PL204232B1

PL204232B1 - Zastosowanie związku fenolowego do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia i/ lub zapobiegania zakażeniom Chlamydiami

Info

Publication number: PL204232B1
Application number: PL362405A
Authority: PL
Inventors: Heikki Vuorela; Pia Vuorela; Raimo Hiltunen; Maija Leinonen; Pekka Saikku
Original assignee: Control Ox Oy
Priority date: 2000-08-18
Filing date: 2001-08-16
Publication date: 2009-12-31
Also published as: FI20001832A0; RU2246939C2; US20040058983A1; FI113942B; PL362405A1; FI20001832L

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku fenolowego do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia i/lub zapobiegania zakażeniom Chlamydiami. Skutecznie działające związki fenolowe pochodzenia roślinnego i odpowiednie związki syntetyczne oraz ich pochodne i ekstrakty roślinne, jak również zawierające je kompozycje, są użyteczne w leczeniu i zapobieganiu zakażeniom drobnoustrojami z rzędu Chlamydiales (chlamydiami). Związków fenolowych pochodzenia roślinnego i odpowiednich związków syntetycznych oraz ich pochodnych i ekstraktów roś linnych moż na uż ywać do wytwarzania preparatów farmaceutycznych, kompozycji stanowiących dodatki do żywności oraz produktów spożywczych wyspecjalizowanych, dobroczynnych dla zdrowia.

Chlamydia są to małe bakterie Gram-ujemne. Z uwagi na ich unikalny, wewnątrzkomórkowy cykl rozmnażania sklasyfikowano je w osobny rząd Chlamydiales, obejmujący rodzaj Chlamydia.

Początkowo rodzaj Chlamydia podzielono na dwa gatunki, a mianowicie Ch. trachomantis i Ch. psittaci. Podział ten oparty był na właściwościach biochemicznych:

Ch. trachomatis Ch. psittaci

Akumulacja glikogenu we wtrętach chlamydiowych (barwienie jodem +) + Wrażliwość na sulfonamidy + Początkowo uważano, że „Ch. trachomatis stanowi grupę jednolitą, natomiast „Ch. psittaci grupę bardzo różnorodną. Kiedy odkryto szczep chlamydiów (później nazwany Ch. pneumoniae) powodujący zakażenia dróg oddechowych bez kontaktu z ptakami, bezdyskusyjnie zaliczono go do grupy „Ch. psitacci, ponieważ spełniał on wyżej wspomniane warunki oparte na właściwościach biochemicznych. Ch. trachomatis i C. pneumoniae różnią się od siebie pod względem struktury powierzchni. Zasadniczym składnikiem strukturalnym powierzchni komórek Ch. trachomatis jest „główne białko błony zewnętrznej (MOMP), odmienne w czterech różnych miejscach i stanowiące podstawę podziału Ch. trachomatis na (jak dotychczas) prawie 20 różnych immunotypów. U Ch. pneumoniae, MOMP jest bardzo konserwatywne i wykryto w nim tylko jeden immunotyp. Oprócz tego, różne są komórki docelowe w tkance: nabłonek narządów płciowych i tkanka łączna w przypadku Ch. trachomatis, i nabłonek dróg oddechowych w przypadku C. pneumoniae. Pierwszy z nich, z wyjątkiem rzadko spotykanego szczepu ziarniniaka wenerycznego (LGV), nie jest zdolny do rozmnażania się w fagocytach i makrofagach, stanowiących komórki docelowe tego drugiego. W przypadku przenikania do komórki, Ch. pneumoniae wykorzystuje receptor heparynowy, nie używany przez chlamydie zakażające narządy płciowe (z wyjątkiem LGV). Następnie, odmienne są drogi przenoszenia i otrzymane obrazy kliniczne: Ch. pneumoniae jest przenoszony drogą oddechową i może się rozprzestrzeniać wewnątrz monocytów do układu krążenia, podczas gdy C. trachomatis przenoszony jest głównie poprzez stosunki płciowe. Oprócz tego, leczenie jest odmienne: zakażenie Ch. trachomatis zazwyczaj leczy się dawką pojedynczą, podczas gdy w przypadku Ch. pneumoniae zalecane są nawet trzytygodniowe przebiegi leczenia antybiotykami.

Poniżej wyszczególniono choroby powodowane przez te gatunki chlamydiów lub z nimi związane.

Ch. trachomatis:

- zapalenie spojówek

- zapalenie szyjki macicy

- zapalenie cewki moczowej

- stany zapalne narządów miednicy małej (PID)

- zakaż enia noworodków, na przykład zapalenie płuc niemowląt Ch. pneumoniae:

- zakaż enia górnych dróg oddechowych

- zapalenie oskrzeli

- zapalenia pł uc

- przewlekł e zapalenie oskrzeli z rozedmą (COPD)

- astma

- zapalenie naczyń

- miażdżyca tętnic i jej komplikacje

- zapalenie mózgu

- niektóre typy stwardnienia rozsianego

PL 204 232 B1

- część przypadków póź nego zapoczą tkowania choroby Alzheimera.

Już w 1989 r. wykazano, że szczep należący do rzędu Chlamydiales powodujący zakażenia dróg oddechowych bez kontaktu z ptakami różni się genetycznie od opisanych szczepów tak Ch. trachomatis, jak i Ch. psittaci w sposób tak wyraźny, że wydzielono go w we własny, osobny gatunek, nazwany Ch. pneumoniae. Homologia jego kwasów nukleinowych z Ch. trachomatis wynosi poniżej 10%. C. trachomatis ma pozagenomowe plazmidy, nie znajdujące się w szczepach C. pneumoniae u ludzi. Genomy obu gatunków poddano sekwencjonowaniu i stwierdzono, ż e u Ch. pneumoniae liczba genów (około 200) jest znacznie wyższa niż u C. trachomatis. We współczesnej reklasyfikacji chlamydiów, drobnoustrój ten przeniesiono do całkowicie innego rodzaju, Chlamydophila. Tak więc, są słuszne powody aby sądzić, że wszystko to, co jest wiadome odnośnie do Ch. trachomatis nie może mieć zastosowania do Ch. pneumoniae.

Najbardziej pospolitymi gatunkami chlamydii są Ch. pneumoniae i Ch. trachomatis, które powodują powszechnie występujące poważne choroby. Ch. psittaci jest szeroko rozpowszechniona w królestwie zwierząt, ale u ludzi może powodować choroby tylko sporadycznie. Poza tym wiadomo, że u przeż uwaczy zakaż enia powoduje Ch. pecorum. Klasyfikacja nowych rodzajów i gatunków Chlamydiales jest w toku.

Ch. pneumoniae jest najczęściej spotykaną chlamydią u ludzi i prawie każdy ulega zakażeniu nią 2-3 razy w życiu. Ch. pneumoniae łatwo atakuje tkankę płucną i rozmnaża się w makrofagach i śródbłonku naczyń krwionośnych. Obraz kliniczny zakażeń dróg oddechowych spowodowanych przez Ch. pneumoniae zmienia się bardzo, od zazwyczaj łagodnych infekcji górnych dróg oddechowych u dzieci do poważnego zapalenia płuc u dorosłych. Od 5 do 10% wszystkich przypadków zapalenia płuc spowodowanych jest przez Ch. pneumoniae. Ch. pneumoniae przenosi się drogą powietrzną od człowieka do człowieka. W sposób oczywisty niektórzy osobnicy są skutecznymi przekaźnikami, ponieważ infekcje stają się powszechniejszymi jedynie w wieku szkolnym. W krajach nordyckich, zakażenia powodowane przez Ch. pneumoniae występują jako epidemie zdarzające się mniej więcej co 6 lat i trwają od 2 do 3 lat.

