PL203543B1 - Sposób ekspresji wysokich poziomów biologicznie aktywnego bia lka fuzyjnego receptor limfotoksyny ß (LT- ß-R)-immunoglobulina, sposób wytwarzania preparatu farmaceutycznego zawieraj acego to bia lko, kompozycja, kompozycja farmaceutyczna i preparat farmaceutyczny - Google Patents

Description

Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób ekspresji wysokich poziomów biologicznie aktywnego bia l- ka fuzyjnego receptor limfotoksyny ß(LT- ß-R)-immunoglobulina, sposób wytwarzania preparatu farma- ceutycznego zawieraj acego to bia lko, kompozycja, kompozycje farmaceutyczne i preparat farmaceu- tyczny. Rodzina TNF sk lada si e z par ligandów i ich specyficznych receptorów okre slanych jako ligandy rodziny TNF i receptory rodziny TNF (Bazzoni i Beutler, 1996, Aggarwal i Natarajan, 1996). Ligandy takie jak TNF typowo znajduje si e jako zwi azane z b lon a postacie na powierzchni komórek lub w nie- których przypadkach s a one selektywnie odcinane z powierzchni komórki i wydzielane. Ligandy wi az a sie do specyficznych receptorów i zjawisko wi azania s lu zy do agregacji dwóch lub wi ecej receptorów. Wewn atrzkomórkowe domeny tych receptorów wyczuwaj a w jaki s sposób t e zmian e i komunikuj a t e informacj e komórce przez mechanizm transdukcji sygna lu, Rodzina bierze udzia l w regulacji uk ladu immunologicznego i by c mo ze innych uk ladów nieimmunologicznych. Regulacja jest cz esto "nadrz ed- nym przelacznikiem" takim, ze sygnalizacja rodziny TNF mo ze wywo lywa c du za ilosc kolejnych zda- rze n najlepiej prezentowanych przez TNF. TNF mo ze inicjowa c ogóln a ochronn a zapaln a odpowied z organizmu na obc a inwazj e, która obejmuje zmienione wystawianie cz asteczek adhezyjnych bior a- cych udzia l w interakcjach mi edzy komórkami, produkcj e chemokin do kierowania specyficznych ko- mórek do specyficznych przedzia lów i napi etnowanie ró znych komórek efektorowych. Jako taka regu- lacja tych szlaków ma potencja l kliniczny. Rodzina receptora TNF jest zbiorem spokrewnionych bia lek, które na ogó l sk ladaj a si e z domeny zewn atrzkomórkowej, domeny transb lonowej i wewn atrzkomórkowej domeny sygnalizu- j acej. Zewn atrzkomórkowa domena jest zbudowana z 2-6 kopii domeny sci sle po laczonej most- kami disiarczkowymi i jest rozpoznawana na podstawie unikalnego u lo zenia reszt cysteinowych (Banner i wsp., 1993). Ka zdy receptor wi aze si e z odpowiednim ligandem (ligandami), cho c jeden ligand mo ze mie c kilka receptorów. W niektórych przypadkach jest jasne, ze rozpuszczalne po- stacie receptorów pozbawionych regionu transb lonowego i/lub domeny wewn atrzkomórkowej ist- niej a w stanie naturalnym. W stanie naturalnym skrócone wersje tych receptorów mog a mie c bez- po srednie biologiczne role regulacyjne. Przyk ladu tego procesu dostarcza system osteoprotege- ryny. Osteoprotegeryna jest wydzielanym receptorem rodziny TNF, który blokuje sygnalizacj e przez RANK-L (tak ze zwany TRANCE) i/lub TRAIL na receptory, które wywo luj a aktywacj e oste- oklastów. Przez blokowanie tych receptorów, najprawdopodobniej receptora RANK, zahamowana jest resorpcja ko sci i przyrasta masa ko sci (Bucay i wsp. 1988). Ewidentnie wirusy zastosowa ly t e taktyk e w celu hamowania aktywno sci TNF w organizmach gospodarzy (Smith i wsp. 1994). Te receptory mog a sygnalizowa c szereg zdarze n, w tym ró znicowanie komórek, sygna ly smierci lub prze zycia komórek. Sygnalizacja smierci komórek jest cz esto wywo lywana przez stosunkowo bezpo srednie powi azania z kaskad a proteaz typu kaspaz w przypadku receptorów Fas i TNF. Receptory TNF s a silnymi narz edziami do wyja sniania szlaków biologicznych, poniewa z s a one latwo przekszta lcane w immunologiczne bia lka fuzyjne, które maj a d lugie okresy pó ltrwania w surowi- cy. Rozpuszczalne dimeryczne formy receptora mog a by c inhibitorami zjawisk, w których bior a udzia l albo naturalne wydzielane albo zwi azane z powierzchni a ligandy. Przez wi azanie z tymi ligandami te bia lka fuzyjne zapobiegaj a interakcji ligandu z receptorami zwiazanymi z cz asteczk a i hamuj a towa- rzysz acy sygna l. Te bia lka fuzyjne Ig-receptor s a po zyteczne w znaczeniu eksperymentalnym i by ly tak ze z powodzeniem stosowane klinicznie na przyk lad TNF-R-Ig by l stosowany do leczenia zapalnej choroby jelita, reumatoidalnego zapalenia stawów i ostrego zespo lu klinicznego towarzysz acego podaniu OKT3 (Eason i wsp., 1996; Feldmann i wsp., 1997; van Dullemen i wsp., 1995). Manipulacja wieloma zdarzeniami, w których bierze udzia l sygnalizacja przez rodzin e receptorów TNF, mo ze mie c zastosowanie w leczeniu chorób o podstawie immunologicznej jak i szerokiego zakresu ludzkich cho- rób maj acych patologiczne nast epstwa wynikaj ace z udzia lu uk ladu immunologicznego. Na przyk lad, wykazano, ze rozpuszczalna posta c ostatnio opisanego receptora, osteoprotegeryny, blokuje utrat e masy ko sci (Simmonet i wsp., 1997). Tak wi ec zjawiska kontrolowane przez sygnalizacj e receptorów rodziny TNF niekoniecznie s a ograniczone do regulacji uk ladu immunologicznego. Przeciwcia la prze- ciw receptorowi mog a blokowa c wi azanie ligandu i to mog a tak ze miec zastosowanie kliniczne. Takie przeciwcia la cz esto zyja bardzo d lugo i mog a mie c przewag e nad rozpuszczalnymi bia lkami fuzyjnymi Ig- receptor, które maj a krótsze okresy pó ltrwania we krwi.PL 203 543 B1 3 Podczas gdy hamowanie szlaku z udzia lem receptorów reprezentuje najbardziej wykorzystywa- ne terapeutyczne zastosowanie tych receptorów, pocz atkowo obiecuj aca klinicznie wydawa la si e ak- tywacja receptorów TNF (Aggrawal i Natarajan, 1996). Aktywacja receptorów TNF mo ze zainicjowa c smier c komórkow a komórki docelowej i st ad zastosowanie w nowotworach by lo i nadal jest atrakcyjne (Eggermont i wsp., 1996). Receptor mo ze by c aktywowany albo przez podanie ligandu tj. naturalny szlak lub przez podanie przeciwcia l, które mog a krzy zowo wi aza c si e z receptorem. Przeciwcia la mo- g a by c korzystne dla leczenia, na przyk lad, raków, poniewa z przeciwcia la mog a pozostawa c w krwi przez d lugi czas w przeciwie nstwie do ligandów, które na ogól maja krótk a d lugo sc zycia we krwi. Przeciwcia la agoni sci s a u zyteczn a broni a w leczeniu raka, poniewa z receptory mog a by c wyra zane bardziej selektywnie w nowotworach lub mog a tylko sygnalizowa c smier c komórek lub ró znicowanie w nowotworach. Podobnie wiele korzystnych zdarze n immunologicznych odbywa si e za po srednic- twem receptorów z rodziny TNF, np. reakcje zapalne gospodarzy, produkcja przeciwcia l itd. i dlatego agonistyczne przeciwcia la mog a mie c korzystne dzia lania w innych, nieonkologicznych zastosowa- niach. Paradoksalnie, zahamowanie szlaku mo ze te z dawa c kliniczne korzy sci w leczeniu nowotwo- rów. Na przyk lad, ligand Fas jest wyra zany przez pewne nowotwory i ta ekspresja mo ze doprowadzi c do smierci limfocytów Fas dodatnich, co u latwia nowotworom ucieczk e uk ladem immunologicznym. W tym przypadku inhibicja uk ladu Fas umo zliwi laby reakcj e uk ladu immunologicznego na nowotwór obecnie w inny sposób, gdy dost ep jest ju z mo zliwy (Green i Ware 1997). Jeden cz lonek tej rodziny receptorów, receptor limfotoksyny beta (LT ßR) wiaze si e z po- wierzchniow a limfotoksyn a (LT), która jest z lo zona z trimerowego kompleksu lancuchów alfa i beta limfotoksyny (Crowe i wsp., 1994). Ta para receptor-ligand bierze udzia l w rozwoju obwodowego uk la- du immunologicznego i regulacji zjawisk w w ez lach ch lonnych i sledzionie w dojrza lym uk ladzie im- munologicznym (Ware i wsp., 1995; Mackay i wsp., 1997; Rennert i wsp., 1996; Rennert i wsp., 1997; Chaplin i Fu, 1998). Mo zna wytworzy c bia lko fuzyjne receptor limfotoksyny ß-immunoglobulina mi edzy LT ßR i IgG (LT ßR-Ig), która blokuje sygnalizacj e mi edzy powierzchniowym ligandem LT i receptorem z konsekwencjami dla stanu funkcjonalnego p echerzykowych komórek dendrytycznych (Mackay i Browning 1998). To blokowanie mo ze dalej doprowadzi c do zmniejszenia objawów choroby autoim- munizacyjnej w modelach gryzoni (Mackay i wsp., 1998, U.S.S.N. 08/505,606 zg loszony 21 lipca, 1995 i U.S.S.N. 60/029,060 zg loszony 26 pa zdziernika 1996). Drugi cz lonek tej rodziny receptorów zwany HVEM (herpes virus entry mediator - mediator wej scia wirusa opryszczki) wi aze si e z ligandem zwanym Light (Mauri i wsp., 1998) jak i z heteromerycznym ligandem LT. Rola tego receptora jest obecnie nieznana, ale bia lko fuzyjne HVEM-Ig mo ze by c przydatne w leczeniu choroby immunolo- gicznej i wykazano, ze ten konstrukt wp lywa na oznaczenia funkcji immunologicznych in vitro (Harrop J.A. i wsp., 1998). Mimo post epu klinicznego dotycz acego cz lonków rodziny TNF jak omówiono powy zej pozostaje potrzeba opracowania sposobu uzyskania zadanych wydajno sci fuzji receptor-Ig odpowiednich do stosowania w warunkach klinicznych. Na przyk lad, bia lko LT ßR-Ig mo ze by c w dwóch postaciach, gdy jest wyra zane w ma lpich komórkach cos lub w komórkach jajnika chomika chi nskiego. Jedna posta c wiaze si e z ligandem z wysokim