Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku s a fizjologicznie aktywne koniugaty czynnika stymuluj acego tworzenie kolonii granulocytów (GCSF), zawieraj ace je kompozycje i sposób wytwarzania koniugatu PEG-GCSF. Czynnik stymuluj acy tworzenie kolonii granulocytów (GCSF) jest farmaceutycznie aktywnym bia lkiem reguluj acym proliferacj e, ró znicowanie i funkcjonaln a aktywacj e granulocytów oboj etnoch lon- nych (Metcalf, Blood 67:257 (1986); Yan i wsp. Blood 84(3): 795-799 (1994); Bensinger, i wsp. Blood 81(11): 3158-3163 (1993); Roberts i wsp., Expt'l Hematology 22: 1156-1163 (1994); Neben i wsp. Blood 81(7): 1960-1967 (1993)). GCSF mo ze pobudza c komórki macierzyste i prekursorowe szpiku kostnego i jest stosowany w leczeniu pacjentów, u których w wyniku chemoterapii zmniejszy la si e liczba granulocytów lub jako wst ep do przeszczepu szpiku kostnego. W patencie U.S. Nr 5,214,132 ujawniono mutein e ludzkiego GCSF ró zni ac a si e od naturalnego hGCSF w pozycjach 1, 3, 4, 5 i 17, w której zamiast aminokwasów naturalnych dla GCSF wyst epuj a odpowiednio Ala, Thr, Tyr, Arg i Ser (Patrz równie z, doniesienie Kuga i wsp., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 103-111 (1989)). M. Okabe i wsp. (Blood 75(9): 1788-1793 (1 maja 1990)) o pochod- nej rhGCSF, w której aminokwasy s a zast apione w pi eciu miejscach N-ko ncowego regionu rhGCSF, wykazuj acej wy zsz a aktywno sc specyficzn a ni z nienaruszony rhGCSF, w dwóch oznaczeniach na mysich i/lub ludzkich progenitorowych komórkach szpiku kostnego. W patencie U.S. Nr 5,218,092 ujawniono mutein e ludzkiego GCSF ró zni ac a si e od naturalnego hGCSF w pozycjach 1, 3, 4, 5, 17, 145 i 147, gdzie zamiast wyst epuj acych w naturalnym GCSF aminokwasów w muteinie wyst epuj a odpowiednio Ala, Thr, Tyr, Arg, Ser, Asn i Ser. Tre sc patentów U.S. Nr. 5,214,132 i 5,218,092 jest w laczona tu przez odniesienie. Dost epno sc biologiczna bia lek leczniczych, takich jak GCSF, jest cz esto ograniczona przez ich krótki pó lokres trwania w osoczu i wra zliwo sc na degradacj e przez proteazy, co zmniejsza ich maksy- malny potencja l kliniczny. Badania innych bia lek leczniczych pokaza ly, ze takie trudno sci mo zna prze- zwyciezy c przez sprz eganie bia lek z polimerami, takimi jak glikol polietylenowy (PEG), zazwyczaj przy pomocy cz asteczki lacznikowej (linkera) kowalencyjnie po laczonej zarówno z bia lkiem jak i z PEG. Pokazano, ze takie, b ed ace koniugatami z PEG, biocz asteczki maj a w la sciwo sci klinicznie u zy- teczne (Inada i wsp., J. Bioact. and Compatible Polymers, 5:343 (1990); Delgado i wsp., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9:249 (1992); i Katre, Advanced Drug Delivery Sys- tems, 10:91 (1993)). W la sciwo sciami tymi s a, mi edzy innymi, lepsza stabilno sc fizyczna i termiczna, ochrona przed degradacj a enzymatyczn a, zwi ekszona rozpuszczalno sc i wyd lu zony pó lokres trwania in vivo, zmniejszony klirens, zmniejszona immunogenno sc, antygenowo sc i zmniejszona toksyczno sc. Koniugaty PEG-GCSF o odmiennej strukturze ni z koniugaty wed lug wynalazku, zosta ly ujaw- nione w publikacji patentu europejskiego Nr EP 0 335 423; w publikacji patentu europejskiego Nr EP 0 401 384; R.W. Niven i wsp., J. Controlled Release 32: 177-189 (1994); i Satake-Ishikawa i wsp., Celi Structure and Function, 17: 157-160 (1992)). Wynalazek dotyczy nowej klasy pochodnych GCSF z glikolem polietylenowym dalej okre slanym jako PEG. Jak pokazano ni zej, koniugat wed lug wynalazku posiada linker amidowy. Fizjologicznie aktywny koniugat wed lug wynalazku przedstawiony jest wzorem I w którym G oznacza czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii granulocytów bez grupy lub grup aminowych, które tworz a w koniugacie wi azanie amidowe z cz asteczk a glikolu polietylenowego; R oznacza ni zszy alkil; n jest liczb a ca lkowit a od 420 do 550, a m jest liczb a ca lkowit a od 1 do 5. Korzystnie R oznacza metyl, n wynosi od 450 do 490, a m wynosi od 1 do 4, bardziej korzystnie m wynosi 2. Korzystnie czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii granulocytów jest Mutein a GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1. Korzystnie n w koniugacie wynosi od 450 do 490, a m przyjmuje warto sc od 1 do 4, korzystniej m wynosi 2.PL 203 462 B1 3 Koniugat wed lug wynalazku ma d lu zszy pó lokres kr azenia w ustroju i wi eksz a, in vivo, aktyw- nosc granulopoetyczn a, ni z odpowiadaj acy mu nieskoniugowany czynnik pobudzaj acy tworzenie ko- lonii granulocytów. Korzystny koniugat wed lug wynalazku przedstawiony jest wzorem I w którym R oznacza grup e metylow a; n ma warto sc od 450 do 490; m stanowi 2, a G oznacza Mutein e GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1 bez grup aminowych, które tworz a w koniugacie wi azanie amidowe z cz asteczk a glikolu polietylenowego. Wynalazek dotyczy równie z kompozycji zawieraj acej fizjologicznie aktywne koniugaty o wzorze I w której w ka zdym koniugacie G oznacza czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii granulocytów bez grupy lub grup aminowych, które tworz a w koniugatach wi azanie amidowe z cz asteczk a glikolu polietylenowego; R w ka zdym z koniugatów niezale znie oznacza ni zszy alkil; n w ka zdym z koniuga- tów niezale znie jest liczb a ca lkowit a od 420 do 550; m w ka zdym z koniugatów niezale znie jest liczb a ca lkowit a od 1 do 4 przy czym zawarto sc procentowa koniugatów, w których m jest 1, wynosi od osiemnastu do dwudziestu pi eciu procent; zawarto sc procentowa koniugatów, w których m jest 2, wynosi od pi ecdziesi eciu do szescdziesi eciu sze sciu procent; zawarto sc procentowa koniugatów, w których m jest równe 3, wynosi od dwunastu do szesnastu procent, a procentowa zawarto sc koniu- gatów, dla których m jest równe 4, wynosi do pi eciu procent. Korzystnie R oznacza grup e metylow a, a n i R s a takie same w ka zdym koniugacie. Korzystnie n w koniugacie