Zakażenia chlamydiami mają charakter przypadkowy i utajony i najważniejsze przede wszystkim są oczywiście ich przewlekłe późniejsze komplikacje. Badania epidemiologiczne wskazują na ważny związek między przewlekłymi zakażeniami Ch. pneumoniae a miażdżycą tętnic: w wielu badaniach potwierdzono także związek między zakażeniami chlamydiami, a występowaniem zawału mięśnia sercowego (AMI). Następnie, przewlekłe zakażenie Cl. pneumoniae w sposób oczywisty odgrywa rolę w zapoczątkowaniu astmy, jak również przewlekłej czopującej choroby płucnej.

Miażdżyca tętnic jest przewlekłym stanem zapalnym i można wykazać obecność cząstek Ch. pneumoniae w komórkach piankowatych i komórkach mięśni gładkich w ponad połowie płytek miażdżycowych. U chorych na AMI często zdarza się odpowiedź immunologiczna na chlamydiowe lipopolisacharydy (LPS), wskazującą na zaostrzenie zakażenia. Możliwe jest także wykrycie chlamydii w uszkodzonych zastawkach serca i występują one szczególnie obficie w tę tniakach aorty brzusznej. Poza tym odkryto, że Ch. pneumoniae odgrywa rolę w zawałach mózgowych i przejściowych atakach niedokrwienia mózgu. Na razie, nie zostało jeszcze ostatecznie wyjaśnione, jaką rolę odgrywają chlamydie w uszkodzonym miejscu, jeśli chodzi o powiększanie się samego uszkodzenia, ale, jak się wydaje, jednym z czynników powolne go postępu takich chorób jest w każdym razie przewlekłe zakażenie chlamydiami. Tym niemniej jednak, na modelach zwierzęcych wykazano, że Ch. pneumoniae inicjują i przyspieszają rozwój miażdżycy tętnic. Wyniki badań epidemiologicznych i klinicznych wykazały, że istnieje wyraźny związek między przewlekłym zakażeniem Ch. pneumoniae a miażdżycą tętnic i AMI. Z wyników ostatnio przeprowadzonych badań wycią gnię to wniosek, ż e zakaż enie Ch. pneumoniae stanowi czynnik ryzyka zdarzeń sercowych. Zakażenie Ch. pneumoniae często kojarzy się z paleniem papierosów, w oczywisty sposób predysponującym do przewlekłych zakażeń chlamydiami.

Zaobserwowano, że leczenie antybiotykami zmniejsza ryzyko ataków serca i że leczenie to umożliwia także wpływanie na powszechnie stosowany wskaźnik zapalenia (ostrej fazy) CRP oraz poziom fibrynogenu w surowicy. W większości krajów uprzemysłowionych, zachorowalność na choroby serca zaczyna spadać, gdy stosowanie antybiotyków, bardzo skutecznych przeciw chlamydiom, staje się powszechne w leczeniu innych zakażeń.

Ch. trachomatis jest najważniejszą przyczyną zakażeń narządów płciowych u kobiet. Poza tym, część negatywnych zakażeń kulturami bakterii dróg moczowych u kobiet w wieku płodności spowodowanych jest przez Ch. trachomatis. Ch. trachomatis jest powszechną przyczyną przewlekłej gruczolistości, a PID (stany zapalne narządów miednicy małej) stanowią najczęstszą komplikację zakażenia

PL 204 232 B1

Ch. trachomatis u kobiet. Zakażenie Ch. trachomatis może być prawie bezobjawowe i jako komplikacje czopującego utworzenia się blizny, spowodowanego przypadkowym zakażeniem utajonym, znane są nawet takie zdarzenia jak ciąża pozamaciczna i niepłodność. Około połowy dzieci urodzonych przez nosicielki chlamydiów zostaje zarażonych przy porodzie i u około połowy noworodków rozwinie się zapalenie spojówek wtrętowe spowodowane jako komplikacja przez Ch. trachomatis. Ch. trachomatis powoduje zakażenia narządów płciowych także u mężczyzn.

Chlamydia są wrażliwe na tetracykliny i erytromycynę. Także, skuteczna okazuje się tu ryfampicyna oraz niektóre nowe fluorochinolony. W przeciwieństwie do, na przykład, Ch. pneumoniae, Ch. trachomatis jest wrażliwa także na sulfonamidy. Wbrew odpowiedzi na leczenie, zakażenia chlamydiowe często nawracają i istnieje także ryzyko ze staną się one przewlekłe. Chlamydia rozmnażają się tylko wewnątrz komórki i stąd też nowe antybiotyki makrolidowe i azalidy, skupiające się skutecznie do komórek, stanowią obecnie alternatywę dla tetracykliny i erytromycyny, jako leki zasadnicze. W skomplikowanym zakażeniu chlamidiowym, leczenie przypuszczalnie będzie kontynuowane przez długi czas i, na przykład, w przypadku choroby Reitera spowodowanej przez chlamidia, zalecany jest trzymiesięczny okres leczenia.

Jak dotychczas, nie istnieją żadne szczepionki do zapobiegania zakażeniom chlamidiowym. Charakter odpowiedzi immunologicznej nie jest dostatecznie poznany i związana jest z nią skłonność do nadwrażliwości.

W opisie patentowym EP O 377 722 opisano sposób oceny ryzyka zawału serca, sposobu diagnozowania choroby serca i naczyń krwionośnych oraz zastosowanie leków skutecznie działających na chlamydia. W publikacji tej, opisano tetracykliny, erytromycynę, rifampicylinę i fluorochinolony jako leki odpowiednie do leczenia lub zapobiegania przewlekłej chorobie serca spowodowanej przez chlamidia.

W dokumencie patentowym WO 98/50074 opisano, zwłaszcza w aspekcie leczenia zakażenia spowodowanego przez Ch. pneumoniae, kombinację środków przeciw drobnoustrojom z rzędu Chla mydiales, w przypadku której każdy składnik aktywny jest skuteczny w określonym stadium cyklu życiowego chlamydiów. W patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 583 0874 opisano sposób diagnozowania ziarniniaka tętniczego chlamidowego spowodowanego przez Ch. pneumoniae, a także kompozycje terapeutyczne przeznaczone do leczenia ziarnicy tętniczej chlamydiowej. Jako związki o odpowiednim działaniu leczniczym wspomniane są tetracykliny, erytromycyny, klarytromycyny, azytromycyna i chinolony.

W patencie JP 1039 686 opisano leczenie miaż dż ycy tętnic spowodowanej przez Ch. pneumoniae, polegające na użyciu kwasu 2-(3,4-dimetoksycynamoilo)aminobenzoesowego jako związku terapeutycznie czynnego, przy dawkowaniu mieszczącym się w zakresie od 100 - 1000 mg/dzień.

Jak wynika z powyższych informacji, istnieje oczywiste zapotrzebowanie na nowe związki i kompozycje, których można by użyć do leczenia i zapobiegania zakażeniom drobnoustrojami z rzędu Chlamidiales.

