PL202392B1 - Sposób otrzymywania preparatu przeciwgrzybiczego - Google Patents

Abstract

Sposób otrzymywania preparatu przeciwgrzybiczego polega na hydrolizie owoców kasztanowca indyjskiego (Aesculus hippocastani L.), z zastosowaniem trypsyny jako katalizatora, a następnie wy­ trąceniu z hydrolizatu frakcji peptydowej o przeciętnym ciężarze cząsteczkowym od 370 do 1500 &£, zawierającą peptydy posiadające od 3 do 13 reszt aminokwasowych w cząsteczce i wydzieleniu tej frakcji. Preparat przeciwgrzybiczy stanowi frakcja peptydowa hydrolizatu białek owocu kasztanowca indyjskiego (Aesculus hippocastani L.), zawierająca peptydy o przeciętnym ciężarze cząsteczkowym od 370 do 1500, posiadające od 3 do 13 reszt aminokwasowych w cząsteczce. Preparat przeciwgrzy- biczy, zastosowany w postaci roztworów wodnych lub alkoholowych lub w postaci emulsji (kremy, balsamy, mleczka) a także w postaci maści, hamuje rozwój grzybów.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania preparatu przeciwgrzybiczego, zawierającego peptydy z owoców kasztanowca indyjskiego (Aesculus hippocastani L.).

Niektóre substancje zawarte w roślinach odgrywają poważną rolę w mechanizmach ochronnych roślin działając przeciwbakteryjnie i przeciwgrzybiczo. Na przykład z opisu patentowego PL 176488 znany jest sposób otrzymywania preparatu o działaniu bakteriobójczym ze śruty rzepakowej, polegający na alkoholowej ekstrakcji tioglikozydów zawartych w śrucie rzepakowej.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że można otrzymać skuteczny przecigrzybiczy preparat z białek zawartych w owocach kasztanowca indyjskiego (Aesculus hippocastani L.). Stwierdzono mianowicie, że specyficzna frakcja uzyskana z hydrolizatu białek owocu kasztanowca indyjskiego odznacza się działaniem hamującym wzrost grzybów i drobnoustrojów testowych.

Stwierdzono również, stosując do hydrolizy białek owocu kasztanowca różne enzymy proteolityczne, że jedynie frakcje peptydowe uzyskane po hydrolizie trypsyną posiadają pożądane własności przeciwgrzybicze.

Sposób otrzymywania preparatu przeciwgrzybiczego, według wynalazku polega na tym, że rozdrobniony owoc kasztanowca indyjskiego (Aesculus hippocastani L.) poddaje się hydrolizie w temperaturze nie przekraczającej 45°C, przy pH roztworu 7,5 do 8, z zastosowaniem trypsyny jako katalizatora, następnie z hydrolizatu wytrąca się, przez podwyższenie pH, frakcję peptydową o przeciętnym ciężarze cząsteczkowym od 370 do 1500 Da, zawierającą peptydy posiadające od 3 do 13 reszt aminokwasowych w cząsteczce, po czym frakcję tę wydziela się z roztworu.

Korzystnie jest hydrolizę prowadzić przez 7 do 24 godzin w temperaturze 38°C do 44°C, najkorzystniej przez 9 do 15 godzin w temperaturze 38,5°C do 39,5°C.

Frakcję peptydową o przeciętnym ciężarze cząsteczkowym od 370 do 1500 Da, zawierającą peptydy posiadające od 3 do 13 reszt aminokwasowych w cząsteczce korzystnie wytrąca się z hydrolizatu w punkcie izoelektrycznym przy pH = 9.

Przed wytrąceniem frakcji przeciwgrzybiczej korzystnie jest hydrolizat białkowy zatężyć. Można go też poddać suszeniu rozpyłowemu lub liofilizacji i następnie przeprowadzić w roztwór wodny.

Do wytrącenia frakcji peptydowej korzystnie stosuje się wodny roztwór wodorotlenku sodowego lub potasowego.

Wytrącony osad frakcji peptydowej korzystnie pozostawia się w celu krystalizacji przez 1 do 16 godzin w temperaturze otoczenia.

Korzystnie jest wytrącony i wydzielony z roztworu osad frakcji peptydowej wysuszyć.

Otrzymany sposobem według wynalazku preparat przeciwgrzybiczy stanowi frakcja peptydowa hydrolizatu białek owocu kasztanowca indyjskiego (Aesculus hippocastani L.), zawierająca peptydy o przecię tnym ciężarze cząsteczkowym od 370 do 1500 Da, posiadają ce od 3 do 13 reszt aminokwasowych w cząsteczce. Zwłaszcza skutecznie przeciwgrzybiczo działa frakcja zawierająca peptydy posiadające od 3 do 7 reszt aminokwasowych w cząsteczce.

Stwierdzono, że roztwór wodny frakcji peptydowej według wynalazku o stężeniu nie niższym niż 0,125% powoduje zahamowanie rozwoju grzybów chorobotwórczych takich jak np. Candida albicans.