wynosi od 450 do 490. Korzystnie ka zdy z koniugatów czynnika pobudzaj acego tworzenie granulocytów jest Mutein a GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1. Korzystnie kompozycja zawiera koniugaty, w których we wzorze I R oznacza grup a metylow a; n w ka zdym koniugacie ma tak a sam a warto sc i jest liczb a ca lkowi- t a od 450 do 490; G oznacza Mutein e GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1 bez grup amino- wych, które tworz a, w ka zdym koniugacie wi azanie amidowe z cz asteczk a glikolu polietylenowego; m w ka zdym koniugacie jest niezale znie liczb a ca lkowit a od 1 do 4; przy czym procentowa zawarto sc koniugatów, w których m jest równe 1 wynosi od osiemnastu do dwudziestu pi eciu procent; procento- wa zawarto sc koniugatów, w których m jest równe 2, wynosi od piecdziesi eciu do sze scdziesi eciu sze sciu procent; procentowa zawarto sc koniugatów, w których m jest równe 3, wynosi od dwunastu do szesnastu procent, a procentowa zawarto sc koniugatów, w których m jest równe 4, wynosi do pi eciu procent. W zakres wynalazku wchodzi równie z sposób wytwarzania koniugatu PEG-GCSF o d luzszym pó lokresie kr azenia w ustroju i wi ekszej in vivo aktywno sci granulopoetycznej ni z odpowiadaj acy mu nieskoniugowany GCSF obejmuj acy kowalencyjne wi azanie z reagenta o wzorzePL 203 462 B1 4 z GCSF z wytworzeniem koniugatu. Korzystnie GCSF jest Mutein a GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1. W porównaniu z niezmodyfikowanym GCSF (to jest, GCSF bez przy laczonego PEG), koniugat wykazuje wyd luzony pólokres kr azenia i czas odporno sci osocza, zmniejszony klirens i zwi ekszon a aktywnosc granulopoetyczn a in vivo. Ponadto, w porównaniu z koniugatami PEG-GCSF, koniugaty wed lug niniejszego wynalazku maj a lepsze w la sciwo sci granulopoetyczne. Inne koniugaty PEG-GCSF ujawniono w publikacji patentu europejskiego Nr EP 0 335 423; w publikacji patentu europejskiego Nr EP 0 401 384 i w Niven, i wsp., Ibid. Jednak koniugaty wed lug tego wynalazku maj a inn a struktur e ni z te koniugaty i lepsze w la sciwo sci, w szczególno sci ujawniaj a d lugo utrzymuj ac a si e, obserwowan a in vivo przy niskich dawkach wysok a aktywnosc granulopoetyczn a. Korzystnie, GCSF stosowany w koniugatach wed lug wynalazku jest mutein a GCSF, która ma w la sciwo sci równowa zne lub lepsze ni z naturalna GCSF i ma takie same zastosowania jak GCSF. Muteina ma tak a sam a sekwencj e aminokwasow a jak GCSF, z wyj atkiem miejsc 1, 3, 4, 5 i 17, w których zamiast aminokwasów wyst epuj acych w naturalnym GCSF w muteinie wyst epuj a odpo- wiednio Ala, Thr, Tyr, Arg i Ser (mutein a GCSF) (Patrz Fig. 1). Muteina taka jest ujawniona w patencie U.S. Nr. 5,214,132. Koniugaty wed lug niniejszego wynalazku maj a takie samo zastosowanie jak GCSF. W szcze- gólno sci, koniugaty wed lug niniejszego wynalazku s a u zyteczne w leczeniu pacjentów, u których licz- ba granulocytów uleg la zmniejszeniu w wyniku chemioterapii lub jako wst ep do przeszczepu szpiku kostnego, w taki sam sposób jak w przypadku stosowania GCSF. Jednak ze koniugaty wed lug niniej- szego wynalazku maj a udoskonalone w la sciwo sci, w tym doskonala stabilnosc, zwi ekszon a rozpusz- czalno sc, poprawiony pó lokres kr azenia i czasy odporno sci osocza. Opis Figur Fig. 1: Pierwszorz edowa struktura Muteiny GCSF Mutein a GCSF ró zni si e od ludzkiego GCSF typu dzikiego w pozycjach 1, 3, 4, 5 i 17, w których zamiast wyst epuj acych w naturalnym GCSF aminokwasów, w muteinie wyst epuj a odpowiednio Ala, Thr, Tyr, Arg i Ser. Fig. 2: Reagenty do pegylacji Fig. 3: Oddzielanie muteiny GCSF zmodyfikowanej PEG 20 kDa i niezmodyfikowanej. Typowy profil wyp lukiwania dla mieszaniny reakcyjnej z PEG. Kolumna: 1-2 ml Fractogel® EMD SO 3 650S Bufor do równowa zenia kolumny: 10 mM octan amonu, pH 4,5 Bufory do wyp lukiwania z kolumny: 1. 0,15 M NaCl w buforze do równowa zenia kolumny 2. 0,5 M NaCl w buforze dla równowa zenia kolumny. Fig. 4: Aktywno sc PEG-muteina GCSF 5 dnia po jednorazowym wstrzykni eciu Samicom myszy C57BL/6J wstrzykni eto podskórnie 25,2 µg koniugatu pegylowanej muteiny GCSF; w pi atym dniu po podaniu zbierano próbki krwi zylnej z zatoki pozaoczodo lowej. Przeprowa- dzono analizy hematologiczne metod a Coulter'a i ró znicow a analiz e leukocytów; oznaczony poziom neutrofili standaryzowano w ka zdym do swiadczeniu wzgl edem kontroli b ed acej no snikiem. Wyniki s a warto sciami srednimi ± S.E. uzyskanymi dla grupy licz acej cztery myszy. Fig. 5: Wzrost liczby PMN w funkcji masy PEG (kDa) w koniugatach muteiny GCSF PEG z lacznikiem amidowym i z mocznikowym. Dla koniugatów wytworzonych z reagentem SPA PMN=0,277MW+3,95. Dla koniugatów wytworzonych z mocznikiem PMN=0,152 MW+2,74. Fig. 6: Aktywno sc PEG-muteina GCSF 7 dnia po jednorazowym wstrzykni eciu Samicom myszy C57BL/6J wstrzykni eto podskórnie 25,2 µg pegylowanego koniugatu muteiny GCSF; w siódmym dniu po podaniu zbierano próbki krwi zylnej z zatoki pozaoczodo lowej. PrzeprowadzonoPL 203 462 B1 5 analizy hematologiczne metod a Coulter'a i ró znicow a analiz e leukocytów; oznaczony poziom neutrofili standaryzowano w ka zdym do swiadczeniu wzgl edem kontroli b ed acej no snikiem. Wyniki s a warto- sciami srednimi ± S.E. uzyskanymi dla grupy licz acej cztery myszy. Fig. 7: Oznaczenie pobudzenia mysich kolonii PBSC (komórki macierzyste krwi obwodowej) Fig. 8: Oznaczenie pobudzenia mysich kolonii PBSC Fig. 9: Oznaczenie pobudzenia mysich kolonii PBSC Fig. 10: Oznaczenie pobudzenia mysich kolonii PBSC Fig. 11: Oznaczenie pobudzenia mysich kolonii PBSC We wzorze I koniugatu wed lug wynalazku warto sci n i m s a dobrane tak, ze uzyskany koniugat o wzorze I ma aktywno sc fizjologiczn a porównywaln a z niezmodyfikowanym GCSF, która to aktyw- nosc mo ze by c taka sama, wi eksza ni z lub mo ze stanowi c cz esc aktywno sci odpowiedniego niezmo- dyfikowanego GCSF. n przedstawia liczb e reszt tlenku