Szikimiany lub związki utworzone z kwasu szikimowego na drodze biosyntezy, związki utworzone na biochemicznym szlaku octan-malonian i związki utworzone poprzez kombinacje tych dwóch sposobów syntezy, należą do grupy związków fenolowych pochodzenia roślinnego. Do wspomnianych związków zaliczają się związki aromatyczne, fenole, kumaryny, lignany, ligniny jak również flawonoidy i ich pochodne. Do prostych związków aromatycznych należą pochodne fenylopropanu i pochodne fenylometanu. W przyrodzie, flawonoidy, które strukturalnie zaliczają się do związków fenolowych, tworzą szeroko rozprzestrzenioną grupę pigmentów roślinnych. Flawonoidy znajdują się wszędzie w królestwie roślin, w mszakach, w rodzinie rozchodników i w innych roślinach niższych. Większość z nich znajduje się w roś linach wyż szych i roś linach naczyniowych i wystę pują one we wszystkich owocach, warzywach, a między innymi w herbacie i winach, zwłaszcza winach czerwonych. W przyrodzie, flawonoidy występują głównie w postaci glikozydów, ale mogą to być także wolne fenole i siarczany w postaci tak zwanych aglikonów, lub związane z polisacharydami i białkami. W większości przypadków, flawonoidy, pod względem budowy, są związkami polifenolowymi. Zidentyfikowano już ponad 8000 flawonoidów pochodzących z roślin i pełnią one niezliczone mnóstwo funkcji. Dzięki swemu gorzkiemu smakowi chronią one rośliny przed szkodliwymi owadami, a dzięki swym właściwościom antybiotycznym, chronią rośliny przed wirusami i bakteriami. Zgodnie z panującą obecnie opinią, flawonoidy nie są związkami ważnymi pod względem odżywczym, ale przynoszą dobroczynne skutki, jeśli chodzi o zdrowie. Działanie takie jest w oczywisty sposób niezależne od witamin i substancji mineralnych znajdujących się w roślinie. Z trudnością tylko mógłby ktoś uniknąć spożycia

PL 204 232 B1 flawonoidów, ale ich możliwości działania zależą, w każdym przypadku, od właściwości absorpcyjnych i dostępnoś ci biologicznej, a dodatkowo takż e od wzajemnego oddział ywania flawonoidów jednocześnie otrzymanych. Już od dłuższego czasu znane jest przeciwutleniające działanie związków fenolowych występujących w przyrodzie i w licznych badaniach zajmowano się wychwytem wolnych rodników. Zgodnie z obecnymi informacjami dotyczącymi tych badań, zdolność flawonoidów do zapobiegania utleniania cholesterolu LDL uważana jest za jedną z ich najważniejszych właściwości. Utlenianie cholesterolu LDL w tkance podśródbłonkowej naczyń krwionośnych jest wstępnym czynnikiem warunkującym miażdżycę tętnic. Wyniki wielu badań nasuwają sugestię, że ważnym czynnikiem zachorowalności powodowanej chorobami serca i naczyń krwionośnych jest niedostatek pobierania z pożywienia flawonoidów. W przeprowadzonych na ludziach badaniach nad flawonoidami obserwowano rolę jedynie kilku najważniejszych flawonoidów, spośród których odnośnie do kwercetyny wykazano działanie zapobiegające utlenianiu cholesterolu LDL, a przez to zmniejszające ryzyko choroby wieńcowej, ponieważ utlenianie cholesterolu LDL w oczywisty sposób związane jest z poszczególnymi fazami miażdżycy tętnic.

Dzienne pobranie flawonoidów z pożywienia jest zmienne i wynosi, na przykład na podstawie badań duńskich, od 0 - 30 mg. Z drugiej strony, w badaniach przeprowadzonych na Finach, stwierdzono umiarkowanie ochronny wpływ flawonoidów na zachorowalność na choroby serca i naczyń krwionośnych, ale różnice w ilości pobranych z pożywieniem flawonoidów okazały się raczej niewielkie, mieszczące się w granicach od około 2 do 6 mg/dzień. W badaniach przeprowadzonych w Holandii stwierdzono odwrotny stosunek między przyjętymi z pożywieniem flawonolami i flawanolami a przypadkami śmierci spowodowanej chorobami serca i naczyń krwionośnych. Zanotowano także odwrotny stosunek między pobieraniem flawonoli i flawonów, a ryzykiem zawałów serca. Flawonoidy znane są także z tego, że oddziaływują na odpowiedzi zapalne i immunologiczne, jak również na wiele innych funkcji komórki. Pewne flawonoidy i liczne inne związki fenolowe występujące w przyrodzie mogą zapobiegać pobieraniu wapnia przez komórkę, lub je wzmagać, co przedstawiono także w poniższej tabeli 1.

Leki blokujące kanał wapniowy odgrywają ważną rolę w leczeniu chorób serca i naczyń krwionośnych, takich jak ból w klatce piersiowej spowodowany anoksją sercową, zawałem serca, miażdżycą tętnic i nadciśnieniem. Leki te oddziaływują na kanały wapniowe przez zapobieganie dopływowi wapnia do komórki i w ten sposób poszerzają tętnicę wieńcową, jak również obniżają opór obwodowy naczyń krwionośnych, przy czym zmniejszone jest obciążenie serca. Stosowanie blokerów wapnia w duż ej skali doprowadził o, na przykł ad, do rozwoju programów skriningowych (przeszukiwawczych) zmierzających do wykrycia działania blokującego kanał wapniowy przez związki wyodrębnione ze środowiska naturalnego. Jako środowiska skriningu w tych badaniach używa się, na przykład, ustalonej linii komórkowej pochodzącej z nowotworu tylnego płata gruczołu krokowego szczura (GH4C1), a takż e posługuje się techniką „opaski zaciskowej, w przypadku której można wtedy badać oddzielne kanały wapniowe jednej komórki. W wyniku tych badań przeprowadzonych z udziałem związków występujących w przyrodzie i naturalnych ekstraktów wykryto wykazywanie działania blokującego lub aktywującego kanały wapniowe. Związki te wykryto wśród pochodzących z roślin prostych fenoli, kumaryn i flawonoidów, a także ekstraktów o wysokiej zawartości wspomnianych związków. Niektóre z nich są pod względem swego działania blokującego porównywalne z werapamilem, a niektóre przejawiają skłonność do wzmagania dopływu wapnia do komórki.

Przedmiotowy wynalazek dotyczy zastosowania związków fenolowych pochodzenia roślinnego, odpowiednich związków syntetycznych, ich pochodnych, ekstraktów roślinnych i zawierających je kompozycji, do leczenia i zapobiegania zakażeniom drobnoustrojami z rzędu Chlamydiales.

Zastosowanie związku fenolowego pochodzenia roślinnego, wybranego z grupy obejmującej takie związki, jak apigenina, luteolina, kwercetyna, kwercytryna, ramnetyna, izoramnetyna, moryna, daizeina, genisteina, kwas kofeinowy, naryngina, galusan metylu, galusan oktylu, galusan dodecylu, galusan izopropylu, rezerwatrol, umbeliferon, skopoletyna, metoksypsoralen i kumaryna, albo związku syntetycznego wybranego z grupy obejmującej kumarynę 106, kumarynę 102, 2'-metoksy-a-naftoflawon, 6,2'-dimetoksyflawon, 6-metylokumarynę, α-naftoflawon, rotenon, kumarynę 30, 3-benzoilobenzo(F)kumarynę i 7-dietyloamino-3-tenoilokumarynę, albo odpowiedniego związku syntetycznego, albo naturalnego ekstraktu roślinnego lub dietetycznego ekstraktu roślinnego wybranego z ekstraktów z Mentha longifolia, Mentha arvensis, Galeopsis speciosa, Salvia officinalis, Thymus vulgaris,

Rumex acetocella, Rosa rugosa, Veronica longifolia, Symphytum asperum, Artemisia vulgaris, Convallaria majalis, Quercus robur, Daucus carota, Fragaria iinumae, Brassica oleracea, Brassica napus,

PL 204 232 B1

Medicago sativa, Citrus sinensis, Vaccinum myrtillus lub mączki floemowej Polygonaceae, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, ż e zwią zki te albo ekstrakty stosuje się do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia i/lub zapobiegania zakażeniom Chlamydiami spowodowanymi przez Ch. pneumoniae.

