ala

Met

Ser

Trp

Val Arg

Gin Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

35

40

45

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Ser Gly

Asp Gly

Gly

Ser

Thr

Tyr

50

55

60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg Phe

Thr Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

15

65

70

75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin Met

Asn Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

80

85

90

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala Arg

Gly Arg

Val

Gly

Tyr

Ser

Leu

95

100

105

20

Tyr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly Thr

Leu Val

Thr

Val

Ser

110

115

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 do wytwarzania leku do leczenia

Claims

1. Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2 do wytwarzania leku do leczenia u człowieka raka charakteryzującego się nadekspresją ErbB2, przy czym wspomniany lek jest do podawania człowiekowi, w dawce początkowej 5 mg/kg przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2; oraz następnie do podawania wielu kolejnych dawek przeciwciała w ilości, która jest taka sama lub mniejsza niż dawka początkowa, przy czym kolejne dawki są do podawania w odstępach co najmniej dwu tygodniowych.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że początkowa dawka wynosi co najmniej 6 mg/kg.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że początkowa dawka wynosi co najmniej 8 mg/kg.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że początkowa dawka wynosi co najmniej 12 mg/kg.

5. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że kolejne dawki są do podawania w odstępach co najmniej trzy tygodniowych.

PL 202 369 B1

6. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3, albo 4, znamienne tym, że co najmniej jedna kolejna dawka wynosi co najmniej 2 mg/kg.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że co najmniej jedna kolejna dawka wynosi 6 mg/kg.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że dawka początkowa wynosi 8 mg/kg a co najmniej jedna kolejna dawka wynosi 8 mg/kg.

9. Zastosowanie według zastrz. 1 do 8, znamienne tym, że dawka początkowa jest do podawania przez iniekcję dożylną lub podskórną a co najmniej jedna kolejna dawka jest do podawania podskórnego.

10. Zastosowanie według zastrz. 1 do 7, znamienne tym, że początkowa dawka jest do podawania przez iniekcję dożylną przy czym są to co najmniej dwie kolejne dawki, a każda kolejna dawka jest do podawania przez iniekcję dożylną lub iniekcję podskórną.

11. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że początkowa dawka wynosi 8 mg/kg, przy czym podawanie początkowej dawki i kolejnych dawek jest w odstępach co najmniej 2 tygodniowych.

12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że dawka początkowa i kolejne dawki są w odstępach co najmniej trzy tygodniowych.

13. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że raka wybiera się z grupy obejmującej raka sutka, białaczki, raka płaskonabłonkowego, drobnokomórkowego raka płuc, niedrobnokomórkowego raka płuc, raka przewodu pokarmowego, raka trzustki, glejaka, raka szyjki macicy, raka jajników, raka wątroby, raka pęcherza moczowego, wątrobiaka, raka okrężnicy, raka okrężnicy i odbytnicy, raka śluzówki macicy, raka gruczołów ślinowych, raka nerek, raka wątroby, raka gruczołu krokowego, raka sromu, raka tarczycy, raka wątroby i różnych rodzajów raka głowy i szyi.

14. Zastosowanie według zastrz 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, znamienne tym, że przeciwciało wiąże się z zewnątrzkomórkową domeną receptora ErbB2.

15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że przeciwciało wiąże się z epitopem 4D5 w obrębie wspomnianej domeny.

16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że przeciwciałem jest humanizowane przeciwciało 4D5 skierowane przeciw ErbB2.

17. Zastosowanie według zastrz. 1-16, znamienne tym, że podaje się ponadto skuteczną ilości czynnika chemioterapeutycznego.

18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że czynnikiem chemioterapeutycznym jest taksan, to jest paklitaksel lub docetaksel.

19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że czynnikiem chemioterapeutycznym jest pochodna antracyklinowa, to jest doksorubicyna lub epirubicyna.

20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że podaje się ponadto czynnik chroniący serce.

21. Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB do wytwarzania leku do leczenia raka u człowieka, przy czym wspomniany lek jest do podawania pacjentowi jako pierwszej dawki tego przeciwciała a następnie co najmniej jednej kolejnej dawki tego przeciwciała, przy czym pierwsza dawka i kolejna dawka są do podawania w odstępie co najmniej dwu tygodniowym.

22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że pierwsza dawka i kolejna dawka są do podawania w odstępie co najmniej trzy tygodniowym.

23. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że pierwsza dawka i kolejna dawka lub każda kolejna dawka wynoszą od 2 mg/kg do 16 mg/kg.

24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że pierwsza dawka i kolejna dawka lub każda kolejna dawka wynoszą od 4 mg/kg lub 6 mg/kg do około 12 mg/kg.

25. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że stosuje się dwie lub więcej kolejnych dawek przeciwciała.

26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że stosuje się od dwóch do dziesięciu kolejnych dawek przeciwciała.

27. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że dwie lub więcej kolejnych dawek są do podawania w odstępach co najmniej dwu tygodniowych.

28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że dwie lub więcej kolejnych dawek są do podawania w odstępach co najmniej około trzy tygodniowych.

29. Zastosowanie według zastrz. 22 do 28, znamienne tym, że podaje się ponadto skuteczną ilość czynnika chemioterapeutycznego.

PL 202 369 B1

30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że czynnikiem chemioterapeutycznym jest taksan.

31. Zastosowanie według zastrz. 21 do 30, znamienne tym, że przeciwciałem jest przeciwciało skierowane przeciw ErbB2.

32. Zestaw zawierający ulotkę, znamienny tym, że zawiera pojemnik z przeciwciałem skierowanym przeciw ErbB i ulotkę informacyjną zawierającą instrukcje dotyczące podawania tego przeciwciała.

33. Zestaw według zastrz. 32, znamienny tym, że zawiera ponadto drugi pojemnik zawierający farmaceutycznie akceptowalny bufor.

34. Zestaw według zastrz. 32 lub 33, znamienny tym, że zawiera jeden lub więcej buforów, rozpuszczalników, filtrów, igieł lub strzykawek.