etylenu w jednostce PEG. Pojedyncza podjed- nostka PEG b ed aca OCH 2 CH 2 ma ciezar cz asteczkowy oko lo 44 daltonów, m przedstawia liczb e jed- nostek PEG do laczonych do cz asteczki GCSF. Koniugat wed lug wynalazku mo ze zawiera c jedn a, dwie, trzy, cztery lub pi ec jednostek PEG na cz asteczk e GCSF. Tak wi ec ciezar cz asteczkowy koniu- gatu (po wy laczeniu ciezaru cz asteczkowego GCSF) zale zy od warto sci n i m. n moze przyjmowa c warto sc od 420 do 550, co daje koniugat w którym ka zda jednostka PEG ma sredni ciezar cz asteczkowy od oko lo 18 kilodaltonów do oko lo 25 kilodaltonów na jednostk e PEG. Korzystnie, n przyjmuje warto sc 450 do 490, co daje koniugat, w którym ka zda jednostka PEG ma sredni ci ezar cz asteczkowy oko lo 20 kilodaltonów, m mo ze przyj ac warto sc 1, 2, 3, 4 lub 5. Korzystnie m wynosi 1-4, a szczególnie korzystnie m wynosi 2. Zakres ciezarów cz asteczkowych koniugatów wed lug wynalazku wynosi od oko lo 18 kilodaltonów (n=420, m=1) do oko lo 125 kilodaltonów (n=550, m=5). Gdy n wynosi od 420 do 550, a m przyjmuje warto sc 1 do 4, to zakres ciezaru cz asteczkowego cz esci koniugatów wed lug wynalazku, b ed acej PEG, wynosi od oko lo 18 kilodaltonów (n=420, m=1) do okolo 97 kilodaltonów (n=550; m=4). Okre slenie „oko lo” przy liczbie oznaczaj acej ciezar cz astecz- kowy oznacza, ze mie sci si e on w rozs adnym zakresie od tej warto sci jak okre slona konwencjonalny- mi technikami analitycznymi. W korzystnym koniugacie n wynosi 450 do 490, a m wynosi 1-4, i w tym przypadku ciezar cz a- steczkowy cz esci PEG koniugatów wynosi od oko lo 20 kilodaltonów (n=450; m~1) do oko lo 86 kilodal- tonów (n=490; m=4). W innym korzystnym koniugacie n wynosi 420 do 550, a m wynosi 2, w którym to przypadku ci ezar cz asteczkowy cz esci PEG koniugatu jest w zakresie od oko lo 37 kilodaltonów (n=420) do oko lo 48 kilodaltonów (m=550). W szczególnie korzystnym koniugacie n wynosi 450 do 490, a m wynosi 2 i w tym przypadku ci ezar cz asteczkowy czesci PEG koniugatu mie sci si e w zakresie od oko lo 40 kilodaltonów (n=450) do oko lo 43 kilodaltonów (n=490). R mo ze oznacza c dowoln a ni zsz a grup e alkilow a, przez co rozumie si e grup e alkilow a zawiera- jac a od jednego do sze sciu atomów w egla, tak a jak grupa metylowa, etylowa, izopropylowa itp. W zakres tego znaczenia w laczone s a alkile o rozga lezionych la ncuchach. Korzystnym alkilem jest metyl. Przez GCSF rozumie si e bia lko naturalne lub zrekombinowane, korzystnie ludzkie, uzyskane z tradycyjnych zróde l, takich jak tkanki, synteza bia lka, hodowle komórkowe komórek naturalnych lub zrekombinowanych. Termin ten obejmuje dowolne bia lka o aktywno sci GCSF, takie jak muteiny lub inaczej zmodyfikowane bia lka. Otrzymywanie i izolowanie GCSF z naturalnych lub zrekombinowanych zróde l jest dobrze znane (patrz przykladowo patenty U.S. Nr. 4,810,643 i 5,532,341). Korzystny ko- niugat GCSF jest koniugatem z mutein a GCSF, jak opisana w patencie U.S. Nr. 5,214,132. Fizjologicznie aktywny koniugat o wzorze I ma aktywno sc GCSF, przez któr a rozumie si e jak a- kolwiek cz esc lub wielokrotno sc jakiejkolwiek znanej aktywno sci GCSF, okre slonej przez ró zne ozna- czenia znane w dziedzinie. W szczególno sci koniugat wed lug niniejszego wynalazku ma aktywnosc GCSF co pokazano przez zdolno sc do zwi ekszania liczby PMN. Jest to znana aktywno sc GCSF. Taka aktywnosc koniugatu mo ze by c oznaczona przy pomocy analiz dobrze znanych w dziedzinie, przyk la- dowo analiz opisanych poni zej (Patrz równie z: Asano i wsp., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19: 2767-2773; Yamasaki i wsp., J. Biochem. (1994) 115: 814-819; i Neben, i wsp., Blood (1993) 81:1960. Koniugaty o wzorze I s a wytwarzane przez kowalencyjne wi azanie GCSF z estrem sukcynimi- dylowym kwasu PEG-propionowego (SPA) b ed acym reagentem o wzorzePL 203 462 B1 6 Reagent o wzorze II mo ze by c uzyskany tradycyjnymi sposobami zgodnymi ze znanymi proce- durami (patrz patent U.S. Nr. 5,672,662). n jest takie samo jak powy zej we wzorze I, i jest tak wybra- ne, by dawa lo koniugat o zadanym ciezarze cz asteczkowym. Korzystne s a takie reagenty, w których n wynosi od 450 do 490 (MW=20 kDa). Inne ci ezary cz asteczkowe mo zna uzyska c przez zmian e n w materiale wyj sciowym PEG-alkohol dla reagenta o wzorze II. Reagent SPA o wzorze II i ciezarach cz asteczkowych 5, 10, 15 i 20 kDa mo zna uzyska c z Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Alabama). Reagent o wzorze II mo ze by c skoniugowany z GCSF sposobami konwencjonalnymi. Wi azanie zachodzi przez wi azanie amidowe. Konkretnie, reagent o wzorze II zasadniczo reaguje z jedn a lub wi eksz a liczb a pierwszorz edowych grup aminowych (przyk ladowo N-koniec i lancuchy boczne lizyny) z GCSF tworz ac wi azanie amidowe pomi edzy GCSF i polimerowym szkieletem PEG. Przedstawiona we wzorze I grupa NH pochodzi od tej pierwszorz edowej grupy (grup) aminowej (aminowych) GCSF, która reaguje z reagentem o wzorze II tworz ac wi azanie amidowe. W mniejszym stopniu reagent o wzorze II mo ze tak ze reagowa c z grup a hydroksylow a seryny w pozycji 66 GCSF tworz ac wi azanie estrowe mi edzy GCSF i polimerowym szkieletem PEG. Warunki reakcji s a typowe i znane specjali- stom, a szczegó lowo s a podane poni zej. Przy laczenie reagentów do GCSF mo zna przeprowadzi c tradycyjnymi sposobami. Mo zna za- stosowa c PEG o dowolnym wybranym wed lug tego wynalazku ci ezarze cz asteczkowym (n). Przyk la- dowo, reakcj e mo zna przeprowadzi c w roztworze o pH od 5 do 10 w temperaturze od 4°C do tempera- tury pokojowej, przez 30 minut do 20 godzin, wykorzystuj ac stosunek molowy reagentu do bia lka od 4:1 do 30:1. Warunki reakcji mo zna tak wybra c, aby skierowa c reakcj e na wytwarzanie g lównie zadanego poziomu podstawie n. Ogólnie, niska temperatura, niskie pH (np. pH 5) i krótki czas reakcji prowadz a do zmniejszenia liczby przy laczonych cz