powinowactwem, a druga nie. Tak wi ec istnieje potrzeba sposobu produkcji wy zszych wydajno sci postaci, która wiaze si e z wy zszym powinowactwem, zarazem minima- lizuj ac obecnosc postaci z ni zszym powinowactwem. Wynalazek dotyczy sposobu ekspresji wysokich poziomów biologicznie aktywnego bia lka fuzyj- nego receptor limfotoksyny ß(LT- ß-R)-immunoglobulina, który obejmuje hodowanie gospodarza trans- formowanego DNA koduj acym bia lko fuzyjne receptor LT- ß-R- -Ig w ssaczym uk ladzie hodowlanym w niskiej temperaturze od 27°C do 35°C. Korzystnie temperatura wynosi 27°C do 32°C. Korzystnie transformowanego gospodarza najpierw hoduje si e w temperaturze powy zej 33°C przez czas wystarczaj acy do jego wzrostu. Korzystnie ponadto obejmuje etap odzyskiwania biologicznie aktywnego bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig z tego uk ladu hodowli za pomoc a chromatografii oddzia lywa n hydrofobowych. Niniejszym przedstawiono sposoby ekspresji z wysokimi wydajno sciami postaci fuzji bia lko-Ig majacych wysokie powinowactwo wi azania do swojego ligandu okre slanych tu jako posta c "'aktywna" przez hodowanie gospodarzy transformowanych DNA koduj acym zadane bia lka fuzyjne w uk ladzie hodowli w niskiej temperaturze, w ten sposób minimalizuj ac ilosc postaci bia lek zle sfa ldowanych lub ze zle utworzonymi mostkami.PL 203 543 B1 4 W zakres wynalazku wchodzi równie z sposób wytwarzania preparatu farmaceutycznego zawie- rajacego biologicznie aktywne bia lko fuzyjne receptor limfotoksyny ß-Ig(LT- ß-R)-Ig obejmuj acy: (a) hodowanie gospodarza transformowanego DNA koduj acym bia lko fuzyjne LT- ß-R-Ig w ssa- czym uk ladzie hodowlanym w niskiej temperaturze od 27°C do 32°C i wyra zanie w ten sposób aktyw- nego bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig; (b) odzyskanie aktywnego bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig z tego uk ladu hodowli; i (c) po laczenie aktywnego bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig z etapu (b) z dopuszczalnym farmaceu- tycznie no snikiem. Wynalazek dotyczy równie z kompozycji obejmuj acej aktywne bia lko fuzyjne receptor limfotok- syny ß-immunoglobulina (LT- ß-R-Ig) i nieaktywne bia lka fuzyjne LT- ß-R-Ig, przy czym 0% do 30% bia lek fuzyjnych LT- ß-R-Ig jest nieaktywnych. Korzystnie w kompozycji 0% do 17% lub 0% do 10% lub 0% do 6% bia lek fuzyjnych LT-P-R-Ig jest nieaktywnych. Korzystnie w kompozycji aktywne bia lka fuzyjne LT- ß-R-Ig s a rozpoznawane przez funkcjonal- nie swoiste przeciwcia lo. Korzystnie domena Fc jest izotypu IgG1. Korzystnie kompozycja jest otrzymana przez hodowanie ssaczej komórki gospodarza transfor- mowanej DNA koduj acym bia lko fuzyjne receptor limfotoksyny (LT- ß-R)-Ig w uk ladzie hodowlanym w temperaturze od 27°C do 35 °C, przy czym zawiera aktywne i nieaktywne formy bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig. W zakres wynalazku wchodz a równie z kompozycje farmaceutyczne zawieraj ace srodek aktyw- ny i dopuszczalny farmaceutycznie no snik, w której srodkiem aktywnym jest kompozycja wed lug wy- nalazku. Ponadto wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego obejmuj acego kompozycj e wed lug wynalazku, w której 0% do 30% bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig jest w postaci nieaktywnej i który jest otrzymany przez: (a) hodowanie gospodarza transformowanego DNA koduj acym bia lko fuzyjne LT- ß-R-Ig w ssa- czym uk ladzie hodowlanym o niskiej temperaturze od 27°C do 32°C w ten sposób wyra zaj ac kompo- zycj e obejmuj ac a biologicznie aktywne bia lko fuzyjne LT- ß-R-Ig. (b) odzyskiwanie aktywnego bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig z tego uk ladu hodowli; i dopuszczalny farmaceutycznie no snik. Krótki opis figur Figura 1. Schemat chimerowego bia lka receptor-immunoglobulina. Lewy panel przedstawia ry- sunek typowej cz asteczki IgG, domeny Fc wype lnione s a na czarno, domeny zmienne la ncucha ciez- kiego s a zabarwione na szaro, a lancuchy lekkie s a bia le. Srodkowy panel przedstawia schematyczny rysunek cz asteczki LT ßR obejmuj acej wewn atrzkomórkowe (ciemnoszare) i zewn atrzkomórkowe (ja- snoszare) domeny. Prawy panel przedstawia schemat bia lka fuzyjnego LT ßR-IgG. Figura 2. Schemat koncepcyjny pokazuj acy prawdopodobn a wad e postaci martwej "dead" LT ßR-Ig, cho c by c mo ze nie zidentyfikowano w la sciwych zle sfa ldowanych aminokwasów lub amino- kwasów z nieprawid lowo utworzonymi mostkami.. Figura 3. Analiza SDS-PAGE ludzkiego LT ßR-Ig przed i po dzia laniu PNGazy F. Scie zki 1 i 2 zawieraj a ludzki LT ßR-Ig oczyszczony z supernatantu hodowli CHO rosn acej w 37°C przy u zyciu chromatografii powinowactwa z bia lkiem A. Scie zka 3 przedstawia ten sam preparat po dzia laniu PN- Gaz a F w celu usuni ecia wszystkich N-zwi azanych oligosacharydów. Scie zka 1 jest puszczana w warunkach nieredukuj acych, scie zki 2 i 3 s a puszczane w warunkach redukuj acych. Prazki bia lka wizualizuje si e przez barwienie zelu Coomassie Brilliant Blue. Figura 4. Analiza bialka przep lywajacego przez kolumn e powinowactwa AGH1 i bia lka eluowa- nego buforem pH 3,5 na nieredukuj acym zelu poliakrylamidowym SDS. Bia lko przed oczyszczaniem za pomoc a powinowactwa jest pokazane w scie zce z prawej strony zelu. Prazki bia lka wizualizuje si e przez barwienie Coomassie Brilliant Blue. Figura 5. Zdolno sc frakcji przep lywu (dolne) i eluowanych (górne) z kolumny powinowactwa AGH1 do wi azania z powierzchniow a limfotoksyn a. Srednie warto sci intensywno sci fluorescencji po- chodz a z analizy FACS jak opisano. Przyk lady profili FACS przedstawiono z prawej gdzie LT ßR-Ig porównano z wi azaniem kontrolnego bia lka LFA-3-Ig. Figura 6. Analityczna chromatografia HIC ludzkiego LT ßR-Ig przy u zyciu kolumny eterowej PO- ROS i zmniejszania gradientu siarczanu amonu. Pik 1 przestawia ni zsz a nieczynn a posta c, pik 2PL 203 543 B1 5 wi eksz a, aktywn a posta c ludzkiego LT ßR-Ig. Frakcje odpowiadaj ace odpowiednio pikowi 1 i 2 po la- czono i analizowano w zelu 4-20% SDS-PAGE (wstawiony panel). Scie zka oznakowana "1" zawiera "nieaktywny" materia l z piku 1, scie zka 2 "aktywny" materia l z piku 2 chromatogramu HIC. Materia l wyj sciowy jest przedstawiony w scie zce "1". Scie zka oznakowana "M" zawiera markery masy cz a- steczkowej. Figura 7. Preparatywna chromatografia HIC (hydrofobowa chromatografia interakcyjna) ludz- kiego LT ßR-Ig przy u zyciu kolumny 15 PHE Pharmacia Source. Eluat bia lka A zawieraj acy ludzki LT ßR-Ig doprowadzano 5M NaCl do ko ncowego st ezenia 1,5 M NaCl, 20 mM fosforan sodu, pH 7,0 i na ladowano na kolumn e. Kolumn e p lukano 5 obj eto sciami 1,5 M NaCl, 20 mM fosforanu sodu, pH 7,0 i eluowano 20 mM fosforanem sodu, pH 7,0. O s X przedstawia czas w minutach, o s Y pokazu- je absorbancj e przy 280 nm. We wstawce Figury pokazano obraz nieredukuj acego zelu SDS-PAGE 4-20% wybarwionego Commassie Brilliant Blue pul frakcji przep lywowej (FT) i Lucji (E). Pozycje mi- gracji postaci "live" i "dead" wskazano strza lkami. Figura 8. Analiza SDS PAGE/Western-blot ludzkiego LT ßR-Ig wydzielanego z komórek CHO rosn acych w ró znych temperaturach. Supernatanty komórek CHO rosn ace we wskazanych tempera- turach hodowli zawieraj ace ludzki LT ßR-Ig analizowano w dwóch powtórzeniach za pomoc a nieredu- kuj acej elektroforezy SDS-PAGE stosuj ac zele gradientowe 4-20% a nastepnie transfer typu western- blotting. Figura 9. Wp lyw temperatury hodowli na procent materia lu "dead" w ca lkowitej ilo sci ludzkiego LT ßR-Ig wydzielanego z komórek ssaków. Butelki w dwóch powtórzeniach zawieraj ace komórki CHO wydzielaj ace zrekombinowany ludzki LT ßR-Ig hodowano we wskazanych temperaturach i wydzielany ludzki LT ßR-Ig oczyszczano za pomoc a chromatografii powinowactwa z bia lkiem A. Procent "nieak- tywnej" formy ludzkiego LT ßR-Ig oceniano w dwóch powtórzeniach stosuj ac analityczn a chromatogra- fi e HIC. Na osi X przedstawiono temperatur e hodowli, na osi Y przedstawiono ilo sc "nieaktywnego" materia lu wyra zanego jako procent ca lkowitej ilo sci ludzkiego LT ßR-Ig wydzielanego przez komórki. Figura 10. Analiza na nieredukuj acym SDS-PAGE HVEM-Ig wytworzonego w 28, 32 i 37°C. Oczyszczone za pomoc a bia lka A preparaty HVEM-Ig pochodz ace z komórek hodowanych w 28, 32 i 37°C mieszano z buforem do próbek do nieredukuj acego SDS-PAGE i poddano elektroforezie w uprzednio wylanych zelach 4-20% SDS-PAGE. Pr azki bia lka wizualizowano przez barwienie Co- omassie Brilliant Blue. Pr azek zaznaczony strza lk a przedstawia niezagregowany HVEM-Ig. Wy zsze masy cz asteczkowe na zelu odpowiadaj a postaciom zagregowanym. Figura 11. Analiza za pomoc a FACS wi azania HVEM-Ig wygenerowanego w 37° w stosunku do 32°C do powierzchniowego Light i/lub LT ß. A) Wi azanie HVEM-Ig jako funkcja st ezenia do komórek 293 transfekowanych ludzkim LIGHT pokazuje, ze materia l wygenerowany w 32 °C wi aze si e lepiej ni z materia l 37. B) Przyk lad obserwowanych profili FACS dla wi azania HVEM-Ig w st ezeniu 2 µg/ml do komórek 293 transfekowanych LIGHT. C) Dalszy przyk lad