Korzystnie, działanie przeciwchlamydiowe na Ch. pneumoniae związku fenolowego pochodzenia roślinnego, albo zawierającego go ekstraktu, albo związku syntetycznego, pod względem zahamowania tworzenia się wtrętów, wynosi 30% lub więcej.

Bardziej korzystnie, działanie przeciwchlamydiowe na Ch. pneumoniae związku fenolowego pochodzenia roślinnego, albo zawierającego go ekstraktu, albo związku syntetycznego, pod względem zahamowania tworzenia się wtrętów, wynosi 90% lub więcej.

Korzystnie, stosuje się związek wybrany z grupy obejmującej apigeninę, luteolinę, kwercetynę, morynę, ramnetynę, galusan metylu, galusan oktylu, galusan dodecylu, galusan izopropylu, skopoletynę, metoksypsoralen, kumarynę 106, α-naftoflawon, rotenon i 7-dietyloamino-3-tenoilokumarynę.

Korzystnie, stosuje się kompozycję zawierającą od 25 μg do 3000 mg, w przeliczeniu na aglikon, związku fenolowego pochodzenia roślinnego, albo związku syntetycznego, w postaci aglikonu lub glikozydu lub ekstraktu go zawierającego.

Korzystnie, związek stosuje się w połączeniu ze związkami siarki zawartymi w czosnku.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że pewne związki fenolowe pochodzenia roślinnego, odpowiednie związki syntetyczne i ich pochodne, oraz ekstrakty i frakcje i częściowe frakcje zawierające wspomniane związki pochodzenia roślinnego, wywierają skierowane przeciw chlamydiom silne działanie, podobne do działania antybiotyków. Związki fenolowe pochodzenia roślinnego, stosowane w rozwiązaniu według wynalazku, są związkami fenolowymi powstałymi z kwasu szikimowego na drodze biosyntezy, związkami fenolowymi utworzonymi na szlaku octan-malonian i związkami fenolowymi utworzonymi w wyniku kombinacji obu tych sposobów. Związki te, takie jak proste związki aromatyczne, fenole, kumaryny, lignany, ligniny i flawonidy otrzymuje się z produktów pochodzących z królestwa roślin, takich jak owoce i warzywa, a specjalnie z owoców cytrusowych, warzyw, jagód, cebuli, herbaty, win czerwonych itd.

Związków fenolowych pochodzenia roślinnego, odpowiednich związków syntetycznych, ich pochodnych, ekstraktów roślinnych i frakcji i częściowych frakcji zawierających te związki można używać jako takich, albo w postaci mieszanin, ewentualnie w kombinacji ze związkami siarki zawartymi w czosnku, takimi jak alicyna lub pochodne alicyny.

Do korzystnych, pochodzących z roślin związków fenolowych należą flawonidy, jak również pochodne fenylometanu i fenylopropanu, kwasy fenolowe, triterpeny, kumaryny i katechiny oraz zawierające je ekstrakty i częściowe frakcje, jak również frakcje zawierające proste fenole, flawonoidy, ich pochodne, polifenole, fenole diterpenowe i chinony diterpenowe, jak również frakcje, z których usunięto frakcję taniny i diterpenów. Korzystne są także odpowiednie związki syntetyczne i ich pochodne oraz farmaceutycznie dozwolone sole, estry i pochodne związków powyżej przytoczonych.

Korzystnymi związkami i zawierającymi je ekstraktami są te związki i ekstrakty, które wykazują działaniu przeciwchlamydiowe (zahamowanie tworzenia wtrętów) równe lub o ponad 30% silniejsze, szczególnie korzystnie równe lub o ponad 90% silniejsze, jak to zdefiniowano w przykładach. Poniżej przedstawiono grupy korzystnych związków i ekstraktów.

- Flawony, takie jak apigenina, luteolina, flawon.

- Flawonole, takie jak kwercetyna, ramnetyna, moryna.

- Flawonony, takie jak naryngina.

- Izoflawony, takie jak genisteina.

- Związki będące pochodnymi fenylometanu, takie jak: galusan metylu, galusan propylu, galusan oktylu, galusan dodecylu, galusan izopropylu.

- Związki będące pochodnymi fenylopropanu, takie jak:

- kumaryny, takie jak umbeliferon, skopoletyna, metoksypsolaren, ksantotoksyna i kumaryna,

- flawan-3-ole, takie jak (-)-epigalokatechina, (-)-epikatechina, (+)-katechina i (-)-epikatechina.

- Związki syntetyczne, takie jak flawonoidy i kumaryny, takie jak kumaryna 106, 2' -metoksy-α-naftoflawon, 6,2'-dimetoksyflawon, 6-metylokumaryna, alfa-naftoflawon, rotanon, 7-dietyloamino-3-tenoilokumaryna.

- Naturalne ekstrakty roślinne, takie jak ekstrakty z Mentha longifolia, Mentha arvensis, Galeopsis speciosa, Salvia officinalis, Thymus vulgaris, Rumex acetocella, Rosa rugosa, Veronica longiPL 204 232 B1 folia, Symphytum asperum, Artemisia vulgaris, Convallaria majalis, Quercus robur, Daucus carota, Fragaria iinumae, Brassica oleracea, Brassica napus, Medicago sativa, Citrus sinensis, mączki z floemu (łyka) lub Vaccinum myrtillus.

Związki fenolowe pochodzenia roślinnego, zawierające je ekstrakty i częściowe frakcje można w dogodny sposób otrzymać z występujących w przyrodzie roślin i/lub ich części, z zastosowaniem jakiejkolwiek typowej metody ekstrakcji i wyodrębniania substancji. Kawałki, korzenie lub liście poddaje się we właściwy sposób hydrodestylacji i macerowaniu, albo tylko hydrodestylacji, po czym otrzymany tak pożądany ekstrakt można poddać dalszemu oczyszczaniu z zastosowaniem dowolnej typowej metody oczyszczania znanej specjaliście z tej dziedziny techniki. Odpowiednie związki syntetyczne lub ich pochodne są zazwyczaj dostępne w handlu, albo można je wytworzyć z zastosowaniem jakiejkolwiek znanej metody syntezy.

W poniż szej tabeli 1 przedstawiono niektóre pochodzące z roślin korzystne związki fenolowe według niniejszego wynalazku, oddziaływanie tych związków na dopływ wapnia do komórki, działanie przeciwutleniające oraz ich budowę chemiczną. Budowę chemiczną związków pokazanych w tabeli 1 przedstawiono poniżej wzorami A, B, C, D i E. Wzór A uwidacznia flawony i flawonole, wzór B flawonony, wzór C izoflawony, wzór D pochodne fenylometanu i wzór E pochodne fenylopropanu. Symbole podstawników R1-7 odnoszą się do odpowiednich grup funkcyjnych podanych w tabeli 1.