asteczek PEG (mniejsze m). Wysoka temperatura, pH oboj et- ne do wysokiego (np. pH = 7) i d lu zszy czas reakcji zwi ekszaj a liczb e przy laczonych cz asteczek PEG (wi eksza m). Przyk ladowo, w przypadku reagenta o wzorze II i ci ezarze cz asteczkowym 5 kDa, w pH 7,3 i przy stosunku molowym reagenta do bia lka 30:1, w temperaturze 4°C i w czasie reakcji 30 minut powstaj a g lównie koniugaty mono-PEG; w temperaturze 4°C i w czasie reakcji 4 godziny powstaj a g lównie koniugaty di-PEG, a w temperaturze pokojowej i w czasie reakcji 4 godziny powstaj a g lównie koniugaty tri-PEG. Reakcj e ko nczy si e przez zakwaszenie mieszaniny reakcyjnej i zamro zenie w -20°C. Na ogó l, korzystne s a pH od 7 do 7,5 i stosunek molowy reagenta do bia lka 4:1 do 6:1. Do rozdzielenia koniugatów z wykorzystaniem ró znicy ladunków u zyte mog a by c sposoby oczyszczania, takie jak chromatografia kationowymienna, która skutecznie rozdziela koniugaty z uwa- gi na ich ró zne ciezary cz asteczkowe. Przyk ladowo, kolumna do wymiany kationowej mo ze by c za la- dowana, a nast epnie p lukana ~20 mM octanem sodu, pH ~4, i nast epnie wymywana liniowym gra- dientem (0 M do 0,5 M) NaCl buforowanym przy pH od 3 do 5,5, korzystnie przy pH ~4,5. Zawarto sc frakcji uzyskanych przez chromatografi e kationowymienn a mo ze by c okre slona przez wyznaczenie ciezaru cz asteczkowego, tradycyjnymi metodami, przyk ladowo przez spektroskopi e SDS-PAGE lub innymi sposobami rozdzia lu cz asteczek z uwagi na ich ci ezar cz asteczkowy. Nast epnie frakcj e identy- fikuje si e jako zawieraj ac a koniugat o wzorze I o zadanej liczbie (m) przy laczonych cz asteczek PEG, oczyszcza si e ze niezmodyfikowanej postaci GCSF i koniugatów z inn a liczb a przy laczonych cz aste- czek PEG. Równie z czesci a tego wynalazku jest kompozycja koniugatów, która zawiera koniugaty o ró z- nych warto sciach m w konkretnych stosunkach. Kompozycj e tak a wytwarza si e przez reakcj e reagen- ta pegyluj acego z GCSF w stosunku molowym od 4 do 6:1 (nadmiar reagenta). Reakcja przebiega w 4°C do 8°C przez 20 godzin, przy pH zbli zonym do 7,5. Przy ko ncu reakcji dodaje si e kwas octowy. Nast epnie koniugat jest oczyszczany z pozosta lo sci niezmodyfikowanego bia lka, nadmiaru reagenta pegyluj acego i innych zanieczyszcze n i sk ladników buforu obecnego podczas reakcji. Poza pegylowanymPL 203 462 B1 7 bia lkiem, jako produkty uboczne reakcji wytwarzane s a N-hydroksysukcynimid i kwas polietylenoglikolo- karboksylowy. Nast epuj ace Przyk lady ilustruj a opisany wynalazek i nie ograniczaj a go w zaden sposób. W Przyk ladach tych by la stosowana Muteina GCSF. Równie z inne rodzaje GCSF mog a by c koniugo- wane z PEG sposobami podanymi tu przyk ladowo. P r z y k l a d 1 Reagenty do pegylacji 1. Lacznik amidowy GABA (P-6GA-1, P-12Ga-1) Amidowy lacznik GABA zawiera 2 nici PEG o ciezarze cz asteczkowym 6 lub 12 kDa. Struktury przedstawiono na Fig. 2-A. 2. Lacznik amidowy (P-5am-1, P-10am-1) Wytworzono laczniki o ci ezarze cz asteczkowym 5 i 10 kDa. Struktur e przedstawiono na Fig. 2-B. 3. Lacznik amidowy Reagentem tym by l dost epny w handlu kwas sukcynimidylopropionowy (SPA), wytworzony z cz asteczek PEG o ci ezarze cz asteczkowym 5, 10, 15 i 20 kDa, a jego ogóln a struktur e przedstawio- no na Fig. 2-C. 4. Lacznik mocznikowy Reagent ten zosta l wytworzony z cz asteczek PEG o ciezarze cz asteczkowym 5, 10 i 25 kDa, a jego typow a struktur e przedstawiono na Fig. 2-D. 5. Lacznik uretanowy Wytworzono laczniki uretanowe o ci ezarze 10 i 20 kDa, a ich struktur e przedstawiono na Fig. 2-E. 6. Lacznik uretanowy Jak pokazuje przedstawiona na Fig. 2-G struktura dost epnego w handlu reagenta PEG o ci eza- rze cz asteczkowym 36 kDa, jeden koniec odczynnika PEG jest zablokowany grup a t-butylow a. Re- agent ten mia l najwy zszy ci ezar cz asteczkowy spo sród PEG u zytych w tym przyk ladzie. 7. Lacznik tiouretanowy Struktur e tego reagenta do pegylacji mo zna zobaczy c na Fig. 2-F. Ci ezar cz asteczkowy PEG u zytego w tym reagencie wynosi l 20 kDa. Nast epuj ace reagenty by ly dostarczone przez Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Tokio, Japonia: 1) muteina G-CSF oznaczona jako Muteina GCSF, Muteina GCSF skoniugowana z rozga lezionym gliko- lem metoksypolietylenowym (m-PEG) zawieraj acym 2 lancuchy m-PEG albo o ciezarze cz asteczko- wym 6 albo 12 kDa (PEG-GABA-NHS, patrz Fig. 2A). Mutein a GCSF skoniugowana z reagentem m-PEG b ed acym liniowym estrem/amidem o ci ezarze cz asteczkowym 5 i 10 kDa (patrz Fig. 2B). Re- agenty m-PEG-kwas sukcynimidylopropionowy (NHS PEG-SPA) o ci ezarze cz asteczkowym 5, 10, 15 i 20 kDa nabyto z Shearwater Polymers, (Huntsville, Alabama, patrz Fig. 2C). Nast epuj ace reagenty do pegylacji bia lka wytworzono w Hoffmann-La Roche, Inc: 1) lacznik m-PEG-mocznik (5, 10 i 25 kDa, patrz Fig. 2D), 2) lacznik m-PEG-uretan (10 i 20 kDa, patrz Fig. 2E) lacznik m-PEG-tiouretan (10 i 20 kDa patrz Fig. 2F), a reagent lacznikowy t-butylo-m-PEG-uretan o srednim ci ezarze cz asteczko- wym 36 kDa uzyskano z DDI Pharmaceuticals, Inc. (Mountainview, CA, patrz Fig. 2G). Reakcje pegylacji Czynnikami wp lywaj acymi na reakcj e pegylacji s a 1) pH, 2) temperatura, 3) czas reakcji, 4) sto- sunek molowy bia lka do reagentu PEG i 5) st ezenie bia lka. Kontroluj ac jeden lub wi ecej z tych czynni- ków mo zna nakierowa c reakcj e na wytwarzanie g lównie mono-, di-, tri-, itp. koniugatów PEG. Przyk la- dowo, warunki reakcji dla reagenta Shearwater Polymer SPA-PEG 5000 (N-hydroksysukcynimid) by ly 1) pH 7,3; 2) temperatura 4°C, dla mono- i di-PEG i temperatura pokojowa dla tri-PEG; 3) czas reakcji dla mono-PEG 30 minut, dla di- i tri-PEG 4 godziny i 4) stosunek molowy bia lka do reagenta 1:30. Dla wszystkich reagentów indywidualnie okre slano optymalne warunki reakcji dla wytworzenia zadanych rodzajów PEG. S a one przedstawione w Tabeli 1. Reakcj e ko nczy si e przez zakwaszenie