ulepszonego wi azania wygenerowanego w 32°C HVEM-Ig do powierzchni linii komórkowej hybrydomy II-23 T, która wyra za zarówno LIGHT i powierzchniowy kompleks limfotoksyny- a/ ß (LT- a/ ß). Figura 12. Analiza BIAcore wi azania albo ligandów LIGHT albo limfotoksyny- ß (LTP) do chipów BIA core z immobilizowanym HVEM-Ig wygenerowanym w trzech ró znych temperaturach. Ka zda krzywa pokazuje przypadek wi azania przy jednym st ezeniu ligandu i stosowanych nast epuj acych st e- zeniach: 30, 15, 7,5, 3,75, 1,87, 0,93, 0,47, 0,23, 0,11 i 0,0 µg/ml. Ka zdy chip ladowano do tego sa- mego poziomu RU wskazuj ac, ze zwi azano te same ilo sci receptor-Ig. Sukces interwencji klinicznych z bia lkami fuzyjnymi receptor-Ig wymaga d lugoterminowej obecno sci tych bia lek i zdolno sci do leczenia przewlekle lub przynajmniej w czasie wznowy cho- rób. Idealnie, preparaty takich bia lek fuzyjnych do stosowania u ludzi nie powinny obejmowa c zadnych postaci zagregowanych, nieaktywnych lub zle sfa ldowanych, poniewa z ich obecno sc b edzie obni za la moc leku, a zmienione struktury mog a wzbudza c odpowiedzi przeciwcia l, które mog a u latwi c usuni ecie leku z organizmu, tym samym zmniejszaj ac jego moc. Ponadto, przeciw- cia la przeciw receptorowi mog a bezpo srednio laczy c si e krzy zowo z naturalnym receptorem na powierzchniach komórki w ten sposób aktywuj ac go, tj. antagonistyczne przeciwcia la, takie jak te opisane w Browning i wsp. 1996, JEM. Agonistyczne przeciwcia la aktywuj a uk lad i w ten sposób dalsze terapie receptor-Ig mog a by c mniej skuteczne a nawet szkodliwe. Przez "immunoglobuli- nowe bia lka fuzyjne" nale zy rozumie c ka zd a fuzj e dowolnej funkcjonalnej cz esci zewn atrzkomór- kowej domeny polipeptydu z dowoln a cz esci a sta lych regionów immunoglobuliny np. domenami CH1, CH2 lub CH3 lub ich kombinacjami. Korzystnie polipeptyd jest cz lonkiem rodziny receptorówPL 203 543 B1 6 TNF. Cz esci cz asteczki Ig mog a pochodzi c z dowolnego z ró znych izotypów immunoglobulin obejmuj acych na przyk lad IgGl, IgG2, IgM, IgA itd. Przez „rodzin e receptorów TNF" nale zy rozu- mie c dowolny receptor, naturalnie zwi azany z b lon a lub wydzielany (jak w przypadku osteoprote- geryny), który ma kanoniczny dla rodziny TNF wzór mostków cysteinowych lub dowolny receptor, który wi aze si e z okre slonym cz lonkiem rodziny ligandów TNF (np. Banner i wsp., 1993). Bia lko LT ßR jest wyra zane w dwóch formach w ma lpich komórkach cos lub komórkach jajnika chomika chi nskiego. Jedna forma, która wi aze ligand z wysokim powinowactwem, jest form a "aktywn a", podczas gdy druga forma, "nieaktywna" nie wi aze si e z ligandem. Mieszanina formy live ( zywej) i dead (martwej) nie by la uprzednio opisana dla jakiegokolwiek zestawu bia lek fuzyjnych receptor TNF-Ig, jednak natura nieaktywnej formy nie jest jasna. Dwie formy wykryto przez obecno sc dwóch pr azków w analizie SDS-PAGE. Wyra zany materia l charakteryzuje si e znaczn a heterogen- no sci a glikozylacji, jednak ta heterogenno sc prawdopodobnie nie powoduje opisanych tu proble- mów funkcjonalnych. Na przyk lad, gdy receptor jest wyra zany jako rozpuszczalna posta c mono- meryczna pozbawiona domeny transb lonowej i regionu Fc immunoglobuliny, obserwuje si e formy nieglikolizowane, mono- i di-N-glikozylowane. Zarówno postacie pojedynczo lub podwójnie gliko- zylowane mog a by c immunoprecypitowane za pomoc a BDA8, przeciwcia la, które rozpoznaje tylko postaci funkcjonalne. Ponadto postaci oczyszczone za pomoc a powinowactwa maj a podobn a heterogenno sc glikozylacji. Wydaje si e bardziej prawdopodobne, ze ekspresja nie zakotwiczonej w b lonie postaci prowadzi do jakich s nieprawid lowo sci w mostkach disiarczkowych daj ac nieod- powiednie po laczenia krzy zowe mi edzy dwoma ramionami dimera receptor-Ig. Rodzina receptorów TNF na ogó l ma 3-4 domeny powtórzone w cz esci zewn atrzkomórko- wej wi azacej ligand z oko lo 3 mostkami disiarczkowymi na domen e. Mo zna przypuszcza c, ze nie- odpowiednie fa ldowanie mog loby doprowadzi c albo do nieprawid lowego wzoru wi aza n disiarcz- kowych albo braku tworzenia pewnych wi aza n disiarczkowych (zilustrowane schematycznie na Figurze 2). W przypadku bia lka fuzyjnego receptor-Ig wydaje si e, ze wczesne sfa ldowanie dome- ny Fc umo zliwia jej pó zniejsz a dimeryzacj e, która doprowadza dwa la ncuchy LTBR, tzn. dwa ra- miona receptora, bardzo blisko siebie. Je sli domeny receptora jeszcze nie zako nczy ly fa ldowania istnieje mo zliwo sc parowania wolnych grup sulfohydrylowych mi edzy ramionami tj. tworzenia mostków mi edzy ramionami. Mo ze wyst api c takie nieprawid lowe fa ldowanie lub mo ze nast api c zmiana porz adku disiarczku mi edzy wolnymi grupami sulfhydrylowymi umieszczonymi obok siebie w pobli zu ju z wytworzonego wi azania disiarczkowego, w obu przypadkach prowadz ac do b ledów fa ldowania. Jest te z mo zliwe, ze nieprawid lowe fa ldowanie zachodzi w jednym ramieniu tj. b ledy fa ldowania wyst epuj a wewn atrz ramienia, cho c takie b ledy mog a nie powodowa c radykalnie zmienionego kszta ltu ko ncowej cz asteczki. W tym przypadku aktywne i nieaktywne postacie mog a nie by c latwe do rozdzielenia za pomoc a konwencjonalnych metod okre slania wielko sci. Na koniec wykazano, ze w receptorze TNFR55 czwarta domena, tj. domena najbli zsza re- gionowi transb lonowemu jest krytyczna dla wi azania ligandu, gdy receptor wyra zano jako bia lko fuzyjne z Ig (Marsters i wsp., 1992). Ta domena mo ze by c krytyczna dla wielu z receptorów TNF. Inne badania TNFR55 wykaza ly, ze by lo to krytyczne tylko w kontek scie bia lka fuzyjnego Ig i ze posta c b lonowa pozbawiona czwartej domeny by la w pe lni aktywna w wi azaniu ligandu TNF (Cor- coran i wsp. 1994). Jednak niedawno analizy krystalograficzne wykaza ly mo zliwe krytyczne funk- cje zwi azane z czwart a domen a (Naismith i wsp., 1996). Czwarta domena jest stosunkowo kon- serwowana mi edzy gatunkami, jednak jest pozbawiona bezpo srednich kontaktów z ligandem (Banner i wsp., 1993). Jest mo zliwe, ze mostki mi edzy ramionami w tym regionie mi edzy dwiema czwartymi domenami, które le za w pobli zu zawiasu i domen CH2+CH3 Fc nie zmienia lyby znacz- nie globalnego kszta ltu cz asteczki i st ad te z mog a by c niewidzialne w metodach podzia lu opar- tych na wielko sci. Tym niemniej cz asteczka wykazywa laby upo sledzone wi azanie ligandu. Recep- tory maj ace tylko 3 domeny mog lyby zachowywa c si e podobnie. Obni zenie temperatury w czasie hodowli komórek spowodowa lo znacz aco mniejsze wydzie- lanie b lednie sfa ldowanej mniejszej postaci (tzn. postaci nieaktywnej). To ulepszenie jest prawdo- podobnie wynikiem obni zonego tempa fa ldowania polipeptydu, co uwzgl ednia loby wi ecej czasu na sfa ldowanie indywidualnych domen cz esci LT ßR przed z lo zeniem bia lka fuzyjnego receptor-Ig do oczekiwanej postaci dimeru. Absolutna temperatura wymagana do zwolnienia procesu fa ldo- wania bia lek zale zy od gospodarza. Dla komórek ssaków (np. CHO) zastrzegany sposób korzyst- nie nast epuje w temperaturach od oko lo 27°C do oko lo 35°C, bardziej korzystnie temperatura wynosi oko lo 27°C do oko lo 32°C. Sposoby te mog a by c te z stosowane w uk ladach hodowli dro z-PL 203 543 B1 7 d zy. Hodowla dro zd zy musi rosn ac w temperaturze oko lo 10°C do oko lo 25°C, korzystnie od oko lo 15°C do oko lo 20°C aby uzyska c znacz ace korzy sci. Wykorzystanie zastrzeganego wynalazku pozwala na prawid lowe sfa ldowanie aktywnych bia lek fuzyjnych Ig. Mo ze w niektórych warunkach by c po zadane pozwolenie na wzrost komórek w wy zszych temperaturach, na przyk lad, od oko lo 37°C do oko lo 43°C, podczas którego nast api tylko niski poziom ekspresji sklonowanego genu. Po zadanym okresie wzrostu fuzje mog a by c wyra zane w niskich tem- peraturach, aby uzyska c zwi ekszon a wydajno sc aktywnych fuzji. Niska temperatura w uk ladach ssa- czych jak omówiono powy zej wynosi korzystnie oko lo 27°C do oko lo 35°C, bardziej korzystnie oko lo 27°C do oko lo 32°C. Zatem zastrzegane sposoby przez obni zenie temperatury, w której wyra zane s a fuzje bia lko-Ig, pozwalaj a specjali scie w dziedzinie na regulowanie fa ldowania zarówno cz esci bia lkowej jak i Ig za- danego bia lka. Dodatkowo, stosuj ac zastrzegane sposoby wed lug wynalazku obejmuj ace techniki chromato- grafii powinowactwa i/lub konwencjonalne mo zna obecnie oczy sci c aktywne frakcje wystarczaj aco, by stosowa c chimerowe bia lka do blokowania funkcji immunologicznych w ró znych klinicznych uk ladach. Dodatkowo stosuj ac sposoby wedlug wynalazku z nisk a temperatur a (tj. = 32°C dla CHO i = 25°C dla dro zd zy) hodowli jest obecnie mo zliwe przygotowanie supernatantu hodowli, który jest wysoce wzbo- gacony w wi eksz a, bardziej aktywn a posta c ludzkiego LT ßR-Ig. Co wiecej, jest mo zliwe, ze z innymi cz lonkami tej rodziny receptorów mog a by c podobne problemy. Na przyk lad, widzimy dwa podobne prazki na nieredukuj acych zelach SDS PAGE dla TNFR55-Ig (zwany tak ze p55 lub p60 TNFR). Po- dobnie w la sciwo sci innego receptora rodziny TNF zwanego HVEM s a ulepszone