PL 204 232 B1

Oddziaływanie na „ IC_m [mole L

PL 204 232 B1

DPPH = 2,2-di(4-tert-oktylofenylo)-1-pikrylohydrazyl, wolny rodnik (przyp. tłum.).

PL 204 232 B1

W przykładach 1-4 przebadano przeciwchlamidiowe działanie pochodzących z roś lin związków fenolowych, a mianowicie kwercetyny, moryny, ramnetyny i galusanu oktylu, na Ch. pneumoniae i Ch.

trachomatis. Wszystkie te związki użyte w stężeniu od 0,5 do 50 μΜ hamowały wzrost Ch. pneumoaniae, przy czym kwercetyna, moryna i ramnetyna okazały się szczególnie skuteczne wobec Ch. trachomatis wtedy, gdy użyto komórek-gospodarzy wstępnie potraktowanych. Tak więc, związkami korzystnymi pod względem leczenia i zapobiegania zakażeniu przez Ch. pneumoniae są, na przykład, związki fenolowe, a mianowicie kwercetyna, moryna, ramnetyna i galusan oktylu, wyizolowane z surowców naturalnych, pod względem leczenia i zapobiegania zakażeniu przez Ch. trachomatis są, z kolei, kwercetyna, moryna i ramnetyna, oraz zawierające je ekstrakty i częściowe frakcje.

Badano również, jak to opisano w przykładzie 5, przeciwchlamidiowe działanie innych pochodzących z roślin związków fenolowych, pewnych syntetycznych flawonoidów i kumaryn, oraz mieszanin związków fenolowych pochodzenia roślinnego z czosnkiem, przy stężeniu wynoszącym 50 μM i stwierdzono znakomite działanie hamujące. Odpowiednio, przebadano, z podobnymi rezultatami, działanie przeciwchlamidiowe alicyny zawartej w czosnku wobec C. pneumoniae.

W przykładzie 6 zbadano przeciwchlamidiowe działanie naturalnych ekstraktów roślinnych i roślinnych ekstraktów spożywczych i stwierdzono doskonałe działanie hamujące. Korzystnymi związkami i zawierającymi je ekstraktami oraz frakcjami są te związki, ekstrakty i frakcje, które wykazują działaniu przeciwchlamydiowe (zahamowanie tworzenia wtrętów) wynoszące 30% lub więcej, szczególnie korzystnie wynoszące 90% lub więcej, jak to zdefiniowano w przykładach. Związek według niniejszego wynalazku, typowo skuteczny w działaniu przeciw chlamidiom, jest dodatkowo przeciwutleniaczem i wpływa na przyjmowanie Ca²⁺ przez komórkę. Również galusan oktylu jest związkiem powszechnie stosowanym jako dodatek do pokarmów.

Jako składniki aktywne, związki fenolowe pochodzenia roślinnego, odpowiednie związki syntetyczne i ich pochodne oraz ekstrakty roślinne, frakcje i ich mieszaniny dawkuje się tak, aby dostarczyć, w przeliczeniu na aglikon, od 25 μg do 3000 mg/dzień. Związki fenolowe pochodzenia roślinnego i odpowiednie związki syntetyczne i ich pochodne oraz ekstrakty roślinne, frakcje i ich mieszaniny, można zgodnie z niniejszym wynalazkiem formułować w preparaty farmaceutyczne w postaci kapsułek, tabletek, maści, preparatów płynnych i innych odpowiednich postaci znanych specjaliście w tej dziedzinie techniki. Preparaty zawierają składnik aktywny w takiej ilości, aby dawka dzienna mieściła się w zakresie od 25 μg do 3000 mg w przeliczeniu na aglikon przy dawkach jednostkowych mieszczących się w zakresie od 25 μg do 500 mg.

Związki fenolowe pochodzenia roślinnego i odpowiednie związki syntetyczne i ich pochodne oraz ekstrakty roślinne, frakcje i ich mieszaniny można także dodawać jako takie do produktów spożywczych, albo też można je wytwarzać jako kompozycje nadające się do wprowadzania do pokarmów jako preparaty ziołowe, przyprawy, granulki itp., których można używać jako takich, przez dodawanie ich do codziennego pożywienia, lub wyspecjalizowanych produktów spożywczych dobroczynnych dla zdrowia, nazywanych także produktami zdrowotnymi, takich jak wyroby gotowe do podania, owsianki, sałatki, napoje, produkty mleczne, tłuszcze jadalne, mrożonki, produkty spożywcze liofilizowane, specjalistyczne produkty spożywcze, frytki, sosy itd. w trakcie ich sporządzania. Związki fenolowe pochodzenia roślinnego i odpowiednie związki syntetyczne i ich pochodne mogą występować w składzie kompozycji albo w postaci aglikonowej, albo w postaci glikozydowej.

Związki fenolowe pochodzenia roślinnego i odpowiednie związki syntetyczne i ich pochodne oraz ekstrakty roślinne, frakcje i ich mieszaniny, stosowane w rozwiązaniu według wynalazku są, jako związki, bezpieczne. Kompozycje i preparaty według wynalazku mogą być stosowane zarówno jako w toku leczenia ostrego zakażenia chlamydiami, albo w reżymie dawkowania kompozycji lub preparatu w sposób ciągły i regularny wraz z codziennym pożywieniem, w celu zapobieżenia zakażeniu chlamydiami. Ponieważ przewlekła choroba wieńcowa powoduje znaczną śmiertelność w postaci zawału mięśnia sercowego (AMI), a z drugiej strony leczenie chorób serca i naczyń krwionośnych przyczynia się do powstania wysokich nakładów finansowych dla gospodarki krajowej; ważne jest, że przez zastosowanie związków fenolowych pochodzenia roślinnego i odpowiednich związków syntetycznych i ich pochodnych oraz ekstraktów roślinnych, frakcji i ich mieszanin według niniejszego wynalazku, a także zawierających je nowych kompozycji możliwe staje się w znacznym stopniu zapobieganie i spowalnianie wzrostu lub wybuch chorób serca i naczyń krwionośnych, w szczególności w grupie osób z ryzykiem wystąpienia choroby. Tych kompozycji i preparatów można także używać do leczenia i zapobiegania ostremu zakażeniu przez Ch. trachomatis, jak również do zapobiegania późniejszym

PL 204 232 B1 powikłaniom, takim jak bezpłodność, ciąża pozamaciczna i rak szyjki macicy, a także do leczenia lub zapobiegania innym zakażeniom i powikłaniom spokrewnionym z chlamydiozą.

Wynalazek przedstawiono bardziej szczegółowo za pomocą następujących przykładów. W przykładach, opisano bezpośrednie działanie związków i ekstraktów roślinnych, stosowanych w rozwiązaniu według wynalazku na Ch. penumoniae i Ch. trachomatis, jak również toksyczność tych związków i ekstraktów wobec uż ytych w przykł adach komórek-gospodarzy (komórki HL, z tkanki ludzkiego pł uca, typowa linia komórek diploidalnych).