mieszaniny reakcyjnej i zamro zenie w -20°C. Wydzielenie zmodyfikowanej i wolnej Muteiny GCSF od z mieszaniny reakcyjnej (wymiana ka- tionowa na sulfopropylu (SP)) Mieszanin e reakcyjn a zawieraj ac a oko lo 5 mg bia lka rozcie nczono 10 do 20 razy wod a i lodo- watym kwasem octowym, doprowadzono pH do 4,5. Nast epnie rozcie nczon a próbk e naniesiono na wcze sniej upakowan a 1-2 ml kolumn e Fractogel EMD SO 3 - 650S (EM Separations, Gibbstown, New Jersey), któr a zrównowa zono 10 mM octanem amonu, pH 4,5. Niezaadsorbowany reagent i produkty uboczne reakcji usuwano podczas p lukania kolumny. Zmodyfikowan a Mutein e GCSF wymywanoPL 203 462 B1 8 gradientem 0,15 M NaCl w buforze do równowa zenia kolumny. Niezmodyfikowan a, pozostaj ac a na kolumnie Mutein e GCSF wymywano 0,5 M NaCl w buforze do równowa zenia kolumny. Oddzielon a mieszanin e koniugatów Muteina GCSF-PEG filtrowano sterylnie przez filtr o porach 0,2 µm i przecho- wywano zamro zon a w -20°C. Charakteryzowanie koniugatów PEG Muteina GCSF Oznaczanie bia lka St ezenia bia lek oczyszczonych koniugatów PEG-Muteina GCSF okre slano stosuj ac warto sc A 280 0,86 dla roztworu o st ezeniu 1 mg/ml. Analiza SDS-PAGE Analiz e SDS-PAGE przeprowadzono stosuj ac 12 i 15% zele poliakryloamidowe lub 8-16% gradien- towe zele poliakryloamidowe w warunkach redukuj acych zgodnie, z Laemmli, Nature 227: 680-685, 1970. Okre slenie procentowego sk ladu kompozycji Procentow a zawartosc w kompozycji ka zdego rodzaju (mono-, di-, tri-, itp.) w ró znych mieszani- nach reakcyjnych koniugatów PEG-Muteina GCSF okre slano z pomiarów densytometrycznych zeli SDS-PAGE wybarwionych Coomassie blue (patrz Tabela 2). Okre slanie masy PEG w koniugatach PEG - Muteina GCSF Ca lkowit a mas e PEG obecnych w ró znych preparatach okre slono ze sredniego ciezaru cz a- steczkowego PEG, identyfikacji poszczególnych koniugatów PEG (mono, di, itp.), na podstawie ru- chliwo sci elektroforetycznej, liczby przy laczonych cz asteczek PEG i procentowego sk ladu opartego na pomiarach densytometrycznych SDS-PAGE wybarwionych Coomassie blue. Ca lkowita masa PEG w poszczególnych preparatach jest sum a poszczególnych mas PEG. Poszczególne masy PEG s a obliczone przy pomocy poni zej przedstawionego równania: Masa PEG = PEG M.W. x # cz asteczek PEG x % kompozycji gdzie PEG M.W.-5, 10, 20 kDa, itd. # cz asteczek PEG =1,2,3 odpowiednio dla mono, di, tri. Dla oznaczenia ca lkowitej masy PEG zastosowano równie z spektrometri e mas (MALDI-TOF). W tym przypadku spektrum mas pozwala na identyfikacj e i okre slenie ciezaru cz asteczkowego po- szczególnych koniugatów PEG. Ciezar cz asteczkowy PEG przy laczonego do ka zdego koniugatu PEG jest ca lkowitym ciezarem cz asteczkowym poszczególnych koniugatów PEG minus ci ezar cz asteczko- wy Muteiny GCSF (18,9 kDa). Warto sci te pomno zone przez % kompozycji daj a poszczególne masy PEG; ich suma daje ca lkowit a mas e PEG. Oba sposoby by ly wykorzystane dla okre slenia mas PEG ró znych preparatów. Wyniki s a pod- sumowane w Tabeli 2. Okre slenie poziomów endotoksyny Poziomy endotoksyny okre slono przy pomocy metody LAL zgodnie z instrukcjami producenta (Associates of Cape Cod, Inc., Woods Hople, Massachusetts). Aktywno sci biologiczne Jak to uprzednio opisano przeprowadzono oznaczenia biologiczne in vitro na komórkach M-NFS-60 i in vivo na samicach myszy C57BL/6J. (Patrz Asano i wsp., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19: 2767-2773.) Wyniki i dyskusja Reakcja pegylacji Ogólnie, wyniki wskazuja, ze dla uzyskania zadanej ilo sci koniugacji mniej reaktywne odczynni- ki, takie jak lacznik mocznikowy wymagaja wy zszego pH, temperatury i stosunku molowego bia l- ko:odczynnik, jak równie z d luzszego czasu reakcji (patrz Tabela 1 i 2). Oddzielenie zmodyfikowanej i wolnej Muteiny GCSF od mieszaniny reakcyjnej Typowy profil wymywania z kolumny przedstawiono na Fig.4. Dodatkowo do chromatografii ka- tionowymiennej mog a by c wymagane dodatkowe etapy, takie jak chromatograficzne s aczenie w zelu dla usuni ecia sladowych zanieczyszcze n i endotoksyny oraz dla przeprowadzenia wymiany buforu w ko n- cowym, przeznaczonym dla przechowywania produkcie. Metoda rozdzia lu przez wymian e na silnym katio- nicie mo ze by c rozszerzona do skali 30 mg dla koniugatów 20 kDa z SPA (amid) i 20 kDa z uretanem. Procedura ta daje niemal ilo sciowe odzyskiwanie zwi azków. Sk lad procentowy kompozycji i masa PEG Wyniki oznaczenia procentowego sk ladu kompozycji i masy PEG przedstawiono w Tabeli 2. Z naszego do swiadczenia wynika, ze w przypadku koniugatów PEG o wysokim ci ezarze cz asteczkowymPL 203 462 B1 9 (np. 20 kDa SPA diPEG i 12 kDa GABA), identyfikacja rodzajów PEG, oparta na ruchliwo sci elektrofo- retycznej, a maj aca na celu okre slenie sk ladu % mieszaniny reakcyjnej, nie jest bardzo rzetelna. W celu okre slenia masy PEG i identyfikacji wysoko podstawionych koniugatów PEG o wysokim cieza- rze cz asteczkowym potrzebne jest zastosowanie kombinacji analiz SDS-PAGE, SP-HPLC i MALDI-TOF MS. Jednak ze koniugaty monopegylowane PEG i koniugaty PEG pochodz ace od reagentów PEG o niskim ci ezarze cz asteczkowym (np. 5 kDa) mog lyby by c zidentyfikowane z zadawalaj ac a dok ladno- sci a na podstawie odpowiednich profili SDS-PAGE. Poziomy endotoksyny Stosuj ac metode LAL, we wszystkich PEG koniugatach, z wyj atkiem jednego pochodnego ure- tanu, wykryto < 1 EU/mg endotoksyny. W tym koniugacie PEG endotoksyn e wykryto jedynie po roz- cie nczeniu. Potwierdzi lo to, ze nie jest to spowodowane zanieczyszczeniem próbki w czasie jej roz- cie nczania i co za tym idzie, w próbce tej musi wyst epowa c jaki s nieznany materia l wywo luj acy ha- mowanie oznaczenia LAL, przy wy zszym st ezeniu bia lka. Po rozcienczeniu próbki, a co za tym idzie, rozcie nczeniu substancji hamuj acej, uzyskano pozytywny wynik dla endotoksyny. Aktywno sc biologiczna W Tabeli 2 podano aktywno sci biologiczne, in vitro i in vivo, wszystkich koniugatów Muteina GCSF-PEG. Na ogó l obserwuje si e odwrotnie proporcjonaln a zale znosc mi edzy aktywno scia in vitro i stopniem podstawienia, jak równie z ciezarem cz asteczkowym PEG. Przeciwnie, zaobserwowano zwi ekszenie aktywno sci in vivo wraz ze zwi ekszeniem ciezaru cz asteczkowego podstawiaj acego PEG. Jest to równie z obserwowane przez innych (Satako-Ishikawa i wsp., Cell Struct Funct. 