przez sekrecj e w ni zszych temperaturach. Ten receptor mo ze stanowi c przyk lad b ledu fa ldowania wewn atrz ramienia, jako ze nie ma wyra znych ró znic w wielko sci w materia lach wytworzonych w ró znych temperaturach. Tym niemniej niezale znie od mechanizmu, sposobami wed lug wynalazku uzyskuje si e wy zszy procent obni zonych temperatur sekrecji bardziej aktywnych bia lek fuzyjnych w preparatach bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig i innych cz lonków rodziny TNF. P r z y k l a d y P r z y k l a d 1. mAb, które specyficznie rozpoznaj a posta c „live" ludzkiego LT ßR-Ig Bia lko LT ßR-Ig (Figura 1) gdy jest wydzielane albo z komórek COS albo CHO transfekowanych plazmidem mo zna oczy scic stosuj ac standardowe metody chromatografii powinowactwa opartej na bia lku A. Oczyszczone bia lko sk lada si e z dwóch blisko po lo zonych pr azków przy oko lo 100 kDa na niereduku- jacym zelu akrylamidowym SDS (Figura 3). Dwa pr azki ró zni a si e oko lo 5 kDa pod wzgl edem pozornej wielko sci. Gdy bia lko jest zredukowane rozdzielane s a zasadniczo dwa prazki przy oko lo 50 kDa wy- nikaj ace z heterogennej glikozylacji (Figura 3). Jednak dwa pr azki obserwowane w warunkach niere- dukuj acych nie wynikaj a bezpo srednio z ró znic w glikozylacji, które daj a pocz atek parze zredukowa- nych prazków: Stosuj ac panel przeciwcia l monoklonalnych w stosunku do ludzkiego LT ßR wykazali- smy, ze przeciwcia la z grupy I, tj. AGH1 i BDA8 rozpoznaj a tylko posta c receptora o du zej masie cz a- steczkowej (Tabela I, wszystkie dane z wyj atkiem selektywno sci dla górnego i dolnego pr azka wzi eto z Browning i wsp., 1996). Przeciwciala z tej grupy wiaza si e bezpo srednio z regionem wi azacym li- gand co wykazano za pomoc a obserwacji, ze fragment Fab BDA8 wciaz blokuje. mAB grupy II mog a tak ze blokowa c wi azanie liganda, jednak w oznaczeniach biologicznych te mAB wykazuj a mieszane zachowanie agonistyczne i antagonistyczne. Gdy z tych mAb zrobi si e kolumn e powinowactwa, (w do swiadczeniach tych stosowano AGH1) i na lo zy mieszanin e du zych i ma lych postaci LT ßR-Ig, mniejsza posta c receptora przep lywa, a wi eksza posta c przyczepia si e do macierzy kolumny. Elucja w niskim pH daje czysty preparat du zej formy (Figura 4). W tych dwóch frakcjach oznaczono zdolno sc do wi azania na powierzchni aktywowanych estrem forbolu komórek hybrydomy 11-23 T, tj. komórek wyra zaj acych na powierzchni kompleks limfotoksyny (jak opisano w Browning i wsp., 1995) i tylko frakcja, która wi aza la si e z mAb by la zdolna do wi azania si e z limfotoksyn a powierzchniow a. Frakcja przep lywu, tj.. prazek o nizszej masie cz asteczkowej by l ca lkowicie nieaktywny (Figura 5). Konkretnie, supernatanty z komórek CHO stabilnie transfekowanych konstruktem LT ßR-Ig przepuszczano przez kolumn e z bia lkiem A w celu izolacji bia lka. Czyste bia lko eluowano 25 mM buforem fosforanu sodu w pH 2,8 i frakcje zawieraj ace bia lko zoboj etniono 1/10 obj eto sci 0,1 M fosforanu sodu, pH 8,6. Immu- noprecypitacje przeprowadzono w obj eto sci 0,25 ml z 3 µg LTßR-Ig i 4 µg mAb anty-LT ßR a nast epnie wy lapanie mAB za pomoc a paciorków sefarozy KappaLock, które rozpoznaj a tylko lancuch kappa na mysim mAb a nie ludzk a domen e Fc. Paciorki usuni eto przez wirowanie i supernatant oczyszczono z pozosta lej immunoglobuliny za pomoc a sefarozy z bia lkiem A. Paciorki potraktowano buforem doPL 203 543 B1 8 próbek SDS PAGE (bez czynnika redukuj acego) i bufor na lo zono na zele SDS-PAGE. Zele puszczo- no i przeniesiono na Hybond i poddano technice typu Western blotu z fragmentem anty ludzkiego Fc skoniugowanego z peroksydaz a z chrzanu (mAb LT ßR a nast epnie anty-mysi a IgG-HRP i wykrywano HRP za pomoc a chemiluminescencji (Amersham). Aby wykorzysta c zdolnosc AGH1, która wy lacznie rozpoznaje aktywn a posta c LT ßR-Ig przygo- towano kolumn e powinowactwa stosuj ac sefaroz e aktywowan a CNBr (Pharmacia, Piscataway, NJ) wed lug protoko lu producenta. Kolumn e dok ladnie p lukano PBS i na lozono oczyszczony za pomoc a bia lka A LT ßR-Ig i zebrano przep lyw (eluat?). Kolumn e przep lukano PBS i nast epnie eluowano 25 mM fosforanem sodu, pH 2. Frakcje zawieraj ace eluat natychmiast zoboj etniano jak opisano powy zej. St ezenia bia lka okre slano za pomoc a absorbancji w 280 nm zak ladaj ac, ze 1 OD roztworu równa si e 1 mg/ml. Pule przep lywu i elucji zawieraj ace LT ßR-Ig badano pod k atem wi azania za pomoc a analizy FACS jak opisano (Browning i wsp., 1995). Frakcja przep lywu nie wykazywa la zabarwienia za pomoc a FACS komórek wyra zaj acych powierzchniow a LT podczas gdy pula z elucji zachowa la pe lna zdolno sc do wi azania. P r z y k l a d 2. Rozdzia l sk ladników ludzkiego LT ßR-Ig „live" i „dead" za pomoc a konwencjo- nalnej chromatografii Potencjalne ró znice strukturalne mi edzy sk ladnikami o du zej i ma lej m.cz. zidentyfikowanych powy zej wykorzystano do zaprojektowania metod rozdzia lu stosuj ac etapy konwencjonalnej chroma- tografii. Jako przyk lad mo zna okre sli c wielko sc bia lka za pomoc a filtracji zelowej w PBS aby uzyska c cz esciowy rozdzia l wi ekszych i mniejszych postaci. Te preparaty mog a wówczas ponownie by c na lo- zone na t e sam a kolumn e aby uzyska c preparaty wi ekszej i mniejszej postaci ludzkiego LT ßR-Ig, które s a wzbogacone w odpowiednie sk ladniki w ponad 90%. Alternatywnie, aby uzyska c ten sam wynik mo zna stosowa c chromatografi e interakcji hydrofobowych (HIC). Mieszanin e bia lek rozcie ncza si e siarczanem amonu, nak lada na kolumn e HIC i ró znicowo eluuje sk ladniki du ze i ma le zmniejszaj acym sie gradientem soli. W tych warunkach uzyskuje si e podstawowy rozdzia l dwóch sk ladników ludzkiego LT ßR-Ig (Figura 6). Te metody jak i metoda immunopowinowactwa opisana powy zej s a przydatne do przygotowania mg ilo sci du zych i ma lych preparatów ludzkiego LT ßR-Ig ale wytworzenie du zych ilo sci tych sk ladników do zastosowania farmaceutycznego pozostawia wiele do zyczenia. Autorzy zg losze- nia opracowali nowy sposób przez adaptacj e metody HIC do zywic, które mo zna otrzyma c w du zych ilo sciach i okre slili warunki chromatografii, które pozwalaj a na przep lyw ma lej postaci ludzkiego mate- ria lu LT ßR-Ig przez kolumn e podczas gdy wi ekszy sk ladnik jest zatrzymywany i moze by c selektywnie wyeluowany (Figura 6). Wyeluowany materia l mo zna podda c etapowi ko ncowemu, takiemu jak chro- matografia wykluczania na podstawie wielko sci czy chromatografia jonowymienna by usun ac zagre- gowany materia l i inne zanieczyszczenia i który po sformu lowaniu do odpowiedniego fizjologicznego buforu mo ze by c wykorzystany w pracy in vivo. W pierwszym przyk ladzie poni zej (A) opisano specy- ficzne warunki, które zastosowano by analitycznie oceni c ilo sc nieaktywnego materia lu w preparacie LT ßR-Ig. W drugim przyk ladzie (B) opisano proces preparatywnego oczyszczania, który daje preparat LT ßR-Ig wysoce wzbogacony w sk ladnik aktywny. A) Analityczna hydrofobowa chromatografia interakcyjna (HIC) mo ze by c stosowana jako ozna- czenie ilo sciowe do oceny ilo sci nieaktywnego LT ßR-Ig Podstawowy rozdzia l mniejszego nieaktywnego i wi ekszego aktywnego sk ladnika zrekombino- wanego ludzkiego LT ßR-Ig przeprowadzono na kolumnie Perseptive Biosystems Poros eter/m (4,6 x 100 mm, numer katalogu P091M526) zrównowa zonej 1,5 M siarczanem amonu, a nast epnie wyelu- owano w zmniejszaj acym si e gradiencie siarczanu amonu. Preparaty LT ßR-Ig rozcie nczono do st eze- nia 0,1 mg/ml i doprowadzono do ko ncowego sk ladu buforu 1,5 M siarczanu amonu, 20 mM fosforanu sodu pH 9 (bufor A). Porcj e (1 ml zawieraj acy 100 µg bia lka) na lo zono na kolumn e Poros eter/m, Ko- lumn e przep lukano 8,3 ml buforu A. Aktywne i nieaktywne sk ladniki ró znicowo eluowano w liniowym gradiencie (ca lkowita obj etosc gradientu 16,6 ml) od 100% bufor A do 100% bufor B (20 mM fosforan sodu, pH 9), a nast epnie p lukano 16,6 ml buforu B. Wyciek z kolumny monitorowano na absorbancje przy 214 nm. Cala procedur e przeprowadzono w temperaturze otoczenia stosuj ac tempo przep lywu przez kolumn e 1 ml/min. Profil elucji reprezentatywnego analitycznego chromatogramu HIC przedsta- wiono na Figurze 5. Pik 1 zawiera frakcje nieaktywn a, a pik 2 aktywn a frakcj e LT ßR-Ig. Aby oceni c ilo sciowy udzia l obu postaci, powierzchnie pików zintegrowano stosuj ac oprogramowanie Perseptive Instruments Vision.PL 203 543 B1 9 B) Preparatywne oczyszczanie ludzkiego zrekombinowanego LT ßR-Ig Klarowanie i zatezanie pod lozy kondycjonowanych: Szcz atki komórek usuni eto z 101 kondycjo- nowanych pod lo zy zebranych z komórek CHO wydzielaj acych zrekombinowany LT ßR-Ig stosuj ac s aczeniem z ograniczon a wydajno scia przez 5 µ polipropylen 5 sgft. Kapsu lk e s acz ac a Calyx (Micro- separations Inc. Westborough MA) a nast epnie 4-calowy wk lad s acz acy Opticap 0,2 u (Millipore Corp., Bedford, MA). Sklarowane pod lo za zatezono przez ultrafiltracj e do oko lo 1 l stosuj ac trzy wk lady Spiral Ultracentrifugation (Amicon, Beverlky, MA) po laczone