P r z y k ł a d 1

Bezpośrednie działanie przeciwchlamydiowe związków fenolowych pochodzenia roślinnego (jako zahamowanie tworzenia wtrętów) Ch. pneumoniae szczep K7 (izolat kliniczny)

Wyniki/Stężenie 50 μΜ

Związki/stężenie 50 μΜ	Zahamowanie % kontroli DMSO	Zahamowanie % kontroli DMSO (potraktowane wstępnie)*
Kwercetyna	90	90
Moryna	99	96
Ramnetyna	99	59
Galusan oktylu	100	100
Deso	0	0

* Komórki-gospodarze inkubowano w ciągu jednego dnia ze związkiem poddawanym badaniu, przed zakażeniem. Na 24-studzienkowe płytki z komórkami-gospodarzami wprowadzono związek poddawany badaniu w 1 ml podłoża podtrzymującego, w tym samym stężeniu, jakie zastosowano w samym teście. Zamiarem takiego sposobu postępowania było zbadanie możliwego skutku działania związku na komórki-gospodarze, które to działanie mogło stanowić czynnik powodujący zahamowanie zakażenia. Postępowanie przyjęte w teście kontynuowano tak, jak to opisano w sposobie oznaczania.

Wyniki/Stężenie 0,5 μΜ

Związki/stężenie 0,5 pM	Zahamowanie % kontroli DMSO	Zahamowanie % kontroli DMSO (potraktowane wstępnie)*
Kwercetyna	68	77
Moryna	80	62
Ramnetyna	73	50
Galusan oktylu	82	62
DMSO	0	0

P r z y k ł a d 2

Zahamowanie zakażalności/Ch. pneumoniae

Wyniki/Stężenie 50 μΜ

Związki/stężenie 50 pM	Zahamowanie % kontroli DMSO	Zahamowanie % kontroli DMSO (potraktowane wstępnie)*
Kwercetyna	76	0
Moryna	94	76
Ramnetyna	100	67
Galusan oktylu	100	100
Deso	0	0

PL 204 232 B1 * Komórki-gospodarze inkubowano w ci ą gu jednego dnia ze związkiem poddawanym badaniu, przed zakażeniem. Na 24-studzienkowe płytki z komórkami-gospodarzami wprowadzono związek poddawany badaniu w 1 ml podłoża podtrzymującego, w tym samym stężeniu, jakie zastosowano w samym teś cie. Zamiarem takiego sposobu postę powania był o zbadanie moż liwego skutku dział ania związku na komórki-gospodarze, które to działanie mogło stanowić czynnik powodujący zahamowanie zakażenia. Postępowanie przyjęte w teście kontynuowano tak, jak to opisano w sposobie oznaczania.

Wyniki/Stężenie 0,5 μΜ

Związki/stężenie 0,5 μΜ	Zahamowanie % kontroli DMSO	Zahamowanie % kontroli DMSO (potraktowane wstępnie)*
Kwercetyna	58	0
Moryna	81	53
Ramnetyna	100	75
Galusan oktylu	59	42
DMSO	0	0

P r z y k ł a d 3

Skutki bezpośredniego działania na Ch. trachomatis

Ch. trachomatis, hodowla w komórkach McCoy'a. Poza tym sposób przeprowadzenia testu taki sam, jak w przypadku Ch. pneumoniae.

Wyniki/Stężenie 50 μΜ

Związki/stężenie 50 gM	Zahamowanie % kontroli DMSO	Zahamowanie % kontroli DMSO (potraktowane wstępnie)*
Kwercetyna	0	100
Moryna	0	100
Ramnetyna	0	100
Galusan oktylu	14	88

Wyniki/Stężenie 0,5 μΜ

Związki/stężenie 50 gM	Zahamowanie % kontroli DMSO	Zahamowanie % kontroli DMSO (potraktowane wstępnie)*
Kwercetyna	0	20
Moryna	0	100
Ramnetyna	0	17
OG (galusan oktylu)	0	0

* Komórki-gospodarze inkubowano w ciągu jednego dnia ze związkiem poddawanym badaniu, przed zakażeniem. Na 24-studzienkowe płytki z komórkami-gospodarzami wprowadzono związek

PL 204 232 B1 poddawany badaniu w 1 ml podłoża podtrzymującego, w tym samym stężeniu, jakie zastosowano w samym teście. Zamiarem takiego sposobu postępowania było zbadanie możliwego skutku działania związku na komórki-gospodarze, które to działanie mogło stanowić czynnik powodujący zahamowanie zakażenia. Postępowanie przyjęte w teście kontynuowano tak, jak to opisano w sposobie oznaczania.

P r z y k ł a d 4

Oznaczenie toksyczności niektórych badanych próbek w stosunku do komórek-gospodarzy Oznaczenia dokonano sposobem opisanym w poprzednich testach, ale bez jakiegokolwiek zakażenia. Żywotność oznaczono metodą barwienia przyżyciowego błękitem trypanowym.

Próbki:

Q = kwertecyna

M = moryna

R = ramnetyna

OG = galusan oktylu

HL-C = komórki HL w samym podłożu odżywczym

HL-CD = komórki HL z dodatkiem DMSO.

Tekst toksyczności HL-C

Q50	Q5	Q0,5	Q0,05	Q0,005	HL-C	HL-CD	μM
10.5	9.2	7,0	11,7	7,4	19,7	9,6	%
M50	M5	M0,5	M0,05	M0,005	HL-C	HL-CD	μM
11,2	8,3	8,4	9,0	8,3	19,0	9,0	%
R50	R5	R0,5	R0,05	R0,005			μM
15,7	9,6	10,0	9,5	10,9			%
OG50	OG5	OG0,5	OG0,05	OG0,005	HL-C	HL-CD	μM
16,4	8,8	7,9	7,4	8,0	5,7	7,8	%

Test toksyczności HL-C (wstępnie potraktowane)

Q50	Q5	Q0,5	Q0,05	Q0,0005		HL-CD	μM
10,5	8,1	3,3	7,2	7,9		30,1	%
M50	M5	M0,5	M0,05	M0,005			μM
9,7	12,7	6,4	8,1	14,4			%
R50	R5	R0,5	R0,05	R0,005	HL-C	HL-CD	μM
16,9	8,0	10,6	7,6	6,6	10,8	10,7	%
OG50	OG5	OG0,5	OG0,05	OG0,005	HL-C		μM
14,8	8,5	5,0	7,1	7,0	7,9		%

P r z y k ł a d 5

Bezpośrednie działanie przeciwchlamydiowe związków fenolowych pochodzenia roślinnego, niektórych związków syntetycznych i mieszanin w stosunku do Ch. pneumoniae

Zastosowano stężenie wynoszące 50 μM.

T a b e l a

1. Flawonoidy występujące w przyrodzie
Związek	Zahamowanie, %
1	2
Apigenina	100
Luteolina	100
Flawon	90
Witeksyna	3
Witeksyno-2''-O-ramnozyd	11

PL 204 232 B1 cd. tabeli

1	2
Luteolino-7-glukozyd	23
Luteolino-3',7'-glukozyd	45
Kwercetyna	90
Ramnetyna	100
Izoramnetyna	70
Moryna	100
Kwercytryna	50
Rutyna	46
Naryngenina	16
Narynina	66
Daidzeina	51
Genisteina	60
Daidzina	0
Genistyna	37
Procyanidyna B1	30
Procyanidyna B2	0

2. Kwasy fenolowe występujące w przyrodzie
Związek	Zahamowanie, %
Kwas benzoesowy	44
Kwas galusowy	27
Kwas syryngowy	32
Kwas kofeinowy	78
Kwas ferulowy	14
Galusan metylu	100
Galusan propylu	100
Galusan oktylu	100
Galusan dodecylu	100