17(3): 157-60, 1992). Postuluje si e, ze przy laczenie chemiczne cz asteczek PEG do szkieletu polipeptydo- wego Muteiny GCSF wywo luje pewn a form e zmian konformacyjnych wp lywaj acych ujemnie na od- dzia lywania receptor/ligand, a co za tym idzie zmniejszaj ac a powinowactwo wi azania. Ponadto, sto- sunkowo krótki czas inkubacji w oznaczeniu in vitro jest prawdopodobnie niewystarczaj acy dla uzy- skania maksymalnej aktywno sci. Z drugiej strony, oznaczenie in vivo u myszy jest znacznie d luzsze (dni) i ko nczy si e kilka dni po wstrzykni eciu leku. D lu zszy czas inkubacji w polaczeniu ze zwi ekszonym pó lokresem trwania w kr azeniu Muteiny GCSF-PEG kompensuje jak akolwiek utrat e powinowactwa wi azania z powodu pegylacji. Ko ncowym wynikiem jest osi agni ecie in vivo maksymalnej aktywno sci biologicznej. Inn a hipotez a jest taka, ze Muteina GCSF-PEG, gdy wstrzyknie si e j a myszy, dzia la jako prolek. W tej sytuacji wyst epuj aca w koniugacie Muteina GCSF-PEG cz asteczka PEG jest w jaki s sposób nieustannie odcinana, co powoduje ci ag le uwalnianie minimalnych ilo sci wolnej Muteiny GCSF, odpowiedzialnej za podtrzymanie i zwi ekszenie aktywno sci in vivo. Jednak ze hipoteza proleku nie wyja snia obserwowanej in vivo, w 7 dni po pocz atkowym podaniu, aktywno sci podstawowej. Me- chanizm proleku jest ma lo prawdopodobny, poniewa z wi azanie amidowe mi edzy bia lkiem i PEG jest stabilne i nie ulega latwo ci eciu. W sród badanych 15 koniugatów Muteina GCSF-PEG ma znacz aco wy zsz a aktywno sc in vivo, w porównaniu z pozosta lymi preparatami, ujawnia ly P-12GA-1, 20 kDa SPA, 20 kDa uretan i 36 kDa uretan, (patrz Fig. 4 i Tabela 2). Ogólnie, obserwowano wprost proporcjonaln a zale znosc mi edzy ciezarem cz asteczkowym cz a- steczki PEG i zwi ekszon a aktywno scia in vivo. Zilustrowano to na Fig. 5, gdzie wzrost liczby PMN jest wyra zony jako funkcja ca lkowitej masy PEG w koniugatach PEG zwi azanych amidem (SPA) i mocznikiem. Selekcja i charakterystyka koniugatów Muteina GCSF-PEG Po starannej ocenie chemii sprz egania, biologicznych w lasciwo sci i sposobu przygotowania le- ku dotycz acej 15 koniugatów PEG, dla dalszej oceny wybrano trzy: 1) P-12GA-1, 2) 20 kDa SPA i 3) 20 kDa uretan. Oceniano pochodne 20 kDa SPA koniugaty mono-, di- i tri-PEG obecne w oczyszczo- nej SP mieszaninie reakcyjnej w bezpo srednim porównaniu g lowa do g lowy, które pokazuje, ze wszystkie trzy zachowuja wysok a aktywno sc granulopoetyczn a przez 5 dni po podaniu samicom my- szy C57BL/6J pojedynczej dawki 25,2 µg, (Tabela 3 i Fig. 4). Przeciwnie, dla uzyskania podobnej aktywno sci (wyniki nie przedstawione) potrzebne by lo codzienne podawanie niezmodyfikowanej Mute- iny GCSF. We wszystkich, z wyj atkiem dwóch przypadków (20 kDa SPA i P-12GA-1), aktywnosc in vivo powraca la do normalnego poziomu w 7 dniu po podaniu myszy pocz atkowej dawki (Fig. 6). Za- równo koniugat 20 kDa SPA jak i P-12GA-1 wykaza ly zwi ekszon a aktywnosc przy ni zszych dawkach 8,4 µg i powróci ly do normalnych poziomów w 7 dniu (patrz Tabela 3). Dane dotycz ace procentowego sk ladu (Tabela 3) wskazuj a, ze oba preparaty 20 kDa SPA i P-12GA-1 zawieraj a oko lo 50% dimeru, a pozosta le 50% jest roz lo zone mi edzy monomerem i trimerem. Reagent 20 kDa uretan wytwarza w stosowanych warunkach eksperymentalnych g lównie mono-PEG (patrz Tabela 3). Oceniono aktyw-PL 203 462 B1 10 no sc in vitro wszystkich koniugatów PEG, w lacznie z dominuj ac a monomeryczn a pochodn a uretanow a zgodnie z ogólnym wzorem odwrotnej zale zno sci mi edzy stopniem podstawienia jak równie z ciezarem cz asteczkowym PEG. Ocena aktywno sci biologicznej in vivo koniugatów PEG wykaza la wprost pro- porcjonaln a zale zno sc wzgl edem ciezaru cz asteczkowego PEG, poza zakresem ci ezaru cz asteczko- wego badanych koniugatów (Fig. 5). Wniosek W sród 15 badanych koniugatów Muteina GCSF-PEG dobre profile aktywno sci in vivo wykazuj a preparaty P-12GA-1, 20 kDa SPA i 20kDa z lacznikiem uretanowym. 20 kDa Muteina GCSF-PEG wykaza la najlepsze wszystkie w la sciwo sci, w lacznie z ekonomiczno scia jej wytwarzania. T a b e l a 1. Warunki reakcji stosowane do wytwarzania ró znych koniugatów PEG MW Chemia Warunki reakcji pH Temperatura Czas Stosunek 5k mocznik 10 RT 1 godz. 1:100 5k amid 7,3 RT 4 godz. 1:30 10k mocznik 10 RT 1 godz. 1:100 10k amid 7,3 RT 4 godz. 1:30 10k uretan 10 4°C 1 godz. 1:30 15k amid 7,3 RT 4 godz. 1:30 20k amid 7,3 RT 4 godz. 1:30 20k tiouretan 8 RT 17 godz. 1:30 20k uretan 10 4°C 1 godz. 1:30 25k mocznik 10 RT 1 godz. 1:100 36k uretan 8 4°C 6 godz. 1:3 RT- temperatura pokojowa T a b e l a 2. Kompozycja, masa PEG i dane o aktywno sci biologicznej ró znych koniugatów Muteina GCSF-PEG Aktywno sci Rodzaj lacznika * sk lad procentowy mono-, di-, tri-, oligo *masa dodanego PEG M-NFS-60 WBC PMN (% kontroli) 1 2 3 4 5 6 Amid (b) 5K 17,3 22,3 51,3 9,1 12600** 9% 22,48 536+40 (a) 5K 0 0 0 100 20000 5% 18,65 539+23 (b) 10K 9,8 63 27,2 0 21700** 11% 20,48 632+82 (a) 10K 10 11 53 26 29500 4% 20,13 701+92 (b) 15K 13,7 61,2 25,1 0 31710 6% 26,68 751+115PL 203 462 B1 11 cd. tabeli 2 1 2 3 4 56 (c) 20K 27,6 49,5 22,9 0 39100** 5% 29,23 977+120 Mocznik (a) 5K 28 19 23 23 11350 40% 12,78 254+27 (a) 10K 29 19 13 23 22800 42% 14,4 364+50 (b) 25K 24,7 15,4 41,6 18,7 63775 6% 27,78 716+87 Uretan (b) 10K 15,8 12,6 36,5 35 29050 10% 19,9 412+88 (c) 20K 81,8 4 14,2 0 26800** 7% 25,83 656+52 (a) 36K 50 50 0 0 54000 15% 25,05 888+132 Tiouretan (b) 20K 70,8 12 17,3 0 28440 20% 21,85 494,71 