w serii. Chromatografia powinowactwa z bia lkiem A: Zat ezone kondycjonowane pod lo ze przepuszczo- no za pomoc a si ly ciezko sci przez kolumn e 10 ml Bia lko A na sefarozie o szybkim przep lywie (Phar- macia) w 4°C. Kolumn e p lukano 50 ml PBS, 50 ml PBS zawieraj acego 0,5 M NaCl i 50 ml PBS. Aby usunac zanieczyszczaj acy bydl ecy IgG kolumny p lukano 50 ml 25 mM fosforanu sodu, pH 5,5. Zwi a- zany LT ßR-Ig eluowano sila ciezko sci 25 mM fosforanem sodu, 100 mM NaCl, pH 2,8 we frakcjach 3 ml i natychmiast zoboj etniono 0,3 ml 0,5 M fosforanu sodu, pH 8,6. Frakcje zawieraj ace bia lko zi- dentyfikowano za pomoc a spektroskopii absorpcyjnej, pulowano i przechowywano w -70°C. Hydrofobowa chromatografia interakcyjna: Pul e z elucji z bia lka A (40 ml w st ezeniu 2,5 mg/ml) rozcie nczono 40 ml 3 M chlorku sodu, 40 mM fosforanu sodu pH 7 i 20 ml 1,5 M chlorku sodu, 20 mM fosforanu sodu pH 7 (wszystkie roztwory by ly w temperaturze otoczenia). Rozcie nczon a pul e za lado- wano na kolumn e Source 15 10 x 100 mm (7,8 ml) (Pharmacia, Piscataway, NJ) z tempem przep lywu 2 ml/min. Kolumn e p lukano 79 ml 1,5 M chlorkiem sodu, 20 mM fosforanem sodu pH 7 z tempem przep lywu 20 ml/min. Zwi azane bia lko eluowano 20 mM fosforanem sodu pH 7 przy tempie przep lywu 2 ml/min. Absorbancj e wycieku monitorowano przy 280 nm i zebrano frakcje 9 ml. Frakcje eluowane zawieraj ace bia lko zidentyfikowano za pomoc a spektrometrii absorpcyjnej UV, pulowano i przecho- wywano w -70°C. Figura 7 przedstawia typowy profil elucji HIC. W tych warunkach nieaktywny mate- ria l przep lywa przez kolumn e, a aktywny materia l wi aze si e z zywic a. Wstawka Figury 7 zawiera skan analizy NR SDS-PAGE barwiony b lekitem coomassie odpowiednio puli przep lywu i elucji. Chromatografia wykluczania wielko sci; Oko lo 100 ml (1,3 mg/ml) puli elucji HIC zawieraj a- cej aktywne sk ladniki LT ßR-Ig zat ezono przez ultrafiltracj e do 9 ml stosuj ac zat ezacz centriprep 30 (Amicon, Beverly, MA). Koncentrat (10,3 mg/ml) za ladowano na kolumn e 1,6 x 100 cm Supe- rose-6 typu preparatywnego (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) zrównowa zon a w PBS z tempem przep lywu 1 ml/min. Wyciek zbierano w 3 ml frakcjach. Frakcje zawieraj ace bia lko identyfikowano za pomoc a spektroskopii absorpcyjnej UV. Wybrane frakcje analizowano pod k atem zawarto sci agregatów przy na lo zeniu 3 µg/ml stosuj ac elektroforez e w zelu NR SDS-PAGE. Frakcje z mini- malnym widzialnym agregatem pulowano i przechowywano w postaci zamro zonej w -70°C. W ten sposób mo zna przygotowa c LT ßR-Ig zawieraj acy minimalne ilo sci nieaktywnego sk ladni- ka LT ßR-Ig obecnego w surowych pod lo zach hodowlanych. P r z y k l a d 3. Warunki fermentacji w niskiej temperaturze wzbogacaj a w du zy, aktywny sk ladnik ludzkiego LT ßR-Ig w czasie etapu hodowli komórek W konwencjonalnych warunkach hodowli komórek ssaków, ludzki LT ßR-Ig jest wydzielany jako mieszanina oko lo 50% ma lego i 50% du zego sk ladnika. Stosowanie zaka zonych bakulowiru- sem komórek owadów do ekspresji tego samego bia lka daje drastycznie obni zone poziomy po- staci ma lej. Poniewa z komórki owadów hoduje si e w 28°C sprawdzili smy, czy ludzki LT ßR-Ig wy- dzielany z komórek ssaków hodowanych w niskiej temperaturze te z b edzie mia l zmieniony stosu- nek postaci du zych i ma lych. Na Figurze 8 pokazane s a supernatanty z komórek CHO wydziela- j acych ludzki LT ßR-Ig hodowanych w kolbach T w 28, 30, 33, 35 i 37°C analizowanych technik a typu Western. Du ze i ma le postacie (wskazane przez strza lki) s a obecne w hodowlach rosn acych w 33, 35 i 37°C. Mo zna zauwa zy c bardzo ma lo oznak ma lej postaci w scie zkach zawieraj acych supernatanty hodowli z komórek hodowanych w 30 i 28°C. Zatem, obni zenie temperatury w cza- sie hodowli komórek radykalnie zmniejsza ilo sc ma lej, nieaktywnej postaci ludzkiego LT ßR-Ig. Aby ilo sciowo okre sli c stosunek mi edzy temperatur a hodowli komórek i stopniem wzbogacenia w wi eksz a, aktywn a posta c ludzkiego LT ßR-Ig za lo zono po dwa powtórzenia kolb hodowlanych i hodowano je w temperaturach w zakresie od 28 -37°C w odst epach co jeden stopie n. Próbki ludzkiego LT ßR-Ig oczyszczone za pomoc a powinowactwa do bia lka A analizowano za pomoc a chromatografii analitycznej HIC aby oceni c ilo sciowo stosunek ma lych i du zych postaci ludzkiego LT ßR-Ig obecnych w preparatach pochodz acych z komórek hodowanych w ró znych temperatu- rach. Jak pokazano graficznie na Figurze 9, ilo sc dolnego pr azka szybko zmniejsza si e oko lo 5-krotnie, gdy temperatur e hodowli obni zy si e z 37 do 32°C. Obni zenie temperatury hodowli doPL 203 543 B1 10 28°C zmniejsza ilo sc dolnej postaci ale w sposób znacznie mniej radykalny. Wyniki te pokazuj a, ze zmniejszenie temperatury hodowli o tylko kilka stopni z 37°C radykalnie zmniejsza ilo sc sk lad- nika o ni zszej m.cz. w ten sposób zwi ekszaj ac wydajno sc wi ekszego aktywnego sk ladnika ludz- kiego LT ßR-Ig. W oparciu o te dane wybrano temperatury hodowli 32 i 28°C aby sprawdzi c, czy obserwacje te mo zna powtórzy c na du za skal e w warunkach, które by by ly odpowiednie do wy- twarzania z u zyciem komórek CHO wydzielaj acych zrekombinowany ludzki LT ßR-Ig, które zosta ly przystosowane do wzrostu w zawiesinie. Do tych do swiadcze n komórki hodowano do g esto sci zbli zonych do 2x10 6 komórek/ml w 37°C, hodowl e rozcie nczano oko lo 4 obj eto sciami pod lo za hodowlanego i inkubowano w 32°C a z zywotno sc komórek spad la poni zej 80%. Obni zenie tempe- ratury do 28°C podczas fazy produkcji tak ze daje znacznie ni zsze poziomy sk ladnika „dead" w zebranym na ko ncu materiale. Ciekawe by lo spostrze zenie, ze podczas gdy liczba komórek nie wzrasta la bardzo podczas fazy produkcji w 28 lub 32°C uzyskano kilkakrotny wzrost miana pro- duktu w stosunku do hodowli rosn acej wy lacznie w 37°C w zebranych kondycjonowanych pod lo- zach. Konkretne warunki, które stosowano w procesach 32 i 28°C s a szczegó lowo opisane poni zej. Wst epne dane sugeruj a, ze obni zenie temperatury hodowli daje podobne korzy sci w innych uk ladach gospodarza, takich jak dro zd ze. Jest interesuj ace, ze u dro zd zy korzystne efekty pro- dukcji w niskiej temperaturze obserwuje si e w znacznie ni zszej temperaturze ni z dla komórek ssaków. Dro zd ze hodowane w 30°C produkuj a przede wszystkim form e nieaktywn a, hodowle rosn ace w 25°C zawieraj a mieszanin e w przybli zeniu równych cz esci formy nieaktywnej i aktywnej i hodowle fermentowane w 16°C produkuj a przede wszystkim aktywn a form e ludzkiego LT ßR-Ig. Te obserwacje sugeruj a, ze fermentacja w niskiej temperaturze daje w efekcie znacz aco wy zsze wydajno sci aktywnego sk ladnika ludzkiego LT ßR-Ig w dowolnym uk ladzie wydzielania gospoda- rza. Specjalista mo ze latwo okre sli c optymaln a temperatur e produkcji dla ka zdego uk ladu. Dostarczamy tu szczegó lowego przyk ladu jak ten proces zastosowano do produkcji LT ßR-Ig. Opracowano dwa sposoby hodowli komórek wykorzystuj ace fakt, ze obni zenie temperatury ho- dowli komórek znacz aco obni za ilo sc nieaktywnych sk ladników obecnych w LT ßR-Ig wydzielanym z komórek gospodarza. Dodatkow a, nieoczekiwan a zalet a fermentacji w niskich temperaturach jest kilkakrotna poprawa miana w porównaniu z tradycyjnymi przebiegami fermentacji przeprowa- dzonymi w 36-37°C. W Tabeli II podsumowano porównawcze wydajno sci i wzgl edne ilo sci nieak- tywnych sk ladników LT ßR-Ig uzyskanych dla dwóch ró znych linii komórkowych transfekowanych ró znymi konstruktami LT ßR-Ig , które ró zni ly si e pod wzgl edem stopnia glikozylacji (nie istotne dla przes lania tego przyk ladu). Proces hodowli komórek w 32°C: Komórki CHO wydzielaj ace ludzki LT ßR-Ig, które przystoso- wano do wzrostu w zawiesinie hodowano w pod lo zach DME/HAM F-12 (zobacz Tabela III) uzupe lnio- nych 10% FBS, 140 mg/l streptomycyny i 50 mg/l gentamycyny. W celu powi ekszenia skali zaszcze- piono dwie kolby typu spiner po 750 ml przy oko lo 2 x 10 5 komórek/ml w pod lo zach hodowlanych. Kultury hodowano w 37°C w atmosferze 5% CO 2 do g esto sci oko lo 3 x 10 6 komórek/ml. Zawiesiny komórek z obu kultur typu spiner laczono w celu zaszczepienia bioreaktora do produkcji wi ekszych w celu powi ekszenia skali zawieraj acego oko lo 10 l pod lo za hodowlanego. Kultur e natleniano w 11% O 2 i hodowano przez trzy dni w 37°C do g esto sci oko lo 2 x 10 6 komórek/ml. Te kultury stosowano do zaszczepienia bioreaktora produkcyjnego zawieraj acego 331 pod lo za hodowlanego z g esto scia 6,4x10 5 komórek/ml. W bioreaktorze produkcyjnym prowadzono hodowl e przez nast epne 8 dni w ko- rzystnej temperaturze 32°C z ilo scia tlenu ustawion a na 11% O 2 . G esto sc komórek w dniu zbioru (dzie n 8) wynosi la oko lo 2 x 10 6 komórek/ml z zywotno scia oko lo 60%. W tych warunkach uzyskano miano 12 mg/l LT ßR-Ig, które by lo dwa razy wy zsze ni z gdy te same komórki hodowano w tradycyjnej temperaturze 37°C. Wzgl edna ilo sc nieaktywnego sk ladnika preparatu LT ßR-Ig wynosi la 17%, co reprezentuje spadek o ponad 60% w porównaniu z