Wysuszona frakcja peptydowa o własnościach przeciwgrzybiczych łatwo daje się przeprowadzić w roztwór wodny lub alkoholowy. Moż e ona być takż e zmieszana ze składnikami preparatów emulsyjnych (mleczka, kremy, balsamy) lub ze składnikami maści. Produkty zawierające preparat przeciwgrzybiczy otrzymany sposobem według wynalazku mogą być stosowane w postaci roztworów wodnych lub alkoholowych (toniki, emulsje płynne) np. do skóry głowy, lub w postaci kremów, balsamów, mleczka, maści np. do skóry nóg, rąk, ciała.

Preparat peptydowy o działaniu przeciwgrzybiczym według wynalazku i sposób jego otrzymywania przedstawiono w przykładach, które ilustrują korzystne formy realizacji wynalazku.

P r z y k ł a d I

Do 750 g odtłuszczonego, zmielonego owocu kasztanowca indyjskiego dodano 2250 g wody i mieszają c doprowadzono pH zawiesiny do wartoś ci 7,7 przy uż yciu 3n wodnego roztworu wodorotlenku sodowego. Następnie doprowadzono temperaturę masy reakcyjnej do 38°C, po czym dodano 0,898 g trypsyny. Reakcję prowadzono przez 9 godzin, przy ciągłym powolnym mieszaniu, utrzymując temperaturę 38 - 39°C, a pH w granicach 7,6 - 7,9. Po zakończeniu hydrolizy przeprowadzono dezaktywację enzymu przez ogrzanie mieszaniny reakcyjnej do 80°C. Hydrolizat odsączono i zliofilizowano, uzyskując około 100 g suchego produktu pośredniego.

PL 202 392 B1

100 g liofilizatu o zawartości 22,5% pochodnych białkowych rozpuszczono w 1000 ml wody destylowanej i dodając wodny roztwór wodorotlenku sodowego doprowadzono do pH 9. Nastąpiło wytrącenie frakcji peptydów, których punkt izoelektryczny przypada przy tej wartości pH. Wytrącony osad produktu pozostawiono jeszcze na 2 godziny w temperaturze pokojowej w kontakcie z roztworem, a nastę pnie odwirowano i wysuszono w temperaturze nie przekraczają cej 45°C.

Otrzymana frakcja hydrolizatu stanowiła 13,5% wagowych mieszaniny peptydów zawartych w hydrolizacie. Frakcja ta badana mikrobiologicznie metodą rozcieńczeniową hamuje wzrost grzybni Candida albicans przy stężeniu 0,125%.

P r z y k ł a d II

Odtłuszczony, zmielony owoc kasztanowca indyjskiego w ilości 82,3 g zmieszano z 247 g wody i mieszaninę doprowadzono do pH 8 używając 3-normalnego wodnego roztworu wodorotlenku sodowego. Dodano 0,15 g trypsyny i reakcją hydrolizy prowadzono przez 10 godzin, przy ciągłym mieszaniu, w temperaturze 41 - 42°C. Odwirowano hydrolizat i zatężono go do zawartości 2,3% substancji białkowych na próżniowej wyparce cienkowarstwowej, nie przekraczając przy tym temperatury 35°C. Następnie dodawano 3n wodnego roztworu wodorotlenku potasowego w celu doprowadzenia pH do wartości 9. Wytrącone peptydy (punkt izoelektryczny przy pH 9) odwirowano, po 5 godzinach odstawania w temperaturze pokojowej, wysuszono na powietrzu, otrzymując frakcję peptydów stanowiącą 14,0% wagowych hydrolizatu. Frakcja ta badana metodą rozcieńczeniową hamuje wzrost grzybni Candida albicans przy stężeniu 0,125%.

Claims (9)

1. Sposób otrzymywania preparatu przeciwgrzybiczego, znamienny tym, że rozdrobniony owoc kasztanowca indyjskiego (Aesculus hippocastani L.) poddaje się hydrolizie w temperaturze nie przekraczającej 45°C, przy pH roztworu od 7,5 do 8, z zastosowaniem trypsyny jako katalizatora, następnie z hydrolizatu wytrąca się, przez podwyższenie pH, frakcję peptydową o przeciętnym ciężarze cząsteczkowym od 370 do 1500, zawierającą peptydy posiadające od 3 do 13 reszt aminokwasowych w cząsteczce, po czym frakcję tę wydziela się z roztworu.

2. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że hydrolizę prowadzi się przez 7 do 24 godzin w temperaturze 38°C do 44°C.

3. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że hydrolizę prowadzi się przez 9 do 15 godzin w temperaturze 38,5°C do 39,5°C.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że frakcję peptydową o przeciętnym ciężarze cząsteczkowym od 370 do 1500, zawierającą peptydy posiadające od 3 do 13 reszt aminokwasowych w cząsteczce, wydziela się z hydrolizatu przez wytrącenie w punkcie izoelektrycznym przy pH = 9.

5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że przed wytrąceniem frakcji peptydowej hydrolizat białkowy zatęża się.

6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że hydrolizat białkowy przed wytrąceniem frakcji peptydowej poddaje się suszeniu rozpyłowemu lub liofilizacji i następnie przeprowadza w roztwór wodny.

7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że do wytrącenia frakcji peptydowej stosuje się wodny roztwór wodorotlenku sodowego lub potasowego.

8. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wytrącony osad frakcji peptydowej pozostawia się w celu krystalizacji przez 1 do 16 godzin w temperaturze otoczenia.

9. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wytrącony osad frakcji peptydowej po wydzieleniu z roztworu suszy się.