GABA (b) 5K 43,4 54,3 2,3 0 18100** 11% 29 598+117 (c) 12K 36 47 17 0 46500** 3% 30,03 886+120 % sk lad i mas e dodanych PEG obliczono w oparciu o pomiar densytometryczny wybarwionego Coomassie-blue SDS-PAGE(*) lub przez analiz e MALDI TOF MS (**) (a), (b), (c): ka zde oznacza odr ebne oznaczenie biologiczne; dane dotycz a PMN 5 dnia T a b e l a 3. Sk lad, masa PEG, miejsca pegylacji i dane dotycz ace aktywno sci biologicznej trzech wiod acych cz asteczek Sk lad procentowy Aktywno sc cz asteczka PEG mono di tri oligo WBC PMN (% kontroli) Masa PEG (kDa) ** M- NFS 60 Dzie n 5 Dzie n 7 Dzie n 5 Dzie n 7 No snik (kontrola) ND 28: pojedyncze wstrzykni ecie 25,2 µg ND 28: codzienne wstrzykni ecie 25,2 µg 8,78 8,05 26,5 8,97 6,1 24,58 100 86 1182 100 76 906 Dawka 8,4 µg 25,4 µg8,4 µg 25,2 µg8,4 µg 25,2 µg 8,4 µg 25,2 µg 12K GABA 36,0 47,0 17,0 0,0 46,5 3% 22,75 30,3 10,7 24,1 701 1064 140 556 20K SPA 27,6 49,5 22,9 0,0 38,1 5% 13,58 21,63 7,5 15,45 519 978 103 447 20K uretan 81,8 4,0 14,2 0,0 26,8 7% 8,35 17,43 6,78 7,93 222 729 74 119PL 203 462 B1 12 Samicom myszy C57BL/6J podano 8,4 lub 25,2 µg koniugatu PEG zarówno jako dawk e dzien- n a ND-28 lub jako pojedyncz a dawk e. Dnia 5 i dnia 7 po pocz atkowym podaniu pobrano próbki krwi zylnej i przeprowadzono ró znico- w a analiz e leukocytów. * W oparciu o densytometryczny pomiar SDS-PAGE barwionego Coomassie. ** Okre slona przez MALDI TOF MS. P r z y k l a d 2: Wytwarzanie 20 kDa PEG skoniugowanego z rhG-CSF Mutein a Modyfikacj e muteiny G-CSF 20 kDa kwasem metoksy-PEG sukcynimidylopropionowym (SPA) przeprowadzono w nast epuj acy sposób. Reagent PEG rozpuszczono w destylowanej wodzie do st e- zenia ~200 mg/ml i dodano do roztworu muteiny G-CSF (~5 mg/ml) w stosunku molowym od 4:1 do 6:1 (nadmiar reagenta). Reakcja przebiega la przez 20 godzin w temperaturze od 4°C do 8°C w pH ~7,5. Przy ko ncu reakcji, w celu jej zatrzymania, dodano lodowatego kwasu octowego. Pegylowan a Mutein e GCSF (okre slan a równie z jak PEGG) nast epnie oczyszczono od pozosta lo sci niezmodyfikowanej muteiny, nadmiaru reagenta PEG i innych zanieczyszcze n i sk ladników buforu obecnych w czasie reakcji modyfikacji. Poza pegylowanym bia lkiem jako produkty uboczne reakcji powstaj a N-hydroksy- sukcynimid i kwas polietylenoglikolokarboksylowy. PEGG oczyszczono przez kationowymienna chromatografi e, a nast epnie ultras aczenie. Kolum- n e do wymiany kationowej za ladowano i przemyto 20 mM octanem sodu, pH 4,0. Przez wymywanie liniowym gradientem chlorku sodu oddzielono PEGG od wszystkich innych sk ladników obecnych w mieszaninie reakcyjnej. Nast epnie w celu zatezenia PEGG do stezenia ~4,0 mg/ml zastosowano ultrafiltracj e/diafiltracj e i wymieniono bufor na 20 mM octan sodu, 50 mM chlorek sodu, pH 6,0. W warunkach podanych powy zej przeprowadzono pi ec reakcji pegylacji i oczyszczania, które analizowano przez chromatografi e jonowymienn a na kationicie, co pokaza lo powtarzalno sc reakcji pegylacji muteiny G-CSF. Wykazano, ze reakcja pegylacji jest powtarzalna w zakresie do 2,5 g (ko n- cowa ilosc uzyskanego PEGG), gdy by la prowadzona w ni zej podanych optymalnych warunkach: stosunek 20 kDa-SPA-PEG: muteina 4 do 6:1; pH ~7,5, 4°C, 20 godzin. Sredni sk lad procentowy mie- szaniny PEGG okre slono na 21,7% mono-PEGG (%RSD=16,6), 60,3% di-PEGG (%RSD=6,6), 15,1% tri-PEGG (%RSD=4,0) i 2,9% tetra-PEGG (%RSD=26,1), jak pokazano w Tabeli 4. T a b e l a 4: Analiza przez jonowymian e na kationicie wzgl ednego procentowego sk ladu mono-, di-, tri- i tetra-PEGG w pi eciu mieszaninach otrzymanych przez syntez e i oczyszczanie PEGG. Numer syntezy Mono-PEGG (%RSD, pi ec oznacze n) Di-PEGG (%RSD, pi ec oznacze n) Tri-PEGG (%RSD, pi ec oznacze n) Tetra-PEGG (%RSD, pi ec oznacze n) 1 21,9% (8,0) 60,3% (2,2) 15,1% (2,2) 2,7% (4,7) 2 27,5% (2,3) 54,4% (1,0) 15,7% (0,8) 2,4% (1,2) 3 18,2% (7,1) 65,5% (0,6) 14,3% (6,6) 2,0% (9,3) 4 21,7% (2,7) 60,1% (1,0) 14,8% (0,5) 3,5% (0,9) 5 19,2% (1,8) 61,3% (0,9) 15,7% (3,7) 3,8% (4,5) Sredni sk lad 21,7% (16,6) 60,3% (6,6) 15,1% (4,0) 2,9% (26,1) P r z y k l a d 3 Mobilizacja komórek macierzystych krwi obwodowej Opracowano sposoby pobudzenia zarówno pierwotnych komórek macierzystych jak i pocho- dz acych ze szpiku kostnego i namna zania kr az acych we krwi obwodowej komórek progenitorowych. Takie pobudzone komórki mog a by c zdolne do po sredniczenia we wczesnym i podtrzymywanym wszczepieniu si e po letalnym napromienianiu i przeszczepie szpiku kostnego lub komórek macierzys- tych, Neben S. Marcus K i Mauch, P: Mobilization of hematopoietic stem and progenitor cell subpopu- lations from the marrow to the blood of mice following cyclophosphamide and/or granulocyte colony- -stimulating factor. Blood 81: 1960 (1993). W laczanie komórek macierzystych krwi obwodowej (PBSC) mo ze pomóc w skróceniu odnowy hematopoetycznej u pacjentów z zanikiem szpiku kostnego indu- kowanym przez chemioterapi e lub u tych pacjentów, u których zastosowane jest inne traktowanie niszcz ace szpik, Roberts AW i Metcalf D: Granulocyte colony-stimulating factor induces selective elevations of progenitor cells in the peripheral blood of mice. Experimental Hematology 22: 1156 (1994).PL 203 462 B1 13 Zarówno czynniki wzrostowe jak i leki chemioterapeutyczne by ly u zywane do pobudzenia mobilizacji, Bodine, D: Mobilization of peripheral blood „stem” cells: where there is smoke, is there fire? Experi- mental Hematology 23: 293 (1995). Po pobudzeniu PBSC aktywowane komórki s a zbierane przez leukoferez e i przechowywane w temperaturze ciek lego azotu a z do momentu, gdy b ed a potrzebne. Obecnie stosowane protoko ly kliniczne wymagaj a powtarzanego zbierania przez leukoferez e koncen- tratów PBSC po typowej chemioterapii z zastosowaniem wysokiej dawki (CHT) i powtarzanego co- dziennie dawkowania lub ci ag lego wlewu z czynnikami wzrostowymi, trwaj acego czasem dwa tygo- dnie i d luzej, Brugger W, Bross