produktem otrzymanym z hodowli w 37°C. Proces hodowli komórek w 28°C: Komórki CHO wydzielaj ace ludzki LT ßR-Ig, które przystoso- wano do wzrostu w zawiesinie, hodowano w pod lo zach DME/HAM's F-12 (zobacz Tabela III) uzupe l- nionych 10% FBS, 140 mg/l streptomycyny i 50 mg/l gentamycyny. W celu powi ekszenia skali za- szczepiono dwie kolby typu spiner po 800 ml przy oko lo 2 x 10 5 komórek/ml w pod lo zach hodowla- nych. Kultury hodowano w 37°C w atmosferze 5% CO 2 do g esto sci oko lo 3,5 x 10 6 komórek/ml. Za- wiesiny komórek z obu kultur typu spiner polaczono w celu zaszczepienia bioreaktora do produkcji wi ekszych ilo sci zawieraj acego oko lo 10 l pod lo za hodowlanego. Kultur e natleniano w 11% O 2 i hodo- wano przez trzy dni w 37°C do g esto sci oko lo 1,7 x 10 6 komórek/ml. T e kultur e zastosowano do za-PL 203 543 B1 11 szczepienia dwóch bioreaktorów produkcyjnych zawieraj acych 40 l pod lo za hodowlanego i jednego 10 l bioreaktora o wyj sciowej g esto sci 2,5-3,5x10 5 komórek/ml przy u zyciu rozcie nczenie 1:9. W bioreakto- rze produkcyjnym prowadzono hodowl e w temperaturze 37°C z natlenianiem w 11% O 2 do osi agni ecia g esto sci komórek oko lo 2x10 6 komórek/ml (dwa dni). Pod koniec drugiego dnia temperatur e bioreakto- ra obni zono do 28°C i prowadzono hodowl e w bioreaktorze przez 5 dodatkowych dni. W 7 dniu przy g esto sciach oko lo 3x10 6 komórek/ml i zywotno sci komórek 75% zawarto sc bioreaktorów zebrano i kondycjonowane pod lo za obrabiano jak opisano powy zej. W tych warunkach uzyskano ko ncowe miano w przybli zeniu 20 mg/l LT ßR-Ig, które by lo 3,3-krotnie wy zsze ni z miano, które otrzymano gdy te same komórki hodowano w 37°C. Wzgl edna ilo sc nieaktywnego sk ladnika wynosi la 10% co repre- zentuje 80% spadek w porównaniu z materia lem przygotowanym w 37°C. P r z y k l a d 4: Zmiany domeny Fc w celu zminimalizowania postaci „dead" podczas produkcji W oparciu o nasze hipotetyczne wyja snienie dlaczego cz asteczki „dead" powstaj a w tych prepa- ratach mo zna by przewidywa c, ze zwolnienie czasu przed dimeryzacj a domen Fc zwi ekszy udzia l prawid lowo sfa ldowanych domen receptora. Zbadali smy kilka metod by uzyska c ten wynik. Jest mo z- liwe, ze ró zne domeny Ig Fc b ed a si e fa ldowa ly w ró znym tempie, jednak wymiana domeny IgG1 na domen e IgG4 nie zmieni la stosunku „live" do „ dead". Po drugie, za pomoc a mutagenezy ukierunko- wanej usuni eto z domeny IgG1 Fc reszty cysteiny w regionie zawiasowym, które krzy zowo lacz a dwa lancuchy peptydowe. Domeny Fc mog a dobrze dimeryzowa c w nieobecno sci tworzenia mostków di- siarczkowych w zawiasie ale tempo mo ze by c wolniejsze. Zast apienie dwóch reszt cysteiny przez alanin e daje zmniejszon a ilosc postaci „dead", jak to okre slono ilo sciowo za pomoc a SDS-PAGE i chromatografii HIC tak, ze gdy LT ßR-Ig typu dzikiego zawiera lby 50 i 5% postaci dead w 37 i 28°C delecja cystein z zawiasu IgG1 prowadzi do 20 i 5% postaci dead, gdy jest wytwarzana w tych odpo- wiednich temperaturach. Dlatego modyfikacja zawiasu przez zast apienie obu reszt cys mo ze polep- szy c jako sc preparatu i co wi ecej jest mo zliwe, ze zast apienie tylko jednej reszty cys mog loby mie c korzystny wp lyw. Takie genetyczne modyfikacje mog lyby obni zy c procent postaci „dead" bez koniecz- no sci stosowania sposobów z nisk a temperatur a. P r z y k l a d 5: Delecja mostków cysteinowych aby skorygowa c problemy fa ldowania Typowo jest bardzo trudno okre sli c szlaki fa ldowania stosowane przez bia lko w celu osi agni ecia ostatecznej prawid lowej postaci. Tym niemniej pewne mostki disiarczkowe w rodzinie receptorów TNF s a niezwyk le i mog a nie by c konieczne do ko ncowego stanu sfa ldowanego. Te mostki s a dobrymi kandydatami do mutagenezy. Jeden taki mostek w trzeciej domenie LT ßR-Ig usuni eto za pomoc a konwencjonalnej mutagenezy ukierunkowanej cystein 101 i 108 do alanin (przy u zyciu numeracji z sekwencji zdefiniowanej w Ware i wsp., 1995) co doprowadzi lo do poprawionego stosunku materia lu dead/live uwidocznionego za pomoc a SDS-PAGE. W LT ßR-Ig typu dzikiego typowo wida c obecno sc 50 i 5% postaci dead przy produkcji odpowiednio w 37 i 28°C. Posta c zmutowana z wydeletowanym jednym mostkiem disiarczkowym cysteiny mia la 20 i 5% postaci dead, gdy by la wytwarzana w tych temperaturach. P r z y k l a d 6. Zastosowanie ni zszych temperatur do poprawienia jako sci preparatu HVEM-Ig Mediator wej scia wirusa opryszczki (HVEM) jest receptorem z rodziny TNF spokrewnionym z LT ßR i wiaze si e scisle z ligandem LIGHT i s labo z ligandem limfotoksyny-a (LTa) (Mauri i wsp., 1998). Ludzki HVEM przygotowano jako bia lko fuzyjne z Ig przez amplifikacj e PCR domeny zewn atrz- komórkowej i po laczono z ludzkimi regionami CH2 i CH3 IgG1 jak opisano dla LT ßR-Ig (Crowe i wsp., 1994). Konstrukt wstawiono do wektora zwanego CH269 (Chicheportiche i wsp., 1997) w celu przej- sciowej ekspresji w ludzkiej linii nerki zarodkowej 293 z ekspresj a wektora w du zej liczbie kopii stosu- j ac uk lad EBNA (komórki 293-E). Zebrano supernatanty i oczyszczono HVEM-Ig stosuj ac chromato- grafi e powinowactwa z bia lkiem A i elucj e przy niskim pH. Przygotowano zrekombinowany LT a z komórek owadzich jak opisano (Browning i wsp., 1996a). Zrekombinowany rozpuszczalny ludzki LIGHT przygotowano przez amplifikacj e PCR ca lkowitego cD- NA stosuj ac RNA ze zaktywowanych komórek IL23 uzyskuj ac region koduj acy o sekwencji opisanej przez Mauri i wsp., 1998. Domen e wiaz ac a receptor LIGHT zamplifikowano za pomoc a PCR i po la- czono w postaci fuzji z liderem czynnika koniugacji alfa i wyra zono zasadniczo jak opisano dla innych spokrewnionych bia lek (Browning i wsp., 1996). Wstawiono znacznik FLAG i sekwencj e odst epnika aminokwasów (G 4 S) 3 mi edzy sekwencj e liderow a i domen e wi azac a receptor, tak ze wydzielany LIGHT posiada lby N-ko ncow a sekwencje FLAG. Konstrukt kodowa l nast epuj ac a cz asteczk e:PL 203 543 B1 12 „MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR..EADYKDDDDNGGGSGGGSGGGSKELNPAAHLTGA NSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTI THGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVLDER LVRLRDGTRSYFGAFMV" gdzie dwie kropki wskazuj a spodziewany N-koniec dojrza lego bia lka, który móg lby by c dalej obrabiany przez usuni ecie nast epnych dwóch aminokwasów (EA). Bia lko oczyszczono z superna- tantu za pomoc a chromatografii powinowactwa na kolumnie mAb anty-FLAG i elucjowano albo za pomoc a niskiego pH albo chelacji z wapniem. LIGHT pe lnej d lugo sci tak ze wstawiono do wektora CH269 w celu ekspresji na powierzchni komórek 293-E jak opisano (Chicheportiche i wsp., 1997). Opisano metody wi azania FACS dla detekcji receptor-Ig do powierzchni komórek i metod BIAcore do mierzenia wi azania rozpuszczonych ligandów do immobilizowanego receptora-Ig (Mackay i wsp., 1997). Technologia BIAcore daje pomiary w czasie rzeczywistym bia lek zwi azanych z chi- pami (tj. z receptorem). Komórki CHO wyra zaj ace HVEM-Ig hodowano do konfluencji w 37°C w butelkach typu roller stosuj ac pod lo za hodowlane uzupe lnione 10% FBS. Gdy komórki osi aga ly konfluencj e, zu zyte pod lo za zast epowano swie zymi pod lo zami i hodowle inkubowano w 37, 32 i 28°C. Hodowle w 28 i 32°C zbierano raz na tydzie n, hodowl e w 37°C co 4 dni. Wydzielany HVEM-Ig oczyszczono sto- suj ac chromatografi e powinowactwa z bia lkiem A jak opisano. Oczyszczone preparaty przecho- wywano w -70°C a z do analizy. Gdy wytwarzano HVEM-Ig w 28, 32 i 37°C i oczyszczano go, wszystkie preparaty zachowywa ly si e podobnie w analizie SDS-PAGE (Figura 10) sugeruj ac, ze w bia lku nie wyst epowa ly wi eksze zmiany. Tak wi ec je sli wyst epowa lo b ledne fa ldowa- nie/tworzenie mostków disiarczkowych, by lo ono albo w obr ebie ramienia lub wyst epowa lo w po- bli zu regionu zawiasowego domeny Fc, tj. mostki wewn atrz ramienia i w zwi azku z tym nie wp ly- wa lo znacz aco na kszta lt cz asteczki w SDS-PAGE. Zdolno sc receptora-Ig do wi azania LIGHT wyra zanego na komórkach 293-E lub LIGHT na aktywowanych komórkach II23 oceniano w ozna- czeniach wi azania FACS (Figura 11). Na obu typach komórek, zdolno sc HVEM-Ig do wi azania ligandu na powierzchni komórki poprawia la si e z grubsza 2-3 krotnie przy ekspresji w 32°C. Sto- suj ac technologi e BIAcore zaobserwowano, ze gdy chipy BIAcore za ladowano HVEM-Ig do po- dobnych poziomów (warto sci RU stanowi a odbicie ilo sci bia lka na chipie), HVEM-Ig wytwarzany w ni zszych temperaturach wi aza l wi ecej ligandu ni z bia lka wytwarzane w wy zszych temperaturach (Figura 12). Wynik ten otrzymano zarówno z LIGHT i LT a jako ligandem. Krzywe wi azania BIAco- re pokazuj a czas rzeczywisty w trakcie i poza zdarzeniami wi azania i mo zna zobaczy c, ze zda- rzenia wi azania by ly podobne niezale znie od temperatury wytwarzania. Dlatego cz esc preparatu jest skuteczne zabita (dead) i ta cz esc jest zmniejszana przez przez ni zsze temperatury wytwa- rzania. Rozwa zamy, ze ni zsza temperatura poprawi la problem wadliwego fa ldowania i poprawi la procent cz