3. Triterpeny występujące w przyrodzie
Związek	Zahamowanie, %
Rezweratrol	54

4. Występujące w przyrodzie kumaryny i katechiny
Związek	Zahamowanie, %
Skopoletyna	96
Metoksypsoralen	100

PL 204 232 B1 cd. tabeli

1	2
Umbeliferon	75
Ksantotoksyna	94
Kumaryna	28
Galusan (-)epikatechiny	85
(-)-Epigalokatechina	58
(-)-Epikatechina	75
(+)-Katechina	76

5. Syntetyczne flawonoidy i kumaryny
Związek	Zahamowanie, %
3-(a-Acetonylo)benzylo]-4-hydroksy-kumaryna	0
Kumaryna 102	63
Kumaryna 106	100
2'-Metoksy-a-naftoflawon	100
6,2'-dimetoksyfl awo n	73
6-Metylokumaryna	71
Alfa-naftoflawon	92
Rotenon	100
7-Dietyloamino-3-tenoilokumaryna	100
3-(2-benzoksazolilo)umbeliferon	28
Kumaryna 30	50
3-Benzoilobenzo(F)kumaryna	62
Kwas 6,8-dibromokumaryno-3-karboksylowy	0
4-Metylo-3-fenylokumaryna	0

6. Mieszaniny
Mieszanina	Zahamowanie, %
Galusan oktylu	100
Galusan oktylu 1/10	53
Galusan oktylu 1/100	17
Czosnek	26
Czosnek 1/10	25
Czosnek 1/100	19
Galusan oktylu 50% + czosnek 50%	100
Galusan oktylu 50% + czosnek 50% 1/10	47
Galusan oktylu 50% + czosnek 50% 1/100	34
Galusan oktylu 50% + czosnek 50% 1/1000	6

PL 204 232 B1

P r z y k ł a d 6

Działanie ekstraktów roślinnych przeciw Ch. pneumoniae

Przeprowadzono wstępny skrining (przeszukanie) 101 ekstraktów pochodzących z 61 naturalnych i spożywczych materiałów roślinnych pod względem działania skierowanego przeciw Ch. pneumoniae. Zastosowano stężenie wynoszące 40 gg/studzienkę.

Poniżej przedstawiono wyniki wybranych, najaktywniejszych w stosunku do Ch. pneumoniae naturalnych ekstraktów roślinnych, obliczonych z czterech różnych ocen.

Roślina	Rodzina	Zahamowanie %	Żywotność
N48. Mentha longifolia	Labiateae	100	dobra
N5 3. Mentha arvensis	Labiateae	100	dobra
N44. Galeopsis speciosa	Labiateae	100	dobra
N57. Salvia officinalis	Labiateae	100	dobra
N57. Salvia officinalis	Labiateae	100	dobra
N58 Thymus vulgaris	Labiateae	100	dobra
N34. Rumex acetocella	Polygonaceae	100	słaba
N30. Rosa rugosa	Rosaceae	100	dobra
N28 Veronica longifolia	Scrophulariaceae	100	słaba
N8 Symphytum asperum	Boraginaceae	100	Słaba
N22. Artemisia vulgaris	Asteraceae	100	dobra
N3 7. Convallaria majalis	Convallariaceae	100	—
Quercus robur	Fagaceae	100	—

Poniżej przedstawiono wyniki wybranych, najaktywniejszych roślinnych ekstraktów spożywczych, które wykazały 100% za hamowanie Ch. pneumoniae, obliczone z czterech różnych ocen.

Roślina	Rodzina	Zahamowanie %	Żywotność
D8. Daucus carota	Umbelliferae	100	-
D14. Fragaria iinumae	Rosaceae	100	słaba
D16. Brassica oleracea	Cruciferae	100	dobra
D17. Brassica napus	Cruciferae	100	dobra
D21. Medicago sativa	Leguminosae	100	dobra
D23. Citrus sinensis	Rutaceae	100	słaba
D25. Phloem flour	Polygonaceae	100	dobra
D30. Vaccinum myrtillus	Ericaceae	100	dobra
D31- Vaccinum myrtillus	Ericaceae	100	dobra

PL 204 232 B1

Nie stwierdzono żadnych znaczących różnic między skutkami działania roślin rozwiniętych w sposób organiczny i normalnie.

W badaniach tych uznano za aktywne ekstrakty z tych roślin, które wykazały 100% zahamowanie powstawania wtrętów Ch. pneumoniae (n = 4). Szczególnie aktywne okazały się rośliny należące do rodziny Labiateae. Niezależnie od sposobu ekstrakcji, czy to metodą hydrodestylacji i maceracji, czy tylko hydrodestylacji, ekstrakty z Salvia officinalis okazały się aktywne w działaniu skierowanym przeciw Ch. pneumoniae. Poniżej podano opis użytych metod mikrobiologicznych metod badawczych.

1. Hodowla i pasażowanie komórek HL.

Pasażowane hodowle komórek HL wytwarza się co 3 dni. Komórki-gospodarze wysiewa się na dzień przed dokonaniem zakażenia. Komórki przepłukuje się 10 ml PBS IX i zbiera za pomocą trypsynizacji (1 : 10, 1,5/2,0 ml/butelkę, około 5 min w komorze o przepływie laminarnym, lub 2 min w CO2, w temperaturze 37°C). Zawiesinę komórek rozcieńcza się do poziomu około 350000 komórek/ml podłoża odżywczego (RN). Hodowle prowadzone w temperaturze 37°C, CO2 (5,0%) i z udziałem podłoża RN zmieniano 1-2 razy/tydzień. Komórki HL można zamrozić w ciekłym azocie [1 ml 7,5% FCS(RN) + 1 ml DMSO].

2. Oczyszczanie chlamydiów.

EB (ciałko elementarne) = zakaźna pozakomórkowa postać chlamydiów. Poprzedniego dnia pobiera się, w celu odtajenia, niezbędną ilość komórek HL zakażonych chlamydiami. Komórki w staranny sposób zawiesza się i utrzymuje w łaźni ultradźwiękowej w ciągu 2 minut [20 sekund nadźwiękawiania (amplituda 24 - 25) i 10 sekund chłodzenia x 6]. Komórki ulegają rozbiciu, a chlamydia pozostają nieuszkodzone.

Zawiesinę wiruje się w ciągu 10 minut przy 1600 obr/min (550 x g), w wyniku czego chlamydia pozostają w supernatancie (resztki komórek HL odrzuca się). Supernatant odsysa się, po czym dodaje 5 ml PBS, zawiesza i nadźwiękawia w ciągu minuty (10 sekund nadźwiękawiania - 5 sekund chłodzenia x 6). Chlamydia można przechowywać w stanie zamrożenia w temperaturze -70°C.

3. Sposób wykonania testu z chlamydiami.

Hodowane komórki HL zakażone zostają EB Ch. pneumoniae. EB atakujące komórkę ulegają przemianie w metabolicznie aktywne ciałka siateczkowe (RB), dzielące się na drodze podziału prostego na wakuolę endosomalną i wtręt. Po pewnym czasie (około 72 h) RB Ch. pneumoniae ponownie kondensują się z utworzeniem EB, po czym wtręty ulegają pokruszeniu, komórki-gospodarze popękaniu i EB zostają uwolnione. Intencją tego sposobu jest zweryfikowanie wtrętów jeszcze przed pęknięciem komórek-gospodarzy.

Jako komórek-gospodarzy dla Ch. pneumoanie użyto w warunkach eksperymentu in vitro komórek HL. W przypadku Ch. trachomatis jako komórki-gospodarze często wykorzystuje się komórki Mc-Coy'a.