K, Frisch J, Dern P, Weber B, Mertelsmann R i Kanz, L: Mobilization of peripheral blood progenitor cells by sequential administration of Interleukin-3 and granulocyte- -macrophage colony-stimulating factor following polychemotherapy with etopside, fosfamide, i cispla- tin. Blood 79: 1193 (1992). Opisane poni zej badania przeprowadzono na dwóch mysich modelach mobilizacji PBSC; w pierwszym modelu stosowano normalne myszy, a w drugim myszy poddane chemioterapii. Do swiadczenia pokaza ly zwi ekszon a skuteczno sc pegylowanej G-CSF Muteiny wed lug wynalazku (PEGG), w porównaniu z NEUPOGEN (G-CSF), pod wzgl edem zdolno sci mobilizowania komórek macierzystych. Równie z pokazano przewag e pegylowanej muteiny z uwagi na znacz aco zmniejszony i bardziej skuteczny re zim dawkowania. W badaniach tych oceniono zdolno sc do namna zania si e mobilizowanych, niedojrza lych mysich PBSC stymulowanych in vitro wieloma czynnikami wzrostowymi w siedmiodniowym te scie wzrostu kolonii na agarze. Poza zdolno scia do tworzenia kolonii, przeprowadzono pe lne badania hematolo- giczne na krwi wszystkich myszy plus oszacowano ca lkowit a liczb e neutrofili (ANC). Okre slono rów- nie z poziomy G-CSF w surowicy. Po optymalizacji oznaczenia, kilkakrotnie przeprowadzono ekspery- menty badaj ac wysokie i niskie dawki G-CSF. Modele do swiadczalne obejmowa ly mobilizowanie indu- kowane przez G-CSF- i cycklofosfamid (Cytoxan), jak równie z leczenie skojarzone przy pomocy za- równo CHT jak i cytokiny. Materia ly i metody We wszystkich do swiadczeniach stosowano 6- do 10-tygodniowe samice myszy C57BL/6J, któ- re otrzymano z The Jackson Laboratory. W dniu - 1 myszom wstrzykni eto IP albo 200 mg/kg Cytoxanu lub no snika, którym jest solanka buforowana fosforanem (PBS). W dniu 0 zwierz etom wstrzykni eto S.C. albo 0,1 ml NEUPOGEN (GCSF), PEGG (20 kDa SPA zwi azanego z pegylowan a mutein a, partia #P20W3) lub nosnika PBS zawieraj acego 1% normaln a surowic e myszy. Myszy otrzymuj ace Neupo- gen dostawa ly codziennie iniekcje takiej samej dawki, podczas gdy wszystkie inne myszy otrzymywa ly no snik. W dniu zabicia zbierano krew obwodow a z zatoki ocznej znieczulonych myszy, do probówek zawieraj acych EDTA. Dla ka zdej grupy dodano niewielk a ilo sc spulowanej pe lnej krwi potrójnie na szalki do hodowli tkankowych o powierzchni 35 mm 2 , zawieraj ace 1000 U/ml zrekombinowanej (rm) mysiej Interleukiny-3, 100 ng/ml rm czynnika z komórek macierzystych i 1000 U/ml rm Interleukiny-6 w ca lkowitej objeto sci 1 ml po zywki RPMI 1640, uzupe lnionej 15% p lodow a surowic a bydl ec a i 0,35% agarem Difco. Zestalone agarem hodowle inkubowano przez jeden tydzie n w 37°C w wilgotnej atmos- ferze powietrza zawieraj acej 5% CO 2 . Kolonie liczono w ciemnym polu stosuj ac mikroskop stereoskopowy. Wyniki W pierwszym do swiadczeniu normalne myszy otrzymywa ly codziennie, w dniach 0-5, dawk e 25 µg/mysz NEUPOGEN lub jednorazowy zastrzyk, w dniu 0, z 25 µg/mysz PEGG. Myszy zabijano w dniach 3-7. Jak pokazano na Fig. 7, mobilizacja pokazana przez tworzenie kolonii by la znacz aco wi eksza, w dniach 3 i 4 u myszy, którym wstrzykni eto NEUPOGEN, lecz stopniowo zmniejsza la si e do poziomu podstawowego w dniu 5 (mimo wstrzykiwania NEUPOGEN przez 5 dni). Z drugiej strony myszy, którym wstrzykni eto PEGG wykaza ly wi eksz a liczb e kolonii, która pozosta la na poziomie pla- teau przez 7 dni. Paradygmat dla modelu chemioterapii by l podobny. Myszy w grupach CHT otrzyma ly w dniu - 1 zastrzyk Cytoxanu. Niektóre myszy w kolejnych dniach otrzymywa ly jedynie no snik, podczas gdy inne poddane by ly leczeniu skojarzonemu zarówno przez wstrzykiwanie NEUPOGEN w dniach 0-5 jak i pojedynczy zastrzyk z PEGG w dniu 0. Fig. 8 pokazuje, ze maksymalny efekt dzia lania Cytoxanu u myszy przypada na 4 dzie n, a w kolejnych dniach nast epuje stopniowy powrót do poziomów pod- stawowych. Zarówno w przypadku grupy NEUPOGEN jak i PEGG maksymalny efekt przypada na dzie n 5, pokazuj ac znaczne zwi ekszenie liczby kolonii. Jednak ze, warto sci dla Cytoxan + PEGG po- zostaj a znacz aco wy zsze ni z w przypadku grupy Cytoxan + NEUPOGEN w dniach 6 i 7. Na Fig. 9 pokazano synergistyczny efekt leczenia skojarzonego wzgl edem samego Cytoxanu lub samego G-CSF.PL 203 462 B1 14 Wyniki drugiego badania przedstawiono na Fig. 10 i 11. Normalne myszy, które otrzymywa ly codziennie iniekcje z ni zsz a dawk a, 3 µg/mysz NEUPOGEN przez 10 kolejnych dni, wykaza ly stosun- kowo niski poziom „wielofazowej” mobilizacji w czasie prowadzonego do swiadczenia. Zwierz eta, któ- rym wstrzykni eto pojedyncz a dawk e, 3 µg/mysz, PEGG wykaza ly w przybli zeniu pi eciokrotnie wi ecej mobilizowanych komórek progenitorowych w krazeniu obwodowym w dniu 4, chocia z efektem by l pojedynczy wyrzut, który zasadniczo zanika l w ci agu 6 dni. U myszy, którym wstrzykni eto Cytoxan, pojedyncza dawka 3 µg/mysz PEGG indukuje z grub- sza równowa zn a wielkosc mobilizacji PBSC jak 30 µg/mysz NEUPOGEN wstrzykiwany przez 10 dni w dawce 3 µg/dzie n (Fig. 11). Obie grupy wykazywa ly maksymaln a mobilizacj e komórek progenitoro- wych w dniu 5 i wielko sc tej mobilizacji by la identyczna. Jedyn a ró znic a wydaje si e by c nieznacznie d lu z- szy efekt opó znienia obserwowany w przypadku NEUPOGEN. Liczba kolonii w modelu CHT by la 4-10 razy wy zsza ni z obserwowana dla modelu normalnych myszy. Do swiadczenia te pokazuj a dwie wyra zne potencjalne korzy sci p lyn ace z pegylowanej muteiny wzgl edem NEUPOGEN. Po pierwsze, widoczna jest wi eksza skuteczno sc PEGG w porównaniu z NEUPOGEN pod wzgl edem zdolno sci do wywo lania mobilizacji PBSC, zarówno w przypadku myszy normalnych jak i myszy poddanych chemioterapii. Po drugie, pokazano ze pegylowana muteina jest bardziej skuteczna u myszy ni z NEUPOGEN, gdy stosuje si e zmniejszony i bardziej wydajny re zim dawkowania ni z ten, obecnie wykorzystywany dla stosowanego klinicznie produktu. PL PL PL