asteczek zywych „live" chocia z nie mo zemy bezpo srednio obserwowa c frakcji cz aste- czek dead. Techniki chromatografii powinowactwa jak nakre slono powy zej mog lyby s lu zy c do roz- dzielenia postaci live/dead po optymalizacji preparatu przez obni zenie temperatury wzrostu i lub mu- tagenez e ró znych cystein albo w zawiasie albo w samym receptorze aby zapobiec nieprawid lowemu fa ldowaniu. P r z y k l a d 7: Generyczne schematy do minimalizacji postaci dead innych bia lek fuzyjnych rodziny TNF receptor -Ig. Wi ekszo sc receptorów rodziny TNF przygotowano jako konstrukty bia lek fuzyjnych z domenami immunoglobulina-Fc Odno snik p55 TNF-R (Loestcher i wsp., 1991, Marsters i wsp., 1992, Ashkenazi i wsp., 1991) p75 TNF-R (Mohler i wsp., 1993) LT ßR (Crowe i wsp., 1994) Fas (Sudai wsp., 1993) CD27 (Goodwin i wsp., 1993) CD30 (Smith i wsp., 1993) CD40 (Fanslow i wsp., 1993) Ox40 (Baum i wsp., 1994) 4-IBB (Alderson i wsp., 1994) HVEM (Mauri i wsp., 1998)PL 203 543 B1 13 W kilku przypadkach a szczególnie dla Fas-Ig i CD40-Ig np. Fanslow i wsp., 1992, chimery s a s labo aktywne w porównaniu z rozpuszczalnymi postaciami Fc dwóch receptorów TNF. Jest mo zliwe, ze niektóre z tych preparatów s a mieszaninami postaci live i dead w ró znych stosunkach. Posta c dead dotyczy po prostu cz asteczki, która wiaze si e z powinowactwem znacz aco (10-1000-krotnie) ni zszym ni z posta c live, tj. mo ze nie by c ca lkowicie pozbawiona zdolno sci wi azania ale zamiast tego ma obni- zone powinowactwo do liganda wzgl edem postaci o wysokim powinowactwie naturalnie spotykanej na komórkach. Mog a wyst api c wadliwe mostki disiarczkowe mi edzy ramionami receptora lub wewn atrz ramienia receptora co prowadzi do mniej aktywnego bia lka. Z którymkolwiek z tych receptorów lub innych jeszcze niezdefiniowanych receptorów, przy- gotowuje si e panel mAb antyreceptorowych za pomoc a konwencjonalnych technik. Te przeciwcia- la zdolne do blokowania wi azania ligandu z receptorem s a korzystnie oceniane przy u zyciu ozna- czenia wi azania ligandu do natywnego receptora na powierzchni komórki (cho c mog a by c wystar- czaj ace inne metody stosuj ace zrekombinowane postacie receptora) by lyby stosowane do two- rzenia kolumn powinowactwa. Preparat mieszaniny postaci receptorów live i dead-Fc przepuszcza si e przez kolumn e i zbiera wyciek. Materia l, który zwi aza l si e z kolumn a eluuje si e buforem o ni- skim pH (typowo pH 2,5 do 4,0) i natychmiast zoboj etnia si e. Dwie frakcje wi aza si e albo z komór- kami w oznaczeniu wi azania FACS (lub dowolnym innym oznaczeniu) albo z ligandem w ró znych st ezeniach bia lka. Niektóre z tych mAB selektywnie wi aza si e z postaci a live i b edzie widoczna ró znica mi edzy st ezeniem potrzebnym do uzyskania 50% wi azania przep lywu w stosunku do elu- atu. Ten wynik oznacza, ze ten mAb jest mAb ró znicuj acym. Stosunek bia lka w eluacie do prze- p lywu b edzie wskazaniem procentu postaci live. Te tak zidentyfikowane mAb mog a by c u zyte do oczyszczenia postaci live za pomoc a powi- nowactwa. Ponadto, ich zastosowanie w ró znych postaciach oznacze n immunologicznych mo ze by c wykorzystane do optymalizacji ekspresji prawid lowej postaci zadanej postaci receptor-Fc. Oznaczenie mo ze by c dalej stosowane w po laczeniu z innymi konwencjonalnymi metodami oczyszczania by znale zc sposoby, które by oczy sci ly aktywn a posta c receptora bez udzia lu tech- nik powinowactwa. Stosuj ac te mAb do naszkicowania postaci live i dead mo zna optymalizowa c temperatur e hodowli i mo zna by optymalizowa c warunki hodowli i opracowa c metody chromato- grafii do wzbogacenia w posta c live. Alternatywnie mo zna by wykorzysta c metody kolumn HIC do rozdzielenia postaci live i dead i stosuj ac t e metod e warunki hodowli uleg lyby optymalizacji. Podobnie, te oznaczenia tworzy lyby podstaw e do mutagenezy cysteinowej cz esci receptora aby okre sli c proble- matyczne wi azania disiarczkowe, które po usuni eciu da lyby funkcjonalnie czynny materia l. Jako ze wiele z tych receptorów b edzie mia lo zastosowanie jako czynniki terapeutyczne w ludz- kich chorobach i b edzie si e chcia lo podawa c pacjentowi wylacznie postacie prawid lowo sfa ldowane, sposoby te b ed a przydatne zarówno do okre slania preparatu i usuwania s labo wiaz acych postaci. Specjali sci b ed a swiadomi, ze ró zne modyfikacje i warianty mog a by c wprowadzone do sposo- bów wed lug niniejszego wynalazku bez oddalania si e od ducha i zakresu wynalazku. Zatem zamiarem jest aby niniejszy wynalazek pokrywa l modyfikacje i warianty wynalazku o ile wchodz a w zakres za la- czonych zastrze ze n lub ich odpowiedników. T a b e l a I. Podsumowanie mAB anty-LT-b-R Cytotoksyczno sc HT29 MAB nazwa Barwienie komórek str acone f Blokuj acy receptor a Grupa wi azaca g mAb immobilizowany na tworzywie sztucznym b Sam rozpuszczalny mAb/ mAb z Rozpuszczalny prazek Lfa1/b2 Receptor mAb BDA8 AGH1 +++ +++ +++ ++ +++ +/- +/- - - -c - - - - górny górny I I BCG6 BHA10 +++ +++ ++ +++ +++ +/- +/- +/- +/- +/- oba nd II II BKA11 CDH10 +++ +++ +/- +++ +++ - +/- +++ d +++ oba nd III III CBE11 +++ nd +++ +/- - oba IV a Oznaczenie ocenia lo czy przeciwcia lo blokuje wi azanie rozpuszczalnego receptora do aktywnego IIL-23. nd - nie badano b P lytka powleczona króliczym anty-mysim Fc, wy lapany receptor mAb, HT29 plus IFNg.PL 203 543 B1 14 c Blokuje d Umo zliwia e Zmienne, pewna cz esciowa inhibicja w pewnych oznaczeniach ale nie w innych f Posta c receptora str acana stosuj ac mAB plus system KappaLock. g Grupy definiowano na podstawie danych w tej tabeli plus przeprowadzono mapowanie epitopów stosuj ac technologi e BIAcore. T a b e l a II. Ekspresja konstruktów LT ßR-Ig w komórkach CHO hodowanych w ró znych temperaturach hodowli Konstrukt Temperatura fermentacji °C Ekspresja mg/L a % nieaktywnych skladników b LT ßR05 37 32 28 6 12 20 50 17 10 LT ßR09 37 32 28 10 - 76 50 _ 6 a Poziom ekspresji oceniono stosuj ac chromatografi e powinowactwa do bia lka A. b Ilo sc nieaktywnych zwi azków obecnych w preparacie LT ßR-Ig oceniano po oczyszczeniu za pomoc a powinowactwa do bia lka A stosuj ac analityczn a metod e HIC. T a b e l a III. Uzupe lnienia do pod lo za DME/HAM F-12 Sk ladnik Ilo sc w 1 l pod lo za a Plodowa surowica bydl eca 100 ml Glukoza 1,85g Wodorow eglan amonu 2,2 g Streptomycyna 140 mg Gentamycyna 50 mg Etanolamina (1 M r-r podstawowy) 0,1 ml Kwas liponowy 91,2 mg Kwas linoleinowy 38,4 mg Trijodo-L-tyronina 0,2 mg EX-Cyte VLE (Bayer) 1 ml Bydl eca insulina 10 mg Bydl eca transferryna 10 mg Bydl eca albumina surowicza 50 mg Pluronic F-68 1 g Cysteina 82 mg Metionina 34 mg Seryna 52 mg Walina 105,6 mg Glicyna 50 mg Kwas asparaginowy 24,4 mg Prolina 52,2 mg Kompozycje s a mieszane z proszkiem do pod lo za i obj eto sc jest doprowadzana do 1L. pH pod- loza doprowadza si e do 7,20 - 7,25 stosuj ac 50% HCl.PL 203 543 B1 15 LITERATURA Aggarwal, B. and Natarajan, K. (1996) Eur. Cytokine Rev. 7:93 Alderson, M. R. et al. (1994) Eur J Immunol 24, 2219-27 Ashkenazi, A. et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88, 10535-9 Banner, D. W. et al (1993) Cell 73, 431-445 Baum, P. R. et al. (1994) Embo J 13, 3992-4001 Bazzoni, F. and Beutler, B. (1996) New England J. Med. 334:1717. Browning, J. L. et al. (1995) J. Immunol. 154, 33-46 Browning, J. et al, (1996) J. Exp. Med. 183, 867-878 Browning, J.L. et al. (1996a) J. Biol. Chem. 271, 8618-8628 Bucay, N. et al. (1998) Genes and Development 12:1260 Chaplin, D. and Fu, Y-X. (1998) Current Opinion in Immunology 10, 289-297 Chiceportiche, Y. et al (1997) J. Biol. Chem. 272, 32401-32410 Corcoran, A. et al (1994) Eur. J. Biochem. 223, 831-840 Crowe, P. D. et al. (1994) Science 264, 707-10 Eason, J. D. et al. (1996) Transplantation 61:224. Eggermont, A. M. et al. (1996) J. Clin. Oncology 14:2653 Fanslow, W. C. et al. (1992) J Immunol 149, 655-60 Feldmann, M. et al. (1997) Ann. Immunol. 64:283-350. Goodwin, R. G. et al. (1993) Cell 73, 447-56 Green, D. and Ware, C. F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:5986 Harrop, J.A.. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:27548. Loetscher, H. et al. (1991) J Biol Chem 266, 18324-9 Mackay, F. et al. (1998) Gastroenterology 115: 1484-1475 Mackay, F and Browning, J. (1998) Nature 395:26 Mackay, F. et al. (1997) Eur J Immunol 27, 2033-42 Marsters, S. et al (1992) J. Biol. Chem. 267, 5747-5750 Mauri, D. N. et al. (1998) lmmunity 8, 21-30 Mohler, el al. (1993) J Immunol 151,1548-61 Naismilh, J. et al (1996) J. Mol. Recognition 9, 113-117 Rennert, P. D. et al. (1996) J Exp Med 184, 1999-2006 Rennert, P. D., Browning, J. L., and Hochman, P. S. (1997) Int Immunol 9, 1627-39 Simmonet, W. S. et al. (1997) Cell 89:309. Smith, C. A., Farrah, T., and Goodwin, R. G. (1994) Cell 76, 959-62 Smith, C. A. et al. (1993) Cell 73, 1349-60 Suda, T., Takahashi, T., Golstein, P., and Nagata, S. (1993) Cell 75, 1169-78 Van Dullemen, H. M. et al. (1995) Gastroenterology 109:129 Ware, C.F. et al. (1995) Current topics in Microbiology and Immunology 198, 175-218PL 203 543 B1 16 PL PL PL