Zakażenie komórkami HL i komórkami McCoy'a.

Na dzień przed zakażeniem komórki-gospodarze wysiewa się na 24-studzienkowe płytki: komórki zbiera się za pomocą trypsynizacji i zawiesza w około 5 ml pożywki płynnej i zlicza w komorze Burkera. Do hodowli, każdą studzienkę posiewa się komórkami użytymi w stężeniu od 250000 - 400000 komórek/studzienkę. Przed wprowadzeniem komórek do studzienek, umieszcza się w nich, jeżeli jest to potrzebne, okrągłe szkiełko nakrywkowe (o średnicy 13 mm) do barwienia. Pożywkę płynną dodaje się w takiej ilości, że uzyskuje się objętość 1 ml/studzienkę. Następnego dnia komórki zakaża się żądaną bakterią.

Roztwór przeznaczony do użycia w zakażaniu i zawierający cząstki chlamydiowe miesza się starannie. Starą pożywkę odsysa się. Do zakażenia, inokulum przechowywane w temperaturze -70°C rozcieńcza się do stężenia IFU wynoszącego około 10³ tak, że objętość roztworu wynosi co najmniej 200 μl/studzienkę na 24-studzienkowej płytce. Komórki zakaża się za pomocą wirowania przy 1600 obr/min (550 x g) w ciągu godziny. Podłoże odżywcze odsysa się i wymienia na podłoże podtrzymujące zawierające cykloheksamid, z także zawierające badany związek (DMSO w stężeniu 0,2%), w ilości 1 ml/studzienkę. Komórki inkubuje się w atmosferze 5% CO2, w temperaturze 35°C. Komórki zakażone Ch. pneumoniae inkubuje się w ciągu 3 dni. Po upływie 2-3 dni usuwa się podłoże podtrzymujące i komórki przemywa raz 1 ml PBS. Do studzienek wprowadza się po 200 μl SPG dla dalszej infekcji, po czym komórki zbiera się końcówką pipety i przenosi do probówek. Materiału tego używa się do zakażania nowych komórek dokonywanego w taki sam sposób w celu testowania hamowania zakaźności („działania chlamydiazydycznego).

- Barwienie wykrywające chlamydia.

Podłoże odżywcze, pozostawione nad szkiełkiem nakrywkowym do barwienia, odsysa się. Zakażone komórki utrwala się na szkiełku nakrywkowym metanolem w ciągu 10 minut. Szkiełko nakrywkowe wyjmuje się ze studzienki i przenosi na odpowiednie przeciwciało monoklonalne sprzężone

PL 204 232 B1 z fluoresceiną na błonie Parafilm, do wilgotnej komory, stroną z komórkami do dołu. Szkiełko nakrywkowe inkubuje się w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C, po czym przemywa dwa razy PBS i raz wodą, a w końcu suszy. Szkiełko nakrywkowe umieszcza się stroną z komórkami do dołu na szkiełku przedmiotowym ze środkiem wiążącym (na przykład podłoże Mounting). Przy obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym, komórki z hodowli komórkowej zakażone chlamydiami wykazują charakterystyczną dla wtrętów chlamydiowych fluorescencję żółtawo-zielonawą na kontrastowym czerwonym tle.

- Chemikalia i odczynniki

RN = podłoże odżywcze FCS: 100 ml RPMI 1640 (Sigma), do którego dodano 3,5% L-glutaminy i 10 mg streptomycyny (stężenie końcowe 20 μg/ml), 7,5 ml FCS. Gotowe roztwory przechowuje sie w temperaturze 8°C.

Podłoże podtrzymujące: 100 ml podłoża odżywczego FCS z dodaniem 50 μg cykloheksamidu do końcowego stężenia 0,5 μg/ml. Gotowe roztwory przechowuje się w temperaturze 8°C. PBS (roztwór chlorku sodu zbuforowany fosforanami metodą Dulbecco, Gibco), pH 7,4.

SPG = sacharoza 0,2 M (37,5 g), KH2PO4 3, 8 mM (0,26 g), Na2HPO4-2^O 6,7 mM (0,61 g), kwas glutaminowy (C5H9NO4) 5 mM (0,36 g), zmieszane w 500 ml wody mili-Q. Po wyjałowieniu przechowywane w temperaturze -20°C.

FCS, cielęca surowica płodowa (Gibco, Szkocja), inaktywowana w temperaturze 56°C w ciągu 30 minut, przesączona i przechowywana w temperaturze -70°C.

Claims

1. Zastosowanie związku fenolowego pochodzenia roślinnego, wybranego z grupy obejmującej takie związki, jak apigenina, luteolina, kwercetyna, kwercytryna, ramnetyna, izoramnetyna, moryna, daizeina, genisteina, kwas kofeinowy, naryngina, galusan metylu, galusan oktylu, galusan dodecylu, galusan izopropylu, rezerwatrol, umbeliferon, skopoletyna, metoksypsoralen i kumaryna, albo związku syntetycznego wybranego z grupy obejmującej kumarynę 106, kumarynę 102, 2'-metoksy-a-naftoflawon, 6,2'-dimetoksyflawon, 6-metylokumarynę, α-naftoflawon, rotenon, kumarynę 30, 3-benzoilobenzo(F)kumarynę i 7-dietyloamino-3-tenoilokumarynę, albo odpowiedniego związku syntetycznego, albo naturalnego ekstraktu roślinnego lub dietetycznego ekstraktu roślinnego wybranego z ekstraktów z Mentha longifolia,

Mentha arvensis, Galeopsis speciosa, Salvia officinalis, Thymus vulgaris, Rumex acetocella, Rosa rugosa, Veronica longifolia, Symphytum asperum, Artemisia vulgaris, Convallaria majalis, Quercus robur,

Daucus carota, Fragaria iinumae, Brassica oleracea, Brassica napus, Medicago sativa, Citrus sinensis, Vaccinum myrtillus lub mączki floemowej Polygonaceae, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia i/lub zapobiegania zakażeniom Chlamydiami spowodowanymi przez Ch. pneumoniae.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że działanie przeciwchlamydiowe na Ch. pneumoniae związku fenolowego pochodzenia roślinnego, albo zawierającego go ekstraktu, albo związku syntetycznego, pod względem zahamowania tworzenia się wtrętów, wynosi 30% lub więcej.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że tym, że działanie przeciwchlamydiowe na Ch. pneumoniae związku fenolowego pochodzenia roślinnego, albo zawierającego go ekstraktu, albo związku syntetycznego, pod względem zahamowania tworzenia się wtrętów, wynosi 90% lub więcej.

4. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienne tym, że stosuje się związek wybrany z grupy obejmującej apigeninę, luteolinę, kwercetynę, morynę, ramnetynę, galusan metylu, galusan oktylu, galusan dodecylu, galusan izopropylu, skopoletynę, metoksypsoralen, kumarynę 106, α-naftoflawon, rotenon i 7-dietyloamino-3-tenoilokumarynę.

5. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrz. 1-4, znamienne tym, że stosuje się kompozycję zawierającą od 25 μg do 3000 mg, w przeliczeniu na aglikon, związku fenolowego pochodzenia roślinnego, albo związku syntetycznego, w postaci aglikonu lub glikozydu lub ekstraktu go zawierającego.

6. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrz. 1-5, znamienne tym, że związek stosuje się w połączeniu ze związkami siarki zawartymi w czosnku.