Claims (14)

1. Zastrze zenia patentowe 1. Sposób ekspresji wysokich poziomów biologicznie aktywnego bia lka fuzyjnego receptor lim- fotoksyny ß(LT- ß-R)-immunoglobulina, znamienny tym, ze obejmuje hodowanie gospodarza trans- formowanego DNA koduj acym bia lko fuzyjne receptor LT- ß-R-Ig w ssaczym uk ladzie hodowlanym w niskiej temperaturze od 27°C do 35°C.

2. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze temperatura wynosi 27°C do 32°C.

3. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze transformowanego gospodarza najpierw ho- duje si e w temperaturze powy zej 33°C przez czas wystarczaj acy do wzrostu gospodarza.

4. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze ponadto obejmuje etap odzyskiwania biolo- gicznie aktywnego bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig z tego uk ladu hodowli za pomoc a chromatografii od- dzia lywa n hydrofobowych.

5. Sposób wytwarzania preparatu farmaceutycznego zawieraj acego biologicznie aktywne bia l- ko fuzyjne receptor limfotoksyny ß-Ig(LT- ß-R)-Ig, znamienny tym, ze obejmuje: (a) hodowanie gospodarza transformowanego DNA koduj acym bia lko fuzyjne LT- ß-R-Ig w ssa- czym uk ladzie hodowlanym w niskiej temperaturze od 27°C do 32°C i wyra zanie w ten sposób aktyw- nego bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig; (b) odzyskanie aktywnego bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig z tego uk ladu hodowli; i (c) po laczenie aktywnego bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig z etapu (b) z dopuszczalnym farmaceu- tycznie no snikiem.

6. Kompozycja, znamienna tym, ze obejmuje aktywne bia lko fuzyjne receptor limfotoksyny ß-immunoglobulina (LT- ß-R-Ig) i nieaktywne bia lka fuzyjne LT- ß-R-Ig, przy czym 0% do 30% bia lek fuzyjnych LT- ß-R-Ig jest nieaktywnych.

7. Kompozycja wed lug zastrz. 6, znamienna tym, ze 0% do 17% bia lek fuzyjnych LT- ß-R-Ig jest nieaktywnych.

8. Kompozycja wed lug zastrz. 6, znamienna tym, ze 0% do 10% bia lek fuzyjnych LT- ß-R-Ig jest nieaktywnych.

9. Kompozycja wed lug zastrz. 6, znamienna tym, ze 0% do 6% bia lek fuzyjnych LT- ß-R-Ig jest nieaktywnych.

10. Kompozycja wed lug zastrz. 6-9, znamienna tym, ze aktywne bia lka fuzyjne LT- ß-R-Ig s a rozpoznawane przez funkcjonalnie swoiste przeciwcia lo.

11. Kompozycja wed lug zastrz. 6, znamienna tym, ze domena Fc jest izotypu IgG1.

12. Kompozycja farmaceutyczna zawieraj aca srodek aktywny i dopuszczalny farmaceutycznie no snik, znamienna tym, ze srodkiem aktywnym jest kompozycja okre slona w zastrz. 11.

13. Kompozycja wed lug zastrz. 6, znamienna tym, ze jest otrzymana przez hodowanie ssaczej komórki gospodarza transformowanej DNA koduj acym bia lko fuzyjne receptor limfotoksyny (LT- ß-R)- Ig w uk ladzie hodowlanym w temperaturze od 27°C do 35 °C, przy czym zawiera aktywne i nieaktyw- ne formy bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig.

14. Preparat farmaceutyczny obejmuj acy kompozycj e okre slon a w zastrz. 6, w której 0% do 30% bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig jest w postaci nieaktywnej, znamienny tym, ze jest otrzymany przez: (a) hodowanie gospodarza transformowanego DNA koduj acym bia lko fuzyjne LT- ß-R-Ig w ssa- czym uk ladzie hodowlanym w niskiej temperaturze od 27°C do 32°C w ten sposób wyra zaj ac kompo- zycj e obejmuj ac a biologicznie aktywne bia lko fuzyjne LT- ß-R-Ig. (b) odzyskiwanie aktywnego bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig z tego uk ladu hodowli; i (c) po laczenie aktywnego bia lka fuzyjnego LT- ß-R-Ig z etapu (b) z dopuszczalnym farmaceu- tycznie no snikiem.PL 203 543 B1 17 RysunkiPL 203 543 B1 18PL 203 543 B1 19PL 203 543 B1 20PL 203 543 B1 21PL 203 543 B1 22PL 203 543 B1 23PL 203 543 B1 24PL 203 543 B1 25PL 203 543 B1 26PL 203 543 B1 27PL 203 543 B1 28 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 z l (w tym 23% VAT) PL PL PL